TY  - JOUR
T1  - Blick - das Magazin der Julius-Maximilians-Universität Würzburg. Ausgabe 1/1995. Schwerpunktthema: Molekulare Mechanismen der Krebsentstehung
N2  - Inhaltsübersicht zum Schwerpunktthema: - Molekulare Mechanismen der Krebsentstehung - Reaktiver Sauerstoff in der Krebsentstehung und Krebstherapie - Krebsentstehung durch Stoffwechselprodukte - Von der Krebsauslösung zum Krebswachstum - Zytogenetische Veränderungen bei malignen Lymphomen - Krebs, ein Problem der Deregulierung der Zellteilungskontrolle - Krebstherapie mit Topoisomerase-Inhibitoren u.a.
KW  - Würzburg
KW  - Universität
KW  - Zeitschrift
KW  - Krebsentstehung
KW  - Krebstherapie
KW  - Molekularbiologie
Y1  - 1995
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-44910
VL  - 1/1995
ER  - 
TY  - THES
A1  - Lorenz, Judith
T1  - Immunhistochemische und zellbiologische Analyse humaner monoklonaler Antikörper gegen kolorektale Karzinome
T1  - Immunohistochemical and cellbiological analysis of human monoclonal antibodies against colorectal carcinoma
N2  - Drei verschiedene mit Hilfe der humanen Hybridomatechnologie aus einem Rektumkarzinompatienten isolierte humane monoklonale Antikörper wurden immunhistochemisch und mit Hilfe zellbiologischer Tests untersucht. Die Ergebnisse der Immunperoxidasefärbung geben erste Hinweise auf die Art und Verteilung der von den Antikörpern erkannten Antigene. HH 98/81-33-154 und HH 99/71-81-149 färben nur wenige kolorektale Karzinome sowie einige Tumoren verschiedenen histologischen Ursprungs an und zeigen keine Reaktion mit normalen adulten oder fetalen Geweben. HH 101/99-14 reagiert dagegen außer mit zahlreichen Dickdarmkarzinomen auch mit einigen fetalen Geweben, was auf die Expression des spezifischen Antigens während der Fetalperiode schließen läßt. Neben den Kreuzreaktionen mit verschiedenen zentralnervösen Strukturen adulter Normalgewebe, die im Hinblick auf paraneoplastische neurologische Krankheitsbilder von Interesse sind, zeigt der Antikörper weiterhin eine Affinität zu drüsig differenzierten Tumoren. Im MTT-Assay auf Zellen der Kolonkarzinomzellinie CACO-2 bewirkte unverdünnter Zellkulturüberstand der Antikörper HH 98/81-33-154 und HH 101/99-14 eine starke Proliferationshemmung. Dieser Effekt konnte sowohl nach 24- als auch nach 48stündiger Inkubation, nicht jedoch mit verdünntem Überstand nachgewiesen werden. Mit Überstand von HH 99/71-81-149 war hingegen nur eine schwache Hemmung mitochondrialer Dehydrogenasen zu verzeichnen. Zellen der Linien HT-29, COLO 206F sowie COLO 320 zeigten sich hingegen resistent gegen die antikörpervermittelte Wachstumshemmung. Mit Hilfe des Cell Death Detection ELISAPLUSÒ konnte weiterhin belegt werden, daß HH 98/81-33-154 und HH 101/99-14 nicht nur das Wachstum von Tumorzellen hemmen, sondern überdies auf der Zellinie CACO-2 Apoptose induzieren. In beiden funktionellen Tests überstieg die gemessene Aktivität des niedriger konzentrierten HH 98/81-33-154 die von HH 101/99-14. Die relativ geringe Anzahl von Kreuzreaktionen mit gesundem Gewebe sowie die apoptoseinduzierende Aktivität von HH 98/81-33-154 und HH 101/99-14 unterstreichen die Eignung der Antikörper als potentielle Immuntherapeutika für die adjuvante Behandlung des kolorektalen Karzinoms, einer weltweit zu den häufigsten Krebsarten zählenden Tumorerkrankung.
N2  - Three different human monoclonal antibodies, which had been isolated from a patient with colorectal carcinoma by using the conventional human hybridoma technology, were tested on cryosections of colorectal carcinoma, other tumors, healthy adult and fetal tissue using immunohistochemical staining. Antibody HH 98/81-33-154 and antibody HH 99/71-81-149 showed only few positive reactions with colorectal carcinoma and other tumors and stained neither normal adult nor fetal tissue. Antibody HH 101/99-14 in contrast reacted with the majority of colorectal carcinoma and a number of other adenomatous malignant tumors. Furthermore cross-reactivity with fetal tissue (which indicates that the antibody recognizes an oncofetal antigen) and structures within the central nervous system on healthy adult tissue were observed. To examine the functional activity of the antibodies in vitro the colorimetric mitochondrial hydroxylase assay (MTT) was performed. Undiluted cell culture supernatant of HH 98/81-33-154 and HH 101/99-14 inhibited cell proliferation on human colorectal carcinoma cell line CACO-2 after 24 and 48 hours of incubation whereas diluted supernatant of those two antibodies and supernatant of antibody HH 99/71-81-149 didn’t show such strong effects. No functional activity on the cell lines HT-29, COLO 206F and COLO320 was observed. The extent of antibody-induced apoptosis on cell line CACO-2 was analysed by the Cell Death Detection ELISA PlusÒ kit. This assay showed that HH 98/81-33-154 and HH 101/99-14 not only inhibit proliferation but induce apoptosis on colorectal tumor cells. In both cellbiologic assays (MTT and Cell Death Detection ELISA PlusÒ) the effect of HH 98/81-33-154 surmounted the effect of HH 101/99-14 although the latter was used in a lower concentration. The fact that HH 98/81-33-154 and HH 101/99-14 showed only few cross-reactions with healthy tissue and induce apoptosis on colorectal tumor cell lines in vitro underlines their suitability for adjuvant immunotherapy of colorectal carcinoma which is one of the most frequent cancers worldwide.
KW  - humane monoklonale Antikörper
KW  - Apoptose
KW  - kolorektales Karzinom
KW  - Krebstherapie
KW  - Immuntherapie
KW  - human monoclonal antibodies
KW  - apoptosis
KW  - colorectal carcinoma
KW  - cancer therapy
KW  - immunotherapy
Y1  - 2004
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-11532
ER  - 
TY  - THES
A1  - Seubert, Carolin
T1  - Onkolytische Virotherapie : Virus-vermittelte Expression von MCP-1 oder ß-Galaktosidase in Vaccinia-Virus-kolonisierten Tumoren führt zu einer erhöhten Tumorregression
T1  - Oncolytic virotherapy : The virus encoded coexpression MCPI and beta galactosidase in vaccinia virus colonized tumor xenografts resulted in enhanced tumor rejection
N2  - Ungeachtet der enormen Entwicklung in Krebsdiagnostik und -Therapie in den letzten Jahren, sind vollständige Heilungsaussichten weiterhin gering und die aktuellen Behandlungsmethoden oftmals mit schwerwiegenden Nebeneffekten verbunden. Aufgrund dessen sind alternative Behandlungsmethoden unbedingt erforderlich und führten zu einer zunehmenden Bedeutung des Vaccinia-Virus als onkolytisches Virus in der Krebstherapie. In der vorliegenden Arbeit wurden zwei mögliche Therapieansätze zur Verstärkung der onkolytischen Effekte in humanen Tumormodellen untersucht. Die Kombination einer gene-directed enzyme prodrug Therapie (GDEPT) mit dem onkolytischen Vaccinia-Virus GLV 1h68 sollte zur Selektivitätssteigerung eines ß-Galaktosidase-aktivierbaren, cytotoxisch-aktiven Drugs führen. Darüber hinaus diente das für MCP-1 codierende Vaccinia-Virus GLV-1h80, zielend auf eine Cytokin-vermittelten Immuntherapie, als Vektor zur spezifischen Beeinflussung des intratumoralen Chemokin-Netzwerks. Im Zuge der GDEPT wurde in dieser Arbeit ein, durch enzymatische Deglykosylierug aktivierbares Prodrug, basierend auf dem cytotoxischem Antibiotikum Duocarmycin SA verwendet. Durch eine Infektion mit GLV-1h68 und einer resultierenden Expression des aktivierenden Enzyms ß-Galaktosidase, sollte eine Umwandlung des Prodrugs in ein cytotoxisches Drug erfolgen. In vitro Infektionsstudien zeigten ein nahezu identisches Replikationsverhalten des Vaccinia-Virus GLV-1h68 und des als Kontrollvirus dienenden rVACV GLV-1h43 in humanen GI-101A-Brustkrebszellen. Die Expression der beiden Reporter-Gene Ruc-GFP sowie ß-Galaktosidase konnten auf Protein-Ebene und mittels RT-PCR nach Infektion mit GLV-1h68 nachgewiesen werden. GLV-1h43-Infektion von GI-101A-Zellen führte zu GFP-Expression, jedoch nicht zur Expression des Enzyms ß Galaktosidase. Untersuchung der Enzym-Aktivität in Zelllysaten und Zellkultur-Überständen zeigten nach Infektion mit GLV 1h68 steigende Menge zellulär assoziierter und freier ß-Galaktosidase. Des Weiteren wurde durch Koinkubation von GI-101A-Zellen mit Virus-freien, ß Galaktosidase-haltigen Zelllysaten bzw. –überständen und Prodrug eine Aktivierung des Prodrugs durch das Virus codierte Enzym nachgewiesen. Diese Koinkubation führte zur Abtötung der Zellen. Nach Inkubation mit Proben mock- oder GLV 1h43-infizierter Zellen konnte keiner Veränderung der Proliferationsrate von GI-101A-Zellen gefunden werden. Kombinierte Behandlung von GI 101A-Zellen mit Viren des Stammes GLV 1h68 und Prodrug führte zu starken Synergieeffekten bei der Abtötung der Zellen und wies einen Bystander Effekt der Kombinationstherapie nach. Dieser konnte in 4 weiteren humanen und 2 Hunde-Brustkrebszellen bestätigt werden. Der erzielte Bystander-Effekt zeigt, dass es nach Virus-induzierter ß-Galaktosidase-Expression in GLV 1h68-infizierten Zellen zu einer enzymatischen Spaltung des Prodrugs in das cytotoxische seco-Analogon des Antibiotikums Duocarmycin SA kommt. Durch die Membrangängigkeit des Drugs konnte auch in angrenzenden uninfizierten Zellen eine Wirkung erzielt werden. Anhand von Expressionsanalysen an Apoptose-assoziierten Proteinen, wie PARP und Caspasen, wurde eine Wirkung des Prodrugs über den intrinsischen Apoptose-Signalweg nachgewiesen. In athymischen Nude-Mäusen durchgeführte Replikationsanalysen und X-Gal-Färbungen GLV 1h68 infizierter Tumore nach Prodrug-Behandlung zeigten, dass GLV-1h68 ungeachtet der simultanen Behandlung mit Prodrug im Tumorgewebe repliziert und es nicht zur Anreicherung lacZ-negativer Virusmutanten kommt. Es konnten, durch Prodrug-Behandlung und einer simultanen Expression aktiver ß Galaktosidase, starke synergistische Effekte und eine signifikante Steigerung der Tumorregression erzielt werden. Da die Kombinationstherapie zu keinerlei Unterschieden in Gewicht und Gesundheitszustand behandelter Versuchstiere führte, konnte eine systemische Toxizität außerhalb des Tumorgewebes ausgeschlossen werden. Verschiedene Zelllinien weisen Unterschiede in ihrer Sensitivität gegenüber der onkolytischen Aktivität von Vaccinia-Virus GLV-1h68 auf. Während einige Zelllinien trotz Virus-Behandlung unverändertes Proliferationsverhalten zeigen (non- oder poor-responder), führt diese Behandlung in anderen Zelllinien zu einer vollständigen Tumorregression (responder). In Anbetracht dieser Unterschiede wurden in dieser Arbeit die Effekte einer induzierten Expression des murinen Chemokins MCP-1 in GI-101A-Tumoren (responder) und HT29-CBG-Tumoren (poor-responder) untersucht. MCP-1 zeichnet sich durch seine chemotaktischen Eigenschaften gegenüber mononukleärer Zellen aus und führt zu pleiotropen Tumor-Effekten. Replikationsstudien am Virus GLV-1h80 und des als Kontrollvirus dienenden rVACV GLV-1h68 zeigten, dass aus der Expression des Fremd-Gens mcp-1 sowohl in vitro als auch in vivo keinerlei negativen Effekte auf das Replikationsverhalten in humanen GI-101A- und HT29-CBG-Zellen resultieren. Durch Real-time Monitoring der GFP-Expression im Tumorgewebe lebender Tiere konnte zunächst eine mit dem Infektionsverlauf zunehmende Signalstärke beobachtet werden, welche dann 42 dpi an Intensität verlor. Toxizität und schädliche Nebeneffekte durch Infektion mit den beiden rVACV konnten anhand der viralen Titer in den Organen der Maus ausgeschlossen werden. Die Titer wiesen auf eine ausschließlich auf das Tumorgewebe begrenzte Replikation der Viren nach Injektion in Tumor-tragende Tiere hin. Die Expression des Chemokins MCP-1 wurde sowohl auf transkriptioneller als auch auf translationeller Ebene in GLV-1h80-inifzierten Zellen und im Tumorgewebe GLV 1h80-injizierter Mäuse nachgewiesen. Nach Infektion mit GLV-1h80 konnte eine mit dem Infektionsverlauf zunehmende MCP-1-Expression gezeigt werden. Dabei wurde zudem deutlich, dass nicht nur eine GLV-1h80-Infektion in vivo zu einer Zunahme der intratumoralen MCP-1-Expression führte, sondern eine Vaccinia-Virus-Infektion allein einen Anstieg des Chemokins zu bewirken vermag. Eine Quantifizierung durch ELISA machte Konzentrationsunterschiede von MCP-1 zwischen den Tumormodellen GI-101A und HT29-CBG deutlich. Sowohl in vitro als auch in vivo führte ein GLV-1h80-Infektion zu deutlich niedrigeren Konzentrationen im HT29-CBG-Kolon-Adenokarzinommodell. Ein Nachweis murinen MCP-1 in Blutseren Tumor-tragender Tiere zeigte eine für therapeutische Effekte erwünschte systemische Freisetzung des intratumoral durch die Infektion mit GLV-1h80 gebildeten Chemokins MCP-1. Durch immunhistologische Untersuchungen GLV-1h80-infizierter Zellen und Tumoren konnte diese, mit dem Infektionsverlauf zunehmende MCP-1-Expression bestätigt werden. Die funktionelle Aktivität des rekombinanten Proteins wurde anhand TNF-α-spezifischer ELISA-Analysen überprüft. Dabei zeigte sich eine erhöhte Expression dieses proinflammatorischen Cytokins in GI-101A-Tumoren nach Infektion mit GLV-1h80. Dagegen konnte keine Steigerung der Expression im HT29-CBG-Tumorgewebe nachgewiesen werden. Ein Nachweis des durch proinflammatorische Immunzellen exprimierten Oberlflächenproteins CD14 zeigte ebenfalls einen Anstieg nach Infektion mit GLV-1h80. Auch diese veränderte Expression blieb im poor-Responder-Modell HT29-CBG aus. Die steigende intratumorale Expression der beiden Proteine in GI-101A-Tumoren nach GLV 1h80-Infektion lässt auf eine Zunahme pro-inflammatorischer Immunzellen, basierend auf einer Virus-induzierten MCP-1-Expression schließen. Ein Monitoring der Tumorprogression nach Implantation von GI 101A-Zellen und Injektion der rVACV GLV-1h80 und GLV-1h68 bzw. einer PBS-Injektion führte nach einer anfänglichen Zunahme des Tumorwachstums schließlich bei beiden Viren zu einer Tumorregression. Jedoch konnte durch die GLV-1h80-vermittelte MCP-1-Expression eine Verstärkung der onkolytischen Effekte erzielt werden, welche sich durch eine signifikante Abnahme des Tumorvolumens zeigte. Im HT29-CBG-Modell führten die therapeutischen Effekte durch rVACV GLV-1h80 zwar zu keiner Regression des Tumors, jedoch zeigte sich auch in diesem humanen Tumormodell eine Verstärkung der onkolytischen Effekte nach GLV-1h80-Infektion im Vergleich zu einer GLV 1h68-Behandlung. Durch die GLV-1h80-induzierte Expression des Chemokins MCP-1 konnte somit eine Hemmung des Tumorwachstums auch im poor-Responder-Modell HT29-CBG erzielt werden. Sowohl die Verwendung eines ß-Galaktosidase-aktivierbaren Prodrugs im Zuge einer GDEPT, als auch die Beeinflussung des intratumoralen Chemokin-Netzwerks durch Expression des Chemokins MCP-1 führten in dieser Arbeit zu positiven Synergismus-Effekten in der onkolytischen Virustherapie. Durch künftige Konstruktion eines rVACV, welches sowohl die Expression des Chemokins MCP-1, als auch des prodrug-aktivierenden Enzyms ß-Galaktosidase im Tumorgewebe induziert, könnte in Kombination mit einer Prodrug-Behandlung eine zusätzliche Verstärkung der Effekte erzielt und möglicherweise eine erfolgreiche Virustherapie in bisher schwach ansprechenden poor- bzw. non-Responder-Modellen ermöglicht werden.
N2  - Irrespective of enormous developments in cancer diagnostics and therapy in the last few years, complete recovery from cancer still occurs rarely. Moreover, conventional therapy is attendant on unspecific side effects. Consequently, novel, well-tolerated and more efficient therapies are required in order to reduce the number of cancer-related deaths. Among several strategies to improve currently applied treatments, the use of oncolytic viruses may turn out to be a highly promising therapeutic approach. In this thesis two different therapeutic approaches were investigated to enhance oncolytic effects of vaccinia virus in human xenografts. First, the lacZ-carrying oncolytic vaccinia virus GLV-1h68 was used in combination with a ß-galactosidase activatable prodrug to increase selectivity of a cytotoxic drug. Second, based on a cytokine-mediated immunotherapy, MCP-1-encoding vaccinia virus GLV-1h80 was used as a vector with a specific impact on the intratumoral chemokine network. In the first approach, an enzymatic activatable prodrug, based on a cytotoxic seco-analogue of the antibiotic duocarmycin SA was used for gene-directed enzyme prodrug therapy (GDEPT). An activation of the cytotoxic prodrug was to be achieved by infection with GLV 1h68 and the resulting expression of the prodrug activating enzyme ß-galactosidase. Cell culture experiments revealed a comparable replication rate of GLV-1h68 and of the control virus strain GLV-1h43 lacking the lacZ gene insert. Expression of the reporter genes Ruc-GFP and ß-galactosidase after infection of GI-101A cells with GLV-1h68 was proven on the protein level and by RT-PCR. Infection of cells with GLV-1h43 resulted in GFP-expression only, confirming the absence of lacZ in GLV-1h43. Analysis of ß-galactosidase concentrations in cell lysates and supernatants revealed an increase of the enzyme during infection of GLV 1h68. Activation of the prodrug by the virus-encoded enzyme was achieved by co incubation of GI-101A-cells with virus-depleted, ß-galactosidase-containing cell lysates or supernatants and prodrug. This co-incubation resulted in killing of GI-101A cells. Conversely, incubation with samples obtained from mock- or GLV-1h43-infected cells and prodrug did not change overall survival of GI-101A-cells. In order to find out whether an additional effect could be achieved in neighboring uninfected cells, called bystander effect, GLV-1h68-infected cells were treated with prodrug. This experiment demonstrated strong synergistic effects in terms of cell killing. Similar results were obtained with 4 other human and with 2 canine breast cancer cell lines. The achieved bystander effect reveiled that upon GLV-1h68 infection the virus-mediated ß-galactosidase-expression resulted in enzymatic cleavage of the prodrug and release of the cytotoxic drug. Furthermore it proved the ability of the activated drug to penetrate cell membranes. Expression analysis on apoptosis-associated proteins, e.g. PARP and caspases, revealed induction of apoptosis via the intrinsic pathway after prodrug activation in GLV-1h68-infected cells. In vivo replication analysis and X-Gal staining of GLV 1h68-infected tumors revealed that GLV-1h68 can replicate within tumor tissue and no enrichment of mutants in lacZ occured, regardless of simultaneous prodrug treatment. Thus, prodrug treatment and expression of ß galactosidase resulted in synergistic effects leading to significantly enhanced tumor regression. Since no sign of malaise or weight loss was observed in prodrug-treated mice when compared to the respective control mice, we concluded that no toxic side effects occurred and active ß-galactosidase released from the tumor was negligible. Different human cell lines reveal varied sensitivity to the oncolytic activity of vaccinia virus GLV-1h68, some cell lines continue growth (non- or poor-responder), while others show complete regression (responder). Considering these differences, the second aspect of this thesis was the analysis of the chemokine MCP-1 in GI-101A-xenografts (responder) and in the poor-responding HT29-CBG tumors. MCP-1 is characterized by chemotactic properties against mononuclear cells and has pleiotropic effects on cancer. Replication studies on GLV 1h80 and the control virus strain GLV-1h68 revealed that expression of the inserted mcp-1-gene had no negative effects on viral replication in vitro as well as in vivo in human GI-101A- or HT-29 CBG-cells. Real-time monitoring of GFP-expression in tumors of infected mice showed increasing amounts of GFP in tumors during the infection process until 21 dpi, followed by a decrease in intensity to 42 dpi. By determining the viral titers in organs of infected mice, toxicity and harmful side effects resulting from infection with both virus strains were excluded. The viral titers demonstrate, that viral replication occurs exclusively in tumor tissue. Expression of MCP-1 in GLV-1h80-infected cells and tumors was detected on transcriptional as well as on translational level. The concentration of the chemokine increased during infection of GLV-1h80. Additionally, the increase of intratumoral MCP-1-concentrations was not only limited on GLV-1h80-infected tumors. On the contrary, vaccinia virus infection itself resulted in increasing amounts of this chemokine. Quantifying MCP-1-expression by ELISA assay revealed differences in concentrations between tumors derived from GI-101A and HT-29-CBG cells. In case of the HT-29-CBG coloncarcinoma, infection with GLV-1h80 resulted in lower concentrations of MCP 1 in vitro as well as in vivo. Confirmation of murine MCP-1 in blood samples of tumor-bearing mice revealed a systemic release of intratumoral MCP-1 predicated on the infection with GLV-1h80. This systemic release is required for therapeutic effects. The increased expression of MCP-1 in GLV-1h80-infected cells and tumors during infection was verified by immunohistochemical analysis. Functional activity of the recombinant protein was checked by a TNF-α-specific ELISA assay, demonstrating increased expression of this proinflammatory cytokine in GI-101A tumors after infection with GLV-1h80. In contrast, no increase was observed in HT-29 CBG tumors. Likewise, the quantification of proinflammatory expressed surface protein CD14 showed higher concentrations in GI-101A-tumors after GLV-1h80-infection. Again, this increase was missing in xenografts of poor-responder HT-29-CBG. The increased expression of these two proteins in GI-101A xenografts after GLV-1h80-infection suggested an accumulation of proinflammatory immune cells, resulting from virus-mediated MCP 1-expression. Moreover, monitoring of tumor progression after implantation of GI-101A cells revealed an initially swelling of the tumors, followed by enhanced tumor regression after infection with GLV-1h80, as well as after GLV 1h68-infection. However, GLV-1h80-mediated MCP-1 expression resulted in an enhancement of oncolytic effects, followed by significant reduced tumor volumes compared to GLV-1h68-colonized tumors. In case of HT-29-CBG tumors MCP-1 induced indeed no regression of tumors. However, even in this poor-responding tumors oncolytic effects could be amplified by GLV 1h80 infection. Hence, inhibition of tumor growth in poor-responder model HT-29-CBG could be achieved by GLV-1h80-induced expression of the chemokine MCP-1. Taken together, both, the use of a ß galactosidase activatable prodrug in GDEPT and the modulation of the intratumoral chemokine network by expression of MCP-1 resulted in positive synergistic effects during oncolytic virus therapy. Future construction of a recombinant VACV, co expressing the prodrug-activating enzyme ß galactosidase as well as MCP-1 in tumor tissue has the potential to induce even stronger synergistic effects and might also lead to a more efficient treatment of up to now poor- or non-responding tumors.
KW  - Vaccinia-Virus
KW  - Chemokine
KW  - Krebs <Medizin>
KW  - Therapie
KW  - Galactosidase <beta->
KW  - MCP-1
KW  - Krebstherapie
KW  - ß-Galaktosidase
KW  - Enzym
KW  - MCP-1
KW  - cancer therapy
KW  - ß-galactosidase
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48083
ER  -