TY  - THES
A1  - Alb, Miriam
T1  - Tumorstroma-Immuntherapie und spontane Immunsuppression im Grm1-transgenen Melanom-Modell
T1  - Tumor stroma immunotherapy and spontaneous immunosuppression in Grm1 transgenic murine melanoma
N2  - 5.1 Immuntherapie mit vom Tumorstroma abgeleiteten Peptiden Tumore bestehen nicht nur aus Tumorzellen, sondern auch aus der sie umgebenden extrazellulären Matrix (EZM), und Stromazellen wie Fibroblasten (cancer-associated fibroblast; CAF) und Endothelzellen (tumor endothelial cell; TEC). Diese Stromazellen haben durch die Ausschüttung von Zytokinen, proteolytischen Enzymen, Wachstums- und Angiogenesefaktoren einen entscheidenden Einfluss auf die Tumorprogression. Sie unterscheiden sich von den Stromazellen der normalen Gewebe durch die Expression von sogenannten Tumorstroma-assoziierten Antigenen (TSAA). Damit sollten Therapien, die auf TSAA abzielen, universell einsetzbar und weniger anfällig gegenüber Resistenzentwicklungen (immune escape Mechanismen) sein, da Stromazellen im Gegensatz zu neoplastischen Zellen genetisch relativ stabil sind. Für eine Immuntherapie mit vom Tumorstroma abgeleiteten Peptiden wählten wir die TSAA Endoglin und Fap, welche während der Wundheilung und im Tumorstroma induziert werden. Dabei sollte überprüft werden, ob prophylaktische Vakzinierungen in C57Bl/6j Mäusen Peptid-reaktive T-Zellen induzieren können, und das Wachstum von transplantieren Grm1-transgenen Tumoren reduziert werden kann. In der Tat konnten wir sowohl bei Endoglin- als auch bei Fap Peptid vakzinierten Tieren in vivo Peptid-reaktive Lymphozyten im Blut und zu einem geringeren Anteil auch in der Milz nachweisen, welche Peptid-gepulste syngene Milzzellen lysieren konnten. Allerdings konnte in beiden Fällen keine Reduktion des Tumorwachstums gegenüber der Kontrollgruppe beobachtet werden. Bei der Fap-Peptid-vakzinierten Gruppe war das Tumorwachstum gegenüber der Kontrollgruppe sogar gesteigert. Dies könnte darauf hindeuten, dass die Induktion Fap-Peptid-reaktiver T-Zellen tumorpromovierend wirkt. Möglicherweise könnte aber durch eine Modifikation des Vakzinierungsprotokolls bzw. durch eine Kombination mit anderen Immuntherapeutika ein verbessertes Ansprechen auf eine Endoglin bzw. Fap basierte Immuntherapie erzielt werden. 5.2 Immunsuppressive Mechanismen im Grm1-transgenen Melanom-Modell Grm1-transgene Mäuse entwickeln spontan kutane Melanome. Dieses Modell erlaubte es uns in der vorliegenden Arbeit spontane Immunantworten im Laufe der Melanomentstehung zu untersuchen. Hierfür analysierten wir sowohl ex vivo als auch in vitro aus Milz und Lymphknoten gewonnene Lymphozyten von Mäusen, welche keine Tumorläsionen bzw. eine niedrige oder hohe Tumorlast aufwiesen. Dabei konnten wir ex vivo einen Anstieg der Frequenz aktivierter CD4+ und CD8+ Lymphozyten mit zunehmender Tumorlast zeigen. Bei tumortragenden Tieren exprimierten jedoch hauptsächlich CD4+ T-Zellen Aktivierungsmarker nach in vitro Stimulation. Interessanterweise waren diese Zellen tumortragender Tiere auch funktionell beeinträchtigt, was sich in einer verminderten Proliferationskapazität nach in vitro Stimulation zeigte. Weitere Analysen ergaben, dass die erhöhte Frequenz regulatorischer T Zellen bei tumortragenden Tieren ein frühes Ereignis im Laufe der Tumorentstehung ist. Gleichzeitig konnte auch ein starker Anstieg der immunsupprimierenden Zytokine Tgf-β1 und Il-10 sowohl in den Lymphknoten als auch im Tumorgewebe beobachtet werden. Dabei war die Tgf-β1-Expression sowohl im Tumor als auch im tumor-drainierenden Lymphknoten erhöht, während Il-10 im Tumor nur moderat exprimiert wurde, was eine komplexere Regulation der Il-10-Expression nahe legt. Dies bedeutet, dass in Grm1-transgenen Mäusen ähnlich wie auch bei Melanompatienten zelluläre und zytokinabhängige Mechanismen zur Tumorentstehung beitragen und dieses Modell daher geeignet ist, um präklinisch immunmodulierende Therapieansätze zu testen.
N2  - 6.1 Immunotherapy with peptides derived from tumor stroma-associated antigens Tumors do not only comprise tumor cells but also stromal cells like fibroblasts (cancer associated fibroblast; CAF) and endothelial cells (tumor endothelial cell; TEC) and the surrounding extracellular matrix (ECM). These stromal cells impact on progression and invasion of tumors through release of cytokines, ECM-degrading enzymes, growth factors, and angiogenic factors. They differ from their normal counterparts through expression of so called tumor stroma-associated antigens (TSAA). Therefore, therapies targeting the tumor stroma should be universally applicable. Furthermore, such therapies should be less prone to resistance mechanisms as stromal cells are genetically more stable than neoplastic cells. We selected the TSAA Endoglin and Fap, which are both specifically induced during wound healing and in the tumor stroma, to test if vaccination with peptides derived from these TSAA induced peptide-reactive T cells, and could reduce the growth of transplanted Grm1 transgenic tumors in C57Bl/6j mice in a prophylactic setting. In mice vaccinated with Endoglin- and Fap-peptides, respectively, peptide-reactive lymphocytes from peripheral blood and spleen were able to lyse peptide-loaded syngeneic splenocytes in vivo. However, vaccination with Endoglin- and Fap-peptides, respectively, did not affect the growth of transplanted Grm1-transgenic tumors. In fact, tumor growth was enhanced in Fap peptide vaccinated mice compared to the control group. This suggests that Fap peptide reactive T cells promote tumor progression. Modification of the vaccination protocol or a combination with an immune-modulatory therapy could, however, increase the efficacy of an anti-Endoglin or anti-Fap therapy, respectively. 6.2 Immunosuppressive mechanisms of Grm1-transgenic murine melanoma Grm1-transgenic mice spontaneously develop cutaneous melanoma. This model allowed us to scrutinize the generic immune responses over the course of melanoma development. To this end, lymphocytes obtained from spleens, unrelated lymph nodes and tumor-draining lymph nodes of mice with no evidence of disease, low or high tumor burden were analyzed ex vivo and in vitro. Thereby, we could demonstrate an increased frequency of activated CD4+ and CD8+ T lymphocytes in the respective organs with increasing tumor burden. However, mainly CD4+ T cells, which could constitute both T helper as well as immune suppressive regulatory T cells, but not CD8+ T cells expressed activation markers upon in vitro stimulation when obtained from tumor-bearing mice. Interestingly, these cells from tumor-burdened animals were also functionally hampered in their proliferative response when subjected to strong in vitro stimulation. Further analyses revealed that the increased frequency of regulatory T cells in tumor-bearing mice is an early event present in all lymphoid organs. Additionally, expression of the immunosuppressive cytokines Tgf-β1 and Il-10 became more evident with increased tumor burden. Notably, Tgf-β1 is strongly expressed in both the tumor and the tumor-draining lymph node, whereas Il-10 expression is more pronounced in the lymph node, suggesting a more complex regulation of Il-10. Thus, similar to the situation in melanoma patients both cytokines as well as cellular immune escape mechanisms seem to contribute to the observed immune suppressed state of tumor-bearing Grm1-transgenic mice, suggesting that this model is suitable for preclinical testing of immune-modulatory therapies.
KW  - Stroma
KW  - Melanom
KW  - Immunsuppression
KW  - tumor
KW  - stroma
KW  - melanoma
KW  - immunosuppression
KW  - Tumorstroma
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-78890
ER  - 
TY  - THES
A1  - Hegerfeldt, Yael
T1  - Kollektive Invasion in Melanomexplantaten: Bedeutung von Zell-Matrix-Interaktionen
T1  - Collective Invasion in Melanoma Explants: Role of Cell-Matrix-Interactions
N2  - Zellmigration ist essentiell für die Invasion und Metastasierung maligner Tumore. Neben der Bewegung von Einzelzellen zeigen Tumore sowohl epithe¬lialen als auch mesenchymalen Ursprungs auch kollektive Migration und Invasion multizellulärer Zellverbände, die sich unter Beibehaltung von Zell-Zell-Adhäsionen koordiniert als Gruppe bewegen. Ziel der Arbeit war, primäre humane Melanomexplantate mittels organotypischer Kultur in 3D Kollagenmatrices einzusetzen, um mittels Zeit-raffermikroskopie und experimentellen Blockadestrategien die zellulären und molekularen Grundlagen kollektiver Migration darzustellen, insbesondere die Bedeutung von Zell-Matrix-Interaktionen und Integrinen. In 3D Explantatkulturen bildeten primäre Melanomexplantate reproduzierbar Invasionszonen und sich ablösende und kollektiv wandernde Zellcluster aus. Diese zeichneten sich durch eine ausgeprägte Polarität mit motiler Vorderfront mit zugartig reorientierten Kollagenfasern und nachgezogenem hinteren Teil der Gruppen aus, vergleichbar der Asymmetrie haptokinetisch migrierender Fibroblasten. β1 Integrine zeigten ein heterogenes Verteilungsmuster mit Fokalisierung an Zell-Matrix-Interaktionen vor allem an der Vorderfront und linearer Anordnung entlang der Zell-Zell-Grenzen. Adhäsionsblockierende anti- β1 Integrin-Antikörper bewirkten nahezu vollständige Hemmung der kollektiven Migration, mit Verlust der Zellgruppenpolarität und Migrationspersistenz. Nach Integrinblockade zerfielen Zellverbände infolge Loslösung von Einzelzellen, die sich mittels β1 Integrin-unabhängiger, amöboider Migration durch die Kollagenmatrix bewegten. Der Übergang von β1 Integrin-abhängiger, kollektiver Migration zu amöboider Einzelzellwanderung (kollektiv-amöboide Transition) ist ein Beispiel für die Plastizität von Tumorzellwanderung, die in Anpassung an das Milieu einen Wechsel der Migrationsstrategie erlaubt. Die Plastizität der Tumorzellmigration muss bei der Entwicklung therapeutischer Konzepte, die auf Hemmung von Tumorinvasion und -metastasierung abzielen, berücksichtigt werden.
N2  - Cell migration is essential for invasion and metastasis of malignant tumors. Besides migration of single cells tumors of epithelial as well as mesenchymal origin show collective migration and invasion of multicellular Clusters, which move coordinated as a group while maintaining cell-cell-adhesions. The purpose of this study was to cultivate primary human melanoma explants in an organotypic 3D collagen matrix and examine the cellular and molecular basis of collective cell migration by time-lapse videomicroscopy and blocking experiments with a special emphasis on integrins and cell-matrix-interactions. In 3D culture primary melanoma explants reproducibly formed invasion zones and detaching cell clusters then migrating collectively as a group. These Clusters exhibited a strong polarity with a mobile front and tension-reoriented collagen fibers and a passively gliding rear end, comparable to the asymmetry found in the haptokinetic migration of fibroblasts. β1 integrins were distributed heterogeneously with focalization predominantly in cell-matrix-interactions at the front and linearly in cell-cell-interactions. Adhesion-blocking anti-β1 integrin-antibodies lead to a near complete inhibition of collective migration with a loss of polarity of the group and loss of persistence of migration. After Integrin blockade clusters disrupted due to detaching single cells that continued to migrate independently of β1 integrins through the collagen matrix using an ameboid migration strategy. The switch of β1 integrin-dependent collective migration to single cell ameboid migration (collective-to-ameboid transition) is an example for the plasticity of tumor cell migration while adapting to the milieu that allows a change in migration strategy. Plasticity of tumor cell migration needs to be considered in the development of therapeutic concepts targeting tumor invasion and metastasis.
KW  - Melanom
KW  - Zellmigration
KW  - kollektive Invasion
KW  - Metastasierung
KW  - extrazelluläre Matrix
KW  - melanoma
KW  - metastasis
KW  - cell migration
KW  - collective invasion
KW  - extracellular matrix
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73849
ER  - 
TY  - THES
A1  - Teutschbein, Janka
T1  - Identifizierung und Charakterisierung von Genen und Proteinen in der Xmrk-induzierten Entwicklung von Melanomen
T1  - Identification and characterization of genes and proteins in Xmrk-induced melanomagenesis
N2  - Melanome stellen die gefährlichste Form von Hautkrebs mit der höchsten Mortalitätsrate dar. Der Transformation normaler Melanozyten zu malignen Melanomen liegen komplexe molekulare und biochemische Veränderungen zu Grunde. Im Xiphophorus-Melanom-Modell ist die onkogene Rezeptortyrosinkinase "Xiphophorus melanoma receptor kinase" (Xmrk) der alleinige Auslöser der Melanominitiation und -progression. Die Aufklärung der Xmrk-vermittelten Signaltransduktion kann zum besseren Verständnis von Ereignissen, die auch bei der humanen Melanomentwicklung eine Rolle spielen, beitragen. In der vorliegenden Arbeit wurde mit Hilfe der Microarray-Technologie die Regulation der Genexpression durch Xmrk analysiert. Zu den nach Rezeptoraktivierung am stärksten herabregulierten Genen gehörten "son of sevenless homolog 1" (Sos1) und "ubiquitin-conjugating enzyme E2I" (Ube2i); stark hochreguliert waren "early growth response 1" (Egr1), "cysteine-rich protein 61" (Cyr61), "dual-specificity phosphatase 4" (Dusp4), "fos-like antigen 1" (Fosl1), "epithelial membrane protein" (Emp1), Osteopontin (Opn), "insulin-like growth factor binding protein 3" (Igfbp3) und "tumor-associated antigen L6" (Taal6). Die für die Regulation dieser Gene verantwortlichen Signalwege wurden durch die Anwendung von niedermolekularen Inhibitoren und siRNA identifiziert, wobei für die SRC-Kinase FYN eine zentrale Bedeutung bei der Xmrk-abhängigen Regulation der Genexpression festgestellt wurde. Darüber hinaus wurde die Expression der Gene in humanen Melanomzelllinien im Vergleich zu normalen humanen Melanozyten untersucht. Als besonders vielversprechende Kandidaten stellten sich dabei DUSP4 und TAAL6 heraus, deren Rolle in der humanen Melanominduktion und -progression Gegenstand zukünftiger Studien sein wird. In einem anderen Ansatz zur Aufklärung des Signalnetzwerkes sollten Zielproteine von Xmrk durch Protein-Protein-Interaktionsstudien mit Hilfe des Split-Ubiquitin-Systems ermittelt werden. Aufgrund ungünstiger Expressions- oder Faltungseigenschaften von Xmrk in diesem System war es aber nicht möglich, den Rezeptor als Köderprotein einzusetzen. Das für die Xmrk-vermittelte Melanomentstehung zentrale Protein FYN konnte jedoch als Köder etabliert und seine Wechselwirkung mit der Tyrosinkinase FAK analysiert werden. Es wurde gezeigt, dass der phosphorylierte Tyrosinrest an Position 397 von FAK für die Interaktion einer N-terminal trunkierten FAK-Variante mit FYN notwendig ist und dass diese Phosphorylierung in Hefe gewährleistet zu sein scheint. Die Suche nach neuen Interaktionspartnern von FYN mittels der Split-Ubiquitin-Technologie könnte Einblicke in weitere FYN-abhängige Ereignisse bieten, die zur Aufklärung seiner zentralen Rolle bei der Tumorentstehung dienen könnte.
N2  - Melanoma is the most aggressive type of skin cancer with the highest mortality rate. The transformation of melanocytes to malignant melanoma is based on complex molecular and biochemical alterations. In the Xiphophorus melanoma model, the oncogenic receptor tyrosine kinase Xiphophorus melanoma receptor kinase (Xmrk) is the sole trigger of melanoma initiation and progression. Elucidating Xmrk-dependent signaling pathways may contribute to a better understanding of processes that play a role in human melanomagenesis, too. Here, the regulation of gene expression by Xmrk was analyzed using a microarray approach. The genes with the strongest down-regulation in response to receptor activation included son of sevenless homolog 1 (Sos1) and ubiquitin-conjugating enzyme E2I (Ube2i), whereas early growth response 1 (Egr1), cysteine-rich protein 61 (Cyr61), dual-specificity phosphatase 4 (Dusp4), fos-like antigen 1 (Fosl1), epithelial membrane protein (Emp1), Osteopontin (Opn), insulin-like growth factor binding protein 3 (Igfbp3), and tumor-associated antigen L6 (Taal6) were strongly up-regulated. The pathways regulating expression of these genes were identified by applying small molecule inhibitors and siRNA. Interestingly, the SRC-family kinase FYN was found to be a key-player in Xmrk-dependent gene regulation. Furthermore, expression of the genes in human melanoma cell lines compared to normal human melanocytes was investigated. The most promising candidates, which might be important for melanoma induction and progression, were DUSP4 and TAAL6. Their potential suitability as diagnostic and prognostic melanoma markers will be addressed in future studies. In addition to gene expression analysis, protein-protein interactions were to be assayed by the split-ubiquitin-system in order to identify novel Xmrk targets. Unfortunately, inappropriate expression or folding of the receptor in this system precluded it from working as bait. However, the FYN protein, which has a central role in Xmrk-mediated signaling, was established as bait and its association with FAK was analyzed in more detail. A phosphorylated tyrosine residue at position 397 of FAK was demonstrated to be necessary for the interaction of an N-terminally truncated FAK variant with FYN, and this phosphorylation event seems to be feasible in yeast. In future, a split-ubiquitin based screen for novel interaction partners of FYN might provide insights into FYN-dependent processes and help to understand its central role in tumor development.
KW  - Melanom
KW  - Schwertkärpfling
KW  - Microarray
KW  - Onkogen
KW  - Epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor
KW  - Yeast-Two-Hybrid-System
KW  - Xiphophorus
KW  - Rezeptortyrosinkinase
KW  - Xmrk
KW  - Protein-Protein-Interaktion
KW  - Split-Ubiquitin-System
KW  - Microarray
KW  - EGFR
KW  - oncogene
KW  - melanoma
KW  - protein-protein interaction
Y1  - 2008
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27516
ER  - 
TY  - THES
A1  - Köstlin, Sebastian Michael Cosmann
T1  - Die Sekretion angiogenetischer Zytokine durch menschliche Melanomzellen unter Hypoxie
T1  - Secretion of angiogenic cytokines by human melanoma cells under hypoxia
N2  - Das maligne Melanom ist ein Tumor der Hautpigmentzellen mit weltweit steigender Inzidenz. Aufgrund seiner frühzeitigen lymphogenen und hämatogenen Metastasierung zählt das maligne Melanom zu den prognostisch sehr ungünstigen Tumorerkrankungen. Nach erfolgter Metastasierung werden mit den derzeitig etablierten Therapieschemata noch keine ausreichenden Prognoseverbesserungen erzielt. Einen möglichen neuen Therapieansatz stellt die Blockade der Tumorangiogenese dar. Besondere Bedeutung wird dabei der zyto- bzw. chemokinvermittelten Angiogenese zugemessen. In den letzten Jahren zeigten verschiedene diesbezügliche Studien richtungsweisende und erfolgversprechende Ergebnisse. Trotzdem besteht weiterhin hoher Bedarf an Verbesserung des Verständnisses der zugrundeliegenden Regulationsmechanismen. Ziel der vorliegenden Arbeit war, die Sekretion acht angiogenetisch wirksamer Zyto- und Chemokine in vitro durch hoch- und niedrigmaligne Melanomzellen unter normalen Kulturbedingungen sowie unter Hypoxie, Serum- und Glukosemangel zu erfassen. Diese Stressbedingungen dienten als vereinfachtes in vitro-Modell der Mangelbedingungen, die in schnell wachsenden bzw. Nekrosezonen angrenzenden Tumorarealen vorherrschen. Mittels ELISA wurden die abgegeben Mengen der Zytokine VEGF, b-FGF, Angiogenin, PDGF und TGF-ß sowie der Chemokine IL-8, Gro-α und GM-CSF in den Zellüberständen bestimmt. Dabei zeigten die verschiedenen Melanomzelllinien für alle getesteten Zyto- bzw. Chemokine außer GM-CSF charakteristische Sekretionsverhalten unter bestimmten Kulturbedingungen. Insbesondere unter Hypoxie und nach Reoxigenierung ließen sich signifikante Veränderungen im Sekretionsverhalten der verschiedenen Melanomzelllinien feststellen. Eine signifikante Steigerung in der Freisetzung der Zyto- bzw. Chemokine durch Melanomzellen unter Hypoxie ließ sich nur für VEGF, b-FGF, Angiogenin und IL-8 feststellen. Zudem unterschieden sich hochmaligne Melanomzelllinien signifikant von niedrigmalignen Zelllinien in ihrer Sekretion von VEGF, Angiogenin, PDGF, IL-8 und Gro-α unter normalen Kulturbedingungen und unter Hypoxie (Angiogenin, PDGF, IL-8 und Gro-α). In weiterführenden Experimenten wurde das Sekretionsverhalten von normalen Melanozyten, Endothelzellen und Fibroblasten untersucht. Dabei wiesen differenzierte Melanozyten im Vergleich zu den Melanomzellen signifikante Unterschiede in den abgegebenen Zyto-/ Chemokinmengen für VEGF, Angiogenin, PDGF, IL-8 und Gro-α unter normalen bzw. hypoxischen Kulturbedingungen auf. Differenzierte Melanozyten unterschieden sich also von Melanomzellen in ihrer Sekretion bei den selben Zyto- bzw. Chemokinen wie niedrigmaligne von hochmalignen Melanomzelllinien (VEGF, Angiogenin, PDGF, IL-8 und Gro-α). Im Sekretionsverhalten für VEGF, Angiogenin, IL-8 und Gro-α ähnelten Fibroblasten und Endothelzellen (bzgl. VEGF nur HMEC-1) den Melanomzellen. Der Einfluss dieser vier Zyto- und Chemokine und b-FGF auf das in-vitro-Wachstumsverhalten von Endothelzellen wurde mit einem BrD-U-Proliferationsassay untersucht. Sowohl mikrovaskuläre (HMEC-1) als auch makrovaskuläre (HUVEC) Endothelzellen steigerten ihre Proliferation unter dem Einfluss von VEGF, b-FGF, Angiogenin, IL-8 und Gro-α signifikant. HMEC-1 reagierten dabei mit einem tendenziell stärkeren Ansprechen auf die Stimulation als HUVEC. In weiteren Versuchen zeigten HUVEC eine erhöhte Sensibilität für Zytokine (insbesondere für b-FGF) unter Serummangelbedingungen, nicht jedoch für Chemokine (IL-8 und Gro-α). Am deutlichsten fiel die Proliferationssteigerung unter dem Einfluss der einzelnen Zyto- und Chemokine aus, wenn HUVEC in nonadhärentem Zustand stimuliert wurden. Mit den Ergebnissen dieser Arbeit konnte erstmalig bzw. zeitgleich mit anderen Publikationen gezeigt werden, dass Melanomzellen unter Hypoxie nicht nur VEGF, sondern auch Angiogenin und IL-8 deutlich vermehrt sezernieren, dass diese Sekretionssteigerung nach Reoxigenierung weiter anhält und Melanomzellen signifikant von differenzierten Melanozyten unterscheidet. Jedes dieser Zyto- und Chemokine stimulierte die Endothelzellproliferation in vitro. Dabei erhöhten Serummangel und vor allem initial fehlende Zell-Zellkontakte die Zyto- bzw. Chemokinwirkung. Im Gegensatz zu dem bisher intensiver untersuchten VEGF sezernierten hochmaligne Melanomzellen unter Hypoxie signifikant mehr Angiogenin und IL-8 als niedrigmaligne Melanomzellen. Nur für Angiogenin zeigte sich darüber hinaus eine gegensätzliche Sekretionsregulation unter Hypoxie aller Melanomzellen im Vergleich zu normalen Melanozyten. Dies könnte für IL-8 und im Besonderen für Angiogenin auf eine mögliche Schlüsselfunktion in der Melanom-induzierten Angiogenese hindeuten. Inwieweit Rückschlüsse auf die in vivo-Verhältnisse und eine klinische Relevanz zulässig sind, werden weitere Untersuchungen und ggf. Therapiestudien zeigen müssen.
N2  - The aim of this study was to investigate the secretion of angiogenic cytokines by human melanoma cells under normal cell culture conditions and conditions of deficiency. Hypoxia, serum- or glucose deficiency served as a simplified in-vitro-model of the deficiency existing in rapid growing tumors or metastasis. The supernatants of highly and low metastatic melanoma cell lines were tested by ELISA for both the angiogenic cytokines VEGF, b-FGF, Angiogenin (ANG), PDGF and TGF-ß and the angiogenic chemokines IL-8, Gro-alpha and GM-CSF. Especially under hypoxia and after reoxygenation the different melanoma cell lines changed their secretion significantly for most of these factors. Melanoma cells showed significant up-regulation of their secretion under hypoxia for VEGF, b-FGF, ANG and IL-8. Over and above that significant differences between low and highly metastatic cell lines could be seen for their secretion of VEGF, ANG, PDGF, IL-8 and Gro-alpha under normal culture conditions and for ANG, PDGF, IL-8 and Gro-alpha under hypoxia. In further experiments the secretion of these eight factors by normal melanocytes, fibroblasts and endothelial cells was tested. In comparison to melanoma cells normal melanocytes showed significant differences in their secretion of VEGF, ANG, PDGF, IL-8 and Gro-alpha under normal culture conditions and/or hypoxia as described before for highly and low metastatic melanoma cell lines. Fibroblasts and endothelial cells showed a similar secretion of VEGF, ANG, IL-8 and Gro-alpha as melanoma cells. To investigate the effect of these four cytokines and b-FGF on the proliferation of endothelial cells a BrD-U-proliferationassay was performed. All angiogenic factors significantly stimulated both microvascular (HMEC-1) and macrovascular (HUVEC) endothelial cell growth. Cytokine stimulation showed a tendency to effect HMEC-1 proliferation more than growth of HUVEC. In further experiments lack of serum revealed an increased sensibility for the tested cytokines (i.e. b-FGF) but not for the chemokines IL-8 and Gro-alpha. All angiogenic factors achieved their strongest proliferative effect stimulating non-adherent endothelial cells. The results of this study showed for the first time respectively contemporaneous that melanoma cells increase not only their secretion of VEGF but also of ANG and IL-8 under hypoxia. It could also be demonstrated that this effect endures under reoxygenation and significantly differenciates melanoma cells from normal melanocytes. Each of these cyto-/ chemokines stimulated endothelial cell proliferation in vitro. Lack of serum and especially of cell-cell contact increased the stimulatory effect of the cytokines and cyto-/chemokines respectively. In contrast to VEGF highly metastatic melanoma cell lines secreted significantly more ANG and IL-8 than the low metastatic cell lines. On top of that all melanoma cells revealed a contrasting regulation only for ANG in comparison to normal melanocytes. This could indicate a key role for IL-8 and especially for ANG within the melanoma induced angiogenesis. To what extent these results admit conclusions to in-vivo conditions and to a clinical relevance has to be evaluated in further studies.
KW  - Angiogenese
KW  - Zytokine
KW  - Melanom
KW  - Hypoxie
KW  - Angiogenin
KW  - Angiogenesis
KW  - cytokine
KW  - melanoma
KW  - hypoxia
KW  - Angiogenin
Y1  - 2006
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-21305
ER  - 
TY  - THES
A1  - Schrama, David
T1  - T-Zell-priming außerhalb sekundärer lymphatischer Gewebe
T1  - T-cell priming outside of secondary lymphoid tissue
N2  - T-Zellimmunantworten werden normalerweise durch folgenden Weg initiiert: unreife dendritische Zellen nehmen Antigen in der Peripherie auf, wandern in die sekundären lymphatischen Organe, wobei sie auf ihrem Weg sowohl reifen als auch das Antigen prozessieren. In den sekundären lymphatischen Organen angekommen, präsentieren sie als reife dendritische Zellen den T-Zellen die Antigene in Form von Peptiden zusammen mit kostimulierenden Molekülen. Dadurch rufen sie eine spezifische T-Zellantwort hervor. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob nicht Situationen herbeigeführt werden können, die ein T-Zell priming außerhalb der sekundären lymphatischen Organe erlauben. Dazu wurden ein murines Modell, bei dem das Zytokin Lymphotoxin-alpha spezifisch am Tumor angereichert wurde, und ein humanes Modell, bei dem reife, antigenbeladene DC intradermal appliziert wurden, untersucht. Im murinen Modell zeigte sich, dass die gerichtete Anreicherung von Lymphotoxin-alpha am Tumor zu dessen Zerstörung führte, welche durch T-Zellen vermittelt wurde, und mit der Induktion eines tertiären lymphatischen Gewebes am Tumor assoziiert war. Dieses tertiäre lymphatische Gewebe war durch die Kompartimentalisierung von T- und B-Zellen und der Präsenz von high endothelial venules charakterisiert und besaß zudem mit dendritischen Zellen und naïven T-Zellen alle Voraussetzungen für ein in loco priming. Dementsprechend konnte in der Folge der gerichteten Lymphotoxin-alpa Therapie im Tumor ein Anstieg am T-Zellinfiltrat, welches sich oligoklonal zusammensetzte, beobachtet werden. In vitro Experimente verdeutlichte die Tumorspezifität der Therapie-induzierten T-Zellantwort, da die T-Zellen auf ein Tumorantigen mit der Ausschüttung von Interferon gamma reagierten und die Tumorzellen lysierten. Im humanen Modell wurden Hautbiopsien von Melanompatienten untersucht, denen im Rahmen einer klinischen Studie autologe, in vitro generierte und antigenbeladene DC intradermal appliziert wurden. Die Patienten erlaubten die Entnahme von Hautbiopsien aus den Injektionsstellen für wissenschaftliche Untersuchungen. Eine Induktion bzw. Verstärkung einer spezifischen T-Zellantwort durch die Vakzinierung mit antigenbeladenen dendritischen Zellen konnte bereits in zahlreichen Arbeiten und auch in dem in dieser Arbeit untersuchten Patientenkollektiv gezeigt werden. Bei der Analyse der Injektionsstellen zeigt sich, dass ein großer Teil der injizierten dendritischen Zellen in der Vakzinierungsstelle verharren und dass diese unabhängig von einer Beladung mit Antigen zu einer Induktion von high endothelial venules Charakteristika führte. Waren die dendritischen Zellen mit Antigen beladen, so führte dies zu einem stärkeren T-Zellinfiltrat in den Injektionsstellen, wobei sowohl naïve als auch central memory T-Zellen nachgewiesen wurde. Diese Zellen wurden vermutlich durch die Überexpression der DC CK1 und SDF1 Chemokinen in den Injektionsstellen, die chemotaktisch auf T-Zellen wirken, angezogen. Das Infiltrat in den Injektionsstellen war oligoklonal und wies tumorspezifische T-Zellen auf. Nachdem diese T-Zellklone im Blut der Patienten vor der Vakzinierung nicht nachweisbar waren, müssen sie zumindest in den Injektionsstellen expandiert sein. Interessanterweise konnte einer dieser Klone in Metastasen nachgewiesen werden, die nach der Vakzinierung dem Patienten entfernt wurden. In beiden Modellen wurde also durch die Manipulation des Mikromilieus, d.h. Lymphotoxin-alpa Anreicherung am Tumor bzw. Injektion von reifen dendritischen Zellen in die Haut, Strukturen wie z.B. high endothelial venules induziert, die ein in loco priming ermöglichen sollten. Dementsprechend riefen diese Veränderungen ein Tumorantigen-spezifisches Infiltrat hervor. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass T-Zell priming auch außerhalb sekundärer lymphatischer Organe erfolgen kann. Prinzipiell scheint also nur der Kontakt von reifen, antigenbeladenen dendritischen Zellen mit den entsprechenden antigenspezifischen, naïven T-Zellen entscheiden zu sein. Die Möglichkeit des in vitro primings bekräftigt diese These. In vivo erfolgt dieses Aufeinandertreffen normalerweise in den sekundären lymphatischen Organen, doch konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass Veränderungen des Mikromilieus diesen Kontakt auch in anderen Geweben ermöglicht.
N2  - Cellular immune responses are initiated by direct interaction of naïve T cells with professional antigen presenting cells, i.e., dendritic cells. In general, this interaction takes place in secondary lymphoid organs: immature dendritic cells capture antigen in the periphery, and while homing to the secondary lymphoid organs they mature and process the antigen. In these organs they present peptides derived from the antigen together with co-stimulatory molecules to the naïve T cells and thereby initiate an antigen-specific T cell response. In the present work we tested if situations can be created allowing priming outside secondary lymphoid organs. To this end, a murine model in which lymphotoxin-alpha was specifically accumulated at the tumor site and a human model where in vitro generated, matured and antigen pulsed dendritic cells were injected intradermal into the patients were investigated. In the murine model the accumulation of lymphotoxin-alpha at the tumor site led to the eradication of the tumor. This therapeutic success was mediated by T cells and associated with the induction of a tertiary lymphoid tissue characterized by compartmentalized T and B cell aggregates and the presence of high endothelial venules. Moreover, with dendritic cells and naïve T cells present in these tissues requirements for in loco priming were fulfilled. Indeed, targeted lymphotoxin-alpha enlarged the T cell-infiltrate within the tumor. In vitro assays demonstrated the tumor-specificity of the therapy-induced infiltrate. In the human model skin biopsies taken from melanoma patients receiving dendritic cell based vaccination and participating at a clinical I study were investigated. The patients provided informed consent to participate in this experimental procedure and to donate skin biopsies for immunological monitoring. Skin biopsies were taken from the injection sites in which autologous, in vitro generated, maturated and antigen-pulsed dendritic cells were injected. Several reports including one about patients from the present patient cohort demonstrated the induction and/or enhancement of tumor specific T cell responses subsequent to dendritic cells based vaccination therapy. Our analysis demonstrated that most of the injected dendritic cells were entrenched at the injection site. The mere presence of mature dendritic cells in the skin caused the induction of high endothelial venules. In case the dendritic cells were pulsed with antigen the T cell infiltrate was enlarged and consisted both of naïve and central memory T cells. These cells were presumably attracted by the overexpression of the T cell attractant chemokines DC-CK1 and SDF-1 leading to an oligoclonal T cell infiltrate composed partially of tumor specific T cells. As T cell clones detected within the injections sites were not present among the peripheral blood lymphocytes, these clones were at least expanded in the injection sites. Notably, one clone could be detested in metastases of one patient excised after the vaccination. In both models manipulation of the microenvironment, i.e. targeting lymphotoxin-alpa to the tumor or injecting mature dendritic cells into the skin, respectively, induced structures like high endothelial venules which should enable in loco priming. Accordingly, these changes induced a tumor antigen specific T cell infiltrate. Thus, these results imply that T cells can be primed outside of secondary lymphoid tissues. Generally, the contact between mature, antigen presenting dendritic cells and the respective antigen specific T cells should be the only necessity for priming. Notably, the possibility of in vitro priming sustains this thesis. In vivo secondary lymphoid organs enable this contact. The present work, however, demonstrates that this contact can also take place in different tissue caused by manipulation of the respective microenvironment.
KW  - T-Lymphozyt
KW  - Priming
KW  - Melanom
KW  - Melanom
KW  - T-Zelle
KW  - priming
KW  - tertiäres lymphatisches Gewebe
KW  - Immunoconjugate
KW  - melanoma
KW  - T-cell
KW  - priming
KW  - tertiary lymphoid tissue
KW  - immunoconjugate
Y1  - 2004
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-15060
ER  - 
TY  - THES
A1  - Hassel, Jessica C.
T1  - Untersuchungen zur Apoptoseregulation durch die Melanom induzierende Rezeptortyrosinkinase Xmrk
T1  - Investigations on apoptosis regulation by the melanoma inducing receptor tyrosine kinase Xmrk
N2  - Überexpression der konstitutiv aktiven Rezeptortyrosinkinase Xmrk im Zahnkarpfen Xiphophorus führt zur Ausbildung maligner Melanome. Expressionsstudien in transgenen Medaka-Fischen haben gezeigt, daß Xmrk allerdings nur in bestimmten Geweben wie Hirn, Epithelien, Auge und Pigmentzellen zur Tumorbildung führt. Zellen, die durch Xmrk transformiert werden können, scheinen somit über entsprechende Komponenten der durch Xmrk induzierten intrazellulären Signaltransduktion verfügen zu müssen. Bisher wurde eine Reihe von Signalproteinen identifiziert, die von Xmrk rekrutiert und aktiviert werden. Dazu gehören die PLC-g, die Adapterproteine Shc und Grb2, die PI3K, die Fyn-Kinase aus der Familie der Src-Kinasen und der Transkriptionsfaktor STAT5. Um die Signaltransduktion von Xmrk in induzierbarer Form untersuchen zu können, wurde eine mit EGF stimulierbare Rezeptorchimäre HER-mrk, deren extrazellulärer Anteil vom humanen EGF-R und deren intrazellulärer Anteil von Xmrk stammt, in der IL-3 abhängigen murinen pro-B-Zellinie Ba/F3 exprimiert. EGF-Stimulation dieser als BaF Hm bezeichneten Zellen führt zu IL-3 unabhängigem Wachstum und zu Langzeitüberleben. Stimulation des aus der gleichen Genfamilie stammenden EGF-Rezeptors hingegen, wird er in Ba/F3 Zellen exprimiert, kann kein Langzeitüberleben vermitteln. Erste Untersuchungen zeigten, daß das durch HER-mrk vermittelte Langzeitüberleben in Ba/F3 Zellen nicht auf einer höheren Rezeptorexpression verglichen mit den EGF-R exprimierenden Zellen beruht. Allerdings korreliert die Rezeptordichte mit der DNA-Syntheseleistung der Ba/F3 Zellen. Durch verschiedene carboxyterminal verkürzte HER-mrk Rezeptormutanten wurde eine unterschiedliche Anzahl von Substratbindungsstellen von Xmrk deletiert. Expression dieser HER-mrk Rezeptormutanten in Ba/F3 Zellen zeigte, daß für die Auslösung der Replikation der DNA keine C-terminale Substratbindungsstelle notwendig ist, während für eine Vollendung der Zellteilung mit Zellvermehrung und für Langzeitüberleben zwei membrannahe Substratbindungsstellen ausreichend sind. Der Vergleich der durch die verschiedenen Rezeptoren induzierten Signalwege bzw. der Substratinteraktionen von HER-mrk, seinen Mutanten und dem EGF-R gab Hinweise auf für die Antiapoptose entscheidende Signalwege. Untersuchungen zur Aktivierung von STAT1, 3 und 5 zeigten, daß HER-mrk zu einer Aktivierung aller drei STAT-Proteine führt, während der EGF-R in Ba/F3 Zellen nur STAT1 und 3, nicht aber STAT5 aktivieren kann. Die HER-mrk Rezeptormutanten zeigten, daß für die Aktivierung von STAT5 durch HER-mrk keine carboxyterminale Substratbindungsstelle notwendig ist, diese aber möglicherweise durch Stabilisierung der Rezeptorbindung seine Aktivierung verstärken. Für die Aktivierung von STAT1 und 3 hingegen sind carboxyterminale Substratbindungsstellen entscheidend. Das für ein antiapoptotisches Protein kodierende STAT5-Zielgen bcl-X wurde als HER-mrk Zielgen identifiziert. Auch die schwächere STAT5 Aktivierung durch die trunkierte HER-mrk Rezeptormutante Hm delta1006 hatte eine bcl-X Transkription zur Folge, während der EGF-R bcl-X nicht induzierte. Untersuchungen weiterer antiapoptotischer Signalwege zeigten, daß die mrk-Kinase sowie ihre Rezeptormutante Hm delta1006 im Gegensatz zum EGF-R auch zu einer Induktion von bcl-2 führen. Da diese Mutante kein Langzeitüberleben vermittelt, ist somit die Induktion der Genexpression antiapoptotischer Proteine wie Bcl-XL und Bcl-2 nicht ausreichend für Antiapoptose. Es bedarf somit der Kombination mehrerer antiapoptotischer Signalwege, um Langzeitüberleben zu sichern. Expression der Rezeptorchimäre HER-mrk in murinen Melanozyten führt bei Stimulation der mrk-Kinase zur Transformation der Zellen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte eine starke Induktion von bcl-X nach HER-mrk Stimulation in den Melanozyten nachgewiesen werden. Bei der Untersuchung humaner Melanomzellinien, die in der Expression verschiedener Rezeptortyrosinkinasen oft ein sehr unterschiedliches Muster zeigen, konnte eine konstitutive Aktivität von STAT5 in allen untersuchten Zellinien nachgewiesen werden, während STAT1 und 3 nur eine schwache und inhomogene Basalaktivität aufwiesen. Es zeigt sich folglich ein ähnliches Bild wie im Xiphophorus-Melanom, in dem ausschließlich STAT5 konstitutiv aktiv ist. Die untersuchten humanen Melanomzellinien zeigten durchweg eine Expression von Bcl-XL. Andere Signalwege wie z.B. die Aktivierung der MAPK hingegen zeigten ein heterogenes Muster bei den verschiedenen Zellinien. Erste Experimente in A375 Zellen deuten darauf hin, daß die Expression von dominant negativem STAT5 zur Reduktion der bcl-X Transkription und zur Apoptose der Zellen führt (Wellbrock, unveröffentlicht). Der STAT5/Bcl-XL Signalweg scheint folglich ganz entscheidend für die Antiapoptose von Melanomen zu sein.
N2  - Overexpression of the constitutively active receptor tyrosine kinase Xmrk, a member of the EGF-R family, in the fish Xiphophorus leads to the formation of malignant melanoma. Studies in transgenic Medaka fish showed that Xmrk only induced tumour formation in distinct tissues like brain, epithelia, eye and pigment cells. This showed that cells, which can be transformed by Xmrk need to have the appropriate components of the Xmrk signal transduction pathways. Until now PLC-g, the adaptor proteins Shc and Grb2, PI3K, the Src kinase Fyn and the transcription factor STAT5 have been identified as signalling proteins recruited and activated by Xmrk. To further investigate the mrk kinase induced signal transduction the receptor chimera HER-mrk was expressed in the IL-3 dependent pro-B cell line Ba/F3. This receptor chimera consists of the extracellular part of the human EGF receptor and the intracellular part of Xmrk. EGF stimulation, therefore, leads to mrk specific signalling in Ba/F3 cells. In HER-mrk expressing Ba/F3 cells EGF can replace the physiological growth factor IL-3 for proliferation and long term survival. In contrast stimulation of the EGF receptor if expressed in Ba/F3 cells does not have this effect. The long term survival triggered by HER-mrk was not based on higher receptor densities of HER-mrk expressing Ba/F3 cells compared to EGF-R expressing ones. Even a strong EGF-R expression could not mediate long term survival whereas even a low HER-mrk receptor expression was sufficient. Expression of C-terminal truncated HER-mrk receptor mutants in Ba/F3 cells showed that for induction of DNA synthesis no C-terminal substrate binding site is needed and that to complete cell division and for long term survival the two membrane proximal binding sites are important. This made it possible to define the crucial pathways for antiapoptotic signalling. Further analysis revealed that Her-mrk activates STAT1, 3 and 5 proteins, whereas the EGF-R could only activate STAT1 and 3, but not STAT5 in Ba/F3 cells. Strikingly, the HER-mrk receptor mutants showed that STAT5 activation by HER-mrk is not dependent on one of the known substrate binding sites but that C-terminal phosphotyrosines enhance the activation of STAT5, possibly by stabilizing the binding to the receptor. For the activation of STAT1 and 3, however, C-terminal substrate binding sites are needed. With regard to antiapoptotic signalling pathways a possible induction of the STAT5 target gene bcl-X has been investigated. Indeed, HER-mrk leads in contrast to the EGF-R to an induction of bcl-X transcription. Even the weaker STAT5 activation by the HER-mrk receptor mutant Hm delta1006 is followed by bcl-XL expression. Investigation of other antiapoptotic singalling pathways showed that the mrk kinse also leads to an induction of bcl-2 expression in contrast to the EGF-R. Strinkingly this was also seen for the receptor mutant Hm delta1006, which is not able to mediate long term growth in Ba/F3 cells. Therefore induction of the expression of the antiapoptotic proteins bcl-XL and bcl-2 seems not to be sufficient for long term survival. This suggests that a combination of different pathways is needed. Expression of the receptor chimera HER-mrk in murine melanocytes induces transformation of the cells under treatment with EGF. With this study it could be shown that mrk stimulation in these melanocytes leads to a strong induction of bcl-X which seems to be based on the activation of STAT5. Investigation of different human melanoma cell lines which often show varying expression of different receptor tyrosine kinases revealed constitutive activation of STAT5 in all of the tested cell lines. STAT1 and 3 however were only weakly activated and showed different activation patterns in the melanoma cell lines. Therefore in human melanoma cell lines a similar picture as for the Xiphophorus melanoma was found. While bcl-XL could not be investigated in the fish melanoma due to lacking cross reactivity of the antibody, northern probes and RT-PCR primers, the human melanoma cell lines showed expression of bcl-XL. Other pathways like the activation of MAPK, however, displayed a heterogenous activation pattern in the different cell lines. First experiments in A375 cells gave evidence that expression of dominant negative STAT5 is followed by reduction of bcl-X transcription and apoptosis of the cells (Wellbrock, unpublished). The STAT5/bcl-XL pathway therefore seems to be crucial for antiapoptosis in melanomas.
KW  - Apoptose
KW  - Rezeptortyrosinkinase
KW  - Melanom
KW  - STAT
KW  - Bcl-X
KW  - apoptosis
KW  - receptor tyrosine kinase
KW  - melanoma
KW  - STAT
KW  - bcl-X
Y1  - 2003
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-11319
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TY  - THES
A1  - Delfgaauw, Jacqueline
T1  - Melanomspezifische Genexpression und Signaltransduktion bei Xiphophorus: Die Rolle des Transkriptionsfaktors Mitf
T1  - Melanoma specific genexpression and signal transduction in Xiphophorus: The role of the transcription factor Mitf
N2  - Die Kenntnis der Transkriptionsregulationsmechanismen stellt eine wichtige biochemische Grundlage für das Verständnis der molekularen Ereignisse, die der Krebsentstehung zugrunde liegen, dar. Eine Schlüsselrolle in der transkriptionellen Kontrolle der Genexpression spielen hierbei die Transkriptionsfaktoren. Diese sind nukleäre Proteine, die mit spezifischen DNA-Elementen interagieren und so die Transkription eines in cis-Position lokalisierten Zielgens regulieren. Da der “microphthalmia associated” Transkriptionsfaktor Mitf-M spezifisch in Melanozyten und Melanomzellen exprimiert wird, scheint er eine wichtige Rolle in der melanomspezifischen transkriptionellen Aktivierung zu spielen und war deshalb im Rahmen dieser Arbeit näher untersucht worden. Das Xiphophorus Melanomsystem, ein genetisch gut charakterisiertes Modell, wurde herangezogen, um unter zu Hilfenahme des Tyrosinasegens des mit Xiphophorus nahe verwandten Medaka (Oryzias latipes) die Transkriptionsregulation im Melanom näher zu untersuchen. Zuerst wurde gezeigt, dass der Medaka Tyrosinasepromotor spezifisch in einer Melanomzellinie von Xiphophorus (PSM Zellen) aktiviert wird. Eine 3,2 kb lange Sequenz, die 5´ zum Transkriptionsstart liegt, reicht dabei aus, eine extrem hohe, melanomspezifische Promotoraktivität zu erreichen. Dabei sind die Regionen, die sogenannte E-Boxen (CANNTG) enthalten, von besonderer Wichtigkeit für die Promotoraktivität in der Melanomzellinie, während sie in embryonalen Xiphophoruszellen (A2, als Kontrollzellen eingesetzt) keinen Einfluß auf die Expression haben. An diese E-Box-Sequenzen binden sogenannte b-HLH-Leuzinzipper Transkriptionsfaktoren. Es konnte auf indirektem Wege bewiesen werden, dass es das Protein Mitf sein muß, das an die E-Boxen im Tyrosinasegenpromotor bindet und somit die transkriptionelle Aktivierung ausübt. In EMSA Studien wurde gezeigt, dass die E-Boxen ein Kernprotein aus PSM-Zellen binden, und das dieses spezifisch an diese 6 bp lange Sequenz bindet, da Mutationen der zentralen Oligonukleotid-Sequenz die Bindung zerstörten. Ein weiterer indirekter Beweis für die Bindung von Mitf an diese E-Boxen konnte durch Co-Transfektionsexperimente erbracht werden. Auch in Säugerfibroblastenzellen konnte ektopisch eingebrachtes Mitf-M die Medaka Tyrosinasegenpromotorkonstrukte durch Bindung an E-Boxen aktivieren und das Luciferasegen zur Expression bringen. Das heißt also, dass Mitf-M ausreicht um sogar in nicht-Melanomzellen den Tyrosinasegenpromotor zu transaktivieren. Aufgrund dieser verschiedenen Experimente konnte gefolgert werden, dass diese Mitf-Bindungsstellen essentiell für eine hohe melanom- oder pigmentzellspezifische Promotoraktivität sind. Die Bindungsstelle A, die nahe der Basalpromotorregion im Medaka Tyrosinasegen liegt (-126/-131), scheint hierbei besonders wichtig für die Promotoraktivität und vor allem auch für die Vermittlung der Zelltypspezifität zu sein. Promotorkonstrukte mit den drei E-Boxen A (-126/-131), B (-2651/-2656) und C (-2866/-2871) zeigten eine gegenüber dem Konstrukt nur mit der A-Bindungsstelle höhere Aktivität. Es scheint sich ein additiver Effekt der Mitf-Bindungsstellen auszuwirken. Es konnte allerdings auch gezeigt werden, dass die E-Boxen nicht alleine verantwortlich für die Melanom- bzw. Pigmentzellspezifität sind. Neben den Mitf-Bindungsstellen gibt es noch weitere Elemente im Tyrosinasegenpromotor, die an der Bestimmmung der Spezifität beteiligt sind, und die zwar durch Deletionsreihen im Promotor eingegrenzt, dennoch noch nicht eindeutig bestimmt werden konnten. Die Wichtigkeit des Transkriptionsfaktors Mitf bzw. seiner Funktionen spiegelt sich auch in seiner starken Konservierung im Laufe der Evolution wider. Vergleichende Studien zeigten dass der Transkriptionsfaktor mit seinen verschiedenen Isoformen in Säugern wie in Vertebraten gut konserviert wurde. Nähere Analysen konnten das Vorhandensein zweier separater Gene für Mitf-M und Mitf-B bei Teleostiern nachweisen, während bei Säugetieren und Vögeln nur ein einziges Gen für die unterschiedlichen Mitf Proteine kodiert. Für das Verständnis der molekularen Prozesse bei der Melanombildung von Xiphophorus war es wichtig die Rolle von Mitf in der Signaltransduktion zu analysieren. Es war möglich einen direkten Zusammenhang zwischen der in PSM Zellen exprimierten Rezeptortyrosinkinase Xmrk, dem Genprodukt des Tumor-induzierenden Onkogens von Xiphophorus, und dem Transkriptionsfaktor Mitf nachzuweisen und seine Regulation über Signaltransduktionswege näher zu klären. Die Regulation von Mitf über den MAPkinase-Weg, konnte durch Inhibitorexperimente nachgewiesen werden. Aufgrund der zahlreichen Aktivitäten von Mitf innerhalb der Melanozyten, und seiner Aktivierungsfunktion für verschiedene Zielgene, ist dieser Transkriptionsfaktor von großer Bedeutung für sowohl Differentierung/Pigmentierung wie auch Proliferation/Überleben der Tumorzellen.
N2  - The analysis of transcriptional regulation is the essential biochemical basis for understanding the molecular mechanisms underlying cancer development. A key role in the transcriptional control of gene expression is played by transcription factors. These are nuclear proteins, interacting with specific DNA elements and thereby regulating the transcription of a target gene, which is located in cis position. The microphthalmia associated transcription factor Mitf-M, which is expressed specifically in melanocytes and melanoma cells seems to play an important role in the melanoma specific transcriptional activation. This thesis therefore focused on the function and the role of Mitf. The genetically well characterized Xiphophorus melanoma system was used as a model. Utilizing the tyrosinase gene of the closely related Medaka (Oryzias latipes) the transcriptional regulation in melanoma was investigated. First it was shown that the Medaka tyrosinase promoter was activated specifically in a melanoma cell line from Xiphophorus (PSM cells). A 3,2 kb sequence upstream the transcription start is sufficient for a high melanoma specific promoter activation. The region containing so called E-boxes (CANNTG) is of special importance for the promoter activity in the melanoma cell line whereas in embryonic cells from Xiphophorus (A2 cells, as control) the E-boxes had no influence on the expression. Members of the b-HLH-leucin zipper transcription factor family bind to this E-boxes. An indirect approach showed that it has to be the protein Mitf that binds to the E-boxes in the promoter of the tyrosinase gene and thereby mediates transcriptional activation. EMSA studies revealed a nuclear protein from PSM cells binding to the E-boxes. This binding occurs specifically to the 6 bp core sequence since mutations of the central oligonucleotid sequence destroyed the binding. An further indirect proof for the binding of Mitf to the E-boxes and thus regulation by Mitf, was obtained through co-transfection experiments. Ectopically delivered Mitf-M even in mammalian fibroblasts activated tyrosinase gene promoter constructs via binding to the E-boxes and by that mediated expression of the luciferase gene. Mitf-M is sufficient to transactivate the tyrosinase gene promoter even in non-melanoma cells. On the basis of these experiments it was concluded that the Mitf binding sites are essential for a high melanoma or pigment cell specific promoter activity. The binding site A, located near the basal promoter region in the Medaka tyrosinase gene (-126/-131), appears to be of a special importance for the promoter activity and for the mediation of tissue specificity. In comparison with the construct only with binding site A, the promoter constructs with all three E-boxes A (-126/-131), B (-2651/-2656) and C (-2866/-2871) showed a higher activity. This seems to be an additive effect of the Mitf binding sites. But it could be shown as well that it are not the E-boxes alone that are responsible for melanoma specificity. Besides the Mitf binding sites there exist further elements in the tyrosinase gene promoter that contribute to the specificity. Experiments with deletion constructs could help to narrow down these elements in the promoter, but they are not yet precisely determined. The importance of the transcription factor Mitf and its functions is reflected as well in its strong evolutionary conservation. Comparative studies showed that the transcription factor with its different isoforms is well conserved between mammals and lower vertebrates. More detailed analysis proved the presence of two separate genes for Mitf-M and Mitf-B in teleosts, whereas in mammals and birds only one single gene exists, coding for the different Mitf proteins. For understanding the molecular mechanisms of melanoma formation in Xiphophorus it was important to analyse the role of Mitf in signal transduction in the tumor cells. It was possible to demonstrate a direct link between the receptor tyrosine kinase Xmrk, the gene product of the tumor inducing oncogene in Xiphophorus, which is expressed in PSM cells and Mitf, and to contribute to its regulation in signal transduction pathways. A regulation of Mitf by the MAPkinase pathway was shown by inhibitor experiments. Because of the numerous activities of Mitf in melanocytes this transcription factor plays a pivotal role in the activation of various genes of high importance for differentiation/pigmentation as well as proliferation/survival of the cells.
KW  - Schwertkärpfling
KW  - Melanom
KW  - Transkriptionsfaktor
KW  - Melanom
KW  - Fisch-Modell-System
KW  - microphthalmia associated transcription factor
KW  - microphthalmia associated transcription factor
KW  - fish model system
KW  - melanoma
Y1  - 2003
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-5217
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