TY  - THES
A1  - Diebold, Mathias
T1  - Virtuelles Screening und Entwicklung selektiver Liganden des Aurora-A – MYCN Komplexes und computergestützte Methoden zur Analyse und Design von PROTACs
T1  - Virtual screening and development of selective ligands for the Aurora-A - MYCN complex and computational methods for analysis and design of PROTACs
N2  - Die Interaktion des onkogenen Transkriptionsfaktors MYCN mit der Ser/Thr Kinase Aurora-A verhindert
dessen Abbau über das Ubiquitin Proteasomsystem indem die Rekrutierung des SCF FbxW7 Komplexes
verhindert wird. Die Kinase nimmt mit der Bindung an MYCN eine aktive Konformation ein und erhält
somit die Fähigkeit zur Kinaseaktivität ohne die sonst notwendige Phosphorylierung von Thr288 oder
die Anwesenheit eines Aktivators wie TPX2. Da hohe MYCN Konzentrationen Tumore wie
Neuroblastome antreiben, ist die Störung der Komplexbildung mit Aurora-A eine valide Strategie zur
Entwicklung von Chemotherapeutika. Einige Inhibitoren von Aurora-A wie Alisertib (MLN8237) sind in
der Lage, eine Konformationsänderung in der Kinase zu verursachen, die mit der Bindung von MYCN
inkompatibel ist und auf diese Weise den Abbau des Transkriptionsfaktors induziert. Da Aurora-A
wichtige Funktionen in der Mitose übernimmt, könnte eine direkte Adressierung des Komplexes anstelle
einer systemischen Inhibition der Kinase vielversprechender sein.
Ziel des Projektes war die Identifizierung von Molekülen, die selektiv an das Interface des
Aurora-A – MYCN Komplexes binden und weiter optimiert werden können, um einen gezielten Abbau
des Transkriptionsfaktors über einen PROTAC Ansatz zu ermöglichen. Virtuelle Screenings und
molekulardynamische Simulationen wurden durchgeführt, um kommerziell erhältliche Verbindungen zu
identifizieren, welche mit einer Bindetasche des Komplexes interagieren, die nur zustande kommt, wenn
beide Proteine miteinander interagieren. Aus einem ersten Set von zehn potentiellen Liganden wurde
für vier eine selektive Interaktion mit dem Protein – Protein Komplex gegenüber Aurora-A oder MYCN
alleine in STD-NMR Experimenten bestätigt. Zwei der Hits besaßen ein identisches Grundgerüst und
wurden als Ausganspunkt für die Optimierung zu potenteren Liganden genutzt. Das Gerüst wurde
fragmentweise vergrößert und in Richtung besserer in-silico Ergebnisse und Funktionalisierung zur
Anbringung von E3-Ligase-Liganden optimiert. Neun dieser Liganden der zweiten Generation wurden
synthetisiert.
Um quantitative Bindungsdaten zu erhalten, wurde ein kovalent verknüpftes Aurora-A – MYCN
Konstrukt entworfen. Die strukturelle und funktionale Integrität wurde in STD-NMR und BLI
Experimenten mit bekannten Aurora-A Inhibitoren bestätigt, sowie in NMR-basierten ATPase Assays.
Zusätzlich konnte die Kristallstruktur des Konstrukts gelöst und damit die Validität des Designs bestätigt
werden. Quantitative Messungen der synthetisierten Moleküle identifizierten HD19S als Hit mit einer
zehnfach höheren Affinität für das Aurora-A – MYCN Konstrukt im Vergleich zu der Kinase allein.
Zusätzlich wurden in-silico Untersuchungen zu PROTACs der Aurora-A Kinase durchgeführt.
Interaktionen zwischen Aurora-A, der E3-Ligase Cereblon und den Liganden wurden modelliert und für
die Erklärung unterschiedlicher Aktivitäten der eingesetzten PROTACs verwendet. Zudem zeigte das
aktivste PROTAC eine hohe Selektivität für Aurora-A gegenüber Aurora-B, obwohl die verwendete
Erkennungseinheit (Alisertib) an beide Aurora-Proteine bindet. Dieser Umstand konnte durch
energetische Analysen von molekulardynamischen Simulationen der ternären Komplexe erklärt werden.
Optimierungsmöglichkeiten für eine effizientere Degradation von Aurora-A durch die PROTACs wurden
basierend auf modifizierten Erkennungseinheiten und verbesserten Linkern untersucht.
N2  - The association of the oncogenic transcription factor MYCN with the Ser/Thr kinase Aurora-A prevents
its degradation via the ubiquitin proteasome system by preventing the SCF FbxW7 complex from binding.
The kinase adopts an active conformation when bound to MYCN, enabling kinase activity without prior
phosphorylation on Thr288 or the presence of an activator like TPX2, and therefore at inappropriate
times during the cell cycle. As high levels of MYCN have been shown to drive cancers like
neuroblastoma, disrupting the complex formation is thought to be a viable development strategy for
chemotherapeutics. Several small-molecule inhibitors of Aurora-A, like Alisertib (MLN8237), are able to
induce a conformational change in the kinase, preventing the formation of the protein – protein complex
and therefore promoting MYCN degradation. However, since Aurora-A has important roles during
mitosis targeting only the complex could be a more promising approach than the systemic inhibition of
the kinase.
This project aimed to identify small molecules which selectively bind at the Aurora-A – MYCN interface
and can be further optimized to induce targeted degradation via a PROTAC approach. Virtual screenings
and molecular dynamics simulations were performed to identify commercially available compounds
which should bind to a pocket formed only when the two proteins come together. Of a first set of ten
potential binders, four showed binding to the Aurora-A – MYCN complex but not the individual proteins
in STD-NMR experiments. Two of these hit molecules contained the same scaffold and were used as a
starting point for optimization towards more potent ligands. In a fragment-based fashion, the scaffold
was grown to achieve better affinity in-silico and provide linkage points for functionalization such as the
attachment of E3 ligase ligands to create PROTACs. Nine of these second-generation compounds were
then synthesized.
In order to obtain quantitative binding data a covalently linked Aurora-A – MYCN construct was
designed. Its structural and functional validity was shown in STD-NMR and BLI experiments with known
Aurora-A inhibitors and in NMR-based ATPase assays. In addition, a crystal structure of the construct
was solved, validating the designed structure. Quantitative measurements with the synthesized
compounds revealed a positive hit (HD19S) with a ten-fold higher affinity to the covalently linked AuroraA – MYCN as compared to Aurora-A alone.
Additionally, effects of PROTACs designed to degrade Aurora-A were studied in-silico. Interactions
between Aurora-A, the E3-ligase Cereblon and small molecules were modelled and successfully used
to explain the differences in activities observed with different PROTACs. The most active PROTAC also
showed a high selectivity for Aurora-A over Aurora-B, even though the recognition unit (Alisertib) can
bind both family members. Through energetic analysis of molecular dynamics simulations of the ternary
complexes, these differences could be explained. Optimizations for a more efficient degradation of
Aurora-A by the PROTACs were examined by changing the recognition unit and improving linkers.
KW  - Arzneimitteldesign
KW  - Protein-Protein-Wechselwirkung
KW  - Vernetzung <Chemie>
KW  - Wirkstoffdesign
KW  - PROTAC
KW  - Proteolysis-Targeting-Chimera
KW  - Aurora-A
KW  - MYCN
KW  - Aurora-A-MYCN-Komplex
Y1  - 2023
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-317594
ER  - 
TY  - THES
A1  - Brockmann, Markus
T1  - Inhibition von Aurora-A als neue Therapiestrategie gegen MYCN-amplifizierte Neuroblastome
T1  - Inhibition of Aurora-A as a novel therapeutic strategy against MYCN-amplified Neuroblastoma
N2  - Im Neuroblastom ist die Amplifikation des MYCN-Gens, das für den Transkriptionsfaktor N-Myc kodiert, der klinisch bedeutendste Faktor für eine schlechte Prognose. Als Mitglied der onkogenen Myc-Familie induziert N-Myc die Expression von Genen, die in vielen biologischen Prozessen wie Metabolismus, Zellzyklusprogression, Zellwachstum und Apoptose eine wichtige Rolle spielen. Die Deregulation der MYCN-Expression führt zu einem charakteristischen Genexpressionsprofil und einem aggressiven Phenotyp in den Tumorzellen. 

In normalen neuronalen Vorläuferzellen wird N-Myc gewöhnlich sehr schnell proteasomal abgebaut. Während der Mitose wird N-Myc an Serin 62 phosphoryliert. Diese Phosphorylierung dient als Erkennungssignal für die Kinase GSK3β, die die Phosphorylierung an Threonin 58 katalysiert. Das Phosphodegron wird von Fbxw7, einer Komponente des E3-Ubiquitinligase-Komplex SCFFbxw7, erkannt. Die anschließende Ubiquitinierung  induziert den proteasomalen Abbau des Proteins. Die Reduktion der N-Myc–Proteinlevel ermöglicht den neuronalen Vorläuferzellen den Austritt aus dem Zellzyklus und führt zu einer terminalen Differenzierung. 

In einem shRNA Screen konnte AURKA als essentielles Gen für die Proliferation MYCN-amplifizierter Neuroblastomzellen identifiziert werden. Eine Aurora-A–Depletion hatte jedoch keinen Einfluss auf das Wachstum nicht-amplifizierter Zellen.
Während dieser Doktorarbeit konnte gezeigt werden, dass Aurora-A speziell den Fbxw7-vermittelten Abbau verhindert und dadurch N-Myc stabilisiert. Für die Stabilisierung ist zwar die Interaktion der beiden Proteine von entscheidender Bedeutung, überraschenderweise spielt die Kinaseaktivität von Aurora-A jedoch keine Rolle. 
Zwei spezifische Aurora-A–Inhibitoren, MLN8054 und MLN8237, sind allerdings in der Lage, nicht nur die Kinaseaktivität zu hemmen, sondern auch die N-Myc-Proteinlevel zu reduzieren. Beide Moleküle induzieren eine Konformationsänderung in der Kinasedomäne von Aurora-A. Diese ungewöhnliche strukturelle Veränderung hat zur Folge, dass der N-Myc/Aurora-A–Komplex dissoziiert und N-Myc mit Hilfe von Fbxw7 proteasomal abgebaut werden kann. In MYCN-amplifizierten Zellen führt diese Reduktion an N-Myc zu einem Zellzyklusarrest in der G1-Phase. Die in vitro Daten konnten in einem transgenen Maus-Modell für das MYCN-amplifizierte Neuroblastom bestätigt werden. Die Behandlung mit MLN8054 und MLN8237 führte in den Tumoren ebenfalls zu einer N-Myc-Reduktion. Darüber hinaus konnte ein prozentualer Anstieg an differenzierten Zellen, die vollständige Tumorregression in der Mehrzahl der Neuroblastome und eine gesteigerte Lebenserwartung beobachtet werden. 
Insgesamt zeigen die in vitro und in vivo Daten, dass die spezifischen Aurora-A–Inhibitoren ein hohes therapeutisches Potential gegen das MYCN-amplifizierte Neuroblastom besitzen.
N2  - Amplification of MYCN, encoding the transcription factor N-Myc, is one of the strongest clinical predictors of poor prognosis in neuroblastoma. As a member of the oncogenic Myc family, N-Myc activates genes that are involved in several biological processes like metabolism, cell cycle progression, cell growth and apoptosis. Deregulation of MYCN expression leads to a distinct gene expression profile and an aggressive phenotype in neuroblastoma cells.

In normal neuronal progenitor cells, N-Myc is rapidly degraded by the ubiquitin-proteasome system. N-Myc degradation is controlled by two phospho-sites. During mitosis, Cyclin B/Cdk1 phosphorylates N-Myc at serine 62, which primes the protein for a second phosphorylation at threonine 58 via GSK3β. This phospho-degron provides a recognition site for Fbxw7, an F-box protein of the E3-Ligase complex SCFFbxw7, leading to destabilisation of the N-Myc protein. Mitotic degradation of the N-Myc protein allows progenitor cells to exit the cell cycle and enables terminal differentiation.

Our group had previously identified AURKA as a gene that is required for cell growth in MYCN-amplified neuroblastoma cells but not essential for cells lacking MYCN. Here, we show that Aurora-A counteracts the Fbxw7-mediated degradation, and that the interaction between Aurora-A and N-Myc is cruical for N-Myc stabilization. Surprisingly, Aurora-A stabilizes the transcription factor in a kinase-independent manner. Interestingly, two Aurora-A-Inhibitors, MLN8054 and MLN8237, inhibit the kinase activity but also destabilize the N-Myc protein. These inhibitors induce an unusual conformation of the kinase domain and resulting in the dissociation of the N-Myc/Aurora-A complex. We demonstrate that the disruption of the complex promotes Fbxw7-mediated degradation of N-Myc. Inhibitor treatment in neuroblastoma cells leads to a cell cycle arrest in G1-phase. In a transgenic mouse model of MYCN-driven neuroblastoma, treatment causes downregulation of N-Myc protein levels, differentiation of the tumor cells and complete tumor regression in the majority of tumors. Consistent with the tumor reduction, treatment with MLN8054 and MLN8234 results in an extension of survival of the transgenic mice. Collectively, these results demonstrate that the Aurora-A–Inhibitors MLN8054 and MLN8237 are potential therapeutics against MYCN-amplified Neuroblastoma.
KW  - N-Myc
KW  - Neuroblastoma
KW  - Therapie
KW  - Neuroblastom
KW  - MYCN-amplified
KW  - Therapy
KW  - Aurora-A
Y1  - 2015
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-135951
ER  -