TY - THES A1 - Nürnberg, Sebastian T1 - Invasive \(Haemophilus\) \(influenzae\)-Isolate in Deutschland: Methodenvalidierung des VITEK MS IVD MALDI-TOF-MS und Untersuchung von Resistenzen gegen Imipenem und Cefotaxim T1 - Invasive \(Haemophilus\) \(influenzae\) Isolates in Germany: Method Validation of the VITEK MS IVD MALDI-TOF-MS and Investigation of Imipenem and Cefotaxime Resistance N2 - Die Inzidenz invasiver H. influenzae-Infektionen in Deutschland steigt seit Jahren an. Die akkurate Identifizierung und Resistenztestung dieses Erregers sind von großer klinischer und epidemiologischer Bedeutung. Daher wurden im Rahmen der vorliegenden Promotionsarbeit umfangreiche Untersuchungen zur Diagnostik und zur Epidemiologie von Antibiotikaresistenzen bei H. influenzae durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass die in der Routinediagnostik mittlerweile weit verbreitete MALDI-TOF-MS-Diagnostik durch das VITEK MS IVD nur eingeschränkt zur sicheren Unterscheidung von H. influenzae und H. haemolyticus einsetzbar ist. H. influenzae-Isolate erkannte das System mit einer Genauigkeit von 100 %. Bei H. haemolyticus-Isolaten wurden dagegen 42 % der untersuchten Stämme fälschlicherweise als H. influenzae erkannt. Dieser Fragestellung wurde mit der bisher umfangreichsten molekularbiologisch charakterisierten Studienpopulation beider Bakterienspezies nachgegangen. Die kalkulierte antibiotische Therapie einer Sepsis oder Meningitis erfolgt häufig mit Carbapenemen, die leitliniengerechte Therapie invasiver H. influenzae-Infektionen mit Drittgenerations-Cephalosporinen. Imipenem und Cefotaxim gehören zu den Hauptvertretern dieser Gruppen. Bezüglich der Antibiotikaresistenztestung wurde erstmalig für H. influenzae herausgefunden, dass die routinemäßig verwendete Gradientenagardiffusion (GAD) bei der Testung von Cefotaxim im Vergleich zum Goldstandard Bouillon-Mikrodilution gleichwertig und bei Imipenem sogar sensitiver in der Detektion von Heteroresistenzen ist. Die Epidemiologie dieser Resistenzen wurde in dieser Arbeit erstmalig für Deutschland systematisch erfasst, indem alle verfügbaren invasiven Isolate gemeldeter H. influenzae-Infektionen der Jahre 2016 (Imipenem) beziehungsweise 2016-2019 (Cefotaxim) untersucht wurden. Es wurde eine hohe Prävalenz einer Imipenem-Resistenz von 13,5 % festgestellt. Die Prävalenz einer Cefotaxim-Resistenz lag bei 0,9 %. Zur molekularen Typisierung wurde bei den Imipenem-resistenten Isolaten eine Multilocus-Sequenztypisierung, bei den Cefotaxim-resistenten Stämmen eine Sequenzierung des vollständigen Genoms durchgeführt. Hierbei wurde eine hohe genetische Diversität der Stämme festgestellt, was die Schlussfolgerung zulässt, dass resistente Mutanten sporadisch entstehen. Die Untersuchung möglicher spatio-temporaler Cluster führte zum Nachweis einer sehr selten vorkommenden Übertragung eines Imipenem-resistenten Stamms. Durch die Sequenzierung von Resistenzgenen wurde die Epidemiologie und Relevanz bekannter Aminosäuresubstitutionen beleuchtet. Unter anderem wurde für die PBP3-Substitutionen L389F und Y557H eine hochsignifikante Korrelation mit dem Auftreten von Cefotaxim-Resistenzen nachgewiesen. Die gewonnenen Genomdaten bieten die Grundlage für die Forschung an weiteren Antibiotikaresistenzdeterminanten von H. influenzae. N2 - Haemophilus influenzae is a fastidious, facultative anaerobic, Gram-negative bacillus that colonizes the respiratory tract and can cause respiratory and invasive infection such as meningitis and sepsis. Invasive H. influenzae infections are potentially life-threatening and incidence rates have been increasing for years. Therefore, fast and accurate diagnostics, reliable testing of antibiotic resistance and a successful antibiotic treatment is of great importance. Therefore, the objective of the first part of this thesis was to evaluate the diagnostic and discriminative potential of the MALDI-TOF-MS system VITEK® MS regarding H. influenzae and H. haemolyticus. H. influenzae can cause invasive infections, whereas H. haemolyticus is mostly apathogenic. The system showed excellent accuracy for the identification of H. influenzae isolates, as 100 % of the 236 isolates were correctly identified. When testing 50 H. haemolyticus strains, however, the system showed significant limitations, since 42 % of these strains were misidentified as H. influenzae. According to the current German guidelines for the treatment of sepsis and meningitis, treatment of invasive H. influenzae infections is carried out using carbapenems, such as imipenem, or third-generation cephalosporins, such as cefotaxime. Therefore, the prevalence of antibiotic resistances to these substances was investigated and possible resistance mechanisms were examined. The two antibiotic susceptibility testing methods Gradient agar diffusion (GAD) and broth microdilution (BMD) were compared. As a result, for the determination of the cefotaxime MIC, the two methods showed an excellent correlation, whereas for imipenem there were significant differences in the measured MIC values. Since strains tested by GAD often showed double or fuzzy inhibition zones, heteroresistances may be more apparent using this method and GAD may be more sensitive at detecting imipenem resistance. The prevalence of imipenem resistance was determined for the year 2016. The analysis of 474 different invasive isolates showed a high prevalence of 5.5 %. If including all resistant isolates according to GAD, the prevalence would be even as high as 13.5 %. MLST was performed on all isolates to investigate the genetic relationship. As a result, however, some sequence types were observed more frequently, it revealed a significant diversity. Both the analysis of ftsI and acrR showed previously described amino acid substitutions. Cefotaxime resistance was investigated for all 2432 invasive H. influenzae for the years 2016-2019. The low prevalence of 0.9 % shows that cefotaxime is still well suited for the treatment of invasive H. influenzae infections. For the investigation of the genetic relationship and possible causes of cefotaxime resistance whole genome sequencing (WGS) was performed on all resistant isolates. The strains showed high genetic diversity and the geographic analysis also showed that the resistant strains were evenly spread throughout the population in Germany. This led to the conclusion that cefotaxime resistance is more likely caused by sporadic mutation events rather than by specific clones spreading in certain areas. The analysis of the ftsI gene showed that the amino acid substitutions L389F and Y557H are significantly associated with elevated cefotaxime MICs. This dissertation provides comprehensive data regarding diagnostics, antimicrobial susceptibility testing and the epidemiology of antibiotic resistances of invasive H. influenzae. It could be shown that the VITEK MS IVD, although established in the routine diagnostics, can only be used to a limited extent for reliably differentiating H. influenzae and H. haemolyticus isolates. Regarding antibiotic susceptibility testing, it was found that GAD showed similar results compared to the gold standard BMD when testing cefotaxime. When testing imipenem, this method was even more sensitive in detecting heteroresistances compared to the gold standard. For the first time, the epidemiology of antibiotic resistance against cefotaxime and imipenem was carried out using a large set of precisely defined invasive H. influenzae isolates to obtain representative data for the prevalence of imipenem and cefotaxime resistance in Germany. By investigating amino acid substitutions in the ftsI and acrR gene the epidemiology and relevance of these substitutions could be shown. A well-founded statement on the relationship of the resistant strains could be made using the state-of-the-art typing methods MLST and whole genome sequencing. The genome data also offers the possibility of examining other genes of these strains in more detail. KW - Haemophilus influenzae KW - MALDI-MS KW - Antibiotikum KW - Cefotaxim KW - Imipenem KW - Haemophilus haemolyticus KW - MALDI-TOF-MS KW - Antibiotikaresistenzen Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-345067 ER - TY - THES A1 - Dette, Katharina Gerda T1 - Wirkung der Antibiotika Doxycyclin und Cefotaxim auf die MMP-Expression, sowie Proliferation, Adhäsion, Migration und Invasion bei Glioblastomzelllinien T1 - The effect of the antibiotics doxycycline and cefotaxime on MMP-expression, proliferation, adhesion, migration and invasion on glioblastoma cells N2 - Das Glioblastom ist der häufigste primäre maligne Hirntomor. Es zeichnet sich durch ein besonders aggessives und invasives Wachstumsverhalten aus. So konnte bis heute trotz moderner Diagnostik und Entwicklung neuer Behandlungsstrategien bestehend aus Operation, Radiatio und Chemotherapie mit Temozolamid die mittlere Überlebenszeit von 14.6 Monaten nicht überschritten werden. Matrixmetalloproteinasen sind zinkabhängige Endopeptidasen, die in der Lage sind die Extrazellulärmatrix zu degradieren, die Basalmembran zu durchbrechen, und somit Migration, Invasion, und Neovaskularisierung von Tumoren zu erleichtern. In zahlreichen Tumoren, so auch im Glioblastom, konnte eine Überexpression von MMPs, besonders von MMP2 und MMP9, nachgewiesen werden. Verschiedene Substanzen sind in der Lage, auf unterschiedlichen Ebenen die MMP-Synthese zu hemmen. Vor allem Doxycyclin, ein Antibiotikum aus der Gruppe der Tetracycline, sowie COL-3, ein chemisch modifiziertes Tetracyclinderivat, wurden an vielen Tumorentitäten in präklinischen und klinischen Studien erfolgreich eingesetzt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden 2 Antibiotika, Doxycyclin und Cefotaxim, auf ihre Wirkung auf 4 Gliomzelllinien, C6, U251, U373 und GaMG, sowie 4 Primärzellen, 2406, 2418, 2421 und 2464, untersucht. Sowohl Doxycyclin, als auch Cefotaxim hemmen teilweise die Expression von MMP2 und MMP9, was durch eine semiquantitative PCR nachgewiesen wurde; die Expression von TIMP1 bleibt weitgehend unverändert. Auch auf Proteinebene konnte mittels Immunhistochemie ein Rückgang von MMP2 und MMP9 bei den meisten Zelllinien und Primärzellen unter Behandlung mit den Antibiotika beobachtet werden. Außerdem konnten Veränderungen im Wachstunsverhalten der Zellen in der Zellkultur verzeichnet werden, wahrscheinlich durch Inhibition der MMPs bedingt. Bei allen Zelllinien und allen Primärzellen wurde eine Abnahme der Proliferation im MTT-Assay, eine Zunahme der Adhäsion im Amidoblackassay, eine Abnahme der Migration im Migrationsassay, und eine Abnahme der Invasion im 3-D-Kollagengel-Assay beobachtet werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit bestätigten die Resultate anderer Arbeitsgruppen mit Doxycyclin an anderen Tumoren, wie dem Prostata-Ca. Der deutliche Einfluss des Doxycyclins auf grundlegende Zelleigenschaften, wie z.B. dem Migrations-, Proliferations- und Invasionsverhalten, erfordert einen kritischen Umgang mit dem Tet-On/Off Systems zur Genregulation, insbesondere dann, wenn funktionelle Untersuchungen Teil der Versuchszielsetzung sind. N2 - The glioblastoma multiforme ist the most common primary malignant brain tumor. It is characterized by a very aggressive and invasive growth. Despite modern diagnostic modalities and the development of new treatment strategies including operation, radiation and chemotherapy with temozolamide, the median survival did not exceed 14,6 months. Matrixmetalloproteinases are zinc-dependent endopeptidases capable of degrading the extracellular matrix, penetrating the basement membrane, and so facilitating migration, invasion and neovascularisation of tumors. In numerous tumors, as well as in glioblastomas, an overexpression of MMPs, especially of MMP2 and MMP9, was demonstrated. Different detergents are able to inhibit the synthesis of MMPs. Doxycycline, a tetracyclic anticiotic, and COL-3, a non-antimicrobial, chemically modified tetracycline, were successfully examined in many tumor entities in preclinical and clinical studies. In this study we investigated the effect of two antibiotics, doxycycline and cefotaxime, on four glioblastoma celllines (C6, U251, U373, GaMG) and four primary cultures (2406, 2418, 2421, 2464). Both, doxycycline and cefotaxime, partially blocked the expression of MMP2 and MMP9, shown by semiquantitative PCR, expression of TIMP1 was unchanged. In immunhistochemistry lower expression levels of MMP2- and MMP9-protein were displayed by treated cells. Furthermore changes in cell growth characteristics in cell culture were detected, probably caused by inhibition of MMPs. In all cell lines and primary cultures the proliferative activity of treated cells was decreased, shown in MTT-Assay. Adhesion of treated cells was increased, and 3-D-invasion and migration were reduced. The results of this study support similar data in other tumor entities and warrant further investigation of the clinical potential of CMT in patients with gliomatous disease. The remarkable influence of doxycycline on cell characteristics, like migration, proliferation and invasion, requires a critical handling with the tet-on/off-system for gene regulation, especially when functional investigation is part of the trial. KW - Doxycyclin KW - Cefotaxim KW - Glioblastom KW - Doxycyclin KW - Cefotaxim KW - Matrixmetalloproteinasen KW - Glioblastoma multiforme KW - MMP KW - MMP KW - doxycycline KW - cefotaxime KW - glioma Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-25503 ER -