TY  - THES
A1  - Stolzenberger, Sascha
T1  - Spezifische Hemmung der allergieassoziierten Interleukin-4 Signaltransduktion
N2  - Das Cytokin Interleukin-4 (IL-4) ist ein essentieller Faktor bei der Entstehung von Sofort-Typ Allergien. Die Bindung von IL-4 an seinen Rezeptor und die anschließende Phosphorylierung des IL-4 aktivierten Transkriptionsfaktors Stat6 ist ein Schlüsselereignis bei der allergischen Immunantwort. In der vorliegenden Arbeit werden Ergebnisse zur Hemmung der Stat6 vermittelten Signaltransduktion des IL-4 Rezeptors vorgestellt. Dazu wurde ein Vektorsystem etabliert, bei dem ein von dem Drosophila-Transkriptionsfaktor Antennapedia abgeleitetes 16 AS langes Peptid benutzt wird. Dieses Antennapediapeptid kann Plasmamembranen lebender Zellen energie- und rezeptorunabhängig durchqueren und dabei andere hydrophile Moleküle mittransportieren. Stat6 bindet über eine SH2 Domäne an phosphorylierte Reste von IL4Ra und bildet, nachdem es selbst phosphoryliert ist, mit anderen Stat6-Molekülen aktive Dimere. Ein aus der Stat6-Bindestelle des IL-4Ra abgeleitetes phosphoryliertes Peptid (Stat6BP) wurde mit Hilfe des Antennapediapeptids in verschiedene humane und murine Zellinien transportiert. Für Stat6BP konnte mit Hilfe von spezifischer Immunpräzipitation und Western-Blot gezeigt werden, dass es IL-4 induzierte Phosphorylierung und Aktivierung von Stat6 transient hemmen kann. Durch zusätzliche Applikation des Tyrosinphosphataseinhibitors Natriumpervanadat gelang es, die hemmende Wirkung von Stat6BP zu verlängern. Unter gleichen Bedingungen konnte auch gezeigt werden, dass Stat6BP spezifisch die Aktivierung von Stat6 hemmt, da die durch IL-4 oder IL-3 induzierte Phosphorylierung des eng verwandten Stat5 völlig unbeeinträchtigt bleibt. Ferner wurde durch das Peptid die Expression eines Stat6 kontrollierten Reportergens gehemmt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde außerdem die Rolle der Src-Typ Kinasen p56lck und p59fyn in der IL-4 Signaltransduktion in unterschiedlichen T-Zellinien untersucht. Es zeigte sich, dass die Aktivierung der beide Kinasen stark von der getesteten Zellinie abhängt. In einigen T-Zellinien aktiviert IL-4 eher p56lck, in anderen eher p59fyn.
N2  - Interleukin-4 (IL-4) is the major factor in the development of allergic diseases like hay fever or asthma. The most important cytoplasmic event following stimulation with IL-4 is the activation of the transcription factor Stat6 (signal transducer and activator of transcription 6). Stat6 binds via a single SH2 domain first to tyrosine-phosphorylated motifs in the IL-4Ra-chain, and then to another Stat6 molecule, which results in the formation of active dimers. Since Stat6 is exclusively used by the IL-4 receptor, it is a promising approach to specifically disrupt IL-4 signal- transduction by inhibiting Stat6 activation. A vector system was established for the delivery of hydrophilic agents into living cells. To this purpose, a 16 amino acid membrane-permeable peptide derived from the Drosophila transcription factor Antennapedia was used. The Antennapedia peptide has been shown to internalize into living cell in a receptor- and energy-independent manner. In this thesis it is shown that a peptide derived from the Stat6-binding region of IL-4Ra (Stat6BP) is an effective inhibitor when it is delivered into cells by coupling with the Antennapedia peptide. Stat6BP completely inhibited IL-4 dependent phosphorylation of Stat6 in different human and murine cell lines, while IL-3 and IL-4 dependent phosphorylation of Stat5 was not affected. The inhibitory effect of Stat6BP was transient, but could be prolonged by treating the cells with the phospatase inhibitor sodium pervanadate. Transcription from a reporter gene construct with a Stat6-dependent promoter was inhibited by Stat6BP as well, indicating that the peptide is a suitable inhibitor for cellular responses downstream from Stat6 phosphorylation. Another aim of this study was to investigate the role of the src-kinases p56lck and p59fyn in IL-4 signaltransduction. The results indicate, that the activation of both kinases is celline dependent. In some T-cellines p56lck was activated dominantly, in others p59fyn.
KW  - Interleukin 4
KW  - Allergie
KW  - Signaltransduktion
KW  - Molekularbiologie
KW  - IL-4
KW  - Interleukin-4
KW  - Allergie
KW  - Peptide
KW  - STAT6
KW  - Signaltransduktion
KW  - IL-4
KW  - Interleukin-4
KW  - Allergy
KW  - Peptid
KW  - Stat6
KW  - Signaltransduction
Y1  - 2000
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-2375
ER  - 
TY  - THES
A1  - Gross, Tim Philipp
T1  - Transkriptionelle Regulation des CD23a-Promotors in Zellen chronischer lymphatischer Leukämien vom B-Zelltyp
T1  - Transcriptional regulation of the CD23a-Promotor in cells of B-cell-type chronic lymphoid leukemias
N2  - Die Expression und Regulation des Gens für den niedrig affinen Immunglobulin E-Rezeptor, von welchem beim Menschen zwei Isoformen existieren, unterscheidet sich deutlich zwischen B-Lymphozyten der chronisch lymphatischen Leukämie und normalen B-Zellen. Eine Untersuchung auf Promotorebene erscheint daher interessant; da der Promotor der Isoform b schon relativ gut charakterisiert ist, wurde in dieser Arbeit der CD23a-Core-Promotor näher betrachtet. Ein besonderes Augenmerk galt dabei putativen Bindungsstellen für STAT6. Das Bindungsverhalten von Transkriptionsfaktoren an Promotor-DNA wurde mit Gel-Retardierungsexperimenten (EMSA) untersucht. Hierzu wurden CD23a-Core-Promotor-Oligonukleotide zusammen mit Kernproteinextrakten aus Stimulationsansätzen von B-CLL- und normalen B-Zellen mit IL-4, IFN-g und PMA genutzt. Die EMSA-Experimente zeigten trotz unterschiedlicher Stimulationsansätze ein sich wiederholendes Bandenmuster, sodass die DNA-Protein-Interaktion auf Core-Promotorebene keine ausreichende Erklärung für die differentielle Regulation der Genexpression lieferte. Allerdings zeigten analoge EMSA-Versuche mit Kernextrakten einer EBV-transformierten Zelllinie ein leicht verändertes Bandenmuster, was auf ein verändertes Profil an Transkriptionsfaktoren am CD23a-Core-Promotor nach EBV-Transformation hindeuten kann. Eine weitere Analyse der Core-Promotorregion mittels der DNase-I-Footprint-Technik wurde durch die Klonierung geeigneter Vektoren und Etablierung einer Positivkontrolle vorbereitet. Da IL-4 den Hauptregulator auch der CD23a-Expression darstellt, war ein zentraler Teil der Arbeit die Charakterisierung von STAT6-Bindungsstellen im CD23a-Core-Promotor. Durch Sequenzanalyse wurden 2 putative STAT6-Bindungsstellen identifiziert. Mit Hilfe von Kompetitionsexperimenten konnte für eine der beiden Stellen (Nukleotidsequenz TAC CTGA GAA, Position 77-86 im CD23a-Core-Promotor) eine STAT6-Bindungsfähigkeit nachgewiesen werden; diese Bindungsstelle zeigte im Vergleich zu ihrem schon bekannten Gegenpart im CD23b-Promotor ein etwas schwächeres Bindungsvermögen für STAT6.Entscheidend für die Regulation der CD23-Expression sind wahrscheinlich das Zusammenspiel von STAT6 mit anderen Transkriptionsfaktoren wie Krox20 und NF-kB sowie alternative Signaltransduktionswege; auch Proto-Onkogene wie bcl-6 und Notch2 sind bei der Expression von CD23 von Bedeutung. Deren Rolle für die Pathogenese der B-CLL muss noch untersucht werden.
N2  - The expression and regulation of the gene of the low-affinity immunoglobulin E receptor, of which there are two isoforms in human beings, is clearly different between B-cells in chronic lymphoid leukemia and normal B-cells. An examination of the promotor seems interesting; as the isoform-b’s promotor is already quite well characterized, in this work the CD23a-core-promotor was further examined. Special attention was turned on putative binding sites of STAT6. The binding of transcription factors to promotor-DNA was examined by electro mobility shift assays (EMSA). This was done by using CD23a-core-promotor oligonucleotides with nuclear extracts from stimulation assays of B-CLL and normal B-cells with IL-4, IFN-g and PMA. The EMSA-experiments showed in spite of different stimulation assays an equal band-pattern; thus the DNA-protein-interaction on the core-promotor level does not sufficiently explain the differential regulation of the gene expression. However, analogous EMSA-experiments with nuclear extracts of an EBV-transformed cell-line showed a slightly different band-pattern, which may be due to a different spectrum of transcription factors on the CD23a-core-promotor after EBV-transformation. A further analysis of the core-promotor was prepared by cloning appropriate vectors and establishing a positive control. As IL-4 is the main regulator of CD23a-expression, a central part of this work was the characterization of STAT6-binding-sites in the CD23a-core-promotor. 2 putative binding sites were identified by sequence-analysis. Competition experiments showed a STAT6-binding ability of one of the two sites (nucleotide sequence TAC CTGA GAA, position 77-86 in the CD23a-core-promotor). This site showed a somewhat weaker binding ability of STAT6 compared with its known counterpart in the CD23b-promotor. Important for the regulation of the CD23-expression is probably the interplay of STAT6 and further transcription factors like Krox20 and NF-kB as well as alternative signal transduction pathways. Also proto-oncogenes like bcl-6 and Notch2 are important in CD23-expression. Their role in the pathogenesis of B-CLL has to be further examined.
KW  - CD23
KW  - CLL
KW  - Promotor
KW  - STAT6
KW  - B-Zellen
KW  - CD23
KW  - CLL
KW  - Promotor
KW  - STAT6
KW  - B-cells
Y1  - 2003
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-7344
ER  -