TY - THES A1 - Wölke, Stefan T1 - Funktionelle Analyse von bakteriellen W-xxx-E Rho GTPasen GEF Mimetika mittels Typ 3 Sekretionssystems von Yersinia enterocolitica T1 - Functional analysis of bacterial W-xxx-E Rho GTPase GEF mimetics using the type 3 secretion system of Yersinia enterocolotica N2 - Die zellulären Rho GTPasen kontrollieren und regulieren zentrale elementare Zellvorgänge wie Phagozytose, Migration und epitheliale Integrität. Aufgrund ihrer zentralen Stellung, interagiert eine Vielzahl von bakteriellen Cytotoxinen und Modulinen mit den Rho GTPasen und wirken so als Pathogenitätsfaktoren. Die zur W-xxx-E Familie gehörenden Effektoren IpgB1 und IpgB2 von Shigella und Map von E. coli (Pathotypen EHEC und EPEC) werden über ein Typ 3 Sekretionssystem (T3SS) in Wirtszellen injiziert und wirken als Rac1, RhoA bzw. Cdc42 GEF Mimetikum. In der vorliegenden Arbeit wurden die Effektor Funktionen von IpgB1 IpgB2 und Map mit Hilfe des Yersinia (Ysc)-T3SS untersucht, was zur Etablierung der „Yersinia-Toolbox“ führte. Damit können heterologe Effektoren isoliert im physiologischen Kontext der Erreger-Zell-Interaktion zellbiologisch untersucht werden unter Vermeidung von simultaner Injektion redundanter oder unbekannter Effektoren. Zur Etablierung der Yersinia-Toolbox wurden zunächst die Gene für die Rho GTPasen modulierenden Shigella Effektoren IpgB1 und IpgB2 sowie der E. coli (EHEC)-Effektor Map mit unterschiedlich langen Gensequenzen der N-terminalen Bereiche des Yersinia-Effektorproteins YopE fusioniert (Hybridproteine: YopEi-X:i = 18, 53 bzw. 138 Aminosäurereste, X = IpgB1, IpgB2 bzw. Map). In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass die Hybridproteine YopE53-X und YopE138-X (X=IpgB1, IpgB2, Map) in den Kulturüberstand sezerniert bzw. in Zielzellen injiziert wurden. In einem weiteren Schritt konnte die zellbiologische Aktivität der heterologen Proteine fluoreszenzmikroskopisch durch Aktinzytoskelettumlagerungen gezeigt werden. So wurden „Membrane Ruffles“ (Rac1-Aktivierung) durch YopE138-IpgB1, Stressfasern (RhoA-Aktivierung) durch E138-IpgB2 und „Mikrospikes“ (Cdc42-Aktivierung) durch YopE138-Map nachgewiesen. Invasionstudien zeigten, dass YopEi-IpgB1 (i = 53, 138) die Yersinia-Invasion induzierte, wohingegen YopEi-IpgB2 die Invasionsrate der Stämme WA (pT3SS, pEi-IpgB2) (i=53, 138) verglichen mit dem Stamm WA (pT3SS) reduziert war. Durch Kombination verschiedener Yersinia-Toolbox-Stämme konnte im Co-Infektionsmodell mit HeLa-Zellen gezeigt werden, dass (1) die YopE138-IpgB1 vermittelte Invasion durch YopE138-IpgB2 signifikant inhibiert werden kann, was auf eine antagonistische Wirkung zwischen IpgB1 und IpgB2 schließen lässt, dass (2) YopT ebenfalls die IpgB1 vermittelte Invasionsrate reduziert (inhibitorische Wirkung auf Rac1), und dass (3) YopE als GAP für RhoG/Rac1 (bevorzugt RhoG) praktisch nicht die IpgB1-vermittelte Invasion hemmt. Durch Klonierung der YopE138-IpgB1 und YopE138-IpgB2 kodierenden Fusionsgene in zwei kompatible Plasmidvektoren konnten die Hybridproteine simultan transloziert werden und die Co-Infektionsergebnisse bestätigt werden. In der Literatur ist beschrieben, dass die Ysc-Translokationspore YopB/YopD Rho-abhängig Membranporen-bedingte Zellschädigungen verursacht (LDH-Freisetzung, PI-Kernfärbung). Mit der Yersinia-Toolbox konnte mit dem Stamm WA (pT3SS) Zytoplasmamembranschädigung / Zytotoxizität nachgewiesen werden, nicht aber mit den Stämmen WA (pE138-X) X = IpgB1, IpgB2 oder Map. Co-Infektionen jedoch zeigen, dass vermehrt LDH bei der Infektion mit WA (pT3SS) + WA (pT3SS, pE138-IpgB1) detektiert wurde, wohingegen dieser Effekt von YopE138-IpgB2 in einer Co-Infektion von WA (pT3SS) + WA (pT3SS, pE138-IpgB2) inhibiert wurde. Auch hier wurde der Antagonismus zwischen IpgB1 und IpgB2 erneut sichtbar. Diese Befunde widersprechen publizierten Daten, die eine RhoA-Aktivierung/Aktinpolymerisierung mit verstärkter Porenbildung in einen Zusammenhang bringen. Rho GTPasen sind beteiligt an der Erhaltung der polarisierten Eipthelzellschichtintegrität über Adhäsionskomplexbildung. Mittels Infektion von polarisierten MDCK-Zellschichten mit verschiedenen Yersinia-Stämmen und Messung des transepithelialen elektrischen Widerstandes/Resistenz (TER) konnte gezeigt werden, dass die Ysc-T3SS vermittelte Injektion von YopE138-IpgB1 (Rac1-Aktivierung) oder YopE138-Map (Cdc42-Aktivierung) zur Abnahme der TER und damit Schädigung der Zellschichtintegrität führt, wogegen bei YopE138-IpgB2-Injektion der TER-Wert unverändert blieb. Um bakterielle Rho GTPasen-modulierende Effektorproteine detailliert untersuchen zu können und um die Rolle von Rho GTPasen im Mausinfektionsmodell mit Yersinia enterocolitica und Salmonellen zu bestimmen, wurden Mäuse mit deletierten Genen für RhoA, Rac1 bzw. Cdc42 in Makrophagen hergestellt. N2 - Phagocytosis, migration and regulation of epithelial integrity are central cellular aspects that are controlled by the cellular Rho GTPases. In this regard, Rac1, RhoA and Cdc42 have important regulatory roles mediating various cytoskeletal rearrangements in many cell types including epithelial cells as well as professional phagocytes. Because of the central role of the Rho GTPases in cellular integrity and function, bacterial cytotoxins and modulins targeting these cellular switches are very efficient pathogenicity factors. Recently, the T3SS effectors, IpgB1, IpgB2 of Shigella and Map of E. coli (pathotype EHEC/EPEC) were assembled in one protein family sharing the common motif W-xxx-E. Members of this protein family are described to act as GEF mimics for the cellular Rho GTPases. In this study the effector functions of IpgB1, IpgB2 and Map were analyzed with the Yersinia (Ysc)-T3SS which led to the development of the “Yersinia-Toolbox”. Yersinia enterocolitica is very suitable to be used as “T3SS-Toolbox” because (1) a plasmid solely carrying the DNA fragment encoding the Ysc-T3SS without T3SS-effectors is available, (2) in difference to Salmonella and E. coli (EPEC/EHECH) the Ysc-T3SS-effector genes of Yersinia are not localized on the chromosome and (3) heterologous proteins fused to the Ysc-T3SS-effector YopE are secreted and translocated into cells. This allows the analysis of single heterologous effectors without simultanous injection of other (unknown/redundant) T3SS-effectors in a physiological context during the interaction of Yersinia with cells. To develop the Yersinia-Toolbox, the genes of the GTPase modulating effectors IpgB1, IpgB2 of Shigella and Map of E. coli (EHEC) were fused to different long sections of the N-Terminus of the Yersinia-Ysc-T3SS-effector YopE (hybrid proteins: YopEi-X: i = 18, 53 or 138 amino acid residues, X = IpgB1, IpgB2 or Map). This study demonstrates the secretion to the culture supernatent and the injection into target cells of the hybrid proteins YopE53-X and YopE138-X (X = IpgB1, IpgB2 and Map). Furthermore, cell biologic activity was detected for the YopE-X hybrid proteins by fluorescence microscopy as membrane ruffles (Rac1 activation), stress fibres (RhoA activation) and micro spikes (Cdc42 activation) occurred after injection of YopE138-IpgB1,.YopE138-IpgB2 and YopE138-Map, in respective. Invasion studies showed that YopEi-IpgB1 (i = 53, 138) induced invasion of Yersinia, whereas YopEi-IpgB2 reduced invasion of the strains WA (pT3SS, pEi-IpgB2) (i = 53, 138) compared to the strain WA (pT3SS). Combination of different Yersinia-Toolbox strains in the co-infection model with HeLa cells showed that (1) YopE138-IpgB2 reduced the YopE138-IpgB1 induced invasion suggesting an antagonism between IpgB1 and IpgB2, (2) YopT also reduced the YopE138-IpgB1 induced invasion (inhibitory function on Rac1) and (3) that YopE as GAP for RhoG/Rac1 (predominantly RhoG) did not inhibit the YopE138-IpgB1 induced invasion. Because of the construction of two different compatible plasmids carrying the genes for either YopE138-IpgB1 or YopE138-IpgB2, simultanous translocation of the hybrid proteins of one single strain was possible. These studies confirmed the results of the co-infection studies. It has been reported that the Ysc translocation pore YopB/YopD induces Rho dependent membrane pores in cells which leads to cellular damage (LDH release, PI-staining of the nucleus). In this study cellular damage / cytotoxicity was detected after an infection of HeLa cells with the Yersinia-Toolbox strain WA (pT3SS). In contrast to that no cytotoxicity was detected after an infection of HeLa cells with the Yersinia-Toolbox strains WA (pT3SS, pE138-X) X = IpgB1, IpgB2 and Map. Additionally, co-infections with the strains WA (pT3SS) and WA (pT3SS, pE138-IpgB1) resulted in an increased LDH release whereas a co-infection with the strains WA (pT3SS) and WA (pT3SS, pE138-IpgB2) led to the decrease of LDH release compared to single infections with WA (pT3SS), again suggesting an antagonism between IpgB1 and IpgB2. These results are contrary to published data, which suggest a correlation between RhoA activation dependent actin polymerisation and pore formation. The cellular Rho GTPases are involved in the maintenance of epithelial integrity of polarized cells. Infections of polarized MDCK cell layers with different Yersinia-Toolbox strains resulted in a decrease of the transepithelial electric resistance (TER) indicating a damage of the epithelial integrity after injection of YopE138-IpgB1 or YopE138-Map. The TER value was not altered after injection of YopE138-IpgB2 indicating an intact epithelial integrity. To study bacterial Rho GTPase modulating proteins in more detail and to get a deeper insight to the role of Rho GTPases in the murine infection model with Yersinia enterocolitica and Salmonella, mice with gene deletions for RhoA, Rac1 or Cdc42 in macrophages were constructed. KW - Actin KW - Yersinia enterocolitica KW - Shigella flexneri KW - EHEC KW - CRE KW - Knockout KW - Guanosintriphosphatasen KW - T3SS KW - Rho GTPasen KW - GEF KW - GAP KW - Mimetika KW - Proteinsekretion KW - T3SS KW - Rho GTPases KW - GEF KW - GAP KW - Mimics Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-55010 N1 - die Arbeit wurde hauptsächlich am Max-von-Pettenkofer-Inst. der LMU München als externe Dissertation erstellt und vom Lehrstuhl für Mikrobiologie der Fakultät für Biologie an der Universität Würzburg betreut. ER - TY - THES A1 - Baumer, Yvonne T1 - Die Rolle und Mechanismen der GTPasen Rac 1 und Rho A in der Regulation der Endothelbarriere T1 - The role of Rho GTPases Rac 1 and Rho A in endothelial barrier function N2 - Endothelzellen kleiden als einschichtiger Zellverband das Innere der Blutgefäße aus und wirken als Barriere zwischen Blut und Interstitium. Entzündungen und Erkrankungen wie Lungenödem oder Arteriosklerose sind gekennzeichnet durch einen Zusammenbruch der Endothelbarriere. Erste Untersuchungen deuten auf eine bedeutende Rolle der GTPasen der Rho-Familie mit den Hauptvertretern Rho A, Rac 1 und Cdc42 als Regulatoren der Endothelbarriere hin. Bezüglich der Regulation der Endothelbarriereintegrität werden den GTPasen Rho A und Rac 1 meist antagonistische Funktionen zugeschrieben. In einem ersten Teil dieser Dissertation wurde daher die Funktion der Rho-GTPasen Rho A, Rac 1 und Cdc42 für die Endothelbarriere in verschiedenen Endothelien untersucht. Hierzu wurden drei mikrovaskuläre Endothelzelltypen verschiedenen Ursprungs sowie makrovaskuläre Endothelzellen der Pulmonalarterie mit GTPase-aktivierenden oder inaktivierenden bakteriellen Toxinen behandelt. Die Aktivierung von Rho A resultierte in allen Endothelzelltypen mit Ausnahme der mikrovaskulären myokardialen Endothelzellen in einem Zusammenbruch der Endothelbarriere. Die Aktivierung von Rac 1 und Cdc42 führte in allen Endothelzellarten zu einer Barrierestabilisierung. Darüber hinaus konnte in fast allen Endothelzelltypen durch pharmakologische Inhibition der Rho-Kinase eine Stabilisierung der Endothelbarriere induziert werden. Die Inaktivierung aller GTPasen sowie die alleinige Inaktivierung von Rac 1 führte zu einem kompletten Zusammenbruch der Endothelbarriere in vitro. Zudem ergaben in vivo-Experimente an perfundierten Rattenmesenterien eine gesteigerte Permeabilität nach Inaktivierung von Rho A, Rac 1 und Cdc42. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die cAMP-vermittelte Stabilisierung der Endothelbarriere genauer charakterisiert und dabei der Einfluss gesteigerter cAMP-Spiegel auf die Aktivität von Rho-GTPasen in humanen dermalen mikrovaskulären Endothelzellen untersucht. Hierbei wurde die cAMP-Konzentration zum einen durch den Einsatz einer Kombination aus dem Adenylatzyklase-Aktivator Forskolin und dem Phosphodiesterase 4-Inhibitor Rolipram und zum anderen durch das cAMP-Analogon 8-pCPT-2’-O-Me-cAMP (O-Me-cAMP) gesteigert. O-Me-cAMP stellt hierbei einen selektiven Aktivator des cAMP nachgeschalteten Epac/Rap 1-Signalweges dar, wohingegen Forskolin/Rolipram durch die generelle cAMP-Steigerung zusätzlich die durch Proteinkinase A (PKA) vermittelten Signalwege stimuliert. Messungen des transendothelialen elektrischen Widerstandes zeigten nach cAMP-Anstieg in beiden Fällen eine Barrierestabilisierung, die mit den Effekten einer Aktivierung von Rac 1 vergleichbar waren. Dies ging mit Veränderungen der Organisation und der Morphologie von Zell-Zell-Kontakten einher. Zusätzlich kam es nach cAMP-Steigerung zu einer gesteigerten Rac 1-Aktivierung ohne Beeinflussung der Rho A-Aktivität. Darüber hinaus zeigten Endothelzellen nach cAMP-Anstieg die Bildung eines corticalen Aktinrings und verminderte Stressfaserbildung, was typische Indizien einer Aktivierung von Rac 1 sind. Um die Rolle von Rac 1 näher zu untersuchen, wurden Rac 1-Inhibitionsstudien durchgeführt. Die pharmakologische Inhibition der Rac 1-Aktivität resultierte in einer verminderten Endothelbarriereintegrität. Für beide cAMP-steigernden Mediatoren kann nach Kombinationsstudien angenommen werden, dass die durch cAMP-Steigerung vermittelten barrierestabilisierenden Effekte durch Rac 1 vermittelt zu sein scheinen. Somit kann aus den Untersuchungen des zweiten Teils dieser Arbeit geschlussfolgert werden, dass cAMP eine gesteigerte Endothelbarrierefunktion sowohl über PKA- als auch über Epac/Rap 1-abhängige Rac 1-Aktivierung vermittelt. Um die Rolle der Rho-GTPasen und von cAMP während einer Barrieredestabilisierung zu untersuchen, wurde im dritten Teil Thrombin als barrieredestabilisierender physiologischer Mediator in humanen dermalen mikrovaskulären Endothelzellen genutzt. Thrombin-Gabe führte zu einem reversiblen Zusammenbruch der Endothelbarriere. Zu diesen Zeitpunkten kam es zu einer signifikanten Inhibition von Rac 1 und einer deutlichen Aktivierung von Rho A. Erst nach 15 min fielen die gesamtzellulären cAMP-Spiegel ab. Innerhalb von 60 min erholte sich die Endothelbarriere und Rac 1- bzw. Rho A-Aktivitäten sowie der cAMP-Spiegel erreichten wieder ihr Ausgangsniveau. Vorinkubation der Endothelzellen mit beiden cAMP-steigernden Mediatoren inhibierte den Thrombin-induzierten Barriere-zusammenbruch ebenso wie die Thrombin-vermittelten Veränderungen der Rac 1- und Rho A-Aktivitäten. Auch in diesem Zusammenhang durchgeführte Rac 1-Inhibitionsstudien deuten darauf hin, dass die Hemmung der Thrombineffekte durch cAMP-Steigerung u.a. durch Aktivierung von Rac 1 vermittelt wird. N2 - Endothelial cells build a monolayer coating the inner surface of blood vessels and thereby form a dynamic barrier between plasma and interstitial space. Impaired endothelial barrier function can result in vascular diseases such as edema, atherosclerosis and inflammation. Small GTPases of the Rho family such as Rho A, Rac 1 and Cdc42 are well known regulators of endothelial barrier integrity. It is generally believed that Rho A and Rac 1 regulate endothelial barrier functions in antagonistic manner. According to this concept, Rho A destabilizes barrier integrity whereas Rac 1 enhances endothelial barrier properties. In a first step we investigated the role of Rho A, Rac 1 and Cdc42 in endothelial barrier regulation in four different types of endothelial cells. Microvascular endothelial cells of different origin (myocardium, mesentery and dermis) and macrovascular endothelial cells from pulmonary artery were treated with bacterial toxins to specifically activate or inactivate Rho GTPases. Effects on endothelial barrier functions were revealed by immunfluorescence microscopy, measurement of transendothelial electrical resistance and FITC-dextran flux as well as by quantification of VE-cadherin-mediated adhesion using laser tweezers. Activation of Rho A resulted in break-down of endothelial barrier functions in all endothelial cell types except microvascular myocardial endothelial cells. Activation of Rac 1 and Cdc42 as well as pharmacological inhibition of Rho kinase stabilized endothelial barrier function in all endothelial cell types. Moreover, inactivation of all three GTPases as well as inactivation of Rac 1 alone resulted in endothelial barrier-breakdown in all endothelial cell types. From these data we conclude that Rac 1 is a highly important regulator required for maintenance of endothelial barrier function. In the second part of the study, we characterized the role of Rho GTPases in cAMP-mediated barrier stabilizing effects in microvascular endothelium. Therefore, we analyzed cAMP-induced effects on transendothelial electrical resistance, Rho GTPase activity and cell junction morphology in human dermal microvascular endothelial cells. To increase intracellular cAMP levels we used the cAMP-analogue 8-pCPT-2’-O-Me-cAMP (O-Me-cAMP) or combined treatment with adenylat cyclase-stimulating agent forskolin together with phosphodiesterase 4 inhibitor rolipram. In this approach O-Me-cAMP is used to selectively activate the Epac/Rap 1 pathway whereas forskolin/rolipram-induced increase of cAMP triggers both protein kinase A (PKA)- and Epac/Rap 1-dependent mechanisms. Measurement of transendothelial electrical resistance revealed barrier stabilizing effects of both Epac/Rap 1 and PKA signaling pathways. Barrier stabilization was accompanied by changes in cell junction morphology and both O-Me-cAMP and forskolin/rolipram treatment strongly activated Rac 1 without affecting Rho A activity. Moreover, endothelial cells displayed changes in actin distribution and cortactin localization typical for activation of Rac 1. To investigate the role of Rac 1 activation in cAMP-mediated barrier stabilization we performed Rac 1 inhibition studies. Pharmacological inhibition of Rac 1 activity decreased transendothelial electrical resistance which was accompanied by formation of intercellular gaps. Under these conditions the efficacy of increased cAMP to stabilize endothelial barrier functions was reduced and O-Me-cAMP had no effect. This indicates that barrier-stabilizing effects of cAMP are at least in part mediated by Rac 1-dependent mechanisms which are induced via PKA and Epac/Rap 1 signaling. Next, to address the importance of cAMP and of Rac 1 under conditions of impaired endothelial barrier integrity we used the physiological permeability-increasing mediator thrombin. Thrombin induced a transient breakdown of endothelial barrier function accompanied by increased stress fiber and gap formation in human dermal microvascular endothelial cells. Rac 1 was significantly inactivated whereas Rho A was strongly activated 5 and 15 min after thrombin treatment. Additionally, cAMP levels were decreased. After 60 min Rac 1 and Rho A activity as well as cAMP levels reached baseline values and endothelial barrier function was restored. Increase of cAMP completely blocked endothelial barrier breakdown and largely prevented thrombin-mediated effects on Rac 1 and Rho A activity indicating that reduction of cAMP was the primary mechanism causing the thrombin response. When Rac 1 was inactivated in parallel, both O-Me-cAMP and forskolin/Rolipram were not effective to prevent thrombin-induced endothelial barrier breakdown. KW - Endothelbarriere Rho-GTPasen KW - Rac 1 KW - Rho A KW - Endothelbarriere KW - Rho-GTPasen KW - Rac 1 KW - Rho A KW - Endothel KW - endothelial barrier KW - Rho GTPases KW - Rho A KW - Rac 1 KW - thrombin Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-33471 ER -