TY - THES A1 - Cho, Seung-Hak T1 - Epidemiologische und molekulare Untersuchungen zur Biofilmbildung in Staphylococcus epidermidis und Staphylococcus aureus T1 - Epidemiological and molecular investigations of the biofilm formation in Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus aureus N2 - Staphylococcus aureus und Staphylococcus epidermidis gehören zu den häufigsten Erregern nosokomialer Infektionen bei immunsupprimierten Patienten. Gleichzeitig bilden diese Bakterien einen wesentlichen Teil der gesunden Hautflora des Menschen. Bisher ist wenig darüber bekannt, ob es Unterschiede in der genetischen Ausstattung zwischen klinischen und kommensalen Isolaten gibt und welche Faktoren zur Etablierung von Staphylokokken im Hospitalmilieu beitragen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, daß die Fähigkeit zur Biofilmbildung offensichtlich ein wesentliches Merkmal pathogener Staphylokokken ist. Die Expression dieses Virulenzfaktors ist dabei hochvariabel und hängt von der genetischen Ausstattung der Stämme mit dem für die Biofilmbildung verantwortlichen ica-Operon, bestimmten Umweltfaktoren und dem Einfluß von Insertionssequenzen ab. In einer epidemiologische Untersuchung wurde gezeigt, daß in S. epidermidis das ica-Operon häufiger in klinischen als in kommensalen Stämmen vorkommt. Der überwiegende Teil dieser ica-positiven Stämme bildete phänotypisch einen Biofilm aus. Im Unterschied dazu enthielten alle untersuchten S. aureus-Stämme, unabhängig von ihrer Herkunft, das vollständige ica-Gencluster, wobei jedoch keiner dieser Stämme unter Laborbedingungen einen Biofilm bildete. Durch subinhibitorischen Konzentrationen bestimmter Antibiotika bzw. durch Osmostress ließ sich die Biofilmbildung in 30 Prozent der S. aureus-Stämme induzieren. Ebenso konnte in ica-positiven S. epidermidis-Stämmen die Biofilmbildung dirch diese Umweltfaktoren stimuliert werden. Die Studie ergab auch, daß es einen Zusammenhang zwischen der Biofilmbildung, der Antibiotikaresistenz und dem Vorkommen der Insertionssequenz IS256 gibt. So war IS256 signifikant häufig in klinischen S. epidermidis und S. aureus-Stämmen nachweisbar, während es keinen Unterschied im Auftreten von IS257 zwischen klinischen und saprophytären Isolaten gab. Die IS256-positiven S. epidermidis-Stämme wiesen überdurchschnittlich oft das ica-Operon auf und waren gegen mindestens zwei Antibiotika gleichzeitig resistent. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß IS256 an der Phasenvariation der Biofilmbildung in vivo beteiligt ist. Bei einem klinischen S. epidermidis-Stamm, der von einem Patienten mit einer Katheter-assoziierten Harnwegsinfektion isoliert wurde, wurde die Insertion des Elementes im icaC-Gen nachgewiesen, was in einem Biofilm-negativen Phänotyp resultierte. Subkultivierung der Insertionsmutante führte nach wenigen Passagen zur Ausbildung eines Biofilms. Die Nukleotidsequenzierung ergab die vollständige Exzision von IS256 aus dem icaC-Gen einschließlich der duplizierten Zielsequenz von sieben Basenpaaren. Diese Daten stimmen vollständig mit den zuvor in einer in-vitro-Studie erhaltenenen Ergebnissen überein und sie zeigen, daß IS256 die Expression des ica-Operons offensichtlich auch in vivo während einer Infektion beeinflußt. Bei S. aureus konnte in dieser Arbeit ebenfalls eine Phasenvariation der Biofilmexpression nachgewiesen werden. Durch Mehrfachpassagen wurden aus ehemals Biofilm-negativen Einzelkolonien mehrere Biofilmproduzenten gewonnen, die auch wieder zum Biofilm-negativen Phänotyp revertieren konnten. Die DNA-Analyse mittels Pulsfeldgelelektrophorese zeigte, daß es in den varianten Stämmen zu größeren DNA-Rearrangements gekommen war, die neben der variablen Biofilmbildung auch mit Unterschieden in der Expression des alternativen Transkriptionsfaktors SigmaB einhergingen. Die Nukleotidsequenzierung des sigB-Systems ergab in den Varianten mehrere Punktmutationen in den SigB-Regulatorgenen rsbU und rsbW. Dies legt nahe, daß der SigB-Genlokus einer starken genetischen Variabilität unterliegt, die wiederum pleiotrope Effekte auf die Genexpression in S. aureus ausübt. Durch Northern-Blot-Analysen konnte allerdings gezeigt werden, daß die Biofilmbildung in den S. aureus-Varianten nicht mit der veränderten SigB-Expression in Zusammenhang steht. N2 - Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis belong to the most frequent causes of nosocomial infections in immunocompromised patients. These bacteria form an essential part of the healthy skin flora of human beings. Little is known, whether there are differences in the genetic equipment between clinical and commensal isolates and which factors contribute to the setup of staphylococci in the hospital environment. The results of the presented work show that the ability to form biofilms is an essential feature of pathogenic staphylococci. The expression of this virulence factor is highly variable and depends on the presence of the ica operon which is responsible for biofilm formation, specific environmental factors and the influence of insertion sequences. In an epidemiological investigation, it was shown that the ica operon in S. epidermidis is more often present in clinical strains than in commensal ones. The predominant part of these ica-positive strains formed phenotypically a biofilm. In contrast, all examined S. aureus contained, independent of their origin, the complete ica gene clusters, while, however, none of these strains formed a biofilm under laboratory conditions. Biofilm formation could be induced by subinhibitory concentrations of specific antibiotics or osmotic stress in 30 percent of the S. aureus strains. Also, biofilm formation could be stimulated in ica-positive S. epidermidis strains through these environmental factors. The study also revealed that there is an association between biofilm formation, antibiotic resistance and the occurrence of the insertion sequence IS256. Thus, IS256 was significantly more often detected in clinical S. epidermidis and S. aureus strains, while there was no difference in the occurrence of IS257 between clinical and saprophytic isolates. Most of the IS256-positive S. epidermidis strains carried the ica operon and were simultaneously resistant against at least two antibiotics. Furthermore, it was shown that IS256 is involved in phase variation of biofilm formation in vivo. In case of a clinical S. epidermidis strain that was isolated from a patient with a catheter-associated urinary tract infection, the insertion of the element in the icaC gene was detected resulting in a biofilm-negative phenotype. Subcultivation of the insertion mutant resulted in biofilm-forming variants after a few passages. Nucleotide sequencing indicated the complete excision of IS256 from the icaC gene including the duplicated target site sequence of seven base pairs. These data are in agreement with the results received in a recent in vitro study and show that IS256 has an influence on the ica-expression during an infection. In this study, phase variation of biofilm formation was also shown in S. aureus. After serial passages, several biofilm producers were derived from formerly biofilm-negative single colonies which could also revert to the biofilm-negative phenotype again. DNA analysis by pulsed-field gel electrophoresis showed that in the variants large DNA-rearrangements took place. In addition to the variable biofilm production, differences in the expression of the alternative transcription factor SigmaB were observed in the variants. Nucleotide sequencing of the sigB system indicated several point mutations in the SigB regulatory genes rsbU and rsbW of the variants. This implies that the SigB gene locus is subject to a strong genetic variability that results, in turn, in pleiotropic effects on gene expression in S. aureus. However, Northern blot analysis revealed that the biofilm formation in the S. aureus variants are not associated with the varying SigB expression. KW - Staphylococcus aureus KW - Staphylococcus epidermis KW - Biofilm KW - Molekulargenetik KW - Staphylokokken KW - nosokomiale Infektionen KW - Biofilmbildung KW - ica-Operon KW - Insertionssequenzen KW - Phasenvariation KW - Regulatorgene KW - staphylococci KW - nosocomial infections KW - biofilm formation KW - ica Operon KW - insertion sequences KW - phase variation KW - regulator genes Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1181296 ER - TY - THES A1 - Freytag, Andreas T1 - Adhärenz humanpathogener Staphylokokken auf orthopädischen Implantatmaterialien T1 - adherence of human pathogen staphylococci on orthopedic joint-prosthesis N2 - Die Anzahl an implantierten Gelenkendoprothesen hat in den letzten Jahrzehnten stark zugenommen. Mit ihr auch die Anzahl an Protheseninfektionen. Die Haupterreger sind Staphylokokken (>80%). Diese sind in vivo unempfindlich gegenüber Antibiotika und somit ist die einzige sinnvolle Therapie der Ausbau der infizierten Prothese, welcher lange und kostenspielige Krankenhausaufenthalte für den Patienten mit sich bringt. Der Grund für diese Resistenz der Bakterien liegt darin, dass sie zur Biofilmbildung fähig sind und sehr gut an Fremdkörper-Oberflächen adhärieren können. Welche Methode nun geeignet ist, die Adhärenz von Staphylokokken am besten unter klinisch relevanten Bedingungen zu untersuchen, ist zu prüfen. Das in der Arbeit entwickelte Modell ermöglicht eine semiquantitative Bestimmung der Adhärenz. Für die Versuche wurden Metallprüfkörper aus Titan und Kobalt-Chrom-Legierung verwendet. Zuvor wurden diese Metalle mit bestimmen Reinigungs- und Sterilisationsvorgängen gesäubert. Ein Teil der verwendeten Prüfkörper ist vor Beimpfung mit den Keimen durch Serumproteine bzw. Gewebsflüssigkeiten beschichtet worden, um das Anheftungsverhalten unter verschiedenen Bedingungen beurteilen zu können. Hierfür wurden Albumin, Kollagen Typ I und Typ II, Fibronektin und Fibrinogen verwendet. Sieben Titan-Prüfkörper sind in Schlieren (Schweiz) durch ein spezielles Verfahren mit PLL-g-PEG, einem Makromolekül welches die Adhäsion von Proteinen herabsetzt, beschichtet worden. Eine Auswirkung durch Infektionen sollte hierbei überprüft werden. Die Auswertung wurde unter REM-Betrachtung durchgeführt. Hierbei ist eine semiquantitative Abstufung der Adhärenzkraft von 1-5 getroffen worden. In den Ergebnissen zeigten die beiden verwendeten Metalle Titan und Kobalt-Chrom-Legierung keine wesentlichen Unterschiede in der gezeigten Adhärenz von Staphylokokken. Durch die Serumprotein- und Gewebsflüssigkeitsbeschichtung ließen sich Unterschiede unter verschiedenen Bedingungen feststellen. Fibronektin und Fibrinogen bewirken eine starke Zunahme an adhärenten Bakterienzellen. Kollagen Typ I und II zeigen eine leichte Adhärenzverstärkung und bewirken Biofilmbildung. Albuminbeschichtung reduziert die Anzahl adhärenter Staphylokokken. Die PLL-g-PEG Beschichtung löst starke Adhärenz und Biofilmbildung aus. Die hier angewandte Methode, kontaminierte Metallprüfkörper unter dem Rasterelektronenmikroskop zu betrachten, eignet sich um das Adhärenzverhalten von Bakterien zu beurteilen. Dabei lassen sich die Versuchsbedingungen auf vielfache Weise verändern. Verschiedene Metalle und andere Materialien können miteinander verglichen werden. Des Weiteren ist es möglich, unterschiedliche Proteinbeschichtungen vorzunehmen, um deren Einfluss auf die Adhärenz zu zeigen. Zusätzlich ist eine Durchführung der Versuche unter Bewegung möglich, was eine Annäherung an die Verhältnisse im menschlichen Körper bedeutet. Neben Staphylokokken könnten auch andere Bakterienspezies untersucht werden. In dieser Studie wird erstmals gezeigt, dass Kollagen eine Biofilmbildung bei Staphylokokken induziert. Dies bedarf weiterer Untersuchung, welcher Mechanismus hierfür verantwortlich ist. Die PLL-g-PEG Beschichtung hat auf Infektionen keine erfolgsversprechende Wirkung. Im Gegenteil, es kommt zu einer starken Besiedlung des Fremdmaterials. Albumin dagegen zeichnet sich durch eine Herabsetzung der Adhärenzstärke aus. Daraus könnte man therapeutischen Nutzen ziehen und Implantate vor Einbau mit Albumin beschichten. N2 - The number of orthopedic joint implantation has increased strongly within the last decades. With it also the number of implant infections. The main pathogenes are Staphylococci (> 80%). These are insensitive in vivo opposite antibiotics and therefore the only meaningful therapy is the removal of the infected artificial joint, which brings long and expensive hospital stays for the patients. On the one hand the reason for this resistance of the bacterias is biofilm formation and on the other hand the very well adherence on artifical surfaces. Which method is suitable now to examine the adherence of Staphylococci best under clinically relevant conditions has to be checked. The model developed in the work makes a semiquantitative determination of the adherence possible. For the tests metal test bodies of titanium and cobalt chrome are used. At first these metals were cleaned with special cleanings and sterilizations . A part of the used test bodies has been coated with serum proteins to judge the adherence under different conditions. Albumin, collagen type I and type II, fibronectin and fibrinogen were used for it. Seven titanium test bodies were coated in Schlieren (Switzerland) by a special method with PLL-g-PEG, a macro molecule, that reduces the adhesion of proteins. A consequence by infections should be checked at this. The evaluation was carried out under REM consideration. At it a semiquantitative layering of the adherence-power of 1-5 has been made. In the results the two used metals titanium and cobalt chrome alloying didn't show any essential differences in the shown adherence of Staphylococci. By the serum protein coatings differences could be stated under different conditions. Fibronectin and fibrinogen cause a strong increase to adherent bacterium cells. Collagen type I and II show low increase and cause biofilm formation. Albumin coating reduces the number of adherent bacterias. The PLL-g-PEG coating triggers strong adherence and biofilm formation. The method to look at contaminated metal test bodies under the REM used here is suitable to judge the adhesion behave of bacteria. At this the test conditions can be changed in a multiple way. Different metals and other materials can be compared with each other. Furthermore it is possible to carry out different protein coatings to show the influence on the adherence. An execution of the tests in addition is possible under movement, that approach towards the conditions in the human body. Also other bacterium species could be examined besides staphylococci. In this study it is shown for the first time that collagen induces a biofilm formation at staphylococci. This requires a further examination, which mechanism for it is responsible. The PLL-g-PEG coating doesn't have any success promising effect on infections. On the contrary, it comes to a strong settlement of the bacterias. Albumin however stands out due to a reduction of the adherence. A therapeutical use would be the coating of foreign bodies with albumin before implantation. KW - Staphylokokken KW - Adhärenz KW - orthopädische Implantate KW - Kollagen KW - Biofilm KW - staphylococci KW - biofilm KW - adherence KW - orthopedic joint prosthesis KW - collagen Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-14178 ER - TY - THES A1 - Kränzler, Hans-Marcus T1 - Untersuchungen zur Regulation der Biofilmbildung bei Staphylokokken T1 - Investigation of the regultion of the Staphylococcal Biofilmformation N2 - Staphylokokken sind in erster Linie Saprophyten, welche die Haut und Schleimhäute des Menschen besiedeln und dort eine wichtige Rolle für das Gleichgewicht der gesunden Mikroflora spielen. Gleichzeitig haben sie sich aber auch zu den häufigsten Verursachern nosokomialer Infektionen entwickelt. Vor allem S. aureus und S. epidermidis verursachen Erkrankungen, die von leichten Haut- und Wundinfektionen bis hin zu lebensbedrohlichen Infektionen wie Pneumonien, Sepsis oder Endokarditis reichen. Infektionen durch S. epidermidis treten dabei meist in Verbindung mit Fremdkörpern wie Kathetersystemen, künstlichen Gelenken und Herzklappen auf. In diesem Zusammenhang scheint vor allem die Fähigkeit, einen Biofilm auf diesen Fremdkörpern bilden zu können eine große Rolle für die Pathogenese zu spielen. Die Therapie von Staphylokokken-Infektionen wird zunehmend durch die ausgeprägte Antibiotikaresistenz dieser Erreger erschwert, die sich mittlerweile auch auf Reserveantibiotika wie Daptomycin, Synercid® (Quinupristin/Dalfopristin) oder Linezolid erstreckt. In der Vergangenheit wurde gezeigt, dass subinhibitorische Konzentrationen des Streptogramin-Antibiotikums Synercid® die Biofilmbildung in S. epidermidis induzieren. Darüber hinaus mehren sich die Hinweise auch bei anderen Bakterien, dass geringe Antibiotika-Konzentrationen, wie sie in natürlichen Habitaten wie zum Beispiel im Boden vorkommen, wichtige Signale bei der Kommunikation von Bakterien untereinander darstellen und möglicherweise eine Funktion bei der Modulation des Metabolismus im Kampf um Nährstoffe ausüben. In dieser Promotionsarbeit sollte daher exemplarisch, mit Hilfe der erst seit kurzem zur Verfügung stehenden DNA-Mikroarray-Technik, der Effekt von subinhibitorischen Synercid®-Konzentrationen auf die globale Genexpression von S. epidermidis und S. aureus analysiert werden. Dabei stand vor allem die Wirkung auf die Biofilmbildung und die Identifikation neuer, an der Biofilmbildung beteiligter Komponenten im Mittelpunkt. Die Ergebnisse zeigen, dass subinhibitorische Synercid®-Konzentrationen bei S. aureus, im Gegensatz zu S. epidermidis, zu einer reduzierten Biofilmbildung führen. Bei beiden Arten ist jedoch die unterschiedliche Biofilmbildung durch eine ausgeprägte Veränderung der allgemeinen Genexpression begleitet. Vor allem war eine starke Induktion von Genen zu beobachten, die für Proteine des Translationsapparates kodieren. Außerdem waren Gene des Nukleotid-Stoffwechsels, der Aminosäure-Synthese und des Kohlenstoff-Metabolismus unterschiedlich reguliert. Des Weiteren konnte mit Hilfe von HPLC-Analysen sowohl bei S. epidermidis als auch bei S. aureus eine reduzierte Konzentration des Signalmoleküls Guanosin-3-5-bisphosphat (ppGpp) festgestellt werden. ppGpp spielt vor allem bei der Kontrolle und Anpassung des Stoffwechsels an Wachstumsbedingungen, wie zum Beispiel das Nährstoffangebot, eine wichtige Rolle. Die Ergebnisse legen nahe, dass die Inaktivierung der ribosomalen Proteine durch Synercid® die reduzierte ppGpp-Konzentration bedingt, was zum einen zur verstärkten Bildung ribosomaler Proteine führt und zum anderen den Zellstoffwechsel in einer Weise beeinflusst, der eine vermehrte extrazelluläre Polysaccharid-Synthese und damit Biofilmbildung ermöglicht. Zusammenfassend zeigen die hier vorgestellten Daten, dass die unterschiedliche Beeinflussung der Biofilmbildung bei S. epidermidis und S. aureus sehr wahrscheinlich durch verschiedene Regulationswege des ica-Operons und/oder unterschiedliche katabolische Fähigkeiten bedingt werden. Die Ergebnisse belegen weiterhin, dass die Wirkung von Antibiotika weit über deren bekannte inhibitorische Effekte hinausgeht und vor allem den Stoffwechsel der Bakterien dramatisch beeinflußt. Die Konsequenzen dieser Befunde sowohl für das Verständinis von mikrobiologischen Konsortien in Ökosystemen als auch für die Anwendung von Antibiotika in der Medizin sind noch nicht abzusehen, bieten jedoch eine interessante Grundlage für weitere experimentelle Arbeiten. N2 - Staphylococci are common inhabitants of the human skin and mucosal membranes, as well as the most prevalent causes of nosocomial infections. The infections mainly caused by S. aureus and S. epidermidis range from mild skin infections to life-threatening infections, like pneumonia, bacteremia or endocarditis. Especially S. epidermidis is the primary pathogen involved in medical device associated infections. In this context, the ability to form a biofilm seems to be crucial. The prevalent antibiotic resistances of Staphylococci poses an increasing challenge to medicine in recent years. The remaining effective antibiotics to treat staphylococci infections are last resort antibiotics, such as daptomycine, Synercid® and linezolid. However, staphylococci isolates with intermediate and high resistances towards these antibiotics have already been reported. There are several lines of evidence that, beside their killing activity, antibiotics have a modulating effect on the metabolism of bacteria when applied in low concentrations. Hence, the impact of this natural compounds on bacteria have to be analysed in more detail in order to provide insights into their mode of action and how bacteria respond to these compounds. Former studies showed, that biofilm formation of staphylococci is influenced by environmental factors, such as temperature, osmolytic stress and the availability of glucose or oxygen, as well as by subinhibitory concentrations of antibiotics. In this context it was shown, that low concentrations of tetracycline, erythromycine and Synercid® induce biofilm formation of S. epidermidis. The aim of this study was to investigate the effect of subinhibitory concentrations of Synercid® on biofilm formation and global gene expression of S. epidermidis and S. aureus. For this purpose DNA microarrays were used to identify and characterise the mechanisms by which Synercid® alters biofilm formation. Furthermore, this studies should lead to the identification of new factors involved in biofilm formation of staphylococci. The data presented here, demonstrate that subinhibitory concentrations of Synercid® reduce biofilm formation in S. aureus, while inducing it in S. epidermidis. The altered biofilm formation is accompanied by a strong impact on the overall gene expression of both species. Especially the expression of genes encoding proteins of the translational apparatus were increased. In addition, genes encoding proteins of the nucleotide metabolism, amino acid biosynthesis and carbohydrate utilisation were affected. Furthermore, HPLC analyses revealed a decreased concentration of the small nucleotide signal molecule guanosine-3-5-bisphosphate (ppGpp) in S. aureus and S. epidermidis under the influence of Synercid®. ppGpp is involved in the control and adaptation of cellular metabolism to changing growth conditions. We hypothesise that the reduced concentrations of ppGpp is due to the inactivation of ribosomal proteins, as a result of Synercid® binding, and mediates on the one hand the increased production of proteins of the translation apparatus and on the other hand effects the cellular metabolism in a way that enable the cells to produce more extracellular polysaccharides resulting finally in an enhanced biofilm formation. In summary, the data presented here show that the differential effect of Synercid® on biofilm formation of S. epidermidis and S. aureus is most likely due to a differential regulation of the ica operon and/or different catabolic abilities. Moreover the data suggest that the effect of antibiotics is more than the sole interaction with a target structure, but influence gene expression and metabolism of bacteria more globally. The consequences of these findings for the comprehension of the interplay in microbial communities as well as for the clinical use of antibiotics is far from being understood. However, the results of this work might provide an interesting basis for future experimental work elucidating these interferences. KW - Staphylococcus KW - Biofilm KW - Genexpression KW - Staphylokokken KW - Biofilmbildung KW - Quinupristin/Dalfopristin KW - subinhibitorische Antibiotikakonzentrationen KW - Staphylococcus KW - biofilmformation KW - Quinupristin/Dalfopristin KW - subinhibitory antibiotikkonzentrations Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-18784 ER -