TY  - THES
A1  - Reisberg, Eva
T1  - Der Einfluss von Trichomen und kutikulären Lipiden auf die bakterielle Besiedelung von Arabidopsis thaliana-Blättern
T1  - The influence of trichomes and cuticular lipids on Arabidopsis thaliana leaf-associated bacterial communities
N2  - Die oberirdischen Oberflächen von Pflanzen sind von komplexen mikrobiellen Konsortien besiedelt deren Zusammensetzung von verschiedenen Faktoren abhängig ist. In der vorliegenden Promotionsarbeit wurden zwei Eigenschaften pflanzlicher Oberflächen auf mögliche Auswirkungen auf ihre bakterielle Besiedelung hin untersucht. Dazu wurden Wildtyplinien und Mutanten von Arabidopsis thaliana eingesetzt. Zunächst wurde die bakterielle Besiedelung von A. thaliana Wildtyplinien in kultivierungsbasierten Experimenten untersucht. Es wurde hierbei ein Überblick über die kultivierbare Diversität auf Pflanzen, die unter kontrollierten Bedingungen im Klimaschrank gewachsen waren und Pflanzen, die einen Freilandaufenthalt durchlaufen hatten, gewonnen. Der Einfluss von nicht-drüsigen Trichomen von A. thaliana auf die Quantität und Diversität der bakteriellen Besiedelung wurde am A. thaliana Col-0-Wildtyp mit normaler Behaarung und der trichomlosen gl1-Mutante untersucht. Mithilfe von DAPI-Färbungen und nachfolgender Zellzählung wurden die bakteriellen Gemeinschaften der beiden Pflanzenlinien quantifiziert. Dabei zeigten sich keine pflanzenlinienspezifischen Unterschiede. Durch die Amplifizierung der bakteriellen 16S rRNA-Gene der Gemeinschaft und den nachfolgenden Einsatz der Denaturierenden Gradientengelelektrophorese (DGGE) wurde ein Überblick über die Diversität der vorherrschenden Bakteriengruppen gewonnen. Obwohl Trichome als bevorzugte Siedlungsplätze von Bakterien gelten, wurden hier auch hinsichtlich der Diversität der bakteriellen Gemeinschaften keine Unterschiede zwischen den untersuchten Pflanzenlinien gefunden. Als weiteres artspezifisches Merkmal von Pflanzenoberflächen wurde die Zusammensetzung der kutikulären Wachse als Einflussfaktor untersucht. Dafür wurden vier eceriferum-Mutanten (cer) von A. thaliana in Landsberg erecta (Ler) Wildtyp-Hintergrund eingesetzt, die sich hinsichtlich der kutikulären Wachszusammensetzung ihrer Blätter unterschieden. Zur Untersuchung der Diversität der bakteriellen Besiedelung wurde zunächst ein DGGE-Screening durchgeführt. Hier zeigten sich deutliche pflanzenlinienspezifische Unterschiede, die vor allem die Gemeinschaften der cer9- und der cer16-Mutante betrafen. Zur genaueren Charakterisierung der bakteriellen Gemeinschaften der fünf Pflanzenlinien wurde die Amplicon-Pyrosequenzierung eingesetzt. Hierbei stellte sich die bakterielle Diversität auf allen Pflanzenlinien entsprechend des Phyllosphärenhabitats moderat divers und ungleich verteilt dar. Die Identifizierung der sequenzierten Phylotypen ließ eine bakterielle Kerngemeinschaft erkennen. Weiterhin wurden 35 Phylotypen identifiziert, die differenziell auf einzelnen Pflanzenlinien auftraten. Hier handelte es sich um den pflanzenlinienspezifischen Teil der bakteriellen Gemeinschaften. Die statistische Analyse zeigte deutlich divergente Muster für die analysierten Bakteriengemeinschaften der fünf Pflanzenlinien. Vor allem die Gemeinschaften der cer6-, cer9- und cer16-Linie konnten in einer UniFrac-basierten Clusteranalyse von den anderen Pflanzenlinien abgegrenzt werden. Diese Ergebnisse zeigen klar, dass die Mutationen in der Wachsbiosynthese zu divergenten bakteriellen Gemeinschaften führten.
N2  - The above-ground parts of plants are colonized by diverse microbial consortia. Their composition is determined by several different factors. In the present study, two common features of plant surfaces and their potential effects on phyllosphere bacteria were investigated. Wildtype lines and several mutants of Arabidopsis thaliana were chosen for these investigations. Initially the bacterial communities on A. thaliana were investigated by a cultivation based approach. First insights into the culturable bacterial diversity on plants, that were grown under controlled climatic conditions or had experienced an outdoor growth period, could be provided. The influence of non-glandular trichomes of A. thaliana leaf surfaces on the quantity and diversity of associated bacterial communities was studied. The A. thaliana Col-0 wildtype which has trichomes on its leaves and the trichomeless gl1-mutant were used for the experiments. For quantification of the bacterial communities DAPI-staining and counting of total cells was applied. No plant line-specific differences were observed. To gain an overview on the diversity of the microbiota of the two plant lines, 16S rRNA-gene-based Denaturing Gradientgelelectrophoreses (DGGE) was used. Trichomes have been described to be preferred colonization sites for bacteria. However, in these experiments no differences in the diversity of the bacterial communities on the two plant lines were observed. Moreover the potential effect of plant cuticular wax composition on phyllosphere bacterial communities was studied. Consequently, four eceriferum (cer) wax mutants with distinct alterations in cuticular wax composition and the A. thaliana Landsberg erecta wildtype were selected. For diversity analysis of the communities an initial DGGE-screening was conducted. The community profiles and subsequent statistical analyses showed distinct patterns for the five plant lines, especially for the cer9 and the cer16 mutant. For a more detailed community analysis, a next generation amplicon pyrosequencing approach was conducted. Upon application of this methodology the communities on all five plant lines were shown to be moderately diverse and uneven, typical for phyllosphere habitats. Identification of community members showed a bacterial core community shared by all plant lines. However, a considerable plant line-specific community was detected, consisting of 35 phylotypes which were differentially present on certain plant lines. Statistical analyses of the sequenced bacterial communities showed distinct patterns for the five plant lines. Specifically, the cer6, cer9 and cer16-mutant communities formed distinct clusters in a UniFrac-based analysis. The results showed that the mutations affecting the wax biosynthesis of the investigated plant lines led to divergent associated bacterial communities.
KW  - Ackerschmalwand
KW  - Bakterien
KW  - Phyllosphäre
KW  - phyllosphere
KW  - amplicon pyrosequencing
KW  - bacterial communities
KW  - Arabidopsis thaliana
KW  - cuticular waxes
KW  - Botanik
KW  - Mikrobiologie
KW  - Bakterien
KW  - Ökologie
KW  - Phyllosphäre
KW  - Kutikula
KW  - Vielfalt
KW  - Schmalwand <Arabidopsis>
Y1  - 2013
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-83971
ER  - 
TY  - THES
A1  - Seibl, Matthias
T1  - Untersuchung der mikrobiellen Diversität in entzündlichen Lymphadenitiden mittels einer 16S-rRNA-basierten Heterogenitäts- & phylogenetischen Analyse (SHARP-Screening)
T1  - Analysis of the microbial diversity in inflammatory lymphadenitis using a 16S-rRNA-based heterogeneity & phylogenetic analysis (SHARP-Screening)
N2  - In der vorliegenden Studie haben wir mit Hilfe von SHARP-Screening, einer 16S-rRNA-basierten Heterogenitäts- und phylogenetischen Analyse, die mikrobielle Diversität in entzündlichen Lymphadenitiden ohne vorherige Kenntnis der jeweiligen Erreger an einer Serie von 15 Lymphknoten untersucht. Die Methode wurde erstmals auf diese Fragestellung angewandt. Sie konnte für die Verwendung von paraffineingebettetem Gewebe adaptiert werden, so dass auch Gewebeproben analysiert werden konnten, von denen kein Gefriermaterial zur Verfügung stand und die in Routineverfahren eingebettet und nach Standardmethoden gefärbt wurden. SHARP-Screening beinhaltet zwei komplementäre Schritte: Zuerst erfolgte die Erstellung einer Genbank aller bakteriellen Gene aus der gesamten extrahierten DNA des analysierten Gewebes durch gezielte Amplifikation des 16S-rRNA-Gens mittels universeller eubakterieller Primer. Als zweiter Schritt wurde nach der Transformation mittels Analyse des Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus die Selektion der jeweiligen unterschiedlichen Phylotypen der enthaltenen 16S-rRNA-Gene durchgeführt (insgesamt 400). Nach der Sequenzierung wurden die 16S-rRNA-Gene durch den Vergleich mit bekannten bakteriellen Sequenzen mit Hilfe des „Basic-Local-Alignment-Search-Tool“ (BLAST) identifiziert. SHARP-Screening hat sich als geeignete Methode zur Analyse der gesamten, in einer Gewebeprobe enthaltenen bakteriellen Flora erwiesen. Dabei wurden zum Teil andere Erreger gefunden, als aus dem histologischen Bild vermutet wurden. So konnte zum Beispiel mit dem Nachweis von Gluconacetobacter sacchari, als potentieller Erreger einer septischen Granulomatose, eine alternative Differentialdiagnose zur histologisch vermuteten Katzenkratzkrankheit aufgezeigt werden. Darüber hinaus konnten auch gleichartige histologische Bilder bei dem gleichen identifizierten Erreger beobachtet werden. Zum Beispiel konnten im Zusammenhang mit dem Auftreten von Ödemen, Nekrosen, granulomatös eitrigen Veränderungen und einer ausgeprägten Sinus-histiozytose im Lymphknotengewebe immer wieder Comamonadaceae bzw. Janthinobacterium nachgewiesen werden. Oft zeigte sich nicht ein einzelner Erreger der Lymphadenitis, sondern ein ganzes Spektrum, wobei aus dem Vorhandensein der 16S-rRNA nicht auf das Vorhandensein vitaler Erreger geschlossen werden kann. Dennoch erlaubt die Häufigkeit der entsprechenden Klone eine semiquantitative Abschätzung der Bedeutung des jeweiligen Erregers. So wies SHARP-Screening auch Homologien zu Paracoccus yeeii nach. Eine Spezies, die mit klassischen Methoden häufig übersehen wird, die in Lymphknoten jedoch eine pathogene Rolle spielen kann. Im Zusammenhang mit dem histologischen Verdacht auf ein Malignom wurden in einigen Fällen Streptomyces, Roseomonas gilardii rosea und Stenotrophomonas maltophila nachgewiesen, die auch in der Literatur häufig bei immunsupprimierten Patienten vorkommen. Bei dem Verdacht auf ein Lymphgranuloma venerum wurde eine Cyanobacterium-Spezies detektiert, die es nach Literaturangaben Chlamydia trachomatis erst möglich macht, den eigenen Aminosäurestoffwechsel zu betreiben. Insgesamt dürften vom SHARP-Screening noch weitere tiefgreifende Erkenntnisse der bakteriellen Diversität und kausaler Erregerassoziationen in Erkrankungen des lymphatischen Systems zu erwarten sein.
N2  - The focus of this study was laid on the analysis of the microbial diversity in inflammatory lymphadenitis of 15 different lymph nodes without prior knowledge of the respective causative organism with help of the SHARP-Screening, a 16S-rRNA-based heterogeneity and phylogenetic analysis. This represents the first study to analyse this problem with the above mentioned SHARP-Screening adapting the method for the utilization of paraffin embedded tissue which consequently allowed the analysis of tissue specimen of which no freezing material was available and which were embedded in routine procedures as well as coloured according to a standard approach. The SHARP-Screening compromises two complementary steps: The first step is the creation of a gene pool of all bacterial genes of the entire DNA extracted from the analysed tissue by the systematic amplification of the 16S-rRNA-gene by means of universal eubacterial primers. The next step after the transformation was the selection of the different phylotypes of the incorporated 16S-rRNA-genes (altogether 400) by analysing the restriction fragment length polymorphism (RFLP). After the sequencing, the 16S-rRNA-genes were identified by comparing them with the known bacterial sequences with help of the “Basic-Local-Alignment-Search-Tool” (BLAST). The SHARP-Screening has proved itself as an adequate method to analyse the entire bacterial flora contained in the tissue sample. In some cases different causative organisms were found in contrast to the expectations which arose from the histological pictures. In this way evidence of gluconacetobacter sacchari could be provided as potential causative agents of a septic granulomatosis, an alternative differential diagnosis to the histologically assumed cat scratch disease. Furthermore, histological pictures of a similar type could be observed with regard to the same identified causative organism. For example, in conjunction with the appearance of edema, necrosis, granulomatosic purulent alterations and a very pronounced sinushistiozytosis in the lymph node tissue, comamonadaceae and accordingly janthinobacteria could consistently be demonstrated. A lot of times not just a single causative organism but a whole spectrum of the lymphadenitis could be identified. Here, however, the existence of the 16S-rRNA cannot be attributed to the existence of vital causative agents. Nevertheless, the frequency of the respective clones allows a semi quantitative assessment of the importance of the corresponding causative agents. Thus the SHARP-Screening proved evidence of homologies to paracoccus yeeii. A species which is often missed with classic methods however can play a pathogenic role. In several cases streptomyces, roseomonas gilardii rosea and stenotrophomonas maltophila, which are often mentioned in literature with regard to immunosuppressed patients, could be demonstrated in connection with the histological suspicion of a malignant tumour. While suspecting a lymphgranuloma venerum, a cyanobacterium species was discovered which according to literature sources enables chlamydia trachomatis to operate the body’s amino acid metabolism. Altogether, the SHARP-Screening is expected to lead to even more profound findings of bacterial diversity and causal causative organism associations with regard to diseases of the lymphatic system.
KW  - Polymerase-Kettenreaktion
KW  - Ribosomale RNS
KW  - Lymphadenitis
KW  - Vielfalt
KW  - Entzündung
KW  - Phylogenetik
KW  - Paraffin
KW  - 16S-rRNA
KW  - mikrobielle Diversität
KW  - unspezifische Lymphadenitis
KW  - SHARP-Screening
KW  - Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-57037
ER  -