TY  - THES
A1  - Schäfer, Nadine
T1  - Eine vergleichende biophysikalische Analyse von Hitze- und Trockentoleranzstrategien der Wüstenpflanze Phoenix dactylifera und Nutzpflanzen der gemäßigten Klimazonen
T1  - A comparative biophysical analysis of heat and drought tolerance strategies of the desert plant Phoenix dactylifera and crops of temperate climates
N2  - Der Klimawandel geht einher mit einem Anstieg der globalen Durchschnittstemperatur und einem dadurch induzierten Wassermangel. Diese beiden abiotischen Stressfaktoren führen zu einer Reduzierung der landwirtschaftlichen Erträge und Biomassen von Kulturpflanzen. Daher ist eine Anpassung der betroffenen Pflanzenarten an das sich ändernde Klima erforderlich, um die landwirtschaftliche Produktivität in Zukunft aufrechtzuerhalten. Gegenwärtig ist unser Wissen über Strategien zur Toleranz gegenüber abiotischem Stress sowie über Genom- und Transkriptionsinformationen auf wenige Modellorganismen von Angiospermen beschränkt, so dass diese Informationen die Basis für die Forschung an Trockenheit und Hitzestress darstellen. Die Untersuchung der Stressadaption innerhalb und zwischen verschiedenen Pflanzengattungen ist von besonderer Relevanz. Vor diesem Hintergrund habe ich im Rahmen meiner Doktorarbeit die Überlebensstrategie der extremophilen Wüstenpflanze Phoenix dactylifera (Dattelpalme) im Vergleich zu zwei Mesophilen, der Kulturpflanze Hordeum vulgare (Gerste) und der Modellpflanze Arabidopsis thaliana, untersucht.
Dattelpalmen sind nicht sukkulente Wüstenpflanzen, die auch unter extremen Trocken- und Hitzebedingungen in den Wüsten der Arabischen Halbinsel wachsen und ertragreich Früchte produzieren. In Phoenix dactylifera ist bislang weder die Molekularbiologie und –physiologie der Schließzellen, vor allem der Anionenkanäle, verstanden, noch wurde der Hitzeschutz ihrer Zuckertransportproteine untersucht.
Um die stomatäre Reaktion auf das Trockenstresshormon ABA (Abscisinsäure) zu verstehen, klonierten wir die Hauptkomponenten des schnellen ABA-Signalwegs von Schließzellen und analysierten den Öffnungsmechanismus der Anionenkanäle aus der Dattelpalme und der Gerste vergleichend zu dem Anionenkanal aus Arabidopsis im heterologen Expressionssystem der Xenopus Oozyten. Beide monokotyledonen Pflanzenarten (Gerste und Dattelpalme) besitzen stomatäre Komplexe, die aus Schließzellen und Nebenzellen bestehen. Dies unterscheidet die Monokotyledonen von den Dikotyledonen, die normalerweise Stomakomplexe aufweisen, die nur aus einem Paar Schließzellen gebildet werden. Interessanterweise schlossen sich Dattelpalmen- und Gerstenstomata als Reaktion auf das Trockenstresshormon ABA nur in Gegenwart von extrazellulärem Nitrat.
Der heterolog-exprimierte Anionenkanal PdSLAC1 wird durch die ABA-Kinase PdOST1 aktiviert und diese Aktivierung wird durch die Koexpression der PP2C-Phosphatase ABI1 gehemmt. Daher wird PdSLAC1 wie seine Orthologen aus Gerste und Arabidopsis durch ein ABA-abhängiges Phosphorylierungs-/Dephosphorylierungsnetzwerk gesteuert. PdOST1 aktivierte den Anionenkanal PdSLAC1 jedoch nur in Gegenwart von extrazellulärem Nitrat - eine elektrische Eigenschaft, die PdSLAC1 mit HvSLAC1 der Gerste gemein hat, sich jedoch von AtSLAC1 unterscheidet. Angesichts der Tatsache, dass in Gegenwart von Nitrat ABA den Stomaschluss verstärkt und beschleunigt, deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass bei Dattelpalmen und Gerste Nitrat als Ligand zum Öffnen von SLAC1 benötigt wird. Dies initiiert die Depolarisation der Schließzellen und leitet schließlich den Stomaschluss ein, um den Wasserverlust der Pflanzen unter Trockenstressbedingungen zu minimieren.
Um die monokotyledone spezifische Nitratabhängigkeit von SLAC1 zu verstehen, führten wir ortsgerichtete Mutagenesestudien auf Basis eines 3D-Modells durch, welche zudem vergleichende Studien an Chimären von Monokotylen- und Dikotylen-SLAC1 Anionenkanälen umfassten. Unsere Struktur-Funktions-Forschung identifizierte zwei Aminosäurenreste auf der Transmembrandomäne 3 (TMD3), die eine wesentliche Rolle bei der Nitrat-abhängigen Regulierung von SLAC1 Anionenkanälen monokotyledoner Pflanzen spielen. Die phylogenetische Analyse ergab schließlich, dass während der Evolution die für Monokotlyedonen spezifische Nitrat-abhängige Regulierung erst nach der Trennung in Monokotyledonen und Dikotyledonen auftrat. Durch die Nitrat-sensitive Regulierung von SLAC1 Anionenkanälen beruht der schnelle Stomaschluss von Monokotyledonen auf dem Zusammenspiel des Trockenstresshormons ABA und dem Stickstoffhaushalt der Pflanze. Da der ABA-Signalweg von Arabidopsis umfassend untersucht wurde, könnte die Entdeckung des monokotyledonen spezifischen Nitrat-abhängigen Motivs in TMD3 nun als Stellschraube zur Verbesserung der Züchtungsprogramme dikotyledoner Nutzpflanzen dienen.
Wüstenpflanzen leiden nicht nur unter Trockenheit, sondern auch unter extremem Hitzestress. Wir konnten zeigen, dass hitzebelastete Dattelpalmen große Mengen der flüchtigen Kohlenwasserstoffverbindung Isopren (2-Methyl-1,3-Butadien) produzieren und emittieren. Durch die vorübergehende Freisetzung von Isopren kann die Pflanze die Photosynthese auch bei extremen Temperaturen betreiben. Es ist jedoch nicht bekannt, ob und wie Isopren in Hitzeperioden auch Transportprozesse durch biologische Membranen schützt. Um den Einfluss von Isopren auf den Transmembrantransport zu untersuchen, identifizierten und klonierten wir den Protonen-gekoppelten Saccharosetransporter 1 (PdSUT1) der Dattelpalme und verglichen seine elektrischen Eigenschaften mit ZmSUT1 (Zea mays Sucrose Transporter 1) im heterologen Expressionssystem der Xenopus Oozyten. Interessanterweise waren das elektrische Verhalten, die kinetischen Eigenschaften und die Temperaturabhängigkeit beider Transporter ähnlich. Die Anwendung von Isopren veränderte jedoch massiv die Affinität von ZmSUT1 zu seinem Substrat Saccharose, während die Affinität des Transporters der Dattelpalme nur schwach beeinflusst wurde. Es wird angenommen, dass die Membranfluidität unter Hitzestress erniedrigt ist, welches durch Interkalierung von Isopren mit den Fettsäureketten biologischer Membrane einhergeht. Dies und die Unempfindlichkeit von PdSUT1 gegenüber Isopren deuten darauf hin, dass der Saccharosetransporter PdSUT1 aus der Wüstenpflanze auch bei hohen Temperaturen Saccharose mit hoher Affinität transportiert. Zukünftige Studien müssen nun klären, ob der flüchtige Kohlenwasserstoff Isopren einen direkten Einfluss auf den Transporter selbst hat oder Isopren in die Membran integriert und damit indirekt die Eigenschaften von Transportproteinen beeinflusst. Unabhängig von der Wirkungsweise von Isopren sollte nicht unerwähnt bleiben, dass PdSUT1 gegenüber Isopren weniger empfindlich ist als sein Ortholog ZmSUT1 aus Mais. Dies kann auf eine Anpassung des Saccharosetransporters an die extremen Hitzeperioden und die damit einhergehende Isoprenemission von Dattelpalmen zurückzuführen sein.
N2  - Low water availability and heat stress present major barriers to achievíng high biomass and full yield potential in crops. Global climate change is accompanied by a subtle increase in the severity of these abiotic stresses. Thus, the adaptation of crop species to the changing climate is required in order to sustain agricultural productivity in the future. Currently, our knowledge of plant strategies for abiotic stress tolerance as well as genomic and transcriptional information is limited to a few model angiosperms, providing a starting point for the understanding of responses to drought and/or heat stress, within and across species.
In the framework of my PhD thesis, we followed a different strategy to learn about abiotic stress tolerance: we studied the survival strategy of the extremophilic desert plant Phoenix dactylifera (date palm) in comparison to the crop Hordeum vulgare (barley) and the model plant Arabidopsis thaliana, both from temperate zones. Date palms grow and produce fruits even under extreme drought and heat conditions in the deserts of the Arabian Peninsula. Neither the molecular biology and physiology of guard cells nor the heat protection of transport protein mediated sugar and ion transport processes have been studied so far in this non-succulent desert plant, Phoenix dactylifera.
To understand the stomatal response to the water stress phytohormone ABA (abscisic acid), we cloned the major components for guard cell fast abscisic acid signaling and analysed the anion channel opening mechanism of the date palm side by side with barley and Arabidopsis in Xenopus oocytes. Both monocot plant species (barley and date palm) possess stomatal complexes consisting of guard cells and subsidiary cells. This distinguishes monocot species from dicots, which usually exhibit stomatal complexes formed by a pair of guard cells only. Interestingly, date palm and barley stomata closed in response to the drought stress hormone ABA only in the presence of extracellular nitrate.
Heterologously expressed Phoenix SLAC1-type anion channel PdSLAC1 is activated by the ABA kinase PdOST1 and this activation is inhibited by the coexpression of PP2C phosphatase ABI1 – thus like its counterparts from barley and Arabidopsis, PdSLAC1 is controlled by an ABA-dependent phosphorylation/dephosphorylation network. However, PdOST1 did activate the desert plant anion channel PdSLAC1 only in the presence of extracellular nitrate – an electrical property that PdSLAC1 shares with the barley SLAC1 but distinguishes both monocot SLAC1 channels from AtSLAC1. Given that, in the presence of nitrate, ABA enhanced and accelerated stomatal closure, our findings indicate that the guard cell osmotic motor driving stomatal closure in date palm and barley uses nitrate as the signal to open the major anion channel SLAC1. This initiates guard cell depolarization and finally stomatal closure to prevent plant wilting under drought stress conditions.
To understand the monocot-specific SLAC1 nitrate dependency, we performed a 3D-model- based site-directed mutagenesis study including chimeric channels between monocot and dicot SLAC1 anion channels. Our structure-function research identified two residues on transmembrane domain 3 (TMD3) that play an essential role in nitrate-dependent gating of monocot SLAC1-type anion channels. Phylogenetic analysis finally revealed that during evolution the monocot specific nitrate-dependent gating was established after the split between monocots and dicots. Thus, the success of monocot species may in part rely on the integration of drought signals (ABA) and the nitrogen nutrition status of the plant via nitrate-sensitive gating of SLAC1 anion channels. Since the Arabidopsis ABA-signaling pathway has been extensively studied, the discovery of the monocot-specific nitrate dependent motif on TMD3 could now serve as a set screw to improve the breeding programs of dicot agricultural crops.
Desert plants not only suffer from drought but also from extreme heat stress. We could show that heat-stressed date palms produce and emit high amounts of the volatile hydrocarbon compound isoprene (2-Methyl-1,3-Butadien). The temporary release of isoprene allows the plant to perform photosynthesis even under extreme temperatures. However, it is not known whether and how isoprene also protects transport processes across biological membranes in periods of heat. To study the influence of isoprene on transmembrane transport, we identified and cloned the date palm proton-coupled sucrose transporter 1 (PdSUT1) and compared its electrical properties with ZmSUT1 (Zea mays Sucrose Transporter 1) in the heterologous expression system of Xenopus oocytes. Interestingly, the electrical behavior, the kinetic properties and the temperature dependence of both carriers were similar. However, the response to isoprene application massively altered the affinity of ZmSUT1 to its substrate sucrose while the affinity of the date palm transporter was only weakly affected. The intercalation of isoprene with the fatty acid chains of biological membranes is believed to decrease the membrane fluidity under heat stress. This and the insensitivity of PdSUT1 towards isoprene may indicate that the desert plant sucrose transporter PdSUT1 transports sucrose with high affinity even at high temperatures. Future studies must now clarify whether the volatile hydrocarbon isoprene has a direct influence on the carrier itself or isoprene integrates into the membrane and thus indirectly influences the properties of transport proteins. Regardless of the mode of action of isoprene, it remains to be noted that PdSUT1 is less sensitive to isoprene than its orthologue from maize. This may be an adaptation of the sucrose carrier to the extreme heat periods and the accompanying isoprene emission from date palms.
KW  - Dattelpalme
KW  - Gerste
KW  - Elektrophysiologie
KW  - Hitzestress
KW  - Schließzelle
KW  - Anionenkanal
KW  - Zuckertransporter
KW  - SLAC1
KW  - SUT1
KW  - Signaltransduktion
KW  - ZmSUT1
KW  - Phoenix dactylifera
KW  - Hordeum vulgare
KW  - Zea mays
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-186491
ER  - 
TY  - THES
A1  - Derrer, Carmen
T1  - Biophysikalische Aufschlüsselung des Transportzyklus von ZmSUT1, einem H+/Saccharose Symporter aus Mais
T1  - Biophysical analysis of the transport cycle of ZmSUT1, a H+/sucrose symporter from maize
N2  - Die Mesophyllzellen vollentwickelter Blätter stellen den Hauptort der Photosynthese höherer Pflanzen dar. Diese autotrophen Zellen (source-Gewebe) produzieren einen Überschuss an Kohlenstoff-Assimilaten, die für die Versorgung anderer heterotropher Gewebe und Organe, wie z.B. Früchten oder Wurzeln (sink-Gewebe), genutzt werden. Das Langstrecken-Transportsystem höherer Pflanzen, das Phloem, transportiert die Photoassimilate durch den gesamten Pflanzenkörper. Der zwischen source- und sink-Geweben herrschende hydrostatische Druckunterschied wird von osmotisch aktiven Substanzen generiert und treibt den Massenstrom in diesem Gefäßsystem an. Der nicht-reduzierende Zucker Saccharose stellt in den meisten höheren Pflanzen die Haupttransportform der photosynthetisch hergestellten Kohlenstoffverbindungen im Phloem dar. Protonen-gekoppelte Saccharosetransporter reichern Saccharose im Phloemgewebe mit einer 1000-fach höheren Konzentration (bis zu 1M), verglichen zum extrazellulären Raum, an. Aufgrund dieser einzigartigen Fähigkeit üben diese Carrier eine essentielle Rolle in der Phloembeladung aus und gewährleisten so die Versorgung der gesamten Pflanze mit Photoassimilaten. Saccharosetransporter können diese Energie-aufwändige Aufgabe nur durch eine enge Kopplung des zeitgleichen Transports von Saccharose und Protonen bewerkstelligen. Molekulare Einblicke in diesen physiologisch außerordentlich wichtigen Prozess der Zuckertranslokation sind jedoch bis heute immer noch sehr lückenhaft. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Saccharosetransporter ZmSUT1 aus Mais im heterologen Expressionssystem der Xenopus Oozyten exprimiert. ZmSUT1 generiert in Oozyten ungewöhnlich hohe Ströme im µA-Bereich, was diesen Zuckertransporter für präzise elektrophysiologische Messungen geradezu prädestiniert. Erste elektrophysiologische Messungen zur Substratspezifität zeigten, dass der synthetische Süßstoff Sucralose kein Substrat für ZmSUT1 darstellt. Darüber hinaus gelang es, Sucralose als kompetitiven Inhibitor der Saccharose-induzierten Transportströme von ZmSUT1 zu identifizieren. Die Verwendung dieses Saccharose-Derivats ermöglichte es, den Transportmechanismus in einzelne Schritte zu zerlegen und diese zu quantifizieren. Durch hochauflösende elektrophysiologische Messungen konnten transiente Ströme in der Abwesenheit jeglichen Substrats detektiert werden, die jedoch in der Anwesenheit sättigender Saccharosekonzentrationen erloschen. Diese sogenannten presteady-state Ströme (Ipre) zeichneten sich durch eine schnelle und eine langsame Komponente in der Relaxationskinetik der Ströme aus. Ipre konnten mit dem Binden der Protonen an den Transporter innerhalb des elektrischen Feldes der Membran in Verbindung gebracht werden. Somit führte die Analyse der presteady-state Ströme zur Aufklärung des ersten Schritts - dem Binden der Protonen - im Transportzyklus von ZmSUT1. Interessanterweise reduzierte der kompetitive Inhibitor Sucralose die langsame Komponente der presteady-state Ströme in Abhängigkeit von der Sucralosekonzentration, während die schnelle Komponente von Ipre unbeeinflusst blieb. Um dieses Verhalten erklären zu können und einen weiteren Schritt im Transportzyklus von ZmSUT1 zu studieren, wurde die Methode der Spannungsklemmen-Fluorometrie zur Untersuchung der Konformationsänderung von ZmSUT1 etabliert. Tatsächlich gelang es, zum ersten Mal die intramolekulare Bewegung eines pflanzlichen Transportproteins zu visualisieren. Detaillierte Analysen zeigten, dass die Konformationsänderungen von ZmSUT1, unabhängig von Saccharose, mit einer schwachen pH-Abhängigkeit auftraten. Interessanterweise wurde die Beweglichkeit des Transporters durch die Applikation des kompetitiven Inhibitors Sucralose deutlich reduziert. Dieser Effekt deutet, zusammen mit dem Sucralose-induzierten Verschwinden der langsamen Komponente der Ipre darauf hin, dass Sucralose den Transporter in seiner auswärts-gerichteten Konformation arretiert. Somit repräsentiert die Zugänglichkeit der extrazellulären Protonenbindestelle und folglich die Konformationsänderung den Geschwindigkeits-bestimmenden Schritt im Reaktionszyklus von ZmSUT1. Zusammenfassend gelang es in dieser Arbeit, das Binden der Protonen und den Zusammenhang mit der Bewegung des Proteins, von einer auswärts-gerichteten in eine einwärts-gerichtete Konformation, aufzuklären. Mit der Hilfe der Erkenntnisse aus dieser Arbeit konnte ein mechanistisches Modell für den Transportzyklus von ZmSUT1 entwickelt werden, anhand dessen alle Ergebnisse schlüssig erklärt und diskutiert werden konnten.
N2  - Higher plants produce carbohydrates via photosynthesis in mesophyll cells of their leaves. These autotrophic cells export the excess of photoassimilates (source-tissue) to supply heterotrophic tissues, such as fruits and roots (sink-tissues), with carbon compounds. According to the Munch hypothesis, osmolytes generate the hydrostatic pressure difference between the source- and sink-tissues that drives the mass flow within the phloem vasculature. In most higher plants the non-reducing disaccharide sucrose represents the main mobile carbohydrate. Proton-driven sucrose transporter play a pivotal role in loading the phloem vessels for long distance transport of sucrose throughout the entire plant body. The strongly hyperpolarized plant membrane potential and the exceptional ability of sucrose carriers to accumulate sucrose quantities of more than 1 M in phloem cells, indicate that plants evolved transporters with unique functional properties. The transporter protein can achieve this task only because proton and sucrose transport are tightly coupled to each other. The knowledge about individual steps in the transport cycle of sucrose carriers is, however, still fragmentary. Within the scope of this work, the sucrose transporter ZmSUT1 from maize was expressed in the heterologous expression system of Xenopus oocytes. ZmSUT1 was found to mediate sucrose-induced proton currents in the µA range, predestinating this carrier for precise electrophysiological measurements of kinetic parameters in Xenopus oocytes. A basic electrophysiological characterization revealed that ZmSUT1 do not transport the synthetic sweetener sucralose but is competitively inhibited by this sucrose derivate. Having this tool in hands, individual steps of the ZmSUT1 transport cycle were dissected and quantified with sophisticated electrophysiological and fluorescence-based methods. Thereby transient currents in the absence of any substrate, which disappeared in the presence of saturating sucrose quantities, could be measured. These so-called presteady-state currents were composed of a fast and a slowly decaying current component and could be associated with the binding of protons to a binding site at the transporter within the electrical field of the membrane. Thus, the study of presteady-state currents allowed us to individually characterize the first step in the transport cycle of ZmSUT1 – the binding of protons to ZmSUT1. Interestingly, the slow current component disappeared in the presence of the competitive inhibitor sucralose. To understand this behavior and to elucidate conformational rearrangements within the carrier associated with the transport of sucrose, we visualized movements of ZmSUT1 using the voltage clamp fluorometry technique. Indeed, we for the first time were able to monitor conformational changes of a plant transport protein. Detailed analysis revealed that conformational changes of ZmSUT1 occur in the absence as well as in the presence of its substrate. However, upon application of the inhibitor sucralose the movements of the ZmSUT1 proteins were markedly reduced. This fact, taken together with the disappearance of the slow presteady-state component, let us conclude that sucralose seem to lock ZmSUT1 in its outward-facing conformation. The rate-limiting step of the reaction cycle is determined by the accessibility of the extracellular proton binding site and thus by conformational changes of the ZmSUT1 protein. Taken together our studies resolved the first step in the reaction cycle of a plant sucrose transporter - the binding of protons to the carrier - and its interrelationship with the alternating movement of the protein. Based on these results a mechanistic transport model of plant sucrose transporters was drawn and discussed.
KW  - Mais
KW  - Saccharose
KW  - Symport
KW  - ZmSUT1
KW  - Transport
KW  - Saccharose
KW  - Spannungsklemmen-Fluorometrie
KW  - VCF
KW  - presteady-state Ströme
KW  - sucrose
KW  - transport
KW  - voltage clamp fluorometry
KW  - presteady-state
Y1  - 2013
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-78949
ER  -