TY - THES A1 - Ehrenschwender, Martin T1 - Auswirkungen einer aktivierenden PIK3CA-Mutation auf die Signaltransduktion von FasL und TRAIL in kolorektalen Karzinomzellen T1 - Effects of an activating mutation in the PIK3CA gene on FasL and TRAIL induced signal transduction in colorectal cancer cells N2 - Die Todesrezeptoren Fas, TRAILR1 und TRAILR2 werden seit einigen Jahren aufgrund ihrer Fähigkeit, Apoptose zu induzieren, als therapeutisch interessantes Ziel bei der Therapie maligner Tumoren angesehen. Gleichzeitig werden immer mehr Entitäten von Tumoren beschrieben, die eine Resistenz gegen die Todesrezeptor-induzierte Apoptose aufweisen. In dieser Konstellation können neben den blockierten proapoptotischen Signalen insbesondere auch Todesrezeptor-assoziierte, protumoral wirksame Signalwege sichtbar werden, die unter anderen Umständen durch die Apoptose maskiert werden. In dieser Arbeit wurde die von FasL- und TRAIL-induzierte Signaltransduktion in einer apoptoseresistenten Variante der kolorektalen Karzinomzelllinie HCT116 untersucht. Eine aktivierende Mutation des PIK3CA-Gens protektiert diese Zellen aufgrund der konstitutiven Aktivierung des onkogenen PI3K/Akt-Signalweges gegenüber Todesrezeptor-vermittelter Apoptose. Durch Vergleich isogener Zelllinien, welche für den PIK3CA-Locus funktionell haploid waren und entweder ein Wildtyp oder ein mutiertes Allel trugen, konnte die Signaltransduktion von Fas und der TRAIL-Todesrezeptoren in apoptoseresistenten Tumorzellen, sowie deren Zusammenspiel mit dem PI3K/Akt-Signalweg im Detail untersucht werden. So wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass nach Stimulation der HCT116 PIK3CA-mut protektierten Zellen mit FasL oder TRAIL die initialen Schritte der Apoptoseinduktion durch Todesrezeptoren bis hin zur Bildung des DISC und der Aktivierung von Caspase-8 ungestört vonstatten gehen. Der durch die PIK3CA-Mutation induzierte Schutzmechanismus muss deshalb unterhalb dieser frühen apoptoseinduzierenden Ereignisse wirksam werden. Darüber hinaus zeigte sich, dass Todesliganden in HCT116 PIK3CA-mut Zellen den proinflammatorischen NFκB-Signalweg aktivieren, wohingegen dieser Signalweg in HCT116 PIK3CA-wt Zellen durch die ablaufende Apoptose inhibiert wurde. Während HCT116 PIK3CA-wt Zellen nach Stimulation von Fas oder den TRAIL-Todesrezeptoren morphologisch die klassischen Anzeichen des apoptotischen Zelltods zeigten, veränderten die HCT116 PIK3CA-mut protektierten Zellen ihre Morphologie von einer mesenchymal-länglichen hin zu einer amöboid-abgerundeten Form, die Zellen blieben jedoch vital. Die Änderung der Zellmorphologie konnte mit dem Vorhandensein enzymatisch aktiver Casapse-8 verknüpft werden, generiert durch den Todesrezeptor-assoziierten DISC. Caspase-8 vermittelte die Reorganisation des Aktinzytoskeletts durch Spaltung und der damit einhergehenden Aktivierung von ROCK-1. Blockade der Caspase-8 Aktivierung in HCT116 PIK3CA-mut Zellen durch pharmakologische Inhibitoren oder ektope Überexpression von cFLIPS verhinderte entsprechend den FasL- oder TRAIL-induzierten Übergang zur amöboid-abgerundeten Zellform. Funktionell zeigten die amöboid-abgerundeten HCT116 PIK3CA-mut Zellen im Vergleich zu unstimulierten HCT116 PIK3CA-mut Zellen eine erhöhte Invasivität, was anhand erhöhter Spiegel an Urokinase im Überstand nachgewiesen werden konnte. Diese Arbeit beschreibt mit der Induktion einer amöboid-abgerundeten Zellmorphologie erstmals eine nicht-apoptotische Funktion von Caspase-8 im Kontext der Todesrezeptor-Signaltransduktion, die von der enzymatischen Aktivität abhängig ist. Weiterhin konnte ROCK-1 als Caspase-8 Substrat identifiziert werden. Ob durch die Aktivierung von ROCK-1 und die Reorganisation des Aktinzytoskeletts neben der Ausbildung einer amöboiden Zellmorphologie auch der amöboide Typ der Zellmigration in Gang gesetzt wird, müssen zukünftige Studien zeigen. N2 - During the last years, the death receptors Fas, TRAILR1 and TRAILR2 emerged as promising therapeutic targets in cancer therapy. On the contrary, the number of tumor entities showing resistance against death receptor-induced apoptosis is still rising, thereby limiting the effectiveness of a therapeutic approach. Furthermore, under conditions where death receptor-induced apoptosis is blocked, cell death induction is not the only signal emanating from Fas and TRAIL death receptors. Non-apoptotic and even tumor-promoting signaling pathways may become apparent which are otherwise masked by ongoing apoptosis. This study provides insight in FasL- and TRAIL-induced signaling in an apoptosis resistant variant of HCT116 colorectal cancer cells. An activating mutation in the PIK3CA gene protected these cells against death receptor-induced apoptosis by constitutive activation of the oncogenic PI3K/Akt pathway. Comparing isogenic cell lines either harboring a PIK3CA wild-type allele or an activating mutated allele allowed investigation of signal transduction events associated with Fas and TRAIL death receptors in apoptosis resistant cells as well as their interplay with the PI3K/Akt signaling pathway. Upon stimulation with FasL or TRAIL, PIK3CA-mut protected HCT116 cells were still capable of initiating the first steps of apoptosis induction as was evident from DISC-formation and activating caspase-8. This indicated that the PIK3CA-mut-granted blocking of the apoptotic program must act downstream of these early events. Furthermore, the proinflammatory NFκB pathway was turned on, as demonstrated by the phosphorylation of crucial signaling components and the enhanced expression of NFκB controlled target genes. Activation of the NFκB pathway, however, was masked in HCT116 PIK3CA-wt cells by ongoing apoptosis. After stimulation of Fas or TRAIL death receptors, HCT116 PIK3CA-wt cells exhibited classical morphological apoptotic features. Interestingly, stimulation of HCT116 PIK3CA-mut cells induced transition to an amoeboid-like morphology without affecting the viability. The changes in cellular morphology were crucially dependent on enzymatically active caspase-8 generated at the DISC. Caspase-8 cleaved and thereby activated ROCK-1, a key player in reorganisation of the actin cytoskeleton. Interfering with caspase-8 activation by ectopic expression of cFLIPS or pharmacological inhibitors abrogated the changes in cellular morphology. Additionally, HCT116 PIK3CA-mut cells showed upon FasL- or TRAIL-treatment increased invasiveness, demonstrated by elevated levels of urokinase in the supernatant of the cells. To date, the FasL- or TRAIL-induced transition of HCT116 PIK3CA-mut cells to an amoeboid-like cellular morphology is the first clearly demonstrated non-apoptotic function of caspase-8 in context of death receptor signaling, that is dependent on the enzymatic activity of the molecule. Furthermore, this study identifies ROCK-1 as a novel substrate of caspase-8. Further investigations will have to clarify the role of caspase-8 mediated activation of ROCK-1 and accompanied reorganization of the actin cytoskeleton with respect to the induction of the amoeboid-type of cell migration. KW - Apoptosis KW - Colonkrebs KW - Fas-Ligand KW - Actin KW - Tumor-Nekrose-Faktor KW - TRAIL KW - CD95 KW - ROCK-1 KW - Caspase-8 KW - Caspase-3 KW - DISC KW - lipid rafts KW - TRAIL KW - CD95 KW - ROCK-1 KW - Caspase-8 KW - Caspase-3 KW - DISC KW - lipid rafts Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-44377 ER - TY - THES A1 - Song, Bong-Seok T1 - Morphodynamiken der Interaktion zwischen T-Zelle und dendritischer Zelle in dreidimensionaler extrazellulärer Matrix T1 - Physical morphodynamics of T cell-DC-interaction in 3D extracellular matrix N2 - Die Aktivierung der T Zelle bedarf der spezifischen Interaktion zwischen T Zelle und Antigen-präsentierender Zelle unter Ausbildung einer engen Anlagerung beider Zellmembranen („immunologische Synapse“) für Rezeptoren-Interaktionen und konsekutive Signaltransduktion. In dreidimensionaler Kollagenmatrix zeigte sich ein stereotypes, dynamisches Muster bei der Interaktion zwischen CD45RO-positiven humanen T Zellen und antigenpräsentierenden dendritischen Zellen. i) Die Kontaktaufnahme wurde stets über das Leading edge der T Zelle initiiert. ii) Beim dynamischen Kontakt wanderte die T Zelle polarisiert, mit vielen Richtungsänderungen und mit reduzierter Geschwindigkeit auf der DC-Oberfläche, nur unterbrochen von kurzen Stopp- und Abrundungsphasen. Der Uropod der T Zelle stand während der dynamischen Kontakts in kontinuierlicher Verbindung zur DC. iii) Die Loslösung der T Zelle von der DC war ein aktiver Prozess, der durch Interaktion der Vorderfront der T Zelle zu benachbarten Kollagenfasern eingeleitet wurde, gefolgt von der Lösung des Zellkörpers und des Uropods. Alternativ wurden Kontakte durch Uropod-mediierte Retention der T Zelle auf der DC-Oberfläche verlängert. Zur dynamischen molekularen Charakterisierung der Kontaktfläche wurde eine Methode zur Darstellung von Lipid-Rafts an lebenden Zellen in der 3D ECM mit BTRITC etabliert. Die Ergebnisse zeigen ein neues 3-Schritt-Konzept dynamischer und produktiver Interaktionen zwischen T Zelle und DC in vitro. Die assymetrische Kontaktzone impliziert distinkte Funktionen von Vorderfront und Uropod der T Zelle und definiert eine neuartige dynamische Kontaktform für die Signalübertragung zwischen beweglichen Zellen. N2 - Activation of T cells is initiated through specific interaction between a T cell and an antigen-presenting cell. It is believed to be facilitated through formation of an interaction plane at the contact site, called the "immunological synapse" (IS).The IS is defined by recruitment and segregation of cell-surface receptors and adaptor proteins at the cell–cell junction, and is responsible for sustained transmission of intracellular signals. In three-dimensional collagen matrices interaction between CD45RO positive human T cells and autologous antigen-presenting dendritic cells (DC) showed a stereotypical, dynamic pattern. i) First contact was initiated through the leading edge of the migrating T cell. ii) The T cell continued to migrate across the surface of the APC during the dynamic contact with the DC, only interrupted by short static episodes or even rounding. T cell morphology during the migration on the DC was polarized, with a sticky tail called uropod being in continuous contact to the DC surface. The leading edge on the contrary continuously interacted with both the DC-surface and the surrounding interphase, iii) eventually resulting in active traction of the T cell front and body away from the DC. The uropod either detached from the DC surface as well or retained the T cell in contact to the DC, thereby prolonging the interaction. In order to characterize the dynamic molecular pattern of the contact plane a new method for visualization of lipid rafts with BTRITC within living cells in 3D extracellular matrix was established. In summary, a new 3-step-concept of dynamic and productive interactions between T cells and dendritic cells in vitro can be shown. The assymetric interaction plane between the polarized T cell and the DC implies discrete functions of leading edge and uropod of the T cell. A new form of dynamic interaction for signaling between mobile cells has been defined morphologically. KW - Immunologie KW - Morphodynamik KW - T Zell-Aktivierung KW - Dendritische Zelle KW - Lipid Rafts KW - T cell activation KW - immunology KW - morphodynamics KW - dendritic cell KW - lipid rafts Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-15397 ER -