TY - THES A1 - Wuttke, Martin T1 - Die Kommunikation zwischen Aldosteron, dem humanen Mineralokortikoidrezeptor und der cAMP/CRE - Signalkaskade T1 - The communication between Aldosterone, the human mineralocorticoid receptor and the cAMP/CRE signal pathway N2 - Doktorarbeit über den Einfluss von Aldosteron auf den intrazellulären Betarezeptorsignalweg. Erklärungsansatz für profibrotische Effekte von Aldosteron. N2 - Dissertation about the influence of aldosterone on the intracellular beta receptor pathway. Proposal for a mechanism by which aldosterone may act profibrotic. KW - Aldosteron KW - Renin-Angiotensin-System KW - Beta-Rezeptor KW - Cyclo-AMP KW - Fibrose KW - Kollagen KW - Aldosterone KW - Beta-Receptor KW - cAMP KW - kollagen Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48072 ER - TY - THES A1 - von Hayn, Kathrin T1 - Untersuchungen zur Ca2+-abhängigen Regulation von cAMP in intakten vaskulären Myocyten T1 - Analysis of the Ca2+-dependent regulation of cAMP in intact vascular smooth muscle cells N2 - Die Regulation des Tonus glatter Muskelzellen wird entscheidend von den beiden antagonistisch wirkenden second messengern cAMP und Ca2+ beeinflusst. Ein Ziel dieser Arbeit war herauszufinden, ob diese beiden Botenstoffe auch direkten Einfluss aufeinander haben können und welche Enzyme in diesem Fall an den Prozessen beteiligt sind. cAMP-Signale in intakten Zellen konnten wir in Echtzeit mit Hilfe des FRET-basierten cAMP-Sensors Epac1-camps beobachten; Ca2+-Signale durch Markieren der Zellen mit Fura-2. Anstiege der intrazellulären Ca2+-Konzentration in VSMCs wurden durch Aktivierung von endogen exprimierten, Gq-gekoppelten P2Y6-Rezeptoren mit Uridindiphosphat (UDP) ausgelöst. Durch eine zusätzliche in-vitro Kalibrierung des Epac1-camps konnten darüber hinaus absolute cAMP-Konzentrationen in einzelnen lebenden Zellen berechnet werden. Während ein Anstieg der Ca2+-Konzentration auf nicht vorstimulierte VSMCs keinen signifikante Einfluss auf die intrazellulären cAMP-Konzentrationen hatte, bewirkte die Aktivierung der purinergen Rezeptoren einen deutlichen Rückgang der intrazellulären cAMP-Konzentration in mit Isoproterenol vorstimulierten VSMCs. Dieser Effekt konnte sowohl durch die Komplexierung von Ca2+ mit BAPTA-AM als auch durch die Überexpression der Ca2+-insensitiven AC4 antagonisiert werden. Adenylatcyclase-Aktivitäts-Assays in VSMC-Membranen zeigten ebenfalls einen Rückgang der Cyclaseaktivität nach Zugabe von 2 und 5 μM freiem Ca2+. Die Hemmung der einzigen Ca2+-regulierbaren PDE1 mit dem selektiven PDE1-Inhibitor 8-Methoxymethyl-IBMX (8-MM-IBMX) hatte im Gegensatz dazu keinen Einfluss auf die durch UDP verursachte Änderung der cAMP-Konzentration in vorstimulierten VSMCs. Schließlich bewirkte die Herunterregulation der Ca2+-inhibierbaren AC5 und 6 mit siRNA einen signifikante Hemmung des durch UDP verursachten Effekts. Fasst man alle diese Ergebnisse zusammen, so lässt sich folgende Schlussfolgerung ziehen: Der durch purinerge Stimulation verursachte Rückgang der cAMP-Konzentration in mit Isoproterenol vorstimulierten VSMCs wird durch eine Hemmung der Ca2+-hemmbaren AC5 und 6 vermittelt. Dadurch sind zwei für die Regulation des Tonus wichtige Signalwege in VSMCs miteinander verbunden, die sich somit gegenseitig entscheidend beeinflussen können. Ein weiterer Bestandteil dieser Arbeit war die Entwicklung eines transgenen Mausmodells, das glattmuskelspezifisch den cAMP-Sensor Epac1-camps exprimiert. Mit Hilfe eines solchen Tiermodells könnten in Zukunft cAMP-Änderungen in intakten Geweben und vielleicht sogar in lebenden Tieren beobachtet werden. Durch Anwendung des Cre-loxP-Rekombinationssystems gelang es eine glatt¬muskelspezifische, für den Epac1-camps transgene Mauslinie zu generieren. Mit isolierten VSMCs dieser Tiere konnten bereits erste FRET-Messungen durchgeführt und agonistinduzierte cAMP-Änderungen beobachtet werden. N2 - Regulation of smooth muscle tone is crucially determined by the antangonistic second messengers cAMP and Ca2+. One aim of this work was to investigate, if these two mediators can also affect each other directly and which enzymes take part in these processes. For observing cAMP signals in living cells with a temporally high resolution, we used the fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based cAMP sensor Epac1-camps. For monitoring changes in intracellular Ca2+, cells were labeled with Fura-2. Rises in intracellular Ca2+ were achieved by activation of on vascular smooth muscle cells (VSMCs) endogenously expressed Gq-coupled P2Y6 receptors with uridine diphosphate (UDP). Additional, in-vitro calibration of the Epac1-camps allowed the calculation of absolute cAMP concentrations in single living cells. An increase of Ca2+ concentrations in non-prestimulated VSMCs did not significantly influence intracellular cAMP concentrations. Activation of purinergic receptors of isoproterenol-prestimulated cells with UDP provoked a clear decrease of intracellular cAMP concentrations. This effect was blocked by the complexation of Ca2+ with BAPTA-AM as well as by overexpression of Ca2+-insensitive AC4. Furthermore, adenylyl cyclase activity assays in the presence of 2 and 5 μM free Ca2+ in VSMC membranes showed a decline in cyclase activity. Inhibition of PDE1, the only Ca2+-dependent phosphodiesterase (PDE), with the selective PDE1 inhibitor 8-methoxymethy-IBMX, in contrast, had no effect on UDP-evoked changes in cAMP concentrations in isoproterenol-prestimulated VSMCs. Finally, knockdown of Ca2+-inhibitable AC5 and 6 with siRNA significantly inhibited the UDP-evoked decrease in cAMP concentrations in isoproterenol-prestimulated VSMCs. To merge all these results, one can draw the following conclusion: The purinergically evoked decrease in cAMP concentrations in isoproterenol-prestimulated VSMCs is caused by an inhibition of AC5 and 6 which is mediated by Ca2+. This mechanism interlinks two essential antagonistic signaling pathways for the regulation of smooth muscle tone. An additional part of this work was to develop a transgenic mouse model, which expresses smooth-muscle-specifically Epac1-camps. In the future, these animals could provide the possibility to observe cAMP signals in intact tissues or even in living animals. With the help of the Cre-loxP recombination system, we achieved to generate such a smooth-muscle-specific transgene. Afterwards FRET measurements in isolated vascular smooth muscle cells of these animals were possible and we were also able to observe agonist-induced cAMP changes in these isolated cells. KW - Glatte Muskulatur KW - Cyclo-AMP KW - Calcium KW - Calcium KW - cAMP KW - vaskuläre glatte Muskelzellen KW - FRET KW - calcium KW - cAMP KW - vascular smooth muscle cells KW - FRET Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-47709 ER - TY - THES A1 - van Elten, Elisabeth T1 - Altersabhängige Vulnerabilität für supraventrikuläre und ventrikuläre Arrhythmien bei Popdc2-Nullmutanten T1 - Age-dependent vulnerability for supraventricular und ventricular arrhythmias in popdc2 null mutant mice N2 - Im Rahmen der Suche nach genetischen Korrelaten für die Suszeptibilität für Herzrhythmusstörungen wurde man auf die Genfamilie mit der sogenannten Popey-Domäne aufmerksam. Ein Gen aus dieser Familie ist das Popdc2-Gen, welches für Transmembranproteine codiert, die möglicherweise eine Rolle in der Zell-Adhäsion und Zell-Interaktion spielen. Diese fanden sich sowohl in adulten Mäusen als auch im Reizleitungssystem des menschlichen Herzens in höherer Dichte. Eine systemische elektrophyiologische Charakterisierung der Podpc2-Nullmutanten erbrachte normale AV-Überleitungseigenschaften und Sinusknotenerholzeit. Im Vergleich zu den Wildtyp-Mäusen zeigten die transgenen Tiere eine erhöhte ektope Aktivität im Ventrikel nach Katecholamin-Stimulation(z.B. Kammerflimmern), sowie öfter Vorhofflimmern nach Burstmanövern. Arrhythmien konnten signifikant häufiger bei Popdc2-Knockout-Mäusen > 9 Monaten nachgewiesen werden, dies könnte auf eine altersabhängige Alteration hindeuten. Möglicherweise spielt das Popdc2-Gen eine wichtige Rolle in der Pathogenese des plötzlichen Herztods durch ventrikuläre Arrhythmien. N2 - With the aim of identification of new genes with a heart restricted gene expression pattern the Popeye domain containing gene family has been isolated. The Popdc2 gene is a member of the Popeye domain containing gene family and the predominantly expressed Popeye gene in adult mouse and human heart. It was found to be present with elevated levels in the myocytes of the cardiac conduction system. As transmembrane proteins the Popdc proteins may participate in cell-adhesion and cell-to-cell interaction. Findings from the intracardiac electro-physiology studies demonstrated no significant differences in atrioventricular conduction properties and sinus node function between WT and Popdc2 the transgenic mice were shown to have a higher incidence of ventricular ectopy, including ventricular fibrillation, after catecholamine stimulation and a higher rate of atrial fibrillation after atrial burst-maneuvers compared to the WT animals. The fact that arrhythmias were found preferentially in Popdc2 mice > 9 month probably reflects an age dependent process in the heart. The Popdc2 gene may alter cardiac excitation properties what might be critical in the pathogenesis of sudden cardiac death due to reentry ventricular arrhythmia. KW - Herzrhythmusstörungen KW - ventrikuläre Tachykardie KW - Popdc KW - cAMP Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-105507 ER - TY - JOUR A1 - Tian, Yuehui A1 - Yang, Shang A1 - Gao, Shiqiang T1 - Advances, perspectives and potential engineering strategies of light-gated phosphodiesterases for optogenetic applications JF - International Journal of Molecular Sciences N2 - The second messengers, cyclic adenosine 3′-5′-monophosphate (cAMP) and cyclic guanosine 3′-5′-monophosphate (cGMP), play important roles in many animal cells by regulating intracellular signaling pathways and modulating cell physiology. Environmental cues like temperature, light, and chemical compounds can stimulate cell surface receptors and trigger the generation of second messengers and the following regulations. The spread of cAMP and cGMP is further shaped by cyclic nucleotide phosphodiesterases (PDEs) for orchestration of intracellular microdomain signaling. However, localized intracellular cAMP and cGMP signaling requires further investigation. Optogenetic manipulation of cAMP and cGMP offers new opportunities for spatio-temporally precise study of their signaling mechanism. Light-gated nucleotide cyclases are well developed and applied for cAMP/cGMP manipulation. Recently discovered rhodopsin phosphodiesterase genes from protists established a new and direct biological connection between light and PDEs. Light-regulated PDEs are under development, and of demand to complete the toolkit for cAMP/cGMP manipulation. In this review, we summarize the state of the art, pros and cons of artificial and natural light-regulated PDEs, and discuss potential new strategies of developing light-gated PDEs for optogenetic manipulation. KW - cyclic nucleotides KW - phosphodiesterases (PDEs) KW - optogenetics KW - cAMP KW - cGMP Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-236203 SN - 1422-0067 VL - 21 IS - 20 ER - TY - THES A1 - Stangl, Christoph T1 - Lichtgesteuerte Manipulation Zentraler Second Messenger in Pflanzen T1 - Manipulation of Crucial Second Messengers in Plants by light N2 - In der vorliegenden Arbeit wurden lichtaktivierte Nucleotidcyclasen auf Basis der lichtaktivierten Adenylatcyclase bPAC (=BlaC, Ryu et al., 2010; Stierl et al., 2011), sowie der direkt lichtaktivierbare Kationenkanal Channelrhodopsin-2 (Nagel et al., 2003) eingesetzt, um lichtinduzierte und damit nicht-invasive Manipulationen der Second Messenger cAMP, cGMP und Calcium, sowie des Membranpotentials in Pflanzenzellen vorzunehmen. Nach transienter Transfektion von N. benthamiana konnte sowohl die Expression der beiden Channelrhodopsinvarianten C128A::YFP und C128T::YFP (unveröffentlichte Daten von R. Gueta und G. Nagel, 2008, Berndt et al., 2009; Bamann et al., 2010), als auch deren Lokalisation in der Plasmamembran von Protoplasten fluoreszenzmikroskopisch gezeigt werden. Die Funktion von Channelrhodopsin als lichtaktivierbarer Kationenkanal konnte in dieser Arbeit erstmals elektrophysiologisch in Pflanzenzellen nachgewiesen werden. In Einstichmessungen im Mesophyllgewebe von N. benthamiana wurden reproduzierbar blaulichtinduzierte Depolarisationen der Plasmamembran erzielt, die in Dauer und Frequenz über das applizierte Lichtmuster steuerbar waren. In Patch-Clamp-Messungen an epidermalen Protoplasten von N. benthamiana, welche transient Channelrhodopsin-2-C128A und Channelrhodopsin-2-C128T exprimierten, konnten zudem blaulichtinduzierte Einwärts-Ströme gezeigt werden. Die Expression der beiden verwendeten Channelrhodopsinvarianten schien hierbei annähernd unabhängig von der vorliegenden Konzentration des zugegebenen Retinals. Des Weiteren konnte in A. thaliana sowohl die Expression als auch die Funktion der lichtaktivierbaren Adenylatcyclase bPAC::YFP (Stierl et al., 2011), sowie einer hieraus durch gezielte Mutation (nach Ryu et al., 2010) abgeleiteten lichtaktivierbaren Guanylatcyclase (bPGC::YFP) erstmalig in höheren Pflanzen gezeigt werden. Nach Bestätigung der Funktion dieser beiden lichtaktivierbaren Nucleotidcyclasen in transient transfizierten Protoplasten von A. thaliana wurden zwei stabil transgene Pflanzenlinien generiert. ZUSAMMENFASSUNG DER ARBEIT - 190 - Pflanzen dieser Linie exprimierten neben dem konstitutiv unter der Kontrolle des 35S-CaMV-Promotors exprimierten Calciumreporterprotein Aequorin zusätzlich und unter der Kontrolle eines östrogeninduzierbaren Glucocorticoidpromotors (Zuo et al., 2000) die lichtaktivierten Nucleotidcyclasen bPAC::YFP bzw. bPGC::YFP. In beiden stabil transgenen Pflanzenlinien wurden Expression und Funktion der jeweiligen lichtaktivierten Nucleotidcyclase gezeigt. In Messungen an einem modifizierten Luminometer konnten weiterhin erstmals blaulichtinduzierte Calciumsignaturen in Pflanzenzellen generiert werden. Auf die Folge von Blaulichtpulsen kam es wiederholt zum Calciumeinstrom in Zellen der erstellten transgenen Pflanzenlinien. Neben der Möglichkeit, sowohl die Konzentration der cyclischen Nucleotide als auch des cytoplasmatischen Calciums über Licht zu manipulieren, wurde durch diese Pflanzen ein direkter Zusammenhang beider Second Messenger gezeigt. Weiterhin sind phänotypische Auffälligkeiten der erstellten Pflanzenlinien beobachtet worden. Es kam zur Verzögerung des Keimungszeitpunktes bPAC::YFP-exprimierender Samen im Licht, jedoch wuchsen die Pflanzen im Anschluss an die verzögerte Keimung normal und uneingeschränkt weiter. In bPAC::YFP-exprimierenden Pollen von Nicotiana SR-1 konnte zudem das Wachstum der Pollenschläuche durch blaues Licht gestoppt werden. bPGC::YFP-exprimierende Pollen hingegen zeigten auch im blauen Licht unverändertes Pollenschlauchwachstum. Neben den beiden erfolgreich generierten, stabil transgenen Pflanzenlinien wurden in analogen Ansätzen transgene A. thaliana Col-0 Aequorin Zellkulturlinien generiert, die neben dem konstitutiv aktiven Calciumreporterprotein Aequorin ebenso bPAC::YFP bzw. bPGC::YFP unter der Kontrolle des östrogeninduzierbaren Glucocorticoidpromotors (Zuo et al., 2000) exprimierten. Auch hier konnten Expression und Funktion beider Nucleotidcyclasen immunologisch und fluoreszenzmikroskopisch gezeigt werden. Über den Einsatz einer sog. 2A-Sequenz wurde weiterhin ein funktionsfähiges Fusionskonstrukt aus dem cAMP-aktivierten Kationenkanal CNGA2 (C460W-E583M, nach Rich et al., 2001) und der lichtaktivierten Adenylatcyclase EuPACα (Iseki et al., 2002) erstellt. Die Funktion dieses Fusionskonstruktes wurde elektrophysiologisch sowie immunologisch gezeigt. N2 - In this study, light-activated nucleotide cyclases based on bPAC (= BlaC, Ryu et al., 2010; Stierl et al., 2011), and the direct light-activated cation channel channelrhodopsin-2 (Nagel et al., 2003) have been used to non-invasively manipulate the level of the second messengers cAMP, cGMP and calcium as well as the membrane potential in plant cells by means of light. After transient transfection of N. benthamiana, the expression of the two channelrhodopsin variants C128A and C128T (unpublished data from Ronnie Gueta and G. Nagel 2008; Berndt et al., 2009; Bamann et al., 2010) as well as their correct localization in the plasma membrane, was shown by fluorescence microscopy imaging. The general function of channelrhodopsin as a light-activated cation channel was shown for the first time electrophysiologically in higher plants. Using impalement measurements on leaf discs, blue-light-induced depolarizations of the plasma membrane could reproducibly be evoked, which followed the given light pattern in duration and frequency. By Patch-Clamp recordings on N. benthamiana protoplasts, clear blue-light-induced inward currents were demonstrated. The expression of both employed channelrhodopsin variants C128A and C128T was almost independent from supplementation of Retinal during their expression. Furthermore, expression and function of the light activated adenylyl cyclase bPAC::YFP (Stierl et al., 2011) and a therefrom derived light activated guanylyl cyclase bPGC::YFP (according to Ryu et al., 2010) was shown for the first time in higher plants. Two stable transgenic plant lines have been generated, which, aside to the constitutively expressed calcium reporter protein Aequorin, express the light-activated nucleotide cyclases bPAC::YFP and bPGC::YFP, respectively, under the control of an estrogen-inducible glucocorticoid promotor (Zuo et al., 2000). Also in these transgenic plants, expression and function of both light-activated nucleotide cyclases was shown. ZUSAMMENFASSUNG DER ARBEIT - 192 - For the first time, blue-light-induced calcium signatures in plant cells were evoked by illumination of leafdiscs of the transgenic plant lines as an implication of an elevated cNMP-level. Beside the possibility to manipulate cNMP-levels as well as the free cytoplasmic calcium concentration in those plants by means of light, a direct interrelation between these two second messengers was shown. Also physiological impairments in the generated plant lines were observed. The germination of bPAC::YFP expressing seeds was considerably delayed when grown in light. Further, the pollen tube growth of transiently bPAC::YFP-transfected pollen of Nicotiana SR-1 was fully stopped by illumination with blue light, whereas normal growth was documented under dark conditions. In contrast, bPGC-transfected pollen did not show affected growth of their pollen tubes neither in darkness nor upon blue light illumination. Beside the generated stable transgenic plant lines, two stable transgenic Arabidopsis thaliana Col-0-Aequorin cell-culture lines have been generated in an analogous approach. Also in this case, the expression of bPGC::YFP and bPAC::YFP was estrogen-inducibly expressed under control of the glucocorticoid-promotor (Zuo et al., 2000), and expression as well as function was shown by means of fluorescence microscopy imaging and cNMP-quantification using ELISA. Furthermore, a fused construct of the cAMP-gated cation channel CNGA2 (C460W-E583M, according to Rich et al., 2001) and the light activated adenylyl-cyclase EuPACα (Iseki et al., 2002) was cloned using a 2A-sequence (Tang et al., 2009) and expressed in oocytes. The function of this construct has been shown electrophysiologically and immunologically. KW - Calciumion KW - Sekundärer Bote KW - Cyclo-AMP KW - Cyclo-GMP KW - Calcium KW - cAMP KW - cGMP KW - lichtgesteuerte Manipulation KW - Calcium KW - cAMP KW - cGMP KW - lightinduced manipulation KW - Pflanzen KW - Licht Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85940 ER - TY - THES A1 - Pitsch, Maximilian Jonathan T1 - Zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP) als Äquivalent akkumulierter neuronaler Evidenz T1 - Cyclic adenosine monophosphate (cAMP) as an equivalent of accumulated neuronal evidence N2 - Die vier Crz-Neurone des ventralen Nervensystems von Drosophila melanogaster sammeln Evidenz, wann im Rahmen eines Paarungsakts zirka 6 Minuten vergangen sind. Diese Entscheidung ist für die männliche Fliege von Bedeutung, da das Männchen vor Ablauf dieser ~6 Minuten, welche den Zeitpunkt der Ejakulation darstellen, eher das eigene Leben opfern würde, als dass es die Paarung beenden würde. Nach Ablauf der ~6 Minuten fällt die Motivation des Männchens dagegen dramatisch ab. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde zunächst mittels optogenetischer neuronaler Inhibitionsprotokolle sowie Verhaltensanalysen das Phänomen der Evidenz-akkumulation in den Crz-Neuronen genauer charakterisiert. Dabei zeigte sich, dass die akkumulierte Evidenz auch während einer elektrischen Inhibition der Crz-Neurone persistierte. Dieses Ergebnis warf die Hypothese auf, dass das Äquivalent der akkumulierten Evidenz in den Crz-Neuronen biochemischer Natur sein könnte. Es wurde daraufhin ein Hochdurchsatzscreening-Verfahren entwickelt, mittels dessen 1388 genetische Manipulationen der Crz-Neurone durchgeführt und auf eine Änderung der Evidenzakkumulation getestet wurden. Nur ~30 genetische Manipulationen zeigten eine veränderte Evidenzakkumulation, wobei die meisten dieser Manipulationen den cAMP-Signalweg betrafen. Mittels der optogenetischen Photoadenylatzyklase bPAC, einer Reihe weiterer genetischer Manipulationen des cAMP-Signalwegs sowie der ex vivo Kalzium-Bildgebung und Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie konnte bestätigt werden, dass cAMP das Äquivalent der in den Crz-Neuronen spannungsabhängig akkumulierten Evidenz darstellt, wobei die Kombination dieser Methoden nahelegte, dass der Schwellenwert der Evidenzakkumulation durch die cAMP-Bindungsaffinität der regulatorischen PKA-Untereinheiten festgelegt sein könnte. Mittels genetischer Mosaikexperimente sowie bildgebenden Verfahren konnte darüber hinaus gezeigt werden, dass innerhalb des Crz-Netzwerks eine positive Rückkopplungsschleife aus rekurrenter Aktivität sowie der cAMP-Akkumulation besteht, welche, sobald die cAMP-Spiegel den Schwellenwert erreichen, zu einem netzwerkweit synchronisierten massiven Kalziumeinstrom führt, was die Abgabe des Crz-Signals an nachgeschaltete Netzwerke triggert. Dieses Phänomen könnte ein Analogon des Aktionspotenzials auf Netzwerkebene sowie auf Intervallzeitskalen darstellen und wurde als „Eruption“ bezeichnet. Genetische, optogenetische sowie Bildgebungsexperimente konnten zeigen, dass die CaMKII derartige Eruptionen durch Niedrighalten der cAMP-Spiegel unterdrückt, was den Zeitmessmechanismus des ersten beschriebenen Intervallzeitmessers CaMKII offenlegt. N2 - The four Crz neurons of the ventral nervous system of Drosophila melanogaster collect evidence about when approximately 6 minutes have elapsed during a mating act. This decision is of importance for the male fly as the male would rather sacrifice his own life than terminate mating before the expiration of these ~6 minutes, which represent the time of ejaculation. After these ~6 minutes, however, the male's motivation drops dramatically. In this dissertation, optogenetic neuronal inhibition protocols as well as behavioral analyses were used to characterize the phenomenon of evidence accumulation in the Crz neurons in more detail. This showed that the accumulated evidence persisted during electrical inhibition of the Crz neurons. This result raised the hypothesis that the equivalent of accumulated evidence in the Crz neurons might be biochemical in nature. A high-throughput-screening-assay was developed using which 1388 genetic manipulations of the Crz neurons were performed and tested for a change in evidence accumulation. Only ~30 genetic manipulations showed altered evidence accumulation, with most of these manipulations involving the cAMP pathway. Using the optogenetic photoadenylyl cyclase bPAC, a number of other genetic manipulations of the cAMP pathway, as well as ex vivo calcium imaging and fluorescence lifetime microscopy techniques, it was confirmed that cAMP represents the equivalent of accumulated evidence in the Crz neurons, and the combination of these methods suggested that the evidence accumulation threshold may be set by the cAMP-binding affinity of regulatory PKA subunits. Using genetic mosaic experiments as well as imaging techniques, it was further shown that within the Crz network there is a positive feedback loop between the recurrent activity as well as the cAMP accumulation, which, once cAMP levels reach the threshold, leads to a network-wide synchronized massive calcium influx, triggering the delivery of the Crz signal to downstream networks. This phenomenon could represent an analog of the action potential at the network level as well as at interval time scales and has been termed an "eruption." Genetic, optogenetic as well as imaging experiments could show that CaMKII suppresses such eruptions by keeping cAMP levels low, revealing the timing mechanism of CaMKII, the first described interval timer. KW - Evidenz KW - Drosophila KW - Biologische Uhr KW - cAMP KW - Intervallzeitmessung Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-351292 ER - TY - THES A1 - Peter, Dominik T1 - Reorganisation der Zellkontakte der Endothelbarriere bei der Stabilisierung durch cAMP und Rac1 T1 - Reorganization of Intercellular Junctions in Stabilization of Endothelial Barrier Functions by cAMP and Rac1 N2 - Zwischen Blutkompartiment und umliegenden Interstitium besteht eine Barriere, die durch eine einzelne Schicht aus Endothelzellen gebildet wird. Essentiell für diese Barriere, deren Funktion in der Begrenzung des Austausches von Flüssigkeit und gelösten Stoffen liegt, sind interzelluläre Junktionen, welche die Endothelzellen miteinander verbinden. Durch eine gestörte Funktion und Regulation der Endothelbarriere entstehen beim Menschen verschiedene Pathologien wie zum Beispiel Ödeme, hämorrhagischer Schlaganfall und vaskuläre Malformationen. Es ist bekannt, dass cAMP die Endothelbarriere zum Teil durch Aktivierung der kleinen GTPase Rac1 stabilisiert. Trotz der großen medizinischen Relevanz dieses Signalweges, sind die damit einhergehenden Effekte auf die interzellulären Kontakte auf ultrastruktureller Ebene weitgehend unbekannt. In mikrovaskulären Endothelzellkulturen kam es ähnlich wie in intakten Mikrogefäßen zur Stärkung der Barrierefunktion. So resultierte sowohl nach Behandlung mit Forskolin und Rolipram (F/R), welche zur Steigerung der intrazellulären cAMP-Spiegel führen, als auch nach Zugabe von 8-(4-chlorophenylthio)-2´-O-methyladenosin-3´,5´-cyclic monophosphorothioate (O-Me-cAMP), einem selektiven Aktivator des cAMP nachgeschalteten Epac/Rap1-Signalweges, ein Anstieg des TER; außerdem konnte durch beide Substanzen (F/R und O-Me-cAMP) die Aktivierung von Rac1 induziert werden. Desweiteren wurde eine verstärkte Intensität und Linearisierung des Immunfluoreszenzsignals der Zelljunktionsproteine VE-Cadherin und Claudin5 entlang der Zellgrenzen beobachtet. In der ultrastrukturellen Analyse der interzellulären Kontaktzonen-Architektur zeigte sich unter F/R- oder O-Me-cAMP-Exposition ein signifikanter Anstieg an komplexen Interdigitationen. Diese komplexen Strukturen waren dadurch charakterisiert, dass sich die Membranen benachbarter Zellen, die durch zahlreiche endotheliale Junktionen stabilisiert wurden, über vergleichsweise lange Distanzen eng aneinanderlegten, so dass ein deutlich verlängerter Interzellularspalt resultierte. Die Inhibition der Rac1-Aktivierung durch NSC-23766 verminderte die Barrierefunktion und blockierte effektiv die O-Me-cAMP-vermittelte Barrierestabilisierung und Reorganisation der Kontaktzone einschließlich der Junktionsproteine. Demgegenüber konnte die F/R-vermittelte Barrierestabilisierung durch NSC-23766 nicht beeinträchtigt werden. Parallel dazu durchgeführte Experimente mit makrovaskulären Endothelien zeigten, dass es in diesem Zelltyp unter Bedingungen erhöhter cAMP-Konzentrationen weder zur Rac1-Aktivierung noch zur Barrierestärkung oder Kontaktzonen-Reorganisation kam. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass in mikrovaskulären Endothelien Rac1-vermittelte Änderungen der Kontaktzonen-Morphologie zur cAMP-induzierten Barrierestabilisierung beitragen. N2 - Evidence exists that cAMP stabilizes the endothelial barrier in part via activation of the small GTPase Rac1. However, despite the high medical relevance of this signaling pathway, the mechanistic effects on intercellular contacts on the ultrastructural level are largely unknown. In microvascular endothelial cell monolayers, in which increased cAMP strengthened barrier properties similar to intact microvessels in vivo, both forskolin and rolipram (F/R) to increase cAMP and 8-(4-chlorophenylthio)-2´-O-methyladenosine-3´,5´-cyclic monophosphorothioate (O-Me-cAMP) to stimulate exchange protein directly activated by cAMP/Ras proximate-1 (Epac/Rap1) signaling enhanced transendothelial electrical resistance (TER) and induced activation of Rac1. Concurrently, augmented immunofluorescence intensity and linearization of signals at cell borders were observed for intercellular junction proteins VE-cadherin and claudin5. Ultrastructural analysis of the intercellular contact zone morphology documented that exposure to F/R or O-Me-cAMP led to a significant increase in the proportion of contacts displaying complex interdigitations of cell borders in which membranes of neighboring cells were closely apposed over comparatively long distances and which were stabilized by numerous intercellular junctions. Interference with Rac1 activation by NSC-23766 completely abolished both barrier stabilization and contact zone reorganization in response to O-Me-cAMP whereas F/R-mediated barrier enhancement was not affected by NSC-23766. In parallel experiments using macrovascular endothelium, increased cAMP failed to induce Rac1 activation, barrier enhancement and contact zone reorganization. These results indicate that in microvascular endothelium Rac1-mediated alterations in contact zone architecture contributes to cAMP-induced barrier stabilization. KW - Endothelbarriere KW - Endothelial barrier functions KW - Adhärens-/ Occludensjunktionen KW - cAMP KW - Rho GTPase KW - Rac1 KW - Epac KW - adherens tight junctions Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-97787 ER - TY - THES A1 - Nikolaev, Viacheslav T1 - Development and application of fluorescent cAMP und cGMP biosensors T1 - Entwicklung und Anwendung fluoreszierender Biosensoren für cAMP und cGMP N2 - The cyclic nucleotides cAMP and cGMP are two ubiquitous important second messengers, which regulate diverse physiological responses from vision and memory to blood pressure and thrombus formation. They act in cells via cAMP- and cGMP-dependent protein kinases (PKA and GK), cyclic nucleotide-gated channels and Epac. Although the concept of cyclic nucleotide signalling is well developed based on classical biochemical studies, these techniques have not allowed to analyze cAMP and cGMP in live cells with high temporal and spatial resolution. In the present study fluorescence resonance energy transfer was used to develop a technique for visualization of cAMP and cGMP in live cells and in vitro by means of fluorescent biosensors. Ligand-induced conformational change in a single nucleotide-binding domain flanked with green fluorescent protein mutants was used for dynamic, highly sensitive measurements of cAMP and cGMP. Such biosensors retained binding properties and chemical specificity of unmodified domains, allowing to image cyclic nucleotides in a physiologically relevant range of concentrations. To develop cAMP-sensors, binding domains of PKA, Epac and cAMP-gated HCN-channel were used. cGMP-sensors were based on single domains of GK and phosphodiesterases (PDEs). Sensors based on Epac were used to analyze spatio-temporal dynamics of cAMP in neurons and macrophages, demonstrating that cAMP-gradients travel with a high speed (~ 40 μm/s) throughout the entire cytosol. To understand the mechanisms of cAMP-compartmentation, kinetics properties of phosphodi-esterase (PDE2) were, next, analyzed in aldosterone producing cells. PDE2 is able to rapidly hydrolyze extensive amounts of cAMP, so that the speed of cAMP-hydrolysis is much faster than that of its synthesis, which might serve as a basis of compartmentation. cAMP-sensors were also used to develop a clinically relevant diagnostic method for reliable detection of β1-adrenergic receptor autoantibodies in cardiac myopathy patients, which has allowed to significantly increase the sensitivity of previously developed diagnostic approaches. Conformational change in a single binding domain of GK and PDE was, next, used to create novel fluorescent biosensors for cGMP. These sensors demonstrated high spatio-temporal resolution and were applied to analyze rapid dynamics of cGMP production by soluble and particulate guanylyl cyclases as well as to image cGMP in mesangial cells. In summary, highly sensitive biosensors for cAMP and cGMP based on single cyclic nucleotide-binding domains have been developed and used in various biological and clinically relevant applications. N2 - Die zyklischen Nukleotide cAMP and cGMP sind zwei ubiquitäre Botenstoffe, die verschiedene physiologische Prozesse regulieren, vom Sehen und Gedächtnis bis zu Blutdruck und Thrombusbildung. Sie wirken über cAMP- und cGMP-abhängige Kinasen (PKA und GK), Kanäle und Epac. Obgleich die Funktionen von zyklischen Nukleotiden in klassischen biochemischen Studien gut untersucht sind, ermöglichen diese Methoden nicht, cAMP und cGMP in lebenden Zellen mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung zu analysieren. In dieser Arbeit wurde Fluoreszenzresonanzenergietransfer benutzt, um eine Technik für die Visualisierung von cAMP and cGMP in lebenden Zellen und in vitro zu entwickeln. Ligand-induzierte Konformationsänderung in einer einzelnen, mit Grünfluoreszenzproteinmutanten fusionierten Bindungsdomäne diente als Grundlage für Biosensoren, die dynamische, hochsensitive Messungen von cAMP und cGMP ermöglichen. Bei solchen Sensoren wurden die chemischen und Bindungseigenschaften von unmodifizierten Domänen aufrechterhalten, was die cAMP- und cGMP-Messungen im physiologischen Konzentrationsbereich in lebenden Zellen ermöglicht. Für die Entwicklung der cAMP-Sensoren wurden die Domänen von PKA, Epac und von einem cAMP- gesteuerten HCN-Kanal benutzt. cGMP-Sensoren beruhen sich auf den Bindungsdomänen von GK und Phosphodiesterasen (PDEs). Mit Hilfe der auf Epac-basierten Sensoren wurde die cAMP-Dynamik in Neuronen und Makrophagen zeitlich und räumlich aufgelöst. In diesen Zellen diffundiert cAMP mit hoher Geschwindigkeit (~ 40 μm/s) frei durch das ganze Zytosol. Um die Mechanismen der cAMP-Kompartimentierung besser zu verstehen, wurden die kinetischen Eigenschaften der PDE2 in aldosteronproduzierenden Zellen analysiert. PDE2 ist imstande, große Mengen von cAMP äußerst schnell zu hydrolisieren, so dass die Geschwindigkeit der cAMP-Hydrolyse viel höher ist als von cAMP-Synthese, was eine Grundlage der cAMP-Kompartimentierung sein könnte. cAMP-Sensoren wurden auch benutzt, um eine klinisch relevante diagnostische Methode zu entwickeln, die Autoantikörper gegen β1-adrenergen Rezeptoren bei Herzinsuffizienzpatienten zuverlässig nachweist. Diese Methode hat ermöglicht, die Sensitivität der früher entwickelten Techniken zu verbessern. Konformationsänderung in einzelnen Bindungsdomänen von GK und PDE wurde als nächstes benutzt, um ein Reihe neuer fluoreszierender Biosensoren für cGMP zu entwickeln. Diese Sensoren zeigten hohe räumliche und zeitliche Auslösung und wurden zur Analyse schneller Dynamik von cGMP-Synthese und für cGMP-Imaging in Mesangialzellen angewandt. Zusammenfassend wurden hochsensitive Biosensoren für cAMP und cGMP auf Grund einzelner, mit Grünfluoreszenzproteinmutanten fusionierter Bindungs-domäne entwickelt und in verschiedenen biologischen und klinisch relevanten Applikationen eingesetzt. KW - Cyclo-AMP KW - Cyclo-GMP KW - Biosensor KW - Fluoreszenz KW - Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer KW - cAMP KW - cGMP KW - FRET KW - Fluoreszenz KW - Sensor KW - cAMP KW - cGMP KW - FRET KW - fluorescence KW - sensor Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-15673 ER - TY - THES A1 - Mayer, Christine Rita T1 - Zyklisches AMP kompensiert morphologische und funktionelle Defekte in isolierten Smn-defizienten Motoneuronen T1 - Cyclic AMP compensates morphological and functional defects in isolated Smn-deficient motoneurons N2 - Die proximale spinale Muskelatrophie (SMA) ist eine autosomal rezessive Erb-krankheit, welche durch fortschreitende Muskelatrophie mit Betonung der pro-ximalen Extremitäten, sowie zunehmende motorische Lähmungen charakterisiert wird. Bedingt wird diese neurodegenerative Erkrankung durch Mutation bzw. Deletion des SMN1-Gens auf Chromosom 5q13. Dies führt zu reduzierten Mengen des ubiquitär exprimierten SMN-Proteins, da der Verlust des SMN1-Gens nicht durch das noch verbleibende SMN2-Gen kompensiert werden kann. Die SMN-Promotor-Region enthält ein CRE II bindendes Element, welches Effekte von zyklischem Adenosinmonophosphat (cAMP) vermittelt und so die SMN-Transkription in untersuchten Zellen stimuliert. Ausgehend von diesem Befund stellte sich die Frage, ob cAMP dem Mangel an volllängen SMN bei der SMA entgegen wirkt. Daher wurden für diese Dissertation neurosphärenbildende kortikale Vorläuferzellen und primär kultivierte Motoneuronen von Smn+/+; SMN2- und Smn–/–;SMN2-Mausembryonen untersucht, um zu klären, ob die cAMP-Behandlung der Zellen zu einer Hochregulierung des SMN2-Transkripts führt, und durch die resultierende Erhöhung des SMN-Proteingehalts morphologische und funktionelle Defekte kompensiert werden. Die Untersuchung zeigte eine signifikante Zunahme des SMN2-Transkriptgehalts in Anwesenheit von cAMP. Dadurch kam es zu einem Anstieg der SMN-Proteinmenge im Soma, Axon und Wachstumskegel von Smn–/–;SMN2-Motoneuronen. Die Verteilungs-störung des SMN-Interaktionspartners hnRNP R mit fehlender kontrolltypischer Anreicherung im distalen Axon und Wachstumskegel von Smn–/–;SMN2-Motoneuronen wurde ebenfalls durch cAMP kompensiert. Smn-defiziente Mo-toneurone zeigten im Vergleich zu Kontrollzellen kleinere Wachstumskegel sowie ein Defizit an β-Aktin im distalen Axon. Zudem fehlte in Smn–/–;SMN2-Motoneuronen die bei Kontrollen ausgeprägte Zusammenlagerung von N-Typ spezifischen Ca2+-Kanälen in der Präsynapse, die nach Kontakt mit der β2-Kette des endplattenspezifischen Laminin-221 spontan öffnen und so einen in-trazellulären Kalziumanstieg bewirken, wodurch es zu Erregbarkeitsstörungen und Axonelongationsdefekten bei Smn-defizienten Motoneuronen kommt. Die Behandlung der Smn-defizienten Motoneuronen mit cAMP führte zur Vergrößerung der Wachstumskegelfläche und zu einer im Verlauf des Axons zunehmenden Anfärbung mit β-Aktin. Außerdem kam es zu einer Erhöhung der Menge an Cav2.2-Kanalprotein in den Wachstumskegeln Smn-defizienter Motoneurone, was mit einer erhöhten Erregbarkeit korrelierte und zu einer Normalisierung der Axonlänge von Smn–/–;SMN2-Motoneuronen auf Laminin-221 führte. Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen die Vermutung zu, dass Smn-defiziente Motoneurone in vivo Defekte im präsynaptischen Bereich der Motorendplatte aufweisen. In Zukunft können mit dem beschriebenen in vitro Assay weitere Substanzen, welche die SMN2-Traskription stimulieren, auf ihr kompensatorisches Potential getestet werden. N2 - Proximal autosomal recessive spinal muscular atrophy (SMA) is caused by mutation or deletion of the SMN1-gene on chromosome 5q13. The SMN promotor region contains a CRE II binding element, which mediates effects of cyclic adenosine monophosphate and stimulates the SMN transcription in examined cells. In animal models of SMA, spinal motoneurons exhibit reduced axon elongation and growth cone size. These defects correlate with reduced ß-actin protein levels in distal axons. In this study I examined primary cultured motoneurons from Smn+/+;SMN2- and Smn-/-;SMN2-mice embryos. The examination could show a significant increase of the SMN2 transcript by treating the cells with cAMP. The Smn protein level increases in the soma, axonal department and growth cones of Smn-deficient motoneurons which were treated with cAMP in cell culture. I could also show that Smn–deficient motoneurons exhibit severe defects in clustering Cav2.2 channels in axonal growth cones and that treating with cAMP compensate these defects. Growth cone size, axonal length, hnRNP R protein levels and ß-actin protein levels in distal axons being normalized by cAMP treating of the Smn-/-;SMN2-motoneurons. Other substances, which stimulate the SMN2 transcription, can be tested in the future with the in this study established in vitro assay. KW - cAMP KW - Spinale Muskelatrophie KW - Motoneuron KW - Actin KW - N-Typ Kalziumkanäle KW - SMN KW - cAMP KW - spinal muscular atrophy KW - N-type calcium channel KW - SMN KW - beta-actin Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-46457 ER - TY - JOUR A1 - Maiellaro, Isabella A1 - Lohse, Martin J. A1 - Kitte, Robert J. A1 - Calebiro, Davide T1 - cAMP Signals in Drosophila Motor Neurons Are Confined to Single Synaptic Boutons JF - Cell Reports N2 - The second messenger cyclic AMP (cAMP) plays an important role in synaptic plasticity. Although there is evidence for local control of synaptic transmission and plasticity, it is less clear whether a similar spatial confinement of cAMP signaling exists. Here, we suggest a possible biophysical basis for the site-specific regulation of synaptic plasticity by cAMP, a highly diffusible small molecule that transforms the physiology of synapses in a local and specific manner. By exploiting the octopaminergic system of Drosophila, which mediates structural synaptic plasticity via a cAMP-dependent pathway, we demonstrate the existence of local cAMP signaling compartments of micrometer dimensions within single motor neurons. In addition, we provide evidence that heterogeneous octopamine receptor localization, coupled with local differences in phosphodiesterase activity, underlies the observed differences in cAMP signaling in the axon, cell body, and boutons. KW - cAMP KW - synaptic plasticity KW - PDE KW - octopamine KW - FRET KW - active zone KW - dunce KW - GPCR Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-162324 VL - 17 IS - 5 ER - TY - THES A1 - Leweke, Rhea T1 - Die Rolle der NF-κB-Aktivierung beim LPS-induzierten Zusammenbruch der Endothelbarriere T1 - Role of NF-κB activation in LPS-induced endothelial barrier breakdown N2 - Eine intakte Endothelbarriere ist eine unabdingbare Voraussetzung für die uneingeschränkte Funktion sämtlicher Organe. Wird die Barrierefunktion durch entzündliche Prozesse gestört, so kommt es zum Austritt von Gefäßflüssigkeit ins Interstitium. Dies resultiert in Organversagen und ist Mitverursacher der hohen Sterblichkeit bei systemischen Entzündungsreaktionen und Sepsis. Vorangehende Untersuchungen haben bereits wichtige Mechanismen aufgedeckt, die zum Barriereverlust führen (Schlegel et al., 2009). In dieser Studie wurde untersucht, ob die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF ĸB für den LPS-induzierten Zusammenbruch der Endothelbarriere von Bedeutung ist. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass die Einwirkung von LPS in zwei verschiedenen Endothelzelllinien, den makrovaskulären PSEC sowie den mikrovaskulären HDMEC, zu einer signifikanten Aktivierung von NF ĸB führte. Dies wurde sowohl mittels Kernextraktionsversuchen als auch durch Immunfluoreszenzfärbungen nachgewiesen. Messungen des TER zeigten eine Abnahme des endothelialen Widerstands und folglich der Barrierefunktion nach Applikation von LPS, gefolgt von einer spontanen Regeneration der Barriere nach einer Inkubationszeit von 24 h. Eine Erhöhung des intrazellulären cAMP Spiegels durch Applikation von Forskolin/Rolipram verhinderte zwar die LPS induzierte Bildung interzellulärer Lücken, nicht jedoch die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF ĸB. Vielmehr verstärkte eine cAMP Erhöhung sogar eine NF ĸB Aktivierung in HDMEC nach 4 h, ohne die Morphologie der Endothelzelljunktionen zu schädigen. Der selektive NF ĸB Inhibitor NBD Peptid vermochte im Gegensatz dazu die LPS induzierte NF ĸB Aktivierung deutlich zu hemmen, verhinderte allerdings weder die interzelluläre Lückenbildung noch den Abfall des TER durch LPS. Im Gegenteil – da unter Einwirkung von NBD Peptid die spontane Regeneration des TER nach LPS Applikation ausblieb, schienen barrierekompromittierende Effekte von LPS durch Hemmung der NF ĸB Aktivierung mittels NBD-Peptid sogar verstärkt zu werden. In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen hemmte auch die Repression von NF ĸB p65 durch eine spezifische p65 siRNA den LPS induzierten Zusammenbruch der Endothelbarriere nicht. Weitere NF ĸB abhängige Proteine wie VASP und Caveolin 1, deren Beteiligung am Pathomechanismus von anderen Arbeitsgruppen vorgeschlagen wurde, blieben in unseren Experimenten unter LPS Exposition unverändert. Zusammenfassend scheint die NF ĸB Aktivierung initial nicht entscheidend am LPS induzierten Zusammenbruch der Endothelbarriere beteiligt zu sein. Unsere Ergebnisse legen vielmehr nahe, dass die Aktivierung des Transkriptionsfaktors möglicherweise Teil eines „Rescue“ Mechanismus sein könnte. N2 - An intact endothelial barrier is indispensable for the functioning of all organs. Inflammatory processes like sepsis lead to increased endothelial permability, causing edema which often result in organ failure. Previous studies uncovered important mechanisms leading to endothelial barrier breakdown (Schlegel et al., 2009). This study analyses if activation of NF ĸB is involved in LPS-induced damage to intercellular junctions. It is demonstrated that LPS leads to activation of NF ĸB in two different endothelial cell lines, PSEC and HDMEC, shown by nuclear extraction and immunofluorescence experiments. Measurements of TER visualise reduction of endothelial resistance and thus integrity of the endothelial barrier after application of LPS, followed by spontaneous regeneration after 24 hours. Increase of intracellular cAMP levels by application of Forskolin/Rolipram prevented LPS-induced intercellular gap formation, while activation of NF ĸB was not affected. Rather, increased cAMP levels intensified activation of NF ĸB in HDMEC after 4 h, without damaging morphology of endothelial cell junctions. The selective NF ĸB-inhibitor NBD-peptide prevented LPS-induced NF ĸB activation but not intercellular gap formation and reduction of TER. Because NBD-peptide blocked spontaneous regeneration of TER after LPS application, barrier compromising effects of LPS appeared to be intensified by inhibition of NF ĸB activation. In accordance with these results repression of NF ĸB p65 by siRNA did not prevent LPS-induced barrier breakdown. Other NF ĸB-dependent proteins like VASP and Caveolin-1, both suggested to be involved in the pathomechanism, remained unaffected. In summary, NF ĸB activation appears not to be initially involved in LPS-induced endothelial barrier breakdown. The results of this study suggest activation of NF ĸB might be part of a “rescue” mechanism. KW - Sepsis KW - Cyclo-AMP KW - Endothel KW - Endotoxin KW - LPS KW - Endothelbarriere KW - Sepsis KW - LPS KW - cAMP KW - endothelial barrier Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-83810 ER - TY - THES A1 - Lechner, Barbara Dorothea T1 - Modulation des axonalen Wachstums primärer Motoneurone durch cAMP in einem Mausmodell für die Spinale Muskelatrophie T1 - Modulation of axonal growth of primary spinal motor neurons by cAMP in a mouse model for Spinal Muscular Atrophy N2 - Die Spinale Muskelatrophie (SMA) ist eine häufige autosomal-rezessiv vererbte Erkrankung des motorischen Nervensystems bei Kindern. Ursache der Degeneration von spinalen Motoneuronen ist der homozygote Verlust des SMN- (survival of motoneuron) Gens und ein dadurch bedingter Mangel an SMN-Protein. Untersuchungen an Motoneuronen von Smn-defizienten Mäusen ergaben Störungen des axonalen Längenwachstums aufgrund einer Fehlverteilung des Zytoskelettproteins beta-Aktin und seiner mRNA in den Axonterminalen. Das Axonwachstum wird durch Aktin-Polymerisierung im Wachstumskegel gesteuert. beta-Aktin-mRNA findet sich auch in Axonen, und die lokale Proteinsynthese kann durch neuronale Aktivierung gesteigert werden. Das SMN-Protein ist am axonalen Transport von beta-Aktin beteiligt. In der vorliegenden Arbeit ergaben Western Blot-Analysen in neuralen Stammzellen (NSC) sowie spinalen Motoneuronen in vitro eine Steigerung der SMN-Proteinexpression durch 8-CPT-cAMP. Zur Untersuchung der Auswirkungen der erhöhten SMN-Proteinmenge auf die Pathologie der Motoneurone wurde ein in-vitro-Assay entwickelt, mit dessen Hilfe gezeigt werden konnte, dass eine Behandlung mit 100 µM 8-CPT-cAMP die axonalen Veränderungen isolierter embryonaler Smn-defizienter Motoneurone kompensieren kann. Motoneurone von 14 Tage alten Smn-defizienten und Kontroll-Mausembryonen wurden über sieben Tage hinweg auf einer Matrix aus Poly-Ornithin und Laminin-111 bzw. Laminin-121/221 kultiviert und mit 100µM cAMP und neurotrophen Faktoren behandelt. Nach Fixierung wurden die Zellen mit Antikörpern gegen Islet-1/2, tau und beta-Aktin gefärbt, mit Hilfe eines konfokalen Mikroskops fotografiert und digital vermessen. 8-CPT-cAMP erhöht den beta-Aktin-Gehalt in den axonalen Wachstumskegeln von Smn-defizienten Motoneuronen. Die Größe der Wachstumskegel nimmt durch die Behandlung um das 2-3fache zu und erreicht normale Werte. Auf Laminin-111 bleibt das Längenwachstum der Axone durch 100µM 8-CPT-cAMP unbeeinflusst, auf Laminin-121/221 wird das Längenwachstum normalisiert. Die beta-Aktin-Verteilung innerhalb der Axone und Wachstumskegel von Smn-defizienten Motoneuronen erscheint durch die cAMP-Behandlung nahezu normalisiert. Die Wiederherstellung der beta-Aktin-Verteilung in Wachstumskegeln durch cAMP kann große Auswirkungen auf die Funktionalität der Motoneurone haben. Die Ergebnisse sind möglicherweise ein erster Schritt auf dem Weg zu einer Therapie für die Spinale Muskelatrophie. N2 - Spinal muscular atrophy (SMA) is an autosomal recessive disorder characterized by loss of alpha-motoneurons in the spinal chord due to low levels of the survival motor neuron (SMN) protein. The genetic cause is the homozygous loss or mutation of the telomeric SMN1 gene and retention of the centromeric SMN2 gene, whose transcripts consist of about 90% truncated and unstable and only 10% functional protein. Motoneurons of Smn-deficient SMN2 transgenic mouse embryos cultured on laminin-1 show abnormalities compared to wildtype controls such as shorter axons, smaller growth cones and a ß-actin protein and mRNA deficit in the distal part of the axon. ß-actin plays a major role in growth cone motility and transmitter release at the presynapse. In addition, SMN works in a complex to transport ß-actin mRNA, which is known to be localized and locally translated in axons and growth cones, along the axon. Local ß-actin protein synthesis can be stimulated by increased neuronal activation. We determined the effects of cAMP on ß-actin localisation in axons as well as on axonal growth parameters in Smn-deficient primary motoneurons. Motoneurons of 14 days old Smn-/-, SMN2 transgenic and wildtype mouse embryos were cultured on laminin for 7 days with 100µM 8-CPT-cAMP and neurotrophic factors BDNF and CNTF. Fluorescence staining and digital measurements revealed a major effect of cAMP treatment on ß-actin distribution and growth cone size, which were restored to normal. Neurite lengths on laminin-111 remained unaffected but were normalized on substrate containing a synapse-specific ß2-laminin isoform. Western blots with neural stem cells (NSC) and heterozygous Smn+/-; SMN2 transgenic motoneurons treated with 100µM cAMP showed a marked upregulation of Smn protein expression. These data point to an important role for cAMP as a possible target of SMA drug therapy. KW - Spinale Muskelatrophie KW - Motoneuron KW - Neurobiologie KW - Laminin KW - Actin KW - SMN KW - cAMP KW - SMN KW - cAMP KW - Spinal Muscular Atrophy Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-39585 ER - TY - THES A1 - Konrad, Charlotte T1 - Biochemische Charakterisierung von cAMP-Gradienten – Einfluss von Phosphodiesterasen T1 - Biochemical Characterization of cAMP Gradients – Influence of Phosphodiesterases N2 - Cyclisches Adenosinmonophosphat ist ein ubiquitärer zweiter Botenstoff zahlreicher Signalwege im menschlichen Körper. Auf eine Vielzahl verschiedenster extrazellulärer Signale folgt jedoch eine Erhöhung desselben intrazellulären Botenstoffs - cAMP. Nichtsdestotrotz schafft es die Zelle, Signalspezifität aufrecht zu erhalten. Ein anerkanntes, wenn auch bisher unverstandenes Modell, um dieses zu ermöglichen, ist das Prinzip der Kompartimentierung. Die Zelle besitzt demnach Areale verschieden hoher cAMP-Konzentrationen, welche lokal begrenzt einzelne Signalkaskaden beeinflussen und somit eine differenzierte Signalübertragung ermöglichen. Eine mögliche Ursache für die Ausbildung solcher Bereiche geringerer cAMP- Konzentrationen (hier als Domänen bezeichnet), ist die hydrolytische Aktivität von Phosphodiesterasen (PDEs), welche als einzige Enzyme die Fähigkeiten besitzen, cAMP zu degradieren. In dieser Arbeit wird der Einfluss der cAMP-Hydrolyse verschiedener PDEs auf die Größe dieser Domänen evaluiert und mit denen der PDE4A1 verglichen, welche bereits durch unsere Arbeitsgruppe aufgrund ihrer Größe als Nanodomänen definiert wurden. Der Fokus wird dabei auf den Einfluss von kinetischen Eigenschaften der Phosphodiesterasen gelegt. So werden eine PDE mit hoher Umsatzgeschwindigkeit (PDE2A3) und eine PDE mit hoher Substrataffinität (PDE8A1) verglichen. Mithilfe sogenannter Linker, Abstandshaltern definierter Länge, werden zusätzlich die Nanodomänen ausgemessen, um einen direkten Zusammenhang zwischen Größe und kinetischer Eigenschaft anzugeben. Die Zusammenschau der Ergebnisse zeigt, dass die maximale Umsatzgeschwindigkeit der Phosphodiesterasen direkt mit der Größe der Nanodomänen korreliert. Durch den unmittelbaren Vergleich der gesamten PDE mit ihrer katalytischen Domäne wird zusätzlich der Einfluss von regulatorischen Domänen evaluiert. Es wird gezeigt, dass diese cAMP-Gradienten modulieren können. Bei der PDE2A3 geschieht die Modulation u.a. durch Stimulation mit cGMP, welche höchstwahrscheinlich dosisabhängig ist und somit graduell verläuft. Hiermit präsentieren sich die Domänen als dynamische Bereiche, d.h. sie können in ihrer Ausprägung reguliert werden. In dieser Arbeit wird die Hypothese bestätigt, dass Phosphodiesterasen eine wichtige Rolle in der Kompartimentierung von cAMP spielen, die Gruppe jedoch inhomogener ist, als bislang angenommen. Die Gradienten-Bildung lässt sich nicht bei jeder Phosphodiesterase darstellen (PDE8A1). Einige Phosphodiesterasen (PDE2A3) jedoch bilden Kompartimente, die durch externe Stimuli in ihrer Größe reguliert werden können. Die Arbeit legt den Grundstein zur breiteren Charakterisierung des spezifischen Einflusses weiterer PDEs auf cAMP-Kompartimentierung, welches nicht nur das Verständnis der Kompartimentierungs-Strategien voranbringt, sondern auch essentiell für das Verständnis der Pathophysiologie zahlreicher Krankheitsbilder, aber auch für das Verständnis bereits angewandter aber auch potentiell neuer Medikamente ist. N2 - Cyclic AMP is a ubiquitous second messenger, which is involved in a huge variety of signaling pathways. Nevertheless, thinking about signaling specificity, it is unclear how numerous diverse signals are all translated via the same second messenger. However, to ensure downstream specificity there is one accepted model - the compartmentalization of cAMP. Different levels of cAMP therefore lead to signaling islets or areas, which ensure a more diverse downstream signaling. One example, which guarantees areas with lower cAMP concentration, is the local hydrolysis of cAMP due to phosphodiesterases’ hydrolytic activity. In this thesis the ability of different phosphodiesterases to build cAMP gradients is compared to the ability of the PDE4 to build cAMP domains in the scale of nanometers, which was already shown by our group. To discriminate influence factors of the formation of those nanodomains, the focus was set on distinct PDEs’ kinetic properties. Therefore, a PDE with a high velocity (PDE2A3) for cAMP hydrolysis is compared to the PDE with the highest known affinity (PDE8A1) to cAMP. Furthermore, with the tools provided by our group, linkers, which are “nanorulers” of distinct size, were used to directly measure the radius of those domains. It is revealed, that the size of the nanodomains directly correlates with the hydrolysis velocity. Furthermore, by comparison of full length PDE with its catalytic domain, it is shown, that their regulatory domains can modulate the ability of phosphodiesterases to create cAMP gradients. In PDE2A3, modulation of cAMP gradients was observed upon cGMP stimulation, which probably occurs in a concentration-dependent matter. Thus, cAMP domains seem to be dynamic areas, i.e. they can be regulated in their size. It is postulated, that phosphodiesterases are one important force for creating compartments, but the family of PDEs itself is inhomogeneous. Not every PDE can build detectable compartments (PDE8A1), but others can build compartments, which are regulated through external stimuli (PDE2A3). The thesis builds the foundation for additional characterization of the other PDE families, which would provide further insight in strategies of cAMP compartmentalization. Moreover, the knowledge of distinct functions of PDEs on cAMP compartments is crucial for the understanding of the pathophysiology of several diseases and the understanding of present and future pharmacological therapies. KW - Cyclo-AMP KW - Phosphodiesterase KW - cAMP KW - PDE Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-205728 ER - TY - THES A1 - Jha, Mithilesh Kumar T1 - Protein Kinase A regulates GATA-3 dependent Activation of IL-5 Gene Expression in T Helper Lymphocytes T1 - XX N2 - Die durch Agentien wie IL-1α, Prostaglandine oder Forskolin induzierte Erhöhung von intrazellulärem zyklischem Adenosin-Monophosphat (cAMP) in T-Lymphozyten inhibiert die Synthese Th1-typischer Zytokine und stimuliert die Synthese Th2-typischer Zytokine. Die für die cAMP-vermittelte Induktion von Th2-Zytokinen verantwortlichen Signaltransduktionskaskaden sind bisher nur unvollständig aufgeklärt. Deshalb konzentrierte sich meine Dissertation auf die Erforschung des cAMP-Signalweges in primären T-Helferzellen. Während die Induktion muriner EL-4 T-Zellen mit Forskolin sowohl zur Aktivierung Th2-typischer als auch zur Inhibierung Th1-typischer Lymphokine führt, kann die ektopische Expression einer katalytisch aktiven Proteinkinase A (PKA) zwar die Synthese von Th2-typischen Lymphokinen stimulieren, nicht jeder die Expression Th1-typischer Lymphokine inhibieren. Dies bedeutet, dass die Aktivierung von PKA selektiv an der Stimulation der Th2-Lymphokinexpression beteiligt ist, während andere, cAMP-abhängige Signaltransduktionswege zur Inhibierung Th1-typischer Lymphokine führen. Durch vergleichende Analysen verschiedener Th-Zellen konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass durch aktive PKA in Th0- und Th2, nicht jeder in Th1-Zellen die Expression von IL-5 erhöht wird. Dieses Phänomen ist wahrscheinlich auf die unterschiedliche Konzentration des Transkriptionsfaktors GATA-3 zurückzuführen. So kommt GATA-3 in Th2-Zellen in hoher, in Th0-Zellen in geringerer und in Th1-Zellen in sehr geringer Konzentration vor. Die ektopische Expression von GATA-3 in Th1-Zellen induziert die Synthese Th2- typischer Lymphokine, die durch erhöhte cAMP-Konzentration oder durch aktive PKA noch verstärkt werden kann. Untersuchungen bezüglich des Einflusses erhöhter cAMP-Spiegel auf Th2- Lymphokine in der Th2-Zelllinie D10 zeigten, dass erhöhte cAMP-Konzentrationen nicht die PKA-Aktivität, sondern vielmehr die Aktivität der p38-Kinase stimuliert. Diese Aktivierung führt zur Phosphorylierung von GATA-3 und dadurch zur Induktion der IL-5- und IL-13-Expression (Chen et al., 2000). In primären T-Helferzellen, die im Mittelpunkt der hier vorgelegten Arbeit standen, konnte beobachtet werden, dass bereits die Expression der katalytischen Untereinheit α der PKA ausreichend für eine optimale IL-5-Expression in Th0-Zellen ist. Die Beobachtung, dass primäre Th2-Zellen sowohl auf die Behandlung mit dem spezifischen PKA-Inhibitor H-89 als auch auf die ektopische Expression der negativ wirkenden Untereinheit 1 der PKA mit signifikant verminderter IL-5-Produktion reagierten, unterstreicht die wichtige Rolle aktiver PKA bei der Regulation des IL-5 Gens. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit durch die Untersuchung verschiedener primärer CD4+ T-Lymphozyten, einschließlich der auch in vivo IL-5 produzierenden Th2-Zellen, gezeigt werden, dass der Adenylzyklase/cAMP/PKASignaltransduktionsweg bedeutend für die IL-5 Genexpression in primären Th2-Zellen und somit auch wichtig für deren Effektorfunktion ist. N2 - Elevation of intracellular cAMP in T lymphocytes, induced by agents such as IL-1α, prostaglandins or forskolin, inhibits Th1-type cytokine production but stimulates Th2-type cytokine production. The signaling pathway engaged in cAMP-mediated induction of Th2 lymphokines remains obscure and therefore my doctoral work was focused on the elucidation of cAMP pathway in primary Th lymphocytes. While forskolin treatment of EL-4 cells led both to an activation of Th2 lymphokines and inhibition of Th1 lymphokines, ectopic expression of catalytically active PKA stimulated Th2 lymphokines but failed to inhibit Th1 lymphokine expression. Thus, the PKA activity is selectively involved in the stimulation of Th2 lymphokine expression whereas other cAMP-dependent pathway(s) appears to downregulate Th1 lymphokines. By investigating different types of primary murine Th cells, it was found that active PKA enhanced IL-5 expression only in Th0 and Th2 but not in Th1 cells. This is likely due to the different levels of GATA-3 whose expression is high in Th2, moderate in Th0 and very low in Th1 cells. Ectopic expression of GATA-3 in Th1 cells induced Th2 lymphokine expression which could be further enhanced by increased cAMP levels or PKA activity. Investigations on the role of increased cAMP levels on Th2 lymphokines in D10 cells, a Th2-type cell line, led to the conclusion that elevated cAMP concentrations do not stimulate PKA but p38 activity which, through phosphorylation of GATA-3, appeared to induce IL-5 and IL-13 expression (Chen et al., 2000). While focusing on primary Th lymphocytes, it was observed that expression of the catalytic subunit α of PKA is sufficient for optimal IL-5 expression in primary Th0 cells. In addition, downregulation of IL-5 production in primary Th2 cells by the treatment with low concentrations of H-89, a PKA specific inhibitor, as well as by the ectopic expression of a negatively acting version of regulatory PKA subunit I demonstrates that active PKA plays an important role in IL-5 gene regulation. These findings using different types of primary CD4+ T lymphocytes, including Th2 cells, the one likely to represent the native IL-5 producers in vivo, demonstrates that the adenylyl cyclase/cAMP/PKA signaling pathway plays an important role in IL-5 gene expression in primary Th2 cells. Thus the importance of cAMP/PKA signaling pathway in Th2 effector function was established during this doctoral research work. KW - PKA KW - IL-5 KW - cAMP KW - Th KW - Forskolin KW - PKA KW - IL-5 KW - cAMP KW - Th KW - Forskolin Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-5281 ER - TY - THES A1 - Jenuwein, Meta T1 - Signaltransduktion im Gehirn SIV-infizierter Rhesusaffen T1 - Signal transduction in brains of SIV-infected macaques N2 - Obwohl das Krankheitsbild der HIV-Demenz schon seit über 20 Jahren bekannt ist, sind die Abläufe und Mechanismen, die zur Ausbildung neuropsychiatrischer Defizite führen, noch immer ungeklärt. Um die Ätiologie und Pathogenese der HIV-Demenz verstehen zu können, sind Untersuchungen in einer möglichst frühen, noch asymptomatischen Phase der HIV-Infektion notwendig. Deswegen bietet das SIV/Rhesusaffen-Modell beste Voraussetzungen um die Entstehung der HIV-Demenz genauer zu untersuchen. Es gibt einige Hinweise, dass viele klinische Zeichen der HIV-Demenz mit Veränderungen im dopaminergen System des ZNS einhergehen. In diesem Zusammenhang wurden in der vorliegenden Arbeit die Signaltransduktion von Dopamin in den dopaminergen Arealen des Gehirns SIV-infizierter Rhesusaffen untersucht. Die Konzentration des cAMP und die Expression des CREB Proteins erwiesen sich als geeignete Untersuchungsparameter. cAMP dient unter anderem dem Neurotransmitter Dopamin in der postsynaptischen Zelle als sogenannter „second messenger“. CREB ist in der darauffolgenden Transduktionskaskade ein Protein, das die Expression zahlreicher Gene beeinflusst. Die Daten wurden für die Hirnregionen Nucleus accumbens, Corpus amygdaloideum und Putamen erhoben. Nucleus accumbens und Corpus amygdaloideum sind Teile des limbischen Systems, die auch in der Pathophysiologie psychiatrischer Störungen und Suchterkrankungen eine Rolle spielen. Das Putamen ist Teil des Corpus striatum, welches extrapyramidale Bewegungsabläufe beeinflusst. Neben dem Vergleich zwischen Kontrolltieren und SIV-infizierten Rhesusaffen wurden auch die Veränderungen der cAMP bzw. CREB Konzentration bei SIV-infizierten und uninfizierten jeweils mit dopaminergen Medikamenten behandelten Rhesusaffen erfasst. Hierfür wurden einige Tiere mit Selegilin bzw. L-DOPA behandelt. Die Ergebnisse lassen sich wie folgt zusammenfassen: Die Konzentration des gesamt CREB war bei SIV-infizierten Tieren in allen untersuchten Hirnregionen reduziert. Die intrazelluläre Konzentration von cAMP war im Nucleus accumbens sowie im Putamen verringert, blieb im Corpus amygdaloideum SIV-infizierter Rhesusaffen jedoch unverändert. Im Nucleus accumbens stieg der CREB Spiegel bei den SIV-infizierten mit Selegilin behandelten Tieren tendenziell an, die cAMP Konzentration blieb jedoch nahezu unverändert. Im Putamen rief die Behandlung SIV-infizierter Tiere mit Selegilin und L-DOPA eine Erhöhung der CREB Expression hervor. Der cAMP Spiegel im Putamen SIV-infizierter Rhesusaffen wurde von der dopaminergen Medikation nicht beeinflusst. Die mit dopaminergen Medikamenten behandelten Kontrolltiere zeigten im Nucleus accumbens und im Putamen keine wesentlichen Veränderungen, weder in der cAMP Konzentration, noch in der CREB Expression. Im Corpus amygdaloideum blieb die cAMP Konzentration durch die Behandlung SIV-infizierter Rhesusaffen mit Selegilin bzw. L-DOPA unverändert. Die cAMP Konzentration fiel bei den mit Selegilin behandelten Kontrolltieren signifikant ab, stieg jedoch bei den mit L-DOPA behandelten Kontrolltieren an. Der CREB Spiegel hingegen zeigte bei den Kontrolltieren sowie auch bei den SIV-infizierten Tieren mit dopaminerger Behandlung im Corpus amygdaloideum keine signifikanten Veränderungen. Einige Versuchstiere wurden erst im AIDS-Stadium der Infektion getötet. Diese Tiere zeigten verglichen mit den SIV-infizierten Tieren, die bereits im asymptomatischen Stadium der Erkrankung getötet wurden, im Nucleus accumbens, im Corpus amygdaloideum und auch im Putamen bezüglich der cAMP Konzentration keinen signifikanten Unterschied. Diese Ähnlichkeit weist auf pathologische Veränderungen des ZNS hin, die schon im frühen Stadium der Infektion entstehen und möglicherweise den Krankheitsverlauf entscheidend beeinflussen. Die Analyse der Ergebnisse zeigt, dass das Immundefizienzvirus in manchen Hirnregionen erwiesenermaßen Veränderungen der dopaminergen Signaltransduktion hervorruft, die sich allerdings nicht in allen Hirnregionen gleich gestalten. Dies könnte auf die unterschiedliche Verteilung der Dopaminrezeptorgruppen in den untersuchten Hirnregionen zurückzuführen sein. Vor allem das Absinken der CREB Konzentration in Regionen des limbischen Systems und im Putamen in SIV-infizierten Rhesusaffen, weist darauf hin, dass die neuropsychiatrischen Veränderungen im Rahmen der HIV-Infektion einen biologischen Hintergrund haben. N2 - Although HIV-dementia has been known for more than 20 years, mechanisms and processes that lead to the development of neuropsychiatric deficits remain still unclear. In order to increase our understanding on the pathogenesis of HIV-dementia, investigations in the early asymptomatic stage of HIV-infection are necessary. The SIV/macaque model is the most appropriate animal model to expand our knowledge about the development of HIV-dementia. There is a great body of evidence that many clinical signs of HIV-dementia are associated with changes in the dopaminergic system of the central nervous system. In the present study, parts of the signal transduction of dopamine, such as cAMP and CREB, were analysed in brains of SIV-infected macaques. cAMP is, among others, a postsynaptic second messenger of dopamine. In the activated transduction chain, CREB is a protein that influences the expression of numerous genes. Measurements were performed in dopaminergic brain regions involving nucleus accumbens, corpus amygdaloideum and putamen. Nucleus accumbens and corpus amygdaloideum are limbic areas and are involved in the pathophysiology of psychiatric disorders and substance abuse. The putamen is part of the corpus striatum, which exerts influence on extrapyramidal motion sequences. cAMP concentrations and CREB expression were measured in uninfected and SIV-infected monkeys, some of which were treated with dopaminergic substances such as L-DOPA and selegiline. The results can be summarized as follows: The concentration of total CREB was reduced in SIV-infected macaques in all investigated brain regions. Intracellular cAMP was reduced in nucleus accumbens and in putamen, but remained unchanged in corpus amygdaloideum. In nucleus accumbens, CREB levels tended to rise in SIV-infected/selegiline-treated macaques, whereas cAMP content did not significantly change through treatment. In putamen dopaminergic treatment of SIV-infected macaques (with L-DOPA or selegiline) resulted in increased expression of CREB. cAMP concentrations following dopaminergic medication remained stable in the putamen of SIV-infected macaques. In uninfected/treated animals, no remarkable changes, in cAMP concentration or in CREB expression were apparent in the putamen. cAMP concentrations remained unchanged in corpus amygdaloideum of SIV-infected monkeys that had received dopaminergic treatment. cAMP concentrations decreased significantly in control animals that were treated with selegiline, but rose in the animals that were treated with L-DOPA. In corpus amygdaloideum CREB expression did not differ significantly between control animals and SIV-infected macaques both treated with dopaminergic medication. Some animals were sacrificed in the AIDS stage of infection. Those animals did not show a significant difference in cAMP concentration compared to SIV-infected macaques that were sacrificed in the early asymptomatic stage of infection; neither in corpus amygdaloideum, nor in nucleus accumbens or in putamen. These data indicate that pathologic changes may arise already in the early stage of infection and may have a decisive influence on disease progression. The obtained results suggest that immunodeficiency virus infection causes an altered dopaminergic signal transduction in some brain regions, although these changes are not the same in every brain structure. These findings may result because of the difference in distribution of dopaminergic receptor groups in the investigated brain areas. The decrease of CREB expression in the brain regions of the limbic system and in the putamen of SIV-infected macaques provides evidence that neuropsychiatric changes associated with HIV-infection may have a biological background. KW - HIV-Demenz KW - Dopamin KW - cAMP KW - CREB KW - SIV KW - HIV-dementia KW - dopamin KW - cAMP KW - CREB KW - SIV Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-12136 ER - TY - THES A1 - Hubertus, Katharina T1 - Regulation des cAMP Spiegel und der Signaltransduktion in humanen Thrombozyten durch Prostanoid-Rezeptoren T1 - Regulation of cAMP level and signaltransduction in human platelets by prostanoid-receptors N2 - Prostanoide wirken über Prostanoid-Rezeptoren auf die Aktivierung oder Hemmung der Thrombozyten. In dieser Arbeit wurde die Existenz und Funktionsweise der Prostanoid-Rezeptoren anhand synthetischer Agonisten und Antagonisten in humanen Thrombozyten nachgewiesen. Weiter wurde untersucht, über welche Prostanoid-Rezeptoren die Signaltransduktion der natürlichen Agonisten wie PGE2, PGE1 und PGA1 vermittelt wird, sowie das Zusammenspiel der Prostanoid-Rezeptoren auf die Aktivierung oder Hemmung der Thrombozyten gezeigt. Das Vorhandensein der Prostaglandin E2 Synthase 3 wurde nachgewiesen sowie erste Anhaltspunkte für die Existenz eines Komplexes aus Prostaglandin E2 Synthase 3, Hitzeschockprotein-90 sowie Casein Kinase 2 gezeigt. N2 - Prostanoids act to platelet activation or inhibition via prostanoid-receptors. In this work, the existence and function of prostanoid receptors in human platelets was shown by using sythetic agonists and antagonists. Further, the prostanoid receptors taking part at the signaltransduction induced by endogen prostanoids like PGE2, PGE1 and PGA1 were examinated. The interactions of the prostanoid receptors in platelet activation and inhibition were shown. The existence of prostaglandin E2 synthase 3 in human platelets was shown and first evidence for a complexe of prostaglandin E2 synthase 3, heat shock protein 90 and casein kinase 2 was given. KW - Prostaglandine KW - Rezeptor KW - Cyclo-AMP KW - Prostanoid-Rezeptor KW - cAMP KW - Prostanoide KW - Thrombozyt KW - prostanoid receptor KW - platelets KW - cAMP KW - prostanoids Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-71996 ER - TY - THES A1 - Herz, Michaela T1 - Molecular characterization of the serotonin and cAMP-signalling pathways in Echinococcus T1 - Molekulare Charakterisierung der Serotonin- und cAMP-Signalwege in Echinococcus N2 - Alveolar and cystic echinococcosis, caused by Echinococcus multilocularis and Echinococcus granulosus respectively, are severe zoonotic diseases with limited treatment options. The sole curative treatment is the surgical removal of the complete parasite material. Due to late diagnosis, chemotherapeutic treatment often is the only treatment option. Treatment is based on benzimidazoles, which merely act parasitostatic and often display strong side effects. Therefore, new therapeutic drugs are urgently needed. Evolutionarily conserved signalling pathways are known to be involved in hostparasite cross-communication, parasite development and survival. Moreover, they represent potential targets for chemotherapeutic drugs. In this context the roles of the serotonin- and cAMP-signalling pathways in Echinococcus were studied. Genes encoding serotonin receptors, a serotonin transporter and enzymes involved in serotonin biosynthesis could be identified in the E. multilocularis and E. granulosus genomes indicating that these parasites are capable of synthesizing and perceiving serotonin signals. Also the influence of exogenous serotonin on parasite development was studied. Serotonin significantly increased metacestode vesicle formation from primary cells and re-differentiation of protoscoleces. Inhibition of serotonin transport with citalopram significantly reduced metacestode vesicle formation from primary cells and caused death of protoscoleces and metacestodes. Furthermore, it could be shown that serotonin increased phosphorylation of protein kinase A substrates. Taken together, these results show that serotonin and serotonin transport are essential for Echinococcus development and survival. Consequently, components of the serotonin pathway represent potential drug targets. In this work the cAMP-signalling pathway was researched with focus on G-protein coupled receptors and adenylate cyclases. 76 G-protein coupled receptors, including members of all major families were identified in the E. multilocularis genome. Four genes homologous to adenylate cyclase IX were identified in the E. multilocularis genome and three in the E. granulosus genome. While glucagon caused no significant effects, the adenylate cyclase activator forskolin and the adenylate cyclase inhibitor 2’, 5’ didesoxyadenosine influenced metacestode vesicle formation from primary cells, re-differentiation of protoscoleces and survival of metacestodes. It was further shown that forskolin increases phosphorylation of protein kinase A substrates, indicating that forskolin activates the cAMP-pathway also in cestodes. These results indicate that the cAMP signalling pathway plays an important role in Echinococcus development and survival. To complement this work, the influence of different media and additives on E. granulosus protoscoleces was investigated. Anaerobic conditions and the presence of FBS prolonged protoscolex survival while different media influenced protoscolex activation and development. Taken together, this work provided important insights into developmental processes in Echinococcus and potential drug targets for echinococcosis chemotherapy. N2 - Alveoläre und zystische Echinokokkose, hervorgerufen durch Echinococcus multilocularis und Echinococcus granulosus, sind schwere zoonotische Erkrankungen mit eingeschränkten Behandlungsmöglichkeiten. Die einzig kurative Therapie besteht in der chirurgischen Entfernung des gesammten Parasitenmaterials. Aufgrund später Diagnosestellung stellt Chemotherapie oft die einzige Behandlungsmöglichkeit dar. Die derzeitige Therapie basiert auf Benzimidazolen, welche nur parasitostatisch wirken und oft schwere Nebenwirkungen hervorrufen. Neue Medikamente werden daher dringend benötigt. Evolutionär konservierte Signalwege sind bekanntermaßen an Wirt-Parasit Kreuzkommunikation, Parasitenentwicklung und deren Überleben beteiligt. Darüber hinaus stellen sie auch mögliche Angriffspunkte für Chemotherapeutika dar. In diesem Zusammenhang wurden die Rollen des Serotonin- und des cAMP-Signalwegs in Echinococcus untersucht. Gene für Serotoninrezeptoren, einen Serotonintransporter und für Enzyme, die in der Serotoninsynthese involviert sind, konnten in den E. multilocularis und E. granulosus Genomen identifiziert werden, was darauf schließen lässt, dass diese Parasiten in der Lage sind, Serotonin selbst herzustellen und zu sensieren. Des Weiteren wurde der Einfluss von exogenem Serotonin auf die Parasitenentwicklung untersucht. Serotonin förderte die Bildung von Metazestodenvesikeln aus Primärzellen und die Rückdifferenzierung von Protoskolizes signifikant. Die Hemmung des Serotonintransports mit Citalopram reduzierte die Bildung von Metazestodenvesikeln aus Primärzellen signifikant und führte zum Absterben von Protoskolizes undMetazestoden. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass Serotonin die Posphorylierung von Proteinkinase A Substraten erhöht. Zusammengefasst zeigen diese Ergebnisse, dass Serotonin und Serotonintransport essentiell f¨ur die Entwicklung und das Überleben von Echinococcus sind. Folglich stellen Komponenten des Serotoninsignalwegs potentielle Angriffspunkte für Medikamente dar. In dieser Arbeit wurde der cAMP-Signalweg mit Schwerpunkt auf G-Protein gekoppelte Rezeptoren und Adenylatzyklasen untersucht. 76 G-Protein gekoppelte Rezeptoren, inclusive Mitglieder aller Hauptfamilien, wurden im E. multilocularis-Genom identifiziert. Vier Homologe zur Adenylatzyklase IX wurden im E. multilocularis- Genom und drei im E. granulosus-Genom identifiziert. Während Glukagon keine signifikanten Effekte hervorrief, beeinflussten der Adenylatzyklase-Aktivator Forskolin und der Adenylatzyklase-Inhibitor 2’, 5’-Didesoxyadenosin die Bildung von Metazestodenvesikeln aus Primärzellen, die Rückdifferenzierung von Protoskolizes und das Überleben vonMetazestoden. Zudem wurde gezeigt, dass Forskolin die Phosphorylierung von Proteinkinase A-Substraten erhöht. Dies bestätigt, dass Forskolin den cAMP-Signalweg aktiviert. Diese Ergebnisse legen nahe, dass der cAMP-Signalweg eine wichtige Rolle in der Entwicklung und dem Überleben von Echinococcus spielt. Um diese Arbeit zu vervollständigen, wurde der Einfluss von verschiedenen Medien und Zusätzen auf E. granulosus Protoskolizes untersucht. Anaerobe Bedingungen und die Anwesenheit von FBS verlängerten das Überleben von Protoskolizes, während verschiedene Medien die Aktivierung und die Entwicklung von Protoskolizes beeinflussten. Insgesamt gibt diese Arbeit wichtige Einblicke in Entwicklungsprozesse von Echinococcus und zeigt potentielle Angriffspunkte für Medikamente auf. KW - Serotonin KW - Cyclo-AMP KW - Fuchsbandwurm KW - cAMP KW - Echinococcus Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-139249 ER - TY - THES A1 - Heindel, Ulla T1 - G-Protein gekoppelte Rezeptoren für Parathormon : molekulare Determinanten der intrazellulären Signalwegankopplung T1 - G-protein coupled receptors for parathyroid hormone: molecular insights into intracellular signalling N2 - In der vorliegenden Dissertation gelang es, die strukturellen und molekularen Determinanten der PTH-Rezeptoren für die Ankopplung an intrazelluläre Signalwege näher zu charakterisieren. Die Regulation des Kalzium-, Phosphat- und Knochenstoffwechsels wird zum erheblichen Teil über den PTH1-Rezeptor (P1R) vermittelt. Parathormon (PTH) aktiviert am P1R mindestens zwei Signalwege: den durch zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP) vermittelten Weg und den Phospholipase C-Signalweg (PLC). Der nahe verwandte PTH2-Rezeptor (P2R) kann außer durch PTH auch über das tuberoinfundibiläre Peptid (TIP39) aktiviert werden. Jedoch besitzt dieser Rezeptor keine Ankopplung an den PLC-Signalweg. Zur Aufklärung der strukturellen und molekularen Determinaten der intrazellulären Signalwegankopplung wurden verschiedene Versuchsansätze ausgewählt, die eine Untergliederung dieser Arbeit in drei Teilprojekte ermöglicht: 1) Die PTH-Rezeptoren sind wichtige Vertreter der Klasse II der G-Protein gekoppelten Rezeptoren. Ein Vergleich der Aminosäuresequenzen der siebten Transmembrandomäne dieser Klasse zeigt ein hoch konserviertes, cytosolnahes „YCFXN“-Motiv in diesem Bereich. Im ersten Teil dieser Arbeit konnte durch Punktmutationen der einzelnen Aminosäuren dieses Motivs gezeigt werden, dass dieser Abschnitt eine entscheidende Determinierungsregion dieser Rezeptorfamilie sowohl für die Ankopplung an den cAMP-Weg, als auch an den PLC-Signalweg darstellt. Die Untersuchungen legen die Vermutung nahe, dass dieser Bereich für die Stabilisierung der Konformation dieser Rezeptoren von großer Bedeutung ist. 2) In einem zweiten Abschnitt dieser Arbeit wurde durch stufenweise Angleichung des P2R an den P1R eine Reihe von funktionell exprimierten P2R/P1R Hybridrezeptoren hergestellt, die eine Übereinstimmung des intrazellulären Bereichs des P1R von bis zu 95 % erreichen. Der Nachweis des PLC-Signalwegs durch die Bestimmung der akkumulierten Gesamtinositolphosphate und des intrazellulären Kalziums zeigte eindrucksvoll, dass trotz einer weitgehenden intrazellulären Übereinstimmung der Aminosäuresequenz des P2R mit dem P1R die Eigenschaft des P1R an den PLC-Signalweg zu koppeln nicht auf den P2R übertragen werden kann. Dies legt nahe, dass auch extrazelluläre Bereiche und Transmembranabschnitte die Ankopplung an intrazelluläre Signalwege steuern. Im Weiteren konnte für den cAMP-Signalweg durch diese Hybridrezeptoren gezeigt werden, dass im Kontext des P2R eingefügte Teilabschnitte des P1R (C-Terminus, zweite und dritte intrazelluläre Schleife ) zusammenwirken und eine effizientere Ankopplung an den cAMP-Weg ermöglichen. Weiterführende Untersuchungen der Membrantranslokation von beta Arrestin2 mit einer anschließenden Internalisierung des Rezeptors zeigten, dass sowohl der P2R als auch die hiervon abgeleiteten Hybridrezeptoren selektiv durch Stimulation mit TIP39, nicht jedoch nach einer Stimulation mit PTH, eine Translokation bewirken. Dieses Ereignis ist von den untersuchten Signalwegen (cAMP-, PLC- und Mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAPK)-Signalweg) unabhängig. Erstmals wurde hier gezeigt, dass der P2R eine Phosphorilierung von MAPK bewirkt, wobei hierfür einer beta-Arrestin2 Translokation nicht notwendig ist. Diese Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass der PTH-Rezeptor in unterschiedlichen Rezeptorkonformationen existiert, so dass einzelne Rezeptorabschnitte unabhängig voneinander verschiedene Signale aktivieren können. 3) Der letzte Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit der Identifikation von intrazellulären Interaktionspartnern des humanen P1R. Neue Protein–Interaktionen mit dem humanen P1R wurden mit einem „Yeast-two-Hybrid“ System identifiziert. Mit Hilfe dieser Methode konnte, als ein potentiell bedeutender intrazellulärer Interaktionspartner des humanen P1R, das PDZ-Protein PDZK1 identifiziert werden. Es gelang mit Hilfe von Koimmunpräzipitations-Experimenten und von GST-pull-down-Assays die Interaktion von PDZK1 mit dem P1R zu verifizieren. PDZK1 bindet an eine Liganden-Bindungsdomäne innerhalb des C-terminalen Abschnitts des P1R, vermutlich an die letzten vier Aminosäuren. Durch einen Hefe-Interaktionstest konnte von den vier in diesem Protein vorkommenden PDZ-Domänen die PDZ1-Domäne als einzige selektiv mit dem P1R interagierende Domäne identifiziert werden. In der Niere interagiert PDZK1 über die PDZ3-Domäne mit dem Na/Pi-Transporter IIa. Eine attraktive Hypothese ist daher die Funktion von PDZK1 als einem Bindeglied zwischem dem Rezeptor und dem Transporter und die damit einhergehende PTH- vermittelte Regulation des Phosphattransports in der Niere. Diese Hypothese bedarf aber nochweiterer funktioneller Analysen (z.B. durch Untersuchungen an PDZK1 Knock-Out Mäusen). N2 - In this project we identified structural and molecular determinants of the PTH receptor familiy with importance for coupling to intracellular signaling pathways. The PTH1-receptor (P1R) is involved in the systemic regulation of calcium and phosphate metabolism, and plays a decisive role in bone metabolism. PTH achieves this by activation of at least two intracellular signalling pathways: the adenylyl cylase (AC) and the phospholipase C (PLC) pathway. The closely related PTH2-receptor (P2R) is, in addition to PTH, also activated by tuberoinfundibular peptide of 39 residues (TIP 39), but unlike the P1R, does not couple to the PLC signaling pathway. This project achieved the identification of structural and molecular deteminatnts by three different approaches: 1) The PTH receptors belong to the class II of G-protein coupled receptors. A comparison of the amino acid sequences of the seventh transmembrane domain shows a highly conserved “YCFXN”-motif near the cytosolic interface of this domain. To examine the role of this conserved motif individual point mutations of these amino acids were generated and evaluated. Studies of the receptor mutants obtained showed that this region plays an important role in coupling to the adenylyl cylase pathway as well as to the PLC signaling pathway. The data obtained in this work suggests that the “YCFXN”-motif is of significant importance for the stabilisation of the receptor conformation. 2) To identify the structural features responsible for activating the PLC pathway, we engineered a series of hybrid P1R/P2R receptor chimeras by gradually adapting the P2R’s cytosolic interface to a P1R-like sequence. These modifications of key differing regions in the second and third loop, and the C-terminal tail allowed for > 95 % of P1R sequence in the cytosolic interface of the P2R. Despite these changes it was not possible to transfer the property of P1R to couple to the PLC signaling pathway to the P2R as shown impressively by the lack of activation of the PLC signaling pathway using measurements of inositol and intracellular calcium. Apparently, extracellular regions as well as transmembrane domains are required for selective coupling to intracellular signaling pathways. By contrast we could show for the cAMP signaling pathway, that when > 95 % of the P2R´s cytosolic interface had a P1R-like sequence, P1R epitopes apparently interacted with each other to result in a more efficient coupling to the cAMP signaling pathway. Stimulation of the receptor by its ligands leads to translocation of -arrestin2 to the cell surface thus initiating internalisation of the receptor. The P2R, as well as the hybrid P1R/P2R receptor chimeras, showed beta arrestin2 translocation selectively after stimulation with TIP39 but not after stimulation with PTH. Ligand-induced translocation of beta-arrestin2 was completely independent from cAMP-, PLC- and mitogen activated proteinkinases (MAPK) signaling pathways in the P2R and its derived chimeric mutants. Furthermore, we could show here for the first time, that the P2R can activate MAPK and that this is independent from a beta-arrestin2 translocation. In conclusion, the PTH-receptors can exist in different receptor conformations which apparently allow the receptors to activate different signals independently. 3) Another goal of this work was the identification of intracellular proteins interacting with the human P1R. A yeast-two-hybrid system was used to identify new protein-protein interactions of the human P1R. Using this method a possible important interacting protein could be identified. This protein was a PDZ-protein, named PDZK1. To verify this interaction co-immunoprecipitation experiments as well as GST-pull-down experiments were done. Binding of PDZK1 occurred within the C terminal region of the P1R and there probably within the last four amino acids. PDZK1 has four PDZ-domains of which the first one was the exclusively interacting domain with the P1R, as determined by a additional yeast-two-hybrid interaction experiment. In kidney the interaction of PDZK1 with the Na/Pi-transporter type IIa occurs via the third PDZ-domain. A hypothesis is that PDZK1 acts as a connecting link between the receptor and the transporter together with a PTH-mediated regulation of the phosphate-transport in kidney. However, this hypothesis will require further studies (e.g. experiments with PDZK1 knock-out mice). KW - Parathormon KW - Rezeptor KW - Intrazellulärraum KW - Signaltransduktion KW - G-Protein gekoppelte Rezeptoren KW - PTH KW - cAMP KW - Inositol KW - PDZ KW - G-protein coupled receptors KW - PTH KW - cAMP KW - PLC KW - PDZ Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-17213 ER - TY - THES A1 - Ege, Carolin T1 - Einfluss der Phosphodiesterase 10A auf cAMP-abhängige Signalwege und deren Effekt auf osteogene Differenzierung und Mechanotransduktion von mesenchymalen Stromazellen T1 - Influence of phosphodiesterase 10A on cAMP-dependent signaling pathways and their effect on osteogenic differentiation and mechanotransduction of mesenchymal stromal cells N2 - Humane mesenchymale Stromazellen sind in der Lage in osteogene Zellen zu differenzieren, und für diese osteogene Differenzierung ist mechanische Belastung ein relevanter Kostimulus. Mechanotransduktion hat zur Folge, dass second messenger wie cAMP und cGMP gebildet werden und sich die Ca2+-Konzentration erhöht, welche wiederum Transkriptionsfaktoren aktivieren, die die Regulation von Genen osteogener Marker vermitteln. Die second messenger cAMP und cGMP werden abgebaut durch Phosphodiesterasen, jedoch ist die Rolle dieser Phosphodiesterasen während der osteogenen Differenzierung oder Mechanotransduktion weiterhin unklar. Das Ziel dieser Arbeit war es, herauszufinden, inwieweit im Besonderen die Phosphodiesterase 10A einen Einfluss nimmt auf die osteogene Differenzierung und die Mechanotransduktion von mesenchymalen Stromazellen und inwiefern sie dabei die cAMP-abhängigen Signalwege moduliert. Langfristig soll hiermit herausgefunden wer-den, welche Bedeutung die PDE10A auf altersinduzierte Krankheiten hat, wobei der Fokus zunächst auf der Osteoporose liegen soll. Um dies zu erreichen, wurden experimentelle Versuche zunächst mit HEK293- und hMSC-TERT-Zellen als Modell für mesenchymale Stromazellen durchgeführt, dann auch mit den mesenchymalen Stromazellen selbst. Untersucht wurde der Einfluss des PDE10A-Inhibitors Papaverin auf die Zellen und auf deren mechanische Induzierbarkeit, sowieso auf die osteogene Differenzierung der hMSC. Außerdem wurden weitere mechanische Versuche durchgeführt, zur Überprüfung des Effekts der Phosphodiesterase 10A. Es wurde beobachtet, dass die Inhibierung von PDE10A mit Papaverin die osteogene Differenzierung und Mineralisierung vermindert. Außerdem gab es einen ersten Hinweis, dass eine Überexpression von PDE10A schwächenden Einfluss nimmt auf die Expression mechanoresponsiver Gene. Nachfolgend auf diese Arbeit wurde erkannt, dass die Expression von mechanoresponsiven Genen durch die PDE10A-Inhibition unterdrückt wird. N2 - Human mesenchymal stromal cells are able to differentiate into osteogenic cells, and for this osteogenic differentiation mechanical stress is a relevant costimulus. Mechanotransduction results in the formation of second messengers such as cAMP and cGMP and an increase in Ca2+ concentration, which in turn activate transcription factors that mediate the regulation of osteogenic marker genes. The second messengers cAMP and cGMP are degraded by phosphodiesterases, but the role of these phosphodiesterases during osteogenic differentiation or mechanotransduction remains unclear. The aim of this work was to determine to what extent phosphodiesterase 10A in particular influences osteogenic differentiation and mechanotransduction of mesenchymal stromal cells and to what extent it modulates cAMP-dependent signaling pathways. In the long term, the aim is to find out what role PDE10A plays in age-related diseases, with an initial focus on osteoporosis. To achieve this, experimental trials were first performed using HEK293 and hMSC-TERT cells as a model for mesenchymal stromal cells, and then also using the mesenchymal stromal cells themselves. The influence of the PDE10A inhibitor papaverine on the cells and on their mechanical inducibility, as well as on the osteogenic differentiation of hMSC was investigated. In addition, further mechanical experiments were performed, to verify the effect of phosphodiesterase 10A. It was observed that inhibition of PDE10A with papaverine decreased osteogenic differentiation and mineralization. In addition, there was initial evidence that overexpression of PDE10A has a debilitating effect on the expression of mechanoresponsive genes. Subsequent to this work, it was recognized that the expression of mechanoresponsive genes is suppressed by PDE10A inhibition. KW - Mesenchymzelle KW - Osteoporose KW - Cyclisches Nucleotid Phosphodiesterase <3,5-> KW - Papaverin KW - Mechanotransduktion KW - Phosphodiesterase 10A KW - cAMP KW - MSC KW - Mesenchymale Stromazellen Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-328327 ER - TY - THES A1 - Berisha, Filip T1 - Molekulare Wirkmechanismen von Sulfonylharnstoffen: Direkte Epac-Aktivierung oder Hemmung der Phosphodiesterasen T1 - Mechanism of action of sulfonylurea: direct epac activation or PDE inhibition N2 - Diabetes mellitus ist die häufigste Stoffwechselerkrankung in Deutschland. Sulfonylharnstoffe (SH) stellen die älteste und eine sehr prominente Gruppe in der oralen Therapie des Diabetes mellitus Typ II dar, die eine verstärkte Insulinfreisetzung vorrangig durch die Hemmung eines ATP-sensitiven Kaliumkanals (K+ATPKanal) erreichen. Daneben konnten weitere Proteine identifiziert werden, die mit SH interagieren und zu deren Effekten beitragen. Während bereits in frühen Arbeiten gezeigt werden konnte, dass SH Vertreter der Phosphodiesterasen (PDE)Familie in ihrer Funktion behindern können, wurde kürzlich Epac2 (exchange protein directly activated by cAMP 2) als weiteres Zielprotein für SH angeführt. Insbesondere die Fähigkeit von SH, direkt an Epac2 zu binden, wird in der Literatur kontrovers diskutiert und eine indirekte Aktivierung durch eine PDE-Hemmung und einen erhöhten cAMP-Spiegel als Mechanismus vermutet. Zur weiteren Untersuchung wurden in dieser Arbeit FRET-basierte Biosensoren verwendet, um die Wirkung von SH auf Epac und PDEs näher zu untersuchen. Dabei konnte sowohl in einem photometrischen Ansatz als auch in lebenden Zellen, die einen Epac2-basierten Sensor enthalten, gezeigt werden, dass eine Aktivierung durch SH stattfindet. Da sowohl Epac2-camps, der von allen hier verwendeten Sensoren mit der höchsten Sensitivität für cAMP, als auch CFP-Epac1δDEPYFP nicht auf SH reagieren, ist diese Aktivierung selektiv für die Isoform Epac2 und wird vorrangig nicht durch eine PDE-Hemmung verursacht. Die Verwendung weiterer Sensoren mit verschiedenen Varianten von Epac2 (verlängerte Version von Epac2-camps) zeigen mit zunehmender Länge über die cAMP-Bindedomäne hinaus eine beginnende Reaktion im Sinne einer instabilen FRET-Kurve (Epac2camps long) bzw. eine deutliche Aktivierung durch den SH (Epac2-camps superlong), wodurch eine direkte Aktivierung bestätigt wird, und suggerieren eine Bindestelle für SH, die sich von denen von cAMP unterschiedet und weiter eingeengt werden konnte (im näheren Bereich von Q454 bzw. E460). Obwohl hierdurch eine direkte Aktivierung gezeigt werden konnte, ist die grundsätzliche Fähigkeit der SH, PDE zu beeinflussen, keineswegs geklärt. Daher wurden weitere Sensoren konstruiert bzw. verwendet, die basierend auf Epac1-camps und Epac2-camps verschiedene PDEs enthalten. Dabei konnte durch die Zugabe von SH eine deutliche Aktivierung des jeweiligen Sensors und somit eine PDEHemmung nachgewiesen werden. Dies konnte sowohl für PDE4A als auch für die in Inselzellen überwiegend vorkommende PDE3B gezeigt werden. Dadurch ergeben sich einige (klinisch relevante) Implikationen. Zum einen stellt neben der direkten Epac-Aktivierung auch die direkte Hemmung der PDE einen wichtigen Mechanismus für die Sekretion von Insulin dar. Außerdem sind bei PDEHemmung und direkter Epac-Aktivierung außerhalb der Inselzellen auch Nebenwirkungen in anderen Organen zu erwarten wie z.B. die Entstehung lebensgefährlicher Rhythmusstörungen in Herzmuskelzellen. N2 - Diabetes is the most common metabolic disease in the developed world. Sulfonylurea (SU) are one of the oldest and prominent group of oral antidiabetic drugs that act by inhibiting an ATP-sensitive potassium channel and increasing insulin release. Furthermore, additional targets have been identified that interact with SU. Whereas early works could show that SU can inhibit the function of different phosphodiesterases (PDEs), Epac2 (exchange protein directly activated by cyclic AMP) has been identified as yet another target protein for CU. Especially the ability to activate Epac2 by direct binding has been subject of controversial debate. In this study we used FRET-based biosensor to investigate the effects of SU on Epac and different PDEs. We could show that SU can activate Epac by direct binding that is selective top the isoform Epac2. The use of different sensors that contain different parts of Epac2 even revealed the approximate location of the binding site that is different to that of cAMP. Moreover, the use of other biosensor containing isoforms of PDE showed the ability of SU to strongly inhibit PDE3 and PDE4. This leads to several (clinically relevant) implications. Firstly, the direct activation of Epac2 present an important mechanism of insulin release. On the other hand, the activation of Epac2 and inhibition of different PDEs in all cells and tissues might lead to numerous side effects in other organs, e.g. the formation of life threatening cardiac arrythmias. KW - Sulfonylharnstoffe KW - FRET KW - Epac KW - Phosphodiesterasen KW - PDE-Hemmung KW - sulfonylurea KW - biosensor KW - cAMP KW - CFP KW - YFP Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-176535 ER - TY - JOUR A1 - Beck, Sebastian A1 - Yu-Strzelczyk, Jing A1 - Pauls, Dennis A1 - Constantin, Oana M. A1 - Gee, Christine E. A1 - Ehmann, Nadine A1 - Kittel, Robert J. A1 - Nagel, Georg A1 - Gao, Shiqiang T1 - Synthetic light-activated ion channels for optogenetic activation and inhibition JF - Frontiers in Neuroscience N2 - Optogenetic manipulation of cells or living organisms became widely used in neuroscience following the introduction of the light-gated ion channel channelrhodopsin-2 (ChR2). ChR2 is a non-selective cation channel, ideally suited to depolarize and evoke action potentials in neurons. However, its calcium (Ca2\(^{2+}\)) permeability and single channel conductance are low and for some applications longer-lasting increases in intracellular Ca\(^{2+}\) might be desirable. Moreover, there is need for an efficient light-gated potassium (K\(^{+}\)) channel that can rapidly inhibit spiking in targeted neurons. Considering the importance of Ca\(^{2+}\) and K\(^{+}\) in cell physiology, light-activated Ca\(^{2+}\)-permeant and K\(^{+}\)-specific channels would be welcome additions to the optogenetic toolbox. Here we describe the engineering of novel light-gated Ca\(^{2+}\)-permeant and K\(^{+}\)-specific channels by fusing a bacterial photoactivated adenylyl cyclase to cyclic nucleotide-gated channels with high permeability for Ca\(^{2+}\) or for K\(^{+}\), respectively. Optimized fusion constructs showed strong light-gated conductance in Xenopus laevis oocytes and in rat hippocampal neurons. These constructs could also be used to control the motility of Drosophila melanogaster larvae, when expressed in motoneurons. Illumination led to body contraction when motoneurons expressed the light-sensitive Ca\(^{2+}\)-permeant channel, and to body extension when expressing the light-sensitive K\(^{+}\) channel, both effectively and reversibly paralyzing the larvae. Further optimization of these constructs will be required for application in adult flies since both constructs led to eclosion failure when expressed in motoneurons. KW - optogenetics KW - calcium KW - potassium KW - bPAC KW - CNG channel KW - cAMP KW - Drosophila melanogaster motoneuron KW - rat hippocampal neurons Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-177520 VL - 12 IS - 643 ER - TY - THES A1 - Anton, Selma T1 - Characterization of cAMP nanodomains surrounding the human Glucagon-like peptide 1 receptor using FRET-based reporters T1 - Charakterisierung der Rezeptor-assoziierten cAMP Nanodomänen des humanen Glucagon-like peptide 1 Rezeptors mittels FRET-basierter Sensoren N2 - Cyclic adenosine monophosphate (cAMP), the ubiquitous second messenger produced upon stimulation of GPCRs which couple to the stimulatory GS protein, orchestrates an array of physiological processes including cardiac function, neuronal plasticity, immune responses, cellular proliferation and apoptosis. By interacting with various effector proteins, among others protein kinase A (PKA) and exchange proteins directly activated by cAMP (Epac), it triggers signaling cascades for the cellular response. Although the functional outcomes of GSPCR-activation are very diverse depending on the extracellular stimulus, they are all mediated exclusively by this single second messenger. Thus, the question arises how specificity in such responses may be attained. A hypothesis to explain signaling specificity is that cellular signaling architecture, and thus precise operation of cAMP in space and time would appear to be essential to achieve signaling specificity. Compartments with elevated cAMP levels would allow specific signal relay from receptors to effectors within a micro- or nanometer range, setting the molecular basis for signaling specificity. Although the paradigm of signaling compartmentation gains continuous recognition and is thoroughly being investigated, the molecular composition of such compartments and how they are maintained remains to be elucidated. In addition, such compartments would require very restricted diffusion of cAMP, but all direct measurements have indicated that it can diffuse in cells almost freely. In this work, we present the identification and characterize of a cAMP signaling compartment at a GSPCR. We created a Förster resonance energy transfer (FRET)-based receptor-sensor conjugate, allowing us to study cAMP dynamics in direct vicinity of the human glucagone-like peptide 1 receptor (hGLP1R). Additional targeting of analogous sensors to the plasma membrane and the cytosol enables assessment of cAMP dynamics in different subcellular regions. We compare both basal and stimulated cAMP levels and study cAMP crosstalk of different receptors. With the design of novel receptor nanorulers up to 60nm in length, which allow mapping cAMP levels in nanometer distance from the hGLP1R, we identify a cAMP nanodomain surrounding it. Further, we show that phosphodiesterases (PDEs), the only enzymes known to degrade cAMP, are decisive in constraining cAMP diffusion into the cytosol thereby maintaining a cAMP gradient. Following the discovery of this nanodomain, we sought to investigate whether downstream effectors such as PKA are present and active within the domain, additionally studying the role of A-kinase anchoring proteins (AKAPs) in targeting PKA to the receptor compartment. We demonstrate that GLP1-produced cAMP signals translate into local nanodomain-restricted PKA phosphorylation and determine that AKAP-tethering is essential for nanodomain PKA. Taken together, our results provide evidence for the existence of a dynamic, receptor associated cAMP nanodomain and give prospect for which key proteins are likely to be involved in its formation. These conditions would allow cAMP to exert its function in a spatially and temporally restricted manner, setting the basis for a cell to achieve signaling specificity. Understanding the molecular mechanism of cAMP signaling would allow modulation and thus regulation of GPCR signaling, taking advantage of it for pharmacological treatment. N2 - G Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) stellen eine große und sehr vielfältige Familie an Membranproteinen dar, deren primäre Funktion die Signalübertragung von extrazellulären Stimuli in intrazelluläre Signale ist. Dank ihrer breiten Expression im gesamten menschlichen Körper regulieren sie unterschiedliche zelluläre Prozesse und damit deren physiologische Funktion, unter anderem die Sinnesempfindung, zelluläre Kommunikation und Neurotransmission. GPCRs stehen im Zusammenhang mit unterschiedlichen Erkrankungen wie Herzinsuffizienz, Krebs, neurologischen Funktionsstörungen und diverser metabolischer Krankheiten, weswegen sie als Ziele („Targets“) zur Behandlung verschiedener Erkrankungen erforscht und genutzt werden. Aufgrund ihrer Expression auf der Zelloberfläche sind sie leicht zugänglich, und die Diversität ihrer Liganden begünstigt zusätzlich ihre Nutzung als pharmakologische Targets. Heutzutage vermitteln bereits 30% aller weltweit zugelassenen Arzneistoffe ihre Wirkung an GPCRs. GPCRs üben ihre Funktion aus, indem sie hauptsächlich an G Proteine binden, welche wiederum die Produktion sogenannter second messenger in Gang setzen. cAMP ist das Hauptsignalmolekül der Rezeptoren, welche an das stimulatorische GS Protein koppeln. cAMP überträgt hunderte ankommende Signale in einer hochspezifischen Weise, indem es an unterschiedliche Effektorproteine bindet, welche sich in bestimmten zellulären Regionen befinden. Dadurch koordiniert dieses Signalmolekül eine Vielzahl zellulärer Prozesse, angefangen bei der Regulierung von Ionenkanalaktivität über die Kontraktilität glatter- und quergestreifter Muskulatur bis hin zur Genexpression, Zellproliferation und Apoptose. Durch die pleiotropen Effekte, welche durch cAMP reguliert werden, stellt sich die Frage, wie GS-gekoppelte Rezeptoren Signalspezifität erreichen, obwohl sie ihre Funktion durch dieses eine Signalmolekül ausführen. Ursprünglich ging man von einer uneingeschränkten Diffusion und dadurch homogenen Verteilung von cAMP in der Zelle aus. Diese Vorstellung ist jedoch nicht mit der Signalisierungsspezifität von GPCRs vereinbar, da unter diesen Umständen cAMP unselektiv all seine Effektorproteine in der gesamten Zelle aktivieren könnte. Daher entstand die Hypothese der cAMP-Kompartimentierung, wobei die Zelle lokal begrenzte Bereiche mit hohen oder niedrigen cAMP Konzentrationen umfassen würde. Jedoch gab es bisher keinerlei Beweise für die Existenz und die molekulare Zusammensetzung mutmaßlicher Domänen. Folglich setzten wir uns als Ziel, hochkonzentrierte cAMP-Kompartimente in der Zelle zu lokalisieren, ihre räumliche Dimension aufzuklären und ihre Rolle zur Realisierung zellulärer Signalisierungsspezifität zu ermitteln. Im Rahmen der vorliegenden Studie setzten wir einen Förster resonance energy transfer (FRET)-basierten cAMP Sensor ein, fusionierten ihn mit dem humanen glucagone-like peptide 1 Rezeptor (hGLP1R) als Prototyp eines GS-koppelnden Rezeptors, um cAMP am Ursprung des Signals zu messen. Mittels dieser Sensoren weisen wir eine Rezeptor-umgebende begrenzte cAMP Domäne nach, welche eine erhöhte cAMP Konzenztration aufweist (Figure ‎3.10). Bei Stimulation des Rezeptors mit GLP1 Konzenztrationen beginnend bei 10 fM entsteht eine Rezeptordomäne mit lokal erhöhten cAMP Konzentrationen, welche getrennt von Plasmamembran und Cytosol ist. Wir zeigen, dass das hGLP1R-Kompartiment geschützt ist vor cAMP Signalen, welche an weiteren, unabhängigen GS-gekoppelten Rezeptoren ihren Ursprung haben (Figure ‎3.11). Um die räumliche Dimension dieser Domäne zu untersuchen, verwendeten wir Nanolinker der Länge 30- und 60 nm als Abstandhalter zwischen Rezeptor und Sensor (Figure ‎3.12) und zeigen dabei, dass sich die Domäne über eine Länge von 60 Nanometern erstreckt, wobei ein abnehmender cAMP-Gradient erkennbar ist. Weiterhin beweisen wir, dass Phosphodiesterasen (PDEs) Schlüsselfaktoren für die Bildung des cAMP-Gradienten um den Rezeptor herum sind, indem sie die Diffusion ins Cytosol beschränken (Figure ‎3.13). Darüber hinaus zeigen wir (Figure ‎3.15), dass Rezeptor-spezifische cAMP Signale PKA-Phosphorylierung in der Rezeptordomäne auslösen und, dass AKAPs elementar für nanodomänen PKA-Aktivität sind, wohingegen die cytosolische PKA-Phosphorylierung unabhängig von AKAP-Targeting der PKA ist (Figure ‎3.16). Zusammenfassend beweisen unsere Ergebnisse die Existenz einer Rezeptor-umgebenden Nanodomäne mit erhöhten cAMP Spiegeln eines GS-gekoppelten Rezeptors. Zeitgleiche Studien in unserer Gruppe zeigen, dass cAMP in der Zelle weitgehend gebunden vorliegt und diffusionslimitiert ist. Dies stellt den Nachweis für eine eingeschränkte Diffusion als molekulare Voraussetzung für die Bildung von Signalkompartimenten dar. Wir gehen davon aus, dass unsere Ergebnisse ein Ausgangspunkt für die Aufklärung von Rezeptoren als Quelle für Signalkompartimente darstellen, jedoch bedarf es weiterer Studien, um die präzise molekulare Zusammensetzung und die beteiligten Proteine dieser Signaldomäne zu untersuchen. Das Grundverständnis der Signalisierungskaskaden auf molekularer Ebene könnte es uns ermöglichen, die zellulären Reaktionen zu manipulieren, um eine Fehlfunktion der Signalisierung in erkrankten Zellen wiederherzustellen. Da der hGLP1R entscheidend für Aufrechterhaltung ausgeglichener Blutglucosespiegel ist, würde die Erfassung der molekularen Details der kompartimentalisierten Signalübertragung die Feinabstimmung der Rezeptorsignale ermöglichen, um ihn als spezifisches Target zur Behandlung von Diabetes Mellitus einzusetzen. KW - FRET KW - cAMP KW - compartments KW - GPCR Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-190695 ER -