TY - THES A1 - John, Vini T1 - Interaction of mycobacteria with myeloid-derived suppressor cells T1 - Wechselwirkung von Mykobakterien mit myeloiden Suppressorzellen N2 - Myeloid-derived suppressor cells (MDSCs) constitute of monocytic (M-MDSCs) and granulocytic cell subsets (G-MDSCs)and were initially described as suppressors of T-cell function in tumor microenvironments. Recent studies have shown the involvement of MDSCs in a number of infectious diseases including Mycobacterium tuberculosis (Mtb) infection. MDSCs are tremendously accumulated in patients with Mtb infection and exert a suppressive effect on T cell responses against mycobacteria. Mycobacterium bovis BCG, the only available vaccine against Mtb fails to protect against the adult pulmonary tuberculosis (TB). Understanding the mechanisms of MDSC suppression for immunity against mycobacterial infection will provide a rational basis to improve anti- TB vaccination and host-directed therapies against TB. In this study, we investigated the role of three lipid-rich components of the plasma membrane, Caveolin-1(Cav-1), Acid Sphingomyelinase (ASM) and asialo-GM1 on BCG-activated MDSCs. Cav-1 is one of the vital components of caveolae (plasma membrane invaginations) which regulates apoptosis and lipid metabolism. In this work, we found that MDSCs upregulated Cav-1, TLR4 and TLR2 expression after BCG infection on the cell surface. However, Cav-1 deficiency resulted in a selective defect in the intracellular TLR2 accumulation in the M-MDSC, but not G-MDSC subset. Further analysis indicated no difference in the phagocytosis of BCG by M-MDSCs from WT and Cav1-/- mice but a reduced capacity to up-regulate surface markers, to secrete various cytokines, induce iNOS and NO production. These defects correlated with deficits of Cav1-/- MDSCs in the suppression of T cell proliferation. Among the signaling pathways that were affected by Cav-1 deficiency, we found lower phosphorylation of NF-kB and p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) in BCG - activated MDSCs. ASM is an enzyme present in lysosomes and is translocated to the cell surface where it hydrolyzes sphingomyelin into ceramide. Flow cytometric studies revealed that MDSCs phagocytosed BCG independent of inhibiting ASMase using pharmacological inhibitors (amitryptiline or desipramine) or MDSCs from WT and ASM-/-. Suppression of ASMase or using ASM-/- MDSCs resulted in reduced NO production and decreased cytokine secretion by MDSCs in response to BCG. Furthermore, MDSCs inhibited by amitryptiline had impaired AKT phosphorylation upon BCG infection. Asialo-GM1 is a ganglioside expressed on the cell surface of MDSCs reported to cooperate with TLR2 for activating ERK signaling. Here, in this study, we found that asialo-GM1 expression was upregulated specifically upon mycobacterial infection and not upon any other stimulus. We noted that the soluble form of asialo-GM1 bound to BCG. Flow cytometric studies revealed that blocking 81 asialo-GM1 did not affect the phagocytosis of BCG into MDSCs. Furthermore, blocking of asialo- GM1 had no effect on the cytokine and NO secretion or AKT signaling. Collectively, the data presented in this work implicated that Cav-1, ASM, asialo-GM1 are dispensable for the internalization of BCG. Rather, Cav-1 and ASM are required for the functional activation of MDSCs. Although asialo-GM1 binds to BCG, we did not find any difference in the functional activation of MDSCs after blocking asialo-GM1. This study provides insights into the role of lipid raft components of the MDSC cell membrane during mycobacterial infection. N2 - Myeloide Suppressorzellen (engl, myeloid-derived suppressor cells MDSCs) bestehen aus monozytischen (M-MDSCs) und granulozytären Subtypen (G-MDSCs) und wurden anfangs als Suppressoren der T-Zellfunktion in Tumormikroumgebungen beschrieben. Kürzlich durchgeführte Studien haben gezeigt, dass MDSCs an einer Reihe von Infektionskrankheiten beteiligt sind, einschließlich einer Infektion mit Mycobacterium tuberculosis (Mtb). MDSCs sind bei der Patienten Mtb-Infektion enorm akkumuliert und üben eine supprimierende Wirkung auf die T-Zell-Antworten gegen Mykobakterien aus. Mycobacterium bovis BCG, der einzige verfügbare Impfstoff gegen Mtb, schützt nicht gegen die Lungentuberkulose bei Erwachsenen (TB). Das Verständnis der Mechanismen über welche MDSCs eine der Immunsuppression bei mykobakteriellen Infektionen vermitteln, bilden eine rationale Grundlage für die Verbesserung der Anti-TB-Impfung und Therapien gegen TB. In dieser Studie wurden die Rolle der drei lipidreichen Komponenten der Plasmamembran, Caveolin-1 (Cav-1), Saure Sphingomyelinase (ASM) und Asialo-GM1 bei BCGaktivierten MDSCs untersucht. Cav-1 ist eine der Komponenten von Caveolae (Plasmamembran-Invagination), die die Apoptose und den Fettstoffwechsel regulieren. Diese Arbeit zeigte, dass MDSCs die Expression von Cav-1, TLR4 und TLR2 nach BCG-Infektion auf der Zelloberfläche hochregulierten. Eine Cav-1 Defizienz führte jedoch zu einem selektiven Defekt in der intrazellulären TLR2-Akkumulation bei MMDSCs, jedoch nicht bei G-MDSCs. Weitere Analysen zeigten keinen Unterschied in der Phagozytose von BCG durch M-MDSCs von WT- und Cav1-/- Mäusen, jedoch eine verringerte Fähigkeit, Oberflächenmarker hoch zu regulieren, verschiedene Zytokine zu sekretieren und die Produktion von iNOS und NO zu induzieren. Diese Defekte korrelierten mit Defiziten von Cav1-/- MDSCs bei der Unterdrückung der T-Zell-Proliferation. Unter den von Cav-1-Mangel betroffenen Signalwegen fanden wir eine geringere Phosphorylierung der NF-KB- und p38- Mitogen-aktivierten Proteinkinase (MAPK) in BCG-aktivierten MDSCs. ASM ist ein in Lysosomen vorhandenes Enzym, das an die Zelloberfläche transloziert wird, wo es Sphingomyelin zu Ceramid hydrolysiert. Durchflusszytometrische Studien ergaben, dass MDSCs BCG unabhängig von der Hemmung von ASMase mit pharmakologischen Inhibitoren (Amitryptilin oder Desipramin) oder MDSCs von ASM-/- Mäusen BCG phagozytierten. Die Suppression von ASMase oder die Verwendung von ASM-/- MDSCs führte zu einer verringerten NO Produktion und einer verringerten Zytokinsekretion durch MDSCs als Antwort auf BCG. Darüber hinaus hatten MDSCs, die durch Amitryptilin inhibiert wurden, die AKT-Phosphorylierung bei einer BCG-Infektion beeinträchtigt. Asialo-GM1 ist ein Gangliosid, das auf der Zelloberfläche von MDSCs exprimiert wird, von dem berichtet wurde, dass es mit TLR2 kooperiert, um ERK-Signale zu aktivieren. Hier in dieser Studie haben wir festgestellt, dass die Expression von Asialo-GM1 spezifisch bei mycobakterieller Infektion und nicht bei einem anderen Stimulus hochreguliert wurde. Wir haben festgestellt, dass die lösliche Form von Asialo-GM1 an BCG binden kann. Durchflusszytometrische Studien ergaben, dass die Blockade von Asialo-GM1 die Phagozytose von BCG in MDSCs nicht beeinflusst. Darüber hinaus hatte die Blockierung von Asialo-GM1 keinen Einfluss auf die Zytokin- und NO-Sekretion oder das AKT-Signal. Zusammenfassend ergaben die in dieser Arbeit präsentierten Daten, dass Cav-1, ASM, asialoGM1 für die Internalisierung von BCG entbehrlich sind. Dagegen sind Cav-1 und ASM für die funktionale Aktivierung von MDSCs erforderlich. Obwohl Asialo-GM1 an BCG bindet, konnten wir nach der Blockierung von Asialo-GM1 keinen Unterschied in der funktionellen Aktivierung von MDSCs feststellen. Diese Studie liefert Einblicke in die Rolle einiger Komponenten der lipid-reicher Areale der MDSC-Zellmembran bei mykobakteriellen Infektionen. KW - MDSCs KW - BCG KW - Caveolin-1 KW - ASM KW - asialoGM1 KW - BCG KW - nitric oxide Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-183501 ER - TY - THES A1 - Wiese, Teresa T1 - Pharmacological targeting of acid sphingomyelinase increases CD4\(^+\) Foxp3\(^+\) regulatory T cell subsets in patients with major depression T1 - Pharmakologische Hemmung der sauren Sphingomyelinase verstärkt CD4\(^+\) Foxp3\(^+\) regulatorische T-Zell-Subpopulationen bei Patienten mit Depression N2 - Lack of acid sphingomyelinase (ASM) activity, either through genetic deficiency or through pharmacological inhibition, is linked with increased activity and frequency of Foxp3+ regulatory T cells (Treg) among cluster of differentiation (CD) 4+ T cells in mice in vivo and in vitro1. Thus, pharmacological blockade of ASM activity, which catalyzes the cleavage of sphingomyelin to ceramide and phosphocholine, might be used as a new therapeutic mechanism to correct numeric and/ or functional Treg de-ficiencies in diseases like multiple sclerosis or major depression. In the present study, the effect of pharmacological inhibition of ASM in humans, in vitro and in vivo, was analyzed. In the in vitro experiments, peripheral blood mono-nuclear cells (PBMC) of healthy human blood donors were treated with two widely prescribed antidepressants with high (sertraline, Ser) or low (citalopram, Cit) capaci-ty to inhibit ASM activity. Similar to the findings in mice an increase in the frequency of Treg among human CD4+ T cells upon inhibition of ASM activity was observed. For the analysis in vivo, a prospective study of the composition of the CD4+ T cell com-partment of patients treated for major depression was done. The data show that pharmacological inhibition of ASM activity was superior to antidepressants with little or no ASM-inhibitory activity in increasing CD45RA- CD25high effector Treg (efTreg) frequencies among CD4+ T cells to normal levels. Independently of ASM inhibition, correlating the data with the clinical response, i.e. improvement of the Hamilton rat-ing scale for depression (HAMD) by at least 50 per cent (%) after four weeks of treatment, it was found that an increase in efTreg frequencies among CD4+ cells dur-ing the first week of treatment identified patients with a clinical response. Regarding the underlying mechanism, it could be found that the positive effect of ASM inhibition on Treg required CD28 co-stimulation suggesting that enhanced CD28 co-stimulation was the driver of the observed increase in the frequency of Treg among human CD4+ T cells. Inhibition of ASM activity was further associated with changes in the expression and shuttling of CTLA-4, a key inhibitory molecule ex-pressed by Treg, between cellular compartments but the suppressive activity of CTLA-4 through its transendocytosis activity was unaffected by the inhibition of ASM activity. In summary, the frequency of (effector) Treg among CD4+ T cells in mice and in hu-mans is increased after inhibition of ASM activity suggesting that ASM blockade might beneficially modulate autoimmune diseases and depression-promoting in-flammation. N2 - Ein Mangel an Aktivität der sauren Sphingomyelinase (ASM), entweder durch ge-netisches Defizit oder durch pharmakologische Hemmung, ist mit einer erhöhten Aktivität und Häufigkeit von Foxp3+ regulatorischen T-Zellen (Treg) innerhalb der CD4+ (cluster of differentation 4) T-Zellen in Mäusen in vivo und in vitro verbun-den1. Daher könnte die pharmakologische Blockade der ASM-Aktivität, die die Spaltung von Sphingomyelin in Ceramid und Phosphocholin katalysiert, als neuer therapeutischer Mechanismus zur Korrektur von numerischen und/oder funktionel-len Treg-Defiziten bei Erkrankungen wie Multipler Sklerose oder schwerer Depres-sion eingesetzt werden. In der vorliegenden Studie wurde die Wirkung der pharmakologischen Hemmung von ASM beim Menschen, in vitro und in vivo analysiert. In den In-vitro-Experimenten wurden die peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) gesunder menschlicher Blutspender mit zwei weithin verschriebenen Antidepressiva mit ho-her (Sertralin, Ser) oder niedriger (Citalopram, Cit) Fähigkeit zur Hemmung der ASM-Aktivität untersucht. Ähnlich wie bei Mäusen wurde bei Hemmung der ASM-Aktivität ein Anstieg der Häufigkeit von Treg innerhalb der menschlichen CD4+ T-Zellen festgestellt. Für die Analyse in vivo wurde eine prospektive Studie über die Zusammensetzung des CD4+ T-Zellkomplexes bei Patienten, die wegen einer De-pression im Krankenhaus behandelt wurden, durchgeführt. Die Daten zeigen, dass die pharmakologische Hemmung der ASM-Aktivität Antidepressiva mit ge-ringer oder keiner ASM-hemmenden Aktivität überlegen war, was die Vermehrung der CD45RA- CD25hoch-Effektor-Treg (efTreg)-Frequenzen innerhalb der CD4+ T-Zellen betraf. Unabhängig von der Untersuchung zur ASM-Aktivität beobachteten wir, dass die klinische Reaktion (d.h. der Verbesserung der Hamilton-Bewertungsskala für Depressionen (HAMD) um mindestens 50 Prozent (%) nach vierwöchiger Behandlung) mit einem frühen Anstieg der efTreg-Frequenzen unter CD4+-Zellen während der ersten Behandlungswoche positiv korrelierte. Hinsichtlich des zugrunde liegenden Mechanismus konnte festgestellt werden, dass die positive Wirkung der ASM-Hemmung auf Treg eine CD28-Kostimulation erforderte, was darauf hindeutet, dass eine verstärkte CD28-Kostimulation die Ur-sache für den beobachteten Anstieg der Frequenz von Treg innerhalb menschli-cher CD4+ T-Zellen war. Die Hemmung der ASM-Aktivität war darüber hinaus mit Veränderungen in der Expression und im zellulären Umsatz von CTLA-4, einem von Treg exprimierten inhibitorischen Schlüsselmolekül, verbunden. Die suppressi-ve Aktivität von CTLA-4 durch seine Transendozytose-Aktivität wurde jedoch durch die Hemmung der ASM-Aktivität nicht beeinflusst. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Häufigkeit von (Effektor-)Treg unter-halb der CD4+ T-Zellen in Mäusen und beim Menschen nach Hemmung der ASM-Aktivität erhöht ist, was darauf hindeutet, dass eine ASM-Blockade Autoimmuner-krankungen und depressionsfördernde Entzündungen vorteilhaft modulieren könn-te. KW - Treg KW - CD28 KW - ASM KW - CTLA-4 KW - Major depression KW - Ceramid Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-233471 ER -