TY  - THES
A1  - Godbole, Amod Anand
T1  - A new paradigm in GPCR signaling at the trans-Golgi network of thyroid cells
T1  - Ein neues Model der GPCR Signaltransduktion am trans-Golgi-Netzwerk von Schilddrüsenzellen
N2  - Whereas G-protein coupled receptors (GPCRs) have been long believed to signal through cyclic AMP exclusively at cell surface, our group has previously shown that GPCRs not only signal at the cell surface but can also continue doing so once internalized together with their ligands, leading to persistent cAMP production. This phenomenon, which we originally described for the thyroid stimulating hormone receptor (TSHR) in thyroid cells, has been observed also for other GPCRs. However, the intracellular compartment(s) responsible for such persistent signaling and its consequences on downstream effectors were insufficiently characterized. The aim of this study was to follow by live-cell imaging the trafficking of internalized TSHRs and other involved signaling proteins as well as to understand the consequences of signaling by internalized TSHRs on the downstream activation of protein kinase A (PKA). cAMP and PKA
activity was measured in real-time in living thyroid cells using FRET-based sensors Epac1-camp and AKAR2 respectively. The results suggest that TSH co-internalizes with its receptor and that the internalized TSH/TSHR complexes traffic retrogradely to the trans-Golgi network (TGN). This study also provides evidence that these internalized TSH/TSHR complexes meet an intracellular pool of Gs proteins in sorting endosomes and in TGN and activate it there, as visualized in real-time using a conformational biosensor nanobody, Nb37. Acute Brefeldin A-induced Golgi collapse hinders the retrograde trafficking of TSH/TSHR complexes, leading to reduced cAMP production and PKA signaling. BFA pretreatment was also able to attenuate CREB phosphorylation suggesting that an intact Golgi/TGN organisation is essential
for an efficient cAMP/PKA signaling by internalized TSH/TSHR complexes. Taken together this data provides evidence that internalized TSH/TSHR complexes meet and activate Gs proteins in sorting endosomes and at the TGN, leading to a local activation of PKA and consequently increased CREB activation. These findings suggest unexpected functions for receptor internalization, with major pathophysiological and pharmacological implications.
N2  - G-Protein-gekoppelte Rezeptoren sind nur in Eukaryonten vorhandeln und bilden die größte und diverseste Familie von Zellmembranrezeptoren. Sie reagieren auf eine vielfältige Gruppe von Stimuli die verschiedene Effektoren aktivieren und damit nachgelagerte Signalkaskaden auslösen, die letztlich entscheidend für die Zellphysiologie sind. Die Regelung der Ligand-vermittelten Signaltransduktion wird hauptsächlich durch die Desensibilisierung des GPCR mittels Dephosphorylierung (katalysiert durch GRK) und zusätzlich durch Internalisierung des GPCR gesteuert. Die Annahme, dass GPCRs für cAMP nur an der Zellmembran signalisieren und nicht mehr sobald sie in die Zelle internalisiert wurden, konnte durch wegweisende unabhängige Forschung an GPCRs im Besonderen an TSHR und PTHR geändert werden. So konnte gezeigt werden, dass sie für cAMP nicht nur an der Zellmembran signalisieren, sondern auch, wenn sie in intrazelluläre Zellkompartimente internalisiert wurde. Dieses Phänomen („sustained signaling“ hier „anhaltende Signalisierung“) wurde seitdem für andere GPCRs (z.B. 2-AR, V2R und LHR) beschrieben. Aber die Zellkompartimente wurden für nachhaltige intrazelluläre Signale nicht ausreichend charakterisiert. Das Ziel dieser Arbeit war es die Bewegung und die dynamische Natur der möglichen signalisierenden Kompartimente mittels „real-time TIRF“-Mikroskopie und die Signalisierung unter Verwendung von „real-time FRET“ in primären Maus Schilddrüsenzellen zu untersuchen.
Die vorliegende Arbeit berichtet, dass TSH/TSHR Komplexe internalisieren und ein signifikanter Teil, welcher vom Retromer Komplex angeführt wird, gelangt über den retrograden (rückwärts gerichteten) Transport in das trans-Golgi-Netzwerk (TGN). Diese TSH/TSHR-Komplexe treffen nicht in den frühen Endosomen auf die Gs-Proteine, sondern in den „Sortierer Endosomen“ und in dem TGN. Ein direkter Beweis für Gs Protein Aktivierung und Signaltransduktion am TGN und in Sortierer Endosomen konnte mittels des nanobody Nb37, einem spezifischen Biosensor für das aktive Gs Protein, erbracht werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Sequestrierung von Nb37 an diesen Kompartimenten ein szintillierendes Verhalten in Zeit und Raum zeigt. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass die katalytische Untereinheit der PKA am Golgi/TGN angereichert ist. Die Behandlung mit Brefeldin A führt zum Verlust dieser PKA Lokalisation am Golgi. Die Beschädigung und Reorganisation des TGN durch Brefeldin A führt zu a) einer abgeschwächten cAMP Reaktion b) einer dreiphasigen PKA Reaktion charakterisiert durch eine schnelle erste Phase, eine langsame (deutlich abgeschwächte) zweite Phase und eine verzögerte dritte Phase und schließlich c) einer abgeschwächte CREB Phosphorylierung. Es gibt Anzeichen dafür, dass die Reorganisation des TGN Kompartimente betrifft, die verantwortlich für intrazelluläre cAMP- und PKA-Signalisierung sind. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das TGN eines der Kompartimente ist, das für die anhaltende TSHR-Signalisierung verantwortlich ist.
KW  - G-Protein gekoppelte Rezeptoren
KW  - GPCR
KW  - thyroid stimulating hormone receptor
KW  - trans-Golgi network
KW  - Signaltransduktion
KW  - Golgi-Apparat
KW  - Schilddrüse
Y1  - 2018
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-147159
ER  - 
TY  - THES
A1  - Schneider, Matthias
T1  - Characterisation of Metalloprotease-mediated EGFR Signal Transactivation after GPCR Stimulation
T1  - Charakterisierung der EGFR Signaltransaktivierung nach GPCR Stimulation
N2  - In the context of metalloprotease-mediated transactivation of the epidermal growth factor receptor, different monoclonal antibodies against ADAM17 / TACE were characterized for their ability to block the sheddase. Activity of some of them was observed at doses between 2µg/mL and 10µg/mL. Kinetic analyses showed their activity starting at around 30 minutes. In cellular assays performed with the antibodies, especially upon treatment of cells with sphingosine-1-phosphate a reduction in proliferation was observed with some candidates. Moreover this study provides potential new roles for ß-Arrestins. Their involvement in the triple membrane-passing signal pathway of EGFR transactivation was shown. Furthermore, in overexpressing cellular model systems, an interaction between ADAM17 and ß-Arrestin1 could be observed. Detailed analysis discovered that phosphorylation of ß-Arrestin1 is crucial for this interaction. Additionally, the novel mechanism of UV-induced EGFR transactivation was extended to squamous cell carcinoma. The mechanism happens in a dose dependent manner and requires a metalloprotease to shed the proligand Amphiregulin. The involvement of both ADAM9 and ADAM17, being the metalloproteases responsible for this cleavage, was shown for SCC9 cells.
N2  - Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene monoklonale Antikörper gegen ADAM17 / TACE im Kontext der Metalloprotease-vermittelten Transaktivierung des Epidermalen Wachstumsfaktors auf ihre Fähigkeit hin untersucht, die Proteaseaktivität zu unterdrücken. Einige von Ihnen zeigten inhibitorische Aktivität bei Konzentrationen zwischen 2µg/ml und 10µg/ml. Die Untersuchung der Zeitabhängigkeit ihrer Wirkungsweise ergab eine Aktivität ab 30 Minuten Vorinkubation. In zellulären Versuchen konnte eine Verminderung der Proliferation besonders nach Stimulation mit Sphingosin-1-Phosphat gezeigt werden. Darüber hinaus konnten möglich neue Funktionen von ß-Arrestinen gezeigt werden. Eine Beteiligung am „triple membrane-passing“ Signalwegs der Transaktivierung des Epidermalen Wachstumsfaktors wurde dargestellt. Zudem wurde eine Interaktion von ß-Arrestin1 und ADAM17 in überexprimierenden Zellsystemen gezeigt. Detaillierte Analysen belegten, dass die Phosphorylierung von ß-Arrestin1 eine notwendige Voraussetzung dafür ist. Weiterhin wurde der neue Mechanismus der UV-vermittelten Aktivierung des epidermalen Wachstumsfaktors auf Plattenephithelkarzinom-Zellen ausgeweitet. Er findet in einer dosisabhängigen Form statt und bedarf einer Metalloprotease zum Aktivieren des Liganden Amphiregulin. Sowohl ADAM9 als auch ADAM17 wurden als die verantwortlichen Metalloproteasen in den untersuchten SCC9 Zellen ermittelt.
KW  - Epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor
KW  - G-Protein gekoppelte Rezeptoren
KW  - Metalloprotease
KW  - Krebs <Medizin>
KW  - EGF Rezeptor
KW  - Transaktivierung
KW  - GPCR
KW  - UV
KW  - EGFR Transactivation
KW  - Metalloprotease
KW  - GPCR
KW  - Cancer
KW  - UV
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-65105
ER  - 
TY  - THES
A1  - Stumpf, Anette D.
T1  - Development of fluorescent FRET receptor sensors for investigation of conformational changes in adenosine A1 and A2A receptors
T1  - Entwicklung fluoreszenter FRET Rezeptor-Sensoren zur Untersuchung von Konformationsänderungen in Adenosin A1 und A2A Rezeptoren
N2  - Adenosine receptors that belong to the rhodopsin-like G protein-coupled receptors (GPCRs) are involved in a lot of regulatory processes and are widely distributed throughout the body which makes them an attractive target for drugs. However, pharmacological knowledge of these receptors is still limited. A big advance regarding the structural knowledge of adenosine receptors was the development of the first crystal structure of the adenosine A2A receptor in 2008. The crystal structure revealed the amino acids that form the ligand binding pocket of the receptor and depicted the endpoint of receptor movement in the ligand binding process. Within the scope of this work two members of the adenosine receptor family were investigated, namely the adenosine A1 and the A2A receptor (A1R, A2AR). A1R was generated on base of the previously developed A2AR. Receptors were tagged with fluorophores, with the cyan fluorescent protein (CFP) at the C-terminal end of receptor and the Fluorescein Arsenical Hairpin binder (FlAsH) binding sequence within the third intracellular loop of receptors. Resulting fluorescent receptor sensors
A1 Fl3 CFP and A2A Fl3 CFP were investigated with help of Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) measurements within living cells. FRET experiments enable the examination of alteration in the distance of two fluorophores and thus the observation of receptor dynamical movements.
For comparison of A1R and A2AR regarding receptor dynamical movement upon ligand binding, fluorescent receptor sensors A1 Fl3 CFP and A2A Fl3 CFP were superfused with various ligands and the outcomes of FRET experiments were compared regarding signal height of FRET ratio evoked by the distinct ligand that is correlated to the conformational change of receptor upon ligand binding. Beside the different direction of FRET ratio upon ligand binding at A1R and A2AR sensor, there were differences observable when signal height and association and dissociation kinetics of the various ligands investigated were compared to each other. Differences between the adenosine receptor subtypes were especially remarkable for the A1R subtype selective agonist CPA and the A2AR subtype selective agonist CGS 21680. Another part of the project was to investigate the influence of single amino acids in the ligand binding process within the fluorescent A1R sensor. Amino acid positions were derived from the crystal structure of the A2AR forming the ligand binding pocket and these amino acids were mutated in the A1R structure. Investigation of the A1R sensor and its mutants regarding confocal analysis showed involvement
of some amino acids in receptor localization. When these amino acids were mutated receptors were not expressed in the plasma membrane of cells. Some amino acids investigated were found to be involved in the ligand binding process in general whereas other amino acids were found to have an influence on the binding of distinct structural groups of the ligands investigated. In a further step, A1R and A2AR were N-terminally tagged with SNAP or CLIP which allowed to label receptor sensors with multiple fluorophores. With this technique receptor distribution in cells could be investigated with help of confocal analysis. Furthermore, ligand binding with fluorescent adenosine receptor ligands and their competition with help of a non-fluorescent antagonist was examined at the SNAP tagged A1R and A2AR. Finally the previously developed receptor sensors were combined to the triple labeled receptor sensors SNAP A1 Fl3 CFP and SNAP A2A Fl3 CFP which were functional regarding FRET experiments and plasma membrane expression was confirmed via confocal analysis. In the future, with the help of this technique, interaction between fluorescent ligand and SNAP tagged receptor can be monitored simultaneously with the receptor movement that is indicated by the distance alteration between FlAsH and CFP. This can
lead to a better understanding of receptor function and its dynamical movement upon ligand binding which may contribute to the development of new and more specific drugs for the A1R and A2AR in the future.
N2  - Adenosin Rezeptoren, die zur Gruppe der Rhodopsin-ähnlichen G Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) gehören, sind in eine Vielzahl regulatorischer Prozesse eingebunden und weit im Körper verbreitet. Das macht sie zu einer interessanten Zielstruktur für Arzneistoffe. Das Wissen über die Struktur der Adenosin Rezeptoren ist jedoch noch begrenzt. Ein großer Fortschritt zu mehr strukturellem Wissen war die Entwicklung der ersten Kristallstruktur des Adenosin A2A Rezeptors im Jahr 2008. Mit der Kristallstruktur wurden die Aminosäuren bekannt, die die Ligandenbindetasche dieses Rezeptors formen. Zudem gab die Kristallstruktur Einblick in den Endpunkt der dynamischen Rezeptorbewegung nach Ligandenbindung. Im Rahmen der hier vorgestellten Arbeit wurden zwei Mitglieder der Adenosin Rezeptor Familie, der Adenosin A1 Rezeptor und der Adenosin A2A Rezeptor (A1R, A2AR), genauer untersucht. Der A1R wurde auf Basis des vor kurzem veröffentlichten A2AR entwickelt. Die Rezeptoren wurden mit Fluorophoren versehen, zum einen mit dem cyan fluoreszierenden Protein (CFP) am C-Terminus des Rezeptors und zum anderen mit der Bindesequenz des kleinen Fluorophors "Fluorescein Arsenical Hairpin binder" (FlAsH) in der dritten intrazellulären Schleife des Rezeptors. Die daraus resultierenden Rezeptorsensoren A1 Fl3 CFP und A2A Fl3 CFP wurden mit Hilfe des Fluoreszenz Resonanz Energie Transfers (FRET) in lebenden Zellen erforscht. FRET Messungen ermöglichen es, eine Änderung der Distanz zwischen
den beiden Fluorophoren und damit Rezeptorbewegungen zu untersuchen. Um A1R und A2AR bezüglich dynamischer Rezeptorbewegungen nach Ligandenbindung vergleichen zu können, wurden die fluoreszierenden Rezeptorsensoren A1 Fl3 CFP und A2A Fl3 CFP mit verschiedenen Liganden umspült. Die Ergebnisse der FRET Messungen bezüglich ihrer Höhe des FRET Ratio wurden verglichen, welche
mit der Konformationsänderung des Rezeptors nach Ligandenbindung zusammenhängt. Neben der unterschiedlichen Richtung des FRET Ratio nach Ligandenbindung am A1R und A2AR Sensor waren Unterschiede bezüglich der Signalhöhe und der Bindungs- und Dissoziationskinetiken feststellbar, wenn die verschiedenen Liganden miteinander verglichen wurden. Unterschiede zwischen den Adenosin Rezeptor Subtypen waren speziell für den A1R subtypselektiven Agonist CPA und für den
A2AR subtypselektiven Agonist CGS 21680 feststellbar. Einen weiteren Punkt in diesem Projekt stellte die Erforschung des Einflusses, den einzelne Aminosäuren im fluoreszierenden A1R Sensor auf den Prozess der Ligandenbindung haben, dar. Die Position der Aminosäuren wurde der Kristallstruktur des A2AR entnommen und entsprechende Aminosäuren im A1R mutiert. Die konfokalmikroskopische Analyse des A1R Sensors und seiner Mutanten ergab, dass einige Aminosäuren direkt an der zellulären Expression des Rezeptors beteiligt waren. Wurden diese Aminosäuren mutiert, wurde der Rezeptor nicht in der Plasmamembran der Zellen exprimiert. Einige Aminosäuren die untersucht wurden,hatten einen generellen Einfluss auf die Bindung der Liganden, andere Aminosäuren hatten mehr Einfluss auf die Bindung bestimmter struktureller Gruppen der untersuchten Liganden. In einem weiteren Schritt wurden A1R und A2AR am N-terminalen Rezeptorende
mit SNAP oder CLIP versehen, was eine Markierung der Rezeptoren mit einer Vielzahl an Fluorophoren erlaubt. Mit Hilfe dieser Technik konnte die Verteilung der Rezeptoren in der Zelle mit konfokaler Mikroskopie untersucht werden. Des Weiteren wurde die Bindung von fluoreszierenden Adenosin Rezeptor Liganden und deren Verdrängung mit einem nicht-fluoreszierenden Adenosin Rezeptor Antagonist erforscht. Am Ende des Projekts wurden die zuvor beschriebenen fluoreszierenden Rezeptorsensoren zu dreifach fluorophormarkierten Rezeptorsensoren kombiniert, was zu den Sensoren SNAP A1 Fl3 CFP und SNAP A2A Fl3 CFP führte. Beide Rezeptorsensoren waren funktionell bezüglich FRET Experimenten und der Expression in der
Plasmamembran der Zellen. In Zukunft können mit dieser Methode gleichzeitig die Bindung von fluoreszierenden Liganden am SNAP-markierten Rezeptor, so wie die Rezeptorbewegung beobachtet
werden, die durch eine Distanzänderung zwischen CFP und FlAsH angezeigt wird. Das kann zu einem besseren Verständnis der Rezeptorfunktion und der dynamischen Rezeptorbewegung nach Ligandenbindung führen, die in Zukunft zur Entwicklung spezifischerer Wirkstoffe am A1R und A2AR beitragen könnte.
KW  - Adenosinrezeptor
KW  - Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer
KW  - G-Protein gekoppelte Rezeptoren
KW  - Adenosine receptors
Y1  - 2015
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-125469
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TY  - THES
A1  - Emami-Nemini, Alexander Darius
T1  - Differential parathyroid hormone receptor signaling directed by adaptor proteins
T1  - Steuerung differenzieller Signalgebung des Parathormon Rezeptors durch Adapterproteine
N2  - The superfamily of G protein-coupled receptors (GPCR) regulates numerous physiological and pathophysiological processes. Hence GPCRs are of significant interest for pharmacological therapy. Embedded into cytoplasmic membranes, GPCRs represent the core of large signaling complexes, which are critical for transduction of exogenous stimuli towards activation of downstream signaling pathways. As a member of the GPCR family B, the parathyroid hormone receptor (PTHR) activates adenylyl cyclases, phospholipases C β as well as mitogen-activated protein kinase-dependent signaling pathways, thereby mediating endocrine and paracrine effects of parathyroid hormone (PTH) and parathyroid hormone-related peptide (PTHrP), respectively. This regulates, calcium homeostasis, bone metabolism and bone development. Paradoxically, PTH is able to induce both catabolic and anabolic bone metabolism. The anabolic effect of PTH is successfully applied in the therapy of severe osteoporosis. Domination of anabolic or catabolic bone-metabolism is entailed by temporal and cell-type specific determinants. The molecular bases are presumably differential arrangements of adaptor proteins within large signaling complexes that may lead to differential activation of signaling pathways, thereby regulating physiological effects. The molecular mechanisms are largely unclear; thus, there is significant interest in revealing a better understanding of PTHR-related adaptor proteins. To identify novel adaptor proteins which direct PTHR signaling pathways, a proteomic screening approach was developed. In this screening, vav2, a guanine-nucleotide exchange factor (GEF) for small GTPases which regulates cytoskeleton reorganization, was found to interact with intracellular domains of PTHR. Evidence is provided that vav2 impairs PTH-mediated phospholipase C β (PLCβ) signaling pathways by competitive interactions with G protein αq subunits. Vice versa, PTH was shown to regulate phosphorylation and subsequent GEF activity of vav2. These findings may thus shed new light on the molecular mechanisms underlying the effects of PTH on bone metabolism by PLC-signaling, cell migration and cytoskeleton organization. In addition to the understanding of intracellular molecular signaling processes, screening for ligands is a fundamental and demanding prerequisite for modern drug development. To this end, ligand binding assays represent a fundamental technique. As a substitution for expensive and potentially harmful radioligand binding, fluorescence-based ligand-binding assays for PTHR were developed in this work. Based on time-resolved fluorescence, several assay variants were established to facilitate drug development for the PTHR.
N2  - Die Superfamilie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) reguliert eine Vielzahl von physiologischen und pathophysiologischen Prozessen, was sie bedeutend für die Pharmakotherapie macht. Eingebettet in die Zytoplasmamembran sind GPCRs das Zentrum von Signalkomplexen, die eine Transduktion äußerer Stimuli zur Aktivierung von nachgeschalteten Signalwegen ermöglichen. Der zur Familie B der GPCRs gehörige Parathormon-Rezeptor (PTHR) aktiviert Adenylyl-Zyklasen-, Phospholipasen Cβ- und Mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAPK)-abhängige Signalwege, wodurch endokrine und parakrine Wirkungen des Parathormons (PTH) und des Parathormon-ähnlichen Peptides (PTHrP) vermittelt werden. Dies ermöglicht die Regulation der Calcium-Homöostase, des Knochenmetabolismus und der Knochenentwicklung. Paradoxerweise kann PTH sowohl katabole als auch anabole Effekte auf den Knochenstoffwechsel induzieren. Den anabolen Effekt von PTH nutzt man erfolgreich in der Therapie der schweren Osteoporose. Ob ein anaboler oder kataboler Knochenmetabolismus überwiegt, wird durch zeitliche und Zelltyp-spezifische Faktoren bestimmt. Dem zugrunde liegt vermutlich unter anderem eine differenzielle Anordnung verschiedener Adapterproteine innerhalb der Signalkomplexe, die zur differenziellen Aktivierung von Signalwegen führen und so eine Steuerung bestimmter physiologischer Effekte ermöglichen. Die molekularen Mechanismen sind jedoch noch weitgehend unklar, weshalb großes Interesse besteht, ein besseres Verständnis über die PTHR-assoziierten Adapterproteine zu entwickeln. Zur Identifizierung neuer Adapterproteine, die PTHR-Signalwege beeinflussen, wurde in dieser Arbeit ein auf dem Proteom-basierender Screening-Ansatz entwickelt. Dieser führte zur Entdeckung einer Interaktion von intrazellulären Domänen des PTHR mit vav2, einem Guanin-Nukleotid Austauschfaktor (GEF) für kleine GTPasen, der die Zytoskelett-Reorganisation steuert. Des Weiteren wurde nachgewiesen, dass vav2 über kompetitive Interaktionen mit G Protein αq Untereinheiten PTH-vermittelte Phospholipase Cβ (PLCβ)-abhängige Signalwege beeinflusst. Umgekehrt wurde gezeigt, dass PTH die Phosphorylierung und damit die GEF Aktivität von vav2 reguliert. Diese Befunde können Aufschluss über molekulare Mechanismen geben, die den Wirkungen von PTH auf den Knochenstoffwechsel durch PLC-Signalwege, Zellmigration und Zytoskelett-Reorganisation zugrunde liegen. Neben dem Verständnis über molekulare Prozesse der intrazellulären Signalgebung ist die Suche nach Liganden eine herausfordernde Grundvoraussetzung für die aktuelle Arzneistoffentwicklung. Liganden-Bindungs-Experimente stellen dafür elementare Techniken dar. Zur Substitution kostenintensiver und potentiell gesundheitsschädlicher Radioliganden-Bindungen, wurden in dieser Arbeit Fluoreszenz-basierte Liganden-Bindungs-Experimente für den PTHR entwickelt. Basierend auf Zeit-aufgelöster Fluoreszenz wurden mehrere Varianten dieser Experimente etabliert, um die Arzneistoffentwicklung am PTHR zu unterstützen.
KW  - G-Protein gekoppelte Rezeptoren
KW  - Parathormon
KW  - G-Protein gekoppelte Rezeptoren
KW  - Parathormon
KW  - vav2
KW  - Guanin Nukleotid Austauschfaktor
KW  - G protein coupled receptor
KW  - parathyroid hormone
KW  - vav2
KW  - guanine nucleotide exchange factor
KW  - Guaninnucleotid-Austauschfaktoren
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72369
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TY  - THES
A1  - Kauk, Michael
T1  - Investigating the Molecular Mechanism of Receptor Activation at Muscarinic Receptors by Means of Pathway-Specific Dualsteric Ligands and Partial Agonists
T1  - Molekulare Grundlagen der Rezeptoraktivierung von muskarinergen Acetylcholin Rezeptoren durch dualstere Liganden und Partialagonisten
N2  - G protein-coupled receptors (GPCRs) form the biggest receptor family that is encoded in the human genome and represent the most druggable target structure for modern therapeutics respectively future drug development. Belonging to aminergic class A GPCRs muscarinic Acetylcholine receptors (mAChRs) are already now of clinical relevance and are also seen as promising future drug targets for treating neurodegenerative diseases like Alzheimer or Parkinson. The mAChR family consist of five subtypes showing high sequence identity for the endogenous ligand binding region and thus it is challenging until now to selectively activate a single receptor subtype. A well accepted method to study ligand binding, dynamic receptor activation and downstream signaling is the fluorescence resonance energy transfer (FRET) application. Here, there relative distance between two fluorophores in close proximity (<10 nm) can be monitored in a dynamic manner. The perquisite for that is the spectral overlap of the emission spectrum of the first fluorophore with the excitation spectrum of the second fluorophore. By inserting two fluorophores into the molecular receptor structure receptor FRET sensors can serve as a powerful tool to study dynamic receptor pharmacology.
Dualsteric Ligands consist of two different pharmacophoric entities and are regarded as a promising ligand design for future drug development. The orthosteric part interacts with high affinity with the endogenous ligand binding region whereas the allosteric part binds to a different receptor region mostly located in the extracellular vestibule. Both moieties are covalently linked. Dualsteric ligands exhibit a dynamic ligand binding. The dualsteric binding position is characterized by a simultaneous binding of the orthosteric and allosteric moiety to the receptor and thus by receptor activation. In the purely allosteric binding position no receptor activation can be monitored.
In the present work the first receptor FRET sensor for the muscarinic subtype 1 (M1) was generated and characterized. The M1-I3N-CFP sensor showed an unaltered physiological behavior as well as ligand and concentration dependent responses. The sensor was used to characterize different sets of dualsteric ligands concerning their pharmacological properties like receptor activation. It was shown that the hybrids consisting of the synthetic full agonist iperoxo and the positive allosteric modulator of BQCA type is very promising. Furthermore, it was shown for orthosteric as well as dualsteric ligands that the degree of receptor activation is highly dependent on the length of and the chemical properties of the linker moiety. For dualsteric ligands a bell-shaped activation characteristic was reported for the first time, suggesting that there is an optimal linker length for dualsteric ligands. The gained knowledge about hybrid design was then used to generate and characterize the first photo-switchable dualsteric ligand. The resulting hybrids were characterized with the M1-I3N-CFP sensor and were described as photo-inactivatable and dimmable. In addition to the ligand characterization the ligand application methodology was further developed and improved. Thus, a fragment-based screening approach for dualsteric ligands was reported in this study for the first time. With this approach it is possible to investigate dualsteric ligands in greater detail by applying either single ligand fragments alone or in a mixture of building blocks. These studies revealed the insights that the effect of dualsteric ligands on a GPCR can be rebuild by applying the single building blocks simultaneously. The fragment-based screening provides high potential for the molecular understanding of dualsteric ligands and for future screening approaches. Next, a further development of the standard procedure for measuring FRET by sensitized emission was performed. Under normal conditions single cell FRET is measured on glass coverslips. After coating the coverslips surface with a 20 nm thick gold layer an increased FRET efficiency up to 60 % could be reported. This finding was validated in different approaches und in different configurations. This FRET enhancement by plasmonic surfaces was until yet unreported in the literature for physiological systems and make FRET for future projects even more powerful.
N2  - G Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) bilden die größte Proteinfamilie, die im humanen Genom verschlüsselt ist. Sie sind nicht nur die Zielstruktur für eine Vielzahl von derzeit gebräuchlichen Medikamenten, sondern gehören auch zu den vielversprechendsten Therapieansätzen für die moderne Medikamentenentwicklung. Muskarinerge Acetylcholin Rezeptoren (mAChRs) gehören zu den aminergen Klasse A GPCRs und sind bereits heute von klinischer Relevanz. Die muskarinerge Rezeptorfamilie wird von fünf Subtypen gebildet, die sich besonders durch eine hohe Sequenzidentität in der endogenen Ligandenbindestelle (orthostere Bindestelle) auszeichnen. Aus diesem Grund ist es mit den herkömmlich verwendeten Medikamenten nicht möglich, einen ganz bestimmten Subtyp zu therapieren, ohne auch andere Subtypen zu beeinflussen und so unerwünschte Nebenwirkungen zu erhalten. Eine Möglichkeit Ligandenbindung, dynamische Rezeptoraktivierung oder Signalweiterleitung von GPCRs nach pharmakologischen Gesichtspunkten zu charakterisieren, stellt der Floreszenz Resonanz Energietransfer (FRET) dar. Mit Hilfe dieser Methode kann über kleine Entfernungen (<10 nm) die relative Orientierung von zwei Fluorophoren mit überlappenden Spektralbereichen mit hoher zeitlicher Auflösung verfolgt werden. Integriert man das Fluorophorpaar mit Hilfe gentechnischer Methoden in die Molekülstruktur des Rezeptors, kann man dessen Konformationsänderung bzw. Aktivierung infolge einer Ligandenbindung aufzeichnen.
Dualstere Liganden sind eine Substanzklasse von hohem zukünftigen klinischen Potential und zeichnen sich durch die Verknüpfung mehrerer pharmakologisch aktiver Untereinheiten aus. Der orthostere Molekülteil interagiert mit der endogenen Ligandenbindestelle und der allostere Molekülteil interagiert mit einem zweiten Rezeptorabschnitt, der häufig in den extrazellulären Schlaufen des Rezeptors zu finden ist. Diese allosteren Bindestellen zeichnet sich durch eine vergleichsweise geringe Sequenzidentität aus, weswegen allostere Modulatoren auch selektiv an Subtypen binden können. Aufgrund des Aufbaus können dualstere Liganden auf vielfältige Weise mit dem Rezeptor interagieren und dieser Bindemechanismus wurde als dynamische Ligandenbindung beschrieben. Zum einen können beide Molekülteile gleichzeitig mit dem Rezeptor interagieren und ihn aktivieren (dualsterer Bindemodus) und zum anderen findet man einen rein allosteren Bindemodus, der den Rezeptor nicht aktiviert. Der orthostere Molekülteil ist vor allem für die Rezeptoraktivierung zuständig, die sich durch eine hohe Affinität auszeichnet und der allostere Molekülteil kann selektive Rezeptorinteraktionen vermitteln. Da dualstere Moleküle immer Eigenschaften beider Untereinheiten besitzen, werden dualstere Liganden als sehr vielversprechend erachtet, zukünftig subtypselektive Medikamente darzustellen.
In dieser Arbeit wurde der erste Rezeptor FRET Sensor für den muskarinergen Subtyp 1 (M1) beschrieben und es konnte gezeigt werden, dass sich dieser Rezeptorsensor in seiner physiologischen Funktion nicht von dem wild Typ unterscheidet. Des Weiteren können mit Hilfe dieses Sensors liganden- und konzentrationsabhängige Rezeptorantworten aufgezeichnet werden. Der M1-I3N-CFP wurde dazu genutzt verschiedene Reihen dualsterer Liganden zu charakterisieren und auf ihre aktivierenden Eigenschaften bezüglich des M1 zu testen. Es wurde gezeigt, dass die Kombination aus dem synthetischen und hochpotenten Agonisten Iperoxo als Orthoster und dem in der Literatur als M1 selektiven positiven allosteren Modulator beschriebenen BQCA als Alloster sehr vielversprechend ist. Es konnte gezeigt werden, dass die rezeptoraktivierenden Eigenschaften sowohl von orthosteren wie auch von dualsteren Liganden stark von der Linkerlänge abhängig sind. Für dualstere Liganden konnte so ein glockenförmiger Zusammenhang zwischen Linkerlänge und Rezeptoraktivierung herausgearbeitet werden. Des Weiteren wurde gezeigt, dass bestimmte Hybride, die den M1 aktivieren, an anderen Subtypen keine Effekte hervorrufen und somit als subtypselektiv beschrieben werden können. Im Anschluss wurde mit Hilfe des gewonnenen Wissens über Iperoxo/BQCA Hybride, das Moleküldesign der dualsteren Liganden weiterentwickelt. So wurden in dieser Arbeit die ersten photo-schaltbaren bzw. photo-dimmbaren dualsteren Liganden beschrieben und charakterisiert. Des Weiteren wurde in dieser Arbeit die herkömmliche Charakterisierung von dualsteren Liganden weiterentwickelt. Es konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass es möglich ist, die Aktivierung eines Rezeptors durch einen dualsteren Liganden nachzustellen, indem die einzelnen Fragmente des ursprünglichen Liganden gleichzeitig appliziert werden. Diese auf Fragmenten basierende Charakterisierung ist die erste Anwendung dieser Art und birgt großes Potential für die zukünftige Suche nach neuen Wirkstoffen. Neben der Untersuchung von pharmakologischen Schwerpunkten wurde auch die Weiterentwicklung der Rezeptor FRET Methodik beschrieben. Die herkömmliche Anwendung der Rezeptor FRET Sensoren geschieht auf Objektträgern aus Quarzglas. In dieser Arbeit wurde diese Anwendung dahingehend weiterentwickelt, dass die Objektträger mit einer 20 nm dicken Goldschicht beschichtet wurden, um den Einfluss von Plasmonoberflächen auf physiologisch relevante FRET Messungen zu untersuchen. Es konnte gezeigt werden, dass mit Hilfe der Goldbeschichtung und in Abhängigkeit des Versuchsaufbaus die Energietransfereffizienz um bis zu 60 % gesteigert werden konnte. Diese Entdeckung zeigt Potential zukünftig die FRET-Reichweite zu erhöhen und so bisher nicht charakterisierbare Sachverhalte aufklären zu können.
KW  - G-Protein gekoppelte Rezeptoren
KW  - Muscarinrezeptor
KW  - Dualsteric Ligands
KW  - Partial Agonists
KW  - Dualstere Liganden
KW  - Partialagonismus
Y1  - 2018
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-173729
N1  - Online-Version enthält nicht den Appendix (Volltexte der Originalveröffentlichungen der Zeitschriftenaufsätze)
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TY  - THES
A1  - Schmid, Benedikt
T1  - Molecular Signaling Mechanisms at the µ-Opioid Receptor
T1  - Molekulare Signalmechanismen am µ-Opioidrezeptor
N2  - To this day, opioids represent the most effective class of drugs for the treatment of severe pain. On a molecular level, all opioids in use today are agonists at the μ-opioid receptor (μ receptor). The μ receptor is a class A G protein-coupled receptor (GPCR). GPCRs are among the biological structures most frequently targeted by pharmaceuticals. They are membrane bound receptors, which confer their signals into the cell primarily by activating a variety of GTPases called G proteins. In the course of the signaling process, the μ receptor will be phosphorylated by GRKs, increasing its affinity for another entity of signaling proteins called β-arrestins (β-arrs). The binding of a β-arr to the activated μ receptor will end the G protein signal and cause the receptor to be internalized into the cell. Past research showed that the μ receptor’s G protein signal puts into effect the desired pain relieving properties of opioid drugs, whereas β-arr recruitment is more often linked to adverse effects like obstipation, tolerance, and respiratory depression. Recent work in academic and industrial research picked up on these findings and looked into the possibility of enhancing G protein signaling while suppressing β-arr recruitment. The conceptual groundwork of such approaches is the phenomenon of biased agonism. It appreciates the fact that different ligands can change the relative contribution of any given pathway to the overall downstream signaling, thus enabling not only receptor-specific but even pathway-specific signaling.
This work examined the ability of a variety of common opioid drugs to specifically activate the different signaling pathways and quantify it by means of resonance energy transfer and protein complementation experiments in living cells. Phosphorylation of the activated receptor is a central step in the canonical GPCR signaling process. Therefore, in a second step, expression levels of the phosphorylating GRKs were enhanced in search for possible effects on receptor signaling and ligand bias.
In short, detailed pharmacological profiles of 17 opioid ligands were recorded. Comparison with known clinical properties of the compounds showed robust correlation of G protein activation efficacy and analgesic potency. Ligand bias (i.e. significant preference of any path- way over another by a given agonist) was found for a number of opioids in native HEK293 cells overexpressing μ receptor and β-arrs. Furthermore, overexpression of GRK2 was shown to fundamentally
change β-arr pharmacodynamics of nearly all opioids. As a consequence, any ligand bias as detected earlier was abolished with GRK2 overexpression, with the exception of buprenorhin. In summary, the following key findings stand out: (1) Common opioid drugs exert biased agonism at the μ receptor to a small extent. (2) Ligand bias is influenced by expression levels of GRK2, which may vary between individuals, target tissues or even over time. (3) One of the opioids, buprenorhin, did not change its signaling properties with the overexpression of GRK2. This might serve as a starting point for the development of new opioids which could lack the ability of β-arr recruitment altogether and thus might help reduce adverse side effects in the treatment of severe pain.
N2  - Nach wie vor stellen Opioide die wirkstärkste Gruppe von Medikamenten zu Behandlung starker Schmerzen dar. Auf molekularer Ebene sind alle heute gebräuchlichen Opioide Agonisten am μ-Opioidrezeptor. Der μ-Opioidrezeptor ist ein G-Protein-gekoppelter Rezeptor (GPCR) der Klasse A. GPCR zählen zu den häufigsten Zielstrukturen von Pharmaka. Sie sind membranständige Rezeptoren, die ihr Signal in erster Linie durch die Aktivierung von G-Proteine genannten GTPasen in die Zelle weiterleiten. Im Laufe des Signalprozesses wird der GPCR von GRK phosphoryliert, wodurch seine Affinität zu einer weiteren Gruppe von Signalproteinen, den sog. β-Arrestinen erhöht wird. Bindet ein β-Arrestin an den Rezeptor, beendet dies das G-Proteinsignal und veranlasst die Internalisierung des Rezeptors ins Zellinnere. Bisherige Forschung zeigte, dass das G-Proteinsignal des μ-Opioidrezeptors die erwünschte Schmerzlinderung vermittelt, wohingegen die Rekrutierung von β-Arrestin oftmals mit unerwünschten Wirkungen wie Obstipation, Toleranzentwicklung und Atemdepression in Verbindung gebracht wird. Neuere akademische und industrielle Forschung griff diese Erkenntnisse auf und erkundete die Möglichkeit, das G-Proteinsignal zu verstärken und zur gleichen Zeit die β-Arrestinrekrutierung zu inhibieren. Die theoretische Grundlage solcher Ansätze liegt im Konzept des biased agonism. Dieses berücksichtigt die Tatsache, dass verschiedene Liganden den Anteil eines bestimmten Signalweges am gesamten vom Rezeptor ausgehenden Signals beeinflussen kann und damit nicht nur rezeptor-, sondern sogar signalwegspezifische Signale möglich sein sollten.
Die vorliegende Arbeit untersuchte eine Reihe von gängigen Opioiden auf ihre Fähigkeit hin, die einzelnen Signalwege spezifisch zu aktivieren und quantifizierte dies mit Methoden des Resonanzenergietransfers sowie der Proteinkomplementierung in lebenden Zellen. Die Phosphorylierung des Rezeptors ist ein zentrales Ereignis in der anerkannten Abfolge der Signalprozesse an GPCR. Daher wurde in einem weiteren Schritt die Expression der phosphorylierenden GRK erhöht und nach möglichen Auswirkungen auf die Selektivität der Signalwegaktivierung gesucht. Hierbei wurde detaillierte pharmakologische Profile von 17 Opioiden erstellt. Der Abgleich mit bekannten klinischen Wirkeigenschaften der Substanzen zeigte einen robusten Zusammenhang zwischen der Fähigkeit, G-Proteine zu aktivieren und der analgetischen Wirkstärke. Ligand bias, d.h. die signifikante Bevorzugung eines Signalweges gegenüber einem anderen durch einen Liganden, konnte für eine Reihe von Opioiden in lebenden HEK293-Zellen gezeigt werden, die den μ-Opioidrezeptor sowie β-Arrestine überexprimierten. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die zusätzliche Überexpression von GRK2 die pharmakodynamischen Eigenschaften nahezu aller Opioide grundlegend veränderte. In der Folge war jeder zuvor gezeigte ligand bias mit Ausnahme von Buprenorphin aufgehoben.
Zusammenfassend stehen die folgenden drei Erkenntnisse im Vordergrund: (1) Gängige Opioide zeigen in einem gewissen Maß Selektivität zwischen den Signalwegen. (2) Ligand bias wird beeinflusst von GRK2-Expressionsleveln, welche zwischen Individuen, verschiedenen Gewebetypen oder auch im zeitlichen Verlauf variieren können. (3) Als einziges der untersuchten Opioide änderte Buprenorphin seine Signaleigenschaften durch die Überexpression von GRK2 nicht. Dies könnte als Anknüpfungspunkt in der Entwicklung neuer Opioide dienen, die keinerlei β-Arrestinrekrutierung bewirken und dadurch helfen könnten, unerwünschte Wirkungen in der Behandlung starker Schmerzen zu verhindern.
KW  - Opiatrezeptor
KW  - Opioide
KW  - G-Protein gekoppelte Rezeptoren
KW  - Pharmakodynamik
KW  - Arrestine
KW  - Rezeptorpharmakologie
KW  - biased agonism
KW  - signalling
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-176850
ER  - 
TY  - THES
A1  - Schihada, Hannes
T1  - Novel optical methods to monitor G-protein-coupled receptor activation in microtiter plates
T1  - Neue optische Methoden zur Messung der Aktivierung von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren in Mikrotiter-Platten
N2  - G-protein-coupled receptors (GPCRs) regulate diverse physiological processes in the human body and represent prime targets in modern drug discovery. Engagement of different ligands to these membrane-embedded proteins evokes distinct receptor conformational rearrangements that facilitate subsequent receptor-mediated signalling and, ultimately, enable cellular adaptation to altered environmental conditions. Since the early 2000s, the technology of resonance energy transfer (RET) has been exploited to assess these conformational receptor dynamics in living cells and real time. However, to date, these conformational GPCR studies are restricted to single-cell microscopic setups, slowing down the discovery of novel GPCR-directed therapeutics. In this work, we present the development of a novel generalizable high-throughput compatible assay for the direct measurement of GPCR activation and deactivation. By screening a variety of energy partners for fluorescence (FRET) and bioluminescence resonance energy transfer (BRET), we identified a highly sensitive design for an α2A-adrenergic receptor conformational biosensor. This biosensor reports the receptor’s conformational change upon ligand binding in a 96-well plate reader format with the highest signal amplitude obtained so far. We demonstrate the capacity of this sensor prototype to faithfully quantify efficacy and potency of GPCR ligands in intact cells and real time. Furthermore, we confirm its universal applicability by cloning and validating five further equivalent GPCR biosensors. To prove the suitability of this new GPCR assay for screening purposes, we measured the well-accepted Z-factor as a parameter for the assay quality. All tested biosensors show excellent Z-factors indicating outstanding assay quality. Furthermore, we demonstrate that this assay provides excellent throughput and presents low rates of erroneous hit identification (false positives and false negatives). Following this phase of assay development, we utilized these biosensors to understand the mechanism and consequences of the postulated modulation of parathyroid hormone receptor 1 (PTHR1) through receptor activity-modifying protein 2 (RAMP2). We found that RAMP2 desensitizes PTHR1, but not the β2-adrenergic receptor (β2AR), for agonist-induced structural changes. This generalizable sensor design offers the first possibility to upscale conformational GPCR studies, which represents the most direct and unbiased approach to monitor receptor activation and deactivation. Therefore, this novel technology provides substantial advantages over currently established methods for GPCR ligand screening. We feel confident that this technology will aid the discovery of novel types of GPCR ligands, help to identify the endogenous ligands of so-called orphan GPCRs and deepen our understanding of the physiological regulation of GPCR function.
N2  - Die Klasse der G-protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) stellt die größte Familie membranständiger Proteine dar. GPCRs regulieren eine Vielzahl diverser physiologischer Prozesse in eukaryotischen Zellen und kontrollieren so unterschiedliche Zellfunktionen im menschlichen Organismus. Sie stellen die Zelloberflächenrezeptoren für verschiedenartige extrazelluläre Stimuli, wie zum Beispiel Photonen, niedermolekulare chemische Verbindungen, Peptide und Lipide dar. Die Wechselwirkung mit diesen sogenannten Liganden stabilisiert spezifische GPCR-Konformationen. Diese dienen wiederum als Ausgangspunkt für nachgeschaltete intrazelluläre Signalkaskaden, die beispielweise über membranverankerte G-Proteine vermittelt werden können. Während endogene GPCR-Agonisten diese Signalweiterleitung verstärken, können andere Biomoleküle wie Lipide, Ionen oder andersartige Membranproteine die Funktion, und damit die Signalweiterleitung der GPCRs modulieren.  	
Aufgrund ihrer Einbindung in eine Vielzahl physiologischer und pathophysiologischer Prozesse, wurden GPCRs schon früh als Angriffspunkte („Targets“) zur Behandlung verschiedener Erkrankungen erforscht und genutzt. Heutzutage vermitteln etwa 30% aller zugelassenen Arzneistoffe ihre Wirkung über G-protein-gekoppelte Rezeptoren. Dennoch wird das große Potential dieser Rezeptorfamilie als Targets für medikamentöse Behandlungen noch nicht in vollem Umfang ausgeschöpft. Tatsächlich gibt es für mehr als 200 GPCRs, die nicht der olfaktorischen Wahrnehmung dienen, noch keine Arzneistoffe, da wenig über deren Pharmakologie und physiologische Bedeutung bekannt ist. Zudem wird die Entwicklung neuartiger GPCR-Liganden erheblich durch das eingeschränkte Methodenrepertoire beeinträchtigt. Alle derzeit etablierten Techniken zur Identifizierung neuer GPCR-Liganden erfassen entweder den Ligand-GPCR-Bindungsprozess, der keine Informationen über die tatsächliche Aktivität der Verbindung liefert, oder messen weit-nachgeschaltete Signale, wie Änderungen sogenannter „Second-Messenger“-Konzentrationen (meist cAMP oder Calcium) und Reporter-Gen-Expressionslevel. Aufgrund ihrer Entfernung vom eigentlichen Rezeptor-Aktivierungsprozess haben diese Methoden allerdings bedeutende Nachteile und produzieren so häufig Falsch-Positive und Falsch-Negative Ergebnisse.	
Seit den frühen 2000er wurden GPCR-Konformationssensoren auf Basis von Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) zur Messung der Ligand-induzierten Rezeptordynamik genutzt. Jedoch wies keiner der bisher entwickelten FRET- oder BRET- (Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer) Sensoren ausreichende Signalstärke auf, um im Hochdurchsatz-Screening (HTS) angewendet werden zu können. 
Die vorliegende Studie beschreibt das erste GPCR-Sensordesign, das aufgrund seiner exzellenten Signalstärke im Hochdurchsatz-Verfahren verwendet werden kann. Wir haben 21 unterschiedliche FRET- und BRET-Sensoren des α2A-adrenergen Rezeptors (α2AAR) getestet und dabei die Kombination der kleinen und hellen Luziferase NanoLuciferase (Nluc) mit dem rot-fluoreszierenden HaloTag-Farbstoff 618 als sensitivstes RET-Paar identifiziert. Der α2AARNluc/Halo(618) Biosensor ermöglicht die Messung der Aktivität und Wirkstärke von α2AAR-Liganden im Mikrotiterplattenformat. Um die universelle Anwendbarkeit dieses Sensordesigns zu prüfen, wurden fünf weitere Nluc/Halo(618)-basierende Sensoren für GPCRs unterschiedlicher Unterfamilien entwickelt. Zudem konnten wir zeigen, dass diese GPCRNluc/Halo(618)-Fusionsproteine weiterhin ihre natürlichen Signalkaskaden in Gang setzen können und damit die biologische Funktionalität dieser Rezeptoren erhalten ist. Außerdem belegt die vorlegende Arbeit, dass diese neue Sensor-Generation zur Messung Ligand-vermittelter Rezeptordynamiken im Hochdurchsatz-Format und zur Untersuchung der GPCR-Regulation durch endogene Modulatoren genutzt werden kann.
Zusammenfassend kann gesagt werden, dass wir den ersten HTS-kompatiblen Assay zur Messung der GPCR-Konformationsänderungen entwickelt haben. Diese Biosensoren erlauben die Charakterisierung neuartiger GPCR-Liganden direkt auf der Rezeptorebene und funktionieren damit unabhängig von nachgeschalteter Signalamplifikation oder Überlagerung verschiedener Signalwege, welche die Aussagekraft traditioneller GPCR-Screening-Verfahren häufig beeinträchtigen. Diese Technik kann zur Entdeckung neuartiger GPCR-Arzneistoffe genutzt werden, zu einem besseren Verständnis bisher kaum erforschter Rezeptoren beitragen und der Identifizierung und Charakterisierung potentieller GPCR-Modulatoren dienen.
KW  - G-Protein gekoppelte Rezeptoren
KW  - Hochdurchsatz-Screening
KW  - Förster Resonanz Energie Transfer
KW  - High-thropughput screening
KW  - Bioluminescence resonance energy transfer
KW  - G-protein-coupled receptors
KW  - Receptor dynamics
Y1  - 2021
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-175415
ER  - 
TY  - THES
A1  - Schreiber, Benjamin
T1  - Selective and enhanced fluorescence by biocompatible nanocoatings to monitor G-protein-coupled receptor dynamics
T1  - Selektive und verstärkte Fluoreszenz durch biokompatible Nanobeschichtungen zur Untersuchung von G-protein-gekoppelten Rezeptoren und ihrer Dynamik
N2  - Fluorescence microscopy has become one of the most important techniques for the imaging of biological cells and tissue, since the technique allows for selective labeling with fluorescent molecules and is highly suitable for low-light applications down to the single molecule regime. The methodological requirements are well-defined for studying membrane receptors within a highly localized nanometer-thin membrane. For example, G-protein-coupled receptors (GPCRs) are an extensively studied class of membrane receptors that represent one of the most important pharmaceutical targets. Ligand binding and GPCR activation dynamics are suspected to take place at the millisecond scale and may even be far faster. Thus, techniques that are fast, selective, and live-cell compatible are required to monitor GPCR dynamics. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) and total internal reflection fluorescence microscopy (TIRF-M) are methods of choice to monitor the dynamics of GPCRs selectively within the cell membrane. 
Despite the remarkable success of these modalities, there are limitations. Most importantly, inhomogeneous illumination can induce imaging artifacts, rendering spectroscopic evaluation difficult. Background signal due to scattering processes or imperfect labeling can hamper the signal-to-noise, thus limiting image contrast and acquisition speed. Careful consideration of the internal physiology is required for FRET sensor design, so that ligand binding and cell compatibility are well-preserved despite the fluorescence labeling procedures. This limitation of labeling positions leads to very low signal changes in FRET-based GPCR analysis. In addition, microscopy of these systems becomes even more challenging in single molecule or low-light applications where the accuracy and temporal resolution may become dramatically low. Fluorescent labels should therefore be brighter, protected from photobleaching, and as small as possible to avoid interference with the binding kinetics. The development of new fluorescent molecules and labeling methods is an ongoing process. However, a complete characterization of new labels and sensors takes time. So far, the perfect dye system for GPCR studies has not been found, even though there is high demand. 
Thus, this thesis explores and applies a different approach based on improved illumination schemes for TIRF-M as well as metal-coated coverslips to enhance fluorescence and FRET efficiency. First, it is demonstrated that a 360° illumination scheme reduces typical TIRF artifacts and produces a much more homogenously illuminated field of view. Second, membrane imaging and FRET spectroscopy are improved by metal coatings that are used to modulate the fluorescent properties of common fluorescent dyes. Computer simulation methods are used to understand the underlying photophysics and to design the coatings. Third, this thesis explores the operational regime and limitations of plasmonic approaches with high sectioning capabilities. The findings are summarized by three publications that are presented in the results section of this work. In addition, the theory of fluorescence and FRET is explained, with particular attention to its emission modulations in the vicinity of metal-dielectric layers. Details of the instrumentation, computer simulations, and cell culture are described in the method section. The work concludes with a discussion of the findings within the framework of recent technological developments as well as perspectives and suggestions for future approaches complete the presented work.
N2  - Die Fluoreszenzmikroskopie ist zu einer der wichtigsten Techniken für die Bildgebung biologischer Zellen und Gewebe geworden, da die Technik eine selektive Markierung mit fluoreszierenden Molekülen ermöglicht und sich hervorragend für Anwendungen bei schwachem Licht bis hin zum Einzelmolekül-Regime eignet. Die methodischen Anforderungen sind gut definiert, um Membranrezeptoren innerhalb einer stark lokalisierten nanometerdünnen Membran zu untersuchen. Zum Beispiel sind G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) eine ausführlich untersuchte Klasse von Membranrezeptoren, weil diese wichtige pharmazeutische Ziele darstellen. Es wird vermutet, dass die Ligandenbindungs- und GPCR-Aktivierungsdynamiken im Millisekundenbereich stattfinden und sogar viel schneller sein können. Daher sind Techniken erforderlich, die schnell, selektiv und lebend-Zell kompatibel sind, um die GPCR-Dynamik zu aufzunehmen. Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET) und internale Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie (TIRF-M) sind Methoden der Wahl, um die Dynamik von GPCRs selektiv innerhalb der Zellmembran zu untersuchen.
Trotz des bemerkenswerten Erfolgs dieser Modalitäten gibt es Einschränkungen. Am wichtigsten ist, dass eine inhomogene Beleuchtung Artefakte erzeugen kann, welche die spektroskopische Auswertung erschweren. Hintergrundsignale aufgrund von Streuprozessen oder unvollständiger Markierung können das Signal-Rausch-Verhältnis beeinträchtigen und somit den Bildkontrast und die Erfassungsgeschwindigkeit begrenzen. Eine sorgfältige Berücksichtigung der internen Physiologie ist für das Design der FRET-Sensoren ist erforderlich, so dass die Ligandenbindung und die Zellkompatibilität trotz der Fluoreszenzmarkierungsverfahren nicht gestört werden. Diese Einschränkung der Markierungspositionen führt zu sehr geringen Signalkontrast in der FRET-basierten GPCR-Analyse. Darüber hinaus wird die Mikroskopie dieser Systeme bei Einzelmolekül- oder Schwachlichtanwendungen, bei denen die Genauigkeit und die zeitliche Auflösung dramatisch niedrig werden können, noch schwieriger. Fluoreszierende Marker sollten daher heller, vor Photobleichung geschützt und so klein wie möglich sein, um Störungen mit der Rezeptorkinetik zu vermeiden. Die Entwicklung neuer fluoreszierender Moleküle und Markierungsmethoden ist ein fortlaufender Prozess. Eine vollständige Charakterisierung neuer Marker und Sensoren benötigt jedoch Zeit. Bis jetzt wurde das perfekte Farbstoffsystem für GPCR-Studien noch nicht gefunden, auch wenn es eine hohe Nachfrage dafür gibt.
Daher wird ein anderer Ansatz auf der Grundlage verbesserter Beleuchtungsschemata für TIRF-M sowie metallbeschichtete Deckgläser zur Verbesserung der Fluoreszenz- und FRET-Effizienz untersucht. Zunächst wird gezeigt, dass ein 360 ° Beleuchtung typische TIRF-Artefakte reduziert und ein wesentlich homogeneres Bildausleuchtung erzeugt. Zweitens wurde durch die Modulation der Fluoreszenzeigenschaften gängiger Fluoreszenzfarbstoffe die Membranbildgebung und FRET-Spektroskopie verbessert. Computersimulationsmethoden werden verwendet, um die zugrundeliegende Photophysik zu verstehen und zielgerichtet Beschichtungen zu entwerfen. Drittens wurden das operationelle Regime und die Grenzen von plasmonischen Ansätzen mit noch höheren Signalselektiverung untersucht. Die Ergebnisse sind in drei Publikationen zusammengefasst, die im Ergebnisteil dieser Arbeit vorgestellt werden. Darüber hinaus wird die Theorie der Fluoreszenz und des FRET unter besonderer Berücksichtigung ihrer Emissionsmodulationen in der Nähe von Metall-Dielektrikum-Schichten erläutert. Details der Instrumentierung, Computersimulationen und Zellkultur werden im Abschnitt Methoden beschrieben. Die Arbeit schließt mit einer Diskussion der Ergebnisse im Rahmen der jüngsten technologischen Entwicklungen sowie mit Perspektiven und Vorschlägen für zukünftige Ansätze, die die vorliegende Arbeit abrunden.
KW  - G-Protein gekoppelte Rezeptoren
KW  - Fluorescence
KW  - Microscopy
KW  - Plasmonic
KW  - Fluorescence Resonance Energy Transfer
KW  - G Protein-Coupled Receptors
KW  - Fluoreszenzmikroskopie
KW  - Fluorescence Microscopy
Y1  - 2018
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-173923
ER  - 
TY  - THES
A1  - Bathe-Peters, Marc
T1  - Spectroscopic approaches for the localization and dynamics of β\(_1\)- and β\(_2\)-adrenergic receptors in cardiomyocytes
T1  - Spektroskopieansätze zur Bestimmung der Lokalisation und Dynamiken von β\(_1\)- und β\(_2\)-Adrenozeptoren in Kardiomyozyten
N2  - In the heart the β\(_1\)-adrenergic receptor (AR) and the β\(_2\)-AR, two prototypical G protein-coupled receptors (GPCRs), are both activated by the same hormones, namely adrenaline and noradrenaline. Both receptors couple to stimulatory G\(_s\) proteins, mediate an increase in cyclic adenosine monophosphate (cAMP) and influence the contractility and frequency of the heart upon stimulation. However, activation of the β\(_1\)-AR, not the β\(_2\)-AR, lead to other additional effects, such as changes in gene transcription resulting in cardiac hypertrophy, leading to speculations on how distinct effects can arise from receptors coupled to the same downstream signaling pathway. 
In this thesis the question of whether this distinct behavior may originate from a differential localization of these two receptors in adult cardiomyocytes is addressed. Therefore, fluorescence spectroscopy tools are developed and implemented in order to elucidate the presence and dynamics of these endogenous receptors at the outer plasma membrane as well as on the T-tubular network of intact adult cardiomyocytes. This allows the visualization of confined localization and diffusion of the β\(_2\)-AR to the T-tubular network at endogenous expression. In contrast, the β\(_1\)-AR is found diffusing at both the outer plasma membrane and the T-tubules. Upon overexpression of the β\(_2\)-AR in adult transgenic cardiomyocytes, the receptors experience a loss of this compartmentalization and are also found at the cell surface. These data suggest that distinct signaling and functional effects can be controlled by specific cell surface targeting of the receptor subtypes.
The tools at the basis of this thesis work are a fluorescent adrenergic antagonist in combination of fluorescence fluctuation spectroscopy to monitor the localization and dynamics of the lowly expressed adrenergic receptors. Along the way to optimizing these approaches, I worked on combining widefield and confocal imaging in one setup, as well as implementing a stable autofocus mechanism using electrically tunable lenses.
N2  - Im Herzen werden der β\(_1\)-adrenerge Rezeptor (AR) und der β\(_2\)-AR, zwei prototypische GPCR, durch die Hormone Adrenalin und Noradrenalin aktiviert. Dabei interagieren beide Rezeptoren mit dem stimulatorischen G\(_s\) Protein, bewirken eine Erhöhung des cyclischen Adenosinmonophosphates (cAMP) und beeinflussen die Kontraktionskraft und Frequenz des Herzens nach einem Stimulus. Jedoch hat die Aktivierung des β\(_1\)-ARs, nicht des β\(_2\)-ARs, auch weitere Effekte, wie z.B. Veränderungen in der Transkription von Genen. Dies wiederum führt zu Spekulationen, wie solch unterschiedliche Effekte von Rezeptoren hervorgerufen werden können, die gleiche Signalwege bedienen.
In dieser Arbeit wird untersucht, ob dieses unterschiedliche Verhalten durch eine ungleiche Verteilung dieser beiden Rezeptoren in adulten Kardiomyozyten hervorgerufen werden könnte. Dazu wird die Lokalisation und die Dynamik dieser endogenen Rezeptoren in der Plasmamembran sowie im T-tubulären Netzwerk von intakten adulten Kardiomyozyten, unter Entwicklung und Verwendung hochsensitiver Fluoreszenzspektroskopiemethoden, bestimmt. Dies ermöglicht die örtliche und dynamische Eingrenzung des β\(_2\)-adrenergen Rezeptors unter endogener Expression ausschließlich auf das T-tubuläre Netzwerk. Dementgegen stellt sich heraus, dass sich der β\(_1\)-adrenerge Rezeptor ubiquitär auf der äußeren Membran und den T-Tubuli befindet und diffundiert. In β\(_2\)-AR überexprimierenden transgenen Kardiomyozyten hingegen werden diese Kompartments nicht beibehalten und es findet eine Umverteilung der Rezeptoren, auch unter Einbezug der Zelloberfläche, statt. Diese Daten können stärker darauf hindeuten, dass einige Rezeptorsubtypen sich gezielt und spezifisch bestimmte Zelloberflächen aussuchen, um somit ihre verschiedenen Signale und funktionären Effekte erzeugen zu können.
Zu den Techniken, die in dieser Arbeit die Bestimmung der Lokalisation und der Dynamiken der niedrig exprimierten adrenergen Rezeptoren zulassen, gehört die Anwendung von Fluoreszenzspektroskopiemethoden in Kombination mit einem fluoreszierenden β-adrenergen Antagonisten. Weitere Techniken, die im Rahmen dieser Arbeit entwickelt wurden und in weiterführenden Studien aufschlussreiche Erkenntnisse liefern könnten, umfassen die Entwicklung eines Setups aus einer Kombination aus Weitfeld- und Konfokalmikroskopie und die Implementierung eines stabilen Autofokus mit Hilfe einer elektrisch veränderbaren Linse.
KW  - G-Protein gekoppelte Rezeptoren
KW  - Beta-Adrenozeptor
KW  - Kardiomyozyt
KW  - Fluoreszenzmikroskopie
KW  - Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie
KW  - Fluorescence
KW  - Fluorescence Microscopy
KW  - G Protein-Coupled Receptor
KW  - Autofocus
KW  - Microscopy
KW  - Beta-Adrenergic Receptor
KW  - Cardiomyocyte
KW  - Fluorescence Correlation Spectroscopy
KW  - FCS
KW  - GPCR
Y1  - 2022
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-258126
ER  -