TY  - THES
A1  - Kaiser, Fabian Marc Philipp
T1  - Analysis of Cross-Clade Neutralizing Antibodies against HIV-1 Env Induced by Immunofocusing
T1  - Analyse von breit neutralisierenden Antikörpern gegen HIV-1 Env, die durch Immunofocusing induziert wurden
N2  - Despite intense research efforts, a safe and effective HIV-1/AIDS vaccine still remains far away. HIV-1 escapes the humoral immune response through various mechanisms and until now, only a few nAbs have been identified. A promising strategy to identify new epitopes that may elicit such nAbs is to dissect and analyze the humoral immune response of sera with broadly reactive nAbs. The identified epitopes recognized by these antibodies might then be incorporated into a vaccine to elicit similar nAbs and thus provide protection from HIV-1 infection. Using random peptide phage display libraries, the Ruprecht laboratory has identified the epitopes recognized by polyclonal antibodies of a rhesus monkey with high-titer, broadly reactive nAbs that had been induced after infection with a SHIV encoding env of a recently transmitted HIV-1 clade C. The laboratory analyzed phage peptide inserts for conformational and linear homology with computational assistance. Several of the identified peptides mimicked domains of the original HIV-1 clade Env, such as conformational V3 loop epitopes and the conserved linear region of the gp120 C-terminus. As part of this work, these mimotopes were analyzed for cross-reactivity with other sera obtained from rhesus monkeys with nAbs and antibody recognition was shown for several mimotopes, particularly those representing the V3 loop. In addition, these mimotopes were incorporated into a novel DNA prime/phage boost strategy to analyze the immunogenicity of such phage-displayed peptides. Mice were primed only once with HIV-1 clade C gp160 DNA and subsequently boosted with mixtures of recombinant phages. This strategy was designed to focus the humoral immune response on a few, selected Env epitopes (immunofocusing) and induced HIV-1 clade C gp160 binding antibodies and cross-clade nAbs. Furthermore, the C-terminus of gp120, a conserved HIV Env region, was linked to the induction of nAbs for the first time. The identification of such conserved antigens may lead to the development of a vaccine that is capable of inducing broadly reactive nAbs that might confer protection form HIV-1 infection.
N2  - Trotz enormer Forschungsleistungen liegt ein sicherer und effektiver Impfstoff gegen HIV-1/AIDS immer noch in weiter Ferne. HIV-1 entkommt der humoralen Immunantwort aufgrund mehrerer Mechanismen und daher wurden bis zu diesem Zeitpunkt nur wenige neutralisierende Antikörper identifiziert. Eine vielversprechende Strategie zur Identifizierung neuer Epitope, die neutralisierende Antikörper induzieren könnten, ist die Analyse von Seren mit solchen Antikörper. Die dabei identifizierten Epitope könnten dann zur Herstellung eines Impfstoffes verwendet werden, der ähnliche neutralisierende Antikörper induziert und damit vor einer Infektion mit HIV-1 schützt. Mittels Phage-Display hat das Labor von Ruth Ruprecht mehrere solcher Epitope von polyklonalen Antikörpern aus Rhesus Affen mit hochtitrigen, breit-neutralisierenden Antikörpern identifiziert. Diese Antikörper wurden nach einer Infektion mit einem SHIV induziert, das das virale Hüllprotein eines kürzlich übertragenen HIV-1 clade C Virus enthielt. Die Phagenpeptide wurden auf konformelle und lineare Homologie mittels einer Computer Software untersucht. Mehrere dieser Peptide entsprachen Domänen des viralen Hüllproteins, wie z.B. konformelle V3 loop Epitope and Epitope des linearen C-Terminus von gp120. Im Rahmen dieser Arbeit wurden diese Mimotope auf Kreuzreaktivität mit anderen Seren von Rhesus Affen mit neutralisierenden Antikörpern untersucht. Dabei wurden insbesondere die Mimotope des V3 loops von anderen Seren erkannt. Des Weiteren wurden diese Phagen-Mimotope im Rahmen einer neuen DNA prime/phage boost Strategie zur Immunisierung verwendet. Mäuse wurden einmalig mit HIV-1 clade C gp160 DNA immunisiert und anschließend mehrfach mit rekombinanten Phagen geboostet. Mittels dieser Strategie sollte das Immunsystem auf einige, spezielle Epitope des viralen Hüllproteins fokusiert werden (Immunofocusing). Hierbei wurden HIV-1 clade gp160-bindende Antikörper und breit-neutralisierende Antikörper induziert. Des Weiteren konnten zum ersten Mal neutralisierende Antikörper gegen den C-terminus von gp120, einer konservierten Region des viralen Hüllproteins, induziert werden. Die Identifikation solcher konservierter Mimotope kann zur Entwicklung von einem HIV-1 Impfstoff beitragen, der breit neutralisierende Antikörper induziert, die vor einer Infektion schützen können.
KW  - Antikörper
KW  - HIV
KW  - Phage Display
KW  - Impfstoff
KW  - Antibody
KW  - HIV
KW  - Phage Display
KW  - Vaccine
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-75494
ER  - 
TY  - THES
A1  - Trujillo Vargas, Claudia Milena
T1  - Development of vaccines against allergic asthma using products derived from intracellular bacteria or helminths
T1  - Entwicklung von Impstoffen gegen allergisches Asthma mit Hilfe von Komponenten aus intrazellulären Mikroorganismen und Helminthen
N2  - Die „Hygiene Hypothese“ postuliert, dass der Kontakt mit Infektionserregern in der frühen Kindheit die Entwicklung von Th2-abhängigen allergischen Immunreaktionen verhindern kann, indem dadurch entweder eine vorrangig Th1-gerichtete Immunität etabliert wird oder alternativ die Bildung von regulatorischen T Zellen induziert wird. Basierend auf dieser Theorie zielte die vorliegende Arbeit darauf ab, Produkte von Mikroorganismen oder Würmern als mögliche Komponenten von Impfstoffen gegen Allergien zu testen. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden lebende BCG, Hitze abgetötete BCG (hk-BCG), CpG und PPD, die alle als Th1 Adjuvantien bekannt sind, auf ihre Effektivität getestet, allergisches Asthma in der Maus zu unterdrücken. Alle Adjuvantien konnten die durch Allergie induzierte Lungeneosinophilie, die Schleimproduktion in der Lunge und mit Ausnahme von PPD, die Lungenüberempfindlichkeit (AHR) unterdrücken, wenn sie zusammen mit OVA/alum verabreicht wurden. Die Lungeneosinophilie konnte jedoch nicht in IL-12 oder IFN-gamma defizienten Mäusen durch die Applikation von hk-BCG, CpG oder PPD verhindert werden. Interessanterweise waren jedoch lebende BCG in der Lage, die allergische Th2 Immunreaktion zu unterdrücken. Ebenso war die Wirkung von lebendem BCG unabhängig vom IL-10, TLR-2, TLR-4 oder MyD88 vermittelten Signalweg. Wurden Mäuse, die mit den verschiedenen Adjuvantien zusammen mit OVA/alum geimpft wurden, einer zweiten Runde OVA/alum Sensibilisierung unterzogen, so konnten nur lebende und hk-BCG die Entwicklung der Entzündung in der Lunge effektiv unterdrücken. Diese Wirkung konnte durch den adoptiven Transfer von CD4+ T Zellen auf naive Mäuse übertragen werden. Zusammenfassend zeigen diese Daten, daß lebende BCG am effektivsten, gefolgt von hk-BCG, CpG und schließlich PPD allergische Th2 Immunreaktionen unterdrücken konnten. Als nächstes wurde untersucht, ob eine Impfung mit dendritischen Zellen (DC) die Entwicklung von Th2 Zellen durch die Induktion von allergenspezifischen Th1 Zellen verhindern kann. Die Applikation von OVA-gepulsten aus dem Knochenmark stammenden-dendritischen Zellen (BM-DC), die mit CpG in vitro stimuliert wurden, konnten die Lungeneosinophilie und Entzündung in den Atemwegen in OVA-immunisierten Mäusen nicht reduzieren. OVA-spezifische IgG1 und IgE Antikörpermengen im Serum waren ebenfalls nicht vermindert. Versuche mit OVA-gepulsten Langerhans-zellen (LC) führten zu ähnlichen Ergebnissen wie mit BM-DC. Jedoch waren in Mäusen, die mit CpG/OVA gepulsten BM-DC behandelt wurden, deutlich erhöhte Werte an OVA-spezifischen IgG2a Antikörper im Serum nachzuweisen, was auf die Induktion einer allergenspezifischen Th1 Immunreaktion in vivo schließen läßt. Insgesamt zeigen die Ergebnisse aber, dass weder die Impfung mit OVA-gepulsten und CpG-stimulierten BM-DC noch mit OVA-gepulsten LC eine Verringerung der allergischen Th2 Immunreaktion in einem Mausmodell mit schwerem atopischem Asthma bewirkt. Im dritten Teil der Arbeit wurde NES, ein exkretorisches/sekretorisches Produkt des Helminthen Nippostrongylus brasiliensis, als ein neues mögliches Adjuvant zur Unterdrückung allergischer Reaktionen untersucht. Die Applikation von NES zusammen mit OVA/alum inhibierte deutlich die Entwicklung der Lungeneosinophilie, Becherzellmetaplasie und Schleimproduktion in der Lunge sowie die Entwicklung der AHR. Das verwendete NES enthielt geringe Mengen an LPS, die diese Wirkung erklären könnte. Allerdings war die Unterdrückung der Th2 Immunreaktion durch NES unabhängig von TLR-4 und konnte immer noch nachgewiesen werden, wenn LPS-depletiertes NES verwendet wurde. Schließlich konnte NES die OVA-induzierte Th2 Immunreaktion unabhängig von IL-10 und IFN-gamma reduzieren. Außerdem konnte der Verdau von NES mit Proteinase K oder eine Hitzebehandlung (kochen) den Th2-unterdrückenden Effekt nicht aufheben. Interessanterweise inhibierte NES in vivo eine OVA-spezifische Th2 Immunreaktion in Anwesenheit einer starken NES-spezifischen Th2 Reaktion. Zusammenfassend führen diese Ergebnisse zu dem Schluß, daß der Helminth N. brasiliensis Substanzen produziert, die die Entwicklung von allergischen Th2 Immunreaktionen beeinflussen. Diese Produkte und ihre Wirkmechanismen genauer zu charakterisieren, könnte zu sehr effektiven Adjuvantien führen, welche allergische Reaktionen unterdrücken könnten. Die Ergebnisse dieser Arbeit könnten zukünftig dazu beitragen, effiziente Impfungen zu entwickeln, die Menschen vor der Entwicklung von allergischen Immunreaktionen schützen.
N2  - According to the hygiene hypothesis, the exposure to infectious agents in early childhood prevents the development of allergen-specific Th2 immune responses because it establishes Th1-based immunity or alternatively, induces the generation of T regulatory cells. Based on this theory, the present study pretended to identify promising microorganism-derived vaccine candidates against allergic asthma in the murine model. In the first part of this work, the efficacy of four different known Th1-inducing adjuvants, i.e. live BCG, heat-killed BCG, CpG and PPD, as components of vaccines aimed at inhibiting allergic asthma was compared. All the adjuvants were effective in inhibiting the development of allergen-induced airway eosinophilia, mucus production, and with the exception of PPD also airway hyperreactivity (AHR), when they were applied together with OVA/alum. Suppression of airway eosinophilia was not observed in IFN-gamma- or IL-12-deficient mice (hk-BCG, CpG-ODN and PPD). Interestingly, live BCG was still able to suppress allergen-induced Th2 responses in the absence of either IFN-gamma or IL-12. The effect of live BCG was also independent on IL-10-, TLR-2-, TLR-4- or MyD88-mediated signaling. When mice vaccinated with the different adjuvants together with OVA/alum were subjected to a second period of OVA/alum immunization, only live and hk-BCG were able to efficiently suppress the development of airway inflammation. This effect could be adoptively transferred by CD4+ T cells. Taken together our data suggest that live BCG>>hk-BCG>CpG>PPD are effective in suppressing allergen-induced Th2 responses. Secondly, the evaluation of a dendritic cell-based vaccination strategy leading to the induction of allergen-specific Th1 cells to protect against the development of allergen-specific Th2 responses was performed. The application of OVA-pulsed BM-DC maturated with CpG was unable to reduce airway eosinophilia and inflammation in OVA-immunized mice. OVA-specific IgG1 or IgE serum levels were also not reduced. The experiments using LC pulsed with OVA yielded similar results. However, the mice vaccinated with CpG/OVA pulsed BM-DC had greatly enhanced levels of OVA-specific IgG2a in the serum, suggesting the induction of allergen-specific Th1 responses in vivo. Thus, these data suggest that the vaccination of mice with OVA-pulsed BM-DC matured with CpG or OVA-pulsed LC did not result in a reduction of allergen-specific Th2 responses in a murine model of severe atopic asthma. Lastly, NES, an excretory/secretory product derived from the helminth Nippostrongylus brasiliensis was evaluated as a new potential adjuvant to prevent the development of allergic responses. The application of NES together with OVA/alum greatly inhibited the development of airway eosinophilia, airway goblet cell metaplasia and mucus production and the development of airway hyperreactivity after metacholine challenge. Furthermore, OVA-specific IgG1 and IgE levels in the serum were also strongly reduced. NES preparations contained small amounts of endotoxin, which may explain these results. However, the suppressive effects of NES on the development of allergen-specific Th2 responses was independent upon IFN-gamma or TLR-4 and still observed in mice treated with LPS-depleted NES. NES reduced OVA-induced Th2 responses also in a IL-10-independent manner. In addition, the digestion with proteinase K or the heat-treatment of NES did not abolish its ability to inhibit allergen-induced Th2 responses. Interestingly, NES suppress OVA-specific Th2 responses in vivo in the presence of a strong NES-specific Th2 environment. Taken together our results suggest that the helminth N. brasiliensis secretes substances which interfere with the development of allergic Th2 responses. In summary, distinct substances derived from microorganisms or helminths which may be used as potential adjuvants to prevent the development of allergic Th2 responses were identified. These findings contribute to the design of efficient vaccines protecting humans from developing allergic asthma.
KW  - Bronchialasthma
KW  - Impfstoff
KW  - BCG
KW  - Eingeweidewürmer
KW  - Asthma
KW  - Impfungen
KW  - BCG
KW  - Helminthen
KW  - Mäuse
KW  - Asthma
KW  - Vaccines
KW  - BCG
KW  - Helminths
KW  - mice
Y1  - 2005
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-12992
ER  - 
TY  - THES
A1  - Hotz, Christian
T1  - Improvement of Salmonella vaccine strains for cancer immune therapy based on secretion or surface display of antigens
T1  - Verbesserung von Salmonella Vakzinstämmen zur Krebsimmuntherapiebasierend auf Sekretion oder oberflächenassoziierter Expression von Antigenen
N2  - Cancer immune therapy represents a promising alternative to conventional anti tumour therapy like radiation, surgical excision of the tumour or classical chemotherapy. The biggest advantage of cancer immune therapy is specificity, achieved by targeting tumour-associated antigens with the effector arms of the host immune system. This is believed to result in less adverse effects than standard therapy and reaches presumably also metastatic lesions at distant sites from the primary tumour. However, cancer immune therapy by vaccination against tumour antigens failed to translate into clinical success, yet. Furthermore, despite tremendous clinical efforts malignant disease still results in high mortalities giving rise to the need for novel vaccination-based therapies against cancer. An interesting approach in this respect is the use of bacteria like attenuated salmonellae as carriers for heterologous cancer antigens. In numerous preclinical studies Salmonella-based vaccines could elicit cell mediated immune responses of the CD4+ and CD8+ type against own and heterologous antigens which make them ideally suited for anti tumour therapy. Special delivery systems in Salmonella carriers like surface display or secretion of antigens were shown to be advantageous for the immunological outcome. This work focussed on developing novel Salmonella carriers for immune therapy against cancer. In a first project, TolC, a multifunctional outer membrane protein of E. coli was utilized as membrane anchor for 3 heterologous antigens. Respective TolC fusion proteins encoded on plasmids were analysed for expression, functionality and plasmid stability in different engineered Salmonella strains. The amount of membrane localized recombinant TolC was enhanced in tolC-deficient strains. Furthermore, fusion proteins were functional and plasmid stability was very high in vitro and in vivo. Disappointingly, neither specific CD4+/CD8+ T-cell responses against the model antigen ovalbumin nor CD8+ responses against the cancer antigen BRAFV600E were detectable in murine model systems. However, mice immunized with Salmonella strains displaying an immunodominant epitope of the cancer related prostate specific antigen (PSA) were partially protected from subsequent tumour challenge with a PSA expressing melanoma cell line. Tumour growth in mice immunized with the respective strain was significantly decelerated compared to controls, thus indicating that this surface display system confers protective immunity against tumours. In a second study, the approved typhoid vaccine strain Salmonella enterica serovar Typhi Ty21a (Ty21a) was improved for the hemolysin type I secretion system of E. coli. This secretion system is widely used for heterologous antigen delivery in live bacterial vaccines. It was demonstrated throughout this work that a mutation of rpoS in Ty21a correlated with decreased ability for hemolysin secretion compared to other Salmonella strains. Complementation with rpoS or the presumed downstream target of rpoS, rfaH resulted in enhanced expression and secretion of heterologous hemolysin in Ty21a. Presumably by raising the amount of free antigen, rfaHcomplemented Ty21a elicited higher antibody titres against heterologous hemolysin in immunized mice than controls and even rpoS-positive Ty21a. Therefore, rfaHcomplemented Ty21a could form the basis of a novel generation of vaccines for human use based on (cancer) antigen secretion.
N2  - Krebsimmuntherapie ist eine viel versprechende Alternative zu den konventionellen Therapien, wie Bestrahlung, chirurgische Entfernung des Tumors oder klassische Chemotherapie. Der größte Vorteil der Krebsimmuntherapie ist Spezifität, welche durch das Zielen des Immunsystems auf so genannte Tumor-Assoziierte Antigene erreicht wird. Diese Form der Therapie sollte weniger Nebenwirkungen als Standardbehandlungen beinhalten, weiterhin könnte diese Metastasen an Orten fern des eigentlichen Tumors bekämpfen. Krebsimmuntherapie zeigte sich jedoch wenig erfolgreich in späten klinischen Studien. Zusätzlich ist die Mortalitätsrate bei Krebsleiden, trotz allen Fortschritts, immer noch sehr hoch, weshalb die Notwendigkeit der Entwicklung alternativer Immuntherapien besteht. Ein interessanter Ansatz hierzu ist die Verwendung von Bakterien wie attenuierten Salmonellen als Träger heterologer Krebsantigene. Eine Vielzahl präklinischer Studien zeigte, dass Vakzine auf der Basis von Salmonellen CD4 und CD8 positive zelluläre Immunantworten auslösen können, welche für eine Krebsimmuntherapie entscheidend sind. Spezielle Antigenliefersysteme in Salmonellen, wie die oberflächengebundene Expression oder die Sekretion von Antigenen sind von Vorteil für die Immunogenität der Antigene. Diese Arbeit zielte auf die Entwicklung von neuen Salmonella Trägerstämmen für die Immuntherapie gegen Krebs. Im ersten Projekt wurde TolC, ein multifunktionelles Protein der E. coli Außenmembran, als Membrananker für drei heterologe Antigene benutzt um eine oberflächenassoziierte Expression dieser Antigene zu erreichen. Die entsprechenden plasmidkodierten TolC Fusionsproteine wurden hinsichtlich ihrer Expression, Funktionalität und Plasmidstabilität in verschiedenen, rekombinanten Salmonella Stämmen in vivo und in vitro untersucht. Die Menge an membranständigem rekombinanten TolC war stark erhöht in tolC-deletierten Stämmen. Zusätzlich waren die Fusionsproteine funktionsfähig und die Plasmide wurden in vitro und in vivo äußerst stabil vererbt. Leider konnten weder spezifische CD4+/CD8+ T-Zellantworten gegen das Modelantigen Ovalbumin noch CD8+ Antworten gegen das Krebsantigen BRAFV600E in immunisierten Mäusen detektiert werden. Mäuse, die mit einem Salmonella Stamm immunisiert wurden, der ein immundominantes Epitop des krebsassoziierten Prostata spezifischen Antigens (PSA) in oberflächengebundener Form produziert, waren jedoch partiell vor PSA exprimierenden Melanomzellen geschützt. Das Tumorwachstum in diesen Mäusen verlief signifikant langsamer als in Kontrollgruppen, was indiziert, dass dieses System schützende Immunantworten gegen Krebs auslösen kann. In einem zweiten Projekt wurde der zur Typhusimpfung zugelassene Stamm Salmonella enterica serovar Typhi Ty21a (Ty21a) für die Hämolysin Sekretion verbessert. Dieses aus E. coli stammende Typ I Sekretionssystem wurde oftmals für die Sekretion von heterologen Antigenen in lebenden bakteriellen Impfstoffträgern verwendet. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass eine Mutation von rpoS in Ty21a mit, im Vergleich zu anderen Salmonellen, verminderter Sekretionsfähigkeit von Hämolysin korreliert. Komplementation von rpoS oder rfaH, einem vermuteten Zielprotein von rpoS in Ty21a, verbesserte die Expression und Sekretion von heterologem Hämolysin. RfaH-rekombinante Salmonellen stimulierten höhere Serumantikörpertiter gegen Hämolysin in immunisierten Mäusen als vergleichbare Kontrollen und sogar rpoS komplementierte Salmonellen, vermutlich durch eine Erhöhung der Menge an freiem Hämolysin. Daher könnte dieser Stamm die Basis einer neuen Generation von Impfstämmen gegen heterologe (Krebs-) Antigene für den humanen Gebrauch bilden.
KW  - Impfstoff
KW  - Immuntherapie
KW  - Krebs <Medizin>
KW  - Salmonella enterica
KW  - Krebsimmuntherapie
KW  - Vaccine
KW  - Cancer Immune Therapy
KW  - Salmonella enterica
Y1  - 2008
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-29548
ER  -