TY - THES A1 - Meinhardt, Julia T1 - Asthmatherapie im Mausmodell : Allergen spezifische Immuntherapie in Kombination mit einer Immunmodulation durch einen IL-4/IL-13 Antagonisten T1 - Inhibition of IL-4/IL-13 does not enhance efficacy of allergen immunotherapy in murine allergic airway inflammation N2 - Die allergenspezifische Immuntherapie ist derzeit die einzige kausale Behandlungsmöglichkeit von Soforttypallergien. Trotzdem ist weiterhin unklar, welcher Parameter für den Behandlungserfolg einer spezifischen Immuntherapie (SIT) pathogenetisch bedeutsam ist. Zusammenfassend zeigte sich, dass für eine pulmonale Soforttypallergie in einem Asthmamodell in der Maus erfolgreich eine SIT etabliert werden konnte, die in einer Reihe von Parametern mit einer SIT im Menschen vergleichbar ist. Dies ist das erste Modell einer pulmonalen Soforttypallergie in der Maus, an dem neben den Wirkprinzipien der SIT auch neue Therapiestrategien untersucht werden können. Eine Behandlung mit SIT in Kombination mit einem immunmodulatorisch wirksamen IL-4/IL-13 Antagonisten zeigte jedoch keinen zusätzlichen therapeutischen Nutzen, welches die scheinbar untergeordnete Rolle der Zytokine IL-4 und IL-13 bei etablierten Allergien untermauert. N2 - Successful allergen specific immunotherapy (SIT) is associated with a reduced Th2 cytokine produktion and the induction of IL-10 producing regulatory T-cells. In order to improve treatment efficacy we investigateed the impact of an IL-4/IL-13 inhibitor during SIT.. BALB/c mice were sensitized intranasally with Ovalbumin for 4 weeks. Subsequently, they were subjected to intranasal SIT, where Ovalbumin was supplied with increasing doses from 1µg - 1mg over 3 weeks together or without an IL-4/IL-13 inhibitor. Bronchoalveolar lavages (BAL) were performed and checked for airway eosinophilia. Cytokines were detected in BAL luids and in mediastinal lymphnodes suspensions. Furthermore OVA specific antibodies were measured. Intranasal OVA sensitization resulted in persisting IgE synthesis and an eosinophil rich airway inflammation. This was combined with increased IL-4 and IL-5 levels. Intranasal SIT could efficiently reverse the allergic phenotype by reducing OVA specific IgE synthesis and airway eosinophilia singnificantly in comparison to untreated OVA sensitized animals. This was associated with decreased IL-4 and IL-5 levels and an increased IFN-y and IL-10 production. Mice treated with the IL-4/IL-13 inhibitor during SIT, however, did not show any significant differences in all measured parameters, when compared to mice treated with SIT alone. The use of an IL-4/IL-13 inhibitor as adjuvant for SIT did not enhance anti allergic effects. Thus, the observed shift from Th2 to Th1 cytokines by allergen specific immunotherapy may not be the key event in successful SIT rather than other factors such as IL-10 producing regulatory T-cells. KW - Asthma KW - Allergie KW - Mausmodell KW - Immunmodulation KW - SIT KW - allergy KW - asthma KW - mouse model KW - cytokine inhibitor KW - SIT Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-20789 ER - TY - THES A1 - Büchner, Lotte T1 - Charakterisierung der CD4+- und CD8+-T-Zell-Immunantwort nach Myokardinfarkt im Mausmodell T1 - Characterisation of the CD4+ and CD8+ T-cell immune response after myocardial infarction in the mouse model N2 - Die Rolle des Immunsystems nach MI hat innerhalb der letzten Jahrzehnte immer mehr Aufmerksamkeit erfahren, trotzdem herrschen weiterhin einige Unklarheiten. Daher war es Ziel dieser Arbeit, das Verhalten der T-Zellen nach MI im Mausmodell näher zu betrachten und zu analysieren. Dafür wurde einerseits mittels Durchflusszytometrie die T-Zell-Immunantwort im Herzen und in verschiedenen lymphatischen Organen mit Fokus auf pro- und antiinflammatorische Zytokine und deren Transkriptionsfaktoren genauer analysiert und andererseits ein Protokoll etabliert, um die T-Zellen im Herzen und in den Lymphknoten mittels Lichtblattmikroskopie sichtbar zu machen. Dabei konnte festgestellt werden, dass die Expression von LAP, welches nicht-kovalent an das antiinflammatorische Zytokin TGF-ß1 gebunden ist und das wichtig für eine ausgeglichene Immunantwort ist, indem es überschießende Entzündungsreaktionen verhindert, in T-Zellen im Herzen nach MI im Vergleich zu naiven und scheinoperierten Mäusen signifikant hochreguliert war. Dieses Ergebnis konnte nur im Herzen und in keinem anderen der untersuchten Organe erzielt werden, weshalb es sich somit um eine lokale Immunreaktion handeln muss, die nur im Herzen nach MI stattfindet. Eine weitere Besonderheit war, dass die Häufigkeit des Vorkommens an Foxp3+ Treg im Herzen im Vergleich zu den anderen untersuchten Organen durchgehend am höchsten war, sowohl bei den Mäusen nach MI als auch bei naiven und scheinoperierten Mäusen. Dies unterstreicht, dass Foxp3+ Treg im Herzen eine wichtige Rolle spielen. Dank der Verbesserung des Protokolls zur bildlichen Darstellung von T-Zellen im Herzen konnte gezeigt werden, dass sich diese nach MI insbesondere im Infarktgewebe befinden und dort relativ gleichmäßig verteilt sind. Außerdem konnten die mediastinalen Lymphknoten im Ganzen dargestellt und die einzelnen T-Zellen sichtbar gemacht werden. Insgesamt lässt sich sagen, dass durch die vorliegende Arbeit neue Erkenntnisse zur Charakterisierung der T-Zell-Immunantwort nach MI im Mausmodell hinzugewonnen werden konnten. Die LAP+ T-Zellen scheinen nach MI im Herzen eine wichtige Rolle zu spielen, weshalb die Funktion dieser Zellen im Reparaturprozess nach MI in zukünftigen Versuchen genauer betrachtet werden sollte. Außerdem wurde der Grundstein zur Anfärbung und Darstellung von T-Zellen in Herzen und in Lymphknoten mittels Lichtblattmikroskopie gelegt, weshalb daran weitergearbeitet werden sollte, um auch andere Immunzellen neben den T-Zellen zeigen zu können. Dadurch können weitere Hinweise auf das Zusammenspiel der Immunzellen nach MI erhalten werden, um die immunologischen Vorgänge immer besser verstehen zu können. N2 - The role of the immune system after MI has received more and more attention within the last decades, yet there are still some uncertainties. Therefore, the aim of this work was to take a closer look at and analyse the behaviour of T cells after MI in a mouse model. For this purpose, on the one hand, the T cell immune response in the heart and in various lymphatic organs was analysed in more detail by means of flow cytometry with a focus on pro- and anti-inflammatory cytokines and their transcription factors and, on the other hand, a protocol was established to visualise the T cells in the heart and in the lymph nodes by means of light sheet microscopy. It was found that the expression of LAP, which is non-covalently bound to the anti-inflammatory cytokine TGF-ß1 and which is important for a balanced immune response by preventing excessive inflammatory reactions, was significantly upregulated in T cells in the heart after MI compared to naïve and sham-operated mice. This result could only be obtained in the heart and in none of the other organs studied, so it must therefore be a local immune response that only occurs in the heart after MI. Another peculiarity was that the frequency of occurrence of Foxp3+ Treg was consistently highest in the heart compared to the other organs studied, both in the mice after MI and in naïve and sham-operated mice. This underlines that Foxp3+ Treg play an important role in the heart. Thanks to the improvement of the protocol for imaging T cells in the heart, it was possible to show that after MI they are located in particular in the infarct tissue and are relatively evenly distributed there. In addition, the mediastinal lymph nodes could be depicted as a whole and the individual T cells made visible. Overall, it can be said that the present work has added new insights into the characterisation of the T-cell immune response after MI in the mouse model. The LAP+ T cells seem to play an important role after MI in the heart, which is why the function of these cells in the repair process after MI should be examined more closely in future experiments. In addition, the foundation was laid for staining and visualising T cells in hearts and in lymph nodes using light sheet microscopy, which is why further work should be done on this in order to be able to show other immune cells besides T cells. This can provide further clues to the interplay of immune cells after MI in order to understand the immunological processes better and better. KW - Herzinfarkt KW - Immunreaktion KW - Myokardinfarkt KW - Immunantwort KW - Mausmodell KW - myocardial infarction KW - immune response Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-320530 ER - TY - THES A1 - Behnke, Jennifer Kim T1 - Charakterisierung der Krankheitsprogression im genetischen hm\(^2\)α-SYN-39 Mausmodell des Morbus Parkinson T1 - Characterization of disease progression in the genetic hm\(^2\)α-SYN-39 mouse model of Parkinson´s disease N2 - In dieser Arbeit wurde die Krankheitsprogression im Parkinson-Mausmodell hm2α-SYN-39 mit zunehmendem Alter charakterisiert. Die Mäuse wurden in 4 Altersgruppen (2-3, 7-8, 11-12, 16-17 Monate) mit motorischen Verhaltenstests auf einen Parkinson-Phänotyp untersucht. Zudem erfolgten Untersuchungen des dopaminergen Systems zur Detektion von neurochemischen Veränderungen und einer Neurodegeneration im nigrostriatalen Trakt. Weiterhin wurden neuroinflammatorische Prozesse des adaptiven und angeborenen IS in der SN und im Striatum mittels immunhistochemischer Färbungen beurteilt. Ein Parkinson-Phänotyp in diesem Mausmodell zeigte sich nur leicht ausgeprägt, sodass der Rotarod- und Zylinder-Test lediglich den Hinweis auf eine nicht-signifikante Einschränkung der Motorik erbrachte. Dennoch ergab die stereologische Quantifizierung TH- und Nissl-positiver Zellen in der SNpc der hm2α-SYN-39 Mäuse eine altersabhängige, signifikant-progrediente Reduktion der dopaminergen Neurone mit zunehmendem Alter. Eine signifikant niedrigere TH-positive Zellzahl dieser tg Mäuse zeigte sich ab einem Alter von 16-17 Monaten verglichen zu gleichaltrigen wt Tieren. Dagegen war die Neurodegeneration im Striatum etwas weniger ausgeprägt. Die tg Mäuse präsentierten im Alter von 16-17 Monaten eine nicht-signifikante Erniedrigung der dopaminergen Terminalen verglichen zu gleichaltrigen wt Tieren. Ein DA-Mangel im Striatum der tg Mäuse konnte mittels HPLC bestätigt werden. Bis zum Alter von 16-17 Monaten wurde eine signifikante Reduktion der DA-Level von 23,2 % verglichen zu gleichaltrigen wt Mäusen gezeigt. Außerdem erniedrigt waren die striatalen Level von NA und 5-HAT bei tg Mäusen, passend zu den bisherigen Ergebnissen bei Parkinson-Patienten. Immunhistochemische Untersuchungen einer Neuroinflammation im nigrostriatalen Trakt ergaben eine tendenziell erhöhte Infiltration von CD4- und CD8-positiven T-Zellen bei hm2α-SYN-39 Mäusen mit zunehmendem Alter, wobei die Infiltration CD8-positiver Zellen ausgeprägter war als bei CD4-positiven Zellen. Eine noch deutlichere neuroinflammatorische Reaktion zeigte das angeborene IS. Hierbei ergab die immunhistologische Quantifizierung CD11b-positiver mikroglialer Zellen einen hochsignifikanten Anstieg im nigrostriatalen Trakt bei hm2α-SYN-39 Mäusen schon im jungen Alter. Zusammenfassend präsentierte dieses Parkinson-Mausmodell eine langsam-progrediente Parkinson-Pathologie mit begleitender Neuroinflammation im nigrostriatalen Trakt während des Alterns, wobei die Immunantwort der mikroglialen Zellen zu einem früheren Zeitpunkt einsetzte als die T-Zellinfiltration und Neurodegeneration. Dieses Mausmodell bietet zahlreiche Möglichkeiten zur zukünftigen Erforschung der Pathophysiologie beim MP. Generell weist diese Arbeit auf eine bedeutende Rolle neuroinflammatorischer Prozesse in der Krankheitsprogression der Parkinsonerkrankung hin und soll dazu ermutigen Neuroinflammation durchaus intensiver in tg Tiermodellen zu untersuchen. N2 - In this doctoral thesis the progression of disease during ageing has been characterized in the mouse model of Parkinson´s disease hm2α-SYN-39. Mice in 4 age groups (2-3, 7-8, 11-12, 16-17 months of age) were tested for a Parkinson´s phenotype through motor performance analysis. Additionally, investigations of the dopaminergic system were performed to detect neurochemical changes and neurodegeneration in the nigrostriatal tract. Furthermore, neuroinflammatory processes of the adaptive and innate immune system in the SN and striatum were evaluated via immunohistochemical staining. A Parkinson´s phenotype in this mouse model appeared only mildly, revealing a hint of non-significant motor impairment in the Rotarod and Cylinder test. However, stereological quantification of TH- and Nissl-positive cells in the SNpc of hm2α-SYN-39 mice resulted in an age-dependent, significant-progressive reduction of dopaminergic neurons with increased age. A significant lower TH-positive cell count of these tg mice was shown at an age of 16-17 months compared to wt mice of the same age. In contrast, the neurodegeneration in the striatum was less pronounced. At an age of 16-17 months tg mice presented with a non-significant reduction of dopaminergic terminals compared to wt mice of the same age. Loss of DA in the striatum of tg mice has been confirmed via HPLC. A significant reduction of DA-levels of 23,2 % was shown at the age of 16-17 months in comparison to same-aged wt mice. Striatal levels of NA and 5-HT of tg mice were reduced as well, matching previous results of Parkinson´s patients. Immunohistochemical investigations of neuroinflammation in the nigrostriatal tract revealed a tendency of increased infiltration of CD4- and CD8-positive T cells in hm2α-SYN-39 mice with increased age, an infiltration of CD8-positive cells being more distinct though than of CD4-positive cells. The innate IS exposed an even stronger neuroinflammatory response. Immunohistochemical quantification of CD11b-positive microglial cells resulted in a highly significant surge in the nigrostriatal tract of hm2α-SYN-39 mice starting at a young age already. In summary, this mouse model of Parkinson´s disease presented with a slowly progressive Parkinson´s pathology accompanied by neuroinflammation in the nigrostriatal tract during the process of ageing, taking in account that an immune response of microglial cells was setting in earlier than T cell infiltration and neurodegeneration. This mouse model offers various opportunities for exploring Parkinson´s pathophysiology in the future. Generally, this work points to a substantial role of neuroinflammatory responses in the progression of Parkinson´s disease and should encourage to further investigate neuroinflammation in tg animal models. KW - Parkinson-Krankheit KW - Altern KW - Tiermodell KW - Neurodegeneration KW - Neuroinflammation KW - Mausmodell Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-302040 ER - TY - THES A1 - Schmid, Eric T1 - Charakterisierung des kardialen Phänotyps bei transgenen Mausmodellen mit Mutationen in kardialen kontraktilen Proteinen und dessen Veränderung durch arterielle Hypertonie T1 - Characterization of the cardiac phenotype in transgenic mouse models with mutations in cardiac contractile proteins and its modification by arterial hypertension N2 - Die Myokardhypertrophie ist in hohem Maß mit einer vorbestehenden bereits niedrig gradigen arteriellen Hypertonie verbunden und gilt als ein unabhängiger Risikofaktor für kardiovaskuläre Ereignisse. Für die familiäre hypertrophische Kardiomyopathie sind aktuell mehr als 450 Mutationen in über 13 Genen, welche für Sarkomerproteine codieren, insbesondere im kardialen Troponin T und im α-Myosin-Schwerkette Gen bekannt. Die hypertrophe Kardiomyopathie ist mit einer Prävalenz von 0,2% die häufigste monogenetisch autosomal-dominant vererbte kardiovaskuläre Erkrankung und eine der häufigsten Ursachen des plötzlichen Herztodes. Unter Berücksichtigung der dargelegten wissenschaftlichen Erkenntnisse resultierte die Aufgabenstellung dieser Arbeit in der Charakterisierung des kardialen Phänotyps bei transgenen Mausmodellen mit Mutationen in kardialen kontraktilen Proteinen (Troponin T und α-Myosin-Schwerkette) und dessen Veränderung durch arterielle Hypertonie (ausgelöst nach dem Goldblattmodell). In der Zusammenschau zeigten operierte Tiere bedeutend signifikant höhere systolische Blutdruckwerte als die „sham“ Gruppe (Messreihe 2007). Die MyHC-R403Q Gruppe zeigte im EKG präoperativ hoch signifikant verlängerte QT-Zeiten zur Kontrollgruppe auf. Dieses Ergebnis bestätigt, dass hypertrophe Kardiomyopathien mit einer QT-Zeit-Verlängerung assoziiert sind. Die MyHC-R403Q Tiere zeigten vier Wochen postoperativ im EKG ebenfalls eine signifikant verlängerte QT-Zeit, jedoch geringeren Ausmaßes, was vermutlich an einer zu starken Stenosierung des Gefäßlumens der Niere mit konsekutiven Niereninfarkt lag. Weiterhin wies diese Mauslinie präoperativ in der Echokardiographie signifikant größere linke Ventrikel ohne Wandverdickung auf. Man kann dies als Hinweis auf eine exzentrische Hypertrophie betrachten, postoperativ konnte allerdings keine Veränderung nachgewiesen werden. Möglicherweise beruht die exzentrische Hypertrophie auf sich entwickelnde schwere Klappenfehler. Eine eingeschränkte systolische Funktion der MyHC-R403Q Tiere konnte durch eine geringere fraktionelle Faserverkürzung prä- und postoperativ zur Kontrollgruppe festgestellt werden sowie zusätzlich eine Tendenz zur postoperativen links-ventrikulären Hypertrophie. Die TnT-Trunk Gruppe zeigte präoperativ eine Tendenz zu geringeren links-ventrikulären Wanddicken im Vergleich zur Kontrollgruppe als Hinweis auf eine geringere Herzmasse sowie signifikant geringere absolute Herzgewichte. Im Trend wiesen postoperativ TnT-Trunk Tiere eine auffallend gut erhaltene systolische Funktion auf. Zusammenfassend scheint die MyHC-R403Q Mutation im Vergleich zur TnT-Trunk Mutation eine bedeutendere Rolle für die Ausprägung einer hypertrophen Kardio-myopathie einzunehmen, wobei die geringere Fallzahl berücksichtigt werden sollte. N2 - Hypertrophic cardiomyopathy frequently coincides with a previously existing arterial hypertension and is regarded to be an independent risk factor for cardiovascular events. For familial hypertrophic cardiomyopathy there are currently more than 450 mutations in more than 13 genes identified which encode sarcomeric proteins, especially in the cardiac troponin T as well as in the myosin heavy chain gene. With a prevalence of 0, 2 %, hypertrophic cardiomyopathy is the most frequent cardiovascular disease which is passed on monogetically and autosomal-dominantly and it is counted among the most frequent causes for sudden death. With regard to these scientific conclusions, the aim of this paper is the characterisation of the cardiac phenotype concerning transgenic mouse models with mutations in cardiac contractile proteins (troponin t and myosin heavy chain) and its alteration by arterial hypertension (caused by the Goldblatt-model). Generally, operated animals showed a significant rise in systolic blood pressure results in comparison to the sham group (test series 2007). Preoperatively, the MyHC-R403Q group displayed significantly prolonged QT-times in ECG in comparison to the control group. This result affirms that hypertrophic cardiomyopathies go together with a QT interval dispersion. Four weeks after the operation, the animals of the MyHC-R403Q group again showed a significantly prolonged QT-time in ECG. This time, however, less distinctive, which is probably due to a hyper-stenosis of the renale vessels with a consequent infarct of the kidney. Moreover, the mouse line preoperatively displayed a significantly grown left ventricle without ventricular hypertrophy. This could be regarded as an intimation of excentric hypertrophia though postoperatively, no evidence for any deterioration was found. Excentric hypertropia perhaps results from severe valve defects which develop over time. A limited systolic function of the MyHC-R403Q animals was proved by evidence of a less significant fractional shortening of the pre – and postoperatively in comparison to the control group. Additionally, a tendency towards postoperative left-ventricular hypertrophy was diagnosed. The TnT-Trunk group’s display of a preoperative tendency to slighter left-ventricular wall thickness in comparison to the control group might be a clue for a lower cardiac mass as well as for significantly lower absolute heart weight. In conclusion, the MyHC-R403Q-mutation seems to play a bigger role for the development of hypertrophic cardiomyopathy in comparison to the TnT-Trunk mutation. However, the smaller number of cases has to be considered. KW - Hypertrophische Herzmuskelkrankheit KW - Herzmuskelkrankheit KW - Hypertonie KW - Sarkomer KW - Troponin KW - Mausmodell KW - transgen KW - Myosin-Schwerkette KW - QT-Zeit Verlängerung KW - transgenic KW - myosin heavy chain KW - cardiac troponin T KW - QT intervall dispersion KW - Hypertonie Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-52690 ER - TY - THES A1 - Hose, Dorothea Anna Elisabeth T1 - Charakterisierung von Spinalganglienneuronen im alpha-Galaktosidase A-defizienten Maus-Modell des M. Fabry T1 - Characterization of dorsal root ganglia neurons in an alpha-galactosidase A deficient mouse model of Fabry disease N2 - M. Fabry ist eine X-chromosomale, lysosomale Speicherkrankheit, die aufgrund einer Mutation im für das Enzym αGalaktosidase A (αGalA)-kodierenden Gen GLA, zu einer vollständig fehlenden oder verminderten Expression von αGalA führt. Aufgrund ubiquitärer Ablagerungen von Globotriaosylceramid 3 (Gb3) kommt es zu einer progressiven Multiorganerkrankung sowie der Entwicklung einer small-fiber Neuropathie (SFN). Der Pathomechanismus des Fabry-assoziierten Schmerzes blieb trotz Entwicklung eines αGalA-defizienten Mausmodells (Fabry-ko-Maus) durch Ohshima et al. bisher weitgehend ungeklärt. Ziel der vorliegenden Arbeit war die systematische Charakterisierung des Fabry-ko-Mausmodells hinsichtlich Schmerz-assoziierten Verhaltens und Expression Schmerz-assoziierter Ionenkanäle in Spinalganglienneuronen. Hierzu wurden insgesamt 42 drei Monate und 41 12 Monate alte männliche und weibliche Fabry-ko-Mäuse und ihre gleichaltrigen Wurfgeschwister untersucht. Die Verhaltenstestungen beinhalteten einen von Frey-, einen Hargreaves- sowie einen „Cold“-Test zur Evaluation der mechanischen und thermischen Rückzugslatenz. Weiterhin erfolgten die Analyse der intraepidermalen Nervenfaserdichte (IENFD) in Fußsohlen der Mäuse sowie eine H.E.-Färbung von Spinalganglien zur Untersuchung morphologischer Veränderungen der Neurone. Zusätzlich folgten immunhistochemische und molekulargenetische Untersuchungen des Gb3-Rezeptors (CD77), des transient receptor potential vanilloid 1 (TRPV1)-Kanals, des spannungsgesteuerten Natrium-Kanals 1.8 (Nav1.8), des Calcitonin Gene related peptide (CGRP), des Neurofilaments 200 (NF200) sowie von Isolectin B4 (IB4) an kryokonservierten und kultivierten Spinalganglienneuronen. In Verhaltenstestungen konnten eine Überempfindlichkeit gegenüber mechanischen und Hitze-Stimuli sowie ein vermindertes Kälteempfinden festgestellt werden. Es zeigte sich eine reduzierte IENFD in Fußsohlen sowie eine Vergrößerung der neuronalen Fläche in Spinalganglien von Fabry-ko-Mäusen. Die immunhistochemischen Untersuchungen ergaben eine erhöhte CD77- und TRPV1-Immunreaktivität sowie eine erniedrigte NF200-Immunreaktivität in Fabry-ko-Mäusen; Untersuchungen hinsichtlich der Immunreaktivität von Nav1.8 ergaben keine Unterschiede. Molekulargenetisch konnte neben einer verminderten Nav1.8-Expression in jungen Fabry-ko-Mäusen keine Unterschiede festgestellt werden. Die Ergebnisse der Verhaltenstestungen sowie die verminderte IENFD bei Fabry-ko-Mäusen entsprechen klinischen Befunden bei Fabry-Patienten. Erstmals konnte in dieser Arbeit eine Vergrößerung der Neuronenfläche in Fabry-ko-Mäusen quantitativ nachgewiesen und eine vermehrte Immunreaktivität von TRPV1 und CD77 festgestellt werden. Bei fehlendem Nachweis eines geschlechtsspezifischen Unterschieds der Ergebnisse, konnte ein Einfluss des weiblichen Geschlechts auf den Phänotyp des M. Fabry ausgeschlossen werden.
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass die von Oshima et al. entwickelte Fabry-ko-Maus ein suffizientes Model zur Erforschung des M. Fabry darstellt. Weiterhin rücken sie TRPV1 und spannungsgesteuerte Natriumkanäle weiter in den Fokus der Untersuchung Fabry-assoziierten Schmerzes und können aufgrund der hohen Anzahl an Versuchstieren und dem Vergleich mit Wurfgeschwistern als Grundlage für weitere Studien dienen. N2 - Morbus Fabry (M. Fabry) is an X-linked lysosomal storage disorder. Due to a mutation in the GLA-gene, which encodes for the enzyme alpha-galactosidase A (αGalA), a multisystemic accumulation of globotriaosylceramid 3 (Gb3) occurs. This leads to organ failure, but also to a small fiber neuropathy (SFN). Despite the development of a mouse model of Fabry disease (Fabry-ko-mouse) by Oshima et al., the pathomechanism of the Fabry-associated pain remains unclear. Aim of this study was the characterization of the Fabry-ko-mouse regarding pain-associated behavior and expression of pain-associated ion channels in dorsal root ganglia (DRG) neurons. A total number of 42 three-month- and 41 12-month-old male and female Fabry-ko-mice and their littermates were examined. To investigate pain-associated behavior, we examined the mechanical and thermal withdrawal latency by using the von Frey-Filament-, the Hargreaves- and the cold plantartest. Furthermore, we analyzed the intraepidermal nerve fiber density (IENFD) in footpads and investigated morphological changes of DRG neurons. In addition, immunohistochemical and molecular genetic studies of the recptor of Gb3 (CD77), transient receptor potential for vanilloid 1 (TRPV1) chanel, sodium channel 1.8 (Nav1.8), calcitonin gene related peptide (CGRP), neurofilament 200 (NF200) and isolectin B4 (IB4) on cryopreserved and cultured dorsal root ganglion neurons were done. In behavioral tests Fabry-ko-mice showed a mechanical and heat hypersensitivity as well as a cold hyposensitivity. Further, a reduced level of IENFD in footpads and an increased level of enlarged DRG neurons in Fabry-ko-mice were found. Immunohistochemical studies revealed an increased CD77- and TRPV1- as well as a decreased NF200-immune reactivity in DRG neurons; studies on Nav1.8 revealed no differences. Despite a reduced Nav1.8-expression, no differences in mRNA levels of CD77 and CGRP were found. The results of the behavioral tests as well as the decreased IENFD in Fabry-ko-mice correlate with clinical findings in Fabry-patients. For the first time an enlargement of DRG neurons could be quantified and an increased immune reactivity of TRPV1 and CD77 in DRG neurons could be determined in Fabry-ko-mice. In the absence of evidence of a gender difference in the results, an influence of the female sex on the phenotype of M. Fabry could not be proved. The results of the present study reveal the Fabry-ko-mouse of Oshima et al. as a sufficient model for further investigations of M. Fabry. Furthermore, they indicate a potential role of TRPV1 and sodium channels in the pathomechanism of Fabry-associated pain, here further studies are still needed. Due to the high number of animals and the comparison with littermates, this study could also serve as a basis for further studies of Fabry-associated pain. KW - Fabry-Krankheit KW - Neuropathischer Schmerz KW - Morbus Fabry KW - Mausmodell KW - Schmerz Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-163233 ER - TY - THES A1 - Auth, Charlotte Sophie T1 - Die Auswirkungen von Tph2-Defizienz und negativen frühen Umwelterfahrungen auf Angstverhalten in weiblichen Mäusen T1 - Differential anxiety-related behaviour and brain activation in Tph2-deficient female mice exposed to adverse early environment N2 - Angsterkrankungen gehören zu den am weitesten verbreiteten psychischen Erkrankungen und stellen eine beträchtliche soziale und wirtschaftliche Herausforderung für unsere Gesellschaft dar. Aversive frühe Erfahrungen sind ein bekannter Risikofaktor für die Entwicklung verschiedener psychischer Erkrankungen, insbesondere Angststörungen. Während der frühen Entwicklung findet die Programmierung der Hypothalamus-Hypophysen-Nebennierenrinden- (HHN)-Achse, die die Ausschüttung des Stresshormons Cortisol in Menschen bzw. Corticosteron in Mäusen steuert, statt. Wenn Individuen in dieser kritischen Phase Stress ausgesetzt sind, wird die regelrechte Ausbildung der HHN-Achse gestört, was zu dysregulierten Verhaltensantworten auf Stressreize im späteren Leben führen kann. Das Serotonin (5-HT)-System als eines der ausgedehntesten Neurotransmittersysteme ist an der Vermittlung der Effekte von früher Stressexposition auf angstähnliche Verhaltensweisen beteiligt. Das Ziel dieser Studie ist es, die Interaktion zwischen genetischer Prädisposition und negativen Einflüssen in frühen Entwicklungsstadien auf die Ausbildung von Angstverhalten im Erwachsenenalter näher zu beleuchten. In dieser Studie wurden Tryptophanhydroxylase 2 (Tph2)-defiziente weibliche Mäuse als Modell für ein lebenslanges konstitutives 5-HT Synthesedefizit im zentralen Nervensystem verwendet. Nachkommen dieser Mauslinie wurden im frühen Lebensalter Maternaler Separation (MS), d.h. einem mütterlichen Trennungsparadigma, unterzogen und im Erwachsenenalter im „Open field“ (OF) oder in der „Dark-light box“ (DLB) getestet. Im Anschluss an die Verhaltensexperimente wurde die neuronale Aktivierung immunhistochemisch durch Darstellung des frühzeitig auftretenden Genprodukts c-Fos bestimmt. In der DLB zeigten homozygot Tph2-defiziente Mäuse eine verringerte motorische Aktivität im hellen Kompartiment, und dieser Effekt konnte durch MS normalisiert werden. Zusätzlich verstärkte MS bei diesem Genotyp das Auftreten von fluchtartigen Sprüngen. Im OF hat MS fluchtartige Verhaltensweisen in homo- und heterozygoten Tph2-defizienten Mäusen befördert. Beide Verhaltenstests führten zu spezifischen neuronalen Aktivierungsmustern, die mithilfe von c-Fos- Immunhistochemie ausgewertet wurden. Die Durchführung des DLB-Tests führte in Abhängigkeit vom Vorhandensein von Tph2 zur Aktivierung des paraventrikulären Kerns des Hypothalamus (PVN) und der basolateralen Amygdala (BL), wohingegen die Exposition gegenüber dem OF-Test zu einer Aktivierung der lateralen Amygdala (La) in Tieren, die einem mütterlichen Trennungsparadigma unterzogen wurden, sowie einer Aktivierung des ventrolateralen (VLPAG) und dorsolateralen (DLPAG) periaquäduktalen Höhlengraus in Abhängigkeit von Tph2 und MS führte. Zusammenfassend weisen die Ergebnisse dieser Studie darauf hin, dass MS aktive Verhaltensantworten auf aversive Reize in Abhängigkeit vom Vorhandensein von 5-HT im Gehirn fördert. Diese Effekte könnten durch die spezifische Aktivierung von mit Angstverhalten in Zusammenhang stehenden Gehirnregionen während der Verhaltensexperimente vermittelt werden. N2 - In a previous phase 1 study, it was observed that CBF can be increased by intermittent controlled hypercapnia in the days after aneurysm rupture in patients with poor to very poor SAB. After resetting mechanical ventilation to baseline parameters, CBF showed a slow and asymptotic return to baseline values without a negative rebound effect. This observation suggests that a longer duration of hypercapnia may prolong the CBF-increasing effect. This study was designed as a dose-optimization study to identify the time point at which CBF reaches a maximum and under the assumption that after this maximum, buffering mechanisms in blood and CSF could lead to adaptation mechanisms that result in a negative rebound effect after cessation of the hypercapnic challenge. An optimal duration of hypercapnia of 45 minutes was noted. KW - Angst KW - Maus KW - Serotonin KW - Stress KW - Entwicklung KW - Angstverhalten KW - Early-Life Stress KW - Mausmodell KW - Serotonindefizienz Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-239488 ER - TY - THES A1 - Wurster, Sebastian T1 - Die Bedeutung von LIN9 für die Regulation der Genexpression, die genomische Stabilität und die Tumorsuppression T1 - The significance of LIN9 for gene regulation, genomic stability and tumor suppression N2 - Pocket proteins and E2F transcription factors regulate the expression of cell cycle associated genes and play a central role in the coordination of cell division, differentiation, and apoptosis. Disorders of these pathways contribute to the development of various human tumor entities. Despite intensive research in the field of cell cycle regulation many details are not yet understood. The LIN complex (LINC / DREAM) is a recently discovered human multiprotein complex, which dynamically interacts with pocket proteins and E2F transcription factors. An essential component of the LIN complex is the LIN9 protein. In order to obtain a better insight into the function of this protein in cell cycle regulation and tumorigenesis, a conditional Lin9 knockout mouse model was established in our laboratory. The primary objective of this study was the phenotypic characterization of embryonic fibroblasts (MEFs) from these mice. Shortly after inactivation of Lin9 cell proliferation was massively impaired. Multiple types of mitotic defects such as structural abnormalities of the spindle apparatus, aberrant nuclei, failed nuclear segregation and cytokinesis failure have been observed in Lin9-depleted cells leading to a dramatic increase in polyploid and aneuploid cells. Ultimately these serious aberrations result in premature cellular senescence. If the senescence of Lin9-deficient cells is overcome by the Large T antigen the cells can adhere to the loss of Lin9, but show severe genomic instability and grow anchorage-independently in soft-agar as a sign of oncogenic transformation. In the second part of the thesis the gene expression of Lin9-deficient cells was assessed by quantitative real time PCR analyses to determine, whether the mitotic abnormalities are caused by transcriptional defects. Here a significant reduction of mitotic gene expression was observed in Lin9-depleted cells. Additionally chromatin immunoprecipitation experiments were performed to clarify the underlying molecular mechanisms. Compared to control cells epigenetic alterations at the promoters of mitotic target genes with regard to activating histone modifications were found in Lin9-deficient MEFs. In the last section of this study, the effects of Lin9 heterozygosity were analyzed. Lin9 heterozygous MEFs showed normal proliferation, although expression of different mitotic genes was slightly reduced. It appeared, however, that the mitotic spindle checkpoint of Lin9 heterozygous MEFs is weakened and thus over several cell generations an increase in polyploid cells was observed. Soft-agar assays showed that Lin9 heterozygosity contributes to oncogenic transformation. Taken together, these results document a crucial role of LIN9 in the regulation of cell cycle-associated gene expression. LIN9 is an essential factor for cell proliferation on one hand, while at the same time it functions as a tumor suppressor. N2 - Pocket-Proteine und E2F-Transkriptionsfaktoren regulieren die Expression von Zellzyklus-assoziierten Genen und spielen eine zentrale Rolle bei der Koordination der Zellteilung, Differenzierung und Apoptose. Störungen dieser Signalwege tragen zur Entstehung zahlreicher Tumorentitäten beim Menschen bei. Trotz der intensiven Untersuchung der Zellzyklusregulation sind viele Details noch unverstanden. Der LIN-Komplex (LINC / DREAM) ist ein kürzlich entdeckter humaner Multiprotein-komplex, welcher dynamisch mit Pocket-Proteinen und E2F-Transkriptionsfaktoren interagiert. Eine essentielle Komponente des LIN-Komplexes ist das LIN9-Protein. Um die Funktion dieses Proteins bei der Zellzyklusregulation und Tumorentstehung genauer untersuchen zu können, wurde in unserer Arbeitsgruppe ein konditionelles Lin9-Knockout-Mausmodell etabliert. Primäres Ziel der Arbeit war es, den Phänotyp embryonaler Fibroblasten (MEFs) aus diesen Mäusen zu charakterisieren. Bereits kurz nach Inaktivierung von Lin9 konnte ein stark verlangsamtes Zellwachstums beobachtet werden. In Lin9-depletierten MEFs wurden multiple mitotische Defekte detektiert, die u. a. strukturelle Auffälligkeiten des Spindelapparates, aberrante Zellkerne, Störungen der Chromosomensegregation sowie zytokinetische Defekte umfassen und in einer dramatischen Zunahme polyploider und aneuploider Zellen resultieren. Im Langzeitverlauf führen diese erheblichen Aberrationen zu einer vorzeitigen zellulären Seneszenz. Wird diese durch das Large T-Protoonkogen durchbrochen, können sich MEFs an den Verlust von Lin9 adaptieren, zeigen dann jedoch eine hochgradige genomische Instabilität und Substrat-unabhängiges Wachstum im Weichagar als Zeichen onkogener Transformation. Im zweiten Abschnitt der vorliegenden Arbeit wurde die Genexpression in Lin9-defizienten MEFs mittels quantitativer Real Time-PCR untersucht um zu klären, ob die beschriebenen Defekte auf Veränderungen der transkriptionellen Aktivität zurück-zuführen sind. Dabei wurde eine erhebliche Reduktion der Expressionslevel mitotischer Gene nach Verlust von Lin9 beobachtet. Des Weiteren wurden zur Klärung der zu Grunde liegenden molekularen Mechanismen Chromatin-Immunpräzipitations-Experimente (ChIP) durchgeführt. Im Vergleich zu Kontrollzellen wurden dabei in Lin9-defizienten Zellen signifikante epigenetische Veränderungen bezüglich aktivierender Histon-Modifikationen an den Promotoren mitotischer Lin9-Zielgene festgestellt. Im letzten Abschnitt der Arbeit sollten die Auswirkungen des heterozygoten Verlustes von Lin9 analysiert werden. Dabei zeigte sich, dass Lin9-haploinsuffiziente Zellen normal proliferieren, obwohl die Expression verschiedener G2/M-Gene leicht vermindert war. Es wurde jedoch eine Schwächung des mitotischen Spindelkontrollpunktes und in der Folge über mehrere Zellgenerationen eine Zunahme polyploider Zellen beobachtet. Mit Weichagar-Assays konnte gezeigt werden, dass bereits der heterozygote Verlust des Lin9-Gens zur onkogenen Transformation beiträgt. Zusammengenommen dokumentieren diese Studien, dass LIN9 eine entscheidende Bedeutung bei der Regulation von Zellzyklus-assoziierten Genen spielt und sowohl einen essentiellen Faktor für die Zellproliferation darstellt als auch durch die Gewährleistung genomischer Stabilität tumorsuppressive Eigenschaften aufweist. KW - Zellzyklus KW - Genexpression KW - Mitose KW - Knock-Out KW - LIN9 KW - Mausmodell KW - konditioneller Knockout Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-114967 ER - TY - THES A1 - Rosel, Eva Annemarie T1 - Die Rolle der endothelialen Stickstoff-Monoxid-Synthase (eNOS) in der Endothelaktivierung T1 - The role of endothelial nitric oxide synthase (eNOS) in endothelial activation N2 - Im Mittelpunkt der Arbeit stand die Rolle der endothelialen Stickstoff-Monoxid-Synthase (eNOS) für die Endothelaktivierung. Für diese Untersuchungen wurde die MLEC-Zellkulturtechnik (murine lung endothelial cells) und die Gegenüberstellung des Wiltyp- und eNOS-Knockout-Genotyps verwendet. Die MLEC-Kulturen wurden aus dem mikrovaskulären Stromgebiet der Lungen von C57Bl6-Wildtyp-Mäusen (WT) und von eNOS-Knockout-Mäusen (KO) angelegt und immunomagnetisch (Anti-CD102) zweifach selektioniert. Die Reinheit der Kulturen für Endothelzellen nach zwei Selektionen lag bei über 95%. WT-Endothelzellen produzieren eine basale Menge an Stickstoff-Monoxid (NO). Sie steigern ihre NO-Produktion nach Stimulation mit VEGF (vascular endothelium growth factor), mit dem Kalzium-Ionophor Ionomycin sowie unter Scherkraftexposition. Die eNOS-Proteinexpression erhöht sich dementsprechend nach 12 Stunden Scherkraftexposition. WT- und eNOS-KO-Endothelzellen unterscheiden sich unter basalen Bedingungen nicht in ihrer Oberflächenexpression der Adhäsionsmoleküle ICAM-1, E-Selektin, P-Selektin und VCAM-1. Nach Zytokin-Stimulation erhöhen beide Genotypen ihr Adhäsionsmolekülprofil in gleicher Weise. Sowohl WT- als auch eNOS-KO-Endothelzellen verfügen zudem über einen schnellen Mechanismus, der die Hochregulation der P-Selektin-Oberflächenexpression nach Stimulation mit Thrombin oder Menadion in gleicher Weise ermöglicht. Auf Stimulation mit Thrombin oder Menadion reagieren WT-Zellen mit einem signifikanten Anstieg der Produktion von freien Sauerstoff-Radikalen (ROS, rapid oxygen species). eNOS-KO-Zellen zeigen eine im Vergleich zum WT erhöhte basale ROS-Produktion. Diese lässt sich auch nach Stimulation nicht weiter steigern. Die experimentellen Ergebnisse zeigen, dass die MLEC-Zellkulturtechnik ein verlässliches Modell für Untersuchungen an Gefäßendothelzellen darstellt. eNOS-KO-Zellen exprimieren nicht automatisch mehr Adhäsionsmoleküle an der Zelloberfläche als WT-Zellen. Allerdings ist die basale Produktion von ROS in eNOS-KO-Zellen vermehrt. Folglich ist in diesem Modell eNOS nicht für die konstitutive Suppression der endothelialen Aktivierung verantwortlich. Der NO-Effekt kann nicht in einer direkten und kontinuierlichen Unterdrückung der endothelialen Oberflächenaktivierung liegen. Das Fehlen von NO führt vielmehr zu einer Verschiebung des Gleichgewichts zwischen dem Radikalfänger NO und O2- (Superoxid) zugunsten von O2-. Aufgrund dieses Ungleichgewichts ist die basale ROS-Produktion von eNOS-KO-Zellen vermutlich erhöht. Damit wird die Endothelzelle empfindlicher gegenüber zusätzlichem oxidativen Stress. Die eNOS-KO-Zellen können die höhere ROS-Belastung in den durchgeführten Untersuchungen kompensieren. Es ist aber denkbar, dass bei zusätzlichem oxidativen Stress ein erhöhtes Maß an O2- das Startsignal für die Abläufe der endothelialen Aktivierung darstellt. N2 - The objective of this study was the role of the endothelial nitric oxide synthase (eNOS) in endothelial activation. To do this we used MLEC cell cultures (murine lung endothelial cells) and the comparison between wildtype- and eNOS-knockout-genotype. MLECs were generated from microvascular lung tissue from C57Bl6-wildtype-mice (WT) and from eNOS-knockout-mice (KO) by immunomagnetic bead selection (anti-CD102). The endothelial cell cultures purity after twofold selection was > 95%. WT-endothelial cells produced a baseline amount of nitric oxide (NO). After stimulation with VEGF (vascular endothelium growth factor), with the calcium-ionophore ionomycin or after exposure to shear stress, WT-endothelial cells produced significantly higher amounts of NO. Simultaneously eNOS-protein expression was upregulated after 12 hours of shear stress exposure. Resting WT- and eNOS-KO-endothelial cells showed no difference in their surface expression of the adhesion molecules ICAM-1, E-Selektin, P-Selektin- and VCAM-1. Stimulation with cytokines led to an equally strong increase of the adhesion molecule expression in both genotypes. WT- as well as eNOS-KO-endothelial cells show a rapid mechanism to upregulate the surface expression of P-Selektin in a similar way after stimulation with thrombin or menadione. WT-endothelial cells showed a significant increase in the generation of rapid oxygen species (ROS) following stimulation with thrombin or menadione. The baseline level of ROS generation in eNOS-KO-endothelial cells is higher than in WT-cells and cannot even be increased upon stimulation. The results show that the MLEC-cell culture technique is a valid model for experimental research in vascular endothelial cells. eNOS-KO-cells do not automatically express a higher amount of adhesion molecules on their surface. However the baseline generation of ROS in eNOS-KO-cells is increased. Therefore eNOS is not responsible for the constitutive suppression of endothelial activation in this model. eNOS-derived NO is not required for the direct and continuous suppression of endothelial surface activation. The absence of NO leads to an imbalance between the scavenger NO and O2- (superoxide) in favour of O2-. It is probably because of this imbalance that the baseline ROS-generation in eNOS-KO-cells is increased. This causes endothelial cells to be more sensitive to oxidative stress. In our experiments the eNOS-KO-cells can compensate for the higher baseline ROS-level. It is however conceivable that an increased level of O2- as an additive oxidative stress may lead to starting signals for endothelial activation. KW - Stickstoffmonoxid KW - Stickstoffmonoxid-Synthase KW - Endothel KW - Zellkultur KW - Arteriosklerose KW - eNOS KW - eNOS-knockout KW - Endothelaktivierung KW - Mausmodell KW - endothelial nitric oxide synthase KW - eNOS-knockout KW - endothelial activation KW - nitric oxide KW - mouse model Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27824 ER - TY - THES A1 - Reiß, Cora T1 - Einfluss von Defekten des Mismatch Reparatur Proteins MLH1 (Mut L Homolog 1) auf Fertilität und Tumorgenese im Mausmodell T1 - Impact of defects of the mismatch repair protein MLH1 (Mut L Homolog 1) on fertility and tumogenesis in mice N2 - Mutationen im humanen DNA Mismatch-Reparatur (MMR) Gens Mlh1 sind mit dem erblichen, nicht-polypösen Kolonkarzinom (Lynch Syndrom, HNPCC) und einem signifikanten Anteil sporadischer kolorektaler Tumore assoziiert. Zudem konnten MMR Defekte in sporadischen und erblichen Lymphom Erkrankungen beschrieben werden. In Zellen resultiert die Inaktivierung des Mlh1 Gens in der Akkumulation von somatischen Mutationen im Genom und einer erhöhten Resistenz gegenüber den genotoxischen Effekten einer Vielzahl von DNA schädigenden Agenzien. Mäuse, die ein Null Allel für das MMR Gen Mlh1 tragen zeigen einen starken Tumorprädispositions Phänotyp. Sie entwickeln vorrangig B- und T-Zell Lymphome und mit geringerer Haufigkeit gastrointestinale Tumore. Zusätzlich sind Mlh1-/- Mäuse durch einen meiotischen Phänotyp charakterisiert, der zu Sterilitäten in beiden Geschlechtern führt. Um die Effekte von Mlh1 missense Mutationen auf die Tumoranfälligkeit zu untersuchen, erzeugten wir eine Mauslinie, die die häufig in HNPCC Patienten beschriebene MLH1G67R Mutation tragen, die in einer der ATP Bindungs-Domänen von MLH1 lokalisiert ist. Auch wenn die MLH1G67R Mutation in homozygot mutanten Mäusen in einer DNA Reparatur Defizienz resultierte hatte sie keinen Effekt auf die MMR vermittelte zelluläre Antwort auf DNA Schäden. Hierzu gehörte die apoptotische Antwort von Epithelzellen der intestinalen Mucosa auf Cisplatin, die in Mlh1-/- Mäusen defektiv jedoch in Mlh1G67R/G67R Mäusen normal ausfiel. Mlh1G67R/G67R mutante Mäuse zeigten wie Mlh1-/- Tiere einen starken Tumorprädispositions Phänotyp. Sie entwickelten jedoch im Vergleich zu Mlh1-/- Tieren signifikant weniger gastrointestinale Tumore, was darauf hinweist, dass Mlh1 missense Mutationen die Tumor supprimierende MMR Funktion in einer Gewebs-spezifischen Weise beeinflussen können. Darüber hinaus sind Mlh1G67R/G67R Mäuse, aufgrund der fehlenden Bindungsfähigkeit des MLH1G67R Proteins an die meiotischen Chromosomen im Pachytän Stadium, steril. Dies zeigt, dass die ATPase Aktivität von MLH1 für die Fertilität in Säugern essentiell ist. Diese Untersuchungen belegen, dass die Mlh1G67R Mutation die biologischen MLH1 Funktionen differentiell mit einem eindeutigen Phänotyp beeinflusst. Um die Rolle von MLH1 für die Lymphomagenese detaillierter untersuchen zu können, generierten wir ein neues Mausmodell mit einem konditionellen Mlh1 Allel (Mlh1flox/flox). Das Einkreuzen von transgenen EIIa-Cre Mausen in die Mlh1flox/flox Mauslinie führte zur konstitutiven Inaktivierung von MLH1. Die resultierende Mlh1Δex4/Δex4 Mauslinie zeichnete sich durch MMR Defizienz und einen zu Mlh1-/- Tieren vergleichbaren Tumorprädispositions Phänotyp aus. Zur T-Zell spezifischen MMR Inaktivierung kombinierten wir das Mlh1flox/flox Allel mit dem Lck-Cre Transgen. In den resultierenden Mlh1TΔex4/TΔex4 Mäusen ist die MLH1 Inaktivierung auf doppelt positive und einzel positive Thymozyten und naïve periphere TZellen beschränkt. Die Entwicklung von T-Zell Lymphomen in Mlh1TΔex4/TΔex4 Mäusen ist im Vergleich zu Mlh1-/- Mäusen signifikant reduziert, was eine wichtige, Lymphom supprimierende MMR Funktion in frühen Stadien der T-Zell Entwicklung oder in lymphoiden Vorläuferzellen impliziert. N2 - Mutations in the human DNA mismatch repair (MMR) gene Mlh1 are associated with hereditary nonpolyposis colorectal cancer (Lynch syndrome, HNPCC) and a significant proportion of sporadic colorectal cancer. Furthermore, MMR defects have also been observed in sporadic and hereditary lymphoid malignancies. In cells the inactivation of MLH1 results in the accumulation of somatic mutations in the genome and an increased resistance to the genotoxic effects of a variety of DNA damaging agents. Mice carrying a null allele for the MMR gene Mlh1 show a strong tumor predisposition phenotype. They are preferentially prone to the development of lymphomas of B- and T-cell origin and to a lesser extent gastrointestinal tumors. Additionally Mlh1-/- mice are characterized by a meiotic phenotype leading to male and female sterility. To study the effect of Mlh1 missense mutations on cancer susceptibility, we generated a mouse line carrying the recurrent MLH1G67R mutation that is located in one of the ATP-binding domains of MLH1. Although the MLH1G67R mutation resulted in DNA repair deficiency in homozygous mutant mice, it did not affect the MMR-mediated cellular response to DNA damage, including the apoptotic response of epithelial cells in the intestinal mucosa to cisplatin, which was defective in Mlh1-/- mice but remained normal in Mlh1G67R/G67R mice. Similar to Mlh1-/- mice, Mlh1G67R/G67R mutant mice displayed a strong cancer predisposition phenotype. However, in contrast to Mlh1-/- mice, Mlh1G67R/G67R mutant mice developed significantly fewer intestinal tumors, indicating that Mlh1 missense mutations can affect MMR tumor suppressor functions in a tissue-specific manner. In addition, Mlh1G67R/G67R mice were sterile because of the inability of the mutant Mlh1G67R protein to interact with meiotic chromosomes at pachynema, demonstrating that the ATPase activity of MLH1 is essential for fertility in mammals. These studies demonstrate that the Mlh1G67R mutation differentially affects the biological functions associated with MLH1 with distinct phenotypic effects. To study the role of MLH1 for lymphomagenesis in more detail, we generated a new mouse model carrying a conditional Mlh1 allele (Mlh1flox/flox). Mating of these mice with EIIa-Cre recombinase transgenic mice allowed the constitutive inactivation of MLH1 and the resulting Mlh1Δex4/Δex4 mouse line displays complete MMR deficiency and a cancer predisposition phenotype similar to Mlh1-/- mice. For T-cell specific MMR inactivation we combined the Mlh1flox/flox allele with the Lck-Cre Transgene. In the resulting Mlh1TΔex4/TΔex4 mice, MLH1 inactivation is limited to double positive and single positive thymocytes and naïve peripheral Tcells. The development of T-cell lymphomas in Mlh1TΔex4/TΔex4 mice is significantly reduced compared to Mlh1-/- mice implicating that MMR functions either at very early stages during Tcell development or even earlier in lymphoid precursor cells to suppress lymphomagenesis. KW - Colonkrebs KW - Genmutation KW - DNS-Reparatur KW - MLH1 KW - HNPCC KW - Mutation KW - Mausmodell KW - Tumor KW - MLH1 KW - HNPCC KW - mutation KW - mousemodell Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-53626 ER - TY - THES A1 - Dietl, Sebastian T1 - Etablierung orthotoper Gehirntumor-Modelle in der Maus T1 - Establishment of orthotopic brain tumor models in mice N2 - Gehirntumore stellen die zweithäufigste Tumorart im Kindesalter dar. Trotz zahlreicher medizinischer Fortschritte verstirbt auch heute noch ca. 1/3 der Betroffenen und die Überlebenden leiden häufig unter geistigen und körperlichen Langzeitfolgen. Zwei Entitäten, die auch heute noch zu den großen Herausforderungen der pädiatrischen Onkologie zählen, sind das Glioblastom und das Medulloblastom. Um beide Tumorarten weiter erforschen und neue Therapiekonzepte entwickeln zu können, wurden im Zuge dieser Arbeit zwei orthotope Mausmodelle etabliert: ein syngenes Glioblastom- und ein xenogenes Medulloblastom-Modell: GL261-FLuc Glioblastom-Modell: Das Glioblastom ist ein seltener Tumor im Kindesalter. Die extrem schlechte Prognose macht neue Behandlungsstrategien jedoch dringend erforderlich. Immuntherapien könnten hier ein rationaler Ansatz sein. Durch orthotope Inokulation lentiviral transduzierter GL261-FLuc Zellen wurde im Rahmen dieser Arbeit das syngene GL261 Modell etabliert und hinsichtlich seiner biomorphologischen und immunologischen Eigenschaften evaluiert: Ähnlich wie humane Glioblastome zeigen GL261-FLuc Zellen in vivo ein aggressives Wachstum, welches von einer schnellen Proliferation und deutlichen Invasionsneigung geprägt ist. Histologisch bestehen GL261-FLuc Tumore aus astrozytär differenzierten Zellen, die neben typischen Nekrosen auch eine starke, funktionell pathologische Vaskularisierung zeigen. Interessanterweise offenbarte das in vivo BLI nach orthotoper Inokulation eine Phase der „Tumoradaptation“ (Tag 6-14), die immunologischer Natur zu sein scheint. Die Tatsache, dass das Tumorwachstum wie beim Menschen in einer prinzipiell immunkompetenten Umgebung stattfindet und dass GL261-FLuc Zellen eine konstitutionelle und durch IFN γ stimulierbare MHC Klasse I Expression aufweisen, qualifiziert das Modell für immuntherapeutische Untersuchungen. Insgesamt handelt es sich nicht nur um ein gut voraussag- und reproduzierbares Modell, das die immunologischen und bio-morphologischen Kennzeichen des humanen Vorbildes suffizient rekapituliert, sondern es liefert auch dank der Möglichkeit, das Zellwachstum mittels BLI zu verfolgen, interessante Einblicke in das in vivo Verhalten der Zellen. MB3W1 Medulloblastom-Modell: Das Medulloblastom ist der häufigste maligne Gehirntumor des Kindesalters und kann, wie neue Genexpressionsstudien zeigen, in verschiedene molekulare Subgruppen unterteilt werden. Für Gruppe 3 Medulloblastome, die mit Abstand die schlechteste klinische Prognose besitzen, gibt es aktuell nur limitierte Daten, unter anderem auch deshalb, weil kaum geeignete Mausmodelle existieren. Der außergewöhnliche Fall eines zweijährigen Jungen, der an einem äußerst aggressiven anaplastischen Medulloblastom verstorben war, führte zur Etablierung des zweiten Hirntumormodells. Mit Zellen dieses Tumors (MB3W1 Zellen), die nach extrakranieller Metastasierung aus malignen Pleuraergüssen isoliert werden konnten, wurde ein orthotopes Xenograftmodell etabliert. Erstaunlicherweise ließen die Zellen sowohl Tumorstammzell- als auch Gruppe 3-Charakteristika erkennen: In vitro wachsen MB3W1 Zellen wie für Stammzellen typisch in Form von Neurosphären und zeigen neben der Fähigkeit zur exponentiellen Langzeitproliferation auch eine hohe ALDH Aktivität. Die Expression typischer Oberflächenmarker wie CD15 und CD133 ist ebenfalls suggestiv für Tumorstammzelleigenschaften. Die hohe Tumorigenität von MB3W1 Zellen in immuninkompetenten Mäusen (bereits 500 Zellen führten zu 100 % Tumorraten) ist neben der Tatsache, dass die induzierten Tumore exakt die histopathologischen Eigenschaften des Primärtumors rekapitulierten und eine multilineäre Differenzierung zeigten, als weiteres Stammzell-kennzeichen zu werten. Ergänzend zum genetischen Profil (MYC Amplifikation, Gruppe 3 spezifisches Genexpressionsmuster, Tetraploidie, 17q Zugewinne), das MB3W1 Zellen klar als Gruppe 3 Medulloblastom identifiziert, spiegeln MB3W1 Zellen auch das aggressive und disseminierende Verhalten, welches Gruppe 3 Tumore auszeichnet, wider. Die Xenotransplantate zeigten nicht nur ein rapides invasives Wachstum in vivo, sondern es konnte interessanterweise auch am Versuchsende regelhaft eine Metastasierung der Zellen in den zerebrospinalen Liquor beobachtet werden. Das im Zuge dieser Arbeit etablierte Xenograftmodell komplementiert die beiden einzigen derzeit veröffentlichten syngenen Gruppe 3 Modelle, da es im Gegensatz zu diesen ohne zusätzliche genetische Manipulation auskommt. Die einzige Modifikation der Zellen (die lentivirale Transduktion mit eGFP und FLuc) diente dem besseren in vivo „Monitoring“, war optional und veränderte auch das biologische Verhalten der Zellen nicht. Insgesamt ist es ein einfaches und gut reproduzierbares Tumormodell, das die gleichzeitige Erforschung von Tumorstammzell- und Gruppe 3-Eigenschaften erlaubt. Vor allem vor dem Hintergrund des außergewöhnlichen klinischen Verlaufs des Primärtumors ist es ein extrem wertvolles Werkzeug, das in Zukunft hoffentlich dazu beitragen wird, neue gezielte Therapiestrategien für die Behandlung solch aggressiver Tumore entwickeln zu können. N2 - Brain tumors are the second most common tumor entity in childhood. Despite of advances in treatment, one third of patients dies and survivors often suffer from severe side effects of therapy. Two (even today) challenging tumor entities are glioblastoma and medulloblastoma. For exploring these tumors and developing new treatment strategies, two orthotopic brain tumor models in mice should be established within this work: a syngenic gliblastoma model and a xenogenic medulloblastoma model: GL261-FLuc glioblastoma model: Glioblastoma is rare in childhood, but because of the devastating prognosis new treatment options are urgently needed. Immunotherapy seems to be a rational strategy. Within this work an orthotopic mouse model was established using lentiviral transduced GL261-FLuc cells and evaluated regarding to its biomorphological and immunological features: Like human glioblastoma GL261-FLuc cells show aggressive tumor growth with high proliferation and invasion. Histologically tumors are built of astrocytic differentiated tumor cells and typically exhibit necrosis and pathological vascularisation. Interestingly tumor growth is characterized through a typical phase of adaption during day 6-14, which seems to be of immunological nature. This and the facts that tumor growth takes place in an immunocompetent environment and that GL261-Fluc cells show expression of MHC I (stimulable with IFN γ) makes this model valuable for immunotherapy investigations. Taken together the GL261-FLuc model is not only good predictable and reproducible, it also reflects the immunological and biomorphological features of the human counterpart. The ability to visualize the tumor growth with BLI gives interesting insights in tumor behaviour within this model. MB3W1 medulloblastoma model: Medulloblastoma is the most frequent brain tumor in childhood. New gene expression studies now reveal four distinct molecular subgroups of medulloblastoma. For group 3 tumors, which by far have the worst prognosis, only limiting data exists, not least because of a lack of suitable tumor models. An extraordinary case of a two-year-old boy suffering from a highly aggressive anaplastic medulloblastoma led to the second tumor model within this work. With cells, isolated from malignant pleural effusions of this tumor (MB3W1 cells), an orthotopic xenograft model was established. Interestingly tumor cells not only exhibit signs of a group 3 medulloblastoma, but also of tumor stem cells: In vitro cultured cells show exponential longterm proliferation, formation of neurospheres and expression of several stem cell markers like CD15, CD133 and high ALDH activity. In vivo tumor cells typically are highly tumorigenic in immunocompromised mice leading to exact copies of the primary tumor and furthermore show the capacity of multilineage differentiation. The clinical course of the patient and the genetic profile of MB3W1 cells (MYC amplification, group 3 gene expression pattern, tetraploidy and gain of chromosome 17q) clearly classifies the tumor as group 3 medulloblastoma. Furthermore the established MB3W1 tumor model mimics the aggressive behaviour of the patient’s tumor by recapitulating its dissemination tendency. Xenotransplants not only show rapid in vivo proliferation, but also metastasize regularly into the cerebrospinal fluid and invade from there again into the cerebral parenchyma. This xenograftmodel is a valid and good reproducible medulloblastoma model, which exhibits not only tumor stem cell features, but also has a clear group 3 signature and therefore complements the only two at the moment published group 3 models. Especially in light of the extraordinary clinical course of the patient, this model will be an extreme valuable instrument to further investigate this aggressive subtype of medulloblastoma and to develop new treatment strategies. KW - Tumor KW - Maus KW - Modell KW - Glioblastom KW - Medulloblastom KW - orthotopes Gehirntumormodell KW - Mausmodell KW - Tumormodell KW - brain tumor model KW - mice Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-160762 ER - TY - THES A1 - Butters, Marlene T1 - Etablierung und Evaluierung von quantitativen RT-PCR- und ELISA-Verfahren zur Bestimmung muriner Zytokinspiegel bei der Immunantwort gegenüber Aspergillus fumigatus T1 - Establishment and evaluation of quantitative RT-PCR- and ELISA-methods for identifycation of murine zytikin levels regarding the immune reaction against Aspergillus fumigatus N2 - In unserer Studie sollte die Genauigkeit der PCR zur Bestimmung von Zytokinspiegeln ermittelt werden. Mittels Blutproben von mit A. Fumigatus infizierten Mäusen, sollte eine Aussage bezüglich der Immunantwort getroffen werden. Wir griffen TNFα, IL-12p40 und IL-10 heraus, um einschätzen zu können, ob die Immunantwort eher humoral oder zellvermittelt abläuft. Zur möglichen Bestimmung der Sensitivität und Genauigkeit, wurden die crossing points der Standardverdünnungsreihen jeweils einmal in einem Lauf dreifach, ausserdem jeweils in drei unabhängigen Läufen von einander einfach eingesetzt, und miteinander verglichen. Unsere Ergebnisse decken sich mit den Ergebnissen aktueller Literatur und Etablierungen anderer Zytokine. Die Etablierung des ELISAs sollte dem Vergleich zwischen mRNA-Ebene und Proteinebene dienen. Zur richtigen Einordnung unserer Arbeiten mit dem Immunoassay müssen die Limitierungen der Ergebnisse beachtet werden. Die Versuche zur Quantifizierung der mRNA murinen TNFαs aus den Versuchsserien misslang. Auch die erzielten Ergebnisse mit Protein-basierten Nachweisverfahren konnten letztendlich nicht suffizient beurteilt werden. Die großen Schwankungen in der Konzentration und die Widersprüchlichkeit im Vergleich der Ergebnisse aktueller Literatur, machen eine Verfälschung durch Kontamination mit Proteinen aus lysierten Zellen sehr wahrscheinlich. Die erzielten Ergebnisse der RT-PCR anhand der Inter- und Intra-Assay- Vergleiche jedoch können nachfolgenden Projekten dazu dienen, hauptsächlich das Instrument LightCycler in seiner Sensitivität und Genauigkeit einschätzen zu können, und so die ermittelten Daten besser verarbeiten zu können. N2 - In this study we analysed the accuracy of PCR for identification of murine cytokine levels. Using blood samples of with A. Fumigatus infected mice, we wanted to reach a conclusion concerning the immune reaction. We picked TNFα, IL-12p40 and IL-10 to decide if the immune reaction is humoral or cell mediated. For determination of sensitivity and accuracy we compared the crossing points of the dilution standard series. We used the standard series once three times in one run and on the other hand in three independent runs. Our results correspond with the results in current literature. The establishment of the ELISA should have served for comparing the mRNA level with the protein level. But the tests failed. We couldn´t find mRNA of murine TNFα, and there was big variability in the concentration of protein. Probably the falsification happend because of the contamination with proteins from lysis of cells. But the conclusions from the RT-PCR inter- and intra-assay comparison could be helpful to assess the LightCycler instrument in its sensitivity and its accuracy and so facilitate the assessment of the results. KW - Aspergillus fumigatus KW - Tumor-Nekrose-Faktor KW - Immunreaktion KW - Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion KW - Polymerase-Kettenreaktion KW - Real time quantitative PCR KW - Aspergillose KW - murin KW - IL 10 KW - IL 12 KW - IL 12p40 KW - ELISA KW - Mausmodell KW - invasive Aspergillose KW - aspergillus fumigatus KW - TNF a KW - immune reaction KW - RT-PCR KW - PCR KW - aspergillosis Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-38890 ER - TY - THES A1 - Klaus, Laura-Christin T1 - Generierung und Charakterisierung eines neuen Mausmodells des Morbus Parkinson durch AAV1/2 vermittelte Überexpression von humanem mutiertem A53T-α-Synuclein in der Substantia nigra T1 - Generation and characterization of a new mouse model for Parkinson’s disease by AAV1/2 induced overexpression of human mutated A53T-α-synuclein in the substantia nigra N2 - Auch wenn die Ätiopathogenese von Morbus Parkinson bis heute nicht vollständig geklärt ist, scheint α-Synuclein (α-Syn) eine zentrale Rolle zu spielen. Die Entdeckung als genetische Ursache der Erkrankung, als Hauptbestandteil der Lewy-Körper (LK) und seine Assoziation mit verschiedenen anderen potenziellen ätiologischen Faktoren verdeutlichen dies. Bei Ratten und Affen führte eine AAV1/2-vermittelte Überexpression von A53T-α-Syn zu einer Degeneration dopaminerger Neurone in der Substantia nigra (SN), einem striatalen dopaminergen Defizit sowie Verhaltensauffälligkeiten. In Anbetracht bestimmter Vorteile der Mausspezies, war es das Ziel dieser Dissertation - die im Rahmen eines kollaborativen Projektes mit dem Toronto Western Research Institut in Ontario, Kanada entstanden ist - dieses auf AAV1/2-A53T-α-Syn basierende Parkinson-Modell auf Mäuse zu übertragen. Dazu wurde AAV1/2-A53T-α-Syn oder leerer AAV1/2-Vektor in einer Dosis von 1,5 µl mit einer Konzentration von 5,16 x 10^12 gp/ml stereotaktisch einseitig in die rechte SN von C57BL/6-wt-Mäusen injiziert. Über einen Zeitraum von 11 Wochen wurden verschiedene Verhaltensexperimente durchgeführt und die beiden Versuchstiergruppen miteinander verglichen. Post-mortem erfolgten verschiedene immunhistochemische Untersuchungen. Es konnte gezeigt werden, dass die einseitige Injektion von AAV1/2-A53T-α-Syn in die SN bei Mäusen eine weit verbreitete Überexpression von A53T-α-Syn in dopaminergen Neuronen der SN induzierte, die innerhalb von 10 Wochen zu signifikanten frühen und persistierenden motorischen Verhaltensauffälligkeiten, nigrostriataler Degeneration und Entwicklung einer Lewy-ähnlichen Pathologie führte. Durch die Generierung und Charakterisierung dieses neuen Parkinson-Mausmodells, das klinische und histopathologische Merkmale der menschlichen Erkrankung widerspiegelt, besteht nun die Möglichkeit es weiterzuentwickeln und z.B. auf transgene Mäuse zu übertragen, um u.a. molekulare Mechanismen der Parkinson-Krankheit zu entschlüsseln und präklinische Tests von krankheitsmodifizierenden Therapien durchzuführen. N2 - Although the etiopathogenesis of Parkinson’s disease (PD) has not been fully elucidated to date, α-synuclein (α-syn) seems to play a central role. Its discovery as a genetic cause of the disease, as the major component of the Lewy bodies (LB) and its association with other potential etiological factors illustrate this. In rats and monkeys, AAV1/2-mediated overexpression of A53T-α-syn resulted in degeneration of dopaminergic neurons of the substantia nigra (SN), a striatal dopaminergic deficit and behavioral deficits. Given certain advantages of the mouse species, the aim of this doctoral thesis - which was part of a collaborative project with the Toronto Western Research Institute in Ontario, Canada - was to transfer this AAV1/2-A53T-α-syn based PD model to mice. For this purpose, 1.5 µl of AAV1/2-A53T-α-syn or AAV1/2 empty vector at a concentration of 5.16 x 10^12 gp/ml were stereotactically injected unilaterally into the right SN of C57BL/6-wt-mice. Several behavioral experiments were performed over a period of 11 weeks and the two groups of mice were compared. Post-mortem measures included different immunohistochemical studies. It was shown that unilateral injection of AAV1/2-A53T-α-syn into the mouse SN induced a widespread overexpression of A53T-α-syn in dopaminergic SN neurons, that led to significant early and persistent motor deficits, nigrostriatal degeneration and development of Lewy-like pathology within 10 weeks. By generating and characterizing this novel PD mouse model, which reflects clinical and histopathological hallmarks of human PD, there is now the opportunity to further develop it and to transfer it e.g. to transgenic mice for unravelling molecular mechanisms of PD and preclinical testing of disease modifying therapies. KW - Parkinson-Krankheit KW - Synuclein KW - Tiermodell KW - Morbus Parkinson KW - α-Synuclein KW - Mausmodell KW - Lewy-Pathologie KW - A53T-Mutation KW - Parkinson’s disease KW - α-synuclein KW - mouse model KW - A53T mutation KW - Lewy-like pathology Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-239217 ER - TY - THES A1 - Bäuerlein, Carina T1 - Identification of new predictive markers for an early diagnosis of an imminent acute Graft-versus-Host Disease T1 - Bestimmung neuer prädiktiver Marker zur Früherkennung einer drohenden akuten Graft-versus-Host Disease N2 - Acute graft-versus-host disease (aGvHD) is an immune syndrome associated with allogeneic hematopoietic cell transplantation (allo-HCT) that is mediated by alloreactive donor T cells attacking the gastrointestinal tract, liver, and skin of the host. Early diagnosis remains problematic and to date mainly relies on clinical symptoms and histopathology. Previously, different groups demonstrated that in order to cause aGvHD, alloreactive T cells require the expression of appropriate homing receptors to efficiently migrate from their priming sites to their target tissues. Therefore, the development of a predictive test based on the homing receptor expression profile of peripheral blood T cells seems attractive to identify patients at risk before the onset of aGvHD. The aim of this study was to analyze migrating alloreactive donor T cell kinetics in the peripheral blood early after allo-HCT in a murine model across minor histocompatibility antigens (miHAg) followed by a precise characterization of the homing receptor expression profile of migrating donor lymphocytes in order to identify suitable predictive markers. Combining daily bioluminescence imaging (BLI) and flow cytometry (FC) allowed defining two weeks of massive alloreactive donor T cell migration before clinical aGvHD symptoms became apparent. Peripheral blood donor T lymphocytes highly up-regulated the homing markers α4β7 integrin, and P- and E-selectin-ligand at peak time points of cell migration. The combination with the activation markers CD25 and CD69 and low expression levels of L-selectin allowed alloreactive donor T cell definition. Based on this migration phase we postulated a potential diagnostic window to precisely identify alloreactive donor T cells upon their homing receptor expression profile. Consequently, targeted pre-emptive treatment with rapamycin starting at the earliest detection time point of alloreactive donor T cells in the peripheral blood (day+6) significantly prolonged survival of treated mice. Based on this data, we propose a potential diagnostic window for alloreactive cell detection based on their homing receptor expression profile for a timely and effective therapeutic intervention before the clinical manifestation of aGvHD. N2 - Die allogene hämatopoetische Stammzelltransplantation ist oft die einzig mögliche Behandlungsmethode für maligne und nicht-maligne hämatologische Erkrankungen. Die Graft-versus-Host Disease stellt den größten, limitierenden Faktor dieser Therapie dar. Bei diesem Immunsyndrom greifen alloreaktive Spender-T-Zellen gezielt Organe des Empfängers an, insbesondere den Gastrointestinaltrakt, die Leber und die Haut. Die frühe Diagnose einer bevorstehenden, akuten GvHD gestaltet sich nach wie vor schwierig und basiert heutzutage hauptsächlich auf dem Auftreten klinischer Symptome und histopathologischen Befunden. Die Entwicklung eines prädiktiven Tests zur Früherkennung gefährdeter Patienten hat daher hohe Priorität. Verschiedene Gruppen zeigten kürzlich, dass Spender-T-Zellen spezifische Rezeptoren, sogenannte Homing-Rezeptoren, exprimieren müssen, um in die Zielorgane einwandern zu können. Deshalb scheint die Entwicklung eines auf dem spezifischen Homing-Rezeptor-Expressionsmuster der T-Zellen im peripheren Blut basierenden Tests vielversprechend, um gezielt Patienten zu identifizieren, die möglicherweise eine aGvHD entwickeln werden. Das Ziel dieser Arbeit war die genaue Analyse der Migrationskinetik alloreaktiver Spender-T-Zellen im peripheren Blut in einem klinisch relevanten Mausmodell mit Unterschieden in minor Histokompatibilitätsantigenen. Es folgte eine präzise Charakterisierung des Homing-Rezeptor-Expressionsprofils der migrierenden Spenderlymphozyten zu ausgewählten Zeitpunkten nach Transplantation, um mögliche, geeignete Rezeptoren für einen prädiktiven Test zu identifizieren. Die Kombination von täglicher in vivo Bildgebung der transplantierten Mäuse mit durchflusszytometrischen Analysen des peripheren Blutes ermöglichte es, eine zweiwöchige Phase massiver Spenderzellmigration vor dem Auftreten klinischer aGvHD Symptome zu definieren. Die detektierten Spenderlymphozyten zeigten eine stark erhöhte Expression des für die Migration in den Gastrointestinaltrakt wichtigen Moleküls α4β7 Integrin sowie der Liganden für P- und E-Selektin, die in das Haut-Homing involviert sind. Die Kombination dieser Marker mit der stark reduzierten Expression von L-Selektin, einem Marker für naive T-Zellen, sowie der signifikant höheren Expression der Aktivierungsmarker CD25 und CD69 im Vergleich zu syngen transplantierten Kontrolltieren ermöglichte die Definition von alloreaktiven Spender-T-Zellen. Eine gezielte, vorbeugende Behandlung mit Rapamycin, beginnend am Tag der Detektion erster alloreaktiver T-Zellen (Tag+6), erhöhte die Überlebensrate der behandelten Mäuse. Aufgrund dieser Daten schlagen wir ein potentielles, diagnostisches Fenster zur Anwendung prädiktiver Tests vor, um Patienten, mit erhöhtem aGvHD-Risiko rechtzeitig zu identifizieren und vorbeugend behandeln zu können. KW - Transplantat-Wirt-Reaktion KW - Graft-versus-host disease KW - Mausmodell KW - T-Zellhoming KW - Graft-versus-host disease KW - mouse model KW - T cell homing KW - Maus KW - Blutstammzelle Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-78489 ER - TY - THES A1 - Morsch, Ilonka T1 - Mechanismen des veränderten Glucosestoffwechsels in Leber, Myokard und Skelettmuskel bei Herzinsuffizienz im Mausmodell der thorakalen Aortenligatur T1 - Mechanism of altered glucose metabolism in liver, myocardium and sceletal muscle in the mouse model of thoracic aortic ligation N2 - In dieser Arbeit wurden die Signalwege an Myokard, Leber und Skelettmuskulatur untersucht, die den Veränderungen des Glucosestoffwechsels im zeitlichen Verlauf bei TAC-induzierter systolischer Herzinsuffizienz zu Grunde liegen können. Es wurde dafür über eine TAC-Operation am Mausmodell eine Herzinsuffizienz induziert. Erniedrigte Nüchtern-Blutzuckerwerte und ein erhöhter myokardialer Glucoseverbrauch fanden sich als die wesentlichen metabolischen Veränderungen in diesem Mausmodell mit TAC-induzierter Herzinsuffizienz. In Vorarbeiten ergaben die GTTs nach zwei Wochen eine erhöhte Glucoseaufnahme nach TAC, die nicht durch eine verstärkte Insulinsignaltransduktion hervorgerufen wurde, da sich die Insulinkonzentrationen und die Insulinsensitivität zwischen den Gruppen nicht unterschieden. Der Nüchternblutzuckers war bei den TAC-operierten Tieren niedriger als bei den Sham-operierten. In der PET-Bildgebung wurde eine erhöhte Glucoseaufnahme im Herzen bei den TAC-Tieren verglichen mit den Sham-operierten Tieren gezeigt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden nun nach einem bzw. sechs Monaten bei den Versuchsgruppen Western Blot Analysen sowie Glykogenassays durchgeführt. Zudem wurde untersucht, wie sich eine zusätzliche Sucrosefütterung über sechs Monate ab OP auswirkt. Dabei fand sich eine erhöhte Expression des basalen Glucosetransporters GLUT1 am Myokard, passend zur erhöhten basalen Glucoseaufnahme im PET. Die Expression des insulinabhängigen Transporters GLUT4 hingegen war - wie bereits in anderen Arbeiten zu Hypertrophie und Herzinsuffizienz - vermindert. Der hepatische und muskuläre Glykogengehalts war nach TAC reduziert, wobei die Depletion der hepatischen Speicher bereits nach einem Monat, im Muskel erst nach sechs Monaten signifikant war. Die Regulation der muskulären Glykogenreserven wurde in unserem Modell möglicherweise über Akt und Hexokinase II vermittelt. Einen Monat nach TAC war am Skelettmuskel eine vorübergehende Reduktion der Akt-Phosphorylierung zu verzeichnen, was über Aktivierung der Glykogensynthase zur Aufrechterhaltung der muskulären Glykogenspeicher beitragen kann. Sechs Monate nach TAC-OP war die Akt-Expression im Skelettmuskel dann jedoch verstärkt, was zwar einen Kompensationsmechanismus zur Vermeidung einer Muskel-Atrophie darstellt, jedoch durch Inaktivierung der Glykogensynthase sinkende Glykogenreserven bedingt. Gleichzeitig war eine Steigerung der Expression von Hexokinase II zu beobachten, die durch Bildung von Glucose-6-Phosphat die intrazellluläre Glucoseverfügbarkeit kompensiert. Bei zusätzlicher Sucrosefütterung über sechs Monate zeigte sich im Muskel der TAC-operierten Tiere keine kompensatorische Steigerung von Akt- und HKII-Expression mehr, und auch die Entleerung der muskulären Glykogenspeicher war vollständig abgefangen. Ebenso wurde die Entleerung der hepatischen Glykogenvorräte durch Sucrose-Substitution verhindert, was für eine ausreichende Glucoseverfügbarkeit spricht und die Normalisierung der Glucosetoleranz erklärt. Wichtige Regulatoren der Leber-Glykogensynthese, z.B. GLUT2 und HK IV, oder der zellulären Energie-Homöostase, z.B. AMPK, waren hingegen zu keinem Zeitpunkt wesentlich verändert. Zusammenfassend konnten somit durch eine Sucrosesubstitution die bei TAC-induzierter Herzinsuffizienz reduzierten Glykogenspeicher in Muskel und Leber erhalten, der systemische Glucosestoffwechsel normalisiert und eine Reduktion der Mortalität erzielt werden. Insgesamt lässt sich feststellen, dass sich Strategien, die zu einer Wiederherstellung der systemischen Glucoseverfügbarkeit beitragen, möglicherweise positiv auf eine Herzinsuffizienztherapie auswirken könnten. N2 - In this work, the signaling pathways in myocardium, liver, and skeletal muscles that may underlie changes in glucose metabolism over time in TAC-induced systolic heart failure were investigated. For this purpose, heart failure was induced by TAC surgery in a mouse model. Lowered fasting blood glucose levels and increased myocardial glucose consumption were found to be the major metabolic changes in this mouse model of TAC-induced heart failure. In preliminary studies, GTTs showed increased glucose uptake after two weeks after TAC, which was not caused by increased insulin signal transduction, since insulin concentrations and insulin sensitivity did not differ between groups. Fasting blood glucose was lower in the TAC-operated animals than in the sham-operated animals. PET imaging showed increased cardiac glucose uptake in the TAC animals compared to the sham-operated animals. In this study, Western blot analyses and glycogen assays were performed after one and six months in the experimental groups. In addition, the effect of an additional sucrose feed over six months after surgery was investigated. An increased expression of the basal glucose transporter GLUT1 was found in the myocardium, matching the increased basal glucose uptake in PET. The expression of the insulin-dependent transporter GLUT4, on the other hand, was reduced, as in other studies on hypertrophy and heart failure. The hepatic and muscular glycogen content was reduced after TAC, whereby the depletion of the hepatic stores was already significant after one month, in the muscle only after six months. The regulation of muscular glycogen reserves was possibly mediated in our model by Akt and hexokinase II. One month after TAC, a temporary reduction of Akt phosphorylation was observed in skeletal muscle, which may contribute to the maintenance of muscular glycogen stores by activating glycogen synthase. However, six months after TAC surgery, Akt expression in skeletal muscle was increased, which is a compensatory mechanism to avoid muscle atrophy, but which causes decreasing glycogen reserves due to inactivation of glycogen synthase. At the same time, an increase in the expression of hexokinase II was observed, which compensates for intracellular glucose availability by producing glucose-6-phosphate. With additional sucrose feeding over six months, no compensatory increase in Akt and HKII expression was observed in the muscle of the TAC-operated animals, and the depletion of muscular glycogen reserves was completely stopped. Likewise, the depletion of hepatic glycogen stores by sucrose substitution was prevented, which indicates sufficient glucose availability and explains the normalization of glucose tolerance. Important regulators of liver glycogen synthesis, e.g. GLUT2 and HK IV, or cellular energy homeostasis, e.g. AMPK, were not significantly altered at any time. In summary, sucrose substitution was able to maintain the reduced glycogen stores in muscle and liver in TAC-induced heart failure, normalize systemic glucose metabolism and reduce mortality. Overall, it can be concluded that strategies that contribute to restoring systemic glucose availability could potentially have a positive impact on heart failure therapy. KW - Herzinsuffizienz KW - Glukosestoffwechsel KW - Mausmodell Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-217718 ER - TY - THES A1 - Krämer, Franziska T1 - Molecular and Biochemical Investigations into VMD2, the gene associated with Best Disease T1 - Molekulare und biochemische Untersuchungen zur Charakterisierung des Morbus Best Gens, VMD2 N2 - Best disease (OMIM 153700) is an early-onset, autosomal dominant maculopathy characterized by egg yolk-like lesions in the central retina. The disease gene, the vitelliform macular dystrophy gene type 2 (VMD2), encodes a 585-aa VMD2 transmembrane protein, termed bestrophin. The protein is predominantly expressed on the basolateral side of the retinal pigment epithelium (RPE) and is thought to be involved in the transport of chloride ions. Bestrophin as well as three closely related VMD2-like proteins (VMD2L1-L3) contain multiple putative transmembrane (TM) domains and an invariant tripeptide (RFP) motif in the N-terminal half of the protein. This and the tissue-restricted expression to polarized epithelial cells are typical features of the VMD2 RFP-TM family. Best disease is predominantly caused by missense mutations, clustering in four distinct „hotspots“ in the evolutionary highly conserved N-terminal region of the protein. To further augment the spectrum of mutations and to gain novel insights into the underlying molecular mechanisms, we screened VMD2 in a large cohort of affected patients. In total, nine novel VMD2 mutations were identified, raising the total number of known Best disease-related mutations from 83 to 92. Eight out of nine novel mutations are hotspot-specific missense mutations, underscoring their functional/structural significance and corroborating the dominant-negative nature of the mutations. Of special interest is a one-basepair deletion (Pro260fsX288) encoding a truncated protein with a deletion of an important functional domain (TM domain four) as well as the entire C-terminal half of bestrophin. For the first time, a nonsense mutation leading to a 50 % non-functional protein has been identified suggesting that on rare occassions Best disease may be caused by haploinsufficiency. Molecular diagnostics strongly requires a reliable classification of VMD2 sequence changes into pathogenic and non-pathogenic types. Since the molecular pathomechanism is unclear at present, the pathogenicity of novel sequence changes of VMD2 are currently assessed in light of known mutations. We therefore initiated a publicly accessible VMD2 mutation database (http://www.uni-wuerzburg.de/humangenetics/vmd2.html) and are collecting and administrating the growing number of mutations, rare sequence variants and common polymorphisms. Missense mutations may disrupt the function of proteins in numerous ways. To evaluate the functional consequences of VMD2 mutations in respect to intracellular mislocalization and/or protein elimination, a set of molecular tools were generated. These included the establishment of an in vitro COS7 heterologous expression assay, the generation of numerous VMD2 mutations by site-directed mutagenesis as well as the development of bestrophin-specific antibodies. Surprisingly, membrane fractionation/Western blot experiments revealed no significant quantitative differences between intact and mutant bestrophin. Irrelevant of the type or location of mutation, incorporation of mutant bestrophin to the membraneous fraction was observed. Thus, impaired membrane integration may be ruled out as causative pathomechanism of Best disease consistent with a dominant-negative effect of the mutations. In a different approach, efforts were directed towards identifying and characterizing the VMD2 RFP-TM protein family in mouse. While clarification of the genomic organization of murine Vmd2 was required as basis to generate Vmd2-targeted animals (see below), the study of closely related proteins (Vmd2L1, Vmd2L2 and Vmd2L3) may provide further clues as to the function of bestrophin. For this, biocomputational as well as RT PCR analyses were performed. Moreover, the novel genes were analyzed by real time quantitative RT PCR, displaying predominant expression in testis, colon and skeletal muscle of Vmd2, Vmd2L1 and Vmd2L3 transcripts, respectively as well as in eye tissue. Interestingly, neither an ORF was determined for murine Vmd2L2 nor was the transcript present in a panel of 12 mouse tissues, suggesting that murine Vmd2L2 may represent a functionally inactive pseudogene. The murine Vmd2L3 gene, as its human counterpart, is a highly differentially spliced transcript. Finally, generating mouse models of Best disease will provide essential tools to investigate the pathophysiology of bestrophin in vivo. We have initiated the generation of two different mouse lineages, one deficient of Vmd2 (knock-out) and the other carrying a human disease-related mutation (Tyr227Asn) in the orthologous murine gene (knock-in). Genetic engineering of both constructs has been achieved and presently, four ES clones harboring the homologous recombination event (Vmd2+/-) have been isolated and are ready for the subsequent steps to generate chimeric animals. The resulting mouse lineages will represent two key models to elucidate the functional role of bestrophin in Best disease, in RPE development and physiology. N2 - Morbus Best (OMIM 153700) ist eine autosomal dominant vererbte Makulopathie mit juvenilem Beginn. Charakteristisch sind Eidotter-ähnliche Läsionen im zentralen Bereich der Retina. Das krankheitsverursachende Gen, das vitelliforme Makuladystrophie-Gen Typ 2 (VMD2), kodiert für ein 585 Aminosäuren langes Transmembranprotein. Das als Bestrophin bezeichnete Protein ist vorwiegend auf der basolateralen Seite des retinalen Pigmentepithels (RPE) exprimiert und wahrscheinlich am Transport von Chloridionen beteiligt. Bestrophin wie auch die drei eng-verwandten VMD2-ähnlichen Proteine (VMD2L1-L3) gehören zur Familie der VMD2 RFP-TM Proteine und sind durch putative Transmembrandomänen (TM) und ein invariantes Tripeptid (RFP) gekennzeichnet. Morbus Best wird hauptsächlich durch „missense“ Mutationen verursacht die in vier Bereichen („hotspots“) akkumulieren. Um das Mutationsspektrum zu erweitern und darüber hinaus den zugrundeliegenden molekularen Mechanismus weitergehend aufzuklären, wurde das VMD2 Gen in betroffenen Patienten untersucht. Insgesamt wurden neun bisher nicht beschriebene Mutationen identifiziert, wodurch sich die Anzahl der bekannten krankheitsassoziierten Mutationen auf 92 erhöhte. Wie die meisten der bisher bekannten Mutationen befinden sich acht „missense“ Mutationen in den sogenannten „hotspots“ des Gens. Dies unterstreicht die funktionelle bzw. strukturelle Bedeutung der betroffenen Regionen sowie den dominant-negativen Effekt der Mutationen. Bemerkenswert ist eine atypische 1-Basenpaar-Deletion (Pro260fsX288) in Exon 7. Denn erstmals wurde eine „nonsense“ Mutation im VMD2 Gen identifiziert, die 50 % nicht-funktionelles Protein zur Folge hat. In seltenen Fällen scheint daher die durch „nonsense“ Mutationen bedingte Haploinsuffizienz der Krankheit zugrunde liegen. Die molekulare Diagnostik verlangt eine zuverlässliche Einteilung der VMD2 Sequenzänderungen in pathogene und nicht-pathogene Gruppen. Da der molekulare Pathomechanismus zurzeit weitgehend ungeklärt ist, wird die Pathogenität neuer Sequenzänderungen aufgrund bereits bekannter Mutationen eingestuft. Es wurde daher eine öffentlich zugängliche VMD2 Mutationsdatenbank eingerichtet (http://www.uni-wuerzburg.de/humangenetics/vmd2.html), in der die wachsende Zahl an Mutationen, Sequenzvarianten und Polymorphismen gesammelt und verwaltet wird. „Missense“ Mutationen können die Proteinfunktion auf verschiedene Weise beeinträchtigen. Geeignete molekulare Assays wurden daher etabliert, um die funkionellen Auswirkungen der VMD2 Mutationen in Hinblick auf die intrazelluläre Lokalisation zu untersuchen. In der vorliegenden Arbeit wurde ein heterologes COS7 Expressionssystem entwickelt, es wurden verschiedene Mutationen mittels „site-directed mutagenesis“ generiert sowie Bestrophin-spezifische Antikörper hergestellt. Überraschenderweise konnte anhand von Membranfraktionierungs- und Westernblot-Analysen keine signifikanten quantitativen Unterschiede zwischen intakten und mutierten Bestrophin nachgewiesen werden. Unabhängig von Art oder Position der Mutation konnte der Einbau von mutiertem Bestrophin in die Membran gezeigt werden. Die Experimente deuten erstmalig darauf hin daß eine fehlerhafte Membranintegration als kausaler krankheitsverursachender Mechanismus ausgeschlossen werden kann. Dies liegt in Übereinstimmung mit dem dominant-negativen Effekt der Mutationen. In einem alternativen Ansatz wurde die VMD2 RFP-TM Proteinfamilie im Mausgenom identifiziert und charakterisiert. Während die Aufklärung der genomischen Struktur des Vmd2 Gens die Grundlage zur Herstellung Vmd2 transgener Mäuse darstellte (siehe unten), gewährte die Charakterisierung der eng verwandten Vmd2L1-L3 Mausgene weitere Einblicke in die Funktion des Bestrophins. Hierzu wurden bioinformatische sowie RT PCR Analysen durchgeführt. Darüber hinaus wurde die präferientielle Expression der jeweiligen Transkripte in Testis, Kolon und Skelettmuskel sowie Augengewebe anhand von „real-time quantitative“ RT PCR nachgewiesen. Interessanterweise stellt Vmd2L2 wahrscheinlich ein funktionell inaktives Pseudogen dar. Ähnlich wie sein humanes Gegenstück wird das Maus Vmd2L3- Transkript auf mRNA Ebene differentiell prozessiert. Mausmodelle für Morbus Best stellen grundlegende Hilfsmittel dar, die Pathophysiology von Bestrophin in vivo zu untersuchen. Es wurde die Herstellung zweier verschiedener Mauslinien initiiert: zum einen ein Vmd2-defizientes „knock-out“ Modell, zum anderen eine „knock-in“ Maus, die eine humane krankheitsassoziierte Mutation (Tyr227Asn) im mausorthologen Gen trägt. Die entsprechenden Konstrukte wurden hergestellt und in ES Zellen eingeschleust. Ausgehend von bislang vier isolierten ES Klonen, die den Vmd2+/- Genotyp tragen, können nun in nachfolgenden Schritten chimäre Tiere generiert werden. Die resultierenden Mauslinien repräsentieren neue experimentelle Ansätze, die funktionelle Rolle des Bestrophins in Morbus Best sowie in der Entwicklung und Physiologie des RPEs aufzukären. KW - Best-Krankheit KW - Genmutation KW - Morbus Best KW - BMD KW - VMD2 KW - Makuladegeneration KW - Mausmodell KW - Best Disease KW - BMD KW - VMD2 KW - macular degeneration KW - mouse model Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-5761 ER - TY - THES A1 - Jung, Susanne T1 - Myokardialer Ischämie- und Reperfusionsschaden bei 5-Lipoxygenase-Knockout-Mäusen T1 - Myocardial ischemia-reperfusion injury in 5-lipoxygenase-knockout-mice N2 - Leukotriene sind, neben anderen Arachidonsäuremetaboliten, wichtige Mediatoren in Entzündungsprozessen. Um ihre Rolle bei den pathophysiologischen Prozessen nach Ischämie und Reperfusion des Herzmuskels aufzuklären, wurden Wildtyp-Mäuse und 5-LOX-KO-Mäuse, die keine Leukotriene produzieren können, untersucht. Die linke vordere Herzkranzarterie wurde für 30min ligiert und 24h in vivo reperfundiert. Bei den KO-Mäusen fand sich zwar eine signifikant höhere Anzahl eingewanderter Neutrophiler im reperfundierten Gewebe, dagegen ergab sich kein signifikanter Unterschied zwischen Wildtyp- und KO-Mäusen bezüglich der resultierenden Infarktgröße und bezüglich der im Gewebe gemessenen Menge an TNF-a. Demnach lässt sich kein Einfluss der 5-Lipoxygenase-Ausschaltung auf den Entzündungsprozess nach Myokardischämie und die Entstehung eines Reperfusionsschadens feststellen. N2 - Leukotrienes are arachidonic acid derivatives that function as important mediators in inflammatory response reactions. To investigate their role in the pathophysiological processes after ischemia and reperfusion of the heart, wildtype mice and 5-LOX-KO-mice that cannot produce leukotrienes were compared using a mouse model of myocardial ischemia and reperfusion. The left anterior coronary artery was ligated for 30 minutes and then reperfused for 24 hours. This yielded no significant difference between wildtype and KO mice with regard to infarct size and amount of TNF-a measured in the heart tissue, even though there was a significantly larger number of infiltrating neutrophiles in the heart tissue of the KO mice. We conclude that there is no effect of the 5-lipoxygenase-knockout on the inflammatory response following myocardial ischemia or on the developing reperfusion injury. KW - Lipoxygenase <5-> KW - Knockout KW - Postischämiesyndrom KW - Myokardischämie KW - Mausmodell KW - Myocardial ischemia KW - lipoxygenase knockout Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-35003 ER - TY - THES A1 - Stadler, David T1 - Studien zur Inflammation und neuronalem Schaden in genetischen Modellen von progredienter Multipler Sklerose T1 - Studies in inflammation and neuronal damage in genetic models of progressive multiple sclerosis N2 - Multiple Sklerose ist eine der häufigsten neurologischen Erkrankungen, die zu motorischen, sensiblen und vegetativen Einschränkungen führt. Häufig beginnt die Erkrankung mit einem schubförmigen Verlauf, dem eine progrediente Verschlechterung folgt. Trotzdem leiden ca. 15% der Patienten bereits von Beginn an, an einer primär progressiven Variante der MS, die bereits mit der progredienten Phase beginnt. Bis jetzt ist die Pathophysiologie nicht vollständig verstanden. Lange Zeit dachte man, dass MS primär eine reine Autoimmun-Erkrankung darstellt, aber in den letzten Jahren ergab sich die Frage, ob es vor allem in den progressiven Formen, eine zytodegenerative Komponente gibt, auf die eine sekundäre Inflammation folgt. Eine mögliche Ursache stellen hier Mutationen des PLP 1 Gens dar, die normalerweise mit leukodystrophischen Erkrankungen assoziiert sind. Es gab zwei Fallberichte, in denen von Patienten berichtet wurde, die unterschiedliche Mutationen in diesem Gen hatten und den klinischen Phänotyp einer MS zeigten. Diese Arbeit sollte nun die Auswirkungen der Mutationen, beziehungsweise einer Nullmutation des PLP 1 Gens in 18- und zum Teil 12-Monate alten Mausmutanten untersuchen. Hier konnten Myelin-Veränderungen und axonaler Schaden in immunhistochemischen Untersuchungen sowie mittels Elektronenmikroskopie und optischer Kohärenztomographie gezeigt werden. Weiter konnte eine Neuroinflammation und damit einhergehend eine zunehmende Anzahl CD8+ T-Zellen sowie einer erhöhten Anzahl an Mikroglia/Makrophagen gefunden werden. Dies ging mit vergleichsweise reduzierten Leistungen der Mutanten bei der motorischen Rotarod-Analyse einher. Interessanterweise wurde weniger neuraler Schaden in den heterozygoten Varianten gefunden, obwohl das Ausmaß der Entzündung gleichblieb. Dies könnte für eine zielgerichtete immunvermittelte Schädigung der Oligodendrozyten sprechen, die zu neuronalem Schaden führt. So konnte gezeigt werden, dass es durch Punktmutationen in einem Myelinprotein-codierendem Gen zu einer sekundären Entzündung kommen kann, die mit dem klinischen Phänotyp einer progressiven MS einhergeht. Weiter sind diese Mausmodelle ein Beispiel für eine genetische Erkrankung des ZNS, in denen die Klinik maßgeblich durch die begleitende Inflammation und nicht allein durch den genetischen Schaden verursacht wird. N2 - Multiple sclerosis (MS) is one of the most common neurological diseases, leading to motor, sensory and vegetative impairment. Frequently, the disease begins as a relapsing remitting form, which is followed by a progressive stage. Nevertheless about 15% of the patients suffer under a primary progressive multiple sclerosis, which starts with the progressive stage. Until now the pathophysiology is not completely understood. For a long time, multiple sclerosis was thought to be an autoimmune disease, but in the last years the question arose if the underlying cause, especially in the progressive forms (PMS), could be a cytodegenerative component, followed by secondary inflammation. A possible candidate here could be point mutations in the PLP 1 gene, which are usually associated with leukodystrophic disorders. There were two case reports about patients carrying distinct point mutations in this gene, leading to the clinical phenotype of multiple sclerosis. This thesis examines 18- and in part 12-month-old mice, carrying these point mutations or having a Plp 1 null mutation. Here myelin alterations and axonal damage in immunohistochemical stainings could be shown, as well as in the optical coherence tomography and electron microscopy. Furthermore, the occurrence of neuroinflammation comprising recruitment of microglia/macrophages and CD8 positive T-cells could be demonstrated. Also, typical clinical symptoms in the Rotarod test were found. Interestingly, there was less neural damage found in heterozygous females than in homozygous mutant mice, while the extent of inflammation was the same. This could indicate a targeted immune-mediated injury of oligodendrocytes leading to neuronal damage. In summary, this thesis shows that a point mutation of a gene coding for a myelin protein of oligodendrocytes can lead to secondary neuroinflammation and a neurological phenotype comparable to PMS. In addition, the generated mouse models are an example for genetic diseases of the CNS, in which the clinical outcome could be driven by inflammation and not only by the primary gene mutation. KW - Multiple Sklerose KW - Maus KW - Genetik KW - Immunsystem KW - Glia KW - Sekundäre Inflammation KW - Neuroinflammation KW - Neurodegeneration KW - Mikroglia KW - Mausmodell Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-236923 ER - TY - THES A1 - Fuhl, Isabell T1 - Untersuchung der synaptischen Lokalisation des heteromeren Glycin-Rezeptors in einem neuen Mausmodell der \(Startle\) Erkrankung - mit Fokus auf die GlyR-β-Untereinheit - T1 - Investigation of the synaptic localisation of the heteromeric glycine receptor in a new mouse model of startle disease - with a focus on the GlyR-β subunit N2 - Der Glycin-Rezeptor ist Teil der inhibitorischen liganden-gesteuerten Ionenkanäle im ZNS und wird am stärksten im adulten Rückenmark sowie im Hirnstamm exprimiert. In der Nerv-Muskel-Synapse sind GlyR für die rekurrente Hemmung der Motoneuronen wichtig und steuern das Gleichgewicht zwischen Erregung und Hemmung der Muskelzellen. Für die glycinerge Neurotransmission sind neben den präsynaptischen GlyR 𝛼1 insbesondere postsynaptische GlyR 𝛼1/𝛽 verantwortlich. Durch Mutationen des GlyR entsteht das Erkrankungsbild der Hyperekplexie mit übersteigerter Schreckhaftigkeit, Muskelsteifheit und Apnoe. Hauptursächlich dafür sind Mutationen im GLRA1-Gen. Die shaky Maus stellt ein gutes Modell zur Erforschung dieser seltenen Erkrankung dar. Die shaky Missense-Mutation Q177K in der extrazellulären 𝛽8-𝛽9 Schleife der Glycin- Rezeptor-𝛼1-Untereinheit zeigte strukturell ein gestörtes Wasserstoffbrückennetzwerk. Funktionell konnten eingeschränkt leitfähige Ionenkanäle identifiziert werden. Der letale Phänotyp äußert sich beim homozygoten shaky Tier durch Schrecksymptome mit einem einhergehenden zunehmenden Gewichtsverlust. Die Quantifizierung der Oberflächenexpression deutete auf einen Verlust synaptischer GlyR 𝛼1/𝛽 hin. Aussagen bezüglich der GlyR-𝛽-Untereinheit, die Teil des synaptischen GlyR Komplexes ist, waren aufgrund fehlender stabiler Antikörper bisher nicht möglich. Das neuartige KI- Mausmodell Glrb eos exprimiert endogen fluoreszierende 𝛽 -Untereinheiten und ermöglicht damit erstmalig eine Betrachtung der GlyR- 𝛽-Expression in Tiermodellen der Startle Erkrankung. Ziel dieser Arbeit war es, die Auswirkungen der shaky Mutation auf die Interaktion mit der 𝛽 -Untereinheit und Gephyrin zu erforschen. Dafür wurden Markerproteine der glycinergen Synapse in Rückenmarksneuronen der Kreuzung Glrb eos x Glra1 sh gefärbt und quantifiziert. Die durchgeführte Gewichtsbestimmung der Nachkommen im zeitlichen Verlauf zeigte keinen Einfluss der eingefügten mEos4b-Sequenz auf das Körpergewicht der Tiere und schließt damit funktionelle Einschränkungen bedingt durch die mEos4b-Sequenz aus. Zur Verstärkung des 𝛽 eos-Signals wurde ein Antikörper verwendet. Die Quantifizierung der GlyR- 𝛽- Untereinheit an Rückenmarksneuronen zeigte für homozygote shaky Tiere im Vergleich zum Wildtyp signifikant reduzierte 𝛽eos Oberflächenexpressionen in Gephyrin Clustern sowie signifikant erniedrigte Kolokalisationen von Gephyrin/𝛼1, 𝛽eos/𝛼1 und 𝛽eos/Gephyrin. Die mutierte GlyR-𝛼1- Untereinheit wurde hingegen vermehrt an der Oberfläche in shaky Tieren exprimiert. Die Ergebnisse der Rückenmarksschnitte unterstützen diese Befunde aus den Primärneuronen. Die Untersuchung der Präsynapse erbrachte für Glrb eos/eos x Glra1 sh/sh eine signifikant verminderte Synapsin und Synapsin/𝛼1 Expression. Die Ergebnisse dieser Arbeit erweitern die Daten früherer Arbeiten zur shaky Maus und zeigen einen starken Verlust synaptischer GlyR 𝛼 1/ 𝛽 an der Oberfläche von Motoneuronen. Ein möglicher kompensatorischer Versuch durch erhöhte 𝛼1 Expression bleibt infolge der Funktionsbeeinträchtigung dieser mutierten GlyR- 𝛼 1 Rezeptoren erfolglos mit letalem Ausgang. In vorherigen Arbeiten wurde vermutet, dass die Mutation in der extrazellulären Bindungsstelle in der Lage ist, Konformationsänderungen in die TM3-TM4-Schleifenstruktur zu übertragen und dadurch die Gephyrin Bindung und synaptische Verankerung zu stören. Die Daten dieser Arbeit stützen diese Annahme und weisen darüber hinaus auf eine gestörte Rezeptorkomplexbindung hin. Die vorliegende Arbeit trägt somit zum besseren Verständnis der Startle Erkrankung auf synaptischer Ebene bei. N2 - The glycine receptor belongs to the inhibitory ligand-gated ion channels in the CNS and is most strongly expressed in the adult spinal cord and brainstem. In the nerve-muscle synapse, GlyR are important for recurrent inhibition of motor neurons and control the balance between excitation and inhibition of muscle cells. In addition to the presynaptic GlyR 𝛼1, postsynaptic GlyR 𝛼1/ 𝛽 in particular are responsible for glycinergic neurotransmission. Mutations of the GlyR lead to the clinical symptoms of hyperekplexia with excessive startle responses, muscle stiffness and apnea. The main causes are mutations in the GLRA1 gene. The shaky mouse is a good model for studying this rare disease. The shaky missense mutation Q177K, located in the extracellular 𝛽8-𝛽9 loop of the glycine receptor 𝛼1 subunit, showed a disrupted hydrogen bond network at the structural level. Functionally restricted conductive ion channels could be identified. The lethal phenotype in the homozygous shaky mouse is manifested by startle symptoms with accompanied increasing weight loss. Quantification of surface expression indicated a loss of synaptic GlyR 𝛼1/𝛽. So far, statements regarding the GlyR-𝛽-subunit which is part of the synaptic receptor complex had not been possible due to the lack of stable antibodies. The novel KI mouse model Glrb eos endogenously expresses fluorescent β-subunits and thus allows an observation of GlyR 𝛽-expression in animal models of startle disease for the first time. The aim of this study was to explore the effects of the shaky mutation on the interaction with the 𝛽-subunit and gephyrin. To this aim, marker proteins of the glycinergic synapse were stained and quantified in spinal cord neurons of Glrb eos x Glra1 sh. The performed weight determination of the littermates over time showed no influence of the inserted mEos4b-sequence on the bodyweight of the animals, thus ruling out functional limitations caused by the mEos4b-sequence. An antibody was used to amplify the 𝛽eos signal. Quantification of the GlyR-𝛽- subunit at spinal cord neurons demonstrated significantly reduced 𝛽eos surface expressions in gephyrin clusters as well as significantly decreased colocalisations of gephyrin/α1, 𝛽eos/𝛼1 and 𝛽eos/gephyrin for homozygous shaky animals compared to wild type. The mutant GlyR- 𝛼1 subunit exhibited enhanced expression at the surface in isolated spinal cord neurons from shaky animals. Results from spinal cord tissues supported these findings from primary neurons. Examination of presynapses revealed significantly decreased synapsin and synapsin/ 𝛼1 expression for Glrb eos/eos x Glra1 sh/sh. The results of this study extend the data of previous studies on the shaky mouse, showing a severe loss of synaptic GlyR 𝛼1/𝛽 at the surface of motor neurons. A potential compensatory attempt through increased α1 expression remains unsuccessful with a lethal outcome due to the functional impairment of these mutated GlyR 𝛼1 receptors. Previous studies have suggested that the mutation in the extracellular binding site is able to transduce conformational changes in the TM3-TM4 loop structure, thereby disrupting gephyrin binding and synaptic integration. The data in this study support this hypothesis and furthermore indicate a disrupted receptor complex binding. The present study thus contributes to a better understanding of Startle disease at the synaptic level. KW - Glycinrezeptor KW - glycine receptor KW - shaky mouse KW - startle disease KW - Hyperekplexie KW - Mausmodell KW - inhibitory snapse Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-348328 ER - TY - THES A1 - Löffler, Daniela Inge Martina T1 - Untersuchungen virulenzattenuierter Listeria monocytogenes Stämme als Impfstoffträger im Mausmodell T1 - Virulence-attenuated Listeria monocytogenes strains as vaccine carrier in vivo N2 - Virulenzattenuierte Stämme des Gram-positiven Pathogens Listeria monocytogenes (Lm) stellen optimale Kandidaten als Träger für heterologe Proteinantigene in die Maus dar. Lm repliziert nach Befreiung aus dem primären phagosomalen Kompartiment sehr effizient und schnell im Zytosol sehr vieler nicht-phagozytischer Wirtszellen als auch in professionellen antigenpräsentierenden Zellen (APC). Diese Fähigkeit in relevante immunologische APCs einzudringen und zu replizieren, erlaubt die zielgerichtete Übertragung heterologer Antigene in die MHC-Klasse-I- und MHC-Klasse-II-Präsentationswege, um so eine effektive zelluläre Immunität zu etablieren. In der vorliegenden Arbeit wurden die in vivo Effizienzen der Aktivierung von antigen-spezifischen CD8+ and CD4+ T-Zellen miteinander verglichen, sobald das plasmidkodierte Proteinantigen Ovalbumin (OVA) in Form von bakteriell exprimierten und exportierten Proteinen, von cDNA oder mRNA durch die jeweiligen virulenzattenuierten Lm trpS Stämme in das Zytosol von antigenpräsentierenden Zellen freigesetzt wurde. Die Freisetzung wurde durch ein Listeria-spezifisches Phagenlysin, welches von den Bakterien vorwiegend im Zytosol der Wirtszelle exprimiert wird, unterstützt. Die Übertragung dieser unterschiedlichen biologisch-aktiven Moleküle durch die autolysierenden Listerien führte im Falle des Proteins und der mRNA erfolgreich zu einer MHC-Klasse-I-Präsentation eines Ovalbumin-Peptides (SIINFEKL), welche letztendlich eine adaptive zelluläre Immunität unter Beteiligung von T-Gedächtniszellen induzierte. Dabei stellte sich die Übertragung des Proteins durch Lm als die effizienteste Strategie im Induzieren einer zellulären adaptiven Immunantwort mit gegen Ovalbumin gerichteten CD8 und CD4 T-Gedächtniszellen heraus. Autolysierende Listerien, welche die plasmidkodierende OVA-DNA übertrugen, lösten dagegen keine OVA-spezifische T-Zellantwort aus. Da sich der Trägerstamm Lm trpS aufgrund der Autolysiskassette zwar als virulenzattenuiert herausgestellt hatte, jedoch bei höher Applikationsdosis dieses Stammes es nur zu einer unvollständigen Lysis kam, wurden die jeweiligen Effizienzen weiterer noch stärker attenuierter autolysierender Lm Stämme als Überträger des Ovalbumins (Lm Mutanten trpS hlyW491A und (trpS aroA aroB)) bestimmt. Beide ermöglichten die OVA-Präsentation über MHC-Klasse-I-Moleküle mit nachfolgender klonaler Expansion spezifischer CD8+ T-Zellen in vergleichbaren signifikanten Werten zum WT Stamm trpS. Ferner wurde zum ersten Mal eine signifikante Präsentation des OVAs über MHC-Klasse-I-Moleküle durch die autolysierende Mutante trpS hlyW491A, welche die plasmidkodierende DNA freisetzte, nachgewiesen. Die autolysierende Lm (trpS aroA aroB) Mutante in hoher CFU (5107) stellte sich dabei als ein sehr vielversprechender Träger des heterologen Proteinantigens heraus, da sie im Gegensatz zum autolysierenden Stamm Lm trpS eine sehr geringe Leberschädigung hervorrief. In diesem Zusammenhang wurde festgestellt, das durch Freisetzung von OVA Antigenen in das Zytosol oder ins Phagosom von APCs, welche von den jeweiligen Lm (trpS aroA aroB) Stämmen als exportiertes, zellwandverankertes oder intrazellulär verbleibendes Protein exprimiert wurden, vergleichbare Häufigkeiten an proliferierten OVA-spezifischen CD8+ T-Zellen induzierten werden konnten. Es zeigten sich jedoch deutliche Unterschiede in der Aktivierung antigen-spezifischer CD4+ T-Zellen durch diese Lm (trpS aroA aroB) OVA-Trägerstämme. Die Strategie der Übertragung exportierter Proteine ins Phagosom oder ins Zytosol antigenpräsentierender Zellen war die wirkungsvollste, um gleichzeitig effiziente MHC-Klasse-I- und MHC-Klasse-II-restringierte Antigenpräsentationen in vivo zu induzieren. Es wurden alternative plasmidkodierende Lysiskassetten für die Freisetzung von DNA-Vakzinen (Baktofektion) aus den Bakterien konstruiert, die alle aus Lyseproteinen eines Listeria-spezifischen Phagens und einem vorangestellten zytosolischen listeriellen Promotor bestehen. Diese wurden in ihrer Effizienz mit der ursprünglich eingesetzten Lysiskassette PactA-ply118 verglichen. Dabei wurde beobachtet, dass zwei von den vier neukonstruierten Lysiskassetten in einige Zellinien vergleichbare Baktofektionsraten erzielten. Jedoch ist die ursprüngliche Phagenlysin-Kassette PactA-ply118 für die Übertragung von Plasmid-DNA in das Zytosol von Wirtszellen die wirksamste, da diese in vivo zu einer besonders hohen Attenuation der Bakterien führte. N2 - Virulence-attenuated strains of the Gram positive pathogen Listeria monocytogenes (Lm) are optimal candidates for the delivery of heterologous antigens into mammalian hosts. Lm escapes the phagosome, replicates efficiently within the cytosol of many host cells including appropriate cells of the immune system like macrophages and dendritic cells (antigen presenting cells, APCs). These natural biological properties of Lm to enter and replicate in relevant immunological APCs allow the targeted delivery of heterologous antigens into the antigen-processing pathway of MHC class I and MHC class II molecules leading to a strong cellular immunity. In this work, the in vivo efficiences of activation of antigen-specific CD8 and CD4 T cells were compared when the plasmid-encoded protein antigen ovalbumin was secreted by the bacteria as a protein or delivered as cDNA or as mRNA. Delivery was supported also by a specific endolysin produced by the bacteria. Listeriae harbouring this transcriptional unit undergo lysis when they reach the cytosol. In the case of OVA as protein or as mRNA, delivery of these different biological active molecules by autolysing Listeria resulted in significant OVA peptide (SIINFEKL) presentation in the context of MHC class I molecules, which also induced an adaptive cellular immunity with memory T cells. Secretion of OVA by the carrier bacteria yielded the strongest immune response involving OVA-specific memory CD8 and CD4 T cells. In contrast, infection with autolysing Listeria delivering OVA-encoded DNA failed to generate OVA-specific T cells. Due to its harbouring of the autolysing cassette, carrier strain Lm trpS was virulence-attenuated, but infection with 5107 bacteria of this strain resulted in a partial lysis. Therefore investigation of other attenuated and also autolysing strains (Lm mutants trpS hlyW491A and (trpS aroA aroB)) was necessary. Both these strains facilitated OVA presentation via MHC-class-I molecules resulting in clonal expansion of specific CD8+ T cells in comparable frequencies as the wild-type strain. Furthermore, autolysing Lm trpS hlyW491A delivering OVA-encoded DNA led to specific presentation of OVA in the context of MHC class I molecules. Additionally, autolysing Lm (trpS aroA aroB) strain with high infection dose (5107) is a promising carrier for heterologous protein antigens because this mutant exhibited only marginal liver toxicity in contrast to the strain Lm trpS. In this regard, comparable frequencies of proliferated OVA-specific CD8+ T cells were induced through the delivery of OVA antigens into phagosome or cytosol of APCs that were expressed as secreted proteins, as anchored-proteins or as intracellular proteins by the respective carrier Lm strains (trpS aroA aroB). Activation of antigen-specific CD4+ T cells by these OVA-carrier Lm (trpS aroA aroB) was different compared to activation of antigen-specific CD8+ T cells. Secretion of OVA by the carrier bacteria yielded the strongest activation of both MHC-class I and II restricted antigen presentation in vivo. Different lysis cassettes were tested consisting of Listeria-specific phage lysis proteins and an intracellular promoter of Listeria for the delivery of DNA vaccines (bactofection). The efficiency of these cassettes was compared to the original cassette (PactA-ply118). Two of the four new cassettes achieved comparable bactofection rates in some cell lines as the originally used cassette. However, the Lm strain containing the cassette PactA-ply118 was found to be the most effective due to high attenuation in mice. KW - Listeria monocytogenes KW - Attenuierung KW - Impfstoff KW - Maus KW - Listeria monocytogenes KW - Impfstoffe KW - Mausmodell KW - Listeria monocytogenes KW - vaccines KW - in vivo Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-18728 ER - TY - THES A1 - Gehrig, Andrea T1 - Untersuchungen zu den molekularen Ursachen der X-gebundenen juvenilen Retinoschisis - vom Gendefekt zum Mausmodell T1 - Molecular studies of X-linked juvenile Retinoschisis - from gene defect to the mouse model N2 - Hereditäre Netzhautdegenerationen betreffen weltweit etwa 15 Millionen Menschen. Sie sind klinisch und genetisch auffällig heterogen. Bisher wurden 139 verschiedene chromosomale Genorte mit Netzhautdystrophien assoziiert, wovon inzwischen 90 Gene identifiziert werden konnten. Mit Hilfe verschiedener Klonierungsstrategien konnte in der vorgelegten Arbeit ein Beitrag zur Aufklärung der genetischen Ursachen einiger ausgewählter Retinopathien geleistet werden. So konnte durch die Positionsklonierung das Gen, das mit der X-gebundenen juvenilen Retinoschisis (RS) assoziiert ist, identifiziert werden. Funktionelle Analysen des Genproduktes sowie die Generierung eines Mausmodells der RS geben einen Einblick in die Physiologie der Retina sowie den Pathomechanismus der Erkrankung. Die genomische Organisation des Interphotorezeptor-Matrixproteoglykans-1 (IMPG1) wurde aufgeklärt und die chromosomale Lokalisation auf 6q13-15 bestimmt. Damit kartierte das Gen in eine Region, in die die Genorte für 7 Retinopathien des Menschen kartiert wurden. Durch Kopplungs- und Mutationsanalysen konnten unsere Arbeiten ausschließen, daß IMPG1 mit North Carolina Makuladystrophie (MCDR1) oder der progressiven bifokalen chorioretinalen Atrophie (PBCRA) in Zusammenhang steht. Die Diacylglycerin Kinase-3 (DAGK3) konnte nach der Bestimmung der genomischen Organisation in die Region 3q27-28 kartiert werden. Dieser chromosomale Abschnitt deckt sich mit der chromosomalen Lokalisation der autosomal dominanten Optikusatrophie (OPA1). Auch hier konnte mit Hilfe von Mutationsanalysen ein Ausschluß des Gens erfolgen. Die X-gebundene juvenile Retinoschisis ist eine häufige Ursache juveniler Makula-degenerationen und betrifft etwa 300.000 junge Männer weltweit. Charakteristische Kennzeichen der Erkrankung sind Aufspaltungen in den inneren Netzhautschichten, die zu zystischen Veränderungen der zentralen Retina führen. Ungefähr 50 % der Patienten entwickeln auch periphere Manifestationen. Durch die Arbeit unserer und anderer Forschergruppen konnte der Krankheitslokus in einen etwa 900 kb großen Bereich auf dem kurzen Arm des X-Chromosoms (Xp22.2) kartiert werden. Durch einen Vergleich der genomischen DNA Sequenzen mit öffentlich zugänglichen ESTs (expressed sequence tags) konnte ein retinaspezifisches Transkript identifiziert werden. Es besteht aus 6 Exonen und kodiert für ein putatives 224 Aminosäuren großes Protein, das sekretiert wird und ein hochkonserviertes Discoidindomänen-Motiv enthält. Discoidindomänen sind in Zelladhäsion oder in Zell-Zell Interaktionen involviert. Mutationsanalysen in RS-Patienten bestätigten, daß es sich bei diesem Transkript um RS1, d.h. um das krankheitsassoziierte Gen der X-gebundenen juvenilen Retinoschisis handelte. Das RS1-Protein (Retinoschisin) kommt in homo-oligomeren Komplexen, die über Disulfidbrücken miteinander verbunden sind, auf der Zelloberfläche der Photorezeptoren und der Bipolaren sowie in den synaptischen Regionen der äußeren (OPL) und innere plexiformen Schicht (IPL) vor. Um die Funktion des normalen Retinoschisins zu untersuchen und um einen Einblick in die RS-Pathogenese zu bekommen, wurde nach der Charakterisierung des orthologen murinen Gens (Rs1h) eine Retinoschisin-defiziente knock-out Maus generiert. Ophthalmologische und histologische Untersuchungen der Rs1h-/Y-Maus zeigen signifikante Parallelen zu dem RS-Erkrankungsbild des Menschen. Damit stellt die Rs1h knock-out Maus ein ideales Tiermodell für die Untersuchung des zugrundeliegenden Krankheitsmechanismusses dar. So konnten wir inzwischen zeigen, daß apoptotische Prozesse zur Degeneration der Photorezeptoren führen. Gegenwärtig werden mit diesem Tiermodell erste gentherapeutische Versuche durchgeführt. Diese Arbeiten sollen Aufschluß darüber geben, ob ein Adeno-assoziierter Virus (AAV)-Transfer des RS1 Gens in die erkrankte Retina ein möglicher Therapieansatz für RS auch beim Menschen sein könnte. N2 - The World Health Organization (WHO) estimates that worldwide approximately 15 million people are affected with hereditary retinal degenerations. Retinal dystrophies are clinically and genetically heterogeneous. To date, 90 retinal disease genes have been identified and of 139 retinal disease genes the chromosomal location is known. In this study, different strategies of disease gene cloning were utilized to elucidate the underlying genetic defects of selected retinopathies. This has led to the identification of the gene associated with X-linked juvenile retinoschisis (RS) by positional cloning. Both, functional analysis of the gene product, named retinoschisin (RS1), and the generation of a mouse model for RS provide novel insight into retinal physiology and the pathomechanism of the disease. The genomic organization of the interphotoreceptor matrix proteoglycan-1 (IMPG1) was established and its chromosomal localization was identified (6q13-15). Seven different human retinal dystrophies have previously been mapped to this region on chromosome 6. A possible genetic association between IMPG1 and two retinal dystrophies, North Carolina macular dystrophy (MCDR1) and progressive bifocal chorioretinal atrophy (PBCRA), was investigated. By means of linkage studies and mutation analysis in affected patients the involvement of IMPG1 in these two different diseases was ruled out. The genomic organization of diacylglycerol kinase-3 (DAGK3) was determined and the gene locus was mapped to chromosome 3q27-28. The autosomal dominant optic atrophy (OPA1) was independently localized to the same chromosomal region. This has prompted us to investigate the role of DAGK3 in OPA1. By mutation analysis such a correlation could be excluded. X-linked juvenile retinoschisis is a common cause of juvenile macular degeneration affecting approximately 300.000 young males worldwide. The disease is characterized by a slitting of the inner retinal layers resulting in cystic degeneration of the central retina. Half of the patients also develop peripheral manifestations. Our laboratory and others localized the RS gene to a 900 kb interval on the short arm of chromosome Xp22.2. Comparison of genomic DNA sequences with publicly available expressed sequence tags (ESTs) have identified a retina-specific transcript. This novel transcript is composed of six exons that encode a 224-amino acid protein including a 23 amino acid signal peptide. Bioinformatical analysis revealed that the putative protein consists almost exclusively of a discoidin domain wich is highly conserved from slime mold to human. Discoidin domains are implicated in cell adhesion or cell-cell interactions. On the basis of mutation analysis in patients affected with RS, we confirmed that the gene indeed is responsible for RS pathology. The RS1 protein is found at the cell surfaces of photoreceptors and bipolar cells and within the synaptic regions of the outer (OPL) and the inner plexiform layers (IPL) most likely as a homo-oligomeric complex. To clarify the function of the normal RS1 and to gain insight into RS pathogenesis a mouse model deficient of the endogenous RS1 protein was generated. For these purposes the genomic organization of the murine orthologous RS1 gene (Rs1h) was identified. Ophthalmologic and histologic analysis of Rs1h-/Y mice revealed significant parallels to the human RS phenotyp. Therefore, the knock-out mouse represents an ideal model to further study the underlying disease mechanism. Recently, we showed that apoptosis is the final pathway of photoreceptor degeneration in Rs1h-/Y mice. Most importantly this mouse model can serve as proof-of-concept for gene therapy. Towards this end we are testing adeno-associated virus (AAV)-based gene transfer of RS1 into the defect murine retina. This may pave the way for a gene based future intervention in humans affected with this condition. KW - Maus KW - Retinoschisis KW - Erbkrankheit KW - Molekulargenetik KW - X-gebundene juvenile Retinoschisis KW - Gendefekt KW - Mausmodell KW - X-linked juvenile retinoschisis KW - gene defect KW - mouse model Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-7212 ER -