TY - THES A1 - Hermann, Stephanie T1 - Adenosindiphosphat-vermittelte Funktion und Expression von purinergen Rezeptoren in gewaschenen humanen Thrombozyten T1 - Adenosindiphosphate-mediated function and expression of purinergic receptors in washed platelets N2 - Nach der Präparation von gewaschenen Thrombozyten, einem wichtigen Ausgangsmaterial für die experimentelle Forschung oder für die Transfusionsmedizin, tritt bekannterweise ein zunehmender Verlust der ADP-vermittelten Aggregationsfähigkeit ein. Die verminderte Funktionsfähigkeit von Thromboyzten nach dem Waschvorgang kann somit auch experimentelle Ergebnisse beeinflussten. Allerdings sind die dafür verantwortlichen molekularen Mechanismen bisher nicht aufgeklärt, sodass in dieser Dissertationsarbeit molekulare sowie auch funktionelle Vorgänge untersucht wurden, die zum bekannten Phänomen des raschen Verlustes der ADP-vermittelten Aggregationsfähigkeit gewaschener Thrombozyten führen. Die Wirkung von ADP wird über die drei purinergen Rezeptoren P2Y1, P2X1 und P2Y12 vermittelt wird. Daher wurde zunächst die ADP-induzierte Aggregationsfähigkeit alleine bzw. unter Kostimulation mit Epinephrin oder Serotonin - zwei Induktoren, deren Rezeptoren mit analogen Signalwegen wie die ADP-Rezeptoren P2Y1 bzw. P2Y12 gekoppelt sind - bestimmt. Um Hinweise zu erhalten, wie die Abnahme der ADP-vermittelten Reaktivität von gewaschenen Thrombozyten mit der purinergen Rezeptorexpression und -distribution sowie mit der nachgeschalteten Signalweiterleitung im Zusammenhang steht, wurde zudem die Expression purinerger Rezeptoren auf der Thrombozytenoberfläche bzw. die Konzentration von purinergen Rezeptoren im Zytosol gewaschener Thrombozyten mittels Durchflusszytometrie bzw. ELISA gemessen. Es zeigte sich, dass die Funktion der den purinergen Rezeptoren nachgeschalteten Signalwege während der Lagerungszeit zunehmend beeinträchtigt wird, aber zumindest teilweise erhalten bleibt, wie anhand von Effekten durch Kostimulation mit den Induktoren Epinephrin und Serotonin gezeigt werden konnte. Die Distribution der Rezeptoren zwischen der Thrombozytenoberfläche und den intrazellulären Kompartimenten unterliegt komplexen Prozessen, die induktorabhängig reguliert sind. Eine initiale Zunahme der Expression von ADP-Rezeptoren während der Lagerung von gewaschenen Thrombozyten geht dabei nicht einher mit der Aufrechterhaltung der ADP-induzierten Aggregation. In der Schlussfolgerung ist die fortschreitende Degeneration der ADP-vermittelten Aggregation - neben einem Rückgang der Rezeptorexpression nach mehr als einer Stunde Lagerungszeit - vor allem auf einen funktionellen Verlust der purinergen Rezeptoren zurückzuführen. N2 - Washing of platelets is an important procedure commonly used for experimental studies, e.g. in cardiovascular research, or transfusion medicine. As a well-known phenomenon, responsiveness to adenosine diphosphate (ADP) is reduced in washed platelets. Therefore, washing of platelets may affect experimental results. The underlying molecular mechanisms of the rapid loss of ADP-mediated aggregation of washed platelets have not been thoroughly studied. Aim of this dissertation was to elucidate the molecular and functional processes of this phenomenon. ADP mediates its action via three purinergic receptors P2Y1, P2X1 and P2Y12. At first the ADP-induced aggregation of washed platelets was determined by using ADP alone or ADP combined with the stimulators epinephrine or serotonin. Both mediate their effects via the same signaling pathways as ADP but use different receptors. To get information if the reduced responsiveness to ADP in washed platelets is linked with the receptor expression and distribution, the expression and concentration of purinergic receptors on the platelet surface and in the cytosol of washed platelets was measured by using flow cytometry and ELISA. It was shown that the function of the signaling pathways downstream of the purinergic receptors was increasingly impaired during storage of washed platelets. However, it could be at least partially retained by co-stimulation with epinephrine or serotonin. The distribution of receptors between the platelet surface and the intracellular compartments is based on complex processes which are regulated depending on the different stimulators. An initial increase in the expression of ADP receptors during storage of washed platelets was not associated with the maintenance of ADP-induced aggregation. In conclusion, the progressive decrease of ADP-mediated aggregation is - next to a decrease of expression - mainly caused by functional loss of the purinergic receptors. KW - ADP KW - Aggregation KW - G-Protein gekoppelte Rezeptor KW - Purinozeptor KW - Thrombozyt KW - adenosine diphosphate KW - aggregation KW - purinergic receptors KW - g-protein-coupled receptor KW - washed platelets KW - P2Y1 KW - P2Y12 KW - P2X1 KW - ELISA KW - flow cytometry Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-185201 ER - TY - THES A1 - Dornieden, Catharina T1 - Aktivierung humaner Thrombozyten durch Streptokokken der Gruppe B: Molekulare Mechanismen und pathophysiologische Bedeutung T1 - Activation of human platelets via group B streptococci: molecular mechanism and pathophysiogical significance N2 - Infektionen mit Streptokokken der Gruppe B (GBS) sind immer noch die häufigste Ursache für early-onset Erkrankungen des Neugeborenen in den Industrieländern, die zu erhöhter neonataler Mortalität und Morbidität führen. Bereits bekannt ist, dass neben verschiedenen anderen Bakterien GBS durch die direkte Interaktion mit Thrombozyten eine Aggregation verursachen können. In dieser Arbeit wurde das Verhalten von septischen und kolonisierenden GBS-Stämmen verglichen. Es konnte gezeigt werden, dass alle GBS-Stämme eine thrombozytäre Formänderung veranlassen; jedoch führen nur von septischen Patienten isolierte Stämme zur Thrombozytenaggregation sowie zur P-Selektinexpression. Septische GBS-Stämme binden Fibrinogen auf ihrer Oberfläche und induzieren die thrombozytäre Thromboxansynthese und Granulasekretion, während kolonisierende GBS-Stämme dies nicht können. p38-mitogen-aktivierte Proteinkinase (p38-MAPK) wurde bevorzugt durch aus septischen Patienten isolierte GBS-Stämme aktiviert, ebenfalls scheint Proteinkinase C (PKC) durch diese aktiviert zu werden. Alle GBS-Stämme aktivierten Phospholipase CgammaII (PLCgammaII), Calzium-Calmodulin-abhängige Kinase II (CaMKII) und bewirken Myosinleichtketten (MLC)-Phosphorylierung über Fcgamma-Rezeptor IIA abhängige Signalwege. Es gibt weder einen Unterschied noch einen additiven Effekt zwischen der Aggregation induziert durch GBS und der Aggregation durch GBS und einer geringen Menge Adenosindiphosphat (ADP). Diese Kenntnisse der molekularen Mechanismen von GBS-induzierten Signalwegen in menschlichen Thrombozyten werden zu einem besseren Verständnis von Bakterieneffekten auf die Thrombozytenaktivierung beitragen und können deshalb neue molekulare Ziele für die pharmakologische Behandlung von GBS sein. N2 - Infections with group B streptococci (GBS) are the most common cause of early-onset sepsis of the newborn, leading to increased neonatal mortality and morbidity. It is well known that, among several other bacteria, GBS can cause an aggregation by direct interaction with platelets. The present dissertation compares the behaviour of septic and colonizing GBS strains. It is shown that, all GBS strains induce a platelet shape change; but only septic GBS strains cause platelet aggregation and P-selectin expression. Septic strains bind fibrinogen on their surface and induce synthesis of thromboxan and granula secretion, while colonizing strains cannot do this. p38 mitogen activated protein kinase (p38-MAPK) is preferentially activated by septic GBS strains, the same applies to protein kinase C (PKC). All GBS strains activate phospholipase CgammaII (PLCgammaII), calcium/calmodulin-dependent myosin kinase II (CaMKII) and cause phosphorylation of myosin light chain (MLC) by FcgammaRIIA receptor dependent signalling pathways. There is no difference between platelet aggregation of GBS and platelet aggregation of GBS and small quantities of adenosine diphosphate (ADP). This knowledge of the molecular mechanism of GBS induced signalling pathways in human platelets contributes to our understanding of the bacterial induced platelet activation and possibly offers new molecular targets of the pharmalogical treatment of GBS infections. KW - Thrombozyt KW - Streptococcus KW - Group B streptococcus KW - platelets Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-46703 ER - TY - THES A1 - Nilla, Jaya Santosh Chakravarthy T1 - An Integrated Knowledgebase and Network Analysis Applied on Platelets and Other Cell Types T1 - Integrierte Datenbank und Netzwerkanalysen zur Untersuchung von Blutplättchen und anderen Zelltypen N2 - Systems biology looks for emergent system effects from large scale assemblies of molecules and data, for instance in the human platelets. However, the computational efforts in all steps before such insights are possible can hardly be under estimated. In practice this involves numerous programming tasks, the establishment of new database systems but as well their maintenance, curation and data validation. Furthermore, network insights are only possible if strong algorithms decipher the interactions, decoding the hidden system effects. This thesis and my work are all about these challenges. To answer this requirement, an integrated platelet network, PlateletWeb, was assembled from different sources and further analyzed for signaling in a systems biological manner including multilevel data integration and visualization. PlateletWeb is an integrated network database and was established by combining the data from recent platelet proteome and transcriptome (SAGE) studies. The information on protein-protein interactions and kinase-substrate relationships extracted from bioinformatical databases as well as published literature were added to this resource. Moreover, the mass spectrometry-based platelet phosphoproteome was combined with site-specific phosphorylation/ dephosphorylation information and then enhanced with data from Phosphosite and complemented by bioinformatical sequence analysis for site-specific kinase predictions. The number of catalogued platelet proteins was increased by over 80% as compared to the previous version. The integration of annotations on kinases, protein domains, transmembrane regions, Gene Ontology, disease associations and drug targets provides ample functional tools for platelet signaling analysis. The PlateletWeb resource provides a novel systems biological workbench for the analysis of platelet signaling in the functional context of protein networks. By comprehensive exploration, over 15000 phosphorylation sites were found, out of which 2500 have the corresponding kinase associations. The network motifs were also investigated in this anucleate cell and characterize signaling modules based on integrated information on phosphorylation and protein-protein interactions. Furthermore, many algorithmic approaches have been introduced, including an exact approach (heinz) based on integer linear programming. At the same time, the concept of semantic similarities between two genes using Gene Ontology (GO) annotations has become an important basis for many analytical approaches in bioinformatics. Assuming that a higher number of semantically similar gene functional annotations reflect biologically more relevant interactions, an edge score was devised for functional network analysis. Bringing these two approaches together, the edge score, based on the GO similarity, and the node score, based on the expression of the proteins in the analyzed cell type (e.g. data from proteomic studies), the functional module as a maximum-scoring sub network in large protein-protein interaction networks was identified. This method was applied to various proteome datasets (different types of blood cells, embryonic stem cells) to identify protein modules that functionally characterize the respective cell type. This scalable method allows a smooth integration of data from various sources and retrieves biologically relevant signaling modules. N2 - Systembiologie sucht nach Systemeffekten in großflächigen Anordnungen von Molekülen und Daten, beispielsweise in menschlichen Blutplättchen. Allerdings kann der Rechenaufwand in den Schritten, die für solche Einsichten nötig sind, kaum unterschätzt werden. In der Praxis umfasst dies zahlreiche Programmieraufgaben, die Einrichtung neuer Datenbanksysteme, sowie deren Wartung, aber auch die Pflege und Validierung der vorgehaltenen Daten. Zudem sind Netzwerkeinsichten nur möglich, wenn effiziente und gute Algorithmen für versteckte Systemeffekte oder auch codierende Wechselwirkungen entschlüsseln. Diese Dissertation und meine Arbeit sind auf diese Herausforderungen konzentriert. Um diese Anforderung zu erfüllen, wurde ein integriertes Thrombozytennetzwerk, PlateletWeb, aus verschiedenen Quellen zusammengestellt und weiterhin auf Signalverarbeitung und –weitergabe einschließlich mehrstufiger Datenintegration und Visualisierung systembiologisch analysiert. PlateletWeb ist eine integrierte Netzwerkdatenbank, die durch die Kombination von Daten aus den neuesten Thrombozyten Proteom und Transkriptom (SAGE) Studien etabliert wurde. Information über Protein-Protein-Wechselwirkungen und Kinase-Substrat-Paaren wurde aus bioinformatischen Datenbanken hinzugefügt, extrahierte Daten aus der veröffentlichten Literatur ergänzten dies weiter. Darüber hinaus wurde das Blutplättchen-Phosphoproteom aufgrund von Daten aus der Massenspektroskopie mit ortsspezifischen Phosphorylierungs-/ Dephosphorylierungsdaten kombiniert. Ergänzt wurde dies um Daten aus der Datenbank Phosphosite und durch bioinformatische Sequenzanalyse unter Nutzung ortsspezifischer Kinasevorhersagen. Die Zahl der katalogisierten Thrombozytenproteine wurde im Vergleich mit der Vorversion von 2008 um mehr als 80% erhöht (beinahe Verdoppelung der Daten, insbesondere aber neue, zusätzliche Datenkategorien, z.B. über Pharmaka, Phosphorylierung, Gen-Ontologie, daneben auch weitere Validierung und Pflege der vorhandenen Daten). Die neue Integration von Annotationen für Kinasen, Proteindomänen, Transmembranregionen, Gene Ontology, Krankheitsbezüge und Azneimittelziele bietet neue, mächtige Werkzeuge für die funktionelle und systembiologische Analyse von Thrombozytensignalwegen. Die PlateletWeb Datenbank liefert eine neuartige systembiologische Werkbank zur Analyse von medizinisch relevanten Blutplättchensignalen (z.B. Plättchenaktivierung bei Thrombose, Hämostase etc.) im funktionellen Zusammenhang von Proteinnetzwerken. Durch umfassende Untersuchungen wurden über 15000 Phosphorylierungsstellen identifiziert, von denen 2500 einer Kinase zugeordnet werden konnten. Netzwerkmotive wurden auch in diesen Zellen ohne Zellkern untersucht und neue und interessante Signalmodule charakterisiert. Dies war nur durch die integrierte Information über Phosphorylierung und Protein-Protein-Wechselwirkungen möglich. Darüber hinaus wurden zahlreiche algorithmische Ansätze verwand, darunter ein exakter Ansatz zur Bayesschen Analyse von Interaktionsnetzwerken (Heinz) basierend auf linearer Integer-Programmierung. Gleichzeitig hat sich unser Konzept der semantischen Ähnlichkeiten zwischen zwei Genen basiert auf Gene Ontology (GO) Annotationen etabliert und ist eine wichtige Grundlage für viele analytische Ansätze in der Bioinformatik geworden. Unter der Annahme, dass eine höhere Anzahl von semantisch ähnlichen funktionellen Genannotationen biologisch relevantere Interaktionen reflektieren, wurde eine Bewertung der Kanten für funktionelle Netzwerkanalyse entwickelt. Die Kombination beider Ansäte, die Kantenbewertung, basierend auf der GO-Ähnlichkeit und die Netzknotenbewertung bezogen auf die Expression der Proteine ermöglichte in den analysierten Zelltypen (unter Nutzung von Daten z.B. aus Proteomstudien) die Identifizierung funktioneller Module als maximal bewertete Subnetzwerke in großen Proteinnetzwerken. Dieses Verfahren wurde an verschiedenen Proteomdatensätzen getestet (verschiedene Arten von Blutzellen, embryonale Stammzellen), um Proteinmodule zu identifizieren, die funktionell den jeweiligen Zelltyp charakterisieren. Weitere Ansätze der Methode erfassen die Analyse von quantitativen Phosphoproteom-Daten zur Identifizierung des Signalflusses in einem Kinase-Substrat Netzwerk. Diese skalierbaren Ansätze ermöglichen eine reibungslose Integration von Daten aus verschiedenen Quellen und liefern biologisch relevante Signalmodule. KW - Systembiologie KW - Netzwerkanalyse KW - Thrombozyt KW - Integrated Knowledgebase KW - Network Analysis KW - Platelets KW - Integrierte Datenbank KW - Blutplättchen Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85730 ER - TY - THES A1 - Schedler, Anette T1 - Analyse von Wirt-Pathogen-Interaktionen zur Untersuchung des Einflusses von \(Aspergillus\) \(fumigatus\) auf die Hämostase T1 - Analysis of host-pathogen interactions to investigate the influence of \(Aspergillus\) \(fumigatus\) on haemostasis N2 - Als Hämostase bezeichnet man die Gesamtheit der Reaktionen, die zu einer effektiven Blutgerinnung beitragen. Sie lässt sich in die primäre (thrombozytäre) Hämostase, in die sekundäre (plasmatische) Hämostase und in das Fibrinolysesystem einteilen. Thrombozyten, oder auch Plättchen genannt, spielen hierbei eine entscheidende Rolle. Sie binden an die durch eine Verletzung einer Blutgefäßwand freigelegten Faktoren, werden so aktiviert und aggregieren mit weiteren Thrombozyten, wodurch ein Thrombus entsteht, der die Verletzung verschließt. Zudem besitzen Thrombozyten Immunokompetenz und können mit anderen Immunzellen interagieren, über Rezeptoren Pathogene erkennen und sie direkt angreifen. Einer dieser Pathogene ist der opportunistische Pilz Aspergillus fumigatus. Dieser bildet im Verlauf seines Lebenszyklus 2,5 -3 µm kleine Konidien aus, die mit dem Wind verbreitet werden und bis tief in die Alveolen der menschlichen Lunge eingeatmet werden können. Während diese Konidien im gesunden Menschen durch das Immunsystem und andere Abwehrmechanismen eliminiert werden, können sie im immunsupprimierten Patienten, z. B. bei Patienten nach einer hämatopoietischen Stammzelltransplantation, auskeimen und verschiedene Krankheiten, sogenannte Aspergillosen, auslösen mit der Invasiven Aspergillose (IA) als schwerwiegendste Form. Diese ist assoziiert mit Gewebezerstörungen, Blutungen und Thrombenbildung am Ort der Infektion. Diese Komplikationen könnten auf einer überhöhten Immunantwort des Wirtes, auf dem mechanischen Eindringen des Pilzes in das Gewebe und die Blutgefäße oder auf einer Änderung der lokalen Hämostase durch sezernierte hydrolytische Enzyme (Proteasen) oder Sekundärmetabolite von A. fumigatus beruhen. Um diese Änderung der Hämostase im Verlauf einer IA zu analysieren, wurde der Einfluss von Morphologien (Konidien, geschwollene Konidien, Keimschläuche und Hyphen), deren Überstände, sowie von proteolytisch aktivem Überstand und von verschiedenen Sekundärmetaboliten von A. fumigatus auf die sekundäre Hämostase und die Aggregation und Aktivität von humanen Thrombozyten untersucht. Bei der Analyse der sekundären Hämostase konnte für keinen dieser eingesetzten Effektoren ein Einfluss festgestellt werden. Bei der Analyse der primären Hämostase und dem Einsatz von Morphologien und ihrer Überstände konnte für Hyphen und ihren ankonzentrierten Überstand eine aggregationssteigernde Wirkung auf Thrombozyten beobachtet werden, die möglicherweise auf Bestandteile der Zellwand von A. fumigatus, wie z. B. β-Galactosaminogalactan (GAG) zurückzuführen ist. Proteolytisch aktiver Überstand führte zu einer Aktivierung der Thrombozyten, die zum Teil auf die PrtT-abhängige proteolytische Spaltung und damit die Aktivierung der Thrombinrezeptoren PAR1 und/oder PAR4 auf der Thrombozytenoberfläche, zum Teil aber auch auf GAG zurückzuführen sein kann. Von den hier verwendeten Mykotoxinen Gliotoxin, Fumagillin, Citrinin, Verruculogen und Deoxynivalenol konnte für Gliotoxin ein negativer Einfluss auf die Thrombozytenaktivität nachgewiesen werden. Dieses Toxin inhibierte die Aggregation und die Aktivität der Thrombozyten, möglicherweise durch die Bildung von Disulfid-Brückenbindungen oder auch durch die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies. Zudem wurde im Verlauf dieser Arbeit eine direkte Interaktion von Gliotoxin mit den ADP-Rezeptoren P2Y1 und P2Y12 sowie mit dem Integrin αIIbβ3 postuliert, die so zwar nicht bestätigt, aber auch nicht vollständig wiederlegt werden konnte. Die hier dargestellten Ergebnisse zeigen deutlich zwei Wirkungen von A. fumigatus auf humane Thrombozyten: zum einen eine Aktivierung oder auch verstärkte Aggregation durch sezernierte Proteasen oder Zellwandbestandteile, zum anderen eine Hemmung durch Gliotoxin, was die bei einer IA beobachtete Thrombenbildung sowie die Blutungen erklären kann. Die Interaktion der aktivierten Thrombozyten mit den Zellen des Immunsystems sowie die zytotoxischen Eigenschaften von Gliotoxin könnten zudem für die beobachtete Gewebezerstörung verantwortlich sein. Dennoch ist weitere Forschung in diesem Gebiet unabdingbar, um die pathophysiologische Änderung der lokalen Hämostase durch A. fumigatus und seine Wirkung auf humane Thrombozyten besser zu verstehen und so eine schnellere Erkennung und Behandlung von Aspergillosen zu ermöglichen. N2 - The term haemostasis summarises the reactions that contribute to stop bleeding effectively. It can be divided into primary (thrombotic) haemostasis, secondary (plasmatic) haemostasis and fibrinolysis. Hereby platelets play an important role. Upon vascular injury platelets bind to released factors, get activated and aggregate with other platelets thereby forming a thrombus that seals the injury. Additionally, platelets possess immunocompetence: they can interact with other cells of the immune system, are able to recognise pathogens via receptors and to attack pathogens directly. One of those pathogens is the opportunistic fungus Aspergillus fumigatus. During its life cycle A. fumigatus produces 2.5 – 3 µm small conidia that are distributed by the air and that can be inhaled deep into the alveoli of the human lung. In healthy humans these conidia are eliminated by the immune system as well as other defence mechanisms. In the immunocompromised patient, e. g. patients that had a hematopoietic stem cell transplantation, the conidia can germinate and cause different diseases, named aspergilloses, with Invasive Aspergillosis (IA) as the most severe form. It is associated with tissue damages, bleedings and thrombus formations at the site of infection. These complications could be due to an over exaggerated immune response, to the mechanical infiltration into the tissue and the blood vessel by the fungus or to an alteration of the local haemostasis caused by secreted hydrolytic enzymes (proteases) or secondary metabolites of A. fumigatus. To characterise the alterations of the local haemostasis during an IA, the effect of different morphologies (conidia, swollen conidia, germ tubes and hyphae), their supernatants, as well as proteolytic active supernatant and secondary metabolites of A. fumigatus on the secondary haemostasis and the activity of human platelets was investigated. During the course of the analysis of the secondary haemostasis no influence of these effectors could be observed. In the course of the investigation of the effects of A. fumigatus on primary haemostasis using different morphologies and their supernatants, hyphae and their concentrated supernatant induced an increase of platelet aggregation. This increase might be caused by components of the cell wall of A. fumigatus, e. g. by β-Galactosaminogalactan (GAG). Proteolytic active supernatant led to an activation of thrombocytes which might be in part due to a PrtT-dependent cleavage and thereby activation of the thrombin-receptors PAR1 and/or PAR4 at the platelet surface as well as in part due to GAG. Of the secondary metabolites used (gliotoxin, fumagillin, citrinin, verruculogen and deoxynivalenol) a negative influence on the activity of the thrombocytes by gliotoxin could be observed. This toxin inhibited the aggregation and activation of thrombocytes maybe by the building of mixed disulphide bridges or by the formation of reactive oxygen species as well. Moreover a direct interaction of gliotoxin with the ADP-receptors P2Y1 and P2Y12 as well as with the integrin αIIbβ3 was postulated in the course of this study. This interaction could not be confirmed but also not disproved completely. The results presented here clearly show two effects of A. fumigatus on human thrombocytes: on one hand the activation or increased aggregation caused by secreted proteases or components of the cell wall, on the other hand the inhibition caused by gliotoxin. Those two effects might explain the bleedings and thrombus formations observed during an IA. The interaction of the activated platelets with immune cells as well as the cytotoxic properties of gliotoxin could be responsible for the tissue damages observed. Nevertheless further investigations are needed for a better understanding of the pathophysiological alteration of the local haemostasis by A. fumigatus and its influence on human thrombocytes to enable a faster identification and treatment of aspergilloses. KW - Aspergillus fumigatus KW - Aspergillose KW - Thrombozyt KW - Interaktion Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-152512 ER - TY - THES A1 - Poppe, Heiko Anton T1 - Bestimmung der Substrat- und Inhibitorspezifität von Phosphodiesterasen mittels Mikrokaloriemetrie T1 - Phosphodiesterase activity and specificity measured using microcalorimetry N2 - Neben den cAMP- und cGMP-abhängigen Proteinkinasen (PKA bzw. PKG) sind als zyklonukleotid-regulierte Effektorproteine die Ionenkanäle CNG1-4, der "guanine nucleotide exhange factor“ Epac sowie die zyklonukleotid-spaltende Familie der Phosphodiesterasen (PDEs) von Bedeutung. Industriell synthetisierte cGMP- und cAMP-Analoga besitzen zwar meist eine hohe Affinität für ihr Zielprotein, über ihre Hydrolysestabilität gegenüber PDEs in der Zelle ist jedoch wenig bekannt. In dieser Arbeit wurden die kinetischen Konstanten von elf der am häufigsten genutzten cAMP-und cGMP-Analoga an verschiedenen Vertretern der PDE-Familien mittels Mikrokaloriemetrie bestimmt. Zudem konnte in den Messungen der inhibitorisch Effekt hydrolysestabiler Derivate auf die PDEs qualitativ und quantitativ ermittelt werden kann. Die Ergebnisse zeigen, dass Phosphodiesterasen in der Lage sind, auch chemisch modifizierte Analogsubstanzen der Cyclonukleotide cAMP und cGMP zu hydrolysieren. Hydrolysestabile Derivate dagegen entwickeln häufig inhibitorische Wirkung auf die PDEs und verursachen dadurch Veränderungen der intrazellulären cAMP und cGMP Konzentrationen. So vermag z. B. die Epac-spezifische Substanz Sp-8-pCPT-2’-O-Me-cAMPS in den in vitro Experimenten die PDEs mit ki-Werten im einstelligen mikromolaren Bereich zu inhibieren. In mit Sp-8-pCPT-2’-O-Me-cAMPS stimulierten Thrombozyten steigt als Folge dieser PDE-Hemmung die cGMP Konzentration in der Zelle an und man beobachtet eine als Folge eine PKG-vermittelte Phosphorylierung des Substratproteins VASP – eine unerwünschte Nebenreaktion. Die erhobenen Daten lassen außerdem Rückschlüsse auf den Inhibitionsmechanismus zu. Einige Analoga inhibieren die cGMP-bindenden GAF-Domänen in den PDEs 2A, 5A, 6cone und 10A sowie die PDE 4D3 nach dem linear-mixed-Typ und beeinflussen daher, neben der katalytischen Aktivität, vermutlich auch regulatorische Zentren dieser Enzyme. Zusammenfassend erleichtern die erhobenen Daten Wissenschaftlern die Auswahl des für ihre Fragestellung am besten geeigneten Derivates. N2 - cAMP and cGMP are critical second messengers that regulate multiple targets including different cAMP/cGMP-dependent protein kinases (PKA/PKGs), exchange proteins directly activated by cAMP (Epacs), phosphodiesterases (PDEs) and cyclic nucleotide-gated ion channels (CNGs). Second and third generation cyclic nucleotide analogs are widely used to elucidate specificity of cellular signaling, mediated by these target proteins. However, the selectivity and stability of these analogs need to be fully understood in order to properly interpret results and rigorously assess the mechanisms by which these analogs work in the cell. To better understand the selectivity and cross-reactivity of these analogs I measured the activation or inhibitory activity of 13 commonly-used cyclic nucleotide analogs 8 different PDEs. To measure their stability to hydrolysis I utilized isothermal microcalorimetry, a method that allows to evaluate whether or not an analog can function as a substrate or inhibitor for PDEs. I demonstrate that indeed some of these analogs can be hydrolyzed by multiple PDEs and others are competitive inhibitors. Herein I provide Ki data for all of the non-hydrolyzable analogs and Km and Vmax values for all of the hydrolyzable analogs. Each of these values, as well as their mode of inhibition can be determined in a single experiment. The data strongly implied that several of these analogs might, in addition to their primary effects, also cause elevation of cAMP or cGMP indirectly by inhibiting PDEs in the cell. Such an effect could of course cloud interpretation of the use of these analogs. Similarly, those that are PDE substrates also might have their duration of action substantially reduced. To illustrate this point we show that Sp-8-pCPT-2’-O-Me-cAMPS, a highly specific non-hydrolyzable Epac activator in vitro, can under certain conditions enhance cGMP/PKG and cAMP/PKA signaling pathways in intact platelets. Specifically we found enhanced VASP phosphorylation at both PKA and PKG phosphorylation sites after the addition of Sp-8-pCPT-2’-O-Me-cAMPS. These data indicate that this “selective Epac activator” is able to indirectly activate the cAMP/PKA and cGMP/PKG signalling pathways presumably through inhibition of platelet PDE5 and/or PDE3. The data together allow to provide recommendations for how best to probe the different cyclic nucleotide signalling pathways using cyclic nucleotide analogs. In summary, the data provide evidence that most cAMP and cGMP analogs have multiple targets. Therefore, interpretation of any effects these analogs have in cells should take into consideration their possible cross-target reactivities. KW - Cyclisches Nucleotid Phosphodiesterase <3 KW - 5-> KW - Proteinkinase A KW - Hydrolyse KW - Mikrokalorimetrie KW - Cyclo-GMP KW - Cyclo-GMP-Derivate KW - Dissoziationskonstante KW - Enzymkinetik KW - Inhibition KW - Cyclo-AMP KW - Signaltransduktion KW - Thrombozyt KW - Immunoblot KW - Stickst KW - Proteinkinase G KW - Adenylatcyclase KW - Epac KW - Linear Mixed Inhibition KW - GAF Domaine KW - Proteinkinase G KW - Adenylylcyclase KW - Epac KW - Linear mixed inhibition KW - Gaf domaine Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-34477 ER - TY - THES A1 - Schwarz, Ulrike T1 - Biochemische und Molekularbiologische Charakterisierung der Wechselwirkungen zwischen Humanen Thrombozyten und Endothelzellen T1 - Biochemical and Molecular Characterization of Interactions Between Human Platelets and Endothelial Cells N2 - Der Blutkreislauf ist als wichtigstes Transportsystem im menschlichen Körper essentiell für die Versorgung der Gewebe und Organe mit Sauerstoff, Nährstoffen, Hormonen etc. Zwei Zelltypen, die eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung eines funktionell intakten Blutgefäßsystems spielen, sind Thrombozyten, die zentralen Mediatoren der Blutgerinnung, und Endothelzellen, welche die luminale Seite der Gefäßwände auskleiden. Diese beiden Zellen sind aber auch wesentlich an der Pathologie der Atherosklerose und kardiovaskulärer Erkrankungen beteiligt. Durch direkte und indirekte Interaktionen beeinflussen sich diese beiden Zelltypen gegenseitig und regulieren ihre Aktivität. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Analysenmethode entwickelt, welche den Funktionszustand der Thrombozyten quantitativ erfaßt. Sowohl die Aktivierung als auch die Hemmung humaner Thrombozyten wird durch die Phosphorylierung spezifischer Signalproteine reguliert. Basierend auf der Verwendung phosphorylierungsspezifischer Antikörper und der Durchflußzytometrie wurde eine Methode etabliert, welche die Proteinphosphorylierung auf Einzelzellebene erfaßt, schnell quantifizierbare Ergebnisse liefert und für die Analyse im Vollblut geeignet ist. Da die Sekretion von Endothelfaktoren den Phosphorylierungszustand dieser Proteine in den Thrombozyten beeinflußt, kann die Methode auch dazu verwendet werden, indirekt Rückschlüsse auf den Funktionszustand der Endothelzellen zu gewinnen. In einer ersten klinischen Anwendung wurde die Methode eingesetzt, um den Therapieverlauf der antithrombotischen Medikamente Ticlopidin und Clopidogrel, welche gezielt die ADP-induzierte Thrombozytenaktivierung hemmen, zu verfolgen und das Antwortverhalten von Patienten auf diese Medikamente zu messen. Mehrere Personen, bei denen Ticlopidin und Clopidogrel keine Wirkung zeigten, wurden gefunden, ein Hinweis darauf, daß eine Resistenz gegen Thienopyridine vorkommt. Es ist bekannt, daß Endothelfaktoren bestimmte Aspekte der Thrombozytenaktivierung hemmen. In dieser Arbeit wurde gezeigt, daß die Phosphorylierung der p38 und p42 Mitogen-aktivierten Proteinkinasen, die im Verlauf der Thrombozytenaktivierung von zahlreichen Agonisten induziert wird, ebenfalls durch die endothelialen Vasodilatatoren NO (Stickstoffmonoxid) und Prostaglandin gehemmt wurde. Außerdem hemmten diese Substanzen die Translokation der inflammatorischen Moleküle P-Selektin und CD40 Ligand (CD40L) aus intrazellulären Speicherorganellen auf die Thrombozytenoberfläche. P-Selektin und CD40L werden auf aktivierten Thrombozyten exprimiert und sind direkt an der Interaktion von Thrombozyten mit Leukozyten und Endothelzellen beteiligt. Um die Auswirkung von CD40L, P-Selektin und weiteren Faktoren aktivierter Thrombozyten auf humane Endothelzellen zu untersuchen, wurde mit Hilfe von cDNA-Arrays die differentielle Genexpression in Endothelzellen nach Koinkubation mit aktivierten Thrombozyten analysiert. Neben einer bereits bekannten Hochregulierung von Faktoren, die an inflammatorischen Prozessen beteiligt sind, wurde eine verstärkte Expression von Transkriptionsfaktoren (c-Jun, Egr1, CREB2), Wachstumsfaktoren (PDGF) sowie von Adhäsionsrezeptoren für extrazelluläre Matrixproteine (Integrin av, Integrin b1) gefunden. Diese Faktoren weisen darauf hin, daß aktivierte Thrombozyten die Migration und Proliferation der Endothelzellen anregen und damit die Wundheilung, aber auch pathophysiologische Prozesse wie die Ausbildung atherosklerotischer Plaques induzieren könnten. N2 - The blood circulation is the human body's main transport system and is essential for supplying tissues and organs with oxygen, nutrients, hormones, etc. Blood platelets, the central mediators of coagulation, and endothelial cells which line the inner wall of blood vessels, play important roles in the maintenance of functionally intact blood vessels. On the other hand, these cells also participate in the pathogenesis of atherosclerosis and cardiovascular diseases. These two cell types mutually influence each other and regulate their activity via direct and indirect interactions. In this work, a method which allows quantitative analysis of platelet function was developed. Platelet activation and inhibition is regulated by phosphorylation of specific signaling proteins. Based on the use of phosphorylation-specific antibodies and flow cytometry, a method was established which measures protein phosphorylation in single cells, gives fast and quantitative results, and is also suitable for analysis of whole blood samples. Since secretion of endothelial cell factors influences the phosphorylation state of these proteins, the method may also be used to get indirect information about the functional integrity of endothelial cells. In a first clinical application, this method was used to monitor the progression of a therapy with the anti-thrombotic drugs ticlopidine and clopidogrel which selectively inhibit ADP-induced platelet activation, and to determine the patients' responsiveness to these drugs. Several non-responders were identified, indicating the existence of a thienopyridine resistance. Endothelial cell factors are known to inhibit different aspects of platelet activation. In this work, phosphorylation of platelet p38 and p42 mitogen-activated protein kinases, which is induced by various platelet activators, was found to be inhibited by the endothelium-derived vasodilators nitric oxide (NO) and prostacyclin. Furthermore, these endothelial cell factors inhibited translocation of the inflammatory molecules P-selectin and CD40 ligand (CD40L) from intracellular granules to the platelet surface membrane. P-selectin and CD40L are expressed on activated platelets and are directly involved in the interaction of platelets with leukocytes and endothelial cells. To study effects of P-selectin, CD40L, and other parameters of activated platelets on human endothelial cells, cDNA Arrays were used to analyze differential gene expression in endothelial cells after coincubation with activated platelets. Besides the already known up-regulation of certain inflammatory factors, a number of additional genes which belong mainly to the group of transcription factors (c-Jun, Egr1, CREB2) and growth factors (PDGF) and of adhesion receptors for extracellular matrix proteins (integrin av, integrin b1) was found to be up-regulated by activated platelets. Expression of these genes indicates that activated platelets may induce migration and proliferation of endothelial cells and thereby initiate wound healing, but may also have pathophysiological effects like the development of atherosclerotic plaques. KW - Thrombozyt KW - Endothelzelle KW - Genexpression KW - Phosphorylierung KW - Signaltransduktion KW - Thrombozyten KW - Endothelzellen KW - Durchflußzytometrie KW - Proteinphosphorylierung KW - Signaltransduktion KW - Genexpression KW - cDNA-Arrays KW - Atherosklerose KW - platelets KW - endothelial cells KW - flow cytometry KW - protein phosphorylation KW - signal transduction KW - gene expression KW - cDNA arrays KW - atherosclerosis Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-2030 ER - TY - THES A1 - Gotru, Sanjeev Kiran T1 - Cation Homeostasis in Platelets T1 - Kationen-Homöostase in Thrombozyten N2 - Divalent cations are important second messengers triggering various signal transduction events in platelets. Whereas calcium channel blockers have an established antithrombotic effect and the regulation of Ca2+ homeostasis has been elucidated in platelets, the molecular regulation of Mg2+ and Zn2+ homeostasis has not been investigated so far. In the first part of the thesis, the role of -type serine-threonine kinase linked to transient receptor potential cation channel, subfamily M, member 7 (TRPM7) in platelets was investigated. Using Trpm7R/R mice with a point mutation deleting the kinase activity, we showed that the TRPM7 kinase regulates platelet activation via immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM), hem(ITAM) and protease-activated receptor (PAR) signaling routes. Furthermore, Trpm7R/R mice were protected from in vivo thrombosis and stroke, thus establishing TRPM7 kinase as a promising anti-thrombotic target. In the second part of the thesis, the role of TRPM7 channel in a megakaryocyte (MK) and platelet-specific knockout mouse, Trpm7fl/fl-Pf4Cre, was investigated. Here, we observed that depending on the type of stimulation, Trpm7fl/fl-Pf4Cre platelets showed either enhanced or inhibited responses. Although Trpm7fl/fl-Pf4Cre mice were thrombocytopenic, no differences to wildtype mice were observed in models of in vivo thrombosis and stroke. The above two studies highlight that inhibition of TRPM7 kinase but not the channel itself (in MKs and platelets) may be a promising anti-thrombotic strategy. Besides TRPM7, we investigated the role of magnesium transporter 1 (MAGT1) in platelet Mg2+ homeostasis and found that MAGT1 primarily regulates receptor-operated calcium entry (ROCE) in platelets specifically upon GPVI activation. This physiological crosstalk is triggered by protein kinase C (PKC) isoforms. Platelets from Magt1-/y mice hyper-reacted to GPVI and thromboxane A2 (TXA2) receptor stimulation in vitro. Consequently, Magt1-/y platelets were found to be pro-thrombotic in disease models of thrombosis and stroke. To compare platelet ITAM-signaling to the immune system, we further investigated the role of MAGT1 in T and B cells. We described the primary role of MAGT1 in mice under pathogen-free conditions. Magt1-/y B cells showed dysregulated Mg2+ and Ca2+ homeostasis upon B-cell receptor activation, thereby altering Syk, LAT, phospholipase C (PLC)2 and PKC phosphorylation. In contrast to human MAGT1-deficient T cells, development and effector functions of mouse Magt1-/y T cells showed no alterations. Finally, in the last part of the thesis, we described methods to measure intracellular free zinc [Zn2+]i in human and mouse platelets with storage pool disease (SPD). We propose to measure the [Zn2+]i status in SPD platelets as a relatively easy diagnostic to screen platelet granule abnormalities. N2 - Zweiwertige Kationen sind wichtige sekundäre Botenstoffe, welche verschiedene Signaltransduktionsereignisse in Thrombozyten initiieren. Zwar wurde die Regulation der Ca2+Homöostase in Blutplättchen bereits aufgeklärt und der Einsatz von Calciumkanalblockern zur antithrombotischen Therapie ausführlich diskutiert, die molekulareRegulation der Mg2+und Zn2+Homöostase in Thrombozyten und Megakaryozyten (MK) wurdebisher jedoch nicht untersucht.Im ersten Teil dieser Thesis wurde die Rolle der -Typ Serin-Threonin Kinase des transienten Rezeptortyp Kation Kanals, Unterfamilie M, 7 (TRPM7) in Thrombozyten untersucht. Unter Verwendung von Trpm7R/RMäusen mit einer Punktmutation in der Kinasedomäne, welche die Aktivität der Kinase blockiert, konnten wir zeigen, dass die TRPM7-Kinase die Thrombozytenaktivierung über Immunorezeptor-Tyrosin-basierte Aktivierungsmotive (ITAM), Hem(ITAM) und Protease-aktivierte Rezeptoren (PAR) reguliert. Trpm7R/RMäuse waren vor in vivoThrombose und Schlaganfall geschützt, was die TRPM7 Kinase als vielversprechendes antithrombotisches Zielprotein etabliert.Im zweiten Teil wurde die Rolle des TRPM7 Kanals in einer Megakaryozyten (MK)-und Plättchen-spezifischen Knockout Maus(Trpm7fl/fl-Pf4Cre) untersucht. Wir konnten zeigen, dass Trpm7fl/fl-Pf4CrePlättchen je nach Art der Stimulation entweder erhöhte oder verminderte Reaktionen zeigten. Obwohl Trpm7fl/fl-Pf4Cre-Mäuse thrombozytopen waren, wurden keine Unterschiede in in vivoThrombosemodellen und Schlaganfall beobachtet. Diese Studien heben hervor, dass die Hemmung der TRPM7 Kinase, aber nicht die des Kanal selbst (inMKs und Plättchen), eine vielversprechende anti-thrombotische Therapie sein könnte. Neben TRPM7 untersuchten wir die Rolle von Magnesium Transporter 1 (MAGT1)in der Mg2+-Homöostase in Thrombozyten und konnten zeigen, dass MAGT1 primär den Rezeptor-gesteuerten Calciuminflux (ROCE) spezifisch nach GPVI Aktivierung reguliert. Dieser physiologische Crosstalk wird durch Proteinkinase C (PKC) Isoformen vermittelt. Thrombozyten von Magt1-/yMäusen reagierten in vitrohyperreaktiv auf GPVI und ThromboxanA2(TXA2) Rezeptor Stimulation. Dementsprechend konnte auch gezeigt werden, dass Magt1-/yPlättchen in Modellen von Thrombose und Schlaganfall pro-thrombotisch wirkten.Um die ITAM-Signalübertragung in Thrombozyten mit der in T und B Zellen zu vergleichen, untersuchten wir die Rolle von MAGT1 in Immunzellen. Wir überprüften die Rolle von MAGT1 in Mäusen unter pathogen-freien Bedingungen. Magt1-/yB Zellen zeigten eine dysregulierte Mg2+und Ca2+Homöostase nach Aktivierung des B Zell Rezeptors, wodurch Syk, LAT, PLCγ2 und PKC Phosphorylierung beeinflusst wurde. Im Gegensatz zu menschlichen MAGT1-defizienten T Zellen, zeigten Magt1-/yT Zellen keine Veränderungen in Entwicklung und Effektorfunktion. Schließlich beschrieben wir im letzten Teil der Arbeit Methoden zur Messung des intrazellulären freien Zinks [Zn2+]iin humanen und murinen Thrombozyten mit Storage-Pool-Defekt (SPD). Wir unterbreiten in dieser Thesis, den [Zn2+]iStatus in SPD Thrombozyten zu messenum nachAnomalien in den Thrombozyten-Granula zu suchen. KW - Thrombozyt KW - Kationen-Homöostase KW - Homöostase KW - Cation Homeostasis KW - Platelets Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-176616 ER - TY - THES A1 - Rabie, Tamer T1 - Cellular regulation of platelet glycoprotein VI : in vivo and in vitro studies in mice T1 - Zelluläre Regulation von Plättchen Glykoprotein VI : in vivo und in vitro Studien in der Maus N2 - Platelet interaction with the subendothelium is essential to limit blood loss after tissue injury. However, upon rupture of atherosclerotic plaques, this interaction may result in blood vessel occlusion leading to life threatening diseases such as myocardial infarction or stroke. Among the subendothelial matrix proteins, collagen is considered to be the most thrombogenic component as it directly activates platelets. Platelets interact with collagen, either indirectly through glycoprotein (GP) Ib-V-IX receptor complex, or directly through the major collagen receptor on the platelet surface, GPVI. The work presented here focused on studying the cellular regulation of GPVI. In addition, a possible role for GPVI in thrombus formation induced by atherosclerotic plaque material was investigated and it was found that GPVI plays an important role in this process. Using a recently published mitochondrial injury model, it was found that GPVI contains a cleavage site for a platelet-expressed metalloproteinase. Further studies showed that platelet activation by CRP, or thrombin induced down-regulation of GPIb, but not GPVI. In parallel, cellular regulation of GPV was studied and it was found that GPV is cleaved in vitro by the metalloproteinase ADAM17. In previous studies it was shown that injection of mice with the anti-GPVI mAb, JAQ1, induces GPVI down-regulation, which is associated with a strong, but transient, thrombocytopenia. Using new anti-GPVI mAbs, which bind different epitopes on the receptor, it is shown in this study that GPVI down-regulation occurs in an epitope-independent manner. Further experiments showed that antibody treatment induces a transient, but significant increase in bleeding time. Using different genetically modified mice, it is shown that, upon antibody injection, GPVI is both, shed from the platelet surface and internalized into the platelet. Signaling through the immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM) of the FcR chain is essential for both processes, while LAT and PLC2 are essential for the shedding process only. Antibody-induced increase in bleeding time and thrombocytopenia were absent in LAT deficient mice, showing that it is possible to uncouple the associated side effects from the down-regulation process. As antibody-induced GPVI internalization still occurs in LAT and PLC2 deficient mice, this suggests a novel signaling pathway downstream of GPVI that has not been described so far. N2 - Plättchen Interaktion mit dem Subendothel ist für die Blutstillung essentiell. Dies kann jedoch nach dem Aufbrechen atherosklerotischer Plaques zu lebensbedrohlicher Erkrankungen wie Infarkt oder Schlaganfall führen. Kollagen, welches die Plättchen dirket aktiviert, ist der thrombogenste Bestandteil der Extrazellularmatrix (EZM). Die Bindung zwischen Plättchen und Kollagen wird sowohl indirekt durch den Glykoprotein (GP) Ib-V-IX Rezeptorkomplex, als auch direkt durch den Kollagenrezeptor GPVI, auf der Plättchenoberfläche vermittelt. In der vorliegenden Arbeit wurde die zelluläre Regulation von GPVI untersucht. Des Weiteren wurde die Rolle von GPVI in durch atheroklerotisches Plaquematerial induzierter Thrombusbildung studiert. Hierbei wurde festgestellt, dass GPVI eine wichtige Funktion in diesem Prozess spielt. Mittels eines jüngst publizierten mitochondrialen Verletzungsmodels, konnte gezeigt werden, dass GPVI eine Erkennungsstelle für eine in den Plättchen exprimierte Metalloproteinase besitzt. Mehrere Versuche haben gezeigt, dass Plättchenaktivierung durch CRP, und Thrombin zur Runterregulierung von GPIb aber nicht von GPVI führt. Parallellaufende Untersuchungen zeigten, dass GPV durch die Metalloproteinase ADAM17 in vitro abgespalten wird. Vorherige Studien ergaben, dass die in vivo Behandlung von Mäusen mit dem anti-GPVI Antikörper, JAQ1, zur Runterregulierung des Rezeptors führt. Dieses ist mit einer starken, transienten Thrombozytopenie assoziiert. Mittels neu generierte anti-GPVI Antikörper (JAQ2, 3), die unterschiedliche Bindungsstellen auf GPVI erkennen, konnte demonstriert werden, dass die Antikörper vermittele GPVI Runterregulierung Epitop unabhängig ist. Weitere Untersuchungen ergaben, dass Anitkörperinjektion eine transiente Erhöhung der Blutungszeit verursacht. Mittels genetisch modifizierter Mäuse konnte dargestellt werden, dass die Antikörpergabe GPVI sowohl von der Plättchenoberfläche abgespalten, als auch internalisiert wird. Während die Signaltransduktion durch das ITAM Motif der FcR Kette essentiell für beide Prozesse ist, sind LAT und PLC2 nur für das Abspalten wichtig. Antikörper induzierte Erhöhung der Blutungszeit und Thrombozytopenie sind abwesend in LAT-defizienten Mäuse, was zeigt, dass möglicherweise die GPVI Runterregulierung von den assoziierten Nebenwirkungen zu trennen ist. Da die GPVI Runterregulierung in LAT und –PLC2 defizienten Mäusen weiterhin stattfindet, zeigt dies einen neuen GPVI Signalweg, der bisher noch nicht beschrieben wurde. KW - Maus KW - Thrombozyt KW - Glykoproteine KW - Regulation KW - Biologie KW - Plättchen KW - Maus KW - Thrombose KW - Kardiovaskulär KW - maus KW - platelets KW - thrombosis KW - cardiovascular Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-14267 ER - TY - THES A1 - Heidenreich, Julius Frederik T1 - Characterization of the widely used Rac1-inhibitors NSC23766 and EHT1864 in mouse platelets T1 - Untersuchung der Rac1-Inhibitoren NSC23766 und EHT1864 in murinen Thrombozyten N2 - Platelet activation and aggregation at sites of vascular injury is critical to prevent excessive blood loss, but may also lead to life-threatening ischemic diseases, such as myocardial infarction and stroke. Extracellular agonists induce platelet activation by stimulation of platelet membrane receptors. Signal transduction results in reorganization of the cytoskeleton, shape change, platelet adhesion and aggregation, cumulating in thrombus formation. Several Rho GTPases, including Rac1, Cdc42 and RhoA, are essential mediators of subsequent intracellular transduction of ITAM- and GPCR-signaling. Therefore, inhibition or knockout can result in severely defective platelet signaling. Mice with platelet specific Rac1-deficiency are protected from arterial thrombosis. This benefit highlights further investigation of Rac1-specific functions and its potential as a new pharmacological target for prevention of cardiovascular diseases. Two newly developed synthetic compounds, NSC23766 and EHT1864, were proposed to provide highly specific inhibition of Rac1 activity, but both drugs have never been tested in Rac1-deficient cell systems to rule out potential Rac1-independent effects. This study revealed significant off-target effects of NSC23766 and EHT1864 that occurred in a dose-dependent fashion in both wild-type and Rac1-deficient platelets. Both inhibitors individually affected resting platelets after treatment, either by altering membrane protein expression (NSC23766) or by a marked decrease of platelet viability (EHT1864). Platelet apoptosis could be confirmed by enhanced levels of phosphatidylserine exposure and decreased mitochondrial membrane potential. Phosphorylation studies of the major effector proteins of Rac1 revealed that NSC23766 and EHT1864 abolish PAK1/PAK2 activation independently of Rac1 in wild-type and knockout platelets, which may contribute to the observed off-target effects. Additionally, this study demonstrated the involvement of Rac1 in G protein-coupled receptor-mediated platelet activation and GPIb-induced signaling. Furthermore, the data revealed that Rac1 is dispensable in the process of integrin IIb 3-mediated clot retraction. This study unveiled that new pharmacological approaches in antithrombotic therapy with Rac1 as molecular target have to be designed carefully in order to obtain high specificity and minimize potential off-target effects. N2 - Die Aktivierung und Aggregation von Thrombozyten nach Gefäßverletzungen ist entscheidend um starken Blutverlust zu vermeiden. Allerdings können diese Prozesse auch zu lebensbedrohlichen ischämischen Erkrankungen führen, wie beispielsweise Myokardinfarkt und Schlaganfall. Die Stimulation der Membranrezeptoren durch Triggersubstanzen leitet die Thrombozytenaktivierung und somit die Reorganisation des Zytoskeletts ein. Dies ermöglicht die Adhäsion und Aggregation der Thrombozyten und führt letztendlich zur Thrombusbildung. Die Rho GTPasen Rac1, Cdc42 und RhoA sind als wichtige Mediatoren an der intrazellulären Signaltransduktion beteiligt. Eine medikamentöse Hemmung oder ein genetischer Knockout kann daher die intrazellulären Signalkaskaden so stark beeinträchtigen, dass eine effiziente Aktivierung der Thrombozyten nicht mehr möglich ist. In Mäusen mit thrombozytenspezifischem Knockout von Rac1 wurde festgestellt, dass der Funktionsverlust von Rac1 gleichzeitig auch Schutz vor der Entwicklung von arterieller Thrombose bedeutet. Könnte man sich diese Tatsache pharmakologisch zunutze machen, würde die Hemmung von Rac1 möglicherweise einen neuen, erfolgsversprechenden Ansatz in der Prävention von kardiovaskulären Erkrankungen darstellen. Für den Forschungseinsatz wurden die zwei synthetischen Inhibitoren NSC23766 und EHT1864 entwickelt um Rac1-vermittelte Funktionen zu studieren. Beide Substanzen versprechen eine hochspezifische Hemmung der Rac(1)-Aktivität, wurden bisher jedoch nicht in Zellsystemen mit Rac1-Defizienz verwendet um die Substanzen kritisch auf mögliche, unerwünschte Nebenwirkungen zu untersuchen. In dieser Dissertation wurde gezeigt, dass NSC23766 und EHT1864 zwar effektive Hemmstoffe für Rac1 sind, allerdings genauso Rac1-unabhängige Nebenwirkungen verursachen. Beide Hemmstoffe führten zu Veränderungen der Thrombozyten: Während unter NSC23766 eine verminderte Expression von Membranrezeptoren beobachtet wurde, führte EHT1864 zu einer stark beeinträchtigten Vitalität der Thrombozyten. Anhand von erhöhten Phosphatidylserin-Werten und einer Veränderung des mitochondrialen Membranpotenzials in den behandelten Thrombozyten konnte die EHT1864-vermittelte Apoptose nachgewiesen werden. Letztendlich wurde anhand der verminderten Phosphorylierung von PAK1/PAK2 gezeigt, dass die Aktivierung dieser Rac1-Effektorproteine durch NSC23766 und EHT1864 direkt unterdrückt wird. Zusätzlich zu den Inhibitor-vermittelten Effekten wurde anhand von Rac1-defizienten Thrombozyten nachgewiesen, dass Rac1 auch an GPCR- und GPIb-vermittelten Signalkaskaden beteiligt ist. Außerdem wurde beobachtet, dass Rac1 für die Integrin IIb 3-vermittelte clot retraction entbehrlich ist. Die Ergebnisse dieser Studie legen dar, dass neue pharmakologische Substanzen für die antithrombotische Therapie mit Rac1 als Zielmolekül gründlich erforscht und hinterfragt werden müssen um die Spezifität zu maximieren und vor allem das Nebenwirkungsprofil zu minimieren. KW - Thrombozyt KW - Thrombose KW - Signaltransduktion KW - Enzyminhibitor KW - Rho-Proteine KW - mouse platelets KW - rac1 inhibitors Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-165453 ER - TY - THES A1 - Kramer, Daniel T1 - Das Phosphatidylinositol-Transfer-Protein PITPnm2 in humanen Thrombozyten T1 - The phosphatidylinositol-transfer-protein PITPnm2 in human platelets N2 - Die Analyse des Phosphoproteoms in ruhenden und in aktivierten humanen Plättchen führte zur Identifikation des PITPnm2-Proteins. Dieses Protein wird bei einer Stimulation von Thrombozyten mit dem Prostazyklinanalogon Iloprost phosphoryliert. Diese Ergebnisse gaben Anlass zu weiteren Untersuchungen zum Vorkommen und zur Funktion dieses Proteins in Thrombozyten. In der Arbeit wurde gezeigt, dass das PITPnm2-Protein das einzige Protein der PITP-Familie ist, welches in humanen Thrombozyten exprimiert wird. Die membranassoziierten Phosphatidylinositol-Transfer-Proteine PITPnm1 und PITPnm3 sind auf cDNA-Ebene nicht in Thrombozyten nachweisbar. Von den drei zur Zeit der Untersuchung bekannten Splicevarianten des PITPnm2-Proteins konnten zwei Varianten in Thrombozyten mittels RT-PCR identifiziert werden. Diese zwei Varianten unterscheiden sich durch ein unterschiedlich exprimiertes Exon, welches im zentralen Teil des Proteins liegt. Ein weiteres Spliceprodukt, dem die Aminosäuren 50 bis 328 im vorderen Teil des Proteins fehlen, wird nicht in Thrombozyten exprimiert. PITPNM2 (Splicevariante 1) wurde als Fusionsprotein mit einem sogenannten „Flag-Tag“ kloniert und in Eukaryonten exprimiert (pCMV-SC-CF, Stratagene). Mit dem rekombinanten Fusionsprotein wurden gegen PITPnm2 gerichtete Antikörper getestet. Der Vergleich mit Flag-Tag-spezifischen Antikörpern zeigte, dass der PITPnm2-spezifische Antikörper zahlreiche Banden detektiert und für weitere Untersuchungen nicht geeignet ist. Dieser PITPnm2-Klon wird auch in weiterführenden Arbeiten eingesetzt werden, die sich mit der Identifizierung der Interaktionspartner dieses Proteins, der subzellulären Lokalisierung und der Teilnahme des Proteins an spezifischen Zell-Signalwegen beschäftigen werden. N2 - In order to gain a deeper insight into the function of platelets the protein composition of both resting and activated human thrombocytes was characterized by using mass spectrometry. One of the identified proteins is the phosphatidylinositol transfer protein PITPnm2. The treatment of platelets by the platelet inhibitor prostacyclin leads to a phosphorylation of the PITPnm2 protein. These results gave rise to further investigations regarding both the occurrence and the function of this protein in human thrombocytes. The phosphatidylinositol transfer proteins are a protein family including the three proteins PITPnm1, PITPnm2, PITPnm3. RT-PCR analysis demonstrated that only the PITPnm2 protein of the PITP-family is expressed in platelets. At the time of investigation, three different splice products of the PITPnm2 protein are described. Two of these three splice products are expressed in platelets at the RNA level. These two splice variants differ in the expression of a variable spliced exon in the central part of the protein. The third splice variant shows the same sequence as the first, however the amino acids 50-328 at the N-terminus of the protein are missing. Cloning and expression of flag-tagged PITPnm2 (pCMV-SC-CF, Stratagene) allowed testing of PITPnm2-specific antibodies. In comparison with flag-tag specific antibodies, PITPnm2-specific antibodies showed numerous unspecific crossreactions and are not suitable for further experiments. The expression clone of PITPnm2 will be very useful for further investigations regarding both the different interaction partners of the PITPnm2 protein and the involvement of the PITPnm2 protein in different signalling cascades. KW - Thrombozyt KW - Inosite KW - Phosphatidylinositol Transfer Proteine KW - PITPnm2 KW - NIR3 KW - phosphatidylinsoitol transfer protein KW - platelets KW - PITPnm2 KW - NIR3 Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-76638 ER - TY - THES A1 - Schüpferling, Anne Marie Heidi T1 - Der Einfluss der Proteasomhemmung durch Bortezomib auf die Aktivierbarkeit humaner Thrombozyten T1 - The role of proteasom activity for activating signaling in human platelets N2 - Bortezomib, ein selektiver und potenter Proteasominhibitor, wird experimentell in der Tumorzellforschung sowie therapeutisch in der Therapie des Multiplen Myeloms eingesetzt. Die Wirkung auf die Thrombozytenfunktion war bislang unzureichend untersucht. Daher evaluiert diese Studie die dosisabhängige Wirkung von Bortezomib auf die Viabilität, die Aggregation von gewaschenen Thrombozyten und auf aktivierende Signalwege in gewaschenen Thrombozyten. Die Thrombozytenviabilität war bei hohen Bortezomibkonzentrationen von 100 - 200 µM vermindert. Passend dazu verminderten 100 - 200 µM Bortezomib die Phosphorylierung der ERK1/2 und der Akt/PKB in humanen Thrombozyten. Im Gegensatz dazu hatten diese hohen Bortezomibkonzentrationen keinen Einfluss auf das Niveau der p38 MAP Kinase-Phosphorylierung in aktivierten Thrombozyten. Die Thrombozytenaggregation, induziert durch hohe Konzentrationen von Kollagen oder TRAP-6, blieb unter 0,1 nM - 200 µM Bortezomib unverändert. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Bortezomib weder die essenziellen, aktivierenden Signalwege noch die Initialisierung der Aggregation relevant beeinflusst. Das zeigt, dass diese Prozesse in Thrombozyten nicht abhängig von der Proteasomaktivität sind. Supramaximale Inhibierung des Proteasomsystems mit Bortezomibkonzentrationen von 100 µM oder mehr führen möglicherweise zu veränderter Thrombozytenreaktionsfähigkeit, welche unter Umständen durch unspezifische und potenziell toxische Effekte mit erniedrigter Zellviabilität verursacht werden. N2 - Bortezomib, a selective and potent proteasome inhibitor, is used experimentally in tumor cell research and therapeutically in the treatment of multiple myeloma. Its effect on platelet function has been insufficiently studied. Therefore, this study evaluates the dose-dependent effects of bortezomib on viability, aggregation of washed platelets and activating signaling pathways in washed platelets. Platelet viability was tampered after incubation with high bortezomib concentrations of 100 - 200 µM. Fittingly, 100 - 200 µM bortezomib decreased phosphorylation of ERK1/2 and Akt/PKB in human platelets. In contrast, these high concentrations of bortezomib had no effect on the level of p38 MAP kinase phosphorylation in activated platelets. Furthermore platelet aggregation induced by high concentrations of collagen or TRAP-6 remained unchanged under the influence 0.1 nM - 200 µM bortezomib. In conclusion, bortezomib does not relevantly affect essential activating signaling pathways or the initialization of aggregation. This indicates that these processes in platelets are not dependent on proteasome activity. Supramaximal inhibition of the proteasome system with bortezomib concentrations of 100 µM or above may lead to altered platelet responsiveness, which may be accompanied by nonspecific and potentially toxic effects associated with decreasing cell viability. KW - Thrombozyt KW - Proteasom KW - Bortezomib KW - Thrombozytenaggregation KW - Thrombozyten KW - Proteasomsystem KW - Thrombozytenaktivierung KW - Viabilität KW - Proteasomhemmung Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-327551 ER - TY - THES A1 - Rauchfuß, Steffen T1 - Der Einfluss des Insulins auf die Thrombozyten und auf die Wechselwirkung zwischen den Blutplättchen und dem Endothel T1 - The Effect of Insulin on Platelets and on Platelet-Endothelium Interactions N2 - Unter physiologischen Bedingungen spielen die Thrombozyten oder Blutplättchen eine zentrale Rolle bei der Erhaltung der Hämostase. Indem sie in Blutgefäßen beschädigte Bereiche erkennen und sich dort gezielt anheften können, verhindern sie das Austreten von Blut in subendotheliale Bereiche und halten eine Blutung gering. Intrazelluläre Signalmoleküle kontrollieren das Zusammenspiel der Plättchenagonisten und der dazugehörigen Rezeptoren und regulieren somit die Aktivierung der Blutplättchen. Verschiedene vorangegangene Publikationen demonstrierten sowohl aktivierende als auch inhibierende Effekte des Insulins auf die Aktivierung, Adhäsion und Aggregation der Blutplättchen. Diese durch das Insulin hervorgerufenen Effekte sollen hauptsächlich über den cGMP und cAMP Signalweg sowie über die Aktivierung von eNOS durch Insulin in den Blutplättchen wirken. Unsere Forschungsergebnisse weisen darauf hin, daß ein akuter, durch das Insulin hervorgerufener Effekt auf die Blutplättchen sowohl unter physiologischen wie auch unter pathologischen Glukosekonzentrationen nicht nachweisbar ist. Insulin zeigte keine Wirkung auf die intrazellulären Signalmoleküle PKB, VASP, P38 und ERK, welche in der Aktivierung/Hemmung der Blutplättchen eine wichtige Rolle spielen. Gleichfalls blieb eine Wirkung auf die Aggregation der Blutplättchen und Aktivierung des Oberflächenrezeptors Integrin αIIbβ3 sowie die Expression von P-Selektin auf der Oberfläche der Thrombozyten nach der Stimulation durch Insulin aus. Auch konnte der Insulinrezeptor durch uns auf der Oberfläche der Thrombozyten weder in seiner unphosphorylierten, noch in seiner phosphorylierten Form nach der Stimulation mit Insulin nachgewiesen werden. Zusammen mit dem Fehlen eines direkten, akuten Insulin-abhängigen Effekts auf die Thrombozyten läßt dies auf das Fehlen eines funktionell aktiven Insulinrezeptors auf der Oberfläche der Thrombozyten schließen. Wir konnten zeigen, daß eNOS in den Blutplättchen nicht vorhanden und damit seine in anderen Publikationen beschriebene Aktivierung durch Insulin in den Thrombozyten nicht gegeben ist. Der von uns und in anderen Publikationen verwendete Antikörper gegen phospho-eNOS erkennt vielmehr ein anderes Protein gleicher Größe, wie wir im Kontrollexperiment mit eNOS-/- knockout Mäusen zeigen konnten. Im Flußkammerexperiment konnte ein indirekter insulinabhängiger Effekt auf die Adhäsion der Thrombozyten an das Endothel und ihre Bildung von Aggregaten beobachtet werden. Die Gabe von pathologischen Insulinmengen führte zu einem Anstieg der NO Sekretion durch das Endothel, welches hemmend auf die Adhäsion und Aggregation der Thrombozyten wirkte. N2 - Under physiologic conditions platelets play a central role in upholding the haemostasis. By recognizing lesions in the vessel walls and attachment to those areas they prevent an influx of blood into subendothelial areas. Intracellular molecules mediate the interaction of platelet agonists and their receptors and therefore control platelet activation. Several previous publications demonstrated enhancing as well as inhibiting effects by insulin on platelet activation, adhesion and aggregation. These insulin- mediated effects are reported to act via the cGMP and cAMP pathway as well as the activation of eNOS by insulin in platelets. Our findings show that there is no acute insulin dependent effect on platelet function under physiologic and pathologic glucose levels. Insulin showed no effect on the phosphorylation of intracellular markers of platelet activation like PKB, VASP, P38 und ERK. Furthermore an effect on platelet aggregation and the activation of the platelet surface receptor integrin αIIbβ3 and the expression of P-Selectin on the platelet surface after insulin stimulation was also not detectable. Expression of the IR was not detectable in platelets which agrees with our other data that insulin-stimulation did not trigger IR phosphorylation or activation of any insulin-induced downstream signalling pathways in platelets including eNOS, PKB, ERK, and p-38 MAPK. These data indicate that either there is no functionally active IR expressed in platelets or that the copy number of IR proteins is too low to activate downstream signalling systems like PKB and MAPK. We could also show that eNOS is not present in platelets and that its activation by insulin, postulated in previous publications, is therefore not given. The antibody which we employed and which was also used in other publications against phospho-eNOS recognizes another protein of the same size, which we could demonstrate in a control experiment with eNOS-/- knock out mice. However, we could detect an indirect insulin dependent effect on platelet endothel adhesion and aggregation in our flow chamber experiments. The insulin induced increase of endothelial NO caused a significant decrease of platelet adhesion to the endothelial cells. KW - Thrombozyt KW - Insulin KW - Insulinrezeptor KW - Diabetes mellitus KW - Endothel Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-28432 ER - TY - THES A1 - Flierl, Ulrike T1 - Einfluss der chronischen Aktivierung der Guanylatcyclase auf die Regulation der Thrombozytenaktivität bei Diabetes mellitus T1 - Influence of chronic activation of soluble guanylyl cyclase on platelet activation in diabetes N2 - Die vorliegende Arbeit beschreibt die günstigen Auswirkungen der chronischen Aktivierung der löslichen Guanylatcyclase durch HMR 1766 auf die Regulation der Thrombozytenaktivität im experimentellen Diabetes mellitus. Es konnte die zugrunde liegende Hypothese eines aktivierten Zustands von Thrombozyten im Diabetes bestätigt und darüber hinaus die Reversibilität dieser Aktivierung durch medikamentöse, direkte, NO-unabhängige, chronische Stimulation der sGC, dem Schlüsselenzym zur Vermittlung endogener NO-Wirkung, gezeigt werden. Hierzu wurden mit Hilfe durchflusszytometrischer Bestimmungen in frisch entnommenem Vollblut verschiedene thrombozytäre Marker analysiert. Zum einen deuteten die Ergebnisse auf eine verminderte NO-Bioverfügbarkeit beziehungsweise eine verringerte Aktivität des Effektorenzyms im Diabetes und eine gesteigerte Aktivität des Enzyms bei HMR 1766-behandelten Versuchstieren hin, zum anderen konnte ein Rückgang der Expression thrombozytärer Aktivierungsparameter in Richtung des Niveaus gesunder Kontrollen bei Thrombozyten der Tiere gezeigt werden, die den GC-Aktivator erhielten. Darüber hinaus stellte sich eine verminderte Aktivierbarkeit auf externe Stimuli bei in vitro Versuchen in Vollblut als auch in PRP heraus. Bei aggregometrischen Untersuchungen mit PRP zeigte sich eine verminderte Aggregation als Reaktion auf Fractalkine-Inkubation und anschließende direkte Stimulation mit ADP bei dem Material HMR 1766 behandelter Tiere. Zur Untersuchung von Akut-Effekten der Substanz wurden Proben gesunder beziehungsweise diabetischer Tiere teils direkt mit dem Medikament inkubiert, und es wurde einmalig medikamentös behandelten Tieren Blut entnommen. Hier stellte sich eine verminderte ADP-induzierte Aggregation bei behandelten Proben heraus, zudem zeigten sich positive Akut-Effekte hinsichtlich der basalen als auch der mit einem NO-Donor stimulierten VASP-Phosphorylierung. Bei der Betrachtung hämatologischer und metabolischer Parameter fiel bei sonst unauffälligen Ergebnissen das MPV auf, das im Diabetes erhöht, nach Behandlung mit dem GC-Aktivator jedoch wieder auf Kontrollwerte reduziert war. Die vielversprechenden Ergebnisse könnten ein Schritt zur Etablierung dieser Substanz als zukünftiges Medikament zur Prävention beziehungsweise Behandlung kardiovaskulärer Komplikationen bei Diabetes sein. N2 - Platelet activation significantly contributes to cardiovascular morbidity and mortality in diabetes. An association between impaired NO-mediated platelet inhibition and platelet activation has recently been demonstrated in experimental diabetes. Guanylyl cyclase activation enhances the reduced signaling via the NO/cGMP pathway. Chronic treatment with HMR1766 enhanced NO/cGMP-mediated signaling in platelets from diabetic rats determined by in vivo phosphorylation of platelet vasodilator-stimulated phosphoprotein (VASP) at Ser157 and Ser239. In parallel, platelet-binding of fibrinogen, surface-expression of P-selectin, appearance of platelet-derived microparticles, and platelet-aggregates with other blood cells were significantly reduced by chronic treatment with HMR1766. CONCLUSIONS: Chronic activation of soluble guanylyl cyclase in diabetic rats improved markers of platelet activation and is a rationale approach for prevention of adverse cardiovascular events in diabetes. KW - Guanylatcyclase KW - Diabetes mellitus KW - Thrombozyt KW - platelet KW - diabetes KW - guanylyl cyclase Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-38541 ER - TY - THES A1 - Neumüller, Jutta T1 - Einfluss der Langzeittherapie mit dem Endocannabinoid-Rezeptorblocker Rimonabant auf Thrombozytenaktivierung und proinflammatorische Chemokine bei Diabetes T1 - Influence of long-term therapy with cannabinoid receptor-1 antagonist Rimonabant on thrombocytes and proinflammatoric chemokines in diabetes N2 - Die Volkskrankheit Adipositas zieht eine Reihe von kostenträchtigen Komplikationen mit sich wie z. B. Diabetes mellitus Typ 2 und kardiovaskuläre Erkrankungen. Der Endocannabinoidblocker Rimonabant ist hierbei ein viel versprechendes Medikament, mit dem nicht nur die Adipositas an sich, sondern zusätzlich auch ihre weit reichenden Komplikationen im kardiovaskulären Bereich reduziert werden können. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnten an Hand 6 Monate alter diabetischer Ratten, welche für 10 Wochen mit Rimonabant behandelt wurden, aufgezeigt werden, dass Rimonabant auf verschiedenste Weise die Initialphase der Atherogenese positiv beeinflusst. Zum einen konnte die Anzahl der zirkulierenden Monozyten signifikant vermindert und auch die für die initiale Rekrutierung von Thrombozyten und Monozyten wichtigen Chemokine RANTES und MCP-1 reduziert werden. Zum anderen zeigten sich positive Effekte auf das Lipidprofil der Probanden. Ein besonderes Augenmerk lag auf dem Aktivitätszustand der Thrombozyten: Mit Rimonabant wurde sowohl die thrombozytäre Aktivierung minimiert als auch ein positiver Einfluss auf die Thrombozytenadhäsion und -aggregation bestätigt. Folglich reduziert Rimonabant das kardiovaskuläre Risiko, indem es die pro-inflammatorischen und pro-atherosklerotischen Kaskaden vermindert. N2 - 6 month old obese Zucker rats were fed with cannabinoid receptor-1 antagonist rimonabant for 10 weeks. We demonstrate positive modulation of circulating monocyte numbers, reduced platelet activation and lower RANTES and MCP-1 levels by Rimonbant in Zucker rats. This may potentially contribute to a reduction of cardiovascular risk. KW - Diabetes mellitus KW - Chemokine KW - RANTES KW - Thrombozyt KW - Fettsucht KW - Endocannabinoide KW - MCP-1 KW - Rimonabant KW - Rezeptorblocker KW - Atherosklerose KW - diabetes KW - rimonabant KW - platelets KW - chemokines Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-55045 ER - TY - THES A1 - Hartmann, Erik Kristoffer T1 - Einfluss von Wachstumsfaktoren auf die ventrale Spondylodese T1 - Influence of growth factors on the anterior spondylodesis N2 - Thrombozyten enthalten und sezernieren eine Vielzahl von Wachstumfaktoren, deren Mitwirkung an der Knochenbildung und –regeneration als gesichert gilt. Platelet-rich plasma (PRP) enthält eine hohe Thrombozytenkonzentration und somit auch dementsprechend hohe Spiegel von Wachstumsfaktoren. Ziel dieser Arbeit war eine Evaluation des Einflusses von PRP auf die Qualität und Quantität der interkorporellen knöchernen Fusion im Rahmen der ventralen Spondylodese von Wirbelkörperverletzungen mit Cage-Implantaten und autologer Spongiosa. In einer prospektiven Studie wurden 15 Patienten mit traumatischer Fraktur der BWS oder LWS ventral mit einem Cage-Implantat und autologer Spongiosa stabilisiert. Indikationsabhängig wurden additiv dorsale Fixateur interne und/oder ventrale Plattensysteme implantiert. Intraoperativ erfolgte die Kombination der autologen Spongiosa mit PRP. Dieses wurde direkt perioperativ aus max. 110 ml venösem Eigenblut des Patienten mit dem kommerziell erhältlichen GPS™-System (Biomet Deutschland GmbH, Berlin) hergestellt. Als Kontrollgruppe fungiert ein zufällig ausgewähltes Kollektiv von 20 Patienten mit traumtischer BWS- oder LWS-Fraktur. Diese wurden ebenfalls ventral mit Cage und autologer Spongiosa sowie zusätzlichen Implantaten stabilisiert, jedoch ohne den Einsatz von PRP. Im Rahmen der Nachbehandlung wurden nach durchschnittlich 8,33 Monaten (PRP-Gruppe) und 12,5 Monaten (Kontrolle) Computertomographien der instrumentierten Wirbelsäulenregion im Knochenfenster angefertigt. Anhand dieser wurde der Fusionsfortschritt exemplarisch für den linkslateralen Auftragungsbereich von Spongiosa bzw. Spongiosa/PRP um den Cage qualtitativ und quantifizierend mittles Volumetrie und Densitometrie (HU) erfasst. Es zeigte sich qualtitaiv bei 20% der PRP-Gruppe sowie 30% der Kontrollgruppe keine oder nur minimale linkslaterale Verknöcherung. Jeweils 40% wurden als durchgehend fusioniert klassifiziert. Quantifizierend ergab sich für beide Gruppen ein nahezu identischer mittlerer Volumenanteil > +100 HU (56,5 bzw. 56,6%) am linkslateralen Gesamtvolumen. Der Volumenanteil > +500 HU beträgt in der Kontrollgruppe 23,57% in der PRP-Gruppe hingegen 29,33%. Die absolute Dichte der Teilvolumina zeigt einen signifikant höheren Durchschnitsswert in der PRP-Gruppe (639,7 HU zu 514,2 HU) sowie nicht signifikant höhere Werte im Teilvolumen > +500 HU (930,7 HU zu 846 HU). Aus den VAS-Scores konnte für den gewählten Nachuntersuchungzeitraum kein signifikanter Unterschied im subjektiven, patientenbezogenen Outcome festgestellt werden. Insgesamt zeigt sich ein Trend, demnach der Einsatz von PRP eine Verbesserung der autologen Spongiosaplastik und damit der Verknöcherung um den Cage ermöglicht. Der bei Etablierung des Konzepts thrombozytärer Wachtsumsfaktoren-konzentrate zur Verbesserung der Knochenheilung erhoffte deutliche, klinische Effekt bleibt jedoch aus. N2 - The effects of PRP were monitored by performing a controlled cohort study of patients undergoing an anterior spinal fusion. One group was treated with the addition of PRP. The growth factors contained within the blood platelets are known to play an important role in the new formation of bone following fractures or the implantation of bone grafts. But the results following the use of platelet-rich plasma in spinal fusion are not yet published. The study involved a group of 15 patients, who had suffered an injury of the thoracic or lumbar spine and had undergone an anterior fusion using cages. They had received an additional posterior stabilisation and/or anterior implants as well as bone graft combined with PRP. A control group made up of 20 patients received a similar treatment, but without the addition of PRP. A CT-Scan was performed of all patients during follow-up examinations. The area on the left side of the cage, where the bone graft with or without PRP had been applied, was analysed and the patients were divided into three classes, depending upon the rate of fusion: Complete fusion, incomplete fusion and no/minimal ossification. In cases, which were classified as complete or incomplete ossification, an additional CT volumetry and densitometry was performed. The patient-referred outcome was documented using the VAS spinal score. In both groups 40% of the patients had reached a complete fusion in the CT-Scans. No or minimal fusion was documented in 20% of the PRP group and 30% of the control group. When measuring the density within the newly formed bone mass, both groups showed nearly identical percentages with a density of over 100 Hounsfield units (HU). The share of bone with a density of over+500 HU was 29.33% in the PRP group) and 23.57% in the control group. Within the partition of over +100 HU the absolute density was significantly higher in the PRP group (639.7 vs. 514.2 HU). Similar results could be shown within the partition of over +500 HU (930.7 vs. 846 HU). The VAS-Scores showed no significant differences between the two groups. The additional application of autologous PRP involves very little risk for the patients. The study implies, that the use of PRP provides a faster fusion and higher density values within the fusion mass. A clear advancement in spinal fusion in terms of a clinical benefit remains questionable. KW - Wirbelsäulenverletzung KW - Computertomographie KW - Spondylodese KW - Platelet-derived Growth Factor KW - Transforming Growth Factor beta KW - Thrombozyt KW - Wirbelsäulenverletzung KW - ventrale Spondylodese KW - autologes thrombozytenreiches Plasma KW - Computertomographie KW - spinal injury KW - anterior spondylodesis KW - autologous platelet-rich plasma KW - computer tomography Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-28933 ER - TY - THES A1 - Rieger, Reinhard T1 - Einflussfaktoren auf die Thrombozytenregeneration nach Hochdosischemotherapie und autologer Stammzelltransplantation - Untersuchung anhand multipler Regressionsanalysen T1 - Influencing factors for the recovery of the platelet count after high-dose therapy and autologous stem cell transplantation - Study based on multiple regression analyses N2 - Das Verfahren der Hochdosischemotherapie mit nachfolgender autologer Stammzelltransplantation ist eine etablierte, gut untersuchte Therapieoption in der Behandlung hämatoonkologischer Erkrankungen. Die sich dabei entwickelnde Thrombozytopenie stellt einen der therapielimitierenden Faktoren dar, wobei sich hier große interindividuelle Unterschiede zeigen. Das Ziel dieser Arbeit war es, mögliche Einflussfaktoren auf die Regeneration der Thrombozytenzahlen nach Hochdosistherapie und autologer Transplantation zu untersuchen. Hierzu erfolgte eine retrospektive Untersuchung von 110 Patientendaten, die von 1994 bis 2003 an der Medizinischen Klinik und Poliklinik II des Universitätsklinikums behandelt wurden. Die Thrombozytenzahlen wurden vier Wochen, drei Monate und sechs Monate nach Transplantation dokumentiert, außerdem wurde die Dauer in Tagen bis zu dem Erreichen der beiden Thrombozytenschwellenwerte 10.000/µl und 20.000/µl untersucht. An potentiellen Einflussfaktoren gingen das Alter zum Zeitpunkt der Transplantation, der body mass index zum Zeitpunkt der Transplantation, das Geschlecht, das Vorhandensein einer vorausgegangenen Ganzkörperbestrahlung, das Vorhandensein einer Antibiotikagabe aufgrund einer transplantationsassoziierten Infektion, die Aplasiedauer, die Anzahl der transfundierten CD34+-Zellen, die Anzahl der transfundierten colony forming units (CFUs), die Anzahl der transfundierten blood forming units (BFUs), das Vorliegen eines Rezidivs und der Thrombozytenausgangswert vor Hochdosistherapie in die Analyse ein. An statistischen Testverfahren wurde der Mann-Whitney-U-Test, der Kruskal-Wallis-Test und der Korrelationskoeffizient nach Spearman verwendet, bei nachgewiesenem potentiellen Zusammenhang erfolgte eine Quantifizierung mittels multipler Regressionsanalysen. Anhand der beiden nichtparametrischen Testverfahren und der Bestimmung des Korrelationskoeffizienten nach Spearman konnte gezeigt werden, dass für die Parameter „Ausgangswert der Thrombozyten vor Hochdosistherapie“, „Dauer der Aplasie“ und „Vorliegen einer Ganzkörperbestrahlung“ ein systematischer Zusammenhang zu den Thrombozytenwerten nach vier Wochen, drei Monaten bzw. sechs Monaten vorliegt. An den beiden Schwellenwerten „Dauer bis Thrombozytenzahl 10.000/µl“ und „Dauer bis Thrombozytenzahl 20.000/µl“ galt das für die Variablen „Dauer der Aplasie“, „Vorhandensein einer Antibiotikatherapie“ und „Geschlecht“. Für die restlichen Parameter konnte keine signifikante Korrelation zu den Thrombozytenzahlen gezeigt werden, was insbesondere für Anzahl der transfundierten CD34+-Zellen, CFUs bzw. BFUs überraschte und anhand klinischer Vorüberlegungen nicht zu erwarten war. Mit Hilfe der oben genannten Parameter, für die ein nichtzufälliger Zusammenhang zu den Thrombozytenzahlen gezeigt werden konnte, erfolgten zu den drei Messpunkten und den zwei Schwellenwerten separate multiple Regressionsanalysen. Im Ergebnis konnten fünf Gleichungen formuliert werden, die, nach Einsetzen der Prädiktoren „Dauer der Aplasie“, „Thrombozytenausgangswert vor Transplantation“ und „Geschlecht“ eine Prognose der Thrombozytenzahlen zu den entsprechenden Zeitpunkten und Zielwerten ermöglichen. Ein möglicher klinischer Einsatz dieser Ergebnisse wäre die Identifikation von Risiko- und Hochrisikogruppen im Vorfeld einer Hochdosischemotherapie und autologer Stammzelltransplantation anhand prognostizierter Thrombozytenwerte. Dies würde ein angepasstes therapeutisches und diagnostisches Vorgehen ermöglichen, wodurch die Sicherheit des Verfahrens und der Krankheitsverlauf verbessert werden könnten. N2 - The protocol of high-dose chemotherapy with autologous stem cell transplantation is an approved and established option in the treatment of haematological malignancies. The developing thrombocytopenia is one of the limiting factors of this therapy, but there are large interindividual differences. The purpose of this study was to identify possible factors of influence for the recovery of the platelet count after high-dose therapy and autologous stem cell transplantation. In order to do this we did a retrospective study that analyses the data of 110 patients, who were treated by the department of medical clinic II of the University Hospital in Würzburg in the years 1994 to 2003. The platelet counts were documented four weeks, three months and six months after the autologous transplantation. Furthermore the duration of time taken for the platelet count of 10.000/µl and 20.000/µl was reviewed. The following parameters were used as potential predictors: age at the time of transplantation, body mass index at the time of transplantation, gender, previous total body irradiation, antibiotics given because of transplantation-associated infections, duration of aplasia, number of transfused CD34+-cells, number of transfused colony forming units (CFUs), number of transfused blood forming units (BFUs), relapse, and the platelet count before high-dose therapy. For the statistical evaluation the Mann-Whitney-U-Test, the Kruskal-Wallis-Test and Spearman´s rank correlation coefficient were used. The quantification of proved correlation was done by multiple regression analyses. The results of the two nonparametric tests and Spearman´s correlation coefficient showed that there was a systematic correlation for the parameters “platelet count before high-dose therapy”, “duration of aplasia” and “previous total body irradiation” to the platelet count after four weeks, three months and six months. There were also significant correlations to the two thresholds “duration until platelet count 10.000/µl” and “duration until platelet count 20.000/µl” for the variables “duration of aplasia”, “antibiotics because of associated infections” and “gender”. The remaining parameters were tested negative. This was surprising under clinical considerations, especially for the numbers of transfused CD34+-cells, CFUs and BFUs. The above mentioned significant, non-random parameters were used for the multiple regression analyses, one analysis for each of the three measurement points and the two thresholds. In the result there were five equations, which allow you to predict the platelet counts at the measurement points and thresholds. You only have to know and insert the duration of aplasia, the gender and the platelet count before high-dose therapy. A possible clinical application of predicted platelet counts could be the identification of risk and high risk groups before the application of high-dose therapy with autologous transplantation. Adjusted therapeutic and diagnostic procedures could improve the safety of the protocol with a possible positive effect on the course of the disease. KW - Regeneration KW - Thrombozyt KW - Blutstammzelle KW - Stammzelle KW - Autogene Transplantation KW - Hochdosischemotherapie KW - Regressionsanalyse KW - Multiple Regression KW - Einflussfaktoren KW - Thromboyztenregeneration KW - CFU KW - BFU KW - influencing factors KW - recovery KW - platelet count KW - high-dose chemotherapy KW - autologous stem cell transplantation Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-76288 ER - TY - THES A1 - Pachel, Christina Elisabeth T1 - Entzündliche Faktoren und Blutplättchen im experimentellen myokardialen ischämischen Schaden T1 - Inflammatory factors and blood platelets in experimental myocardial ischemic injury N2 - Die erfolgreiche therapeutische Beeinflussung pathophysiologischer Prozesse im Herzen nach myokardialem Infarkt stellt nicht zuletzt durch die steigenden Fallzahlen in der westlichen Welt und die vergleichsweise hohe Mortalität eine Herausforderung an Forschung und Entwicklung dar. In der vorliegenden Arbeit werden verschiedene therapeutische Strategien in klinisch relevanten Mausmodellen des Myokardinfarkts und des Ischämie-Reperfusions-Schadens getestet. Zunächst wird untersucht, ob sich der Einsatz des NFκB-aktivierenden Zytokins TWEAK, welches weitreichende Funktionen in physiologischen Prozessen wie Wundheilung und Entzündung besitzt, als eine mögliche Therapiestrategie eignet. Die Expression von TWEAK wird nach myokardialem Infarkt stark im Herzgewebe induziert. Das gleiche gilt für den Rezeptor von TWEAK, Fn14, der vor allem auf kardialen Fibroblasten exprimiert wird. Daher wird angenommen, dass das TWEAK-Fn14-System am kardialen Remodelling und der Wundheilung im infarzierten Herzen beteiligt sein kann. Eine rekombinante Variante von TWEAK - HSA-Flag-TWEAK - wird im Mausmodell des Myokardinfarkts getestet. Überraschenderweise zeigt sich hierbei, dass die therapeutische Behandlung von infarzierten Versuchstieren mit diesem Protein die Mortalität im Vergleich zu Placebo-behandelten Mäusen signifikant erhöht. Dies geht mit einem vermehrten Auftreten an linksventrikulären Rupturen einher, ohne dass Defekte im kardialen Remodelling oder eine erhöhte Apoptoserate im Herzen festgestellt werden können. HSA-Flag-TWEAK bewirkt eine Erhöhung der Gewebekonzentrationen an verschiedenen pro-inflammatorischen Zytokinen (IFN-γ, IL-5, IL-12, GITR, MCP-1/-5 und RANTES) und das vermehrte Einwandern von Immunzellen in das Myokard. Hierbei ist insbesondere die stark erhöhte Infiltration an neutrophilen Granulozyten auffällig. Ein kausaler Zusammenhang zwischen diesen Immunzellen und den auftretenden kardialen Rupturen kann durch die Depletion der Neutrophilen gezeigt werden: Nach der systemischen Applikation eines Ly6G-depletierenden Antikörpers ist das Auftreten von kardialen Rupturen nach TWEAK-Gabe vergleichbar mit der Placebo-behandelten Infarktgruppe. Die Tatsache, dass die Mortalität dennoch erhöht ist, deutet auf weitere negative Effekte durch TWEAK hin. Diese Ergebnisse legen die Vermutung nahe, dass eine Hemmung der TWEAK-Fn14-Achse positive Effekte auf die Wundheilung nach Herzinfarkt bewirken könnte. Als zweite Therapiestrategie wird die pharmakologische Beeinflussung verschiedener Blutplättchen-spezifischer Zielstrukturen untersucht, um das Auftreten von Mikrothromben nach Myokardinfarkt zu reduzieren. Eine Hemmung über das Blutplättchen-Glykoprotein GPVI bewirkt in dem hier eingesetzten Mausmodell der kardialen Ischämie-Reperfusion eine signifikant verbesserte Mikrozirkulation sowie verringerte Infarktgrößen. GPVI stellt somit ein vielversprechendes Ziel für eine blutplättchenhemmende Therapie nach Myokardinfarkt dar. Zusammengefasst werden in der vorliegenden Arbeit verschiedene neuartige Therapieoptionen untersucht, die die Auswirkungen ischämischer Erkrankungen des Herzens beeinflussen können. Die Ergebnisse besitzen daher das Potenzial, zur Entwicklung neuer Therapien nach Myokardinfarkt beizutragen. N2 - The successful therapeutic targeting of pathophysiological processes in the heart is of importance for the treatment of patients suffering from myocardial infarction. Due to the combination of the rising incidence of this diesease in Western countries with its comparably high mortality, novel therapies need to be developed. In the work presented here, several innovative concepts are tested in clinically relevant mouse models of myocardial infarction and ischemia-reperfusion injury. First, the feasibility of using the NFκB-activating cytokine TWEAK as a novel drug in the treatment of myocardial infarction is assessed. TWEAK is involved in wound healing and inflammation and might therefore play a pivotal role in cardiac remodelling and the outcome after myocardial infarction. The expression of this cytokine within the infarcted heart is significantly up-regulated as is the expression of the TWEAK receptor Fn14, which is mainly expressed on cardiac fibroblasts. A recombinant variant of this cytokine - HSA-Flag-TWEAK - is used to treat infarcted mice in order to assess whether exogeneous TWEAK modulates the pathologic events following ischemic cardiac injury. Surprisingly, the treatment of infarcted test animals with HSA-Flag-TWEAK results in significantly increased mortality compared to placebo-treated mice. This is accompanied with an increased incidence in left ventricular cardiac ruptures without apparent defects in cardiac remodelling or increased rates of cardiac apoptosis. Treatment with HSA-Flag-TWEAK increases tissue levels of several pro-inflammatory cytokines (IFN-γ, IL-5, IL-12, GITR, MCP-1/-5 and RANTES) and elevates the numbers of immune cells within the myocardium. In particular, the infiltration of neutrophilic granulocytes is markedly increased. Employing Ly6G-depleting antibodies in vivo proves neutrophils to be a causal factor in the occurrence of cardiac ruptures following HSA-Flag-TWEAK treatment. Depletion of these cells results in a reduction of cardiac rupture incidences to baseline values. Nevertheless, mice treated with HSA-Flag-TWEAK still show increased mortalities, irrespective of being proficient or deficient for neutrophils. This implies further negative mechanisms induced by the activation of the TWEAK-Fn14 axis in this experimental setting and might pave the way for the development of therapies neutralizing or blocking TWEAK as a novel means to improve the outcome after myocardial infarction. As a second therapeutic strategy, several platelet-specific proteins are targeted in a mouse model of myocardial ischemia-reperfusion injury to reduce the incidence of microthrombi after myocardial infarction. Inhibiting the platelet glycoprotein GPVI results in significantly improved microcirculation and decreased infarct sizes. Platelet inhibition by targeting GPVI might therefore be a promising novel therapeutic strategy after myocardial infarction. In summary, a number of innovative therapeutic strategies targeting different molecular structures are tested here and the results of this study may contribute to the development of novel therapies after myocardial infarction. KW - Herzinfarkt KW - Herzruptur KW - Entzündung KW - Thrombozyt KW - TWEAK KW - Thrombozyt KW - Inflammation KW - TWEAK KW - Rupturen Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-92565 ER - TY - THES A1 - Klingler, Philipp T1 - Exploration of proteasome interactions with human platelet function T1 - Untersuchung von Proteasom-Wechselwirkungen mit der Funktion humaner Thrombozyten N2 - Platelets are anucleated cell fragments derived from megakaryocytes. They play a fundamental role in hemostasis, but there is rising evidence that they are also involved in immunological processes. Despite absence of a nucleus, human platelets are capable of de novo protein synthesis and contain a fully functional proteasome system, which is, in nucleated cells, involved in processes like cell cycle progression or apoptosis by its ability of protein degradation. The physiological significance of the proteasome system in human platelets is not yet fully understood and subject of ongoing research. Therefore, this study was conducted with the intention to outline the role of the proteasome system for functional characteristics of human platelets. For experimentation, citrated whole blood from healthy donors was obtained and preincubated with proteasome inhibitors. In addition to the commonly used bortezomib, the potent and selective proteasome inhibitor carfilzomib was selected as a second inhibitor to rule out agent-specific effects and to confirm that observed changes are related to proteasome inhibition. Irreversibly induced platelet activation and aggregation were not affected by proteasome blockade with bortezomib up to 24 hours. Conversely, proteasome inhibition led to enhanced threshold aggregation and agglutination up to 25 %, accompanied by partial alleviation of induced VASP phosphorylation of approximately 10-15 %. Expression of different receptors were almost unaffected. Instead, a significant increase of PP2A activity was observable in platelets after proteasome blockade, accompanied by facilitated platelet adhesion to coated surfaces in static experiments or flow chamber experiments. Carfilzomib, used for the first time in functional experimentation with human platelets in vitro, led to a dose-dependent decrease of proteasome activity with accumulation of poly ubiquitylated proteins. Like bortezomib, carfilzomib treatment resulted in enhanced threshold aggregation with attenuated VASP phosphorylation. As the main conclusion of this thesis, proteasome inhibition enhances the responsiveness of human platelets, provided by an alleviation of platelet inhibitory pathways and by an additional increase of PP2A activity, resulting in facilitated platelet adhesion under static and flow conditions. The proteasome system appears to be involved in the promotion of inhibitory counterregulation in platelets. The potential of proteasome inhibitors for triggering thromboembolic adverse events in patients must be clarified in further studies, in addition to their possible use for targeting platelet function to improve the hemostatic reactivity of platelets. N2 - Thrombozyten sind kernlose Zellfragmente, welche aus Megakaryozyten gebildet werden. Sie spielen eine fundamentale Rolle in der Hämostase, aber es gibt immer mehr Hinweise, dass Thrombozyten auch in immunologischen Prozessen involviert sind. Trotz Fehlen eines Zellkerns haben humane Thrombozyten die Fähigkeit zur de novo Proteinsynthese und besitzen außerdem ein voll funktionstüchtiges Proteasomsystem, welches in kernhaltigen Zellen über den Proteinabbau an Prozessen wie dem Fortschreiten des Zellzyklus oder der Apoptose beteiligt ist. Die physiologische Bedeutung des Proteasomsystems in humanen Thrombozyten ist nicht vollständig geklärt und ist aus diesem Grund Gegenstand aktueller Forschung. Daher war es Ziel dieser Studie, die Rolle des Proteasomsystems für die funktionellen Eigenschaften humaner Thrombozyten zu erforschen. Für die Experimente wurde Citrat-Vollblut von gesunden Spendern gewonnen und mit Proteasom-Hemmstoffen vorinkubiert. Es wurde neben dem gängigen Bortezomib der potente und selektive Proteasom-Inhibitor Carfilzomib als zweiter Inhibitor eingesetzt, um substanzspezifische Effekte auszuschließen und zu bestätigen, dass die beobachteten Veränderungen auf der Proteasom-Inhibition beruhen. Die irreversibel induzierte Thrombozytenaktivierung und -aggregation wurde durch die Hemmung des Proteasoms mit Bortezomib bis zu 24 Stunden nicht beeinflusst. Allerdings führte die Proteasom-Hemmung zu einer verstärkten Schwellenwertaggregation und -agglutination um bis zu 25 % sowie zu einer partiellen Abschwächung der induzierten VASP-Phosphorylierung um etwa 10-15 %. Die Expression verschiedener Rezeptoren blieb nahezu unbeeinflusst. Stattdessen konnte unter Proteasom-Inhibition eine erhöhte Enzymaktivität der PP2A beobachtet werden, begleitet von einer erleichterten Thrombozytenadhäsion an beschichteten Oberflächen bei statischen Versuchen ober bei Flusskammerversuchen. Carfilzomib, welches erstmals für funktionelle Experimente mit menschlichen Thrombozyten in vitro eingesetzt wurde, führte zu einer dosisabhängigen Abnahme der Proteasom-Aktivität mit einer Akkumulation von poly ubiquitylierten Proteinen. Wie Bortezomib mündete die Behandlung mit Carfilzomib in einer verstärkten Schwellenwertaggregation und abgeschwächter VASP-Phosphorylierung. Die wichtigste Schlussfolgerung dieser Arbeit ist, dass die Inhibition des Proteasoms die Reaktivität humaner Thrombozyten erhöht, gekennzeichnet durch eine Abschwächung der hemmenden Signalwege der Thrombozyten und durch eine zusätzliche Erhöhung der PP2A-Enzymaktivität, was zu einer erleichterten Thrombozytenadhäsion unter statischen Verhältnissen und unter Flussbedingungen führt. Das Proteasomsystem scheint an der Förderung der hemmenden Gegenregulation in Thrombozyten beteiligt zu sein. Das Potenzial von Proteasom Inhibitoren, thromboembolische Nebenwirkungen bei Patienten auszulösen, muss in weiteren Studien geklärt werden, ebenso wie ihr möglicher Einsatz für die gezielte Beeinflussung der Thrombozytenfunktion zur Verbesserung der hämostatischen Reaktivität der Thrombozyten. KW - Thrombozyt KW - Proteasom KW - Platelet KW - Proteasome KW - Bortezomib Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-321089 ER - TY - THES A1 - Vielreicher, Martin Christian T1 - Fluoreszenz-mikroskopische Untersuchung der Inaktivierung der Tyrosinkinase SRC im Integrin alphaIIb-beta3 -Signalweg T1 - Studies on the inactivation process of the tyrosine kinase Src in the integrin alphaIIb-beta3 signaling pathway by fluorescence microscopy N2 - Essentiell für die Blutstillung (Haemostase) ist die Thrombozyten- oder Blutplaettchen-Adhaesion und die Thrombus-Bildung. Beide Vorgaenge werden hauptsaechlich durch den Thrombozyten-Rezeptor Integrin alphaIIb-beta3 vermittelt. Nach Bindung des Liganden Fibrinogen aendert sich die Rezeptor-Konformation, Integrine assoziieren und ein intrazellulaeres Signalnetzwerk wird aktiviert, welches die Organisation des Aktin-Zytoskeletts steuert. Diese Zytoskelett-Reorganisationen sind Grundlage für zellulaere Adhaesions- und Aggregations-Prozesse. Die Signalvermittlung vom Integrin zum Zytoskelett wird durch die Protein-Tyrosinkinase Src eingeleitet, deren Aktivitaetszustand den Signalweg reguliert. Bei der Src-Aktivierung wird Tyrosin 418 durch Autokatalyse phosphoryliert. Die Kinase muss jedoch wieder inaktiviert werden. Dies übernimmt in Plaettchen ausschliesslich die Tyrosinkinase Csk (C-terminale Src Kinase) durch Phosphorylierung von Tyrosin 529 im C-terminalen Ende des Proteins. Die Csk-vermittelte Inaktivierung von Src stellt den entscheidenden Kontrollschritt des alphaIIb-beta3-vermittelten Signalwegs dar. Obwohl bekannt ist, dass die Src-Aktivierung bei der Zelladhaesion an den Zellraendern der Lamellipodien geschieht und man den Mechanismus und die Kinetik der Src-Csk Interaktion genauer versteht, ist bislang immer noch unbekannt, wo und wie Src inaktiviert wird bzw. welche Rolle der Src-Inaktivierung genau zukommt. FRET (Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer) ist ein physikalischer Effekt, mit dem Interaktionen beliebiger fluoreszenzmarkierter Proteine mikroskopisch detektiert werden koennen. Diese Technik wurde genutzt, um die Src-Csk-Interaktion waehrend der alphaIIb-beta3-vermittelten Fibrinogen-Adhaesion in einer etablierten Thrombozyten-Modellzelllinie (A5-CHO) direkt visualisierbar zu machen. Es zeigten sich starke Src-Csk Interaktionen (FRET-Signale) an den Zellraendern aktiver Lamellipodien und zusaetzlich in Fokalkontakten, wo beide Proteine mit Vinculin, einem Fokalkontakte-Marker, co-lokalisierten. Die Proteininteraktionen folgten einem hochdynamischen Ablauf. Nach der Akkumulation der Src-Csk Komplexe an den Zellraendern wanderten sie in Abstaenden von 2-3 Minuten nach innen, fragmentierten und bildeten schliesslich stabile Fokal-Adhaesionen. FRET-Signale an den Zellraendern fanden sich vor allem in ruhenden Lamellipodien bzw., waehrend des Lamellipodien-Rückzugs, in wachsenden Lamellipodien traten die FRET-Signale dort dagegen nicht auf. In unabhaengigen biochemischen Tests im Zeitfenster der FRET-Beobachtungen wurde ein spezifischer Anstieg der Src-Tyr529-Phosphorylierung (Inaktivierung) und eine parallele Abnahme der Src-Tyr418-Phosphorylierung (Aktivierung) gemessen. Weiterführende Ergebnisse lieferten Versuche mit Src- und Csk-Mutanten. Die Co-Expression von Wildtyp-Src mit Kinase-inaktivem CskK222R hatte weder einen Effekt auf die Adhaesion und Ausbreitung der Zellen noch auf die Praesenz von FRET, es aenderte sich jedoch drastisch die zellulaere Verteilung der FRET-Signale sowie das Wachstum und die Form der Lamellipodien. Die Co-Expression von Wildtyp-Csk mit konstitutiv aktivem SrcY529F verursachte dagegen eine stark verringerte Adhaesionsfaehigkeit und Hemmung der Lamellipodien-Bildung. Die Fokal-Adhaesionspunkte in diesen Zellen waren sehr schwach und ueberdimensioniert und lagen ungeordnet verteilt in der Adhaesionsebene. Zusaetzlich verursachte SrcY529F eine starke Ueberaktivierung des Zytoskeletts und das fast vollstaendige Verschwinden der FRET-Signale. Die ermittelten Daten zeigen, dass die enge Kontrolle der Src-Aktivitaet durch Csk eine bedeutende Rolle für die funktionelle Zell-Adhaesion and -Ausbreitung spielt. Co-Immunpraezipitations-Resultate und Messungen der Menge an markiertem Protein in Zellen, in welchen FRET detektierbar war, untermauern zusaetzlich unsere These, zum ersten Mal die Src-Regulation durch Csk in lebenden Zellen direkt beobachtbar gemacht zu haben. Dieser neue FRET-Ansatz kann auch als Reporter-System für Prozesse der Src-Inaktivierung in anderen Signalwegen und Zellen angewendet werden. Das Messprinzip kann weiterhin auf das Studium der Inaktivierung weiterer Mitglieder der Familie der Src-Kinasen (in verschiedensten Signalwegen) erweitert werden. N2 - Platelet adhesion and thrombus formation required for functional hemostasis depends on integrin receptor mediated “outside-in” signaling to the cytoskeleton. Integrin alphaIIb-beta3 is the major integrin on the platelet surface and acts as a specific receptor for the plasma protein fibrinogen. Fibrinogen binding causes clustering of integrins within the plasma membrane activating the protein tyrosine kinase Src (signal initiation) by phosphorylation of tyrosine 418. Src, however, is negatively regulated by another tyrosine kinase, Csk (C-terminal Src kinase), which phosphorylates tyrosine 529. Although, in adhering cells, it is believed that Src is getting activated at lamellipodia leading edges, neither the cellular location nor the dynamics and exact role of Src inactivation is known to date. Here, we studied Src inactivation during alphaIIb-beta3-dependent adhesion to fibrinogen in the established platelet model cell line A5-CHO. Using a live cell FRET (fluorescence resonance energy transfer) microscopy technique with CFP and YFP label molecules (cyan and yellow fluorescent protein), we were able to image highly dynamic Src-Csk interactions at the leading edges of active lamellipodia. Every 2-3 minutes, signals detecting Src-Csk interactions (complexes) appeared at the cell periphery before they begin to move inward in the cell and reorganize while lamellipodia start to protrude (grow). FRET signals were also found in small accumulations at the fringe and also further to the centre of the adhesion plane (focal complexes and adhesions). Src and Csk co-localize with vinculin (a focal adhesion marker) within these regions. During the runtime of FRET observation a specific increase in Src-Tyr529 phosphorylation with a parallel decrease in Src-Tyr418 phosphorylation was observed supporting the idea that Src inactivation occurs within the cells. The role of Src-Csk interaction was studied in further detail using Src and Csk mutants. The data revealed that co-expression of inactive CskK222R did not alter the presence of FRET signals, but fundamentally changed its distribution within the cell. Furthermore it caused lamellipodia shape changes and a tendency of constant lamellipodia protrusion. Co-expression of constitutively active SrcY529F in turn caused a severe adhesion and spreading dysfunction. Adherent cells showed very weak, disorganized and oversized focal adhesions, a hyper-activated cytoskeleton (visible in fast-changing membrane blebs) and absence of FRET signals. Results from immunoprecipitation analyses and protein level determination within cells, in which FRET was detectable, further supported that we were able, for the first time, to directly visualize Src (and integrin) regulation by Csk control in live cells. The results show that Src control by Csk is ultimately required for lamellipodia and focal adhesion function and thus for cell anchorage and spreading. The novel FRET-approach reported here can be readily applied to other integrin and signaling pathways including the study of closely related Src family kinases (SFKs). Results may also contribute to a better understanding of the processes of tumor formation. KW - Antigen CD41 KW - Src-Proteine KW - C-terminal-Src-Kinase KW - Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer KW - Thrombozyt KW - CHO-Zelle KW - Lamellipodium KW - Zellskelett KW - Zelladhäsion KW - Integrin alphaIIb-beta3 KW - integrin alphaIIb-beta3 KW - src kinase KW - csk KW - FRET KW - platelet KW - cell adhesion KW - CHO cell KW - lamellipodium KW - actin cytoskeleton Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-26743 ER - TY - THES A1 - Thielmann, Ina T1 - Function and regulation of phospholipase D in blood platelets: in vitro and in vivo studies in mice T1 - Funktion und Regulation von Phospholipase D in Thrombozyten: in vitro und in vivo Studien in Mäusen N2 - Summary Platelet activation and aggregation are crucial for primary hemostasis but can also result in occlusive thrombus formation. Agonist induced platelet activation involves different signaling pathways leading to the activation of phospholipases (PL) which produce second messengers. While the role of PLCs in platelet activation is well established, less is known about the relevance of PLDs. In the current study, the function and regulation of PLD in platelets was investigated using genetic and pharmacological approaches. In the first part of this thesis, adhesion, activation and aggregation of platelets from mice lacking PLD2 or both PLD1 and PLD2 were analyzed in vitro and in vivo. While the absence of PLD2 resulted in slightly reduced PLD activity in platelets, it had no detectable effect on the platelet function in vitro and in vivo. However, the combined deficiency of both PLD isoforms resulted in defective alpha-granule release and protection in a model of ferric chloride induced arteriolar thrombosis, effects that were not observed in mice lacking only one PLD isoform. These results revealed, for the first time, redundant roles of PLD1 and PLD2 in platelet alpha-granule secretion and indicate that this may be relevant for pathological thrombus formation. Thus, PLD might represent a promising target for antithrombotic therapy. Thus, this hypothesis was tested more directly in the second part of this thesis. The effects of pharmacological inhibition of PLD activity on hemostasis, thrombosis and thrombo-inflammatory brain infarction in mice were assessed. Treatment of platelets with the reversible, small molecule PLD inhibitor 5-Fluoro-2-indolyl des-chlorohalopemide (FIPI) led to a specific blockade of PLD activity that was associated with reduced -granule release and integrin activation. Mice that received FIPI at a dose of 3 mg/kg displayed reduced occlusive thrombus formation upon chemical injury of carotid arteries or mesenterial arterioles. Similarly, FIPI-treated mice had smaller infarct sizes and significantly better motor and neurological function 24 hours after transient middle cerebral artery occlusion. This protective effect was not associated with major intracerebral hemorrhage or prolonged tail bleeding times. Thus, pharmacological PLD inhibition might represent a safe therapeutic strategy to prevent arterial thrombosis or ischemic stroke. After revealing a central role for PLD in thrombo-inflammation, the regulation of PLD activity in platelets was analyzed in the last part of the thesis. Up to date, most studies made use of inhibitors potentially exerting off-target effects and consequently PLD regulation is discussed controversially. Therefore, PLD activity in mice genetically lacking potential modulators of PLD activity was determined to address these controversies. These studies revealed that PLD is tightly regulated during initial platelet activation. While integrin outside-in signaling and Gi signaling was dispensable for PLD activation, it was found that PLC dependent pathways were relevant for the regulation of PLD enzyme activity. N2 - Zusammenfassung Thrombozytenaktivierung und -aggregation sowie die anschließende Thrombusbildung sind essentielle Prozesse während der primären Hämostase. Andererseits kann unkontrollierte Thrombozytenaktivierung zum Gefäßverschluss und somit zu Schlaganfall oder Herzinfarkt führen. Verschiedene Signalwege, die für die Thrombozytenaktivierung von Bedeutung sind, führen zur Aktivierung von Phospholipasen (PL), die daraufhin sekundäre intrazelluläre Botenstoffe generieren. Während die Rolle von PLCs für die Thrombozytenaktivierung bekannt ist, ist die Relevanz der PLDs noch ungeklärt. Die vorliegende Arbeit untersucht die Funktion und Regulation von PLD in der Thrombozytenaktivierung und Thrombusbildung mittels genetisch veränderter Mäuse. Im ersten Teil der Arbeit wurde die Adhäsion, Aktivierung und Aggregation von Pld2-/- und Pld1-/-/Pld2-/- Thrombozyten in vitro und in vivo untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Abwesenheit von PLD2 zu einer verminderten PLD Aktivität in Thrombozyten führte. Dies hatte allerdings keinen erkennbaren Effekt auf die Funktion der Thrombozyten in vitro und in vivo. Die PLD doppel-defizienten Thrombozyten hingegen wiesen Defekte bei der Sekretion der α-Granula auf, was zur Bildung von instabilen FeCl3-induzierten Thromben in einem in vivo Thrombosemodell führte. Diese Effekte waren in den einzeldefizienten Mäusen nicht vorhanden, was auf redundante Funktionen von PLD1 und PLD2 in diesem Prozess schließen lässt. Interessanterweise wurden keine hämostatischen Defekte durch die Doppeldefizienz hervorgerufen. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass PLD eine neue potentielle antithrombotische Zielstruktur darstellt. Diese Hypothese wurde im zweiten Teil der Arbeit weiter überprüft. Der Effekt einer PLD Hemmung durch den reversiblen PLD Inhibitor 5-Fluoro-2-indolyl des-chlorohalopemide (FIPI) auf Hämostase und Thrombose wurde untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Behandlung von Mäusen mit FIPI zu einer spezifischen Blockade von PLD führte, die die alpha-Degranulierung und Integrinaktivierung, im ähnlichen Ausmaß wie in den doppeldefizienten Mäusen, beeinträchtigte. Des Weiteren zeigten Mäuse, die mit 3 mg/kg FIPI behandelt wurden, starke Defekte in der arteriellen Thrombusbildung in Makro- und Mikrogefäßen. FIPI vermittelte PLD Inhibition führte außerdem zu einem Schutz der Mäuse in einem Modell des ischämischen Schlaganfalls, ohne intrazerebrale Blutungen hervorzurufen. Diese Ergebnisse etablieren FIPI als potentiellen antithrombotischen Wirkstoff für eine effektive und sichere Behandlung von kardio- und zerebrovaskulären Erkrankungen. Da PLD eine zentrale Rolle während der Thrombusbildung hat, wurde im letzten Teil der Arbeit auf die Regulation von PLD während der Thrombozytenaktivierung eingegangen. Bisherige Studien verwendeten häufig Inhibitoren, die zu unspezifischen Effekten führen können. Daher wird die Regulation von PLD in der Literatur kontrovers diskutiert. Die Untersuchung der PLD Aktivität in verschiedenen knockout Mauslinien stellt einen nützlichen Ansatz dar, um die kontrovers diskutierte PLD Regulation aufzuklären. Zu diesem Zweck wurde die PLD Aktivität in genetisch veränderten Mäusen, denen potentielle Regulatoren von PLD fehlen, gemessen. Im Zuge diesen Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass integrinabhängige- und Gi-vermittelte Signalwege keinen Einfluss auf die Regulation von PLD hatten, während PLC vermittelte Signale von Bedeutung waren. KW - Phospholipase D KW - Thrombozyt KW - Thrombose KW - Schlaganfall KW - Hämsotase KW - Phospholipase D KW - Thrombose KW - Hämostase KW - Schlaganfall KW - Blutstillung KW - Maus Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-99179 ER - TY - THES A1 - Erro, Alejandro Berna T1 - Generation and Characterization of Stromal Interaction Molecule 2 (STIM2)-deficient Mice T1 - Generierung und Charakterisierung von Stromal Interaction Molecule 2 (STIM2)-defizienten Mäusen N2 - An increase in cytosolic Ca2+ levels ([Ca2+]i) is a key event that occurs downstream of many signaling cascades in response to an external stimulus and regulates a wide range of cellular processes, including platelet activation. Eukaryotic cells increase their basal [Ca2+]i allowing extracellular Ca2+ influx into the cell, which involves different mechanisms. Store-operated Ca2+ entry (SOCE) is considered the main mechanism of extracellular Ca2+ influx in electrically non-excitable cells and platelets, and comprises an initial Ca2+ depletion from intracellular Ca2+ stores prior to activation of extracellular Ca2+ influx. Although the close relation between Ca2+ release from intracellular stores and extracellular Ca2+ influx was clear, the nature of the signal that linked both events remained elusive until 2005, when Stromal Interaction Molecule 1 (STIM1) was identified as an endoplasmic reticulum (ER) Ca2+ sensor essential for inositol (1,4,5)-trisphosphate (IP3)-mediated SOCE in vitro. However, the function of its homologue STIM2 in Ca2+ homeostasis was in general unknown. Therefore, mice lacking STIM2 (Stim2-/-) were generated in this work to study initially STIM2 function in platelets and in cells of the immune system. Stim2-/- mice developed normally in size and weight to adulthood and were fertile. However, for unknown reasons, they started to die spontaneously at the age of 8 weeks. Unexpectedly, Stim2-/- mice did not show relevant differences in platelets, revealing that STIM2 function is not essential in these cells. However, STIM2 seems to be involved in mammary gland development during pregnancy and is essential for mammary gland function during lactation. CD4+ T cells lacking STIM2 showed decreased SOCE. Our data suggest that STIM2 has a very specific function in the immune system and is involved in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) at early stages of the disease progression. Stim2-/- neurons were also defective in SOCE. Surprisingly, our results evidenced that STIM2 participates in mechanisms of neuronal damage after ischemic events in brain. This is the first time that the involvement of SOCE in ischemic neuronal damage has been reported. This finding may serve as a basis for the development of novel neuroprotective agents for the treatment of ischemic stroke, and possibly other neurodegenerative disorders in which disturbances in cellular Ca2+ homeostasis are considered a major pathophysiological component. N2 - Der Anstieg des cytosolischen Ca2+-Spiegels ([Ca2+]i) ist ein Schlüsselereignis, das vielen Signalkaskaden, durch extrazellulären Stimulus ausgelöst werden, nachgeschalten ist, und eine große Reihe zellulärer Prozesse reguliert, z.B. die Aktivierung von Blutplättchen. Eukaryotische Zellen erhöhen ihren basalen ([Ca2+]i) durch Einstrom von extrazellulärem Ca2+ in die Zelle hinein, was durch verschiedene Mechanismen geschehen kann. Store-operated Ca2+-entry (SOCE), wird als der Hauptmechanismus für den Einstrom von extrazellulärem Ca2+ in nicht elektrisch-erregbaren Zellen sowie Plättchen angesehen und beinhaltet einen initialen Ca2+-Ausstrom aus intrazellulären Speichern der dem Ca2+-Einstrom aus der Extrazellulärraum vorrausgeht. Obwohl die Beziehung zwischen Ca2+-Ausstrom aus intrazellulären Speichern und extrazellulärem Ca2+-Einstrom über die Plasmamembran viele Jahre bekannt war, so blieb doch das beide Ereignisse verknüpfende Element unbekannt. Im Jahre 2005 jedoch wurde Stromal Interaction Molecule 1 (STIM1) als Ca2+-Sensor des endoplasmatischen Retikulums (ER) und als essentieller Bestandteil für inositol(1,4,5)-triphosphat (IP3)-vermittelten SOCE in vitro identifiziert. Die Funktion seines Homologs, STIM2, in der Ca2+ Homeostase blieb jedoch unklar. Aus diesem Grund generierten wir STIM2-defiziente (Stim2-/-) Mäuse um die Funktion dieses Proteins in Blutplättchen und Immunzellen untersuchen zu können. Bis zum Erwachsenenalter entwickelten sich Stim2-/- Mäuse normal in Bezug auf Größe und Gewicht und waren fertil. Jedoch sterben die Tiere spontan aus unbekannten Gründen, beginnend ab einem Alter von 8 Wochen. Unerwarteter Weise, zeigten Stim2-/- Mäuse keine maßgeblichen Funktionsunterschiede in Plättchen, was eine essentielle Funktion von STIM2 in diesen Zellen ausschließt. Jedoch scheint STIM2 in die Entwicklung der Brustdrüsen während der Schwangerschaft involviert und essentiell für die Brustdrüsenfunktion während der Säugephase zu sein. Darüberhinaus zeigten STIM2 defiziente CD4+ T-Zellen einen verminderten SOCE. Weiter deuten unsere Daten auf eine spezifische Funktion von STIM2 im Immunsystem hin, mit einem Einfluss auf die frühen Phasen und das Fortschreiten der Experimentellen Autoimmun-Enzephalomyelitis (EAE). Stim2-/- Neuronen wiesen ebenso wie CD4+ T-Zellen einen gestörten SOCE auf. Desweiteren belegen unsere Ergebnisse, dass STIM2 überrascherweise an den Neuronen zerstörenden Mechanismen nach ischämischen Ereignissen des Gehirns mitwirkt. Dies ist die erste Studie, die von einer Beteiligung von SOCEan ischämischen neuronalen Schäden berichtet. Diese Entdeckungen können vielleicht als Basis für die Entwicklung neuer neuroprotektiver Medikamente bei ischämischen Schlaganfall dienen - und möglicherweise auch bei anderen neurodegenerativen Erkrankungen, bei denen Störungen der zellulären Ca2+ Homöostase als hauptsächliche pathophysologische Komponente angesehen werden. KW - Calcium-bindende Proteine KW - Intrazellulärraum KW - Thrombozyt KW - Knockout KW - STIM2 KW - SOC KW - SOCE KW - STIM2 KW - SOC KW - SOCE KW - Store-Operated KW - knockout Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-47301 ER - TY - THES A1 - Zeeshan [geb. Majeed], Saman T1 - Implementation of Bioinformatics Methods for miRNA and Metabolic Modelling T1 - Die Umsetzung der Bioinformatik-Methoden für miRNA-und der Metabolischen Modellierung N2 - Dynamic interactions and their changes are at the forefront of current research in bioinformatics and systems biology. This thesis focusses on two particular dynamic aspects of cellular adaptation: miRNA and metabolites. miRNAs have an established role in hematopoiesis and megakaryocytopoiesis, and platelet miRNAs have potential as tools for understanding basic mechanisms of platelet function. The thesis highlights the possible role of miRNAs in regulating protein translation in platelet lifespan with relevance to platelet apoptosis and identifying involved pathways and potential key regulatory molecules. Furthermore, corresponding miRNA/target mRNAs in murine platelets are identified. Moreover, key miRNAs involved in aortic aneurysm are predicted by similar techniques. The clinical relevance of miRNAs as biomarkers, targets, resulting later translational therapeutics, and tissue specific restrictors of genes expression in cardiovascular diseases is also discussed. In a second part of thesis we highlight the importance of scientific software solution development in metabolic modelling and how it can be helpful in bioinformatics tool development along with software feature analysis such as performed on metabolic flux analysis applications. We proposed the “Butterfly” approach to implement efficiently scientific software programming. Using this approach, software applications were developed for quantitative Metabolic Flux Analysis and efficient Mass Isotopomer Distribution Analysis (MIDA) in metabolic modelling as well as for data management. “LS-MIDA” allows easy and efficient MIDA analysis and, with a more powerful algorithm and database, the software “Isotopo” allows efficient analysis of metabolic flows, for instance in pathogenic bacteria (Salmonella, Listeria). All three approaches have been published (see Appendices). N2 - Dynamische Wechselwirkungen und deren Veränderungen sind wichtige Themen der aktuellen Forschung in Bioinformatik und Systembiologie. Diese Promotionsarbeit konzentriert sich auf zwei besonders dynamische Aspekte der zellulären Anpassung: miRNA und Metabolite. miRNAs spielen eine wichtige Rolle in der Hämatopoese und Megakaryozytopoese, und die Thrombozyten miRNAs helfen uns, grundlegende Mechanismen der Thrombozytenfunktion besser zu verstehen. Die Arbeit analysiert die potentielle Rolle von miRNAs bei der Proteintranslation, der Thrombozytenlebensdauer sowie der Apoptose von Thrombozyten und ermöglichte die Identifizierung von beteiligten Signalwegen und möglicher regulatorischer Schlüsselmoleküle. Darüber hinaus wurden entsprechende miRNA / Ziel-mRNAs in murinen Thrombozyten systematisch gesammelt. Zudem wurden wichtige miRNAs, die am Aortenaneurysma beteiligt sein könnten, durch ähnliche Techniken vorhergesagt. Die klinische Relevanz von miRNAs als Biomarker, und resultierende potentielle Therapeutika, etwa über eine gewebsspezifische Beeinflussung der Genexpression bei Herz-Kreislauf Erkrankungen wird ebenfalls diskutiert. In einem zweiten Teil der Dissertation wird die Bedeutung der Entwicklung wissenschaftlicher Softwarelösungen für die Stoffwechselmodellierung aufgezeigt, mit einer Software-Feature-Analyse wurden verschiedene Softwarelösungen in der Bioinformatik verglichen. Wir vorgeschlagen dann den "Butterfly"-Ansatz, um effiziente wissenschaftliche Software-Programmierung zu implementieren. Mit diesem Ansatz wurden für die quantitative Stoffflussanalyse mit Isotopomeren effiziente Software-Anwendungen und ihre Datenverwaltung entwickelt: LS-MIDA ermöglicht eine einfache und effiziente Analyse, die Software "Isotopo" ermöglicht mit einem leistungsfähigeren Algorithmus und einer Datenbank, eine noch effizientere Analyse von Stoffwechselflüssen, zum Beispiel in pathogenen Bakterien (Salmonellen, Listerien). Alle drei Ansätze wurden bereits veröffentlicht (siehe Appendix). KW - miRNS KW - Bioinformatics KW - miRNA KW - Metabolic Modelling KW - Spectral Data Analysis KW - Butterfly KW - Thrombozyt KW - Bioinformatik KW - Stoffwechsel KW - Modellierung KW - Metabolischen Modellierung Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-102900 ER - TY - THES A1 - Czakai, Kristin Bernadette T1 - Interaktionen des humanpathogenen Pilzes Aspergillus fumigatus mit dem angeborenen Immunsystem und Thrombozyten T1 - Interaction of the human pathogenic mold Aspergillus fumigatus with the innate immune system and platelets N2 - Pilze sind in unserer Umwelt allgegenwärtig und besiedeln im Fall von Candida albicans (C. albicans) sogar bei über 50% der Menschen die Schleimhäute, während Sporen von Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) täglich über die Atmung in die Lunge des Menschen gelangen. Dennoch sind Erkrankungen, die durch diese zwei Pilze ausgelöst werden, bei gesunden Menschen selten. Ist jedoch das Immunsystem beeinträchtigt, können diese Pilze zu systemischen und damit lebensbedrohlichen Erkrankungen wie der invasiven Aspergillose und der systemischen Candidiasis führen. Für eine Verbesserung der Behandlung solcher Infektionen ist das genaue Verständnis der Immunabwehrmechanismen entscheidend. Da A. fumigatus über die Lunge in den Körper gelangt, wurden in dieser Arbeit die häufigsten Immunzellen der Lunge, die Makrophagen, und deren Immunantwort auf A. fumigatus untersucht. Parallel hierzu wurden dendritische Zellen (DCs) verwendet, die als Brücke zwischen dem angeborenen und adaptiven Immunsystem wirken. Ein besonderes Augenmerk wurde hierbei auf A. fumigatus induzierte Genexpressionsänderungen und deren Regulationsmechanismen gelegt. Dabei wurden kurze, regulatorische RNAs, die sogenannten miRNAs, untersucht, die eine wichtige Rolle in der post-transkriptionalen Genregulation spielen. Bislang ist nur wenig über die miRNA-abhängigen Genregulationen in DCs, die auf eine Infektion mit A. fumigatus oder C. albicans reagieren, bekannt. Um alle durch A. fumigatus und C. albicans regulierten miRNAs zu identifizieren, wurden DCs mit A. fumigatus und C. albicans ko-kultiviert und anschließend eine Komplettsequenzierung der kurzen RNAs durchgeführt. Die Pilz-spezifische Induktion der miRNA-Regulation wurde zudem mit der miRNA-Regulation durch den bakteriellen Zellwandbestandteil Lipopolysaccharid verglichen. Durch die Stimulation mit Keimschläuchen von A. fumigatus wurden die miRNAs miR-132-3p/5p, miR-155-5p, miR129-2-3p, miR-129-5p, miR-212-3p/5p und miR-9-5p in DCs induziert. Diese wurden ebenfalls durch C. albicans induziert, zudem noch die miRNAs miR-147a und miR-147b. Spezifisch für A. fumigatus war die Regulation der miR-129-2-3p. Neben dem miRNA-Profiling wurde auch das mRNA-Transkriptom über Microarrays analysiert und dadurch 18 potentielle Zielgene der Pilz-induzierten miRNAs identifiziert. Neben den Elementen der Translationsregulation wurden auch die Transkriptionsfaktoren untersucht. Als einziger unter den 60 regulierten Transkriptionsfaktoren zeigte KLF4 eine veränderte Expressionsrichtung in DCs, die mit Pilzen oder LPS behandelt waren. Während die Stimulation mit LPS die Expression von KLF4 induzierte, wurde es durch die Pilze A. fumigatus und C. albicans reprimiert. In einer Untersuchung der unterschiedlichen A. fumigatus-Rezeptoren, wurde deren Einfluss auf die KLF4-Regulation gezeigt. Während TLR4-Liganden KLF4 induzierten, führten Liganden, die an die Rezeptoren TLR2/TLR1 und Dectin-1 binden, zu einer Reduktion von KLF4. Nach einem erfolgreich etablierten KLF4-knock-down mittels RNA-Interferenz wurden KLF4-Zielgene untersucht. Während kein bzw. nur ein geringer Effekt auf die Genexpression von CCL2, RANTES, CXCL10 und TNF beobachtet wurde, sorgte der KLF4 knock-down für eine hoch signifikante Reduktion der IL6-Genexpression in LPS-stimulierten DCs. Um die KLF4-Regulation weiter zu untersuchen, wurde zudem eine weitere Zellpopulation des angeborenen Immunsystems, die Makrophagen, verwendet. Auch hier wurde die Immunantwort gegen A. fumigatus analysiert. Zudem wurde die Rolle der Thrombozyten als Immunmediatoren betrachtet. Zuerst wurde ein Zytokinprofil des plättchenreichen Plasmas (PRP), das mit A. fumigatus stimuliert wurde, erstellt. In diesem konnte nur RANTES in hoher Konzentration nachgewiesen werden. Daraufhin wurde der Einfluss von PRP auf die Reifung von DCs, die Phagozytosefähigkeit von Makrophagen und DCs sowie der Einfluss von DCs und Makrophagen auf die metabolische Aktivität von A. fumigatus in An- und Abwesenheit von plättchenreichem Plasma untersucht. Es konnte eine gering verstärkte Reifung der DCs durch PRP gezeigt werden. Isolierte Thrombozyten konnten die Phagozytose von DCs steigern, während Makrophagen durch PRP verstärkt Konidien phagozytierten. In einem genomweiten Transkriptomprofiling wurde die Immunantwort von DCs und Makrophagen verglichen. Zudem wurde untersucht, wie PRP die Immunantwort dieser Immunzellen beeinflusst. Es wurden 2 bzw. 24 Gene identifiziert, die signifikant in A. fumigatus-stimulierten DCs und Makrophagen reguliert waren. Hierbei wurde gezeigt, dass KLF4 durch die Zugabe von PRP herabreguliert wurde. Das zuvor beschriebene Zielgen IL6 wurde durch PRP in A. fumigatus-stimulierten DCs gegenüber stimulierten DCs ohne PRP deutlich reduziert, wodurch sich eine immunmodulatorische Fähigkeit des PRP zeigte. Die Induktion von IL-6, weiteren Zytokinen und der Reifemarker durch A. fumigatus in DCs wurden zudem in einem Booleschen Modell simuliert. Dieses Modell soll in Zukunft Vorhersagen über experimentelle Ergebnisse und dadurch eine optimale Versuchsvorbereitung ermöglichen. N2 - Fungi are ubiquitously distributed and around 50% of human mucosae are colonized by Candida albicans. Spores of Aspergillus fumigatus, called conidia, reach the human lung by inhalation of normal air. Still, fungi normally do not cause severe diseases in healthy individuals. Immunosuppression, however, predisposes to systematic and therefore life-threatening infection like invasive aspergillosis and systemic candidiasis. The treatment of those infections can only be improved by a detailed insight in immune defense mechanisms. The most prominent cell type in the lung, the location where A. fumigatus conidia can germinate and grow into tissue, are macrophages. Furthermore, the immune response of DCs that bridge innate and adaptive immunity was compared to macrophages. The main focus was on A. fumigatus induced changes in gene expression and their regulatory mechanisms. Especially the regulation of small, regulatory RNAs, called miRNAs, that are important in the post-transcriptional regulation of gene expression, was examined. So far, little is known about miRNA regulations in DCs, confronted with A. fumigatus or C. albicans. Therefore a complete sequencing of small RNAs was performed to discover all regulated miRNAs. The fungi-induced regulation was compared to DCs, stimulated with the bacterial cell membrane component lipopolysaccharide (LPS). An A. fumigatus and C. albicans dependent regulation of miR-132-3p/5p, miR-155-5p, miR129-2-3p, miR-129-5p, miR-212-3p/5p and miR-9-5p was observed. In C. albicans simulated DCs miR-147a and miR-147b were additionally regulated, whereas miR-129-2-3p was specifically regulated by A. fumigatus. Furthermore a genome wide transcriptome profiling was performed and 18 potential miRNA targets were identified. Beside post-transcriptional regulators of gene expression, an analysis of transcriptional regulators, called transcription factors, was conducted. The transcription factor KLF4 was identified as the only of all 60 differentially regulated transcription factors that was oppositely regulated comparing fungi and LPS. KLF4 was induced by LPS, but strongly down-regulated by A. fumigatus and C. albicans stimulation. Specific Toll-like receptor 4 activation by LPS and ultra-pure LPS induced KLF4. However, ligands to TLR2/TLR1 and Dectin-1 significantly reduced KLF4 mRNA and protein. A KLF4 knock-down by RNA interference was established to analyze KLF4 target genes. Little or no effect was observed on the expression of CCL2, RANTES, CXCL10 and TNF. However, KLF4 knock down induced a significant reduction of IL6 gene expression and IL-6 release by LPS treated DCs. To further examine the KLF4 regulation another cell type of the innate immune system, called macrophages, was used. The A. fumigatus-induced immune response of macrophages was compared to DCs. Furthermore, the role of platelets as immune mediators was examined. At first, a cytokine profile of untreated and A. fumigatus stimulated platelet-rich plasma was performed. RANTES was identified as the only detectable cytokine. Then the influence of PRP on DC maturation, DC and macrophages phagocytosis as well as the metabolic activity of A. fumigatus was determined. Only a weak, but still significant, influence of PRP on DCs maturation induced by A. fumigatus was observed. In the analysis of phagocytosis of A. fumigatus conidia, DCs and macrophages were reacting differently to the addition of PRP and isolated platelets. Isolated platelets were able to enhance the phagocytosis of DCs. On the other hand, PRP and plasma without platelets increased phagocytosis of macrophages. In a genome wide approach the immune response of DCs and macrophages was compared and additionally examined, if PRP alters the DC and macrophage gene expression. PRP induced a significant regulation of 2 and 24 genes of A. fumigatus treated DCs and macrophages. Furthermore, an influence of PRP on the KLF4 expression was monitored. The previously described KLF4 target gene IL6 was significantly down-regulated in PRP and A. fumigatus stimulated DCs and macrophages, compared to A. fumigatus stimulated cells. In conclusion, PRP has only a weak but detectable influence on cell function and gene expression. Furthermore a Boolean model was established to analyze the influence of A. fumigatus stimulation on the cytokine release, especially of IL-6, IL-1B and TNF, and the induction of maturation markers. This model will be used for predictions and optimizations of experimental settings. KW - Aspergillus fumigatus KW - Immunsystem KW - Thrombozyt KW - angeborenes Immunsystem Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-117496 ER - TY - THES A1 - Brown, Helena Charlotte T1 - Investigating the role of the platelet receptor C-type lectin-like receptor 2 in models of thrombosis T1 - Untersuchungen zur Rolle des Thrombozytenrezeptors CLEC-2 (C- type lectin-like receptor 2) in Thrombosemodellen N2 - Platelets have a key physiological role in haemostasis however, inappropriate thrombus formation can lead to cardiovascular diseases such as myocardial infarction or stroke. Although, such diseases are common worldwide there are comparatively few anti-platelet drugs, and these are associated with an increased risk of bleeding. Platelets also have roles in thrombo-inflammation, immuno-thrombosis and cancer, in part via C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2) and its ligand podoplanin. Although CLEC-2 contributes to these diseases in mice, as well as to thrombus stability, it is unclear whether CLEC-2 has similar roles in humans, particularly as human CLEC-2 (hCLEC-2) cannot be investigated experimentally in vivo. To investigate hCLEC-2 in vivo, we generated a humanised CLEC-2 mouse (hCLEC-2KI) model, as well as a novel monoclonal antibody, HEL1, that binds to a different site than an existing antibody, AYP1. Using these antibodies, we have provided proof of principle for the use of hCLEC-2KI mice to test potential therapeutics targeting hCLEC-2, and shown for the first time that hCLEC-2 can be immunodepleted, with little effect on haemostasis. However, our results have also suggested that there are species differences in the role of CLEC-2 in arterial thrombosis. We further confirmed this using human blood where blocking CLEC-2 ligand binding had no effect on thrombosis, whereas we confirmed a minor role for mouse CLEC-2 in thrombus stability. We also investigated the effect of blocking CLEC-2 signalling using the Bruton’s tyrosine kinase inhibitor PRN473 on CLEC-2 mediated immuno-thrombosis in a Salmonella typhimurium infection model. However, no effect on thrombosis was observed suggesting that CLEC-2 signalling is not involved. Overall, our results suggest that there may be differences in the role of human and mouse CLEC-2, at least in arterial thrombosis, which could limit the potential of CLEC-2 as an anti-thrombotic target. However, it appears that the interaction between CLEC-2 and podoplanin is conserved and therefore CLEC-2 could still be a therapeutic target in immuno-thrombosis, thrombo-inflammation and cancer. Furthermore, any potential human specific therapeutics could be investigated in vivo using hCLEC-2KI mice. N2 - Thrombozyten sind ein wichtiger Bestandteil der Hämostase, können allerdings durch die Bildung eines Blutgerinnsels auch kardiovaskuläre Krankheitsbilder wie Myokardinfarkte oder Schlaganfälle hervorrufen. Obwohl diese Erkrankungen weltweit zu den führenden Todesursachen zählen, gibt es vergleichsweise wenig Thrombozyteninhibitoren und die bislang verfügbaren Wirkstoffe gehen mit einem erhöhten Blutungsrisiko einher. Darüber hinaus spielen Thrombozyten auch bei thrombo-inflammatorischen oder malignen Erkrankungen eine Rolle und sind maßgeblich an Entzündungs-vermittelten Thrombosen (Immunothrombosen) beteiligt. Daten aus Mausmodellen legen nahe, dass die Interaktion zwischen dem Thrombozytenrezeptor CLEC-2 (C-type lectin-like receptor 2) und seinem Liganden Podoplanin von Bedeutung für diese Krankheitsbilder, und die Thrombusstabilität ist. Allerdings ist bislang unklar, ob CLEC-2 im Menschen eine ähnliche Rolle spielt, da die Rolle des menschlichen CLEC-2 (hCLEC-2) in diesen Prozessen bislang nicht experimentell in vivo erforscht werden kann. Um hCLEC-2 in vivo zu erforschen, haben wir Mäuse generiert, die humanes CLEC-2 exprimieren (hCLEC-2KI), sowie einen neuen, monoklonalen Antikörper (HEL1) entwickelt, der an eine andere Bindungsstelle als der zuvor generierter Antikörper (AYP1) bindet. Mit Hilfe dieser Antikörper haben wir erstmalig gezeigt, dass hCLEC-2KI Mäuse geeignet sind, um potenzielle Therapeutika zu testen, die auf hCLEC-2 abzielen. Des Weiteren konnten wir erstmalig zeigen, dass auch hCLEC-2 immunodepletiert werden kann und dass der Verlust des Rezeptors in zirkulierenden Thrombozyten die Hämostase nur minimal beeinträchtigt. Allerdings deuten unsere Ergebnisse auch darauf hin, dass es hinsichtlich der Bedeutung CLEC-2 für die arterielle Thrombose artspezifische Unterschiede gibt: Während Maus CLEC-2 zur Stabilität der Thromben beiträgt, hatte die Blockade der Ligandenbindungsstelle von hCLEC-2 keinen Einfluss auf Thrombose. Des Weiteren wurde mit Hilfe des Bruton’s tyrosine kinase Inhibitors PRN473 der Effekt einer Blockierung des CLEC-2 Signalwegs auf die durch CLEC-2 hervorgerufene Immuno-Thrombose in einem Salmonella typhimurium Infektionsmodel erforscht. Da jedoch keine Effekte nachgewiesen werde konnten, schlussfolgern wir, dass der CLEC-2 Signalweg nicht in diesen Prozess involviert ist. Insgesamt deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass es Unterschiede in der Rolle von CLEC-2 zwischen Mensch und Maus gibt, zumindest im Kontext der arteriellen Thrombose, was das Potenzial von CLEC-2 als antithrombotisches Ziel einschränken könnte. Da allem Anschein nach die Interaktion zwischen CLEC-2 und Podoplanin konserviert ist, könnte CLEC-2 dennoch als Therapeutikum für Thrombo-Inflammation, Immunothrombose und Krebsbildungen genutzt werden. Des Weiteren könnten für den Menschen entwickelte Therapieansätze mit Hilfe von hCLEC-2KI Mäusen in vivo untersucht werden. KW - Thrombozyt KW - Thrombose KW - Platelet KW - Thrombosis KW - Rezeptor Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-293108 ER - TY - THES A1 - Wangorsch, Gaby T1 - Mathematical modeling of cellular signal transduction T1 - Mathematische Modellierung der zellulären Signaltransduktion N2 - A subtly regulated and controlled course of cellular processes is essential for the healthy functioning not only of single cells, but also of organs being constituted thereof. In return, this entails the proper functioning of the whole organism. This implies a complex intra- and inter-cellular communication and signal processing that require equally multi-faceted methods to describe and investigate the underlying processes. Within the scope of this thesis, mathematical modeling of cellular signaling finds its application in the analysis of cellular processes and signaling cascades in different organisms. ... N2 - Das fein regulierte und kontrollierte Ablaufen zellulärer Prozesse ist essentiell für das gesunde Funktionieren einzelner Zellen, sowie der aus ihnen bestehenden Organe. Diese wiederum bedingen das Funktionieren des gesamten Organismus. Genauso vielschichtig wie die Kommunikation und Signalverarbeitung innerhalb und zwischen den Zellen, sind die Methoden um diese Vorgänge zu beschreiben und zu untersuchen. Die mathematische Modellierung zellulärer Signalverarbeitung findet im Rahmen dieser Arbeit Anwendung in der Analyse zellulärer Prozesse und Signalkaskaden in verschiedenen Organismen.... KW - Mathematische Modellierung KW - Thrombozyt KW - Systembiologie KW - Mathematische Modellierung KW - Mathematical modeling KW - platelets KW - signaling pathway KW - systems biology KW - Signaltransduktion Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-87746 ER - TY - THES A1 - Popp, Michael T1 - Mechanisms of platelet activation and receptor regulation in genetically modified mice T1 - Mechanismen der Thrombozytenaktivierung und Rezeptorregulation in genetisch veränderten Mäusen N2 - This work summarizes the results of studies on several major aspects of platelet activation and platelet receptor regulation. Therefore, this thesis is divided into four parts. Platelet activation and aggregation at sites of vascular injury is critical to prevent excessive blood loss, but may also lead to life-threatening ischemic disease states, such as myocardial infarction and stroke. Agonist-induced elevation in cytosolic Ca2+ concentrations is essential for platelet activation in hemostasis and thrombosis. The principal route of Ca2+ influx in platelets is store-operated calcium entry (SOCE). The calcium sensor molecule stromal interaction molecule 1 (STIM1) regulates SOCE by activating the membrane calcium channel protein Orai1, but the exact mechanisms of this interaction are not fully understood. Using affinity chromatography to screen for STIM1 interacting proteins in platelets, bridging integrator 2 (BIN2), an adapter protein belonging to the family of BAR proteins that is mainly expressed in the hematopoietic system, was identified. Newly generated BIN2 KO mice were viable and fertile but their platelets displayed markedly impaired SOCE in response to thapsigargin (TG) as well as agonists acting on immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM) or G protein-coupled receptors. This SOCE defect resulted in impaired (hem)ITAM induced platelet activation, aggregate formation under flow and procoagulant activity. As a consequence, mice lacking BIN2 in platelets were protected from occlusive arterial thrombus formation and thrombo-inflammatory cerebral infarct progression in a model of experimental stroke. These results identify BIN2 as a critical regulator of platelet SOCE in thrombosis and thrombo-inflammatory disease. Integrin αIIbβ3 plays a central role in the adhesion and aggregation of platelets. Integrin activation requires the transmission of a signal from the small cytoplasmic tails of the α or β subunit to the large extracellular domains resulting in conformational changes of the extracellular domains to enable ligand binding. It was hypothesized that Hic-5 is a novel regulator of integrin αIIbβ3 activation in mice. As demonstrated in the second part of this thesis, lack of Hic-5 had no detectable effect on platelet integrin activation and function in vitro and in vivo under all tested conditions. These results indicate that Hic-5 is dispensable for integrin αIIbβ3 activation and consequently for arterial thrombosis and hemostasis in mice. The Rho GTPase family members RhoA and Rac1 play major roles in platelet activation at sites of vascular injury. Little is known about possible redundant functions of these Rho GTPases in regulating platelet function. To investigate functional redundancies of RhoA and Rac1 in platelet production and function, mice with MK- and platelet-specific double- deficiencies in RhoA and Rac1 were generated. RhoA/Rac1 double-deficiency phenocopied the respective single knockouts without any additional effects in the double-knockout animals, demonstrating for the first time a functional non-redundancy of RhoA and Rac1 in platelet function. Antibodies against platelet glycoproteins (GP) trigger platelet destruction in immune thrombocytopenia (ITP) by binding to Fcγ receptors (FcγRs) on immune cells. However, antibodies against the platelet collagen receptor GPVI exert powerful anti-thrombotic action in vivo by inducing ectodomain shedding of the receptor associated with a transient thrombocytopenia. As shown in the final part of this thesis, blockade or deficiency of the inhibitory FcγRIIB abolished sequestration of anti-GPVI opsonized platelets in the hepatic vasculature and GPVI shedding. This process was mediated by liver sinusoidal endothelial cells (LSEC), the major FcγRIIB expressing cell type in the body. Furthermore, LSEC FcγRIIB mediated hepatic platelet sequestration and contributed to thrombocytopenia in mice treated with antibodies against αIIbβ3, the major target antigen in human ITP. These results reveal a novel and unexpected function of hepatic FcγRIIB in the processing of antibody-opsonized platelets. N2 - Diese Arbeit fasst Untersuchungen zu verschiedenen Aspekten der Aktivierung von Thrombozyten und deren Rezeptorregulation zusammen. Daher ist diese Doktorarbeit in vier Teile gegliedert. Die Aktivierung und Aggregation von Thrombozyten nach einer Gefäßverletzung ist entscheidend, um einen übermäßigen Blutverlust zu vermeiden, kann aber auch zu lebensbedrohlichen ischämischen Erkrankungen, wie beispielsweise Myokardinfarkt und Schlaganfall, führen. Bei der Aktivierung der Thrombozyten kommt es zu einem Anstieg der zytosolischen Ca2+-Konzentration. Der Ca2+-Einstrom in die Thrombozyten erfolgt hauptsächlich durch den „store operated calcium entry“ (SOCE). Der Calciumsensor „stromal interaction molecule 1“ (STIM1) reguliert den SOCE indem er das Ionenkanal-bildende Protein Orai1 in der Plasmamembran aktiviert. Der genaue Mechanismus dieser Interaktion ist jedoch noch nicht vollständig aufgeklärt. Durch den Einsatz von Affinitätschromatographie, um Interaktionspartner von STIM1 zu identifizieren, wurde „bridging integrator 2“ (BIN2) gefunden. BIN2 ist ein Adapterprotein, aus der Familie der BAR Proteine, welches hauptsächlich von Zellen des hämatopoetischen Systems exprimiert wird. BIN2-defiziente Mäuse sind lebensfähig und fruchtbar, aber ihre Thrombozyten zeigten einen deutlich verminderten SOCE. Diese Reduktion zeigte sich sowohl nach der Stimulation mit Thapsigargin, aber auch nach der Stimulation mit Agonisten, die „immunoreceptor tyrosine-based activation motif-“ (ITAM-) oder G-Protein gekoppelte Rezeptoren aktivieren. Der defekte SOCE führte zu verminderter (hem)ITAM-induzierter Thrombozytenaktivierung, reduzierter Thrombenbildung im Flusskammersystem und verminderter prokoagulanter Aktivität. Dies hatte zur Folge, dass Mäuse mit thrombozytenspezifischer BIN2-Defizienz vor arterieller Thrombose und, in einem Schlaganfallmodell, vor thrombo-inflammatorischer Infarktprogression geschützt sind. Diese Ergebnisse zeigen, dass BIN2 ein wichtiger Regulator des SOCE in Thrombozyten bei Thrombosen und thrombo-inflammatorischen Erkrankungen ist. Das Integrin αIIbβ3 spielt bei der Adhäsion und Aggregation von Thrombozyten eine wichtige Rolle. Um das Integrin zu aktivieren, bedarf es einer Signalübertragung von den kleinen zytoplasmatischen Teilen der α und β Untereinheiten zu den großen extrazellulären Domänen, was zu deren Konformationsänderung führt und schließlich die Ligandenbindung ermöglicht. Es besteht die Hypothese, dass Hic-5 an der Regulation des Integrins αIIbβ3 in murinen Thrombozyten beteiligt ist. Wie im zweiten Teil dieser Arbeit gezeigt werden konnte, hat eine Hic-5 Defizienz jedoch weder in vitro noch in vivo Einfluss auf die Aktivierung und Funktion des Integrins αIIbβ3 in Thrombozyten. Diese Ergebnisse zeigen, dass Hic-5 für die Aktivierung des Integrins αIIbβ3 und folglich auch für die arterielle Thrombose und Hämostase in Mäusen entbehrlich ist. Kleine GTPasen der Rho-Proteinfamilie, wie z.B. RhoA und Rac1 spielen bei der Thrombozytenaktivierung bei Gefäßverletzungen eine wichtige Rolle. Dennoch ist wenig über redundante Funktionen von RhoA und Rac1 bei der Steuerung der Thrombozytenfunktion bekannt. Um eine mögliche funktionelle Redundanz von RhoA und Rac1 zu untersuchen, wurden MK- und thrombozytenspezifische RhoA und Rac1 doppelt-defiziente Tiere gezüchtet. Die Thrombozyten der Tiere zeigten die Phänotypen einer RhoA- und Rac1-Defizienz, ohne dass weiter Effekte bemerkbar waren. Diese Ergebnisse zeigen zum ersten Mal, dass es keine funktionelle Redundanz von RhoA und Rac1 bei der Regulation der Thrombozytenfunktion gibt. Antikörper, die gegen Glykoproteine auf Thrombozyten gerichtet sind, führen bei einer Immunthrombozytopenie (ITP) durch die Bindung an Fcγ Rezeptoren auf Immunzellen, zu einer Zerstörung der Thrombozyten. Eine Ausnahme sind Antikörper gegen den Kollagenrezeptor GPVI der Thrombozyten. Hier führen diese Antikörper zu einem starken antithrombotischen Schutz in vivo, indem sie das sog. „Shedding“ der Ektodomäne des Rezeptors und nur eine vorübergehende Thrombozytopenie auslösen. Im letzten Teil dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass sowohl die Blockade, also auch das vollständige Fehlen des inhibitorischen FcγRIIB, die Sequestrierung von anti-GPVI-opsonierten Thrombozyten und das Shedding von GPVI verhindert. Für diese Prozesse ist speziell der FcγRIIB auf „liver sinusoidal endothelial cells“ (LSEC) ursächlich. Ferner konnte gezeigt werden, dass FcγRIIB auf LSECs auch für die Sequestrierung von Thrombozyten und die Thrombozytopenie in Mäusen, die mit Antikörpern gegen αIIbβ3, dem Hauptantigen bei humaner ITP, behandelt wurden, verantwortlich ist. Diese Ergebnisse enthüllen eine neue und unerwartete Funktion des hepatischen FcγRIIB bei der Reaktion auf Antikörper-opsonierte Thrombozyten. KW - Hämostase KW - Maus KW - Thrombose KW - Thrombozyt KW - Schlaganfall KW - RhoGTPase KW - Hic-5 KW - SOCE KW - GPVI Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-135494 ER - TY - THES A1 - Plaß, Armin T1 - Molekulargenetische Diagnostik des Von-Willebrand-Syndroms basierend auf der Analyse der genomischen DNA und der vWF-cDNA T1 - Molecular genetic diagnostic of von-willebrand-syndrome based on the analysis of genomic DNA and vWF-cDNA N2 - Der vWF ist ein sehr großes Protein, das im Plasma als Multimer vorliegt und an der Blutgerinnung beteiligt ist. Der Größe entsprechend handelt es sich um ein Protein, das zahlreiche Funktionen bei diesem Prozess übernimmt. Genauso vielfältig können sich auch unterschiedliche Defekte des vWF auf die Hämostase auswirken. Die genetische Analyse der zu Grunde liegenden Defekte kann bei der Diagnose der von-Willebrand-Erkrankung aber auch bei der Therapie zusätzliche Informationen liefern. Ziel dieser Arbeit war es, die Mutationen im vWF-Gen zweier Patienten auf cDNA-Ebene nachzuweisen und diese in Zusammenhang mit ihrem klinischen Erscheinungsbild und den Laborparametern zu stellen. Zu diesem Zweck wurde Thrombozyten-RNA der Patienten isoliert, durch RT-PCR in cDNA umgeschrieben und sequenziert. Bei Patient 1, der eine milde Klinik aufweist, fanden sich die nicht-gekoppelten Mutationen p.R760C und p.R854Q, die bereits von Casonato und Mitarbeitern 2007 beschriebenen wurden. Im Gegensatz zu den dort festgestellten quantitativen und funktionellen Veränderungen des vWF resultiert bei unserem Patienten ein rein quantitativer Defekt. Eine de novo Mutation könnte bei Patient 1 Ursache eines somatischen Mosaiks und damit des milden Phänotyps sein. Bei Patientin 2 fand sich ein Basenaustausch von Adenin nach Thymin an der Transkript-Position 3437 (c.3437A>G). Im Gegensatz zu dem von Goodeve et al. 2007 beschriebenen Patienten mit der von-Willebrand-Erkrankung vom Typ 1, der genau diese Mutation zeigte 51, konnte bei unserer Patientin keine weitere Mutation im vWF-Gen festgestellt werden. Diese Mutation alleine führt jedoch auch zu der von-Willebrand-Erkrankung vom Typ 1, die sich in einer Verringerung der vWF-Menge, also einem quantitativen Defekt, äußert. Die Etablierung der RNA-Isolation und cDNA-Synthese aus Plättchen konnte darüber hinaus eingesetzt werden, um spezifische Transkripte in Plättchen nachzuweisen. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass für die massenspektrometrisch in Plättchen nachgewiesene Metalloendopeptidase Nardilysin auch das Transkript detektiert werden kann. Durch RT-PCR konnte belegt werden, dass die mRNA der beiden Isoformen NRD1-001 und NRD1-002 in Thrombozyten vorkommt. N2 - Von-Willebrand-factor is a large multimeric protein that is secreted into plasma and involved in primary haemostasis. Consistent with the size of the protein, vWF plays a key role in several functions in the haemostatic process. Genetic defects in the vWF result in numerous phenotypically different bleeding abnormalities. Mutation screening can be useful in diagnosis and therapy of the disease. Aim of this work was the confirmation of vWF-gene mutations in two patients on cDNA level and the classification in relation to phenotypic parameters. RNA was extracted from the patient´s platelets, transcribed reversely by RT-PCR and sequenced. Patient 1 shows only a mild bleeding phenotype. He is a carrier of two heterozygous mutations, p.R760C and p.R854Q, a combination already described by Casonato et al 2007 in a patient suffering of quantitative and qualitative vWF defects. Our patient only shows a qualitative reduction of vWF. One of the mutations found in patient 1 could be due to a de novo mutation, affecting only part of the cells and so resulting in a mild phenotype. In patient 2, the heterozygous mutation c.3437A>G was confirmed. A patient carrying this mutation was described by Goodeve et al 2007. This patient was a carrier of an additional mutation in the vWF-gene which could be excluded in our patient. The single mutation is sufficient to explain vWD type 1, characterized by reduced but structurally normal vWF. The establishment of RNA isolation and cDNA synthesis from platelets could also be used in transcript-profiling of platelets. After identifying Nardilysin, a metalloendopeptidase, in platelets by mass spectrometry tools we could confirm this observation on cDNA level. Two different alternatively spliced isoforms of Nardilysin, NRD1-001 and NRD1-002, could be verified in platelets. KW - Willebrand-Jürgens-Syndrom KW - Molekulargenetik KW - Thrombozyt KW - von-willebrand-syndrom KW - nardilysin KW - r854q KW - r760c KW - y1146c KW - von-willebrand-syndrome KW - nardilysin KW - r854q KW - r760c KW - y1146c Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72822 ER - TY - THES A1 - Jurak Begonja, Antonija T1 - NO/cGMP and ROS Pathways in Regulation of Platelet Function and Megakaryocyte Maturation T1 - NO/cGMP und ROS Singnalwege in Regulation der Plättchen Funktion und Megakaryozyten Entwicklung N2 - Blutplättchen spielen unter physiologischen Bedingungen eine wichtige Rolle bei der Erhaltung der Hämostase. So verhindern sie ein andauerndes Bluten von Wunden, indem sie in Blutgefässen zwischen normalen Zellen des Endothels und beschädigten Bereichen unterscheiden und sich dort gezielt anheften können. Das Zusammenspiel der Plättchenagonisten und den dazugehörigen Rezeptoren wird durch intrazelluläre Signalmoleküle kontrolliert, die die Aktivierung der Blutplättchen regulieren. Äusserst wichtige intrazellulare Signalmoleküle stellen dabei die zyklischen Nukleotide cGMP und cAMP dar, die bei der Hemmung der Plättchen beteiligt sind. Die Bildung von cGMP und cAMP in den Blutplättchen wird durch die aus dem Endothel freigesetzten Moleküle NO und Prostacyclin (PGI2) stimuliert, die ihrerseits Blutplättchen hemmen, indem sie Proteinkinase G (PKG) und Proteinkinase A (PKA) aktivieren. Neuerdings wird vorgeschlagen, dass es sich bei ROS („reactive oxygen species“) um einen neuen Modulator bei der Signaltransduktion zwischen verschiedenen Zelltypen handelt. Die hier zusammengefasste Arbeit beschreibt die Rolle der ROS-Produktion bei der Aktivierung von Blutplättchen, die Beziehung zwischen dem NO/cGMP/PKG I Signalweg und der ROS bzw. MAP-Kinase Signaltransduktion, und die Rolle von zyklischen Nukleotiden bei der Entwicklung von Megakaryozyten und Blutplättchen. Werden Blutplättchen durch unterschiedliche Einflüsse aktiviert, so produzieren sie über die Aktivierung von NAD(P)H-Oxidase nur intrazelluläres aber nicht extrazelluläres ROS. Dabei beinflusst das in den Blutplättchen produzierte ROS signifikant die Aktivierung von αIIbβ3 Integrin, nicht jedoch die Sekretion von alpha- bzw. dichten Granula oder die Gestalt der Blutplättchen. Die Thrombin-induzierte Integrin αIIbβ3-Aktivierung ist nach Behandlung der Blutplättchen mit Hemmstoffen der NAD(P)H-Oxidase oder Superoxid-Fängern signifikant reduziert. Diese Inhibitoren reduzieren auch die Aggregation der Blutplättchen bzw. die Thrombusbildung auf Kollagen, wobei diese Effekte unabhängig vom NO/cGMP Signalweg vermittelt werden. Sowohl ADP, das von dichten Granula der Blutplättchen sezerniert wird und zur Aktivierung von P2Y12-Rezeptoren führt, als auch die Freigabe von Thromboxan A2 stellen wichtige, vorgeschaltete Vermittler bei der p38 MAP Kinase-Aktivierung durch Thrombin dar. Jedoch spielt die p38 MAP-Kinase-Aktivierung keine signifikante Rolle bei der Thrombin-induzierten Kalzium-Mobilisierung, P-Selektin Exprimierung, αIIbβ3 Integrin Aktivierung oder Aggregation der Blutplättchen. Abschliessend kann festgestellt werden, dass sich die Aktivierung der PKG insgesamt klar hemmend auf die p38 and ERK MAP-Kinasen in menschlichen Blutplättchen auswirkt. Desweiteren zeigt diese Studie, dass zyklische Nukleotide nicht nur die Blutplättchen hemmen, sondern auch einen Einfluss auf die Entwicklung der Megakaryozyten und Blutplättchen haben, aber auf unterschiedliche Weise. cAMP ist an der Differenzierung von embryonalen hämatopoietischen Zellen zu Megakaryozyten beteiligt, wobei cGMP keine Rolle bei diesem Prozess spielt. Während PKA in embryonalen Zellen schon vertreten ist, steigt beim Reifungsprozess der Megakaryozyten die Expression von Proteinen, die bei der cGMP Signalverbreitung („soluble guanylyl cyclase“, sGC; PKG) mitwirken, stetig an. In der letzten Phase der Reifung von Megakaryozyten, die durch die Freisetzung der Blutplättchen charakterisiert ist, zeigen cGMP und cAMP leicht divergierende Effekte: cGMP verstärkt die Bildung von Blutplättchen, während cAMP dieselbe reduziert. Dies deutet auf einen fein abgestimmten Prozess hin, abhängig von einem Stimulus, der von den benachbarten Zellen des Sinusoid-Endothels stammen könnte. Die Ergebnisse dieser Dissertation tragen zu einen besseren Verständnis der Regulation von Blutplättchen sowie der möglichen molekularen Mechanismen bei, die eine Rolle bei der Reifung von Megakaryozyten im vaskularen Mikroumfeld des Knochenmarks innehaben. N2 - In physiological conditions platelets have a major role in maintaining haemostasis. Platelets prevent bleeding from wounds by distinguishing normal endothelial cells in vasculature from areas with lesions to which they adhere. Interaction of platelet agonists and their receptors is controlled by intracellular signaling molecules that regulate the activation state of platelets. Very important intracellular signaling molecules are cyclic nucleotides (cGMP and cAMP), both involved in inhibition of platelet activation. Formation of cGMP and cAMP in platelets is stimulated by endothelial-derived NO and prostacyclin (PGI2), which then mediate inhibition of platelets by activating protein kinase G (PKG) and protein kinase A (PKA). Recently, it has been suggested that reactive oxygen species (ROS) represent new modulators of cell signaling within different cell types. The work summarized here describes the involvement of platelet ROS production in platelet activation, the relation of NO/cGMP/PKG I pathway to ROS and to mitogen-activated protein kinases (MAP kinase) signaling, and the involvement of cyclic nucleotides in megakaryocyte and platelet development. Platelets activated with different agonists produce intracellular but not extracellular ROS by activation of NAD(P)H oxidase. In addition, ROS produced in platelets significantly affects αIIbβ3 integrin activation but not alpha/dense granule secretion and platelet shape change. Thrombin induced integrin αIIbβ3 activation is significantly decreased after pretreatment of platelets with NAD(P)H oxidase inhibitors and superoxide scavengers. These inhibitors also reduce platelet aggregation and thrombus formation on collagen under high shear and achieve their effects independently of the NO/cGMP pathway. ADP secreted from platelet dense granules with subsequent activation of P2Y12 receptors as well as thromboxane A2 release are found to be important upstream mediators of p38 MAP kinase activation by thrombin. However, p38 MAP kinase activation does not significantly contribute to calcium mobilization, P-selectin expression, αIIbβ3 integrin activation and aggregation of human platelets in response to thrombin. Finally, PKG activation does not stimulate, but rather inhibit, p38 and ERK MAP kinases in human platelets. Further study revealed that cyclic nucleotides not only inhibit platelet activation, but are also involved, albeit differentially, in megakaryocyte and platelet development. cAMP is engaged in haematopoietic stem cell differentiation to megakaryocytes, and cGMP has no impact on this process. While PKA is already present in stem cells, expression of proteins involved in cGMP signaling (soluble guanylyl cyclase, sGC; PKG) increases with maturation of megakaryocytes. In the final step of megakaryocyte maturation that includes release of platelets, cGMP and cAMP have mild but opposing effects: cGMP increases platelet production while cAMP decreases it indicating a finely regulated process that could depend on stimulus coming from adjacent endothelial cells of sinusoids in bone marrow. The results of this thesis contribute to a better understanding of platelet regulation and of the possible molecular mechanisms involved in megakaryocyte maturation in bone marrow vascular microenvironment. KW - Thrombozyt KW - Megakaryozyt KW - Signaltransduktion KW - Stickstoffmonoxid KW - Cyclo-GMP KW - Reaktive Sauerstoffspezies KW - Plättchen KW - NO KW - cGMP KW - ROS KW - Megakaryozyten KW - Platelets KW - NO KW - cGMP KW - ROS KW - Megakaryocytes Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-21954 ER - TY - THES A1 - Stegner, David T1 - Novel Aspects of Platelet Signaling and of the Pathogenesis of Immune Thrombocytopenia T1 - Neue Aspekte in Signalwegen von Blutplättchen und in der Pathogenese der Immunthrombozytopenie N2 - This work summarizes the results of studies on three major aspects of platelet signaling and of the pathogenesis of immune thrombocytopenia. Therefore, this thesis is divided into three parts. i) Platelet activation and subsequent thrombus formation at sites of vascular injury is crucial for normal hemostasis, but it can also trigger myocardial infarction and stroke. The initial capture of flowing platelets to the injured vessel wall is mediated by the interaction of the glycoprotein (GP) Ib-V-IX complex with von Willebrand factor (vWF) immobilized on the exposed subendothelial extracellular matrix (ECM). The central importance of GPIb for platelet adhesion is well established, whereas GPV is generally considered to be of minor relevance for platelet physiology and thrombus formation. This study intended to clarify the relevance of this receptor during thrombus formation using Gp5-/- mice and mice with different double-deficiencies in GPV and in other platelet receptors. It was found that GPV and the collagen receptor integrin a2b1 have partially redundant functions in collagentriggered platelet aggregation. Further, it was revealed that GPV limits thrombus formation and impairs hemostasis in vivo. The data presented here demonstrate that the protective effect of GPVI-deficiency (another platelet collagen receptor) in arterial thrombosis and ischemic stroke depends on the expression of GPV. Moreover, it was demonstrated that lack of GPV restores the hemostatic function of mice lacking both GPVI and a2b1 or mice lacking GPVI and the C-type lectin receptor 2 (CLEC-2). Conclusively, GPV-depletion or blockade might have the potential to treat hemorrhagic disease states. ii) Platelets contain the two phospholipase (PL) D isoforms, PLD1 and PLD2, both of which presumably become activated upon platelet stimulation. However, the function of PLD in the process of platelet activation and aggregation has not been definitively explored. Thus, PLD-deficient mice were analyzed. Mice lacking PLD1 or PLD2 were viable, fertile and had normal platelet counts. PLD1 was found to be responsible for the inducible PLD-activity in platelets and to contribute to efficient integrin activation under static conditions. Moreover, flow adhesion experiments revealed that PLD1 is essential for efficient GPIb-mediated integrin activation. Consequently, Pld1-/- mice were protected from arterial thrombosis and ischemic brain infarction without affecting tail bleeding times. Hence, inhibition of PLD1 might be a novel approach for antithrombotic therapy. iii) Cellular activation of platelets or immune cells results in increased cytosolic calcium (Ca2+) levels. Store-operated calcium entry (SOCE) via the STIM1-Orai1 axis is the main route of Ca2+ entry downstream of immunoreceptor tyrosine-based activating motif (ITAM) receptor stimulation in mast cells and T cells. However, the requirement of Ca2+-mobilization in Fcg receptor (FcgR)-signaling and the relevance of STIM2 for T cell SOCE have been unclear. To address these questions, genetically modified mice lacking central molecules of the SOCE machinery were analyzed. Ca2+-measurements revealed that both STIM isoforms contribute to Ca2+-mobilization downstream of T cell receptor activation. Additionally, it was found that FcgR stimulation results in SOCE and is mediated by STIM1 and probably Orai1. Animal models of immune thrombocytopenia (ITP) revealed that SOCE is essential for platelet clearance and that both STIM isoforms contribute to the pathology of ITP. Moreover, in this work it was also demonstrated that STIM1 and Orai1 are essential in IgG-mediated systemic anaphylaxis. STIM2 contributes to IgG-mediated, but not to IgE-mediated anaphylaxis. The data indicate that interference with SOCE might become a new strategy to prevent or treat IgG-dependent autoimmune diseases. N2 - Diese Arbeit fasst Untersuchungen von drei wesentlichen Aspekten der Signalwege von Blutplättchen und der Pathogenese der Immunthrombozytopenie zusammen. Daher ist diese Doktorarbeit in drei Teile unterteilt. i) Die Aktivierung von Blutplättchen und die anschließende Thrombusbildung in Folge vaskulärer Verletzungen sind für die normale Hämostase elementar, sie können aber auch Herzinfarkt oder Schlaganfall verursachen. Die anfängliche Adhäsion zirkulierender Blutplättchen an der verletzten Gefäßwand wird durch die Wechselwirkung des Glykoprotein (GP) Ib-V-IX Komplexes mit dem auf der freigelegten subendothelialen Matrix immobilisierten von Willebrand Faktor (vWF) vermittelt. Die zentrale Bedeutung von GPIb für die Adhäsion von Blutplättchen ist lange bekannt, wohingegen GPV allgemein als unbedeutend für die Physiologie von Blutplättchen oder die Thrombusbildung angesehen wird. Das Ziel dieser Arbeit war, die Bedeutung dieses Rezeptors für die Thrombusbildung zu überprüfen. Hierfür wurden GPV-defiziente Mäuse und mehrere Mauslinien, denen neben GPV ein weiterer Plättchenrezeptor fehlte, analysiert. Es wurde festgestellt, dass GPV und der Kollagenrezeptor Integrin a2b1 teilweise redundante Funktionen in der Kollagenvermittelten Plättchenaggregation haben. Des Weiteren wurde gezeigt, dass GPV die Thrombusbildung begrenzt sowie die Wundstillung reguliert. Die hier gezeigten Daten belegen, dass GPV überraschenderweise für den Schutz vor arterieller Thrombose oder ischämischem Schlaganfall, der aus dem Fehlen des wichtigsten Kollagenrezeptors GPVI resultiert, benötigt wird. Außerdem wurde gezeigt, dass die Abwesenheit von GPV die Hämostase in Mäusen, denen GPVI und a2b1 oder GPVI und CLEC-2 (von C-type lectin receptor 2) fehlt, wieder herstellt. Folglich, könnte die pharmakologische Herabregulierung der GPV-Expression oder die Blockade des Rezeptors eine neue Behandlungsmöglichkeit von hämorrhagischen Krankheitszuständen darstellen. ii) Blutplättchen exprimieren die beiden Phospholipase (PL) D Isoformen PLD1 und PLD2, die vermutlich beide im Zuge der Blutplättchenstimulation aktiviert werden. Allerdings wurde die Rolle von PLD in der Thrombozytenaktivierung und -aggregation noch nicht abschließend untersucht. Daher wurden PLD-defiziente Mäuse analysiert. Mäuse, denen entweder PLD1 oder PLD2 fehlt, sind lebensfähig, fertil und haben normale Thrombozytenzahlen. Es zeigte sich, dass PLD1 für den induzierbaren Anteil der PLD-Aktivität in Blutplättchen verantwortlich und an der Integrinaktivierung unter statischen Bedingungen beteiligt ist. Des Weiteren ergaben Adhäsionsexperimente unter Flussbedingungen, dass PLD1 für die GPIb-vermittelte Integrinaktivierung von zentraler Bedeutung ist. Folglich sind Mäuse mit einer genetischen Ablation von PLD1 vor arterieller Thrombusbildung und ischämischem Schlaganfall geschützt. Da die Blutungszeiten dieser Tiere nicht verlängert waren, könnte die Inhibition von PLD1 einen anti-thrombotischen Therapieansatz darstellen. iii) Die zelluläre Aktivierung von Thrombozyten oder Immunzellen geht mit einem Anstieg der zytosolischen Kalziumkonzentration einher. Der sogenannte Speicher-vermittelte Kalziumeinstrom (store-operated calcium entry, SOCE) über die STIM1-Orai1-Achse ist der wichtigste Kalziumeinstrommechanismus in Folge der Stimulation von Rezeptoren mit einem immunoreceptor tyrosine-based activating motif (ITAM) in Mastzellen und T-Zellen. Allerdings ist die Notwendigkeit eines Kalziumeinstroms in Fcg Rezeptor (FcgR)-vermittelten Signalprozessen sowie die Relevanz von STIM2 hierbei noch unklar. Daher wurden gentechnisch veränderte Mäuse, denen zentrale Moleküle des SOCE-Apparats fehlen, untersucht. Kalziummessungen zeigten, dass beide STIM-Isoformen an der Kalziummobilisierung in Folge der T-Zellrezeptorstimulation beteiligt sind. Außerdem wurde gezeigt, dass die Stimulation von FcgRs zu SOCE führt, der von STIM1 und vermutlich auch von Orai1 vermittelt wird. Die Daten aus dem Immunthrombozytopenie (ITP) Tiermodell belegen, dass SOCE für die Zerstörung von Plättchen essentiell ist. Weiterhin sprechen die hiervorliegenden Ergebnisse für eine Rolle beider STIM Isoformen in der Pathologie der ITP. Außerdem konnte in dieser Arbeit nachgewiesen werden, dass STIM1 und Orai1 entscheidende Faktoren für IgG-vermittelte systemische Anaphylaxie sind. STIM2 ist ebenfalls an der IgG-vermittelten, nicht jedoch an der IgE-vermittelten Anaphylaxie beteiligt. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Eingriffe in den SOCE eine neue Strategie in der Behandlung von IgG-abhängigen immunologischen Erkrankungen sein könnten. KW - Thrombozyt KW - Phospholipase D KW - Calcium KW - Immunthrombozytopenie KW - Glycoprotein GPV KW - platelet KW - Immune Thrombocytopenia KW - phospholipase D KW - glycoprotein GPV KW - store-operated calcium entry Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-87980 ER - TY - THES A1 - Göb [née Klaus], Vanessa Aline Domenica T1 - Pathomechanisms underlying ischemic stroke T1 - Pathomechanismen des ischämischen Schlaganfalles N2 - Every year, stroke affects over 100 million people worldwide and the number of cases continues to grow. Ischemic stroke is the most prevalent form of stroke and rapid restoration of blood flow is the primary therapeutic aim. However, recanalization might fail or reperfusion itself induces detrimental processes leading to infarct progression. Previous studies identified platelets and immune cells as drivers of this so-called ischemia/reperfusion (I/R) injury, establishing the concept of ischemic stroke as thrombo-inflammatory disease. Reduced cerebral blood flow despite recanalization promoted the hypothesis that thrombus formation within the cerebral microcirculation induces further tissue damage. The results presented in this thesis refute this: using complementary methodologies, it was shown that infarct growth precedes the occurrence of thrombi excluding them as I/R injury-underlying cause. Blood brain barrier disruption is one of the hallmarks of ischemic stroke pathology and was confirmed as early event during reperfusion injury in the second part of this study. Abolished platelet α-granule release protects mice from vascular leakage in the early reperfusion phase resulting in smaller infarcts. Using in vitro assays, platelet α-granule-derived PDGF-AB was identified as one factor contributing to blood-brain barrier disruption. In vivo visualization of platelet activation would provide important insights in the spatio-temporal context of platelet activation in stroke pathology. As platelet signaling results in elevated intracellular Ca2+ levels, this is an ideal readout. To overcome the limitations of chemical calcium indicators, a mouse line expressing an endogenous calcium reporter specifically in platelets and megakaryocytes was generated. Presence of the reporter did not interfere with platelet function, consequently these mice were characterized in in vivo and ex vivo models. Upon ischemic stroke, neutrophils are among the first cells that are recruited to the brain. Since for neutrophils both, beneficial and detrimental effects are described, their role was investigated within this thesis. Neither neutrophil depletion nor absence of NADPH-dependent ROS production (Ncf-/- mice) affected stroke outcome. In contrast, abolished NET-formation in Pad4-/- mice resulted in reduced infarct sizes, revealing detrimental effects of NETosis in the context of ischemic stroke, which might become a potential therapeutic target. Cerebral venous (sinus) thrombosis, CV(S)T is a rare type of stroke with mainly idiopathic onset. Whereas for arterial thrombosis a critical contribution of platelets is known and widely accepted, for venous thrombosis this is less clear but considered more and more. In the last part of this thesis, it was shown that fab-fragments of the anti-CLEC-2 antibody INU1 trigger pathological platelet activation in vivo, resulting in foudroyant CVT accompanied by heavy neurological symptoms. Using this novel animal model for CVT, cooperative signaling of the two platelet receptors CLEC-2 and GPIIb/IIIa was revealed as major trigger of CVT and potential target for treatment. N2 - Jährlich sind weltweit über 100 Millionen Menschen von einem Schlaganfall betroffen, wobei die Zahl der Fälle weiter zunimmt. Der ischämische Schlaganfall ist die häufigste Form des Schlaganfalls, und die sofortige Wiederherstellung des Blutflusses ist das oberste Therapie¬ziel. Allerdings kommt es vor, dass die Rekanalisierung des betroffenen Gefäßes fehlschlägt oder die Reperfusion selbst zu schädlichen Prozessen führt, die das Fortschreiten des Infarkts begünstigen. In vorangegangen Studien wurden Thrombozyten und Immunzellen als treibende Kräfte dieser so genannten Ischämie/Reperfusion (I/R)-Schädigung identifiziert und der ischämische Schlaganfall als thrombo-inflammatorische Erkrankung definiert. Eine verminderte zerebrale Durchblutung trotz Rekanalisation führte zu der Hypothese, dass die Bildung von Thromben in der zerebralen Mikrozirkulation zu weiteren Gewebeschäden führt. Die hier vorgestellten Ergebnisse widerlegen dies: Mit Hilfe komplementärer Methoden konnte gezeigt werden, dass das Infarktwachstum dem Auftreten von Thromben vorausgeht, was diese als Ursache für die I/R-Verletzung ausschließt. Die Störung der Blut-Hirn-Schranke ist eines der charakteristischen Kennzeichen der Pathologie des ischämischen Schlaganfalls und wurde im zweiten Teil dieser Studie als frühes Ereignis während des Reperfusionsschadens bestätigt. Mit Hilfe transgener Mäuse konnte gezeigt werden, dass die Ausschüttung von α-Granula aus Thrombozyten in der frühen Reperfusionsphase an Störungen der Blut-Hirn-Schranke beteiligt ist und somit zum Infarktwachstum beiträgt. In in-vitro-Versuchen konnte gezeigt werden, dass PDGF-AB, ein Bestandteil der α-Granula, an Prozessen, die für die Beeinträchtigung der Blut-Hirn-Schranke verantwortlich sind, beteiligt ist. Die Sichtbarmachung von aktivierten Thrombozyten in vivo, würde wichtige Erkenntnisse über den räumlichen und zeitlichen Kontext der Aktivierung von Thrombozyten im Verlauf des Schlaganfalls liefern. Da alle aktivierenden Signalwege zum Anstieg des intrazellulären Kalziumspiegels führen, ist Kalzium ein idealer Indikator der Thrombozytenaktivierung. Um die Grenzen chemischer Kalziumindikatoren zu überwinden, wurde eine transgene Mauslinie erzeugt, welche einen endogenen Kalziumreporter speziell in Thrombozyten und Megakaryozyten exprimiert. Die Anwesenheit des Reporters hatte keine Auswirkung auf die Funktionalität der Thrombozyten und die Mäuse wurden in vivo sowie ex vivo in verschiedenen Experimenten charakterisiert. In der Folge eines ischämischen Schlaganfalles gehören Neutrophile zu den am frühesten ins Gehirn einwandernden Zellen. Dabei werden Neutrophilen sowohl günstige als auch schädliche Wirkungen auf den Verlauf des ischämischen Schlaganfalls zugeschrieben. Aus diesem Grund wurde ihre Rolle in dieser Arbeit näher untersucht. Weder die Abwesenheit von Neutrophilen noch das Fehlen der NADPH-abhängigen Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (Ncf1-/- Mäuse) beeinflussen den Ausgang eines Schlaganfalls. Im Gegensatz dazu, führte die Verhinderung der NET-Bildung (NET = neutrophil extracellular traps) in Pad4-/- Mäusen zu verringerten Infarktgrößen, was auf eine schädliche Wirkung der NETose im Zusammenhang des Schlaganfalls hinweist und somit ein therapeutisches Angriffsziel darstellen könnte. Sinusvenenthrombosen sind eine seltene Form des Schlaganfalls, die meist ohne bekannte Ursache auftreten. Während für die arterielle Thrombose ein kritischer Beitrag der Thrombozyten bekannt und weithin akzeptiert ist, ist dies für venöse Thrombosen weniger klar, wird aber immer mehr in Betracht gezogen. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde gezeigt, dass Fab-Fragmente des anti-CLEC-2-Antikörpers INU1 in vivo eine pathologische Aktivierung von Thrombozyten auslösen, die zu einer fulminanten Sinusvenenthrombose mit schweren neurologischen Symptomen führt. Mit Hilfe dieses neuartigen Tiermodells wurde die zusammenwirkende Signalübertragung der beiden Thrombozytenrezeptoren CLEC-2 und GPIIb/IIIa als Hauptauslöser der Sinusvenenthrombose und damit potenzielles Ziel für eine Behandlung identifiziert. KW - Schlaganfall KW - Thrombozyt KW - Maus KW - Blut-Hirn-Schranke KW - Sinusthrombose KW - thrombo-inflammation KW - ischemic stroke KW - blood brain barrier KW - CVT KW - platelets Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-286727 ER - TY - THES A1 - Zimmermann [née Papp], Lena T1 - Platelets as modulators of blood-brain barrier disruption and inflammation in the pathophysiology of ischemic stroke T1 - Thrombozyten als Modulatoren der Blut-Hirn-Schrankenstörung und Inflammation in der Pathophysiologie des ischämischen Schlaganfalls N2 - Ischemia-reperfusion injury (I/R injury) is a common complication in ischemic stroke (IS) treatment, which is characterized by a paradoxical perpetuation of tissue damage despite the successful re-establishment of vascular perfusion. This phenomenon is known to be facilitated by the detrimental interplay of platelets and inflammatory cells at the vascular interface. However, the spatio-temporal and molecular mechanisms underlying these cellular interactions and their contribution to infarct progression are still incompletely understood. Therefore, this study intended to clarify the temporal mechanisms of infarct growth after cerebral vessel recanalization. The data presented here could show that infarct progression is driven by early blood-brain-barrier perturbation and is independent of secondary thrombus formation. Since previous studies unravelled the secretion of platelet granules as a molecular mechanism of how platelets contribute to I/R injury, special emphasis was placed on the role of platelet granule secretion in the process of barrier dysfunction. By combining an in vitro approach with a murine IS model, it could be shown that platelet α-granules exerted endothelial-damaging properties, whereas their absence (NBEAL2-deficiency) translated into improved microvascular integrity. Hence, targeting platelet α-granules might serve as a novel treatment option to reduce vascular integrity loss and diminish infarct growth despite recanalization. Recent evidence revealed that pathomechanisms underlying I/R injury are already instrumental during large vessel occlusion. This indicates that penumbral tissue loss under occlusion and I/R injury during reperfusion share an intertwined relationship. In accordance with this notion, human observational data disclosed the presence of a neutrophil dominated immune response and local platelet activation and secretion, by the detection of the main components of platelet α-granules, within the secluded vasculature of IS patients. These initial observations of immune cells and platelets could be further expanded within this thesis by flow cytometric analysis of local ischemic blood samples. Phenotyping of immune cells disclosed a yet unknown shift in the lymphocyte population towards CD4+ T cells and additionally corroborated the concept of an immediate intravascular immune response that is dominated by granulocytes. Furthermore, this thesis provides first-time evidence for the increased appearance of platelet-leukocyte-aggregates within the secluded human vasculature. Thus, interfering with immune cells and/or platelets already under occlusion might serve as a potential strategy to diminish infarct expansion and ameliorate clinical outcome after IS. N2 - Eine häufig auftretende Komplikation in der Behandlung des ischämischen Schlaganfalls ist der Ischämie/Reperfusion Schaden (I/R Schaden), welcher trotz der erfolgreichen Wiederherstellung der zerebralen Durchblutung durch ein paradoxes Fortschreiten des entstandenen Gewebeschadens charakterisiert ist. Dieses Phänomen wird durch das schädigende Zusammenspiel von Thrombozyten und inflammatorischen Zellen am vaskulären Endothel verursacht. Allerdings sind die räumlich-temporalen und molekularen Mechanismen dieser zellulären Interaktionen und deren Beteiligung am Infarktwachstum noch nicht vollständig verstanden. Daraus folgend, beabsichtigte diese Arbeit eben diese temporalen Mechanismen des fortschreitenden Infarktwachstums nach der zerebralen Gefäßwiedereröffnung aufzuklären. Die hier vorgestellten Daten implizieren, dass das anhaltende Fortschreiten des Gewebeschadens durch die Schädigung der Bluthirnschranke verursacht wird und somit unabhängig vom Auftreten sekundär gebildeter Thromben ist. In vorangegangenen Studien konnte die Freisetzung von thrombozytären Granula als molekularer Mechanismus, mit welchem Thrombozyten zum I/R Schaden beitragen, aufgedeckt werden. Basierend auf diesen Studien wurde in dieser Arbeit ein besonderes Augenmerk auf die Sekretion thrombozytärer Granula im Zusammenhang mit der Beeinträchtigung der endothelialen Barriere gelegt. Durch die Kombination eines in vitro Ansatzes mit einem murinen Model des ischämischen Schlaganfalls konnte gezeigt werden, dass α-Granula endothelialen Schaden verursachen, wohingegen deren Absenz (NBEAL2 Defizienz) zu einer verbesserten mikrovaskulären Integrität führte. Aufgrund dessen könnte das Adressieren der α-Granula als eine neuartige Therapieoption zum Erhalt der vaskulären Integrität und zur Verminderung des Infarktwachstums trotz Rekanalisation genutzt werden. Neuste Erkenntnisse enthüllten, dass die dem I/R Schaden zu Grunde liegenden Pathomechanismen bereits während des Verschlusses eines großen hirnversorgenden Gefäßes zu beobachten sind. Dies deutet darauf hin, dass der Verlust von penumbralem Gewebe unter Okklusion und I/R Schädigung während der Reperfusion im engen Zusammenhang stehen. Im Einklang hiermit konnten humane Daten eine Neutrophilen-dominierte Immunantwort und lokale Thrombozyten Aktivierung und deren Sekretion, anhand der Detektion der α-Granula Hauptkomponenten, im verschlossenen Gefäßsystem von ischämischen Schlaganfall Patienten nachweisen. Diese anfänglichen Beobachtungen konnten im Rahmen dieser Arbeit anhand durchflusszytometrischer Untersuchungen von lokal abgenommenen ischämischen Blutproben erweitert werden. Die Phänotypisierung von Immunzellen enthüllte eine bisher unbekannte Verschiebung der Lymphozyten Population hin zu CD4+ T-Zellen und bekräftigte zusätzlich das Konzept einer unmittelbaren intravaskulären Immunantwort, welche durch Granulozyten dominiert wird. Darüber hinaus konnte in dieser Thesis das erste Mal das erhöhte Auftreten von Thrombozyten-Leukozyten-Aggregaten in dem verschlossenen humanen Gefäßsystem nachgewiesen werden. Demzufolge könnte eine Beeinflussung von Immunzellen und/oder Thrombozyten bereits unter Okklusion als potentiell vielversprechende Strategie genutzt werden, um die Ausweitung des Infarktes einzuschränken und klinische Endpunkte nach einem ischämischen Schlaganfall zu verbessern. KW - Schlaganfall KW - Thrombozyt KW - Entzündung KW - Thrombo-inflammation KW - Ischemic stroke KW - Platelets KW - Inflamamtion KW - Immune cells KW - Vascular system Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-302850 ER - TY - THES A1 - Hubertus, Katharina T1 - Regulation des cAMP Spiegel und der Signaltransduktion in humanen Thrombozyten durch Prostanoid-Rezeptoren T1 - Regulation of cAMP level and signaltransduction in human platelets by prostanoid-receptors N2 - Prostanoide wirken über Prostanoid-Rezeptoren auf die Aktivierung oder Hemmung der Thrombozyten. In dieser Arbeit wurde die Existenz und Funktionsweise der Prostanoid-Rezeptoren anhand synthetischer Agonisten und Antagonisten in humanen Thrombozyten nachgewiesen. Weiter wurde untersucht, über welche Prostanoid-Rezeptoren die Signaltransduktion der natürlichen Agonisten wie PGE2, PGE1 und PGA1 vermittelt wird, sowie das Zusammenspiel der Prostanoid-Rezeptoren auf die Aktivierung oder Hemmung der Thrombozyten gezeigt. Das Vorhandensein der Prostaglandin E2 Synthase 3 wurde nachgewiesen sowie erste Anhaltspunkte für die Existenz eines Komplexes aus Prostaglandin E2 Synthase 3, Hitzeschockprotein-90 sowie Casein Kinase 2 gezeigt. N2 - Prostanoids act to platelet activation or inhibition via prostanoid-receptors. In this work, the existence and function of prostanoid receptors in human platelets was shown by using sythetic agonists and antagonists. Further, the prostanoid receptors taking part at the signaltransduction induced by endogen prostanoids like PGE2, PGE1 and PGA1 were examinated. The interactions of the prostanoid receptors in platelet activation and inhibition were shown. The existence of prostaglandin E2 synthase 3 in human platelets was shown and first evidence for a complexe of prostaglandin E2 synthase 3, heat shock protein 90 and casein kinase 2 was given. KW - Prostaglandine KW - Rezeptor KW - Cyclo-AMP KW - Prostanoid-Rezeptor KW - cAMP KW - Prostanoide KW - Thrombozyt KW - prostanoid receptor KW - platelets KW - cAMP KW - prostanoids Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-71996 ER - TY - THES A1 - Mott, Kristina T1 - Regulation of platelet biogenesis in the native and myeloablated bone marrow niche T1 - Die Regulation der Thrombozytenbiogenese im nativen und myeloablatierten Knochenmark N2 - Megakaryocytes (MKs) are the largest cells of the hematopoietic system and the precursor cells of platelets. During proplatelet formation (PPF) bone marrow (BM) MKs extent large cytoplasmic protrusions into the lumen of sinusoidal blood vessels. Under homeostatic conditions PPF occurs exclusively in the direction of the sinusoid, while platelet generation into the marrow cavity is prevented. So far, the mechanisms regulating this process in vivo are still not completely understood, especially when PPF is deregulated during disease. This thesis investigated the mechanisms of PPF in native BM and after myeloablation by total body irradiation (TBI). First, we have identified a specialized type of BM stromal cells, so called CXCL12-abundant reticular (CAR) cells, as novel possible regulators of PPF. By using complementary high-resolution microscopy techniques, we have studied the morphogenetic events at the MK/vessel wall interface in new detail, demonstrating that PPF formation preferentially occurs at CAR cell-free sites at the endothelium. In the second part of this thesis, we analyzed the processes leading to BM remodeling in response to myeloablation by TBI. We used confocal laser scanning microscopy (CLSM) to study the kinetic of radiation-triggered vasodilation and mapped extracellular matrix (ECM) proteins after TBI. We could demonstrate that collagen type IV and laminin α5 are specifically degraded at BM sinusoids. At the radiation-injured vessel wall we observed ectopic release of platelet-like particles into the marrow cavity concomitantly to aberrant CAR cell morphology, suggesting that the balance of factors regulating PPF is disturbed after TBI. ECM proteolysis is predominantly mediated by the matrix metalloproteinase MMP9, as revealed by gelatin-zymography and by a newly established BM in situ zymography technique. In transgenic mice lacking MMP9 vascular recovery was delayed, hinting towards a role of MMP9 in vessel reconstitution after myeloablation. In a third series of experiments, we studied the irradiated BM in the context of hematopoietic stem cell transplantation (HSCT). By using mice as BM donors that ubiquitously express the fluorescent reporter protein dsRed we tracked engraftment of donor cells and especially MKs in the recipient BM. We found a distinct engraftment pattern and cluster formation for MKs, which is different from other blood cell lineages. Finally, we assessed platelet function after TBI and HSCT and were the first to demonstrate that platelets become massively hyporeactive, particularly upon stimulation of the collagen receptor GPVI. In summary, our findings shed light on the processes of PPF during health and disease which will help to develop treatments for aberrant thrombopoiesis. N2 - Megakaryozyten (MKs) sind die größten Zellen des hämatopoetischen Systems und die Vorläuferzellen der Blutplättchen. Während der Ausbildung von Proplättchen schnüren MKs im Knochenmark (KM) große zytoplasmatische Ausläufer in das Lumen der sinusoidalen Blutgefäße ab. Unter homöostatischen Bedingungen erfolgt die Proplättchenbildung ausschließlich in Richtung der Sinusoide, während die Thrombozytenbildung in die Knochenmarkkavität verhindert wird. Bislang sind die Mechanismen, die diesen Prozess in vivo steuern, noch nicht vollständig aufgeklärt insbesondere, wenn die Thrombozytenbiogenese unter Krankheitsbedingungen dereguliert ist. In dieser Arbeit wurden die Mechanismen der Thrombopoese im nativen Knochenmark und nach Myeloablation durch Ganzkörperbestrahlung (total body irradiation, TBI) untersucht. Zunächst haben wir einen spezialisierten Typ von KM-Stromazellen, die sog. CXCL12-abundant reticular (CAR) Zellen, als neue mögliche Regulatoren der Proplättchenbildung identifiziert. Durch den Einsatz komplementärer hochauflösender Mikroskopietechniken haben wir die morphogenetischen Vorgänge an der Schnittstelle zwischen MKs und Gefäßwand genauer untersucht und gezeigt, dass die Generierung von Proplättchen bevorzugt an CAR-Zell-freien Stellen am Endothel stattfindet. Im zweiten Teil dieser Arbeit analysierten wir die Prozesse, die zum Knochenmarkumbau nach Myeloablation durch TBI führen. Mit Hilfe von konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie untersuchten wir die Kinetik der strahleninduzierten Vasodilatation und kartierten die extrazelluläre Matrix (EZM) Proteine nach TBI. So konnten wir zeigen, dass Kollagen Typ IV und Laminin α5 spezifisch an den Knochenmarksinusoiden abgebaut werden. An der strahlengeschädigten Gefäßwand beobachteten wir die ektope Freisetzung plättchenartiger Partikel in die Knochenmarkkavität, die mit einer abnormalen CAR-Zellmorphologie einherging. Dies weist darauf hin, dass das Gleichgewicht der Faktoren, die die gerichtete Proplättchenbildung regulieren, nach TBI gestört ist. Die EZM-Proteolyse wird vor allem durch die Matrix-Metalloproteinase MMP9 vermittelt, was durch Gelatine-Zymographie und durch eine neu etablierte in situ Zymographie-Technik für das Knochenmark nachgewiesen wurde. Bei transgenen Mäusen, die defizient für MMP9 sind, war die Regeneration der Vaskulatur verzögert, was auf eine Rolle von MMP9 bei der Gefäßrekonstitution nach Myeloablation hindeutet. In einer dritten Versuchsreihe untersuchten wir das bestrahlte KM im Rahmen einer hämatopoetischen Stammzelltransplantation (HSZT). Mit Hilfe von Mäusen als KM-Spender, die ubiquitär das fluoreszierende Reporterprotein dsRed exprimieren, verfolgten wir das Anwachsen von Spenderzellen und insbesondere von MKs im Empfängerknochenmark. Wir beobachteten ein eindeutiges Muster bzw. Clusterbildung für anwachsende MKs, die sich von anderen Blutzelllinien unterschied. Schließlich untersuchten wir die Funktion von Thrombozyten nach TBI und HSZT und konnten als erste zeigen, dass Thrombozyten eine massive Hyporeaktivität ausbilden, insbesondere nach Stimulation des Kollagenrezeptors GPVI. Zusammenfassend geben unsere Ergebnisse Aufschluss über die Prozesse der Thrombopoese im nativen und pathologischen Knochenmark, was zur Entwicklung von Therapien zu Behandlung von defekter Thrombozytenbiogenese beitragen wird. KW - Knochenmark KW - Knochenmarktransplantation KW - Megakaryozyt KW - Thrombozyt KW - Ganzkörperbestrahlung KW - bone marrow KW - myeloablation KW - thrombopoiesis Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-289630 ER - TY - THES A1 - Morowski, Martina T1 - Relevance of platelet count and ITAM-signalling pathway in murine models of haemostasis, thrombosis and thrombo-inflammation T1 - Relevanz der Thrombozytenzahl und des ITAM-Signalwegs in Mausmodellen der Hämostase, Thrombose und Thromboinflammation N2 - Platelets are important players in haemostasis and their activation is essential to limit post-traumatic blood loss upon vessel injury. On the other hand, pathological platelet activation may lead to thrombosis resulting in myocardial infarction and stroke. Platelet activation and subsequent thrombus formation are, therefore, tightly regulated and require a well-defined interplay of platelet surface receptors, intracellular signalling molecules, cytoskeletal rearrangements and the activation of the coagulation cascade. In vivo thrombosis and haemostasis models mimic thrombus formation at sites of vascular lesions and are frequently used to assess thrombotic and haemostatic functions of platelets. In this dissertation, different in vivo models were used in mice to address the question at what level a reduced platelet count (PC) compromises stable thrombus formation. To study this, mice were rendered thrombocytopenic by low-dose anti-GPIbα antibody treatment and subjected to a tail bleeding time assay as well as to four different in vivo thrombosis models. Haemostasis and occlusive thrombus formation in small vessels were only mildly affected even at severe reductions of the PC. In contrast, occlusive thrombus formation in larger arteries required higher PCs demonstrating that considerable differences in the sensitivity for PC reductions exist between these models. In a second part of this study, mice were rendered thrombocytopenic by injection of high-dose anti-GPIbα antibody which led to the complete loss of all platelets from the circulation for several days. During recovery from thrombocytopenia, the newly generated platelet population was characterised and revealed a defect in immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM)-signalling. This defect translated into impaired arterial thrombus formation. To further investigate ITAM-signalling in vivo, genetically modified mice were analysed which display a positive or negative regulation of platelet ITAM-signalling in vitro. Whereas mice lacking the adapter Grb2 in platelets showed a delayed thrombus formation in vivo after acetylsalicylic acid treatment, Clp36ΔLIM bone marrow chimeric mice and SLAP/SLAP2-deficient mice displayed pro-thrombotic properties in vivo. Finally, mice lacking the adapter protein EFhd2 were analysed in vitro and in vivo. However, EFhd2-deficient platelets showed only a minor increase in the procoagulant activity compared to control. N2 - Thrombozyten sind wichtige Zellen für die Hämostase, die bei einer Verletzung der Gefäßwand aktiviert werden, um den Blutverlust zu begrenzen. Auf der anderen Seite kann die pathologische Aktvierung von Thrombozyten jedoch zu Thromboseereignissen und in Konsequenz zu Schlaganfall und Herzinfarkt führen. Die Aktivierung von Thrombozyten und die nachfolgende Thrombusbildung sind daher streng reguliert und setzen ein enges Zusammenspiel von Thrombozytenoberflächenrezeptoren, intrazellulären Signalmolekülen, Zytoskelettumstrukturierungen und die Aktivierung der Koagulationskaskade voraus. In vivo Thrombose- und Hämostase-Modelle ahmen die Thrombusbildung in Gefäßen nach und werden häufig benutzt um die hämostatische und thrombotische Funktion von Thrombozyten zu untersuchen. In dieser Dissertation wurden verschiedene in vivo Modelle in Mäusen genutzt, um zu klären, ab welcher Thrombozytenzahl eine stabile Thrombusbildung beeinträchtigt ist. Für diese Untersuchung wurden Mäuse mit geringen Dosen anti-GPIbα Antikörper behandelt, die zu einer Reduktion der Thrombozytenzahl führen. Anschließend wurden die Mäuse in einem Blutungszeitmodel und vier verschiedenen thrombotischen Modellen untersucht. Hämostase oder okklusive Thrombusbildung in kleinen Gefäßen waren auch bei einer sehr starken Reduktion der Thrombozytenzahl kaum beeinträchtigt. Im Gegensatz dazu war für eine normale Thrombusbildung in größeren Gefäßen eine höhere Thrombozytenzahl nötig. Verschiedene in vivo Modelle zeigen daher eine unterschiedliche Sensitivität gegenüber einer Reduktion der Thrombozytenzahl. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden Mäuse mit einer hohen Dosis anti-GPIbα Antikörper behandelt, die zu einem völligen, mehrtägigen Verlust aller Thrombozyten im Blutkreislauf führte. Während sich die Thrombozytenzahl erholte, wurden neu generierte Thrombozyten charakterisiert, die einen deutlichen Defekt im ITAM-Signalweg zeigten. Dieser Defekt führte zu einer verminderten arteriellen Thrombusbildung. Um Auswirkungen eines Defektes im ITAM-Signalweg detaillierter in vivo zu untersuchen, wurden genetisch veränderte Mäuse, die in vitro eine reduzierte oder verstärkte ITAM-Signaltransduktion in Thrombozyten zeigen, untersucht. Während Mäuse, die in Thrombozyten kein Grb2 exprimieren nach Acetylsalicylsäurebehandlung in vivo eine verlangsamte Thrombusbildung zeigten, war die Thrombusbildung in Clp36ΔLIM Knochenmarkchimären und SLAP/SLAP2-defizienten Mäusen beschleunigt. Darüber hinaus wurden EFhd2-defiziente Mäuse in vitro und in vivo analysiert. EFhd2-defiziente Thrombozyten zeigten jedoch nur eine geringe Steigerung in der prokoagulatorischen Aktivität im Vergleich zu Kontrolltieren. KW - Thrombozyt KW - Platelet count KW - ITAM-signalling KW - Murine models of thrombosis and haemostasis KW - Maus KW - Blutstillung KW - Thrombose Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-99193 ER - TY - THES A1 - Semeniak, Daniela T1 - Role of bone marrow extracellular matrix proteins on platelet biogenesis and function T1 - Die Rolle der extrazellulären Matrixproteine des Knochenmarks auf die Thrombozytenbiogenes und -funktion N2 - Platelets, small anucleated blood cells responsible for hemostasis, interact at sights of injury with several exposed extracellular matrix (ECM) proteins through specific receptors. Ligand binding leads to activation, adhesion and aggregation of platelets. Already megakaryocytes (MKs), the immediate precursor cells in bone marrow (BM), are in constant contact to these ECM proteins (ECMP). The interaction of ECMP with MKs is, in contrast to platelets, less well understood. It is therefore important to study how MKs interact with sinusoids via the underlying ECMP. This thesis addresses three major topics to elucidate these interactions and their role in platelet biogenesis. First, we studied the topology of ECMP within BM and their impact on proplatelet formation (PPF) in vitro. By establishing a four-color immunofluorescence microscopy we localized collagens and other ECMP and determined their degree of contact towards vessels and megakaryocytes (MKs). In in vitro assays we could demonstrate that Col I mediates increased MK adhesion, but inhibits PPF by collagen receptor GPVI. By immunoblot analyses we identified that the signaling events underyling this inhibition are different from those in platelet activation at the Src family kinase level. Second, we determined the degree of MK-ECM interaction in situ using confocal laser scanning microscopy of four-color IF-stained femora and spleen sections. In transgenic mouse models lacking either of the two major collagen receptors we could show that these mice have an impaired association of MKs to collagens in the BM, while the MK count in spleen increased threefold. This might contribute to the overall unaltered platelet counts in collagen receptor-deficient mice. In a third approach, we studied how the equilibrium of ECMP within BM is altered after irradiation. Collagen type IV and laminin-α5 subunits were selectively degraded at the sinusoids, while the matrix degrading protease MMP9 was upregulated in MKs. Platelet numbers decreased and platelets became hyporesponsive towards agonists, especially those for GPVI activation. Taken together, the results indicate that MK-ECM interaction differs substantially from the well-known platelet-ECM signaling. Future work should further elucidate how ECMP can be targeted to ameliorate the platelet production and function defects, especially in patients after BM irradiation. N2 - Thrombozyten, kleine kernlose Zellen, die für die Hämostase verantwortlich sind, interagieren an verletzten Gefäßwänden mit exponierten extrazellulären Matrixproteinen (EZMP) durch Oberflächenrezeptoren. Durch die Ligandenbindung werden die Thrombozyten aktiviert, adhärieren und aggregieren schlussendlich. Schon Megakaryozyten (MKs), die unmittelbaren Vorläuferzellen im Knochenmark (KM), stehen ebenfalls mit EZMP im ständigen Kontakt. Im Gegensatz zur Thrombozyteninteraktion ist die Interaktion der MKs mit EZMP jedoch nicht sehr gut untersucht. Aus diesem Grund ist es wichtig zu verstehen wie MKs mit Sinusoiden durch die darunterliegenden EZMP interagieren. Diese Doktorarbeit beleuchtet dazu drei Hauptthemen, die zu einem besseren Verständnis dieser Interaktion und dessen Rolle in der Thrombozytenbildung beitragen. In einem ersten Themenblock klärten wir die Topologie verschiedener EZMP des Knochenmarks und deren Rolle bei der Proplättchenbildung auf. Durch die Etablierung einer Vierfarben-Immunfluoreszenzmikroskopie, lokalisierten wir verschiedene Kollagene und andere EZMP im KM und bestimmten deren Kontakt zu Gefäßen und MKs. In in vitro-Ansätzen konnten wir demonstrieren, dass Kollagen Typ I eine erhöhte Adhäsion von MKs vermittelt, aber die Proplättchenbildung durch den Kollagenrezeptor GPVI inhibiert. Mittels Immunoblotanalysen identifizierten wir eine Signalkaskade, die von der Thrombozytenaktivierung auf der Ebene der Src family Kinasen abweicht. In einem zweiten Themenkomplex bestimmten wir in situ den Grad an Interaktion von MKs mit EZMP mittels konfokaler Laserscanning-Mikroskopie von vierfach immunfluoreszenzgefärbten Femora- und Milzschnitten. In transgenen Mäusen, denen einer der zwei Hauptkollagenrezeptoren fehlen, konnten wir zeigen, dass MKs dieser Mäuse eine veränderte Assoziation zu Kollagenen im Knochenmark aufweisen, während die MK-Anzahl in der Milz um das Dreifache anstieg. Dies könnte insgesamt zur unbeeinflussten Thrombozytenzahl in diesen Mäusen beitragen. In einem dritten Themenkomplex untersuchten wir wie das Gleichgewicht im Knochenmark nach Bestrahlung beeinflusst ist. Spezifisch Kollagen Typ IV und laminin-α5 waren an den Sinusoiden degradiert, während die Expression der matrixabbauenden Protease MMP-9 in MKs hochreguliert war. Die Thrombozytenzahl sank und sie wurden hyporesponsiv auf Agonisten, speziell auf diejenigen für die GPVI-Aktivierung. Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse, dass die Interaktion von MKs mit EZMP sich substantiell von der Thrombozyten-EZMP vermittelten Signaltransduktion unterscheidet. Zukünftige Untersuchungen sollen weiter beleuchten wie EZMP gezielt beeinflusst werden können um Defekte in der Thrombozytenproduktion und –funktion abzumildern, besonders in Patienten nach Bestrahlung. KW - Knochenmark KW - Thrombozyt KW - Extracellular matrix proteins KW - platelet biogenesis KW - Extrazelluläre Matrix KW - Megakaryocytes KW - platelets Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-155857 ER - TY - THES A1 - Heck, Johannes T1 - Role of cyclase-associated protein 2 in platelet function and description of an inherited macrothrombocytopenia T1 - Rolle von cyclase-associated protein 2 in der Thrombozytenfunktion und Beschreibung einer erblich bedingten Makrothrombozytopenie N2 - Cyclase-associated protein (CAP)2 is an evolutionarily highly conserved actin-binding protein implicated in striated muscle development, carcinogenesis, and wound healing in mammals. To date, the presence as well as the putative role(s) of CAP2 in platelets, however, remain unknown. Therefore, mice constitutively lacking CAP2 (Cap2gt/gt mice) were examined for platelet function. These studies confirmed the presence of both mammalian CAP isoforms, CAP1 and CAP2, in platelets. CAP2-deficient platelets were slightly larger than WT controls and displayed increased GPIIbIIIa activation and P-selectin recruitment in response to the (hem)ITAM-specific agonists collagen-related peptide and rhodocytin. However, spreading of CAP2-deficient platelets on a fibrinogen matrix was unaltered. In conclusion, the functionally redundant CAP1 isoform may compensate for the lack of CAP2 in murine platelets. Moreover, the studies presented in this thesis unveiled a severe macrothrombocytopenia that occurred independently of the targeted Cap2 allele and which was preliminarily termed orphan (orph). Crossing of the respective mice to C57BL/6J wild-type animals revealed an autosomal recessive inheritance. Orph mice were anemic and developed splenomegaly as well as BM fibrosis, suggesting a general hematopoietic defect. Strikingly, BM MKs of orph mice demonstrated an aberrant morphology and appeared to release platelets ectopically into the BM cavity, thus pointing to defective thrombopoiesis as cause for the low platelet counts. Orph platelets exhibited marked activation defects and spread poorly on fibrinogen. The unaltered protein content strongly suggested a defective alpha-granule release to account for the observed hyporesponsiveness. In addition, the cytoskeleton of orph platelets was characterized by disorganized microtubules and accumulations of filamentous actin. However, further experiments are required to elucidate the activation defects and cytoskeletal abnormalities in orph platelets. Above all, the gene mutation responsible for the phenotype of orph mice needs to be determined by next-generation sequencing in order to shed light on the underlying genetic and mechanistic cause. N2 - Cyclase-associated protein 2 (CAP)2 ist ein evolutionär hoch konserviertes Aktin-bindendes Protein, welches in der Entwicklung der quergestreiften Muskulatur, der Krebsentstehung und der Wundheilung von Säugetieren eine Rolle spielt. Bis heute sind jedoch das Vorhandensein sowie die mutmaßliche(n) Funktion(en) von CAP2 in Thrombozyten unbekannt. Aus diesem Grund wurden Mäuse, denen konstitutiv CAP2 fehlt (Cap2gt/gt-Mäuse), im Hinblick auf ihre Thrombozytenfunktion untersucht. Diese Untersuchungen bestätigten die Anwesenheit beider Säugetierisoforme von CAP, CAP1 und CAP2, in Thrombozyten. CAP2-defiziente Thrombozyten waren geringfügig größer als WT-Kontrollen und zeigten eine erhöhte GPIIbIIIa-Aktivierung und P-Selektin-Rekrutierung nach Stimulation durch die (hem)ITAM-spezifischen Agonisten collagen-related peptide und Rhodozytin. Demgegenüber verlief die Adhäsion (sog. spreading) CAP2-defizienter Thrombozyten auf einer Fibrinogen-Matrix unverändert. Dies legt den Schluss nahe, dass die funktionell redundante CAP1-Isoform in der Lage ist, den Mangel an CAP2 in Mäusethrombozyten zu kompensieren. Darüber hinaus offenbarten die in dieser Dissertation präsentierten Untersuchungen eine schwere Makrothrombozytopenie, welche unabhängig von dem veränderten Cap2-Allel auftrat und welche vorläufig als orphan (orph) bezeichnet wurde. Das Kreuzen der entsprechenden Mäuse mit C57BL/6J-Wildtyp-Tieren enthüllte einen autosomal rezessiven Erbgang. Orph-Mäuse waren anämisch und entwickelten eine Milzvergrößerung sowie eine Knochenmarkfibrose, was einen generellen hämatopoetischen Defekt nahelegte. Bemerkenswerterweise waren Knochenmarksmegakaryozten von orph-Mäusen morphologisch auffällig und gaben allem Anschein nach Thrombozyten ektop in das Knochenmarkstroma ab, was auf eine defekte Thrombopoese als Ursache für die niedrigen Thrombozytenzahlen hindeutet. Orph-Thrombozyten zeigten ausgesprochene Aktivierungsdefekte und adhärierten kaum auf Fibrinogen. Der unveränderte Gehalt an Proteinen lenkte den Verdacht auf eine defekte Exozytose von Alpha-Granula als Ursache der Mindererregbarkeit. Des Weiteren war das Zytoskelett von orph-Thrombozyten durch unorganisierte Mikrotubuli und Akkumulationen von filamentösem Aktin charakterisiert. Weitere Experimente sind jedoch notwendig, um die Aktivierungsdefekte und die Zytoskelettveränderungen aufzuklären. Vor allem aber muss die Genmutation, welche für den Phänotyp der orph-Mäuse verantwortlich ist, mittels Sequenziermethoden der nächsten Generation (next-generation sequencing) aufgeklärt werden um Aufschluss über die zugrunde liegende genetische und mechanistische Ursache zu geben. KW - Thrombozyt KW - Actin KW - Actin-bindende Proteine KW - Thrombozytopenie KW - platelets KW - actin cytoskeleton KW - actin-binding proteins KW - cyclase-associated protein KW - cyclase-associated protein 2 KW - inherited macrothrombocytopenia Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-179968 ER - TY - THES A1 - Teichmann, Lino Lars T1 - Stromabwärts der cGMP-abhängigen Proteinkinase in Thrombozyten - Physiologische und diagnostische Relevanz von VASP und Identifikation neuer Substrate T1 - Downstream of the cGMP-dependent protein kinase in platelets – physiological and diagnostic relevance of VASP and identification of new substrates N2 - Clopidogrel hat sich als potentes Medikament zur Verhinderung kardiovaskulärer Ereignisse sowohl bei Patienten mit akutem Koronarsyndrom ohne ST-Hebung (non-STE-ACS) als auch bei Patienten mit akutem Myokardinfarkt mit ST-Hebung (STEMI) erwiesen (CURE- und COMMIT-Studie). Insbesondere der Nutzen einer Vorbehandlung mit Clopidogrel bei perkutaner Koronarintervention ist bei Patienten mit non-STE-ACS und STEMI gut belegt (PCI-CURE- und PCI-CLARITY-Studie). Ein beträchtlicher Anteil der Patienten zeigt allerdings kein adäquates Ansprechverhalten auf Clopidogrel. Wir etablierten deswegen zusätzlich zu einem bereits bestehenden FACS-Assay, der den Effekt von Clopidogrel anhand der Phosphorylierung des Proteins VASP quantitativ bestimmt, einen neuartigen auf dem gleichen Prinzip beruhenden enzyme-immuno assay (EIA). In einer Doppelblindstudie mit gesunden Probanden spiegelten im systematischen Vergleich von VASP-EIA, VASP-FACS und anderer verbreiteter Verfahren (Aggregation, p-Selektin Expresssion, PFA100) sowohl die VASP-Assays als auch die Aggregation die Plättchen-Inhibition deutlich wider. Demgegenüber waren weder die p-Selektin Expression noch der PFA100 ein Indikator für den Clopidogrel-Effekt. Die VASP-Assays zeichneten sich im Vergleich zur Aggregation durch bessere Quantifizierbarkeit und eine enge Abhängigkeit von der Zielstruktur des Clopidogrels, dem P2Y12-Rezeptor, aus. So hatte eine Medikation mit Acetylsalicylsäure keinen Einfluss auf die VASP-Assays, verminderte allerdings die Aggregation. Weiterhin konnten wir im Rahmen der Probandenstudie durch Verwendung PAR- (protease activated receptor) spezifischer Peptide (SFFLRN, AYPGKF) und dem stabilen Thromboxan A2 Analog U46619 in ex-vivo Versuchen nachweisen, dass die antithrombozytären Eigenschaften des Clopidogrels zum Teil auf der indirekten Hemmung der Thrombin- und Thromboxan-induzierten Plättchenaktivierung beruhen. Diese Ergebnisse betonen die zentrale Bedeutung Galpha(i)-vermittelter Signalwege in Thrombozyten. Im zweiten Teil dieser Arbeit strebten wir an, neue Substrate der cGMP-abhängigen Proteinkinase zu identifizieren und das bekannte Substrat VASP weiter zu charakterisieren. Die Plättchenadhäsion und -aktivierung an der Zellwand sind initiale Ereignisse der arteriellen Thrombose. Prostacyclin und NO erhöhen die intrazelluläre Konzentration zyklischer Nukleotide (cAMP, cGMP). Dies führt zu einer umfassenden Inhibition der Thrombozyten, hauptsächlich durch Aktivierung der cAMP- bzw. cGMP-abhängige Proteinkinase (cAK, cGK). Es liegt bisher kein schlüssiges Bild davon vor, wie die Substrate der cAK und cGK die Plättcheninhibition regulieren. Wir identifizierten zunächst das adenylylcyclase-associated protein (CAP1) anhand der Analyse des humanen Plättchen-Phosphoproteoms als neues Substrat der cGK, das innerhalb von Sekunden nach SNP-Stimulation phosphoryliert wird. Die Separation des Phosphoproteoms erfolgte durch 2D-Gelelektrophorese. Wildtyp-CAP1 und Mutanten, bei denen an putativen Phosphorylierungsstellen Serin bzw. Threonin durch Alanin ausgetauscht wurde, wurden anschließend in PtK2-Zellen exprimiert. Bisher konnte die Ko-Transfektion von PtK2-Zellen mit CAP1 und cGK eine Phosphorylierung von CAP1 durch die cGK nicht bestätigen. Weitere Anstrengungen werden nötig sein, CAP1 als cGK-Substrat zu etablieren. Flusskammerversuche zeigten, dass die Hemmung der Thrombusformation durch SNP bei VASP-defizienten Mäusen im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen (WT) ineffektiv ist und belegen, dass die Inhibition der Agonisten-induzierten Thrombusformation durch den NO/cGMP-Signalweg in VASP-defizienten Plättchen gestört ist. VASP hatte in unseren Experimenten keinen signifikanten Einfluss auf die GPIIbIIIa-Aktivierung (gemessen mit dem monoklonalen Antikörper JON/A), die Serotonin-Sekretion (delta-Granula) und die p-Selektin-Expression (alpha-Granula). Die Ergebnisse legen nahe, dass die VASP-Deletion zu subtilen Störungen von Thrombozytenfunktionen führt, die erst in Experimenten deutlich zu Tage treten, die ihr Zusammenspiel abbilden. N2 - Dual-antiplatelet therapy with aspirin and clopidogrel has become the standard therapy to prevent cardiovascular complications of acute coronary syndrome and percutaneous coronary intervention. Increasing experience, however, indicates that a significant proportion of patients do not respond adequately to clopidogrel. We performed a double blinded clinical study with healthy volunteers receiving clopidogrel or placebo to compare various assays of platelet responsiveness, including two methods (a newly established enzyme immunoassay and a FACS assay) based on VASP phosphorylation, for monitoring clopidogrel action. In the clopidogrel group ADP-induced platelet aggregation and the ADP-induced decrease in iloprost-stimulated VASP phosphorylation was attenuated significantly as compared to the placebo group. P-selectin and PFA100 measurements failed to clearly distinguish between the placebo and clopidogrel group of this study. The VASP assays directly measure the function of the clopidogrel target, the P2Y12 receptor, and are selective for clopidogrel effects. Hence the VASP assays are, in contrast to platelet aggregation, not affected by aspirin. In the framework of the study we could additionally demonstrate that the antithrombocytic properties of clopidogrel are partly due to the indirect inhibition of the thrombin and thromboxane induced platelet activation. These results underline the importance of Galpha(i) mediated signalling pathways in platelets. Prostacyclin and NO increase the intracellular concentrations of cyclic nucleotides (cGMP, cAMP). This process results in platelet inhibition mainly by activation of the cGMP- and cAMP-dependent proteinkinase (cGK Ibeta, cAK). How these kinases regulate platelet inhibition is an active field of research. In the second part of the work we therefore sought to identify new substrates of the cGMP-dependent proteinkinase and to further characterize its well established substrate VASP. We initially identified the adenylylcyclase-associated protein (CAP1) as a new substrate of the cGK Ibeta analyzing the human platelet phosphoproteom by two-dimensional gel electrophoresis. To evaluate the role of CAP1 as an in vivo substrate of cGK Ibeta (and cAK) PtK-2 cells were transfected with wildtype CAP1 or the mutants S125A and T375A and cGK Ibeta simultaneously or with either protein alone. Phosphorylation of CAP1 by cGK I beta could not be confirmed as yet and further efforts will be necessary to answer the question whether CAP1 really is a cGK Ibeta substrate. Flowchamber experiments revealed that the inhibition of thrombus formation in whole blood of VASP deficient mice (when compared to wild type) was impaired with the NO donor sodium nitroprusside. Thus VASP plays a major role in the inhibitory NO/cGMP signalling pathway in platelets. KW - Blutstillung KW - Thrombozyt KW - Vasodilatator-stimuliertes Phosphoprotein KW - Clopidogrel KW - Haemostasis KW - platelets KW - Vasodilator-stimulated phosphoprotein KW - Clopidogrel Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-25843 ER - TY - THES A1 - Cherpokova, Deya T1 - Studies on modulators of platelet (hem)ITAM signaling and platelet production in genetically modified mice T1 - Untersuchungen an Modulatoren des thrombozytären (hem)ITAM-Signalwegs und der Thrombozytenbildung in genetisch veränderten Mäusen N2 - Summary Platelet activation and aggregation at sites of vascular injury is critical to prevent excessive blood loss, but may also lead to life-threatening ischemic disease states, such as myocardial infarction and stroke. Glycoprotein (GP) VI and C type lectin-like receptor 2 (CLEC-2) are essential platelet activating receptors in hemostasis and thrombo-inflammatory disease which signal through a (hem)immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM)-dependent pathway. The adapter molecules Src-like adapter protein (SLAP) and SLAP2 are involved in the regulation of immune cell receptor surface expression and signaling, but their function in platelets is unknown. As revealed in this thesis, single deficiency of SLAP or SLAP2 in mice had only moderate effects on platelet function, while SLAP/SLAP2 double deficiency resulted in markedly increased signal transduction, integrin activation, granule release, aggregation, procoagulant activity and thrombin generation following (hem)ITAM-coupled, but not G protein-coupled receptor activation. Slap-/-/Slap2-/- mice displayed accelerated occlusive arterial thrombus formation and a dramatically worsened outcome after focal cerebral ischemia. These results establish SLAP and SLAP2 as critical inhibitors of platelet (hem)ITAM signaling in the setting of arterial thrombosis and ischemic stroke. GPVI has emerged as a promising novel pharmacological target for treatment of thrombotic and inflammatory disease states, but the exact mechanisms of its immunodepletion in vivo are incompletely understood. It was hypothesized that SLAP and SLAP2 may be involved in the control of GPVI down-regulation because of their role in the internalization of immune cell receptors. As demonstrated in the second part of the thesis, SLAP and SLAP2 were dispensable for antibody-induced GPVI down-regulation, but anti-GPVI treatment resulted in prolonged strong thrombocytopenia in Slap-/-/Slap2-/- mice. The profound thrombocytopenia likely resulted from the powerful platelet activation which the anti-GPVI antibody induced in Slap-/-/Slap2-/- platelets, but importantly, not in wild-type platelets. These data indicate that the expression and activation state of key modulators of the GPVI signaling cascade may have important implications for the safety profile and efficacy of anti-GPVI agents. Small GTPases of the Rho family, such as RhoA and Cdc42, are critically involved in the regulation of cytoskeletal rearrangements during platelet activation, but little is known about the specific roles and functional redundancy of both proteins in platelet biogenesis. As shown in the final part of the thesis, combined deficiency of RhoA and Cdc42 led to marked alterations in megakaryocyte morphology and the generation of platelets of heterogeneous size and granule content. Despite severe hemostatic defects and profound thrombo¬cytopenia, circulating RhoA-/-/Cdc42-/- platelets were still capable of granule secretion and the formation of occlusive thrombi. These results implicate the existence of both distinct and overlapping roles of RhoA and Cdc42 in platelet production and function. N2 - Zusammenfassung Die Aktivierung und Aggregation von Thrombozyten nach einer Gefäßverletzung ist entscheidend, um einen starken Blutverlust zu vermeiden. Diese Prozesse können aber auch zu lebensbedrohlichen ischämischen Erkrankungen führen, wie beispielsweise Myokardinfarkt und Schlaganfall. Die aktivatorischen Thrombozytenrezeptoren Glykoprotein (GP) VI und C type lectin-like receptor 2 (CLEC-2) spielen eine wichtige Rolle im Prozess der Hämostase und Thrombo-Inflammation. Die Aktivierung beider Rezeptoren leitet eine (hem)immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM)-abhängige Signalkaskade ein. Die Adapterproteine Src-like adapter protein (SLAP) und SLAP2 sind an der Regulation der Oberflächenexpression von Immunzellrezeptoren und der Steuerung nachgeschalteter Signalwege beteiligt, aber ihre Funktion in Thrombozyten ist unbekannt. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die Einzeldefizienz von SLAP oder SLAP2 in Mäusen einen milden Effekt auf die Thrombozytenfunktion hatte. Hingegen führte das Fehlen beider Proteine zu deutlich verstärkter Signaltransduktion, Integrinaktivierung, Freisetzung von Granula, Aggregation, prokoagulatorischer Aktivität und Thrombingenerierung nach (hem)ITAM-abhängiger, aber nicht G Protein-gekoppelter Rezeptoraktivierung. Die SLAP/SLAP2-Doppeldefizienz ging mit beschleunigter Bildung okklusiver arterieller Thromben und dramatisch verschlechtertem Zustand nach fokaler zerebraler Ischämie einher. Diese Ergebnisse etablieren SLAP und SLAP2 als essentielle Inhibitoren des (hem)ITAM-Signalwegs in arterieller Thrombose und im ischämischen Schlaganfall. GPVI wird zunehmend als vielversprechender neuer pharmakologischer Angriffspunkt für die Behandlung von thrombotischen und entzündlichen Erkrankungen betrachtet. Die genauen Mechanismen der Herabregulierung von GPVI nach Antikörper-Gabe in vivo sind jedoch unvollständig aufgeklärt. Im Hinblick auf die Rolle von SLAP und SLAP2 in der Internalisierung von Immunzellrezeptoren wurde die Hypothese aufgestellt, dass beide Adapterproteine entscheidend an der Herabregulierung von GPVI beteiligt sein könnten. Im zweiten Teil dieser Dissertation wurde aber gezeigt, dass SLAP und SLAP2 nicht erforderlich sind für die Depletion von GPVI. Dagegen ging die Antikörper-induzierte Herabregulierung von GPVI mit lang anhaltender starker Thrombozytopenie in Slap-/-/Slap2-/- Mäusen einher. Der anti-GPVI-Antikörper induzierte eine starke Aktivierung von Slap-/-/Slap2-/- Thrombo¬zyten, nicht aber von Wildtypthrombozyten, was eine mögliche Erklärung für die schwere Thrombozytopenie lieferte. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Expression und der Aktivierungszustand von Molekülen, die die Feinregulierung der GPVI-Signalkaskade steuern, wichtige Auswirkungen auf das Sicherheitsprofil und die Wirksamkeit von an GPVI angreifenden Substanzen haben könnten. Kleine GTPasen der Rho-Proteinfamilie, wie z.B. RhoA und Cdc42, sind maßgeblich an der Regulation von Umstrukturierungen des Zytoskeletts während der Aktivierung von Thrombozyten beteiligt. Dennoch ist wenig über spezifische und überlappende Funktionen von RhoA und Cdc42 während der Thrombozyten-Biogenese bekannt. Der letzte Teil der Arbeit befasste sich mit den Auswirkungen einer Doppeldefizienz von RhoA und Cdc42 in Megakaryozyten. Das Fehlen beider Proteine führte zu einer dramatisch veränderten Megakaryozyten¬morphologie und zur Produktion von Thrombozyten heterogener Größe und Granulainhaltes. Trotz markanter Thrombozytopenie und stark beeinträchtigter Hämostase in den RhoA-/-/Cdc42-/- Mäusen waren zirkulierende Thrombozyten in der Lage, ihre Granula freizusetzen, und die Bildung okklusiver Thromben war weitestgehend unverändert. Diese Ergebnisse implizieren, dass RhoA und Cdc42 sowohl unterschiedliche als auch überlappende Rollen in der Produktion und Funktion von Thrombozyten spielen. KW - Thrombozyt KW - Platelets KW - Thrombozytenaggregation KW - platelet aggregation KW - megakaryocyte Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-120068 N1 - Aus datenschutzrechtlichen Gründen wurde der Zugriff auf den Volltext zu diesem Dokument gesperrt. Eine inhaltlich identische neue Version ist erhältlich unter: https://doi.org/10.25972/OPUS-30377 ER - TY - THES A1 - Cherpokova, Deya T1 - Studies on modulators of platelet (hem)ITAM signaling and platelet production in genetically modified mice T1 - Untersuchungen an Modulatoren des thrombozytären (hem)ITAM-Signalwegs und der Thrombozytenbildung in genetisch veränderten Mäusen N2 - Summary Platelet activation and aggregation at sites of vascular injury is critical to prevent excessive blood loss, but may also lead to life-threatening ischemic disease states, such as myocardial infarction and stroke. Glycoprotein (GP) VI and C type lectin-like receptor 2 (CLEC-2) are essential platelet activating receptors in hemostasis and thrombo-inflammatory disease which signal through a (hem)immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM)-dependent pathway. The adapter molecules Src-like adapter protein (SLAP) and SLAP2 are involved in the regulation of immune cell receptor surface expression and signaling, but their function in platelets is unknown. As revealed in this thesis, single deficiency of SLAP or SLAP2 in mice had only moderate effects on platelet function, while SLAP/SLAP2 double deficiency resulted in markedly increased signal transduction, integrin activation, granule release, aggregation, procoagulant activity and thrombin generation following (hem)ITAM-coupled, but not G protein-coupled receptor activation. Slap-/-/Slap2-/- mice displayed accelerated occlusive arterial thrombus formation and a dramatically worsened outcome after focal cerebral ischemia. These results establish SLAP and SLAP2 as critical inhibitors of platelet (hem)ITAM signaling in the setting of arterial thrombosis and ischemic stroke. GPVI has emerged as a promising novel pharmacological target for treatment of thrombotic and inflammatory disease states, but the exact mechanisms of its immunodepletion in vivo are incompletely understood. It was hypothesized that SLAP and SLAP2 may be involved in the control of GPVI down-regulation because of their role in the internalization of immune cell receptors. As demonstrated in the second part of the thesis, SLAP and SLAP2 were dispensable for antibody-induced GPVI down-regulation, but anti-GPVI treatment resulted in prolonged strong thrombocytopenia in Slap-/-/Slap2-/- mice. The profound thrombocytopenia likely resulted from the powerful platelet activation which the anti-GPVI antibody induced in Slap-/-/Slap2-/- platelets, but importantly, not in wild-type platelets. These data indicate that the expression and activation state of key modulators of the GPVI signaling cascade may have important implications for the safety profile and efficacy of anti-GPVI agents. Small GTPases of the Rho family, such as RhoA and Cdc42, are critically involved in the regulation of cytoskeletal rearrangements during platelet activation, but little is known about the specific roles and functional redundancy of both proteins in platelet biogenesis. As shown in the final part of the thesis, combined deficiency of RhoA and Cdc42 led to marked alterations in megakaryocyte morphology and the generation of platelets of heterogeneous size and granule content. Despite severe hemostatic defects and profound thrombo¬cytopenia, circulating RhoA-/-/Cdc42-/- platelets were still capable of granule secretion and the formation of occlusive thrombi. These results implicate the existence of both distinct and overlapping roles of RhoA and Cdc42 in platelet production and function. N2 - Zusammenfassung Die Aktivierung und Aggregation von Thrombozyten nach einer Gefäßverletzung ist entscheidend, um einen starken Blutverlust zu vermeiden. Diese Prozesse können aber auch zu lebensbedrohlichen ischämischen Erkrankungen führen, wie beispielsweise Myokardinfarkt und Schlaganfall. Die aktivatorischen Thrombozytenrezeptoren Glykoprotein (GP) VI und C type lectin-like receptor 2 (CLEC-2) spielen eine wichtige Rolle im Prozess der Hämostase und Thrombo-Inflammation. Die Aktivierung beider Rezeptoren leitet eine (hem)immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM)-abhängige Signalkaskade ein. Die Adapterproteine Src-like adapter protein (SLAP) und SLAP2 sind an der Regulation der Oberflächenexpression von Immunzellrezeptoren und der Steuerung nachgeschalteter Signalwege beteiligt, aber ihre Funktion in Thrombozyten ist unbekannt. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die Einzeldefizienz von SLAP oder SLAP2 in Mäusen einen milden Effekt auf die Thrombozytenfunktion hatte. Hingegen führte das Fehlen beider Proteine zu deutlich verstärkter Signaltransduktion, Integrinaktivierung, Freisetzung von Granula, Aggregation, prokoagulatorischer Aktivität und Thrombingenerierung nach (hem)ITAM-abhängiger, aber nicht G Protein-gekoppelter Rezeptoraktivierung. Die SLAP/SLAP2-Doppeldefizienz ging mit beschleunigter Bildung okklusiver arterieller Thromben und dramatisch verschlechtertem Zustand nach fokaler zerebraler Ischämie einher. Diese Ergebnisse etablieren SLAP und SLAP2 als essentielle Inhibitoren des (hem)ITAM-Signalwegs in arterieller Thrombose und im ischämischen Schlaganfall. GPVI wird zunehmend als vielversprechender neuer pharmakologischer Angriffspunkt für die Behandlung von thrombotischen und entzündlichen Erkrankungen betrachtet. Die genauen Mechanismen der Herabregulierung von GPVI nach Antikörper-Gabe in vivo sind jedoch unvollständig aufgeklärt. Im Hinblick auf die Rolle von SLAP und SLAP2 in der Internalisierung von Immunzellrezeptoren wurde die Hypothese aufgestellt, dass beide Adapterproteine entscheidend an der Herabregulierung von GPVI beteiligt sein könnten. Im zweiten Teil dieser Dissertation wurde aber gezeigt, dass SLAP und SLAP2 nicht erforderlich sind für die Depletion von GPVI. Dagegen ging die Antikörper-induzierte Herabregulierung von GPVI mit lang anhaltender starker Thrombozytopenie in Slap-/-/Slap2-/- Mäusen einher. Der anti-GPVI-Antikörper induzierte eine starke Aktivierung von Slap-/-/Slap2-/- Thrombo¬zyten, nicht aber von Wildtypthrombozyten, was eine mögliche Erklärung für die schwere Thrombozytopenie lieferte. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Expression und der Aktivierungszustand von Molekülen, die die Feinregulierung der GPVI-Signalkaskade steuern, wichtige Auswirkungen auf das Sicherheitsprofil und die Wirksamkeit von an GPVI angreifenden Substanzen haben könnten. Kleine GTPasen der Rho-Proteinfamilie, wie z.B. RhoA und Cdc42, sind maßgeblich an der Regulation von Umstrukturierungen des Zytoskeletts während der Aktivierung von Thrombozyten beteiligt. Dennoch ist wenig über spezifische und überlappende Funktionen von RhoA und Cdc42 während der Thrombozyten-Biogenese bekannt. Der letzte Teil der Arbeit befasste sich mit den Auswirkungen einer Doppeldefizienz von RhoA und Cdc42 in Megakaryozyten. Das Fehlen beider Proteine führte zu einer dramatisch veränderten Megakaryozyten¬morphologie und zur Produktion von Thrombozyten heterogener Größe und Granulainhaltes. Trotz markanter Thrombozytopenie und stark beeinträchtigter Hämostase in den RhoA-/-/Cdc42-/- Mäusen waren zirkulierende Thrombozyten in der Lage, ihre Granula freizusetzen, und die Bildung okklusiver Thromben war weitestgehend unverändert. Diese Ergebnisse implizieren, dass RhoA und Cdc42 sowohl unterschiedliche als auch überlappende Rollen in der Produktion und Funktion von Thrombozyten spielen. KW - Thrombozyt KW - Thrombozytenaggregation KW - Platelets KW - platelet aggregation KW - megakaryocyte Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-303777 N1 - Dieses Dokument wurde aus Datenschutzgründen - ohne inhaltliche Änderungen - erneut veröffentlicht. Die ursprüngliche Veröffentlichung war am 06.10.2017 ER - TY - THES A1 - Bender, Markus T1 - Studies on platelet cytoskeletal dynamics and receptor regulation in genetically modified mice T1 - Untersuchungen zur Zytoskelettdynamik und Rezeptorregulation in Blutplättchen genetisch modifizierter Mäuse N2 - Blutplättchen werden von Megakaryozyten im Knochenmark in einem Prozess produziert, an dem Aktin beteiligt ist. Aktin-Depolymerisierungsfaktor (ADF) und Cofilin sind Aktin-bindende Proteine, die als entscheidende Regulatoren im Aktinumsatz agieren, indem sie das Schneiden und Depolymerisieren von Filamenten unterstützen. Die Bedeutung von ADF/Cofilin und des Aktinumsatzes in der Bildung von Blutplättchen ist gegenwärtig nicht bekannt. In der vorliegenden Arbeit wurden Mäuse untersucht, die eine konstitutive ADF-Defizienz und/oder die eine konditionale n-Cofilin Defizienz (Cre/loxP) aufweisen. Um Cofilin nur in Megakaryozyten und Blutplättchen auszuschalten, wurden Cofilinfl/fl Mäuse mit PF4-Cre Mäusen verpaart. ADF- oder n-Cofilin-defiziente Mäuse hatten keinen oder nur einen geringen Phänotyp in Blutplättchen. Eine Defizienz von ADF und n-Cofilin führte hingegen zu einem beinahe kompletten Verlust der Blutplättchen, was mit Defekten in der Bildung von Plättchenzonen in Knochenmark-Megakaryozyten einherging. Weitere Untersuchungen an in vitro und ex vivo kultivierten Megakaryozyten zeigten eine Reduzierung der Bildung von Proplättchen und das Fehlen der typischen Verdickungen der Proplättchen. Diese Daten zeigen redundante aber essentielle Funktionen von ADF und n-Cofilin im terminalen Schritt der Plättchenbildung in vitro und in vivo, und belegen erstmals eine wichtige Rolle des Aktinumsatzes in diesem Prozess. Im zweiten Teil dieser Dissertation wurden die Mechanismen untersucht, die für die zelluläre Regulierung des Hauptkollagenrezeptors auf Blutplättchen, Glykoprotein VI (GPVI), verantwortlich sind. Nach einer Gefäßwandverletzung wird subendotheliales Kollagen freigelegt, wodurch GPVI die Aktivierung von Blutplättchen vermittelt, und damit zur Blutstillung (Hämostase), aber auch zum Verschluss eines verletzten Gefäßes beitragen kann, was letztendlich zu einem Myokardinfarkt oder einem Schlaganfall führen kann. Deshalb ist GPVI ein attraktives Zielprotein für eine anti-thrombotische Therapie, insbesondere weil frühere Studien gezeigt haben, dass anti-GPVI Antikörper eine irreversible Herunterregulierung des Rezeptors auf zirkulierenden Blutplättchen mittels Internalisierung und Abspaltung induzieren. Es wird vermutet, dass Metalloproteinasen der ADAM (a disintegrin and metalloproteinase domain) - Familie das Abspalten vermitteln, jedoch fehlt in vivo der Beweis dafür. Um die Mechanismen des Abspaltungsprozesses des GPVI Rezeptors in vivo besser verstehen zu können, wurden zwei Mauslinien, GPVI- und konditionale ADAM10-defiziente Mäuse, generiert und zusätzlich sogenannte „low TACE (TNFalpha converting enzyme)“ Mäuse analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass GPVI in vitro von ADAM10 oder TACE in Abhängigkeit der Signalwege, die zum Abspalten des Rezeptors führen, geschnitten werden kann. Darüberhinaus wurde GPVI in vivo nach Antikörperverabreichung in ADAM10-defizienten Mäusen und „low TACE“ Mäusen herunterreguliert, was vermuten lässt, dass entweder beide Metalloproteinasen an diesem Prozess beteiligt sind oder noch eine zusätzliche Metalloproteinase für die GPVI Regulation in vivo verantwortlich ist. N2 - Platelets are produced by bone marrow megakaryocytes in a process involving actin dynamics. Actin-depolymerizing factor (ADF) and cofilin are actin-binding proteins that act as key regulators in actin turnover by promoting filament severing and depolymerization. The overall significance of ADF/cofilin function and actin turnover in platelet formation is presently unclear. In the first part of this thesis, platelet formation and function were studied in mice constitutively lacking ADF and/or mice with a conditional deficiency (Cre/loxP) in n-cofilin. To delete cofilin exclusively in megakaryocytes and platelets, cofilinfl/fl mice were crossed with PF4 (platelet factor 4)-Cre mice. While a single-deficiency in ADF or n-cofilin resulted in no or only a minor platelet formation defect, respectively, a double-deficiency in ADF and n-cofilin led to an almost complete loss of platelets. Bone marrow megakaryocytes of ADF/n-cofilin-deficient mice showed defective platelet zone formation. Interestingly, in vitro and ex vivo megakaryocyte differentiation revealed reduced proplatelet formation and absence of platelet-forming swellings. These data establish that ADF and n-cofilin have redundant but essential roles in the terminal step of platelet formation in vitro and in vivo. In the second part of the thesis, mechanisms underlying cellular regulation of the major platelet collagen receptor, glycoprotein VI (GPVI), were studied. GPVI mediates platelet activation on exposed subendothelial collagens at sites of vascular injury, and thereby contributes to normal hemostasis but also to occlusion of diseased vessels in the setting of myocardial infarction or stroke. Thus, GPVI is an attractive target for anti-thrombotic therapy, particularly because previous studies have shown that anti-GPVI antibodies induce irreversible down-regulation of the receptor in circulating platelets by internalization and ectodomain shedding. Metalloproteinases of the ADAM (a disintegrin and metalloproteinase domain) family are suspected to mediate this ectodomain shedding, but in vivo evidence for this is lacking. To study the mechanism of GPVI regulation in vivo, two mouse lines, Gp6 knock-out and Adam10fl/fl, PF4-Cre mice, were generated and in addition low TACE (TNFalpha converting enzyme) mice were analyzed. It was shown that GPVI can be cleaved in vitro by ADAM10 or TACE depending on the shedding-inducing signaling pathway. Moreover, GPVI was down-regulated in vivo upon antibody injection in ADAM10-deficient and low TACE mice suggesting that either both or an additional metalloproteinase is involved in GPVI regulation in vivo. KW - Zellskelett KW - Thrombozyt KW - Metalloproteinasen KW - Actin-bindende Proteine KW - Platelets KW - Cytoskeleton KW - Metalloproteases KW - Actin binding proteins Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48390 ER - TY - THES A1 - Baig, Ayesha Anjum T1 - Studies on platelet interactions with the coagulation system and on modulators of platelet (hem)ITAM signaling in genetically modified mice T1 - Studien zur Thrombozyteninteraktion mit der Gerinnungskaskade und Modulation des (hem)ITAM Signalwegs in genetisch veränderaten Mäusen N2 - Activated platelets and coagulation jointly contribute to physiological hemostasis. However, pathological conditions can also trigger unwanted platelet activation and initiation of coagulation resulting in thrombosis and precipitation of ischemic damage of vital organs such as the heart or brain. The specific contribution of procoagulant platelets, positioned at the interface of the processes of platelet activation and coagulation, in ischemic stroke had remained uninvestigated. The first section of the thesis addresses this aspect through experiments conducted in novel megakaryocyte- and platelet-specific TMEM16F conditional KO mice (cKO). cKO platelets phenocopied defects in platelets from Scott Syndrome patients and had severely impaired procoagulant characteristics. This led to decelerated platelet-driven thrombin generation and delayed fibrin formation. cKO mice displayed prolonged bleeding times and impaired arterial thrombosis. However, infarct volumes in cKO mice were comparable to wildtype (WT) mice in an experimental model of ischemic stroke. Therefore, while TMEM16F-regulated platelet procoagulant activity is critical for hemostasis and thrombosis, it is dispensable for cerebral thrombo-inflammation in mice. The second section describes the generation and initial characterization of a novel knockin mouse strain that expresses human coagulation factor XII (FXII) instead of endogenous murine FXII. These knockin mice had normal occlusion times in an experimental model of arterial thrombosis demonstrating that human FXII is functional in mice. Therefore, these mice constitute a valuable tool for testing novel pharmacological agents against human FXII – an attractive potential target for antithrombotic therapy. Glycoprotein (GP)VI and C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2)-mediated (hem)immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM) signaling represent a major pathway for platelet activation. The last section of the thesis provides experimental evidence for redundant functions between the two members of the Grb2 family of adapter proteins - Grb2 and Gads that lie downstream of GPVI and CLEC-2 stimulation. In vitro and in vivo studies in mice deficient in both Grb2 and Gads (DKO) revealed that DKO platelets had defects in (hem)ITAM-stimulation-specific activation, aggregation and signal transduction that were more severe than the defects observed in single Grb2 KO or Gads KO mice. Furthermore, the specific role of these adapters downstream of (hem)ITAM signaling was essential for maintenance of hemostasis but dispensable for the known CLEC-2 dependent regulation of blood-lymphatic vessel separation. N2 - Aktivierte Thrombozyten und die Gerinnungskaskade bilden gemeinsam die Grundlage der physiologischen Hämostase. Daneben können jedoch auch pathologische Bedingungen Thrombozytenaktivierung herbeiführen und die Gerinnungskaskade auslösen und somit zum Gefäßverschluss führen, was häufig ischämische Schäden lebenswichtiger Organe wie beispielsweise des Herzens oder des Gehirns verursachen kann. Prokoagulante Thrombozy-ten befinden sich an der Schnittstelle zwischen Thrombozytenaktivierung und der Gerin-nungskaskade, ihre Funktion bei der Pathogenese des ischämischen Schlaganfalls wurde jedoch bisher nicht im Detail untersucht. Der erste Teil dieser Doktorarbeit widmet sich dieser Fragestellung durch die Analyse von neu generierten konditionalen, Megakaryozyten- und Thrombozyten-spezifischen Tmem16f Knockout Mäusen. TMEM16F-defiziente Thrombozy-ten wiesen ähnliche Defekte wie die Thrombozyten von Scott-Syndrom-Patienten sowie stark beeinträchtigte prokoagulante Eigenschaften auf. Diese Defekte gingen mit signifikant verlangsamter thrombozytenabhängiger Thrombingenerierung und verzögerter Fibrinbildung einher. TMEM16F-Defizienz führte zu verlängerter Blutungszeit und beeinträchtigte in einem experimentellen Modell die Bildung arterieller Thromben. TMEM16F-defiziente Mäuse wiesen jedoch im Vergleich zu wildtypischen Mäusen keinerlei Unterschiede im experimentellen ischämischen Schlaganfall auf. TMEM16F-gesteuerte prokoagulante Thrombozytenfunktion ist demnach kritisch für Hämostase und Thrombose, während sie eine untergeordnete Rolle in zerebraler Thrombo-Inflammation spielt. Der zweite Teil dieser Arbeit befasst sich mit der Generierung und Erstbeschreibung einer neuen Mauslinie, welche den humanen Hageman-Faktor (FXII) anstelle des endogenen murinen FXII exprimiert. In den resultierenden Knock-in Mäusen war die Bildung okklusiver arterieller Thromben nach chemisch induzierter Gefäßverletzung nicht beeinträchtigt, was zeigt, dass der humane FXII im Maussystem voll funktionstüchtig ist. Somit können diese Mäuse in der Zukunft als ein wertvolles Werkzeug zum Testen neuer pharmakologischer Ansätze zur Herabsetzung der FXII-Aktivität eingesetzt werden, welche einen vielver-sprechenden Targets neuartiger antithrombotischer Behandlungsansätze darstellt. Die thrombozytären Rezeptoren Glykoprotein (GP)VI und C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2) lösen (hem)immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM)-gekoppelte Signalwege aus, welche eine eine Schlüsselrolle in der Thrombozytenaktivierung spielen. Der dritte Teil dieser Doktorarbeit liefert experimentelle Hinweise für überlappende Funkti-onen der Adapterproteine Grb2 und Gads in der (hem)ITAM-anhängigen Signalkaskade. In vitro und in vivo Studien zeigten, dass Grb2/Gads-doppeldefiziente Thrombozyten (hem)ITAM-spezifische Defekte in der Aktivierung, Aggregation und Signaltransduktion aufweisen, die im Vergleich zu einzeldefizienten Thrombozyten deutlich ausgeprägter sind und somit eine redundante Rolle der Adapterproteine offenbaren. Während Grb2 und Gads gemeinsam an der Aufrechterhaltung physiologischer Hämostase beteiligt sind, tragen sie nicht entscheidend zur bekannten CLEC-2-abhängigen Regulation der Trennung von Blut- und Lymphgefäßen bei. KW - Blutgerinnung KW - Thrombozyt KW - Signaltransduktion KW - Maus KW - Thrombosis KW - Thrombo-inflammation KW - TMEM16F KW - (hem)ITAM signaling Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-164888 ER - TY - THES A1 - Vögtle, Timo T1 - Studies on receptor signaling and regulation in platelets and T cells from genetically modified mice T1 - Studien zur Signaltransduktion und Regulierung von Rezeptoren in Thrombozyten und T-Zellen genetisch veränderter Mäuse N2 - Receptors with tyrosine-based signaling motifs control essential functions of hematopoietic cells, including lymphocytes and platelets. Downstream of the platelet receptor glycoprotein (GP) VI and the T cell receptor (TCR) the immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM) initiates a signaling cascade that involves kinases, adapter and effector proteins and finally leads to cellular activation. This thesis summarizes the results of three studies investigating different aspects of receptor signaling and regulation in platelets and T cells. In the first part, the impact of constitutive Ca2+ influx on TCR signaling and T cell physiology was investigated using a transgenic mouse line with a mutation in the Ca2+ sensor stromal interaction molecule 1 (STIM1). The elevated cytoplasmic Ca2+ level resulted in an altered phosphorylation pattern of the key enzyme phospholipase (PL) Cγ1 in response to TCR stimulation, but without affecting its enzymatic activity. Withdrawal of extracellular Ca2+ or inhibition of the phosphatase calcineurin restored the normal phosphorylation pattern. In addition, there was a decrease in the release of Th2-type cytokines interleukin 4, 5 and 13 upon stimulation in vitro. The second part of the thesis deals with the role of the adapter protein growth factor receptor-bound protein 2 (Grb2) in platelets using a megakaryocyte/platelet-specific knockout mouse line. Loss of Grb2 severely impaired signaling of GPVI and C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2), a related hemITAM receptor. This was attributed to defective stabilization of the linker for activation of T cells (LAT) signalosome and resulted in reduced adhesion, aggregation, Ca2+ mobilization and procoagulant activity downstream of (hem)ITAM-coupled receptors in vitro. In contrast, the signaling pathways of G protein-coupled receptors (GPCRs) and the integrin αIIbβ3, which do not utilize the LAT signalosome, were unaffected. In vivo, the defective (hem)ITAM signaling caused prolonged bleeding times, however, thrombus formation was only affected under conditions where GPCR signaling was impaired (upon acetylsalicylic acid treatment). These results establish Grb2 as an important adapter protein in the propagation of GPVI- and CLEC-2-induced signals. Finally, the proteolytic regulation of the immunoreceptor tyrosine-based switch motif (ITSM)-bearing receptor CD84 in platelets was investigated. This study demonstrated that in mice CD84 is cleaved by two distinct and independent proteolytic mechanisms upon platelet activation: shedding of the extracellular part, which is exclusively mediated by a disintegrin and metalloproteinase (ADAM) 10 and cleavage of the intracellular C-terminus by the protease calpain. Finally, the analysis of soluble CD84 levels in the plasma of transgenic mice revealed that shedding of CD84 by ADAM10 occurs constitutively in vivo. N2 - Rezeptoren mit Tyrosin-basierten Signaltransduktionsmotiven sind von fundamentaler Bedeutung für die Funktion hematopoietischer Zellen wie Lymphozyten und Thrombozyten. Unterhalb des Glykoproteins (GP) VI auf Thrombozyten und des T-Zell Rezeptors (TZR) auf T-Zellen initiiert das immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM) eine Signalkaskade, die Kinasen, Adapter- und Effektorproteine mit einbezieht und schlussendlich zur Aktivierung der Zelle führt. Die hier vorgelegte Arbeit fasst die Ergebnisse dreier Studien zusammen, die sich mit verschiedenen Aspekten der Signaltransduktion und Regulation von Rezeptoren in Thrombozyten und T-Zellen befasst. Im ersten Teil wurde der Einfluss eines konstitutiven Ca2+-Einstroms auf die TZR Signalkaskade und T-Zell Funktion untersucht. Hierzu wurde eine transgene Mauslinie mit einer Mutation im Ca2+-Sensor stromal interaction molecule 1 (STIM1) verwendet. Die erhöhte zytoplasmatische Ca2+-Konzentration veränderte das Phosphorylierungsmuster der Phospholipase (PL) Cγ1, ein Schlüsselenzym der Signalkaskade, nach Stimulation des TZRs. Die enzymatische Aktivität der PLCγ1 blieb hierbei jedoch unverändert. In der Abwesenheit von extrazellulärem Ca2+ oder bei Inhibition der Phosphatase Calcineurin war das Phosphorylierungsmuster hingegen wieder normal. Darüber hinaus zeigten die T Zellen nach Stimulation in vitro eine verringerte Produktion von Interleukinen des Th2-Typs (Interleukin-4, 5 und 13). Der zweite Teil der Arbeit befasst sich mit der Funktion des Adapterproteins growth factor receptor-bound protein 2 (Grb2) in Thrombozyten, die unter Zuhilfenahme einer Megakaryozyten- und Thrombozyten-spezifischen Knockout Mauslinie untersucht wurde. Hierbei zeigte es sich, dass der Verlust von Grb2 die Signaltransduktion von GPVI und des verwandten hemITAM-Rezeptors C type lectin-like receptor 2 (CLEC-2) schwer beeinträchtigt. Dies konnte auf eine mangelnde Stabilisierung des linker for activation of T cells (LAT) Signalosoms zurückgeführt werden und resultierte in einer verminderten Adhäsion, Aggregation, Ca2+-Mobilisierung und prokoagulatorischen Aktivität nach Aktivierung (hem)ITAM gekoppelter Rezeptoren in vitro. Im Gegensatz hierzu blieben die Signaltransduktionswege G-protein-gekoppelter Rezeptoren (GPCRs) und des Integrins αIIbβ3, die das LAT Signalosom nicht nutzen, unbeeinflusst. In in vivo Studien verursachte die beeinträchtigte (hem)ITAM Signaltransduktion eine verlängerte Blutungszeit der Mäuse, während die Entstehung von Thromben nur bei gleichzeitiger Hemmung von GPCR-Signalwegen (durch Acetylsalicylsäuregabe) vermindert war. Diese Ergebnisse etablieren Grb2 als ein wichtiges Adapterprotein in der Signaltransduktionskaskade von GPVI und CLEC-2. Schließlich wurde im dritten Teil dieser Arbeit die proteolytische Regulation des Rezeptors CD84, der ein immunoreceptor tyrosine-based switch motif (ITSM) enthält, untersucht. In dieser Studie konnte gezeigt werden, dass CD84 in Mausthrombozyten durch zwei verschiedene und unabhängige proteolytische Mechanismen geschnitten wird: Zum einen durch Shedding des extrazellulären Teils, was ausschließlich durch die a disintegrin and metalloproteinase (ADAM) 10 bewerkstelligt wird, und zum anderen durch das Schneiden des intrazellulären C Terminus durch die Protease Calpain. Des Weiteren zeigte eine Untersuchung von Plasmaproben transgener Mäuse, dass das Shedding von CD84 durch ADAM10 konstitutiv in vivo erfolgt. KW - Thrombozyt KW - T-Lymphozyt KW - Rezeptor KW - Signaltransduktion KW - Calcium KW - Platelet KW - Thrombose KW - T cell KW - receptor signaling KW - calcium KW - ITAM KW - Hämostase KW - Metalloproteinasen KW - Adapterprotein Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-97114 ER - TY - THES A1 - Strehl, Amrei T1 - Studies on regulation and signaling of the platelet glycoproteins GPV and GPVI T1 - Studien zur Regulation und Signaltransduktion der Plättchenglykoproteine GPV und GPVI N2 - Bei Verletzung einer Gefäßwand kommen Blutplättchen in Kontakt mit den Substanzen des Subendothels; Die Plättchen werden dadurch aktiviert, sie aggregieren und verschließen die Wunde, wodurch ein hoher Blutverlust verhindert wird. Unter pathologischen Bedingungen, bei Aufbrechen eines artherosklerotischen Plaques an der Gefäßwand, können sich jedoch große Plättchenaggregate, die Thromben, formen, die das Gefäß verschließen, den Blutfluss stoppen und somit zu Schlaganfall und Herzinfarkt führen können. Die kontrollierte Regulation und Signaltransduktion von bzw. durch Plättchenoberflächenrezeptoren ist wesentlich für das Funktionieren der Zellen und die intakte Balance zwischen physiologischer Plättchen-Aktivierung und der pathologischen Bildung eines Thrombus. In der vorliegenden Arbeit wird über wichtige Aspekte dieser Signalwege, die in drei Unterprojekten untersucht worden sind, berichtet. In dem ersten Unterprojekt wurde die Regulation von Plättchenoberflächenrezeptoren, den Glykoproteinen (GP) V und VI, bei Mäusen analysiert. Hier wird beschrieben, dass GPV und GPVI von der Plättchenoberfläche durch Metalloproteinasen geschnitten werden. Während physiologischer Stress, wie das Entkoppeln der oxidativen Phosphorylierung in den Mitochondrien, das Schneiden von GPVI durch eine unbekannte Proteinase auslöst, verursacht die Aktivierung von Plättchen mit bestimmten Agonisten das Schneiden von GPV. Die dafür verantwortliche Metalloproteinase wurde als ADAM17 identifiziert. In dem zweiten Unterprojekt wurde die Rolle der Protein Kinase C (PKC) in der Plättchenaktivierung einerseits und in der Plättchen pro-koagulanten Aktivität andereseits untersucht. Die Konformationsänderung/Aktivierung von alphaIIbeta3-Integrinen und Sekretion von Granula sind charakteristisch für die Plättchenaktivierung. Calcium-(Ca2+)-abhängige Phosphatidylserin (PS)- Expression auf der Plättchenoberfläche hingegen ist kennzeichnend für die pro-koagulante Aktivität. Der Beitrag von PKC zu den beschriebenen Plättchenzuständen war bisher unklar. In diesem Projekt wurde zum ersten Mal gezeigt, dass PKC eine doppelte Funktion in den Plättchen besitzt: einerseits fördert PKC die Plättchen-Aktivierung und –Aggregation, andererseits unterdrückt PKC die pro-koagulant Aktivität. In dem dritten Unterprojekt wurde die Rolle der kleinen GTPase Rac1 in der Plättchen- Aktivierung und -Aggregation in vitro und in vivo an konditionalen Rac1 Mäusen analysiert. Es wird berichtet, dass Rac1 für die GPVI abhängige Aktivierung von alphaIIbbeta3-Integrinen und dem Freisetzen von Ca2+ in der Zelle, notwendig ist, sowie für GPVI abhängige Plättchen-Aggregation und Thrombus Bildung. Hiermit wird die GTPase Rac1 zum ersten Mal in den Signalweg unterhalb von GPVI eingeordnet und ihr zudem dort eine essentielle Rolle zugeteilt. N2 - Platelets are crucial to inhibit extensive blood loss at sites of vascular injury. However, under pathological conditions such as rupture of an atherosclerotic plaque, activated platelets form aggregates that may occlude the vessel. This can lead to heart attack and stroke. Various and complex signaling pathways in the cell are involved in the steps of platelet adhesion, activation and aggregation. Single aspects of these processes were studied in three different subprojects in this work. The Glycoprotein (GP) Ib-V-IX complex is responsible for the first contact of platelets with the vessel wall. Subsequently, GPVI can bind to collagen of the subendothelium, which initiates a signaling cascade leading to platelet activation, aggregation, characterized by integrin activation and granule secretion and platelet procoagulant activity. The latter is characterized by exposed phosphatidylserine (PS) on the platelet surface, which enhances thrombin generation and thereby the coagulation cascade. A controlled regulation of GP receptors on the platelet surface is vital for an intact response of the cell to platelet agonists. In the first subproject described here the regulation of GPV and GPVI on mouse platelets was investigated and it was found that both receptors are shed from the platelet surface in a metalloproteinase dependent manner. However, GPVI is shed upon mitochondrial injury, while GPV cleavage could be observed upon platelet stimulation. The metalloproteinase responsible for GPVI shedding remains unknown whereas the metallproteinase that sheds GPV was identified in this work as being ADAM17. This shows that the expression of both receptors underlies a controlled mechanism regulated through distinct metalloproteinases. In the second subproject the role of protein kinase C (PKC) in platelet activation and procoagulant response was investigated using PKC specific inhibitors. It was found that PKC blockage reduced platelet activation but enhanced platelet procoagulant activity. This is the first time that a dual role in platelet activation and procoagulant activity is defined for PKC. In the third project the role of the small GTPase Rac1 in platelet signaling was studied using conditional Rac1 knock out mice. It is reported here that Rac1 lies downstream of GPVI and is involved in integrin activation and cytsolic Ca2+ changes in vitro and platelet adhesion and thrombus formation in vivo. This is the first time that Rac1 is demonstrated to have a pivotal role in GPVI signaling and furthermore points to a novel, unknown pathway downstream of GPVI. KW - Thrombozyt KW - Membranglykoproteine KW - Proteinkinase C KW - Signaltransduktion KW - Blutplättchen KW - Glykoprotein-Shedding KW - Protein Kinase C KW - Koagulation KW - Rac1 KW - platelets KW - glycoprotein-shedding KW - protein kinase C KW - coagulation KW - Rac1 Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-22283 ER - TY - THES A1 - Hofmann, Sebastian T1 - Studies on the function and regulation of CD84, GPVI and Orai2 in genetically modified mice T1 - Untersuchungen zur Funktion und Regulation von CD84, GPVI und Orai2 in genetisch veränderten Mäusen N2 - Platelet activation and aggregation at sites of vascular injury are essential processes to limit blood loss but they also contribute to arterial thrombosis, which can lead to myocardial infarction and stroke. Stable thrombus formation requires a series of events involving platelet receptors which contribute to adhesion, activation and aggregation of platelets. Regulation of receptor expression by (metallo-)proteinases has been described for several platelet receptors, but the molecular mechanisms are ill-defined. The signaling lymphocyte activation molecule (SLAM) family member CD84 is expressed in immune cells and platelets, however its role in platelet physiology was unclear. In this thesis, CD84 deficient mice were generated and analyzed. In well established in vitro and in vivo assays testing platelet function and thrombus formation, CD84 deficient mice displayed phenotypes indistinguishable from wild-type controls. It was concluded that CD84 in platelets does not function as modulator of thrombus formation, but rather has other functions. In line with this, in the second part of this thesis, a novel regulation mechanism for platelet CD84 was discovered and elucidated. Upon platelet activation, the N-terminus of CD84 was found to be cleaved exclusively by the a disintegrin and metalloproteinase 10 (ADAM10), whereas the intracellular part was cleaved by calpain. In addition, regulation of the platelet activating collagen receptor glycoprotein VI (GPVI) was studied and it was shown that GPVI is in contrast to CD84 differentially regulated by ADAM10 and ADAM17. A novel role of CD84 under pathophysiological conditions was revealed as CD84 deficient mice were protected from ischemic stroke in the model of transient middle cerebral artery occlusion and this protection was based on the lack of CD84 in T cells. Ca2+ is an essential second messenger that facilitates activation of platelets and diverse functions in different eukaryotic cell types. Store-operated Ca2+ entry (SOCE) represents the major mechanism leading to rise in intracellular Ca2+ concentration in non-excitable cells. The Ca2+ sensor STIM1 (stromal interaction molecule 1) and the SOC channel subunit protein Orai1 are established mediators of SOCE in platelets. STIM2 is the major STIM isoform in neurons, but the role of the SOC channel subunit protein Orai2 in platelets and neurons has remained elusive. In the third part of this thesis, Orai2 deficient mice were generated and analyzed. Orai2 was dispensable for platelet function, however, Orai2 deficient mice were protected from ischemic neurodegeneration and this phenotype was attributed to defective SOCE in neurons. N2 - Die Aktivierung und Aggregation von Blutplättchen sind wichtige Prozesse um Blutverlust nach Gefäßverletzungen zu vermeiden. Diese Prozesse spielen aber auch eine Rolle in der arteriellen Thrombose, die zu Herzinfarkt und Schlaganfall führen kann. Die Bildung stabiler Thromben setzt eine Reihe von Vorgängen voraus, an denen Blutplättchenrezeptoren beteiligt sind, welche zur Adhäsion, Aktivierung und Aggregation der Blutplättchen beitragen. Für einige Blutplättchenrezeptoren wurde eine Regulation der Expression durch (Metallo )Proteinasen beschrieben, jedoch sind die molekularen Mechanismen weitgehend unbekannt. CD84, ein Protein das zur signaling lymphocyte activation molecule (SLAM) Familie gehört, wird sowohl in Immunzellen als auch in Blutplättchen exprimiert. Jedoch war die Rolle von CD84 in der Physiologie der Blutplättchen unklar. In der vorliegenden Arbeit wurden CD84 defiziente Mäuse generiert und analysiert. In etablierten in vitro und in vivo Test, welche die Blutplättchenfunktion und Thrombusbildung untersuchen, war der Phänotyp von CD84 defizienten Mäusen unverändert gegenüber Wildtyp-Kontrollen. Es wurde die Schlussfolgerung gezogen, dass CD84 in Blutplättchen nicht als Modulator der Thrombusbildung fungiert, sondern eher andere Funktionen hat. Im Einklang damit wurde im zweiten Teil dieser Arbeit ein neuer Regulationsmechanismus entdeckt und aufgeklärt. Infolge von Blutplättchenaktivierung wurde der N-terminale Teil von CD84 ausschließlich von a disintegrin and metalloproteinase 10 (ADAM10) geschnitten, während der intrazelluläre Anteil durch Calpain prozessiert wurde. Weiterhin wurde die Regulation des Blutplättchen-aktivierenden Kollagenrezeptors Glykoprotein VI (GPVI) untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass GPVI, im Gegensatz zu CD84, einer differenziellen Regulation durch ADAM10 und ADAM17 unterliegt. Unter pathophysiologischen Bedingungen wurde eine neue Rolle von CD84 aufgedeckt, da CD84 defiziente Mäuse vor ischämischem Schlaganfall im transient middle cerebral artery occlusion Modell geschützt waren. Dieser Schutz beruhte auf dem Fehlen von CD84 auf T Zellen. Ca2+ ist ein wichtiger sekundärer Botenstoff, der die Aktivierung von Blutplättchen ermöglicht sowie diverse Funktionen in verschiedenen eukaryotischen Zellen erfüllt. Store-operated Ca2+ entry (SOCE) stellt den Hauptmechanismus dar, der zum Anstieg der intrazellulären Ca2+ Konzentration in nicht-erregbaren Zellen führt. Der Ca2+ Sensor STIM1 (stromal interaction molecule 1) und das SOC-Kanal Protein Orai1 sind als Vermittler des SOCE in Blutplättchen bekannt. STIM2 stellt die Hauptisoform der STIM Moleküle in Neuronen dar, jedoch war die Rolle des SOC-Kanal Proteins Orai2 in Blutplättchen und Neuronen weitgehend unbekannt. Im dritten Teil dieser Arbeit wurden Orai2 defiziente Mäuse generiert und analysiert. Orai2 war nicht essentiell für die Funktion von Blutplättchen, jedoch waren Orai2 defiziente Mäuse vor ischämischer Neurodegeneration geschützt. Dieser Phänotyp wurde auf einen defekten SOCE in Neuronen zurückgeführt. KW - Thrombozyt KW - Maus KW - Genexpression KW - Metalloproteinasen KW - platelets KW - CD84 KW - Metalloproteinase KW - GPVI Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-87949 ER - TY - THES A1 - Baumann, Juliane T1 - Studies on the influence of mutations in the Myh9 gene on platelet function T1 - Studien zum Einfluss von Mutationen im Myh9 Gen auf die Thrombozytenfunktion N2 - The platelet cytoskeleton ensures normal size and discoid shape under resting conditions and undergoes immediate reorganization in response to changes in the extracellular environment through integrin-based adhesion sites, resulting in actomyosin-mediated contractile forces. Mutations in the contractile protein non-muscle myosin heavy chain IIA display, among others, macrothrombocytopenia and a mild to moderate bleeding tendency in human patients. It is insufficiently understood which factors contribute to the hemostatic defect found in MYH9-related disease patients. Therefore, a better understanding of the underlying biophysical mechanisms in thrombus formation and stabilization is warranted. This thesis demonstrates that an amino acid exchange at the positions 702, 1424 and 1841 in the heavy chain of the contractile protein non-muscle myosin IIA, caused by heterozygous point mutations in the gene, resulted in macrothrombocytopenia and increased bleeding in mice, reflecting the clinical hallmark of the MYH9-related disease in human patients. Basic characterization of biological functions of Myh9 mutant platelets revealed overall normal surface glycoprotein expression and agonist-induced activation when compared to wildtype platelets. However, myosin light chain phosphorylation after thrombin-activation was reduced in mutant platelets, resulting in less contractile forces and a defect in clot retraction. Altered biophysical characteristics with lower adhesion and interaction forces of Myh9 mutant platelets led to reduced thrombus formation and stability. Platelets from patients with the respective mutations recapitulated the findings obtained with murine platelets, such as impaired thrombus formation and stiffness. Besides biological and biophysical characterization of mutant platelets from mice and men, treatment options were investigated to prevent increased bleeding caused by reduced platelet forces. The antifibrinolytic agent tranexamic acid was applied to stabilize less compact thrombi, which are presumably more vulnerable to fibrinolysis. The hemostatic function in Myh9 mutant mice was improved by interfering with the fibrinolytic system. These results show the beneficial effect of fibrin stabilization to reduce bleeding in MYH9-related disease. N2 - Das thrombozytäre Zytoskelett gewährleistet eine normale Zellgröße und diskoide Form unter ruhenden Bedingungen. Als Reaktion auf Veränderungen in der extrazellulären Umgebung wird das Zytoskelett durch Integrin-basierte Adhäsionsstellen reorganisiert, was zu Aktomyosin-vermittelten kontraktilen Kräften führt. Mutationen in der schweren Kette des kontraktilen nicht-muskulären Proteins Myosin IIA führen bei Patienten u. a. zu einer Makrothrombozytopenie und einer leichten bis mittelschweren Blutungsneigung. Es ist unzureichend geklärt, welche Faktoren zum hämostatischen Defekt bei Patienten mit MYH9-bedingter Erkrankung beitragen. Daher ist ein besseres Verständnis der zugrunde liegenden biophysikalischen Mechanismen bei der Thrombusbildung und -stabilisierung erforderlich. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass der Austausch von einzelnen Aminosäuren an den Positionen 702, 1424 und 1841 im kontraktilen Protein Myosin IIA, hervorgerufen durch Punktmutationen im kodierenden Gen, zu einer Makrothrombozytopenie und zu einer verlängerten Blutungszeit in Mäusen führt. Dies spiegelt die klinischen Merkmale der MYH9-assoziierte Erkrankungen bei Patienten wider. Die basale Charakterisierung der biologischen Funktionen von Myh9-mutierten Thrombozyten im Vergleich zu Wildtyp-Thrombozyten ergab eine insgesamt normale Oberflächenglykoproteinexpression und Agonisten-induzierte Aktivierung. Interessanterweise war die Phosphorylierung der leichten Myosinkette in den mutierten Thrombozyten nach Aktivierung reduziert, was zu einer geringeren Kontraktionskraft und damit zu einem Defekt beim Zusammenziehen des Gerinnsels führte. Mit Hilfe von biophysikalischen Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass geringere Adhäsions- und Interaktionskräfte von Thrombozyten mit Punktmutationen im Myh9 Gen zu einer verminderten Thrombusbildung und -stabilität führen. Thrombozyten von Patienten mit den entsprechenden Mutationen rekapitulierten die mit murinen Thrombozyten erhaltenen Ergebnisse, wie z. B. eine beeinträchtigte Thrombusbildung und -steifigkeit. Neben der biologischen und biophysikalischen Charakterisierung der Thrombozyten von Mäusen und Menschen mit den Punktmutationen wurden Behandlungsmöglichkeiten untersucht, um die erhöhte Blutungsneigung aufgrund der verminderten Thrombozytenkräfte zu verhindern. Das Antifibrinolytikum Tranexamsäure wurde eingesetzt, um weniger kompakte Thromben zu stabilisieren, die vermutlich anfälliger für Fibrinolyse sind. Die hämostatische Funktion von Mäusen mit Myh9-Mutationen konnte durch die Gabe von Tranexamsäure verbessert werden. Diese Ergebnisse zeigen die positive Wirkung der Fibrinstabilisierung zur Verringerung von Blutungsneigungen bei MYH9-assoziierte Erkrankungen. KW - Thrombozyt KW - Zellskelett KW - Platelets KW - Cytoskeleton KW - Biomechanics KW - Myosin IIA KW - Biomechanik Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-287953 ER - TY - THES A1 - Volz, Julia T1 - Studies on the influence of platelets on vascular integrity in primary tumors and the role of BIN2 in platelet calcium signaling T1 - Studien zum Einfluss von Thrombozyten auf die Gefäßintegrität im Primärtumor und zur Rolle von BIN2 im Calcium-Signalweg von Thrombozyten N2 - Maintenance of tumor vasculature integrity is indispensable for tumor growth and thus affects tumor progression. Previous studies have identified platelets as major regulators of tumor vascular integrity, as their depletion selectively renders tumor vessels highly permeable, causing massive intratumoral hemorrhage. While these results establish platelets as potential targets for anti-tumor therapy, depletion is not a treatment option due to the essential role of platelets for hemostasis. This thesis demonstrates for the first time that functional inhibition of glycoprotein (GP) VI on the platelet surface rapidly induces tumor hemorrhage and diminishes tumor growth similar to complete platelet depletion but without inducing systemic bleeding complications. Both, the intratumoral bleeding and tumor growth arrest could be reverted by depletion of Ly6G+ cells confirming them to be responsible for the induction of bleeding and necrosis within the tumor. In addition, GPVI inhibition increased intra-tumoral accumulation of co-administered chemotherapeutic agents, thereby resulting in a profound anti-tumor effect. In summary, this thesis manifests platelet GPVI as a key regulator of vascular integrity specifically in growing tumors, serving as a potential basis for the development of anti-tumor strategies. In the second part of this thesis, light is shed on the modulating role of bridging integrator 2 (BIN2) in platelet Ca2+ signaling. Stromal interaction molecule 1 (STIM1) mediated store-operated calcium entry (SOCE) is the major route of Ca2+ influx in platelets, triggered by inositol trisphosphate receptor (IP3R)-dependent Ca2+ store release. In this thesis, the BAR domain superfamily member BIN2 was identified as the first Ca2+ signaling modulator, interacting with both, STIM1 and IP3R in platelets. Deletion of BIN2 resulted in reduced Ca2+ store release and Ca2+ influx in response to all tested platelet agonists. These defects were a consequence of impaired IP3R function in combination with defective STIM1-mediated SOC channel activation, while Ca2+ store content and agonist-induced IP3 production were unaltered. These results establish BIN2 as a central regulator of platelet Ca2+ signaling. The third part of this thesis focuses on the effect of the soluble neuronal guidance protein Sema7A on platelet function. Rosenberger et al. discovered that Sema7A cleavage from red blood cells increases the formation of platelet-neutrophil complexes, thereby reinforcing thrombo-inflammation in myocardial ischemia-reperfusion injury (MIRI). This thesis establishes soluble Sema7A as a stimulator of platelet thrombus formation via its interaction with platelet GPIbα, thereby reinforcing PNC formation. Thus, interfering with the GPIb-Sema7A interaction during MIRI represents a potential strategy to reduce cardiac damage and improve clinical outcome following MI. N2 - Die Aufrechterhaltung einer intakten Gefäßstruktur im Primärtumor ist unerlässlich für dessen Wachstum und beeinflusst dadurch die Tumorentwicklung. Es wurde bereits gezeigt, dass Thrombozyten bei diesem Prozess eine große Rolle spielen, da ihre experimentelle Depletion in Mäusen zu extrem durchlässigen Gefäßen und in Folge dessen zu starken Blutungen im Tumor führt. Diese Ergebnisse machen Thrombozyten zu potentiellen Angriffspunkten in der Krebstherapie, eine komplette Depletion ist dabei jedoch auf Grund ihrer essentiellen Funktion bei der Hämostase nicht denkbar. In dieser Thesis wurde zum ersten Mal gezeigt, dass auch die Blockade des Glykoproteins (GP) VI auf der Thrombozytenoberfläche zu vergleichbaren Blutungen im Tumor und zur Hemmung des Tumorwachstums führt, ohne jedoch das generelle Blutungsrisiko zu beeinflussen. Die durch die GPVI Blockade induzierten Effekte können durch eine gleichzeitige Depletion von Ly6G+ Zellen verhindert werden, was zeigt, dass dieser Zelltyp ursächlich an der Entstehung der Blutung beteiligt ist. Des Weiteren führt die Blockade von GPVI in Kombination mit einem Chemotherapeutikum zu einer Erhöhung dessen Konzentration im Tumorgewebe und damit zu einer verstärkten antitumoralen Wirkung. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass GPVI ein wichtiger Regulator der Gefäßintegrität im wachsenden Tumor ist, was als Grundlage für die Entwicklung von Krebstherapien genutzt werden könnte. Im zweiten Teil dieser Thesis wurde die Rolle des bridging integrator 2 (BIN2) im Ca2+ Signalweg von Thrombozyten untersucht. Der STIM1 abhängige „store operated calcium entry“ (SOCE) vermittelt den größten Ca2+-Einstrom in Thrombozyten. SOCE wird durch den inositol trisphosphate receptor (IP3R)-abhängigen Ca2+ Ausstrom aus dem zelleigenen Ca2+ Reservoir aktiviert. In dieser Thesis wurde BIN2 als erstes Adapterprotein im Ca2+ Signalweg von Thrombozyten identifiziert, das sowohl mit STIM1 als auch mit IP3R interagiert. Das Fehlen von BIN2 führt zu einer Reduktion des Ca2+ Ausstroms aus dem zelleigenen Ca2+ Reservoir und eine Verminderung des Einstroms von extrazellulärem Ca2+. Diesen Defekten liegen die Beeinträchtigungen der Funktion sowohl des IP3R als auch von STIM1 zugrunde, während die Ca2+ Menge im Reservoir und die Agonisten-induzierte IP3 Produktion unverändert bleiben. Zusammenfassend konnte BIN2 als zentrales Molekül im Ca2+ Signalweg von Thrombozyten etabliert werden. Der dritte Teil der Thesis befasst sich mit dem Effekt des löslichen „neuronal guidance protein“ Sema7A auf Thrombozyten. Die Arbeitsgruppe um Prof. Rosenberger konnte bereits zeigen, dass das von Erythrozyten abgespaltene Sema7A die Bildung von Komplexen aus Thrombozyten und Neutrophilen (PNC) fördert und damit die Thrombo-Inflammation während Zusammenfassung III des Ischämie/Reperfusionsschadens des Myokards (MIRI) begünstigt. In dieser Thesis konnte gezeigt werden, dass die Interaktion des löslichen Sema7A mit GPIbα auf der Thrombozytenoberfläche die Thrombenbildung fördert und über diesen Mechanismus auch die PNC Bildung und somit Thrombo-Inflammation verstärkt. Aufgrund dessen stellt der Eingriff in die GPIbα-Sema7a Interaktion eine potentielle Strategie dar, den Gewebeschaden während des MIRI zu reduzieren und damit den Schaden nach einem Myokardinfarkt einzugrenzen. KW - Thrombozyt KW - Primärtumor KW - Maus KW - GPVI KW - Vaskuläre Integrität KW - Calcium signalling KW - BIN2 Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-217427 ER - TY - THES A1 - Scheller [geb. Birkholz], Inga T1 - Studies on the role of actin-binding proteins in platelet production and function in mice T1 - Zur Rolle von Aktin-bindenden Proteinen in der Bildung und der Funktion von Thrombozyten in der Maus N2 - Platelet activation and aggregation at sites of vascular injury involves massive cytoskeletal re-organization, which is required for proper platelet function. Moreover, the cytoskeleton plays central roles in megakaryo- and thrombopoiesis. Thus, cytoskeletal protein aberrations can be the underlying reason for many pathological phenotypes. Although intensive research is carried out to identify the key players involved in cytoskeletal reorganization, the signaling cascades orchestrating these complex processes are still poorly understood. This thesis investigates the role of three actin-binding proteins, Coactosin-like (Cotl) 1, Profilin (Pfn) 1 and Thymosin (T) β4, in platelet formation and function using genetically modified mice. ADF-H-containing proteins such as Twinfilin or Cofilin are well characterized as regulators of thrombopoesis and cytoskeletal reorganization. Although Cotl1 belongs to the ADF-H protein family, lack of Cotl1 did not affect platelet count or cytoskeletal dynamics. However, Cotl1-deficiency resulted in significant protection from arterial thrombus formation and ischemic stroke in vivo. Defective GPIb-vWF interactions and altered second wave mediator release present potential reasons for the beneficial effect of Cotl1-deficiency. These results reveal an unexpected function of Cotl1 as a regulator of thrombosis and hemostasis, establishing it as a potential target for a safe therapeutic therapy to prevent arterial thrombosis or ischemic stroke. Recent studies showed that the organization of the circumferential actin cytoskeleton modulates calpain-mediated αIIbβ3 integrin closure, thereby also controlling αIIbβ3 integrin localization. The second part of this thesis identified the actin-sequestering protein Pfn1 as a central regulator of platelet integrin function as Pfn1-deficient platelets displayed almost abolished αIIbβ3 integrin signaling. This translated into a profound protection from arterial thrombus formation and prolonged tail bleeding times in vivo which was caused by enhanced calpain-dependent integrin closure. These findings further emphasize the importance of a functional actin cytoskeleton for intact platelet function in vitro and in vivo. Tβ4 is a moonlighting protein, acting as one of the major actin-sequestering proteins in cells of higher eukaryotes and exerting various paracrine functions including anti-inflammatory, immunomodulatory and pro-angiogenic effects. Although excessively studied, its role for cytoskeletal dynamics, the distinction between endo- and exogenous protein function and its uptake and release mechanisms are still poorly understood. Constitutive Tβ4-deficiency resulted in thrombocytopenia accompanied by a largely diminished G-actin pool in platelets and divergent effects on platelet reactivity. Pre-incubation of platelets with recombinant Tβ4 will help to understand the function of endo- and exogenous protein, which is under current investigation. N2 - Die Aktivierung und Aggregation von Thrombozyten bei Gefäßverletzungen zieht massive Umstrukturierungen des Zytoskeletts nach sich, die eine Voraussetzung für die intakte Funktion der Zellen darstellen. Des Weiteren nimmt das Zytoskelett eine zentrale Rolle in der Megakaryo- und Thrombopoese ein. Daher können Anomalien zytoskeletaler Proteine eine Vielzahl von Krankheitsbildern verursachen. Obwohl intensiv an den beteiligten Proteinen geforscht wird, sind die Signalkaskaden, die den komplexen Vorgang der Umstrukturierung des Zytoskeletts steuern, noch weitgehend unbekannt. In dieser Dissertation wurden drei Aktin-bindende Proteine, Coactosin-like (Cotl) 1, Profilin (Pfn) 1 und Thymosin (T) β4, hinsichtlich ihrer Rolle für die Bildung und Funktion von Thrombozyten mittels genetisch veränderter Mäuse untersucht. Proteine wie Twinfilin oder Cofilin, die ADF-H-Domänen enthalten, sind oftmals an der Thrombopoese sowie an zytoskeletaler Umstrukturierung beteiligt. Obgleich Cotl1 der ADF-H Proteinfamilie zugehörig ist, konnte in Cotl1-defizienten Mäusen weder eine Veränderung der Thrombozytenzahlen, noch der zytoskeletalen Dynamik festgestellt werden. Unerwarteter-weise zog eine Cotl1-Defizienz in vivo einen Schutz vor arterieller Thrombose und Schlaganfall nach sich. Defekte GPIb-vWF-Interaktionen sowie eine veränderte Freisetzung von sekundären intrazellulären Mediatoren zeigen mögliche Gründe für den schützenden Effekt einer Cotl1-Defizienz auf. Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass Cotl1 ein zentraler Regulator von Thrombose und Hämostase ist und etabliert es damit als potentielle antithrombotische Zielstruktur für eine effektive und sichere Behandlung von kardio- und zerebrovaskulären Erkrankungen. Studien zeigten, dass die Organisation des kortikalen Aktin-Zytoskeletts die Calpain-vermittelte αIIbβ3-Integrin-Inaktivierung moduliert und dadurch die Lokalisation der Integrine kontrolliert. Der zweite Teil dieser Dissertation identifizierte das Aktin-komplexierende Molekül Pfn1 als zentralen Regulator der Integrinfunktion in Thrombozyten, da Pfn1-defiziente Thrombozyten eine stark verminderte Reaktivität nach αIIbβ3-Integrin Aktivierung zeigten. Dies führte zu einem profunden Schutz vor arterieller Thrombusbildung und verlängerten Blutungszeiten in vivo, der durch eine verstärkte Calpain-vermittelte Integrin-Inaktivierung verursacht wurde. Diese Befunde unterstreichen erneut die zentrale Bedeutung eines funktionales Aktin-Zytoskeletts für die Aufrechterhaltung der Thrombozytenfunktion in vitro und in vivo. Tβ4 ist ein bivalentes Protein, das einerseits eine Funktion als Aktin-komplexierendes Protein in Zellen höherer Eukaryoten ausübt und andererseits unterschiedliche parakrine Funktionen hat, zu denen entzündungshemmende, immunmodulierende und pro-angiogene Wirkungen zählen. Obwohl intensiv an Tβ4 geforscht wird, ist seine Bedeutung für die Dynamik des Zytoskeletts sowie die Unterscheidung zwischen endo- und exogener Proteinfunktion und seine Aufnahme- und Freisetzungsmechanismen kaum verstanden. Konstitutive Tβ4-Defizienz zog eine Thrombozytopenie, begleitet von einem stark verminderten G-Aktin-Gehalt in Thrombozyten und gegensätzlichen Effekten auf die Thrombozytenreaktivität, nach sich. Der Effekt von rekombinant exprimiertem Tβ4 auf Thrombozyten, der derzeit untersucht wird, wird zum besseren Verständnis der endo- und exogenen Proteinfunktion, beitragen. KW - Thrombozyt KW - Zellskelett KW - Maus KW - platelet KW - cytoskeleton KW - Thymosin b4 KW - Profilin KW - Coactosin-like Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-168582 ER - TY - THES A1 - Chen, Wenchun T1 - Studies on the role of calcium channels and the kinase domain of transient receptor potential melastatin-like 7 (TRPM7) in platelet function T1 - Studien über die Rolle von Calcium Kanälen und der Kinase Dömane von transient receptor potential melastatin-like 7 (TRPM7) für die Thrombozytenfunktion N2 - Platelet activation and aggregation are essential processes for the sealing of injured vessel walls and preventing blood loss. Under pathological conditions, however, platelet aggregation can lead to uncontrolled thrombus formation, resulting in irreversible vessel occlusion. Therefore, precise regulation of platelet activation is required to ensure efficient platelet plug formation and wound sealing but also to prevent uncontrolled thrombus formation. Rapid elevations in the intracellular levels of cations are a core signaling event during platelet activation. In this thesis, the roles of Ca2+ and Mg2+ channels in the regulation of platelet function were investigated. Orai1, the major store-operated calcium (SOC) channel in platelets, is not only vital for diverse signaling pathways, but may also regulate receptor-operated calcium entry (ROCE). The coupling between the Orai1 signalosome and canonical transient receptor potential channel (TRPC) isoforms has been suggested as an essential step in the activation of store-operated calcium entry (SOCE) and ROCE in human platelets. However, the functional significance of the biochemical interaction between Orai and TRPC isoforms still remains to be answered. In the first part of this thesis, the functional crosstalk between Orai1 and TRPC6 was addressed. Orai1-mediated SOCE was found to enhance the activity of phospholipases (PL) C and D, to increase diacylglycerol (DAG) production and finally to regulate TRPC6-mediated ROCE via DAG, indicating that the regulation of TRPC6 channel activity seems to be independent of the physical interaction with Orai1. Furthermore, Orai1 and TRPC6 double deficiency led to a reduced Ca2+ store content and basal cytoplasmic Ca2+ concentrations, but surprisingly also enhanced ATP secretion, which may enhance Ca2+ influx via P2X1 and compensate for the severe Ca2+ deficits seen in double mutant platelets. In addition, Orai1 and TRPC6 were not essential for G protein-coupled receptor (GPCR)-mediated platelet activation, aggregation and thrombus formation. Transient receptor potential melastatin-like 7 (TRPM7) contains a cytosolic serine/threonine protein kinase. To date, a few in vitro substrates of the TRPM7 kinase have been identified, however, the physiological role of the kinase remains unknown. In the second part of this thesis, mice with a point mutation which blocks the catalytic activity of the TRPM7 kinase (Trpm7KI) were used to study the role of the TRPM7 kinase in platelet function. In Trpm7KI platelets phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (PIP2) metabolism and Ca2+ mobilization were severely impaired upon glycoprotein (GP) VI activation, indicating that the TRPM7 kinase regulates PLC function. This signaling defect in Trpm7KI platelets resulted in impaired aggregate formation under flow and protected animals from arterial thrombosis and ischemic brain infarction. Altogether, these results highlight the kinase domain of TRPM7 as a pivotal signaling moiety implicated in the pathogenesis of thrombosis and cerebrovascular events. N2 - Die Aktivierung und Aggregation von Thrombozyten sind zwei elementare Prozesse für das Abdichten verletzter Gefäßwände und damit zur Verhinderung von exzessivem Blutverlust. Unter pathologischen Bedingungen kann die Thrombozytenaggregation jedoch zur unkontrollierten Thrombusbildung und folglich zum irreversiblen Gefäßverschluss führen. Daher ist eine präzise Regulation der Thrombozytenaktivierung wichtig, um effizient Gefäßverletzungen zu schließen aber gleichzeitig eine unkontrollierte Thrombusbildung zu verhindern. Schnelle Veränderungen der zytoplasmatischen Konztentration von Kationen stellen ein Kernelement der Signaltransduktion während der Plättchenaktivierung dar. In dieser Arbeit wurden die Rolle von Ca2+ und Mg2+ Kanälen in der Regulation der Thrombozytenfunktion untersucht. Orai1, der bedeutendste store-operated calcium (SOC) Kanal in Thrombozyten, ist nicht nur entscheidend für verschiedene Signalwege, sondern reguliert möglicherweise auch receptor-operated calcium entry (ROCE). Die Kopplung zwischen dem Orai1-Signalkomplex und canonical transient receptor potential channel (TRPC) Isoformen wurde als entscheidender Schritt in der Aktivierung in der Aktivierung von store-operated calcium entry (SOCE) und ROCE in humanen Thrombozyten vermutet. Die Frage nach der funktionellen Relevanz der Interaktion zwischen Orai und TRPC Isoformen blieb jedoch unbeantwortet. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde der funktionelle Crosstalk zwischen Orai1 und TRPC6 adressiert. Hierbei zeigte sich, das Orai1-vermittelter SOCE die Aktivität der Phosholipasen (PL) C und D steigert, die Diacylglycerol (DAG) Produktion verstärkt und schließlich TRPC6-vermittelten ROCE via DAG reguliert, was darauf hindeutet, dass die Regulation der TRPC6 Kanalaktivität unabhängig von einer direkten Interaktion mit Orai1 zu sein scheint. Darüber hinaus führte die Doppeldefizienz von Orai1 und TRPC6 zu verringerten Ca2+ Konzentrationen in intrazellulären Ca2+-Speichern und im Zytoplasma der Thrombozyten. Überraschenderweise war auch die ATP-Sekretion erhöht, was eventuell den Ca2+-Einstrom durch P2X1 verstärkt und möglicherweise das starke Ca2+-Defizit in den doppeldefizienten Thrombozyten kompensiert. Außerdem wurde gezeigt, dass Orai1 und TRPC6 nicht für die Aktivierung und Aggregation von Thrombozyten sowie für die Thrombusbildung mittlels G protein-gekoppelter Rezeptoren (GPCR) benötigt werden. Transient receptor potential melastatin-like 7 (TRPM7) enthält eine zytosolische Serin/Threonin-Kinase Domain. Bislang wurden zwar wenige in vitro Substrate der TRPM7 Kinase identifiziert, jedoch ist die physiologische Rolle dieser Kinase immer noch unbekannt. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden Mäuse mit einer Punktmutation, welche die katalytische Aktivität der TRPM7 Kinase blockiert (Trpm7KI) eingesetzt um die Rolle der TRPM7 Kinase für die Funktion von Thrombozyten zu untersuchen. In Trpm7KI Thrombozyten war der Metabolismus von phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PIP2) und die Ca2+-Mobilisierung nach Aktivierung des Rezeptors Glykoprotein (GP) VI schwer beeinträchtigt, was darauf hindeutet, dass die Aktivität der TRPM7 Kinase die Funktion der PLC reguliert. Aus diesem Signaltransduktionsdefekt in Trpm7KI Thrombozyten resultierte eine verringerte Aggregatbildung unter Flussbedingungen und ein Schutz der Tiere vor arteriellen Thrombosen und ischämischem Schlaganfall. Zusammenfassend heben diese Ergebnisse die Kinasedomäne von TRPM7 als einen ausschlaggebenden Bestandteil in Signalkaskaden hervor und implizieren eine Rolle dieser Domäne in der Pathogenese von ischämischen Kardio- und zerebrovaskulären Erkrankungen. KW - Thrombozyt KW - Calciumkanal KW - Protein TRPC6 KW - Platelet KW - Orai1 KW - Crosstalk KW - TRPM7 kinase Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-103719 ER - TY - THES A1 - Aurbach, Katja T1 - Studies on the role of the cytoskeleton in platelet production T1 - Studien über die Rolle des Zytoskeletts in der Produktion von Thrombozyten N2 - Platelets are small anucleated cell fragments that originate from megakaryocytes (MKs), which are large cells located in the bone marrow (BM). MKs extend long cytoplasmic protrusions, a process which is called proplatelet formation, into the lumen of the sinusoidal vessels where platelets are sized by the bloodstream. During the process of platelet biogenesis, segments of the MK penetrate the endothelium and, through cytoskeletal remodeling inside the MK, proplatelet fragments are released. Rho GTPases, such as RhoA and RhoB, are critically involved in cytoskeletal rearrangements of both the actin and the tubulin cytoskeleton. The first part of this thesis concentrated on the protein RhoB and its involvement in cytoskeletal organization in MKs and platelets. Single knockout (KO) mice lacking RhoB had a minor microthrombocytopenia, which means a smaller platelet size and reduced platelet number, accompanied by defects in the microtubule cytoskeleton in both MKs and platelets. In particular, tubulin organization and stability, which is regulated by posttranslational modifications of α-tubulin, were disturbed in RhoB-/- platelets. In contrast, RhoB-/- MKs produced abnormally shaped proplatelets but had unaltered posttranslational modifications of α-tubulin. The second part focused on the influence of RhoA and RhoB on MK localization and platelet biogenesis in murine BM. Many intact RhoA-/- MKs are able to transmigrate through the endothelial layer and stay attached to the vessel wall, whereas only 1% of wildtype (wt) MKs are detectable in the intrasinusoidal space. Concomitant deficiency of RhoA and RhoB reverts this transmigration and results in macrothrombocytopenia, MK clusters around the vessel in the BM and defective MK development. The underlying mechanism that governs MKs to distinct localizations in the BM is poorly understood, thus this thesis suggests that this process may be dependent on RhoB protein levels, as RhoA deficiency is coincided with increased RhoB levels in MKs and platelets. The third part of this thesis targeted the protein PDK1, a downstream effector of Rho GTPases, in regard to MK maturation and polarization throughout thrombopoiesis. MK- and platelet-specific KO in mice led to a significant macrothrombocytopenia, impaired actin cytoskeletal reorganization during MK spreading and proplatelet formation, with defective MK maturation. This was associated with decreased PAK activity and, subsequently, phosphorylation of its substrates LIMK and Cofilin. Together, the observations of this thesis highlight the importance of Rho GTPases and their downstream effectors on the regulation of the MK and platelet cytoskeleton. N2 - Thrombozyten sind kleine Zellfragmente ohne Zellkern, die von Megakaryozyten (MKs) produziert werden. MKs sind riesige Zellen im Knochenmark, welche lange zytoplasmatische Ausläufer in die sinusoidalen Blutgefäße strecken, woraus durch den Blutstrom Thrombozyten abgeschnürt werden. Während der Thrombozyten-Biogenese penetrieren Teile des MKs das Endothel und durch zytoskeletales Umorganisieren innerhalb des MKs werden Proplättchen-Fragmente gebildet. Rho GTPasen wie die Proteine RhoA und RhoB sind maßgebliche Regulatoren des Zytoskeletts, sowohl des Aktins als auch des Tubulin Zytoskeletts. Der erste Teil dieser Thesis konzentrierte sich auf das Protein RhoB und dessen Einfluss auf die Organisation des Zytoskeletts. Mäuse mit einer Defizienz für das Protein RhoB zeigen eine Microthrombozytopenie und eine Reduktion der Thrombozytenzahl und -größe. Dies ist begleitet von Defekten des Mikrotubuli Zytoskeletts sowohl in MKs als auch in Blutplättchen. In Thrombozyten waren insbesondere Tubulin Organisation und Stabilisation betroffen, welche durch posttranslationale Modifizierungen von α-Tubulin bestimmt wurde. RhoB-negative MKs hingegen produzierten abnormal geformte Proplättchen, hatten jedoch unveränderte posttranslationale Modifizierungen von α-Tubulin. Der zweite Teil dieser Thesis fokussierte sich auf den Einfluss von RhoA und RhoB auf die Lokalisation von MKs im Knochenmarkt von Mäusen. Eine große Anzahl von RhoA-negativen MKs können durch das Endothel in die Blutgefäße wandern und bleiben dort adhärent, während nur etwa 1% wildtypischer MKs am Blutgefäß detektierbar sind. Gleichzeitige Defizienz von RhoA und RhoB revertiert die Translokation von RhoA-negativen MKs und führt in Mäusen zu Makrothrombozytopenie, die Formierung von MK Clustern um die Gefäßwand im Knochenmarkt und eine fehlerhafte MK Entwicklung. Der Mechanismus, der MKs zu bestimmten Positionen im Knochenmarkt führt, ist bisher kaum verstanden. In dieser Thesis konnte gezeigt werden, dass dieser Prozess von dem Level an RhoB Protein abhängig sein könnte, da eine Defizienz von RhoA zu einer Hochregulierung von RhoB in MKs und Thrombozyten führte. Der dritte Teil dieser Thesis zielte auf ein Signalprotein der Rho GTPasen ab, dem Protein PDK1. Es wurde die Rolle von PDK1 in der Regulation von MK Reifung und Polarisation während der Bildung von Thrombozyten untersucht. Ein MK und Thrombozyten spezifischer KO von PDK1 führte zu einer signifikanten Makrothrombozytopenie, einem gestörten Aktin Zytoskelett, während des MK Spreadings und der Proplättchen Bildung, begleitet von einer fehlerhaften MK Reifung. Dies war mit einer Reduktion in der Aktivität von PAK und folglich dem Phosphorylierungsstatus seiner Substrate LIMK und Cofilin assoziiert. Die Beobachtungen dieser Doktorarbeit arbeiteten die Relevanz von Rho GTPasen und ihren Signalproteinen für die Regulation des MK und Thrombozyten Zytoskelettes im Maus-Modell hervor. KW - Megakaryozyt KW - Thrombozyt KW - Zellskelett KW - Thrombopoiesis KW - Cytoskeleton Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-234669 ER - TY - THES A1 - Mischnik, Marcel T1 - Systembiologische Analyse der ADP- und Prostaglandin-vermittelten Signaltransduktion humaner Thrombozyten T1 - Systems biological analysis of ADP and prostaglandin mediated signal transduction in human thrombocytes N2 - Thrombozyten (Blutplättchen) sind die Vermittler der zellulären Hämostase. Ihre Fähigkeit zu Aggregieren und sich an das umgebende Gewebe verletzter Blutgefässe anzulagern, wird durch ein komplexes intrazelluläres Signaltransduktionsnetzwerk bestimmt, das sowohl aktivierende, als auch inhibierende Subnetzwerke beinhaltet. Das Verständnis dieser Prozesse ist von hoher medizinischer Bedeutung. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die thrombozytäre Signaltransduktion sowohl mittels eines Boole'schen, als auch verschiedener dynamischer Modelle analysiert. Die Boole'sche Modellierung führte zu interessanten Erkenntnissen über das Zusammenwirken einzelner Subnetzwerke bei der Vermittlung irreversibler Plättchenaktivierung und zeigte Mechanismen der Interaktion mit dem hemmenden Prostaglandinsystem auf. Das Modell beinhaltet unter Anderem wichtige Systemkomponenten wie Calciumsignalgebung, Aktivierung von Schlüsselkinasen wie Src und PKC, Integrin-vermitteltes outside-in sowie inside-out Signalgebung und autokrine ADP- und Thromboxan-Produktion. Unter Verwendung dieses Boole'schen Ansatzes wurde weiterhin das System-eigene Schwellenwertverhalten analysiert. Dabei stellte sich eine umgekehrt proportionale Abhängigkeit des relativen aktivierenden Reizes, der notwendig ist um den Schwellenwert zu überschreiten, vom absoluten hemmenden Input heraus. Das System adaptiert demnach an höhere Prostaglandinkonzentrationen durch eine Erhöhung der Sensitivität für Aktivatoren wie dem van-Willebrandt-Faktor und Kollagen, und ermöglicht somit auch unter lokal hemmenden Bedingungen eine Plättchen-vermittelte Hämostase. Der nächste Schritt bestand in der Implementierung eines Differentialgleichungs-basierten Modells der thrombozytären Prostaglandin-Signaltransduktion, um einen detaillierten Überblick über die Dynamik des inhibierenden Netzwerkteils zu erhalten. Die kinetischen Parameter dieses Modells wurden teilweise der Literatur entnommen. Der andere Teil wurde anhand einer umfassenden Kombination dosis- und zeitabhängiger cAMP und phospho-VASP Messdaten geschätzt. Der Prozess beinhaltete mehrere Iterationen aus Modellvorhersagen einerseits und experimentellem Design andererseits. Das Modell liefert die quantitativen Effekte der Prostaglandinrezeptoren IP, DP1, EP3 und EP4 und des ADP-Rezeptors P2Y12 auf die zugrunde liegende Signalkaskade. EP4 zeigt den stärksten Effekt in der aktivierenden Fraktion, wohingegen EP3 einen stärkeren inhibitorischen Effekt ausübt, als der durch Clopidogrel hemmbare ADP-Rezeptor P2Y12. Weiterhin wurden die Eigenschaften des negativen feedback-loops der PKA auf den cAMP-Spiegel untersucht, und eine direkte Beeinflussung der Adenylatzyklase durch die PKA festgestellt, in Form einer Reduzierung der maximalen katalytischen Geschwindigkeit. Die Identifizierbarkeit der geschätzten Parameter wurde mittels profile-Likelihood-Schätzung untersucht. In einem dritten Schritt wurde ein sowohl die aktivierenden, als auch die hemmenden Netzwerkteile umfassendes dynamisches Modell implementiert. Die Topologie dieses Modells wurde in Anlehnung an die des Boole'schen Modells auf der Basis von a priori Wissen festgelegt. Die Modellparameter wurden anhand von Western-Blot, Calcium- und Aggregationsmessungen geschätzt. Auch hier wurde die Identifizierbarkeit der Modellparameter durch profile-likelihood-Schätzung überprüft. Die bei niedrigen Ligandenkonzentrationen auftretende Reversibilität der Plättchen-Aggregation konnte mittels dieses Modells reproduziert werden. Jedoch zeigte sich bei mittleren ADP-Konzentrationen ein Fließgleichgewicht in einem teilweise aktivierten Zustand, und damit kein bistabiles Schwellenwertverhalten. Inwiefern dieses Verhalten durch einen Umgebungs-basierteren Mechanismus des Alles-Oder-Nichts-Verhaltens begründet wird, bei dem der Übergang von reversibler zu irreversibler Aggregation mehr durch parakrine Effekte des gesammten Thrombus bestimmt wird, als durch spezifische Signaltransduktionseigenschaften der einzelnen Zelle, müssen zukünftige Experimente zeigen. Insgesamt geben die erstellten Modelle interessante Einblicke in die Funktionsweise der Thrombozyten und ermöglichen die Simulation von pharmakologischen und genetischen Einflüssen, wie Rezeptormodulationen und knock-outs. Sie geben damit Implikationen zur Entstehung und Behandlung pathophysiologischer Zustände, und wertvolle Denkanstöße für die weitere Forschung. N2 - Platelets represent the key-players in mammalian wound-healing. Their ability to aggregate and attach to the surrounding tissue of damaged blood vessels is thereby mediated by a complex signal -transduction network that comprises both activatory and inhibitory components. Due to its medical relevance and the lack of profound understanding, the network constitutes a convenient target for modeling. In a first step, a Boolean implementation of platelet signal transduction, comprising both activating and inhibiting networks components was established. This led to important information, on how the function of different subnetworks coalesce to fully activate the platelet and to promote irreversible aggregation. These include calcium signalling, activation of key-kinases like Akt, Src and PKC, Integrin outside-in as well as inside-out signalling and autocrin ADP and thromboxane production. In addition, using this data-free approach, the systems inherent threshold behaviour was analysed. The model revealed, that the relative activating strength, that transgresses the threshold, decreases with elevating PGI inputs and is also dependent on auto- and parakrin effects. Thus, the system adapts for higher prostaglandin-concentrations by increasing its sensitivity for activators like vWF and collagen, and thereby commits thrombocyte-dependent active processes such as wound healing even if subsequently blood prostaglandin-levels are higher in later time points. Secondly, an ordinary-differential-equation based model of platelet prostaglandin signalling was established, to get a detailed view of the dynamics governing the inhibiting network part. The kinetic parameters of the model were partly taken from literature and in part estimated along a comprehensive combination of time-course and dose-response measurements of cAMP and phosphorylated VASP. The process involved an iterative cycle between model predictions and experimental design. The model delivered the quantitative effects of the prostaglandin receptors IP, DP1, EP3, EP4 and the ADP receptor P2Y12 on the underlying signalling cascade. EP4 showed the strongest effect in the activating fraction, whereas EP3 turned out to exert a greater inhibiting impact than the commonly established pharmacological target P2Y12. Furthermore, the nature of the double-negative feedback loop constituted by PKA was examined, which disclosed a direct influence of PKA on adenylate cyclase, reducing its maximum catalytic speed. The identifiablility of all kinetic parameters was analysed via profile likelihood estimation. Finally, a dynamical model comprising both activating ADP-signalling through P2Y1 and P2Y12 receptors, and the inhibiting prostaglandin-pathway was implemented. The topology of this larger model was established on the basis of a priori knowledge. Model parameters were fitted along time-resolved Western-Blot, calcium and aggregation measurements. The identifiability of the model parameters was again check by means of profile likelihood estimation. Reversibility of platelet activation at low ADP concentrations could be reproduced by this model. However, at medium concentrations the system appears to assume a steady-state in a partly activated condition, thus not providing for a bistable threshold behaviour. If this behaviour is based on a more enviroment-based character of the observed point-of-no-return behaviour, in which the transition from reversible to irreversible aggregation is rather due to parakrin effects evoked by the entire cell array, than due to specific network properties present in the single cell, has to be investigated by further experiments. All in all, the models show interesting properties of platelet signal transduction, and give valuable implications for medical treatment and future research. KW - Thrombozyt KW - Modellierung KW - ADP KW - Prostaglandine KW - Signaltransduktion KW - Thrombozyten KW - Modellierung KW - ADP KW - Prostaglandine KW - platelets KW - ADP KW - prostaglandin KW - modeling KW - boolean KW - ODE Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-78807 ER - TY - THES A1 - Boyanova, Desislava Veselinova T1 - Systems biological analysis of the platelet proteome and applications of functional module search in proteome networks T1 - Systembiologische Analyse des Blutplättchenproteoms und funktionelle Modulsuche in Proteinnetzwerken N2 - Recent development of proteomic approaches and generation of large-scale proteomic datasets calls for new methods for biological interpretation of the obtained results. Systems biological approaches such as integrated network analysis and functional module search have become an essential part of proteomic investigation. Proteomics is especially applied in anucleate cells such as platelets. The underlying molecular mechanisms of platelet activation and their pharmacological modulation are of immense importance for clinical research. Advances in platelet proteomics have provided a large amount of proteomic data, which has not yet been comprehensively investigated in a systems biological perspective. To this end, I assembled platelet specific data from proteomic and transcriptomic studies by detailed manual curation and worked on the generation of a comprehensive human platelet repository for systems biological analysis of platelets in the functional context of integrated networks (PlateletWeb) (http:/PlateletWeb.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de). I also added platelet-specific experimentally validated phosphorylation data and generated kinase predictions for 80% of the newly identified platelet phosphosites. The combination of drug, disease and pathway information with phosphorylation and interaction data makes this database the first integrative platelet platform available for platelet research. PlateletWeb contains more than 5000 platelet proteins, which can also be analyzed and visualized in a network context, allowing identification of all major signaling modules involved in platelet activation and inhibition. Using the wealth of integrated data I performed a series of platelet-specific analyses regarding the platelet proteome, pathways, drug targets and novel platelet phosphorylation events involved in crucial signaling events. I analyzed the statistical enrichment of known pathways for platelet proteins and identified endocytosis as a highly represented pathway in platelets. Further results revealed that highly connected platelet proteins are more often targeted by drugs. Using integrated network analysis offered by PlateletWeb, I analyzed the crucial activation signaling pathway of adenosine diphosphate (ADP), visualizing how the signal flow from receptors to effectors is maintained. My work on integrin inside-out signaling was also based on the integrated network approach and examined new platelet-specific phosphorylation sites and their regulation using kinase predictions. I generated hypothesis on integrin signaling, by investigating the regulation of Ser269 phosphorylation site on the docking protein 1 (DOK1). This phosphorylation site may influence the inhibiting effect of DOK1 on integrin a2bb3. Extending the integrated network approach to further cell lines, I used the assembled human interactome information for the analysis of functional modules in cellular networks. The investigation was performed with a previously developed module detection algorithm, which finds maximum-scoring subgraphs in transcriptomic datasets by using assigned values to the network nodes. We extended the algorithm to qualitative proteomic datasets and enhanced the module search by adding functional information to the network edges to concentrate the solution onto modules with high functional similarity. I performed a series of analyses to validate its performance in small-sized (virus-infected gastric cells) and medium-sized networks (human lymphocytes). In both cases the algorithm extracted characteristic modules of sample proteins with high functional similarity. The functional module search is especially useful in site-specific phosphoproteomic datasets, where kinase regulation of the detected sites is often sparse or lacking. Therefore, I used the module detection algorithm in quantitative phosphoproteomic datasets. In a platelet phosphorylation dataset, I presented a pipeline for network analysis of detected phosphorylation sites. In a second approach, the functional module detecting algorithm was used on a phosphoproteome network of human embryonic stem cells, in which nodes represented the maximally changing phosphorylation sites in the experiment. Additional kinases from the human phosphoproteome in PlateletWeb were included to the network to investigate the regulation of the signal flow. Results indicated important phosphorylation sites and their upstream kinases and explained changes observed in embryonic stem cells during differentiation. This work presents novel approaches for integrated network analysis in cells and introduces for the first time a systematic biological investigation of the human platelet proteome based on the platelet-specific knowledge base PlateletWeb. The extended methods for optimized functional module detection offer an invaluable tool for exploring proteomic datasets and covering gaps in complex large-scale data analysis. By combining exact module detection approaches with functional information data between interacting proteins, characteristic functional modules with high functional resemblance can be extracted from complex datasets, thereby focusing on important changes in the observed networks. N2 - Jüngste Entwicklungen der Proteomik und die damit einhergehende Erzeugung großer Datensätze erfordern neue Methoden zur biologischen Interpretation der gewonnenen Ergebnisse. Systembiologische Ansätze wie die integrierte Netzwerkanalyse sowie die funktionelle Modulsuche sind zu einem wesentlichen Bestandteil bei der Untersuchung von Proteinen geworden. Die Proteomik wird vor allem in kernlosen Zellen wie den Blutplättchen angewandt. Die zu Grunde liegenden molekularen Mechanismen bei der Aktivierung von Thrombozyten und deren pharmakologische Modulation sind von immenser Bedeutung für die klinische Forschung. Aktuelle Studien in der Proteomforschung haben insbesondere bei Thrombozyten große Mengen an Daten erzeugt, die bisher noch nicht umfassend systembiologisch untersucht wurden. Zu diesem Zweck stellte ich manuell thrombozyten-spezifische Daten aus Proteom- und Transkriptomstudien zusammen und arbeitete an der Entwicklung einer umfassenden menschlichen Thrombozytendatenbank für die systembiologische Analyse der Funktion von Blutplättchen mittels integrierter Netzwerkanalyse (PlateletWeb) (http:/PlateletWeb.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de). Zusätzlich habe ich plättchen-spezifische, experimentell validierte Phosphorylierungsinformationen hinzugefügt und generierte Kinasenvorhersagen für 80% der neu identifizierten Phosphorylierungsstellen. Die Kombination aus Medikamenten, assoziierten Krankheiten und Signalweginformation zusammen mit Phosphorylierungs- und Interaktionsdaten macht diese Datenbank zu einer ersten und umfassenden Anlaufstelle für Thrombozytenforschung. PlateletWeb enthält mehr als 5000 Plättchenproteine, die in einem Netzwerk analysiert und dargestellt werden können. Dabei ist die Identifizierung aller wichtigen Signalmodule zur Plättchenaktivierung und -inhibierung möglich. Mit der Fülle an verfügbaren Daten führte ich eine Reihe thrombozyten-spezifischer Analysen am Plättchenproteom, an Signalwegen, pharmakologischen Wirkstoffzielen und Phosphorylierungsreaktionen in grundlegenden Signalprozessen durch. Ich analysierte die statistische Anreicherung bekannter Signalwege für Plättchenproteine und identifizierte Endozytose als einen sehr repräsentativen Signalweg in Thrombozyten. Weitere Ergebnisse zeigten, dass stark vernetzte Plättchenproteine häufiger Ziel von Medikamenten sind. Mittels der Netzwerkanalyse von PlateletWeb untersuchte ich den grundlegenden Signalaktivierungspfad von Adenosindiphosphat (ADP), und veranschaulichte den Signalfluss von Rezeptor zu Effektor. Meine Arbeit an der Integrin-Inside-Out-Signalisierung beinhaltete zudem die Untersuchung neuer thrombozyten-spezifischer Phosphorylierungsstellen und ihre Regulation durch Kinasenvorhersagen mit Hilfe des integrierten Netzwerkanalyseansatzes. Durch die Untersuchung der Regulation bei der Phosphorylierungsstelle Ser269 im Docking-Protein (DOK1) stellte ich eine neue Hypothese zur Integrinsignalisierung auf. Diese Phosphorylierungsstelle könnte den inhibitorischen Effekt von DOK1 auf integrin a2bb3 beeinflussen. Ich erweiterte den integrierten Netzwerkanalyseansatz für andere Zelllinien, indem ich die gesammelten Informationen aus dem menschlichen Interaktom für die Analyse von funktionellen Modulen in zellulären Netzen nutzte. Die Untersuchung wurde mit einem zuvor entwickelten Algorithmus zur Modulerkennung durchgeführt, der maximal bewertete Teilgraphen in Transkriptomdatensätzen anhand zugewiesener Werte für Netzwerkknoten findet. Wir erweiterten den Algorithmus zur Anwendung auf qualitative Proteomdatensätze und optimierten die Modulsuche durch Integration funktioneller Informationen in die Netzwerkkanten. Dies fokussierte die Optimierung auf Proteinmodule mit hoher funktioneller Ähnlichkeit. Ich führte eine Reihe von Analysen durch, um die Effizienz des Algorithmus in kleinen (durch Viren infizierte Magenzellen) und mittelgroßen Netzwerken (menschliche Lymphozyten) zu überprüfen. In beiden Fällen extrahierte der Algorithmus charakteristische Module der untersuchten Proteine mit hohen funktionellen Ähnlichkeiten. Die funktionelle Modulsuche ist besonders bei positionsspezifischen Phosphoproteomikdatensätzen nützlich, in denen die Kinasenregulation der detektierten Phosphorylierungsstellen nur spärlich oder gar nicht vorhanden ist. Daher habe ich den Algorithmus der Moduldetektion auf quantitative Phosphoproteomikdatensätze angewandt. Anhand eines Datensatzes bestehend aus phosphorylierten Plättchenproteinen habe ich eine Vorgehensweise zur Netzwerkanalyse von Phosphorylierungsstellen entwickelt. In einer zweiten Studie wurde der Algorithmus der Moduldetektion auf ein phosphoproteomisches Netzwerk menschlich embryonaler Stammzellen angewandt, in dem Phosphorylierungsstellen mit maximaler Veränderung durch Netzwerkknoten repräsentiert wurden. Um die Regulation des Signalflusses zu untersuchen wurden weitere Kinasen aus dem menschlichen Phosphoproteom beziehungsweise PlateletWeb integriert. Ergebnisse wiesen auf wichtige Phosphorylierungsstellen und ihre Upstream-Kinasen hin und verdeutlichten Vorgänge, die während der Differenzierung in den embryonalen Stammzellen stattgefunden haben. Diese Arbeit bietet neue Vorgehensweisen der integrierten Netzwerkanalyse in Zellen und präsentiert zum ersten Mal eine systembiologische Untersuchung des menschlichen Proteoms mit Hilfe der Trombozytendatenbank PlateletWeb. Die erweiterten Methoden zur verbesserten Erkennung funktioneller Module bieten ein wertvolles Werkzeug für die Erforschung proteomischer Datensätze und vervollständigen die komplexe und umfangreiche Datenanalyse. Charakteristische Module, die große Ähnlichkeit auf funktioneller Ebene aufweisen, können durch die Kombination von exakten Modulerkennungsansätzen mit funktionellen Daten extrahiert werden. Dabei werden wichtige Änderungen besonders bei der Analyse komplexer Netzwerke hervorgehoben. KW - Netzwerkanalyse KW - Thrombozyt KW - Proteomanalyse KW - Systembiologie KW - Funktionelle Modulsuche KW - Plättchenphosphoproteom KW - Netzwerkalgorithmen KW - Systems Biology KW - Integrated network analysis KW - Plättchennetzwerk KW - Proteome KW - Phosphoproteomic analysis KW - Functional module search KW - Functional interaction Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72165 ER - TY - THES A1 - Becker, Isabelle Carlotta T1 - The role of megakaryocytes and platelets in vascular and osteogenic development T1 - Die Rolle von Megakaryozyten und Thrombozyten in vaskulärer und osteogener Entwicklung N2 - Platelets, small anucleate cell fragments in the blood stream, derive from large precursor cells, so-called megakaryocytes (MK) residing in the bone marrow (BM). In addition to their role in wound healing, platelets have been shown to play a significant role during inflammatory bleeding. Above all, the immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM) receptors GPVI as well as CLEC-2 have been identified as main regulators of vascular integrity. In addition to ITAM-bearing receptors, our group identified GPV as another potent regulator of hemostasis and thrombosis. Surprisingly, concomitant lack of GPV and CLEC-2 deteriorated blood-lymphatic misconnections observed in Clec2-/- mice resulting in severe edema formation and intestinal inflammation. Analysis of lymphatic and vascular development in embryonic mesenteries revealed severely defective blood-lymph-vessel separation, which translated into thrombocytopenia and increased vascular permeability due to reduced tight junction density in mesenteric blood vessels and consequent leakage of blood into the peritoneal cavity. Recently, platelet granule release has been proposed to ameliorate the progression of retinopathy of prematurity (ROP), a fatal disease in newborns leading to retinal degradation. The mechanisms governing platelet activation in this process remained elusive nonetheless, which prompted us to investigate a possible role of ITAM signaling. In the second part of this thesis, granule release during ROP was shown to be GPVI- and partly CLEC-2-triggered since blockade or loss of these receptors markedly deteriorated ROP progression. Proplatelet formation from MKs is highly dependent on a functional microtubule and actin cytoskeleton, the latter of which is regulated by several actin-monomer binding proteins including Cofilin1 and Twinfilin1 that have been associated with actin-severing at pointed ends. In the present study, a redundancy between both proteins especially important for the guided release of proplatelets into the bloodstream was identified, since deficiency in both proteins markedly impaired MK functionality mainly due to altered actin-microtubule crosstalk. Besides ITAM-triggered activation, platelets and MKs are dependent on inhibitory receptors, which prevent overshooting activation. We here identified macrothrombocytopenic mice with a mutation within Mpig6b encoding the ITIM-bearing receptor G6b-B. G6b-B-mutant mice developed a severe myelofibrosis associated with sex-specific bone remodeling defects resulting in osteosclerosis and -porosis in female mice. Moreover, G6b-B was shown to be indispensable for MK maturation as verified by a significant reduction in MK-specific gene expression in G6b-B-mutant MKs due to reduced GATA-1 activity. N2 - Blutplättchen, die kleinsten Zellen des hämatopoetischen Systems, werden von großen Vorläuferzellen, den Megakaryozyten (MKs), im Knochenmark gebildet. Neben ihrer Rolle bei der Blutstillung und Wundheilung sind Thrombozyten außerdem maßgeblich daran beteiligt, Blutungen in Entzündungsprozessen zu verhindern. Insbesondere den immuno- receptor tyrosine-based activation motif (ITAM) Rezeptoren GPVI und CLEC-2 wird eine tragende Rolle in der Aufrechterhaltung der vaskulären Integrität zugeschrieben. Neben den ITAM-Rezeptoren konnten wir auch für den Thrombozytenrezeptor GPV eine Funktion in Hämostase und Thrombose identifizieren. Erstaunlicherweise führte ein gleichzeitiger Verlust von GPV und CLEC-2 zu einer dramatischen Verstärkung der Blut- Lymphgefäß-Fehlbildungen, die bereits in CLEC-2-defizienten Mäusen beschrieben wurde, sodass die Tiere eine starke Ödembildung in den Extremitäten sowie Entzündungen des Dünndarms aufwiesen. Eine vertiefte Analyse der vaskulären Strukturen in Mesenterien während der Embryonalentwicklung offenbarte zusätzliche Defekte in der Blut- und Lymphgefäßtrennung in CLEC-2/GPV-defizienten Mäusen. Diese Deformationen führten zu Thrombozytopenie, Anämie und einer erhöhten vaskulären Permeabilität in adulten Mäusen, was sich auf eine reduzierte tight-junction-Dichte in Mesenterien und Darmgewebe zurückführen ließ, die zu einem Austritt von Blut in die Peritonealhöhle führte. In einer kürzlich veröffentlichten Publikation wurde Plättchengranula eine Rolle in der Auflösung retinopathischer Gefäßmissbildungen zugeschrieben. Retinopathia praema- turorum (ROP) ist eine Krankheit in Frühgeborenen, die aufgrund von Sauerstoffunter- schieden vor und nach Geburt zu Netzhautablösung und Blindheit führen kann. Die exakten Mechanismen, die hierbei zu Thrombozytenaktivierung und nachfolgender Degranulierung beitragen, sind bisher allerdings nicht bekannt. Da eine tragende Rolle von ITAM Rezeptoren in der Aufrechterhaltung vaskulärer Integrität insbesondere in krankhaftem Gewebe zuvor bereits aufgezeigt wurde, untersuchten wir die Entwicklung von Vaso-obliteration und Neovaskularisierung in CLEC-2 und GPVI-depletierten oder defizienten Mäusen und konnten einen Beitrag beider Rezeptoren zur Progression von ROP nachweisen. Die Produktion von Thrombozyten aus MKs ist stark von einem funktionalen Mikrotubuli- und Aktin-Zytoskelett abhängig. Aktinpolymerisation wird substanziell von unterschiedlichen Aktin-bindenden Proteinen reguliert, von denen Cofilin1 und Twinflin1 ein Abtrennen der Filamente induzieren. Wir konnten nun eine funktionale Redundanz beider Proteine in murinen MKs aufzeigen, die insbesondere für ein geregeltes Abschnüren von Thrombozyten in die Blutbahn essentiell ist und von einem Crosstalk zwischen Aktin- und Mikrotubuli- Zytoskeletts abhängig ist, der durch Twinfilin1 und Cofilin1 aufrechterhalten wird. Neben ITAM-induzierter Thrombozytenaktivierung spielt auch die Inhibition derselbigen durch immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif (ITIM)-Rezeptoren eine große Rolle in MKs und Plättchen, da diese eine überschießende Aktivierung verhindern. Wir konnten in der vorliegenden Arbeit eine Spontanmutation in Mpig6b, das für den ITIM-Rezeptor G6b-B codiert, in stark makrothrombozytopenen, wildtypischen Mäusen identifizieren. Außer in der stark reduzierten Thrombozytenzahl manifestierte sich die Mutation des Weiteren in einer massiven Myelofibrose, die mit einer geschlechtsspezifischen Osteosklerose und -porose in weiblichen Mäusen einherging. Überraschenderweise konnten wir zudem einen dramatischen Reifungsblock in G6b-B-mutierten MKs feststellen, der insbesondere in einer reduzierten Expression des Transkriptionsfaktors GATA-1 begründet lag. KW - Megakaryozyt KW - Thrombozyt KW - Megakaryocyte KW - platelets KW - bone marrow KW - hematopoiesis Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-210241 ER - TY - THES A1 - May, Frauke T1 - The role of the (hem)ITAM-coupled receptors C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2) and Glycoprotein (GP) VI for platelet function: in vitro and in vivo studies in mice T1 - Die Rolle der (hem)ITAM-gekoppelten Rezeptoren C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2) und Glykoprotein (GP) VI in der Thrombozytenfunktion: in vitro- und in vivo-Studien in Mäusen N2 - Die Thrombozytenaktivierung und –adhäsion sowie die nachfolgende Thrombusbildung ist ein essentieller Prozess in der primären Hämostase, der aber auch irreversible Gefäßverschlüsse und damit Herzinfarkt oder Schlaganfall verursachen kann. Erst kürzlich wurde beschrieben, dass der C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2) auf der Thrombozytenoberfläche exprimiert wird, jedoch wurde für diesen Rezeptor noch keine Funktion in den Prozessen der Hämostase und Thrombose gezeigt. In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle von CLEC-2 in der Thrombozytenfunktion und Thrombusbildung im Mausmodel untersucht. In dem ersten Teil dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Behandlung von Mäusen mit dem neu generierten monoklonalen Antikörper INU1, der gegen murines CLEC-2 gerichtet ist, zu dem vollständigen und hochspezifischen Verlust des Rezeptors in zirkulierenden Thrombozyten führte, ein Prozess, der als „Immundepletion“ bezeichnet wird. Die CLEC-2-defizienten Thrombozyten waren nicht mehr durch den CLEC-2-spezifischen Agonisten Rhodozytin aktivierbar, während die Aktivierung durch alle anderen getesteten Agonisten nicht beeinträchtigt war. Dieser selektive Defekt führte unter Flussbedingungen ex vivo zu stark verminderter Aggregatbildung der Thrombozyten. Außerdem zeigten in vivo-Thrombosestudien, dass die gebildeten Thromben instabil waren und vermehrt embolisierten. Infolgedessen war die CLEC-2 Defizienz mit einem deutlichen Schutz vor arterieller Thrombose verbunden. Außerdem ließ die in INU1-behandelten Mäusen beobachtete variable Verlängerung der Blutungszeit auf einen moderaten hämostatischen Defekt schließen. Diese Ergebnisse zeigen zum ersten Mal, dass CLEC-2 in vitro und in vivo signifikant zur Thrombusstabilität beiträgt und eine essentielle Rolle in der Hämostase und arteriellen Thrombose spielt. Daher stellt CLEC-2 eine potentiell neue antithrombotische Zielstruktur dar, die in vivo inaktiviert werden kann. Diese in vivo-Herabregulierung von Thrombozytenoberflächenrezeptoren könnte einen vielversprechenden Ansatz für zukünftige antithrombotische Therapien darstellen. Der zweite Teil dieser Arbeit behandelte den Effekt einer Doppelimmundepletion der immunoreceptor tyrosine-based activation motiv (ITAM)- und hemITAM-gekoppelten Rezeptoren Glykoprotein (GP) VI und CLEC-2 auf Hämostase und Thrombose mittels einer Kombination der GPVI- beziehungsweise CLEC-2-spezifischen Antikörper JAQ1 und INU1. Eine Einzeldepletion von GPVI oder CLEC-2 in vivo beeinträchtigte nicht die Expression und Funktion des jeweils anderen Rezeptors. Eine gleichzeitige Behandlung mit beiden Antikörpern führte jedoch zu dem nachhaltigen Verlust der GPVI- und CLEC-2-vermittelten Signale in Thrombozyten, während andere Signalwege nicht betroffen waren. Im Gegensatz zu den Einzeldefizienzen, wiesen die GPVI/CLEC-2 doppeldefizienten Mäuse einen schwerwiegenden Blutungsphänotyp auf. Außerdem führte die Behandlung zu einer starken Beeinträchtigung der arteriellen Thrombusbildung, die die Effekte der Einzeldefizienzen weit übertraf. Von Bedeutung ist auch, dass gleiche Ergebnisse in Gp6-/- Mäusen gefunden wurden, die mittels INU1-Behandlung CLEC-2-depletiert wurden. Dies veranschaulicht, dass der Blutungsphänotyp nicht durch Sekundäreffekte der kombinierten Antikörperbehandlung hervorgerufen wurde. Diese Daten deuten darauf hin, dass GPVI und CLEC-2 sowohl unabhängig voneinander als auch gleichzeitig in vivo von der Thrombozytenoberfläche herabreguliert werden können und lassen unerwartete redundante Funktionen der beiden Rezeptoren in Hämostase und Thrombose erkennen. Da beide Rezeptoren, GPVI und CLEC-2, als neue antithrombotische Zielstrukturen diskutiert werden, könnten diese Ergebnisse wichtige Auswirkungen auf die Entwicklung von anti-GPVI oder anti-CLEC-2-basierenden Antithrombotika haben. N2 - Platelet activation and adhesion results in thrombus formation that is essential for normal hemostasis, but can also cause irreversible vessel occlusion leading to myocardial infarction or stroke. The C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2) was recently identified to be expressed on the platelet surface, however, a role for this receptor in hemostasis and thrombosis had not been demonstrated. In the current study, the involvement of CLEC-2 in platelet function and thrombus formation was investigated using mice as a model system. In the first part of the thesis, it was found that treatment of mice with a newly generated monoclonal antibody against murine CLEC-2 (INU1) led to the complete and highly specific loss of the receptor in circulating platelets (a process termed “immunodepletion”). CLEC-2-deficient platelets were completely unresponsive to the CLEC-2-specific agonist rhodocytin, whereas activation induced by all other tested agonists was unaltered. This selective defect translated into severely decreased platelet aggregate formation under flow ex vivo; and in vivo thrombosis models revealed impaired stabilization of formed thrombi with enhanced embolization. Consequently, CLEC-2 deficiency profoundly protected mice from occlusive arterial thrombus formation. Furthermore, variable bleeding times in INU1-treated mice indicated a moderate hemostatic defect. This reveals for the first time that CLEC-2 significantly contributes to thrombus stability in vitro and in vivo and plays a crucial role in hemostasis and arterial thrombosis. Thus, CLEC-2 represents a potential novel anti-thrombotic target that can be functionally inactivated in vivo. This in vivo down-regulation of platelet surface receptors might be a promising approach for future anti-thrombotic therapy. The second part of the work investigated the effect of double-immunodepletion of the immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM)- and hemITAM-coupled receptors, platelet glycoprotein (GP) VI and CLEC-2, on hemostasis and thrombosis using a combination of the GPVI- and CLEC-2-specific antibodies, JAQ1 and INU1, respectively. Isolated targeting of either GPVI or CLEC-2 in vivo did not affect expression or function of the respective other receptor. However, simultaneous treatment with both antibodies resulted in the sustained loss of GPVI and CLEC-2 signaling in platelets, while leaving other activation pathways intact. In contrast to single deficiency of either receptor, GPVI/CLEC-2 double-deficient mice displayed a dramatic hemostatic defect. Furthermore, this treatment resulted in profound impairment of arterial thrombus formation that far exceeded the effects seen in single-depleted animals. Importantly, similar results were obtained in Gp6-/- mice that were depleted of CLEC-2 by INU1-treatment, demonstrating that this severe bleeding phenotype was not caused by secondary effects of combined antibody treatment. These data suggest that GPVI and CLEC-2 can be independently or simultaneously down-regulated in platelets in vivo and reveal an unexpected functional redundancy of the two receptors in hemostasis and thrombosis. Since GPVI and CLEC-2 have intensively been discussed as potential anti-thrombotic targets, these results may have important implications for the development of novel, yet save anti-GPVI or anti-CLEC-2-based therapies. KW - Thrombozyt KW - Rezeptor KW - Thrombose KW - Biologie KW - Zelle KW - Biology KW - Cell Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-65383 ER - TY - THES A1 - Stritt, Simon T1 - The role of the cytoskeleton in platelet production and the pathogenesis of platelet disorders in humans and mice T1 - Die Rolle des Zytoskeletts in der Thrombopoese und der Pathogenese von Thrombozytopathien im Menschen und der Maus N2 - Platelets are continuously produced from megakaryocytes (MK) in the bone marrow by a cytoskeleton-driven process of which the molecular regulation is not fully understood. As revealed in this thesis, MK/ platelet-specific Profilin1 (Pfn1) deficiency results in micro- thrombocytopenia, a hallmark of the Wiskott-Aldrich syndrome (WAS) in humans, due to accelerated platelet turnover and premature platelet release into the bone marrow. Both Pfn1-deficient mouse platelets and platelets isolated from WAS patients contained abnormally organized and hyper-stable microtubules. These results reveal an unexpected function of Pfn1 as a regulator of microtubule organization and point to a previously unrecognized mechanism underlying the platelet formation defect in WAS patients. In contrast, Twinfilin2a (Twf2a) was established as a central regulator of platelet reactivity and turnover. Twf2a-deficient mice revealed an age-dependent macrothrombocytopenia that could be explained by a markedly decreased platelet half-life, likely due to the pronounced hyper-reactivity of \(Twf2a^{-/-}\) platelets. The latter was characterized by sustained integrin acti- vation and thrombin generation in vitro that translated into accelerated thrombus formation in vivo. To further elucidate mechanisms of integrin activation, Rap1-GTP-interacting adaptor molecule (RIAM)-null mice were generated. Despite the proposed critical role of RIAM for platelet integrin activation, no alterations in this process could be found and it was concluded that RIAM is dispensable for the activation of β1 and β3 integrins, at least in platelets. These findings change the current mechanistic understanding of platelet integrin activation. Outside-in signaling by integrins and other surface receptors was supposed to regulate MK migration, but also the temporal and spatial formation of proplatelet protrusions. In this the- sis, phospholipase D (PLD) was revealed as critical regulator of actin dynamics and podo- some formation in MKs. Hence, the unaltered platelet counts and production in \(Pld1/2^{-/-}\) mice and the absence of a premature platelet release in the bone marrow of \(Itga2^{-/-}\) mice question the role of podosomes in platelet production and raise the need to reconsider the proposed inhibitory signaling by α2β1 integrins on proplatelet formation. Non-muscle myosin IIA (NMMIIA) has been implicated as a downstream effector of the in- hibitory signals transmitted via α2β1 integrins. Besides Rho-GTPase signaling, also \(Mg^{2+}\) and transient receptor potential melastatin-like 7 (TRPM7) channel α-kinase are known regulators of NMMIIA activity. In this thesis, TRPM7 was identified as major regulator of \(Mg^{2+}\) homeostasis in MKs and platelets. Furthermore, decreased \([Mg^{2+}]_i\) led to deregulated NMMIIA activity and altered cytoskeletal dynamics that impaired thrombopoiesis and resulted in macrothrombocytopenia in humans and mice. N2 - Thrombozyten werden kontinuierlich durch einen Zytoskelett-getriebenen Prozess von Megakaryozyten (MK) im Knochenmark gebildet. Die zugrunde liegenden molekularen Me- chanismen sind jedoch weitestgehend unverstanden. In dieser Thesis konnte gezeigt werden, dass eine MK/ Thrombozyten-spezifische Profilin1 (Pfn1) Defizienz eine Mikrothrombozytopenie verursacht, die das Hauptmerkmal des Wiskott- Aldrich Syndroms (WAS) im Menschen ist. Die reduzierte Thrombozytenzahl konnte auf eine beschleunigte Entfernung der Thrombozyten aus der Zirkulation sowie deren vorzeitige Freisetzung im Knochenmark zurückgeführt werden. Sowohl Thrombozyten von Pfn1- defizienten Mäusen, als auch von Patienten mit WAS wiesen abnormal organisierte und hyper-stabile Mikrotubuli auf. Die im Rahmen dieser Thesis gewonnenen Ergebnisse zeigen eine unerwartete Funktion von Pfn1 als Regulator der Mikrotubuliorganisation und weisen auf einen bisher nicht erkannten Mechanismus hin, welcher dem Thrombozytenproduktionsde- fekt in Patienten mit WAS zugrunde liegt. Im Gegensatz hierzu konnte Twinfilin2a (Twf2a) als zentraler Regulator der Thrombozyten- reaktivität und Lebenspanne etabliert werden. Mäuse mit einer Twf2a Defizienz zeigten eine progressive Makrothrombozytopenie, die durch eine stark reduzierte Lebenspanne der Thrombozyten erklärt werden konnte. Letzteres war höchstwahrscheinlich durch eine erhöhte Empfindlichkeit von Twf2a-defizienten Thrombozyten gegenüber von aktivierenden Stimuli bedingt. Die Hyperreaktivität von Twf2a-defizienten Thrombozyten zeigte sich durch eine verlängerte Aktivierung der Integrine und erhöhter Thrombingenerierung in vitro sowie be- schleunigter Thrombusbildung in vivo. Um die Mechanismen der Integrinaktivierung besser zu charakterisieren, wurden Rap1-GTP- interacting adaptor molecule (RIAM)-null Mäuse generiert. Obwohl RIAM eine zentrale Rolle in der thrombozytären Integrinaktivierung zugeschriebenen wurde, konnten keine Defekte in diesem Prozess in RIAM-null Thrombozyten identifiziert werden. Dies führte zu der Schluss- folgerung, dass RIAM für die Aktivierung von β1 und β3 Integrinen in Thrombozyten nicht benötigt wird. Diese Erkenntnisse verändern das gegenwärtige mechanistische Verständnis der Integrinaktivierung in Thrombozyten. Die outside-in Signalgebung durch Integrine und andere Oberflächenrezeptoren reguliert die Migration sowie die zeitliche und räumliche Bildung von proplatelets durch MKs. In dieser Thesis konnte gezeigt werden, dass Phospholipase D (PLD) ein zentraler Regulator der Aktindynamik und Podosomenbildung in MKs ist. Die normale Thrombozytenzahl und -Produktion in \(Pld1/2^{-/-}\) Mäusen sowie die fehlende vorzeitige Freisetzung von Thrombozytenim Knochenmark von \(Itga2^{-/-}\) Mäusen, stellen die Funktion von Podosomen in der Throm- bozytenproduktion in Frage. Ferner zeigen diese Ergebnisse, dass die Rolle der inhibitori- schen Signalgebung durch α2β1 Integrine in der proplatelet-Bildung noch einmal überdacht werden muss. Non-muscle myosin IIA (NMMIIA) wird als Effektorprotein im α2β1 Integrinsignalweg ange- sehen. Neben Signalen, die durch Rho-GTPasen vermittelt werden, regulieren auch \(Mg^{2+}\) und die α-Kinase des transient receptor potential melastatin-like 7 (TRPM7) Kanals die Akti- vität von NMMIIA. Im Rahmen dieser Thesis wurde TRPM7 als Hauptregulator der \(Mg^{2+}\) Homöostase in MKs und Thrombozyten identifiziert. Darüber hinaus führten erniedrigte intra- zelluläre \(Mg^{2+}\) Konzentrationen zu einer veränderten NMMIIA Aktivität und Zytoskelettdyna- mik. Diese Defekte beeinträchtigten die Thrombopoese und verursachten eine Makrothrom- bozytopenie im Menschen und der Maus. KW - Thrombozytopoese KW - Thrombozytopathie KW - Megakaryopoese KW - Zellskelett KW - Thrombozyt KW - Zytoskelett Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-122662 ER - TY - THES A1 - Pleines, Irina T1 - The role of the Rho GTPases Rac1 and Cdc42 for platelet function and formation T1 - Die Rolle der Rho GTPasen Rac1 und Cdc42 in Thrombozytenfunktion und -bildung N2 - Platelet activation induces cytoskeletal rearrangements involving a change from discoid to spheric shape, secretion, and eventually adhesion and spreading on immobilized ligands. Small GTPases of the Rho family, such as Rac1 and Cdc42, are known to be involved in these processes by facilitating the formation of lamellipodia and filopodia, respectively. This thesis focuses on the role Rac1 and Cdc42 for platelet function and formation from their precursor cells, the megakaryocytes (MKs), using conditional knock-out mice. In the first part of the work, the involvement of Rac1 in the activation of the enzyme phospholipase (PL) C2 in the signaling pathway of the major platelet collagen receptor glycoprotein (GP) VI was investigated. It was found that Rac1 is essential for PLC2 activation independently of tyrosine phosphorylation of the enzyme, resulting in a specific platelet activation defect downstream of GPVI, whereas signaling of other activating receptors remains unaffected. Since Rac1-deficient mice were protected from arterial thrombosis in two different in vivo models, the GTPase might serve as a potential target for the development of new drugs for the treatment and prophylaxis of cardio- and cerebrovascular diseases. The second part of the thesis deals with the first characterization of MK- and platelet-specific Cdc42 knock-out mice. Cdc42-deficient mice displayed mild thrombo-cytopenia and platelet production from mutant MKs was markedly reduced. Unexpectedly, Cdc42-deficient platelets showed increased granule content and release upon activation, leading to accelerated thrombus formation in vitro and in vivo. Furthermore, Cdc42 was not generally required for filopodia formation upon platelet activation. Thus, these results indicate that Cdc42, unlike Rac1, is involved in multiple signaling pathways essential for proper platelet formation and function. Finally, the outcome of combined deletion of Rac1 and Cdc42 was studied. In contrast to single deficiency of either GTPase, platelet production from double-deficient MKs was virtually abrogated, resulting in dramatic macrothrombocytopenia in the animals. Formed platelets were largely non-functional leading to a severe hemostatic defect and defective thrombus formation in double-deficient mice in vivo. These results demonstrate for the first time a functional redundancy of Rac1 and Cdc42 in the hematopoietic system. N2 - Umstrukturierungen des Zytoskeletts spielen eine bedeutende Rolle bei der Aktivierung von Thrombozyten und sind in diesem Zusammenhang unerlässlich für Formänderung, Sekretion, sowie für Adhäsion und Ausbreitung auf immobilisierten Adhäsionsproteinen. Es wird vermutet, dass kleine GTPasen der Rho-Proteinfamilie, wie z.B. Rac1 und Cdc42, maßgeblich an diesen Prozessen beteiligt sind, indem sie die Bildung von Lamellipodien bzw. Filopodien bewirken. Die hier vorliegende Dissertation beschäftigt sich mit der Funktion von Rac1 und Cdc42 sowohl für die Aktivierung von Thrombozyten, als auch für deren Neubildung aus ihren Vorläuferzellen, den Megakaryozyten (MKs). Zu diesem Zweck wurden konditionale Knock-out-Mäuse generiert und in vitro und in vivo analysiert. Der erste Teil der Arbeit beinhaltete die Untersuchung der Rolle von Rac1 im Signalweg des wichtigsten Thrombozyten-Kollagen-Rezeptors, Glykoprotein (GP) VI, dessen Stimulation zur Aktivierung des Enzyms Phospholipase 2 (PLC2) führt. Es konnte gezeigt werden, dass Rac1 notwendig für PLC2-Aktivierung ist, und zwar unabhängig von der simultan stattfindenden Tyrosin-Phosphorylierung des Enzyms. Dies führte dazu, dass in Rac1-defizienten Thrombozyten spezifisch der GPVI-Signalweg blockiert war, während die Aktivierung durch andere Rezeptoren unverändert funktionierte. Da Rac1-defiziente Mäuse vor arteriellem Gefäßverschluss (Thrombose) in zwei verschiedenen in vivo Modellen geschützt waren, könnte Rac1 einen potenziellen Angriffspunkt für die Entwicklung neuer antithrombotisch wirksamer Medikamente darstellen. Im zweiten Teil der Dissertation wurden erstmals die Auswirkungen eines MK- und Thrombozyten-spezifischen Cdc42-Knock-outs charakterisiert. Cdc42-defiziente Mäuse zeigten eine leichte Thrombozytopenie und die Neubildung von Thrombozyten aus defizienten MKs war merklich beeinträchtigt. Entgegen aller Erwartungen waren sowohl Inhalt, als auch Freisetzung von Granula aus Cdc42-defizienten Thrombozyten stark erhöht, was zu beschleunigter Thrombusbildung in vitro und Gefäßverschluss in vivo führte. Überdies war Cdc42 generell nicht essentiell für die Ausbildung von Filopodien nach Thrombozytenaktivierung. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Cdc42 an einer Vielzahl von Signalwegen beteiligt ist, welche für die korrekte Bildung und Funktion von Thrombozyten unabdingbar sind. Der letzte Teil der Arbeit beschäftigte sich mit den Auswirkungen einer Doppel-defizienz von Rac1 und Cdc42. Im Gegensatz zur jeweiligen Einfachdefizienz war die Bildung von Thrombozyten aus doppeldefizienten MKs fast komplett blockiert, was eine stark ausgeprägte Makrothrombozytopenie in den betroffenen Tieren zur Folge hatte. Die wenigen gebildeten Thrombozyten waren in ihrer Funktion stark beeinträchtigt. Dies führte zusammen mit den extrem niedrigen Thrombozytenzahlen dazu, dass in doppeldefizienten Mäusen sowohl Hämostase als auch Thrombusbildung defekt waren. Diese Resultate zeigen erstmals eine funktionelle Redundanz von Rac1 und Cdc42 im hämatopoetischen System. KW - Thrombose KW - Rho GTPasen KW - Thrombozyt KW - platelet KW - Rho GTPase KW - platelet KW - Rho GTPase KW - Thrombosis Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48572 ER - TY - THES A1 - Weigel [verh. Hoffmann], Mathis Leonard T1 - Thrombozytenfunktionsanalyse als potenzielles Instrument zur Früherkennung von Sepsis T1 - Platelet function analysis as a potential tool for early sepsis diagnosis N2 - Sepsis ist ein häufiges und akut lebensbedrohliches Syndrom, das eine Organfunktionsstörung in Folge einer dysregulierten Immunantwort auf eine Infektion beschreibt. Eine frühzeitige Diagnosestellung und Therapieeinleitung sind von zentraler Bedeutung für das Überleben der Patient:innen. In einer Pilotstudie konnte unsere Forschungsgruppe mittels Durchflusszytometrie eine ausgeprägte Hyporeaktivität der Thrombozyten bei Sepsis nachweisen, die einen potenziell neuen Biomarker zur Sepsis-Früherkennung darstellt. Zur Evaluation des Ausmaßes und Entstehungszeitpunktes der detektierten Thrombozytenfunktionsstörung wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit zusätzlich zu Patient:innen mit Sepsis (SOFA-Score ≥ 2; n=13) auch hospitalisierte Patient:innen mit einer Infektion ohne Sepsis (SOFA-Score < 2; n=12) rekrutiert. Beide Kohorten wurden zu zwei Zeitpunkten (t1: <24h; t2: Tag 5-7) im Krankheitsverlauf mittels Durchflusszytometrie und PFA-200 untersucht und mit einer gesunden Kontrollgruppe (n=28) verglichen. Phänotypische Auffälligkeiten der Thrombozyten bei Sepsis umfassten: (i) eine veränderte Expression verschiedener Untereinheiten des GPIb-IX-V-Rezeptorkomplexes, die auf ein verstärktes Rezeptor-Shedding hindeutet; (ii) ein ausgeprägtes Mepacrin-Beladungsdefizit, das auf eine zunehmend reduzierte Anzahl von δ-Granula entlang des Infektion-Sepsis Kontinuums hinweist; (iii) eine Reduktion endständig gebundener Sialinsäure im Sinne einer verstärkten Desialylierung. Die funktionelle Analyse der Thrombozyten bei Sepsis ergab bei durchflusszytometrischer Messung der Integrin αIIbβ3-Aktivierung (PAC-1-Bindung) eine ausgeprägte generalisierte Hyporeaktivität gegenüber multiplen Agonisten, die abgeschwächt bereits bei Infektion nachweisbar war und gemäß ROC-Analysen gut zwischen Infektion und Sepsis diskriminierte (AUC >0.80 für alle Agonisten). Im Gegensatz dazu zeigten Thrombozyten bei Sepsis und Analyse mittels PFA-200 unter Einfluss physiologischer Scherkräfte eine normale bis gar beschleunigte Aggregation. Die Reaktivitätsmessung von Thrombozyten mittels Durchflusszytometrie stellt weiterhin einen vielversprechenden Biomarker für die Sepsis-Früherkennung dar. Für weitere Schlussfolgerungen ist jedoch eine größere Kohorte erforderlich. In nachfolgenden Untersuchungen sollten zudem mechanistische Ursachen der beschriebenen phänotypischen und funktionellen Auffälligkeiten von Thrombozyten bei Infektion und Sepsis z.B. mittels Koinkubationsexperimenten untersucht werden. N2 - Sepsis is a frequent and life-threatening condition that describes organ dysfunction resulting from a dysregulated host immune response to infection. Early diagnosis and treatment are essential to improve patient survival. In a previous pilot study with sepsis patients, our research identified a severe platelet hyporeactivity using flow cytometry which could become a potential new biomarker for early sepsis diagnosis. To evaluate onset and extend of the detected platelet dysfunction in this study, we extended our patient cohort in addition to sepsis (SOFA-score ≥2; n=13) also to hospitalized patients with infection without sepsis (SOFA-score <2; n=12). Both cohorts were assessed at two time points during the disease (t1: <24h; t2: day 5-7) by flow cytometry and PFA-200 and compared with a healthy control group (n=28). Platelet phenotypic abnormalities during sepsis included: (i) altered expression of subunits of the GPIb-IX-V receptor complex, pointing to increased receptor shedding; (ii) a severe mepacrine loading deficit, indicating an increasingly reduced number of δ-granules along the infection-sepsis continuum; (iii) a reduction of terminally bound sialic acid, suggesting increased desialylation. Functional analysis of platelets in sepsis revealed a marked and generalized hyporeactivity toward multiple agonists when integrin αIIbβ3 activation (PAC-1 binding) was measured by flow cytometry, which was already to a lesser extend present in patients with infection and discriminated well between infection and sepsis according to ROC analysis (AUC >0.80 for all agonists). In contrast, platelets from septic patients showed normal to even accelerated aggregation when measured under flow condition and physiological shear forces by PFA-200. Analysis of platelet reactivity by flow cytometry remains a promising biomarker for early sepsis detection, but a larger cohort is needed for further conclusions. In subsequent studies, mechanistic causes of the described alterations in platelet phenotype and function during infection and sepsis should be investigated, e.g. by means of co-incubation experiments. KW - Sepsis KW - Thrombozyt KW - Biomarker KW - Frühdiagnostik KW - Durchflusscytometrie KW - Thrombozytenfunktionsanalyse Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-358193 ER - TY - THES A1 - Fröhling, Tobias Marius T1 - Untersuchungen zur Wirkungsweise von Zyklonukleotiden auf die Thrombozytenaktivierung T1 - Investigations on the effectiveness of cyclic nucleotides on platelet activation N2 - In der vorliegenden Arbeit ging es darum, die inhibierende Wirkung von extrazellulär zugefügten GMP-Derivaten auf die Thrombozytenaktivierung nachzuweisen. Anhand verschiedener thrombozytärer Aktivierungsmarker wie ERK, der Expression von P-Selektin und intrazellulärem Kalziumeinstrom zeigte sich eine signifikante Inhibition der Thrombozytenaktivierung durch zyklische GMP-Analoga. Neu ist, dass auch nicht-zyklische GMP-Derivate eindeutig einen hemmenden Effekt aufweisen. Guanosin-Derivate alleine führen dagegen weder zu einer Hemmung noch zu einer vermehrten Stimulation der Plättchenaktivierung. Die Wirkung der GMP-Analoga scheint von der negativen Phosphatgruppe abhängig zu sein. Der frühe Zeitpunkt der Inhibition und die Tatsache, dass auch Hemmer der PKG einen inhibierenden Effekt auf die Thrombozytenaktierung aufweisen, führen zu der Hypothese, dass es sich um PGK-unabhängige Effekte handelt. Der Thrombinrezeptor als Wirkort der GMP-Analoga konnte in Biacore-Messungen ausgeschlossen werden. Es gilt nun, speziell den Thromboxanrezeptor auf mögliche Interaktionen mit GMP-Derivaten hin zu untersuchen. N2 - Platelets play a key role in hemostasis through their ability to rapidly adhere to activated or injured endothelium, subendothelial matrix proteins and other activated platelets. A strong equilibrium between activating and inhibiting processes is essential for normal platelet and vascular function, impairment of this equilibrium being associated with either thrombophilic or bleeding disorders. Cyclic guanosine monophosphate is a crucial and synergistic intracellular messenger that mediates the effects of platelet inhibitors such as nitric oxide (NO) and prostacyclin (PG-I2). This work investigated the effects of extracellular-cyclic-nucleotides on platelet-activation. Different platelet-activation markers like ERK, P-Selectin and intracellular Calcium were tested to be effected by extracellular added cyclic nucleotides. We could show, that cyclic nucleotide derivatives have the power to inhibit platelet activation (stimulated by Thrombin or TRAP6). New is a similar effect with non-cyclic nucleotides like 8-pCPT-5´-GMP and 8-Br-5´-GMP. Guanosine derivatives alone have no effect on platelet activation, so we conclude that the effect might depend on the negative phosphate group of GMP. Furthermore we think that it might be a PGK-independet mechanism because of an early effect even after 15-30 seconds. We could exclude the thrombin receptor as direct interactor by Biacore measurement and suppose that there is some interaction between the guanosine monophosphates and the thromboxane-receptor on the platelet surface. KW - Cyclonucleotide KW - Nucleotide KW - Thrombozyt KW - Aktivierung KW - Cyclo-GMP-Derivate KW - Thrombin KW - Plättchenaktivierung KW - Plättchenhemmung KW - Platets Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-53473 ER - TY - THES A1 - Schnurr, Axel T1 - Variabilität der Thrombozytenhemmung durch den ADP-Antagonisten Clopidogrel bei Patienten mit koronarer Herzerkrankung T1 - Variability of adp-antagonist clopidogrel induced platelet inhibition in patients with ischaemic heart disease N2 - Zum Nachweis einer interindividuellen Variabilität bei der Therapie mit Clopidogrel wurden in dieser Promotionsarbeit Patienten mit ausreichender Therapiedauer auf eine verbleibende Aktivierbarkeit der Thrombozyten untersucht. Hierfür wurde eine auf Phosphorylierung des Proteins VASP basierender Assay, der mittlerweile auch kommerziell verfügbar ist, eingesetzt. Dieser auf einer durchflusszytometrische Analyse beruhende Test zeigte bei 10 % der untersuchten Patienten eine Restaktivierbarkeit der Thrombozyten trotz ausreichender Thienopyridin-Einnahme. Die statistische Analyse erbrachte den Nachweis von zwei Untergruppen: Eine Untergruppe zeigte trotz Clopidogrel-Therapie eine fast normale Aktivierbarkeit der Thrombozyten („non-responder“), die andere zeigt eine teilweise Thrombozytenfunktionshemmung („low-responder“). In der statistischen Analyse wurde eine deutliche Signifikanz der Ergebnisse mittels Students-t-Test festgestellt. Aus zufällig ausgewählten Proben der „non-responder“ und der adäquat reagierenden Patienten konnte eine Veränderung intrazelluläre Signalwege nicht nachgewiesen werden. Nach Veröffentlichung der Gensequenz für den P2Y12 Rezeptor erfolgte die entsprechende Genanalyse bei diesen Patienten. Es konnten 2 stumme Polymophismen nachgewiesen werden, diese jedoch sowohl in der Gruppe der Responder als auch bei Low-/Non-Respondern. Somit wurde in dieser Promotionsarbeit das mittlerweile von verschiedenen Arbeitsgruppen diskutierte, bei etwa 10 % der Patienten auftretende Therapieversagen von Thienopyridinen bestätigt. Eine Genveränderung oder Änderungen intrazellulärer Signalwege konnte als molekulare Ursache nicht gezeigt werden. N2 - To detect interindividual varabilities during clopidogrel treatment we investigated patients with sufficient treatment duration for remaining activation of platelets. For detection we used an VASP (vasodilator-stimulated phosphoprotein) based assay, which is commercially available. This assay works with flow cell detection system (FACS) and showed in 10 % of all investigated patients remaining platelet activatiation even though thienopyridine treatment was sufficint. The statistic analysis showed two sub-groups of remaining platelet acitivity: one consisted of patients with completely regular platelet acitivity (non-responder), the other showed partial remaining acitivity (low-responder). The statistic analysis using a student-t-test proved a solid significance of the results. Randomly chosen probes out of the non-responder sub-group and the regular reacting patients showed no changes in intra-cellular pathways. The in 2000 newly published gene-sequence of the P2Y12 receptor was utilized to look for mutations/variations. Two silent polymorphism were detected in both (low- and non-responder) sub-groups. In this thesis we added to the increasingly published number of articles reporting a 10 % non-responding to thienopyridine treatment. For this variation no gene sequence alternation or change in intracellular pathway singalling were found responsible. KW - Clopidogrel KW - Variabilität KW - Herzkrankheit KW - Thrombozyt KW - Vasodilatator-stimuliertes Phosphoprotein KW - Therapieresistenz KW - clopidogrel KW - variability KW - ischaemic heart disease KW - platelet KW - vasodilator-stimulated phosphoprotein KW - therapy non-responder Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-49677 ER - TY - THES A1 - Menninger, Stefanie T1 - Verbesserung der vaskulären Funktion und Reduzierung der Thrombozytenaktivierung durch Telmisartan bei Ratten mit Streptozotocin-induziertem Diabetes mellitus T1 - Improvement of vascular function and reduction of platelet activation by Telmisartan in rats with streptozotocin-induced diabetes mellitus N2 - Die vorliegende Arbeit untersucht die positiven Auswirkungen des Angiotensin-II-Rezeptor-Antagonisten Telmisartan auf die endotheliale Funktion und Thrombozytenaktivierung bei Ratten mit Streptozotocin-induziertem Diabetes mellitus. In Gefäßreaktivitätsstudien, Luminometer- und Fluoreszenzmessungen und mit Hilfe der Durchflusszytometrie wurden die Wirkungen des Medikamentes überprüft. Es konnte gezeigt werden, dass sich durch Telmisartan die NO-Bioverfügbarkeit verbessert, welche maßgeblich für die endotheliale Funktion verantwortlich ist und durch Ca2+-abhängige Aktivierung der eNOS und dehnungsinduzierte, Ca2+-unabhängigen NO-Bildung beeinflusst wird. Positiv wird des Weiteren die Sensitivität der glatten Gefäßmuskelzellen gegenüber NO beeinflusst, was zur Vasodilatation führt. Die atherosklerosefördernde Superoxidbildung wird zusätzlich reduziert. Es erfolgten außerdem Messungen von thrombozytengebundenem Fibrinogen, dementsprechend der GP IIb/IIIa-Aktivität, und der VASP-Phosphorylierung, demzufolge dem NO/cGMP-Signalweg, in Thrombozyten durch FITC-markierte Antikörper mit Hilfe der Durchflusszytometrie. Es wurde gezeigt, dass die Thrombozytenaktivierung, die für den initialen Schritt der Atherosklerose verantwortlich gemacht wird, durch Telmisartan verringert wird. Alle Messungen wurden vergleichend in einer Kontroll-, Placebo- und Telmisartangruppe durchgeführt. Die beobachtete Blutdrucksenkung ist, nach früheren Betrachtungen, nicht alleine verantwortlich für die verbesserte endotheliale Funktion, welche bei dem Einsatz von AT-II-Antagonisten beobachtet wird. Telmisartan wirkt, laut einer Studie, als einziger AT-II-Antagonist als partieller PPAR-Rezeptor, so dass Insulinresistenz und metabolische Parameter verbessert werden. Über diese Wirkungen beeinflusst Telmisartan auch die endotheliale Funktion und die Thrombozytenaktivierung. Zur Reduktion von vaskulären Komplikationen bei Diabetes mellitus erscheint Telmisartan aufgrund der vorliegenden Ergebnisse als sinnvolle medikamentöse Therapie. N2 - Diabetes is associated with endothelial dysfunction and platelet activation, which are positively modulated by chronic treatment with telmisartan. KW - Diabetes mellitus KW - Thrombozyt KW - Renin-Angiotensin-System KW - Stickstoffmonoxid KW - NO-Bioverfügbarkeit KW - Atherosklerose KW - nitric oxide bioavailability KW - atherosclerosis Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-77292 ER - TY - THES A1 - Simoneit, Franziska T1 - Zusammenhang zwischen der Serumkonzentration serotonerger Antidepressiva und der Blutgerinnung T1 - Serum concentration of serotonergic antidepressants and blood coagulation: Is there a relationship? N2 - Das Verordnungsvolumen von Antidepressiva in Deutschland hat sich in den letzten zehn Jahren etwa verdoppelt. Gleichzeitig liegen zahlreiche Untersuchungen über erhöhte Blutungstendenzen unter der Therapie mit serotonergen Antidepressiva vor. Die aktuelle Studienlage deutet darauf hin, dass es unter anderem über das serotonerge System zu Beeinflussungen der Thrombozyteneigenschaften und in Folge dessen zu Veränderungen der Blutgerinnung kommen könnte. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den Zusammenhang zwischen der Serumkonzentration serotonerger Antidepressiva und der Blutgerinnung zu untersuchen. Im Gegensatz zur Dosis bietet die Serumkonzentration exakte Informationen über die tatsächlich wirkende Antidepressivamenge und berücksichtigt neben der Patientenadhärenz die interindividuelle Variabilität der pharmakokinetischen Eigenschaften. Die Beurteilung der Blutgerinnung erfolgte unter Zuhilfenahme von Gerinnungsparametern (Thrombozytenzahl, mittleres Plättchenvolumen, Quick, INR, partielle Thromboplastinzeit). Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass mit steigender Serumkonzentration Veränderungen der Blutgerinnung und in Folge dessen auch der Gerinnungsparameter entstehen können. Darüber hinaus sollte untersucht werden unter welchen Antidepressiva potentielle Veränderungen auftreten. Es wurden Antidepressiva unterschiedlicher Wirkungsgruppen analysiert: Amitriptylin, Doxepin, Es‑Citalopram, Mirtazapin und Venlafaxin. Besonders selektive Serotonin-Wiederaufnahmehemmer standen auf Grund der aktuellen Studienlage im Verdacht Einfluss auf die Gerinnung zu nehmen. Um Antidepressiva spezifische Aussagen treffen zu können, war das Vorliegen einer antidepressiven Monotherapie grundlegendes Selektionskriterium. Alle potenziell gerinnungsbeeinflussenden sowie serotonerg wirkenden Arzneimittel wurden ausgeschlossen. Die Daten wurden retrospektiv erhoben und stammten von stationär therapierten Patienten der Klinik für Psychiatrie, Psychosomatik und Psychotherapie am Universitätsklinikum Würzburg. Die Untersuchungen ergaben für das trizyklische Antidepressivum Amitriptylin signifikante Ergebnisse. Die interindividuelle Analyse zeigte signifikant positive Korrelationen zwischen der partiellen Thromboplastinzeit (PTT) und dem Metabolitenspiegel (Nortriptylin‑Konzentration, rs=0,564; p=0,010, N=20) sowie dem Summenspiegel von Amitriptylin (Amitriptylin- und Nortriptylin‑Konzentration, rs=0,477; p=0,033, N=20). Darüber hinaus stellten sich im Rahmen der intraindividuellen Analyse signifikante Unterschiede zwischen der Thrombozytenzahl unter niedriger und hoher Amitriptylin‑Konzentration dar (Z= ‑2,867; p=0,004, N=45). Ergänzend wurde im Rahmen von explorativen Untersuchungen der Zusammenhang zwischen der verabreichten Dosis und der Serumkonzentration der Antidepressiva analysiert. Die Ergebnisse zeigten Schwankungen um den Faktor 3 bis 11, die im Vergleich zu anderen Studien geringer ausfielen. Der Verdacht, dass besonders selektive Serotonin-Wiederaufnahmehemmer einen erhöhten Einfluss auf die Gerinnungsparameter haben, wurde in der aktuellen Arbeit nicht bestätigt. Ebenso waren unter Doxepin, Mirtazapin und Venlafaxin keine Zusammenhänge zur Serumkonzentration zu beobachten. Die signifikanten Ergebnisse unter Amitriptylin lassen vermuten, dass nicht nur die Inhibition von Serotonintransportern, wie bei selektiven Serotonin-Wiederaufnahmehemmern, sondern zusätzlich auch die Hemmung von Serotoninrezeptoren, wie dem 5‑HT2A‑Rezeptor, eine Rolle im Hinblick auf Veränderungen von Thrombozyteneigenschaften spielen. Dennoch lagen im Rahmen dieser Untersuchung 98% der Gerinnungsparameter aller analysierten Antidepressiva im Normbereich. Die Ergebnisse legen die Vermutung nahe, dass das Risiko immer wieder berichteter Blutungskomplikationen unter der Behandlung mit Antidepressiva trotz zunehmender Verordnungszahlen überschaubar scheint. Entsprechend aktueller Publikationen ist vermutlich erst bei zusätzlicher Einnahme von nichtsteroidalen Antirheumatika sowie antikoagulativen Arzneimitteln von einem erhöhten Blutungsrisiko auszugehen. Besonders gastrointestinale Blutungen spielen bei Kombination dieser Medikamente auf Grund der gesteigerten Magensäuresekretion eine Rolle. Ob die Serumkonzentration der Antidepressiva bei entsprechender Komedikation ebenfalls eine Rolle im Hinblick auf Veränderungen der Gerinnungsparameter spielt, sollte im Rahmen weiterführender Längsschnittstudien genauer untersucht werden. Ergänzend wären Untersuchungen zur Klärung des Kausalzusammenhangs wünschenswert, um das Blutungsrisiko im Zusammenhang mit Antidepressiva in Zukunft weiter minimieren zu können. N2 - Introduction: The prescription of antidepressants has increased worldwide in recent years. Treatment with serotonergic antidepressants has been associated with enhanced risk of bleeding. Correlations to serum concentrations of antidepressants have not been investigated in detail. Methods: Serum concentrations of amitriptyline (AMI), doxepin (DOX), escitalopram (ESC), mirtazapine (MIR) and venlafaxine (VEN) as well as coagulation parameters in 507 patients were retrospectively evaluated in the Department of Psychiatry, Psychosomatics and Psychotherapy at the University Hospital of Würzburg. The coagulation parameters assessed were: platelet count (PLC), mean platelet volume (MPV), prothrombin time (PT), international normalized ratio (INR) and partial thromboplastin time (PTT). The main inclusion criterion was an antidepressant monotherapy. Results: In interindividual analysis significant correlations were observed between PTT and NOR (p=0.010) as well as between PTT and AMI+NOR (p=0.033). Intraindividual analyses showed significant differences of PLC between low and high concentrations of AMI+NOR (p<0.01). For DOX, ESC, MIR and VEN, no statistical significances were found. Discussion: The majority of publications about changes in coagulation during antidepressant drug therapy only considers selective serotonin reuptake inhibitors (SSRI). Nevertheless, as AMI has serotonin transporter and receptor inhibiting properties, significant correlations with PTT and PLC were found. However, since coagulation parameters in all samples were within the normal range, a rather low increase of bleeding risk by antidepressant monotherapy is assumed. The results of our study support the assumption that the documented bleeding events of recent studies are mainly due to the combined use of antidepressants, non-steroidal anti-inflammatory drugs and platelet aggregation inhibitors. KW - Depression KW - Blutgerinnung KW - Arzneimittelüberwachung KW - Thrombozyt KW - Serotonin-Reuptake-Hemmer KW - Serumkonzentration KW - TDM KW - Therapeutisches Drug monitoring KW - antidepressant drug KW - serum concentration KW - coagulation KW - therapeutic drug monitoring KW - bleeding Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-188521 ER -