TY  - THES
A1  - Gise, Alexander von
T1  - Suppression der Apoptose durch C-Raf erfordert MEK1 und Phosphatidylinositol 3-Kinase abhängige Signale
T1  - Apoptosis Suppression by C-Raf Requires MEK1- and Phosphatidylinositol 3-Kinase-Dependent Signals.
N2  - Unterhalb des Interleukin 3 (Il-3) Rezeptors sind zwei Ras-abhängige Signalwege beschrieben, die entweder zur Aktivierung von C-Raf oder von PI3-Kinase (PI3K)/Proteinkinase B (PKB, AKT) führen und Wachstum und Überleben vermitteln. Frühere Untersuchungen des Mechanismus, über den C-Raf Apoptose unterdrückt, zeigten die Notwendigkeit einer Anwesenheit der zytoplasmatischen Kinase an den Mitochondrien. Diese Translokation konnte entweder durch Überexpression des antiapoptotischen Proteins Bcl-2 oder aber durch Fusion der Kinase mit dem mitochondriellen Protein Mas p70 erreicht werden. Aktiviertes mitochondriell gebundenes C-Raf ist nicht in der Lage ERK1 und ERK2 zu aktivieren, vermag aber durch Inaktivierung des proapoptotischen Bcl-2 Familienmitgliedes BAD Apoptose zu unterdrücken. Ungeachtet dieser Ergebnisse deuteten andere genetische und biochemische Untersuchungen auch auf eine Bedeutung der Raf Effektoren MEK und ERK in der Unterdrückung des programmierten Zelltodes hin. Im Rahmen dieser Arbeit wurde daher die Bedeutung von MEK und MEK-abhängigen Signalwegen für das zelluläres Überleben untersucht. Wir nutzten für diese Untersuchungen überwiegend die Il-3 abhängige Zelllinie 23D. MEK war essentiell für das zelluläre Überleben und Wachstum nach Stimulation durch Il-3. Eine konstitutiv aktive MEK1 Mutante verzögerte signifikant das Einsetzen der Apoptose nach Entzug des Wachstumsfaktors, während eine dominant negative Mutante den Zelltod akzelerierte. In der Fibroblastenzelllinie NIH 3T3 unterdrückte eine konstitutiv aktive Mutante von ERK2, ähnlich effektiv wie onkogenes MEK, durch Doxorubicin induzierten Zelltod. Diese Beobachtung lässt auf einen, das Überleben der Zelle vermittelnden, Signalweg von MEK schließen, der zur Aktivierung von ERK führt. Der protektive Effekt von aktiviertem MEK in 32D Zellen wurde durch MEK- und PI3K-abhängige Mechanismen vermittelt. Die dabei beobachtete Aktivierung von PI3K führt zur Phosphorylierung und Aktivierung von AKT. Die Abhängigkeit von MEK und PI3K Signalwegen konnte auch für den Schutz von 32D Zellen vor Apoptose durch onkogenes C-Raf gezeigt werden. Diese Befunde ließen sich ebenso in der Il-3 abhängigen pro-B Zelllinie BaF3 verifizieren, was darauf schließen lässt, dass die Rekrutierung von MEK/ERK im antiapoptotischen Signalweg von aktiviertem Raf ein allgemeingültiger Mechanismus ist. Dass in diesem antiapoptotischen Signalweg von C-Raf auch der PI3K Effektor AKT notwendig ist zeigten weitere Untersuchungen, in denen eine dominant negative Mutante von AKT den protektiven Effekt von aktiviertem C-Raf inhibierte, während eine konstitutiv aktive Form von AKT einen synergistischen Effekt mit C-Raf in der Unterdrückung der Apoptose hatte. Diese Daten zeigen einen, zelluläres Überleben vermittelnden Effekt von Raf, der durch MEK und AKT vermittelt wird.
N2  - Two Ras effector pathways leading to the activation of C-Raf and phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) have been implicated in the survival signaling by the interleukin 3 (IL-3) receptor. Analysis of apoptosis suppression by C-Raf demonstrated the requirement for mitochondrial translocation of the kinase in this process. This could be achieved either by overexpression of the antiapoptotic protein Bcl-2 or by targeting C-Raf to the mitochondria via fusion to the mitochondrial protein Mas p70. Mitochondrially active C-Raf is unable to activate extracellular signal-related kinase 1 (ERK1) and ERK2 but suppresses cell death by inactivating the proapoptotic Bcl-2 family member BAD. However, genetic and biochemical data also have suggested a role for the C-Raf effector module MEK-ERK in apoptosis suppression. We thus tested for MEK requirement in cell survival signaling using the interleukin 3 (IL-3)-dependent cell line 32D. MEK is essential for survival and growth in the presence of IL-3. Upon growth factor withdrawal the expression of constitutively active MEK1 mutants significantly delays the onset of apoptosis, whereas the presence of a dominant negative mutant accelerates cell death. Survival signaling by MEK most likely results from the activation of ERKs since expression of a constitutively active form of ERK2 was as effective in protecting NIH 3T3 fibroblasts against doxorubicin-induced cell death as oncogenic MEK. The survival effect of activated MEK in 32D cells is achieved by both MEK- and PI3K-dependent mechanisms and results in the activation of PI3K and in the phosphorylation of AKT. MEK and PI3K dependence is also observed in 32D cells protected from apoptosis by oncogenic C-Raf. Additionally, we also could extend these findings to the IL-3-dependent pro-B-cell line BaF3, suggesting that recruitment of MEK is a common mechanism for survival signaling by activated Raf. Requirement for the PI3K effector AKT in this process is further demonstrated by the inhibitory effect of a dominant negative AKT mutant on Raf-1-induced cell survival. Moreover, a constitutively active form of AKT synergizes with Raf-1 in apoptosis suppression. In summary these data strongly suggest a Raf effector pathway for cell survival that is mediated by MEK and AKT.
KW  - Apoptosis
KW  - Raf-Kinasen
KW  - Raf <Biochemie>
KW  - Interleukin 3
KW  - MEK
KW  - ERK
KW  - PKB
KW  - AKT
KW  - Interleukin-3
KW  - Apoptosis
KW  - Raf
KW  - MEK
KW  - AKT
KW  - Interleukin-3
Y1  - 2007
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-24947
ER  - 
TY  - THES
A1  - Stark, Felix
T1  - Funktionelle Untersuchungen zur Regulation der Protein Kinase CK2 durch Polyamine in Drosophila melanogaster und deren physiologische Bedeutung
T1  - Functional analysis of the regulation of the protein kinase CK2 by polyamines in Drosophila melanogaster and its psyiological meaning
N2  - Die heterotetramere Proteinkinase CK2 nimmt aufgrund der großen Anzahl und Diversität ihrer Substrate, sowie aufgrund ihrer Eigenschaft Signalwege miteinander zu vernetzen eine Sonderstellung innerhalb der Kinasen ein. CK2 beeinflusst Proliferation, Differenzierung und Apoptose, Prozesse an denen auch Polyamine und der MAPK-Signalweg beteiligt sind. Eine vor kurzem durchgeführte Arbeit beschreibt die Bindung von CK2 an das Gerüstprotein KSR und die Verstärkung des MAPK-Signalwegs durch Phosphorylierung von Raf-Proteinen in Vertebraten. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass CK2 auch in Drosophila mit KSR interagiert und das einzige in Drosophila vorhandene Raf-Potein (DRaf) in vitro phosphoryliert. Im Gegensatz zur Phosphorylierung der humanen B-Raf und C-Raf Proteine an Serin 446 bzw. Serin 338 innerhalb der „negative charge regulatory region“ (N-Region), führten Kinasereaktionen und Massenspektrometrische Untersuchungen zur Identifizierung von Serin 11 als CK2 Phosphorylierungsstelle in DRaf, während ein zu Serin 446 in B-Raf äquivalentes Serin in der N-Region in Drosophila nicht durch CK2 phosphoryliert wird. Durch Überexpression von DRaf sowie von zwei DRaf-Varianten bei denen Serin 11 durch Alanin oder Aspartat substituiert wurde (DRafS11A und DRafS11D) konnte in Zellkulturexperimenten gezeigt werden, dass die Ladung an der Aminosäureposition 11 die Funktion von DRaf beeinflusst, wobei eine negative Ladung an dieser Stelle zur Phosphorylierung und Aktivierung der Effektorkinase Erk führt. Die Phosphorylierung durch CK2 ist unabhängig von regulatorischen Botenstoffen ("second messengers"), wird aber durch Bindung von Polyaminen moduliert. Intrazelluläre Polyamine entstammen zum grossen Teil dem zellulären Aminosäurekatabolismus und beeinflussen die Phosphorylierung von DRaf durch CK2 in vitro, wobei Spermin ein effizienter Inhibitor der Reaktion ist, während die Effekte von Putrescin und Spermidin gering sind. Auch in Drosophila Schneider S2 Zellen und in adulten weiblichen Fliegen hat Spermin einen inhibitorischen, CK2-abhängigen Effekt auf die Aktivierung von Erk. Ausserdem konnte gezeigt werden, dass Putrescin und Spermidin in der Lage sind die Aktivierung von Erk, im Vergleich zu Zellen die nur mit Spermin behandelt wurden, zu erhöhen. Das spricht dafür, dass die Phosphorylierung von DRaf und die davon abhängige Aktivierung von Erk durch CK2 von der Menge und Relation der verschiedenen Polyamine zueinander abhängt. Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen den Schluss zu, dass der Polyaminmetabolismus über CK2 mit dem MAPK-Signalweg verknüpft ist. Nachdem Polyamine durch Aminosäurekatabolismus enstehen, kann auf diese Weise der MAPK-Signalweg in Abhängigkeit der Verfügbarkeit zellulärer Aminosäuren reguliert werden. Vorversuche zeigten eine Beeinflussung von Proliferation und Apoptose durch CK2 und Polyamine. Weitere Untersuchungen sind aber nötig um spezifische Einflüsse von Polyaminen und CK2 auf zelluläre Prozesse wie Proliferation, Differenzierung und Apoptose aufzudecken.
N2  - Because of its high number and diversity of substrates, as well as its ability to cross-link signalling pathways, the heterotetrameric protein kinase CK2 has an exceptional position within kinases. CK2 influences proliferation, differentiation and apoptosis, processes in which also polyamines and the MAPK-signalling pathway are involved. A recent publication delineates binding of CK2 to the scaffold protein KSR and the enhancement of the MAPK-signalling pathway by phosphorylation of Raf-proteins in vertebrates. In my thesis I could show that CK2 also interacts with KSR in Drosophila and phosphorylates the only existing Raf protein in Drosophila (DRaf) in vitro. In contrast to the phosphorylation of human B-Raf- and C-Raf-proteins on serine 446 respectively serine 338 within the "negative charge regulatory region" (N-region), kinase reactions and mass spectrometric analyses led to the identification of serine 11 as phosphorylation site in DRaf, whereas a serine in the N-region, which corresponds to serine 446 of B-Raf, is not phosphorylated by CK2 in Drosophila. In cell culture experiments overexpression of DRaf and two DRaf-variants, in which serine 11 was substituted by alanine or aspartate (DRafS11A and DRafS11D), revealed the charge at amino acid position 11 to affect the function of DRaf, with a negative charge leading to phosphorylation and activation of the effector kinase Erk. Phosphorylation by CK2 is independent of second messengers, whereas it is modified by binding of polyamines. Intracellular polyamines mainly derive from cellular amino acid catabolism and modulate the phosphorylation of DRaf by CK2 in vitro with spermine being an efficient inhibitor of the reaction, whereas the effects of putrescine and spermidine are minor. In Drosophila Schneider S2 cells and adult flies spermine inhibits the activation of Erk in a CK2-dependent way. Furthermore administration of putrescine and spermidine in combination with spermine leads to enhanced Erk activation in cells compared to cells that are treated with spermine. These results suggest that phosphorylation of DRaf and the subsequent activation of Erk by CK2 are dependent on the amount and relative concentrations of polyamines. Altogether the results of this work demonstrate a role for CK2 in linking polyamine metabolism to the MAPK-signalling pathway. Since polyamines derive from amino acid catabolism, the MAPK-signalling pathway can be regulated dependent on the availability of cellular amino acids. Preliminary experiments point to CK2- and polyamine-dependent effects on proliferation and apoptosis. Further investigations are necessary to reveal specific effects of polyamines and CK2 on cellular processes like proliferation, differentiation and apoptosis.
KW  - Protein Kinase CK2
KW  - Polyamine
KW  - MAP-Kinase
KW  - Signaltransduktion
KW  - Taufliege
KW  - Raf <Biochemie>
KW  - MAPK-Signalweg
KW  - Drosophila melanogaster
KW  - DRaf
KW  - protein kinase CK2
KW  - polyamines
KW  - MAPK signalling pathway
KW  - Drosophila melanogaster
KW  - DRaf
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-57522
ER  -