TY  - THES
A1  - Löffler, Daniela Inge Martina
T1  - Untersuchungen virulenzattenuierter Listeria monocytogenes Stämme als Impfstoffträger im Mausmodell
T1  - Virulence-attenuated Listeria monocytogenes strains as vaccine carrier in vivo
N2  - Virulenzattenuierte Stämme des Gram-positiven Pathogens Listeria monocytogenes (Lm) stellen optimale Kandidaten als Träger für heterologe Proteinantigene in die Maus dar. Lm repliziert nach Befreiung aus dem primären phagosomalen Kompartiment sehr effizient und schnell im Zytosol sehr vieler nicht-phagozytischer Wirtszellen als auch in professionellen antigenpräsentierenden Zellen (APC). Diese Fähigkeit in relevante immunologische APCs einzudringen und zu replizieren, erlaubt die zielgerichtete Übertragung heterologer Antigene in die MHC-Klasse-I- und MHC-Klasse-II-Präsentationswege, um so eine effektive zelluläre Immunität zu etablieren. In der vorliegenden Arbeit wurden die in vivo Effizienzen der Aktivierung von antigen-spezifischen CD8+ and CD4+ T-Zellen miteinander verglichen, sobald das plasmidkodierte Proteinantigen Ovalbumin (OVA) in Form von bakteriell exprimierten und exportierten Proteinen, von cDNA oder mRNA durch die jeweiligen virulenzattenuierten Lm trpS Stämme in das Zytosol von antigenpräsentierenden Zellen freigesetzt wurde. Die Freisetzung wurde durch ein Listeria-spezifisches Phagenlysin, welches von den Bakterien vorwiegend im Zytosol der Wirtszelle exprimiert wird, unterstützt. Die Übertragung dieser unterschiedlichen biologisch-aktiven Moleküle durch die autolysierenden Listerien führte im Falle des Proteins und der mRNA erfolgreich zu einer MHC-Klasse-I-Präsentation eines Ovalbumin-Peptides (SIINFEKL), welche letztendlich eine adaptive zelluläre Immunität unter Beteiligung von T-Gedächtniszellen induzierte. Dabei stellte sich die Übertragung des Proteins durch Lm als die effizienteste Strategie im Induzieren einer zellulären adaptiven Immunantwort mit gegen Ovalbumin gerichteten CD8 und CD4 T-Gedächtniszellen heraus. Autolysierende Listerien, welche die plasmidkodierende OVA-DNA übertrugen, lösten dagegen keine OVA-spezifische T-Zellantwort aus. Da sich der Trägerstamm Lm trpS aufgrund der Autolysiskassette zwar als virulenzattenuiert herausgestellt hatte, jedoch bei höher Applikationsdosis dieses Stammes es nur zu einer unvollständigen Lysis kam, wurden die jeweiligen Effizienzen weiterer noch stärker attenuierter autolysierender Lm Stämme als Überträger des Ovalbumins (Lm Mutanten trpS hlyW491A und (trpS aroA aroB)) bestimmt. Beide ermöglichten die OVA-Präsentation über MHC-Klasse-I-Moleküle mit nachfolgender klonaler Expansion spezifischer CD8+ T-Zellen in vergleichbaren signifikanten Werten zum WT Stamm trpS. Ferner wurde zum ersten Mal eine signifikante Präsentation des OVAs über MHC-Klasse-I-Moleküle durch die autolysierende Mutante trpS hlyW491A, welche die plasmidkodierende DNA freisetzte, nachgewiesen. Die autolysierende Lm (trpS aroA aroB) Mutante in hoher CFU (5107) stellte sich dabei als ein sehr vielversprechender Träger des heterologen Proteinantigens heraus, da sie im Gegensatz zum autolysierenden Stamm Lm trpS eine sehr geringe Leberschädigung hervorrief. In diesem Zusammenhang wurde festgestellt, das durch Freisetzung von OVA Antigenen in das Zytosol oder ins Phagosom von APCs, welche von den jeweiligen Lm (trpS aroA aroB) Stämmen als exportiertes, zellwandverankertes oder intrazellulär verbleibendes Protein exprimiert wurden, vergleichbare Häufigkeiten an proliferierten OVA-spezifischen CD8+ T-Zellen induzierten werden konnten. Es zeigten sich jedoch deutliche Unterschiede in der Aktivierung antigen-spezifischer CD4+ T-Zellen durch diese Lm (trpS aroA aroB) OVA-Trägerstämme. Die Strategie der Übertragung exportierter Proteine ins Phagosom oder ins Zytosol antigenpräsentierender Zellen war die wirkungsvollste, um gleichzeitig effiziente MHC-Klasse-I- und MHC-Klasse-II-restringierte Antigenpräsentationen in vivo zu induzieren. Es wurden alternative plasmidkodierende Lysiskassetten für die Freisetzung von DNA-Vakzinen (Baktofektion) aus den Bakterien konstruiert, die alle aus Lyseproteinen eines Listeria-spezifischen Phagens und einem vorangestellten zytosolischen listeriellen Promotor bestehen. Diese wurden in ihrer Effizienz mit der ursprünglich eingesetzten Lysiskassette PactA-ply118 verglichen. Dabei wurde beobachtet, dass zwei von den vier neukonstruierten Lysiskassetten in einige Zellinien vergleichbare Baktofektionsraten erzielten. Jedoch ist die ursprüngliche Phagenlysin-Kassette PactA-ply118 für die Übertragung von Plasmid-DNA in das Zytosol von Wirtszellen die wirksamste, da diese in vivo zu einer besonders hohen Attenuation der Bakterien führte.
N2  - Virulence-attenuated strains of the Gram positive pathogen Listeria monocytogenes (Lm) are optimal candidates for the delivery of heterologous antigens into mammalian hosts. Lm escapes the phagosome, replicates efficiently within the cytosol of many host cells including appropriate cells of the immune system like macrophages and dendritic cells (antigen presenting cells, APCs). These natural biological properties of Lm to enter and replicate in relevant immunological APCs allow the targeted delivery of heterologous antigens into the antigen-processing pathway of MHC class I and MHC class II molecules leading to a strong cellular immunity. In this work, the in vivo efficiences of activation of antigen-specific CD8 and CD4 T cells were compared when the plasmid-encoded protein antigen ovalbumin was secreted by the bacteria as a protein or delivered as cDNA or as mRNA. Delivery was supported also by a specific endolysin produced by the bacteria. Listeriae harbouring this transcriptional unit undergo lysis when they reach the cytosol. In the case of OVA as protein or as mRNA, delivery of these different biological active molecules by autolysing Listeria resulted in significant OVA peptide (SIINFEKL) presentation in the context of MHC class I molecules, which also induced an adaptive cellular immunity with memory T cells. Secretion of OVA by the carrier bacteria yielded the strongest immune response involving OVA-specific memory CD8 and CD4 T cells. In contrast, infection with autolysing Listeria delivering OVA-encoded DNA failed to generate OVA-specific T cells. Due to its harbouring of the autolysing cassette, carrier strain Lm trpS was virulence-attenuated, but infection with 5107 bacteria of this strain resulted in a partial lysis. Therefore investigation of other attenuated and also autolysing strains (Lm mutants trpS hlyW491A and (trpS aroA aroB)) was necessary. Both these strains facilitated OVA presentation via MHC-class-I molecules resulting in clonal expansion of specific CD8+ T cells in comparable frequencies as the wild-type strain. Furthermore, autolysing Lm trpS hlyW491A delivering OVA-encoded DNA led to specific presentation of OVA in the context of MHC class I molecules. Additionally, autolysing Lm (trpS aroA aroB) strain with high infection dose (5107) is a promising carrier for heterologous protein antigens because this mutant exhibited only marginal liver toxicity in contrast to the strain Lm trpS. In this regard, comparable frequencies of proliferated OVA-specific CD8+ T cells were induced through the delivery of OVA antigens into phagosome or cytosol of APCs that were expressed as secreted proteins, as anchored-proteins or as intracellular proteins by the respective carrier Lm strains (trpS aroA aroB). Activation of antigen-specific CD4+ T cells by these OVA-carrier Lm (trpS aroA aroB) was different compared to activation of antigen-specific CD8+ T cells. Secretion of OVA by the carrier bacteria yielded the strongest activation of both MHC-class I and II restricted antigen presentation in vivo. Different lysis cassettes were tested consisting of Listeria-specific phage lysis proteins and an intracellular promoter of Listeria for the delivery of DNA vaccines (bactofection). The efficiency of these cassettes was compared to the original cassette (PactA-ply118). Two of the four new cassettes achieved comparable bactofection rates in some cell lines as the originally used cassette. However, the Lm strain containing the cassette PactA-ply118 was found to be the most effective due to high attenuation in mice.
KW  - Listeria monocytogenes
KW  - Attenuierung
KW  - Impfstoff
KW  - Maus
KW  - Listeria monocytogenes
KW  - Impfstoffe
KW  - Mausmodell
KW  - Listeria monocytogenes
KW  - vaccines
KW  - in vivo
Y1  - 2006
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-18728
ER  - 
TY  - THES
A1  - Gareiß, Barbara
T1  - Einfluss niedermolekularer Protein-Tyrosin-Phosphatasen von Listeria monocytogenes auf die listerielle Genexpression und Virulenz
T1  - Influence of low molecular weight protein tyrosine phosphatases of Listeria monocytogenes on the listerial gene expression and virulence
N2  - Im Genom von Listeria monocytogenes konnten zwei Gene identifiziert werden, die mutmaßlich für niedermolekulare Protein-Tyrosin Phosphatasen (LMW-PTPs) kodieren, Lmo0938/Ptp-1 und Lmo2540/Ptp-2, beide ähneln LMW-PTPs von B. subtilis. Einzel- und Doppeldeletionen der ptp-Gene beeinflussten die Transkription zahlreicher Gene, wie anhand von Gesamtgenom-DNA-Microarray-Analysen und quantitativer RT-PCR gezeigt werden konnten. Insbesondere waren die Gene für i) die Internaline A und B, ii) den Osmoprotektanten-Transporter OpuC, iii) MCP, notwendig zur Flagellen-Bewegung und iv) eine Anzahl von den Proteinen, die in die Nährstoffaufnahme sowie den intrazellulären Metabolismus involviert sind, in vitro herunterreguliert. Die PrfA-regulierten Virulenzgene wurden in den Mutanten verstärkt exprimiert. Im Wesentlichen konnte das gleiche Transkriptionsmuster in infizierten Caco-2-Enterocyten beobachtet werden. Die verringerte Invasivität (abhängig von InlA) und die Unbeweglichkeit der Mutanten passt zu den Transkriptionsergebnissen. Jedoch wurden weder die intrazelluläre Replikation innerhalb eukaryontischer Wirtszellen noch die Resistenz gegen Stressbedingungen durch die Deletion beeinträchtigt. Die Proteome des Wildtyps und der ptp-Mutanten wurden durch 2-dimensionale Gelelektrophorese verglichen und es zeigte sich, dass die Transkriptionsergebnisse nicht vollständig im Proteom reflektiert wurden. Die Ergebnisse zeigen, dass die Ptps in die Regulationsnetzwerke des alternativen Stress-Sigmafaktor SigB und von PrfA eingreifen. Der ähnliche Effekt beider Ptps auf die Transkription oder auf den Proteinlevel deutet eine Interaktion oder Kooperation der beiden Enzyme an.
N2  - In the genome of Listeria monocytogenes we identified two genes putatively encoding low molecular weight protein-tyrosine phosphatases (LMW PTPs), Lmo0938/Ptp-1 and Lmo2540/Ptp-2, similar to LMW PTPS of B. subtilis and S. aureus. Single and double deletions of the ptp genes affected transcription of numerous genes, shown by whole-genome DNA-microarray analysis and quantitative RT-PCR. In particular the genes for i) the internalins AB, ii) the osmoprotectant uptake system OpuC, iii) MCP, important for flagellar motion, and iv) a number of proteins involved in nutrient uptake and intracellular metabolism, were down regulated in vitro. The PrfA-regulated virulence genes were up regulated in the mutants. Essentially the same transcription pattern was observed in infected Caco-2 enterocytes. The decreased invasiveness (dependent on InlA) and non-motility of the mutants matches the transcription results. However, neither replication within eukaryotic host cells nor resistance against stress conditions was impaired by the deletions. The proteomes of wild type and Ptp-mutants were compared by 2-D-protein gel electrophoresis, surprisingly showing that the transcription results were not completely reflected in the proteome. The results show that the Ptps interfere with the stress sigma factor SigB and PrfA regulatory networks. The similar effect of both Ptps on transcription or on protein level suggests an interaction or cooperation of the two enzymes.
KW  - Listeria monocytogenes
KW  - Genexpression
KW  - Proteintyrosinphosphatase
KW  - Listeria monocytogenes
KW  - niedermolekulare Protein-Tyrosin-Phosphatasen
KW  - Transkriptionsregulation
KW  - Proteom
KW  - Invasion
KW  - Listeria monocytogenes
KW  - low molecular weight protein tyrosine phosphatase
KW  - transcription regulation
KW  - proteome
KW  - invasion
Y1  - 2006
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-19853
ER  -