TY  - THES
A1  - Vu Xuan, Nghia
T1  - Generation of tools to investigate Chikungunya virus
T1  - Entwicklung von Methoden zum Chikungunya-Nachweis
N2  - CHIKV is the prototype of Alphaviruses and it causes an acute febrile illness with rash, severely painful arthralgias, and sometimes arthritis. While CHIKV has first been identified in the 1950s in Africa, recent outbreaks of CHIKV in the islands of the Indian Ocean and particular in Italia have re-drawn attention to CHIKV. In the past CHIKV disease was considered self-limiting and non-fatal. However, a number of deaths on Reunion (Anonym, 2006) during the outbreak, which was affected directly or indirectly by CHIKV, have changed this view. To defeat CHIKV outbreaks diagnostic tools and anti CHIKV therapies are urgently needed. In this thesis, we generated tools to investigate CHIKV at the molecular level by serological tests. CHIKV was isolated from a German woman who was infected during her holidays on the Mauritius Island. To characterize this viral isolate the complete viral genome was amplified by PCR and molecular cloned. In order to analyse antibody responses of infected individuals some of the structural and non-structural genes were subcloned in bacterial expression vectors. The NSP2, proteinase, capsid, E1 and E2 were subsequently expressed in E.coli using purified successfully. In this thesis, the structural proteins were used to develop a screening test for anti-CHIKV antibodies in patient derived serum samples. These tests were evaluated with pre-characterized anti-CHIKV sera (30 samples) obtained from the BNI Hamburg and 100 serum samples from German blood donors used as negative controls. Immunoblotting analysis revealed that up to 77% of precharacterised positive sera could recognize the recombinant proteins and there were no detectable reactivity of CHIKV-negative German donor sera. The recombinant proteins were also recognized by 71.4% of positive sera in the newly established ELISA. In order to go further in analyses of the results, an in house IFA was performed. Positive sera (21 samples) were used. The results showed that all of them reacted positive, but this assay was less sensitive than the IFA from BNI. In comparison with the IFA result from BNI Hamburg, the results were not congruent in all test performed. This could be due to various drawbacks of the tests. A cross reaction in Alphaviruses and the different strains are mentioned as well as the denatured forms of the structural proteins. Besides the main structural proteins (E1, E2 and C), other proteins such as non-structural proteins, uncleaved precursor proteins could participate in the different outcomes of serological assays. In order to go further in the CHIKV diagnoses, the CHIKV recombinant proteins were applied to screen the anti-CHIKV antibodies in the Vietnamese population, who are considered to live in the high risk regions. In serological tests, 158 sera of Vietnamese donors were incubated with the recombinant proteins or the fixed CHIKV infected cells. The results showed that 24% of Vietnamese donor sera recognized the recombinant proteins in immunoblot assay, while 36% scored positive in the ELISA assay. In IFA, the sera considered positive were 11.4%. While some discrepancies in serological tests were found, these results showed that the ratio of CHIKV-positive sera seem to be equal to the other regions in the world, which are affected by CHIKV. It is suggested that CHIKV infection in Vietnam has been repeatedly misdiagnosed. This study cohort consisted only of samples originating from Hanoi area of Northern Vietnam, thus, future studies should expand to include samples from other Vietnam areas. To do this the various subtypes of the virus in the different regions should be isolated and the sequences of these viruses should be well characterized.
KW  - Viren
KW  - Enzyme-linked immunosorbent assay
KW  - Vietnam
KW  - RNS-Viren
KW  - chikungunya virus
KW  - Diagnostik
KW  - chikungunya virus
KW  - diagnostic
Y1  - 2008
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-28993
ER  - 
TY  - THES
A1  - Guenzel, Carolin Alexandra
T1  - The Characterization of Nipah Virus V and W proteins
T1  - Die Charakterisierung der Nipah Virus V und W Proteine
N2  - The work of the previous chapters describes the role of Nipah virus (NiV) V and W proteins regarding their role in interferon antagonism and regulation of viral replication. Previous publications have shown that NiV encodes IFN antagonist activity in its V, W and C protein (Park et al., 2003b; Rodriguez et al., 2002). In order to study the effect of both NiV proteins in the context of a virus infection, recombinant Newcastle disease viruses (rNDVs) expressing NiV V or NiV W were constructed. As a control virus served rNDV expressing NDV V proteins, which behaved like wildtype NDV. Growth kinetic experiments demonstrated that rNDVs expressing NiV V or W grew to higher titers than rNDV expressing NDV V in human A549 cells. This result suggested that both NiV V and W were able to render the avian virus, which normally does not replicate well in human cells, into a better growing virus. This hypothesis was supported by the fact that all rNDVs grew similarly in avian DF1 or Vero cells. When rNDV-infected A549 cells were specifically stained for NiV V or W protein it was observed that V is localized in the cytoplasm whereas W could be predominantly found in the nucleus. This observation was in agreement with previous studies reporting a nucleus export signal (NES) for NiV V and a nuclear localization signal (NLS) for NiV W (Rodriguez et al., 2004; Shaw et al., 2005). The specific localization of each NiV protein has also been shown to contribute to different functions in terms of IFN antagonism (Shaw et al., 2005). Here, NiV V and W proteins caused a severe attenuation of the immune response in rNDV-infected human A549 and dendritic cells. The transcription of type I interferons and ISGs was significantly downregulated in the presence of NiV V and W proteins. As a consequence of the transcriptional block, there was also an inhibition at the level of translation (as seen for A549 cells) and the secretion of IFNs and cytokines/chemokines (as seen for DCs). In contrast, NDV V protein induced a host immune response. Both NiV V and W also displayed a strong inhibitory effect on the function DCs. DCs represent a very important cell class because they link the innate immune response to the adaptive immune response (Banchereau & Steinman, 1998). By downregulating the production and secretion of important cytokines/chemokines that are important for the activation of B and T lymphocytes, NiV V and W were able to disrupt that link. Interestingly, NiV W seemed to be a stronger inhibitor than NiV V in both A549 cells and DCs. Overall, it was demonstrated that NiV V and W were able to prevent the induction of the innate and adaptive host immune response cascade by inhibiting the transcription of immune genes in DCs and A549 cells. The second part of this work addressed the question whether NiV V and W proteins have a regulatory role in viral replication. This has been previously reported for Nipah virus itself (Sleeman et al., 2008) and other viruses (Atreya et al., 1998; Horikami et al., 1996; Witko et al., 2006). In order to study the ability of the V and W proteins of NiV to regulate viral transcription and/or replication, an existing NiV minireplicon assay was used (Halpin et al., 2004). Here, it was shown that NiV V and W (but not C) proteins significantly downregulated NiV minireplicon activity. The common N terminal region was shown to harbor the inhibitory activity. Co-immunoprecipitation experiments showed that both NiV V and W (but not C) were able to interact with NiV N, one component of the NiV polymerase. This result was supported by immunofluorescence experiments that revealed co-localization of NiV N with V and W. The binding of NiV V or W to NiV N occurred via their N terminus and more specifically amino acids 1-50. This suggested that V and W might inhibit viral replication by interacting with the viral polymerase resulting in a loss of function. Exact mechanisms still have to be elucidated.
N2  - Die Arbeit der vorangegangenen Kapitel geht auf die Rolle von Nipah Virus (NiV) V und W Proteinen bezueglich deren Rolle im Interferon-Antagonismus und Regulation der viralen Replikation. In vergangenen Veroeffentlichungen wurde gezeigt, dass NiV seine interferon-antagonistische Aktivitaet in dessen V, W und C Proteinen kodiert (Park et al., 2003b; Rodriguez et al., 2002). Um den Effekt beider NiV Proteine im Rahmen einer Virusinfektion zu untersuchen, wurden rekombinante Newcastle disease Viren (rNDV), welche entweder NiV V oder W exprimieren, konstruiert. Als Kontrollvirus diente ein rNDV, der das NDV V Protein exprimiert. Dabei verhaelt sich der rekombinante Virus wie NDV-Wildtyp. Kinetische Wachstumsexperimente in A549 Zellen zeigten, dass rNDVs, die NiV V oder W exprimieren, zu hoeheren Titern wuchsen als rNDV, der NDV V exprimiert. Dieses Ergebnis deutete darauf hin, dass sowohl NiV V als auch NiV W im Stande waren, den Vogelvirus, welcher normalerweise schlecht in humanen Zellen repliziert, zu einem besseren Wachstum anzuregen. Diese Hypothese wurde durch die Tatsache unterstuetzt, dass alle rNDVs ein recht recht aehnliches Wachstumsverhalten in Vogelzellen (DF1 Zellen) und Vero Zellen aufwiesen. Ausserdem wurden rNDV-infizierte A549 Zellen spezifisch gegen NiV V oder W Protein angefaerbt und es konnte beobachtet werden, dass V im Zytoplasma und W ueberwiegend im Nukleus der Zelle lokalisiert ist. Diese Beobachtung stimmte mit vorhergehenden Studien ueberein, die von ein Nukleus-Exportsignal (NES) fuer NiV V und ein Nukleus-Lokalisationsignal (NLS) fuer NiV W berichteten (Rodriguez et al., 2004; Shaw et al., 2005). Es wurde gezeigt, dass diese unterschiedliche, jedoch spezifische Lokalisation der NiV Proteine zu verschiedenen Funktionen bezueglich des Interferon-Antagonismus beitraegt (Shaw et al., 2005). In der vorliegenden Arbeit verursachten NiV V und W Proteine eine heftige Attenuation der Immunantwort in rNDV-infizierten humanen A549 und dendritischen Zellen (DC). In der Anwesenheit von NiV V und W Proteinen wurde die Transkription der Typ 1-Interferonen und ISGs signifikant herunterreguliert. Als Konsequenz des transkriptionellen Blocks konnte auch eine Inhibition auf translationalem Niveau (zu sehen in A459 Zellen) und eine Inhibition der Sekretion von IFNs und Zytokinen/ Chemokinen (zu sehen in DCs) verzeichnet werden. Im Gegensatz dazu induzierte NDV V Protein ein Immunantwort im Wirt. Sowohl NiV V als auch W zeigten auch einen starken inhibitorischen Wirkung auf die Funktion von DCs. DCs repraesentieren einen sehr wichtigen Zelltyp, da sie eine Verbindung zwischen der angeborenen und erworbenen Immunantwort herstellen (Banchereau & Steinman, 1998). Durch die Herunterregulierung der Produktion und Sekretion wichtiger Zytokine/ Chemokine, die fuer die Aktivierung von B- und T-Lymphozyten wichtig sind, waren NiV V und W faehig, diese Verbindung zu zerstoeren. Interessanterweise schien NiV W in A549 Zellen ein viel staerkerer Inhibitor zu sein als NiV V. Insgesamt wurde demonstriert, dass NiV V und W durch Inhibierung der Transkription von Immungenen im Stande waren, die Induktion der angeborenen und erworbenen Immunantwort-Kaskade zu unterbinden. Der zweite Teil dieser Arbeit beschaeftigt sich mit der Frage, ob NiV V oder W Proteine eine regulatorische Aufgabe in der viralen Replikation uebernehmen. Vorherige Berichte hatten dies fuer Nipah Virus selbst (Sleeman et al., 2008) und andere Viren demonstriert (Atreya et al., 1998; Horikami et al., 1996; Witko et al., 2006). Um die Faehigkeit von V und W Proteinen bezueglich der Regulation der viralen Transkription und/ oder Replikation zu bestimmen, wurde Gebrauch von einem bereits existierenden NiV Minireplikon-Assay gemacht (Halpin et al., 2004). In der vorliegenden Studie wurde gezeigt, dass NiV V und W (jedoch nicht C) Proteine die NiV Minireplikon-Aktivitaet in signifikanter Weise reduzierten. Es wurde gezeigt, dass die gemeinsame N-terminale Region die inhibitorische Aktivitaet besitzt. Ko-Immunopraezipitationsexperimente demonstrierten weitehin, dass sowohl NiV V als auch W (jedoch nicht C) im Stande waren, mit NiV N, einer Komponente der NiV Polymerase, zu interagieren. Dieses Ergebnis wurde von Immunfluoreszenzexperimenten untermauert, die eine Kolokalisation zwischen NiV N und V und W demonstrierten. Der N-Terminus von NiV V und W, und hierbei speziell die Aminosaeuren 1-50, waren fuer die Bindung von NiV V und W an NiV N verantwortlich. Dies deutete darauf hin, dass V und W durch das Binden der viralen Polymerase die virale Replikation inhibiert.
KW  - Viren
KW  - Interferon
KW  - Immunreaktion
KW  - Replikation
KW  - Interferonantagonismus
KW  - Immunsupression
KW  - Interferonantagonism
KW  - Immunesupression
Y1  - 2009
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-37627
ER  - 
TY  - THES
A1  - Neske, Florian
T1  - Entwicklung molekularbiologischer und serologischer Methoden zum Nachweis von Infektionen mit dem humanen Bocavirus und dem Polyomavirus WU
T1  - Development of molecularbiological and serological detection methods of human Bocavirus and Polyomavirus WU
N2  - Durch Viren ausgelöste Infektionen der Atemwege zählen zu den häufigsten Erkrankungen des Menschen. Durch molekularbiologische Verfahren konnten in den vergangen Jahren bis dahin unbekannte Viren in respiratorischen Proben nachgewiesen werden, darunter das humane Bocavirus (hBoV) in 2005 und das Polyomavirus WU (WUPyV) in 2007. In der vorliegenden Arbeit wurden qualitative und quantitative DNA-Nachweisverfahren für hBoV und WUPyV etabliert und validiert, um retrospektiv die Infektionshäufigkeit von hBoV und WUPyV bei hospitalisierten Kindern mit akuter respiratorischer Erkrankung (ARE) der Universitätskinderklinik Würzburg zu untersuchen. Zusätzlich wurden phylogenetische Untersuchungen dieser Viren durchgeführt. Zum Nachweis von Antikörpern gegen Kapsidproteine von hBoV und WUPyV wurde ein auf rekombinanten Baculoviren basierender Immunfluoreszenztest (IFT) etabliert. HBoV-DNA konnte in 12 % von 834 untersuchten Nasenrachensekreten (NRS) von Kindern mit ARE aus dem Zeitraum von Januar 02 – September 05 detektiert werden. Das mediane Alter der hBoV-positiven Kinder war 1,8 Jahre, die mediane hBoV-Last betrug 4,9 x 103 Kopien/ml. Bei einem großen Teil (39,1 %) der hBoV-DNA-positiven Kinder wurden Koinfektionen mit anderen respiratorischen Viren detektiert, was jedoch keine signifikante Auswirkung auf die nachgewiesene hBoV DNA Menge hatte. Kinder mit Bronchitis wiesen eine signifikant höhere Viruslast auf als Kinder mit Fieberkrämpfen. Im Rahmen einer Verlaufsstudie konnte hBoV-DNA bei einem Kind über einen Zeitraum von 4,5 Monaten in NRS nachgewiesen werden. Bei einem Teil der Kinder mit hBoV-DNA-positiven NRS wurden Serum- und Stuhlproben auf hBoV-DNA untersucht. In einer von 10 Serumproben und 14 von 31 Stuhlproben konnte BoV-DNA nachgewiesen werden. Dabei war die hBoV-DNA-Menge im NRS signifikant höher, wenn die Stuhlprobe ebenfalls positiv war. Die phylogenetische Analyse von hBoV bestätigte die vom Erstbeschreiber ermittelten Cluster (St1 und St2). Diese Cluster weisen eine hohen Identität zueinander auf, sowohl auf Nukleotid- (≥99,6 %) als auch auf Aminosäure (AS)-Ebene (≥99,9 %). Ein Zusammenhang zwischen den Clustern und klinischen oder virologischen Faktoren war nicht ersichtlich. Die Untersuchung auf IgG-Antikörper gegen hBoV-VP2 ergab bei gesunden Erwachsenen eine Seroprävalenz von 74 %. Ein Zusammenhang zwischen Alter und Seropositivität für hBoV-VP2 war nicht erkennbar. Die WUPyV-Untersuchungen wurden anhand von NRS durchgeführt, die im Zeitraum von Januar 02 – September 05 und Januar 07 – Juli 07 entnommen wurden. Dabei konnte WUPyV-DNA bei 5,2 % der Proben mit einer medianen Viruslast von 9,5x 102 Kopien/ml nachgewiesen werden. Das mediane Alter der WUPyV-infizierten Kinder betrug 3,0 Jahre. Bei 54,8 % der WUPyV positiven Kinder konnte eine Koinfektion mit einem anderen respiratorischen Virus festgestellt werden, wobei keine Korrelation zwischen Koinfektion und WUPyV-DNA-Menge ersichtlich wurde. Eine Assoziation zwischen der WUPyV-Last in NRS und klinischer Diagnose war nicht feststellbar. In 3 von 14 Serum- und 2 von 14 Stuhlproben von Kindern mit WUPyV-DNA-positivem NRS konnte WUPyV-DNA detektiert werden. Dabei war die WUPyV-Last im NRS von Kindern mit positivem Serum höher als bei Kindern mit negativem Serum. Durch die phylogenetischen Untersuchung von WUPyV konnten zwei Cluster mit hoher Nukleotid-Identität (≥99,2 %) ermittelt werden. Der Großteil (60,3 %) der Substitutionen war nicht synonym, was zu einer Identität auf AS-Ebene von 98,8 % führte. Von den AS Mutationen waren 76 % Cluster-spezifisch. Mit dem etablierten WUPyV-spezifischen IFT konnte bei gesunden Erwachsenen eine IgG-Seroprävalenz von 88 % für WUPyV ermittelt werden. Ein signifikanter Unterschied im medianen Alter zwischen Anti-WUPyV-VP1-positiven und -negativen Probanden konnte nicht festgestellt werden. Zusammenfassend konnte durch die etablierten molekularen und serologischen Nachweisverfahren die Infektionshäufigkeit von hBoV und WUPyV bei Kindern mit ARE, die Phylogenie der Viren und die Seroprävalenz bei gesunden Erwachsenen erforscht werden. Die in den vorliegenden Studien ermittelten Infektionshäufigkeiten für hBoV und WUPyV deckten sich mit anderen Publikationen zur Epidemiologie von hBoV und WUPyV. Durch die in dieser Arbeit durchgeführten Versuche konnten keine offensichtlichen Assoziationen zwischen einer hBoV- oder WUPyV-Infektion und einer respiratorischen Erkrankung festgestellt werden. Zur Untersuchung der Pathogenität von hBoV und WUPyV sind daher noch weitere Studien notwendig.
N2  - Respiratory tract infections are a major cause of human morbidity and are caused by a broad spectrum of microbial agents, mostly viruses. In recent years, the use of molecular biology methods led to the discovery of several novel viruses, including the human bocavirus (hBoV) in 2005 and the polyomavirus WU (WUPyV) in 2007. In this study, we established qualitative and quantitative polymerase chain reaction assays for both viruses in order to investigate their genoprevalence in hospitalized children with acute respiratory diseases (ARD). Furthermore, phylogenetic analyses of hBoV and WUPyV were performed. In order to study the antibody response against hBoV and WUPyV, immunofluorescence assays (IFA) based on recombinant baculoviruses were established for both viruses. Nasopharyngeal aspirates (NPA) from the period of January 02 to September 05 of hospitalized children with ARD were retrospectively tested for the presence of hBoV DNA. We found that 12 % of the NPA were positive for hBoV DNA. The median age of hBoV DNA-positive children was 1,8 years and the median hBoV load in NPA was 4.9 x 103 copies/ml. Coinfections with other respiratory viruses were detected in 39,1 % of the hBoV DNA-positive NPA. There was no difference of the hBoV load in NPA between children with or without known coinfection, but the load was significantly higher in children with bronchitis than in children with the diagnosis of febrile seizures. In follow-up studies, hBoV DNA shedding was detected for a maximum period of 4.5 months. HBoV DNA was found in 1 of 10 serum samples and in 14 of 31 stool samples of children with hBoV DNA-positive NPA. The hBoV load in NPA was significantly higher for children with positive stool samples. Phylogenetic analysis of hBoV confirmed the previously suggested clusters St1 and St2. The nucleotide and amino acid identity between the clusters was very high (≥99.6 % and ≥99.9 %, respectively). An association of the clusters with virological or clinical parameters was not apparent. Using an IFA to detect IgG against hBoV VP2 antigen, the seroprevalence for hBoV in healthy adults was found to be 74 %. There was no association between age and seropositivity in the study population. WUPyV DNA was analysed in 1232 NPA, which had been collected from 2002 to 2007, and was found in 5.2 % of theses samples with a median WUPyV load of 9.5 x 102 copies/ml. Coinfections were found in 54.8 % of the WUPyV DNA-positive NPA. The median age of the WUPyV DNA-positive children was 3.0 years. The WUPyV load in NPA was neither associated with the coinfection status nor with the clinical diagnoses. WUPyV DNA was found in 3 of 14 serum samples and in 2 of 14 stool samples of WUPyV DNA-positive children. The WUPyV load in NPA tended to be higher in viremic children. Two different WUPyV clusters with high nucleotide-identity (≥99 %) were found by phylogenetic analysis. A high number (60.3 %) of nucleotide substitutions was non synonymous, resulting in 46 amino acid mutations and 98.8 % amino acid identity. Of the amino acid mutations, 76 % were specific for the two clusters. The IgG seroprevalence for WUPyV among healthy adults was 88 % as determined by IFA based on Sf9 cells expressing WUPyV VP1. As seen with hBoV, there was no association between age and seropositivity. In conclusion, we investigated the genoprevalence of hBoV and WUPyV in children with ARD and the seroprevalence in healthy adults. The results of our studies were in agreement with other publications on the epidemiology and serology of hBoV and WUPyV. No obvious association between infection with hBoV or WUPyV and clinical diagnosis was apparent. The methods established and evaluated in this thesis can be applied for further studies to investigate the pathogenicity of hBoV and WUPyV.
KW  - Viren
KW  - Polyoma-Virus
KW  - Parvoviren
KW  - Atemwegsinfektion
KW  - Polymerase-Kettenreaktion
KW  - Immunfluoreszenz
KW  - Boccavirus
KW  - Polyomavirus WU
KW  - Virusnachweis
KW  - quantitative real-time PCR
KW  - Immunofluoreszenztest
KW  - Boccavirus
KW  - Polyomavirus WU
KW  - quantitative real-time PCR
KW  - Immunofluorescence Assay
Y1  - 2009
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-40424
ER  - 
TY  - BOOK
A1  - Bock, Stefanie
A1  - Gauch, Fabian
A1  - Giernat, Yannik
A1  - Hillebrand, Frank
A1  - Kozlova, Darja
A1  - Linck, Lisa
A1  - Moschall, Rebecca
A1  - Sauer, Markus
A1  - Schenk, Christian
A1  - Ulrich, Kristina
A1  - Bodem, Jochen
T1  - HIV-1 : Lehrbuch von Studenten für Studenten
T1  - HIV-1 : a textbook for students written by students
N2  - Dies ist ein Lehrbuch über die HIV-1 Replikation, Pathogenese und Therapie. Es richtet sich an Studenten der Biologie und der Medizin, die etwas mehr über HIV erfahren wollen und stellt neben virologischen Themen auch die zellulären Grundlagen dar. Es umfasst den Viruseintritt, die reverse Transkription, Genom-Integration, Transkriptionsregualtion, die Kotrolle des Spleißens, der Polyadenylierung und des RNA-Exportes. Die Darstellung wird abgerundet mit Kapiteln zum intrazellulärem Transport, zu Nef und zum Virusassembly. In zwei weiteren Kapitel wird die HIV-1 Pathogenese und die Therapie besprochen. Zur Lernkontrolle sind den Kapiteln Fragen und auch Klausurfragen angefügt.
KW  - HIV
KW  - Retroviren
KW  - Lehrbuch
KW  - Viren
KW  - Virologie
KW  - Transkription
KW  - RNS
KW  - Therapie
KW  - Pathogenese
KW  - Epidemiologie
KW  - RNA-Export
KW  - Polyadenylierung
KW  - Reverse Transkription
KW  - Transkription
Y1  - 2013
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-78980
SN  - 978-3-923959-90-7
ER  -