TY - JOUR A1 - Meier, I. A1 - Shephard, S. E. A1 - Lutz, Werner K. T1 - Nitrosation of aspartic acid, aspartame, and glycine ethylester. Alkylation of 4-(p-nitrobenzyl)pyridine (NBP) in vitro and binding to DNA in the rat N2 - In a colorimetric assay using 4-( p-nitrobenzyl)pyridine (NBP) as a nucleophilic scavenger of alkylating agents, the nitrosation and alkylation reactions were investigated for a number of amino acids and derivatives. The alkylating activity increased with the square of the nitrite concentration. The nitrosation rate constants for aspartic acid, aspartame, and glycine ethylester ( = precursors C) were 0.08, 1.4 and ~ 0.2, respectively, expressed in terms of the pH-dependent \(k_2\) rate constant of the equation dNOCjdt = \(k_2\) • (C]· [nitrite]\(^2\) • The rates correlated inversely with the basicity of the amino group. The stability of the alkylating activity was astonishingly high, both in acid and at neutral pH. Half-lives of 500, 200, and 30 min were determined for aspartic acid (pH 3.5), aspartame (pH 2.5), and glycine ethylester (pH 2.5). Values of 60, 15, and 2 min; respectively, were found at pH 7. It is concluded that rearrangement of the primary N-nitroso product to the ultimate alkylating agent could be rate-limiting. The potential of nitrosated a-amino acids to bind to DN A in vivo was investigated by oral gavage of radiolabelled glycine ethylester to rats, followed irnmediately by sodium nitrite. DNA was isolated from stomach and liver and analysed for radioactivity and modified nucleotides. No indication of DNA adduct formation was obtained. Based on an estimation of the dose fraction converted from glycine ethylester to the nitroso product under the given experimental conditions, the maximum possible DNA-binding potency of nitroso glycine ethylester is about one order of magnitude below the methylating potency of N-nitrosomethylurea in rat stomach. The apparent discrepancy to the in vitro data could be due to efficient detoxification processes in mammalian cells. KW - Toxikologie KW - Nitrosation KW - Alkylation KW - Amino acids KW - DNA binding Y1 - 1990 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60804 ER - TY - THES A1 - Arand, Katja T1 - Charakterisierung hydrophiler Permeationswege in der pflanzlichen Kutikula anhand der Permeationseigenschaften ionischer Aminosäuren T1 - Characterisation of the hydrophilic pathway in plant cuticles by means of permeation properties of hydrophilic, ionic amino acids. N2 - Um sich vor dem Austrocknen zu schützen, haben Pflanzen eine Transpirationsbarriere entwickelt, die als Membran alle primären, oberirdischen Pflanzenteile überzieht. Diese so genannte Kutikula besteht hauptsächlich aus den lipophilen Komponenten Kutin und Wachs und reduziert so effektiv den Verlust von Wasser und wasserlöslichen Nährstoffen aus dem Blattinneren. Trotzdem ist sie nicht vollständig undurchlässig, und so können Wasser und gelöste Substanzen wie organische und anorganische Nährstoffe, Pestizide oder Umweltchemikalien die Kutikula in beiden Richtungen permeieren. Dabei ist offensichtlich, dass die zu Grunde liegenden Transportmechanismen den Ernährungszustand der Pflanzen, die Effizienz von Pestiziden und die Wirkung von Umweltchemikalien beeinflussen. Ein genaues Verständnis der Transportprozesse auf denen die kutikuläre Permeation basiert, kann helfen die Wirkweise von blattapplizierten Dünge- und Pflanzenschutzmitteln zu optimieren, indem gezielt Wirk- oder Zusatzstoffe modelliert werden können, welche die Aufnahme steigern. In der vorliegenden Arbeit sollte deshalb der Einfluss physiko-chemischer Eigenschaften von hydrophilen Verbindungen auf die kutikuläre Permeation untersucht werden. Nicht zuletzt wegen ihrer strukturellen Ähnlichkeit mit den blattapplizierten Herbiziden Glufosinat und Glyphosat wurden Aminosäuren als Modellsubstenzen ausgewählt. Die verwendeten Aminosäuren sind gut wasserlöslich, wobei alle Oktanol/Wasser Verteilungskoeffizienten kleiner als 1 sind. Zusätzlich liegen alle Aminosäuren in gelöster Form als Ionen vor, was zu einer Hydratisierung der Moleküle führt. Es wird spekuliert, dass hydratisierte Moleküle keinen Zugang zur lipophilen Phase der Kutikula haben. Welche Rolle die Hydrathülle bei der Permeation tatsächlich spielt, ist allerdings noch unklar. Viele Aktivwirkstoffe liegen nur unter ganz bestimmten Bedingungen in geladener Form vor, während die Richtung der kontinuierlichen Nettoladung der Aminosäuren durch den pH Wert modifiziert wird. Damit kann der Einfluss verschiedener Ladungszustände auf die kutikuläre Permeation unter Verwendung eines einheitlichen Sets von Modellsubstanzen untersucht werden. Unter natürlichen Bedingungen sind Aminosäuren unter anderem auf Blattoberflächen zu finden, wo sie blattassoziierten Mikroorganismen eine profitable Nahrungsquelle bieten. Ob äußere Faktoren für die Deposition dieser Recourcen verantwortlich sind, oder ob der Ursprung innerhalb des Blattgewebes liegt, wird kontrovers diskutiert. Die Sorption von Aminosäuren in isolierte Kutikularmembranen ist sehr gering, und korreliert - anders als bei lipophilen Substanzen - nicht mit dem Oktanol/Wasser Verteilungskoeffizienten. Das zeigt, dass der Verteilung von lipophilen und hydrophilen Substanzen innerhalb der Kutikula verschiedene Mechanismen zu Grunde liegen. Unter einer gegebenen Bedingung werden die kutikulären Leitwerte der Aminosäuren negativ vom Molvolumen beeinflusst. Zudem übersteigt die Länge des Permeationswegs die eigentliche Dicke der Membran um ein Vielfaches. Diese Zusammenhänge kennzeichnen eine gehinderte Diffusion innerhalb einer engporigen und weit verzweigten Umgebung. Eine Änderung des pH Wertes wirkt sich in unterschiedlicher Form auf die Leitwerte von Wasser und Aminosäuren aus. Mit steigendem pH Wert erhöht sich die Wasserpermeabilität isolierter Kutikularmembranen, was durch eine zunehmende, messbare Wassersorption in die Kutikula erklärt werden kann. Eine pH abhängige Dissoziation funktioneller Gruppen bewirkt eine Schwellung des polaren Weges, weshalb auch für die anionischen Aminosäuren bei pH 11 die höchsten Leitwerte gemessen wurden. Die zwitterionischen Aminosäuren bei pH 6 wiesen hingegen die geringsten Leitwerte auf, was im Widerspruch zu der Beobachtung steht, dass bei pH 1 die geringste Wassersorption in die Kutikula stattfindet. Eine Erklärung hierfür liefern die Hydrathüllen, die bei den zwitterionischen Aminosäuren am stärksten und bei den anionischen Species am geringsten ausgeprägt sind. Eine negative Korrelation aller gemessenen Aminosäureleitwerte mit den entsprechenden hydratisierten Molvolumen zeigt eindeutig, dass die Hydrathülle eine wichtige Größe für die Permeation durch die Kutikula darstellt. Dabei nimmt der Leitwert einer hydrophilen Substanz mit definiertem Molvolumen mit kleiner werdender Hydrathülle zu. Intakte Blätter wurden in flüssiges Wasser als Rezeptorlösung getaucht, um steady-state Bedingungen aufrecht zu erhalten. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Permeabilitäten von intakten Kutikularmembranen, die anhand der natürlichen Aminosäurekonzentration innerhalb der Blätter bestimmt wurden, in derselben Größenordnung liegen, wie die für isolierte Membranen gemessenen. Außerdem konnte ein Vergleich der Flussraten auf der Ober- und Unterseite der Blätter zeigen, dass die stomatären Poren nicht direkt in den Leachingprozess involviert sind. N2 - In order to overcome the risk of withering, all primary, aerial plant parts are bordered against the atmosphere with a transpiration barrier membrane, the so called cuticle. It is mainly composed of the lipophilic compounds cutin and waxes and therefore ensure an essentially reduction of uncontrolled loss of water and water soluble metabolites from plant tissues. Nevertheless, the cuticle is partially permeable for water and solutes like organic and inorganic nutrients, pesticides or environmental chemicals, and the flow can occur in both directions. It is obvious, that the basic transport processes are important for the survival of plants, agricultural success or environmental pollution. Therefore, the knowledge of the meachanisms, underlying cuticular permeation, can improve the effectiveness of foliar applied nutrients and pesticides, in the way of modelling ideal active ingredients or additives to enhance cuticular uptake. In the present study aminio acids were used as model compounds to understand the influence of the physico-chemical properties of hydrophilic solutes on cuticular permeability. This is not only because of their structural similarity to foliar applied herbicides like glyphosate and glufosinate. Amino acids are water soluble with octanol/water partition coefficients always smaller than 1 and they carry charges. The resulting hydration of the molecules renders them insoluble in the waxy layer of the cuticle and therefore the actual role of the associated hydration shell for cuticular permeation is still questionable. In contrast to many active ingredients, which are ionised only under certain conditions, the continuous net charge of amino acids is modified by pH. This provides an insight into the effect of anionic, zwitterionic and cationic properties on cuticular permeability by using the same set of solutes. Furthermore, amino acids are frequently found on leaf surfaces where leaf associated microorganisms benefit from their nutritional significance. It is still controversial, if amino acids originate from airborne particles or from the underlying leaf tissue. The sorption of amino acids into isolated cuticular membranes was very low and cuticle/water partition coefficients were not correlated to octanol/water partition coefficients, as is true for lipophilic solutes. This proves the existence of two different mechanisms for cuticular penetration of lipophilic and hydrophilic solutes. Under a given condition, permeances were determined by the molar volume of the amino acids and the pathway was much longer than the membrane thickness, which indicates a hindered diffusion in a porous and tortuous environment. Permeances for water and amino acids were affected by pH but in different ways. The water permeance increased with increasing pH which can be explained by a higher water sorption caused by dissociation of weak acidic groups within the cuticle above pH 6. Due to the maximum swelling of the pathway at pH 11 amino acid permeances were highest for the anionic form. Surprisingly, permeances were lowest for the zwitterionic species at intermediate pH and not for the cationic amino acids at pH 1 where the least water sorption occurs. The reason becomes obvious, when - next to the molar volume of the amino acids - the hydration shell is taken into account. Since the zwitterionic species at pH 6 possess the biggest and the anionic amino acids the smallest hydration shells, overall permeances are well correlated with the hydrated molar volume. Thus, it was shown that the hydration shell plays an important role in cuticular permeability in the way that smaller hydration shells favour an increase in permeances, given that the molar volume of the “naked” molecule remain constant. One exception was found for the amino acid permeability of isolated rose cuticles at pH 1. The fact, that under this condition, permeances are partially controlled by octanol/water partition coefficient shows clearly, that the lipophilic and the hydrophilic pathway are not strictly separated from each other. Amino acids with large lipophilic side chains can also benefit from partitioning within the lipophilic phase of the cuticle. It is still a matter of debate, if permeation experiments with isolated cuticular membranes reflect the real situation in intact plants, because isolation processes could alter cuticular properties. To proof the authority of this set up, additional leaching experiments were performed with intact leafs. It was shown that permeances of intact cuticles, which were driven by the natural amino acid content in the leaf tissue, are in deed in the same order of magnitude as for isolated cuticular membranes, when liquid water was used as receiver. Furthermore, a comparison between fluxes from the upper and the lower leaf side showed that stomatal pores are not directly involved into the leaching process. KW - Permeation KW - Aminosäuren KW - Kutikula KW - Efeu KW - pH-Wert KW - Rose KW - Hydrathülle KW - Amino acids KW - aqueous pathways KW - hydration KW - permeability KW - plant cuticle Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-49954 ER - TY - JOUR A1 - Drechsler, Christiane A1 - Meinitzer, Andreas A1 - Pilz, Stefan A1 - Krane, Vera A1 - Tomaschitz, Andreas A1 - Ritz, Eberhard A1 - März, Winfried A1 - Wanner, Christoph T1 - Homoarginine, heart failure, and sudden cardiac death in haemodialysis patients JF - European Journal of Heart Failure N2 - Aims Sudden cardiac death (SCD) is a major contributor to the excess mortality of patients on maintenance dialysis. Homoarginine deficiency may lead to decreased nitric oxide availability and endothelial dysfunction. Based on this rationale we assessed whether homoarginine deficiency is a risk factor for SCD in dialysis patients. Methods and results This study examined the association of homoarginine with cardiovascular outcomes in 1255 diabetic haemodialysis patients from the German diabetes and dialysis study. During a median of 4 years of follow-up, hazard ratios (HR) (95% CI) for reaching the following pre-specified, adjudicated endpoints were determined: SCD, myocardial infarction, stroke, death due to heart failure, and combined cardiovascular events. There was a strong association of low homoarginine concentrations with the presence of congestive heart failure and left ventricular hypertrophy as well as increased levels of brain natriuretic peptide. Per unit decrease in homoarginine, the risk of SCD increased three-fold (HR 3.1, 95% CI 2.0–4.9), attenuating slightly in multivariate models (HR 2.4; 95% CI 1.5–3.9). Patients in the lowest homoarginine quintile experienced a more than two-fold increased risk of SCD, and more than three-fold increased risk of heart failure death than patients in the highest quintile, which accounted for the high incidence of combined cardiovascular events. Low homoarginine showed a trend towards increased risk of stroke, however, myocardial infarction was not meaningfully affected. Conclusion Low homoarginine is a strong risk factor for SCD and death due to heart failure in haemodialysis patients. Further studies are needed to elucidate the underlying mechanisms, offering the potential to develop new interventional strategies. KW - Homoarginine KW - Sudden cardiac death KW - Heart failure KW - Amino acids KW - Haemodialysis Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-140495 VL - 13 IS - 8 ER - TY - THES A1 - Almeling, Stefan T1 - The use of aerosol-based detection systems in the quality control of drug substances T1 - Die Verwendung von aerosol-basierten Detektionssystemen in der Qualitätskontrolle von Arneiwirkstoffen N2 - The work presented in this thesis was mainly targeted at exploring the capabilities of evaporation based LC detectors as well as further alternatives for the control of impurities in substances not exhibiting a suitable chromophore for UV-detection. In the course of the work carried out, several new methods for the identification, impurities control and composition testing of APIs were elaborated. An evaporation based detector that entered into the field of pharmaceutical analysis in the recent years was the Evaporative Light Scattering Detector (ELSD). However, non-reproducible spikes were reported when injecting concentrated test solutions as they are usually required for the control of impurities. The reasons, for the appearance of these spikes as well as possibilities for their avoidance were explored in a systematic study. Moreover, the dependence of the detector sensitivity on different eluent composition, eluent flow-rate and ELSD settings was investigated. In the course of the revision of the Ph.Eur. monographs for aspartic acid and alanine, a C18 reversed phase ion-pair LC method using 1 mmol/L of perfluoroheptanoic acid as an ion-pair reagent and a charged aerosol detector (CAD) was developed and fully validated for the purity control of Asp. The method was capable of separating the organic acids and major amino acids known to occur as process related impurities. With a slight modification, the method was also applicable for the purity control of Ala. Based on the developed LC-CAD method for the impurity control of alanine, a comparative study of the performance characteristics of different evaporation based LC detectors, i.e. ELSD, CAD and the recently developed Nano Quantity Analyte Detector (NQAD) was carried out. Additionally, an MS detector and qNMR were included in this study. It was found that the control of impurities in Alanine at an ICH conform level could be ensured using LC coupled to CAD, MSD and NQAD detection as well as by the use of qNMR. In terms of performance, prize and ease of use CAD and NQAD were found to be the most suitable alternatives. In terms of repeatability and sensitivity, the CAD appeared slightly superior to the NQAD. The quality of streptomycin sulfate is not sufficiently controlled by the current Ph.Eur. monograph in that an appropriate test for the control of the related substances is missing. A study was carried out to develop a C18 reversed phase ion-pair LC method using pentafluoropropionic acid as an ion-pair reagent and a CAD for the identification and control of the related substances. The developed method allowed the separation of 21 impurities from streptomycin. Moreover, coupling of the method to MS allowed the identification of the separated impurities. The method was shown to be sufficiently sensitive to control the related substances with a disregard limit of 0.1% as it is normally applied in the Ph.Eur. for products derived from fermentation. Currently, the aescin content of horse-chestnut standardized dry extract is determined using a complex and laborious photometric determination. A more selective LC-UV assay determination for beta-aescin has been proposed for the Ph.Eur. draft monograph of horse-chestnut standardized dry extract. Possibilities were explored to further improve the LC-method using detection by CAD. It was demonstrated that by the use of a modified LC-CAD method several problems related to the differences in the UV-response of the various components contained in the active aescin fraction could be eliminated. Moreover the proposed reference standard strategy was reviewed. Eventually, it was demonstrated on the example of two different clusters of pharmacologically active peptides how low energy collision induced dissociation mass spectrometry (low energy CID-MS) can successfully be used for identification testing in pharmacopoeial monographs. In this respect, the combination of a direct confirmation of the molecular mass via the m/z-ratio of the molecule ions with structural sequence information obtained by low energy CID-MS experiments was found to deliver a higher degree of certainty of the identity of a given substance than the set of tests currently described in the monographs. A significant gain in efficiency and throughput and important reduction of the amount of sample consumed during testing were identified as being additional advantages of this approach. Taken together, it could be demonstrated on various examples how recent technological advancements in the field of analytical chemistry can contribute to improve the quality control of APIs. N2 - Die durchgeführten Arbeiten hatten zum Ziel, das Potential von evaporationsbasierten HPLC-Detektoren sowie weiterer moderner Techniken hinsichtlich ihrer Eignung zur Reinheitsprüfung von pharmazeutischen Wirkstoffen zu untersuchen. Im Zuge der Arbeiten wurden verschiedene neue Methoden zur Identifizierung, Verunreinigungskontrolle und zur Überprüfung der Zusammensetzung von pharmazeutischen Wirkstoffen entwickelt. Ein evaporationsbasierter Detektor, der in den letzten Jahren Einzug in die pharmazeutische Analytik gehalten hat, ist der Lichtstreudetektor (ELSD). Allerdings wurde berichtet, dass es im Zusammenhang mit der Injektion konzentrierter Testlösungen zum Auftreten nicht reproduzierbarer Spikes kam. In einer systematischen Studie wurden die Gründe hierfür ermittelt und gleichzeitig Möglichkeiten ihrer Vermeidung aufgezeigt. Darüber hinaus wurde die Abhängigkeit der Empfindlichkeit des Detektors von der Zusammensetzung der mobilen Phase, der LC-Flußrate und den Einstellungen des ELSD untersucht. Im Zuge der Revision der Monografien für Asparaginsäure und Alanin wurde eine C18-Ionenpaar-HPLC-Methode unter Verwendung von 1 mmol/L Perfluorheptansäure und Detektion mittels eines geladenen Sprühnebeldetektors (Charged Aerosol Detector – CAD) für die Reinheitskontrolle von Asparaginsäure entwickelt und validiert. Mit Hilfe dieser Methode konnten sowohl organische Säuren als auch die wesentlichen Aminosäuren, die als prozessrelevante Verunreinigungen bekannt sind, abgetrennt werden. Nach geringfügiger Modifikation konnte diese Methode auch zur Reiheitskontrolle von Alanin eingesetzt werden. Basierend auf der HPLC-CAD-Methode für Alanin wurde eine vergleichende Studie der Leistungsfähigkeit verschiedener evaporationsbasierter HPLC-Detektoren durch-geführt. Untersucht wurden der ELSD, der CAD und der kürzlich entwickelte „Nano Quantity Analyte Detektor“ (NQAD). Weiterhin wurden ein massenspektrometrischer Detektor (MSD) sowie die Quantifizierung mittels NMR-Spektroskopie (qNMR) in die Untersuchung einbezogen. Im Ergebnis war die Reinheitskontrolle von Alanin auf einem ICH konformen Niveau unter Verwendung des CAD, NQAD und MSD sowie mittels qNMR möglich. Hinsichtlich der Kriterien Leistungsfähigkeit, Preis und Benutzerfreundlichkeit waren der CAD und der NQAD die geeignetsten Alternativen. Bezüglich Wiederholbarkeit und Empfindlichkeit war der CAD dem NQAD leicht überlegen. Die Qualität von Streptomycinsulfat wird von der aktuellen Arzneibuchmonografie mangels eines geeigneten Reinheitstests nicht ausreichend kontrolliert. Aus diesem Grund wurde eine C18-Ionenpaar-HPLC-Methode unter Verwendung von Perfluorpropionsäure und Detektion mittels CAD zur Identifizierung und Kontrolle der Verunreinigungen entwickelt. Mit dieser Methode konnten 21 Verunreinigungen von Streptomycin abgetrennt und nach massenspektormetrischer Kopplung identifiziert werden. Die Methode erwies sich als ausreichend empfindlich, um Verunreinigungen mit einer Ausschlussgrenze von 0.1%, wie sie im Europäischen Arzneibuch für Fermentationsprodukte üblicherweise angewandt wird, zu kontrollieren. Derzeit wird der Aescingehalt in standardisiertem Rosskastanien-Trockenextrakt mittels einer komplexen photometrischen Methode bestimmt. Für den entsprechen-den Entwurf einer Monografie des Europäischen Arzneibuchs wurde eine selektivere HPLC-UV-Methode vorgeschlagen. Die Möglichkeiten einer weiteren Verbesserung dieser Methode unter Verwendung des CAD wurden untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass eine modifizierte HPLC-CAD-Methode geeignet ist, Probleme, die sich aus der unterschiedlichen UV-Absorption der im Aescingemisch enthaltenen Substanzen ergeben, zu eliminieren. Weiterhin wurde die vorgeschlagene Referenzstandard Strategie überprüft. Abschließend wurde am Beispiel von zwei Gruppen pharmakologisch wirksamer Peptide nachgewiesen, wie kollisionsinduzierte Massenspektrometrie (CID-MS) erfolgreich für die Identitätskontrolle in Arzneibuchmongrafien eingesetzt werden kann. Diesbezüglich erbrachte die Kombination der direkten Massenbestätigung mittels des m/z-Verhältnisses des Molekül-Ions mit den aus dem CID-MS-Experiment erhaltenen Informationen ein höheres Maß an Gewissheit hinsichtlich der Identitätsbestätigung als die derzeit beschriebenen Tests. Als weitere Vorteile dieses Ansatzes wurden ein wesentlicher Effizienzgewinn sowie eine erhebliche Reduktion des durch die Testung verbrauchten Probenmaterials identifiziert. Zusammenfassend zeigen die Arbeiten an verschiedenen Beispielen, wie aktuelle Entwicklungen im Bereich der analytischen Chemie dazu beitragen können, die Qualitätskontrolle von Arzneimittelwirkstoffen zu verbessern. KW - Elektronensprayionisations-Massenspektrometrie KW - Qualitätskontrolle KW - Arzneimittel KW - Reinheitsanalytik KW - evaporationsbasierte Detektoren KW - Charged Aerosol Detektion KW - Streptomycin KW - Aminosäuren KW - Aescin KW - HPLC KW - Europäsches Arzneibuch KW - Purity control KW - evaporation based detectors KW - charged aerosol detector KW - Streptomycin KW - Amino acids KW - Aescin Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-64722 ER - TY - THES A1 - Wahl, Oliver T1 - Impurity Profiling of Challenging Active Pharmaceutical Ingredients without Chromophore T1 - Erstellen von Verunreinigungsprofilen von anspruchsvollen Wirkstoffen ohne Chromophor N2 - The impurity profiling of pharmaceutical ingredients can oppose many challenges. The best part of active pharmaceutical ingredients (APIs) and the related substances are detectable by UV detection, a very common detection principle. However, if an API lacks a suitable chromophore other means of detection are necessary. The corona charged aerosol detector (CAD) is a detector capable of detecting substances independent of their chemical structure. This “universal” detector has only one limitation: The analyte has to have a sufficiently low vapor pressure. Another important challenge that comes often together with the lack of a chromophore concerns the separation. These substances (e.g. most amino acids and derivatives) often contain structures that make them difficult to retain on conventional reversed phase columns. Possible solutions to overcome these challenges, like the application of the CAD and the benefit of so-called mixed-mode stationary phases in impurity profiling for pharmacopoeial purposes were explored in this work. The related substances analyzed in this thesis comprise amino acids, inorganic ions, bisphosphonic acids, basic and acidic derivatives of amino acids (esters and amides). The successful development and validation of mixed-mode liquid chromatography methods with CAD detection for carbocisteine and ibandronate sodium might help to increase the acceptance of this versatile detector in the pharmaceutical industry and in official authorities dealing with the determination of related substances. The combination of UV and CAD detection proved very useful during the analysis of Bicisate. Most of the related substances and some unidentified impurities were detectable by CAD whereas a synthesis by-product, a semi-volatile ester, was only detectable in the UV trace. The simple combination covers all relevant impurities in a single analysis. Two truly orthogonal methods regarding separation and detection for the enantiomeric purity of magnesium-L-aspartate helped to find the reason for elevated D aspartic acid content in the drug substance. A very quick and sensitive indirect separation using the OPA derivatization with NAC was developed as a powerful screening tool, whereas the direct separation of D- and L-CBQCA-Asp derivatives confirmed the results. Both methods were optimized in order to do without substances mentioned on the REACH list, like sodium tetraborate which is very frequently applied in standard derivatization protocols and CE separations. The importance of orthogonal detection principles in the determination of related substances of amino acids was discussed in a review article dealing with the revision of amino acid monographs in the Ph. Eur.. N2 - Die Reinheitsprüfung pharmazeutischer Wirkstoffe kann den Analytiker vor verschiedene Hürden stellen. So gilt für den größten Teil pharmazeutischer Wirkstoffe und deren verwandte Substanzen, dass sie mit Hilfe des weit verbreiteten UV-Detektors nachweisbar sind. Verfügt ein Wirkstoff hingegen nicht über ein geeignetes Chromophor, so benötigt man andere Möglichkeiten der Detektion. Der corona charged aerosol detector (CAD) ist in der Lage Substanzen unabhängig von ihrer chemischen Struktur zu detektieren, vorausgesetzt, sie sind schwerflüchtig. Eine weitere Herausforderung, die häufig mit dem Fehlen eines Chromophors einhergeht betrifft die Trennung. Verbindungen dieser Art (z.B. die meisten Aminosäuren und deren Derivate) enthalten häufig Strukturen, die eine Trennung auf konventionellen Umkehrphasen erschweren. Mögliche Ansätze um die genannten Herausforderungen zu meistern, wie zum Beispiel die Verwendung des CAD und sogenannter mixed-mode Phasen in der pharmazeutischen Reinheitsanalytik wurden erarbeitet und an konkreten Anwendungen erprobt. Die in dieser Arbeit bestimmten verwandten Substanzen sind vor allem Aminosäuren, anorganische Ionen, Bisphosphonate sowie basische und saure Derivate von Aminosäuren (Ester und Amide). Die erfolgreiche Entwicklung und Validierung von mixed-mode flüssig-chromatographischer Methoden kombiniert mit CAD für Carbocistein und Ibandronat Natrium könnte dabei helfen die Akzeptanz in der Pharmazeutischen Industrie und bei den für Reinheitsprüfungen zuständigen Behörden für diesen vielseitigen Detektor zu verbessern. Die Kombination von UV-Detektion und CAD erwies sich bei der Analyse von Bicisate als sehr nützlich. Die meisten verwandten Substanzen und einige unbekannte Verunreinigungen konnten mittels CAD detektiert werden, während ein Nebenprodukt der Synthese, ein halb-flüchtiger Ester, nur mit Hilfe des UV Detektors sichtbar war. Die Kombination zweier Detektionstechniken ermöglichte die Bestimmung aller relevanten Verunreinigungen in einer einzigen Analyse. Die Bestimmung der optischen Reinheit von Magnesium-L-Aspartat gelang mittels zweier orthogonaler Methoden und der Grund für das Auftreten von erhöhten Konzentrationen an D-Aspartat wurde gefunden. Eine schnelle indirekte Bestimmung der OPA/NAC-Derivate eignete sich als Screening-tool, während die direkte Trennung der enantiomeren CBQCA-Derivate die Ergebnisse bestätigte. Beide Methoden wurden im Hinblick darauf optimiert, dass sie ohne Substanzen wie Natriumtetraborat, eine Substanz auf der REACH Liste für besonders besorgniserregende Substanzen, sowie gebräuchlicher Puffer bei Derivatisierungsreaktionen und CZE Trennungen, auskamen. Die Bedeutung von orthogonalen Detektionstechniken bei der Bestimmung der verwandten Substanzen von Aminosäuren wurde in einem Übersichtsartikel, der in Zusammenhang mit der Revision von Aminosäuren Monographien des Europäischen Arzneibuches steht, diskutiert. KW - Chromatographie KW - Verunreinigung KW - Impurity Profiling KW - Amino acids KW - Corona charged aerosol detector KW - Aminosäuren Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-137205 ER - TY - THES A1 - Unger, Nina T1 - Stability of Tryptophan in Parenteral Amino Acid Solutions: Identification of Degradation Products and Development of HPLC Analysis Methods T1 - Stabilität von Tryptophan in parenteralen Aminosäure-Lösungen: Identifizierung von Abbauprodukten und Entwicklung von analytischen HPLC Methoden N2 - The stability of Trp in pure solutions and in parenteral AA formulations was evaluated with regard to typically used manufacturing processes, storage conditions and primary packaging. Therefore, thorough stability studies on Trp solutions were conducted beforehand. The applied stressing method, i.e. steam sterilization by autoclave, are chemically seen relatively mild but showed to be efficient to induce Trp degradation in the presence of oxygen. Subsequent identification, separation and characterization were challenging due to similar substance properties, numerous stereoisomers and pairs of diastereomers found amongst them. However, the identified o-aminoacetophenone compounds, Kyn and NFK, are associated with photo reactivity and have photo-oxidizing properties. Thus, best possible protection from UV-light, together with strict oxygen expulsion, are the most important criteria to impede Trp degradation after autoclaving. The identification of Trp degradation products was assisted by the compilation of a substance library, which included manifold reported and chemically plausible Trp degradation substances. The substances were classified for priority and their early or late-stage occurrence. The large number of possible substances and stereoisomers was narrowed down with the information retrieved from LC-UV/MS experiments. However, final identification was achieved by the synthesis of proposed substances as references. The following eight substances were characterized as Trp degradation substances: Kyn, NFK and three pairs of diastereomers R,R/R,S DiOia, R,R/R,S Oia and cis/trans PIC. Fig. 33 shows the proposed degradation pathway and demonstrates the close chemical relationship, which may be an explanation for the conversion of some substances into each other during the storage period. The proposed pathway brings together the results of different Trp stability and stressing studies, respectively [89, 94, 97, 98, 103, 133]. To our knowledge, the simultaneous formation of the identified degradation substances has not been reported before and especially not under the stressing conditions applied. The application of a traditional RP-HPLC method was compared to two developed IP-HPLC methods and a RP-HPLC methods using a modified perfluorinated column. Orthogonal analyses methods and especially the combination of UV and MS detection are necessary in order to indicate potentially undetected degradation substances. Main evaluation criteria were the separation performance, analyses time, reproducibility and feasibility. The best results upon assessment of all Trp degradation products, in both; pure Trp solutions and pharmaceutical formulations, were obtained by a traditional RP-HPLC. The optimized method was validated according to ICH guidelines Q2(R1) and meets the criteria of a stability-indicating HPLC-UV method. The validated method has a sufficient separation performance with an adequate selectivity indicating the Trp degradation substances next to each other and next to other AAs in finished pharmaceutical formulations. The detailed knowledge of Trp degradation and the method presented may be transferred practically to the pharmaceutical industry processing Trp-containing products. In general, the findings might contribute to the quality management of such pharmaceutical products during manufacturing and storage. Additionally, the study results provide basic information for the establishment of an impurity consideration following the ICH guidelines Q3B (R2) (impurities in new drug products) for products containing Trp. However, further development of the method applying more sophisticated detectors or more potent HPLC techniques like e.g. UHPLC and the implication of more sensitive (MS) detectors like ToF-MS would be advantageous with regard to economic and practical aspects. N2 - Diese Arbeit dient der Stabilitätsbeurteilung von Tryptophan (Trp) in parenteralen Aminosäurelösungen, insbesondere im Hinblick auf Einflussfaktoren wie der Herstellungsprozess, z.B. der Sterilisationsvorgang, Lagerungsbedingungen, sowie die Art der verwendeten Primärverpackung. Zunächst wurde die Stabilität von reinen Trp-Lösungen untersucht, die mehreren aufeinanderfolgenden Sterilisationszyklen im Autoklav ausgesetzt wurden. Generell stellt der Autoklavierprozess eine Vergleichsweise milde und kontrollierte Art der Hitzebelastung dar. Dabei wurde zwischen Lösungen unterschieden, die Sauerstoff enthielten und Lösungen, in denen der gelöste Sauerstoff mittels Stickstoffgas ausgetrieben wurde und die anschließend luftdicht verschlossen wurden. Es konnte festgestellt werden, dass der Autoklavierprozess, in Anwesenheit von Sauerstoff, zu einem Abbau von Trp führt, welcher sich außerdem auch durch eine Gelbfärbung der Lösungen zeigt. Die Identifizierung und Charakterisierung der Abbauprodukte erwies sich als schwierig aufgrund von sehr ähnlichen Substanzen, die eine Trennung mittels HPLC und die UV-Detektion alleine erschwerten. Die Massenspektroskopie zeigte erst, dass einige Abbauprodukte zeitgleich eluieren und einige isomere Formen vorliegen. Mithilfe von preparativer HPLC und Fragmentierung in der Ionenfalle konnten drei Diastereomeren-Paare gefunden werden, R,R/R,S Oia und DiOia, cis/trans PIC und zwei weitere Substanzen, Kyn und NFK. Die beiden letztgenannten Stoffe haben eine Sonderstellung, denn sie besitzen jeweils ein o-Aminoacetophenon-Grundgerüst anstelle des Indols, und absorbieren dadurch zusätzlich bei Wellenlängen von > 320 nm, und wirken photosensibilisierend, wodurch die Stabilität von Trp (unter Lichteinstrahlung) zusätzlich nachteilig beeinflusst wird. Daraus lässt sich ableiten, dass der Abbau von Trp in Lösungen maßgeblich durch strengen Sauerstoff- und Lichtausschluss verhindert werden kann. Die Abbildung Fig. 33 zeigt schematisch, wie die einzelnen Abbauprodukte möglicherweise entstehen und zusammenhängen könnten. Die Aufstellung der chemischen Zusammenhänge beruht auf den Ergebnissen verschiedener Trp-Stabilitätsstudien und bringt diese auf einen Nenner [89, 94, 97, 98, 103, 133]. Soweit durch die Literaturrecherche bekannt, wurde das zeitgleiche Auftreten aller hier identifizierten Abbauprodukte bislang noch nicht dokumentiert. Insbesondere wurden keine Studien über Stabilitätsprobleme, bedingt durch die Wasserdampf- Sterilisation gefunden. Des Weiteren zeigten die quantitativen Untersuchungen von Lösungen, die eine Woche, ein und drei Jahre (nach einmaligem Autoklavieren) eingelagert wurden, dass die Abbauprodukte nicht linear entstehen und zunehmen, sondern, dass sich deren prozentuale Anteile dynamisch verändern (Kapitel 3.2.). Für die Identifizierung der Abbauprodukte von Trp war die Zusammenstellung einer Substanz- Bibliothek äußerst hilfreich. Sie beinhaltet chemisch plausible Trp-Abbauprodukte, sowie aus der Literatur bekannte Abbauprodukte, die durch verschiedenste Stressmethoden hervorgerufen werden. Diese Substanzen wurden nach Plausibilität und Priorität kategorisiert, um ein gezieltes Screening in gestressten (autoklavierten) Trp-Lösungen durchzuführen. Zusammen mit den Ergebnissen der LC-UV/MS Analyse konnte die Auswahl auf einige wenige Abbauprodukte begrenzt werden. Da es sich dabei um Isomere handelte, gelang die Identifizierung letztendlich erst durch die Synthese der in Frage kommenden Stoffe. Mithilfe der Synthese der Referenzsubstanzen konnte eine HPLC-UV Methode entwickelt, optimiert und nach den ICH Q2(R1) Richtlinien validiert werden, die eine Quantifizierung der Substanzen in reinen Trp-, und in handelsüblichen parenteralen Aminosäurelösungen ermöglicht. Für die validierte Methode wurde als stationäre Phase eine herkömmliche C18- Säule verwendet. Zu Vergleichszwecken wurde eine Methode auf einer Pentafluorophenyl (PFP)-Säule entwickelt und optimiert (Method D 1 und D 2), sowie zwei RP-Methoden mit zwei analogen Ionen-Paar-Reagenzien (Method B und C). Verglichen und beurteilt wurden dabei die Trennleistungen, Analysendauer, Reproduzierbarkeit und die praktische Anwendbarkeit der jeweiligen Methoden. Die besten Ergebnisse wurden aber mittels der traditionellen RP-HPLC erreicht. Die Ergebnisse könnten für die Herstellung, Lagerung und Beurteilung von Trp-haltigen Lösungen durchaus relevant sein. Eine strenge Kontrolle der Sauerstoffwerte sowie ein kontinuierlicher Lichtschutz während und nach der Verarbeitung sind unverzichtbar. Die Ergebnisse erlauben außerdem ein gezieltes Screening nach Abbauprodukten, bzw. „Markern“. Die Erstellung von Beurteilungen, wie es z.B in den ICH Q3B(R2) Richtlinien gefordert ist, wird erleichtert, da die Identität bestimmt wurde und eine validierte Quantifizierungsmethode entwickelt wurde. Die Methode könnte für industrielle Zwecke noch weiter optimiert werden, indem z.B. eine UHPLC entwickelt wird oder sensiblere Detektoren, wie z.B. ein ToF- Massendetektor, verwendet werden. Letztendlich sollte allerdings von der Arzneibuchmethode abgegrenzt werden, die Verunreinigungen aus dem Trp-Herstellungsprozess erfasst (1,1´ Ethyliden(bis)Trp). Die hier entwickelte Methode erfasst die Abbauprodukte von Trp in reinen Trp und in Trp-haltigen Aminosäurelösungen, die typischerweise durch Fehler bei der Herstellung oder den Autoklavierprozess hervorgerufen werden können. KW - Stabilität KW - Stability KW - Parenteral KW - Amino acids KW - Aminosäuren KW - Tryptophan KW - HPLC Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-199825 ER -