TY - JOUR A1 - Scheer, Ulrich T1 - Das Chromatin : seine Struktur und Funktion N2 - no abstract available KW - Chromatin Y1 - 1986 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-80790 ER - TY - THES A1 - Körner, Ulrich T1 - Funktionelle Rolle von HMGN-Proteinen während der Embryonalentwicklung von Xenopus laevis T1 - The functional role of the HMGN proteins during embryogenesis of Xenopus laevis N2 - HMGN Proteine sind Architekturelemente des Chromatins und besitzen die Fähigkeit, Chromatin aufzulockern. Sie ermöglichen anderen Proteinen den Zugang zu Nukleosomen und unterstützen DNA-abhängige Prozesse wie Replikation, Transkription und DNA-Reparatur. In dieser Arbeit wurde die funktionelle Rolle der HMGN Proteine während der Embryogenese am Beispiel des südafrikanischen Krallenfroschs Xenopus laevis untersucht. Dabei wurde entdeckt, dass sowohl die Expression als auch die zelluläre Verteilung der HMGN Proteine entwicklungsspezifisch reguliert ist. Eine Manipulation der HMGN Proteinmengen während der Embryonalentwicklung führte zu schweren Fehlentwicklungen in Postblastula Embryonen. In der Oogenese waren sowohl Xenopus HMGN mRNAs als auch Xenopus HMGN Proteine in allen Oozytenstadien nachweisbar. Interessanterweise waren HMGN Proteine in späteren Oozytenstadien nur im Zytoplasma zu finden und nicht mit Lampenbürstenchromosomen assoziiert. Im Zuge der Maturation der Oozyten zu Eiern verschwinden die Proteine gänzlich. Während der Embryogenese waren HMGN Proteine dann erst wieder ab der Blastula detektierbar, zeitgleich mit der transkriptionellen Aktivierung des embryonalen Genoms. Gleichzeitig wiesen ihre Expressionsmuster, zumindest auf mRNA-Ebene, auf Gewebspezifität hin. Whole mount in situ-Hybridisierungen und RT-PCR-Analysen zeigten eine erhöhte mRNA-Menge in mesodermalen und neuroektodermalen Geweben von Schwanzknospenstadien. Nach Injektion rekombinanter HMGN Proteine (Überexpression) oder Morpholino-Antisense-Oligonukleotiden (knock-down) in die Zygote entwickelten sich Embryonen mit offenen Rücken, stark verkürzten und gebogenen Körperachsen und deformierten Kopfstrukturen als Hauptmerkmale. Histologische Analysen und insbesondere die Magnetresonanz Bildgebung deuteten auf Fehler in der Mesodermdifferenzierung hin. Die Analysen zeigen, dass eine bestimmte kritische zelluläre HMGN Proteinmenge für eine korrekte Embryonalentwicklung von Xenopus laevis notwendig ist. Durch „animal cap assays“ und RT-PCR-Expressionsanalysen Mesoderm-spezifischer Gene konnte schließlich gezeigt werden, dass HMGN Proteine die Regulation Mesoderm-spezifischer Gene beeinflussen. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass auch die HMGN-Genexpression während der Mesodermdifferenzierung reguliert wird. Durch eine Analyse des Expressionsbeginns entwicklungsrelevanter Gene während der Midblastula Transition konnte gezeigt werden, dass veränderte HMGN Proteinmengen den Expressionsbeginn spezifischer Gene wie Xbra und chordin beeinflussen. Damit konnte zum ersten Mal ein Einfluss dieser ubiquitären Chromatinproteine auf die Expression spezifischer Gene gefunden werden. Die durch HMGN Proteine verursachte fehlerhafte Expression von Xbra und chordin als Schlüsselgene der Mesodermdifferenzierung kann die Fehlentwicklungen mesodermaler Strukturen erklären. N2 - HMGN proteins are architectural chromatin proteins that reduce the compaction of the chromatin fiber, facilitate access to nucleosomes and modulate DNA-dependent processes such as replication, transcription and DNA repair. In this work the functional role of the HMGN proteins during embryogenesis was analyzed using the African clawed frog Xenopus laevis as a model system. The expression and cellular location of the HMGN proteins was found to be developmentally regulated. Experimental manipulations of the HMGN protein amounts led to gross developmental defects in postblastula embryos. HMGN transcripts and proteins were present throughout oogenesis. Interestingly, the HMGN proteins were stored in the cytoplasm of later oocyte stages and excluded from the oocytes nuclei and lampbrush chromosomes. Upon maturation of oocytes into eggs, HMGN proteins were no longer detectable. During embryogenesis, HMGN proteins were first detected in blastula stage embryos, coinciding with the transcriptional activation of the embryonic genome. At least at the mRNA level the expression pattern showed a tissue specific pattern, with relatively high levels of mRNAs in the mesodermal and neuroectodermal regions of early tailbud embryos as shown by whole mount in-situ hybridization and RT-PCR-analyses. After microinjection of recombinant HMGN proteins (overexpression) or morpholino-antisense oligonucleotides (knock-down) the embryos displayed typical phenotypes with imperfect closure of the blastopore, distorted body axis and abnormal head structures. Histological analyses and magnetic resonance imaging indicated that mesoderm differentiation was particularly affected by aberrant HMGN protein levels. The results demonstrate that proper embryonic development of Xenopus laevis requires precisely regulated levels of HMGN proteins. “Animal cap assays” and RT-PCR-analyses of the expression of mesodermal genes indicated that HMGN proteins are involved in the regulation of mesoderm specific genes. These experiments also indicated that the HMGN expression itself is regulated during mesoderm differentiation. Moreover, by studying the expression pattern of developmentally relevant genes during midblastula transition it became evident that altered HMGN protein levels influence the onset of the expression of specific genes such as Xbra and chordin. The results show, for the first time, that these ubiquitous chromatin proteins modulate the expression of specific genes. The HMGN-induced misexpression of Xbra and chordin as key regulatory genes during mesoderm differentiation may explain the observed malformations of mesodermal structures. KW - Glatter Krallenfrosch KW - HMG-Proteine KW - Genexpression KW - Embryonalentwicklung KW - HMGN Proteine KW - Xenopus laevis KW - Genexpression KW - Chromatin KW - Embryonalentwicklung KW - HMGN proteins KW - Xenopus laevis KW - chromatin KW - gene expression KW - early development Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-9166 ER - TY - THES A1 - Schütz, Monika T1 - Dynamik und Funktion der HMG-Proteine T1 - Dynamics and Function of HMG-proteins N2 - HMG-Proteine sind Architekturelemente des Chromatins und regulieren durch ihre Bindung an das Chromatin auf verschiedene Weise DNA-abhängige Prozesse wie Replikation, Transkription und DNA-Reparatur. Um zu verstehen, wie HMG-Proteine ihre vielfältigen Funktionen erfüllen können, wurde mit Hilfe von EGFP- und DsRed2-Fusionsproteinen ihre Funktion in vivo untersucht. Im Wesentlichen wurde dabei mit Hilfe von Bleichtechniken ihr dynamisches Verhalten charakterisiert. Daneben wurde für die HMGN-Proteine ihr bislang unbekanntes Expressionsverhalten in Tumorzellen bestimmt. So konnte für die HMGN-Proteine gezeigt werden, dass bestimmte Tumorzelllinien (HT-29, FTC-133, MCF-7, RPMI 8226, 697, Ishikawa, LNCap) eine relativ erhöhte Expression von HMGN2 aufweisen, die mit der Tumordifferenzierung korreliert. Eine relativ verringerte Expression von HMGN1 steht dagegen in Mammakarzinomen und Non-Hodgkin-Lymphomen in direktem Zusammenhang mit der Aggressivität der Tumore. Somit kann die HMGN-Expression bei diesen Tumoren als diagnostischer Marker verwendet werden. FRAP-Analysen mit EGFP-Fusionsproteinen führten zu der Erkenntnis, dass HMGN1, HMGN2, HMGA1a, HMGA1b und HMGB1 sich sehr schnell durch den Zellkern bewegen und nur transient an das Chromatin gebunden sind. Es konnte gezeigt werden, dass die spezifischen DNA/Chromatin-Bindungsmotive im Wesentlichen entscheiden, wo die Bindung der HMG-Proteine in vivo erfolgt, ihre Verweildauer im Euchromatin, Heterochromatin und zellzyklusabhängig dann aber durch Modifikationen (Phosphorylierungen, Acetylierungen) reguliert wird. Dies wurde beispielhaft durch punktmutierte und deletierte Fusionsproteine, sowie durch Inkubation der Zellen mit spezifischen Drogen für die HMGA1a-Proteine gezeigt. FRAP-Analysen haben außerdem gezeigt, dass die Spleißvarianten hHMGA1a und hHMGA1b unterschiedliche kinetische Parameter besitzen. Dies zeigt, dass beiden Varianten unterschiedliche Funktionen zugesprochen werden können. Die gefundenen spezifischen, transienten Verweildauern der einzelnen HMG-Proteine führen zu einem Modell eines dynamischen Chromatin-Netzwerkes, wobei alle HMG-Proteine in Wechselwirkungen innerhalb eines dynamischen Chromatinprotein-Cocktails DNA-abhängige Prozesse regulieren können. Die jeweiligen, wie hier gezeigt, durch Modifikationen regulierten Verweildauern der HMG-Proteine bestimmen darüber, welche anderen Chromatinproteine wie lange am Chromatin verbleiben und bestimmte Funktionen, wie beispielsweise die Modifikation der Core-Histone, übernehmen können. Die dynamischen Parameter einzelner HMG-Proteine erklären so, wie diese Proteine ihre vielfältigen Funktionen als Architekturelemente und bei der Regulation DNA-abhängiger Prozesse erfüllen können. Einige Vertreter, wie die HMGB1-Proteine, bewegen sich so schnell durch den Zellkern, dass ihre kinetischen Parameter durch das beschränkte zeitliche Auflösungsvermögen konfokaler Mikroskope der älteren Generation nicht erfassbar sind. Die Bestimmung von Dosis-Wirkungs-Beziehungen von Drogen, welche die kinetischen Parameter von HMGB1-Proteinen beeinflussen können, ist inzwischen mit Mikroskopen der neuen Generation möglich. Im Verlaufe der Arbeit zeigte sich, dass andere verwendete Fluorophore wie DsRed2 die kinetischen Eigenschaften von HMG-Fusionsproteinen beeinflussen können. Durch eine erhöhte Verweildauer können auch sehr transiente Interaktionen sichtbar gemacht werden. Wie gezeigt wurde, kann eine erhöhte Verweildauer aber auch zur Verdrängung anderer Proteine führen, die die gleichen Bindungsstellen benutzen und so eine Modulation des Chromatins bewirken. Die Nutzung von DsRed-Fluorophoren ermöglicht interessante neue Erkenntnisse. Diese müssen aber stets vor dem Hintergrund eines veränderten dynamischen Verhaltens der Fusionsproteine interpretiert werden. Zusammengenommen liefern die hier vorgestellten Ergebnisse zur Dynamik der HMG-Proteine grundlegende Informationen, die zur Klärung ihrer Funktion bei Chromatinmodulationen, etwa bei Differenzierungsprozessen oder der Entstehung von Tumorzellen entscheidend beitragen. Die Erkenntnis, dass diese Proteine lediglich transiente Interaktionen mit ihren Bindungspartnern eingehen können, sind im Hinblick auf die Behandlung von Tumoren, bei denen HMG-Proteine im Vergleich zu Normalgewebe häufig überexprimiert sind, von großer Bedeutung. N2 - HMG proteins are architectural chromatin proteins that regulate different DNA dependent processes such as replication, transcription and DNA repair. To understand how HMG proteins manage to fulfill their multiple functions they were investigated in vivo with the help of EGFP and DsRed2 fusion proteins. Using photobleaching techniques their dynamic properties were characterized in detail. Furthermore, the expression pattern of HMGN proteins in tumor cell lines was investigated for the first time. As presented in this thesis, it was found that HMGN2 proteins exhibited an elevated expression level in some tumor cells (HT-29, FTC-133, MCF-7, RPMI 8226, 697, Ishikawa, LNCap) correlating with the tumor differentiation status. In contrast a reduced expression of HMGN1 found in Mammacarcinoma and Non-Hodgkin-Lymphoma correlated with tumor aggressiveness. Therefore the analyses of HMGN expression may be a suitable diagnostic marker at least in the tumors investigated. FRAP analyses with cells expressing EGFP fusion proteins revealed that HMGN1, HMGN2, HMGA1a, HMGA1b and HMGB1 move very rapidly through the cell nucleus and only bind transiently to chromatin. It was demonstrated that the decision where HMG proteins bind in vivo is essentially mediated by their specific DNA binding motifs. However, the individual residence times in eu- or heterochromatin and chromosomes are regulated by protein modifications (phosphorylation, acetylation). This has been demonstrated using point mutated and truncated HMGA fusion proteins and by the application of specific drugs as well. FRAP analyses also indicated that the splice variants HMGA1a and HMGA1b exhibit different kinetic properties. This supports the view that both variants have different functions. The kinetic parameters characteristic for each HMG protein lead to a model of a dynamic chromatin network in which all HMG proteins are able to regulate DNA dependent processes via multiple interactions with other proteins as components of a cocktail of dynamic chromatin proteins. In this model, individual residence times of all HMG proteins which are regulated by secondary modifications would determine how long other chromatin modulating proteins could reside on chromatin. Therefore the dynamic parameters of the HMG proteins directly affect the capability of other proteins to modulate chromatin structure, e.g. by modifications of core histones. This explains the multiple functions of HMG proteins in chromatin packaging and function. The kinetic parameters of some rapidly moving members of the HMG protein family, such as HMGB1, are beyond the time resolution capacities of most confocal microscopes. However, novel setups of modern confocal microscopes are now capable to determine the dynamic parameters of HMGB proteins and allow investigations of drug induced effects on HMGB dynamics. Control experiments revealed that other fluorophors such as DsRed2 modulate the dynamic parameters of HMG fusion proteins. Due to an increased residence time of HMG DsRed2 fusion proteins it is possible to monitor even very transient interactions. Moreover, it could be observed that this increased residence time may interfere with binding of other proteins (i.e. proteins which occupy the same binding sites) leading to a reorganization of chromatin. Thus, fusion proteins with DsRed fluorophores may be used as helpful tools to investigate protein functions. However, results should always be considered against the background of DsRed modulated kinetics and thus they should be interpreted very carefully. Taken together the results presented in this thesis provide novel information about the dynamic behaviour of HMG proteins which is crucial to understand how chromatin is modulated during differentiation processes or development of neoplasia. Their transient interactions with DNA or other proteins and the fact that overexpression correlates with tumor progression might be relevant for the development of novel strategies for tumor treatment. KW - HMG-Proteine KW - Chromatin KW - Genexpression KW - Tumor KW - HMG KW - Dynamik KW - Chromatin KW - EGFP KW - Tumorinstabilität KW - HMG KW - Dynamics KW - Chromatin KW - EGFP KW - Tumorinstability Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-15627 ER - TY - THES A1 - Vogel, Benjamin T1 - Organisation von Chromatin durch HMGA1 Proteine T1 - Organisation of chromatin through HMGA1 proteins N2 - HMGA1 Proteine sind kleine, basische, Nicht-Histon Proteine, die in Lösung keine Struktur aufweisen, durch drei AT-Haken, als DNA-Bindungsmotive, gekennzeichnet sind und präferentiell an die kleine Furche der DNA binden. Als differenziell exprimierte Architekturelemente des Chromatins erfüllen sie wichtige Funktionen bei der Regulation DNA abhängiger Prozesse in Zellen und während Entwicklungsprozessen. Aberrante Expressionen führen zu Entwicklungsdefekten und Krebs. In dieser Arbeit wurde der Einfluss von HMGA1 Proteinen auf die Organisation des Chromatins untersucht. Als Modell diente dabei zunächst die Differenzierung von C2C12 Muskelvorläuferzellen. Wie in einer früheren Arbeit gezeigt wurde, ist die Herunterregulation von HMGA1a essentiell für den Eintritt von C2C12 Zellen in die Myogenese. Eine konstante Überexpression von HMGA1a-eGFP hingegen verhindert die Muskeldifferenzierung durch Beeinflussung der Expression myogenesespezifischer Gene und Etablierung einer stabilen Chromatinstruktur. Wie in der vorliegenden Arbeit herausgefunden wurde, nimmt die differenzielle HMGA1a Expression nicht nur Einfluss auf die Expression muskelspezifischer Gene, sondern auch auf die globale Zusammensetzung des Chromatins durch eine reduzierte Expression von H1 Histonen und einer aberranten Expression von HMGB1, HMGN1 und HP1 Proteinen. HMGA1a wurde zusammen mit ORC Proteinen eine Funktion bei der Definition von Replikationsursprüngen in eukaryotischen Zellen zugesprochen. ORC Proteine wurden auch als Komponenten des Heterochromatins und als Interaktionspartner von HP1α identifiziert. Hier konnte mit Hilfe von Co-Immunpräzipitationen, Pull-down Assays und Verdrängungsexperimenten gezeigt werden, dass HMGA1 ein weiterer, direkter Interaktionspartner von ORC Proteinen im Heterochromatin ist und zusammen mit HP1α kooperiert. Pull-down-, Verdrängungs- und siRNA-Experimente zeigten zudem, dass HMGA1 zwar nicht direkt mit HP1α interagiert, die Kooperation der Proteine über ORC aber dennoch wichtig für die Aufrechterhaltung der Heterochromatinsstruktur ist. Damit erweisen sich HMGA1 Proteine als wichtige Stabilisierungsfaktoren des Heterochromatins. Bislang ging man davon aus, dass HMGA1 Moleküle linear, also eindimensional, an ein DNA Molekül binden. Das Vorhandensein von drei DNA-Bindungsmotiven und die eher struktur- als sequenzabhängige Bindung an die DNA lassen vermuten, dass HMGA1 Proteine auch gleichzeitig an benachbarte DNA-Stränge, also auch dreidimensional, binden könnten. Bekräftigt wurde diese Vermutung durch die Bildung von Chromatinaggregaten in Zellen die HMGA1a-eGFP überexprimierten. Dies wurde mittels konfokaler und hochauflösender Mikroskopie (dSTORM) analysiert. Um das Potential einer DNA-Quervernetzung durch HMGA1 Proteine nachzuweisen, wurde eine neue Methode entwickelt. Mit Hilfe eines neuartigen DNA Cross-linking Assays wurde nachgewiesen, dass HMGA1 Proteine in der Lage sind, zwei individuelle DNA Stränge zu vernetzen. Zudem wurde eine neue Domäne in HMGA1 entdeckt die maßgeblich zum Cross-linking beiträgt. Elektronenmikroskopische Analysen bestätigten, dass HMGA1 Proteine in der Lage sind Kreuzungen und Schleifen in DNA Molekülen zu erzeugen. Diese Ergebnisse unterstützen die Vermutung, dass HMGA1 Proteine im Zellkern ein DNA Gerüst bilden können, das Einfluss auf die zelltypische Chromatinorganisation nimmt und dadurch DNA abhängige Prozesse beeinflusst. In wie weit eine HMGA1 induzierte DNA Quervernetzung in vivo zum Beispiel in Chromozentren von C2C12 Zellen oder in Krebszellen, in denen HMGA1 Proteine stark überexprimiert sind, eine Rolle spielen, müssen künftige Untersuchungen zeigen. In dieser Arbeit konnte also gezeigt werden, dass HMGA1 Proteine die Chromatinstruktur auf drei Ebenen organisieren können: Durch Beeinflussung der Chromatinzusammensetzung durch Veränderung der Expression von Chromatinproteinen, durch Interaktion mit anderen Architekturelementen des Chromatins und durch Organisation eines potentiellen DNA Gerüsts. N2 - HMGA1 proteins are small basic non-histone proteins characterized by three DNA binding domains, the AT-hooks, which bind to the minor groove of DNA. As differentially expressed architectural chromatin proteins, they perform important functions in the regulation of DNA dependent processes and in development. Aberrant expression leads to developmental defects and cancer. In this thesis the influence of HMGA1 proteins on chromatin organization is investigated. Initially C2C12 myogenic precursor cells were studied, which can be differentiated to myotubes. Previously it had been shown that down-regulation of HMGA1 proteins is crucial for the initiation of myogenic differentiation. Constant over-expression of HMGA1a-eGFP prevents myogenic differentiation by influencing the expression of myogenic genes and by the establishment of a stable chromatin structure. Here it was shown that the differential HMGA1 expression does not only influence the expression of myogenic specific genes but also affects total chromatin composition. This was shown by reduced and aberrant expression of chromatin proteins such as histone H1, HMGB1, HMGN1 and HP1 proteins. Recently it was demonstrated that HMGA1 together with ORC proteins function in origin definition in eukaryotic cells. ORC proteins were also identified as components of heterochromatin and direct interaction partners of HP1α. Here, it was shown by co-immunoprecipitation, pull-down assays, siRNA and displacement experiments that HMGA1 proteins can interact with ORC proteins directly and that they can cooperate with HP1α in heterochromatin. It could be shown that HP1α indeed does not directly interact with HMGA1 but together with ORC proteins is relevant for heterochromatin maintenance. Thus HMGA1 proteins turned out to be important stabilizers of heterochromatin. Until recently it was thought that HMGA1 proteins bind DNA collinearly. In principle the three independent DNA binding AT-hooks of HMGA1 also suggest a concomitant binding to neighboring DNA strands, which could lead to a three dimensional stabilization of DNA. This assumption was affirmed by the occurrence of chromatin aggregates in HMGA1a-eGFP overexpressing cells, which was analyzed by confocal and high resolution (dSTORM) microscopy. By using a newly developed DNA cross-linking assay, which allows the analysis of a DNA crosslinking capability of a protein, it was proven that HMGA1 proteins can bind two individual DNA fibers simultaneously. Furthermore a novel domain in HMGA1 proteins was discovered which is significantly involved in the DNA cross-linking. Electron microscopic analyses confirmed that HMGA1 proteins can specifically generate crossings and loops in DNA molecules. These results support the assumption that HMGA1 proteins can create a DNA scaffold that has influence on cell typical chromatin organization and possibly also affects DNA dependent processes. To what extent HMGA1 induced DNA cross-linking plays a role in vivo, for example in the organization of chromocenters of C2C12 cells or in cancer cells, where HMGA1 proteins are over-expressed, will need to be elucidated in further experiments In summary, this work shows, that HMGA1 proteins influence chromatin structure and composition by affecting the expression of chromatin proteins, by interacting with other architectural chromatin proteins or by producing a higher organization of chromatin on its own. KW - Chromatin KW - HMG-Proteine KW - HMGA1 KW - Chromatin KW - dSTORM KW - HMGA1 KW - Chromatin KW - dSTORM Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-65295 ER - TY - THES A1 - Dindar, Gülcin T1 - Molecular basis for product-specificity of DOT1 methyltransferases in Trypanosoma brucei T1 - Die molekularen Grundlagen der Produktspezifität von DOT1 Methyltransferasen in Trypanosoma brucei N2 - Post-translational histone modifications (PTMs) such as methylation of lysine residues influence chromatin structure and function. PTMs are involved in different cellular processes such as DNA replication, transcription and cell differentiation. Deregulations of PTM patterns are responsible for a variety of human diseases including acute leukemia. DOT1 enzymes are highly conserved histone methyltransferases that are responsible for methylation of lysine 79 on histone H3 (H3K79). Most eukaryotes contain one single DOT1 enzyme, whereas African trypanosomes have two homologues, DOT1A and DOT1B, which methylate H3K76 (H3K76 is homologous to H3K79 in other organisms). DOT1A is essential and mediates mono- and di-methylations, whereas DOT1B additionally catalyzes tri-methylation of H3K76. However, a mechanistic understanding how these different enzymatic activities are achieved is lacking. This thesis exploits the fact that trypanosomes possess two DOT1 enzymes with different catalytic properties to understand the molecular basis for the differential product-specificity of DOT1 enzymes. A trypanosomal nucleosome reconstitution system was established to analyze methyltransferase activity under defined in vitro conditions. Homology modeling allowed the identification of critical residues within and outside the catalytic center that modulate product-specificity. Exchange of these residues transferred the product-specificity from one enzyme to the other and revealed regulatory domains adjacent to the catalytic center. This work provides the first evidence that few specific residues in DOT1 enzymes are crucial to catalyze methyl-state-specific reactions. These results have also consequences for the functional understanding of homologous enzymes in other eukaryotes. N2 - Posttranslationale Histonmodifizierungen (PTMs), wie beispielsweise die Methylierung von Lysinseitenketten, beeinflussen maßgeblich die Struktur und Funktion von Chromatin. PTMs spielen eine wichtige Rolle in verschiedensten zellulären Prozessen, darunter DNA Replikation, Transkription oder Zelldifferenzierung. Darüber hinaus liegt ein verändertes PTM-Muster einer Vielzahl humaner Erkrankungen zugrunde, wie z.B. der akuten myeloischen Leukämie. DOT1-Enzyme sind hochkonservierte Histonmethyltransferasen, die für die Methylierung von Lysin 79 in Histon H3 (H3K79) verantwortlich sind. Im Gegensatz zu den meisten Eukaryoten, die lediglich ein einziges DOT1-Enzym besitzen, finden sich zwei homologe Proteine in afrikanischen Trypanosomen (DOT1A und DOT1B), die Lysin 76 in Histon H3 (H3K76) methylieren (H3K76 ist homolog zu H3K79 in anderen Organismen). DOT1A ist essentiell und katalysiert Mono- und Di-Methylierungen, wohin gegen DOT1B darüber hinaus eine Trimethylierung an H3K76 setzen kann. Derzeit fehlt jegliches mechanistische Verständnis darüber, wie beide Enzyme diese unterschiedliche Produktspezifität erreichen. Die vorliegende Dissertation macht sich den Umstand zunutze, dass Trypanosomen zwei DOT1-Methyltransferasen mit unterschiedlichen katalytischen Eigenschaften besitzen, um Einblicke in die molekulare Grundlage der unterschiedlichen Produktspezifität zu erlangen. Zunächst wurde ein Rekonstitutionssystem für Nukleosomen aus Trypanosomen etabliert, das es ermöglichte die Methyltransferase-Aktivitäten unter definierten in vitro Bedingungen zu analysieren. Homologiemodelle erlaubten die Identifikation von wichtigen Aminosäurepositionen innerhalb und außerhalb des katalytischen Zentrums der Enzyme, die einen Einfluss auf die Produktspezifität haben. Ein Austausch der Aminosäuren an diesen Positionen führte zu einer Umwandlung der Produktspezifität und offenbarte gleichzeitig DOT1A- und DOT1B-spezifische regulatorische Domänen, die an das katalytische Zentrum angrenzen. Diese Arbeit liefert erste Hinweise, dass wenige maßgebliche Aminosäuren in DOT1-Enzymen für den H3K76-Methylierungsgrad während der Katalyse entscheidend sind. Darüber hinaus haben die hier dargestellten Ergebnisse ebenfalls Konsequenzen für das funktionale Verständnis der homologen Enzyme in anderen Eukaryoten. KW - Histon-Methyltransferase KW - Chromatin KW - Trypanosoma brucei KW - DOT1 methyltransferase KW - homology modeling KW - product specificity Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-102524 ER - TY - THES A1 - Löschberger, Anna T1 - Biologische Referenzstrukturen und Protokolloptimierung in der hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie mit dSTORM T1 - Biological model structures and optimization of protocols in super-resolution fluorescence microscopy with dSTORM N2 - Die Lokalisationsmikroskopie ist eine neue, vielversprechende Methode der hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie. Sie ermöglicht detaillierte Einblicke in die Organisation und den strukturellen Aufbau von Zellen. Da die Vorbereitung der Proben und das Aufnehmen der Bilder im Vergleich zu herkömmlichen Methoden höhere Anforderungen stellt, mussten ihr Potential und ihre Zuverlässigkeit erst noch überzeugend gezeigt werden. Bis vor kurzem wurde das Auflösungsvermögen vor allem an Mikrotubuli gezeigt, deren filamentöse Struktur allerdings schon in konfokalen Bildern zu erkennen ist. Deswegen wurde in dieser Dissertation der Kernporenkomplex (NPC), dessen Struktur in der konventionellen Fluoreszenzmikroskopie nicht auflösbar ist, als Modellstruktur für die hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie eingeführt. Dazu wurden Kernporenkomplexe aus Kernhüllen von Xenopus laevis Oocyten mit dSTORM (direct stochastic optical reconstruction microscopy), einer Methode der Lokalisationsmikroskopie, hochaufgelöst. Damit konnte nun erstmals die Achtfachsymmetrie dieses Proteinkomplexes lichtmikroskopisch dargestellt werden. Desweiteren konnte der Zentralkanal mit einem Durchmesser von ca. 40 nm aufgelöst werden. Die Daten eigneten sich außerdem für eine automatisierte Bildanalyse nach dem sogenannten "particle averaging" - einer aus der Elektronenmikroskopie bekannten Methode, um eine Durchschnittsstruktur zu ermitteln. Darüber hinaus wurden Zweifach-Färbungen von NPCs benutzt, um verschiedene Ansätze für Zweifarben-Aufnahmen mit dSTORM zu testen. Neben dem mittlerweile standardmäßig benutzten, sequentiellen Ansatz mit zwei spektral getrennten Farbstoffen, wurde auch ein simultaner Ansatz mit zwei spektral überlappenden Farbstoffen erfolgreich angewandt. Auch für 3D-Messungen mit den Ansätzen Biplane und Astigmatismus eignete sich die Markierung der Kernhülle. Hier wurden jedoch A6-Zellen benutzt und die Krümmung des Zellkerns über die gefärbten Kernporen dargestellt. dSTORM-Messungen können nicht nur an fixierten, sondern auch in lebenden Zellen durchgeführt werden. Hierzu eignen sich vor allem sehr immobile Proteine, wie H2B oder Lamin C. Anhand von SNAP-Tag- und Halo-Tag-Konstrukten konnte gezeigt werden, dass sich kommerziell erhältliche, organische Farbstoffe auch in endogener zellulärer Umgebung schalten lassen, wodurch Lebendzell-Aufnahmen mit dSTORM möglich sind. Ein weiterer Teil dieser Arbeit befasst sich mit korrelativen Aufnahmen aus dSTORM und Rasterelektronenmikroskopie (SEM). Hierzu wurden Xenopus laevis Kernhüllen zuerst mit dSTORM hochaufgelöst und danach für die EM präpariert. Anschließend wurden zugehörige Bereiche am Rasterelektronenmikroskop aufgenommen. Mit den erhaltenen korrelativen Bildern konnte gezeigt werden, dass sich dSTORM und SEM bei geeigneten Proben durchaus kombinieren lassen. Proteine können somit spezifisch markiert und im Rahmen ihrer strukturellen Umgebung mit nahezu molekularer Auflösung dargestellt werden. Da hochwertige Aufnahmen eine ausgereifte Probenpräparation voraussetzen, darf deren Etablierung nicht zu kurz kommen. Unter dieser Prämisse wurde ein optimiertes Markierungsprotokoll mit dem Namen ClickOx entwickelt. Mit ClickOx bleibt bei der kupferkatalysierten Azid-Alkin-Cycloaddition die Feinstruktur von Aktinfilamenten, sowie die Fluoreszenz fluoreszierender Proteine, deutlich sichtbar erhalten. Während bei den klassischen Click-Protokollen auf Grund der Entstehung von reaktiven Sauerstoff-Spezies (ROS) feine zelluläre Strukturen, wie Aktinfilamente, angegriffen oder zerstört werden, schützt das neue Protokoll mit enzymatischem Sauerstoffentzug Proteine und somit Strukturen vor Reaktionen mit ROS. Das unterstreicht, wie wichtig es ist auch sogenannte "etablierte" Protokolle weiterzuentwickeln, denn bestimmte Nebeneffekte in Präparationen werden unter Umständen erstmals in der Hochauflösung sichtbar. Ein weiterer Aspekt war die Untersuchung des Einflusses von D1 auf die Chromatinorganisation. Mit verschiedenen mikroskopischen Methoden konnten Hinweise auf eine mögliche DNA-Cross-Linking-Fähigkeit dieses Proteins gesammelt werden. Hier wurde die Einzelmolekülinformation der dSTORM-Filme genutzt, um unterschiedliche Grade von DNA- bzw. Chromatin-Akkumulation zu vergleichen. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass wildtypisches D1 DNA vernetzen kann. Dies erfolgt über die sogenannten AT-Haken-Motive. Sobald diese alle durch Mutation funktionsunfähig gemacht werden - wie bei der verwendeten R10xG-Mutante - lässt sich keine Akkumulation der DNA mehr beobachten. Neben der Chromatinaggregation durch D1-Expression konnte in FRAP-Experimenten gezeigt werden, dass nur die "echten" AT-Haken eine hohe Affinität zum Chromatin aufweisen, die sogenannten "potentiellen" hingegen nicht. N2 - Localization microscopy is a new and promising imaging technique, which provides detailed insights into cellular organization and structural composition of cells with high spatial resolution. Due to the challenging preparation of samples and demanding imaging procedure, its potential and reliability had to be proven. Until recently the resolution has been shown mainly on microtubules, whose structure is already visible in confocal images. This thesis introduced the nuclear pore complex (NPC) as a more demanding model structure for super-resolution fluorescence microscopy as the structure of NPCs can not be resolved with conventional fluorescence microscopy. For this purpose nuclear envelopes of Xenopus laevis oocytes were highly resolved with dSTORM (direct stochastic optical reconstruction microscopy). With this localization microscopy method it was further possible to resolve the eightfold symmetry of nuclear pore complexes with light microscopy for the first time. In addition the central channel could be resolved with a diameter of about 40 nm. Furthermore, the localizations were used for single particle averaging, a well known image analysis method from electron microscopy, to calculate an average structure. Double staining of NPCs was used to check the potential of two-color imaging with dSTORM. Beside the common way of sequential imaging with two clearly spectrally separated dyes, a spectral demixing approach with spectrally overlapping dyes was applied. Labeling the nuclear envelope was also suitable for 3D measurements using two different approaches, i.e. biplane and astigmatism. In this case, labeled NPCs of Xenopus laevis A6-cells were used to illustrate the bending of the nucleus. dSTORM can be applied not only in fixed but also in living cells. Immobile proteins such as H2B or lamin C are especially suitable for this approach. Using fusion proteins with SNAP-Tag or Halo-Tag, it was shown that photoswitching of commercially available organic dyes is possible in an endogenous cellular environment and thus enabeling dSTORM in living cells. Another aspect of this work covers correlative microscopy using dSTORM and scanning electron microscopy (SEM). Therefor nuclear envelopes of Xenopus laevis were first imaged with dSTORM and then prepared for SEM. After that, corresponding areas were imaged with SEM. The resulting correlative images showed clearly that - assuming one has appropriate samples - dSTORM and SEM can be fairly combined. This way specifically labeled proteins can be imaged with nearly molecular resolution in the context of their structural environment. Since the quality of localization microscopy strongly depends on sample preparation, ongoing developments of labeling protocols are required. On this premise an optimized labeling protocol called ClickOx was developed. ClickOx clearly preserves the fine structure of actin filaments and the fluorescence of fluorescent proteins when using copper-catalyzed azide-alkine-cycloaddition. Whereas fine cellular structures such as actin filaments are affected by reactive oxygen species (ROS) under standard clicking procedures, the new protocol, which contains an enzymatic oxygen scavenger, protects proteins and thus cellular structures from reactions with ROS. This demonstrates the importance of further developing even so called "well established" protocols, because some side effects may appear only in super-resolution. Another aspect adressed the influence of D1 on chromatin organization. Hints for a possible DNA cross-linking ability of D1 were collected using different microscopic approaches. The single-molecule information of dSTORM measurements was used to analyse chromatin aggregation induced by D1 expression. The results indicate that wildtype D1 can cross-link DNA with its AT-hooks. Consequently the loss-of-function mutant R10xG is unable to aggregate chromatin. Furthermore FRAP experiments were performed to demonstrate that only "true" AT-hooks in D1 have a strong affinity to chromatin, but not the so called "potential" AT-hooks. KW - Fluoreszenzmikroskopie KW - Chromatin KW - Kernporen-Komplex KW - Click-Chemie KW - Korrelative Mikroskopie KW - Lokalisationsmikroskopie KW - dSTORM KW - super-resolution KW - Hochauflösung Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-102630 ER - TY - THES A1 - Wedel, Carolin T1 - The impact of DNA sequence and chromatin on transcription in \(Trypanosoma\) \(brucei\) T1 - Der Einfluss der DNA-Sequenz und der Chromatinstruktur auf die Transkription in \(Trypanosoma\) \(brucei\) N2 - For cellular viability, transcription is a fundamental process. Hereby, the DNA plays the most elemental and highly versatile role. It has long been known that promoters contain conserved and often well-defined motifs, which dictate the site of transcription initiation by providing binding sites for regulatory proteins. However, research within the last decade revealed that it is promoters lacking conserved promoter motifs and transcribing constitutively expressed genes that constitute the majority of promoters in eukaryotes. While the process of transcription initiation is well studied, whether defined DNA sequence motifs are required for the transcription of constitutively expressed genes in eukaryotes remains unknown. In the highly divergent protozoan parasite Trypanosoma brucei, most of the proteincoding genes are organized in large polycistronic transcription units. The genes within one polycistronic transcription unit are generally unrelated and transcribed by a common transcription start site for which no RNA polymerase II promoter motifs have been identified so far. Thus, it is assumed that transcription initiation is not regulated but how transcription is initiated in T. brucei is not known. This study aimed to investigate the requirement of DNA sequence motifs and chromatin structures for transcription initiation in an organism lacking transcriptional regulation. To this end, I performed a systematic analysis to investigate the dependence of transcription initiation on the DNA sequence. I was able to identify GT-rich promoter elements required for directional transcription initiation and targeted deposition of the histone variant H2A.Z, a conserved component during transcription initiation. Furthermore, nucleosome positioning data in this work provide evidence that sites of transcription initiation are rather characterized by broad regions of open and more accessible chromatin than narrow nucleosome depleted regions as it is the case in other eukaryotes. These findings highlight the importance of chromatin during transcription initiation. Polycistronic RNA in T. brucei is separated by adding an independently transcribed miniexon during trans-splicing. The data in this work suggest that nucleosome occupancy plays an important role during RNA maturation by slowing down the progressing polymerase and thereby facilitating the choice of the proper splice site during trans-splicing. Overall, this work investigated the role of the DNA sequence during transcription initiation and nucleosome positioning in a highly divergent eukaryote. Furthermore, the findings shed light on the conservation of the requirement of DNA motifs during transcription initiation and the regulatory potential of chromatin during RNA maturation. The findings improve the understanding of gene expression regulation in T. brucei, a eukaryotic parasite lacking transcriptional Regulation. N2 - Die Transkription ist ein entscheidender Prozess in der Zelle und die DNA-Sequenz nimmt hierbei eine elementare Rolle ein. Promotoren beinhalten spezifische und konservierte DNASequenzen und vermitteln den Start der Transkription durch die Rekrutierung spezifischer Proteine. Jedoch haben Forschungen im vergangenen Jahrzehnt gezeigt, dass die Mehrzahl der Promotoren in eukaryotischen Genomen keine konservierten Promotormotive aufweisen und häufig konstitutiv exprimierte Gene transkribieren. Obgleich der Prozess der Transkriptionsinitiation im Allgemeinen gut erforscht ist, konnte bisher nicht nachgewiesen werden, ob ein definiertes DNA-Motiv während der Transkription von konstitutiv exprimierten Genes erforderlich ist. In dem eukaryotischen und einzelligen Parasiten Trypanosoma brucei ist die Mehrzahl der proteinkodierenden Gene in lange polycistronische Transkriptionseinheiten arrangiert. Diese werden von einem gemeinsamen Transkriptionsstart durch die RNA Polymerase II transkribiert, allerdings konnten hier bisher keine Promotormotive identifiziert werden. Aus diesem Grund besteht die Annahme, dass Transkription keiner Regulation unterliegt. Allgemein ist der Prozess der Transkriptionsinitiation in T. brucei bisher nur wenig verstanden. Um den Zusammenhang zwischen DNA-Motiven und konstitutiver Genexpression näher zu untersuchen und Schlussfolgerungen über die DNA-Sequenz-Abhängigkeit der Transkriptionsinitiation zu ziehen, habe ich eine systematische Analyse in T. brucei durchgeführt. Ich konnte GT-reiche Promotorelemente innerhalb dieser Regionen identifizieren, die sowohl eine gerichtete Transkriptionsinitiation, als auch den gezielten Einbau der Histonvariante H2A.Z in Nukleosomen nahe der Transkriptionsstartstelle vermittelt haben. Des Weiteren zeigten Nukleosomenpositionierungsdaten, dass in Trypanosomen die Transkripitonsstartstellen nicht die charakteristische, nukleosomendepletierte Region, wie für andere Organismen beschrieben, sondern eine offene Chromatinstruktur enthalten. Zusätzlich konnte ich zeigen, dass die Chromatinstruktur eine wichtige Rolle während der mRNAProzessierung spielt. In T. brucei wird die polycistronische pre-mRNA durch das Anfügen eines Miniexons während des sogenannten trans-Splicens in individuelle mRNAs aufgetrennt. Die Daten dieser Arbeit belegen, dass die Anreicherung von Nukleosomen eine Verlangsamung der transkribierenden Polymerase bewirken und sie somit die richtige Wahl der Splicestelle gewährleisten. Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit die Rolle der DNA Sequenz während der Transkriptionsinitiation und Nukleosomenpositionierung in einem divergenten Eukaryoten untersucht. Die Erkenntnisse bringen mehr Licht in die Konservierung der Notwendigkeit eines DNA-Motivs während der Transkriptionsinitiation und das regulatorische Potential der Chromatinstruktur während der RNA-Reifung. Zudem verbessern sie das Verständnis der Genexpressionsregulation in T. brucei, einem eukaryotischen Parasiten, der ohne transkriptionelle Regulation überlebt. KW - Transkription KW - Chromatin KW - Trypanosoma brucei KW - Genexpression KW - Epigenetik KW - RNA polymerase II KW - splicing KW - nuclesosome positioning Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-173438 ER - TY - THES A1 - Kraus, Amelie Johanna T1 - H2A.Z – a molecular guardian of RNA polymerase II transcription in African trypanosomes T1 - H2A.Z – eine molekulare Wächterin der RNA Polymerase II Transkription in Afrikanischen Trypanosomen N2 - In eukaryotes, the enormously long DNA molecules need to be packaged together with histone proteins into nucleosomes and further into compact chromatin structures to fit it into the nucleus. This nuclear organisation interferes with all phases of transcription that require the polymerase to bind to DNA. During transcription – the process in which the hereditary information stored in DNA is transferred to many transportable RNA molecules - nucleosomes form a physical obstacle for polymerase progression. Thus, transcription is usually accompanied by processes mediating nucleosome destabilisation, including post-translational histone modifications (PTMs) or exchange of canonical histones by their variant forms. To the best of our knowledge, acetylation of histones has the highest capability to induce chromatin opening. The lysine modification can destabilise histone-DNA interactions within a nucleosome and can serve as a binding site for various chromatin remodelers that can modify the nucleosome composition. For example, H4 acetylation can impede chromatin folding and can stimulate the exchange of canonical H2A histone by its variant form H2A.Z at transcription start sites (TSSs) in many eukaryotes, including humans. As histone H4, H2A.Z can be post-translationally acetylated and as acetylated H4, acetylated H2A.Z is enriched at TSSs suggested to be critical for transcription. However, thus far, it has been difficult to study the cause and consequence of H2A.Z acetylation. Even though, genome-wide chromatin profiling studies such as ChIP-seq have already revealed the genomic localisation of many histone PTMs and variant proteins, they can only be used to study individual chromatin marks and not to identify all factors important for establishing a distinct chromatin structure. This would require a comprehensive understanding of all marks associated to a specific genomic locus. However, thus far, such analyses of locus-specific chromatin have only been successful for repetitive regions, such as telomeres. In my doctoral thesis, I used the unicellular parasite Trypanosoma brucei as a model system for chromatin biology and took advantage of its chromatin landscape with TSSs comprising already 7% of the total T. brucei genome (humans: 0.00000156%). Atypical for a eukaryote, the protein-coding genes are arranged in long polycistronic transcription units (PTUs). Each PTU is controlled by its own ~10 kb-wide TSS, that lies upstream of the PTU. As observed in other eukaryotes, TSSs are enriched with nucleosomes containing acetylated histones and the histone variant H2A.Z. This is why I used T. brucei to particularly investigate the TSS-specific chromatin structures and to identify factors involved in H2A.Z deposition and transcription regulation in eukaryotes. To this end, I established an approach for locus-specific chromatin isolation that would allow me to identify the TSSs- and non-TSS-specific chromatin marks. Later, combining the approach with a method for quantifying lysine-specific histone acetylation levels, I found H2A.Z and H4 acetylation enriched in TSSs-nucleosomes and mediated by the histone acetyltransferases HAT1 and HAT2. Depletion of HAT2 reduced the levels of TSS-specific H4 acetylation, affected targeted H2A.Z deposition and shifted the sites of transcription initiation. Whereas HAT1 depletion had only a minor effect on H2A.Z deposition, it had a strong effect on H2A.Z acetylation and transcription levels. My findings demonstrate a clear link between histone acetylation, H2A.Z deposition and transcription initiation in the early diverged unicellular parasite T. brucei, which was thus far not possible to determine in other eukaryotes. Overall, my study highlights the usefulness of T. brucei as a model system for studying chromatin biology. My findings allow the conclusion that H2A.Z regardless of its modification state defines sites of transcription initiation, whereas H2A.Z acetylation is essential co-factor for transcription initiation. Altogether, my data suggest that TSS-specific chromatin establishment is one of the earliest developed mechanisms to control transcription initiation in eukaryotes. N2 - In Eukaryoten muss die genomische DNA zusammen mit Histonproteinen zu Nukleosomen und weiter zu kompakten Chromatinstrukturen verpackt werden, damit sie in den Zellkern passt. Diese Organisation behindert die Transkription bei jedem Schritt, bei dem die Polymerase an der DNA bindet. Während der Transkription – dem Prozess bei dem die in der DNA gespeicherte Erbinformation in viele transportable RNA Molekülen umgewandelt wird – stellen Nukleosomen ein physikalisches Hindernis für das Vorankommen der Polymerase dar. Aus diesem Grund wird die Transkription üblicherweise von Prozessen begleitet, die für die Destabilisierung der Nukleosomen sorgen, wie zum Beispiel post-translationale Modifizierung (PTM) der Histone oder der Austausch von kanonischen Histonproteinen durch eine ihrer Varianten. Soweit bisher bekannt ist Histonacetylierung am besten dafür geeignet, eine offene Chromatinstruktur bereit zu stellen. Die Lysinmodifizierung kann Interaktionen zwischen der DNA und den Histonen innerhalb eines Nukleosomes destabilisieren und als Andockstelle für einige Proteinkomplexe sogenannte Chromatin-Modellierer fungieren, die die Zusammensetzung eines Nukleosomes verändern können. Zum Beispiel, kann Acetylierung am Histon H4 das „Zusammenfalten“ des Chromatins erschweren und den Austausch von kanonischem H2A mit ihrer Variante H2A.Z an den Transkriptiosinitiationsstellen (TSSen) in vielen eukaryotischen Organismen, Menschen eingeschlossen, stimulieren. Wie Histon H4, kann auch H2A.Z post-translationell acetyliert werden und wie acetyliertes H4, findet man auch acetyliertes H2A.Z vor allem an TSSen. Deswegen geht man davon aus, dass es sehr wichtig für die Transkriptioninitiierung ist. Allerdings war es bisher nicht möglich, die Ursache und Wirkung von H2A.Z Acetylierung genauer zu untersuchen. Genom-weite Chromatinprofilstudien wie z.B. ChIP-Seq ermöglichen es die genomische Lokalisierung von vielen Histon-Modifizierungen und -Varianten zu bestimmen. Dennoch reichen sie nicht dafür aus alle Faktoren, die für die Bildung einer bestimmten Chromatinstruktur notwendig sind, gleichzeitig herauszufinden. Das würde voraussetzen, dass man alle Merkmale der genomischen Stelle kennt. Bisher waren Analysen von spezifischen Chromatinstellen nur erfolgreich, wenn das Chromatin von einer repetitiven Region, wie z.B. Telomeren, stammt. In meiner Doktorarbeit verwendete ich den einzelligen Parasiten Trypanosoma brucei als Modelsystem für Chromatinbiologie. Dabei machte ich mir dessen Chromatinorganisation zunutze, die eher untypisch für einen eukaryotische Organismus ist. TSSen machen hier ungefähr 7% des gesamten Genoms aus (Mensch: 0.00000156%). Protein-kodierende Gene sind in langen polycistronischen Transkriptionseinheiten (PTE) angeordnet. Jede dieser Einheiten besitzt eine eigene TSS, die vor der PTE liegt, und bis zu 10 kb lang sein kann. Jedoch, wie in anderen Eukaryoten, sind an den TSSen Nukleosomen angereichert, die sich durch acetylierte Histone und den Einbau der Histonvariante H2A.Z auszeichnen. Aus diesen Gründen verwendete ich T. brucei, um während meiner Doktorarbeit die Chromatinstrukturen, die TSSen auszeichnen, genauer zu untersuchen und die Faktoren, die bei der H2A.Z Positionierung und dadurch bei der Transkriptionsregulation in Eukaryoten eine Rolle spielen, herauszufinden. Dafür etablierte ich zuerst eine Methode, mit der man Chromatin von einer bestimmten genomischen Stelle isolieren kann und die es mir ermöglichen würde, die Merkmale von TSS-spezifischen und -unspezifischen Chromatin zu identifizieren. Später konnte ich das entwickelte Protokoll mit einer Methode zur Quantifizierung von Lysin-spezifischen Histonacetylierung kombinieren. Dadurch konnte ich herausfinden, dass Nukleosomen an trypanosomischen TSSen stark acetyliertes H2A.Z und H4 enthalten und dass für diese Modifizierungen die Histonacetyltransferasen HAT1 und HAT2 verantwortlich sind. Eine Reduzierung der HAT2-Levels führte zu einer Reduzierung von H4 Acetylierung, verschlechterte die gezielte H2A.Z Positionierung und führte dazu, dass die Transkriptioninitiierung sich verlagerte. Wohingegen eine Reduzierung von HAT1, die zwar nur einen kleinen Einfluss auf die H2A.Z Positionierung hatte, eine sehr starke Verringerung von acetyliertem H2A.Z und der Transkriptionsrate zur Folge hatte. Durch meine Ergebnisse konnte ich zeigen, dass in T. brucei, einem evolutionär divergenten eukaryotischem Organismus, die Prozesse der Histonacetylierung, H2A.Z Positionierung und Transkriptionsinitiierung sehr stark miteinander verbunden sind. Meine Arbeit ist des weiteren ein Beweis dafür, dass T. brucei ein sehr wichtiger Modellorganismus für die Forschung an Chromatin ist. Insgesamt erlauben meine Ergebnisse die Schlussfolgerung, dass H2A.Z, egal ob modifiziert oder nicht, ein Herausstellungsmerkmal für TSSen ist, während acetyliertes H2A.Z essentiell für die Transkriptionsinitiierung darstellt. Zusammengefasst, weisen die Daten meiner Doktorarbeit darauf hin, dass die Etablierung von bestimmten Chromatinstrukturen an TSSen eines der frühesten entwickelten Mechanismen zur Kontrolle der Transkriptionsinitiierung in Eukaryoten ist. KW - Chromatin KW - Histone KW - Histonacetyltransferase KW - Transcription KW - Acetylation KW - H2A.Z KW - Trypanosoma Brucei KW - Histone Acetylation KW - Transcription KW - Chromatin KW - Histone KW - Histone modification KW - Histone variant Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-250568 ER - TY - THES A1 - Eisenhuth, Nicole Juliana T1 - Novel and conserved roles of the histone methyltransferase DOT1B in trypanosomatid parasites T1 - Neue und konservierte Rollen der Histonmethyltransferase DOT1B in Parasiten der Ordnung Trypanosomatida N2 - The family of trypanosomatid parasites, including the human pathogens Trypanosoma brucei and Leishmania, has evolved sophisticated strategies to survive in harmful host environments. While Leishmania generate a safe niche inside the host’s macrophages, Trypanosoma brucei lives extracellularly in the mammalian bloodstream, where it is constantly exposed to the attack of the immune system. Trypanosoma brucei ensures its survival by periodically changing its protective surface coat in a process known as antigenic variation. The surface coat is composed of one species of ‘variant surface glycoprotein’ (VSG). Even though the genome possesses a large repertoire of different VSG isoforms, only one is ever expressed at a time from one out of the 15 specialized subtelomeric ‘expression sites’ (ES). Switching the coat can be accomplished either by a recombination-based exchange of the actively-expressed VSG with a silent VSG, or by a transcriptional switch to a previously silent ES. The conserved histone methyltransferase DOT1B methylates histone H3 on lysine 76 and is involved in ES regulation in T. brucei. DOT1B ensures accurate transcriptional silencing of the inactive ES VSGs and influences the kinetics of a transcriptional switch. The molecular machinery that enables DOT1B to execute these regulatory functions at the ES is still elusive, however. To learn more about DOT1B-mediated regulatory processes, I wanted to identify DOT1B-associated proteins. Using two complementary approaches, specifically affinity purification and proximity-dependent biotin identification (BioID), I identified several novel DOT1B-interacting candidates. To validate these data, I carried out reciprocal co-immunoprecipitations with the most promising candidates. An interaction of DOT1B with the Ribonuclease H2 protein complex, which has never been described before in any other organism, was confirmed. Trypanosomal Ribonuclease H2 maintains genome integrity by resolving RNA-DNA hybrids, structures that if not properly processed might initiate antigenic variation. I then investigated DOT1B’s contribution to this novel route to antigenic variation. Remarkably, DOT1B depletion caused an increased RNA-DNA hybrid abundance, accumulation of DNA damage, and increased VSG switching. Deregulation of VSGs from throughout the silent repertoire was observed, indicating that recombination-based switching events occurred. Encouragingly, the pattern of deregulated VSGs was similar to that seen in Ribonuclease H2-depleted cells. Together these data support the hypothesis that both proteins act together in modulating RNA-DNA hybrids to contribute to the tightly-regulated process of antigenic variation. The transmission of trypanosomatid parasites to mammalian hosts is facilitated by insect vectors. Parasites need to adapt to the extremely different environments encountered during transmission. To ensure their survival, they differentiate into various specialized forms adapted to each tissue microenvironment. Besides antigenic variation, DOT1B additionally affects the developmental differentiation from the mammalian-infective to the insect stage of Trypanosoma brucei. However, substantially less is known about the influence of chromatin-associated proteins such as DOT1B on survival and adaptation strategies of related Leishmania parasites. To elucidate whether DOT1B’s functions are conserved in Leishmania, phenotypes after gene deletion were analyzed. As in Trypanosoma brucei, generation of a gene deletion mutant demonstrated that DOT1B is not essential for the cell viability in vitro. DOT1B deletion was accompanied with a loss of histone H3 lysine 73 trimethylation (the lysine homologous to trypanosomal H3K76), indicating that Leishmania DOT1B is also solely responsible for catalyzing this post-translational modification. As in T. brucei, dimethylation could only be observed during mitosis/cytokinesis, while trimethylation was detectable throughout the cell cycle in wild-type cells. In contrast to the trypanosome DOT1B, LmxDOT1B was not essential for differentiation in vitro. However, preliminary data indicate that the enzyme is required for effective macrophage infection. In conclusion, this study demonstrated that the identification of protein networks and the characterization of protein functions of orthologous proteins from related parasites are effective tools to improve our understanding of the parasite survival strategies. Such insights are a necessary step on the road to developing better treatments for the devastating diseases they cause. N2 - Vertreter der Familie der Trypanosomatidae einschließlich der humanpathogenen Trypanosoma brucei und Leishmania Arten entwickelten eine Reihe von ausgeklügelten Strategien, um in ihren Wirten zu überleben. Während sich Leishmanien eine sichere Nische in den Makrophagen ihrer Wirte aufbauen, lebt Trypanosoma brucei ausschließlich extrazellulär im Blutkreislauf der Säugetiere. Dort ist der Parasit ständig dem Angriff des Immunsystems ausgesetzt. Um sein Überleben zu sichern, wechselt er regelmäßig seine variablen Oberflächenproteine (VSG), eine Strategie, die auch als antigene Variation bekannt ist. Obwohl das Genom des Parasiten über ein enormes Repertoire an VSG Genen verfügt, wird immer nur eine einzige Art von einer von 15 spezialisierten telomerproximalen Expressionsstellen (ES) transkribiert. Um die VSG-Zelloberfläche zu wechseln, können Trypanosomen das VSG Gen der aktiven ES gegen ein inaktives VSG aus dem gigantischen Repertoire mittels Rekombination eintauschen. Eine weitere Möglichkeit ist der Transkriptionswechsel zu einer zuvor stillen ES. Die konservierte Histonmethyltransferase DOT1B katalysiert die Methylierung von Histon H3 am Lysin 76 und ist an der ES-Regulation beteiligt. DOT1B gewährleistet den transkriptionell inaktiven Status der ES und beeinflusst die Kinetik eines transkriptionellen ES Wechsels. Die molekularen Komponenten, die DOT1B diese regulatorischen Funktionen an der ES ermöglichen, sind jedoch noch unbekannt. Um mehr über die von DOT1B vermittelten Mechanismen zu erfahren, ist es notwendig, DOT1B-assoziierte Proteine zu identifizieren. Durch die Anwendung von komplementären biochemischen Proteinaufreinigungsmethoden gelang es mir, mehrere potentielle Proteininteraktionen zu DOT1B zu entdecken. Um die Daten zu validieren, führte ich weitere Proteinaufreinigungen mit den vielversprechendsten Kandidaten durch. Eine Interaktion zwischen DOT1B und der Ribonuklease H2 konnte bestätigt werden - eine Interaktion, die noch nie zuvor in anderen Organismen beschrieben wurde. In Trypanosomen gewährleistet Ribonuklease H2 die Genomintegrität, indem das Enzym RNA-DNA-Hybride auflöst. Diese Strukturen können zudem, wenn sie nicht richtig prozessiert werden, antigene Variation initiieren. In dieser Studie wurde daher außerdem DOT1B’s Beitrag zu diesem Weg der Initiation der antigenen Variation analysiert. In der Tat konnte gezeigt werden, dass DOT1B RNA-DNA-Hybride moduliert und die Genomintegrität sowie VSG-Wechselrate beeinflusst. Die Tatsache, dass in DOT1B-Mutanten VSG Isoformen von den unterschiedlichsten Genomregionen exprimiert wurden, deutet darauf hin, dass rekombinations-basierte Ereignisse dem VSG-Wechsel zu Grunde lagen. Da in den DOT1B-Mutanten ähnliche VSG exprimiert wurden wie in Ribonuklease H2-Mutanten, kann vermutet werden, dass beide Proteine bei der Modulation der RNA-DNA-Hybride zusammenwirken, um antigene Variation zu regulieren. Trypanosomen und Leishmanien werden mittels Insektenvektoren auf den nächsten Säugerwirt übertragen. Sie müssen daher nicht nur im Säugerwirt überleben, sondern sich auch an die extrem unterschiedliche Umgebung im Vektor anpassen. Dafür differenzieren sich die Parasiten in speziell angepasste Zellstadien. Zusätzlich zu der antigenen Variation beeinflusst DOT1B die Entwicklungsdifferenzierung in Trypanosoma brucei. In Leishmanien hingegen ist über den Einfluss von chromatin-assoziierten Proteinen wie DOT1B auf die Überlebens- und Anpassungsstrategien wesentlich weniger bekannt. Um herauszufinden, ob die Funktionen von DOT1B in Leishmanien konserviert sind, wurden Phänotypen nach Gendeletion analysiert. Wie auch in Trypanosoma brucei konnte gezeigt werden, dass DOT1B für das Überleben der Parasiten nicht essentiell ist. Die Deletion von DOT1B ging mit einem Verlust der Trimethylierung von Histon H3 am Lysin 73 (dem zum trypanosomalen H3K76 homologen Lysin) einher, was darauf hinweist, dass DOT1B auch in Leishmanien allein für die Katalyse dieser posttranslationalen Modifikation verantwortlich ist. Wie in Trypanosoma brucei konnte eine Dimethylierung nur in der Mitose/Zytokinese beobachtet werden, wobei die Trimethylierung während des gesamten Zellzyklus in Wildtyp-Zellen nachweisbar war. Im Gegensatz zum trypanosomalen DOT1B war LmxDOT1B für die Differenzierung in vitro entbehrlich. Vorläufige Daten zeigen jedoch, dass das Enzym für eine wirksame Makrophageninfektion wesentlich ist. Zusammenfassend zeigte diese Studie, dass die Identifizierung von Proteinnetzwerken und die Charakterisierung von Funktionen orthologer Proteine aus verwandten Parasiten wirksame Werkzeuge sind, um unser Verständnis der Überlebensstrategien der Parasiten zu verbessern. Solche Erkenntnisse sind ein notwendiger Schritt auf dem Weg zu effektiveren Behandlungsmethoden für die verheerenden Krankheiten, die diese Parasiten verursachen. KW - Trypanosoma brucei KW - Leishmania KW - Chromatin KW - Histon-Methyltransferase KW - DNA repair KW - developmental differentiation KW - DOT1 KW - Ribonuclease H2 Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-219936 ER - TY - THES A1 - Haas, Tobias Eberhard T1 - Analyse der RNA-Landschaft und Chromatinorganisation in lytischer HSV-1 Infektion und Stress T1 - Analysis of RNA landscape and chromatin organization in lytic HSV-1 infection and stress N2 - Zellstress in Form von lytischer Herpes-simplex-Virustyp-1-Infektion, Hitze und Salzstress führt dazu, dass die RNA-Polymerase II über das 3'-Ende von manchen Genen hinaus transkribiert. Dies geht bei Herpes-simplex-Virustyp-1-Infektion teilweise mit offenem Chromatin nach dem 3'-Ende einher. In dieser Arbeit wurden verschiedene Methoden getestet, um diese Effekte genomweit zu eruieren. Dabei wurden die Peak-Caller ATAC-seq-Pipeline, F-Seq, Hotspots und MACS2 getestet sowie mit der Hilfsgröße „downstream Open Chromatin Regions“ gearbeitet. Weiterhin wurde das R-Skript „Pipeline for ATAC-seq and 4sU-seq plotting“ entwickelt, mit dem sich die Dynamik der oben beschriebenen Effekte zeigen lässt: Die Offenheit des Chromatins ist bei Herpesinfektion zusätzlich zur Erhöhung nach dem 3'-Ende generell erhöht. Die Transkription der RNA-Polymerase II über das 3'-Ende hingegen nimmt nach 75k Basenpaaren rapide ab. Die Ergebnisse des R-Skripts im Bezug auf Salz und Hitzestress decken sich mit vorbeschriebener Literatur, in der gezeigt wurde, dass eine Erhöhung der Offenheit des Chromatins nach dem 3'-Ende nicht stattfindet. N2 - Cell stress in the form of lytic herpes simplex virus type 1 infection, heat, and salt stress causes RNA polymerase II to transcribe beyond the 3' end of some genes. This is sometimes associated with open chromatin beyond the 3' end in herpes simplex virus type 1 infection. In this work, several methods were tested to elicit these effects genome-wide. The peak caller ATAC-seq-Pipeline, F-Seq, hotspots, and MACS2 were tested, and the auxiliary variable "downstream open chromatin regions" was used. Furthermore, the R script "Pipeline for ATAC-seq and 4sU-seq plotting" was developed to show the dynamics of the effects described above: Chromatin openness is generally increased in herpes infection in addition to being increased after the 3' end. In contrast, RNA polymerase II transcription across the 3' end decreases rapidly after 75k base pairs. The results of the R-script in relation to salt and heat stress are consistent with pre-described literature showing that an increase in chromatin openness after the 3' end does not occur. KW - Herpes-simplex-Virus KW - Salzstress KW - Hitzestress KW - Chromatin KW - Peak Caller Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-283028 ER - TY - THES A1 - Fetiva Mora, Maria Camila T1 - Changes in chromatin accessibility by oncogenic YAP and its relevance for regulation of cell cycle gene expression and cell migration T1 - Änderungen der Chromatinzugänglichkeit durch onkogene YAP und seine Relevanz für die Genexpression während des Zellzyklus und für die Zellmigration N2 - Various types of cancer involve aberrant cell cycle regulation. Among the pathways responsible for tumor growth, the YAP oncogene, a key downstream effector of the Hippo pathway, is responsible for oncogenic processes including cell proliferation, and metastasis by controlling the expression of cell cycle genes. In turn, the MMB multiprotein complex (which is formed when B-MYB binds to the MuvB core) is a master regulator of mitotic gene expression, which has also been associated with cancer. Previously, our laboratory identified a novel crosstalk between the MMB-complex and YAP. By binding to enhancers of MMB target genes and promoting B-MYB binding to promoters, YAP and MMB co-regulate a set of mitotic and cytokinetic target genes which promote cell proliferation. This doctoral thesis addresses the mechanisms of YAP and MMB mediated transcription, and it characterizes the role of YAP regulated enhancers in transcription of cell cycle genes. The results reported in this thesis indicate that expression of constitutively active, oncogenic YAP5SA leads to widespread changes in chromatin accessibility in untransformed human MCF10A cells. ATAC-seq identified that newly accessible and active regions include YAP-bound enhancers, while the MMB-bound promoters were found to be already accessible and remain open during YAP induction. By means of CRISPR-interference (CRISPRi) and chromatin immuniprecipitation (ChIP), we identified a role of YAP-bound enhancers in recruitment of CDK7 to MMB-regulated promoters and in RNA Pol II driven transcriptional initiation and elongation of G2/M genes. Moreover, by interfering with the YAP-B-MYB protein interaction, we can show that binding of YAP to B-MYB is also critical for the initiation of transcription at MMB-regulated genes. Unexpectedly, overexpression of YAP5SA also leads to less accessible chromatin regions or chromatin closing. Motif analysis revealed that the newly closed regions contain binding motifs for the p53 family of transcription factors. Interestingly, chromatin closing by YAP is linked to the reduced expression and loss of chromatin-binding of the p53 family member Np63. Furthermore, I demonstrate that downregulation of Np63 following expression of YAP is a key step in driving cellular migration. Together, the findings of this thesis provide insights into the role of YAP in the chromatin changes that contribute to the oncogenic activities of YAP. The overexpression of YAP5SA not only leads to the opening of chromatin at YAP-bound enhancers which together with the MMB complex stimulate the expression of G2/M genes, but also promotes the closing of chromatin at ∆Np63 -bound regions in order to lead to cell migration. N2 - Ein Kennzeichen vieler Tumoren ist die fehlerhafte Aktivierung von zellzyklusregulierenden Signalwegen. Ein für das Tumorwachstum wichtiger Signalwege ist der Hippo-Signalweg und das durch ihn regulierte Onkogen YAP, ein transkriptioneller Koaktivator. Durch die Regulierung von Zellzyklusgenen ist YAP verantwortlich für onkogene Prozesse wie Zellproliferation und Metastasierung. Der MMB-Multiproteinkomplex wiederum – er entsteht, wenn B-MYB an das MuvB-Kernmodul bindet – ist ein wichtiger Regulator der mitotischen Genexpression, welche ebenso mit der Tumorentstehung in Verbindung gebracht wurde. Unser Labor hat zuvor einen neuen Mechanismus der Regulation mitotischer Gene durch den MMB-Komplex und YAP identifiziert: Durch die Bindung an Enhancer der MMB-Zielgene und die Förderung der B-MYB-Bindung an Promotoren reguliert YAP eine Reihe von mitotischen und zytokinetischen Zielgenen, welche die Zellproliferation fördern. Diese Doktorarbeit befasst sich mit den Mechanismen der YAP- und MMB-vermittelten Transkription und charakterisiert die Rolle der YAP regulierten Enhancer während der Transkription von Zellzyklusgenen. Die in dieser Dissertation dargelegten Ergebnisse zeigen, dass die Expression von konstitutiv aktivem, onkogenem YAP5SA zu weitreichenden Veränderungen in der Chromatinzugänglichkeit nicht-transformierter humaner MCF10A Zellen führt. ATAC-seq zeigte, dass ein grosse Anzahl YAP-gebundene Enhancer zugänglich und aktiviert werden. Gleichzeitig konnte festgestellt werden, dass die MMB-gebundenen Promotoren bereits vor der Expression von YAP zugänglich sind und während der YAP-Induktion offen bleiben. Mittels CRISP-Interferenz (CRISPRi) und Chromatin-Immunpräzipitationen (ChIP) konnten wir zeigen, dass YAP-gebundene Enhancer die Rekrutierung von CDK7 an MMB-regulierten Promotoren sowie die Initiation und Elongation der Transkription von G2/M Genen fördert. Durch die experimentelle Blockade der YAP-B-MYB Proteininteraktion konnten wir darüber hinaus belegen, dass auch die Bindung von YAP an B-MYB für die Initiation der Transkription an MMB-regulierten Genen entscheidend ist. Unerwarteterweise führte die Überexpression von YAP5SA auch dazu, dass bestimmte Regionen im Genom weniger zugänglich werden. Motivanalysen ergaben, dass diese neu geschlossenen Regionen Bindungsmotive für die p53-Familie von Transkriptionsfaktoren enthalten. Die Chromatinschließung durch YAP ist an eine reduzierte Expression und an den Verlust der Chromatinbindung des p53-Familienmitglieds Np63 gekoppelt. Schließlich konnte gezeigt werden, dass die Inhibition von Np63 durch YAP ein wichtiger Schritt in der YAP-abhängigen Förderung der Zellmigration ist. Zusammenfassend liefern die Ergebnisse dieser Dissertation Einblicke in die Rolle von YAP bei Chromatinveränderungen welche zu den onkogenen Aktivitäten von YAP beitragen. Die Überexpression von YAP führt dabei einerseits zur Öffnung des Chromatins an YAP-gebundenen Enhancern, die zusammen mit dem MMB-Komplex die Expression von G2/M Genen stimulieren. Andererseits fördert YAP auch das Schließen von Chromatin an Np63-gebundenen Regionen, was wiederum Zellmigration nach sich zieht. KW - YAP KW - B-MYB KW - MMB KW - enhancers KW - transcription KW - chromatin accessibility KW - opening of chromatin KW - closing of chromatin KW - cell migration KW - G2/M genes KW - Chromatin KW - Genexpression KW - Zellzyklus KW - Zellmigration Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-302910 ER -