TY  - THES
A1  - Neufeld, Bernd
T1  - Neue Interaktionspartner der MAPKAP-Kinasen 3pK und MK2
T1  - New interaction partners of the MAPKAP-kinases 3pK and MK2
N2  - Auf der Suche nach physiologischen Substraten der MAPK-aktivierten Proteinkinasen (MAPKAP-Kinasen), 3pK und MAPKAP-K2 (MK2), wurden Mitglieder eines Säuger-Polycomb-Komplexes, HPH2 und das Protoonkoprotein Bmi1, als Interaktionspartner identifiziert. Proteine aus der Polycomb-Gruppe (PcG) sind dafür bekannt, multimere, Chromatin-assoziierte Proteinkomplexe zu bilden. Diese wirken als transkriptionelle Repressoren und spielen als solche eine wichtige Rolle sowohl in der Regulation von Entwicklungsprozessen als auch in der Kontrolle der zellulären Proliferation. HPH2 bindet im Hefe two-hybrid-System sowohl an 3pK als auch an MK2. Die Kinasen coimmunpräzipitieren auch mit den PcG-Proteinen. Weiterhin wurde festgestellt, daß nicht aktivierte und DNA-assoziierte 3pK, ähnlich wie Bmi1, in einem in vivo Repressionsassay als transkriptioneller Repressor wirkt. Dies unterstellt, daß 3pK, wie Bmi1, fähig sein muß, andere PcG-Proteine an das Zielgen zu rekrutieren, wo sich dann ein biologisch funktioneller Repressionskomplex rekonstituiert. Bmi1 ist ein Phosphoprotein und beide MAPKAP-Kinasen konnten in dieser Arbeit als in vitro Bmi1-Kinasen identifiziert werden. Da der Phosphorylierungsstatus von Bmi1 mit seiner Dissoziation und der anderer PcG-Proteine vom Chromatin korreliert, könnten die MAPKAP-Kinasen Regulatoren einer phosphorylierungs-abhängigen PcG-Komplex/Chromatin-Interaktion sein. 3pK und MK2 wurden hier als die ersten Kinasen identifiziert, die in Assoziation mit Proteinen von PcG-Komplexen vorliegen, was ein funktionelles Zusammenwirken von MAPK-Signaltransduktionsnetzwerk und der Regulation der PcG-Funktion nahe legt. Ein weiterer durch das two-hybrid-System und Coimmunpräzipitationsexperimente identifizierter Interaktionspartner beider hier analysierter MAPKAP-Kinasen ist der basische Helix-Loop-Helix- (bHLH) Transkriptionsfaktor E47. Dieses E2A-kodierte Protein bindet als Homo- bzw. Heterodimer mit gewebespezifischen bHLH-Proteinen an sogenannte E-Box-DNA-Motive und ist so in die Regulation gewebespezifischer Genexpression und Zelldifferenzierung involviert. In dieser Arbeit konnten 3pK und MK2 als in vitro Kinasen des in Zellen phosphoryliert vorliegenden Transkriptionsfaktors identifiziert werden. Weiterhin führte die transiente Expression jeder dieser Kinasen in einem Reportergenassay mit einem E-Box-Promotorkonstrukt zu einer Repression der transkriptionellen Aktivität von E47. Der bHLH-Transkriptionsfaktor E47 interagiert also mit beiden MAPKAP-Kinasen, 3pK und MK2, was die Kinasen als neu identifizierte Regulatoren der E47-abhängigen Genexpression präsentiert. Mit dieser Arbeit ist ein erster Aufschluß der physiologischen Aktivität der MAPKAP-Kinasen 3pK und MK2 als transkriptionelle Regulatoren gelungen.
N2  - SUMMARY In a search for physiological substrates for the MAPK-activated protein kinases (MAPKAP kinases), 3pK and MAPKAPK-2 (MK2), constituents of a mammalian polycomb complex, HPH2 and the proto-oncoprotein Bmi1 were identified as interaction partners. Polycomb group (PcG) proteins are characterised to form large multimeric, chromatin-associated protein complexes with repressive transcriptional function. PcG complexes have an important role in the regulation of developmental processes and in the control of cellular proliferation. HPH2 binds to either kinase in a yeast two-hybrid assay and both, 3pK and MK2 are shown here to coimmunoprecipitate with HPH2 and Bmi1 or Bmi1 from mammalian cell lysates, respectively. Further, non-activated and DNA-bound 3pK could be identified as a transcriptional repressor of a chromatin-embedded gene in an artificial repression assay similar to the function of Bmi1. This suggests, that non-activated and DNA-bound 3pK, like Bmi1, must be able to recruit other PcG proteins to the target gene to reconstitute a functional repressive complex. Bmi1 is a phosphoprotein and both, 3pK and MK2 were identified in this paper to be in vitro Bmi1-kinases. Since the Bmi1 phosphorylation status was shown to be correlated with its dissociation from chromatin, it is likely that the MAPKAP kinases might be regulators of phosphorylation-dependent PcG-complex/chromatin interaction. In summary, the MAPK-activated protein kinases 3pK and MK2 are the first kinases identified to be assembled with members of PcG-protein complexes, suggesting a link of the MAPK signalling network to the regulation of PcG complex function. Another new interaction partner of both MAPKAP kinases which was identified by means of the two-hybrid system and coimmunoprecipitation experiments is the basic helix-loop-helix (bHLH) transcription factor E47. This E2A-encoded protein is known to be involved in the regulation of tissue-specific gene expression and cell differentiation. E47 is a phosphoprotein, and 3pK and MK2 were identified as E47-kinases in vitro. Further, expression of either kinase results in a repression of the transcriptional activity of overexpressed E47 in transient reporter gene assays with an E-box containing promoter construct. In summary, the MAPK-activated protein kinases 3pK and MK2 were identified to be assembled with the bHLH transcription factor E47 suggesting that these kinases are regulators of E47 activity and E47 dependent gene expression. These results provide first evidence for the physiological function of the MAPKAP kinases 3pK and MK2 as transcriptional regulators.
KW  - MAP-Kinase
KW  - Signaltransduktion
KW  - Molekularbiologie
KW  - intrazelluläre Signaltransduktion
KW  - MAPK-Signalwege
KW  - MAPKAP-Kinase
KW  - 3pK
KW  - MK2
KW  - Polycomb
KW  - HPH2
KW  - Bmi1
KW  - Molecular biology
KW  - intracellular signal transduction
KW  - MAPK-Signalwege
KW  - MAPKAP kinase
KW  - 3pK
KW  - MK2
KW  - Polycomb
KW  - HPH2
KW  - Bmi1
KW  - bHLH transcription factor
Y1  - 2000
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1765
ER  - 
TY  - THES
A1  - Otto, Ines Maria
T1  - Klonierung und funktionelle Analyse des Aktinreorganisators p150-Spir
T1  - Cloning and functional analysis of the p150-Spir actin reorganizator
N2  - Die c-Jun-N-terminale Kinase (JNK), ein Mitglied der Familie der MAP-Kinasen (Mi-togen Activated Protein Kinases), wirkt als signalübertragender Effektor, der den klei-nen GTPasen der Rho–Familie Rac und Cdc42 nachgeschaltet ist. Rho-GTPasen spielen eine Schlüsselrolle in der Regulation von zellulären Aktinstrukturen und steuern Prozesse in der Zelle, die Änderungen der Aktinstruktur erfordern, wie z.B. Änderungen der Zellmorphologie, Zellmigration, Wachstum und Differenzierung. Genetische Studien an der Fruchtfliege Drosophila melanogaster konnten eine Rolle des Drosophila-JNK-Homologs DJNK(basket) in der Regulation von Zellbewegungen und Zellmorphologieänderungen während der Drosophila-Embryogenese zeigen. Inhibierung der Funktion von DJNK auf allen Stufen der DJNK-Signaltransduktions-kaskade führt zum sogenannten dorsal closure-Phänotyp der Embryonen mit fehlender Zellstreckung und fehlender Migration dorsaler Epithelzellen. Der molekulare Mechanismus, mit dessen Hilfe Rho-GTPasen Aktinstrukturen regu-lieren und wie JNK Einfluss auf Zellmorphologie und Zellbewegung nimmt, ist bisher nicht bekannt. Die Identifizierung neuer, mit JNK interagierender Proteine könnte zum besseren Verständnis der Funktion und Regulation von JNK führen. In dieser Arbeit wurde ein Yeast-Two-Hybrid-Screen mit dem Drosophila-Homolog DJNK/basket durchgeführt, der zur Entdeckung des Drosophila-Proteins p150-Spir als Interaktionspartner von DJNK führte. Der C-terminus des p150-Spir-Proteins enthält eine JNK-Interaktionsdomäne, ein DEJL-Motiv (Docking Site for Erk and JNK, LxL) und wird von aktivierten JNK-Proteinkinasen phosphoryliert. p150-Spir ist ein Multi-Domänen-Protein, das in seiner aminoterminalen Hälfte eine Aufeinanderfolge von vier WH2-Domänen (Wiskott Aldrich Homology Domain 2) enthält. WH2-Domänen binden monomeres Aktin, Proteine mit WH2 Domänen, wie z.B. WASP oder WAVE sind Aktinreorganisatoren. Die transiente Überexpression von p150-Spir in NIH3T3-Mausfibroblasten führt ebenfalls zu einer Aktinreorganisation. Eine weitere Domäne in p150-Spir ist eine modifizierte FYVE-Zinkfinger-Struktur (mFYVE) im zentralen Bereich des Proteins, die für die subzelluläre Lokalisation von p150-Spir von Bedeutung ist. Mutationen, welche die Zinkfingerstruktur zerstören, führen bei Überexpression in NIH3T3-Zellen zu einer zytoplasmatischen Lokalisation der mutierten p150-Spir-Proteine, während Wildtyp-p150-Spir perinukleär akkumuliert. Spir-Proteine sind evolutionär hoch konserviert. Es konnten Spir-ähnliche Sequenzen auf den humanen Chromosomen 16 und 18, in der Maus und in der Seescheide Ciona savignyi gefunden werden. Der höchste Grad an Konservierung besteht im Bereich der funktionellen Proteindomänen. Ein in allen Spir-Proteinen ent-haltenes, als Spir-Box bezeichnetes hoch konserviertes Sequenzmotiv befindet sich unmittelbar vor dem mFYVE-Zinkfinger. Die Spir-Box zeigt Strukturverwandschaft zur Rab-GTPase-Bindungsregion in Rabphilin 3A, einem Protein, das ebenfalls eine FYVE-Domäne besitzt. Rab-GTPasen sind wie FYVE-Domänenproteine in die Regulation zellulärer Vesikeltransportprozesse involviert. Das Vorhandensein beider Do-mänen in p150-Spir deutet auf eine Rolle des Proteins in zellulären Transportprozes-sen hin. Ein denkbares Modell wäre, daß p150-Spir unter der Kontrolle von JNK-Signalen zelluläre Aktinstrukturen reguliert, die für Transportprozessse in der Zelle von Bedeutung sind; p150-Spir fungiert damit möglicherweise als direktes Bindeglied zwischen MAPK-Signaltransduktionskaskaden und dem Aktinzytoskelett.
N2  - Summary c-Jun-N-terminal kinases (JNKs) are members of the MAPK family (mitogen activated protein kinases) and act as downstream effectors of Rho family-GTPases, Rac and Cdc42. Rho family GTPases are involved in the regulation of cellular actin structures and control cellular processes which require remodelling of the actin skeleton, such as morphological changes, migration, growth and differentiation. A role for the Drosophila JNK-homolog DJNK/basket in the regulation of cell move-ment and cell shape changes during Drosophila embryogenesis arises from its func-tion in the process of dorsal closure. Inhibition of the DJNK-cascade results in a mu-tant phenotyp, where the dorsal elongation and migration of the epithelial cells fails. However, a direct link between JNK signaling and actin reorganization has not yet been established. A Yeast-Two-Hybrid-Screen using DJNK as a bait led to the discovery of the new Drosophila protein p150-Spir. p150-Spir is a multi-domain protein with a stretch of acidic amino acids, a cluster of 4 WH2-domains (Wiskott Aldrich Homology Domain 2), a Spir-Box and a modified FYVE zinc-finger motif (mFYVE). In addition, the C-terminus of p150-Spir harbors a docking site for ERK and JNK, LXL (DEJL-motif) and is phosphorylated by JNK in vitro and in vivo. When coexpressed with p150-Spir in NIH3T3 cells, JNK translocates to and colocalizes with p150-Spir at discrete spots around the nucleus. In its N-terminal part p150-Spir possesses 4 WH2-Domains. WH2-domains bind monomeric actin and WH2-family proteins, such as WASP and WAVE are involved in actin reorganization. We can show that in NIH3T3 mouse fibroblasts, p150-Spir co-localizes with F-actin and its overexpression induces clustering of filamentous actin around the nucleus. A modified FYVE zinc-finger structure (mFYVE) is located in the central region of the protein. FYVE-fingers mediate cell membrane localization of proteins. Disruption of the p150-Spir mFYVE-structure by deletion mutagenesis or cysteine/serine substitu-tions shows that the mFYVE-domain determines the subcellular localisation of p150-Spir. In contrast to the perinuclear distribution of the wild type p150-Spir, the mutated protein exhibits a uniform cytoplasmic distribution. Spir-family proteins are highly conserved among different species. Comparison of Drosophila p150-Spir sequences to EST data bases identified similar sequences in human (on chromosomes 16 and 18), mouse and the ascidian Ciona savignyi. A con-served sequence motif found in all Spir proteins - called Spir-Box - is located in the N-terminus, next to the mFYVE domain. Close inspection of the Spir-Box sequence revealed homology to the GTPase binding region of Rabphilin 3A, a FYVE domain containing protein which binds the small GTPase Rab3a. Rab-GTPases are involved in the regulation of cellular vesicle trafficking processes. The presence of a mFYVE domain in p150-Spir protein and a Spir-Box - a possible Rab-GTPase binding motif - suggests a potential function of Spir proteins in vesicel transport. In a possible model Spir initiates remodelling processes of the actin cytoskeleton, necessary for cellular transport processes under the control of JNK signals and thereby provides a direct link between MAPK-signaling and the actin cytoskeleton.
KW  - Taufliege
KW  - Actin
KW  - MAP-Kinase
KW  - Molekulargenetik
KW  - p150-Spir
KW  - JNK
KW  - Drosophila
KW  - MAPK
KW  - Aktin
KW  - Zytoskelett
KW  - WH2-Domäne
KW  - FYVE-Motiv
KW  - Vesikeltransport
KW  - Rab-GTPase
KW  - p150-spir
KW  - JNK
KW  - Drosophila
KW  - MAPK
KW  - actin
KW  - cytosceleton
KW  - WH2-domain
KW  - FYVE-motif
KW  - vesicle trafficking
KW  - Rab-GTPase
Y1  - 2001
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1178402
ER  - 
TY  - THES
A1  - Hartkamp, Jörg
T1  - Regulation von MAPK Signalwegen durch die Sein/Threonin Kinase MLK3
T1  - regulation of MAPK signaling pathways through mixed lineage kinase 3
N2  - MAPK Kaskaden spielen eine Schlüsselrolle bei der Übertragung und der Umwandlung von extrazellulären Reizen in intrazelluläre Signale und regulieren dadurch unterschiedliche Prozesse wie Differenzierung, Zellproliferation oder Stress Antworten. 'Mixed Lineage Kinasen' (MLKs) bilden eine Familie von Serin/Threonin Proteinkinasen mit mehreren Protein/Protein Interaktionsdomänen (SH3, Cdc42 Rac interactive binding sequence/CRIB, Leuzin Zipper), die am engsten mit der Familie der MAPKK Kinasen verwandt ist. In der voliegenden Arbeit zeigen wir, dass MLK3 Cdc42/Rac induzierte JNK/SAPK Aktivität vermittelt, welches zu einer anschließenden Phosphorylierung und verstärkter transkriptioneller Aktivität des zur AP-1 Familie gehörenden immediate early Gens c-Jun führt. Zusätzlich phosphoryliert MLK3 die dualspezifischen Kinasen MEK1/2 direkt in vitro und in vivo an den für die Aktivierung wichtigen Serinen 217/221. Wohingegen dies nur zu einer ERK Aktivierung in Überexpressionssystemen führte, demonstrieren die Analysen überzeugend, dass endogenes MEK1/2, welches von MLK3 phosphoryliert worden ist, nicht in der Lage ist, diese Aktivität auf das physiologische Substrat ERK1/2 in vitro wie auch in vivo zu übertragen. Wir postulieren daher, dass MLK3 vermittelte MEK1/2 Phosphorylierung die dualspezifischen Kinasen von ERK1/2 Aktivierung entkoppelt. Zusätzlich zeigen wir, dass Überexpression von Wild Typ MLK3 zur morphologischen Transformation von NIH 3T3 Fibroblasten und Wachstum in Soft Agar führt. In Übereinstimmung mit den anderen Analysen ist MEK1/2 stark phosphoryliert jedoch von ERK1/2 Aktivierung in MLK3 transformierten Zellen entkoppelt. Weiterhin kooperiert MLK3 mit aktivierter MEK1 in Foci Bildung, was zeigt, dass MLK3 andere Signalwege als ERK1/2 in der Zelltransformation benutzt. Vielmehr ist in MLK3 transformierten Fibroblasten Wachstumsfaktor-induzierte ERK1/2 Aktivierung und Expression des immediate early Gens junB partiell blockiert. Unsere Analysen zeigen zum ersten Mal für eine MAPKK Kinase, dass sie MAPK Signalwege unterschiedlich reguliert. Während MLK3 auf der einen Seite JNK/SAPK aktiviert, entkoppelt es MEK1/2 induzierte Phosphorylierung von ERK1/2 Aktivierung und blockiert sogar Wachstumsfaktor-induzierte ERK1/2 Ativierung partiell.
N2  - MAPK cascades play a key role in transducing and converting signals from extracellular stimuli into intracellular signals thereby regulating diverse processes like differentiation, proliferation or stress responses. Mixed lineage kinases (MLKs) form a family of serin/threonin protein kinases with multiple protein/protein interaction domains (SH3, Cdc42 Rac interactive binding sequence/CRIB, leucine zipper), which are most closely related to the MAPKK kinase family. In this work we show that MLK3 mediates Cdc42/Rac induced JNK/SAPK activation resulting in subsequent phosphorylation and enhanced transcriptional activity of the immediate early gene c-jun, which belongs to the family of AP-1 proteins. In addition MLK3 directly phosphorylates the dual specificity kinases MEK1/2 in vitro and in vivo on serines 217/221, which are important for activation. Whereas this only resulted in activation of the ERK1/2 pathway in overexpression systems, the analyses demonstrate convincingly that endogenous MEK1/2 phosphorylated by MLK3 is unable to transmit its activity in vitro and in vivo to its physiological substrat, ERK1/2. Therefore we postulate that MLK3 mediated MEK1/2 phosphorylation uncouples the dual specificity kinases from ERK1/2 activation. Furthermore we show that overexpression of wild type MLK3 leads to morphological transformation of NIH 3T3 fibroblasts and growth in soft agar. Consistent with the other analyses MEK1/2 is highly phosphorylated but uncoupled from ERK1/2 activation in MLK3 transformed cells. In addition MLK3 cooperates with activated MEK1 in foci formation which demonstrates that MLK3 utilizes pathways different from ERK1/2 for cell transformation. Furthermore growth factor induced ERK1/2 activation and induction of the immediate early gene junB is partially blocked in MLK3 transformed fibroblasts. Our data provide evidence for the first time that a MAPKK kinase differentially regulates MAPK pathways. On the one hand MLK3 activates JNK/SAPK but on the other hand it uncouples MEK1/2 phosphorylation from ERK1/2 activation and even blocks growth factor induced ERK1/2 activation partially.
KW  - MAP-Kinase
KW  - Signaltransduktion
KW  - Protein-Serin-Threonin-Kinasen
KW  - MLK3
KW  - ERK
KW  - MEK
KW  - JNK
KW  - jun
KW  - Transformation
KW  - MLK3
KW  - ERK
KW  - MEK
KW  - JNK
KW  - jun
KW  - transformation
Y1  - 2001
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-312
ER  - 
TY  - THES
A1  - Schmidt, Marc
T1  - Die Rolle mitogener und stressinduzierter MAPK-Signalwege in der Regulation von keratinozytären Wachstums- und Differenzierungsvorgängen
T1  - The role of mitogenic and stress-induced MAPK pathways in the regulation of growth and differentiation of keratinocytes
N2  - Fehlgeleitete Proliferations- und Differenzierungsprozesse von Keratinozyten spielen eine entscheidende Rolle in der Pathogenese vieler Hauterkrankungen. Die intrazellulären Signalmechanismen, die die Balance zwischen Keratinozytenwachstum und -differen-zierung steuern, sind bislang weitgehend unbekannt. In dieser Arbeit wurde die Bedeutung Mitogen-aktivierter Proteinkinase (MAPK-) Signalwege in keratinozytären Wachstums- und Differenzierungsvorgängen untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß Induktion von Keratinozytendifferenzierung durch Erhöhung der extrazellulären Calciumkonzentration mit einer raschen und transienten Aktivierung des Raf/MEK/Erk- (MAPK-) Signalweges verbunden ist, während keine veränderte Aktivität der stressinduzierten MAPK Jnk und p38 nachweisbar war. Die calciuminduzierte Erk-Aktivierung unterschied sich in ihrer Kinetik von mitogener Erk-Aktivierung durch den Epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) und konnte durch Veränderungen der intrazellulären Calciumkonzentration moduliert werden. Während die mitogene Erk-Aktivierung durch die kleine GTPase Ras vermittelt wird, erfolgte calciuminduzierte Aktivierung von Erk Ras-unabhängig, was auf einen fundamentalen Unterschied mitogener und differenzierungsinduzierender Stimuli hinsichtlich ihrer Aktivierungsmechanismen der Raf/MEK/Erk-Kaskade hindeutet. Trotz der transienten Natur der calciuminduzierten Erk-Aktivierung waren die calcium-vermittelte Expression des Zellzykusinhibitors p21/Cip1 und des Differenzierungsmarkers Involucrin sensitiv für MEK-Inhibition, was auf eine wichtige Rolle des Raf/MEK/Erk-Signalweges in frühen Stadien des Differenzierungsprozesses hinweist. Wichtige Konvergenzpunkte zwischen calcium- und MAPK-abhängigen Signalwegen scheinen die beiden calciumbindenden S100-Proteine MRP8 und MRP14 zu sein. Beide Proteine werden in vitro differenzierungsabhängig exprimiert und translozieren sowohl nach Erhöhung der intrazellulären Calciumkonzentration als auch nach Stimulation stress-aktivierter MAPK an Zytoskelettstrukturen. Untersuchung der Expression von MRP8 und MRP14 in paraffin- und kryofixierten Serienschnitten gesunder und pathologisch veränderter Haut ergab, dass deren Expression normalerweise auf differenzierende Zellen im Haarfollikel beschränkt ist, jedoch in differenzierten Hautschichten hyperproliferativer oder tumoröser Haut massiv induziert werden kann. In der hier vorgestellten Arbeit wurden interessante neue Signalbeziehungen identifiziert, deren Entdeckung einen wichtigen Beitrag zum Verständnis der regulatorischen Mechanismen leisten könnte, durch die die Epidermis ihre funktionell wichtige Homöostase erhält.
N2  - Abnormal proliferation and differentiation processes play an important role in the pathogenesis of various skin diseases. The intracellular signaling mechanisms governing the balance between growth and differentiation of keratinocytes are still largely unknown. In this thesis the role of mitogen-activated protein kinase (MAPK) cascades in keratinocyte growth and differentiation was analysed. Induction of keratinocyte differentiation by elevation of extracellular calcium levels resulted in a rapid and transient activation of the Raf/MEK/Erk (MAPK) pathway but did not increase activity of the stress-activated Jnk or p38 MAPKs. Calcium-induced Erk activation differed in kinetics from mitogenic Erk activation by epidermal growth factor (EGF) and and could be modulated by alterations of intracellular calcium levels. While EGF-induced Erk activation was mediated by the small GTPase Ras, calcium-induced Erk activity occurred independently of active Ras. This suggests that proliferative and differentiation-inducing stimuli use alternative mechanisms to activate the Raf/MEK/Erk pathway. Despite the transient nature of Erk activation, calcium-induced expression of the cell cycle inhibitor protein p21 and the differentiation marker involucrin were sensitive to MEK inhibition which implies a role for the Raf/MEK/Erk pathway in early stages of keratinocyte differentiation. The two calcium binding S100 proteins additionally studied here, MRP8 and MRP14, seem to represent important convergent points between calcium and MAPK signaling. In vitro both proteins are expressed in a differentiation-dependent manner in keratinocytes. Elevation of intracellular calcium levels as well as activation of stress-activated MAPKs resulted in translocation of MRP8/MRP14 complexes to the cytoskeleton. When expression of MRP8 and MRP14 was analysed in serial paraffin- or kryo-sections of healthy or diseased skin, signals in normal skin were largely restricted to differentiating cells of the hair follicle, however, additionally a strong induction of MRP8/14 expression was observed in differentiating epidermal layers of hyperproliferative or tumorigenic skin. In this thesis important novel signaling interactions were identified which provide new basic insights into the molecular mechanisms involved in the regulation of skin homeostasis which is essential for the maintenance of the multiple functions of the epidermis.
KW  - Keratinozyt
KW  - Zelldifferenzierung
KW  - MAP-Kinase
KW  - Signaltransduktion
KW  - Keratinozyten
KW  - Differenzierung
KW  - Calcium
KW  - MAP-Kinase
KW  - Signaltransduktion
KW  - S100-Protein
KW  - Raf/MEK/ERK
KW  - Keratinocyte
KW  - differentiation
KW  - calcium
KW  - MAPK
KW  - signal transduction
KW  - S100 protein
KW  - Raf/MEK/ERK
Y1  - 2001
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-2013
ER  - 
TY  - THES
A1  - Rennefahrt, Ulrike
T1  - Die Rolle einer konstitutiv-aktiven MAP-Kinase SAPK-Beta bei der zellulären Transformation, Proliferation und Apoptose von NIH-3T3-Fibroblasten
T1  - The role of a constitutively active MAP kinase SAPKbeta in cellular transformation, proliferation and apoptosis of NIH 3T3 fibroblasts
N2  - Bei c-Jun N-terminalen Kinasen (JNKs) (auch als Stress-aktivierte Proteinkinasen SAPKs bezeichnet), handelt es sich um Mitglieder der Mitogen-aktivierten Proteinkinase Familie (MAPK), die die Genexpression als eine Antwort auf eine Vielzahl von physiologischen und nicht-physiologischen Stimuli regulieren. Gendeletionsexperimente (knockout) und der Einsatz von dominant-negativen Mutanten wiesen auf eine Funktion von SAPK/JNKs bei Prozessen der zellulären Differenzierung, dem Überleben und/oder Apoptose sowie onkogener Transformation hin. Direkte Analysen des transformierenden Potentials von SAPK/JNKs wurden bislang durch das Fehlen von konstitutiv-aktiven Mutanten verhindert. Erst unlängst konnte durch die Fusion der MAP Kinase mit seiner direkten, in der Kaskade vorgeschalteten, Aktivatorkinase solche Mutanten bereitgestellt werden. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde ein SAPKb-MKK7 Hybridprotein generiert, mit dessen Hilfe das transformierende Potential von aktiviertem SAPKb charakterisiert werden konnte. Die induzierte Expression von SAPKb-MKK7 führte zur morphologischen Transformation von NIH 3T3 Fibroblasten. Darüber hinaus bildeten diese Zellen kleine Foci aus transformierten Zellen, wuchsen in Soft-Agar und vergleichbar mit onkogenem Ras oder Raf, resultierte auch die Expression von aktiviertem SAPKb in der Zerstörung des F-Aktins. Des Weiteren steigerte die Expression von SAPKb-MKK7 die Proliferationsraten von NIH 3T3 Zellen. Im Gegensatz zu den akut transformierenden Onkogenen wie ras oder raf, ist SAPKb-MKK7 jedoch nicht in der Lage, das Überleben der transformierten Zellen zu bewirken. Unsere Daten schlagen daher vor, das konstitutiv-aktives SAPK/JNK zwar die Hauptaspekte zellulärer Transformation verursacht, aber nicht imstande ist, alle Veränderungen zu induzieren, die benötigt werden, um einen vollständig transformierten Phänotypen zu etablieren, weshalb insgesamt gesehen, sein transformierendes Potential deutlich schwächer ausgeprägt ist. Wir haben zusätzlich damit begonnen, dass tumorgene Potential von SAPKb-MKK7 direkt im Nacktmausmodell zu verifizieren. Die Injektion von SAPKb-MKK7 exprimierenden Fibroblasten resultierte in der Etablierung eines gut definierten Fibrosarkoms, wobei die Latenzzeit länger war als bei v-Raf transformierten Zellen. Somit ist die Expression von aktiviertem SAPK/JNK ausreichend, um die Tumorentwicklung in vivo zu initieren, auch wenn die lange Latenzzeit auf die Notwendigkeit zusätzlicher genetischer Veränderungen hinweist.
N2  - The c-Jun N-terminal kinases (JNKs) (also known as stress-activated protein kinases, SAPKs), members of the mitogen-activated protein kinase (MAPK) family, regulate gene expression in response to a variety of physiological and environmental stimuli. Gene knockout experiments and the use of dominant interfering mutants have pointed to a role of SAPK/JNKs in the processes of cell differentiation, survival and/or apoptosis as well as oncogenic transformation. Direct analysis of the transforming potential of JNKs has been hampered so far by the lack of constitutively active forms of these kinases. Recently such mutants have become available by fusion of the MAPK with its direct upstream activator kinase. In the context of this PhD thesis a constitutively active SAPKb-MKK7 hybrid protein was generated and used to characterize the transforming potential of activated SAPKb. Inducible expression of SAPKb-MKK7 caused morphological transformation of NIH 3T3 fibroblasts. Additionally, these cells formed small foci of transformed cells, grew anchorage-independent in soft agar and similar to oncogenic Ras and Raf, expression of activated SAPKb resulted in the degradation of F-actin stress fibers. Furthermore, expression of SAPKb-MKK7 increased proliferation rates of NIH 3T3 cells. However, in contrast to the classical oncogenes like ras and raf, SAPKb-MKK7 is not able to selectively support the survival of the transformed cells. Therefore, our data suggest that constitutive SAPK/JNK activation elicits major aspects of cellular transformation, but is unable to induce the complete set of changes which are required to establish the fully transformed phenotype. We have also begun to directly determine the tumorigenic potential of SAPKb-MKK7 in the nude mouse. Injection of SAPKb-MKK7 expressing fibroblasts resulted in the establishement of a well defined fibrosarcoma, albeit at much later timepoints than in the case of v-Raf transformed cells. The long latency with which they develop tumors suggests the requirement of further genetic alterations. Thus expression of activated SAPK/JNK is sufficient to initiate tumor development in vivo.
KW  - MAP-Kinase
KW  - Zelldifferenzierung
KW  - SAPK
KW  - JNK
KW  - Signaltransduktion
KW  - Transformation
KW  - Fibroblasten
KW  - SAPK
KW  - JNK
KW  - signal transduction
KW  - transformation
KW  - fibroblasts
Y1  - 2002
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-4158
ER  - 
TY  - THES
A1  - Stark, Felix
T1  - Funktionelle Untersuchungen zur Regulation der Protein Kinase CK2 durch Polyamine in Drosophila melanogaster und deren physiologische Bedeutung
T1  - Functional analysis of the regulation of the protein kinase CK2 by polyamines in Drosophila melanogaster and its psyiological meaning
N2  - Die heterotetramere Proteinkinase CK2 nimmt aufgrund der großen Anzahl und Diversität ihrer Substrate, sowie aufgrund ihrer Eigenschaft Signalwege miteinander zu vernetzen eine Sonderstellung innerhalb der Kinasen ein. CK2 beeinflusst Proliferation, Differenzierung und Apoptose, Prozesse an denen auch Polyamine und der MAPK-Signalweg beteiligt sind. Eine vor kurzem durchgeführte Arbeit beschreibt die Bindung von CK2 an das Gerüstprotein KSR und die Verstärkung des MAPK-Signalwegs durch Phosphorylierung von Raf-Proteinen in Vertebraten. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass CK2 auch in Drosophila mit KSR interagiert und das einzige in Drosophila vorhandene Raf-Potein (DRaf) in vitro phosphoryliert. Im Gegensatz zur Phosphorylierung der humanen B-Raf und C-Raf Proteine an Serin 446 bzw. Serin 338 innerhalb der „negative charge regulatory region“ (N-Region), führten Kinasereaktionen und Massenspektrometrische Untersuchungen zur Identifizierung von Serin 11 als CK2 Phosphorylierungsstelle in DRaf, während ein zu Serin 446 in B-Raf äquivalentes Serin in der N-Region in Drosophila nicht durch CK2 phosphoryliert wird. Durch Überexpression von DRaf sowie von zwei DRaf-Varianten bei denen Serin 11 durch Alanin oder Aspartat substituiert wurde (DRafS11A und DRafS11D) konnte in Zellkulturexperimenten gezeigt werden, dass die Ladung an der Aminosäureposition 11 die Funktion von DRaf beeinflusst, wobei eine negative Ladung an dieser Stelle zur Phosphorylierung und Aktivierung der Effektorkinase Erk führt. Die Phosphorylierung durch CK2 ist unabhängig von regulatorischen Botenstoffen ("second messengers"), wird aber durch Bindung von Polyaminen moduliert. Intrazelluläre Polyamine entstammen zum grossen Teil dem zellulären Aminosäurekatabolismus und beeinflussen die Phosphorylierung von DRaf durch CK2 in vitro, wobei Spermin ein effizienter Inhibitor der Reaktion ist, während die Effekte von Putrescin und Spermidin gering sind. Auch in Drosophila Schneider S2 Zellen und in adulten weiblichen Fliegen hat Spermin einen inhibitorischen, CK2-abhängigen Effekt auf die Aktivierung von Erk. Ausserdem konnte gezeigt werden, dass Putrescin und Spermidin in der Lage sind die Aktivierung von Erk, im Vergleich zu Zellen die nur mit Spermin behandelt wurden, zu erhöhen. Das spricht dafür, dass die Phosphorylierung von DRaf und die davon abhängige Aktivierung von Erk durch CK2 von der Menge und Relation der verschiedenen Polyamine zueinander abhängt. Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen den Schluss zu, dass der Polyaminmetabolismus über CK2 mit dem MAPK-Signalweg verknüpft ist. Nachdem Polyamine durch Aminosäurekatabolismus enstehen, kann auf diese Weise der MAPK-Signalweg in Abhängigkeit der Verfügbarkeit zellulärer Aminosäuren reguliert werden. Vorversuche zeigten eine Beeinflussung von Proliferation und Apoptose durch CK2 und Polyamine. Weitere Untersuchungen sind aber nötig um spezifische Einflüsse von Polyaminen und CK2 auf zelluläre Prozesse wie Proliferation, Differenzierung und Apoptose aufzudecken.
N2  - Because of its high number and diversity of substrates, as well as its ability to cross-link signalling pathways, the heterotetrameric protein kinase CK2 has an exceptional position within kinases. CK2 influences proliferation, differentiation and apoptosis, processes in which also polyamines and the MAPK-signalling pathway are involved. A recent publication delineates binding of CK2 to the scaffold protein KSR and the enhancement of the MAPK-signalling pathway by phosphorylation of Raf-proteins in vertebrates. In my thesis I could show that CK2 also interacts with KSR in Drosophila and phosphorylates the only existing Raf protein in Drosophila (DRaf) in vitro. In contrast to the phosphorylation of human B-Raf- and C-Raf-proteins on serine 446 respectively serine 338 within the "negative charge regulatory region" (N-region), kinase reactions and mass spectrometric analyses led to the identification of serine 11 as phosphorylation site in DRaf, whereas a serine in the N-region, which corresponds to serine 446 of B-Raf, is not phosphorylated by CK2 in Drosophila. In cell culture experiments overexpression of DRaf and two DRaf-variants, in which serine 11 was substituted by alanine or aspartate (DRafS11A and DRafS11D), revealed the charge at amino acid position 11 to affect the function of DRaf, with a negative charge leading to phosphorylation and activation of the effector kinase Erk. Phosphorylation by CK2 is independent of second messengers, whereas it is modified by binding of polyamines. Intracellular polyamines mainly derive from cellular amino acid catabolism and modulate the phosphorylation of DRaf by CK2 in vitro with spermine being an efficient inhibitor of the reaction, whereas the effects of putrescine and spermidine are minor. In Drosophila Schneider S2 cells and adult flies spermine inhibits the activation of Erk in a CK2-dependent way. Furthermore administration of putrescine and spermidine in combination with spermine leads to enhanced Erk activation in cells compared to cells that are treated with spermine. These results suggest that phosphorylation of DRaf and the subsequent activation of Erk by CK2 are dependent on the amount and relative concentrations of polyamines. Altogether the results of this work demonstrate a role for CK2 in linking polyamine metabolism to the MAPK-signalling pathway. Since polyamines derive from amino acid catabolism, the MAPK-signalling pathway can be regulated dependent on the availability of cellular amino acids. Preliminary experiments point to CK2- and polyamine-dependent effects on proliferation and apoptosis. Further investigations are necessary to reveal specific effects of polyamines and CK2 on cellular processes like proliferation, differentiation and apoptosis.
KW  - Protein Kinase CK2
KW  - Polyamine
KW  - MAP-Kinase
KW  - Signaltransduktion
KW  - Taufliege
KW  - Raf <Biochemie>
KW  - MAPK-Signalweg
KW  - Drosophila melanogaster
KW  - DRaf
KW  - protein kinase CK2
KW  - polyamines
KW  - MAPK signalling pathway
KW  - Drosophila melanogaster
KW  - DRaf
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-57522
ER  -