TY - THES A1 - Riekert, Maximilian T1 - Der Einfluss mesenchymaler Stammzellen auf T-Zellsubpopulationen bei gesunden Probanden und Patienten mit rheumatischen Erkrankungen T1 - The influence of mesenchymal stem cells on T-cell subsets in healthy donors and patients with rheumatic diseases N2 - In dieser Arbeit wurde der Einfluss mesenchymaler Stammzellen (MSC) auf verschiedene T-Zellsubpopulationen in vitro untersucht. Dazu wurden Naive- und Nicht-Naive CD4+ T-Zellen aus humanen PBMCs von gesunden Probanden und Patienten mit Autoimmun-Arthritis bei rheumatischen Erkrankungen isoliert und im Beisein/in Abwesenheit von MSCs unter Th-17-polarisierenden Bedingungen kultiviert. Nach einer 6 Tage umfassenden Inkubationszeit erfolgte die flowzytometrische Bestimmung des Phänotyps, der Proliferation, der Apoptose, des Zytokinprofils und der Chemokinrezeptorexpression Naiver und Nicht-Naiver-CD4+ T-Zellen im Beisein/in Abwesenheit von MSCs. Die Phänotypen wurden als CD45RA+CD27+ Naive-, CD45RA-CD27+ Gedächtnis-, CD45RA- CD27- Effektor- und CD45RA+CD27- TEMRA-Zellen definiert und ihre jeweiligen prozentualen Anteile an allen CD4+ T-Zellen bestimmt. Nach Beurteilung der Proliferation und Apoptose, erfolgte die Analyse der IFNγ-, IL-17-, IL-9- und IL-13-Produktion für jeden der vier Phänotypen. Zusätzlich wurde der prozentuale Anteil an FoxP3+CD25+CD127- Tregs und deren IL-10-Produktion bestimmt. Abschließend erfolgte die Messung der CCR5-, CCR6- und CXCR3- Expression. Insgesamt konnte sowohl in der Naiven CD4+- als auch in der Nicht-Naiven CD4+ T- Zellfraktion eine Hemmung der Proliferation und Apoptose CD4+ T-Zellen durch MSCs gemessen werden. Zudem supprimierten MSCs die Produktion der Zytokine IFNγ, IL-17, IL-9 und IL-10 und steigerten teilweise die Produktion von antiinflammatorischem IL-13. In den vier untersuchten Phänotypen verhielt sich die Zytokinproduktion variabel und war bei CD45RA-CD27+ Gedächtnis- und CD45RA-CD27- Effektor-Zellen am größten. Der hemmende Einfluss der MSCs war auf diese beiden Phänotypen ebenfalls am stärksten ausgeprägt. CD45RA+CD27+ Naive- und CD45RA+CD27- TEMRA-Zellen produzierten in Kultur mit MSCs mitunter vermehrt proinflammatorische Zytokine. Analog zur Proliferation und Apoptose verminderten MSCs die Expression von CCR5, CCR6 und CXCR3 auf CD4+ T-Zellen. Die beschriebenen Effekte der MSCs konnten sowohl bei gesunden Probanden, als auch bei Patienten mit rheumatischen Erkrankungen nachgewiesen werden. Durch die Verwendung eines Transwell®-Systems konnte gezeigt werden, dass MSCs ihre Wirkung auf T-Lymphozyten nicht nur durch direkten Zell-Zell-Kontakt, sondern auch über lösliche Faktoren ausüben. Die Resultate dieser Arbeit verdeutlichen den immunsuppressiven Charakter der MSCs auf Naive und Nicht-Naive CD4+ T-Zellen unter Th17-polarisierenden Bedingungen in vitro. Jedoch zeigt die Analyse der Zytokinproduktion in den untersuchten T-Zell-Phänotypen, dass MSCs neben ihrer immunsuppressiven Eigenschaft die Zytokinantwort einzelner T-Zellphänotypen steigern können. MSCs scheinen daher am ehesten eine immunmodulatorische Rolle zu spielen, indem sie übersteigerte Immunreaktionen herabsetzen und bei Bedarf immunstimulierend wirken. N2 - In this thesis the influence of mesenchymal stem cells (MSCs) on different T cell subsets was investigated in vitro. Naive- and Non-Naive CD4+ T cells were isolated from human PBMCs of healthy donors and patients with rheumatic diseases and cultured in presence/in absence of MSCs under Th17 polarizing conditions. After incubation for six days phenotype, proliferation, apoptosis, cytokine profile and expression of chemokine receptors of Naive- and Non-Naive CD4+ T cells in presence/in absence of MSCs was determined by flow cytometry. T cell subsets were defined as CD45RA+CD27+ Naive, CD45RA-CD27+ Memory, CD45RA-CD27- Effektor and CD45RA+CD27- TEMRA cells and the percentage of total CD4+ T cells was calculated. After assessing proliferation and apoptosis, production of IFNγ, IL-17, IL-9 and IL-13 was analyzed for each of the four subsets. Additionally, the percentages of FoxP3+CD25+CD127- Tregs and the corresponding production of IL-10 were determined. Finally, the expression of chemokine receptors CCR5, CCR6 and CXCR3 was measured. In both the Naive and Non-Naive CD4+ cell fraction an inhibition of proliferation and apoptosis of CD4+ T cells through MSCs was analyzed. Moreover, MSCs suppressed the production of the cytokines IFNγ, IL-17, IL-9 and IL-10 and partially enhanced the production of IL-13. The cytokine production varied in the four analyzed T cell subsets, with the highest cytokine production among CD45RA-CD27+ Memory and CD45RA-CD27- Effector cells. The inhibiting influence of MSCs on these two subsets was most prominent. CD45RA+CD27+ Naive and CD45RA+CD27- TEMRA cells occasionally produced more proinflammatory cytokines in culture with MSCs. Like similar effects of MSCs on proliferation and apoptosis, MSCs diminished the expression of CCR5, CCR6 and CXCR3 on CD4+ T cells. The effects of MSCs were demonstrated in both, healthy donors and patients with rheumatic diseases. By the use of a Transwell®-System it was shown that MSCs exert their effects not only through direct cell-cell-contact but also by soluble factors. The results of this thesis elucidate the immunosuppressive character of MSCs on Naive and Non-Naive CD4+ T cells under Th17-polarizing conditions in vitro. However, the analysis of the cytokine production in the investigated T cell subsets showed, that MSCs are able to enhance the immune response besides their immunosuppressive properties. Therefore, MSCs most likely seem to play an immunomodulatory role, by reducing exaggerated immune reactions and, if required are also able to act immune stimulating. KW - mesenchymal KW - stem KW - cell KW - Rheuma KW - Mesenchymale Stammzellen KW - Mesenchymal Stem Cells KW - Rheuma KW - Immunologie KW - Immunology KW - T-Zellen KW - T-Cells KW - Subpopulationen KW - Subsets Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-178195 ER - TY - THES A1 - Fensky, Florian T1 - Untersuchungen zur chondrogenen Prädifferenzierung von humanen mesenchymalen Stammzellen in Kollagen Typ I Hydrogelen unter dem Einfluss von TGF-ß1 T1 - Chondrogenic predifferentiation of human mesenchymal stem cells (MSC) in collagen type I hydrogels under the influence of TGF-ß1 N2 - Der hyaline Gelenkknorpel ist auf Grund seines sehr eingeschränkten Selbstheilungspotentiales nicht in der Lage, auf Verletzungen mit adäquaten Regenerationsmechanismen zu reagieren. So hat sich in der Orthopädischen Klinik König-Ludwig-Haus zur Behandlung von fokalen Gelenkknorpelläsionen die matrixgekoppelte autologe Chondrozytentransplantation unter Verwendung eines Kollagen Typ I Hydrogel (CaReS®, Arthro Kinetics, Esslingen) etabliert. In der Zukunft könnten möglicherweise humane mesenchymale Stammzellen (hMSZ) eine alternative Zellquelle darstellen. In der vorliegenden Arbeit wurde in Anlehnung an die im klinischen Alltag befindliche matrixgekoppelte ACT der Frage nachgegangen, ob eine ex vivo Prädifferenzierung von hMSZ mit TGF-ß1 für 10 Tage zu einer chondrogenen Differenzierung führt. Durch den Nachweis chondrogener Markergene wie Kollagen II und Aggrekan konnte gezeigt werden, dass eine chondrogene Differenzierung von hMSZ unter Zugabe von TGF-ß1 über 10 Tage induziert werden kann. Ob diese 10-tägige Prädifferenzierung zu einem ausreichend stabilen Gelenkknorpelregenerat führen kann, muss letztendlich im Tierversuch überprüft werden. N2 - Due to the very restricted self-healing potential articular cartilage is not able to react to injuries with adequate regeneration mechanisms. Concerning this problem the matrix-based autologous chondrocyte transplantation (ACT) using a collagen type I hydrogel as a three-dimensional scaffold (CaReS®, Arthro Kinetics, Esslingen) is currently established in the Orthopaedic Institute, König-Ludwig-Haus to treat focal cartilage defects. In the future human mesenchymal stem cells (MSC) can form an alternative cell source for tissue engineering. With reference to the matrix-based ACT, the objective of this study was to determine whether an ex vivo predifferentiation with TGF-ß1 over 10 days leads to a chondrogenic differentiation of MSC. The proof of the decisive chondrogenic marker genes, like collagen type II and aggrecan, demonstrated that a chondrogenic differentiation of human mesenchymal stem cells can be induced under the influence TGF-ß1 over a period of 10 days. Further animal experiments will reveal whether this 10-day ex vivo predifferentiation can lead to a sufficiently stable articular cartilage. KW - Chondrogene Differenzierung KW - Mesenchymale Stammzellen KW - Kollagen Hydrogel KW - Chondrogenic Differentiation KW - Mesenchymal Stem Cells KW - Collagen Hydrogel Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-36622 ER - TY - THES A1 - Schilling, Tatjana T1 - Transdifferentiation of Human Mesenchymal Stem Cells T1 - Transdifferenzierung humaner Mesenchymaler Stammzellen N2 - With ageing, the loss of bone mass correlates with the expansion of adipose tissue in human bone marrow thus facilitating bone-related diseases like osteopenia and osteoporosis. The molecular mechanisms underlying these events are still largely unknown. Reduced osteogenesis and concurrently enhanced adipogenesis might not only occur due to the impairment of conventional osteogenic differentiation originating from mesenchymal stem cells (MSCs). Additionally, transdifferentiation of (pre-)osteoblasts into adipocytes could contribute to the fatty conversion. Therefore, the aim of the present study was to prove the existence of transdifferentiation between the adipogenic and osteogenic lineage and to elucidate molecular mechanisms underlying this phenomenon. At first, a cell culture system of primary human MSCs was established that allowed for differentiation into the adipogenic and osteogenic lineage and proved that the MSC-derived adipocytes and pre-osteoblasts were capable of transdifferentiation (reprogramming) from one into the other lineage. Thereby, lineage-specific markers were completely reversed after reprogramming of pre-osteoblasts into adipocytes. The osteogenic transdifferentiation of adipocytes was slightly less efficient since osteogenic markers were present but the adipogenic ones partly persisted. Hence, plasticity also reached into the differentiation pathways of both lineages and the better performance of adipogenic reprogramming further supported the assumption of its occurrence in vivo. The subsequent examination of gene expression changes by microarray analyses that compared transdifferentiated cells with conventionally differentiated ones revealed high numbers of reproducibly regulated genes shortly after initiation of adipogenic and osteogenic reprogramming. Thereof, many genes were correlated with metabolism, transcription, and signal transduction as FGF, IGF, and Wnt signalling, but only few of the established adipogenesis- and none of the osteogenesis-associated marker genes were detected within 24 h after initiation of transdifferentiation. To find possible key control factors of transdifferentiation amongst the huge amount of regulated genes, a novel bioinformatic scoring scheme was developed that ranked genes due to their potential relevance for reprogramming. Besides the reproducibility and level of their regulation, also the possible reciprocity between the adipogenic and osteogenic transdifferentiation pathway was taken into account. Fibroblast growth factor 1 (FGF1) that ranked as one of the leading candidates to govern reprogramming was proven to inhibit adipogenic differentiation as well as adipogenic transdifferentiation in our cell culture system. Further examination of the FGF signalling pathway and other highly ranked genes could help to better understand the age-related fatty degeneration at the molecular level and therefore provide target molecules for therapeutic modulation of the plasticity of both lineages in order to inhibit adipogenic degeneration and to enhance osteogenesis. N2 - Der Verlust an Knochenmasse im Alter ist mit der Ausbreitung von Fettgewebe im menschlichen Knochenmark assoziiert und fördert daher auch knochenspezifische Erkrankungen wie Osteopenie und Osteoporose. Die diesen Ereignissen zu Grunde liegenden Mechanismen sind immer noch weitgehend unbekannt. Die abnehmende Osteogenese und die gleichzeitig zunehmende Adipogenese treten wahrscheinlich nicht nur wegen der Beeinträchtigung der konventionellen osteogenen Differenzierung von mesenchymalen Stammzellen (MSZ) auf. Zusätzlich könnte auch die Transdifferenzierung (Reprogrammierung) von Osteoblasten(vorläufern) zu Adipozyten zur fettigen Umwandlung beitragen. Das Ziel der vorliegenden Studie war es daher, die Existenz der Transdifferenzierung zwischen dem adipogenen und osteogenen Differenzierungsweg nachzuweisen und die molekularen Mechanismen aufzuklären, die diesem Phänomen zu Grunde liegen. Zunächst wurde ein Zellkultursystem primärer mesenchymaler Stammzellen etabliert, in dem eine Differenzierung zu Adipozyten und Osteoblasten durchgeführt werden konnte, und nachgewiesen, dass aus MSZ erhaltene Adipozyten und Osteoblastenvorläufer von einer zur anderen Zelllinie transdifferenziert (reprogrammiert) werden können. Dabei wurden die zelllinienspezifischen Marker nach der Reprogrammierung von Osteoblastenvorläufern zu Adipozyten vollständig umgekehrt. Die osteogene Transdifferenzierung von Adipozyten war etwas weniger effizient, da die osteogenen Marker zwar vorhanden waren, aber auch die adipogenen Marker weiterhin auftraten. Die Plastizität erstreckte sich also auch auf die Differenzierungswege der beiden Zellpopulationen, wobei das bessere Ergebnis bezüglich der adipogenen Reprogrammierung die Annahme ihres Auftretens in vivo weiter unterstützte. Die nachfolgende Untersuchung von Genexpressionsänderungen mittels Mikroarray-Analysen, die transdifferenzierte mit konventionell differenzierten Zellen verglichen, führte kurz nach Initiation der adipogenen und osteogenen Transdifferenzierung zum Auffinden zahlreicher, reproduzierbar regulierter Gene. Viele dieser Gene standen mit Metabolismus, Transkription und Signaltransduktion wie dem FGF-, IGF- und Wnt-Signalweg in Zusammenhang, es wurden allerdings nur einige Adipogenese- und keinerlei Osteogenese-assoziierte Markergene innerhalb 24 h nach Initiation der Transdifferenzierung detektiert. Um unter der großen Zahl an regulierten Genen mögliche Schlüsselkontrollfaktoren der Transdifferenzierung zu finden, wurde ein neuartiges, bioinformatisches Punktesystem entwickelt, das Gene entsprechend ihrer potenziellen Relevanz für die Reprogrammierung auflistete. Dabei wurde neben der Reproduzierbarkeit und dem Ausmaß ihrer Regulation auch eine mögliche Reziprozität der Regulation zwischen dem adipogenen und osteogenen Transdifferenzierungsweg berücksichtigt. Es konnte nachgewiesen werden, dass der Fibroblastenwachstumsfaktor 1 (FGF1), der als einer der Hauptkandidaten für die Steuerung der Reprogrammierung eingeordnet worden war, in unserem Zellkultursystem sowohl die adipogene Differenzierung als auch die adipogene Transdifferenzierung hemmt. Die weitere Untersuchung des FGF-Signalwegs und anderer, hoch gelisteter Gene könnte zum besseren Verständnis der altersbezogenen fettigen Degeneration auf molekularer Ebene beitragen und daher Zielmoleküle liefern, die eine therapeutische Beeinflussung der Plastizität zwischen beiden Zelllinien zur Verhinderung der fettigen Degeneration und zur Förderung der Osteogenese erlauben. KW - Zelldifferenzierung KW - Metaplasie KW - Mesenchymale Stammzellen KW - Transdifferenzierung KW - Osteoblasten KW - Adipozyten KW - Mesenchymal Stem Cells KW - transdifferentiation KW - osteoblasts KW - adipocytes Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-24299 ER -