TY - THES A1 - Ferber, Elena T1 - Transkriptionelle, metabolische und physiologische Anpassung nach Selbstintoxikation mit reaktiven Sekundärstoffen: die Glukosinolat-Bombe in Arabidopsis thaliana T1 - Transcriptional, metabolic and physiological adaptation after self-intoxication with reactive secondary substances: the glucosinolate bomb in Arabidopsis thaliana N2 - In Brassicaceae werden bei einer Gewebszerstörung unreaktive Glukosinolate durch das Enzym Myrosinase hydrolysiert. Es entstehen reaktive Substanzen wie Isothiocyanate (ITCs). Da diese Reaktion sehr schnell erfolgt wird sie auch als Senföl-Glukosid-Bombe bezeichnet. In Arabidopsis thaliana erfolgt nach Verwundung und Pathogeninfektion eine massive Akkumulation des ITCs Sulforaphan (SF), welches eine reaktive elektophile Spezies (RES) darstellt. Zu der Gruppe der RES zählen auch einige Oxylipine mit einer α,β-ungesättigten Carbonylgruppen wie 12-oxo-Phytodiensäure (OPDA) oder Phytoprostan A1 (PPA1). Die Fähigkeit der kovalenten Modifikation von Peptiden und Proteinen gilt als essentiell sowohl für die toxischen als auch die Gen-induzierenden Eigenschaften der RES. Neben ihrer Reaktivität spielt auch die Lipophilie eine Rolle für die Fähigkeit über Membranen zu diffundieren und unspezifisch an Proteine zu binden. Die in der vorliegenden Arbeit durchgeführten Transkriptomanalysen an Arabidopsis-Keimlingen mit sub-toxischen Konzentrationen von SF, Benzylisothiocyanat (BITC) und dem Oxylipin Prostaglandin A1 (PGA1) zeigten, dass strukturell sehr verschiedene RES einen gemeinsamen Satz von 55 Genen induzieren. Unter diesen befanden sich verschiedene Hitzeschock-, Stressassoziierte- und Detoxifizierungsgene. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Aktivierung über eine Muster-spezifische Erkennung der RES erfolgt. Als einen möglichen Mechanismus der RES-vermittelten Geninduktion wird die Regulation durch die Veränderung des zellulären Redox-Potentials als Folge kovalenter Modifikation von GSH durch RES diskutiert. Die Untersuchung der GSH-Gehalte sowie des Redox-Potential nach Behandlung mit sub-toxischen RES-Konzentrationen in Arabidopsis-Keimlingen zeigte jedoch unter den getesteten Bedingungen keine Veränderung. Neben dem Erkennungs- und Signaltransduktionsmechanismus ist auch die biologische Bedeutung von RES für die Vermittlung einer Stresstoleranz noch weitgehend unklar. Durch die Untersuchung der Genexpression in Arabidopsis-Pflanzen nach Verwundung konnte gezeigt werden, dass eine wundinduzierte Akkumulation von SF zur Induktion einiger Gene der Hitzeschockreaktion (HSR) im Wildtyp, jedoch nicht in der myrosinase-defiziten tgg1tgg2-Mutante führte. Auch in der Transkriptomanalyse war nach RES-Gabe ebenfalls eine starke Induktion hitze-responsiver Gene, deren Regulation über den Masterregulator dem Hitzeschock-TF A1 vermittelt wird, zu beobachten. Besonders die Induktion der HSPs, welche als Chaperone fungieren und damit Thiolgruppen von Proteinen vor Modifikation schützen können, haben vermutlich bei chemischer Intoxikation protektive Eigenschaften für die Zellen. Tatsächlich zeigte sich unter den gewählten Bedingungen die hsfa1a,b,d,e-Mutante empfindlicher gegenüber ITCs als der Wildtyp. Die Fähigkeit, eine HSR ausbilden zu können, scheint in Arabidopsis bei chemischer Intoxikation eine bedeutende Rolle zu spielen. Eine Vorbehandlung mit RES wie SF, BITC oder dem HSP90-Inhibitor Radicicol in Arabidopsis-Keimlingen konnte eine Schutzwirkung vor chemischer Intoxikation vermitteln. Dies erfolgte jedoch nicht nach Behandlung mit moderater Hitze (zwei Stunden, 37 °C). Somit scheint die HSR alleine nicht ausreichend für den Aufbau eines effektiven Schutzes vor BITC-Intoxikation zu sein. Als metabolische Antwort von Arabidopsis-Keimlingen auf Intoxikation mit RES konnte eine konzentrationsabhängige Senkung der maximalen Quantenausbeute am Photosystem II (PSII), sowie gleichzeitig eine Akkumulation an TAG-Spezies beobachtet werden. Diese metabolische Reaktion ist in der Literatur bereits als Schutz gegen Hitzestress beschrieben. Die Bedeutung der TAG-Akkumulation nach chemischem ITC-Stress ist noch unklar. N2 - In Brassicaceae, unreactive glucosinolates are hydrolyzed by the enzyme myrosinase during tissue destruction. Reactive substances such as isothiocyanates (ITCs) are formed. Since this reaction takes place very quickly, it is also called mustard oil bomb. In Arabidopsis thaliana, after wounding and pathogen infection, a massive accumulation of the ITC Sulforaphan (SF) occurs, which is a reactive electophilic species (RES). The group of RES also includes some oxylipins with a α,β-unsaturated carbonyl group such as 12-oxo-phytodienoic acid (OPDA) or phytoprotane A1 (PPA1). The ability to covalently modify peptides and proteins is considered essential for the toxic and gene inducing properties of RES. In addition to their reactivity, lipophilia also plays a role in the ability to diffuse across membranes and bind unspecifically to proteins. The transcriptome analyses performed on Arabidopsis-seedlings with sub-toxic concentrations of SF, benzylisothiocyanate (BITC) and oxylipin prostaglandin A1 (PGA1) showed that structurally very different RES induce a common set of 55 genes. Among the induced genes were several heat shock, stress associated and detoxification genes. These observations suggest that activation is via pattern-specific recognition of RES. As a possible mechanism of RES-mediated gene induction, regulation by alteration of the cellular redox potential as result of covalent modification of GSH by RES is discussed. However, the study of GSH levels and redox potential after treatment with sub-toxic RES concentrations in Arabidopsis-seedlings showed no change under the tested conditions. In addition to the recognition and signal transduction mechanism for RES, the biological significance of RES for the mediation of stress tolerance is still largely unclear. By studying the gene expression of Arabidopsis-plants after wounding, it was shown that wound induced accumulation of SF led to the induction of some genes of heat shock response (HSR) in the wild type, but not in the myrosinase-deficient tgg1tgg2-mutant. Also in transcriptome analysis a strong induction of heat-responsive genes could be observed after RES administration, whose regulation is mediated by the master regulator of the heatshock-TF A1 (HSFA1). In particular, the induction of HSPs, which act as chaperones and can thus protect thiol groups of proteins from modification, presumably have protective properties for the cells during chemical intoxication. In fact, under the conditions tested, the hsfa1a,b,d,e-mutants were more sensitive to ITCs than the wild type. The ability to form HSR seems to play an important role in chemical intoxication in Arabidopsis. Pretreatment with RES such as SF, BITC or the HSP90 inhibitor radicicol in Arabidopsis-seedlings could mediate a protective effect against chemical intoxication. However, this was not done after treatment with moderate heat (two hours, 37 °C). Thus, HSR alone does not seem to be sufficient to provide effective protection against BITC intoxication. As a metabolic response of Arabidopsis-seedlings to intoxication with RES, a concentration-dependent reduction of the maximum quantum yield at the photosystem II (PSII), as well as an accumulation of TAG species could be observed. This metabolic reaction is already described in the literature as protection against heat stress. The significance of TAG accumulation after chemical stress in the form of ITC intoxication is still unclear. KW - Ackerschmalwand KW - Glucosinolate KW - Isothiocyanate KW - reaktive elektrophile Spezies KW - Sulforaphan KW - Schmalwand Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-185116 ER - TY - THES A1 - Kajahn, Inga T1 - Kopplungsmethoden in der Naturstoffanalytik : Untersuchungen an Arabidopsis thaliana und an Ancistrocladus-Pflanzen T1 - Hyphenation methods in the analysis of natural products : investigations on Arabidopsis thaliana and Ancistrocladus-plants N2 - Im Rahmen dieser Disseration wurden im Einzelnen folgende Ergebnisse erzielt: A. Isolierung und Strukturaufklärung von Naphthylisochinolin-Alkaloiden aus verschiedenen Ancistrocladus-Spezies: • Die bisher noch nicht phytochemisch untersuchten Rindenextrakte der vietnamesischen Unterart Ancistrocladus tectorius ssp. cochinchinensis wurden im Hinblick auf ihre Sekundärmetabolite analysiert. Dabei identifizierte man vier bereits bekannte und drei neuartige Naphthylisochinoline-Alkaloide. Die Strukturen dieser drei Metabolite wurden nach Isolierung unter Verwendung diverser 2D-NMR-Techniken aufgeklärt. Die entdeckten Substanzen – Ancistrocladinium A (30) und seine beiden O-Demethylderivate 31 und 32 – waren die drei ersten Vertreter des neuartigen N,8'-Naphthyldihydroisochinolin-Kupplungstyps. Diese Naturstoffe verfügen über vielversprechende pharmakologische Wirkungen – vor allem gegen den Erreger der Leishmaniose. • Die botanisch noch nicht vollständig charakterisierte Lianenart ''A. ikela'', die aus der Demokratischen Republik Kongo stammt, wurde im Laufe der Arbeit morphologisch und phytochemisch untersucht und beschrieben. Neben den beiden N,C-verknüpften Naphthylisochinolinen Ancistrocladinium A (30) und Ancistrocladinium B [(M/P)-39] wurde bei der phytochemischen Analyse ein neuartiges C,C-gekuppeltes Alkaloid – 8-O-Methylancistrogriffin C (40) – isoliert. Des weiteren wurde ein Gradient entwickelt, der die vollständige Trennung der beiden Atrop-Diastereomere von 39 und dadurch HPLC-NMR- und HPLC-CD-Analysen der einzelen Epimere ermöglichte, so dass die Rotationsbarriere der bei Raumtemperatur langsam drehenden Biarylachse bestimmt werden konnte. • Aus Blättern der bereits gut untersuchten indischen Ancistrocladus-Art A. heyneanus wurde mit 6-O-Methyl-8,4'-O-didemethylancistrocladin (42) ein weiteres neues Naphthylisochinolin-Alkaloid isoliert. • Eine phytochemische Untersuchung der Familie der Ancistrocladaceae auf das Vorkommen von N,C-verküpften Naphtylisochinolinen ergab, dass diese strukturell außergewöhnlichen Alkaloide in diesen Lianen weit verbreitet sind. B: Die Rolle des Phloems bei der Pathogen-vermittelten Ausbreitung von Signalen: • Im Rahmen des Teilprojektes B8 des SFBs 567 wurden Untersuchungen zur Rolle des Phloems bei der Weiterleitung von Langstreckensignalen nach Infektion von Arabidopsis-thaliana-Pflanzen mit virulenten oder avirulenten Stämmen von Pseudomonas syringae pv. tomato durchgeführt. Zunächst wurde dazu eine im nL-Maßstab anwendbare Analysenmethode für die Hauptmetabolite von A. thaliana – die Glucosinolate – entwickelt. Mit Hilfe dieser empfindlichen Methode wurden in Pflanzenextrakten von A. thaliana viele bekannte und einige neue Glucosinolate (8-Methylsulfonyl-n-octyl-, 2-Hydroxy-4-methylsulfinyl-n-butyl-, 2-Hydroxy-4-methylsulfonyl-n-butyl- und 4-Hydroxy- benzoyloxymethylglucosinolat) identifiziert. Des weiteren wurden MS/MS-Analysen der Glucosinolate durchgeführt, bei denen neben mehreren typischen Fragmenten für die Thiozucker-Einheit auch einige charakteristische Fragmente für die unterschiedlichen Seitenketten (z.B. Methylsulfinyl-n-alkyl- oder Methylthio-n-alkyl-Struktur) detektiert wurden. Leider ergaben vor allem die aromatischen und heteroaromatischen Seitenketten-Typen kein typisches Fragmentierungs-muster. • Bei der Analyse der Phloemexsudate konnte in Phloemsäften von unbehandelten Pflanzen neben Methoxyglucobrassicin (73) ein für Pflanzen neuartiges Phosphat 87 (1-Glycero-1-myo-inositolphosphat) identifiziert werden. In den Phloemsäften der unterschiedlich behandelten Pflanzen (infiltriert mit MgCl2, einem virulentem oder einem avirulentem Pseudomonas-Stamm) kamen sämtliche Hauptmetabolite der Blätter vor. Lediglich ein leichter, nicht signifikanter Konzentrationsanstieg von Methoxyglucobrassicin (73) wurde im Phloemsaft von mit avirulenten Pathogenen infizierten Pflanzen festgestellt. Dieser Anstieg muss aber kritisch betrachtet werden, da er auch ein Artefakt des starken mechanischen Reizes des Infiltrationsprozesses sein könnte. Andere kleine Konzentrationsänderungen könnten außerdem durch das starke ''Grundrauschen'' der Infiltration überlagert werden. C: Strukturaufklärung polyketidischer Sekundärmetabolite aus Mikroorganismen: • Zwei niedermolekulare Naturstoffe aus dem extremophilen Streptomyceten-Stamm KC 1030, die in der Arbeitsgruppe von Prof. H.-P. Fiedler (Universität Tübingen) isoliert worden waren, wurden strukturell aufgeklärt. Bei dem einen handelt es sich um das bereits bekannte Frigocyclinon (89), bei dem anderen um ein neues Angucyclinon 88 mit Fridamycin-E-Grundkörper. Darüber hinaus wurden aus einem weiteren Streptomyces-Stamm (AK 671) zwei neue (97, 98) und drei (96, 99, 100) bekannte biosynthetisch interessante Sekundärmetabolite isoliert. N2 - In detail, the following results were achieved during this doctoral thesis: A: Isolation and structural elucidation of naphthylisoquinoline alkaloids from Ancistrocladus species: • The not yet phytochemically investigated bark extracts of the Vietnamese subspecies Ancistrocladus tectorius ssp. cochinchinensis were analyzed. Four already known and three unknown naphthylisoquinoline alkaloids were identified. The three new metabolites were isolated and structurally elucidated by the use of different 2D NMR techniques. The defined structures – ancistrocladinium A (30) and its two O-demethyl derivatives 31 and 32 – are the first representatives of the new N,8'-naphthyl dihydroisoquinoline coupling type. These natural products exhibit promising biological activities – above all against the pathogen of leishmaniasis. • The botanically not yet fully characterized liana species ''A. ikela'', which was collected in the Congo Basin (Democratic Republic Congo), was morphologically and phytochemically investigated and described botanically. Besides the two N,C-coupled naphthylisoquinolines, ancistrocladinium A (30) and ancistrocladinium B [(M/P)-39], a new C,C-coupled alkaloid – 8-O-methylancistrogriffine C (40) – was isolated. Furthermore, by establishing a gradient system for the baseline separation of both atropodiastereomers of 39 HPLC-NMR and HPLC-CD analyses of the individual two purified epimers were performed to define the rotational barrier of the biaryl axis, which slowly rotates at room temperature. • From the leaves of the already well-investigated Indian Ancistrocladus species A. heyneanus, 6-O-methyl-8,4'-O-didemethylancistrocladine (42), a hitherto unknown naphthylisoquinoline alkaloid, was isolated. • A phytochemical investigation of the plant family of the Ancistrocladaceae with respect to the occurrence of N,C-coupled naphtylisoquinolines proved that these structurally exceptional alkaloids are quite common in this liana family. B: The role of the phloem during the propagation of pathogen-mediated signals: • Within the scope of the project B8 of the SFB 567, investigations on the role of the phloem during the propagation of long-distance signals after infection of plants of Arabidopsis thaliana with virulental or avirulental strains of Pseudomonas syringae pv. tomato were carried out. For this purpose initially an analytical method for the main metabolites – the glucosinolates – of A. thaliana applicable at a nL-scale was developed. Using this sensitive method, many known but also some new glucosinolates (8-methylsulfonyl-n-octyl-, 2-hydroxy-4-methylsulfinyl-n-butyl-, 2-hydroxy-4-methylsulfonyl-n-butyl-, and 4-hydroxy-benzoyloxymethyl-glucosinolate) were identified in plant extracts of A. thaliana. Furthermore, MS/MS analyses of the glucosinolates were carried out to verify their structures. Next to some typical fragments of the thiosugar moiety a few characteristic fragments of the different side chain structures (e.g. methylsulfinyl-n-alkyl- or methylthio-n-alkyl structure) were detected. Unfortunately, not all of the different types of side chaines led to typical fragmentation pattern. • In the phloem sap of entirely untreated plants, only methoxyglucobrassicin (73) and a phosphate 87 (1-glycero-1-myo-inositolphosphate), which was not kown so far to be located in plants, were identified in the course of the analysis of the phloem exudates. In the phloem saps of all the differently treated plants (infiltrated with MgCl2, virulental or avirulental Pseudomonas strain) all of the main leaf metabolites occurred. Solely a slight but not significant increase of the concentration of methoxyglucobrassicin (73) was measured in the phloem exudates of plants infected with avirulental pathogens. One has to be extremely careful with respect to the observed increase since it is possible that the enhanced glucosinolate concentration was the result of the strong mechanical stimulus of the infiltration procedure. Furthermore, slight changes in the concentration of other metabolites could be superimposed by signals caused by the infiltration procedure. C: Structural elucidation of polyketidic secondary metabolites from microorganisms • The structures of two low-molecular natural products isolated in the working group of Prof. H.-P. Fiedler (University of Tübingen) from the extremophilic Streptomyces strain KC 1030 were elucidated. One of them was the already known frigocyclinone (89) and the other one was the new angucyclinone 88 with a fridamycine E core structure. Moreover, from the Streptomyces strain AK 671, two new (97, 98) and three known (96, 99, 100) biosynthetically interesting secondary metabolites were isolated. KW - CE-oTOF-MS KW - Arabidopsis thaliana KW - Glucosinolate KW - Ancistrocladaceae KW - Ancistrocladus cochinchinenesis KW - Ancistrocladinium A KW - Naphthylisochinolinalkaloide KW - CE-oTOF-MS KW - Arabidopsis thaliana KW - glucosinolates KW - Ancistrocladus cochinchinensis KW - ancistrocladinium A KW - naphthylisoquinoline alkaloids Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27288 ER - TY - THES A1 - Travers-Martin, Nora Verena T1 - The role of the glucosinolate-myrosinase system for the interaction of Brassicaceae with the turnip sawfly Athalia rosae(L.) T1 - Die Rolle des Glucosinolat-Myrosinase Systems bei der Interaktion von Brassicaceae mit der Rübsenblattwespe Athalia rosae (L.) N2 - Brassicaceae and a few related plant families are characterized by possession of the glucosinolate-myrosinase system. Glucosinolates are amino-acid derived allelochemicals which are hydrolysed upon tissue damage by myrosinase enzymes to produce various degradation products which can be toxic for generalist insects. The larvae of the crucifer-specialist Athalia rosae, the turnip sawfly, sequester glucosinolates into their haemolymph. The role of the glucosinolate-myrosinase system for the interaction of the turnip sawfly with Brassicaceae was examined in this study from two different perspectives: variation within individual plants and between plant species. The plant responses to the feeding by herbivores and the short-term effects this induction had on insect behaviour were investigated in white mustard. Furthermore, plants can use multiple defences. Hence correlations of glucosinolates and myrosinase activities with other defences and nutritional quality and their long-term effects on the development of the insects were investigated in seven different plant species. N2 - Die Brassicaceen und einige nah verwandte Pflanzenfamilien zeichnen sich durch den Besitz des Glucosinolat-Myrosinase Systems aus. Glucosinolate sind von Aminosäuren abgeleitete Allelochemikalien, die nach Gewebezerstörung von Myrosinaseenzymen hydrolysiert werden. Die entstehenden Abbauprodukte wirken auf generalistische Insekten toxisch. Larven der auf Brassicaceen spezialisierten Rübsenblattwespe, Athalia rosae, sequestrieren Glucosinolate in ihre Hämolymphe. In der vorliegenden Studie wird die Rolle des Glucosinolat-Myrosinase Systems für die Interaktion von Brassicaceen mit der Rübsenblattwespe aus zwei unterschiedlichen Perspektiven untersucht: Variationen innerhalb einzelner Pflanzen und zwischen verschiedenen Pflanzenarten. Die pflanzliche Antwort innnerhalb einzelner Individuen auf Herbivorenfraß und deren kurzzeitige Auswirkungen auf das Insektenverhalten wurden am Weißen Senf untersucht. Des Weiteren nutzen Pflanzen multiple Abwehrmethoden. Daher wurden Korrelationen des Glucosinolat-Myrosinase Systems mit anderen Abwehrmethoden und mit dem Nährstoffgehalt der Pflanzen sowie deren langfristige Effekte auf die Entwicklung der Insekten an sieben verschiedenen Pflanzenarten untersucht. KW - Glucosinolate KW - Chemische Ökologie KW - Myrosinase KW - Insekten KW - Pflanzen-Insekten Interaktionen KW - Glucosinolates KW - Myrosinase KW - Insects KW - Chemical Ecology KW - Plant-Insect Interactions Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-25335 ER -