TY - THES A1 - Maier [verh. Hartmann], Carina Ramona T1 - Regulation of the Mevalonate Pathway by the Deubiquitinase USP28 in Squamous Cancer T1 - Regulation des Mevalonat Stoffwechselwegs durch die Deubiquitinase USP28 in Plattenepithelkarzinomen N2 - The reprogramming of metabolic pathways is a hallmark of cancer: Tumour cells are dependent on the supply with metabolites and building blocks to fulfil their increased need as highly proliferating cells. Especially de novo synthesis pathways are upregulated when the cells of the growing tumours are not able to satisfy the required metabolic levels by uptake from the environment. De novo synthesis pathways are often under the control of master transcription factors which regulate the gene expression of enzymes involved in the synthesis process. The master regulators for de novo fatty acid synthesis and cholesterogenesis are sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs). While SREBP1 preferably controls the expression of enzymes involved in fatty acid synthesis, SREBP2 regulates the transcription of the enzymes of the mevalonate pathway and downstream processes namely cholesterol, isoprenoids and building blocks for ubiquinone synthesis. SREBP activity is tightly regulated at different levels: The post-translational modification by ubiquitination decreases the stability of active SREBPs. The attachment of K48-linked ubiquitin chains marks the transcription factors for the proteasomal degradation. In tumour cells, high levels of active SREBPs are essential for the upregulation of the respective metabolic pathways. The increased stability and activity of SREBPs were investigated in this thesis. SREBPs are ubiquitinated by the E3 ligase Fbw7 which leads to the subsequential proteolysis of the transcription factors. The work conducted in this thesis identified the counteracting deubiquitination enzyme USP28 which removes the ubiquitin chains from SREBPs and prevents their proteasomal degradation. It further revealed that the stabilization of SREBP2 by USP28 plays an important role in the context of squamous cancers. Increased USP28 levels are associated with a poor survival in patients with squamous tumour subtypes. It was shown that reduced USP28 levels in cell lines and in vivo result in a decrease of SREBP2 activity and downregulation of the mevalonate pathway. This manipulation led to reduced proliferation and tumour growth. A direct comparison of adenocarcinomas and squamous cell carcinomas in lung cancer patients revealed an upregulation of USP28 as well as SREBP2 and its target genes. Targeting the USP28-SREBP2 regulatory axis in squamous cell lines by inhibitors also reduced cell viability and proliferation. In conclusion, this study reports evidence for the importance of the mevalonate pathway regulated by the USP28-SREBP2 axis in tumour initiation and progression of squamous cancer. The combinatorial inhibitor treatment of USP28 and HMGCR, the rate limiting enzyme of the mevalonate pathway, by statins opens the possibility for a targeted therapeutic treatment of squamous cancer patients. N2 - Die Reprogrammierung metabolischer Stoffwechselwege ist ein Kennzeichen von Krebs: Tumorzellen sind abhängig von der Versorgung mit Metaboliten und Bausteinen, um ihren wachsenden Bedarf als hoch proliferierende Zellen zu decken. Vor allem die de novo Stoffwechselsynthesewege sich hochreguliert, wenn die Zellen des wachsenden Tumors nicht mehr in der Lage sind, ihr erforderliches metabolisches Niveau mithilfe der Aufnahme aus der Umgebung zu erfüllen. De novo Synthesewege sind oft unter der Kontrolle von zentralen Transkriptionsfaktoren die die Genexpression von Enzymen, die im Syntheseprozess beteiligt sind, regulieren. Die vorherrschenden Regulatoren, für die de novo Fettsäuresynthese und der Cholesterogenese sind die Steroid-regulatorisches-Element-bindende Proteine (SREBPs). Während SREBP1 bevorzugt die Expression von Enzymen die an der Fettsäuresynthese beteiligt sind kontrolliert, reguliert SREBP2 die Transkription von Enzymen des Mevalonat Stoffwechselwegs, sowie Prozesse unterhalb, namentlich die Cholesterol-, Isoprenoid- und die die Synthese von Bausteinen für die Ubiquinonsynthese. Die Aktivität von SREBP ist streng reguliert auf verschiedenen Ebenen: Die post-translationale Modifikation mittels Ubiquitinierung reduziert die Stabilität von aktiven SREBPs. Das Anhängen von K48-verlinkten Ubiquitinketten markiert die Transkriptionsfaktoren für den proteasomalen Abbau. In Tumorzellen sind hohe Niveaus von aktiven SREBPs essentiell für die Induktion der entsprechenden metabolischen Stoffwechselwege. Die erhöhte Stabilität und Aktivität von SREBPs wurden im Rahmen dieser Arbeit untersucht. SREBPs werden von der E3-Ligase Fbw7 ubiquitiniert, was zur Proteolyse der Transkriptionsfaktoren führt. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass das entgegenwirkende Deubiquitinierungsenzym USP28 die Ubiquitinketten von SREBPs entfernt und deren proteasomalen Abbau verhindert. Diese Forschungsarbeit zeigt weiterhin, dass die Stabilisierung von SREBP2 durch USP28 eine wichtige Rolle im Kontext von Epithelkarzinomen spielt. Erhöhte USP28 Niveaus werden mit einem schlechten Überleben von Patienten in der Krebs-Untergruppe der Plattenepithelkarzinomen verbunden. Es konnte gezeigt werden, dass reduzierte USP28 Niveaus, in Zelllinien und in vivo, niedrigere SREBP2-Aktivität und eine Herunterregulierung des Mevalonat Stoffwechselwegs ergeben. Diese Manipulation führte zu reduzierter Proliferation und Tumorwachstum. Ein direkter Vergleich von Adenokarzinomen und Plattenepithelkarzinomen in Lungenkrebspatienten zeigte zudem eine Hochregulierung von USP28 ebenso wie SREBP2 und dessen Zielgenen. Der gezielte Einsatz von Inhibitoren gegen die USP28-SREBP2 regulatorische Achse in Plattenepithelzellen reduzierte die Lebensfähigkeit und Proliferation der Zellen. Abschließend berichtet diese Forschungsarbeit von der Bedeutung des durch die USP28-SREBP2 Achse regulierten Mevalonat Stoffwechselwegs bei der Tumorinitiation und dem Fortschreiten von Plattenepithelkarzinomen. Die kombinatorische Behandlung mit USP28- und Inhibitoren der HMGCR, dem Schlüsselenzym des Mevalonat Stoffwechselwegs, mithilfe von Statinen eröffnet die Möglichkeit für eine gezielte therapeutische Behandlung von Patienten mit Plattenepithelkarzinomen. KW - Ubiquitin KW - Metabolismus KW - Deubiquitination KW - Mevalonate Pathway KW - Cancer Metabolism KW - Lung squamous cancer cells Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-348740 ER - TY - THES A1 - Christmann, Gabriel T1 - USP 10 als Deubiquitinase für β-Catenin T1 - USP 10 as a Deubiquitinase for β-Catenin N2 - Der WNT-Signalweg ist ein hochkonservierter Signalweg, dessen zentraler intrazellulärer Regulationsschritt die Proteinstabilität des Proteins β-Catenin ist. Deregulierende Mutationen in diesem sind frühe Ereignisse bei der Entstehung von Darmtumoren. Ist der Abbau von β-Catenin gestört, so ist unabhängig von äußerer Kontrolle der Signalweg konstitutiv aktiviert und liefert ein Wachstumssignal. Untersuchungen haben aber gezeigt, dass beim Vorliegen solcher Mutationen immer noch eine – unzureichende – Ubiquitinylierung und ein Abbau von β-Catenin stattfindet. Ziel dieser Studie war Deubiquitinasen (DUBs) zu finden, die durch ihre Aktivität den Abbau von β-Catenin verhindern. Mithilfe eines siRNA Screens in der Vorarbeit konnten DUBs als Kandidaten für einen CRISPR Ansatz ausgewählt werden. APC Wildtyp HEK293T Zellen und Darmkrebszellen wurden mit lentiviralen CRISPR/Cas9 Vektoren infiziert, in welche sgRNAs gegen exonische Sequenzen von DUBs geklont waren. Einzelne Zellklone von USP10 CRISPR Zellen wurden weiter untersucht. In Western Blots und Immunofluoreszenz zeigte sich bei den USP10 CRISPR Zellen eine verminderte Expression von USP10 und damit einhergehend β-Catenin. Proteinstabilitätsversuche mit MG132 und Cycloheximid zeigten einen erhöhten Abbau von β-Catenin in HEK293T USP10 CRISPR Zellen, vor allem nach Stimulierung des WNT-Signalwegs durch LiCl. In Aktivierungsassays (Luciferase und TOP-GFP FACS) des WNT-Signalwegs zeigte sich in HEK293T Zellen nach Behandlung mit LiCl eine geringere Aktivierung in den USP10 CRISPR Zellen. In einem Wachstumsassay zeigten HT29 USP10 CRISPR ein geringeres Wachstum als Kontrollzellen. Während in einer histologischen Färbung von Mausgewebe eine erhöhte Expression von USP10 nachweisbar war, zeigten sich in einer TMA Färbung kein eindeutiger Unterschied zwischen gesundem Gewebe und Tumorgewebe. Die Studie identifiziert USP10 als eine mögliche DUB für β-Catenin und potenzielles Ziel für eine Beeinflussung des mutierten WNT-Signalwegs in Darmkrebszellen. N2 - The WNT- signaling pathway is a highly preserved pathway. Its central intracellular regulation measure is the protein stability of the protein β-Catenin. Mutations that cause a deregulation in said pathway occur early within the development of intestinal tumors. If the breakdown of β-Catenin is impaired, the WNT- signaling pathway will get activated constitutively, providing growth signals, regardless of outer controls. Investigations have shown, that if such mutations exist there will still be a (insufficient) ubiquitinylation and a breakdown of β-Catenin. It was the aim of this research to identify deubiquitinases (DUBs) whose activity prevent the breakdown of β-Catenin. It was possible to select DUBs as potential candidates for a CRISPR approach by using sIRNA Screens. APC Wildtype HEK293T cells and intestinal tumor cells where infected by lentiviral CRISPR/Cas9 vectors which contained sgRNAs clones that worked against exonic sequences of DUBs. Individual cell clones of USP10 CRISPR cells where further investigated. Within western blots and immunofluorescence USP10 CRISPR cells showed a reduced expression of USP10 and thus, β- Catenin. Protein stability trials using MG132 and cycloheximide showed an increased breakdown of β-Catenin in HEK293T USP10 CRISPR cells, especially in response to stimulation of the WNT- signaling pathway using LiCl. Within activation assays (Luciferase and TOP-GFP FACS) of the WNT- signaling pathway, a reduced activation in USP10 CRISPR cells after treatment with LiCl was shown within HEK293T cells. Within a growth assay HT29 USP10 CRISPR showed a reduced growth when compared to control cells. While there was evidence of an increased expression of USP10 within the histological coloration of mouse tissue, the TMA coloration did not show a significant difference between healthy tissue and tumor tissue. This study identified USP10 as a possible DUB for β- Catenin and as a possible target for the manipulation of the mutations that cause a deregulation within the WNT- signaling pathway in intestinal tumor cells. KW - Darmkrebs KW - Ubiquitin KW - USP10 KW - Catenin Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-272998 ER - TY - THES A1 - Xu, Wenshan T1 - Regulation of the DNA Damage Response by the Ubiquitin System T1 - Regulierung der DNA-Schadensreaktion durch das Ubiquitin System N2 - DNA damage occurs frequently during normal cellular progresses or by environmental factors. To preserve the genome integrity, DNA damage response (DDR) has evolved to repair DNA and the non-properly repaired DNA induces human diseases like immune deficiency and cancer. Since a large number of proteins involved in DDR are enzymes of ubiquitin system, it is critical to investigate how the ubiquitin system regulates cellular response to DNA damage. Hereby, we reveal a novel mechanism for DDR regulation via activation of SCF ubiquitin ligase upon DNA damage. As an essential step for DNA damage-induced inhibition of DNA replication, Cdc25A degradation by the E3 ligase β-TrCP upon DNA damage requires the deubiquitinase Usp28. Usp28 deubiquitinates β-TrCP in response to DNA damage, thereby promotes its dimerization, which is required for its activity in substrate ubiquitination and degradation. Particularly, ubiquitination at a specific lysine on β-TrCP suppresses dimerization. The key mediator protein of DDR, 53BP1, forms oligomers and associates with β-TrCP to inhibit its activity in unstressed cells. Upon DNA damage, 53BP1 is degraded in the nucleoplasm, which requires oligomerization and is promoted by Usp28 in a β-TrCP-dependent manner. Consequently, 53BP1 destruction releases and activates β-TrCP during DNA damage response. Moreover, 53BP1 deletion and DNA damage promote β-TrCP dimerization and recruitment to chromatin sites that locate in the vicinity of putative replication origins. Subsequently, the chromatin-associated Cdc25A is degraded by β-TrCP at the origins. The stimulation of β-TrCP binding to the origins upon DNA damage is accompanied by unloading of Cdc45, a crucial component of pre-initiation complexes for replication. Loading of Cdc45 to origins is a key Cdk2-dependent step for DNA replication initiation, indicating that localized Cdc25A degradation by β-TrCP at origins inactivates Cdk2, thereby inhibits the initiation of DNA replication. Collectively, this study suggests a novel mechanism for the regulation of DNA replication upon DNA damage, which involves 53BP1- and Usp28-dependent activation of the SCF(β-TrCP) ligase in Cdc25A degradation. N2 - DNA-Schäden treten häufig in Folge zellulären Fortschrittes oder durch externe Faktoren auf. Um die Integrität des Genoms zu bewahren und DNA Schäden zu reparieren, die Ursache für viele Autoimmunkrankheiten und Krebs sind, hat sich ein durch DNA Schäden getriggertes Geflecht aus Reparaturprozessen (englisch: “DNA damage response (DDR)”) entwickelt. Hierbei ist es von großem Interesse zu verstehen, wie das Ubiquitin-Proteasom-System die zelluläre Antwort auf DNA-Schäden reguliert. Wir konnten zeigen, dass die SCF Ubiquitin Ligase β-TrCP durch geschädigte DNA aktiviert wird, was einen bisher unbekannten Mechanismus für die Regulation der DDR darstellt. Für den grundlegenden Schritt der durch DNA Schäden ausgelösten Inhibition der DNA Replikation – der Abbau von Cdc25A durch die E3 Ligase β-TrCP – wird die Deubiquitinase Usp28 benötigt. Diese deubiquitiniert β-TrCP als Antwort auf DNA-Schäden und fördert dadurch seine Dimerisierung, die für die Substrat-Ubiquitinierung und dem anschließenden Abbau erforderlich ist. Hierbei unterdrückt die Ubiquitinierung eines spezifischen Lysin-Rests von β-TrCP dessen Dimerisierung. Das Schlüsselprotein vom DDR, 53BP1, oligomerisiert und assoziiert mit β-TrCP, was seine Aktivität in gesunden Zellen inhibiert. Auf DNA-Schäden hin oligomerisiert 53BP1 und wird mit Hilfe von Usp28 abhängig von β-TrCP im Nukleoplasma abgebaut. Durch den Abbau von 53BP1 wird β-TrCP freigesetzt, aktiviert und kann auf DNA Schäden reagieren. Die Deletion von 53BP1 fördert die Dimerisierung von β-TrCP. Die Reparaturmaschinerie wird daraufhin an Stellen des Chromatins rekrutiert, die in der Nähe von vermeintlichen Replikationsursprüngen liegen. Chromatin-assoziiertes Cdc25A wird dann durch β-TrCP ubiquitiniert. Die Bindung von β-TrCP an die Replikationsursprünge in Folge von DNA Schädigung wird begleitet von der Freisetzung von Cdc45, das eine entscheidende Komponente des Präinitiationskomplexes darstellt. Das Beladen von Cdc45 an die Replikationsursprünge stellt eine Schlüsselfunktion der Cdc25A-abhängigen DNA Replikationsinititation dar. Gezielter Abbau von Cdc25A durch β-TrCP an den Replikationsursprüngen inaktiviert Cdk2 und inhibiert dadurch DNA Replikation. Zusammenfassend lässt sich konstatieren, dass unsere Studien einen neuartigen Mechanismus für die Regulation der DNA Replikation auf DNA Schäden hin aufgezeigt haben, der die 53BP1- und Usp28-abhängige Aktivierung der SCF(β-TrCP) Ubiquitin Ligase im Abbau von Cdc25A beinhaltet. KW - DNS-Schädigung KW - DNS-Reparatur KW - Ubiquitin KW - DNA damage KW - Ubiquitin system Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-160064 ER - TY - THES A1 - Liess [née Eller], Anna Katharina Luise T1 - Understanding the regulation of the ubiquitin-conjugating enzyme UBE2S T1 - Die Regulation des Ubiquitin-konjugierenden Enzyms UBE2S N2 - The ubiquitination of proteins serves as molecular signal to control an enormous number of physiological processes and its dysregulation is connected to human diseases like cancer. The versatility of this signal stems from the diverse ways by which ubiquitin can be attached to its targets. Thus, specificity and tight regulation of the ubiquitination are pivotal requirements of ubiquitin signaling. Ubiquitin-conjugating enzymes (E2s) act at the heart of the ubiquitination cascade, transferring ubiquitin from a ubiquitin-activating enzyme (E1) to a ubiquitin ligase (E3) or substrate. When cooperating with a RING-type E3, ubiquitin-conjugating enzymes can determine linkage specificity in ubiquitin chain formation. Our understanding of the regulation of E2 activities is still limited at a structural level. The work described here identifies two regulation mechanisms in UBE2S, a cognate E2 of the human RING-type E3 anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C). UBE2S elongates ubiquitin chains on APC/C substrates in a Lys11 linkage-specific manner, thereby targeting these substrates for degradation and driving mitotic progression. In addition, UBE2S was found to have a role in DNA repair by enhancing non-homologous end-joining (NHEJ) and causing transcriptional arrest at DNA damage sites in homologous recombination (HR). Furthermore, UBE2S overexpression is a characteristic feature of many cancer types and is connected to poor prognosis and diminished response to therapy. The first regulatory mechanism uncovered in this thesis involves the intramolecular auto-ubiquitination of a particular lysine residue (Lys+5) close to the active site cysteine, presumably through conformational flexibility of the active site region. The Lys+5-linked ubiquitin molecule adopts a donor-like, ‘closed’ orientation towards UBE2S, thereby conferring auto-inhibition. Notably, Lys+5 is a major physiological ubiquitination site in ~25% of the human E2 enzymes, thus providing regulatory opportunities beyond UBE2S. Besides the active, monomeric state and the auto-inhibited state caused by auto-ubiquitination, I discovered that UBE2S can adopt a dimeric state. The latter also provides an auto-inhibited state, in which ubiquitin transfer is blocked via the obstruction of donor binding. UBE2S dimerization is promoted by its unique C-terminal extension, suppresses auto-ubiquitination and thereby the proteasomal degradation of UBE2S. Taken together, the data provided in this thesis illustrate the intricate ways by which UBE2S activity is fine-tuned and the notion that structurally diverse mechanisms have evolved to restrict the first step in the catalytic cycle of E2 enzymes. N2 - Die Ubiquitinierung von Proteinen fungiert als molekulares Signal zur Kontrolle einer Vielzahl physiologischer Prozesse, wobei eine gestörte Regulation der Ubiquitinierung eng mit zahlreichen Erkrankungen, wie beispielsweise Krebs, verbunden ist. Aufgrund der verschiedenen Verknüpfungsmöglichkeiten von Ubiquitin, die das zelluläre Schicksal des Zielproteins bestimmen, sind Spezifität und stringente Regulation unabkömmliche Voraussetzungen im Ubiquitinierungsprozess. Ubiquitin-konjugierende Enzyme (E2s) fungieren in der Mitte der Ubiquitinierungskaskade. Sie übernehmen ein Ubiquitinmolekül vom Ubiquitin-aktivierenden Enzym (E1) und übertragen es auf eine Ubiquitin-Ligase (E3) oder direkt auf das Zielprotein. Arbeiten Ubiquitin-konjugierende Enzyme mit E3s des RING-Typus zusammen, so bestimmen E2s die Art der Verknüpfung. Die Regulation der Aktivität Ubiquitin-konjugierender Enzyme auf struktureller Ebene ist jedoch bisher nur bedingt verstanden. Die hier dargelegte Arbeit umfasst die Identifizierung zweier Regulationsmechanismen des Ubiquitin-konjugierenden Enzyms UBE2S. UBE2S arbeitet mit einem humanen E3 des RING-Typus‚ dem ‚Anaphase Promoting Complex/Cyclosome‘ (APC/C) zusammen und bildet Lys11-spezifische Ubiquitinketten auf Substraten des APC/Cs. Hierdurch werden die Substrate für den Abbau durch das Proteasom markiert, was das Fortschreiten der Mitose bedingt. Zusätzlich wird UBE2S eine Rolle in der DNS-Reparatur zugeschrieben. Hierbei verstärkt UBE2S die nicht-homologe Rekombination (NHEJ) und verhindert außerdem die Transkription an DNS-Bruchstellen, die durch Homologe Rekombination (HR) repariert werden. Die Überexpression von UBE2S ist ein Charakteristikum verschiedenster Krebsarten, vermindert den Erfolg herkömmlicher Krebstherapien, und führt somit zu schlechten Prognosen für betroffenen Patienten. Der erste hier beschriebene Regulationsmechanismus beinhaltet die intramolekulare Ubiquitinierung eines Lysins (Lys+5) nahe des katalytischen Cysteins, mutmaßlich durch strukturelle Flexibilität der Region des aktiven Zentrums. Das Lys+5-verknüpfte Ubiquitin nimmt eine Donorubiquitin-ähnliche Position auf UBE2S ein, wodurch UBE2S gehemmt wird. Da ein Lysin an der Position +5 in ~25% der humanen E2-Enzyme vorhanden und eine physiologische Ubiquitinierungsstelle ist, birgt dieser Mechanismus Regulationsmöglichkeiten über UBE2S hinaus. Zusätzlich zum aktiven monomeren Zustand und dem durch Autoubiquitinierung ausgelösten inhibierten Zustand, kann UBE2S auch als Dimer vorliegen. In diesem Zustand ist es ebenfalls inaktiv, da die Donorubiquitin-Bindestelle auf UBE2S durch ein zweites Molekül des E2s blockiert wird. Begünstigt wird die Dimerisierung durch die C-terminale Verlängerung von UBE2S und verhindert so deren Autoubiquitinierung, und folglich den proteasomalen Abbau von UBE2S. Es handelt sich hierbei somit um einen zweiten Regulationsmechanismus von UBE2S. Zusammenfassend veranschaulichen die in dieser Arbeit dargelegten Daten die komplexen Möglichkeiten, durch die die Aktivität von UBE2S reguliert werden kann, sowie die Erkenntnis, dass strukturell unterschiedliche Mechanismen existieren, um den ersten Schritt der von Ubiquitin-konjugierenden Enzymen katalysierten Reaktion zu hemmen. KW - E2 KW - Regulation KW - Ubiquitin KW - Mechanismus KW - UBE2S KW - structural mechanism KW - Ubiquitin-conjugating enzyme KW - regulation Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-204190 ER - TY - THES A1 - Orth, Barbara T1 - Identification of an atypical peptide binding mode of the BTB domain of the transcription factor MIZ1 with a HUWE1-derived peptide T1 - Identifikation eines neuen Bindungsmodus zwischen der BTB-Domäne des Transkriptionsfaktors MIZ1 und eines Peptids aus der HECT-E3-Ligase HUWE1 N2 - Ubiquitination is a posttranslational modification with immense impact on a wide range of cellular processes, including proteasomal degradation, membrane dynamics, transcription, translation, cell cycle, apoptosis, DNA repair and immunity. These diverse functions stem from the various ubiquitin chain types, topologies, and attachment sites on substrate proteins. Substrate recruitment and modification on lysine, serine or threonine residues is catalyzed by ubiquitin ligases (E3s). An important E3 that decides about the fate of numerous substrates is the HECT-type ubiquitin ligase HUWE1. Depending on the substrate, HUWE1 is involved in different processes, such as cell proliferation and differentiation, DNA repair, and transcription. One of the transcription factors that is ubiquitinated by HUWE1 is the MYC interacting zinc finger protein 1 (MIZ1). MIZ1 is a BTB/POZ (Bric-à-brac, Tramtrack and Broad-Complex/Pox virus and zinc finger) zinc finger (ZF) protein that binds to DNA through its 13 C2H2-type zinc fingers and either activates or represses the transcription of target genes, including genes involved in cell cycle arrest, such as P21CIP1 (CDKN1A). The precise functions of MIZ1 depend on its interactions with the MYC-MAX heterodimer, but also its heterodimerization with other BTB-ZF proteins, such as BCL6 or NAC1. How MIZ1 interacts with HUWE1 has not been studied and, as a consequence, it has not been possible to rationally develop tools to manipulate this interaction with specificity in order to better understand the effects of the interaction on the transcriptional function of MIZ1 on target genes or processes downstream. One aspect of my research, therefore, aimed at characterizing the MIZ1-HUWE1 interaction at a structural level. I determined a crystal structure of the MIZ1-BTB-domain in complex with a peptide, referred to as ASC, derived from a C terminal region of HUWE1, previously named ‘activation segment’. The binding mode observed in this crystal structure could be validated by binding and activity assays in vitro and by cell-based co-IP experiments in the context of N-terminally truncated HUWE1 constructs. I was not able to provide unambiguous evidence for the identified binding mode in the context of full-length HUWE1, indicating that MIZ1 recognition by HUWE1 requires yet unknown regions in the cell. While the structural details of the MIZ1-HUWE1 interaction remains to be elucidated in the context of the full-length proteins, the binding mode between MIZ1BTB and ASC revealed an interesting, atypical structural feature of the BTB domain of MIZ1 that, to my knowledge, has not been described for other BTB-ZF proteins: The B3 region in MIZ1BTB is conformationally malleable, which allows for a HUWE1-ASC-peptide-mediated β-sheet extension of the upper B1/B2-strands, resulting in a mixed, 3 stranded β-sheet. Such β-sheet extension does not appear to occur in other homo- or heterodimeric BTB-ZF proteins, including MIZ1-heterodimers, since these proteins typically possess a pre-formed B3-strand in at least one subunit. Instead, BCL6 co repressor-derived peptides (SMRT and BCOR) were found to extend the lower β-sheet in BCL6BTB by binding to an adjacent ‘lateral groove’. This interaction follows a 1:1 stoichiometry, whereas the MIZ1BTB-ASC-complex shows a 2:1 stoichiometry. The crystal structure of the MIZ1BTB-ASC-complex I determined, along with comparative binding studies of ASC with monomeric, homodimeric, and heterodimeric MIZ1BTB variants, respectively, suggests that ASC selects for MIZ1BTB homodimers. The structural data I generated may serve as an entry point for the prediction of additional interaction partners of MIZ1 that also have the ability to extend the upper β-sheet of MIZ1BTB. If successful, such interaction partners and structures thereof might aid the design of peptidomimetics or small-molecule inhibitors of MIZ1 signaling. Proof-of-principle for such a structure-guided approach targeting BTB domains has been provided by small-molecule inhibitors of BCL6BTB co-repressors interactions. If a similar approach led to molecules that interfere with specific interactions of MIZ1, they would provide intriguing probes to study MIZ1 biology and may eventually allow for the development of MIZ1-directed cancer therapeutics. N2 - Ubiquitinierung ist eine posttranslationale Modifikation mit weitreichendem Einfluss auf eine Vielzahl von zellulären Prozessen, wie proteasomale Degradation, Membrandynamik, Transkription, Translation, Zellzyklus, Apoptose, DNA-Reparatur und Immunität. Grundlage für diese Diversität ist die Möglichkeit, dass Substrate an unterschiedlichen Stellen mit verschiedenen Ubiquitin-Kettentypen modifiziert werden können. Die Substratrekrutierung und -modifikation an Lysin-, Serin oder Threonin Resten wird durch Ubiquitin-Ligasen (E3s) katalysiert. Eine wichtige Ubiquitin-Ligase, die zahlreiche Substrate reguliert, ist die HECT-Ligase HUWE1. Abhängig vom Substrat ist HUWE1 an verschiedenen Prozessen, wie der Zellproliferation und -differenzierung, DNA-Reparatur, aber auch Transkription beteiligt. Ein Transkriptionsfaktor, der von HUWE1 ubiquitiniert wird, ist MIZ1 (MYC interacting zinc finger protein 1). MIZ1 ist ein BTB/POZ (Bric-à-brac, Tramtrack and Broad-Complex/Pox Virus and Zinc finger) Zinkfinger(ZF)-Protein, das über seine 13 C2H2 Zinkfinger an DNA bindet und so die Transkription von verschiedenen Zielgenen aktivieren oder reprimieren kann. MIZ1-Zielgene sind unter anderem am Zellzyklusarrest beteiligt, wie z.B. das Gen P21CIP1 (CDKN1A). Die biologischen Funktionen von MIZ1 werden unter anderem durch seine Interaktion mit dem MYC MAX-Heterodimer, aber auch durch Heterodimerisierung mit anderen BTB ZF Proteinen, wie BCL6 oder NAC1, reguliert. Wie MIZ1 mit der HUWE1-Ligase interagiert, wurde bislang strukturell noch nicht untersucht, weshalb noch nicht gezielt kleine Moleküle zur Manipulation der Interaktion entwickelt werden konnten, um Einfluss auf die transkriptionellen Funktionen von MIZ1 oder seiner Zielgene zu nehmen. Meine Untersuchungen zielten daher unter anderem darauf ab, die MIZ1-HUWE1-Interaktion auf struktureller Ebene zu charakterisieren. Ich konnte eine Kristallstruktur der MIZ1-BTB-Domäne in Komplex mit dem HUWE1-Peptid ASC lösen, dessen Sequenz in der C-terminalen Region von HUWE1 zu finden ist und zuvor als „activation segment“ definiert wurde. Der in dieser Kristallstruktur beobachtete Bindungsmodus konnte durch Bindungs- und Aktivitätsassays in vitro und durch co-IP-Experimente in zellbasierten Assays validiert werden, jedoch nur im Zusammenhang mit N-terminal verkürzten HUWE1 Konstrukten. Es war mir nicht möglich, diesen Bindungsmodus im Kontext des HUWE1-Proteins voller Länge nachzuweisen, was darauf hindeutet, dass bei der MIZ1-Erkennung durch HUWE1 in der Zelle andere Regionen beteiligt sein könnten. Während die strukturellen Details der MIZ1-HUWE1-Interaktion im Kontext der Proteine voller Länge noch aufgeklärt werden müssen, zeigte der Bindungsmodus zwischen MIZ1BTB und ASC ein atpyisches Strukturmerkmal der BTB-Domäne von MIZ1, das meines Wissens bislang in keinem anderen BTB-ZF-Protein beschrieben wurde: Die B3-Region in MIZ1BTB zeigt eine untypische konformationelle Flexibilität, die es erlaubt, dass das HUWE1-ASC-Peptid die B1/B2-Stränge im oberen Segment von MIZ1BTB zu einem 3-strängigen β-Faltblatt erweitert. Eine solche β-Faltblatt-Erweiterung scheint in anderen homo- oder heterodimeren BTB-ZF-Proteinen, einschließlich MIZ1-Heterodimeren, nicht aufzutreten, da diese Proteine typischerweise bereits einen B3-Strang in mindestens einer Untereinheit aufweisen. Stattdessen konnte beobachtet werden, dass Peptidliganden, wie sie von den BCL6 Co-Repressoren SMRT und BCOR abgeleitet wurden, ein β-Faltblatt im unteren Segment von BCL6BTB erweitern, indem sie in der sogenannten „lateral groove“ binden, die in unmittelbarer Nähe des betreffenden β-Faltblattes lokalisiert ist. Während die Interaktion von BCL6BTB mit Co-Repressor-Peptiden eine 1:1 Stöchiometrie zeigt, beobachtete ich für den MIZ1BTB-ASC-Komplex eine 2:1 Stöchiometrie. Die Kristallstruktur des MIZ1BTB-ASC-Komplexes, zusammen mit Bindungsassays, die die Interaktion zwischen ASC und monomerem, homodimerem bzw. heterodimerem MIZ1BTB untersuchten, deuten darauf hin, dass ASC spezifisch mit MIZ1BTB-Homodimeren interagiert. Daher könnten die von mir gewonnenen Strukturinformationen dazu dienen, weitere MIZ1-Bindungspartner vorherzusagen. Falls erfolgreich, könnten die neu identifizierten Interaktionspartner und zugehörige Strukturen dazu genutzt werden, Peptidomimetika und niedermolekulare Inhibitoren zu entwickeln, die spezifische Interaktionen von MIZ1 und die zugehörigen zellulären Prozesse stören und somit als Werkzeuge zum besseren Verständnis der MIZ1 Biologie dienen könnten. Vorbild dabei können zahlreiche niedermolekulare Verbindungen sein, die zur Störung der Co-Repressor-Peptid-Bindung an BCL6BTB entwickelt wurden. Wenn es auf ähnliche Weise gelänge, spezifischen Einfluss auf die transkriptionelle Funktion von MIZ1 zu nehmen, so könnte dies von hohem therapeutischen Nutzen in der Bekämpfung verschiedener Krebsarten sein. KW - Ubiquitin KW - Ubiquitin-Protein-Ligase KW - Ubiquitinierung KW - Transkriptionsfaktor KW - Zink-Finger-Proteine KW - HUWE1 KW - MIZ1 KW - BTB domain KW - binding mode KW - peptide Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-250447 ER - TY - THES A1 - Ries, Lena Kerstin T1 - From recognition to reaction: Mechanistic analysis of the interactions of the HECT ligase E6AP with ubiquitin T1 - Von der Erkennung bis zur Reaktion: Mechanistische Analyse der Wechselwirkungen der HECT-Ligase E6AP mit Ubiquitin N2 - The ubiquitination of proteins controls a multitude of physiological processes. This versatility of ubiquitin as a molecular signal arises from the diverse ways by which it can be attached to target proteins. Different ubiquitination patterns are then translated into different downstream consequences. Due to the enormous complexity of possible ubiquitin modifications, the ubiquitination machinery must be highly specific and tightly controlled. Ubiquitination proceeds through an enzymatic cascade, the last step of which is catalyzed by the E3 enzyme family. E3 enzymes are the crucial regulators since they dictate the specificity of substrate selection and modification. Deregulation of the HECT-type ubiquitin ligase E6AP (UBE3A) is implicated in human papilloma virus-induced cervical tumorigenesis and several neurodevelopmental disorders. Yet the structural underpinnings of activity, regulation and specificity in this crucial ligase are incompletely understood. One aim of this study was to unravel the role of the a1’-helix N-terminal to the HECT domain that was found to be a key element mediating regulation and oligomerization in other HECT ligases. I found that most N-terminally extended HECT domain constructs were insoluble when expressed in E. coli, indicating that additional regions N-terminal to the tested fragments may be essential to protect this highly hydrophobic helix from causing aggregation. Another question addressed in this study was how E6AP builds ubiquitin chains. Using single-turnover experiments, I showed that ubiquitin-loaded E6AP is unable to transfer an additional ubiquitin molecule onto a stably linked ubiquitin-E6AP complex. This indicates that E6AP cannot assemble chains on its active site and may instead follow a sequential addition mechanism in which one ubiquitin molecule is transferred at a time to the target protein. Using NMR spectroscopy and extensive mutational analyses, the determinants of ubiquitin recognition by the C-lobe of E6AP were unraveled and assigned to particular steps in the catalytic cycle. A functionally critical interface was identified that is specifically required during thioester formation between the C-terminus of ubiquitin and the ligase active site. This interface resembles the one utilized by NEDD4-type enzymes, suggesting a conserved ubiquitin binding mode across HECT ligases, independent of their linkage specificities. Moreover, I identified critical surface patches on ubiquitin and in the N- and C-terminal portions of the catalytic domain of E6AP that are important for the subsequent step of isopeptide bond formation. I also uncovered key determinants of the Lys48-linkage specificity of E6AP, both in the E6AP HECT domain and ubiquitin itself. This includes the C-terminal tail of E6AP and a hydrophilic surface region of ubiquitin in proximity to the acceptor site, Lys48. It is thus tempting to speculate that ubiquitin linkage formation by E6AP is substrate-assisted. Taken together, my results improve our mechanistic understanding of the structure-function relationship between E6AP and ubiquitin, thus providing a basis for ultimately manipulating the functions of this HECT ligase for therapeutic applications. N2 - Die Ubiquitinierung von Proteinen ist an nahezu jedem physiologischen Prozess beteiligt. Die Vielseitigkeit mit der Ubiquitin als molekulares Signal fungiert, rührt von den vielfältigen Möglichkeiten her, wie es an Zielproteine gebunden werden kann. Verschiedene Ubiquitinierungsmuster rufen unterschiedliche biologische Ereignisse hervor. Angesichts der enormen Komplexität möglicher Ubiquitinierungsmodifikationen muss die Ubiquitinierungs-maschinerie hochspezifisch und streng kontrolliert sein. Die Ubiquitinierung erfolgt über eine enzymatische Kaskade. Der letzte Schritt wird hierbei durch die Enzymfamilie der Ubiquitin-Ligasen katalysiert. Ubiquitin-Ligasen sind primär für die Spezifität in Substraterkennung und Ubiquitin-Kettenbildung verantwortlich. Misregulation der HECT-Ligase E6AP fördert die durch humane Papillomaviren induzierte Tumorentwicklung im Gebärmutterhals und ist mit zwei schweren neurologischen Krankheiten verbunden. Strukturelle Einzelheiten über den Mechanismus, die Regulation und die Spezifität dieser wichtigen Ligase sind jedoch weitgehend unbekannt. Für verschiedene HECT-Ligasen wurde gezeigt, dass die a1‘-Helix N-terminal zur HECT-Domäne ein Schlüsselelement für die Regulation und den Oligomerisierungszustand der Enzyme darstellt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Helix eine wichtige Funktion für die Stabilität von E6AP erfüllt. Der Großteil N-terminal verlängerter, in E. coli exprimierter HECT-Domänen-Konstrukte war unlöslich, was darauf hindeutet, dass N-terminal gelegene Regionen hydrophobe Bereiche des Proteins vor Aggregation schützen. Eine weitere Fragestellung dieser Arbeit befasste sich mit dem Mechanismus der Ubiquitin-Kettenbildung durch E6AP. Mit ‘single-turnover‘-Experimenten konnte gezeigt werden, dass ein über einen Thioester gebundenes Ubiquitin von E6AP nicht auf einen stabil verknüpften Ubiquitin-E6AP-Komplex übertragen werden kann. Dies deutet daraufhin, dass E6AP keine Ketten auf dem katalytischen Cystein aufbauen kann und stattdessen einem sequentiellen Additionsmechanismus der Ubiquitin-Kettenbildung folgt. Mithilfe von NMR Spektroskopie und umfangreicher Mutagenese-Studien wurde eine Interaktion zwischen dem C-Lobe von E6AP und Ubiquitin gefunden, die während der Thioesterbildung zwischen dem C-Terminus von Ubiquitin und dem aktiven Zentrum von E6AP gebraucht wird. Diese Interaktionsfläche ähnelt derer der NEDD4-Familie, was auf einen konservierten Bindungsmodus der HECT-Ligasen an Ubiquitin im ersten Reaktionsschritt hindeutet, ungeachtet der jeweiligen Kettenspezifitäten. Verschiedene Oberflächen auf Ubiquitin und E6AP, sowohl auf dem C-Lobe als auch auf dem N-Lobe, konnten identifiziert werden, die für die Bildung einer Isopeptidbindung zwischen zwei Ubiquitin-Molekülen von Bedeutung sind. Neben dem C-Terminus von E6AP wurde eine hydrophile Oberfläche auf Ubiquitin in unmittelbarer Nähe zum Akzeptor Lys48 gefunden, die wichtig für die Lys48-spezifische Ubiquitin-Kettenbildung ist. Der Gedanke liegt nahe, dass die Ubiquitin-Kettenbildung durch E6AP über Substratunterstützte Katalyse verläuft. Zusammenfassend erweitern diese Ergebnisse maßgeblich unser Verständnis der Erkennung von Ubiquitin durch die HECT-Ligase E6AP und können möglicherweise dazu beitragen Wirkstoffe zu entwickeln, welche eine Fehlregulierung von E6AP ausgleichen können. KW - Ubiquitin KW - Ubiquitin-Protein-Ligase KW - Ubiquitinierung KW - ubiquitin recognition KW - ubiquitin chain formation KW - ubiquitin linkage specificity Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-179609 ER - TY - THES A1 - Wollny, Claudia T1 - Der p97-Kofaktor UBXD1 ist ein neuer Regulator des NF-kB-Signalweges T1 - The p97-cofactor UBXD1 is a new regulator of NF-kB-signaling N2 - Die essenzielle, Ubiquitin-selektive ATPase p97 reguliert eine Vielzahl unterschiedlicher Prozesse in Eukaryoten. Dazu zählen Proteinqualitätskontrolle, DNA-Reparatur, Signaltransduktion, Zellzykluskontrolle, Autophagie sowie das endolysosomale System. Diese unterschiedlichen Funktionen von p97 werden durch die Bindung von Kofaktoren engmaschig gesteuert und kontrolliert. Die größte und am besten untersuchte Gruppe von p97-Kofaktoren sind die Proteine der UBX Familie. Diese zeichnen sich durch den Besitz einer UBX-Domäne aus, welche die Bindung an p97 vermittelt. Das in höheren Eukaryoten konservierte Familienmitglied UBXD1 besitzt darüber hinaus mit einer PUB-Domäne und einem VIM-Motiv noch mindestens zwei weitere p97-Bindemodule. UBXD1 kann an Vesikel des endolysosomalen Degradationssytems lokalisieren, seine genauen zellulären Funktionen sind jedoch noch weitgehend unbekannt. Ziel dieser Arbeit war die funktionelle Charakterisierung von humanem UBXD1. Dafür wurden Kandidaten eines zuvor durchgeführten Yeast-Two-Hybrid-Screens auf ihre Two Hybrid-Interaktion mit unterschiedlichen UBXD1-Varianten getestet. Darüber hinaus wurde durch Immunpräzipitationsexperimente untersucht, ob die Kandidatenproteine auch in Säugerzellen mit UBXD1 interagieren. Als vielversprechende neue Bindungspartner von UBXD1 wurden so die Ubiquitin-Ligase TRIAD3A und das Ubiquitin-editierende Protein A20 identifiziert. Desweiteren konnte gezeigt werden, dass die Interaktion zwischen UBXD1 und A20 von einer funktionellen PUB Domäne und dem siebten Zinkfinger Motiv von A20 abhängig ist. Da sowohl TRIAD3A als auch A20 negative Regulatoren des NF B Signalweges sind, wurde daraufhin untersucht, ob auch UBXD1 eine Funktion in diesem Signalweg besitzt. Tatsächlich war in UBXD1-depletierten HeLa 57A-Zellen die NF B-abhängige Expression eines Reportgens nach Aktivierung des Signalweges durch TNF, IL-1, Doxorubicin und H2O2 stark reduziert. Dabei spricht die verringerte Aktivierung nach unterschiedlichen Stimuli für eine generelle Rolle von UBXD1 im NF B Signalweg. Durch quantitative Echtzeit-PCR konnte gezeigt werden, dass in HeLa- und HEK293T-Zellen nach UBXD1-Depletion auch die Expression endogener NF B Zielgene verringert ist. Da in UBXD1-depletierten Zellen nach Stimulation mit TNF oder IL-1 bereits die Kerntranslokation des NF B-Transkriptionsfaktor p65 reduziert ist, ist davon auszugehen, dass UBXD1 an einer früheren Phase der Aktivierung des Signalweges beteiligt ist. Möglicherweise ist dies darauf zurückzuführen, dass UBXD1 bekannte Funktionen von A20 reguliert und etwa die Bindung von A20 an Vesikel des endolysosomalen Systems oder an lineare Ubiquitinketten beeinflusst. Diese Arbeit beschreibt somit eine neue Funktion des p97-Kofaktors UBXD1 im NF B-Signalweg. N2 - The essential, ubiquitin-selective ATPase p97 regulates a variety of cellular processes in eukaryotes. Among others, these include protein quality control, DNA repair, signal-transduction, cell cycle control, autophagy and the endolysosomal system. The distinct functions of p97 are tightly controlled by regulatory cofactors. UBX domain-containing proteins are the largest and best studied group of p97 cofactors . They are characterized by a UBX domain, which mediates binding to p97. The family-member UBXD1 is highly conserved in higher eukaryotes and possesses at least two additional p97 binding modules, a PUB domain and a VIM motif. While UBXD1 can localize to vesicles of the endolysosomal degradation system, its exact cellular function is still poorly understood. The aim of this study was the functional characterisation of human UBXD1. To that end, candidates of a previous yeast two-hybrid screen were tested for their two-hybrid interaction with different UBXD1 variants. Immunoprecipitation experiments were used to analyse if the candidates also interact with UBXD1 in mammalian cells. This led to the identification of the ubiquitin-ligase TRIAD3A and the ubiquitin-editing protein A20 as promising new binding partners of UBXD1. Moreover, it could be demonstrated that the interaction between UBXD1 and A20 depends on a functional PUB domain and the seventh zinc finger motif of A20. Because both TRIAD3A and A20 are negative regulators of the NF-B signaling pathway, it was subsequently tested if UBXD1 also has a function in NF-B signaling. Indeed, UBXD1-depleted HeLa 57A cells showed a strongly reduced NF B dependent expression of a reporter gene after activation of the signaling pathway by TNF, IL-1, Doxorubicin and H2O2. The reduced activity observed after various stimuli argues for a general role of UBXD1 in the NF-B signaling pathway. Quantitative real-time PCR demonstrated that the expression of endogenous NF-B target genes in HeLa and HEK293T cells was also reduced upon UBXD1-depletion. Since the nuclear translocation of the NF-B subunit p65 upon stimulation with TNF or IL-1was also reduced in UBXD1-depleted cells, UBXD1 is likely to participate in an earlier phase of NF-B activation. It is possible that UBXD1 regulates a known function of A20 and influences for example the binding of A20 to endocytic vesicles or to linear ubiquitin chains. In summary, this work describes a novel function of the p97 cofactor UBXD1 as a positive regulator of the NF-B signaling pathway. KW - Ubiquitin KW - UBXD1 KW - Signaltransduktion KW - Cofaktor KW - p97 KW - Signalweg KW - Zellbiologie Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-132430 ER - TY - JOUR A1 - Sander, Bodo A1 - Xu, Wenshan A1 - Eilers, Martin A1 - Popov, Nikita A1 - Lorenz, Sonja T1 - A conformational switch regulates the ubiquitin ligase HUWE1 JF - eLife N2 - The human ubiquitin ligase HUWE1 has key roles in tumorigenesis, yet it is unkown how its activity is regulated. We present the crystal structure of a C-terminal part of HUWE1, including the catalytic domain, and reveal an asymmetric auto-inhibited dimer. We show that HUWE1 dimerizes in solution and self-associates in cells, and that both occurs through the crystallographic dimer interface. We demonstrate that HUWE1 is inhibited in cells and that it can be activated by disruption of the dimer interface. We identify a conserved segment in HUWE1 that counteracts dimer formation by associating with the dimerization region intramolecularly. Our studies reveal, intriguingly, that the tumor suppressor p14ARF binds to this segment and may thus shift the conformational equilibrium of HUWE1 toward the inactive state. We propose a model, in which the activity of HUWE1 underlies conformational control in response to physiological cues—a mechanism that may be exploited for cancer therapy. KW - Medicine KW - Structural Biology KW - Molecular Biophysics KW - HUWE1 KW - HECT Ligase KW - Ubiquitin KW - P14ARF KW - X-Ray Chrystallography KW - Enzyme Regulation Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-171862 VL - 6 ER - TY - THES A1 - Peter, Stefanie T1 - Hemmung der Myc-Funktion durch niedermolekulare Inhibitoren der E3-Ubiquitin-Ligase Huwe1 T1 - Inhibition of Myc function using small molecule inhibitors of the E3 ubiquitin ligase Huwe1 N2 - Die Deregulation des Transkriptionsfaktors Myc ist ein zentraler Mechanismus in der kolorektalen Karzinogenese. Die Myc-Deletion in Tumormodellen hemmt das Wachstum von Kolonkarzinomen, somit stellt die Inaktivierung von Myc einen Ansatzpunkt in der Behandlung von kolorektalen Tumoren dar. Die direkte Inhibition von Myc ist schwierig, da Myc keine katalytische Aktivität besitzt und stattdessen für die Myc-Funktion nötige Protein-Protein- oder Protein-DNA-Interaktionen angegriffen werden müssen. Die E3-Ubiquitin-Ligase Huwe1 interagiert sowohl mit Myc als auch mit dem Myc-interagierenden Protein Miz1 und ist im Kolonkarzinom überexprimiert. Huwe1 ubiquitiniert Myc und induziert darüber dessen Transaktivierungsfunktion. Die Inaktivierung von Huwe1 ist somit eine vielversprechende Möglichkeit für die Inhibition der Myc-Funktion und die Therapie des Kolonkarzinoms. In dieser Arbeit wird mittels shRNA-vermittelter Depletion von Huwe1 in Zellkulturexperimenten gezeigt, dass Huwe1 für die Proliferation von Kolonkarzinomzelllinien und für die Transaktivierung von Myc-Zielgenen benötigt wird. Mit zwei von Boehringer Ingelheim identifizierten niedermolekularen Huwe1-Inhibitoren (BI8622 und BI8626) ist es möglich, die Huwe1-Funktion spezifisch in Zellen zu blockieren. Die Huwe1-Inhibitoren induzieren einen Proliferationsarrest in kolorektalen Karzinomzelllinien, wohingegen die Substanzen auf embryonale Stammzellen keine Auswirkungen haben. Die Inaktivierung von Huwe1 führt zu einer Akkumulation von Miz1 an Promotoren Myc-aktivierter Zielgene und darüber zu einer vermehrten Bildung repressiver Myc/Miz1-Komplexe, was mit einer Deacetylierung von Histon H3 und einer transkriptionellen Repression Myc-gebundener Gene assoziiert ist. Miz1 akkumuliert nach Huwe1-Inhibition ebenso an direkten Miz1-Zielgenen, deren Expression bleibt aber unbeeinflusst. Diese Daten weisen darauf hin, dass eine kontinuierliche Degradierung von Miz1 durch Huwe1 zur Transaktivierung von Myc-Zielgenen in Kolonkarzinomzellen nötig ist. Damit wurde ein neuer Mechanismus identifiziert, über den Huwe1 die Myc-Transaktivierung reguliert und der eine tumorzellspezifische Repression der Myc-Funktion mit Hilfe von Huwe1-Inhibitoren ermöglicht. N2 - Deregulation of the transcription factor Myc is a central driver in colorectal carcinogenesis. Deletion of Myc in murine tumor models inhibits the growth of colon carcinoma, therefore inactivation of Myc is an attractive possibility for treating these types of malignancies. Since Myc does not contain any catalytic activity, protein-protein or protein-DNA interactions necessary for Myc function need to be modified, making direct targeting of Myc difficult. The E3 ubiquitin ligase Huwe1 interacts both with Myc and the Myc-interacting protein Miz1 and is overexpressed in colorectal cancer. Huwe1 ubiquitinates Myc thereby inducing its transactivation function. Hence, inactivation of Huwe1 is a reasonable approach for inhibition of Myc function and treatment of colon cancer. In this work depletion of Huwe1 via shRNA shows that Huwe1 is required for the proliferation of colon carcinoma cell lines and for transactivation of Myc target genes. Two novel small molecule inhibitors of Huwe1 (BI8622 and BI8626), which were identified by Boehringer Ingelheim, block Huwe1 function in cells specifically. The Huwe1 inhibitors induce a proliferation arrest in colorectal cancer cell lines, but not in embryonic stem cells. Inactivation of Huwe1 leads to an accumulation of Miz1 at promoters of Myc-activated target genes and to an increased formation of repressive Myc/Miz1 complexes at these sites. This is associated with deacetylation of histone H3 and transcriptional repression of Myc-bound genes. Additionally, Miz1 accumulates at direct Miz1 target genes upon Huwe1 inhibition but this does not influence expression of these genes. These data suggest that a continuous degradation of Miz1 by Huwe1 is required for transcriptional activation of Myc target genes in colon cancer cells. This identified a new principle how Huwe1 regulates Myc transactivation allowing a tumor cell-specific repression of Myc function via small molecule inhibitors of Huwe1. KW - Myc KW - Ubiquitin KW - Huwe1 KW - Kolonkarzinom KW - Colonkrebs Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-104449 ER - TY - THES A1 - Klenk, Johann Christoph T1 - Posttranslationale Modifikation von Phosducin durch den small ubiquitin-related modifier "SUMO" T1 - Posttranslational modification of phosducin with the small ubiquitin-related modifier 'SUMO' N2 - Die Rezeptor vermittelte Aktivierung heterotrimerer G-Proteine ist einer der bedeutendsten Signaltransduktionsmechanismen in vielen Organismen. Die Vielzahl unterschiedlicher Rezeptoren und Agonisten macht eine effektive Kontrolle des einzelnen Signals unumgänglich. Das zytosolische Protein Phosducin bindet beta-gamma-Untereinheiten aktivierter G-Proteine und hemmt damit sowohl Gbeta-gamma-vermittelte Effekte als auch Galpha-vermittelte Effekte. In der vorliegenden Arbeit wurde neben der bekannten 33 kDa Form von Phosducin eine weitere 47 kDa große Form in der Retina und im Herz identifiziert. Hierbei handelte es sich um Phosducin, welches mit dem small ubiquitin-related modifier, SUMO, modifiziert war. Weiterhin wurde sowohl in vitro als auch in zellulären Sytemen gezeigt, dass Phosducin mit einem Molekül SUMO an Lysin 33 modifiziert wird. Durch punktgerichtete Mutation dieser Modifikationsstelle wurde eine SUMOylierungs-defiziente Phosducin-Mutante generiert. Diese Mutante unterliegt einem gesteigerten Turnover im Vergleich zu Wildtyp-Phosducin, welcher auf die verstärke Ubiquitinierung und dem damit verbundenen proteasomalen Abbau der Mutante zurückzuführen war. Dies demonstriert, dass SUMOylierung von Phosducin protektive Wirkung auf dieses Protein hat. Darüberhinaus behindert die SUMOylierung von Phosducin dessen Bindung an Gbeta-gamma-Untereinheiten heterotrimerer G-Proteine. Diese Beobachtungen erlauben den Schluss, dass SUMOylierung neben der Phosphorylierung ein neuer und wichtiger Mechanismus ist, über den die Verfügbarkeit von Phosducin als G-Protein-Regulator kontrolliert wird. N2 - Receptor-mediated activation of heterotrimeric G-proteins is one of the most important signalling mechanisms in many organisms. The variety of different receptors and ligands require a tight control of the individual signalling processes. The cytosolic protein Phosducin has been show to tightly bind to Gbeta-gamma subunits of heterotrimeric G-proteins thereby attenuating Gbeta-gamma and G-alpha mediated signals. In the present study a previously unknown 47 kDa high molecular isoform of 33 kDa protein phosducin was identified in the retina and the heart. This isoform was shown to be phosducin modified with the small ubiquitin-related modifier SUMO. Further experiments in vitro and in cells revealed that phosducin is modified with SUMO at lysine 33. Mutation of lysine 33 abolished SUMOylation of phosducin. Compared to wild-type phosducin the SUMOylation-deficient mutant of phosducin revealed reduced steady state protein levels and increased ubiquitination. This suggests that SUMOylation is protecting phosducin from ubiquitination and subsequent proteasomal degradation. Moreover, SUMOylation of phosducin decreased its ability to bind to Gbeta-gamma subunits of heterotrimeric G-proteins. Together, these findings show that phosducin is a previously unrecognized target of SUMO modification, and that SUMOylation controls phosducin stability in cells as well as its functional properties. KW - SUMO KW - Ubiquitin KW - Phosducin KW - G-Protein KW - posttranslationale Modifikation KW - SUMO KW - ubiquitin KW - phosducin KW - G-protein KW - posttranslational modification Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-19140 ER - TY - THES A1 - Kühlkamp, Thomas T1 - Der plasmamembran assoziierte Transportregulator RS1 bindet Ubiquitin und gelangt in den Zellkern T1 - The plasma membrane associated transport modifier RS1binds ubiquitin und migrates into the nucleus N2 - Die vorliegende Arbeit liefert wichtige Erkenntnisse über die subzelluläre Verteilung und die Funktion des RS1-Proteins vom Schwein (pRS1), einem Regulator von Plasmamembran-transportern. Das grün fluoreszierende Protein (GFP) wurde mit pRS1 fusioniert und in LLC-PK1 Zellen exprimiert. Das GFP-pRS1 Fusionsprodukt (96 kD) konnte an der Plasmamembran, im Zytosol und im Zellkern entdeckt werden. Bei GFP-Fusion mit trunkierten pRS1-Proteinen zeigte sich, dass der C-Terminus die Kernlokalisierung beeinflusst. Dagegen wurde die Kernlokalisierung durch eine Trunkierung des N-Terminus nicht gestört. Im C-Terminus des pRS1 konnte von AS 579 bis 616 eine Ubiquitin associated domain (UBA) identifiziert werden, die auch in den anderen bisher bekannten RS1-Proteinen aus Mensch, Kaninchen und Maus konserviert vorliegt. Eine Ubiquitin-Affinitätschromatographie zeigte, dass das pRS1-Protein Ubiquitin auf nicht kovalente Weise bindet. Nach der Trunkierung der UBA-Domäne war keine Wechselwirkung des pRS1-Proteins mit Ubiquitin mehr feststellbar. Ein konserviertes Di-Leucin-Endozytose-Motiv (pRS1 AS 366/67) deutet eine Funktion des pRS1-Proteins bei der Internalisierung von Plasmamembranproteinen an. Deshalb wurde das Endozytoseverhalten von pRS1 überexprimierenden LLC-PK1 Zellen untersucht, wobei sich zeigte, dass diese Zellen eine deutlich höhere Aufnahme des Endozytosefarbstoffes RH 414 aufwiesen als Zellen, die pRS1 nicht überexprimierten. Die in dieser Arbeit gesammelten Daten zum RS1-Protein wurden zusammen mit früher erhobenen Ergebnissen zum RS1-Protein im Rahmen eines Modells zusammengefasst. In diesem hypothetischen Modell wird angenommen, dass RS1 ein Adapterprotein ist, welches die ubiquitinabhängige Endozytose von Plasmamembrantransportern vermittelt und als Signalmolekül in den Zellkern gelangen kann, wo es an der Transcriptionsrepression des SGLT1 beteiligt ist. N2 - This work discribes investigations about the subcellular distribution and function of the plasma membrane-associated protein RS1, an regulator of plasma membrane transporters like the Na+-D-glucose cotransporter SGLT1 or the organic cation transporter OCT2 (Vehyl et al., 1993; Reinhardt et al., 1999; Valentin et al., 2000). The green fluorescent protein (GFP) was fused to RS1 from pig (pRS1) and expressed in LLC-PK1 cells. The GFP-pRS1 protein could be detected at the plasma membrane, in the cytoplasma and in the nucleus. Expression of various truncated forms of GFP-pRS1 showed that the N-terminal half of pRS1 (amino acids 1-328) is not necessary for the migration of pRS1 into the nucleus. In contrast, truncations of the C-terminus inhibited translocation into the nucleus. The C-terminus of pRS1 contains a conserved ubiquitin associated domain (UBA) at amino acids 579 to 616. Affinity chromatography with ubiquitin-conjungated Sepharose beads showed a noncovalent binding of pRS1 to immobilized ubiquitin, which was abolished in the presence of an excess of free ubiquitin. Further analysis schowed that the C-terminal 111 amino acids were indispensable for ubiquitin binding. A conserved di-leucine signal (pRS1 336/337) is a well known endocytosis motif and points to an involvement of pRS1 in the internalisation of plasma membrane proteins. This hypothesis was supported by the finding of an increased uptake of the intercalating membrane dye RH 414 in a pRS1-overexpressing LLC-PK1 cell line. Based on this findings together with previous data, a model for the physiological role of RS1 was proposed. In this model, RS1 serves as an adaptor which links ubiquitinated plasma membrane transporters such as SGLT1 to the endocytosis machinery. Moreover RS1 migrates into the nucleus and is involved in the transcriptional suppression of SGLT1. KW - Ubiquitin KW - Carrier-Proteine KW - Plasmamembran KW - Zellkern KW - RS1 KW - SGLT1 KW - UBA KW - Ubiquitin KW - Plasmamembrane KW - Zellkern KW - Endocytose KW - RS1 KW - SGLT1 KW - UBA KW - ubiquitin KW - plasma membrane KW - nucleus KW - endocytosis Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1179507 ER -