TY - THES A1 - Linder, Bastian T1 - Systemischer Spleißfaktormangel im Zebrafisch Danio rerio – Etablierung und Charakterisierung eines Tiermodells für Retinitis pigmentosa T1 - Systemic splicing factor deficiency causes tissue-specific defects: a zebrafish model for retinitis pigmentosa N2 - Retinitis pigmentosa (RP) ist eine vererbte Form der Erblindung, die durch eine progressive Degeneration von Photorezeptorzellen in der Retina verursacht wird. Neben „klassischen“ RP-Krankheitsgenen, die direkt oder indirekt mit dem Sehprozess und der Aufrechterhaltung der Photorezeptoren in Verbindung stehen, können auch Mutationen in Genen für konstitutive Spleißfaktoren zur Photorezeptordegeneration führen. RP kann daher als Paradebeispiel einer Erkrankung mit paradoxer Gewebespezifität angesehen werden: Defekte in essentiellen und ubiquitär exprimierten Genen führen zu einem Phänotyp, der nur wenige Zelltypen betrifft. Um Einblicke in diesen außergewöhnlichen Pathomechanismus zu erhalten, wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit ein Tiermodell für Spleißfaktor-vermittelte RP im Zebrafisch Danio rerio etabliert. Zunächst wurde gezeigt, dass eine RP verursachende Punktmutation des Spleißfaktors Prpf31 auch in dessen Zebrafisch-Homolog zu einem Verlust der physiologischen Aktivität führt. Als Modell für die Prpf31-Mangelsituation diente dann die durch ein Antisense-Morpholino induzierte partielle Reduktion der Prpf31-Expression in Zebrafischlarven. Konsistent mit einem RP-Phänotyp zeigte sich in diesen Larven eine starke Beeinträchtigung des Sehvermögens. Sie wurde – ebenfalls analog zu RP – durch defekte Photorezeptoren verursacht, die bei ansonsten normal entwickelter Retina eine deutlich veränderte Morphologie aufwiesen. Daraufhin konnten in einer genomweiten Transkriptomanalyse der Augen von Prpf31-defizienten Larven erstmals in vivo photorezeptorspezifische Gene identifiziert werden, deren Expression durch den Mangel an Prpf31 beeinträchtigt war. Im zweiten Teil der Arbeit wurde untersucht, ob es neben den bereits bekannten RP-Krankheitsgenen weitere Spleißfaktoren gibt, deren Defekt die Degeneration von Photorezeptoren auslösen kann. Dazu wurde in Zebrafischlarven ein Mangel an Prpf4 erzeugt, einem Spleißfaktor, der bislang nicht mit RP in Verbindung gebracht worden war. Der Phänotyp dieser Fische war nicht von dem des Prpf31 RP-Modells zu unterscheiden. Dies lieferte einen Hinweis darauf, dass auch Defekte in Prpf4 in der Lage sein könnten, RP auszulösen. Tatsächlich konnte durch genetisches Screening ein RP-Patient mit einer Punktmutation in Prpf4 identifiziert werden (Kollaboration mit Hanno Bolz, Universität Köln). Die biochemische Analyse dieser Mutation zeigte, dass sie zu einem Defekt der Integration von Prpf4 in spleißosomale Untereinheiten und zu dessen Funktionsverlust in vivo führt. Mit dem in dieser Arbeit etablierten Tiermodell konnte zum ersten Mal in vivo ein von Spleißfaktor-Mutationen verursachter Pathomechanismus von Retinitis pigmentosa nachvollzogen werden. Die vom Prpf31-Mangel betroffenen Photorezeptortranskripte stellen vielversprechende Kandidaten für die Vermittlung der Gewebespezifität dar und unterstützen die Hypothese, dass ihre ineffiziente Prozessierung den RP-Phänotyp auslöst. Die Entdeckung eines weiteren Spleißfaktors, dessen Defizienz ebenfalls zu defekten Photorezeptoren führt, zeigt, dass offenbar der Funktionsverlust des Spleißosoms generell in der Lage ist, die Degeneration dieser Zellen zu verursachen. Dies ist nicht zuletzt auch von klinischer Relevanz, da vermutet werden kann, dass sich unter den vielen bisher nicht identifizierten RP-Krankheitsgenen weitere Spleißfaktoren befinden. N2 - Retinitis pigmentosa (RP) is a hereditary eye disease marked by the progressive degeneration of photoreceptor cells in the retina. Typical RP disease gene products are involved in visual function or photoreceptor maintenance. However, also mutations in constitutive splicing factors have been shown to cause this type of photoreceptor degeneration. In humans, almost all transcripts need to be processed by the spliceosome and hence its constitutive components are considered to be essential in all cells of the body. RP therefore serves as a paradigm for diseases with a tissue specificity paradox: Defects in essential and ubiquitously expressed genes lead to a phenotype that affects only a small subset of cells or tissues. To gain insight into this unusual etiology, an animal model for splicing factor-linked RP was established in the zebrafish Danio rerio. First, it was shown that an RP-causing missense mutation in the splicing factor Prpf31 leads to a loss of its physiological activity not only in humans, but likewise in zebrafish. The resulting splicing factor deficiency was then modeled in zebrafish embryos by the injection of an antisense morpholino that blocked Prpf31 translation. Consistent with an RP-like phenotype, partial silencing of Prpf31 led to a marked reduction in visual function. This was – again similar to what is observed in RP – caused by severe photoreceptor defects, as these cells presented a highly aberrant morphology in an otherwise normal retina. Consequently, a genome-wide transcriptome analysis of these animals for the first time resulted in the identification of photoreceptor-specific transcripts which show altered expression in vivo due to Prpf31 deficiency. The second part of this work followed the hypothesis that mutations in other splicing factors may likewise elicit photoreceptor degeneration. Therefore, the splicing factor Prpf4, which was not linked to RP prior to this work, was silenced in zebrafish embryos by the injection of an antisense morpholino. The phenotype of these fish was indistinguishable from the Prpf31 RP-model. Defects in Prpf4 might hence be able to cause the degeneration of photoreceptors. Consistent with this, an RP patient with a missense mutation of Prpf4 was identified (in collaboration with Hanno Bolz, University of Cologne). The biochemical analysis of this mutation revealed that it leads to a defect in the integration of Prpf4 into spliceosomal subunits and to its loss of function in vivo. The animal model established in this work for the first time allowed studying the etiology of splicing factor-linked RP in photoreceptors in vivo. The photoreceptor transcripts affected by Prpf31 deficiency are promising candidates for mediating the tissue-specificity of the disease and support the hypothesis that their inefficient processing triggers the RP-phenotype. The identification of another splicing factor, whose deficiency leads to defective photoreceptors, shows that a loss of spliceosomal function in general is able to cause the degeneration of these cells. This is also of clinical relevance, as it shows that the large list of unknown RP disease genes might include even more splicing factors. KW - RNS-Spleißen KW - Spleißen KW - Spleißosom KW - Retinopathia pigmentosa KW - Tiermodell KW - Zebrabärbling KW - RNA Spleißen KW - Zebrafisch KW - Tiermodell KW - Retinitis pigmentosa KW - Biochemie KW - pre-mRNA splicing KW - zebrafish KW - animal model KW - Retinitis pigmentosa KW - biochemistry Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-69965 ER - TY - THES A1 - Gan, Qiang T1 - Investigation on Distinct Roles of Smad Proteins in Mediating Bone Morphogenetic Proteins Signals T1 - Untersuchung auf Unterschiedliche Rollen von Smad Proteinen in der Signalübertragung der Knochenmorphogenetischen Proteine N2 - Knochenmorphogenetische Proteine (engl. Bone morphogenetic Proteins, BMPs) sind eine Bestandteil von transforming growth factor-β (TGF-β)-Superfamilie und spielen wichtige Rollen in zahlreichen biologischen Ereignissen in der Entwicklung fast aller mehrzelligen Organismen. Fehlregulierte BMP-Signalweg ist die zugrunde liegenden Ursachen von zahlreichen erblichen und nicht erblichen Krankheiten wie Krebs. Die von BMP induziete breite Palette von biologischen Reaktionen konvergiert auf drei eng verwandten Smad Proteine. Sie vermitteln intrazelluläre Signale von BMP-Rezeptoren in den Zellkern. Die Spezifität des BMP-Signalwegs wurde intensiv auf der Ebene der Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen erforscht, aber, wie die verschiedenen Smad Proteine die durch BMPs hervorgerufen differenziellen Signale beitragen, bleibt unklar. In dieser Arbeit haben wir die BMP / Smad Signalweg in verschiedenen Aspektenuntersucht. Auf der Suche nach einem geeigneten Fluoreszenz-Reporter im Zebrafisch, verglichen wir verschiedene photo-schaltbaren Proteine und fand EosFP der beste Kandidat für diesen Modellorganismus im Bezug auf seine schnelle Reifung und Fluoreszenz-Intensität. Wir haben durch molekulare Modifizierung geeignete Vektoren erstellt, die Tol2-Transposon basieren trangenesis im Zebrafisch zu ermöglichen. Damit wurden schließlich transgenzebrafisch-Linien erzeugt. Wir kombinierten Fluoreszenz-Protein-Tagging mit hochauflösender Mikroskopie und untersuchten die Dynamik der Smad-Proteine in Modellsystem Zebrafisch. Es wurde beobachteten, dass Smad5 Kern-Translokation erfährt, als BMP Signalgeber bei Zebrafisch Gastrulation. Wir erkundeten die Beteiligung der Smad Proteine während der Myogenese-zu-Osteogenese Umwandlung von C2C12 Zelllinie, die durch BMP4 induziert wurde. Mit siRNA versuchten wir die endogene Smad Proteine niederzuschlagen, wobei die Auswirkungen auf diesen gekoppelten noch unterschiedlichen Verfahren durch quantitative real-time PCR und Terminal-Marker Färbung ausgewertet. Wir spekulieren, dass verschiedene Smad-Komplex Stöchiometrie für unterschiedliche durch BMPs hervorgerufe zelluläre Signale verantwortlich sein könnte. N2 - Bone morphogenetic proteins (BMPs) belong to the transforming growth factor-β (TGF-β) superfamily and play important roles in numerous biological events in the development of almost all multi-cellular organisms. Dysregulated BMP signaling is the underlying causes of numerous heritable and non-heritable human diseases including cancer. The vast range of biological responses induced by BMPs converges on three closely related Smad proteins that convey intracellular signals from BMP receptors to the nucleus. The specificity of BMP signaling has been intensively investigated at the level of ligand-receptor interactions, but how the different Smad proteins contribute to differential signals elicited by BMPs remains unclear. In this work, we investigated the BMP/Smad signaling in different aspects. In search for an appropriate fluorescence reporter in zebrafish, we compared different photo-switchable proteins and found EosFP the best candidate this model system for its fast maturation and fluorescence intensity. We modified and created appropriate vectors enabling Tol2-transposon based trangenesis in zebrafish, with which transgenic zebrafish lines were generated. We combined fluorescence protein tagging with high resolution microscopy and investigate the dynamics of Smad proteins in model system zebrafish. We observed that Smad5 undergoes nucleo-translocation as BMP signal transmitter during zebrafish gastrulation. We explored the Smad involvement during myogenic-to-osteogenic conversion of C2C12 cell line induced by BMP4. We created transient loss-of-function of Smads by siRNA-mediated knockdowns and analyzed the effects on these coupled yet distinct procedures by quantitative real-time PCR and terminal marker staining. We found that different Smad-complex stoichiometry might be responsible for distinct cellular signals elicited by BMPs. KW - Knochen-Morphogenese-Proteine KW - Zebrabärbling KW - Signaltransduktion KW - Bone morphogenetic proteins KW - Smad KW - Signaling KW - Zebrafish KW - Cell line KW - Differentiation KW - Differenzierung KW - Zelllinie KW - Zebrafisch Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-71127 ER - TY - THES A1 - Wortmann, Sebastian T1 - Das Tuberoinfundibuläre Peptid von 39 Aminosäuren (TIP39): Gen-Struktur und Expressionsmuster im Zebrafisch und Mäusehirn T1 - The tuberoinfundibular peptide of 39 amino acids (TIP39): Gene structure and expression scheme in zebrafish and mouse brain N2 - Das Tuberoinfundibuläre Peptid von 39 Aminosäuren (TIP39), ein kurzes Oligopeptid mit einer N-terminalen und einer C-terminalen alpha-Helix, wurde ursprünglich bei der Suche nach einem Liganden für den neu beschriebenen PTH2-Rezeptor aus einem Hypothalamus-Hypophysen-Extrakt isoliert. Aus der bisherigen Charakterisierung von TIP39 ist am meisten bekannt bezüglich der Expressions-Muster und der Interaktion am PTH2-Rezeptor. TIP39 ist der stärkste bekannte Aktivator des PTH2-Rezeptors und wirkt am PTH1-Rezeptor als funktioneller Antagonist. Inzwischen wurde auch das TIP39 Gen des Menschen und der Maus charakterisiert. Die physiologische Rolle von TIP39 ist dennoch bisher weitgehend ungeklärt, diskutiert werden Einflüsse auf den Kalzium-Phosphat-Haushalt, die Hypothalamus-Hypophysen-Achse oder die Nozizeption. Der Schwerpunkt dieser Arbeit lag auf der Untersuchung des TIP39 kodierenden Gens des Zebrafischs danio rerio. Die komplette cDNA konnte amplifiziert werden und wurde unter der Accession No. AF486190 in der GenBank veröffentlicht. Der Genlocus konnte mittels Radiation Hybrid Mapping auf Chromosom 17 lokalisiert werden. Die 3 charakterisierten Exons und 2 Introns umfassen zusammen ca. 3750 bp. Daneben wurde die Prozessierung des Genprodukts aufgeklärt: TIP39 wird beim Zebrafisch als Preprohormon translatiert, am N-terminalen Ende findet sich eine 25 Aminosäuren lange Signalsequenz, die für sezernierte Peptide typisch ist und welche für die Aufnahme in das Endoplasmatische Retikulum verantwortlich ist. In diesem Bereich finden sich eine weitgehende Übereinstimmungen zwischen den analysierten Spezies. Gefolgt wird die Zielsequenz von einem 93 Aminosäuren langen Zwischenpeptid, das sich als wenig konserviert zwischen den Spezies zeigt. Die eigentliche Sequenz von TIP39 beim Zebrafisch zeigte eine Sequenzhomologie von 59% zur humanen Sequenz und wurde mittels Blast Suche als hochkonserviert in allen 12 untersuchten Spezies wiedergefunden. Im genomischen Southern-Blot zeigte sich, dass TIP39 beim Zebrafisch im einfachen Chromosomensatz ein „single-copy“ Gen ist. Mittels RT-PCR konnte eine sehr frühe erste Expression von TIP39 bereits ab 16 Stunden nach Fertilisation gezeigt werden. Im Bereich des supraoptischen Trakts des Zebrafischhirn konnte eine scharf umschriebene Zellpopulation mit starker TIP39-Expression detektiert werden. Durch Knockdown-Experimente konnte beim Zebrafisch gezeigt werden, dass ein Fehlen von TIP39 Expression während der Embryogenese zu einer Fehlentwicklung des Frontalhirns führt und zudem mit einer Funktionsbeeinträchtigung der Schwanzmotorik einhergeht. Hierfür wurden gerade befruchteten Zebrafischeiern im Zwei-Zell-Stadium sogenannte „Morpholinos“ injiiziert, welche als Antisense-Nukleotide spezifisch die Translation von TIP39 hemmen. Ergänzend konnte im Mäusehirn die Expression von TIP39 mittels in-situ Hybridisierung bestimmt werden. Es zeigte sich eine Expression von TIP39 in einer Vielzahl von klar umschriebenen Neuronengruppen, so im Hypothalamus, dem limbischen System und in sensorischen Neuronen, ohne dass sich im Einzelfall jeweils sicher eine Funktion hieraus ableiten lässt. In der vorliegenden Arbeit konnte somit erstmals gezeigt werden, dass TIP39 zur korrekten Neurogenese bei der Entwicklung des Frontalhirns des Zebrafisches unabdingbar ist und auch die frühe Entwicklung der Motoneurone durch TIP39 beeinflusst wird. Die ermittelten Daten unterstützen die Vorstellung von TIP39 als ein sezerniertes Neuropeptid, das als Transmitter in der Sensorik, insbesondere der Nozizeption, wirkt. Auch eine Beeinflussung der zentralnervösen Steuerung der Motorik durch TIP39 wird angenommen. Die gute Lokalisations-Übereinstimmung der Expressionen von TIP39 mit seinem zugeordneten Rezeptor, dem PTH2-Rezeptor, lässt eine systemische endokrine Wirkung von TIP39 wenig wahrscheinlich erscheinen, sondern stärkt die Hypothese von TIP39 als einem para-, bzw. autokrin wirkenden Neurotransmitter. N2 - The tuberoinfundibular peptide of 39 aa (TIP39) is a short oligopeptide containing two alpha-helices. It was first detected in hypothalamic tissue while searching for a ligand of the new-described parathyroid hormone receptor 2 (PTH2R). So far only expression scheme and interaction with the PTH2R is investigated. TIP39 is the most potent activator of the PTH2R and a functional antagonist of the PTH1R. In contrast little is known about the physiological role of TIP39, influences on the calcium phosphate balance or on nociception are discussed. We focused on the analysis of the zebrafish gene encoding the TIP39. The complete cDNA was amplified and publish in PubMed (Accession No. AF486190). The gene locus was detected on chromosome 17 via radiation hybrid mapping. TIP39 consists of 3 exons and 2 introns, in total covering 3750 bp. Zebrafish TIP39 is translated as a preprohormone, containing a typical 25 aa signal sequence, responsible for uptake to the endoplasmatic reticulum. This signal sequence showed broad accordance among all 12 analysed species, but the following 93 aa intercalated peptide is only poorly conserved. The actual TIP39 peptide shows aa accordance of 59% between zebrafish and human. Via southern blotting zebrafish TIP39 was characterized as a single copy gene. The fist expression of TIP39 during embryogenesis was detected before 16 hpf by RT-PCR. Strong TIP39 expression was located in a distinct cell group of the supraoptic tract. Knockdown of TIP39 during embryogenesis showed TIP39 being indispensable for correct forebrain development. Furthermore we described the distribution of TIP39 expression in the mouse brain by in-situ hybridization. In this work the zebrafish TIP39 gene is described. We showed first the influence of TIP39 on correct forebrain development and motoneurone formation. This data confirm TIP39 being most likely a neurotransmitter involved in sensoric especially nociception. Because of the widely concordance of the TIP39 and PTH2R expression we estimate a paracrine or autocrine effect of TIP39. KW - Zebrabärbling KW - Parathormon KW - Rezeptor KW - TIP39 KW - Parathormon KW - Rezeptor KW - Zebrafisch KW - TIP39 KW - parathyroid hormone KW - receptor KW - zebrafish Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-32230 ER - TY - THES A1 - Eggert, Christian T1 - Untersuchungen zur Biogenese spleißosomaler UsnRNPs und ihrer Bedeutung für die Pathogenese der SMA T1 - Analysis of the biogenesis of spliceosomal UsnRNPs and their significance in the pathogenesis of SMA N2 - Die neurodegenerative Krankheit Spinale Muskelatrophie (SMA) wird durch den Mangel an funktionellem Survival Motor Neuron Protein (SMN) verursacht. Eine Funktion von SMN liegt in der Biogenese spleißosomaler UsnRNPs (U-rich small nuclear ribonucleoprotein particles). Diese Arbeit zeigt in einem SMA-Modell in Hela-Zellkultur, dass der SMN-Mangel zu einer reduzierten de novo-Produktion der spleißosomalen UsnRNPs führt. In einem Zebrafisch-Modell für SMA wurde nachgewiesen, dass die reduzierte UsnRNP-Produktion die Degenerationen von Axonen der Motoneuronen verursacht, einen Phänotyp wie er bei SMA auftritt. Damit konnte erstmals eine direkte Verbindung zwischen einer zellulären Funktion von SMN und der Entstehung von SMA hergestellt werden. N2 - The neurodegenerative disease spinal muscular atrophy (SMA) is caused by unsufficient production of the survival motor neuron protein (SMN). This study shows in a SMA-model in Hela cells that SMN deficiency results in reduced de novo synthesis of spliceosomal UsnRNPs (U-rich small nuclear ribonucleoprotein particles). A zebrafish model for SMA revealed that the impaired synthesis of UsnRNPs is a direct cause for the degeneration of axons in motor neurons. This is the first link between a cellular function of SMN and the pathogenesis of SMA. KW - Spinale Muskelatrophie KW - Pathogenese KW - RNS-Spleißen KW - Small nuclear RNP KW - SMA KW - SMN KW - UsnRNP KW - Zebrafisch KW - PRMT5 KW - SMN KW - SMA KW - UsnRNP KW - zebrafish KW - PRMT5 Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-15334 ER - TY - THES A1 - Schäfer, Matthias T1 - Molecular mechanisms of floor plate formation and neural patterning in zebrafish T1 - Molekulare Mechanismen der Bodenplatten Entwicklung und neuronale Musterbildung im Zebrafisch N2 - The vertebrate spinal cord is composed of billions of neurons and glia cells, which are formed in a highly coordinated manner during early neurogenesis. Specification of these cells at distinct positions along the dorsoventral (DV) axis of the developing spinal cord is controlled by a ventrally located signaling center, the medial floor plate (MFP). Currently, the origin and time frame of specification of this important organizer are not clear. During my PhD thesis, I have analyzed the function of the novel secreted growth factor Midkine-a (Mdka) in zebrafish. In higher vertebrates, mdk and the related factor pleiotrophin (ptn) are widely expressed during embryogenesis and are implicated in a variety of processes. The in-vivo function of both factors, however, is unclear, as knock-out mice show no embryonic phenotype. We have isolated two mdk co-orthologs, mdka and mdkb, and one single ptn gene in zebrafish. Molecular phylogenetic analyses have shown that these genes evolved after two large gene block duplications. In contrast to higher vertebrates, zebrafish mdk and ptn genes have undergone functional divergence, resulting in mostly non-redundant expression patterns and functions. I have shown by overexpression and knock-down analyses that Mdka is required for MFP formation during zebrafish neurulation. Unlike the previously known MFP inducing factors, mdka is not expressed within the embryonic shield or tailbud but is dynamically expressed in the paraxial mesoderm. I used epistatic and mutant analyses to show that Mdka acts independently from these factors. This indicates a novel mechanism of Mdka dependent MFP formation during zebrafish neurulation. To get insight into the signaling properties of zebrafish Mdka, the function of both Mdk proteins and the candidate receptor Anaplastic lymphoma kinase (Alk) have been compared. Knock-down of mdka and mdkb resulted in the same reduction of iridophores as in mutants deficient for Alk. This indicates that Alk could be a putative receptor of Mdks during zebrafish embryogenesis. In most vertebrate species a lateral floor plate (LFP) domain adjacent to the MFP has been defined. In higher vertebrates it has been shown that the LFP is located within the p3 domain, which forms V3 interneurons. It is unclear, how different cell types in this domain are organized during early embryogenesis. I have analyzed a novel homeobox gene in zebrafish, nkx2.2b, which is exclusively expressed in the LFP. Overexpression, mutant and inhibitor analyses showed that nkx2.2b is activated by Sonic hedgehog (Shh), but repressed by retinoids and the motoneuron-inducing factor Islet-1 (Isl1). I could show that in zebrafish LFP and p3 neuronal cells are located at the same level along the DV axis, but alternate along the anteroposterior (AP) axis. Moreover, these two different cell populations require different levels of HH signaling and nkx2.2 activities. This provides new insights into the structure of the vertebrate spinal cord and suggests a novel mechanism of neural patterning. N2 - Das Rückenmark von Vertebraten besteht aus Milliarden von Neuronen und Gliazellen, die in einem sehr komplexen Muster während der frühen Neurogenese gebildet werden. Die Spezifizierung dieser Zellen an spezifischen Positionen entlang der dorsoventralen (DV) Achse des Rückenmarks wird durch ein ventrales Organisationszentrum, die mediale Bodenplatte (MFP), kontrolliert. Die Herkunft und der Zeitraum der Spezifizierung dieses wichtigen Organisationszentrums sind zurzeit nicht klar. In meiner Doktorarbeit habe ich die Funktionen des neuen Wachstumsfaktors Midkine-a (Mdka) im Zebrafisch charakterisiert. Mdka und der verwandte Faktor pleiotrophin (ptn) zeigen ein breites Expressionsmuster während der Embryogenese von höheren Vertebraten und sind offenbar an einer Vielzahl von Prozessen beteiligt. Die exakten in-vivo Funktionen sind jedoch nicht bekannt, da knock-out Mäuse keinen embryonalen Phänotyp zeigen. Im Zebrafisch haben wir zwei co-orthologe mdk Gene, mdka und mdkb, sowie ein ptn Gen-Ortholog isoliert. Molekulare phylogenetische Analysen ergaben, dass diese Gene durch zwei unabhängige Duplikationen eines Gen-Blocks entstanden sind. Im Gegensatz zu höheren Vertebraten haben mdk und ptn Gene divergente Funktionen entwickelt, was zu weitestgehend nicht redundanten Funktionen und Expressionsmustern geführt hat. Mittels Überexpressions- und knock-down Analysen konnte ich zeigen, dass Mdka für die Bildung der MFP im Zebrafisch benötigt wird. Anders als bisher bekannte MFP induzierende Faktoren ist Mdka nicht im embryonalen Gastrula-Organisator, dem ‚Shield’ oder der Schwanzknospe exprimiert, sondern dynamisch im paraxialen Mesoderm. Durch epistatische Analysen und Mutanten-Experimente konnte ich weiterhin zeigen, dass Mdka unabhängig von diesen Faktoren wirkt. Dies deutet auf einen neuen Mdka abhängigen Mechanismus der MFP- Bildung während der Neurogenese im Zebrafisch hin. Um Einblick in den Signalweg von Mdka im Zebrafisch zu erhalten, wurde die Funktion der midkine Gene mit der des potentiellen Rezeptors, der Anaplastischen Lymphom-Kinase (Alk), verglichen. Ein ‚Knock-down’ beider Mdk Proteine führte zu einer vergleichbaren Reduktion von Iridophoren wie bei Alk defizienten Mutanten. Demnach könnte Alk ein Rezeptor beider Mdk Proteine während der Zebrafisch-Embryogenese sein. In vielen Vertebratenspezies wurde neben der MFP eine laterale Bodenplatten (LFP) Domäne definiert. In höheren Vertebraten wurde gezeigt, dass LFP Zellen innerhalb der p3 neuronalen Domäne lokalisiert sind, welche V3 Interneuronen bilden. Es ist zurzeit nicht klar, wie diese Zelltypen angeordnet sind und wie sie während der Embryogenese gebildet werden. Ich habe ein neues Homeobox Gen nkx2.2b im Zebrafisch analysiert, welches ausschließlich in der LFP exprimiert ist. Überexpressions-, Mutanten- und Inhibitorenanalysen haben gezeigt, dass nkx2.2b durch Sonic Hedgehog (Shh) aktiviert, durch Retinolsäure und den Motoneuronen induzierenden Faktor Islet-1 (Isl1) aber reprimiert wird. Ich konnte weiterhin zeigen, dass im Zebrafisch LFP und p3 neuronale Zellen auf der gleichen Ebene entlang der DV Achse lokalisiert sind und entlang der anteroposterioren (AP) Achse alternieren. Diese zwei Zellpopulationen benötigen verschiedene Aktivitäten von Hedgehog und nkx2.2b. Dies stellt einen neuen Aspekt für den Aufbau des Rückenmarks von Vertebraten dar und deutet auf einen bisher unbekannten Mechanismus der neuronalen Musterbildung hin. KW - Zebrabärbling KW - Wachstumsfaktor KW - Neurogenese KW - Homöobox KW - Bodenplatte KW - neuronale Musterbildung KW - Midkine KW - Homeobox Gene KW - Zebrafisch KW - floor plate KW - neural patterning KW - Midkine KW - Homeobox genes KW - zebrafish Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-15789 ER -