TY  - THES
A1  - Klein, Dennis
T1  - The pathogenic role of endogenous antibodies in a mouse model for Charcot-Marie-Tooth 1B neuropathy
T1  - Die pathogenetische Funktion von endogenen Antikörpern in einem Maus-Modell der Charcot-Marie-Tooth 1B Neuropathie
N2  - Charcot-Marie-Tooth (CMT) type 1 neuropathies are a genetically heterogeneous group of non-treatable inherited disorders affecting the peripheral nervous system that lead to sensory and motor dysfunction. Secondary low grade inflammation, implicating the innate and adaptive immune system, could previously be identified as a substantial disease modifier in two mouse models for CMT1, CMT1B and 1X, respectively. However, the exact mechanism how the adaptive immune system contributes to disease pathogenesis is not completely understood. Based on observations that the accumulation of endogenous antibodies to myelin components is important for rapid myelin clearance after nerve injury during Wallerian degeneration, a possibly similar mechanism was considered for endogenous antibodies as disease amplifier in mice heterozygously deficient for P0 (P0het), mimicking some typical features of CMT1B.
In this study an increased antibody deposition was detected in the affected peripheral nerves of P0het myelin mutant mice. By crossbreeding P0het mutants with mice specifically lacking B-lymphocytes, and therefore antibodies (JHD-/-), a decline of endoneurial macrophages together with a substantially ameliorated demyelination could be demonstrated in 6-month-old mutant mice. Moreover, reconstitution with murine IgGs reverted the neuropathic phenotype, substantiating that endogenous antibodies are potentially pathogenic at this early stage of disease. Unexpectedly, in 12-months-old P0het mutants, JHD deficiency resulted in disease aggravation accompanied by an increased inflammatory reaction and M2-polarized macrophage response.
These observations suggest that in a mouse model for CMT1B, the lack of endogenous antibodies has a dichotomous effect: ameliorating early macrophage-mediated demyelination, as opposed to increasing inflammatory reactions leading to disease aggravation at older ages.
N2  - Als Charcot-Marie-Tooth (CMT) Typ 1 Erkrankungen bezeichnet man eine genetisch heterogene Gruppe von nicht behandelbaren, erblichen Neuropathien, die das periphere Nervensystem betreffen und letztendlich zu starken motorischen und sensorischen Defiziten führen. Anhand verschiedener Studien konnte gezeigt werden, dass sekundäre Entzündungsreaktionen, insbesondere des angeborenen und adaptiven Immunsystems, eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese von zwei verschiedenen CMT1-Mausmodellen (CMT1B und CMT1X) spielen. Jedoch ist der genaue Mechanismus, in dem das adaptive Immunsystem zur Pathogenese beiträgt, nicht komplett bekannt. In einer veröffentlichten Studie wurden gebundenen endogenen Antiköpern eine wichtige Rolle beim raschen Myelinabbau nach Nervläsion während der Waller´schen Degeneration zugeschrieben. In Mäusen, die heterozygot defizient für P0 (P0het) sind und einige typische Merkmale der CMT1B Neuropathie aufweisen, sollte ein möglicherweise ähnlicher Mechanismus von endogenen Antikörpern untersucht werden, der zur Verstärkung der Krankheitsentwicklung führt.
In dieser Studie konnte eine vermehrte Antikörperbindung in den betroffenen peripheren Nerven von P0het Myelinmutanten beobachtet werden. Anhand von Verkreuzungs-Experimenten von P0het Mutanten mit Mäusen, die keine B-Lymphozyten besitzen und daher keine Antikörper bilden können (JHD-/-), konnte zudem in den untersuchten 6 Monate alten Doppelmutanten eine verringerte Anzahl endoneuraler Makrophagen und eine deutliche Verbesserung der Demyelinisierung aufgezeigt werden. Zusätzlich konnte anhand von Rekonstitutions-Experimenten mit mausspezifischen-IgGs der neuropathische Phänotyp in peripheren Nerven wiederhergestellt werden, was die mögliche pathogenetische Rolle endogener Antikörper im frühen Stadium der Erkrankung bekräftigt. Unerwarteterweise führte die JHD-Defizienz jedoch in 12 Monate alten P0het Mausmutanten eher zu einer Verschlechterung der Neuropathie, zusammen mit einer verstärkten Entzündungsreaktion und M2-polarisierten Makrophagen-Aktivierung.
Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass das Fehlen von Antikörpern in einem etablierten Mausmodell für CMT1B unterschiedliche Folgen hat, da dies zu einer verringerten Makrophagen-vermittelten Demyelinisierung im frühen Erkrankungsverlauf führt, gleichzeitig aber im späteren Alter in einer verstärkten Entzündungsreaktion und einem vermehrten Nervschaden resultiert.
KW  - Charcot-Marie-Tooth
KW  - Demyelinisierung
KW  - Adaptives Immunsystem
KW  - Antikörper
KW  - Makrophagen
KW  - B-Lymphocyten
KW  - Fc-Rezeptor
KW  - Komplement
KW  - demyelination
KW  - antibodies
KW  - macrophages
KW  - adaptive immune system
KW  - B-lymphocytes
KW  - Fc-receptor
KW  - complement
KW  - Maus
KW  - Charcot-Marie-Syndrom
KW  - Immunsystem
KW  - Antikörper
Y1  - 2015
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-121941
ER  - 
TY  - THES
A1  - Czakai, Kristin Bernadette
T1  - Interaktionen des humanpathogenen Pilzes Aspergillus fumigatus mit dem angeborenen Immunsystem und Thrombozyten
T1  - Interaction of the human pathogenic mold Aspergillus fumigatus with the innate immune system and platelets
N2  - Pilze sind in unserer Umwelt allgegenwärtig und besiedeln im Fall von Candida albicans (C. albicans) sogar bei über 50% der Menschen die Schleimhäute, während Sporen von Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) täglich über die Atmung in die Lunge des Menschen gelangen. Dennoch sind Erkrankungen, die durch diese zwei Pilze ausgelöst werden, bei gesunden Menschen selten. Ist jedoch das Immunsystem beeinträchtigt, können diese Pilze zu systemischen und damit lebensbedrohlichen Erkrankungen wie der invasiven Aspergillose und der systemischen Candidiasis führen. Für eine Verbesserung der Behandlung solcher Infektionen ist das genaue Verständnis der Immunabwehrmechanismen entscheidend. Da A. fumigatus über die Lunge in den Körper gelangt, wurden in dieser Arbeit die häufigsten Immunzellen der Lunge, die Makrophagen, und deren Immunantwort auf A. fumigatus untersucht. Parallel hierzu wurden dendritische Zellen (DCs) verwendet, die als Brücke zwischen dem angeborenen und adaptiven Immunsystem wirken. Ein besonderes Augenmerk wurde hierbei auf A. fumigatus induzierte Genexpressionsänderungen und deren Regulationsmechanismen gelegt. Dabei wurden kurze, regulatorische RNAs, die sogenannten miRNAs, untersucht, die eine wichtige Rolle in der post-transkriptionalen Genregulation spielen. Bislang ist nur wenig über die miRNA-abhängigen Genregulationen in DCs, die auf eine Infektion mit A. fumigatus oder C. albicans reagieren, bekannt. Um alle durch A. fumigatus und C. albicans regulierten miRNAs zu identifizieren, wurden DCs mit A. fumigatus und C. albicans ko-kultiviert und anschließend eine Komplettsequenzierung der kurzen RNAs durchgeführt. Die Pilz-spezifische Induktion der miRNA-Regulation wurde zudem mit der miRNA-Regulation durch den bakteriellen Zellwandbestandteil Lipopolysaccharid verglichen. Durch die Stimulation mit Keimschläuchen von A. fumigatus wurden die miRNAs miR-132-3p/5p, miR-155-5p, miR129-2-3p, miR-129-5p, miR-212-3p/5p und miR-9-5p in DCs induziert. Diese wurden ebenfalls durch C. albicans induziert, zudem noch die miRNAs miR-147a und miR-147b. Spezifisch für A. fumigatus war die Regulation der miR-129-2-3p. Neben dem miRNA-Profiling wurde auch das mRNA-Transkriptom über Microarrays analysiert und dadurch 18 potentielle Zielgene der Pilz-induzierten miRNAs identifiziert.
Neben den Elementen der Translationsregulation wurden auch die Transkriptionsfaktoren untersucht. Als einziger unter den 60 regulierten Transkriptionsfaktoren zeigte KLF4 eine veränderte Expressionsrichtung in DCs, die mit Pilzen oder LPS behandelt waren. Während die Stimulation mit LPS die Expression von KLF4 induzierte, wurde es durch die Pilze A. fumigatus und C. albicans reprimiert. In einer Untersuchung der unterschiedlichen A. fumigatus-Rezeptoren, wurde deren Einfluss auf die KLF4-Regulation gezeigt. Während TLR4-Liganden KLF4 induzierten, führten Liganden, die an die Rezeptoren TLR2/TLR1 und Dectin-1 binden, zu einer Reduktion von KLF4. Nach einem erfolgreich etablierten KLF4-knock-down mittels RNA-Interferenz wurden KLF4-Zielgene untersucht. Während kein bzw. nur ein geringer Effekt auf die Genexpression von CCL2, RANTES, CXCL10 und TNF beobachtet wurde, sorgte der KLF4 knock-down für eine hoch signifikante Reduktion der IL6-Genexpression in LPS-stimulierten DCs.
Um die KLF4-Regulation weiter zu untersuchen, wurde zudem eine weitere Zellpopulation des angeborenen Immunsystems, die Makrophagen, verwendet. Auch hier wurde die Immunantwort gegen A. fumigatus analysiert. Zudem wurde die Rolle der Thrombozyten als Immunmediatoren betrachtet. Zuerst wurde ein Zytokinprofil des plättchenreichen Plasmas (PRP), das mit A. fumigatus stimuliert wurde, erstellt. In diesem konnte nur RANTES in hoher Konzentration nachgewiesen werden. Daraufhin wurde der Einfluss von PRP auf die Reifung von DCs, die Phagozytosefähigkeit von Makrophagen und DCs sowie der Einfluss von DCs und Makrophagen auf die metabolische Aktivität von A. fumigatus in An- und Abwesenheit von plättchenreichem Plasma untersucht. Es konnte eine gering verstärkte Reifung der DCs durch PRP gezeigt werden. Isolierte Thrombozyten konnten die Phagozytose von DCs steigern, während Makrophagen durch PRP verstärkt Konidien phagozytierten. In einem genomweiten Transkriptomprofiling wurde die Immunantwort von DCs und Makrophagen verglichen. Zudem wurde untersucht, wie PRP die Immunantwort dieser Immunzellen beeinflusst. Es wurden 2 bzw. 24 Gene identifiziert, die signifikant in A. fumigatus-stimulierten DCs und Makrophagen reguliert waren. Hierbei wurde gezeigt, dass KLF4 durch die Zugabe von PRP herabreguliert wurde. Das zuvor beschriebene Zielgen IL6 wurde durch PRP in A. fumigatus-stimulierten DCs gegenüber stimulierten DCs ohne PRP deutlich reduziert, wodurch sich eine immunmodulatorische Fähigkeit des PRP zeigte. 
Die Induktion von IL-6, weiteren Zytokinen und der Reifemarker durch A. fumigatus in DCs wurden zudem in einem Booleschen Modell simuliert. Dieses Modell soll in Zukunft Vorhersagen über experimentelle Ergebnisse und dadurch eine optimale Versuchsvorbereitung ermöglichen.
N2  - Fungi are ubiquitously distributed and around 50% of human mucosae are colonized by Candida albicans. Spores of Aspergillus fumigatus, called conidia, reach the human lung by inhalation of normal air. Still, fungi normally do not cause severe diseases in healthy individuals. Immunosuppression, however, predisposes to systematic and therefore life-threatening infection like invasive aspergillosis and systemic candidiasis. The treatment of those infections can only be improved by a detailed insight in immune defense mechanisms. The most prominent cell type in the lung, the location where A. fumigatus conidia can germinate and grow into tissue, are macrophages. Furthermore, the immune response of DCs that bridge innate and adaptive immunity was compared to macrophages. The main focus was on A. fumigatus induced changes in gene expression and their regulatory mechanisms.
Especially the regulation of small, regulatory RNAs, called miRNAs, that are important in the post-transcriptional regulation of gene expression, was examined. So far, little is known about miRNA regulations in DCs, confronted with A. fumigatus or C. albicans. Therefore a complete sequencing of small RNAs was performed to discover all regulated miRNAs. The fungi-induced regulation was compared to DCs, stimulated with the bacterial cell membrane component lipopolysaccharide (LPS). An A. fumigatus and C. albicans dependent regulation of miR-132-3p/5p, miR-155-5p, miR129-2-3p, miR-129-5p, miR-212-3p/5p and miR-9-5p was observed. In C. albicans simulated DCs miR-147a and miR-147b were additionally regulated, whereas miR-129-2-3p was specifically regulated by A. fumigatus. Furthermore a genome wide transcriptome profiling was performed and 18 potential miRNA targets were identified. 
Beside post-transcriptional regulators of gene expression, an analysis of transcriptional regulators, called transcription factors, was conducted. The transcription factor KLF4 was identified as the only of all 60 differentially regulated transcription factors that was oppositely regulated comparing fungi and LPS. KLF4 was induced by LPS, but strongly down-regulated by A. fumigatus and C. albicans stimulation. Specific Toll-like receptor 4 activation by LPS and ultra-pure LPS induced KLF4. However, ligands to TLR2/TLR1 and Dectin-1 significantly reduced KLF4 mRNA and protein. A KLF4 knock-down by RNA interference was established to analyze KLF4 target genes. Little or no effect was observed on the expression of CCL2, RANTES, CXCL10 and TNF. However, KLF4 knock down induced a significant reduction of IL6 gene expression and IL-6 release by LPS treated DCs.
To further examine the KLF4 regulation another cell type of the innate immune system, called macrophages, was used. The A. fumigatus-induced immune response of macrophages was compared to DCs. Furthermore, the role of platelets as immune mediators was examined. At first, a cytokine profile of untreated and A. fumigatus stimulated platelet-rich plasma was performed. RANTES was identified as the only detectable cytokine. Then the influence of PRP on DC maturation, DC and macrophages phagocytosis as well as the metabolic activity of A. fumigatus was determined. Only a weak, but still significant, influence of PRP on DCs maturation induced by A. fumigatus was observed. In the analysis of phagocytosis of A. fumigatus conidia, DCs and macrophages were reacting differently to the addition of PRP and isolated platelets. Isolated platelets were able to enhance the phagocytosis of DCs. On the other hand, PRP and plasma without platelets increased phagocytosis of macrophages. In a genome wide approach the immune response of DCs and macrophages was compared and additionally examined, if PRP alters the DC and macrophage gene expression. PRP induced a significant regulation of 2 and 24 genes of A. fumigatus treated DCs and macrophages. Furthermore, an influence of PRP on the KLF4 expression was monitored. The previously described KLF4 target gene IL6 was significantly down-regulated in PRP and A. fumigatus stimulated DCs and macrophages, compared to A. fumigatus stimulated cells. In conclusion, PRP has only a weak but detectable influence on cell function and gene expression. 
Furthermore a Boolean model was established to analyze the influence of A. fumigatus stimulation on the cytokine release, especially of IL-6, IL-1B and TNF, and the induction of maturation markers. This model will be used for predictions and optimizations of experimental settings.
KW  - Aspergillus fumigatus
KW  - Immunsystem
KW  - Thrombozyt
KW  - angeborenes Immunsystem
Y1  - 2015
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-117496
ER  -