TY - THES A1 - Widmaier, Louis T1 - Die Regulation des Chemokinrezeptors CXCR4 durch Chemotherapeutika in Myelomzelllinien T1 - The regulation of chemokinreceptor CXCR4 by chemotherapeutics in myeloma cell lines N2 - Untersucht wurde der Einfluss mehrerer Chemotherapeutika auf den Chemokinrezeptor CXCR4 in Myelomzelllinien auf Ebene des Promotors, der mRNA und der Rezeptorverteilung, wobei drei Substanzen (Etoposid, Bortezomib und Dexamethason) als potenzielle Suppressoren des Promotors ausgemacht werden konnten. Abhängig vom Myelom-Zelltyp und der Dosierung können so evtl. Rückschlüsse auf die beobachtete Suppression von CXCR4 bei erkrankten Patienten mit hoher CXCR4-Aktivität (hier: Malignes Myelom) durch die begleitende Chemotherapie gezogen werden, welche eine Diagnostik und Therapie bei diesen Patienten erschwert. Hintergrund: Hintergrund für diese Arbeit waren Beobachtungen in klinischen Fallstudien von Lapa et al. am Universitätsklinikum Würzburg, die sich auf CXCR4 bezogen, welches u.a. bei Patienten mit Multiplem Myelom überexprimiert wird und dadurch bereits als Target für Diagnostik und Therapie in der Klinik Anwendung findet. Dabei konnte bei PET-CT Untersuchungen in der Nuklearmedizin beobachtet werden, dass es durch die begleitende Chemotherapie der Patienten zu einer Suppression des markierten CXCR4-Signals kam, so dass es nicht mehr zur Verlaufsbeobachtung und vor allem nicht mehr zur Radiotherapie und Therapiekontrolle verwendet werden konnte. Um den Einfluss und mögliche Interaktionen der Chemotherapeutika auf CXCR4 zu untersuchen, war es Ziel dieser Arbeit, ein vergleichbares Szenario in-vitro nachzustellen und Einflüsse messbar zu machen, um so mögliche Ansätze und Verbesserungsvorschläge für die klinische Anwendung zu liefern. Methoden/Ergebnisse: Hierfür wurden im ersten Teil INA-6 (Myelomzellen) und Mesenchymale Stammzellen (MSC) kultiviert, in Ko-Kultur gebracht und nach einer bestimmten Zeit wieder getrennt, um anschließend den gegenseitigen Einfluss in Bezug auf CXCR4 zu messen. Zudem wurde der Einfluss von Dexamethason untersucht. Es zeigte sich eine enge Bindung zwischen INA-6 und MSC sowie eine hohe CXCR4-Aktivität bei INA-6, jedoch konnte keine Induktion der CXCR4-Aktivität in MSC durch INA-6-Kontakt oder Dexamethason quantifiziert werden. Die Immunzytologie erwies sich aufgrund einer schweren Anfärbbarkeit von CXCR4 – auch mit verschiedensten Antikörpern und sogar Liganden-gekoppeltem Farbstoff– als kaum auswertbar, wobei eine Darstellung von CXCR4 generell aber gelang. Der CXCR4-Promotor wurde mittels Software genauer analysiert, wobei einige relevante Bindestellen, u.a. für Glukokortikoide und NFkB gefunden wurden. Die Herstellung eines CXCR4- pGl4.14-Promotor-Konstrukts war erfolgreich, ebenso dessen Einschleusung in Myelomzellen. Auch gelang die Herstellung stabiler transfizierter INA-6, sodass mit diesen anschließend konstantere Ergebnisse erzielt werden konnten. Im größten Teil der Arbeit wurden geeignete Chemotherapeutika-Konzentrationen ermittelt und in Viabilitäts- und Apoptose-Versuchen überprüft. Die Stimulationsversuche mit diesen zeigten variable Effekte abhängig vom Zelltyp (INA-6, MM1S), jedoch konnten Bortezomib, Etoposid und Dexamethason konzentrationsabhängig als starke Suppressoren der CXCR4-Aktivität ausgemacht werden, was sich v.a. auf Ebene der Promotoraktivität – gemessen mittels Luciferase - zeigte. Interpretation: In-vitro konnten somit drei potenzielle Suppressoren der CXCR4-Aktivität ausgemacht werden: Etoposid, Bortezomib und Dexamethason. Zumindest beim INA-6-Zelltyp fiel dieser Effekt deutlich aus, wobei in der Klinik der entsprechende Zelltyp sowie die Dosierung der Medikamente berücksichtigt werden müssen. Hinzu kommen weitere Einflussfaktoren des menschlichen Körpers, die nicht berücksichtig werden konnten. Die genauen Mechanismen der Suppression könnten sich aus den Bindestellen des Promotors erklären, die von uns analysiert wurden, aber auf die in weiteren Arbeiten noch näher eingegangen werden muss. N2 - The influence of several chemotherapeutic agents on the chemokine receptor CXCR4 in myeloma cell lines at the level of the promoter, the mRNA and the receptor distribution was examined, whereby three substances (etoposide, bortezomib and dexamethasone) could be identified as potential suppressors of the promoter. Depending on the cell type and the dosage, conclusions can be drawn about the observed suppression of CXCR4 in patients with diseases with high CXCR4 activity (here: multiple myeloma) due to the accompanying chemotherapy, which impairs theranostic applications like diagnostic imaging using PET/CT and may in particular abolish the chances of radiotherapeutic intervention in these patients. Background: The background for this work were observations in clinical case studies by Lapa et al. at the University Hospital Würzburg, which referred to CXCR4, which is overexpressed in patients with multiple myeloma and is therefore already used as a target for diagnostics and therapy in the clinic. During PET-CT examinations in nuclear medicine, it could be observed that the accompanying chemotherapy of the patients led to a suppression of the marked CXCR4 signal, which is why it could no longer be used for monitoring the follow-up, but also was lost as a radiotherapeutic target. In order to investigate the influence and possible interactions of chemotherapeutic agents on CXCR4, the aim of this work was to simulate a comparable scenario in vitro and to make influences measurable in order to provide possible approaches and suggestions for improvement for clinical application. Methods/Conclusions: For this purpose, INA-6 (myeloma cells) and mesenchymal stem cells (MSC) were cultivated in the first part, brought into co-culture and separated again after a certain time in order to then measure the mutual influence with regard to CXCR4 expression. The influence of dexamethasone was also examined. There were intensive contacts between INA-6 and MSC and high CXCR4 activity in INA-6, but no induction of CXCR4 activity in MSC by INA-6 or dexamethasone could be quantified. The immunocytology turned out to be difficult due to the difficulty of staining CXCR4 - even with a wide variety of antibodies and ligand-coupled dyes - although CXCR4 was generally able to be represented. The CXCR4 promoter was analyzed in more detail using the Genomatix software, and some relevant binding sites, including response elements for glucocorticoids and NFkB, were found. The production of a CXCR4-pGl4.14 luciferase-reporter construct was successful, as was its introduction into myeloma cells. The production of stably transfected INA-6 was also successful, so that more constant results could then be achieved. In a large part of the work, suitable chemotherapeutic concentrations were determined and checked in viability and apoptosis tests. The stimulation experiments with these showed variable effects depending on the cell type (INA-6, MM1S). However, depending on the concentration, bortezomib, etoposide and dexamethasone could be identified as strong suppressors of CXCR4 activity, which was particularly evident at the level of activity of our luciferase-reporter construct. Interpretation: Overall, three potential suppressors of CXCR4 activity could be identified in-vitro: etoposide, bortezomib and dexamethasone. At least with the INA-6 cell type, this effect was clear, although the corresponding cell type and the dosage of the medication must be taken into account in the clinic. In addition, there may be other influencing factors of the human organism in vivo that could not be considered. The exact mechanisms of suppression could be explained by the binding sites of the promoter, which we analyzed, but which will have to be discussed in more detail in further work. KW - Bortezomib KW - Plasmozytom KW - Chemokin CXCL12 KW - Multiples Myelom KW - Chemotherapie KW - Promotor KW - CXCR4 KW - Stimulationsversuche Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-345682 ER - TY - JOUR A1 - Winkler, Christoph A1 - Hong, Yunhan A1 - Wittbrodt, Joachim A1 - Schartl, Manfred T1 - Analysis of heterologous and homologous promoters and enhancers in vitro and in vivo by gene transfer into Japanese medaka (Oryzias latipes) and Xiphophorus N2 - Efficient expression systems are required for analysis of gene regulation and function in teleost fish. To develop such systems, a nurober of inducible or constitutive promoter and enhancer sequences of fish or higher vertebrate origin were tested for activity in a variety of fish celllines andin embryos of the Japanese medaka fish (Oryzias latipes) and Xiphophorus. The activity of the different promoterenhancer combinations were quantitated. Considerable differences were found for some constructs if tested in vitro or in vivo. From the data obtained, a set of expression vectors for basic research as weH as for aquaculture purposes were established. KW - Schwertkärpfling KW - Japankärpfling KW - Gentransfer KW - Enhancer KW - Promotor KW - In vitro KW - In vivo Y1 - 1992 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-86796 ER - TY - THES A1 - Willenbacher, Ella T1 - Analyse der Frequenz polymorpher repetitiver Elemente innerhalb der Promotorregion des PAX-7 Gens bei Patienten mit Schizophrenie und einer gesunden Vergleichspopulation T1 - Analysis of the frequency of polymorphic repetitive motives in the PAX-7 promotor region in schizophrenic and healthy populations N2 - PAX 7 ist ein Gen mit, neben anderen Funktionen, ausgeprägter neuroentwicklungsgeschichtlicher Bedeutung. Schizophrenie wird heute als primär genetisch bedingte Neuroentwicklungstörung aufgefaßt (I.1.2, Abbildung 2). Im Rahmen dieser Dissertation wurde die Assoziation zwischen den drei repetitiven Trinukleotidpolymorphismen vom (CCT)n Typ und ihren fünf korrespondierenden Genotypen in der regulatorischen Sequenz der PAX 7 Promotorregion, die bekannterweise die Expressionshöhe des PAX 7 Genproduktes beeinflussen und einer Prädisposition zur Entwicklung einer Schizophrenie oder einer Ihrer Subkategorien nach DSM-IV3 (paranoid, nicht-paranoid, schizoaffektiv) mittels eines Polymerasekettenreaktions-basierten Assays in Proben von 280 an Schizophrenie erkrankten Patienten und 229 Kontrollproben gesunder Blutspender untersucht. Weder auf der genotypischen noch auf der allelischen Ebene konnte eine statistisch signifikante Korrelation nachgewiesen werden. Die PAX 7 Promotor Polymorphismen stellen also keine nützlichen Biomarker einer schizophren Polymorphismen Prädisposition dar. Die Rolle dieser Polymorphismen in anderen PAX 7 abhängigen Mechanismen bedarf weiterer Aufklärung, während polygen orientierte „Komplettgenom“ Techniken (z.B. genexpression profiling) besser geeignet sein könnten um das multifaktorielle Netz der Schizophrenie-Entwicklung aufzuklären. N2 - Pax 7 is a gene of , among other features, enormous neurodevelopmental importance. Schizophrenia is today considered to be a primarily genetic based neurodevelopmental disease (I.1.2, figure 2). In this thesis the association between the three repetitive trinucleotide polymorphisms of the (CCT)n type and their five existing genotypic expressions, known to affect expression levels of Pax 7, in the regulative sequence of the Pax 7 promotor and the predisposition towards development of schizophrenia or its subcategories according to DSM-IV3 (paranoid, not-paranoid, schizoaffective) was analyzed by means of an polymerase chain reaction based assay in the DNA of 280 pts. afflicted by this condition and 229 control samples from healthy blood donors. No statistical association was found neither on the genotypic nor the allelic level. Thus Pax 7 promotor polymorphisms are no usefull biomarkers of a predisposition towards a development of schizophrenic manifestations. The role this polymorphisms in other Pax 7 related mechanisms should be further elucidated, while polygenic oriented whole genome techniques (e.g. genexpression profiling) seem to be candidates to entangle the multifactorial web of schizophrenic predisposition. KW - PAX-7 KW - Schizophrenie KW - Promotor KW - PAX-7 KW - Schizophrenia KW - Promotor Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-45392 ER - TY - THES A1 - Cordes, Tatjana T1 - Bindungsverhalten der verschiedenen NFAT-Transkriptionsfaktoren an den nur77-Promotor und ihre Kooperationsfähigkeit mit MEF2D bei der Aktivierung des nur77-Promotors T1 - Binding of the different NFAT-transcription factors at the nur77-promotor and the cooperation with MEF2D in the activation of the nur77-promotor N2 - Sowohl NFAT- (Nukleäre Faktoren aktivierter T-Zellen) als auch MEF2- (’myosin-enhancer factor 2’) Transkriptionsfaktoren spielen eine wichtige Rolle bei der Differenzierung, Proliferation oder Apoptose vieler eukaryotischer Zellen. Sie sind in einer Vielzahl von Zellen aktiv und können dort die Transkription ihrer Zielgene nach Stimulation der Zellen mit anschließendem Calcium-Einstrom aktivieren. Dabei kooperieren sie oft mit anderen Transkriptionsfaktoren. Kurz vor Beginn dieser Arbeit erschienen zwei Veröffentlichungen, die eine Kooperation von MEF2D mit NFATc2 bei der Aktivierung des nur77-Promotors, der bei der negativen Selektion von T-Zellen aktiv ist, beschrieben. Im Rahmen dieser Arbeit sollte nun das Bindungsverhalten verschiedener NFAT-Proteine an den nur77-Promotor und ihre Kooperationsfähigkeit mit MEF2D bei der Aktivierung des nur77- und anderer Promotoren untersucht werden. Es konnte gezeigt werden, dass verschiedene NFAT-Faktoren direkt an ein Oligonukleotid des nur77-Promotors (von Position -274 bis -247 bp reichend) binden. Diese Bindung wird zwar durch eine Bindung von MEF2-Faktoren an den Promotor unterstützt, ist jedoch nicht wesentlich beeinträchtigt, wenn MEF2-Faktoren aufgrund von einer Mutation in ihrer Bindungssequenz nicht binden können. Dagegen führt eine Mutation der NFAT-Bindungsstelle zu einer aufgehobenen Bindung von NFAT-Faktoren an den Promotor. Desweiteren zeigte sich, dass nicht nur endogenes NFATc2 sondern auch verschiedene NFATc1-Isoformen an den Promotor binden können. In ihrer Fähigkeit mit MEF2D zu kooperieren, zeigte sich kein Unterschied zwischen den getesteten NFAT-Isoformen NFATc1/αA, NFATc1/αC oder NFATc2. So aktivierten in Transfektionsversuchen in Jurkat T-Zellen und 293 T-Zellen alle NFAT-Proteine die Luciferase-Reporter-Gen-Konstrukte gemeinsam mit MEF2D in etwa additiver Weise. Dies konnte an verschiedenen Luciferase-Reporter-Genen (nur77-gesteuert, hFasL-gesteuert und desmin-gesteuert) nachgewiesen werden, was auf eine mögliche Kooperation der verschiedenen NFAT-Faktoren mit MEF2D (und evtl. auch anderen MEF2-Faktoren) nicht nur bei der Apoptose von T-Zellen sondern auch in anderen Zellen hinweist. N2 - NFAT- (nuclear factors of activated t cells) and MEF2- (myosin enhancer factor 2) transcription factors play an important role in the differentiation, proliferation or apoptosis of eucaryotic cells. They are activ in a variation of cells and they can activate the transcription of their target genes after stimulation of the cells with calcium influx. Both cooperate often with other transcription factors. Before the beginning of this work, there were two publications which discribed a cooperation of MEF2D with NFATc2 in the activation of the nur77 promotor, which is activ in t cells undergoing negative selection. In this work I studied the binding of different NFAT-proteins at the nur77-promotor and their ability to cooperate with MEF2D activating the nur77-promotor and other promotors. It could be shown that different NFAT-facors bind to an oligonucleotid of the nur77-promotor (reaching from position -274 to -247 bp). This binding is assisted by the binding of MEF2D to the promotor, but MEF2D binding is not essential for NFAT binding (when the MEF2-binding site is mutated). When the NFAT binding site is mutated, no binding of NFAT factors could be observed. It also could be shown, that not only NFATc2 but also different NFATc1-isoforms can bind to the promotor. There was no difference between the tested NFAT-isoforms NFATc1/αA, NFATc1/αC or NFATc2 in their ability to cooperate with MEF2D. All of them activated different luciferace-reporter-gene-contructs (nur77, hFasL, desmin) in transfection assays in Jurkat t-cells and 293 t-cells aproximately in addition, which might hint to a possible cooperation of different NFAT-factors with MEF2D not only in the apoptosis of t-cells but also in other cells. KW - Transkriptionsfaktor KW - Promotor KW - Apoptosis KW - Immunsystem KW - NFAT KW - MEF2D KW - Nur77 KW - Protein-Protein-Interaktion KW - Protein-DNA-Interaktion KW - NFAT KW - MEF2D KW - nur77 KW - interaction KW - apoptosis Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-25964 ER - TY - THES A1 - Gross, Tim Philipp T1 - Transkriptionelle Regulation des CD23a-Promotors in Zellen chronischer lymphatischer Leukämien vom B-Zelltyp T1 - Transcriptional regulation of the CD23a-Promotor in cells of B-cell-type chronic lymphoid leukemias N2 - Die Expression und Regulation des Gens für den niedrig affinen Immunglobulin E-Rezeptor, von welchem beim Menschen zwei Isoformen existieren, unterscheidet sich deutlich zwischen B-Lymphozyten der chronisch lymphatischen Leukämie und normalen B-Zellen. Eine Untersuchung auf Promotorebene erscheint daher interessant; da der Promotor der Isoform b schon relativ gut charakterisiert ist, wurde in dieser Arbeit der CD23a-Core-Promotor näher betrachtet. Ein besonderes Augenmerk galt dabei putativen Bindungsstellen für STAT6. Das Bindungsverhalten von Transkriptionsfaktoren an Promotor-DNA wurde mit Gel-Retardierungsexperimenten (EMSA) untersucht. Hierzu wurden CD23a-Core-Promotor-Oligonukleotide zusammen mit Kernproteinextrakten aus Stimulationsansätzen von B-CLL- und normalen B-Zellen mit IL-4, IFN-g und PMA genutzt. Die EMSA-Experimente zeigten trotz unterschiedlicher Stimulationsansätze ein sich wiederholendes Bandenmuster, sodass die DNA-Protein-Interaktion auf Core-Promotorebene keine ausreichende Erklärung für die differentielle Regulation der Genexpression lieferte. Allerdings zeigten analoge EMSA-Versuche mit Kernextrakten einer EBV-transformierten Zelllinie ein leicht verändertes Bandenmuster, was auf ein verändertes Profil an Transkriptionsfaktoren am CD23a-Core-Promotor nach EBV-Transformation hindeuten kann. Eine weitere Analyse der Core-Promotorregion mittels der DNase-I-Footprint-Technik wurde durch die Klonierung geeigneter Vektoren und Etablierung einer Positivkontrolle vorbereitet. Da IL-4 den Hauptregulator auch der CD23a-Expression darstellt, war ein zentraler Teil der Arbeit die Charakterisierung von STAT6-Bindungsstellen im CD23a-Core-Promotor. Durch Sequenzanalyse wurden 2 putative STAT6-Bindungsstellen identifiziert. Mit Hilfe von Kompetitionsexperimenten konnte für eine der beiden Stellen (Nukleotidsequenz TAC CTGA GAA, Position 77-86 im CD23a-Core-Promotor) eine STAT6-Bindungsfähigkeit nachgewiesen werden; diese Bindungsstelle zeigte im Vergleich zu ihrem schon bekannten Gegenpart im CD23b-Promotor ein etwas schwächeres Bindungsvermögen für STAT6.Entscheidend für die Regulation der CD23-Expression sind wahrscheinlich das Zusammenspiel von STAT6 mit anderen Transkriptionsfaktoren wie Krox20 und NF-kB sowie alternative Signaltransduktionswege; auch Proto-Onkogene wie bcl-6 und Notch2 sind bei der Expression von CD23 von Bedeutung. Deren Rolle für die Pathogenese der B-CLL muss noch untersucht werden. N2 - The expression and regulation of the gene of the low-affinity immunoglobulin E receptor, of which there are two isoforms in human beings, is clearly different between B-cells in chronic lymphoid leukemia and normal B-cells. An examination of the promotor seems interesting; as the isoform-b’s promotor is already quite well characterized, in this work the CD23a-core-promotor was further examined. Special attention was turned on putative binding sites of STAT6. The binding of transcription factors to promotor-DNA was examined by electro mobility shift assays (EMSA). This was done by using CD23a-core-promotor oligonucleotides with nuclear extracts from stimulation assays of B-CLL and normal B-cells with IL-4, IFN-g and PMA. The EMSA-experiments showed in spite of different stimulation assays an equal band-pattern; thus the DNA-protein-interaction on the core-promotor level does not sufficiently explain the differential regulation of the gene expression. However, analogous EMSA-experiments with nuclear extracts of an EBV-transformed cell-line showed a slightly different band-pattern, which may be due to a different spectrum of transcription factors on the CD23a-core-promotor after EBV-transformation. A further analysis of the core-promotor was prepared by cloning appropriate vectors and establishing a positive control. As IL-4 is the main regulator of CD23a-expression, a central part of this work was the characterization of STAT6-binding-sites in the CD23a-core-promotor. 2 putative binding sites were identified by sequence-analysis. Competition experiments showed a STAT6-binding ability of one of the two sites (nucleotide sequence TAC CTGA GAA, position 77-86 in the CD23a-core-promotor). This site showed a somewhat weaker binding ability of STAT6 compared with its known counterpart in the CD23b-promotor. Important for the regulation of the CD23-expression is probably the interplay of STAT6 and further transcription factors like Krox20 and NF-kB as well as alternative signal transduction pathways. Also proto-oncogenes like bcl-6 and Notch2 are important in CD23-expression. Their role in the pathogenesis of B-CLL has to be further examined. KW - CD23 KW - CLL KW - Promotor KW - STAT6 KW - B-Zellen KW - CD23 KW - CLL KW - Promotor KW - STAT6 KW - B-cells Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-7344 ER - TY - THES A1 - Syagaylo, Yana T1 - Strukturelle und funktionelle Untersuchung der Promotorregionen der menschlichen PAX3-, PAX6- und PAX7-Gene: Bedeutung von Polymorphismen für schizophrene Erkrankungen T1 - Structural and functional characterization of the promoter regions of the human PAX3, PAX6 and PAX7 genes: relevance of polymorphisms for schizophrenia N2 - Das Ziel dieser Arbeit war die Klärung der phänotypischen Konsequenzen struktureller Variationen in den regulatorischen Regionen einiger für psychische Erkrankungen potentiell relevanter Entwicklungsgene. Die Pax-Gene sind Mitglieder einer Familie der Transkriptionsfaktoren, die sowohl mehrere Schritte in der Embryogenese als auch Aufrechterhaltung des Differenzierungszustandes der Zellen einiger adulten Gewebe kontrollieren. Im Rahmen dieser Fragestellung wurden die Promotorregionen der menschlichen PAX3-, PAX6- und PAX7-Gene charakterisiert. Weiterhin wurden funktionelle Folgen der mit diesen Promotoren assoziierten Repeat-Polymorphismen auf die Expression dieser Gene untersucht. Schliesslich wurde die Relevanz für die psychischen Erkrankungen wie die Schizophrenie getestet. N2 - The aim of this study was the elucidation of phenotypical consequences of structural variations in regulatory regions of developmental genes that are potentially relevant for mental disease. The Pax genes are members of a family of evolutionary conserved transcription factors, which control several steps in the embryogenesis as well as maintain the differentiation status of cells in adult tissues. In this context the promoter regions of the human PAX3, PAX6 and PAX7 genes were characterized. Therefore, functional effects of the polymorphic repetitive elements in the gene promoter regions on the expression of these genes were examined. Finally, the relevance for the psychiatric diseases like schizophrenia was tested. KW - Schizophrenie KW - Transkriptionsfaktor KW - Genanalyse KW - Promotor KW - PAX-Gene KW - Promotor KW - Promotorpolymorphismus KW - Schizophrenieerkrankung KW - PAX genes KW - promoter KW - promoter polymorphism KW - schizophrenia Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-5459 ER - TY - THES A1 - Schenk, Thomas T1 - Genetische und funktionale Vereinfachung eines komplexen Retrovirus am Beispiel des Primaten Foamy Virus Typ 1 (PFV-1) T1 - Genetic and Functional Simplification of a Complex Retrovirus Exemplified for the Primate Foamy Virus Type 1 (PFV-1) N2 - Foamyviren (Spumaviridae) werden neuerdings von den übrigen Retroviren (Orthoretroviridae) abgegrenzt. Durch verschiedene Besonderheiten in ihrem Replikationszyklus, wie der Möglichkeit zur intrazellulären Retrotransposition oder der reversen Transkription spät im Vermehrungszyklus, nehmen sie eine funktionale Sonderstellung zwischen Retro-, Hepadnaviren und Retrotransposons ein. Aufgrund des Aufbaus ihres Genoms, das neben dem minimalen Gensatz der einfachen Retroviren Gag, Pro, Pol und Env noch zwei weitere akzessorische Leserahmen aufweist, werden sie zu den komplexen Retroviren gerechnet. Einer dieser zusätzlichen Leserahmen kodiert für den transkriptionalen Transaktivator Tas, der für die Replikation essentiell ist. Ein infektiöser Klon einer genetisch vereinfachten Variante des Primaten Foamy Virus Typ 1 (PFV-1) wurde konstruiert, der den konstitutiv aktiven immediate early gene (IE) Promotor und Enhancer des Cytomegalievirus (CMV) im Kontext einer hybriden LTR trägt. Dieses Konstrukt, sowie ein weiteres mit funktionaler Deletion des Tas-Gens führten nach Transfektion in Zellkulturen zur Freisetzung genetisch vereinfachter, infektiöser Viren, deren Replikationskompetenz und genetische Stabilität nachgewiesen wurde. Die rekombinanten Viren zeigten dabei um etwa drei lg-Stufen erniedrigte Virustiter im zellfreien Kulturüberstand und eine reduzierte Replikationskinetik. Versuche zur Steigerung der erreichbaren Virustiter durch thermisches Aufbrechen der Zellen, Inkubation mit dem demethylierenden Agens 5-Azacytidin (AZC) und Induktion mit dem Transkriptions-Stimulator Natriumbutyrat wurden unternommen, resultierten aber nicht in einer Steigerung der Freisetzung infektiöser Partikel oder der viralen Genexpression. Die Promotor-Aktivität der hybriden LTR wurde in einem transienten Reportergenassay unter Verwendung des Luciferasegens quantifiziert und war mit der der tas-stimulierten foamyviralen LTR vergleichbar. Eine Mutation des DD35E-Motivs im aktiven Zentrum der Integrase zu DA35E führte zur Replikationsunfähigkeit der vereinfachten Viren. Obwohl der Promotor eines nicht integrierenden Virus in die hybride LTR eingeführt wurde, blieb die Integration ein obligates Ereignis für die Replikation der Viren. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass eine genetische Vereinfachung des PFV-1 und Replikation mit einem heterologen Promotor in einer hybriden LTR möglich ist. Damit ist eine Voraussetzung für die Konstruktion PFV-basierter Vektoren zur Gentherapie unter Verwendung gewebespezifischer Promotoren gegeben. N2 - Recently Foamyviruses (Spumaviridae) were reclassified and separated from the conventional Retroviruses (Orthoretroviridae). Some peculiarities of their replication cycle, e.g. their ability to perfom intracellular retrotransposition and their reverse transcription occuring late in the reproduction cycle, indicate a special functional position between Retro-, Hepadnaviruses and Retrotransposons. Due to the architecture of their genome, which includes two additional open reading frames besides the minimum set of retroviral genes - gag, pro, pol and env - they are so called complex retroviruses. One of the additional reading frames encodes for the transcriptional transactivator tas, which is essential for viral replication. An infectious molecular clone representing a genetically simplified mutant of the Primate Foamy Virus Type 1 (PFV-1), that harbors the cytomegalovirus (CMV) immediate early (IE) gene promoter and enhancer within a hybrid LTR, was constructed. After transfection into cell cultures this construct as well as another with a functional deletion of the tas gene gave rise to genetically simplified infectious viruses. The replication competence and genetic stability of the mutants were demonstrated. Viral titers of the recombinants were reduced by approximately three orders of magnitude and replication kinetics were diminished. Efforts to increase viral titers, e.g. by thermic lysis of cell cultures, by incubation with the demethylating agent 5-Azacytidine (AZC) or by induction with the stimulator of transcription sodium butyrate, did neither lead to an increase in viral gene expression nor to a greater number of released infectious particles. The promoter activity of the hybrid LTR as quantified with a transient reporter gene assay using luciferase was comparable to the one of the foamyviral LTR stimulated by tas. Mutation of the DD35E motif in the active center of the integrase to DA35E abolished viral replication competence. Even though a promoter of a non integrating virus was used in the hybrid LTR integration remained essential for viral replication. This study demonstrated the genetic simplification of PFV-1 and replication using a heterologous promoter in a hybrid LTR. These are important requirements for the construction of PFV based vectors for gene therapy using tissue specific promoters. KW - Virus KW - Retrovirus KW - Foamyvirus KW - Spumavirus KW - Genetik KW - Vereinfachung KW - Promotor KW - Integration KW - heterolog KW - virus KW - retrovirus KW - foamyvirus KW - spumavirus KW - genetics KW - simplification KW - promoter KW - integration KW - heterologous Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-3249 ER -