TY  - THES
A1  - Stichel, Thomas Günther
T1  - Die Herstellung von Scaffolds aus funktionellen Hybridpolymeren für die regenerative Medizin mittels Zwei-Photonen-Polymerisation
T1  - Fabrication of scaffolds of hybrid polymers for regenerative medicine using two photon polymerization
N2  - In der vorliegenden Arbeit wurde das Verfahren der Zwei-Photonen-Polymerisation von anorganisch-organischen Hybridpolymeren (ORMOCER®e) untersucht. Untersuchungsschwerpunkte bildeten dabei die theoretischen Betrachtungen der Wechselwirkung zwischen Laser und Hybridpolymer, die experimentelle Charakterisierung unterschiedlicher ORMOCER®e sowie die Aufskalierung der Technologie im Hinblick auf die Herstellung von Scaffold-Strukturen für die regenerative Medizin. Hierbei wurde u. a. ein innovativer Belichtungsaufbau entworfen und aufgebaut, der es erlaubt makroskopische, poröse Scaffold-Strukturen mit minimalen Strukturgrößen im Bereich von wenigen Mikrometern herzustellen.
ORMOCER®e sind typischerweise für optische Anwendungen konzipiert, weisen allerdings z. T. biokompatible Eigenschaften auf. Das Material ORMOCER® MB-47 wurde von M. Beyer eigens für biologische Anwendungen synthetisiert. Es zeichnet sich durch Biokompatibilität, teilweiser Biodegradierbarkeit und hervorragende Strukturierbarkeit durch die Zwei-Photonen-Polymerisation aus.
Das in dieser Arbeit verwendete Mikrostrukturierungssystem beinhaltet im Wesentlichen einen Ultrakurzpulslaser, der 325 fs Pulse bei 1030 nm emittiert (verwendet wird die zweite Harmonische bei 515 nm), ein hochpräzises Positionierungssystem, bestehend aus drei luftgelagerten Lineartischen mit einer Reichweite von 10 cm (y-, z-Richtung) bzw. 15 cm (x-Richtung) sowie diversen Objektiven zur Fokussierung. Mit diesen Komponenten lassen sich komplexe dreidimensionale Strukturen mit minimalen Strukturgrößen von bis unter 100 nm erzeugen.
In Kapitel 5.1 wurden theoretische Untersuchungen im Hinblick auf das Wechselwirkungsverhalten zwischen der fokalen Intensitätsverteilung und dem Materialsystem zur Bildung eines Voxels durchgeführt, wobei das technische Wechselwirkungsvolumen und das chemische Wechselwirkungsvolumen samt den reaktionskinetischen Abläufen separat betrachtet wurde.
Das technische Wechselwirkungsvolumen beschreibt die Wechselwirkung zwischen der fokalen Intensitätsverteilung und dem Materialsystem im Rahmen eines Schwellwertprozesses, der es erlaubt Strukturdimensionen unterhalb des Beugungslimits zu realisieren. Die theoretischen Untersuchungen diesbezüglich ergaben, dass sphärische Aberrationen die fokale Intensitätsverteilung (Intensity-Point Spread Function (IPSF)) in Abhängigkeit der Belichtungskonfiguration z. T. sehr stark beeinflussen. Darüber hinaus wurde durch Betrachtung des Schwellwertverhaltens ein mathematischer Zusammenhang zwischen der IPSF und der Leistungsabhängigkeit der Charakteristik des technischen Wechselwirkungsvolumens geschaffen.
Das chemische Wechselwirkungsvolumen beschreibt das tatsächliche Volumen der stattfindenden Polymerisationsreaktion. Dieses geht über das des technischen hinaus, was eine Folge von raumeinnehmendem Kettenwachstum im Rahmen von reaktionskinetischen Teilprozessen ist. Durch die Simulationen dieser reaktionskinetischen Abläufe wurde das leistungsabhängige, zeitliche Verhalten der Reaktionsteilnehmer (Radikale, Monomer, Photoinitiator) und des Vernetzungsgrades ermittelt. Die Simulation wurden für sehr kurze Belichtungszeiten (< 10 ms) auf der Basis von gekoppelten Differentialgleichungen nach Uppal & Shiakolas durchgeführt. Dabei wurde der Einfluss der Teilchendiffusion sowie der Temperaturentwicklung als gering erachtet und in den Berechnungen vernachlässigt.
Die Simulationsergebnisse zeigen, dass eine geringe Belichtungszeit nicht unbedingt durch größere Laserleistungen ausgeglichen werden kann, um einen bestimmten Vernetzungsgrad zu erzielen. Vielmehr führt eine höhere Leistung zu einem raschen Verbrauch des Photoinitiators im Reaktionsvolumen und damit einem schnelleren Erliegen der Polymerisationsreaktion. Um dennoch hohe Vernetzungsgrade erzielen zu können, sind die Reaktionsgeschwindigkeitskoeffizienten der Propagation und der Terminierung k_P und k_T sowie eine ausreichende Photoinitiatorkonzentration von entscheidender Bedeutung. Je größer das Verhältnis k_P/k_T, desto höhere Vernetzungsgrade können auch bei kurzen Belichtungszeiten realisiert werden, wobei ein wesentlicher Teil der Polymerisation als Dunkelreaktion stattfindet. Diese Erkenntnis ist für die Aufskalierung der Technologie der Zwei-Photonen-Polymerisation von großer Bedeutung, welche mit einer Verkürzung der Belichtungszeiten einhergehen muss.
Des Weiteren zeigen die Simulationen, dass das spatiale Konversionsprofil eines Voxels ein lokales Minimum im Zentrum aufweisen kann. Dieses Phänomen tritt dann auf, wenn aufgrund der applizierten Leistung, welche gemäß des Profils der IPSF im Zentrum am höchsten ist, der Photoinitiator im Zentrum rasch verbraucht wird.
In Kapitel 5.2 wurde die Voxelbildung, das Vernetzungsverhalten sowie die mechanischen Eigenschaften belichteter ORMOCER®e bei unterschiedlichen Parametern und Materialsystemen experimentell untersucht.
An Hand von Voxelfeldern wurden die Voxelgröße, das Aspektverhältnis und das Voxelvolumen bei unterschiedlichen Laserleistungen ermittelt. Die Ergebnisse wurden mit den berechneten technischen Wechselwirkungsvolumina verglichen, wobei die Differenz von tatsächlicher Voxelgröße und technischem Wechselwirkungsvolumen als eine weitere charakteristische Größe eingeführt wurde. Dabei zeigte sich, dass besonders die Voxellänge von der Länge des technischen Wechselwirkungsvolumens derart abweicht, dass dies nicht durch raumeinnehmendes Kettenwachstum im Rahmen der Reaktionskinetik erklärt werden kann. Mögliche Erklärungsansätze basieren hierbei auf Wechselwirkungseffekte zwischen Lichtfeld und Material. Beispielsweise könnten durch den nichtlinearen optischen Kerr-Effekt oder die Polymerisation selbst Brechzahlinhomogenitäten induziert werden, welche die Voxelbildung durch Selbstfokussierung beeinflussen. Der Unterschied der Voxelbreite, also das laterale chemische Voxelwachstum, zur Breite des technischen Wechselwirkungsvolumens wurde hingegen mit Hilfe der Reaktionskinetik erklärt. Dabei zeigte sich, dass dieser Unterschied sowohl vom Material selbst als auch von der Fokussieroptik abhängt.
Des Weiteren wurde die Polymerisationsrate der unterschiedlichen Materialien aus der Auftragung des Voxelvolumens gegenüber der Laserleistung durch lineare Approximation bestimmt. Hierbei wurde festgestellt, dass die Materialsysteme z. T. erhebliche Unterschiede aufweisen. Als das Materialsystem mit der höchsten Polymerisationsrate hat sich das auf Acrylaten als vernetzbare Gruppen basierende OC-V in Kombination mit dem Irgacure® Oxe02 Photoinitiator herausgestellt. Aus diesem Grund wurde es für die Herstellung von makroskopischen Strukturen durch die Zwei-Photonen-Polymerisation bevorzugt verwendet.
Die unterschiedlichen Materialien wurden ferner mit Hilfe der µ-Raman-Spektroskopie auf ihr Vernetzungsverhalten untersucht. Konkret wurden hierbei Linienfelder unter Variation der Scan-Geschwindigkeit und der Laserleistung mit Hilfe der 2PP hergestellt und vermessen. Die Vernetzungsgrade wurden semi-quantitativ aus den Spektren ermittelt. Insgesamt wurden Vernetzungsgrade im Bereich zwischen 40 % und 60 % gemessen, wobei mit OC-V und 2 Gew.-% Irgacure® Ox02 die höchsten Vernetzungsgrade erzielt wurden. Des Weiteren hat sich gezeigt, dass die Konversionsgrade für die jeweiligen Materialsysteme bei allen Scan-Geschwindigkeiten sich auf einem im Rahmen der Fehlergrenzen gleichem Niveau befinden. Damit kann der durch Simulationen theoretisch prognostizierte Abfall des Sättigungskonversionsgrades mit zunehmender Scan-Geschwindigkeit mit entsprechend variierenden Belichtungszeiten nicht als verifiziert angesehen werden.
Die verschiedenen Materialsysteme wurden außerdem bezüglich ihrer mechanischen Eigenschaften charakterisiert. Zu diesem Zweck wurden zylindrische Formkörper unter verschiedenen Bedingungen (1PP, 2PP, verschiedene Photoinitiatorkonzentrationen) hergestellt und Druckfestigkeitsmessungen durchgeführt, sowie die Dichten und die Vernetzungsgrade aus den Formkörpern bestimmt.
Insgesamt wurden Elastizitätsmodule im Bereich zwischen 0,40 und 1,37 GPa und Bruchfestigkeitswerte zwischen 117 bis 310 MPa ermittelt. Es konnte festgestellt werden, dass die Konzentration des Photoiniators das Vernetzungsverhalten und damit die mechanischen Eigenschaften der Formkörper stark beeinflusst. Während geringe Konzentrationen zu geringeren Vernetzungsgraden und niedrigen Elastizitätsmodulen führten, zeigten die Formkörper höherer Konzentration ein deutlich spröderes Verhalten mit höheren Vernetzungsgraden und Elastizitätsmodulen. Das höchste Elastizitätsmodul wurde an Hand von Formkörpern vermessen, welche aus OC-V mit 2 Gew.-% Irgacure® Ox02 hergestellt wurden.
Darüber hinaus wurde festgestellt, dass sich die mechanischen Eigenschaften von durch 2PP hergestellten Formkörpern durch die applizierte Laserleistung beeinflussen lassen. Die Ursache hierfür ist, dass durch die Laserleistung die Voxelgröße und damit der Überlapp zwischen den Voxeln eingestellt werden kann. Im Bereich des Überlapps findet dann eine Doppelbelichtung des Materials statt, was zu höheren Vernetzungsgraden führen kann. Außerdem wurden durch die 2PP bei hinreichend großen Belichtungsleistungen auch Formkörper realisiert, welche höhere Elastizitätsmodule und Bruchfestigkeitswerte aufwiesen als Körper, welche durch UV-Belichtung hergestellt wurden.
Die Aufskalierung der Zwei-Photonen-Technologie wurde in Kapitel 5.3 behandelt. Neben einer ausführlichen Diskussion zu den Herausforderungen diesbezüglich, wurden zwei Belichtungsstrategien zur Herstellung von makroskopischen Scaffold-Strukturen eingesetzt und optimiert. Hierbei ist insbesondere der Badaufbau hervorzuheben, der es erlaubte Strukturen von prinzipiell unbegrenzter Höhe mit Hilfe der Zwei-Photonen-Polymerisation herzustellen.
Eine wesentliche Herausforderung der Aufskalierung der 2PP ist die Beschleunigung des Prozesses. Aus den Betrachtungen geht hervor, dass für eine gravierende Beschleunigung der 2PP-Strukturierung neben der Scan-Geschwindigkeit auch das Beschleunigungsvermögen des Positionierungssystems entscheidend ist. Des Weiteren sind auch Parallelisierungsmethoden mit z. B. diffraktiven optischen Elementen nötig, um ausreichende Prozessgeschwindigkeiten zu erzielen.
Der Standardaufbau mit Luftobjektiven wurde dazu verwendet millimetergroße Strukturen mit hoher Qualität aus ORMOCER®en herzustellen. Auch wenn die maximale Strukturhöhe durch den Arbeitsabstand des Objektivs beschränkt ist, hat sich gezeigt, dass dieser Aufbau sich für die einfache Herstellung von millimetergroßen Test-Scaffold-Strukturen eignet, welche z. B. für Zellwachstumsversuche oder mechanische Belastungstest eingesetzt werden können. Das biodegradierbare MB-47 wurde hierbei ebenfalls erfolgreich eingesetzt und u. a. für die Herstellung von Drug-Delivery-Strukturen verwendet.
Der Badaufbau, basierend auf einem Materialbad mit durchsichtigem Boden, einem darin befindlichen und in der Vertikalen (z-Richtung) beweglichen Substrathalter sowie einer Belichtung von unten durch eine sich in der Ebene bewegende Fokussieroptik, wurde verwendet um eine Freiheitsstatue mit 2 cm Höhe sowie millimetergroße Scaffold-Strukturen mit Porengrößen im Bereich von 40 bis 500 µm in ORMOCER-V zu realisieren. Weitere Strukturierungsresultate mit z. T. anwendungsbezogenem Hintergrund sind die Gehörknöchelchen des menschlichen Ohrs in Lebensgröße, ein Scaffold in Form eines Steigbügels des menschlichen Ohrs, Test-Scaffold-Strukturen für mechanische oder biologische Untersuchungen sowie Drug-Delivery Strukturen. Es wurden Bauraten von bis zu 10 mm^3/h erzielt.
Bezüglich der Prozessgeschwindigkeit und Strukturhöhe wurde bei Weitem noch nicht das Potential des luftgelagerten Positioniersystems ausgeschöpft. Dafür bedarf es einer Gewichtsoptimierung des bestehenden Belichtungsaufbau, um höhere Beschleunigungswerte und Scan-Geschwindigkeiten realisieren zu können. Unter Annahme einer effektiven Gewichtsoptimierung und der damit verbundenen Erhöhung der Beschleunigung auf 10 m/s^2 könnte eine Baurate bei einer Scan-Geschwindigkeit von 225 mm/s und einem Slice- und Hatch-Abstand  von 15 und 10 µm von etwa 60 mm^3/h erzielt werden.
Im Rahmen der Aufskalierung wurde ebenfalls der experimentelle Einsatz von diffraktiven optischen Elementen zur Fokus-Multiplikation untersucht. Die Experimente wurden mit Hilfe eines Elements durchgeführt, welches eine 2 x 2 Punkte-Matrix  neben der ungebeugten 0. Ordnung bereitstellt und Bestandteil eines experimentellen Setups war, welches aus Linsen, Blenden und einem Objektiv zur Fokussierung bestand. Mit Hilfe der erzeugten Spot-Matrix wurden zum einen simultan vier Drug-Delivery-Strukturen hergestellt und zum anderen einzelne Scaffold-Strukturen realisiert. In jedem Fall wurde eine Beschleunigung des Prozess bzw. eine Erhöhung der Polymerisationsrate um den Faktor 4 für die verwendeten Parameter erreicht. Bei der Herstellung der Scaffolds wurden zwei unterschiedliche Strategien verfolgt. Während zum einen die Periodizität der inneren Scaffold-Struktur auf die Fokusabstände angepasst und damit simultan vier aneinandergereihte Einheitszellen hergestellt wurden, konnte zum anderen auch demonstriert werden, dass durch die geschickte Bewegung der Fokusse eine ineinander verschobene Struktur möglich ist. Der Vorteil der letzteren Strategie ist, dass auf diese Weise eine komplette Schicht gescannt werden kann und damit hohe Scan-Geschwindigkeiten realisiert werden können. Die erzielten Bauraten waren dennoch nicht größer als die Bauraten, die mit einem einzelnen Spot im Rahmen des Standardaufbaus oder des Badaufbaus erreicht wurden. Hierfür bedarf es weiterer Optimierung der Parameter und des Setups.
Transmittiert fokussiertes Licht eine Grenzfläche zweier Medien mit unterschiedlichen Brechungsindizes, dann tritt sphärische Aberration auf, welche sich durch die Verbreiterung des Fokus besonders in axiale Richtung bemerkbar macht. Da diese im Rahmen der verwendeten Belichtungsstrategien die Strukturierungsergebnisse nachweislich beeinträchtigen, wurden experimentelle Untersuchungen sowie Optimierungsroutinen diesbezüglich durchgeführt.
Im Zusammenhang mit dem Standardaufbau wurde eine Leistungsanpassung während der Strukturierung vorgenommen. Auf diese Weise wurde erreicht, dass bei variabler Fokustiefe im Material die maximale Intensität trotz sphärischer Aberration konstant gehalten wurde, wodurch sich die strukturelle Homogenität der Scaffolds entlang der axialen Richtung (optische Achse) deutlich verbesserte.
Des Weiteren wurde der Badaufbau dazu verwendet, die axiale Intensitätsverteilung in-situ für diskrete Fokustiefen unter der Verwendung eines Objektivs mit der NA von 0,60 abzubilden. Zu diesem Zweck wurde aus hergestellten Voxelfeldern eine Voxelfeldfunktion ermittelt und mit der axialen IPSF korreliert. Dabei wurde angenommen, dass sich das chemische Wechselwirkungsvolumen vernachlässigbar gering vom technischen Wechselwirkungsvolumen unterscheidet. Die experimentellen Ergebnisse zeigten deutlich die für sphärische Aberrationen typischen Nebenmaxima auf. Die Lage bzw. Abstände dieser entsprachen in guter Übereinstimmung den jeweiligen Simulationen. Schließlich wurde noch die sphärische Aberration durch den Korrekturring der Objektive für verschiedene Deckglasdicken korrigiert. Die resultierende IPSF wurde ebenfalls mit Hilfe des Badaufbaus abgebildet, wobei keinerlei Nebenmaxima gefunden werden konnten. Die Breite des Hauptmaximums konnte deutlich verringert werden.
Zusammengefasst lässt sich sagen, dass im Rahmen dieser Arbeit erhebliche Fortschritte bei der Aufskalierung der 2PP zur Erzeugung von Scaffold-Strukturen für die regenerative Medizin erzielt wurden. Die erreichten Strukturdimensionen und die Bauraten übertreffen alle bis dato bekannten Ergebnisse. Dabei wurden auch durch theoretische Betrachtungen und experimentellen Methoden grundlegende Erkenntnisse über die Reaktionsdynamik der durch die Zwei-Photonen-Absorption initiierten Polymerisationsreaktion gewonnen. Nichtsdestotrotz sind einige Fragestellungen offen sowie Problematiken des Prozesses vorhanden, die für eine Realisierung von makroskopischen Scaffold-Strukturen gelöst werden müssen.
So sind die realisierten Bauraten noch zu gering, um in angemessener Zeit makroskopische Scaffolds-Strukturen herzustellen, welche deutlich größer als 1 cm^3 sind. Aus diesem Grund müssen weitere Verbesserungen bezüglich der Scan-Geschwindigkeit sowie des Einsatzes von diffraktiven optischen Elementen zur Erhöhung der Polymerisationsrate erzielt werden. Da bei der Verwendung von Multi-Spot-Arrays, welche mit Hilfe gewöhnlicher diffraktiver optischer Elemente erzeugt wurden, die Realisierung von beliebigen und detaillierten äußeren Scaffold-Formen eingeschränkt ist, empfiehlt es sich den Einsatz von Spatial Light-Modulatoren zu verfolgen. Diese fungieren als dynamisch modulierbares DOE, mit dem einzelne Spots gezielt ein- und ausgeblendet und Spotabstände dynamisch variiert werden können. Schließlich ist es vorstellbar, den Spatial Light-Modulator mit dem Badaufbau zu kombinieren, um uneingeschränkte, große Strukturen in annehmbarer Zeit mit hochaufgelösten Details herstellen zu können. Dieses Vorgehen bedarf allerdings noch der tiefgreifenden Untersuchung der Potentiale des Spatial Light-Modulators.
Darüber hinaus weisen die theoretischen und experimentellen Untersuchungen zur Reaktionskinetik darauf hin, dass die Voxelentstehung ein komplexer Prozess ist, der möglicherweise auch durch nichtlineare optische Wechselwirkungseffekte abseits der Zwei-Photonen-Absorption beeinflusst wird. Daher sind hier weitere Untersuchungen und Berechnungen zu empfehlen, um z. B. den Einfluss einer intensitätsabhängigen Brechzahl  auf die Voxelbildung quantifizieren zu können. Entsprechende Ergebnisse könnten schließlich dazu dienen, dass im Rahmen dieser Arbeit entwickelte Modell zur Voxelbildung, welches auf der getrennten Betrachtung von technischen und chemischen Wechselwirkungsvolumen basiert, zu verbessern. Ein leistungsfähiges Modell, welches die Voxelbildung in Abhängigkeit des Materials und der Fokussieroptik präzise vorhersagen kann, wäre für das Erzielen optimaler Strukturierungsergebnissen ein Gewinn.
N2  - In this thesis, the two photon polymerization technique using ORMOCER®s was investigated thoroughly. The main aspects of matter were the theoretical investigations of the interaction between laser and polymer, the experimental characterization of the different ORMOCER®s, and the scale-up of the photon polymerization technique in order to fabricate scaffolds for the regenerative medicine. The latter was achieved by designing and building up an innovative exposure device[38] which enables the fabrication of scaffold structures with minimal structure sizes of a view microns.
The experiments were done using UV sensitive anorganic-organic hybrid polymers, also known as ORMOCER®s. These are typically synthesized for optical applications, but some are also biocompatible. The ORMOCER® MB-47 was invented by M. Beyer for biological application and possesses biocompatibility, partial biodegradability, and advanced 2PP structuring behavior.
The micro-structuring system used contains an ultra-short pulse laser which emits 325 fs pulses at 1030 nm (applied was 515 nm using second harmonic generation), a highly precise positioning system which consists of three air-bearing stages with a travel range of 10 cm (y, z direction) and 15 cm (x direction), respectively, and some objectives for focusing. With these components, complex three-dimensional structures with minimal structure size below 1 µm can be produced.
In Capital 5.1, theoretical studies of the interaction between the focal intensity distribution and the material, which defines voxel growth, were performed. Therefore, the technical interaction volume and the chemical interaction volume were separately investigated.
The technical interaction volume describes the threshold driven interaction between the focal intensity distribution and the material system, which allows the realization of structure sizes below the resolution limit (diffraction) of the wavelength used. The theoretical investigations showed that spherical aberration influences the focal intensity distributions (Intensity-Point Spread Function (IPSF)) which were calculated for different experimental exposure configuration. The results propose a severe influence with increasing focus depth into the material. Moreover, a formal relation between the IPSF and the technical interaction volume was derived by using the threshold assumption. By using the Gaussian beam assumption as IPSF, the analogy of the derived formula to the voxel growth model of Serbin et al. was recognized.
The chemical interaction volume represents the actual volume of the polymerization reaction. Its amount exceeds the technical interaction volume due to the space-consuming chain growth during the polymerization. By the simulation of the reaction kinetics of the polymerization, the time- and power-depending behavior of the different reactants (radicals, monomer, photo initiator) as well as the degree of conversion was calculated. The simulations were done for very short exposure times (< 10 ms) by using a system of coupled differential equations which are based on a model invented by Uppal & Shiakolas. Therefore, the influence of diffusion and temperature was estimated to be small on short time scales and thus neglected.
The results of the simulations show that a short exposure time cannot be necessarily compensated by high laser powers to achieve a certain degree of conversion. Higher laser power leads rather to a swift consumption of the photo initiator and thus to a disruption of the polymerization. In order to achieve high degrees of conversions, the reactive rate coefficients of the propagation and termination k_P and k_T as well as a sufficient amount of photo initiator concentration is essential. The larger the ratio k_P/k_T the higher degree of conversion can be realized even with short exposure times whereas a significant part of the reaction takes place during the dark period. This finding is important for the scale-up of the photon polymerization technique which has to involve shorter exposure times.
Moreover, the simulations show that the spatial profile of the degree of conversion can feature a central minimum. This phenomenon occurs when the central maximum intensity of the IPSF consumes the entire photo initiators in short times which leads to a disruption of the polymerization.
In Capital 5.2, the voxel growth, the behavior of conversion as well as the mechanical properties of hardened ORMOCER®s were experimentally investigated with different parameters and material systems.
By means of voxel fields, voxel sizes, aspect ratios and voxel volumes at different laser powers were determined. The results were compared with the calculated technical interaction volume, whereas the difference was invented as a new characteristic value.  It has been shown that the voxel length deviates clearly from the length of the technical interaction volume which cannot be explained by space-consuming chain growth during the polymerization. Instead,  it was assumed that this observation is reasoned by interaction effects between light and material (optical Kerr effect, polymerization) leading to an inhomogeneous refractive index distribution and thus to self-focusing and self-trapping. In contrast to that, the difference between the voxel diameter and the diameter of the technical interaction volume was correlated with reaction kinetic influences.
Additionally, the dependency of the voxel volume on the laser power was linear approximated in order to determine the polymerization rate of different material systems. Here, strong differences between the materials were identified. The material with the highest polymerization rate was OC-V with the Irgacure® Oxe02 photo initiator which consists of acrylates as cross-linkable group. Because of this, this material system was preferred for 2PP structuring of large scale structures.
The different materials were investigated concerning their conversion behavior by means of µ-Raman spectroscopy. Therefore, fields of lines were produced by 2PP with varying scan speed and laser power and measured. The degree of conversion was then semi-quantitative extracted from the spectra. All in all, the degrees of conversion were determined to be in the range of 40 to 60 % for all materials. The material with the highest degree of conversion was the OC-V with 2 wt.-% Irgacure® Ox02. Moreover, the measurements showed that the degree of conversion for each material system does not vary with the scan speed (exposure time) within the limits of measurement error. Thus, the simulations from Capital 5.1.3, which predicted that shorter exposure times cannot be necessarily compensated by higher laser powers, could not be confirmed.
Furthermore, the mechanical properties of the different materials were characterized. Therefore, cylindrical samples were produced with different processes and parameters and tested with a compressive load. Also the densities and degrees of conversion were determined.
All in all, elastic moduli between 0,40 and 1,37 GPa and load failures between 117 and 310 MPa were measured. It was detected that the photo initiator concentration influences the conversion behavior and thus the mechanical properties of the samples. While low concentrations led to lower degrees of conversion and lower elastic moduli, the samples produced with higher concentrations were more brittle with higher degrees of conversion and elastic moduli. The highest elastic modulus was measured for samples which were produced in OC-V with 2 wt.-% Irgacure® Ox02.
Moreover, the mechanical properties of samples produced with 2PP can be influenced by the utilized laser power. This is reasoned by the voxel sizes which can be adjusted by the laser power and which determine the overlap of vicinal voxels at distinct hatch and slice distances. In the overlap area double exposure takes place which can lead to higher degrees of conversion. It was found that with sufficient laser powers the 2PP leads to higher elastic moduli and load failures than the 1PP.
Capital 5.3 deals with the scale-up of the photon polymerization technique. After the discussion of the challenges, two exposure strategies were used to produce macroscopic scaffold structures. Especially, the vat setup has to be emphasized which can be used to build structures with basically unlimited structure heights by means of the 2PP technique.
One of the major challenges concerning the scale-up of the 2PP is the speed-up of the process. Therefore, the scan speeds as well as the acceleration of the positioning system play important roles. Moreover it was detected that further parallelizing techniques as the utilization of diffraction optical elements are needed in order to achieve a sufficient speed-up of the 2PP technology.
The standard exposure setup with air objectives was used to fabricate millimeter-sized structures in ORMOCER®s which high quality. Though the maximal achievable structure height is limited by the working distance of the objective used, the setup is suitable for the fabrication of macroscopic scaffolds which can be utilized for biological or mechanical testing. Moreover, the biodegradable MB-47 was successfully used for the fabrication of Drug Delivery structures.
The vat setup bases on a vat/bath as material reservoir with transparent bottom, a sample holder moveable in the vertical (z) direction, and an upside down x-y-scanning objective. The sample can be moved upwards which enables one to build structures whose heights are not limited by the working distance of the employed objective anymore. This setup was used to fabricate a model of the statue of liberty with a height of 2 cm and millimeter-sized scaffolds with pore sizes in the area between 40 and 500 µm in ORMOCER®-V. Moreover, the human ossicles in life size, a scaffold in the shape of the human stapes, different test scaffold structures for mechanical and biological investigations and drug delivery structures were build. The achieved maximum building rate was 10 mm^3/h.
So far, the speed-up and scale-up potentials of the air-bearing positioning system haven’t been exhausted when using the vat setup. Therefore, the setup has to be optimized regarding weight and stability in order to realize higher accelerations of up to 10 m/s^2. This would enable build rates of up to 60 mm3/h with a scan speed of 224 mm/s and slice and hatch distances of 15 and 10 µm.
Moreover, the speed-up by means of diffractive optical elements was experimentally investigated. Therefore, an optical setup was constructed which includes the diffractive optical element, some lenses, an objective, and a blind to blank the zero order. By this a 2 x 2 spot matrix was generated which was used for the simultaneous fabrication of four drug delivery structures and the production of single scaffold structures. In both cases an increase of the polymerization rate was achieved regarding to structuring without diffractive optical elements. For the fabrication of the scaffold structures two different scan strategies were performed. Using the first one, a scaffold was built up by the simultaneous structuring of four scaffolds’ gyroid unit cells. After finishing these cells, more cells were stitched to them until a millimeter-sized scaffold was achieved. For this strategy, it’s important that the size of the unit cell design is adjusted to the focal matrix distances. With the second strategy a scanning of the whole spot matrix along the whole scaffold flank is performed. By this it was possible to produce a pile of interleaved beams which represents a woodpile-like scaffold. The fact that the produce lines of each layer are as long as scaffold flank leads to the advantage that higher scan speeds and thus build rates can be achieved than with the first strategy. Nevertheless, the realized maximum build rates weren’t exceeding the build rates which were reached by using the standard setup or the vat setup. Thus, more optimization of parameters and setup is needed.
If focused laser lights transmits through an interface of two materials with different refractive indices, spherical aberration occurs which leads to blurring of the focal intensity distribution especially in the axial direction. When using air objectives this blurring affects the structuring results. Hence theoretical and experimental investigations were done in order to optimize exposure routines.
When using the standard exposure setup, power adoption was performed during the structuring process which allows holding the maximum focal intensity constant at varying focal depths in the presence of spherical aberration influences. By this, a clear improvement of the scaffolds’ quality and homogeneity along the axial direction was achieved.
Furthermore, the vat setup with the NA 0.60 objective was used to perform an experimental in situ mapping of the focal axial intensity distribution for different focal depths. A voxel field function was extracted from produced voxel fields and correlated with the axial intensity distribution. Therefore, it was assumed that the chemical interaction volume is equal to the technical interaction volume. The experimental results showed clearly the presence of side maxima which are typical for spherical aberration influences. The distances between them were predicted quite exactly by theoretical simulations. Finally, the spherical aberrations were reduced by the correction collar of the objective. The resulting intensity distribution was also mapped with the vat setup and no side maxima were found for the experimental intensity distribution. Moreover the contrast of the main maximum was clearly improved.
Overall, it can be concluded that within this work a noticeable progress in the scale-up of the two-photon polymerization technique was achieved which is important for the fabrication of scaffold structures for the regenerative medicine. The realized structure dimensions and build rates exceed all, so far, known specifications of structures fabricated by two-photon polymerization. Moreover, basic knowledge of the most important aspects of the scale-up was discovered by thoroughly theoretical and experimental investigations.
Nevertheless, there is still much improvement necessary to establish the two photon polymerization technique as a competitive tool for the production of scaffold structures which are larger than 1 cm^3. Higher scan speeds and advanced setups with diffractive optical elements must be applied to achieve build rates in the range over 1 cm^3/h. Due to the lack in flexibility of usual diffractive optical elements, it is recommended to use spatial light modulators which are dynamic adjustable diffractive optical elements. With them it is possible to vary the spot intensity distribution, spot number as well as the spot distances during the process. Finally, it is imaginable that in future the vat setup combined with a spatial light modulator can be used for the fabrication of large macro structures with finest details in adequate time. But therefore, it is necessary to perform thoroughly investigations concerning the potentials of spatial light modulators.
Moreover, the theoretical and experimental investigations on the reaction kinetics show that voxel growth is a complex process which is possibly affected by nonlinear optical interactions aside from the two-photon absorption phenomenon. Thus, intensive study should be done in order to, for example, quantify the influence of an intensity-dependent refractive index on the voxel growth. Maybe, results could be used to improve the voxel growth model of this work which bases on the separate consideration of the technical and chemical interaction volumes. A powerful tool enabling the prices prediction of voxel growth characteristics depending on material and focusing optics would help to improve the detail quality of fabricated scaffolds.
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Y1  - 2014
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-130161
ER  - 
TY  - THES
A1  - Wittmann, Katharina
T1  - Adipose Tissue Engineering - Development of Volume-Stable 3-Dimensional Constructs and Approaches Towards Effective Vascularization
T1  - Tissue Engineering von Fettgewebe - Generierung volumenstabiler 3-dimensionaler Fettgewebe-Konstrukte und Entwicklung effektiver Vaskularisierungsstrategien
N2  - Adipose tissue defects and related pathologies still represent major challenges in reconstructive surgery. Based on to the paradigm ‘replace with alike’, adipose tissue is considered the ideal substitute material for damaged soft tissue [1-3]. Yet the transfer of autologous fat, particularly larger volumes, is confined by deficient and unpredictable long term results, as well as considerable operative morbidity at the donor and recipient site [4-6], calling for innovative treatment options to improve patient care. 
With the aim to achieve complete regeneration of soft tissue defects, adipose tissue engineering holds great promise to provide functional, biologically active adipose tissue equivalents. Here, especially long-term maintenance of volume and shape, as well as sufficient vascularization of engineered adipose tissue represent critical and unresolved challenges [7-9]. For adipose tissue engineering approaches to be successful, it is thus essential to generate constructs that retain their initial volume in vivo, as well as to ensure their rapid vascularization to support cell survival and differentiation for full tissue regeneration [9,10]. Therefore, it was the ultimate goal of this thesis to develop volume-stable 3D adipose tissue constructs and to identify applicable strategies for sufficient vascularization of engineered constructs. The feasibility of the investigated approaches was verified by translation from in vitro to in vivo as a critical step for the advancement of potential regenerative therapies.

For the development of volume-stable constructs, the combination of two biomaterials with complementary properties was successfully implemented. In contrast to previous approaches in the field using mainly non-degradable solid structures for mechanical protection of developing adipose tissue [11-13], the combination of a cell-instructive hydrogel component with a biodegradable porous support structure of adequate texture was shown advantageous for the generation of volume-stable adipose tissue. Specifically, stable fibrin hydrogels previously developed in our group [14] served as cell carrier and supported the adipogenic development of adipose-derived stem cells (ASCs) as reflected by lipid accumulation and leptin secretion. Stable fibrin gels were thereby shown to be equally supportive of adipogenesis compared to commercial TissuCol hydrogels in vitro. Using ASCs as a safe source of autologous cells [15,16] added substantial practicability to the approach. To enhance the mechanical strength of the engineered constructs, porous biodegradable poly(ε caprolactone)-based polyurethane (PU) scaffolds were introduced as support structures and shown to exhibit adequately sized pores to host adipocytes as well as interconnectivity to allow coherent tissue formation and vascularization. Low wettability and impaired cell attachment indicated that PU scaffolds alone were insufficient in retaining cells within the pores, yet cytocompatibility and differentiation of ASCs were adequately demonstrated, rendering the PU scaffolds suitable as support structures for the generation of stable fibrin/PU composite constructs (Chapter 3). 
Volume-stable adipose tissue constructs were generated by seeding the pre-established stable fibrin/PU composites with ASCs. Investigation of size and weight in vitro revealed that composite constructs featured enhanced stability relative to stable fibrin gels alone. Comparing stable fibrin gels and TissuCol as hydrogel components, it was found that TissuCol gels were less resilient to degradation and contraction. Composite constructs were fully characterized, showing good cell viability of ASCs and strong adipogenic development as indicated by functional analysis via histological Oil Red O staining of lipid vacuoles, qRT-PCR analysis of prominent adipogenic markers (PPARγ, C/EBPα, GLUT4, aP2) and quantification of leptin secretion. In a pilot study in vivo, investigating the suitability of the constructs for transplantation, stable fibrin/PU composites provided with a vascular pedicle gave rise to areas of well-vascularized adipose tissue, contrasted by insufficient capillary formation and adipogenesis in constructs implanted without pedicle. The biomaterial combination of stable fibrin gels and porous biodegradable PU scaffolds was thereby shown highly suitable for the generation of volume-stable adipose tissue constructs in vivo, and in addition, the effectiveness of immediate vascularization upon implantation to support adipose tissue formation was demonstrated (Chapter 4).

Further pursuing the objective to investigate adequate vascularization strategies for engineered adipose tissue, hypoxic preconditioning was conducted as a possible approach for in vitro prevascularization. In 2D culture experiments, analysis on the cellular level illustrated that the adipogenic potential of ASCs was reduced under hypoxic conditions when applied in the differentiation phase, irrespective of the oxygen tension encountered by the cells during expansion. Hypoxic treatment of ASCs in 3D constructs prepared from stable fibrin gels similarly resulted in reduced adipogenesis, whereas endothelial CD31 expression as well as enhanced leptin and vascular endothelial growth factor (VEGF) secretion indicated that hypoxic treatment indeed resulted in a pro-angiogenic response of ASCs. Especially the observed profound regulation of leptin production by hypoxia and the dual role of leptin as adipokine and angiogenic modulator were considered an interesting connection advocating further study. Having confirmed the hypothesis that hypoxia may generate a pro-angiogenic milieu inside ASC-seeded constructs, faster vessel ingrowth and improved vascularization as well as an enhanced tolerance of hypoxia-treated ASCs towards ischemic conditions upon implanatation may be expected, but remain to be verified in rodent models in vivo (Chapter 5).

Having previously been utilized for bone and cartilage engineering [17-19], as well as for revascularization and wound healing applications [20-22], stromal-vascular fraction (SVF) cells were investigated as a novel cell source for adipose tissue engineering. Providing cells with adipogenic differentiation as well as vascularization potential, the SVF was applied with the specific aim to promote adipogenesis and vascularization in engineered constructs in vivo. With only basic in vitro investigations by Lin et al. addressing the SVF for adipose repair to date [23], the present work thoroughly investigated SVF cells for adipose tissue construct generation in vitro, and in particular, pioneered the application of these cells for adipose tissue engineering in vivo.
Initial in vitro experiments compared SVF- and ASC-seeded stable fibrin constructs in different medium compositions employing preadipocyte (PGM-2) and endothelial cell culture medium (EGM-2). It was found that a 1:1 mixture of PGM-2 and EGM-2, as previously established for co-culture models of adipogenesis [24], efficiently maintained cells with adipogenic and endothelial potential in SVF-seeded constructs in short and long-term culture setups. Observations on the cellular level were supported by analysis of mRNA expression of characteristic adipogenic and endothelial markers. In preparation of the evaluation of SVF-seeded constructs under in vivo conditions, a whole mount staining (WMS) method, facilitating the 3D visualization of adipocytes and blood vessels, was successfully established and optimized using native adipose tissue as template (Chapter 6). 
In a subcutaneous nude mouse model, SVF cells were, for the first time in vivo, elucidated for their potential to support the functional assembly of vascularized adipose tissue. Investigating the effect of adipogenic precultivation of SVF-seeded stable fibrin constructs in vitro prior to implantation on the in vivo outcome, hormonal induction was shown beneficial in terms of adipocyte development, whereas a strong vascularization potential was observed when no adipogenic inducers were added. Via histological analysis, it was proven that the developed structures were of human origin and derived from the implanted cells. Applying SVF cells without precultivation in vitro but comparing two different fibrin carriers, namely stable fibrin and TissuCol gels, revealed that TissuCol profoundly supported adipose formation by SVF cells in vivo. This was contrasted by only minor SVF cell development and a strong reduction of cell numbers in stable fibrin gels implanted without precultivation. Histomorphometric analysis of adipocytes and capillary structures was conducted to verify the qualitative results, concluding that particularly SVF cells in TissuCol were highly suited for adipose regeneration in vivo. Employing the established WMS technique, the close interaction of mature adipocytes and blood vessels in TissuCol constructs was impressively shown and via species-specific human vimentin staining, the expected strong involvement of implanted SVF cells in the formation of coherent adipose tissue was confirmed (Chapter 7). 

With the development of biodegradable volume-stable adipose tissue constructs, the application of ASCs and SVF cells as two promising cell sources for functional adipose regeneration, as well as the thorough evaluation of strategies for construct vascularization in vitro and in vivo, this thesis provides valuable solutions to current challenges in adipose tissue engineering. The presented findings further open up new perspectives for innovative treatments to cure soft tissue defects and serve as a basis for directed approaches towards the generation of clinically applicable soft tissue substitutes.
N2  - In der rekonstruktiven Chirurgie besteht ein ständig wachsender Bedarf an geeigneten Implantaten, um Weichteildefekte nach Tumorresektionen, Traumata, oder aufgrund von kongenitalen Missbildungen adäquat ersetzen zu können [1]. Hierbei stellt körpereigenes Fettgewebe als Weichteilersatz das ideale Substitutionsmaterial dar [2-4]. Derzeit angewandte Wiederherstellungsmethoden verwenden frei transplantierbare und gestielte Lappenplastiken aus autologem Fettgewebe oder greifen auf künstliche Kollagen- und Silikonimplantate zurück [5]. Diese Ansätze sind jedoch zum Teil mit gravierenden Nachteilen behaftet, wie Absorption und Nekrotisierung bei transplantiertem körpereigenem Fettgewebe, sowie Fremdkörperreaktionen und fibrotischen Verkapselungen bei Kollagen und Silikon. Insbesondere die Versorgung großvolumiger Defekte ist mit komplexen chirurgischen Eingriffen verbunden und geht häufig mit Komplikationen wie Infektionen, Narbenbildung und Volumenverlust, sowie Defiziten an der Hebe- und Empfängerstelle einher [1,5-8]. Es besteht daher ein großer Bedarf an innovativen Methoden und der Entwicklung neuer Materialien, die einen dauerhaften körpereigenen Weichteilersatz ermöglichen. 
Das interdisziplinäre Feld des Tissue Engineerings von Fettgewebe zielt auf die Entwicklung neuer Ansätze zur Regeneration von Weichteildefekten und der Bereitstellung von biologisch äquivalentem Gewebeersatz, vor allem für die Rekonstruktion großvolumiger Defekte. Verringerte Volumenstabilität und unzureichende Blutgefäßversorgung stellen jedoch auch bei durch Tissue Engineering hergestelltem Gewebe zentrale Limitationen dar [5,8,9]. Für die erfolgreiche Substitution von Weichteildefekten mit Methoden des Tissue Engineerings ist es daher essenziell, Gewebekonstrukte mit ausreichender Volumenstabilität bereitzustellen, um auch nach Implantation in vivo langfristig zu bestehen, sowie eine adäquate Blutgefäßversorgung zu gewährleisten, um Zellüberleben und Differenzierung für eine vollständige Geweberegeneration zu garantieren [5,10]. 
Folglich war es Ziel dieser Arbeit, volumenstabile Fettgewebekonstrukte zu entwickeln und neue Strategien zur Vaskularisierung der generierten Konstrukte zu evaluieren. Als wichtiger Schritt in Bezug auf eine potenzielle klinische Anwendbarkeit wurden außerdem vielversprechende In-vitro-Ansätze auf den In-vivo-Kontext in etablierten Mausmodellen übertragen.
Für die Entwicklung volumenstabiler Fettgewebekonstrukte wurde die Kombination zweier Biomaterialien mit komplementären Eigenschaften verfolgt. So wurden für die Konstruktherstellung Fibrinhydrogele als Zellträger mit hochporösen bioabbaubaren Scaffolds als mechanische Schutzstrukturen kombiniert. Im Gegensatz zu bisherigen Ansätzen zur Verbesserung der Volumenstabilität, in denen hauptsächlich nicht abbaubare, rigide Gerüst- oder Hohlkörperstrukturen zum mechanischen Schutz des entstehenden Gewebes appliziert wurden [11-13], wurden hier ausschließlich bioabbaubare und Gewebe kompatible Materialien verwendet. Dabei konnte auf bereits zuvor entwickelte stabile Fibringele [14] zurückgegriffen werden, die in dieser Arbeit erstmals für das Fettgewebe Engineering als Zellträger für mesenchymale Stammzellen aus dem Fettgewebe (adipose-derived stem cells; ASCs) verwendet wurden. Mittels sich ergänzender Analysemethoden auf zellulärer (Oil Red O-Färbung) und molekularer Ebene (Leptin Sekretion; ELISA) konnte erfolgreich die adipogene Differenzierung der in den Fibringelen inkorporierten ASCs nachgewiesen werden. Im Vergleich zu kommerziell erhältlichem Fibrin (TissuCol, Baxter) zeigten ASCs in den stabilen Fibringelen eine mit TissuCol vergleichbare, gute adipogene Differenzierbarkeit. Durch die Verwendung von ASCs als sichere und autologe Zellquelle [15,16] für die Konstruktherstellung wurde zudem die potenzielle klinische Anwendbarkeit der generierten Zell-Biomaterial-Konstrukte erhöht.
Zur Verbesserung der Volumenstabilität wurden bioabbaubare Poly(ε caprolacton)-basierte Polyurethan-Scaffolds als zusätzliche Gerüststruktur evaluiert. Aufgrund ihrer hohen Porosität und Interkonnektivität stellten sich die Scaffolds als besonders geeignet für die Differenzierung von Adipozyten sowie für die Generierung von kohärentem Fettgewebe heraus. Bei direkter Besiedelung mit ASCs wiesen die PU-Scaffolds zwar eine geringe Zelladhäsion und inhomogene Zellverteilung auf, die adipogene Differenzierung der Zellen war jedoch nicht beeinträchtigt. Daraufhin wurde die Generierung von Fibrin/PU Kompositkonstrukten durch Kombination der PU-Scaffolds mit den zuvor untersuchten stabilen Fibringelen angestrebt (Kapitel 3).
Durch Zusammenführung der stabilen Fibringele als Zellträger für ASCs mit den PU Scaffolds als zusätzlicher Gerüststruktur konnten in folgenden Arbeiten erfolgreich homogene und mechanisch stabile Fettgewebekonstrukte hergestellt werden. Die detaillierte Evaluation von Größe und Gewicht zeigte, dass in den Kompositkonstrukten durch die zusätzliche poröse PU-Scaffoldstruktur eine erhöhte Stabilität im Vergleich zu den stabilen Fibringelen als alleinigem Zellträger erreicht werden konnte. Der Vergleich der stabilen Fibringele mit TissuCol als Hydrogelkomponente zeigte, dass TissuCol-Gele unter In vitro Kulturbedingungen stärker kontrahierten und schneller abgebaut wurden. Die in den Kompositkonstrukten inkorporierten ASCs zeigten gute Viabilität sowie deutliche adipogene Differenzierung auf histologischer (Oil Red O-Färbung) als auch auf molekularer Ebene (qRT-PCR; ELISA). In einer In-vivo-Pilotstudie wurden die Kompositkonstrukte auf ihre Transplantierbarkeit hin überprüft und durch mikrochirurgische Insertion eines Durchflussgefäßes bei der Implantation unmittelbar vaskularisiert. In stabilen Fibrin/PU Konstrukten mit integriertem Gefäßstiel wurde so die Entwicklung von vaskularisiertem Fettgewebe im Vergleich zu ungestielten Konstrukten entschieden verbessert. Mittels der erfolgreichen In-vivo-Implantation der Kompositkonstrukte konnte die Anwendbarkeit der Biomaterialkombination aus stabilem Fibrin und porösen PU Scaffolds für die Generierung volumenstabiler Fettgewebekonstrukte demonstriert und gleichzeitig der positive Effekt einer direkten Vaskularisierung durch Integration eines Gefäßstiels gezeigt werden (Kapitel 4).

Im Rahmen der weiteren Evaluation potenzieller Vaskularisierungsstrategien wurden im Anschluss Ansätze zur Prävaskularisierung in vitro untersucht. Hierbei stellte die hypoxische Vorkultur von mittels Tissue Engineering generierten Fettgewebekonstrukten einen möglichen Ansatz zur Schaffung eines pro-angiogenen, vaskularisierungsfördernden Milieus innerhalb der Konstrukte dar. Ebenso von Interesse waren in diesem Zusammenhang die Auswirkungen von Hypoxie auf die adipogene Differenzierung von ASCs. 
Erste Versuche im 2D-Kulturformat mit ASCs zeigten, dass das adipogene Potenzial der Zellen unter Hypoxie in der Differenzierungsphase stark vermindert war, wobei der während der Expansionsphase der Zellen bestehende Sauerstoffpartialdruck keinen Einfluss auf die Fettentwicklung hatte. Auch in 3D-Konstrukten basierend auf stabilen Fibringelen konnte eine verringerte adipogene Differenzierung von ASCs unter hypoxischer Kultur nachgewiesen werden, dabei wurden im Gegenzug endotheliale Marker (CD31) und pro angiogene Wachstumsfaktoren, wie z.B. vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor (VEGF), aber auch das Adipokin Leptin, stark hochreguliert. Insbesondere die deutliche Veränderung der Leptinsekretion unter hypoxischen Kulturbedingungen und die duale Rolle von Leptin als adipogener und pro-angiogener Faktor ergeben interessante Perspektiven für weiterführende Untersuchungen. Basierend auf den gezeigten Ergebnissen konnte insgesamt bestätigt werden, dass die hypoxische Vorkultur in vitro zur Entstehung eines pro angiogenen und potenziell vaskularisierungsfördernden Milieus beitragen kann. Es gilt nun in Folgestudien das Potenzial der hypoxischen Vorkultur zur Verbesserung der Vaskularisierung in vivo, sowie eine erhöhte Toleranz der implantierten Zellen gegenüber hypoxischen Bedingungen nach der Implantation in etablierten In-vivo-Mausmodellen zu verifizieren (Kapitel 5).

Ein weiterer Ansatz zur Generierung von vaskularisiertem Fettgewebe in vitro und in vivo wurde durch den Einsatz der stromalen-vaskulären Fraktion (SVF) als neue Zellquelle für das Fettgewebe-Engineering verfolgt. Bisher wurde die SVF hauptsächlich für das Tissue Engineering von Knochen- und Knorpelgewebe [17-19] oder für Vaskularisierungs- und Wundheilungsansätze [20-22] untersucht. In der SVF enthalten sind sowohl Fettvorläuferzellen als auch Endothelzellen, Perizyten, Fibroblasten und Immunzellen [8]. Durch Verwendung dieses heterogenen Zellgemisches sollte die simultane Entwicklung von Fettzellen und vaskulären Strukturen erreicht werden, und damit eine schnellere und effizientere Fettgewebeentwicklung in vivo. Da sich bisher nur eine In-vitro-Studie explizit dem Tissue Engineering von Fettgewebe mit SVF-Zellen widmet [23], wurden in dieser Arbeit SVF-besiedelte Fettgewebekonstrukte basierend auf Fibringelen als Zellträger zunächst umfassend in vitro charakterisiert und erstmals die Fettgewebeentwicklung der Zellen im Mausmodell in vivo untersucht.
In vorbereitenden In-vitro-Arbeiten wurden SVF-besiedelte stabile Fibringele mit den bisher verwendeten ASC-basierten Konstrukten verglichen. Dabei wurde zunächst die adipogene und endotheliale Differenzierbarkeit der SVF in unterschiedlichen Zellkulturmedien untersucht. Eine 1:1-Mischung aus Präadipozytenmedium (PGM-2) und Endothelzellmedium (EGM-2), die zuvor schon für Kokulturexperimente von ASCs und Endothelzellen verwendet worden war [24], stellte sich als besonders geeignet für die Kurz- und Langzeitkultur der SVF in stabilen Fibringelen heraus. Umfassende histologische Untersuchungen zeigten, dass mit Hilfe dieser Medienkomposition insbesondere das adipogene und endotheliale Differenzierungspotenzial der verschiedenen Zelltypen in der SVF innerhalb der generierten 3D-Konstrukte erhalten werden kann. Die auf zellulärer Ebene gewonnenen Erkenntnisse konnten mittels qRT-PCR-Analyse von adipogenen und endothelialen Markern (PPARγ, aP2, CD31) auf mRNA-Ebene bestätigt werden. Um in Zukunft die In-vivo-Untersuchung der generierten Fettgewebekonstrukte zu erleichtern, sowie eine strukturelle Analyse des Gewebeverbands und insbesondere die Interaktion von Adipozyten und Blutgefäßen zu ermöglichen, wurde zusätzlich eine 3D-Färbetechnik (Whole Mount Staining), zunächst unter Verwendung von nativem humanem Fettgewebe, etabliert (Kapitel 6).
In einer anschließenden umfassenden Studie in immundefizienten Nacktmäusen (NMRI Foxn1nu/Foxn1nu) wurden SVF-Zellen zum ersten Mal in vivo für das Engineering von vaskularisiertem Fettgewebe untersucht. Hierbei wurden sowohl der Effekt der In vitro Vorkultur der SVF-basierten Konstrukte als auch der Einfluss des Trägermaterials auf die Gewebeentwicklung in vivo evaluiert. Die adipogene Vorkultur der SVF-besiedelten Konstrukte in vitro über einen Zeitraum von 7 Tagen vor Implantation wirkte sich positiv auf die Fettdifferenzierung in vivo aus, wohingegen die Vorkultur unter nicht-induzierten Bedingungen ohne adipogene Induktion verstärkt zur Bildung von vaskulären Strukturen führte. Durch Spezies-spezifische Färbung gegen humanes Vimentin konnte gezeigt werden, dass die beobachteten Strukturen humanen Ursprungs waren und daher von den implantierten SVF-Zellen stammten. 
Der Einfluss des Trägermaterials auf die Gewebebildung in vivo wurde durch Besiedelung stabiler Fibringele und TissuCol-Gele mit SVF-Zellen verglichen. Die Konstrukte wurden ohne In-vitro-Vorkultur direkt nach der Herstellung implantiert. Hier zeigte sich in stabilen Fibringelen nach 4 Wochen in vivo keine nennenswerte Gewebeentwicklung, wobei auch der Anteil an humanen Zellen innerhalb der Konstrukte zum Zeitpunkt der Explantation stark verringert war. Im Gegensatz dazu konnte in TissuCol-Gelen die Entwicklung von kohärentem und maturem Fettgewebe nachgewiesen werden von dem große Teile humanen Ursprungs waren. Die histologischen Ergebnisse wurden mittels histomorphometrischer Quantifizierung von Adipozyten und Blutgefäßstrukturen verifiziert, wodurch das herausragende Potenzial der SVF für das Fettgewebe-Engineering in vivo nochmals verdeutlicht wurde. Unter Verwendung der zuvor etablierten 3D-Färbetechnik (Whole Mount Staining) konnten anschließend Adipozyten und Blutgefäße innerhalb des entstandenen kohärenten Gewebeverbands in TissuCol-Gelen visualisiert werden. Mit Hilfe einer humanspezifischen Färbung in 3D konnte zusätzlich die weitreichende Beteiligung der implantierten SVF Zellen bei der Gewebeentwicklung nachgewiesen werden (Kapitel 7).

Die in der Dissertation entwickelten bioabbaubaren volumenstabilen Fettgewebekonstrukte, die Untersuchung von ASCs und SVF-Zellen als vielversprechende regenerative Zellquellen für die Generierung funktioneller Konstrukte, sowie die Evaluation unterschiedlicher Vaskularisierungsstrategien in vitro und in vivo leisten einen wichtigen Beitrag zu neuen und innovativen Ansätzen im Bereich des Tissue Engineerings von Fettgewebe. Die Ergebnisse stellen eine Grundlage für die zielgerichtete Entwicklung regenerativer Implantate dar und eröffnen neue Perspektiven für die Generierung klinisch anwendbarer Fettgewebekonstrukte als Weichteilersatz.
KW  - Tissue Engineering
KW  - Fettgewebe
KW  - Tissue Engineering
KW  - Adipose Tissue
KW  - Vascularization
KW  - Fibrin
Y1  - 2014
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-107196
ER  - 
TY  - THES
A1  - Werner, Katharina Julia
T1  - Adipose Tissue Engineering - In vitro Development of a subcutaneous fat layer and a vascularized adipose tissue construct utilizing extracellular matrix structures
T1  - Fettgewebe Engineering - In vitro Entwicklung einer subkutanen Fettschicht und eines vaskularisierten Fettgewebskonstruktes unter Verwendung extrazellulärer Matrixstrukturen
N2  - Each year millions of plastic and reconstructive procedures are performed to regenerate soft tissue defects after, for example, traumata, deep burns or tumor resections. Tissue engineered adipose tissue grafts are a promising alternative to autologous fat transfer or synthetic implants to meet this demand for adipose tissue. Strategies of tissue engineering, especially the use of cell carriers, provide an environment for better cell survival, an easier positioning and supplemented with the appropriate conditions a faster vascularization in vivo. To successfully engineer an adipose tissue substitute for clinical use, it is crucial to know the actual intended application. In some areas, like the upper and lower extremities, only a thin subcutaneous fat layer is needed and in others, large volumes of vascularized fat grafts are more desirable. The use and interplay of stem cells and selected scaffolds were investigated and provide now a basis for the generation of fitted and suitable substitutes in two different application areas.

Complex injuries of the upper and lower extremities, in many cases, lead to excessive scarring. Due to severe damage to the subcutaneous fat layer, a common sequela is adhesion formation to mobile structures like tendons, nerves, and blood vessels resulting in restricted motion and disabling pain [Moor 1996, McHugh 1997]. In order to generate a subcutaneous fat layer to cushion scarred tissue after substantial burns or injuries, different collagen matrices were tested for clinical handling and the ability to support adipogenesis. When testing five different collagen matrices, PermacolTM and StratticeTM showed promising characteristics; additionally both possess the clinical approval. Under culture conditions, only PermacolTM, a cross-linked collagen matrix, exhibited an excellent long-term stability. Ranking nearly on the same level was StratticeTM, a non-cross-linked dermal scaffold; it only exhibited a slight shrinkage. All other scaffolds tested were severely compromised in stability under culture conditions. Engineering a subcutaneous fat layer, a construct would be desirable with a thin layer of emerging fat for cushioning on one side, and a non-seeded other side for cell migration and host integration. With PermacolTM and StratticeTM, it was possible to produce constructs with ASC (adipose derived stem cells) seeded on one side, which could be adipogenically differentiated. Additionally, the thickness of the cell layer could be varied. Thereby, it becomes possible to adjust the thickness of the construct to the surrounding tissue. In order to reduce the pre-implantation time ex vivo and the costs, the culture time was varied by testing different induction protocols. An adipogenic induction period of only four days was demonstrated to be sufficient to obtain a substantial adipogenic differentiation of the applied ASC. Thus, seeded with ASC, PermacolTM and StratticeTM are suitable scaffolds to engineer subcutaneous fat layers for reconstruction of the upper and lower extremities, as they support adipogenesis and are appropriately thin, and therefore would not compromise the cosmesis.

For the engineering of large-volume adipose tissue, adequate vascularization still represents a major challenge. With the objective to engineer vascularized fat pads, it is important to consider the slow kinetics of revascularization in vivo. Therefore, a decellularized porcine jejunum with pre-existing vascular structures and pedicles to connect to the host vasculature or the circulation of a bioreactor system was used. In a first step, the ability of a small decellularized jejunal section was tested for cell adhesion and for supporting adipogenic differentiation of hASC mono-cultures. Cell adhesion and adipogenic maturation of ASC seeded on the jejunal material was verified through histological and molecular analysis. After the successful mono-culture, the goal was to establish a MVEC (microvascular endothelial cells) and ASC co-culture; suitable culture conditions had to be found, which support the viability of both cell types and do not interfere with the adipogenic differentiation. After the elimination of EGF (epidermal growth factor) from the co-culture medium, substantial adipogenic maturation was observed. In the next step, a large jejunal segment (length 8 cm), with its pre-existing vascular structures and arterial/venous pedicles, was connected to the supply system of a custom-made bioreactor. After successful reseeding the vascular structure with endothelial cells, the lumen was seeded with ASC which were then adipogenically induced. Histological and molecular examinations confirmed adipogenic maturation and the existence of seeded vessels within the engineered construct. Noteworthily, a co-localization of adipogenically differentiating ASC and endothelial cells in vascular networks could be observed. So, for the first time a vascularized fat construct was developed in vitro, based on the use of a decellularized porcine jejunum. As this engineered construct can be connected to a supply system or even to a patient vasculature, it is versatile in use, for example, as transplant in plastic and reconstruction surgery, as model in basic research or as an in vitro drug testing system. 

To summarize, in this work a promising substitute for subcutaneous fat layer reconstruction, in the upper and lower extremities, was developed, and the first, as far as reported, in vitro generated adipose tissue construct with integrated vascular networks was successfully engineered.
N2  - Jedes Jahr werden Millionen von plastischen und wiederherstellenden Eingriffe durchgeführt, um zum Beispiel nach Traumata, hochgradigen Verbrennungen oder Tumorekonstruktionen, die natürliche Erscheinung und Funktion im Bereich von Weichgewebsdefekt wiederherzustellen. Gezüchtete Fettgewebskonstrukte sind eine vielversprechende Alternative zu autologen Fettgewebstransfers oder synthetischen Implantaten, um dem Bedarf an Fettgewebe gerecht zu werden. Die Strategien der Gewebezüchtung, besonders das Verwenden von Zellträgern, schaffen eine Umgebung für besseres Zellüberleben, eine einfachere Positionierung und - versehen mit den entsprechenden Eigenschaften - eine schnellere Vaskularisierung in vivo. Um erfolgreich einen Fettgewebe-Ersatz für die klinische Anwendung herzustellen, ist es notwendig das spätere Anwendungsgebiet zu kennen. In manchen Bereichen, wie in den oberen und unteren Extremitäten, braucht man nur eine dünne Unterhautfettschicht, und in anderen Bereichen wiederum ist ein großes Volumen an vaskularisiertem Fettgewebskonstrukt anzustreben. Die Nutzung und das Zusammenspiel von Stammzellen und ausgewählten Zellträgern wurden untersucht und legen nun eine Basis für die Herstellung von passendem und zweckmäßigem Ersatzgewebe zweier unterschiedlicher Anwendungsgebiete.

Komplexe Verletzungen der oberen und unteren Extremitäten führen oftmals zu beträchtlicher Narbenbildung. Eine häufige Folgeerscheinung, hervorgerufen durch eine schwere Beschädigung des Unterhautfettgewebes, ist die Adhäsion zwischen mobilen Strukturen wie Sehnen, Nerven und Blutgefäßen. Dies resultiert dann in eingeschränkter Beweglichkeit und lähmenden Schmerzen [Moor 1996, McHugh 1997]. Um eine subkutane Fettschicht herzustellen, die das vernarbte Gewebe nach schwerer Verbrennung oder Verletzung polstert, wurden verschiedene Kollagenmaterialien auf die klinische Handhabung und die Unterstützung der Adipogenese untersucht. In der Untersuchung von fünf verschiedenen Kollagenmatrices zeigten PermacolTM und StratticeTM vielversprechende Eigenschaften. Beide besitzen außerdem die klinische Zulassung. PermacolTM, eine chemisch quervernetzte Kollagenmatrix, zeigte unter Kulturbedingungen hervorragende Langzeitstabilität. Fast ebenso gute Eigenschaften konnten bei StratticeTM, einem nicht vernetzten dermalen Gerüstmaterial, beobachtet werden; es zeigte lediglich leichte Schrumpfung. Alle sonst getesteten Kollagenmaterialien waren unter Kulturbedingungen stark in ihrer Stabilität beeinträchtigt. Zur Herstellung einer subkutanen Fettschicht wäre ein Konstrukt wünschenswert mit einer dünnen, gerade entstehenden Fettschicht für die Polsterung auf der einen Seite und einer nicht besiedelten anderen Seite für die Zelleinwanderung und die Integration in das umliegende Gewebe. Mit PermacolTM und StratticeTM war es möglich Konstrukte herzustellen, welche auf einer Seite mit ASC (aus dem Fettgewebe isolierte Stammzellen) besiedelt und anschließend adipogen differenziert werden konnten. Zusätzlich konnte die Dicke der Zellschicht hierbei variiert werden. Somit ist es möglich die Dicke des Konstruktes an das umliegende Gewebe anzupassen. Um die Preimplantationszeit ex vivo zu verkürzen und damit auch die Kosten zu senken, wurde die Kulturzeit variiert, indem verschiedene Induktionsprotokolle getestet wurden. Eine adipogene Induktionsperiode von nur vier Tagen erwies sich als ausreichend, um eine substantielle adipogene Differenzierung der eingesetzten ASC zu erreichen. Das heißt, die mit ASC besiedelten PermacolTM und StratticeTM Matrices sind zweckdienliche Zellträgermaterialien, um eine subkutane Fettschicht für die oberen und unteren Extremitäten herzustellen, da sie die Adipogenese unterstützen und durch die nur geringe und anpassbare Dicke die Kosmesis nicht beeinträchtigen.

Für die Entwicklung von großvolumigem Fettgewebe stellt die adäquate Vaskularisierung noch immer eine große Herausforderung dar. Mit dem Ziel ein vaskularisiertes Fettkonstrukt herzustellen, ist es wichtig die langsame Kinetik der Revaskularisierung in vivo zu berücksichtigen. Daher wurde hier ein dezellularisiertes Schweinedarmsegment mit schon vorhandenen Gefäßstrukturen und Gefäßanschlüssen für die Verbindung zum Kreislaufsystem des Patienten oder eines Bioreaktor-Systems verwendet. Im ersten Schritt wurden auf einem kleinen dezellularisierten Schweinedarm-Stück die Zelladhäsion und die adipogene Differenzierung der ASC in Monokultur getestet. Die Zelladhäsion und die adipogene Reifung konnte mittels histologischer und molekularer Analysen auf dem jejunalen Material nachgewiesen werden. Nach der erfolgreichen Monokultur musste die Co-Kultur von MVEC (micro vaskuläre Endothelzellen) und ASC etabliert werden. Um dieses Ziel zu erreichen, wurden geeignete Kulturbedingungen gesucht, die die Lebensfähigkeit beider Zelltypen unterstützen und gleichzeitig die adipogene Differenzierung nicht beeinträchtigen. Nach dem Ausschluss von EGF (epidermaler Wachstumsfaktor) aus dem Co-Kulturmedium wurde eine substantielle adipogene Reifung der ASC beobachtet. Im nächsten Schritt wurde ein großes dezellularisiertes jejunales Darmsegment (Länge 8 cm) mit der schon existenten Gefäßstruktur und dem arteriellen und venösen Gefäßstiel an den spezialangefertigten Bioreaktor angeschlossen. Nach der erfolgreichen Wiederbesiedelung der Gefäßstrukturen mit Endothelzellen wurde das Darmlumen mit ASC besiedelt, welche anschließend adipogen induziert wurden. Histologische und molekulare Untersuchungen konnten die adipogenen Reifung und die Existenz von besiedelten Gefäßen im hergestellten Konstrukt bestätigen. Besonders erwähnenswert ist die Beobachtung der Co-Lokalisierung von adipogen differenzierenden ASC und Endothelzellen in vasculären Netzwerken. Somit wurde zum ersten Mal - basierend auf einem dezellularisierten Schweinedarm - ein vaskularisiertes Fettgewebskonstrukt in vitro hergestellt. Da dieses Konstrukt an das Versorgungssystem angeschlossen oder mit dem Blutkreislauf des Patienten verbunden werden kann, ist es vielfältig einsetzbar, zum Beispiel in der plastisch-rekonstruktiven Chirurgie, als Modell in der Grundlagenforschung oder als ein in vitro Medikamenten-Testsystem.

Zusammengefasst, wurde in der vorgelegten Arbeit ein vielversprechendes Ersatzmaterial für die Rekonstruktion des Unterhautfettgewebes für die unteren und oberen Extremitäten entwickelt, und zum ersten Mal erfolgreich, so weit in der Literatur bekannt, ein Fettgewebskonstrukt mit integriertem vaskularisiertem Netzwerk in vitro generiert.
KW  - Tissue Engineering
KW  - Fettgewebe
KW  - Extrazelluläre Matrix
KW  - Vascularisation
KW  - adipose tissue engineering
KW  - subcutaneous fat layer
KW  - scar revision surgery
KW  - vascularized fat construct
KW  - Bioreactor System
KW  - extracellular matrix
KW  - adipose tissue
Y1  - 2014
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-104676
ER  - 
TY  - THES
A1  - Weyhmüller Reboredo, Jenny
T1  - Tissue Engineering eines Meniskus - Vom Biomaterial zum Implantat
T1  - Tissue Engineering of a meniscus - from a biomaterial to the implant
N2  - Der Meniskus, ein scheibenförmiger Faserknorpel, spielt im Kniegelenk eine bedeutende Rolle, weil er Kräfte und Druck im Kniegelenk gleichmäßig verteilt, Stöße dämpft sowie der Kraftübertragung und Stabilisierung dient. Durch die Entfernung des Gewebes, der sogenannten Totalmeniskektomie, nach einer Meniskusverletzung oder einem Riss, verändern sich die mechanischen Eigenschaften des Gelenks stark und verursachen durch die erhöhte Belastung der Gelenkflächen Arthrose. Arthrose ist weltweit die Häufigste aller Gelenkerkrankungen. Der Erhalt der körperlichen Leistungsfähigkeit und Mobilität bis ins hohe Alter sowie die Bewahrung der Gesundheit von Herz-Kreislauf- und Stoffwechselorganen zählen aufgrund des demografischen Wandels zu den großen medizinischen Herausforderungen. Die Erkrankung des muskuloskelettalen Systems stellte 2010 im Bundesgebiet die am häufigsten vorkommende Krankheitsart dar.
Während Risse in den äußeren Teilen des Meniskus aufgrund des Anschlusses an das Blutgefäßsystem spontan heilen können, können sie dies in tieferen Zonen nicht. Durch die begrenzte Heilungsfähigkeit des Knorpels bleibt langfristig der Einsatz eines Ersatzgewebes die einzige therapeutische Alternative.
In der vorliegenden Arbeit wurde als therapeutische Alternative erfolgreich ein vaskularisiertes Meniskusersatzgewebe mit Methoden des Tissue Engineering entwickelt. Es soll in Zukunft als Implantat Verwendung finden. Tissue Engineering ist ein interdisziplinäres Forschungsfeld, in dem Gewebe außerhalb des Körpers generiert werden. Schlüsselkomponenten sind Zellen, die aus einem Organismus isoliert werden, und Trägerstrukturen, die mit Zellen besiedelt werden. Die Biomaterialien geben den Zellen eine geeignete Umgebung, die die Extrazelluläre Matrix (EZM) ersetzen soll, um die Funktion der Zellen beizubehalten, eigene Matrix zu bilden. Zum Erhalt eines funktionelles Gewebes werden oftmals dynamische Kultursysteme, sogenannte Bioreaktoren, verwendet, die natürliche Stimuli wie beispielsweise den Blutfluss oder mechanische Kompressionskräfte während der in vitro Reifungsphase des Gewebes, zur Verfügung stellen. Das Gewebekonstrukt wurde auf Basis natürlicher Biomaterialien aufgebaut, unter Verwendung ausschließlich primärer Zellen, die später direkt vom Patienten gewonnen werden können und damit Abstoßungsreaktionen auszuschließen sind. Da der Meniskus teilvaskularisiert ist und die in vivo Situation des Gewebes bestmöglich nachgebaut werden sollte, wurden Konstrukte mit mehreren Zelltypen, sogenannte Ko-Kulturen aufgebaut. Neben mikrovaskulären Endothelzellen (mvEZ) und Meniskuszellen (MZ) erfolgten Versuche mit mesenchymalen Stammzellen (MSZ).
Zur Bereitstellung einer zelltypspezifischen Matrixumgebung, diente den mvEZ ein Stück Schweinedarm mit azellularisierten Gefäßstrukturen (BioVaSc®) und den MZ diente eine geeig- nete Kollagenmatrix (Kollagen Typ I Hydrogel). Die Validierung und Charakterisierung des aufgebauten 3D Meniskuskonstrukts, welches in einem dynamischen Perfusions-Bioreaktorsystem kultiviert wurde, erfolgte mit knorpeltypischen Matrixmarkern wie Aggrekan, Kollagen Typ I, II und X sowie mit den Transkriptionsfaktoren RunX2 und Sox9, die in der Knorpelentstehung von großer Bedeutung sind. Zusätzlich erfolgten Auswertungen mit endothelzellspezifischen Markern wie vWF, CD31 und VEGF, um die Vaskularisierung im Konstrukt nachzuweisen. Analysiert wurden auch die Zellvitalitäten in den Konstrukten.
Aufgrund einer nur geringen Verfügbarkeit von MZ wurden Kulturansätze mit alternativen Zellquellen, den MSZ, durchgeführt. Dafür erfolgte zunächst deren Isolation und Charakterisierung und die Auswahl einer geeigneten 3D Kollagenmatrix. Die beste Zellintegration der MSZ konnte auf einer eigens hergestellten elektrogesponnenen Matrix beobachtet werden. Die Matrix besteht aus zwei unterschiedlichen Kollagentypen, die auf insgesamt fünf Schichten verteilt sind. Die Fasern besitzen weiter unterschiedliche Ausrichtungen. Während die Kollagen Typ I Fasern in den äußeren Schichten keiner Ausrichtung zugehören, liegen die Kollagen Typ II Fasern in der mittleren Schicht parallel zueinander. Der native Meniskus war für den Aufbau einer solchen Kollagen-Trägerstruktur das natürliche Vorbild, das imitiert werden sollte. Nach der Besiedelung der Matrix mit MSZ, konnte eine Integration der Zellen bereits nach vier Tagen bis in die Mittelschicht sowie eine spontane chondrogene Differenzierung nach einer insgesamt dreiwöchigen Kultivierung gezeigt werden. Das Biomaterial stellt in Hinblick auf die Differenzierung der Zellen ohne die Zugabe von Wachstumsfaktoren eine relevante Bedeutung für klinische Studien dar.
Zur Kultivierung des 3D Meniskuskonstrukts wurde ein Bioreaktor entwickelt. Mit diesem können neben Perfusion der Gefäßsysteme zusätzlich Kompressionskräfte sowie Scherspannungen auf das Ersatzgewebe appliziert und die Differenzierung von MZ bzw. MSZ während der in vitro Kultur über mechanische Reize stimuliert werden. Ein anderes Anwendungsfeld für den neuartigen Bioreaktor ist seine Verwendung als Prüftestsystem für die Optimierung und Qualitätssicherung von Gewebekonstrukten.
N2  - The meniscus, a disk-shaped fibrous cartilage, plays an important role in the equal distribution of pressure, shock absorption, power transmission and stability within the knee joint. After a meniscus injury or a meniscus tear, a total meniscectomy is done where the complete tissue is removed. This leads to a change of mechanical properties in the joint and causes arthrosis by an increased strain on the joint surfaces. Wordwide arthrosis is the most frequent of all joint diseases. Due to the demographic change, maintaining physical fitness and mobility up to an old age are the main challenges besides ensuring health of the heart and circulatory system and of the metabolic organs. Musculoskeletal disorders represented the most frequent type of disease in Germany in 2010.
While tears in the outer zone of the meniscus heal spontaneously because of its connection to the blood vessel system, tears in the deeper zones do not heal. Due to the limited healing capacity of cartilage the use of a replacement tissue is the only therapeutic alternative in the long run.
In the present work a vascularized meniscus construct as therapeutic alternatives has been developed with the Tissue Engineering method for the further use as an implant. Tissue En- gineering is an interdisciplinary research field to generate tissues outside the body. The key components are isolated cells from an organism, and scaffolds, which are seeded with cells. Biomaterials provide a suitable environment that replaces the extracellular matrix (ECM) to maintain cell functionality to let cells build up their own matrix. To maintain a functional tissue during in vitro dynamic culture, bioreactor systems are used to provide natural stimuli such as blood flow or mechanical compression forces.
The tissue construct is based on natural biomaterials and solely on primary cells, which later can be isolated directly from the patient and thereby exclude repulsion reactions. Due to its limited vascularity of the meniscus and the aim to build up at its best the in vivo situation more than one cell type is used to generate constructs, so called co-culture systems. Mesen- chymal stem cells (MSZ) besides microvascular endothelial cells (mvEZ) and meniscus cells (MZ) were used in the experiments.
To supply a cell type specific matrix environment, a segment of a porcine jejunum with decellularized vascular structures (BioVaSc®) for the mvEZ and a collagen based matrix (collagen type I hydrogel) for the MZ were employed. The validation and characterization of the de- veloped 3D meniscus construct, that was cultured in a dynamic perfusion bioreactor system, was performed by using cartilage matrix specific markers, such as aggrecan, collagen type I, II and X, as well as the transcription factors RunX2 and Sox9 that are of major importance for cartilage development. Further analysis with endothelial cell specific markers, such as vWF, CD31 and VEGF were performed to evaluate the vascularization of the construct. Furthermore, cell vitality tests of the construct were made.
Because of the limited availability of primary MZ, culture approaches with MSZ as an alter- native cell source were investigated. Cell isolation and characterization were performed and a suitable 3D collagen matrix was selected. The best cell integration of the MSZ could be observed on a specifically engineered electrospun matrix. The matrix consists of two different collagen types that are arranged in a total of five layers. The fibers are further orientated in different directions. While outer layers consist of randomly-aligned collagen type I fibers, the collagen type II fibers in the middle layer are aligned parallel to each other. The native meniscus tissue serves as natural example and its structure is replicated in such a collagen scaffold. After seeding the scaffold with MSZ, cell integration into the middle layer could be observed after four days, as well as a spontanous chondrogenic differentation after three weeks of culture. The biomaterial developed in this work has to be considered as relevant for clinical studies with regard to cell differentiation without adding growth factors to the culture.
For the culture of 3D meniscus construct a bioreactor was successfully developed, that can apply compressive strength and shear stress to the tissue model in addition to perfusing the vascular system. With these measures the differentiation of MZ or MSZ could be induced with mechanical strains during the in vitro culture. Another field of application for the new bioreactor is its use as a test system for the optimization and quality control of the tissue models.
KW  - Tissue Engineering
KW  - Meniskustransplantation
KW  - Bioreaktor
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Y1  - 2014
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-108477
ER  -