TY  - THES
A1  - Juling, Martin Johannes
T1  - Untersuchung der HBV-Genotypen bei antiviral behandelten Hepatitis B-Patienten im Zeitraum von 1997 bis 2004 an der Universitätsklinik Würzburg
T1  - Distribution of HBV genotypes among chronic hepatitis B infected patients from universityhospital Wuerzburg in 1997 till 2004
N2  - Von den acht bekannten HBV-Genotypen sind die Genotypen A und D in Europa vorherrschend, Genotyp A in Nordwesteuropa, Genotyp D im Mittelmeerraum und in Südosteuropa. Dies bestätigte sich auch in der vorliegenden Studie, bei der von 62 genotypisierten Proben 91,9 % diesen beiden Genotypen zugeordnet werden konnten. Genotyp D war mit 64,5 % (40 Patienten) vorherrschend. Es folgten der Genotyp A (17 Patienten) und der Genotyp C (4 Patienten). In einem Fall wurde Genotyp B nachgewiesen. Deutschland als Herkunftsland war bei Patienten mit Genotyp A signifikant häufiger vertreten als bei Patienten mit Genotyp D. Der relativ hohe Genotyp D-Anteil ist möglicherweise darauf zurückzuführen, dass durch zunehmende Immigration das Auftreten verschiedener Genotypen beispielsweise aus dem südosteuropäischen Raum begünstigt wird. Patienten mit Genotyp A sprechen häufig besser auf IFN-alpha an, so dass eine Therapie mit Nukleosid- bzw. Nukleotidanaloga nicht erforderlich ist. Diese Patienten wurden somit à priori nicht in dieser Studie erfasst, was eine mögliche Erklärung dafür ist, dass der Genotyp A-Anteil mit 27,4 % relativ gering ausfiel. Bei der Untersuchung von statistischen Zusammenhängen zwischen HBV-Genotyp und Patientenalter, Geschlecht, Viruslast und Therapiedauer ergaben sich keine signifikanten Ergebnisse. Diese Studie bietet Basisinformationen zur Genotypverteilung in Deutschland. Bezüglich einer Korrelation zwischen den verschiedenen HBV-Genotypen und demographischen, virologischen sowie klinischen Charakteristika wird es künftig weiterer Studien bedürfen.
N2  - Among the eight known HBV-genotypes, genotype A and D dominate in Europe. This study established the prevalence of different HBV genotypes in 62 patients from universityhospital Wuerzburg, Germany. The prevalences of genotypes A and D were 27,4% and 64,5%, for genotypes B and C 1,6% and 6,5%. The results indicated that genotypes A and D are the predominat genotypes in German patients with chronic HBV infection.
KW  - Hepatitis B
KW  - Genotyp
KW  - Lamivudin
KW  - Interferon <alpha->
KW  - Nucleosidanaloga
KW  - Nucleotidanaloga
KW  - Genotypverteilung
KW  - Hepatitis B
KW  - genotype
KW  - distribution
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48789
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Herpin, Amaury
A1  - Braasch, Ingo
A1  - Kraeussling, Michael
A1  - Schmidt, Cornelia
A1  - Thoma, Eva C.
A1  - Nakamura, Shuhei
A1  - Tanaka, Minoru
A1  - Schartl, Manfred
T1  - Transcriptional Rewiring of the Sex Determining dmrt1 Gene Duplicate by Transposable Elements
N2  - Control and coordination of eukaryotic gene expression rely on transcriptional and posttranscriptional regulatory networks. Evolutionary innovations and adaptations often require rapid changes of such networks. It has long been hypothesized that transposable elements (TE) might contribute to the rewiring of regulatory interactions. More recently it emerged that TEs might bring in ready-to-use transcription factor binding sites to create alterations to the promoters by which they were captured. A process where the gene regulatory architecture is of remarkable plasticity is sex determination. While the more downstream components of the sex determination cascades are evolutionary conserved, the master regulators can switch between groups of organisms even on the interspecies level or between populations. In the medaka fish (Oryzias latipes) a duplicated copy of dmrt1, designated dmrt1bY or DMY, on the Y chromosome was shown to be the master regulator of male development, similar to Sry in mammals. We found that the dmrt1bY gene has acquired a new feedback downregulation of its expression. Additionally, the autosomal dmrt1a gene is also able to regulate transcription of its duplicated paralog by binding to a unique target Dmrt1 site nested within the dmrt1bY proximal promoter region. We could trace back this novel regulatory element to a highly conserved sequence within a new type of TE that inserted into the upstream region of dmrt1bY shortly after the duplication event. Our data provide functional evidence for a role of TEs in transcriptional network rewiring for sub- and/or neo-functionalization of duplicated genes. In the particular case of dmrt1bY, this contributed to create new hierarchies of sex-determining genes.
KW  - Gen
KW  - dmrt1
KW  - sex-determining gene
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-68437
ER  - 
TY  - THES
A1  - Tran-Van, Hieu
T1  - Semaphorin receptors in the immunological synapse: regulation and measles virus-driven modulation
T1  - Semaphorinrezeptoren in der immunologischen Synapse: Regulierung und masernvirusgesteuerte Modulation
N2  - Jährlich gehen ca. 164000 Todesfälle (WHO, 2008) auf eine Infektion mit Masernviren (MV) zurück. Die Hauptursache für den tödlichen Verlauf der Krankheit ist die MV-induzierte Immunsuppression, deren zugrunde liegende Mechanismen noch nicht völlig aufgeklärt sind. Es gibt Hinweise darauf, dass MV einerseits die Funktionalität von T-Zellen beeinträchtigt, indem es die Aktindynamik behindert, und andererseits dendritische Zellen (DC) infiziert, was dazu führt, dass sie T-Zellen nicht mehr vollständig aktivieren können. Während der Entwicklung bzw. des Wachstums von Neuronen kommt es zum Kollaps wachsender Dendriten, wenn Semaphorine (insbesondere SEMA3A) an den Rezeptor Plexin-A1 (plexA1) und seinem Korezeptor Neuropilin-1 (NP-1) binden. Dieser Kollaps wird durch interferenz mit der Aktindynamik verursacht. In dieser Studie wurde die Funktion dieser drei Moleküle in Immunzellen bzw. ihre Rolle in der MV-induzierten Immunsuppression untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass plexA1 eine wichtige Komponente der humanen immunologischen Synapse (IS) ist. Nach CD3/CD28-Ligation kommt es zur transienten Translokation zur T-Zelloberfläche und zur Akkumulation an der Kontaktfläche zwischen T-Zelle und DC bzw. α-CD3/CD28 beschichteten Mikropartikeln. Wird die plexA1-Expression inhibiert (RNAi) oder die plexA1-Funktion gestört (exogenes Blockieren oder Expression einer dominant negativen Mutante), ist die T-Zellexpansion reduziert. Nach MV-Exposition ist die Translokation von plexA1 und NP-1, ebenfalls einem wichtigen Bestandteil der immunologischen Synapse, zur Kontaktfläche auf T-Zellseite gestört. Des Weiteren behindert eine MV-Infektion den plexA1/NP-1-Metabolismus in reifenden DC und führt zusätzlich zu einer frühen und starken Ausschüttung von SEMA3A durch DC, insbesondere in Gegenwart allogener T-Zellen. Durch rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen wurde gezeigt, dass SEMA3A einen transienten Verlust aktinbasierter Zellfortsätze bei T-Zellen zur Folge hat. Zusätzlich reduziert SEMA3A das chemotaktische Migrationsverhalten von DC und T Zell und die Frequenz ihrer Konjugat-Bildung. Zusammenfassend stellt sich die Situation so dar, dass MV die Semaphorinrezeptorfunktion zum einen dadurch beeinträchtigt, dass es die Rekrutierung der Rezeptoren zur IS verhindert und zum anderen zur verfrühten Ausschüttung des kollapsinduzierenden Liganden SEMA3A führt. Beide Phänomene könnten einen wichtigen Beitrag zur MV-induzierten Immunsuppression leisten.
N2  - Measles virus (MV) infection causes approximately 164,000 deaths per year worldwide (WHO, 2008). The main cause of death is MV-induced immunosuppression but the underlying mechanisms are not fully understood. It has been suggested that MV renders T cells dysfunctional by disrupting the integrity of actin dynamics while MV infection of dendritic cells results in their inability to sustain T cell activation. During neuronal development, semaphorins (SEMAs), especially SEMA3A, induce a collapse of growing dendrites via the binding to plexin-A1 (plexA1) and its coreceptor neuropilin-1 (NP-1). The collapse results from a disruption of actin dynamics. In this study, the roles of these three molecules were investigated in human immune cells and their possible role in MV induced immunosuppression. The present data have shown that plexA1 is an important component of human immunological synapse (IS). It translocated transiently to the surface of T cells after CD3/28 ligation and accumulated at the stimulatory interface between T cells and DCs (or CD3/28 coated beads). When plexA1 expression was inhibited (RNAi) or its function was disrupted (exogenous blocking or dominant negative expression), T cell expansion was reduced. Upon MV exposure, translocation of plexA1 and NP-1, another important component of IS, towards the stimulatory interface in T cells was abrogated. Moreover, MV infection interfered with plexA1/NP-1 turnover in maturing DCs and promoted early and substantial release of SEMA3A from these cells, particularly in the presence of allogenic T cells. As revealed by scanning electron microscopy, the release of SEMA3A caused a transient loss of actin-based protrusions on T cells. SEMA3A affected chemotactic migration of T cells and DCs, and reduced formation of allogenic DC/T cell conjugates. In conclusion, MV targeted SEMA receptor function both by disrupting their recruitment to the IS and by promoting a premature release of their repulsive ligand, SEMA3A. Both of which could contribute to MV-induced immunosuppression.
KW  - Masernvirus
KW  - Dendritische Zelle
KW  - Immunreaktion
KW  - Dendritic cells
KW  - Immunological synapse
KW  - Virology
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-53926
ER  - 
TY  - THES
A1  - Monzón Casanova, Elisa
T1  - Rat iNKT Cells: Phenotype and Function
T1  - Ratten iNKT Zellen: Phänotyp und Funktion
N2  - iNKT cells are a population of T cells with unique characteristics. In contrast to most αβ T cells which recognize peptides presented by highly polymorphic MHC molecules, iNKT cells are reactive to glycolipids presented by CD1d, a non-polymorphic MHC-I like molecule. Moreover, whereas MHC-restricted αβ T cells bear highly variable receptors (TCRs) formed after somatic recombination of the V(D)J gene segments, the TCR of iNKT cells is formed by an invariant α chain, which always contains the same gene segments: AV14 and AJ18; and a β chain of limited BV gene usage: BV8S2, BV7 or BV2, in the mouse. This invariant α chain is the reason for which these cells are named “i” and the NK part of their name refers to the expression of receptors typical of natural killer (NK) cells. iNKT cells recognize glycolipids of endogenous and microbial origin. After activation they secrete large amounts of very different cytokines such as IFN-γ and IL-4 and thus influence immune responses and pathological conditions. One of the most potent iNKT cell agonists, recognized by the semi-invariant TCR, is the synthetic glycolipid α-Galactosylceramide (α-Gal). iNKT cells can be visualized using CD1d-multimeric complexes loaded with α-Gal and flow cytometry, since this reagent has enough avidity to stain these cells. Interestingly, mouse iNKT cells can be stained with human α-Gal-loaded CD1d oligomers and human iNKT cells can also be visualized with mouse α-Gal-loaded CD1d oligomers, indicating a high degree of conservation of the recognition of α-Gal presented by CD1d through evolution. Previous studies showed that rats have the genes necessary to build semi-invariant TCRs: They have a CD1d homologue; one or two BV8S2 homologues and interestingly, up to ten AV14 gene segments, which are highly conserved when compared to the mouse genes. Importantly, it has been shown at least for two of these AV14 gene segments that they can produce invariant TCRα chains which, when coexpressed with BV8-containing β chains, react to α-Gal presented by rat CD1d. Furthermore, ex vivo stimulation of primary splenocytes with α-Gal results in the secretion of IL-4 and IFN-γ. Surprisingly, rat semi-invariant TCRs do not recognize α-Gal presented by mouse CD1d and accordingly, mouse α-Gal-loaded CD1d tetramers failed to stain a discrete population of rat iNKT cells. Taking all together, despite that strong evidence suggested that iNKT cells are present in the rat, the direct identification of such population and the analysis of CD1d-restricted immune responses were still pending for this species. Hence the work presented in this doctoral thesis was aimed to identify iNKT cells, to analyze their phenotype and also to study the distribution and function of CD1d in the rat. For these purposes, we produced essential reagents which were still lacking such as rat specific anti-CD1d monoclonal antibodies and rat CD1d oligomers. Importantly, two of three anti-rat CD1d monoclonal antibodies (all of them generated in our laboratory before this thesis was initiated) also recognized mouse CD1d and therefore allowed a direct comparison of CD1d expression between rat and mouse. Whereas CD1d distribution in the hematopoietic system was found to be extremely similar between these two species; in non-lymphatic tissues important differences were observed. Interestingly, CD1d protein was detected at not yet described sites such as the rat exocrine pancreas and rat and mouse Paneth cells. These monoclonal antibodies did not only allowed the analysis of CD1d expression, but also the first demonstration of the function of rat CD1d as an antigen presenting molecule, since cytokine release in response to α-Gal was blocked when they were added to ex vivo cultures of rat primary cells. Staining of primary rat iNKT cells (possible now with the newly generated rat CD1d oligomers) revealed interesting similarities with human iNKT cells. First, we observed that rat iNKT cells are only a minority among all NKR-P1A/B positive T cells. Human iNKT cells constitute also a very small proportion of NKR-P1A (CD161) expressing T cells, whereas in mice inbred strains which express NKR-P1C (NK1.1), most of NKRP1C expressing T cells are iNKT cells. Second, the majority of rat iNKT cells are either CD4 or DN and only a small proportion expresses CD8β. These findings are similar to humans and different to mice which lack CD8+ iNKT cells. Third, analysis of various inbred rat strains demonstrated different iNKT cell frequencies which correlated with cytokine secretion after α-Gal stimulation of primary cells. In comparison to mice, iNKT cell numbers are markedly reduced in rats. In F344 rats, inbred rat strain which released the highest cytokine amounts after α-Gal stimulation, approximately 0.25% and 0.1% of total liver and spleen lymphocytes, respectively, are iNKT cells. In contrast, in LEW rats iNKT cells were practically absent and neither IL-4 nor IFN-γ were detected after stimulation of primary cells with α-Gal. Once more, these frequencies are very close to those observed in humans. Last, as reported for human peripheral blood cells, rat iNKT cells could be easily expanded in vitro by adding α-Gal to cultures of intrahepatic lymphocytes, whereas the expansion of mouse iNKT cells was not possible using the same protocol. The presence of a multimember AV14 gene segment family in the rat is an intriguing characteristic. These AV14 gene segments are extremely homologous except in the CDR2α region. Based on the amino acid sequence of this region they have been divided into two different types: Type I and II. A specific tissue distribution of the different types was proposed in the first study where the presence of several AV14 gene segments was described. We also analyzed the AV14 gene segment usage in F344 and LEW inbred rat strains. In F344 rats we found no preferential usage of either AV14 gene segment type in the spleen and the liver but type II AV14 gene segments appeared more frequently in the thymus. In contrast, LEW rats show a preferential usage of type I AV14 gene segments in all three compartments analyzed: Thymus, spleen and liver. Taken all together, the usage of newly generated reagents allowed to gain novel insights into CD1d expression in the rat and in the mouse and to directly identify rat iNKT cells for the first time. The phenotypic and functional analysis of rat iNKT cells revealed numerous similarities with human iNKT cells. These are of special interest, since rats serve to investigate several pathological conditions including models for autoimmune diseases. The possibility now to analyze iNKT cells and CD1d-restricted T cell responses in the rat might help to understand the pathogenesis of such diseases. In addition, the uncomplicated in vitro expansion and culture of rat iNKT cells should facilitate the analysis of the immunomoldulatory capacities of these cells.
N2  - iNKT Zellen sind eine Population von T Zellen mit einigen Besonderheiten. Anders als die meisten αβ T Zellen, deren T Zell Rezeptoren (TZRs) für von hochpolymorphen MHC Molekülen präsentierte Peptide spezifisch sind, erkennen iNKT Zellen Glycolipide die von CD1d, einem nicht polymorphem MHC-I artigen Moleküle, präsentiert werden. Während MHC-restringierte αβ T Zellen sehr unterschiedliche TZRs haben, die nach somatischer Rekombination der V(D)J Gensegmente generiert werden, besteht der TZR der iNKT Zellen aus einer invarianten α Kette und einer β Kette mit einem limitierten BV Gen Repertoire (BV8S2, BV7 und BV2 in Maus). Die invariante α Kette, auf die das i im Namen der iNKT Zellen verweist, enthält in der Maus immer AV14 und AJ18 kodierte V-Regionen. Das NK in ihrem Namen verweist darauf, dass sie häufig NK-Zell typische Oberflächenmoleküle exprimieren. iNKT Zellen erkennen Glycolipide endogenen und mikrobiellen Ursprungs und sezernieren nach Aktivierung große Mengen verschiedener Zytokine wie zum Beispiel IL-4 und IFN-γ. Auf diese Weise beeinflussen sie Immunantwort und pathologische Zustände. Eine der potentesten iNKT-Zell-TZR Agonisten ist das α-Galactosylceramid (α-Gal) und α-Gal beladene CD1d-Multimere ermöglichen es iNKT Zellen zu färben und mittels Durchflusszytometrie sichtbar zu machen. Die hohe Konservierung der iNKT TZR-CD1d Interaktion ermöglicht es sogar, Maus iNKT Zellen mittels α-Gal beladenen humanen CD1d-Multimere zu färben. Vorhergehende Studien zeigten, dass Ratten die notwendigen Gene für die Generierung der semi-invarianten TZR haben: Sie besitzen ein CD1d Homolog, ein oder zwei BV8S2 Homologe und bis zu zehn AV14 Gensegmente, die im Vergleich zu den Maus-AV14 Genen hoch konserviert sind. Mehrere dieser AV14 Gensegmenten wurden mit AJ18 zusammen rearrangiert gefunden und für mindestens zwei dieser invarianten α Ketten wurde gezeigt, dass sie zusammen mit BV8 enthaltenden β Ketten TZR bilden, die von CD1d präsentiertes α-Gal erkennen. Weiterhin wurde gezeigt, dass primäre Ratten- Milzzellen und intrahepatische Lymphozyten nach Kultur mit α-Gal IL-4 und IFN-γ sezernieren. Auf Grund dieser Befunde und der starken Konservierung der CD1d Gene und der Gene, die die semi-invarianten TZR kodieren, überrascht es, dass keine definierte Zellpopulation von intrahepatischen Rattenlymphozyten mittels α-Gal beladenen Maus CD1d-Tetrameren gefärbt wurde. Zusammengefasst kann gesagt werden, dass die direkte Identifizierung der Zellen und die Analyse der CD1d restringierten Immunantworten in der Ratten noch austand, obwohl es starke Hinweise für die Existenz der iNKT Zellen in dieser Art gab. Infolgedessen sind die Ziele dieser Arbeit: die Identifizierung der Ratten iNKT Zellen, die Analyse ihres Phänotyps und die Untersuchung der CD1d-restringierten Immunantworten. Um diese Ziele zu erreichen, wurden noch fehlende essentielle Reagenzien hergestellt, wie die ersten Ratten-CD1d spezifischen monoklonalen Antikörper und Ratten CD1d Oligomere. Zwei der drei charakterisierten monoklonalen Antikörpern erkennen sowohl Ratten CD1d als auch Maus CD1d. Dies ermöglichte den direkten Vergleich der CD1d Expression zwischen beiden Spezies (diese Antikörper wurden in unserem Labor vor dem Anfang dieser Doktorarbeit hergestellt). Während die CD1d Verteilung im hämatopoetischen System beider Arten äußerst ähnlich ist, wurden in nicht lymphatischen Geweben sehr starke Unterschiede gefunden. Interessanterweise wurde das CD1d Protein auch an noch nicht beschriebenen Stellen wie im exokrinen Pankreas der Ratte und in Paneth Zellen von Maus und Ratte beobachtet. Die monoklonalen Antikörper erlaubten nicht nur die Analyse der CD1d Verteilung, sondern auch den Beweis der Funktion von CD1d als Antigen präsentierendes Molekül, weil die Zugabe der Antikörper zu ex vivo Kulturen von primären Zellen die Sekretion von Zytokinen bei der Stimulation mit α-Gal hemmt. Färbungen von primären Ratten iNKT Zellen, jetzt möglich durch die neu generierte Ratten CD1d-Dimere, zeigten interessante Gemeinsamkeiten mit humanen iNKT Zellen. Es wurde erstens beobachtet, dass Ratten iNKT Zellen nur eine Minderheit unter allen NKR-P1A/B positiven T Zellen sind. Dies ähnelt den humanen iNKT Zellen, die ebenfalls auch nur ein sehr kleinen Teil der NKR-P1A (CD161) exprimierenden T Zellen stellen, während in Mausstämmen, die NKR-P1C (NK1.1) exprimieren, die Mehrheit der NKR-P1C positiven T Zellen iNKT Zellen sind. Zweitens sind die meisten Ratten iNKT Zellen CD4 positiv oder doppelt negativ während nur ein kleiner Anteil CD8β exprimiert. Diese Befunde gleichen denen mit humanen iNKTs und unterscheiden sich von Maus iNKTs, die immer CD8β negativ sind. Drittens zeigt die Analyse von verschiedenen Rattenstämmen, ähnlich wie beim Menschen, 10-100 fach geringere Frequenzen von iNKT Zellen als in der Maus. In F344 Ratten sind etwa 0.25% aller Lymphozyten in der Leber und etwa 0.1% aller Milzzellen iNKT Zellen. Wobei dies der Rattenstamm ist, der die größte Mengen an Zytokinen nach α-Gal Stimulation produziert. In LEW Ratten, die keine Zytokine nach α-Gal Stimulation produzierten, konnten iNKT Zellen praktisch nicht gefärbt werden. Schließlich konnten, wie bei humanen peripherischen Blutzellen beobachtet, Ratten iNKT Zellen durch alleinige Zugabe von α-Gal in vitro expandiert werden, während dies mit Maus iNKT Zellen nicht möglich war. Eine faszinierende bislang nur in der Ratte gemachte Beobachtung ist die Existenz einer AV14 Multigenfamilie, deren Mitglieder bis auf die CDR2 kodierende Region hochhomolog sind. Basiert auf der Aminosäuresequenz dieser Region wurde diese Familie in zwei Gruppen aufgeteilt: Typ I und II. Die erste Studie, in der diese zwei verschiedenen Typen beschrieben wurden, schlug eine spezifische Gewebsverteilung von AV14 positiven TCR vor. Wir haben ebenfalls die Benutzung dieser AV14 Gene in F344 und LEW Inzuchtrattenstämmen analysiert und gefunden, dass es in F344 Leber und Milz keine Präferenz für einen bestimmten AV14 Typ gibt. Jedoch wurde der Typ II häufiger in F344 Thymus gefunden. Im Vergleich zeigen LEW Ratten eine bevorzugte Benutzung des Typ I in allen analysierten Geweben (Thymus, Milz und Leber). Zusammengefasst kann gesagt werden, dass diese Studie mit Hilfe neu generierter Reaganzien neue Erkenntnisse zur CD1d Expression in Ratte und Maus gewonnen wurden und erstmals eine direkte phänotypische und funktionelle Analyse von iNKT Zellen der Ratte durchgeführt wurde. Es wurden eine Reihe von Gemeinsamkeiten zwischen iNKT Zellen von Ratte und Mensch gefunden. Diese sind vor allem deshalb von Interesse, da das Versuchstier Ratte für eine Reihe von Autoimmunkrankheiten und andere pathologische Zustände als Modellorganismus dient. Es ist zu erwarten, dass weitere Untersuchungen von CD1d-restringierten Zellen der Ratte neue Einsichten in die Genese dieser Krankheiten ermöglicht. Darüberhinaus sollte die in der Ratte beobachtete einfach durchzuführende in vitro Kultur und Expansion von iNKT Zellen eine Analyse ihrer immunmodulatorischen Eigenschaften deutlich erleichtern.
KW  - Ratte
KW  - Natürliche Killerzelle
KW  - Immunologie
KW  - CD1d
KW  - rat
KW  - NKT
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-56526
ER  - 
TY  - THES
A1  - Matthes, Daniel
T1  - Molekulare Untersuchungen zum Gag-Protein der Foamyviren
T1  - Molecular analysis of the foamyviral Gag protein
N2  - Foamyviren (FV) weisen eine Reihe von Merkmalen auf, welche sie von Orthoretroviren unterscheidet, die sie jedoch gleichzeitig mit den Hepadnaviren teilen. Dies betrifft neben der Genomorganisation, der Proteinexpression sowie dem Replikationsverhalten auch die Partikelmorphogenese. Die zentrale Komponente in diesem Prozeß stellt das Gag-Protein dar. FV benötigen im Gegensatz zu Orthoretroviren und vergleichbar den Hepadnaviren die Koexpression des homologen Glykoproteins für den zellulären Partikelexport. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde mittels eines chimären Konstruktes aus den Gag-Proteinen von MPMV und PFV versucht, ein Env-interagierendes Motiv sowie die für die Interaktion mit dem Glykoprotein essentiellen As in PFV Gag zu identifizieren. Dabei wiesen die chimären Gag-Proteine Gemeinsamkeiten mit PFV Gag auf, wie eine perinukleäre Akkumulation, eine Vorraussetzung für das Assembly sowohl von PFV als auch MPMV. Desweiteren waren die Gag-Chimären für einen zellulären Export auf die Koexpression des homologen Glykoproteins angewiesen. Dies deutete auf die Integrität und Funktionalität des dafür notwendigen PFV Gag N-Terminus hin. Die chimären Gag-Moleküle multimerisierten jedoch nicht zu Kapsiden oder vergleichbaren partikulären Strukturen, vermutlich aufgrund massiver sterischer Zwänge infolge der Beteiligung heterologer Proteindomänen, weswegen sie kein geeignetes System zur funktionellen Analyse der PFV Gag-Env-Interaktion darstellten. Eine weitere Besonderheit foamyviraler Gag-Proteine ist ihr äußerst geringer Lysinanteil. Im Gegensatz zu den Gag-Proteinen der Orthoretroviren wird der überwiegende Anteil basischer Aminosäuren (As) durch Arginin vertreten. Da über 60 % der Arginin-spezifizierenden Kodons über eine Einzelmutation aus Lysin-Kodons hervorgegangen sein könnten, ist es wahrscheinlich, daß im Verlauf der foamyviralen Evolution eine positive Selektionierung von Gag-Mutanten mit einer Lysin-zu-Arginin-Substitution stattfand. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde anhand der Beispiele von PFV sowie FFV der Frage nachgegangen, welche Funktionen Arginine in foamyviralen Gag-Proteinen während der Replikation übernehmen. Dazu wurde in infektiösen PFV- sowie FFV-Klonen eine Reihe von Argininen gegen Lysine substituiert. Zusätzlich wurde das singuläre Lysin in PFV Gag gegen Arginin substituiert. Dabei konnte gezeigt werden, daß sämtliche PFV- sowie FFV-Mutanten replikationskompetent waren. Das singuläre Lysin in PFV Gag war für dessen Replikation in immortalisierten Zellen entbehrlich, in einer primären Zellinie wies die entsprechende Mutante jedoch eine stark eingeschränkte Replikationsfähigkeit auf. Eine PFV-Substitutionsmutante (M141) induzierte in transfizierten 293T-Zellkulturen einen CPE, ein Hinweis auf eine Beteiligung dieses Gag-Abschnittes an der Interaktion mit dem PFV Glykoprotein. Nach zehnmaliger Zellkultur-Passagierung der PFV Gag-Mutanten traten weder Revertanten noch Pseudorevertanten auf, was jedoch aufgrund der kurzen Zeitspanne des Experimentes nur eine begrenzte Aussagekraft bezüglich der genetischen Stabilität der Mutanten zuließ. Mittels der Applikation von AZT, eines Inhibitors der foamyviralen reversen Transkription, entweder auf die virusproduzierenden Zellen oder die zur Infektion verwendeten Zielzellen konnte gezeigt werden, daß sich die PFV Gag-Lysinmutanten hinsichtlich ihrer Replikationsstrategie nicht von WT-Viren unterscheiden und ihre genomische RNA größtenteils noch in der Produktionszelle revers transkribieren. Desweiteren konnte mittels quantitativer real-time PCR nachgewiesen werden, daß die PFV- und FFV-Mutanten wie für FV üblich sowohl DNA als auch RNA in ihre Partikel verpacken. Die infektiöse Natur foamyviraler genomischer DNA konnte bereits in früheren Veröffentlichungen gezeigt werden. Auch in dieser Arbeit konnte nach Transfektion von Zellen mit aufgereinigter Virionen-DNA und anschließendem Überstandtransfer ein CPE in den infizierten Indikatorzellen induziert werden, was die Produktion infektiöser Viruspartikel bewies. Die -Aminogruppe von Lysin fungiert als potentieller Ubiquitinakzeptor. Für das singuläre Lysin im WT Gag-Protein von PFV konnte wie in früheren Veröffentlichungen keine Ubiquitinierung festgestellt werden, im Gegensatz dazu wurde bei vier der fünf PFV Substitutionsmutanten eine Ubiquitinierung der neu eingeführten Lysine detektiert. Diese kovalente Modifikation hatte jedoch keinen Einfluß auf die Env-Restriktion des PFV-Kapsidexportes aus der Zelle. Für FFV konnte sowohl für den WT als auch die Substitutionsmutanten weder eine LP- noch eine Gag-Ubiquitinierung festgestellt werden. Als wahrscheinliche Ursache dafür kommen Unterschiede in den Komponenten der Ubiquitinierungsmaschinerie zwischen humanen Zellen und Katzenzellen in Frage, weshalb die Analyse einer möglichen Ubiquitinierung der neu in FFV Gag eingeführten Lysine in Katzenzellen als Produktionszellen durchgeführt werden sollte. Die Replikationsfähigkeit mehrerer Substitutionsmutanten der Gegenwart von IFN- und - war im Vergleich zum WT stark eingeschränkt. Dies deutete darauf hin, daß IFN-vermittelte Abwehrmechanismen eine Rolle während der positiven Selektion der Lysin-zu-Arginin-Substitutionsmutanten gespielt haben könnten. Die in dieser Arbeit erzielten Resultate zeigten, daß sich die PFV- sowie FFV-Lysinmutanten in ihrem Replikationsverhalten nicht von WT-Viren unterscheiden. Im Kontext einer über Millionen von Jahren andauernden Wirts-Erreger-Koevolution stellt jedoch der durch zelluläre Restriktionsfaktoren vermittelte Selektionsdruck auf das Virus einen wichtigen Aspekt dar. Demnach könnte die Substitution von Lysin gegen Arginin beispielsweise über eine veränderte kovalente Modifikation eine Interaktion mit antiretroviralen Restriktionsfaktoren der Wirtszelle modifiziert oder inhibiert haben, wodurch diese Mutanten im Verlauf der foamyviralen Evolution positiv selektioniert wurden.
N2  - Foamyviruses (FV) harbour several features which distinguishes them from orthoretroviruses and which they share with the hepadnaviruses. Beside differences in the genomic organization, the protein expression and the replication strategy this referrs to the morphogenesis of viral particles, in which the Gag protein plays the key role. In contrast to orthoretroviruses and like hepadnaviruses, cellular egress of FV capsids depends on the presence of cognate Env protein. In the first part of this work it was tried to identify an Env-interacting motif as well as essential amino acids (aa) involved in the recognition of the glycoprotein in PFV Gag. Therefore a chimeric construct containing parts of the Gag proteins of Mason-Pfizer monkey virus (MPMV) and PFV was constructed. Like PFV Gag, the chimeric Gag proteins showed a perinuclear accumulation, a feature of PFV and MPMV assembly. Additionally, cellular export of the Gag chimerics was PFV Env restricted. This pointed to the integrity and functionality of the PFV Gag N-terminus in the chimeric construct. Nevertheless, chimeric Gag molekules didn´t multimerize to capsids or comparable particle structures. This was probably caused by massive sterical disorders, due to the involvement of heterologous protein domains. Therefore, the Gag chimerics didn´t represent an appropriate system for the functional analysis of the PFV Gag-Env interaction. Another peculiarity of foamyviral Gag proteins is their extremely low lysine content. In contrast to orthoretroviral Gag proteins, the main part of basic aa is represented by arginines. Due to the fact that more than 60 % of the arginine-specifying codons could have evolved out of lysine-specifying codons over a single point mutation, a positive selection of Gag mutants with a lysine-to-arginine substitution in the course of foamyviral evolution is likely. In the second part of this work, functions of arginines in foamyviral Gag proteins during replication were studied by using infectious molecular clones of PFV and FFV. Therefore several arginines were substituted for lysines. Additionally the single lysine in PFV Gag (K396) was mutated to arginine. All PFV as well as FFV mutants were replication-competent. Additionally, the single lysine in PFV Gag was non-essential for replication in immortalized cell culture, whereas replication was strongly inhibited in a primary cell line. One PFV substitution mutant (M141) induced an CPE in transfected 293T-cell culture, an indication of an involvement of this part of Gag in the interaction with the PFV glycoprotein. Upon ten cell-free passages of PFV Gag mutants in cell culture, neither revertants nor pseudorevertants appeared, indicating genetic stability during a short-term cell culture experiment. By application of AZT, an inhibitor of the foamyviral reverse transcription, on producer cells or target cells it was shown that the reverse transcription of the genomic RNA of the PFV Gag lysine mutants occured mainly in the producer cell and that they therefore didnt differ from wild-type (wt) virus with respect to replication strategy. By quantitative real-time PCR it was shown that PFV and FFV mutants incorporate DNA as well as RNA in particles. Like in recent publications, the infectiousness of foamyviral genomic DNA could be demonstrated in this work. By transfecting cells with extracted virion DNA and following supernatant transfer a CPE could be induced in the infected target cells, showing the production of infectious virus. The -aminogroup of lysine functions as a potential ubiquitin acceptor. Like in recent publications, no ubiquitination of the single lysine in PFV wt Gag could be detected. In contrast, four out of five PFV substitution mutants showed ubiquitination of the introduced lysines. Nevertheless, Gag mutants with this covalent modification didn´t have the ability to generate virus like particles (VLPs) or to be pseudotyped by heterologous Env. For FFV wt and mutants, neither Env leader peptide nor Gag ubiquitination could be detected. Differences in components of the ubiquitinination machinery between human cells and feline cells are a probable reason for this. Therefore the analysis of ubiquitiniation of the newly introduced lysines in FFV Gag should be carried out in feline cells as producer cells. Replication of several substitution mutants was strongly inhibited compared to wt virus in the presence of IFN- and -. These results indicated that IFN mediated defense mechanisms could have played a role in the positive selection of the lysine-to-arginine substitution mutants. These results show that the PFV and FFV mutants didn´t differ from wt viruses with respect to their replication strategy. In the context of the long-term host-pathogen coevolution the selection pressure on the virus mediated by cellular restriction factors represents an important aspect dar. The mutation from lysines to arginines implying an altered covalent modification of Gag could have lead to an modification or inhibition of the interaction with antiretroviral restriction factors of the host cell, leading to a positive selection of these mutants during foamyviral evolution.
KW  - Spumaviren
KW  - Gag-Proteine
KW  - Spumaviruses
KW  - Gag protein
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-52162
ER  - 
TY  - THES
A1  - Brandl, Carolin
T1  - Molekulare Mechanismen und zelluläre Kooperationen tolerogener Dendritischer Zellen bei der Experimentellen Autoimmun-Enzephalomyelitis
T1  - Molecular mechanism and cellular cooperations of tolerogenic dendritic cells in the experimental autoimmune enzephalomyelitis
N2  - Aus Vorarbeiten in der Arbeitsgruppe war bekannt, dass Mäuse durch Injektion von tolerogenen, TNF-gereiften und MOG-beladenen DZ vor EAE geschützt werden können. Eines der Ziele dieser Arbeit war es zu untersuchen, ob das koinhibitorische Molekül B7-H1 auf der Oberfläche der DZ einen Einfluss auf das tolerogene Potential der DZ hat. Dazu wurden B7-H1-defiziente DZ generiert, mit TNF gereift, mit MOG-Peptid beladen und intravenös in Mäuse injiziert, bevor die EAE induziert wurde. Es zeigte sich, dass diese DZ die Tiere sogar noch besser vor der Krankheit schützen konnten als die WT DZ. Die Injektion der B7-H1-/- DZ bewirkte eine verstärkte Produktion von IL-10 and IL-13 nach Restimulation der Milz-Zellen in vitro und eine erhöhte Menge von protektiven Serum-Zytokinen (IL-4 und IL-13), welche von NKT-Zellen produziert wurden. Versuche mit CD1d-/- und J&#945;281-/- Mäusen haben ergeben, dass diese Zytokine von Typ II NKT-Zellen produziert wurden. Weitere Versuche mit Typ I und II NKT-Zell-Linien haben bestätigt, dass nur die Typ II NKT-Zellen von einem endogenen CD1d-Ligand der DZ stimuliert werden können. Außerdem wird dies über B7-H1 reguliert, da die NKT-Zell-Reaktion in Abwesenheit von B7-H1 stärker ist. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass neben den NKT-Zellen MZ B-Zellen nötig sind, um die Mäuse vor der EAE-Entwicklung zu schützen. Versuche mit CD22-/- Mäusen, welche eine Reduktion in der MZ B-Zell-Population zeigen, haben ergeben, dass in Abwesenheit von MZ B-Zellen keine EAE-Protektion mehr möglich ist. In dieser Arbeit wurde auch der Effekt von Glykolipid-Antigenen, welche einen Großteil der Myelinscheide des ZNS ausmachen, auf DZ untersucht. Ausgewählte Lipide führen zu einer Reifung der DZ, welche sich in der verstärkten MHC II- und CD86-Expression, jedoch nicht in der Produktion von Zytokinen äußert. Außerdem sind diese Lipid-gereiften DZ in der Lage T-Zellen zu stimulieren. Als letzter Punkt wurde in dieser Arbeit der Zusammenhang zwischen Masern-Virus-Infektionen und EAE untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass eine cerebrale Masern-Infektion zusammen mit einer EAE-Induktion einen dramatischen Effekt auf die Tiere hat. Für diese Versuche wurde ein Maus-Modell einer persistierenden Masern-Infektion im Gehirn verwendet. Diese Tiere leben nach der Virus-Behandlung ohne Symptome. Nach der EAE-Induktion starben diese Tiere jedoch bereits wenige Tage später aufgrund einer MOG-Peptid-spezifischen Reaktion.
N2  - From previous studies in our group it was known that tolerogenic, TNF-matured and MOG-loaded DC could protect mice from developing EAE. One issue of this thesis was to investigate the effect of the co-inhibitory molecule B7-H1 on the tolerogenic potential of the DC. Therefore B7-H1-deficient DC were generated, matured with TNF, loaded with MOG peptide and injected intravenously before inducing EAE. It could be shown that the B7-H1-/- DC were even better in protecting mice from EAE. The injection of B7-H1-/- DC induced an increased production of IL-10 and IL-13 after restimulation of splenic cells in vitro and an increased amount of the protective serum-cytokines (IL-4 and IL-13) which were produced by NKT cells. Experiments with CD1d-/- and J&#945;281-/- mice showed that these cytokines were produced by Type II NKT cells. Futher experiments with Type I and II NKT cell lines confirmed that only Type II NKT cells could be stimulated by an endogenous CD1d-Ligand on the DC. Futhermore this mechanism is regulated by B7-H1 because the NKT cell reaction is stronger in the absence of B7-H1. This study also showed that besides the NKT cells the MZ B cells are necessary to protect mice from EAE. Experiments with CD22-/- mice which have a reduction in MZ B cells showed that EAE protection in the absence of MZ B cells is not possible. Another issue of this work was to study the effect of glycolipid antigens on DC. These lipids are a major part of the myelin sheath of the CNS. Some lipids induce DC maturation which is indicated by an increased MHC II and CD86 expression but not by cytokine production. Futhermore these lipid-matured DC are able to stimulate T cells. The last point of this study was to investigate the connection between measles virus infections and EAE. It could be shown that a cerebral measles infection together with EAE has an dramatic effect on the mice. For these experiments the mouse model of an persistant measles infection in the brain was used. These animals live without symptoms after treatment with the virus alone but after EAE induction these mice died rapidly because of an MOG specific reaction.
KW  - Encephalomyelitis
KW  - Dendritische Zelle
KW  - Immuntoleranz
KW  - Autoimmunität
KW  - dendritic cell
KW  - tolerance
KW  - autoimmunity
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-49380
ER  - 
TY  - THES
A1  - Schneiderbanger, Daniel
T1  - Molekulare Epidemiologie des Respiratory Syncytial Virus bei Kindern mit Atemwegsinfektionen im Zeitraum von 2002 bis 2006
T1  - Molecular epidemiology of respiratory syncytial virus infections in chidren between 2002 and 2006
N2  - Hintergrund: Infektionen mit dem Respiratory Syncytial Virus (RSV) sind die häufigste virale Ursache für respiratorische Erkrankungen bei Säuglingen und Kleinkindern. Reinfektionen treten lebenslang auf. Es wurden zwei Typen (A und B) und mehrere Genotypen beschrieben. Die vorliegenden Daten über die molekulare Epidemiologie von RSV in Deutschland sind nur begrenzt. Material und Methoden: Zwischen Januar 2002 und Juli 2006 wurden 221 Nasenrachensekrete (NRS) von Kindern, welche in der Universitätskinderklinik Würzburg behandelt wurden, durch Routine-Untersuchung mit einem Immunfluoreszenztest auf RSV-Antigen positiv befunden. Die phylogenetische Analyse wurde aus Restmaterial von 211 NRS durchgeführt, indem die zweite variable Region des G-Gens amplifiziert und sequenziert wurde. Ergebnisse: Insgesamt war die Prävalenz von Typ A-Viren mit 69,5 % größer als die der Typ B-Viren mit 30,5 %. RSV Typ A war das dominierende Virus in allen Saisons außer in der Saison 2002-2003. Über den gesamten Beobachtungszeitraum traten drei A-Genotypen (GA2, GA5 und GA7) und vier B-Genotypen (GB3, SAB3, BA und ein neuer Genotyp) auf. Die Genotypen GA2, GA5, SAB3 und BA waren am häufigsten im Umlauf und in beinahe allen Saisons prävalent. Unter den B-Genotypen nahm der Anteil des Genotyps BA von 25 % (2002) auf 92 % (2005-2006) zu. Drei Typ B-Sequenzen wurden einem neuen Genotyp zugeordnet, welcher BWUE benannt wurde. Es wurde eine Reinfektion mit demselben Genotyp (GA5) bei einem Kind beobachtet, welches im Alter von 12 und 28 Monaten mit einer RSV-Infektion hospitalisiert war. Schlußfolgerung: Die Ergebnisse unserer Studie stehen in Einklang mit der molekularen Epidemiologie von RSV in anderen geographischen Regionen. Wir beobachteten sowohl Genotypen, welche über mehrere Saisons prävalent waren, als auch Genotypen, welche über den beobachteten Zeitraum zunehmend dominanter werdend andere Genotypen verdrängten. Zudem wurde ein neuer B-Genotyp entdeckt.
N2  - Title: Molecular epidemiology of respiratory syncytial virus infections in Underfranconia between 2002 and 2006 Background: The respiratory syncytial virus (RSV) es the most common viral cause of respiratory infections in infants and children. Reinfections occur lifelong. Two RSV subtypes (A and B) and several genotypes have been described. The available data on the molecular epidemiology of RSV in Germany are only limited. Material and methods: Between January 2002 and July 2006, 211 respiratory samples of infants and children treated in the Children’s Hospital of the University Würzburg were found to be positive for RSV antigen by routine testing with immunofluorescensce assays. Phylogenetic analysis was performed on 211 of these samples by amplification and sequencing of the second variable region of the RSV G gene. Results: The type distribution of the 211 RSV positive samples was 69,5 % type A and 30,5 % type B. RSV type A was the predominating virus in all seasons except for the winter season 2002/03. Over the whole observation period, three different A-genotypes (GA2, GA5, GA7) and four different B-genotypes (GB3, SAB3, BA and novel genotype) were detected. The RSV genotypes GA2, GA5, SAB3 and BA were most frequently found and were prevalent in almost all seasons. Among the B-genotypes, the proportion of the genotype BA increased from 25 % in 2002 to 91 % in 2005/06. Three type B sequences were assigned to a novel genotype, which was tentatively named BWUE. One reinfection with the same genotype (GA5) was observed in a child who was hospitalised with RSV infection at the age of 12 and 28 months. Conclusion: The results of our study are in agreement with the molecular epidemiology of RSV in other geographical regions. We observed both genotype persistence and genotype shifting during the observation period. In addition, we detected a novel B genotype.
KW  - RSV
KW  - molekulare Epidemiologie
KW  - RSV
KW  - molecular epidemiology
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-51984
ER  - 
TY  - THES
A1  - Li, Jian-Qiang
T1  - Modulating the expression of enzymes of isoprenoid synthesis: effects on Vgamma9Vdelta2 T cell activation and tumor cell growth
T1  - Modulation der Expression von Enzymen der Isoprenoidsynthese: Effekte auf die Vgamma9Vdelta2 T Zellaktivierung und das Tumorzellwachstum
N2  - This study focuses on phosphoantigen specific Vg9Vd2 T cells which only exist in human and non-human primates. This population accounts for 1%-5% of peripheral blood T-lymphocytes but their frequency can rise to 50% of total blood T cells upon infection. Vg9Vd2 T cells can be activated by nonpeptide compounds with critical phosphate moieties which are termed as phosphoantigens. These include isopentenyl pyrophosphate (IPP), a key compound of isoprenoid synthesis in all organisms, and (E)-4-Hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate (HMBPP), a direct precursor of IPP in DOXP pathway which only exist in eubacteria, plants, apicomplexaen parasites. Its activity as phosphoantigen is at least 1000 fold higher than that of IPP. However, direct structural evidence of phosphoantigen binding to the TCR is missing so far. Moreover, Vg9Vd2 T cells have potent anti-tumor activity e.g. against the B-cell lymphoma Daudi, whose Vg9Vd2 T cell activating properties have been suggested to result from sensing of abnormal intracellular IPP levels by the Vg9Vd2 TCR or Vg9Vd2 TCR binding to other postulated ligands such as an ectopically expressed F1-ATPase or UL-16 binding protein 4 (ULBP4). Aminobisphosphonates and alkymines were hypothesized to activate Vg9Vd2 T cells indirectly by inhibiting the IPP consuming enzyme farnysyl pyrophosphates synthesis (FPPS) although off target effects of these drugs or a direct interaction with the Vg9Vd2 TCR could not be excluded. This thesis presents new approaches for the mechanistic analysis of Vg9Vd2 T cell activation. By employing retroviral transduction of FPPS specific shRNA, it shows that specific shRNA reduces expression of FPPS and is sufficient to convert hematopoietic and non-hematopoietic tumor cell lines into Vg9Vd2 T cell activators. FPPS knockdown cells activated Vg9Vd2 T cells as measured by increased levels of CD69 and CD107a, kill of FPPS knockdown cells and induction of IFN-&#947; secretion. The IPP-synthesis-inhibiting drug mevastatin reduced Vg9Vd2 T cell activation by FPPS knockdown cells or aminobisphosphonate treated cells but not activation by the phosphoantigen bromohydrin pyrophosphate (BrHPP). A reduced growth of the FPPS knockdown cells has not been observed which is different to what has been reported for aminobisphosphonate treated cells. Finally, the human B-cell lymphoma RAJI has been transduced with Tetracyclin-inducible FPPS specific shRNA and proven to gain and loose the capacity to activate Vg9Vd2 TCR transductants upon doxycylin provision or removal. Another approach for the analysis of Vg9Vd2 T cell activation is Vg9Vd2 TCR transduced mouse cell lines with specificity for phosphoantigens. In contrast to the previously used Vg9Vd2 TCR transduced Jurkat cells, these cells do not present phosphoantigens, and are therefore specially suited for analysis of phosphoantigen presentation. The response of the new TCR transductants to presumed Vg9Vd2 TCR ligands/activators such as phosphoantigens, aminobisphosphonates or FPPS knockdown cells, depended strongly on the expression of a rat/mouse CD28 molecule by the transductants and its ligation by the (CD80) counter receptor on the ligand-presenting cell. The response is likely to reflect recognition of cognate Vg9Vd2 TCR antigens since mutations in the TCR-&#948; chain CDR2 and 3 abolished this response but activation by TCR or CD3 specific antibodies. A major difference between TCR transductants and primary gd T cells, was the lacking response of TCR transductants to Daudi or IPP. In addition their sensitivity to other soluble phosphoantigens was about 100 fold weaker than that of primary cells, stimulation of both cell type to CD80 expressing FPPS knock down or aminobisphosphonates was similar. Finally, the transductants have also been used to analyze effects of over-expression or knockdown of enzymes of isoprenoid synthesis such as 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA reductase (HMG-CoA reductase or HMGR), mevalonate-5-pyrophosphate decarboxylase (MVD), isopentenyl pyrophosphate isomerase (IDI), geranyl-geranyl pyrophosphate synthase (GGPPS) but no clear effects have been found. In conclusion, this thesis supports the concept of Vg9Vd2 T cells being sensors of a dysregulated isoprenoid metabolism and established new tools to study ligand recognition and TCR mediated activation of this T cell population. These tools will be most useful to address following questions: 1) How does the dysregulation of isoprenoid metabolism affect tumor growth? 2) What is the correlation between the modulation of IPP levels and the Vg9Vd2 TCR binding or expression of other postulated ligands? 3) Are there any mevalonate pathway enzymes other than FPPS and HMGR, which play an important role in Vg9Vd2 T cells activation? 4) What is/are the putative phosphoantigen-presenting molecule(s)?
N2  - Die vorliegende Arbeit widmet sich den phosphoantigenspezifischen Vg9Vd2 T Zellen, die nur im Menschen und nicht-humanen Primaten zu finden ist. Diese Population stellt 1-5% der peripheren Blut T-Zellen aber ihre Frequenz kann bei Infektionen auf bis zu 50% steigen. Vg9Vd2 T Zellen können durch nicht Peptid-Moleküle aktiviert werden, die sich durch eine essentielle Phosphatkomponente auszeichnen. Hierzu gehören das Isopentenyl-pyrophosphat (IPP), ein Schlüsselmolekül der Isoprenoidsynthese aller Organismen, sowie das bezüglich seiner gd T zellaktivierenden Eigenschaften mehr als 1000fach stärkere (E)-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl-pyrophosphat (HMBPP), dass der direkte Vorläufer des IPP im DOXP Stoffwechselweg ist, der nur bei Eubakterien, Pflanzen und apikomplexen Bakterien zu finden ist. Direkte strukturelle Belege für die Bindung von Phosphoantigenen an den gd TCR stehen jedoch aus. Darüber hinaus besitzen Vg9Vd2 T Zellen eine direkte gegen Tumoren wie das B-Zelllymphom Daudi gerichtete Aktivität, für deren Erklärung ein „Erspüren“ eines abnormal erhöhten intrazellulären IPP Spiegels durch den Vg9Vd2 TCR oder Bindung des Vg9Vd2 TCR an Liganden, wie einer ectopisch exprimierten F1-ATPase oder des UL-16 bindenden Proteins 4 (ULBP4) herangezogen wurde. Die Vg9Vd2 T Zell Aktivierung durch Aminobisphosphonate und Alkylamine wurde hingegen auf die Inhibition des IPP verbrauchenden Enzyms Farnesylpyrophosphatsynthase (FPPS) zurückgeführt, obgleich Wirkungen auf andere Moleküle oder eine direkte Bindung an den TCR nicht ausgeschlossen werden konnten. Die vorgelegte Dissertationsschrift beschreibt neue Ansätze der Analyse der Mechanismen der Vg9Vd2 T Zell Aktivierung. Sie zeigt, dass eine mittels retroviraler Transduktion von shRNA erzielte Reduktion der FPPS Expression ausreicht, um hematopoietische und nicht-hematopoietische Tumorzellen zu Vg9Vd2 T Zellaktivatoren zu machen. Die FPPS knockdown zellvermittelte Aktivierung der Vg9Vd2 T Zellen zeigte sich in erhöhter Expression von CD69, CD107a, Zytotoxizität gegen FPPS knockdown Zellen und Induktion der IFNg Sekretion. Die, die IPP-Synthese inhibierende Substanz Mevastatin, reduzierte die Vg9Vd2 T Zellaktivierung durch FPPS knockdown Zellen oder Aminobisphosphonat behandelte Zellen, aber nicht die Aktivierung durch das Phosphoantigen Bromhydrin Pyrophosphat. Ein vermindertes Wachstum der FPPS knockdown Zellen wurde nicht nachgewiesen was im Gegensatz zur Literatur über Aminobisphosphonat behandelte Zellen steht. Weiterhin wurde ein Tetracyclin-induzierbares FPPS spezifische shRNA kodierendes lentivirales Konstrukt in humane B-Zelllymphom Raji Zellen transduziert, die anschließlich die durch Zugabe bzw. Entfernung von doxycyclin gesteuerte Fähigkeit erhielten, Vg9Vd2 T Zellen zu aktivieren. Ein anderer Ansatz zur Analyse der Vg9Vd2 T-zellvermittelten Aktivierung war die Entwicklung phosphoantigenspezifischer Vg9Vd2 TCR transduzierter Mauszelllinien. Diese Zellen unterscheiden sich von den bisher benutzten humanen Vg9Vd2 TCR transduzierten Jurkat Zellen dadurch, dass sie keine Phosphoantigene präsentieren, und sind daher für Analyse der Phosphoantigenpräsentation besonders geeignet. Die Antwort der neuen TCR Transduktanten auf wahrscheinliche Vg9Vd2 TCR Zellliganden bzw. Vg9Vd2 T-Zellaktivatoren wie Phosphoantigene, Aminobisphosphonate oder FPPS knockdown Zellen hing im hohen Maße von der Expression eines Ratten/Maus CD28 Moleküls auf den Transduktanten und dessen Bindung an den (CD80) Gegenrezeptor auf der antigenpräsentierenden Zelle ab. Höchstwahrscheinlich reflektiert die Antwort auf eine spezifische Antigenerkennung, da Mutationen in den CDR2 und 3 der TCRd Kette die Antwort verschwinden ließen, aber keine Effekte auf die Stimulation durch CD3 oder TCR spezifische Antikörper hatten. Ein gravierender Unterschied der TCR-Transduktanten zu primären gd T Zellen lag auch darin, dass die TCR Transduktanten weder durch Daudi Zellen noch durch IPP stimuliert wurden und ihre Empfindlichkeit gegenüber löslichen Phosphoantigenen ungefähr 1000fach geringer als bei primären Vg9Vd2 T-Zellen war, während sich die Antwort der beiden Zelltypen auf FPPS knockdown oder Aminobisphosphonate-behandelte Zellen ähnelten. Schließlich wurden die Transduktanten verwendet, um Effekte der Überexpression oder des knockdown von Enzymen der Isoprenoidsynthese wie 3-Hydroxy-3-Methyl-Glutaryl-CoA reductase (HMG-CoA reduktase or HMGR), Mevalonat-5-Pyrophosphat decarboxylase (MVD), Isopentenyl Pyrophosphat Isomerase (IDI), Geranylgeranyl Pyrophosphate Synthase (GGPPS) zu analysieren, wobei keine eindeutigen Effekte beobachtet wurden. Zusammengefasst kann gesagt werden, dass die vorgelegte Arbeit die Vorstellung von Vg9Vd2 TCR Zellen als Sensoren eines entgleisten Isoprenoidstoffwechsel unterstützt und neue Werkzeuge zur Analyse der Ligandenerkennung und TCR vermittelten Aktivierung dieser Zellpopulation vorstellt. Diese Werkzeuge sollten bei der Beantwortung folgender Fragen helfen: 1) Wie beeinflusst die Fehlregulation des Isoprenoidstoffwechesle das Tumorwachstum. 2) Welche Korrelation besteht zwischen der Modulation der IPP Spiegel und der Vg9Vd2 TCR vermittelten Aktivierung bzw. der Expression anderer vorgeschlagener Vg9Vd2 Liganden. 3) Gibt es Enzyme außer der FPPS und der HMG-CoA Reduktase, die eine wichtige Rolle bei der Vg9Vd2 T-Zellaktivierung spielen und schließlich 4) Welche(s) Molekül(e) präsentiert bzw. präsentieren Phosphoantigene ?
KW  - Primaten
KW  - T-Lymphozyt
KW  - Tumorwachstum
KW  - Isoprenoide
KW  - Synthese
KW  - Vg9Vd2 T Zellaktivierung
KW  - Isoprenoidsynthese
KW  - Farnesylpyrophosphatsynthase (FPPS)
KW  - Aminobisphosphonat
KW  - Isopentenyl-pyrophosphat (IPP)
KW  - Vg9Vd2 T cell
KW  - Isoprenoid Synthesis
KW  - Farnesyl Pyrophosphate Synthase
KW  - Aminobisphosphonate
KW  - Isopentenyl pyrophosphate (IPP)
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-46388
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Neske, Florian
A1  - Prifert, Christiane
A1  - Scheiner, Barbara
A1  - Ewald, Moritz
A1  - Schubert, Joerg
A1  - Opitz, Andreas
A1  - Weissbrich, Benedikt
T1  - High prevalence of antibodies against polyomavirus WU, polyomavirus KI, and human bocavirus in German blood donors
N2  - Background: DNA of the polyomaviruses WU (WUPyV) and KI (KIPyV) and of human bocavirus (HBoV) has been detected with varying frequency in respiratory tract samples of children. However, only little is known about the humoral immune response against these viruses. Our aim was to establish virus-specific serological assays and to determine the prevalence of immunoglobulin G (IgG) against these three viruses in the general population. Methods: The capsid proteins VP1 of WUPyV and KIPyV and VP2 of HBoV were cloned into baculovirus vectors and expressed in Sf9 insect cells. IgG antibodies against WUPyV VP1, KIPyV VP1, and HBoV VP2 were determined by immunofluorescence assays in 100 plasma samples of blood donors. Results: The median age of the blood donors was 31 years (range 20 - 66 yrs), 52% were male. 89% of the samples were positive for WUPyV IgG (median age 31 yrs, 49.4% male), 67% were positive for KIPyV IgG (median age 32 yrs, 46.3% male), and 76% were positive for HBoV IgG (median age 32 yrs, 51.3% male). For WUPyV and HBoV, there were no significant differences of the seropositivity rates with respect to age groups or gender. For KIPyV, the seropositivity rate increased significantly from 59% in the age group 20 - 29 years to 100% in the agegroup > 50 years. Conclusions: High prevalences of antibodies against WUPyV, KIPyV, and HBoV were found in plasma samples of healthy adults. The results indicate that primary infection with these viruses occurs during childhood or youth. For KIPyV, the seropositivity appears to increase further during adulthood.
KW  - Polyoma-Virus
KW  - polyomaviruses
KW  - human bocavirus
KW  - respiratory tract
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-67941
ER  - 
TY  - THES
A1  - Hummel, Horst-Dieter
T1  - Herstellung und Evaluation genetisch veränderter Masernviren zur spezifischen Infektion und Elimination primärer maligner Plasmazellen
T1  - Genetically engineered attenuated measles virus specifically infects and kills primary multiple myeloma cells
N2  - Das Multiple Myelom ist trotz deutlicher Fortschritte in der Therapie meist eine unheilbare Erkrankung, so dass der Erforschung neuer therapeutischer Optionen mit dem Ziel, eine möglichst langfristige krankheitsfreie Zeit für den betroffenen Patienten zu erreichen, eine wichtige Bedeutung zukommt. Hierbei erweist sich der Ansatz, maligne Plasmazellen spezifisch mit onkolytischen Viren zu infizieren und zu eliminieren, als zunehmend vielversprechend. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein neues rekombinantes Masernvirus kloniert, das selektiv primäre MM-Zellen infiziert und abtötet. Diese Fähigkeit basiert auf der Verwendung eines mutierten H-Proteins, das nicht mehr mit den natürlichen Rezeptoren CD46 oder CD150 interagiert und das zusätzlich mit einem single chain Antikörper (scFvWue) verknüpft ist, der MM-Zellen spezifisch bindet. Unter Verwendung eines etablierten Rescuesystems aus cDNA konnten in vitro replikationskompetente Virionen von MV-Wue erstellt werden. Diese vorgenommenen Veränderungen beeinflussten die Fähigkeit zur effizienten Replikation und Produktion infektiöser Viren in vitro nicht. Zur funktionellen Testung des neuen rekombinanten Virus MV-Wue wurde die Spezifität des Virus für primäre maligne Plasmazellen in Infektionsexperimenten gezeigt sowie der Mechanismus der Ablation als Apoptose definiert.
N2  - The applicability of cytoreductive treatment of malignant diseases using recombinant viruses strongly depends on specific recognition of surface receptors to target exclusively neoplastic cells. A recently generated monoclonal antibody (mAb), Wue-1, specifically detects CD138(+) multiple myeloma (MM) cells. In this study, a haemagglutinin (H) protein that was receptor-blinded (i.e. did not bind to CD46 and CD150) was genetically re-engineered by fusing it to a single-chain antibody fragment (scFv) derived from the Wue-1 mAb open reading frame (scFv-Wue), resulting in the recombinant retargeted measles virus (MV)-Wue. MV-Wue efficiently targeted and fully replicated in primary MM cells, reaching titres similar to those seen with non-retargeted viruses. In agreement with its altered receptor specificity, infection of target cells was no longer dependent on CD150 or CD46, but was restricted to cells that had been labelled with Wue-1 mAb. Importantly, infection with MV-Wue rapidly induced apoptosis in CD138(+) malignant plasma cell targets. MV-Wue is the first fully retargeted MV using the restricted interaction between Wue-1 mAb and primary MM cells specifically to infect, replicate in and deplete malignant plasma cells.
KW  - Multiples Myelom
KW  - Masernvirus
KW  - retardeted virus
KW  - Wue-1
KW  - multiple myeloma
KW  - retargeted measles virus
KW  - Wue-1
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-51393
ER  - 
TY  - THES
A1  - Reichert, Verena
T1  - Frequenz, Funktion und Phänotyp regulatorischer T-Zellen bei Kindern mit schwerer atopischer Dermatitis
T1  - Frequency, function and phenotype of regulatory T-cells in children with severe atopic dermatitis
N2  - Die Wichtigkeit regulatorischer T-Zellen bei der Immunregulation und der Entwicklung der immunologischen Toleranz ist unumstritten. Deshalb wird ihnen eine bedeutende Rolle bei der Pathogenese von Autoimmunerkrankungen und allergischen Erkrankungen zugeschrieben. Bei allgemein steigender Prävalenz allergischer Erkrankungen bleiben verfügbare Therapieoptionen derzeit auf symptomatische Regime begrenzt. Dies ist nicht zuletzt auf die unklare Genese dieser Erkrankungen zurückzuführen. Bei der AD handelt es sich um eine chronisch-entzündliche Hauterkrankung, die im Säuglingsalter beginnt und durch sehr starken Juckreiz gekennzeichnet ist. Um der AD zugrundeliegenden Mechanismen zumindest teilweise zu durchleuchten, wurden in der vorliegenden Arbeit Frequenz, Funktion und Phänotyp der regulatorischen T-Zellen von Kindern zwischen drei und 16 Jahren, die an der schwersten Form der AD leiden, unter Anwendung spezieller Färbemethoden und eines Suppressionsassay mit Hilfe der Durchflusszytometrie untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass eine erhöhte Anzahl regulatorischer T-Zellen bei den Kindern mit AD gegenüber dem gesunden Kontrollkollektiv vorhanden war. Diese wiesen allerdings eine deutlich verminderte Suppressorfunktion auf. Die Analyse der Oberflächenmerkmale CD45RO und CD45RA zeigte, dass der Anteil CD25hi in der Population CD45RO+ T-Zellen bei den Kindern mit schwerer atopischer Dermatitis signifikant höher war als im Kontrollkollektiv. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass der Anteil naiver Tregs in der Patientengruppe deutlich niedriger war als bei der Kontrollgruppe. Demgegenüber war der Anteil der Effektor-Gedächtniszellen in der Patientengruppe signifikant höher als in der Vergleichsgruppe. Die Untersuchung des Todesrezeptors CD95 ergab, dass die Population CD95+CD4+CD25+ T-Zellen der Patienten signifikant geringer war als bei dem gesunden Kontrollkollektiv. Die hier beschriebenen Ergebnisse deuten daraufhin, dass bei Patienten mit AD Tregs zwar in ausreichendem Maße produziert werden, sie aber funktionell insuffizient sind. Die genauen zugrundeliegenden Mechanismen auf genetischer Ebene sowie mögliche, involvierte Signaltransduktionswege gilt es in weiterführenden Studien zu untersuchen. Des Weiteren beschreiben die Resultate ein gestörtes Gleichgewicht zwischen naiven Tregs und Gedächtniszellen. Das heißt, dass der größere Anteil der Effektor-Tregs sich zu Effektor-Gedächtniszellen entwickelt, die in ihrer Funktion aber möglicherweise eingeschränkt sind. Die geringere Anzahl CD95 exprimierender regulatorischer T-Zellen in der Patientengruppe lässt eine Fehlregulation der Apoptose vermuten, was wiederum die erhöhte Anzahl dieser Zellen erklären könnte. Zusammenfassend liefert die vorliegende Studie Hinweise darauf, dass Tregs eine bedeutende Rolle in der Pathogenese der atopischen Dermatitis spielen. Die zugrundeliegenden Mechanismen allerdings müssen in weiteren Studien untersucht und identifiziert werden, um sie zukünftig als Angriffsziel therapeutischer Ansätze nutzen zu können.
N2  - Children in Australia and around the world suffer a significant health burden due to atopic disease. The most prevalent allergic disorder in children is atopic dermatitis (AD). AD reflects an abnormal immune response to environmental antigens, which is mainly induced by T lymphocytes. There is evidence that these T lymphocytes are tightly controlled by a subset of T cells, known as T regulatory cells (T regs). Functional analysis indicates that T regs actively suppress the immune response. Phenotypically, T regs are characterized by surface expression of CD4 and CD25 and intracellular expression of the transcription factor Foxp3. In our study we analysed T regs numbers and functions and phenotype in AD patients. our findings indicate a higher number of T regs in children suffering form atopic Dermatitis than in healthy controls however with limited suppressive capacities.
KW  - Endogenes Ekzem
KW  - Immunreaktion
KW  - Allergie
KW  - Regulatorische T-Zellen
KW  - atopische Deramtitis
KW  - T-Helferzellen
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-49355
ER  - 
TY  - THES
A1  - Schmidt, Michaela
T1  - Exzitotoxische Prozesse in der SIV-Enzephalitis
T1  - Excitotoxic processes in SIV-encephalitis
N2  - Die Glutamat-vermittelte Exzitotoxizität gilt als einer der wichtigsten neuropathologischen Faktoren der HIV-Demenz: Während Glutamat in physiologischer Konzentration als exzitatorischer Neurotransmitter fungiert, wirkt es in zu hoher Konzentration neurotoxisch. In vorliegender Arbeit wurde mittels Western Blotting die Proteinexpression der exzitatorischen Aminosäuretransporter EAAT1 und EAAT2 gemessen, die vor allem für den Abtransport von Glutamat aus dem synaptischen Spalt sorgen. Hierzu wurden Gehirne von mit dem simianen Immundefizienz Virus (SIV) infizierten chinesischen und indischen Rhesusaffen verwendet. SIV verursacht im SIV-Rhesusaffenmodell ähnliche Schäden wie das humane Immundefizienz Virus (HIV) beim Menschen. Zur Entstehung der SIV-Enzephalitis tragen, wie auch bei der HIV-Demenz, aktivierte Monozyten und Mikroglia bei, die u.a. das Neurotoxin Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-alpha) sezernieren. Dessen Protein- und Genexpression wurde mittels ELISA und Real-Time-PCR ausgewertet. Für die vorliegende Arbeit wurden zwei für die HIV-Demenz besonders relevante Gehirnregionen ausgewählt: das Putamen, das als Teil der Basalganglien für die extrapyramidale Steuerung der Motorik zuständig ist, und der Nucleus Accumbens, der affektives und motivationales Verhalten in Bewegungsabläufe integriert. Als potentielle Pharmaka wurden der MAO-B-Hemmer Selegilin, der NMDAR-Antagonist Memantin sowie die Antioxidantien N-Acetylcystein (NAC) und Melatonin getestet. Es gelang in vorliegender Arbeit erstmals, eine Störung der Proteinexpression der glutamatergen Transporter EAAT1 und EAAT2 im Putamen mit zunehmender Dauer der SIV-Infektion und ihren dramatischen Verlust bei Entwicklung von AIDS nachzuweisen. Im Nucleus Accumbens fand sich eine relativ konstante Proteinexpression des EAAT1 und EAAT2 im Verlauf der SIV-Infektion. Weiterhin konnte ein Anstieg des TNF-alpha mit fortschreitender Infektionsdauer hinsichtlich der Genexpression im Putamen und der Proteinexpression im Nucleus Accumbens nachgewiesen werden. Die fehlende Eignung von Selegilin als neuroprotektive Substanz im Rahmen der SIV-Enzephalitis wurde repliziert. Memantin, NAC und Melatonin hingegen verbesserten in weiten Teilen die Expression von EAAT1 und EAAT2 und wirkten immunstimulierend, was sie zu interessanten Kandidaten für eine neuroprotektive Medikation macht. In beiden Hirnregionen zeigte sich bei den indischen Rhesusaffen eine höhere TNF-alpha-Expression als bei den chinesischen Tieren. Dies entspricht der Beobachtung, dass die SIV-Infektion bei indischen Rhesusaffen meist schneller und schwerer verläuft.
N2  - Glutamate-mediated excitotoxicity is considered one of the major neuropathological factors inducing HIV dementia: serving as an excitatory neurotransmitter in physiological concentration, glutamate exerts neurotoxic effects if secreted excessively. In the present study, the protein expression level of the excitatory amino acid transporters EAAT1 and EAAT2, which are responsible for the removal of glutamate from the synaptic cleft, was analyzed via Western Blotting. For this purpose, brains of Chinese and Indian macaques infected with the simian immunodeficiency virus (SIV) were used. SIV causes similar symptoms in the SIV/macaque model as the human immunodeficiency virus (HIV) does in humans. Similar to HIV-dementia, the development of SIV-encephalitis is triggered by activated monocytes and microglia, which secrete – among other things - the neurotoxin tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha). TNF-alpha protein and gene expression was examined using ELISA and real-time-PCR. For the present study, two brain regions were chosen due to their specific relevance for HIV-dementia: first the putamen, which is part of the basal ganglia and exerts influence on extrapyramidal motion sequences, and second the nucleus accumbens, which integrates affective and motivational behavior in motor activity. The MAO-B-inhibitor selegiline, the NMDAR-antagonist memantine and the antioxidants N-acetyl-cysteine (NAC) and melatonin were tested as potential pharmaceuticals. For the first time ever, the present study shows a disruption of protein expression of the glutamatergic transporters EAAT1 and EAAT2 in the putamen during an SIV infection, and a dramatic loss of EAATs associated with the development of AIDS. In the nucleus accumbens, a relatively constant protein expression of EAAT1 and EAAT2 was found during the progression of the SIV infection. Additionally it has been proved that TNF-alpha gene expression in the putamen and TNF-alpha protein expression in the nucleus accumbens increase in the course of an SIV infection. It was replicated that selegiline is unsuitable as a neuroprotective agent regarding SIV encephalitis. Memantine, NAC and melatonin, on the other hand, largely improved the expression of EAAT1 and EAAT2, and stimulated the immune system, so that these substances can be taken into consideration as possible neuroprotective pharmaceuticals. In both brain regions, the Indian macaques showed a higher TNF-alpha expression level than the Chinese macaques. This finding corresponds to the fact that the course of an SIV infection is faster and more severe in Indian macaques.
KW  - Affenimmundefizienzvirus
KW  - HIV
KW  - Gehirn
KW  - Demenz
KW  - Memantin
KW  - Selegilin
KW  - Acetylcystein
KW  - Nucleus accumbens
KW  - Tumor-Nekrose-Faktor <alpha>
KW  - MAO-Hemme
KW  - Exzitotoxizität
KW  - SIV
KW  - EAAT
KW  - Putamen
KW  - Glutamat
KW  - excitotoxicity
KW  - SIV
KW  - glutamate
KW  - EAAT
KW  - TNF-alpha
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-54526
ER  - 
TY  - THES
A1  - Nistal, Markus
T1  - Etablierung eines proviralen molekularen Klons des Equine Foamy Virus (EFV)
T1  - A proviral molucular clone of equine foamy virus (EFV)
N2  - Foamyviren (FV) sind komplexe Retroviren, die sich in ihrem Replikationszyklus in vielerlei Hinsicht von den klassischen Retroviren (Orthoretrovirinae) unterscheiden. Funktional nehmen sie eine Mittelstellung zwischen Orthoretroviren und Hepadnaviren ein. Wichtige Unterschiede zu Orthoretroviren liegen in der Reifung und Ausschleusung viraler Partikel. Die Partikelreifung findet wie bei Typ B/D-Orthoretroviren an intrazytoplasmatischen Strukturen statt. Die Partikelfreisetzung wurde bei FV im Gegensatz zu Orthoretroviren hauptsächlich als Ausknospen an intrazellulären Membranen beschrieben. Neben anderen für das Ausknospen relevanten Motiven wurde im viralen Glykoprotein ein ER-Rückführungsmotiv gefunden, das in fast allen FV vorhanden ist und die Ausschleusung an intrazytoplasmatische Membranen dirigieren soll. Im Jahr 2000 wurde erstmals ein FV aus Pferden isoliert. Dieses Equine Foamy Virus (EFV) zeigte die beschriebenen Eigenschaften anderer FV, jedoch ein ausschließliches Ausknospen viraler Partikel an der Plasmamembran. Ein ER-Rückführungsmotiv ist im Genom von EFV nicht konserviert. In dieser Arbeit wurde aus mit EFV infizierten Zellkulturen mit Hilfe der PCR das virale Genom amplifiziert und kloniert. Die Genomanteile wurden zu einem proviralen molekularen Klon des Virus zusammengefügt. Eine vollständige Sequenzierung erlaubte die Identifikation expressionskritischer Veränderungen. Mittels weiterer Klonierungen und PCR-Mutagenese konnten eine Sequenzunterbrechung und verschiedene Stopp-Mutationen korrigiert werden. Verschiedene Zelllinien wurden mit dem proviralen Klon transfiziert, eine quantitativ relevante Anzucht von Viren in der Zellkultur gelang trotz Nachweis von viralem Genom durch PCR nach mehreren zellfreien Passagen nicht. Als Ursache der fehlenden Virusexpression sind Mutationen des Matrizengenoms vor der Klonierung zu vermuten, die für die effektive Replikation relevante, aber bisher noch nicht bekannte Positionen in regulatorischen Proteinen oder LTR-Regionen betreffen.
N2  - Foamy viruses are complex retroviruses, which differ from classic retroviruses in many aspects of their replication cycle. Their characteristics are between orthoretroviruses and hepadnaviruses. Important differences to orthoretroviruses concern particle maturation and budding. Particle maturation takes place at intracytoplasmatic structures like with type B/D retroviruses. Particle release in foamy viruses was described as budding from intracellular membranes in opposite to orthoretroviruses budding from plasma membrane. Besides other relevant budding motives an ER retrieval motif was found in almost all foamy viral glykoproteins which is supposed to direct particle budding to intracytoplasmatic membranes. In 2000 a foamy virus was isolated from horses. This equine foamy virus (EFV) showed the usual foamy viral characteristics, but an exclusive budding of viral particles from plasma membrane. An ER retrieval motif is mot conserved among EFV. For this study the viral genome was amplified from EFV-infected cell cultures by PCR and cloned. The genome parts were put together to a proviral molecular clone of EFV. Complete sequencing allowed identification of critical changes in comparison to the published sequence. A disruption of the sequence and several stop mutations could be corrected by subsequent cloning and PCR mutagenesis. Several adherent cell lines were transfected with the proviral clone, a quantitatively relevant culture of the virus was not achieved despite proof of viral genome by PCR after several cell-free passages. As a cause for the lack of expression has to be thought of mutations of the template genome before cloning. Those mutations may affect yet unknown positions in regulatory proteins or LTR regions relevant for effective replication.
KW  - Spumaviren
KW  - Partikelreifung
KW  - Budding
KW  - Virusanzucht
KW  - budding
KW  - particle maturation
KW  - molecular cloning
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48928
ER  - 
TY  - THES
A1  - Barg, Nicole
T1  - Die Rolle der purinreichen Sequenzen für die Replikation von Prototyp-Foamyviren
T1  - Complex effects of foamy virus purine-rich regions on replication
N2  - Foamyviren enthalten vier zentrale purinreiche Sequenzen, die Elemente A bis D. Bekannt sind solche auch bei anderen Retroviren, u.a. bei HIV, wo der cPPT (central polypurine tract) für eine effektive Replikation benötigt wird und eine Kopie des 3´PPT darstellt. Bei FV ist nur das Element D sequenzidentisch zum 3´PPT, welcher sich bei allen Retroviren findet und von welchem die Plusstrang-Synthese bei der Bildung der cDNA intiiert wird. Vermutet wurde daher für das Element D, das es einen zweiten Initiationsort für die Plusstrang-Synthese darstellt und analog zum cPPT bei HIV die Replikation zu beschleunigen vermag. Um die Funktion der purinreichen Sequenzen zu verstehen, führten wir Mutationen in die Elemente A bis D ein und untersuchten sie im infektiösen Volllängenklon sowie im Vektorkontext; zusätzlich analysierten wir die viralen Proteine in infizierten Zellen und Viruspartikeln.
N2  - Foamy viruses contain four central purine-rich sequences, namely element A, B, C and D. Such sequences are also known in other retroviruses, for example in HIV, which harbours a cPPT (central polypurine tract) that is needed for effective replication and is an exact copy of the 3´PPT. In FV only element D is a copy of the 3´PPT, which is essential for reverse transcription as it is the initiation site for plus strand DNA synthesis. Therefore, element D is thought to serve as a second initiation site for plus strand DNA synthesis in order to accelerate viral replication. We mutated the four purine-rich elements and analysed them in vector and infectious virus context to determine their role; furthermore we investigated viral protein production in infected cells and viral particles.
KW  - Prototyp-Foamyviren
KW  - Polypurintrakt
KW  - Plusstrangsynthese
KW  - reverse Transkription
KW  - prototyp foamyviruses
KW  - purine-rich region
KW  - plus strand synthesis
KW  - reverse transcription
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-56137
ER  - 
TY  - THES
A1  - Heinze, Britta
T1  - Charakterisierung der angeborenen Immunantwort gegen Pneumoviren in einem in vivo Modell
T1  - Characterization of the innate immune response against pneumoviruses in an in vivo model
N2  - In dieser Arbeit wurde das PVM-Mausmodell verwendet, um die Bedeutung der Typ I und Typ III Interferonantwort für die Pathogenese einer pneumoviralen Infektion zu analysieren. Hierzu wurden zunächst mit Hilfe der reversen Genetik rekombinante PVM-Mutanten hergestellt, bei denen die Gene für die NS-Proteine, welche vermutlich als Interferonantagonisten fungieren, deletiert sind. Die Charakterisierung der Replikationsfähigkeit der rPVM dNS-Mutanten erfolgte in vitro in Interferon-kompetenten und Interferon-inkompetenten Zelllinien. Ein zentraler Schritt innerhalb dieser Charakterisierung war die Untersuchung der Induktion von Interferonen in vivo und in vitro nach Infektion mit den rPVM dNSMutanten, wobei nachgewiesen wurde, dass die NS-Proteine von PVM als Interferonantagonisten fungieren. In allen Interferon-kompetenten Zellkulturen wurde eine Attenuierung von rPVM dNS1, rPVM dNS2 und rPVM dNS1dNS2 bezogen auf rPVM beobachtet. In allen Interferon-inkompetenten Zellkulturen konnte die Attenuierung der rPVM dNS-Mutanten nahezu vollständig revertiert werden. Nach Infektion mit den rPVM dNS-Mutanten wurde in verschiedenen Zelllinien eine Induktion von Typ I und Typ III Interferonen betrachtet, wobei Unterschiede in der Stärke der Interferon-Induktion nach Infektion mit den rPVM dNS-Mutanten vorhanden waren. Zusammenfassend war es möglich, die NS1- und NS2-Proteine von PVM in Analogie zu RSV eindeutig als Antagonisten der Interferonantwort zu identifizieren. Die Untersuchung der protektiven Rolle von Typ I und Typ III Interferonen für die Replikation und Pathogenität von PVM bildete den zweiten Teil dieser Arbeit. Hierzu wurde die Replikationsfähigkeit und Pathogenität der rPVM dNS-Mutanten in verschiedenen Interferon-defizienten Mausstämmen getestet. Die Untersuchungen ergaben eine protektive Rolle von Typ I und Typ III Interferonen bei einer Infektion mit PVM, wobei den Typ I Interferonen ein effektiverer Einfluss zugeordnet werden konnte. Ein Vergleich von Replikation und Virulenz zwischen den verschiedenen Typ I oder Typ III oder Typ I/Typ III Interferonrezeptor-defizienten Mausstämmen belegte eine erhöhte Suszeptibilität der Typ I/Typ III Interferonrezeptor-defizienten Mäuse gegenüber einer Infektion mit den rPVM dNS-Mutanten. Eine vollständige Aufhebung der Attenuierung wurde auch in den Typ I/Typ III Interferonrezeptor-defizienten Mäusen nicht erlangt. Eine anti-apoptotische Funktion der NS-Proteine zusätzlich zu ihrer Wirkungsweise als Interferonantagonisten wurde aufgrund der unvollständigen Revertierung der Pathogenität der rPVM dNS-Mutanten in Typ I/Typ III Interferonrezeptor-defizienten Mäusen vermutet. Der abschließende Teil dieser Dissertation befasste sich mit der Frage, welche Zellen bei einer natürlichen pulmonalen Infektion Interferone in vivo produzieren. In vitro wurde beobachtet, dass überraschenderweise nur sehr wenige virusinfizierte oder uninfizierte Zellen Typ I Interferone bilden. Der Nachweis darüber, welche Zellen während einer pulmonalen Infektion hauptsächlich Interferone in vivo produzieren, war aufgrund der fehlenden Eignung der kommerziell erhältlichen Interferon-Antikörper für intrazelluläre Gewebefärbungen nicht möglich. Dennoch gelang es abschließend durch eine neue Nachweismethode erstmals Zellen mit rezeptorgebundenen Interferon zu identifizieren, wobei es sich um ziliierte Epithelzellen, Alveolarmakrophagen und vermutlich Clarazellen sowie Typ I und Typ II Pneumozyten handelte.
N2  - In this thesis the PVM mouse model was used to unveil the role of type I and type III interferone response for the pathogenesis of pneumoviral infection. First, recombinant PVM dNS-mutants with single or combined deletions of the NS-genes were generated and replication efficiency characterization was analyzed in interferon-competent cells as well as in interferon-incompetent cells. A major point was to elucidate the NS-proteins of PVM as interferon antagonists. In interferon-competent cells the replication of rPVM dNS-mutants were significantly attenuated. These attenuation of all three rPVM dNS-mutants was almost completely reversed when interferon-incompetent cells were infected. Induction of type I and type III interferons was determined in different cell types after infection with rPVM dNS-mutants with differences in intensity of interferon induction. Thus, NS1- and NS2-proteins were clearly identified as interferon antagonists. To analyze the protective capacity of type I and type III interferons with respect to replication and pathology of PVM, mice lacking functional receptors for either or both interferons were infected with rPVM or the respective dNS-mutants. The results indicated that both type I and type III interferons which one restricted replication and pathology of PVM, with the former playing the greater role. Interestingly, the replication and virulence of wild-type PVM were completely unaffected by the presence or absence of functional receptors to type I and type III interferon, indicating that both systems are strongly suppressed during infection. However, pretreatment of mice with type I interferon were protective against lethal rPVM challenge, whereas pretreatment with type III interferon delayed but did not prevent death. Finally, the PVM-NS-proteins appeared to delay apoptosis independently of its IFN-antagonistic activity that may contribute to the limited pathogenicity of the viruses in type I/type III receptor deficient mice. In the last part type I interferon producing cells in a pneumoviral infection in vivo should be identified. It was documented that type I interferon producing cells are virusinfected cells as well as uninfected cells. Surprisingly, in vitro only few cells produced type I interferon during rPVM-GFP7 dNS1dNS2 infection. Because the commercially available interferon antibodies are not qualified for intracellular tissue staining it was not possible to identify in vivo the interferon producing cells, but by inventing a new method it was possible to verify the binding of type I interferon to the cell surface receptor of ciliated epithelial cells, alveolar macrophages and presumably Clara cells and type I and type II pneumocytes.
KW  - Interferon
KW  - RS-Virus
KW  - Immunreaktion
KW  - Lungenentzündung
KW  - Apoptosis
KW  - Tiermodell
KW  - Toll-like-Rezeptoren
KW  - PVM
KW  - Nichtstrukturproteine
KW  - IFNAR
KW  - Interferonrezeptor
KW  - PVM
KW  - interferon
KW  - IFNAR
KW  - receptor
KW  - apoptosis
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-56454
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Monzon-Casanova, Elisa
A1  - Steiniger, Birte
A1  - Schweigle, Stefanie
A1  - Clemen, Holger
A1  - Zdzieblo, Daniela
A1  - Starick, Lisa
A1  - Mueller, Ingrid
A1  - Wang, Chyung-Ru
A1  - Rhost, Sara
A1  - Cardell, Susanna
A1  - Pyz, Elwira
A1  - Herrmann, Thomas
T1  - CD1d Expression in Paneth Cells and Rat Exocrine Pancreas Revealed by Novel Monoclonal Antibodies Which Differentially Affect NKT Cell Activation
N2  - Background: CD1d is a nonpolymorphic MHC class I-like molecule which presents nonpeptide ligands, e.g. glycolipids, to NKT cells. These cells are known to have multiple effects on innate and adaptive immune responses and on the development of pathological conditions. In order to analyze CD1d expression and function in the rat, the first rat CD1dspecific monoclonal antibodies (mAbs) were generated. Methodology/Principal Findings: Two mAbs, WTH-1 and WTH-2, were generated which bound equally well to cell surfaceexpressed rat and mouse CD1d. Their non-overlapping epitopes were mapped to the CD1d heavy chain. Flow cytometry and immunohistological analyses revealed a nearly identical degree and pattern of CD1d expression for hematopoieitic cells of both species. Notable is also the detection of CD1d protein in mouse and rat Paneth cells as well as the extremely high CD1d expression in acinar exocrine cells of the rat pancreas and the expression of CD4 on rat marginal zone B cells. Both mAbs blocked a-galactosylceramide recognition by primary rat and mouse NKT cells. Interestingly, the two mAbs differed in their impact on the activation of various autoreactive T cell hybridomas, including the XV19.2 hybridoma whose activation was enhanced by the WTH-1 mAb. Conclusions/Significance: The two novel monoclonal antibodies described in this study, allowed the analysis of CD1d expression and CD1d-restricted T cell responses in the rat for the first time. Moreover, they provided new insights into mechanisms of CD1d-restricted antigen recognition. While CD1d expression by hematopoietic cells of mice and rats was extremely similar, CD1d protein was detected at not yet described sites of non-lymphatic tissues such as the rat exocrine pancreas and Paneth cells. The latter is of special relevance given the recently reported defects of Paneth cells in CD1d2/2 mice, which resulted in an altered composition of the gut flora.
KW  - Krebs <Medizin>
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-68477
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Huenig, Siegfried
A1  - Huenig, Georg
T1  - Cataract Surgery With Implantation of an Artificial Lens
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85908
ER  - 
TY  - THES
A1  - Eujen, Heike Carola
T1  - Blockade der Antigenerkennung als therapeutische Strategie in einem CD8+ T-Zell vermittelten Mausmodell der Multiplen Sklerose
T1  - Interference with Recognition of a Neo-Autoantigen as Therapeutic Strategy in a CD8+ T Cell Mediated Mouse Model of Multiple Sclerosis
N2  - Die Multiple Sklerose (MS) ist eine schwere, momentan noch unheilbare Autoimmunerkrankung des Zentralnervensystems, die weltweit ca. 1 Mio. Menschen betrifft. Da die zur Zeit verfügbaren, anti-inflammatorischen und immunsuppressiven Therapieformen lediglich krankheitsverzögernd wirken, ist es Gegenstand intensiver Forschungsbemühungen, Möglichkeiten zur spezifischen Interferenz mit bei der MS ablaufenden Pathomechanismen zu ergründen und im Tiermodell zu testen. Das von uns für diese Arbeit verwendete Mausmodell einer CD8+ T-Zell vermittelten Experimentellen Autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) trägt dabei neuen Erkenntnissen Rechnung, die zeigen, dass zytotoxische T-Lymphozyten bei der Pathogenese der humanen MS von entscheidender Bedeutung sind. Es handelt sich um doppelt transgene Nachkommen von Mäusen, die das Modell-Antigen Ovalbumin (OVA) unter der Kontrolle eines Oligodendrozyten (ODC-)-spezifischen MBP-Promotors im ZNS exprimieren, und Mäusen, die Ovalbumin-spezifische CD8+ T-Zellen besitzen (OT-I Zellen). Es kommt in diesem Modell zur Autoantigenerkennung durch die CD8+ T-Zellen mit konsekutiver Ausbildung einer fulminanten, letal verlaufenden EAE. Ziel der vorliegenden Arbeit war es nun, die therapeutische Potenz des monoklonalen Antikörpers 25-D1.16 zu evaluieren, der gegen das Autoantigen Ovalbumin in Kombination mit einem MHC-I-Molekül gerichtet ist. Mit Hilfe von FACS-Analysen und Fluoreszenz-Mikroskopie konnten wir zunächst bestätigen, dass 25-D1.16 spezifisch den Komplex aus dem Peptid SIINFEKL (antigenes Epitop von Ovalbumin) gebunden an ein MHC-I-Molekül (H-2Kb) erkennt. In nachfolgenden in vitro Versuchen wurde der Einfluss des Antikörpers auf Aktivierung und Proliferation von durch SIINFEKL:MHC-I-Komplex stimulierten OT-I Zellen untersucht. Es wurden hierfür Zellproliferation (Proliferations-Assays), Expression des Oberflächenmoleküls CD69 (FACS-Analysen) sowie IFN-γ-Sekretion (ELISA) gemessen. In Gegenwart von 25-D1.16 zeigte sich durchweg eine hochsignifikante Reduktion der jeweiligen Proliferations-/Aktivierungsmarker. Wir konnten somit in vitro zeigen, dass der gegen das Autoantigen Ovalbumin/H-2Kb gerichtete, monoklonale Antikörper 25-D1.16 kompetitiv die Aktivierung und Proliferation entsprechender T-Lymphozyten inhibieren kann. Um diese Daten in vivo zu validieren und die pathogenetische Relevanz zu überprüfen, haben wir ODC-OVA/OT-I doppelt transgenen Mäusen verschiedene Dosen von 25-D1.16 vor Auftreten erster EAE-Symptome einmalig intraperitoneal verabreicht. Anschließend wurde der Krankheitsverlauf klinisch beurteilt. Im EAE-Stadium 4 ohne Besserungstendenz oder bei Versuchsende wurden außerdem histologische Schnitte des Zentralnervensystems angefertigt, gefärbt (H.E., CD3, Mac-3, Luxol Fast Blue/PAS) und mit unbehandelten Tieren verglichen. Ein Teil der ODC-OVA/OT-I doppelt transgenen Tiere blieb nach Applikation des Antikörpers völlig gesund, während bei einem anderen Teil der Ausbruch der EAE zwar nicht vollständig verhindert, ihr Schweregrad aber deutlich gemildert wurde. Der Effekt der Antikörpertherapie war jedoch nicht nur klinisch, sondern auch histopathologisch überzeugend. So zeigte das Zentralnervensystem erfolgreich therapierter Mäuse eine weitgehend bis vollständig intakte Gewebsarchitektur (H.E.-Färbung) mit im Vergleich zu unbehandelten Mäusen drastisch reduzierter OT-I Zell- und Makrophagen/Mikroglia-Infiltration (Immunhistochemie CD3 und Mac-3). In der Luxol Fast Blue/PAS-Färbung fanden sich keinerlei Entmarkungsherde sondern durchgängig myelinisierte Axone. Es gelang uns somit durch hohe Antikörperdosen (500 μg pro ODC-OVA/OT-I doppelt transgener Maus) bei 83 % der behandelten Versuchstiere den Ausbruch der EAE ganz zu verhindern bzw. deren Verlauf deutlich abzumildern. Zusammenfassend beschreiben wir hier erstmals die antigen-spezifische Therapie einer CD8+ T-Zell mediierten EAE mittels eines gegen Peptid:MHC-I-Komplex gerichteten, monoklonalen Antikörpers. Durch Interferenz mit der Erkennung des Autoantigens durch die CD8+ T-Zellen waren wir in vivo in der Lage, den Pathomechanismus der EAE zu inhibieren. Hieraus ergibt sich ein vielversprechendes Behandlungskonzept für die Therapie der Multiplen Sklerose am Menschen.
N2  - Multiple sclerosis is an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system (CNS) of presumed autoimmune origin, which affects around 1 million people worldwide. To date, anti-inflammatory and immunomodulatory therapies in clinical use can slow disease progression but are not curative and have considerable adverse effects. For this reason, researchers have begun to focus on developing antigen-specific treatment options, thereby avoiding generalized immunosuppression. Recently, the importance of CD8+ T cells in the pathogenesis of multiple sclerosis has begun to emerge. Here we employ a mouse model of CD8+ T cell mediated experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), in which the neo-self antigen ovalbumin (OVA) expressed by oligodendrocytes (ODC) is targeted by CD8+ T cells with transgenic T cell receptors (OT-I cells). In this animal model of ODC-OVA/OT-I double transgenic mice, recognition of the autoantigen by CD8+ T cells leads to fulminant, lethal EAE. A possible strategy to block organ-specific CD8+ T cell mediated inflammation is the interference with antigen recognition by a monoclonal antibody (mAb) specific for the complex composed of the immunodominant peptide and an MHC class I molecule. We therefore tested the therapeutic potency of the mAb 25-D1.16 which binds to the the OVA-8/MHC I complex, in our ODC-OVA/OT-I mouse model. Using flow cytometry and fluorescence microscopy, we confirmed that 25-D1.16 specifically recognizes the peptide SIINFEKL (antigenic epitope of ovalbumin) presented by H-2Kb, the murine homologue of the human MHC class I molecule. With in vitro experiments we addressed the ability of 25-D1.16 to inhibit activation and proliferation of OT-I cells stimulated by SIINFEKL:MHC I complexes. Cell proliferation (radioactive proliferation assays), expression of the early activation marker CD69 on the cell surface (flow cytometry) and IFN-γ secretion (ELISA) were measured. In the presence of 25-D1.16 we saw a highly significant reduction of the respective markers of activation/proliferation. We were thus able to show that the mAb 25-D1.16 recognizing OVA-8/H-2Kb is able to competitively inhibit the response of CD8+ T cells specific for the same peptide/MHC class I complex. To validate these findings in vivo and to study their pathogenic relevance, ODC-OVA/OT-I double transgenic mice were treated with different doses of 25-D1.16. For each mouse, a single dose was injected into the peritoneum prior to EAE onset. On a daily basis, mice were then scored for clinical symptoms of disease (scale 0 – 5). At the end of the experiment, histological and immunohistochemical analysis was performed on sections of brain and spinal cord and was compared to untreated animals. We observed a dose-dependent reduction of EAE severity after injection of 25-D1.16. At low doses (100 μg per mouse), the disease course was indistinguishable from that of untreated ODC-OVA/OT-1 double transgenic mice, whereas at 500 μg 10/12 animals survived. About half of them either showed no or only mild symptoms, while the others experienced full recovery after transient exacerbation. An intermediate phenotype was observed at 200 μg per mouse. Corresponding to the clinical results, the antibody’s effect on the extent of CNS damage was also convincing. Histopathological comparison of mice that recovered under 25-D1.16 therapy showed a virtually intact tissue architecture with only mild residual vacuolization (HE staining), less influx of T cells, as well as reduced microglia/macrophage activation (CD3 and Mac-3 immune histology). Luxol Fast Blue/PAS stained CNS sections showed remyelinated axons while extensive inflammation and myelin destruction is seen in double transgenic mice without 25-D1.16 therapy. In summary, treatment with high doses of 25-D1.16 (500 μg per mouse) saved 83% of the tested animals from lethal EAE, either preventing the development of or attenuating disease symptoms. For the first time, we here describe an antigen specific therapy of CD8+ T cell mediated EAE using a monoclonal antibody binding to peptide/MHC I complexes. By interference with recognition of the autoantigen by CD8+ T cells we were able to inhibit the onset of disease in vivo. Although there are anticipated problems in translating the present results into treatment of MS patients, they might offer a promising concept for future selective immunotherapy in human multiple sclerosis.
KW  - Multiple Sklerose
KW  - Antigen
KW  - Blockade
KW  - Tiermodell
KW  - Therapie
KW  - Autoimmunität
KW  - EAE
KW  - CD8 T-Zellen
KW  - spezifisch
KW  - zytotoxisch
KW  - Antigenerkennung
KW  - multiple sclerosis
KW  - EAE
KW  - CD8 T cell
KW  - antigen-specific
KW  - autoimmunity
KW  - therapy
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-52052
ER  - 
TY  - THES
A1  - Salditt, Andreas
T1  - Bedeutung des ESCRT-Systems für die Partikelfreisetzung von Masernviren
T1  - Impact of the ESCRT-System on Measles virus particle release
N2  - Die Matrix-Proteine von Vertretern der Ordnung Mononegavirales sind essentiell für späte Schritte im viralen Lebenszyklus, insbesondere der Knospung und Partikelmorphogenese. Die Abschnürung und Freisetzung umhüllter RNA-Viren ist dabei abhängig von dem Transport des viralen Matrix-Proteins und seiner Interaktion mit Wirtsproteinen wie dem ESCRT-System (endosomal sorting complex required for transport), welches in die Sortierung zellulärer Proteine involviert ist. Im Verlauf der Masernvirus (MV)-Infektion interagiert das M-Protein einerseits mit dem viralen Nukleoproteinkomplex und andererseits mit den viralen Glykoproteinen an der Oberfläche. Die Bedeutung des MV-M-Proteins für die Partikelproduktion und sein intrazellulärer Transport wurden bislang kaum untersucht. Bisher ist nur bekannt, dass das M-Protein oligomerisiert, teilweise monoubiquitiniert vorliegt und in Zellen, wenn alleine exprimiert, die Produktion von Virus-like-particle (VLP) vermittelt (Pohl et al., 2007). In dieser Studie wird gezeigt, dass das MV-M-Protein ähnlich wie das VP40-Protein des Ebolavirus (EBOV) mit Lipid Rafts und TEMs (tetraspanin enriched microdomain) assoziiert ist, wobei aber das M-Protein weniger effizient an der Plasmamembran akkumuliert. Beide Proteine unterscheiden sich nicht wesentlich in ihrer Assoziation mit Kompartimentmarkern. Interessant ist jedoch, dass das VP40-Protein und das M-Protein an der Plasmamembran mit dem Adaptor Protein-3 (AP-3) kolokalisieren. Die Kolokalisation des M-Proteins mit AP-3 wird aber nur in infizierten Zellen und nicht in Zellen, in denen das M-Protein allein exprimiert wird, beobachtet. Im Gegensatz zum VP40-Protein, welches die ESCRT-Komponenten über seine N-terminale L-Domäne rekrutiert und diese für die Partikelproduktion benutzt, geschieht dies beim M-Protein ESCRT-unabhängig, da die Mutation der Motive, die Ähnlichkeiten zu den bekannten L-Domänen zeigen, keine Auswirkungen auf die VLP-Produktion haben. Zudem rekrutierte das M-Protein weder Tsg101, Aip-1 oder Vps4 an die Plasmamembran, noch wird die VLP- oder die Virusproduktion durch dominant negatives Vps4 inhibiert. Der Transfer der VP40 L-Domäne in das MV-M-Protein hatte weder einen Einfluss auf die Assoziation mit Tetraspaninen noch auf die ESCRT-Abhängigkeit der VLP-Produktion. Damit wurde gezeigt, dass die VLP-Freisetzung des MV-M-Proteins ESCRT-unabhängig ist. Die Freisetzung erfolgt beim MV durch einen grundsätzlich anderen Weg, der noch untersucht werden muss.
N2  - The matrix proteins of the order Mononegarivales are essential for late steps in the viral life cycle, especially for budding process and viral morphogenesis. Budding and release of enveloped RNA-viruses depend on transport of the viral matrix protein and its interaction with host proteins, which are involved in sorting of cellular proteins, e.g. the ESCRT system. During the course of measles virus infection, the M-protein interacts with the viral nucleocapsid-complex and the viral glycoproteins. The impact of MV-M-protein for the particle production and intracellular transport is barely known yet. So far, it has been shown that the M-protein forms oligomers, is partially mono-ubiquinated and has the capability to promote VLP-production. In this study it could be shown that the MV-M-protein and EBOV-VP40-protein associate with detergent-resistant and tetraspanin-enriched microdomains. However, compared to the VP40-protein the M-protein accumulates less efficiently at the plasma membrane. Both proteins do not essentially vary in their association with compartment markers. Interestingly, VP40- and M-protein, the latter only when expressed in the context of MV infection (but not from plasmid), efficiently co-localised with adaptor protein 3 (AP-3) at the plasma membrane indicating its importance for membrane targeting. In contrast to VP40, which recruits ESCRT components via its N-terminal late (L) domain and exploits them for particle production, M-protein promotes particle production independently of this pathway since 1) ablation of motifs bearing similarity to canonical L domains did not affect VLP production, 2) it did not redistribute Tsg101, AIP-1, or Vps4 to the plasma membrane, and 3) neither VLP nor infectious virus production were sensitive to inhibition by dominant negative Vps4. In addition, transfer of the VP40 L domain into the MV-M-protein did not alter trafficking or ESCRT dependence for VLP production to that of VP40 suggesting that budding activity of MV-M-protein follows an ESCRT independent pathway.
KW  - Masernvirus
KW  - Matrixproteine
KW  - Assembly
KW  - Matrix-Protein
KW  - ESCRT-System
KW  - Measles Virus release
KW  - ESCRT
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48317
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Brandl, Carolin
A1  - Ortler, Sonja
A1  - Herrmann, Thomas
A1  - Cardell, Susanna
A1  - Lutz, Manfred B.
A1  - Wiendl, Heinz
T1  - B7-H1-Deficiency Enhances the Potential of Tolerogenic Dendritic Cells by Activating CD1d-Restricted Type II NKT Cells
N2  - Background: Dendritic cells (DC) can act tolerogenic at a semi-mature stage by induction of protective CD4+ T cell and NKT cell responses. Methodology/Principal Findings: Here we studied the role of the co-inhibitory molecule B7-H1 (PD-L1, CD274) on semimature DC that were generated from bone marrow (BM) cells of B7-H12/2 mice and applied to the model of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE). Injections of B7-H1-deficient DC showed increased EAE protection as compared to wild type (WT)-DC. Injections of B7-H12/2 TNF-DC induced higher release of peptide-specific IL-10 and IL-13 after restimulation in vitro together with elevated serum cytokines IL-4 and IL-13 produced by NKT cells, and reduced IL-17 and IFN-c production in the CNS. Experiments in CD1d2/2 and Ja2812/2 mice as well as with type I and II NKT cell lines indicated that only type II NKT cells but not type I NKT cells (invariant NKT cells) could be stimulated by an endogenous CD1d-ligand on DC and were responsible for the increased serum cytokine production in the absence of B7-H1. Conclusions/Significance: Together, our data indicate that BM-DC express an endogenous CD1d ligand and B7-H1 to ihibit type II but not type I NKT cells. In the absence of B7-H1 on these DC their tolerogenic potential to stimulate tolerogenic CD4+ and NKT cell responses is enhanced.
KW  - Dendritische Zelle
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-68457
ER  - 
TY  - THES
A1  - Clemen, Holger
T1  - Analyse der Expression und möglicher signalinduzierender Eigenschaften des CD1d-Moleküls der Ratte
T1  - Analysis of expression and potential signal inducing properties of rat CD1d-molecule
N2  - Wie MHC Klasse I und II-Moleküle präsentieren CD1d-Moleküle dem TCR Antigene, allerdings Lipide und Glykolipide und nicht Proteinfragmente. Die Entdeckung der massiven TH1- und TH2-Zytokinproduktion von Typ I-NKT-Zellen nach CD1d-vermittelter Erkennung von α-Galactosylceramid, einem aus dem Meeresschwamm gewonnenen Glykosphingolipid, weckte großes Interesse an ihrem immunregulatorischen Potential und ihrem möglichen Nutzen für neue Immun- und Tumortherapien. Um die Funktion und die Bedeutung von CD1d besser zu verstehen, wurden in dieser Arbeit die Expressionslevel der lymphatischen Gewebe der Ratte und der Maus untersucht. Hierfür wurden die neu generierten monoklonalen Antikörper 232 und 58/4 verwendet, die die CD1d-Moleküle von Ratte und Maus binden und so den direkten Vergleich beider Spezies ermöglichen. Sowohl die isolierten Zellen des Thymus und der Milz als auch des Lymphknotens waren in der LEW- und F344-Ratte sowie in der BALB/c-Maus schwach bis stark CD1d positiv. In der LEW-Ratte und in der F344-Ratte wiesen jeweils ca. 18% der Milzzellen eine vergleichsweise erhöhte CD1d-Expression auf. Dabei handelte es sich in erster Linie um Marginalzonen-B-Zellen. Bestimmte Subpopulationen der Dendritischen Zellen und vermutlich Makrophagen stellten die restlichen CD1d stark positiven Populationen dar. Nur ca. 2% der isolierten Zellen der Lymphknoten der LEW-Ratte waren stark CD1d positiv, wohingegen der LEW-Thymus gemäß dem noch geringeren Anteil an APC kaum Zellen mit erhöhter CD1d-Expression enthielt. In der BALB/c-Maus war der Anteil CD1d stark positiver Milzzellen mit 4% deutlich geringer als in der LEW- oder F344-Milz. Abgesehen von MZ-B-Zellen konnten in der Maus kaum Populationen mit starker CD1d-Expression in den verschiedenen Färbungen festgestellt werden. Demnach stellt CD1d sowohl in der Ratte als auch in der Maus einen guten Marker für MZ-B-Zellen dar. Demgegenüber zeigten vereinzelt kleine Populationen der Milz, des Lymphknotens und des Thymus beider Spezies eine verminderte oder gar keine CD1d-Expression. Zur Analyse möglicher signalinduzierender Eigenschaften der verschiedenen Anti- CD1d-Antikörper wurden ihre Effekte auf rCD1d+ Transduktanten und primäre Zellen untersucht. 58/4 konnte im Gegensatz zu 232 spezifisch über Bindung an Ratten- CD1d Zelltod und Aggregatbildung in Tumor-B-Zellen des Menschen und der Maus, aber nicht in Tumor-T-Zellen, induzieren. Der zytoplasmatische Schwanz der CD1d-Moleküle scheint an der Aggregatbildung beteiligt zu sein. Die Bindung von 58/4 oder 232 führte in überlebenden rCD1d+ Raji-Zellen zu einer ähnlich starken Internalisierung der CD1d-Moleküle. Während nach 5-stündiger Inkubation mit 232 und erneuter CD1d-Färbung wieder die vorherige CD1d- Expression festgestellt wurde, konnte nach Inkubation mit 58/4 eine bleibende Herunterregulierung beobachtet werden. Folglich bewirkte 58/4 ein anderes bzw. stärkeres Signal in den Zellen als 232. Diese Beobachtungen stützen die Signaltransduktion als mögliche weitere Funktion der CD1d-Moleküle neben der Antigenpräsentation und definieren die monoklonalen Antikörper 232 und 58/4 als nützliche Werkzeuge für weitere Studien zur Analyse der molekularen Mechanismen der CD1d-vermittelten Signaltransduktion. Das Verständnis solcher Mechanismen bildet wiederum die Grundlage für die Entwicklung neuer Therapien z. B. zur Eliminierung CD1d exprimierender Tumore.
N2  - CD1d-molecules present in contrast to MHC class I and II-molecules lipid antigens to T-cells. There are some observations showing strong CD1d-mediated effects on immune system, so that there is a growing interest in understanding these mechanisms in order to be able to regulate this influence. The expression of CD1d in rats hasnt been known yet. Since our anti-CD1d-antibodies recognize CD1d-molecules of rats as well as of mice, we could compare these species. Antigen-presenting cells, especially marginal-zone B-cells, showed in both the highest CD1d-expression, so that our anti-CD1d-antibodies can be used for their identification. Only a small part of the cells of thymus, spleen and lymphnodes showed a marginal or no CD1d-expression. The analysis of antibody-inducing effects on CD1d+ cells showed, that some of our antibodies can mediate a CD1d-specific cell-death similar to the well-known MHC II-mediated cell death. Survived cells react with an antibody-dependent rate of aggregation or down-regulation of CD1d indicating our antibodies can become a potential tool for further analysis of CD1d-mediated reactions in order to develop new therapies, for example for elimination of CD1d-expressing tumors.
KW  - Zelltod
KW  - Signaltransduktion
KW  - Immunmodulation
KW  - CD1d
KW  - CD1d
KW  - cell death
KW  - signal transduction
KW  - immune modulation
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-65242
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Merget, Benjamin
A1  - Wolf, Matthias
T1  - A molecular phylogeny of Hypnales (Bryophyta) inferred from ITS2 sequence-structure data
N2  - Background: Hypnales comprise over 50% of all pleurocarpous mosses. They provide a young radiation complicating phylogenetic analyses. To resolve the hypnalean phylogeny, it is necessary to use a phylogenetic marker providing highly variable features to resolve species on the one hand and conserved features enabling a backbone analysis on the other. Therefore we used highly variable internal transcribed spacer 2 (ITS2) sequences and conserved secondary structures, as deposited with the ITS2 Database, simultaneously. Findings: We built an accurate and in parts robustly resolved large scale phylogeny for 1,634 currently available hypnalean ITS2 sequence-structure pairs. Conclusions: Profile Neighbor-Joining revealed a possible hypnalean backbone, indicating that most of the hypnalean taxa classified as different moss families are polyphyletic assemblages awaiting taxonomic changes.
KW  - Moose
KW  - Hypnales
KW  - Bryophyta
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-67997
ER  -