TY - THES A1 - Seidensticker, Katharina T1 - Aufbau eines humanen 3D-Atemwegsmodells zur Modellierung der Atemwegsinfektion mit Bordetella pertussis T1 - Investigations of pertussis toxins in a 3D in vitro model of the human respiratory mucosa N2 - Mittels Tissue Engineering hergestellte humane 3D in vitro-Testsysteme sind ein neuer Ansatz, um u.a. Erkrankungen der Atemwege zu simulieren und zu untersuchen. Obwohl gegen B. pertussis, den Erreger des Keuchhustens, Impfstoffe zur Verfügung stehen, nimmt die Erkrankungs-Inzidenz in den letzten Jahren deutlich zu. Da B. pertussis zu den obligat humanpathogenen Erregern zählt, sind die aus Tierversuchen stammenden Daten nur unzureichend auf den Menschen übertragbar. Die genauen Pathomechanismen der Infektion sind bisher nicht geklärt. Auf einer biologischen Kollagenmatrix wurde eine Ko-Kultur aus humanen tracheobronchialen Fibroblasten und humanen tracheobronchialen Epithelzellen (hTEC) angesiedelt und 3 Wochen unter apikaler Belüftung kultiviert. Die ausdifferenzierten 3D Testsysteme wurden mit Überständen von Bordetella pertussis-Kulturen inkubiert und auf licht- und elektronenmikroskopischer Ebene analysiert. Weiterhin wurden 2D Kulturen der hTEC mit Hilfe der Ramanspektroskopie nicht-invasiv auf intrazelluläre Veränderungen nach der Inkubation mit den bakteriellen Überständen untersucht. Das 3D Testsystem der humanen Atemwegschleimhaut zeigte auf lichtmikroskopischer und ultrastruktureller Ebene eine hohe in vitro – in vivo-Korrelation. Die elektronenmikroskopische Analyse zeigte morphologische Veränderungen nach der Inkubation mit den B. pertussis Überständen, die mit vorbeschrieben Effekten einer B. pertussis Infektion korrelieren. Mittels der Ramanspektroskopie ließen sich Gruppen von unbehandelten Zellen von Gruppen, die zuvor mit Bakterienüberständen inkubiert wurden, trennen. Somit zeigte sich die Ramanspektroskopie sensitiv für intrazelluläre Infektionsfolgen. Zusammenfassend wurde belegt, dass das 3D-Modell der humanen Atemwegschleimhaut zur Untersuchung obligat humanpathogener Infektionserreger geeignet ist und dass die Ramanspektroskopie eine nicht-invasive Methode ist, um durch Infektionen hervorgerufene intrazellulären Pathologien zu analysieren. N2 - Three dimensional (3D) tissue-engineered human tissue models are of high relevance, e.g. to investigate virulence mechanisms of human obligate pathogens in vitro. One major obligate agent causing acute respiratory diseases is Bordetella pertussis (Bp), the agent of whooping cough. The progress towards elimination Bp has stalled which is mainly caused due to an absence of suitable models to gain more knowledge about its pathomechanism. On a biological collagen matrix (SISser) a co-culture of human fibroblasts and human airway epithelial cells (hTEC) was seeded and cultured under airlift conditions. The completely differentiated test systems were treated with sterile-filtrated supernatants of Bp and afterwards analyzed with light and transmission electron microscopy. 2D cultures of hTEC were also infected and analyzed with Raman spectroscopy. The 3D test system of the human airway mucosa shows high in vitro - in vivo - correlation on both structural and ultrastructural level. Preliminary morphological analysis after infection with Bp supernatant reveals considerable ultrastructural changes which were not observed in control samples and correlate to effects knows from Bp infections in vivo. In 2D cultivation conditions the Raman spectra of infected hTEC clearly differ from spectra of the control. It is shown that the 3D airway mucosa model represents pathological effects of Bp toxins and offers an opportunity to further examine their pathomechanisms. Raman spectroscopy appears to be a practical method to show intracellular changes on living cells non-invasively. KW - Bordetella pertussis KW - Tissue Engineering KW - Raman-Spektroskopie KW - 3D-Gewebemodell KW - Keuchhusten KW - Konfokale Ramanspektroskopie KW - Airlift-Kultur Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-242092 ER - TY - THES A1 - Heydarian, Motaharehsadat T1 - Development of human 3D tissue models for studying \(Neisseria\) \(gonorrhoeae\) infection T1 - Entwicklung menschlicher 3D-Gewebemodelle zur Untersuchung der Infektion mit \(Neisseria\) \(gonorrhoeae\) N2 - Gonorrhea is the second most common sexually transmitted infection worldwide and is caused by Gram-negative, human-specific diplococcus Neisseria gonorrhoeae. It colonizes the mucosal surface of the female reproductive tract and the male urethra. A rapid increase in antibiotic resistance makes gonorrhea a serious threat to public health worldwide. Since N. gonorrhoeae is a human-specific pathogen, animal infection models are not able to recapitulate all the features of infection. Therefore, a realistic in vitro cell culture model is urgently required for studying the gonorrhea infection. In this study, we established and characterized three independent 3D tissue models based on the porcine small intestinal submucosa (SIS) scaffold by co-culturing human dermal fibroblasts with human colorectal carcinoma, endometrial epithelial, and male uroepithelial cells. The histological, immunohistochemical, and ultra-structural analysis showed that the 3D SIS scaffold-based models closely mimic the main characteristics of the site of gonococcal infection in the human host including the formation of epithelial monolayer, underlying connective tissue, mucus production, tight junction (TJ), and microvilli. In addition, functional analysis such as transepithelial electrical resistance (TEER) and barrier permeability indicated high barrier integrity of the cell layer. We infected the established 3D tissue models with different N. gonorrhoeae strains and derivatives presenting various phenotypes regarding adhesion and invasion. The results showed disruption of TJs and growing the interleukins production in response to the infection, which depends on the type of strain and cell. In addition, the 3D tissue models supported bacterial survival, which provided an appropriate in vitro model for long-term infection study. This could be mainly because of the high resilience of the 3D tissue models based on the SIS scaffold to the infection in terms of alteration in permeability, cell destruction, and bacterial transmigration. During gonorrhea infection, a high level of neutrophils migrates to the site of infection. The studies also showed that N. gonorrhoeae can survive or even replicate inside the neutrophils. Therefore, studying the interaction between neutrophils and N. gonorrhoeae is substantially under scrutiny. For this purpose, we generated a 3D tissue model by triple co-culturing of human primary fibroblast cells, human colorectal carcinoma cells, and human umbilical vein endothelial cells. The tissue model was subsequently infected by N. gonorrhoeae. A perfusion-based bioreactor system was employed to recreate blood flow in the side of endothelial cells and consequently study human neutrophils transmigration to the site of infection. We observed neutrophils activation upon the infection. Furthermore, we demonstrated the uptake of N. gonorrhoeae by human neutrophils and reverse transmigration of neutrophils to the basal side carrying N. gonorrhoeae. In summary, the introduced 3D tissue models in this research represent a promising tool to investigate N. gonorrhoeae infections under close-to-natural conditions. N2 - Tripper ist die zweithäufigste sexuell übertragbare Krankheit weltweit und wird durch Gram negative, humanspezifische Diplokokken Neisseria gonorrhoeae verursacht. Das human Pathogen besiedelt die Schleimhautoberfläche des weiblichen Fortpflanzungstraktes und der männlichen Harnröhre. Die rasante Zunahme der Antibiotikaresistenzen macht Gonorrhö zu einer ernsthaften Bedrohung für die öffentliche Gesundheit weltweit. Da N. gonorrhoeae ein humanspezifischer Erreger ist, ist es nicht möglich alle Merkmale einer Infektion in Tiermodellen nachzustellen, daher ist ein realistisches In-vitro-Zellkulturmodell für die Untersuchung der Gonorrhö-Infektion dringend erforderlich. In dieser Studie haben wir drei unabhängige 3D- Gewebemodelle etabliert und charakterisiert, die auf dem Gerüst der Schweine-Submukosa (SIS) basieren, indem wir menschliche dermale Fibroblasten mit menschlichen Darmkrebs-, Endometrialepithel- und männlichen Uroepithelzellen kultivieren. Die histologischen, immunhistochemischen und ultrastrukturellen Analysen zeigten, dass die 3D SIS-Gerüstmodelle die Hauptmerkmale der Stelle der Gonokokken Infektion im menschlichen Wirt genau nachahmen, indem sich Epithelien Monoschichten ausbildeten, unter denen sich Bindegewebe erstrechte. Zudem wiesen die Zellen enge Zell-Zell Kontakte auf und es kam zur Produktion von einer Mukosaschicht sowie Mikrovilli in den Modellen. Darüber hinaus zeigten Funktionsanalysen wie die Messung des transepithelialen elektrischen Widerstands (TEER) und die der Barriere Durchlässigkeit eine hohe Barriere Integrität der Zellschicht. Wir haben die etablierten 3D- Gewebemodelle mit verschiedenen N. gonorrhoeae-Stämmen und Derivaten infiziert, die verschiedene Phänotypen bezüglich der Adhäsion und der Invasion aufwiesen. Die Ergebnisse zeigten eine Unterbrechung der engen Zellverbindungen und eine Zunahme der Interleukin Produktion als Reaktion auf die Infektion, dessen Ausprägung allerdings stark von der Art des Stammes und des verwendeten Zelltyps abhängig ist. Darüber hinaus unterstützten die 3D- Gewebemodelle das bakterielle Überleben, was ein geeignetes In-vitro-Modell für Langzeit- Infektionsstudien liefert. Dies könnte vor allem auf die hohe Widerstandsfähigkeit der SIS- Gerüstmodelle gegen Infektionen in Bezug auf Veränderung der Permeabilität, Zellzerstörung und Bakterienwanderung zurückzuführen sein. Während der Gonorrhoe-Infektion wandert ein hoher Anteil an Neutrophilen an den Ort der Infektion. Die Studie zeigte auch, dass N. gonorrhoeae in den Neutrophilen überleben konnten oder sich sogar in diesen vermehren konnten. Deshalb wurde besonderes die Interaktion zwischen Neutrophilen und N. gonorrhoeae näher betrachtet. Zu diesem Zweck haben wir ein 3D-Gewebemodell mit Hilfe einer dreifache Co-Kultivierung von menschlichen primären Fibroblasten Zellen, menschlichen kolorektalen Karzinomzellen und menschlichen Nabelvenenendothelzellen erstellt. Das Gewebemodell wurde anschließend mit N. gonorrhoeae infiziert. Ein perfusionsbasiertes Bioreaktorsystem wurde eingesetzt, um den Blutfluss auf der Seite der Endothelzellen nachzuahmen und somit konnte die Auswanderung menschlicher Neutrophile zur Infektionsstelle untersucht werden. Darüber hinaus konnte mit diesem Modell die Aufnahme von N. gonorrhoeae in menschliche Neutrophilen und deren Rückwanderung in den Blutfluss beladen mit N. gonorrhoeae nachgewiesen werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das in dieser Forschung vorgestellte 3D-Gewebemodell ein vielversprechendes Instrument zur Untersuchung von N. gonorrhoeae-Infektionen unter naturnahen Bedingungen darstellt. KW - 3D-Gewebemodell KW - 3D tissue model KW - Neisseria gonorrhoeae KW - Co-Kultur KW - Bioreaktor KW - Neutrophil KW - co-culture KW - bioreactor KW - neutrophil Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-204967 ER -