TY - THES A1 - Sauer, Mark T1 - Die microRNA-26 Familie kontrolliert über den REST-Komplex ein für die Neurogenese essentielles regulatorisches RNA Netzwerk T1 - The microRNA-26 family controls a regulatory RNA network which is essential for neurogenesis via the REST-complex N2 - In einem sich entwickelnden multizellulären Organismus ist die räumlich-zeitliche Regulation der Genexpression von entscheidender Bedeutung für die Bildung, Identität und Funktion von Zellen. Der REST (repressor element silencing transcription factor) Komplex spielt bei der neuronalen Differenzierung und bei der Aufrechterhaltung des neuronalen Status eine essentielle Rolle, indem er in nicht neuronalen Zellen und neuralen Vorläufern die Expression neuronaler Gene unterdrückt, in deren Promotorregion eine RE1 (repressor element 1) Erkennungssequenz vorhanden ist. Während der neuronalen Differenzierung wird der REST-Komplex schrittweise inaktiviert, was zur Einleitung eines neuronalen Genexpression-Programms führt. Es wird daher angenommen, dass die Inhibierung des REST-Komplexes ein essentieller Vorgang der Neurogenese ist. Wichtige Bestandteile für die transkriptionell repressive Funktion des REST-Komplexes sind kleine Phosphatasen (CTDSP = C-terminal domain small phosphatases), welche die Polymerase-II-Aktivität an Zielgenen inhibieren. Im Zebrafisch wurde gezeigt, dass ctdsp2 durch die miR-26b negativ reguliert wird. Alle miR-26 Familienmitglieder sind in Vertebraten evolutionär konserviert und in Introns von Ctdsp Genen kodiert. Sie sind in der Lage, die Expression ihres eigenen Wirtsgens mittels einer autoregulatorischen Rückkopplungsschleife zu regulieren. Im Rahmen dieser Dissertation wurde als Modellsystem für die Neurogenese ein neurales Differenzierungssystem, welches auf murinen, embryonalen Stammzellen (ESCs) aufbaut, eingesetzt. Zur funktionellen Analyse der miR-26 Familie wurden mit Hilfe der CRISPR/Cas9-Methode verschiedene miR-26 Knockout (KO) ESC-Linien hergestellt. Hierbei wurden die Sequenzen der einzelnen Familienmitglieder und der gesamten miR-26 Familie im Genom von Wildtyp (Wt) ESCs deletiert. Diese miR-26-defizienten ESCLinien behielten ihre Pluripotenz und zeigten keinen Phänotyp hinsichtlich Proliferation, Morphologie und Identität der Zellen während der Differenzierung bis zum neuralen Vorläuferzellstadium (NPCs, engl.: neural progenitor cells). Jedoch führte die Deletion sowohl der gesamten miR-26 Familie als auch einzelner Mitglieder bei der terminalen Differenzierung zu einem spezifischen Entwicklungsstillstand im NPC Stadium und infolgedessen zu einer starken Reduktion der Anzahl von Neuronen und Astroglia. Die Transkriptom-Analyse der differenzierten miR-26-KO ESCs mittels RNA-Seq zeigte, dass die Expression von Genen die mit der Neurogenese und der neuronalen Differenzierung, aber auch der Gliogenese assoziert sind, herunterreguliert war. Die Abwesenheit der miR-26 Familie führte außerdem zu einer selektiven Reduzierung bestimmter miRNAs (REST-miRs), die einerseits die Expression von REST-Komplex Komponenten unterdrücken können, und andererseits selbst unter dessen transkriptioneller Kontrolle stehen. Zu diesem REST-miR Netzwerk gehören einige miRNAs (miR-9, miR-124, miR-132 und miR-218), die wichtige Funktionen bei verschiedenen Prozessen der neuronalen Entwicklung haben. Weiterhin führte der miR-26-KO zu einer Derepression der Proteinlevel von REST und CTDSP2 während der terminalen Differenzierung. Funktionelle Analysen mit miRNA mimics zeigten, dass erhöhte miR-26 Level zu einer Hochregulation von REST-miRs führen. Weitere Experimente, die darauf zielten, die Hierarchie des REST-miR Netwerks aufzuklären zeigten, dass die miR-26 Familie stromaufwärts die REST-miR Expression reguliert. Zusammengefasst weisen die in dieser Arbeit gezeigten Daten darauf hin, dass die miR-26 Familie als Initiator der schrittweisen Inaktivierung des REST-Komplexes eine zentrale Rolle bei der Differenzierung von neuralen Vorläuferzellen zu postmitotischen Neuronen spielt. N2 - The spatio-temporal control of gene expression in a developing multicellular organism is a key determinant for the formation, cellular identity and function of cells. The REST (repressor element silencing transcription factor) complex plays a crucial role in the process of neuronal differentiation and the maintenance of the neuronal status by suppressing neuronal genes which contain a RE1 (repressor element 1) recognition sequence within their promotor region in non-neuronal cells or in neural progenitors. During neuronal differentiation, the REST complex is gradually inactivated, leading to the initiation of a neuronal gene expression program. It is therefore assumed that the regulation of the REST complex is an essential component for the initiation of neurogenesis. Critical effector proteins of the REST complex are small phosphatases (CTDSPs = C-terminal domain small phosphatases), which reduces the polymerase II activity on target genes. In zebrafish it was shown that the REST complex-associated phosphatase ctdsp2 is negatively regulated by miR-26b. All miR-26 family members are evolutionarily conserved in vertebrates and located in introns of Ctdsp genes. Furthermore the miR-26 family members repress their own host genes through an intrinsic autoregulatory negative feedback loop. In this study, a murine embryonic stem cell (ESC) -based neural differentiation paradigm was used as a model system for neurogenesis. To analyze the function of the miR-26 family, the CRISPR/Cas9 technology was employed to generate various miR-26 knockout (KO) ESC lines, with deletions of individual family members and the entire miR-26 family in the genome of ESCs. These miR-26-deficient ESCs retained their pluripotency and did not show altered proliferation, morphology, or cell identity during neural differentiation up to the neural progenitor cell (NPC) stage. However, deletion of the entire miR-26 family as well as of single members disrupted the terminal differentiation and led to a specific developmental arrest at the NPC stage and consequently a strong reduction of neuron and astroglia cell frequencies. Global gene expression analyses in differentiated miR-26-KO ESCs further revealed that genes, which are associated with neurogenesis, neuronal differentiation, but also gliogenesis, were downregulated. The absence of the miR-26 familiy resulted in the selective reduction of a specific set of miRNAs (REST-miRs), which on the one hand suppress the expression of REST complex components and on the other hand are themselves under the transcriptional control of the REST complex. Among others, several miRNAs (miR-9, miR-124, miR-132 and miR-218), which play an important role in various processes of neuronal development, belong to this REST-miR network. Moreover, the miR-26-KO led to the derepression of REST and CTDSP2 protein levels during terminal differentiation. Functional analyses with miRNA mimics showed that increased miR-26 levels resulted in an upregulation of REST-miRs. Further experiments aimed at elucidating the hierarchy of REST-miR regulation revealed that the miR-26 family act upstream to regulate RESTmiR expression and presumably has an initial function in the regulation of this network. Taken together, the data presented in this work suggest that the miR-26 family act as an initiator for the stepwise inactivation of the REST complex during neural differentiation. Therefore, these findings are consistent with the notion that the miR-26 family represents a central regulator for neural progenitor cell differentiation into postmitotic neurons. KW - Neurogenese KW - miR-26 Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-184008 ER - TY - THES A1 - Grieß-Porsch, Simone Margot T1 - Analyse der Beteiligung parthenogenetischer Zellen an der Gehirnentwicklung in chimären Mausembryonen T1 - Analyzing the developmental potential of parthenogenetic embryonic mouse stem cells for brain development and regenerative medicine N2 - In der vorliegenden Arbeit wurden die Verteilungsmuster von PG-Donorzellen in Gehirnen von Mäusechimären, die nach dem Aggregations- und dem ESC-Verfahren generiert wurden, im Embryonalstadium E14.5 untersucht und miteinander verglichen. Während in Aggregations-Chimären eine Präferenz von PG-Donorzellen für eine Besiedelung des Cortex und des Striatum zu beobachten ist, zeigen Gehirnbereiche in ESC-Chimären eine gleichmäßige Verteilung der PG-Donorzellen. Um die unterschiedliche Besiedelung von PG-Stammzellen in den Chimären erklären zu können, wurden neuronale und gliale Zellfrequenzanalysen durchgeführt. Sowohl bei der relativen Neuronen- als auch bei der relativen Astrozytenhäufigkeit ist kein signifikanter Unterschied zwischen den Aggregations- und den ESC-Chimären festzustellen. Beide Chimärtypen unterscheiden sich nicht in der Zahl der aus PG-Donorzellen differenzierten Nerven- und Stützzellen. Das Potenzial von PG-Stammzellen, funktionsfähige dopaminerge Neuronen zu bilden, wurde in den beiden Chimärtypen vergleichend analysiert. In beiden Chimärtypen wurden von PG-Donorzellen abstammende dopaminerge Neuronen nachgewiesen. Sowie für die Neuronen- und die Astrozytenzahl konnte auch für die Anzahl dopaminerger Neuronen kein signifikanter Unterschied zwischen Aggregations- und ESC-Chimären beobachtet werden. N2 - Uniparental stem cells such as parthenogenetic stem cells (PGSCs) have attracted attention as an alternative way to derive pluripotent stem cell lines with histocompatibility and ethical advantages. Therefore, uniparental stem cell are considered as a suitabel source for future clinical applications and replacement therapy. To further characterize the development potential of murine PGSC, we analyzed the contribution of donor-derived cells in PG aggregation chimeras (PG-ICM) as compred to parthenogentic embryonic stem cells chimeras 8PG-ESC) in E14.5 mice brains. Donor- derived cells were quantified within 4 brain regions: medulla, cortex, striatum, and hypothalamus. The medulla was used as a control area against which PG donor cell distribution was compared (Keverne et al., 1995). Histological analyses showed that PG-ICM chimeras have a restricted cell contribution of donor-derived cells. The donor cells showed a preference for telencephatic structures like cortex 114% and straitum 150% and are less frequently detected in diencephalic strructures like hypothalamus 92,4%. In contrast, the frequency of donor-derived cells in PG-ESC chimeras was found to be cortex/striatum 52% and hypothalamus 75%. Our findings indicate that PG-ES cells and PG-ICM differ in their contribution tob rain development, which establishes a basic for studying the molecular processes and the nature of ICM and ESCs. KW - Stammzellen KW - Stammzellen Chimär Maus Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-155703 ER - TY - THES A1 - Serfling, Sebastian T1 - Funktion der Histon-Demethylase Kdm6a während der Teratombildung T1 - Function of the histone demethylase KDM6A during teratoma formation N2 - Pluripotente Zellen sind sowohl in der Stammzellforschung als auch für regenerative Therapieansätze von großer Bedeutung. Erste Stammzelltherapien sind bereits erfolgreich am Menschen durchgeführt worden. Besonders wichtig ist die Sicherheit der Therapie, um Risiken, wie die „Entartung“ von Stammzellen zu Tumorzellen, zu minimieren. Als Ansatzpunkt für einheitliche Therapie-Standards, sind z.B. genaue Angaben zur Anzahl injizierter Zellen, dem Injektionsort und Biomarker (wie Pluripotenz- und Differenzierungs-Marker) zur Kategorisierung der Stammzellen zu nennen. Während der Embryonalentwicklung spielen die Polycomb-Proteinkomplexe PCR1 und PCR2 eine maßgebliche Rolle beim Aufrechterhalten der Pluripotenz, weil sie Chromatin-Modifikationen, wie z.B. Histonmethylierungen vermitteln und so die Genexpression kontrollieren können. Lange Zeit wurde angenommen, dass Histon-Methylierungen irreversibel sind, doch mit Entdeckung der Lysin-spezifischen Demethylase 1 (LSD1) wurde diese Sichtweise revidiert. Ein Mitglied der derzeit bekannten 32 Histon-Demethylasen ist Kdm6a (UTX), die die Histon-Demethylierung des Lysins an der Aminosäure-Position 27 von Histon H3 (H3K27me2/3) katalysiert. Kdm6a spielt eine wichtige Rolle bei der Embryogenese und wurde in der hier vorgestellten Arbeit am Teratommodell, einem benignen Keimzelltumor, untersucht. In dieser Arbeit wurden Teratome von Mäusen untersucht, die aus embryonalen Stammzellen (ESC) mit Wildtyp- und shRNA vermittelter reduzierter Expression oder durch genetisch kontrollierten Knockdown sowie Knockout entstand sind. Diese wurden anschließend nach histologischen (H&E-Färbungen), histochemischen (PCNA-, SSEA-1- und TUNEL-Färbungen) sowie Analyse der Genexpressionsmuster aller drei Keimblätter mittels RT-PCR untersucht und ausgewertet. Sowohl Wildtyp als auch Kdm6a-Knockdown und Knockout-Teratome bildeten Gewebe der drei Keimblätter aus. In Teratomen mit supprimierter Kdm6a-Expression gab es jedoch Unterschiede in der Bildung mesodermaler und endodermaler Gewebe mit einer signifikanten Abnahme von Knorpel- und Muskelgewebe. Da sich Kdm6a-defiziente Teratome zu wesentlich größeren Tumoren als Wildtyp-Teratome entwickelten, wurde deren Proliferations-, Pluripotenz- und Apoptose-Verhalten mittels PCNA und SSEA-1 und TUNEL histochemischen Färbungen untersucht. Wir beobachteten in Knockout-Teratomen eine höhere Anzahl von PCNA- und SSEA-1-positiven Zellen. Daraus folgt, dass Kdm6a-defiziente ESCs - im Gegensatz zu Wildtyp ESCs - zur Bildung von Teratomen mit einer höheren Anzahl von proliferierenden und pluripotenten Zellen neigen. In der Fraktion apoptotischer Zellen (TUNEL positiver Zellen) der Kdm6a-defizienten Teratome gab es keinen signifikanten Unterschied zu Teratomen, die aus Wildtyp-ESCs entstanden. Nach Analyse der Genexpressionsmuster fanden wir in Zellen, in denen Kdm6a reprimiert bzw. deaktiviert wurde, einen Verlust der Pluripotenz und folglich eine starke Reduzierung der Pluripotenzmarker Oct4, Sox2 und Nanog. Die Analyse des Genexpressionsmusters läßt vermuten, dass der Verlust bzw. die Abnahme der Kdm6a-Aktivität in direkten Zusammenhang mit einer Abnahme der Pluripotenz durch Methylierung von H3K27 steht. Weitere Analysen, z.B. durch ChIP (Chromatin Immun-Präzipitations-) Assays mit H3K27me2/3 spezifischen Antikörpern, sind nötig, um dies endgültig zu beweisen. Unsere Arbeiten zeigten, dass die Kdm6-Demethylase-Aktivität essentiell für den Erhalt der Pluripotenz von embryonalen Stammzellen ist. N2 - The histone demethylase KDM6A is essential to maintain pluripotency in teratoma cells and for mesodermal differentiation. Also the KDM6A knockout teratomas are bigger and exhibit an increased cell proliferation rate KW - Histon-Demethylase Kdm6a KW - kdm6a KW - UTX KW - Histon-Demethylase Kdm6a Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-140473 ER - TY - THES A1 - Melzer, Juliane T1 - Die Funktion der p21-aktivierten Kinase Mbt in Neuroblasten während der Entwicklung des zentralen Nervensystems von Drosophila melanogaster T1 - The function of the p21-activated kinase Mbt in neuroblasts during the development of the central nervous system of Drosophila melanogaster N2 - p21-aktivierte Kinasen regulieren zahlreiche zelluläre Prozesse, die während der Entwicklung, aber auch beispielsweise bei der Krebsentstehung, von zentraler Bedeutung sind. Mbt, das einzige Typ II PAK-Protein von Drosophila melanogaster, spielt eine Rolle bei der Gehirnentwicklung. Eine Nullmutation von mbt, mbtP1, bildet kleinere Gehirne mit stark verkleinerten Pilzkörpern aus. In dieser Arbeit wurde die Funktion von Mbt in Neuroblasten untersucht. Mbt wurde als Teil des apikalen Proteinkomplexes in Neuroblasten des Zentralhirns nachgewiesen. Die apikale Lokalisation von Mbt ist Zellzyklus-abhängig und wird über Bindung an Cdc42 reguliert. Sie ist essentiell für die Funktion von Mbt in Neuroblasten. Trotz apikaler Mbt-Lokalisation in Neuroblasten zeigte die mbt Nullmutante keine Defekte des basalen Mechanismus der asymmetrischen Zellteilung. Mud zeigte geringfügige Lokalisationsveränderungen, die auf einen möglichen Einfluss von Mbt hinweisen. Obwohl PAKs zentrale Regulatoren des Zytoskeletts sind, zeigte die mbtP1 Mutante keine offensichtlichen Veränderungen des Aktin- und Tubulin-Zytoskeletts. Armadillo, ein Aktin-assoziiertes Mbt-Substrat, zeigte ebenfalls keine Lokalisationsveränderung in Neuroblasten. Mbt steuert jedoch die apikale Anreicherung von Cno, einem weiteren Aktin-assoziierten Protein, in Neuroblasten. Darüber hinaus beeinflusst Mbt die Zellgröße von Neuroblasten, sowie deren Proliferationspotenzial und Überleben. mbtP1 Neuroblasten sind kleiner als wildtypische Neuroblasten, haben ein geringeres Proliferationsvermögen und eine geringere Überlebenswahrscheinlichkeit. Der Zelltod von Neuroblasten ist jedoch ein sekundärer Effekt. Daher kann eine Blockierung von Apoptose den adulten Pilzkörperphänotyp nicht retten. Signalwege, die Zellgröße und Proliferation regulieren, wurden auf eine Beteiligung von Mbt hin analysiert. mbtP1 induzierte leichte Effekte im Insulin-Signalweg und die Delokalisation eines nukleolären Proteins. Eine genetische Interaktion von mbtP1 mit Mutationen in Genen des klassischen MAPK-Signalweges identifzierte mbt als Positivregulator dieses Signalweges im Auge. Ein ähnlicher, schwächerer Effekt wurde auch bzgl. der Proliferation und Größe von Neuroblasten beobachtet. Eine 2D-Gelanalyse von Larvengehirnen identifizierte Bic und Hsp83 als mögliche von Mbt regulierte Proteine. Diese Arbeit charakterisiert eine bisher unbekannte Funktion der p21-aktivierten Kinase Mbt in neuronalen Stammzellen und liefert damit Ansatzpunkte für eine detaillierte Aufklärung der Funktionsmechanismen von Typ II PAKs bei der Regulation von Zellproliferation und Überleben N2 - p21-activated kinases regulate numerous cellular processes central not only during development, but also for example for cancer pathogenesis. Mbt, the only type II PAK in Drosophila, regulates brain development. The mbt null mutant mbtP1 exhibits reduced brain size, with the mushroom bodies showing the most pronounced reduction. In this work, the function of Mbt in neuroblasts was investigated. Mbt was identified as a component of the apical protein complex in central brain neuroblasts. The apical localization of Mbt was cell cycle dependent and regulated by binding to Cdc42, which is essential for Mbt function in neuroblasts. Despite apical localization of Mbt, the mbtP1 null allel showed no defects in the basic mechanism of asymmetric cell division in larval neuroblasts. However, Mud showed minor localization changes indicating a possible influence of Mbt. Even though PAKs are well-known regulators of the cytoskeleton, no obvious changes in the actin and tubulin cytoskeleton were observed in mbtP1 neuroblasts. The localization of Armadillo, an actin-associated Mbt substrate, was also undisturbed throughout the cell cycle. Mbt controls the apical enrichment of Cno, another actin-associated protein. Moreover, Mbt influences neuroblast cell size, proliferation potential and survival. mbtP1 neuroblasts were smaller than wildtype neuroblasts and showed reduced proliferation activity and survival. However, the apoptotic loss of mbtP1 neuroblasts is a secondary effect. Thus, the adult mushroom body phenotype cannot be rescued by blocking apoptosis. Signalling pathways known to regulate growth and proliferation were analyzed with respect to a possible participation of Mbt. mbtP1 induced slight effects in the insulin pathway and strongly influenced the localization of an unknown nucleolar protein. Genetic interactions of mbtP1 with mutations in genes involved in the classical MAPK pathway identified mbt as a positive regulator of the MAPK pathway. A similar effect was also observed with respect to neuroblast proliferation and size. A 2D gel analysis of larval brains identified Bic and Hsp83 as candidate proteins, that might be regulated by Mbt. This work characterizes a novel function of the p21-activated kinase Mbt in neural stem cells. It provides starting points for a detailed analysis of the mechanisms of type II PAK functions in the control of cell growth, proliferation and survival. KW - Taufliege KW - Auge KW - Ontogenie KW - Pilzkörper KW - Molekularbiologie KW - p21-aktivierten Kinase KW - PAK KW - Neuroblast KW - Pilzkörper KW - Drosophila melanogaster KW - p21 activated kinase KW - PAK KW - neuroblast KW - mushroombody KW - Drosophila melanogaster Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85619 ER - TY - THES A1 - Brousos, Nikos Alexander T1 - Mesenchymale Stammzellen: Analyse der Auswirkungen des Einsatzes von humanem Serum in der Langzeitkultur sowie des Entwicklungspotentials im Blastozystenmodell T1 - Mesenchymal stem cells: The effect of human serum in long term culture and the developmental potential in the blastocyst model N2 - Mesenchymale Stammzellen (MSCs) sind multipotente adulte Stammzellen. Sie können aus einer Vielzahl verschiedener Gewebe isoliert werden, z.B. aus Knochenmark (BM), Fettgewebe (AT) und Nabelschnurblut (CB). Besondere Bedeutung haben MSCs als mögliche Zellquelle für neuartige klinische Stammzelltherapien, da sie relativ einfach aus adulten Patienten isoliert und in vitro expandiert werden können. Grundlage für die erforschten Therapieansätze ist häufig das Entwicklungspotential der MSCs. Es umfasst mesenchymale Zelltypen wie Adipozyten, Chondrozyten und Osteoblasten, aber auch nicht-mesenchymale Zelltypen wie z.B. Hepatozyten oder Nervenzellen. Das Entwick-lungspotential von MSCs zu nicht-mesenchymalen Zelltypen ist jedoch umstritten und viele Differenzierungswege sind bisher nur in vitro gezeigt. Außerdem ist unklar, ob MSCs aus verschiedenen Ursprungsgeweben dasselbe Entwicklungspotential besitzen. Ein Ziel dieser Arbeit war deshalb das in vivo Differenzierungspotential von CB-, AT- und BM-MSCs vergleichend zu untersuchen. Dazu wurden die MSCs in murine Tag-3-Blastozysten injiziert. Diese wurden dann in Foster-Mäuse transferiert und die daraus entstandenen Embryonen am Tag 16 der Embryonalentwicklung (E16.5) analysiert. Dazu wurde gDNA aus verschiedenen embryonalen Geweben isoliert und mittels humanspezifischer quantitativer real-time PCR (qPCR) die Verteilung sowie das Ausmaß der humanen Donorkontribution bestimmt. Außerdem sollte der Differenzierungsstatus der humanen Zellen mittels in situ Hybridisierung und Antikörperfärbung analysiert werden... N2 - Mesenchymal stem cells (MSCs) are multipotent adult stem cells. They can be isolated from a multitude of tissues including bone marrow (BM), adipose tissue (AT) and cord blood (CB). MSCs gained special importance as potential cell source for novel stem cell-based therapies, because their isolation is relatively easy from patients and they can be expanded in vitro. Current attempts to use MSCs as therapeutic are based on their developmental potential, which includes mesenchymal cell types, for example adipocytes, chondrocytes and osteoblasts as well as the non-mesenchymal cell types like hepatocytes and neural cell types. The developmental potential of MSCs towards non-mesenchymal cell types is controversial and so far often only showed in vitro. Further, it is not clear whether MSCs from different tissue origins have the same developmental potential. Hence the aim of this thesis was to evaluate and compare the in vivo differentiation potential of human MSCs from CB, BM and AT. Therefore MSCs were injected in murine embryonic day 3.5 blastocysts. Then the blastocysts were transferred into foster mice and the developing E 16.5 embryos were analyzed. For this analysis gDNA from a variety of embryonic tissues was isolated. Distribution and degree of human donor contribution was determined by quantification of the human gDNA sequences in the samples with human specific quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR). In addition it was planned to analyze the differentiation status of the human cells by immunhistochemistry and in situ hybridization ... KW - Stammzelle KW - Mesenchym KW - Zelldifferenzierung KW - mesenchymale Stammzellen KW - MSC KW - Blastozysteninjektion KW - Seneszenz KW - humanes Serum KW - Entwicklungspotential KW - mesenchymal stem cells KW - blastocyst injection KW - senescence KW - human serum KW - developmental potential Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-70401 ER - TY - THES A1 - Wruck, Robert T1 - Wachstums- und Sekretionsverhalten humaner fetaler Lungenfibroblasten nach Applikation von Gamma-Strahlung in vitro T1 - Growth and secretion behavior of human fetal lung fibroblasts after application of gamma-radiation in vitro N2 - Der wesentliche Dosis limitierende Faktor einer Strahlentherapie thorakaler Malignome ist die Strahlenempfindlichkeit des Lungenparenchymes, da sich mit einer Häufigkeit von 25-75 % aller Patienten ein Strahlenschaden des Lungengewebes entwickeln kann. Die Inzidenz einer Lungenfibrose nach 6- 12 Monaten liegt bei 15-30%. Die Kombination zytostatischer Medikamente mit ionisierender Strahlung kann die Ansprechraten verbessern, kann andererseits die Inzidenz einer Pneumonitis erhöhen. Die konkreten Mechanismen, die zu einer Pneumonitis und einer strahleninduzierten Fibrose führen, sind bislang noch nicht vollständig bekannt. Es wird vermutet, daß die ortsständigen Zellen der Lunge eine aktivere Rolle in der Pathogenese als bisher angenommen, einnehmen. Tiermodelle der Strahlenschädiung der Lunge zeigten ein sehr frühe Expression von TGF-ß-mRNA and fibronectin-mRNA nach Bestrahlung. TGF-ß und Fibronectin sind in der BALF und Serum von an thorakalen Malignomen erkrankten, strahlentherapeutisch behandelten Patienten erhöht. Neben Makrophagen und Typ II Pneumocyten als zelluläre Quellen der genannten Cytokine, sind Fibroblasten in der Lage beide Agentien in erheblichem Umfang zu synthetisieren. Ziele Um die aktive Rolle von Fibroblasten in der Pathogenese der strahleninduzierten Lungenfibrose in Abwesenheit von Entzündungszellen zu untersuchen, bestrahlten wir Lungenfibroblasten in vitro und beobachteten folgende Parameter. 1. Zellwachstum 2. Synthese von Fibronectin 3. Synthese von Kollagen ( Procollagen-I-Peptid) 4. Synthese von TGF-ß1 Methoden Humane fetale Lungenfibroblasten (MRC-5 ,ICN Biochemicals Eschwege ,Deutschland) wurden in DME Medium kultiviert unter Zugabe von 10% FCS plus L-Glutamine, Penicillin G , Amphotericin B und Gentamycin; Luftfeuchtigkeit 100% , Temperatur 37°, CO2 5%, Medienwechsel erfolgten zweimal wöchentlich und 24 Stunden vor den Messungen. 24h nach der Aussaat der Zellen erfolgte die Strahlenapplikation (CO 60; 4.5, 7.5, 10.5 Gy ). Messungen erfolgten an den Tagen 3,6,9,12,15 nach Bestrahlung. Hierfür wurden folgende Materialien verwandt. Fibronectin (ELISA), Takara TGF beta (ELISA), DPC Biermann Procollagen-I-Peptide (ELISA), Takara LDH ( kinetischer Assay), Sigma Cell counts (Zählkammer) Alle Messungen wurden zweimal unternommen. Ergebnisse: 1. Das Zellwachstum wurde dosisabhängig gehemmt. 2. Beginnend am 3 Tag stieg die Syntheserate des Fibronectin dosisabhängig. 3. Ähnliche Beobachtungen wurde bzgl der Procollagen-I-Peptid Synthese beobachtet. 4. TGF-ß Spiegel fanden sich nach Bestrahlung ab Tag 6 bis zum 4-fachen über dem Ausgangswert erhöht und kehrten ziwschen den Tagen 9 und 15 auf das Ausgangsniveau zurück. 5. Eine Erhöhung des LDH wurde nicht beobachtet. Dies zeigte, dass eine Zytolyse kein wesentlichen Einfluß hatte. Disskusion: Bei Bestrahlung humaner fetaler Lungenfibroblasten wird das Zellwachstum dosisabhängig limitiert. Dies wurde nicht durch einen strahlenbedingt erhöhten Zelltod hervorgerufen , da das bestimmte LDH ( ein Marker der Zytolyse) in den Zellkulturüberständen nicht erhöht war. Wir vermuten, das durch Bestrahlung eine Differenzierung von Progenitor Fibroblasten zu postmitotischen Fibrocyten erfolgte, wie auch bereits von anderen Arbeitsgruppen berichtet. TGF-ß fand sich nach Bestrahlung in den Zellkulturüberständen deutlich erhöht. Es wird angenommen , daß TGF-ß eine Schlüsselrolle in der Pathogenese fibrosierender Erkrankungen der Lunge, der Leber, der Niere spielt und ebenso in die Enstehung der durch ionisierende Bestrahlung hervorgerufene Lungenfibrose eingebunden ist. Unsere Experimente haben gezeigt , daß Fibroblasten in der Lage sind große Mengen TGF-ß and Fibronectin - sogar in Abwesenheit von Entzündungszellen- zu erzeugen und sich vermutlich autokrin stimulieren können. Dieser Mechanismus wird als wichtiger Co-Faktor in der Pathobiologie verschiedener zur Fibrose führender Lungenerkrankungen angenommen. Schlussfolgerung Fibroblasten produzieren erhöhte Mengen TGF-ß und Fibronectin nach Applikation ionisierender Strahlung. Sie könnten in der Pathogenese der Strahlenschädigung der Lunge eine aktivere Rolle spielen als bisher angenommen. N2 - Introduction The major dosis limiting factor of radiation therapy of thoracic malignomas is the lung which may develop radiation injury with a frequency of 25-70% of patients .The incidence of lung fibrosis after 6-12 months ist 15-30 %. Combination of cytostatic drugs with ionizid radiation can improve response rates, but may result in a higher incidence of pneumonitis. The exact mechanisms leading to pneumonitis and radiation induced fibrosis of the lung are yet unknown.The structural cells of the lung are of the lung are probably involved in the pathogenesis in a more active way than thougt until now. Animal models of radiation injury of the lung showed a very early expression of TGF-beta -mRNA and fibronectin-mRNA after irradiation. TGF-ß and Fibronectin were elevated in BALF and in serum. Macrophages and type-II-pneumocytes are thought to be the cellular source, but fibroblasts also are capable to synthesize both agents in large amounts. Aims In order to investigate the active role of fibroblasts in the pathogenesis of radiation fibrosis we irradiated human lung fibroblasts in vitro. We focused on following points: 1. cell growth 2. synthesis of fibronectin 3. synthesis of collagen (procollagen-I-peptid) 4. synthesis of TGF-beta-1 Methods Human fetal lung fibroblasts (MRC-5 ,ICN Biochemicals Eschwege ,Germany) cultured in DME-medium plus 10 % FCS plus L-glutamine, penicillin G, amphotericin B and gentamycine; air humidity 100 %, temp. 37°C, CO2 5%; change of medium twice weekly and 24 hr. before measurements. 24hrs. after seeding, application of ionizing radiation (CO 60; 4.5, 7.5, 10.5 Gy ). Measurements on day 3,6,9,12,15 after irradiation: Fibronectin (ELISA), Takara TGF beta (ELISA), DPC Biermann Procollagen-I-Peptide (ELISA), Takara LDH ( kinetic assay), Sigma Cell counts (counting chamber) All measurements have been done twice. Results 1. cell growth was inhibited in a dose dependent manner. 2. Beginning at day 3 cell related synthesis of fibronectin was increased depending on the dose of irradiation. 3. Similar observations were made in synthesis of procollagen-I-peptide. 4. TGF-beta levels were increased four fold after irradiation beginning on day 6 and returned to basal values between day 9 and 15 (the cells treated with 10.5 Gy were an exception. Here we found a furthermore higher secretion rate ). 5. No elevation of LDH was noticed, showing that cytolysis was not important in these effects. Discussion Irradiation of fetal human lung fibroblasts inihibited cell growth in a dose depend manner. This was not due to cell death initiated by ionizing rays, because LDH ( marker of cytolysis) was not elevated in culture supernatants. We assume that irradiation induces differentiation of progenitor-fibroblasts to promitotic fibrocytes as reported by other groups. TGF-beta was considerably elevated in culture supernatants after irradiation. TGF-beta is assumed to play a key role in fibrosing disease of lung, liver and kidney and may be involved in radiation induced lung fibrosis as well. Our experiments show, that fibroblasts are able to produce high amounts of TGF-beta and fibronectins - even if inflammatory cells are absent- and may stimulate themselves in an autocrine manner.This mechanism is thought to be an important co-factor in the pathobiology of different fibrosing disorders of the lung and may be important in radiation injury of the lung as well. Conclusion Fibroblasts produce increased amounts of TGF-beta and fibronectin after irradiation. They may play a more active role in the pathogenesis of radiation injury than thought up to now. KW - Ionisierende Strahlung KW - Strahlentherapie KW - Lungenfibrose KW - Fibroblast KW - Transforming Growth Factor beta 1 KW - Prokollagen KW - Fibronectin KW - Radiation KW - radiation therapy KW - pulmonary fibrosis KW - fibroblast KW - transforming growth factor beta 1 KW - procollagen KW - fibronectin Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-70698 ER - TY - THES A1 - Stark, Felix T1 - Funktionelle Untersuchungen zur Regulation der Protein Kinase CK2 durch Polyamine in Drosophila melanogaster und deren physiologische Bedeutung T1 - Functional analysis of the regulation of the protein kinase CK2 by polyamines in Drosophila melanogaster and its psyiological meaning N2 - Die heterotetramere Proteinkinase CK2 nimmt aufgrund der großen Anzahl und Diversität ihrer Substrate, sowie aufgrund ihrer Eigenschaft Signalwege miteinander zu vernetzen eine Sonderstellung innerhalb der Kinasen ein. CK2 beeinflusst Proliferation, Differenzierung und Apoptose, Prozesse an denen auch Polyamine und der MAPK-Signalweg beteiligt sind. Eine vor kurzem durchgeführte Arbeit beschreibt die Bindung von CK2 an das Gerüstprotein KSR und die Verstärkung des MAPK-Signalwegs durch Phosphorylierung von Raf-Proteinen in Vertebraten. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass CK2 auch in Drosophila mit KSR interagiert und das einzige in Drosophila vorhandene Raf-Potein (DRaf) in vitro phosphoryliert. Im Gegensatz zur Phosphorylierung der humanen B-Raf und C-Raf Proteine an Serin 446 bzw. Serin 338 innerhalb der „negative charge regulatory region“ (N-Region), führten Kinasereaktionen und Massenspektrometrische Untersuchungen zur Identifizierung von Serin 11 als CK2 Phosphorylierungsstelle in DRaf, während ein zu Serin 446 in B-Raf äquivalentes Serin in der N-Region in Drosophila nicht durch CK2 phosphoryliert wird. Durch Überexpression von DRaf sowie von zwei DRaf-Varianten bei denen Serin 11 durch Alanin oder Aspartat substituiert wurde (DRafS11A und DRafS11D) konnte in Zellkulturexperimenten gezeigt werden, dass die Ladung an der Aminosäureposition 11 die Funktion von DRaf beeinflusst, wobei eine negative Ladung an dieser Stelle zur Phosphorylierung und Aktivierung der Effektorkinase Erk führt. Die Phosphorylierung durch CK2 ist unabhängig von regulatorischen Botenstoffen ("second messengers"), wird aber durch Bindung von Polyaminen moduliert. Intrazelluläre Polyamine entstammen zum grossen Teil dem zellulären Aminosäurekatabolismus und beeinflussen die Phosphorylierung von DRaf durch CK2 in vitro, wobei Spermin ein effizienter Inhibitor der Reaktion ist, während die Effekte von Putrescin und Spermidin gering sind. Auch in Drosophila Schneider S2 Zellen und in adulten weiblichen Fliegen hat Spermin einen inhibitorischen, CK2-abhängigen Effekt auf die Aktivierung von Erk. Ausserdem konnte gezeigt werden, dass Putrescin und Spermidin in der Lage sind die Aktivierung von Erk, im Vergleich zu Zellen die nur mit Spermin behandelt wurden, zu erhöhen. Das spricht dafür, dass die Phosphorylierung von DRaf und die davon abhängige Aktivierung von Erk durch CK2 von der Menge und Relation der verschiedenen Polyamine zueinander abhängt. Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen den Schluss zu, dass der Polyaminmetabolismus über CK2 mit dem MAPK-Signalweg verknüpft ist. Nachdem Polyamine durch Aminosäurekatabolismus enstehen, kann auf diese Weise der MAPK-Signalweg in Abhängigkeit der Verfügbarkeit zellulärer Aminosäuren reguliert werden. Vorversuche zeigten eine Beeinflussung von Proliferation und Apoptose durch CK2 und Polyamine. Weitere Untersuchungen sind aber nötig um spezifische Einflüsse von Polyaminen und CK2 auf zelluläre Prozesse wie Proliferation, Differenzierung und Apoptose aufzudecken. N2 - Because of its high number and diversity of substrates, as well as its ability to cross-link signalling pathways, the heterotetrameric protein kinase CK2 has an exceptional position within kinases. CK2 influences proliferation, differentiation and apoptosis, processes in which also polyamines and the MAPK-signalling pathway are involved. A recent publication delineates binding of CK2 to the scaffold protein KSR and the enhancement of the MAPK-signalling pathway by phosphorylation of Raf-proteins in vertebrates. In my thesis I could show that CK2 also interacts with KSR in Drosophila and phosphorylates the only existing Raf protein in Drosophila (DRaf) in vitro. In contrast to the phosphorylation of human B-Raf- and C-Raf-proteins on serine 446 respectively serine 338 within the "negative charge regulatory region" (N-region), kinase reactions and mass spectrometric analyses led to the identification of serine 11 as phosphorylation site in DRaf, whereas a serine in the N-region, which corresponds to serine 446 of B-Raf, is not phosphorylated by CK2 in Drosophila. In cell culture experiments overexpression of DRaf and two DRaf-variants, in which serine 11 was substituted by alanine or aspartate (DRafS11A and DRafS11D), revealed the charge at amino acid position 11 to affect the function of DRaf, with a negative charge leading to phosphorylation and activation of the effector kinase Erk. Phosphorylation by CK2 is independent of second messengers, whereas it is modified by binding of polyamines. Intracellular polyamines mainly derive from cellular amino acid catabolism and modulate the phosphorylation of DRaf by CK2 in vitro with spermine being an efficient inhibitor of the reaction, whereas the effects of putrescine and spermidine are minor. In Drosophila Schneider S2 cells and adult flies spermine inhibits the activation of Erk in a CK2-dependent way. Furthermore administration of putrescine and spermidine in combination with spermine leads to enhanced Erk activation in cells compared to cells that are treated with spermine. These results suggest that phosphorylation of DRaf and the subsequent activation of Erk by CK2 are dependent on the amount and relative concentrations of polyamines. Altogether the results of this work demonstrate a role for CK2 in linking polyamine metabolism to the MAPK-signalling pathway. Since polyamines derive from amino acid catabolism, the MAPK-signalling pathway can be regulated dependent on the availability of cellular amino acids. Preliminary experiments point to CK2- and polyamine-dependent effects on proliferation and apoptosis. Further investigations are necessary to reveal specific effects of polyamines and CK2 on cellular processes like proliferation, differentiation and apoptosis. KW - Protein Kinase CK2 KW - Polyamine KW - MAP-Kinase KW - Signaltransduktion KW - Taufliege KW - Raf KW - MAPK-Signalweg KW - Drosophila melanogaster KW - DRaf KW - protein kinase CK2 KW - polyamines KW - MAPK signalling pathway KW - Drosophila melanogaster KW - DRaf Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-57522 ER - TY - THES A1 - Gesser, Martin Benedikt Ambros T1 - Optimierung eines Balanced Lethal Systems für Salmonella Typhi Ty21a T1 - Optimisation of a balanced lethal system in Salmonella Typhi Ty21a N2 - Das Projekt „Balanced Lethal System in Salmonella typhi Ty21a“ der AG Bakterielle Tumortherapie des MSZ zielt auf die Entwicklung eines Vakzinstammes, der in der humanen Krebstherapie zum Einsatz kommen soll. Ziel dieser Arbeit war das zuvor etablierte Balanced Lethal System in Salmonella typhi Ty21a zu optimieren. N2 - The aim of this project is to develop a bacterial vaccine that will be used in cancer immunotherapy. The aim of this dissertation was to improve the established balanced lethal system in Salmonella typhi Ty21a. KW - Immuntherapie KW - Balanced Lethal System KW - Salmonella typhi KW - Vakzinierung KW - Prostatakarzinom KW - Immuntherapie KW - Balanced Lethal System KW - Salmonella typhi KW - Vakzinierung KW - Prostatakarzinom KW - Immunotherapy KW - balanced lethal system KW - salmonella typhi KW - vaccine KW - prostate cancer Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-55740 ER - TY - THES A1 - Rechtenwald, Christian T1 - Charakterisierung und Weiterentwicklung eines Balanced Lethal Systems in \({Salmonella}\) \({spp}\) T1 - Characterization and further development of a balanced lethal system in \({salmonella}\) \({spp}\) N2 - Charakterisierung und Weiterentwicklung eines Systems zur antibiotikafreien Plasmidstabilisierung und Sekretion heterologer Antigene über das Hämolysin a-Sekretionssystem in attenuiereten Salmonella-Stämmen. Ziel ist die Entwicklung tumorspezifischer Vakzine. N2 - Characterization and further development of a system for antibiotic-free plasmid stabilization in attenuated salmonella strains and secretion-enabling of heterologous antigens via the hemolysin a-secretion system. Goal is the development of tumor-specific vaccines. KW - Salmonella KW - Balanced lethal Systeme KW - Stabilisierung von Plasmiden KW - Tumorvaccine KW - Immuntherapie KW - Balanced lethal Systeme KW - Salmonella typhi KW - Balanced lethal System KW - Salmonella typhi Ty21a KW - immunotherapy Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-71092 ER - TY - THES A1 - Götz, Andreas T1 - Replikation von enteroinvasiven Escherichia coli und Salmonella enterica Serovar Typhimurium Stämmen in Epithelzellen unter besonderer Betrachtung des Kohlenstoffmetabolismus T1 - Replication of enteroinvasive Escherichia coli and Salmonella enterica Serovar Typhimurium strains in epithelial cells with particular examination of the carbon metabolism N2 - Schlagwörter: Salmonella , Salmonella enterica , Salmonella typhimurium , Salmonellose , Escherichia coli , Shigella , Infektion , Bakterielle Infektion , Zellkultur , HeLa-Zelle , Apoptosis , Metabolismus , Stoffwechsel , Glucose , Glucosetransport , Glucosestoffwechsel , Katabolismus , Kohlenstoff , Kohlenstoffbedarf , Kohlenstoffhaushalt , Kohlenstoffstoffwechsel , Kohlenstoff-13 , Kohlenstoffisotop Salmonella Typhimurium und enteroinvasive E. coli (EIEC) sind fakultativ intrazelluläre Bakterien aus der Familie der Enterobacteriaceae. Während erstere sich nach der Internalisierung durch eukaryotische Zellen normalerweise in einem spezialisierten Phagosom, der Salmonella-enthaltenden Vakuole (SCV), vermehren, replizieren EIEC im Zytoplasma der Wirtszellen. In der vorliegenden Arbeit wurde zunächst durch Mikroinjektion die Fähigkeit von S. Typhimurium 14028s untersucht, ebenfalls im Zytoplasma von Caco-2-Zellen replizieren zu können. Dabei wurde festgestellt, daß ein früher als S. Typhimurium 14028s WT bezeichneter Stamm eine Insertion eines Desoxythymidins an Position 76 des offenen Leserasters von rfbP trägt, einem Gen, dessen Protein an der LPS-Synthese beteiligt ist. Weiterhin synthetisierte dieser Stamm ein rauhes LPS. Aufgrund von Agglutination konnte der Rauh-Stamm nur mit geringem Erfolg mikroinjiziert werden. Hingegen lag 5 h nach der Mikroinjektion einer nicht invasiven Mutante von Salmonella mit vollständigem LPS der Anteil an Caco-2-Zellen, die mehr als 32 Bakterien enthielten, bei etwa 30 %. Der Anteil war 2-3 mal höher als bei früheren Mikroinjektionen in HeLa-Zellen. Daher wurde das Verhalten von HeLa-Zellen nach einer Infektion durch S. Typhimurium ΔsifA - einer Mutante, die aus der SCV ins Zytoplasma entkommt - untersucht. Dabei wurde festgestellt, daß die sifA-Mutante 10 h nach der Infektion die Aktivität der Caspasen 9 und 3 in HeLa-Zellen, aber nicht in Caco-2-Zellen induziert. In weiteren Versuchen wurde die Bedeutung von Glukose, Glukose-6-phosphat und Mannose als Kohlenstoffquellen für die extra- und intrazelluläre Replikation zweier Isolate enteroinvasiver E. coli und eines S. Typhimurium Stammes analysiert. Zu diesem Zweck wurden zunächst definierte Mutanten in den beiden wichtigsten Phosphoenolpyruvat-abhängigen Phosphotransferasesystemen (PTS) für die Aufnahme von Glukose und Mannose, ptsG und manXYZ, sowie im Antiporter für die Aufnahme von Glukose-6-phosphat, uhpT, konstruiert. Bei Wachstum im Minimalmedium mit Glukose als einziger C-Quelle waren die Generationszeiten aller ΔptsG- und ΔptsG, manXYZ-Mutanten im Vergleich zu den Wildstämmen deutlich verlängert. Ebenso wuchsen ΔmanXYZ-Mutanten bzw. ΔuhpT-Mutanten deutlich langsamer auf Mannose bzw. Glukose-6-phosphat. Jedoch ergaben sich hierbei Stamm-spezifische Unterschiede. So erreichte EIEC 4608-58 ΔuhpT in der stationären Phase eine ähnliche Zelldichte wie der Wildstamm in Gegenwart von Glukose-6-phosphat und eine ΔptsG, manXYZ-Mutante von S. Typhimurium 14028s konnte immer noch effizient mit Glukose wachsen. Infektionsversuche mit Caco-2-Zellen zeigten weiterhin, daß die Deletion von ptsG zu einer signifikanten Erhöhung der Adhärenz und Invasivität von EIEC 4608-58 führt, während sich die intrazellulären Generationszeiten aller hier untersuchten Mutanten kaum veränderten. Selbst die ΔptsG, manXYZ, uhpT-Dreifachmutanten der drei hier verwendeten Enterobakterien und die ΔptsG, manXYZ, glk-Mutante von S. Typhimurium 14028s konnten immer noch in Caco-2-Zellen replizieren, wenn auch mit Stamm-spezifisch verringerten Geschwindigkeiten. 13C-Markierungsexperimente mit [U-13C6]-Glukose als Substrat ergaben jedoch, daß in der Tat alle hier untersuchten enterobakteriellen Wildstämme Glukose während der Replikation in Caco-2-Zellen unter Zellkulturbedingungen verwerten. Glukose-6-phosphat, Glukonat oder Fettsäuren konnten dagegen als wichtigste Kohlenstoffquellen für das intrazelluläre Wachstum ausgeschlossen werden. EIEC 4608-58 metabolisierte Glukose jedoch weniger effizient als EIEC HN280 und schien zudem noch zusätzlich C3-Substrate aus der Wirtszelle aufzunehmen. Das Markierungsmuster zeigte einen Stamm-spezifischen Kohlenstofffluß durch Glykolyse und/oder Entner-Doudoroff-Weg, Pentosephosphatzyklus, Citratzyklus und den anaplerotischen Reaktionen zwischen PEP und Oxalacetat. Mutanten mit Deletionen in ptsG und manXYZ konnten auf alternative C3-Substrate wechseln und glichen dies durch eine erhöhte Aufnahme von Aminosäuren aus den Wirtszellen aus. N2 - Salmonella Typhimurium and enteroinvasive E. coli (EIEC) are facultative intracellular bacteria belonging to the family of Enterobacteriaceae. After internalisation by eukaryotic cells Salmonella normally resides inside a specialised phagosome called Salmonella-containing vacuole (SCV) whereas EIEC replicates inside the cytosol of host cells. In this study the ability of S. Typhimurium 14028s to replicate inside the cytosol of Caco-2 host cells was investigated by microinjection. It was thereby observed that a formerly used strain also called S. Typhimurium 14028s WT harboured an insertion of one deoxythymidin at position 76 of the rfbP open reading frame, a gene whose protein is involved in the LPS biosynthesis. Furthermore this strain expressed a rough LPS. Due to agglutination the microinjection procedure of the rough strain had only little success. But the percentage of Caco-2 cells that harboured more than 32 bacteria was about 30 % 5 h after injection of a non invasive mutant of Salmonella expressing full-length LPS chains. This was 2-3 times higher than the results observed before using HeLa cells. Therefore, the behaviour of HeLa cells infected by S. Typhimurium ΔsifA - a mutant that escapes from the SCV into the cytosol - was studied. The results showed that the sifA mutant strain induced the activity of caspases 9 and 3 in HeLa cells 10 h after infection but not in Caco-2 cells. In further experiments the contribution of glucose, glucose 6-phosphate and mannose as carbon sources for extra- and intracellular growth of two enteroinvasive E. coli isolates and one S. Typhimurium strain was analysed. Therefore, defined mutants of the most important phosphoenolpyruvate-dependent phosphotransferase systems (PTS) taking up glucose or mannose, i.e. ptsG and manXYZ, were constructed as well as mutants carrying a deletion of uhpT the antiporter for uptake of glucose 6-phosphate. During growth of the resulting ΔptsG and ΔptsG, manXYZ mutants in minimal medium with glucose as sole carbon source considerably longer generation times were observed. Likewise, ΔmanXYZ mutants and ΔuhpT mutants grew significantly slower on mannose or glucose 6-phosphate, respectively. But there were also strain specific differences. EIEC 4608-58 ΔuhpT reached a similar cell density as the wild-type strain during stationary phase when grown in the presence of glucose 6-phosphate and S. Typhimurium ΔptsG, manXYZ could still grow efficiently on glucose. Infections of Caco-2 cells showed that the deletion of ptsG increased the ability of EIEC 4608-58 significantly to adhere and invade these cells. But the intracellular generation times of all mutants under study were hardly changed. Even the triple mutants ΔptsG, manXYZ, uhpT of all three enterobacterial strains and the ΔptsG, manXYZ, glk mutant of S. Typhimurium 14028s were still able to replicate in Caco-2 cells, albeit at strain specific lower rates. 13C-Isotopologue profiling using [U-13C6]glucose as precursor revealed that in deed all analysed enterobacterial wild-type strains utilised glucose for their replication in Caco-2 cells under the applied conditions. Glucose 6-phosphate, gluconate and fatty acids could be ruled out as main carbon sources for intracellular growth. EIEC 4608-58 metabolised the applied glucose less efficiently than EIEC HN280 and seemed to take up C3-compounds from the host cells in addition to glucose. The labelling patterns reflected strain specific carbon fluxes via glycolysis and/or Entner-Doudoroff pathway, pentose phosphate pathway, citric acid cycle and the anaplerotic reactions between PEP and oxaloacetate. Mutants carrying deletions in ptsG and manXYZ switched to alternative C3-substrates and counterbalanced this by an increased uptake of amino acids from the host cells. KW - Escherichia coli KW - Intrazellulärraum KW - Salmonella typhimurium KW - Vermehrung KW - Kohlenstoffstoffwechsel KW - Salmonella KW - Salmonella enterica KW - Salmonella typhimurium KW - Salmonellose KW - Escherichia coli KW - Shigella KW - Infektion KW - Bakterielle Infektion KW - sifA KW - enteroinvasive KW - CaCo-2 cell KW - 13C-isotopologue profiling KW - microinjection Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-57292 ER - TY - THES A1 - Choi, Soon Won T1 - Analyse des neuralen Differenzierungspotentials androgenetischer muriner embryonaler Stammzellen in vitro und in vivo T1 - Analysis of the neural differentiation potential of androgenetic murine embryonic stem cells in vitro and in vivo N2 - Pluripotente embryonale Stammzellen (ES Zellen) sind aufgrund ihrer Selbsterneuerung- und ihrer Multiliniendifferenzierungs-Fähigkeiten interessante Zelltypen sowohl für die Grundlagenforschung als auch für die regenerative Medizin. Uniparentale Zygoten mit zwei väterlichen (androgenetisch: AG) oder zwei mütterlichen (gynogenetisch: GG; parthenogenetisch: PG) Genomen sind nicht in der Lage, lebensfähige Nachkommen zu entwickeln. Sie entwickeln sich jedoch erfolgreich bis zu Blastozysten, aus denen pluripotente ES Zellen abgeleitet werden können. Mit uniparentalen ES Zellen können zum Einen parent-of-origin-spezifische Einflüsse auf die Gewebeentwicklung untersucht und zum Anderen histokompatible und somit therapeutisch relevante Zellpopulationen generiert werden. Obwohl viele Aspekte des in vitro und in vivo Differenzierungspotenzials von PG ES Zellen aus mehreren Spezies in den zurückliegenden Jahren untersucht worden sind, ist das volle Differenzierungspotenzial von AG ES Zellen bisher nicht erschöpfend analysiert worden. Zellen der Inneren Zellmasse (ICM) von PG und AG Embryonen zeigten nach Blastozysteninjektion ortsspezifische Kontribution zur Gehirnentwicklung, wobei PG Zellen bevorzugt im Cortex und im Striatum lokalisierten, während sich AG Zellen verstärkt im Hypothalamus nachzuweisen waren. Aus AG und GG ES Zellen konnten zudem in vitro hämatopoetische Stammzellen differenziert werden, die nach Transplantation im Mausmodell tumorfrei das gesamte hämatopoetische System repopulierten. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass AG ES Zellen ein mit N ES Zellen vergleichbares in vitro und in vivo Differenzierungspotential in der frühen neuralen Entwicklung besitzen. Das Ziel meiner Arbeit war es zu untersuchen, ob murine AG ES Zellen sich zu verschiedenen neuronalen Subtypen entwickeln können und ob sie tumorfrei neurale Zelltypen nach Transplantation bilden können. In dieser Studie wurden AG ES Zellen im Vergleich zu biparentalen (N) ES Zellen in vitro über Embryoid Bodies (EBs) zunächst zu pan-neuronalen Vorläuferzellen (pNPCs) und weiter zu Neuron- und Glialzell-Marker (ß-III Tubulin (Tuj-1), NeuN, TH und GFAP) positiven Zellen differenziert.. Weiterhin wurde das dopaminerge (DA) Differenzierungspotential von AG ES Zellen näher untersucht, indem sie in einem Ko-Kultursystem mit Stromazellen gerichtet differenziert wurden. Diese DA Neurone wurden durch semiquantitative RT-PCR Analysen und immunhistochemische Färbungen für DA Neuronen-spezifische Marker (TH, PITX3, Nurr1) charakterisiert. Darüber hinaus wurde der Imprinting-Status von neun ausgesuchten Loci in AG und N ES, pNPC und DA Zellkulturen durch real-time RT-PCR Analysen untersucht. Die hier analysierten Gene, die im Gehirn allelspezifisch exprimiert werden, zeigten in pNPCs eine parent-of-origin-spezifische Genexpression mit Ausnahme von Ube3a. Nach Blastozysteninjektion wurde die Bildung von DA Neuronen in AG und N fötalen chimären Gehirnen untersucht. Hier zeigte sich, dass TH- and PITX3-positive AG DA Neurone abgeleitet aus ES Zellen im Mittelhirn von E12.5 und E16.5 Chimären detektiert werden konnten. Diese fötalen chimären Gehirne zeigten eine verbreitete und gleichmäßige Verteilung der AG Donorzellen in den Arealen Cortex, Striatum und Hypothalamus. Stereotaktische Transplantationen von AG und N pNPCs in ein „Traumatic Brain Injury (TBI) Model“ zeigten zudem, dass frühe Differenzierungsstufen von AG und N pNPC-Kulturen häufig Teratome generierten. Durch die Transplantation von langzeitdifferenzierten AG oder N pNPC-Kulturen konnte jedoch ein tumorfreies Anwachsen neuronaler und glialer Zellen erreicht werden. Die immunhistochemische Auswertung von Transplantaten bezüglich der Donorzellkontribution im Gehirn erfolgten bis zu drei Monaten nach der Injektion. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass AG ES Zellen neurales Differenzierungspotential, speziell zur Bildung von DA Neuronen, besitzen. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass langzeitdifferenzierte AG und N pNPCs nach Transplantation im traumatisierte Mausgehirnmodell tumorfrei anwachsen und anschließend zu neuralen Zellen differenzieren können. Trotz unbalancierter Genexpression von imprinted Genen lässt sich feststellen, dass AG ES Zellen therapeutisch relevant für zukünftige zelluläre Ersatzstrategien von Nervengewebe sein können. N2 - Pluripotent embryonic stem (ES) cells are interesting cell types both for basic research and for regenerative medicine because of their enormous self-renewal and multi-lineage differentiation capacity. Uniparental zygotes with two paternal (androgenetic: AG) or two maternal (gynogenetic: GG; parthenogenetic: PG) genomes are not able to develop into viable offsprings but develop successfully up to blastocysts, from which ES cells can be derived. Uniparental ES cells can be utilized to study parent-of-origin-specific influences on tissue development and histocompatible, and therapeutically-relevant cell populations could be generated from them. While many aspects of the in vitro and in vivo differentiation potential of PG uniparental ES cells were studied for several species, the capacity of AG ES cells have not been analyzed to the same extent. PG and AG inner cell mass (ICM) cells showed region-specific contribution in brain development following blastocyst injection. While PG cells were preferentially located in the cortex and the striatum, AG cells were most commonly found in the hypothalamus. Hematopoietic cells derived from AG and GG ES cells generated after transplantation long-term repopulating and tumor-free complete hematopoietic engraftments in irradiated transplant recipients. Furthermore, AG and N ES cells also show a comparable in vitro and in vivo neural differentiation potential during early development, The aim of the present study was to investigate whether AG ES cells can develop into specific neuronal subtypes, and whether they can form neural cell types after transplantation, lacking teratoma formation. In this study, AG ES cells and as controls biparental (N) ES cells were differentiated in vitro via embryoid bodies (EBs) into pan-neural progenitor cells (pNPCs) and consequently to cells which expressed a variety of neuron- and glial cell-specific markers, including ß-III tubulin (Tuj-1), NeuN, TH, and GFAP. Furthermore the dopaminergic (DA) differentiation potential of AG ES cells was investigated more closely, by directed neuronal differentiation of AG ES cells in a co-culture system with stromal cells. The resulting neurons were characterized by semi-quantitative RT-PCR analyses and immunohistochemical stainings for DA neuron-specific markers (TH, PITX3, Nurr1). Additionally, the imprinting status of nine selected loci in AG and N ES cell, pNPC and DA cell cultures was studied by real-time RT-PCR analyses. The genes analyzed here, known to be expressed allel-specific in the brain, maintained in pNPCs a parent-of-origin-specific gene expression with the exception of UBE3A.   Following blastocyst injection the formation of DA neurons was studied in the AG and N chimeric fetal brains. TH- and PITX3-positive DA neurons derived from ES AG cells in the midbrain of E12.5 and E16.5 chimeras were detected. These chimeric fetal brains showed a widespread and balanced distribution of AG cells in the brain areas Cortex, Striatum and Hypothalamus. Stereotactic transplantations of AG and N pNPCs in a "Traumatic Brain Injury (TBI) Model" showed that early neural differentiation stages of AG and N pNPC cultures tended to generate teratomas. Importantly, neuronal and glial tumor-free engraftments could be achieved by the transplantation of long-term differentiated AG or N pNPC cultures. The immunohistochemical assessment of the donor cell contribution of individual transplants was performed up to three months post-transplantation. The results presented here show that AG ES cells have DA neuronal differentiation potential, and that long-term differentiated AG and N pNPCs can engraft tumor-free in a brain injury model. In spite of imbalanced imprinted gene expressions my results suggest that AG ES cells could be therapeutically relevant for future cellular replacement strategies of neural tissues. KW - Deutschland / Stammzellgesetz KW - Dopaminerge Nervenzelle KW - Nervenzelle KW - Embryonale Stammzelle KW - Stammzelle KW - Embryonale Stammzelle KW - androgenetisch KW - Differenzierung KW - Imprinting KW - Transplantation KW - embryonic stem cell KW - androgenetic KW - differentiation KW - imprinting KW - transplantation Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48452 ER - TY - THES A1 - Diessner, Ernst Joachim T1 - Konstruktion eines Balanced lethal Systems für Salmonella typhi Ty21a T1 - Construction of a balanced lethal systems for Salmonella typhi Ty21a N2 - Ziel der Arbeit ist unter anderem die Entwicklung von Vakzinen gegen maligne Neoplasien auf der Basis von attenuierten Bakterien. Sie dienen hierbei als Träger von tumorspezifischen Antigenen. Diese können mit Hilfe des E. coli Hämolysin-a-Sekretionssystems von Salmonella-Bakterienstämmen sezerniert werden und eine spezifische Immunreaktion induzieren. Sowohl die Gene, die für das Sekretionssystem kodieren als auch die Gensequenzen des tumorspezifische Antigens sind bei dem Projekt auf dem detailliert beschriebenen Antigendelivery Plasmid pMO kodiert. Die bis dato angewandte Methode der pMO-Plasmidstabilisierung mit Hilfe von Antibiotikaresistenzgenen beinhaltet jedoch zahlreiche, beschriebene Probleme und wird seitens der Behörden in Impfstämmen zunehmend restriktiv gehandhabt. Im Rahmen der Entwicklung eines bakteriellen Tumorimpfstoffes war es daher das Ziel dieser Arbeit ein System zur Stabilisierung des Antigendelivery Plasmids pMO zu etablieren, das auf den Einsatz von Antibiotikaresistenzgenen verzichtet. N2 - Development of a system to stabilize plasmids in bacteria, by using a balanced lethal system, Development of tumor vaccines by using Salmonella bacteria KW - Salmonella KW - Balanced lethal Systeme KW - Stabilisierung von Plasmiden KW - Tumorvaccine KW - Immuntherapie KW - Balanced lethal Systeme KW - Salmonella typhi KW - Balanced lethal System KW - Salmonella typhi Ty21a KW - immunotherapy Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-51638 ER - TY - THES A1 - Tränkenschuh, Wolfgang T1 - Die Rolle von NF-kappaB und MEK in der Apoptosesuppression durch Raf T1 - The role of NF-kappaB and MEK in suppression of apoptosis by activated Raf N2 - Aus genetischen und zellbiologischen Untersuchungen ist bekannt, dass die Proteinkinase Raf Apoptose unterdrücken kann, die Effektoren sind jedoch im Detail nicht klar. Am Modell der IL-3 abhängigen Zellinie 32D wurde die Rolle des Transkriptionsfaktors NF-kappaB in der Apoptosesuppression durch aktiviertes Raf untersucht. Unter Verwendung zweier aktiver Raf-Mutanten ergaben sich Hinweise auf eine proapoptotische Funktion, passend zu den NF-kappaB zugeschriebenen proaptotischen Zielgenen. Für den Raf-Effektor MEK ist eine antiapoptotische Funktion bekannt. Hier gelang es mit einer hyperaktiven Mutante (deltaStu-MEK-LIDEMANE) aus IL-3 abhängigen 32D Zellen einen Faktor-unabhängigen Zellpool (FID) zu generieren. Das von den bekannten Vorstellungen über Zytokin-abhängige Zellinien abweichende Verhalten, nach dem erst die Mutation von mehr als einem Onkogen zu einer Faktorunabhängigkeit führt, wurde genauer charakterisiert. Die FID-Zellen sind weiter von den Signalmolekülen MEK und PI3-Kinase abhängig und ein autokriner Mechanismus konnte ebenso wie die Expression von Signalmolekülen auf der Zelloberfläche ausgeschlossen werden. N2 - The protein kinase Raf is able to suppress apoptosis, although its effectors are not known in detail. The IL-3-dependent cell line 32D served as a model for the suppression of apoptosis by activated Raf in order to elucidate the role of the transcription factor NF-kappaB. We used two different active Raf mutants in our experimental approach and found evidence of a proapoptotic role for NF-kappaB. This stresses the significance of the proapoptotic target genes of NF-kappaB. The Raf effector MEK has an established antiapoptotic role. Our hyperactive MEK-mutant (deltaStu-MEK-LIDEMANE) turned IL-3-dependent 32D cells into cytokine-independent cells contrary to the traditional model of cytokine dependence. The cytokine-independent cells still employed the MEK and PI3-Kinase pathways. An autocrine mechanism could be excluded as well as the presence of surface signalling molecules. KW - Apoptosis KW - Raf-Kinasen KW - Interleukin 3 KW - Apoptosis KW - NF-kappaB KW - MEK KW - Interleukin-3 Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-37011 ER - TY - THES A1 - Mentzel, Benjamin Tobias T1 - Biochemische und phänotypische Untersuchungen zur Funktion der p21-aktivierten Kinase DPAK3 in Drosophila melanogaster T1 - Biochemical and phenotypic analysis of the p21-activated kinase DPAK3 in Drosophila melanogaster N2 - Gegenstand dieser Arbeit ist das Drosophila melanogaster Protein DPAK3, ein Vertreter der hochkonservierten Familie der p21-aktivierten Kinasen (PAK). DPAK3 und seine Homologen aus anderen Insektenarten und C. elegans können aufgrund eines Vergleichs der Proteinsequenz und struktureller Merkmale in eine eigenen Untergruppe 1* innerhalb der Gruppe 1 der PAK-Proteine eingeordnet werden. Das Genom von Drosophila kodiert noch für zwei weitere PAK-Proteine, das zur Gruppe 1 gehörende DPAK1 und das Gruppe 2 PAK-Protein Mbt. Wie die klassischen Gruppe 1 PAK-Proteine bildet DPAK3 im inaktiven Zustand Dimere. DPAK3 interagiert mit den GTP-gebundenen Formen der RhoGTPasen Rac1, Rac2 und Cdc42. Durch die Bindung dieser Proteine geht DPAK3 aus dem dimeren in den monomeren Zustand über und seine Kinaseaktivität wird durch diese Bindung gesteigert. DPAK3 ist für die Ausbildung der korrekten Morphologie kultivierter Drosophila Zellen erforderlich und beeinflußt die Regulation des Aktinzytoskeletts. Weiterhin konnte CK2beta, die regulatorische Untereinheit der Casein Kinase 2, als neuer Regulator von p21-aktivierten Kinasen identifiziert werden. Das Genom von Drosophila besitzt drei Transkriptionseinheiten, die für CK2beta', CK2betatestes und fünf verschiedene Isoformen von CK2beta kodieren. Eine vergleichende Analyse zeigt, daß alle CK2beta-Proteine mit DPAK1, DPAK3 und in geringerem Maß auch mit Mbt interagieren und in der Lage sind, die Aktivität der PAK-Proteine in vitro zu hemmen. Die Bindung von CK2beta an DPAK3 wird, wie bei allen anderen Serin- / Threoninkinasen, die bisher als Interaktionspartner von CK2beta identifiziert wurden, über die Kinasedomäne von DPAK3 vermittelt. Die Bildung des aus zwei katalytischen CK2a und zwei CK2beta Untereinheiten bestehenden CK2-Holoenzyms hängt von der Fähigkeit von CK2beta ab, Dimere zu bilden. Es konnte gezeigt werden, daß die Bildung eines b-b Dimers für die Interaktion mit und Regulation von DPAK3 nicht erforderlich ist. In vivo wurden die bisher bekannten Dpak3 Allele untersucht, wobei kein gesichertes Nullallel identifiziert werden konnte. Durch enzymatisch katalysierte Rekombination wurde eine neue Deletion hergestellt, die das komplette Leseraster von Dpak3 entfernt. Mit Hilfe von genetischen Mosaiken wurde die Rolle von DPAK3 in der Augenentwicklung untersucht. Durch den Verlust der Genfunktion von Dpak3 wird die Ausbildung der korrekten Struktur der Komplexaugen nur leicht beeinträchtigt. Bei der Analyse einer Dpak1 Mutante wurde dasselbe Ergebnis erzielt. Gleichzeitiger Verlust der Genfunktion von Dpak1 und Dpak3 hingegen führt zu massiven strukturellen Defekten. DPAK1 und DPAK3 erfüllen somit zumindest teilweise redundante Funktionen in der Augenentwicklung. Es wird Gegenstand zukünftiger Studien sein müssen, die gemeinsamen und getrennten Funktionen dieser PAK-Proteine in Drosophila aufzuklären. N2 - Subject of this work is the Drosophila melanogaster protein DPAK3, a member of the highly conserved family of p21-activated kinases. Based on the comparison of the amino acid sequence and structural features, DPAK3 and its homologues from other insect species and C. elegans can be assigned to a distinct subgroup 1* within the group 1 PAK proteins. The genome of Drosophila encodes for two additional PAK proteins, DPAK1 and Mbt, which belong to the group 1 and group 2 p21-activated kinases, respectively. Like the classical group 1 PAK proteins, DPAK3 forms dimers in its inactive conformation. DPAK3 binds to and is activated by the Rho GTPases Rac1, Rac2 and Cdc42. The interaction with these proteins leads to the disruption of the DPAK3 dimer and an increase in the kinase activity of DPAK3. DPAK3 is necessary for the development of the normal morphology of cultured Drosophila cells and influences the regulation of the actin cytoskeleton. CK2b the regulatory subunit of casein kinase 2 was identified as a new regulator of p21 activated kinases. The genome of Drosophila possesses three different transcriptional units that encode the proteins CK2b', CK2btestes and five different isoforms of CK2b. A comparative analysis shows that all CK2b proteins interact with DPAK1, DPAK3 and Mbt and negatively regulate the activity of these kinases in vitro. CK2b binds to the kinase domain of DPAK3 which is consistent with previous results obtained from other serine/threonine kinases interacting with CK2b. The CK2 holoenzyme consists of two catalytically active CK2a subunits and two regulatory CK2b subunits. My results show that the ability of CK2b to form dimers, which is essential for the formation of the CK2 holoenzyme, is not necessary for the regulation of p21 activated kinases. The analysis of the available Dpak3 alleles in vivo revealed the necessity to create a new bona fide loss of function allele. To accomplish this goal, a new deletion which removes the entire Dpak3 open reading frame was created by enzymatically catalysed recombination. Genetic mosaics were used to study the role of DPAK3 in eye development. The morphology of the complex eyes was only slightly impaired by the loss of Dpak3 function. The same result was obtained when analysing Dpak1 mutants, but removal of the gene function of both Dpak1 and Dpak3 leads to massive structural defects. This shows that Dpak1 and Dpak3 have at least partially redundant functions in eye development. Further studies will be necessary to reveal the common and distinct functions of these p21-activated kinases in Drosophila. KW - Taufliege KW - Drosophila melanogaster Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-30290 ER - TY - THES A1 - Wirth, Susanne T1 - Postoperative Strahlentherapie des Prostatakarzinoms in Nordbayern: "Patterns of Care" 1998 - 2000 multizentrische retrospektive Analyse von 134 Patienten in Nordbayern T1 - Patterns of Care in the Radiotherapy of the Prostate Cancer in Northern Bavaria 1998 - 2000 - a multicentre retrospective analysis of 134 patients in Northern Bavarian N2 - Ziel der vorliegenden Arbeit war die Analyse der Versorgungsstrukturen in der postoperativen Strahlentherapie des Prostatakarzinoms in Nordbayern, um für den Behandlungszeitraum von 1998 bis 2000 Patientenselektion, Behandlungskonzepte und Ergebnisse auf der Ebene eines regionalen Qualitätszirkels zu charakterisieren. Hierfür wurden die Daten von 134 in kurativer Absicht postoperativ perkutan bestrahlter Patienten aus den strahlentherapeutischen Abteilungen von vier fränkischen Kliniken ausgewertet. Als Endpunkte dieser Patterns of Care Studie wurden das Gesamtüberleben und die biochemische Kontrolle (ASTRO-Kriterien mit Rückdatierung) analysiert. Bei der Datenauswertung wurde evident, dass das untersuchte Patientenkollektiv eine ausgeprägte Heterogenität bezüglich der klinischen Eigenschaften aufweist. Diese Studie offenbart somit, dass die Zuweiser im Untersuchungszeitraum die Patienten anhand unterschiedlicher Kriterien sowohl zur Operation als auch zur postoperativen Strahlentherapie selektierten. So differierten Resektionsgrad sowie initialer PSA-Wert zwischen den beteiligten Zentren signifikant. Wesentlich homogener erschien das Patientengut im Hinblick auf Alter, Gleason-Score sowie den pT- und pN- Stadien. Die vorliegende Analyse dokumentiert darüber hinaus die unterschiedlichen strahlentherapeutischen Konzepte im Untersuchungszeitraum von 1998-2000. Ein signifikanter Unterschied zwischen den Zentren im Behandlungsregime ergab sich in der Zielvolumendefinition, wohingegen die applizierten Gesamtdosen vergleichbar waren. Die mittlere Nachbeobachtungszeit lag insgesamt bei 4,8 Jahren. Die aktuarische biochemische Kontrolle nach 5 Jahren betrug 82,1%. Sie variierte zwischen den Zentren nicht signifikant von 63,8% bis 100%. Bei multivariater Analyse zeigte sich, dass die biochemische Kontrolle mit dem Alter und dem initialen PSA-Wert assoziiert war. Das 5-Jahres-Gesamtüberleben betrug 93,9% und variierte ebenfalls nicht signifikant zwischen 88,9% (Zentrum 3) und 94,7% (Zentrum 4). Die Erfassung von Akut- und Spättoxizitäten waren nicht Gegenstand der vorliegenden Untersuchung. Die von Zentrum zu Zentrum unterschiedliche Form der Dokumentation von Akutreaktionen während der Strahlentherapie sowie die nur in geringem Umfange vorliegenden Angaben zu Spätfolgen der Strahlentherapie ließen eine einheitliche Graduierung sowie eine Vergleichbarkeit von Toxizitätsdaten zwischen den Zentren als nicht realistisch erscheinen. Abschließend lässt sich festhalten, dass die Daten eine sehr heterogene Indikationsstellung und insbesondere im Hinblick auf die Zielvolumendefinition eine heterogene Durchführung der postoperativen Strahlentherapie dokumentieren. Dies mag darin mitbegründet sein, dass zum Untersuchungszeitraum keine einheitlichen Leitlinien für das Prostatakarzinom verfügbar waren. Ziele der evidenzbasierten Medizin könnten somit zukünftig sein, Kriterien für eine verbesserte Patientenselektion zu finden und therapeutische Richtlinien in die Praxis zu transferieren. Vielfältige Diskussionen, beispielsweise der Zielvolumendefinition sowie der Therapiealternativen sind gegenwärtig am Beginn. Weitere klinische Studien werden initiiert und deren Ergebnisse abgewartet werden müssen, bis validierte Empfehlungen als Standards etabliert werden können. N2 - Patterns of Care in the Radiotherapy of Prostate Cancer in Northern Bavaria 1998-2000 – A multicenter retrospective analysis of 134 patients in Northern Bavaria Purpose: The purpose of the present patterns-of-care study of radiotherapy in prostate cancer was to analyze patient selection, treatment strategies and outcome in one geographic region of Germany. A number of 134 patients irradiated postoperatively by four radiation oncology departments in Northern Bavaria during the time period from 1998 to 2000 were included. All patients were treated with curative intent. As primary endpoints survival status and actuarial biochemical control (ASTRO definition) were defined. Results: All patients received three-dimensional conformal radiotherapy (3D-CRT). Brachytherapy was not examined. The concepts of treatment varied between the four centers significantly in R-status, initial prostate-specific-antigen (PSA) and nodal radiotherapy frequency. The total radiotherapy doses were similar. The overall 5-year biochemical control was 81,1% and did not differ significantly between the four departments. The overall 5-year survival was 93,9% and did not differ significantly as well. The present multicenter retrospective study shows distinct patterns of patient referral and selection at the four centers. This can be accounted for the matter that during the investigated time period there were no guidelines for the treatment in prostate cancer available. KW - Prostatakarzinom KW - Strahlentherapie KW - Prostatektomie KW - Biochemische Kontrolle KW - prostate cancer KW - radiotherapy Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-34197 ER - TY - THES A1 - Hilgert, Susanne T1 - Interaktion zweier mechanistisch unterschiedlicher Aktinnukleatoren - Spir und Cappuccino T1 - Interaction between two actin nucleators - Spir and Cappuccino N2 - Formine der Cappuccino-Familie nukleieren lineare Aktinfilamente mittels der formin homolgy 2- (FH2-) Domäne, Spir-Proteine mittels des WASP-Homologie-Domäne 2- (WH2-) Clusters. spire- und cappuccino-Mutanten haben in Drosophila einen nahezu identischen Phänotyp. Zudem wurde ein überlappendes Expressionsmuster der Säugerhomologe von Drosophila spire- und cappuccino, spir-1 und formin 2, im sich entwickelnden und im adulten Zentralnervensystems von Mäusen beobachtet. In dieser Arbeit wurde eine mögliche Interaktion von Spir-Proteinen mit Forminen der Cappuccino-Familie aus Drosophila und Maus in in vitro Bindungsstudien und in in vivo Kolokalisationsstudien untersucht. Eine direkte Interaktion wurde für Drosophila Spir und Cappuccino sowie für Säuger Spir-1 und Formin-2 nachgewiesen. Die Interaktionsdomänen sind konserviert und wurden auf die Kinase Non-catalytic C-lobe Domain (KIND-Domäne) der Spir-Proteine und auf die FH2-Domäne der Cappuccino-Proteine eingegrenzt. Diese Interaktion ist spezifisch für Spir- und Cappuccino-Proteine. So interagiert die FH2-Domäne des Formins Diaphanous-1 nicht mit Spir-1-KIND. Ebenso interagiert die KIND-Domäne des RasGEFs very-KIND (VKIND) nicht mit der FH2-Domäne von Formin-2. N2 - Formins of the Cappuccino-family and Spir proteins are nucleators of unbranched actin filaments. Cappuccino proteins mediate nucleation by means of the formin homology 2 (FH2) domain, Spir proteins via a cluster of four WASP homology domains 2 (WH2). The Drosophila spire- and cappuccino- mutant phenotypes are nearly identical. Furthermore, the mammalian orthologs of Drosophila spire- and cappuccino, spir-1 and formin-2 have an overlapping expression pattern in the developing and adult nervous system of mice. The work presented here focused on a potential protein interaction of Cappuccino-subfamily formins and Spir proteins which was analyzed using in vitro binding assays and in vivo colocalization studies. A direct interaction between Drosophila Spir and Cappuccino as well as between mammalian Spir-1 and Formin-2 was determined. The binding sites were narrowed down to the Kinase Non-catalytic C-lobe Domain (KIND) domain of Spir and the FH2 domain of Cappuccino-subfamily formins. This conserved interaction is specific for Spir- and Cappuccino proteins. Both, the in vivo and the in vitro studies did not reveal any interaction of Spir-1-KIND with the FH2-domain of the formin Diaphanous-1 nor for Formin-2-FH2 with the KIND domain of the RasGEF very-KIND (VKIND). KW - Formin-Proteinfamilie KW - Cappuccino KW - Formin-2 KW - Spir KW - KIND KW - FH2 KW - Cappuccino KW - Formin-2 KW - Spir KW - KIND KW - FH2 Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-24701 ER - TY - THES A1 - Gise, Alexander von T1 - Suppression der Apoptose durch C-Raf erfordert MEK1 und Phosphatidylinositol 3-Kinase abhängige Signale T1 - Apoptosis Suppression by C-Raf Requires MEK1- and Phosphatidylinositol 3-Kinase-Dependent Signals. N2 - Unterhalb des Interleukin 3 (Il-3) Rezeptors sind zwei Ras-abhängige Signalwege beschrieben, die entweder zur Aktivierung von C-Raf oder von PI3-Kinase (PI3K)/Proteinkinase B (PKB, AKT) führen und Wachstum und Überleben vermitteln. Frühere Untersuchungen des Mechanismus, über den C-Raf Apoptose unterdrückt, zeigten die Notwendigkeit einer Anwesenheit der zytoplasmatischen Kinase an den Mitochondrien. Diese Translokation konnte entweder durch Überexpression des antiapoptotischen Proteins Bcl-2 oder aber durch Fusion der Kinase mit dem mitochondriellen Protein Mas p70 erreicht werden. Aktiviertes mitochondriell gebundenes C-Raf ist nicht in der Lage ERK1 und ERK2 zu aktivieren, vermag aber durch Inaktivierung des proapoptotischen Bcl-2 Familienmitgliedes BAD Apoptose zu unterdrücken. Ungeachtet dieser Ergebnisse deuteten andere genetische und biochemische Untersuchungen auch auf eine Bedeutung der Raf Effektoren MEK und ERK in der Unterdrückung des programmierten Zelltodes hin. Im Rahmen dieser Arbeit wurde daher die Bedeutung von MEK und MEK-abhängigen Signalwegen für das zelluläres Überleben untersucht. Wir nutzten für diese Untersuchungen überwiegend die Il-3 abhängige Zelllinie 23D. MEK war essentiell für das zelluläre Überleben und Wachstum nach Stimulation durch Il-3. Eine konstitutiv aktive MEK1 Mutante verzögerte signifikant das Einsetzen der Apoptose nach Entzug des Wachstumsfaktors, während eine dominant negative Mutante den Zelltod akzelerierte. In der Fibroblastenzelllinie NIH 3T3 unterdrückte eine konstitutiv aktive Mutante von ERK2, ähnlich effektiv wie onkogenes MEK, durch Doxorubicin induzierten Zelltod. Diese Beobachtung lässt auf einen, das Überleben der Zelle vermittelnden, Signalweg von MEK schließen, der zur Aktivierung von ERK führt. Der protektive Effekt von aktiviertem MEK in 32D Zellen wurde durch MEK- und PI3K-abhängige Mechanismen vermittelt. Die dabei beobachtete Aktivierung von PI3K führt zur Phosphorylierung und Aktivierung von AKT. Die Abhängigkeit von MEK und PI3K Signalwegen konnte auch für den Schutz von 32D Zellen vor Apoptose durch onkogenes C-Raf gezeigt werden. Diese Befunde ließen sich ebenso in der Il-3 abhängigen pro-B Zelllinie BaF3 verifizieren, was darauf schließen lässt, dass die Rekrutierung von MEK/ERK im antiapoptotischen Signalweg von aktiviertem Raf ein allgemeingültiger Mechanismus ist. Dass in diesem antiapoptotischen Signalweg von C-Raf auch der PI3K Effektor AKT notwendig ist zeigten weitere Untersuchungen, in denen eine dominant negative Mutante von AKT den protektiven Effekt von aktiviertem C-Raf inhibierte, während eine konstitutiv aktive Form von AKT einen synergistischen Effekt mit C-Raf in der Unterdrückung der Apoptose hatte. Diese Daten zeigen einen, zelluläres Überleben vermittelnden Effekt von Raf, der durch MEK und AKT vermittelt wird. N2 - Two Ras effector pathways leading to the activation of C-Raf and phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) have been implicated in the survival signaling by the interleukin 3 (IL-3) receptor. Analysis of apoptosis suppression by C-Raf demonstrated the requirement for mitochondrial translocation of the kinase in this process. This could be achieved either by overexpression of the antiapoptotic protein Bcl-2 or by targeting C-Raf to the mitochondria via fusion to the mitochondrial protein Mas p70. Mitochondrially active C-Raf is unable to activate extracellular signal-related kinase 1 (ERK1) and ERK2 but suppresses cell death by inactivating the proapoptotic Bcl-2 family member BAD. However, genetic and biochemical data also have suggested a role for the C-Raf effector module MEK-ERK in apoptosis suppression. We thus tested for MEK requirement in cell survival signaling using the interleukin 3 (IL-3)-dependent cell line 32D. MEK is essential for survival and growth in the presence of IL-3. Upon growth factor withdrawal the expression of constitutively active MEK1 mutants significantly delays the onset of apoptosis, whereas the presence of a dominant negative mutant accelerates cell death. Survival signaling by MEK most likely results from the activation of ERKs since expression of a constitutively active form of ERK2 was as effective in protecting NIH 3T3 fibroblasts against doxorubicin-induced cell death as oncogenic MEK. The survival effect of activated MEK in 32D cells is achieved by both MEK- and PI3K-dependent mechanisms and results in the activation of PI3K and in the phosphorylation of AKT. MEK and PI3K dependence is also observed in 32D cells protected from apoptosis by oncogenic C-Raf. Additionally, we also could extend these findings to the IL-3-dependent pro-B-cell line BaF3, suggesting that recruitment of MEK is a common mechanism for survival signaling by activated Raf. Requirement for the PI3K effector AKT in this process is further demonstrated by the inhibitory effect of a dominant negative AKT mutant on Raf-1-induced cell survival. Moreover, a constitutively active form of AKT synergizes with Raf-1 in apoptosis suppression. In summary these data strongly suggest a Raf effector pathway for cell survival that is mediated by MEK and AKT. KW - Apoptosis KW - Raf-Kinasen KW - Raf KW - Interleukin 3 KW - MEK KW - ERK KW - PKB KW - AKT KW - Interleukin-3 KW - Apoptosis KW - Raf KW - MEK KW - AKT KW - Interleukin-3 Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-24947 ER - TY - THES A1 - Giner, Martin T1 - Signalmechanismen der epithelialen Proliferation und DIfferenzierung T1 - Signal mechanisms of Proliferation and Differentiation in Epithelia N2 - Gestörte Proliferations- und Differenzierungsprozesse in Keratinozyten spielen eine wichtige Rolle in der Pathogenese vieler Hauterkrankungen. Intrazelluläre Signalmechanismen, die die korrekte Balance zwischen epidermaler Proliferation und Differenzierung aufrecht halten, sind bis jetzt größtenteils unbekannt. Einer dieser ausschlaggebenden Transkriptionsfaktoren ist der Nukleäre Faktor-kappaB (NF-kB). Uns interessierte der Einfluss des IKK/IkBa/NF-kB-Signalweges auf das intrinsische Differenzierungsprogramm von Keratinozyten. Mittels retroviraler Infektion wurden sowohl in primären Keratinozyten als auch in HaCaT verschieden mutante Formen von Faktoren des NF-kB-Signalweges eingebracht: dominant negative (dn) Formen der IKK1 und IKK2, eine konstitutiv aktive Form der IKK2 (IKK2 EE) und eine nicht-degradierbare Form des Inhibitors IkBa. Zusätzlich wurden auch pharmakologische Inhibitoren von NF-kB (BAY 11-7082 und SC-514) untersucht. Die Funktionalität der Mutanten wurde im Westernblot durch Analyse der IkBa Degradation überprüft. Anschließend wurde die Differenzierung der Keratinozyten durch Erhöhung des extrazellulären Calciums induziert. Der Grad der Differenzierung wurde durch morphologische Studien und Untersuchung der Expression der Differenzierungs-marker p21 und Involucrin untersucht. Im Gegensatz zu Ergebnissen aus Tiermodellen, konnten wir keine Effekte der mutierten IkB Kinasen 1 und 2 auf die Calcium-induzierte in vitro Differenzierung beobachten. Jedoch wurde die Aktivierung inflammatorischer Gene, gemessen an der Induktion von ICAM-1 und IL-8 nach TNF-a Stimulation, vollständig in den IKK2 KD und mut IkBa exprimierenden Zellen inhibiert. In der Zelllinie, welche die entsprechende IKK1 Mutante trug, wurde deren Expression nur teilweise geblockt. Zusammenfassend lässt sich aus unseren Ergebnissen schließen, dass zumindest in vitro IKK1 und IKK2 nicht an der Regulation des Calcium-induzierten intrinsischen Differen-zierungsprozesses von Keratinozyten beteiligt sind, jedoch eine zentrale Rolle in der inflammatorischen Aktivierung dieser Zellen spielen. N2 - Disturbed proliferation and differentiation processes of keratinocytes play a major role in the pathogenesis of many skin diseases. Intracellular signalling mechanisms which regulate the balance between epidermal proliferation and differentiation, however, are thus far largely unknown. Earlier reports suggest a role for the transcription factor nuclear factor–kappaB (NF-kB) in such processes. Here we attempted to analyze the impact of the IKK/IkBa/NF-kB signalling pathway on the intrinsic differentiation process of keratinocytes. Primary human keratinocytes as well as HaCaT cells were retrovirally infected to express different mutant forms of components of the IKK/NF-kB pathway: dominant negative (dn) mutants of NF-kB upstream kinases IKK1 and IKK2, a constitutive active form of IKK2 (IKK2 EE), and a non degradable mutant form of IkBa. In addition, pharmacological inhibitors of the pathway such as BAY 11-7082 and SC-514 were analysed. Proper functionality of the generated mutants was subsequently confirmed by Western blot analysis monitoring induced IkBa degradation. Thereafter, differentiation of keratinocytes was induced by elevation of extracellular calcium levels. The differentiation state of keratinocytes was then assessed by studying morphology and expression of differentiation markers such as p21 as well as involucrin. In contrast to data reported from animal models, we could not detect any effects of mutated IKK1 or IKK2 on the calcium-induced intrinsic differentiation program in keratinocytes. However, inflammatory activation of keratinocytes as measured by TNF-a-mediated up-regulation of ICAM-1 and IL-8 was almost completely inhibited in cells expressing dn IKK2 and the IkBa mutant form whereas it was only partly blocked in IKK1dn cells. In conclusion, our data suggest that, in least in vitro, IKK1 and IKK2 are not involved in the regulation of calcium-induced keratinocyte differentiation while they are pivotal for inflammatory activation of these cells. KW - NF-kappaB KW - Keratinozyten KW - Involucrin KW - Differenzierung KW - Proliferation KW - inflammatorische Antwort KW - NF-kappaB KW - Keratinocytes KW - Involucrin KW - differentiation KW - proliferation KW - inflammatory response Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27069 ER - TY - THES A1 - Menzel, Nicolas T1 - Molekulare Analyse der zellulären Funktionen der p21-aktivierten Kinase Mushroom bodies tiny von Drosophila melanogaster T1 - Molecular analysis and cellular functions of the p21 activated kinase Mushroom bodies tiny from Drosophila melanogaster N2 - In Drosophila melanogaster wurde der p21-aktivierten Proteinkinase Mushroom bodies tiny (Mbt) eine wichtige Rolle als Regulator während der Differenzierung von Photorezeptorzellen zugeschrieben. Da morphologische Umgestaltungsprozesse der Photorezeptorzellen von dynamischen Zellbewegungen begleitet und die molekularen Details größtenteils noch ungeklärt sind, wurden in dieser Arbeit die Funktionen von Mbt in Bezug auf veränderte Zelladhäsionseigenschaften, Reorganisation des Aktincytoskeletts und die Beteiligung an weiteren Signalwegen analysiert. Im ersten Projekt wurde ein genetischer Interaktionsscreen mit Hilfe eines hypomorphen mbt- Allels (mbtP3) durchgeführt, um zu untersuchen, in welche zellulären Signalwege Mbt einzuordnen ist. Die Identifizierung des Aktin-Depolymerisationsfaktor Cofilin (Drosophila: Twinstar) und der Phosphatase Slingshot bestätigte, daß Mbt in Prozesse involviert ist, die die Aktindynamik kontrollieren. In Vertebraten phosphoryliert und inaktiviert die Proteinkinase Pak4 (Drosophila Homolog zu Mbt) die Lim-Kinase (Limk), die wiederum Cofilin durch Phosphorylierung hemmt. Dieser Effekt kann nach Dephosphorylierung des Cofilin durch die Phosphatase Slingshot wieder aufgehoben werden. In Drosophila konnte gezeigt werden, daß aktiviertes Mbt mit Twinstar und Drosophila Limk (D-Limk) assoziiert ist und die Phosphorylierungen beider Moleküle induzieren kann. Zusammen mit genetischen Experimenten stellen die Ergebnisse entgegen der Situation in Vertebraten die Funktion von D-Limk als Vermittler zwischen Mbt und Twinstar in Frage und lassen vielmehr auf einen Verlauf des Signals von Mbt direkt an Twinstar, über Slingshot oder unbekannte Kinasen schließen. Ein zweites Projekt beschäftigte sich mit dem Einfluß von Mbt auf die DE-Cadherin-beta- Catenin/Armadillo vermittelte Zelladhäsion. Dazu wurde ein Zellkultursystem in Drosophila Schneiderzellen etabliert, welches es erlaubte, den DE-Cadherin-beta-Catenin/Armadillo-alpha- Catenin Komplex vollständig zu rekonstituieren. Die Resultate zeigten, daß Mbt mit dem Komplex interagiert und beta-Catenin/Armadillo an den Aminosäuren S561 und S688 phosphoryliert. Die Phosphorylierung bewirkt eine Destabilisierung der Bindung zwischen DE-Cadherin und beta- Catenin/Armadillo und vermindert die Adhäsion der Zellkontakte zwischen Zellen. Im dritten Projekt ging es um die Suche nach unbekannten Phosphorylierungspartnern und der Integration von Mbt in weitere Signalwege. Dazu wurde eine stringente, radioaktive in vitro Phosphorylierungsreaktion entwickelt, die die Detektion von Mbt-spezifischen Phosphorylierungssubstraten aus einem Extrakt von Drosophila Schneiderzellen ermöglichte. In einer Vorstufe wurde dieses Extrakt mit dem ATP-Analogon 5’-Fluorosulfonylbenzoyladenosin (5’FSBA) vorbehandelt, um sämtliche endogenen Kinasen irreversibel zu inhibieren und die nachfolgende Phosphorylierungsreaktion mit aufgereinigtem Mbt spezifisch für Mbt zu machen. Nach Auftrennung und Identifizierung der potentiellen Phosphoproteine durch Massenspektrometrie wurde das Drosophila Dynamitin als neuer Interaktions- und Phosphorylierungspartner von Mbt gefunden. N2 - In Drosophila melanogaster, the p21 activated kinase Mushroom bodies tiny (Mbt) fulfils a critical role in the differentiation of photoreceptor cells during development. Differentiation of photoreceptor cells is accompanied by morphogenetic rearrangement, however, the underlying molecular mechanisms are not completely understood. Therefore in this work the function of Mbt was analysed with respect to the modulation of cell-cell adhesion, reorganization of the actin cytoskeleton and the integration of Mbt in different signalling pathways. In the first project a genetic screen with a hypomorphic mbt allele (mbtP3) was performed to identify components of Mbt signalling pathways. The identification of the actin depolymerization factor Cofilin (Drosophila: Twinstar) and the phosphatase Slingshot confirmed that Mbt is involved in actin regulating processes. In vertebrates, the p21 activated kinase Pak4 (Drosophila homolog of Mbt) acts as an upstream activator of the Lim-Kinase (Limk) which in turn inactivates the actin depolymerization factor Cofilin by phosphorylation. This effect can be reversed by the phosphatase Slingshot. In Drosophila activated Mbt is not only associated with Twinstar and Drosophila Limk (D-Limk) but also induces phosphorylation of both molecules. Together with genetic experiments these results are in contrast to the situation of Pak4 in vertebrates and question the role of D-Limk as a major mediator in signalling between Mbt and Twinstar. Instead we propose that Mbt can either directly act on Twinstar or regulates Twinstar phosphorylation through Slingshot or other unknown kinases. In the second project, the influence of Mbt on DE-cadherin mediated cell adhesion was investigated. Therefore a Drosophila Schneider cell line was established which allowed the reconstitution of a functional DE-cadherin-beta-catenin/Armadillo-alpha-catenin complex. The results revealed an interaction between Mbt and this complex and further showed that Mbt specifically phosphorylates beta-catenin/Armadillo on amino acids S561 and S688. As a consequence the binding between beta-catenin/Armadillo and DE-cadherin is destabilized leading to a reduced adhesion between cells. The third project was to devise a strategy that allows with high selectivity the identification of phosphorylation substrates of Mbt from total lysates of Drosophila Schneider cells. The general idea was to irreversibly block endogenous kinase activities by the ATP-analog 5’-fluorosulfonylbenzoyladenosine and then to perform a radioactive in vitro kinase assay in the presence of exogenously provided Mbt. The potential phosphoproteins were purified and identified by mass spectrometry. The Drosophila Dynamitin was found as a novel interaction and phosphorylation partner of Mbt. KW - Drosophila KW - Kinase KW - Zellkontakte KW - Photorezeptorzellen KW - Aktincytoskelett KW - Drosophila KW - kinase KW - cell contacts KW - photoreceptor cells KW - actin cytoskeleton Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-23727 ER - TY - THES A1 - Jäckle, Kristoff T1 - Genexpressionsanalyse der Transkriptionsfaktoren PU.1, Gabp-alpha und der Proteinkinase HPK 1 im murinen hämatopoetischen System T1 - Genexpressionsanalysis of the transkriptionfactors PU.1, Gabp-alpha and the proteinkinase HPK 1 in the murine hematopoetic system N2 - Die Identität von verschiedenen Stamm-und Vorläuferzellen wird durch zellspezifisches Genexpressionsmuster bestimmt128. Ähnlich einem Fingerabdruck ist eine Zelle durch ihr Expressionsprofil charakterisiert. In dieser Arbeit wurde die Expression der Transkritionsfaktoren PU.1 und Gabp-alpha und der Proteinkinase HPK 1 im murinen hämatopoetischen System mittels RT-PCR-Analysen betrachtet. Neben Gesamtknochenmark, hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen, ES-Zellen und NSZs wurden sowohl differenzierte Zellen des myeloischen Systems als auch des lymphatischen Systems analysiert. Die untersuchten Transkriptionsfaktoren PU.1 und Gabp-alpha konnten dabei ubiquitär in den untersuchten hämatopoetischen Zellpopulationen nachgewiesen werden. In NSCs konnte Gabp-alpha, jedoch nicht PU.1 nachgewiesen werden. HPK 1 wurde im Einklang mit früheren Ergebnissen in Gesamtknochenmark in T-und B-Zellen in hämatopoetischen Vorläuferzellen und zu geringem Umfang in embryonalen Stammzellen gefunden. Tiefere Einblicke in Veränderung des Expressionsprofils während der Differenzierung von unreifen Vorläuferzellen zu reifen Effektorzellen würden die Kenntnisse über die molekularen Mechanismen der Differenzierung erweitern. Diese Erkenntnisse sind die Voraussetzung um in den Differenzierungsvorgang regulativ einzugreifen. N2 - Genexpressionsanalysis of the transkriptionfactors PU.1, Gabp-alpha and the proteinkinase HPK 1 in the murine hematopoetic system KW - Stammzellen Maus KW - stem cells Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-18742 ER - TY - THES A1 - Dürr, Michael T1 - Analyse des in vivo Differenzierungspotentials humaner leukämischer Zellen sowie humaner und muriner neuraler Stammzellen T1 - Analysis of the developmental potential of human leukemic cells as well as human and murine neural stem cells in vivo N2 - In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob die zelluläre Identität somatischer Stamm-/Vorläuferzelltypen durch Behandlung mit Chromatin-modifizierenden Substanzen und/oder durch Transplantation verändert werden kann. Dazu wurden humane leukämische KG-1 Zellen in murine Blastozysten injiziert. Murine und humane neurale Stammzellen (NSZ)wurden in vitro mit Trichostatin A (TSA) und 5’-Aza-2’-deoxycytidin (AzaC)inkubiert und anschließend in murine Blastozysten bzw. adulte NOD/SCID Mäuse transplantiert. In dem Versuchen konnte gezeigt werden, dass humane leukämische Zellen nach Injektion in murine Blastozysten in sich entwickelnden Embryonen und adulten Tiere präferentiell hämatopoetische Gewebe besiedeln. Daneben konnte gezeigt werden, dass myeloische Leukämiezellen in chimären murinen Embryonen ein Erythrozyten-spezifisches Genexpressionsmuster aktivieren. Die Inkubation humaner und muriner NSZ mit Histondeacetylase-Inhibitoren und AzaC führte zu einer reversiblen Hyperacetylierung von Histon H4 und zur Demethylierung genomischer DNA. Die Injektion behandelter muriner NSZ in murine Blastozysten führte im Vergleich zu unbehandelten NSZ zu einer stärkeren Besiedelung adulter Tiere durch Donorzellen. Darüber hinaus besiedelten Abkömmlinge injizierter behandelter NSZ häufiger hämatopoetische Gewebe in chimären Tieren und exprimierten Hämatopoese-spezifische Oberflächenproteine. Weitere Analysen ergaben, dass humane NSZ im Gegensatz zu humanen hämatopoetischen Stammzellen nicht dazu in der Lage sind, in immunsupprimierten NOD/SCID Mäusen ein humanes hämatopoetisches System zu etablieren. Auch nach Inkubation humaner NSZ mit Chromatin-modifizierenden Substanzen konnte keine humane Hämatopoese in transplantierten Mäusen festgestellt werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass der Differenzierungsstatus und das Entwicklungspotential verschiedener Zelltypen durch geeignete Stimuli verändert werden kann. Durch Injektion in embryonale Mikroumgebung differenzieren humane leukämische Zellen und aktivieren ein Erythrozyten-spezifisches Genexpressionsmuster. Durch die Veränderung des Epigenotyps muriner NSZ gefolgt von einer Transplantation in murine Blastozysten konnte eine Transdifferenzierung neuraler in hämatopoetische Zellen induziert werden. N2 - The objective of the present thesis was to investigate whether the cellular identity of somatic stem and progenitor cell types could be modified by treatment with chromatin modifying agents and/or transplantation into appropriate in vivo systems. To this end, human leukemic KG-1 cells were injected into murine blastocysts. Murine and human neural stem cells (NSC) were incubated with Trichostatin A (TSA) and 5’-Aza-2’-deoxycytidine (AzaC) in vitro and subsequently transplanted into murine blastocysts and adult NOD/SCID mice respectively. It could be shown that after transplantation into murine blastocysts human leukemic cells preferentially engraft hematopoietic tissues of developing embryos and adults. Furthermore, myeloid leukemic cells activated an erythrocyte-specific gene expression pattern in chimeric embryos. Incubation of human and murine NSC with Histone deacetylases and AzaC caused reversible hyperacetylation of histone H4 and demethylation of genomic DNA. Comparison of adult recipient mice revealed that the injection of treated murine NSC caused a more stringent engraftment of recipients than untreated murine NSC. In addition, progeny of TSA/AzaC treated NSC engrafted more often hematopoietic tissues and expressed hematopoiesis-specific surface markers. In a further set of experiments it could be demonstrated that in contrast to human hematopoietic stem cells, human NSC do not engraft the hematopoietic system of immundeficient mice. Even after treatment of human NSC with chromatin-modifying agents no human hematopoiesis was detected in transplanted mice. Overall, these results indicate that the differentiation status and developmental potential of several somatic progenitor and stem cell types could be modified by appropriate stimuli. By exposure to embryonic microenvironment human leukemic cells differentiate and activate an erythrocyte-specific gene expression pattern. After modification of the epigenotype of murine NSC followed by transplantation into murine blastocyts transdifferentiation of neural into hematopoietic cells could be induced. KW - Stammzelle KW - Leukämie KW - Zelldifferenzierung KW - Differenzierungspotential KW - Leukämie KW - neurale Stammzelle KW - differentiation potential KW - leukemia KW - neural stem cell Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-14567 ER - TY - THES A1 - Voss, Jan T1 - Substratspezifität und Signaltransduktion zellulärer und onkogener Abl-Tyrosinkinasen T1 - Substrate specificities and signalling pathways of physiological and oncogenic Abl tyrosin kinases N2 - Deregulierte Überaktivierung von Tyrosinkinasen der Abl-Familie spielen eine wesentliche Rolle in verschiedenen Leukämieformen beim Menschen. Neben der schon seit vielen Jahren für die CML als ursächlich anerkannten Fusionskinase p210Bcr-Abl sind weitere Fusionskinasen unter Beteiligung der Abl-Kinase in Formen der sowohl CML als auch der ALL und CMML beschrieben worden. Diese seltener auftretenden Abl-Fusionskinasen umfassen sowohl Bcr-Abl Proteine anderer Größe (p165Bcr-Abl, p190Bcr-Abl und p230Bcr-Abl) als auch die Tel-Abl Fusionskinasen, die anstelle von Teilen des Bcr-Proteins Teile des Tel-Proteins beinhalten. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Kinasespezifität der onkongenen Fusionstyrosinkinasen Bcr-Abl und Tel-Abl mit der der physiologischen Kinasen c-Abl und Arg verglichen. Mittels kurzer Peptide, deren Aminosäuresequenzen Phosphorylierungsepitopen in Substratproteinen der Kinasen der Abl-Famile entsprechen, konnte eine verminderte katalytische Spezifität der onkogenen Kinasen Bcr-Abl und Tel-Abl gezeigt werden. Der zweiten Teil der hier dargestellten Ergebnisse fokussiert auf Signaltransduktionsereignisse, die in Tel-Abl exprimierenden Zellen auftreten, und vergleicht diese mit der für Bcr-Abl bekannten Signaltransduktion. Ähnlich wie Bcr-Abl konnte auch Tel-Abl in Proteinkomplexen mit dem Adapterprotein CRKL, ein Protein, das in Bcr-Abl-transformierten Zellen konstitutiv Tyrosin-phosphoryliert ist, nachgewiesen werden. Des weiteren wurde gezeigt, daß in den Tel-Abl exprimierenden Zellen die Adapterproteinen c-CrkII und CRKL phosphoryliert sind und mit vielen anderen tyrosinphosphorylierten Proteinen Komplexe bilden. Schließlich wurden einige Signaltransduktionsschritte beschrieben, die sowohl in Zellen, die Tel-Abl exprimieren, als auch in Zellen mit Bcr-Abl-Expression aktiviert sind. Mittels eines Ras×GPT-spezifischen Präzipitationsassys konnte eine konstitutive Anhebung des GTP-belandenen Anteils des GTPase Ras in den Zellen mit Expression der leukämischen Abl-Formen gezeigt werden. Sowohl die mitogene Kinase MAPK/Erk als auch die Kinase Akt/PKB, welche die Apotptose blockiert, werden ebenfalls durch Tel-Abl aktiviert. Die Ergebnisse der hier dargestellten Arbeit zeigen, daß die leukämischen Abl-Fusionsproteine eine katalytische Spezifität aufweisen, die sich von der der physiologischen Abl-Kinasen unterscheidet und daß Tel-Abl zumindest einige der Signaltransduktionswege zu aktivieren vermag, welche auch durch das onkogene Protein Bcr-Abl aktiviert werden. N2 - Inappropriate activation of Abl family kinases plays a crucial role in different human leukaemias. In addition to the well known oncoproteins p190Bcr-Abl and p210Bcr-Abl, Tel-Abl, a novel fusion protein resulting from a different chromosomal translocation, has recently been described. In this study, the kinase specificities of the Bcr-Abl and Tel-Abl proteins were compared to the physiological Abl family kinases c-Abl and Arg (abl related gene). Using short peptides which correspond to the target epitopes in known substrate proteins of Abl family kinases, we found a higher catalytic promiscuity of Bcr-Abl and Tel-Abl. Similar to Bcr-Abl, Tel-Abl was found in complexes with the adapter protein CRKL. In addition, c-Crk II and CRKL are tyrosine phosphorylated and complexed with numerous other tyrosine phosphorylated proteins in Tel-Abl expressing cells. GTPase analysis with a Ras-GTP-specific precipitation assay showed constitutive elevation of GTP-loaded Ras in cells expressing the leukaemic Abl proteins. The mitogenic MAPK/Erk kinases as well as Akt/PKB, a kinase implicated to negatively regulate apoptosis, were also constitutively activated by both Bcr-Abl and Tel-Abl. The results indicate that the leukaemic Abl-fusion proteins have catalytic specificities different from the normal kinases c-Abl and Arg and that Tel-Abl is capable to activate at least some pathways which are also upregulated by Bcr-Abl. KW - Bcr-Abl KW - Tel-Abl KW - Substratspezifität KW - Signaltransduktion KW - Bcr-Abl KW - Tel-Abl KW - substrate specificity KW - signal transduction Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-12819 ER - TY - THES A1 - Laumen, Helmut T1 - Funktion von BOB.1/OBF.1 für oktamerabhängige und Immunglobulin-Transkription in B-Zellen und Hodgkin-Reed-Sternberg-Zellen und Identifizierung von BOB.1/OBF.1-regulierten Genen N2 - BOB.1/OBF.1 ist ein Lymhozyten-spezifischer transkriptioneller Koaktivator. Er bindet an die Oct1 und Oct2 Transkriptionsfaktoren und verstärkt deren transkriptionelles Potential. Die Untersuchung BOB.1/OBF.1- defizienter Mäuse ergab, dass BOB.1/OBF.1 eine entscheidende Funktion hat in verschiedenen BZellentwicklungsstadien. Überraschenderweise zeigte die Analyse BOB.1/OBF.1-defizienter Mäuse eine weitgehend normale Expression von Genen, welche ein Oktamer-Motiv in ihren regulatorischen Regionen enthalten wie z. B. die Immunglobulingene. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Rolle von BOB.1/OBF.1 für oktamerabhängige Transkription in einer aus BOB.1/OBF.1-defizienten Mäusen etablierten B-Zelllinie untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass Promotoren, die von einem funktionellen Oktamer-Motiv abhängen, gänzlich inaktiv sind in BOB.1/OBF.1-defizienten B-Zellen. Mittels eines in diesen Zellen stabil exprimierten, regulierbaren BOB.1/OBF.1-Fusionsproteins konnte gezeigt werden, dass dieser transkriptionelle Defekt eine direkte Folge des Fehlens des Koaktivators BOB.1/OBF.1 ist. Dies gilt für einen synthetischen Oktamer- Promotor-regulierten Reporter ebenso wie für einen Immunglobulin-k-Promoter-regulierten Reporter. Diese Ergebnisse zeigten, dass BOB.1/OBF.1 selbst ein nicht-redundantes Protein in B-Zellen ist und absolut notwendig ist für oktamerabhängige transkriptionelle Aktivität. Zahlreiche in B-Zellen exprimierte Gene enthalten ein Oktamer-Motiv in ihrer regulatorischen Region, jedoch wurden erst wenige beschrieben, deren Expression von BOB.1/OBF.1 reguliert wird. Um die molekulare Basis der Funktion von BOB.1/OBF.1 für die B-Zellentwicklung zu verstehen, wurde im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit mit verschiedenen Methoden nach BOB.1/OBF.1-regulierten Zielgenen gesucht. Mit der cDNA-RDA-Methode konnte MLC1A als ein in präB-Zellen durch BOB.1/OBF.1 indirekt reguliertes Gen identifiziert werden. Affymetrix-Genchip-Experimente identifizierten sowohl durch BOB.1/OBF.1 heraufregulierte Gene, wie Ahd2like, Rbp1, Creg als auch herabregulierte Gene, wie Id3. Eine Klassifizierung der potentiellen Zielgene nach ihrer Funktion legt eine Funktion von BOB.1/OBF.1 nahe für verschieden Aspekte der B-Zellphysiologie wie Zellmetabolismus, Zelladhäsion und Zelldifferenzierung. BOB.1/OBF.1 hat also sehr wahrscheinlich eine sehr weitgefächerte Funktion in verschiedenen regulatorischen Mechanismen von B-Zellentwicklung und -funktion. Das Fehlen von Immunglobulin-Expression in Hodgkin-Reed-Sternberg-Zellen (HRS-Zellen) des klassischen Hodgkin-Lymphoms wurde ursprünglich erklärt durch inaktivierende Mutationen im Promotor oder in kodierenden Sequenzen des Gens. Im dritten Teil dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass in HRS-Zellen weder BOB.1/OBF.1 noch Oct2 exprimierte werden. Durch Transfektion von Reportern, die durch Oktamer- Motive oder durch einen Immunglobulin-Promotor reguliert werden, in HRS-Zelllinien konnte gezeigt werden, dass das Fehlen dieser Proteine sehr wahrscheinlich maßgeblich am Defekt der Immunglobulin-Transkription in HRS-Zellen beteiligt ist. N2 - BOB.1/OBF.1 is a lymphocyte-restricted transcriptional coactivator. It binds to the Oct1 and Oct2 transcription factors and increases their transactivation potential. Targeted gene disruption experiments revealed that BOB.1/OBF.1 is critical at different stages of B cell development. Surprisingly, animals deficient for BOB.1/OBF.1 showed virtually normal expression of genes that contain octamer motifs in their regulatory regions, like immunoglobulin genes. In the first part of this work the role of BOB.1/OBF.1 for octamerdependent transcription in a B cell line established from BOB.1/OBF.1-deficient mice was addressed. We show that promoters exclusively dependent on functional octamer motifs are completely inactive in BOB.1/OBF.1- deficient B cells. To demonstrate directly that the lack of activity is a consequence of lack of the coactivator, we constructed a hormone regulated conditional allele of BOB.1/OBF.1, which was introduced into the BOB.1/OBF.1-deficient B cells. This resulted in the hormone-dependent transcriptional activity of octamerdependent reporters in these cells. The BOB.1/OBF.1 requirement for octamer promoter function was also observed when an authentic immunoglobulin k-promoter was assayed. Thus, these results demonstrate that BOB.1/OBF.1 itself is a non-redundant protein in B cells and absolutely required for octamer-dependent transcriptional activity. A large number of genes expressed in B cells contain octamer motifs in their regulatory regions. However, only few genes have been described so far whose expression is dependent on BOB.1/OBF.1. To understand the molecular basis of BOB.1/OBF.1 function in B cell development we searched for BOB.1/OBF.1 target genes by different screening methods, in the second part of this work. Using the cDNA-RDA method MLC1A could be identified as a gene indirectly regulated by BOB.1/OBF.1 in preB cells. Genechip experiments identified genes induced by BOB.1/OBF.1, like Ahd2like, Rbp1, Creg, and genes repressed by BOB.1/OBF.1, like Id3. Classification of BOB.1/OBF.1 target genes by function suggests that they affect various aspects of B cell physiology such as cellular metabolism, cell adhesion and differentiation. Our observations suggest that by regulating genes in different functional pathways, BOB.1/OBF.1 has a widespread effect on B cell development and function. The absence of immunoglobulin expression in Hodgkin-Reed-Sternberg (HRS) cells of classical Hodgkin lymphoma was initially suggested to be caused by inactivating mutations in the immunoglobulin promoter or coding region. In the third part of this work it was shown, that HRS cells express no BOB.1/OBF.1 and Oct2. By transfection experiments in HRS cell lines, using octamer-motif dependent and immunoglobulin regulated reporters, it was shown that the lack of this proteins is likely to be critically involved in the observed defect of immunoglobulin transcription in HRS cells. KW - B-Lymphozyt KW - Transkriptionsfaktor Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-12500 ER - TY - THES A1 - Schmittwolf, Carolin T1 - Analyse des Differenzierungspotentials muriner hämatopoetischer und neuraler Stammzellen nach Modifikation ihrer Genexpression T1 - Analysis of murine hematopoietic and neural stem cells´ potential of differentiation after modification of their gene expression N2 - In der vorliegenden Arbeit wurde das Differenzierungspotential muriner hämatopoetischer und neuraler Stammzellen nach Modifikation ihrer Genexpression untersucht. Zur Veränderung der Genexpression wurden für die beiden adulten Stammzelltypen zwei unterschiedliche experimentelle Ansätze gewählt: In hämatopoetischen Stammzellen wurden molekulare Regulatoren der Hämatopoese durch retroviral vermittelten Gentransfer überexprimiert und anschließend ihr in vitro Verhalten und in vivo in Maustransplantationsmodellen ihre Rekonstitutionsfähigkeit untersucht. Neurale Stammzellen wurden gleichzeitig mit den Chromatin-modifizierenden Substanzen Trichostatin A (TSA) und 5-Aza-2´-desoxycytidin (AzadC) behandelt, im Anschluß ihre Sensitivität gegenüber der Behandlung in vitro bestimmt und ihr hämatopoetisches Entwicklungspotential in vivo analysiert. In hämatopoetischen Stammzellen wurde der Transkriptionsfaktor HOXB4, die hämatopoetische Vorläuferkinase 1 (HPK1) oder eine Kinase-inaktive Mutante der HPK1 (HPK1M46) durch retrovirale Transduktion überexprimiert. Der Transfer wildtypischer HPK1 oder HPK1M46 Gene in Knochenmarkzellen hatte in vitro keinen meßbaren Einfluß auf die Proliferation und Anzahl primitiver Vorläuferzellen, was auch nach Expression verschiedener Proteinmengen beobachtet wurde. Das Repopulationsverhalten hämatopoetischer Stammzellen, die mit wildtypischer HPK1 transduziert wurden, war vergleichbar mit dem kontrolltransduzierter Stammzellen. Nach HPK1M46 Transduktion zeigten hämatopoetische Stammzellen in vivo ein reduziertes Langzeitrepopulationsverhalten und Knochenmarkzellen ex vivo ein eingeschränktes Koloniebildungspotential. Sowohl mit wildtypischer HPK1 als auch mit HPK1M46 transduzierte hämatopoetische Stammzellen wiesen ein normales Multilinienbesiedlungspotential auf. Nach Transduktion von Knochenmarkzellen mit HOXB4, einem wichtigen Regulator der Selbsterneuerung hämatopoetischer Stammzellen, konnten diese in vitro expandiert werden, ohne daß sie, wie dies bei kontrolltransduzierten Knochenmarkzellen auftrat, phänotypisch Differenzierungsmarker ausbildeten. Nach HOXB4 Transduktion akkumulierte eine homogene, Mac-1niedrig exprimierende Zellpopulation im Gegensatz zu einer Mac-1hoch, Gr-1 sowie c-kit positiven Population, die sich in den Kontrollkulturen entwickelte. Auf mRNS Ebene wurden nur in den Kontrollkulturen Transkripte hochreguliert, die für differenzierende Zellen spezifisch sind, wie z. B. Zyklin D1 während myeloider Differenzierung. Die Überexpression von HOXB4 ermöglichte eine konstante Proliferationsrate und hatte auf das Verhältnis von asymmetrischen zu symmetrischen Zellteilungen jedoch keinen Einfluß. Entsprechend blieb das Expressionsmuster an Zyklinen, Zyklin-abhängigen Kinasen und Mitgliedern des Transkriptionsaktivators AP-1 in HOXB4 transduzierten Knochenmarkzellen über den beobachteten Zeitraum konstant. Durch die Überexpression von HOXB4 kann somit in kultivierten Knochenmarkzellen in vitro eine stabile Proliferationsrate induziert und parallel eine fortschreitende Differenzierung der Knochenmarkkultur aufgehalten oder zumindest verzögert werden. Sowohl wildtypische als auch bcl-2 transgene neurale Stammzellen, die mit den Epigenotyp-verändernden Substanzen TSA und AzadC behandelt wurden, zeigten nach Transplantation in bestrahlte adulte Rezipienten hämatopoetisches Entwicklungspotential, das unbehandelte neurale Stammzellen nicht aufwiesen. Die Frequenz chimärer Tiere konnte durch Verwendung bcl-2 transgener neuraler Stammzellen erhöht werden und bereits in vitro wiesen wildtypische und bcl-2 transgene neurale Stammzellen unterschiedliche Sensitivität gegenüber der TSA/AzadC Behandlung auf. Diese von behandelten neuralen Stammzellen vermittelte Rekonstitution des hämatopoetischen Systems war langanhaltend und fand sowohl in der myeloiden als auch in der lymphoiden Linie statt. Eine erfolgreiche hämatopoetische Besiedlung war auch nach Transplantation klonaler neuraler Stammzellen zu beobachten, so daß eine Verunreinigung mit hämatopoetischen Zellen als Ursache der Rekonstitution ausgeschlossen werden konnte. Die beobachtete Generierung der morphologisch und phänotypisch intakten hämatopoetischen Zellen aus neuralen Zellen war nicht das Ergebnis einer Zellfusion von Rezipientenzellen mit injizierten Donorzellen. Denn die hämatopoetischen Donorzellen trugen einen normalen 2n Karyotyp und wiesen keine Heterokaryons auf, die für Fusionen charakteristisch wären. Somit ist es möglich, durch die Veränderung des Epigenotyps neuraler Stammzellen gefolgt von einer Transplantation in eine hämatopoetische Mikroumgebung eine Transdifferenzierung neuraler in hämatopoetische Zellen zu induzieren. N2 - This PhD thesis addressed the capacity of murine hematopoietic and neural stem cells to differentiate after modifying their gene expression pattern. Two different experimental approaches were chosen and applied to both systems of adult stem cells: By retroviral mediated gene transfer molecular regulators of hematopoiesis were overexpressed in hematopoietic stem cells and the behaviour of the genetically modified hematopoietic stem cells was analyzed in vitro and using mouse transplantatioin models their reconstitution capacity in vivo was tested. Neural stem cells were simultaneously treated with the two chromatin-modifying substances trichostatin A (TSA) and 5-aza-2´-deoxycytidine (AzadC), in vitro their TSA/AzadC sensitivity and in vivo their hematopoietic differentiation potential was studied. The transcriptionfactor HOXB4, the hematopoietic progenitor kinase 1 (HPK1) or a kinase-dead mutant of HPK1 (HPK1M46) were overexpressed in hematopoietic stem cells by retroviral transduction. Retrovirally transferred wildtype HPK1 or HPK1M46 in bone marrow cells showed no detectable influence on proliferation or numbers of primitive progenitors in vitro even when varying protein amounts were expressed. The repopulation capacity of hematopoietic stem cells transduced with wildtype HPK1 was comparable to control transduced stem cells. However, HPK1M46 transduced hematopoietic stem cells showed in vivo a reduced long-term repopulation activity and bone marrow cells displayed a limited colony forming potential in vitro. Wildtype HPK1 as well as HPK1M46 transduced hematopoietic stem cells possessed a normal multi-lineage repopulation potential. Although differentiation was observable in control transduced bone marrow cells transduction of bone marrow cells with HOXB4, an important regulator of self-renewal of hematopoietic stem cells, permitted in vitro expansion of bone marrow cells without expression of phenotypical differentiation markers. After HOXB4 transduction a homogenous Mac-1low expressing cell population accumulated in contrast to a Mac-1high, Gr-1 and c-kit positive population developing in control cultures. At mRNA level transcripts specific for differentiating cells like cyclin D1 during myeloid differentiation were upregulated only in control cells. Overexpression of HOXB4 enabled a constant cell proliferation rate but showed no influence on the ratio of symmetric to asymmetric cell divisions. Likewise the expression pattern of cyclins, cyclin-dependent kinases and members of the AP-1 transcription activator complex remained constant in HOXB4-transduced bone marrow cells over time. Thus by overexpressing HOXB4, a sustained and stable proliferation rate can be induced in cultured bone marrow cells in vitro and ongoing differentiation of the bone marrow culture can be blocked or at least delayed. After treatment with the epigenotype-modifying substances TSA and AzadC wildtype as well as bcl-2 transgenic neural stem cells revealed hematopoietic differentiation potential after transplantation into irradiated adult recipients which was not shown by untreated neural stem cells. The frequency of chimeric mice could be enhanced by using bcl-2 transgenic neural stem cells and already in vitro wildtype and bcl-2 transgenic neural stem cells revealed different TSA/AzadC sensitivity. This reconstitution of the hematopoietic system by treated neural stem cells was long lasting and occurred in the lymphoid as well as in the myeloid lineage. Successful hematopoietic reconstitution was also observable after transplanting clonal neural stem cells thereby excluding residual hematopoietic cells in the neural stem cell preparation to account for the reconstitution of the hematopoietic system. The generation of morphological and phenotypical intact hematopoietic cells from neural cells was not the consequence of cell fusion of recipient cells with injected donor cells because of the normal 2n genotype and the absence of heterokaryons which are known to be characteristic for fusion events. In view of that it is possible by modifying the epigenotype of neural stem cells followed by transplantation into a hematopoietic microenvironment to induce transdifferentiation of neural cells into hematopoietic cells. KW - Maus KW - Stammzelle KW - Genexpression KW - Modifizierung KW - Zelldifferenzierung KW - hämatopoetische Stammzelle KW - neurale Stammzelle KW - HOXB4 KW - HPK1 KW - epigenetische Modifikation KW - hematopoietic stem cell KW - neural stem cell KW - HOXB4 KW - HPK1 KW - epigenetic modification Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-8812 ER - TY - THES A1 - Schmidt, Enrico T1 - Ein neuer und ungewöhnlicher Signalweg erlaubt physiologischen Konzentrationen von Erythropoetin mitogene Kinasen in primären erythroiden Vorläuferzellen zu aktivieren T1 - A novel and unusual pathway allows physiological concentrations of erythropoietin to activate mitogenic kinases in primary erythroid progenitor cells N2 - Die Stimulation primärer erythroider Vorläuferzellen (PEPs) mit Erythropoetin (Epo) führt zur Aktivierung der mitogenen Kinasen („extracellular signal-regulated kinases“ (Erks) und „mitogen-activated protein kinase/Erk-activating kinases“ (MEKs)). Der Mechanismus der Aktivierung war bisher unklar. Mehrere wissenschaftliche Gruppen haben zudem unerwartet herausgefunden, dass eine Verkürzung und Mutation des zytoplasmatischen Endes des Epo-Rezeptors (EpoR), welche zum Verlust der Bindungsmöglichkeiten für verschiedene Signalproteine führt, anscheinend nur einen geringen Effekt auf das EpoR-Signalsystem hat. Diese Ergebnisse werden durch Viabilität und normaler Erythrozytenzahl von mutierten Mäusen unterstützt. Ein neuer Signalweg, der in biochemischen Studien mit aus menschlichem Nabelschnurblut gewonnenen PEPs gefunden wurde, könnte diese überraschenden Ergebnisse erklären. Wir zeigen zum ersten mal, dass Ras und das Klasse 1b Enzym der Familie der Phosphatidylinositol-3-Kinasen (PI3K), PI3Kg, nach Stimulation mit einer physiologischen Konzentration von Epo aktiviert werden. Überraschenderweise kann in PEPs die Epo-induzierte Ras-, MEK- und Erk-Aktivierung durch drei strukturell unterschiedliche PI3K-Inhibitoren blockiert werden. Überdies ist die Erk-Aktivierung in PEPs unempfindlich gegenüber Inhibierung der Raf-Kinasen, wird aber durch Proteinkinase C (PKC)-Inhibitoren unterdrückt. Im Gegensatz dazu ist die durch Stammzellfaktor („stem cell factor“ (SCF)) induzierte Erk-Aktivierung empfindlich gegenüber Raf-Inhibierung, jedoch unempfindlich gegenüber PI3K- und PKC-Inhibitoren. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Aktivierung von MEKs und Erks in PEPs durch geringe Konzentrationen an Epo nicht durch die klassische Signalkaskade „Src homology 2 domain-containing transforming protein C“ (Shc), „growth factor receptor bound protein 2“ (Grb2), „son of sevenless“ (Sos), Ras, Raf, MEK und Erk erfolgt, sondern durch einen PI3K-abhängigen und Raf-unabhängigen Signalweg, welcher PKC-Aktivität benötigt, reguliert wird. N2 - Stimulation of primary erythroid progenitors (PEPs) with erythropoietin (Epo) leads to the activation of the mitogenic kinases (extracellular signal-regulated kinases (Erks) and mitogen-activated protein kinase/Erk-activating kinases (MEKs)). So far, it has been unclear how this is mechanistically accomplished. Moreover, several research groups unexpectedly found that truncation and mutation of the cytoplasmic tail of the Epo receptor (EpoR), which prevents binding of numerous signal-transducing proteins, had apparently little effect on EpoR signalling. These results are supported by viability and normal erythrocyte counts of mutant mice. A novel pathway, now unraveled by biochemical studies in human cord blood-derived PEPs, might explain these puzzling findings. We show, for the first time, that Ras and the class Ib enzyme of the phosphatidylinositol-3 kinase (PI3K) family, PI3Kg, are activated in response to physiological Epo concentrations. Surprisingly, Ras, MEK and Erk activation by Epo in PEPs can be blocked by three structurally different PI3K inhibitors. Furthermore, Erk activation in PEPs is insensitive to the inhibition of Raf kinase but suppressed upon protein kinase C (PKC) inhibition. In contrast, Erk activation induced by stem cell factor (SCF), which activates c-Kit in the same cells, is sensitive to Raf inhibitors and insensitive to PI3K and PKC inhibitors. These results indicate that the activation of MEKs and Erks by minimal concentrations of Epo in PEPs does not occur through the classical cascade Src homology 2 domain-containing transforming protein C (Shc), growth factor receptor bound protein 2 (Grb2), son of sevenless (Sos), Ras, Raf, MEK and Erk. Instead, MEKs and Erks are activated via PI3K, through a Raf-independent signalling pathway which requires PKC activity. KW - Erythropoietin KW - Signaltransduktion KW - Protoonkogen KW - Erythropoetin KW - Epo KW - erythroide Vorläufer KW - PI3-K KW - Erk KW - erythropoietin KW - Epo KW - erythroid progenitors KW - PI3-K KW - Erk Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-10429 ER - TY - THES A1 - Wurzer, Walter T1 - Die Rolle des Transkriptionsfaktors NF-KappaB in Influenza-A-Virus infizierten Zellen T1 - The role of the transcriptionfactor NF-kB in influenza-A-virus infected cells N2 - Die Aktivierung von Transkriptionsfaktors NF-kB ist ein Charakteristikum viraler Infektionen, einschließlich der Infektion durch Influenza-A-Viren (Hiscott J. et al., 2001). Da die Expression vieler proinflammatorischer und antiviraler Zytokine, wie IFNb oder TNF-a durch NF-kB kontrolliert wird, hat sich ein Konzept entwickelt, welches besagt, dass NF-kB und sein übergeordneter Aktivator IKK wichtige Bestandteile der angeborenen, antiviralen Immunität im Kontext einer Infektion mit RNA-Viren sind (Chu WM. Et al., 1999). Im Gegensatz zu dieser weithin akzeptierten Ansicht, wurde in der hier vorliegenden Arbeit gezeigt, dass die Aktivierung von NF-kB für eine effiziente Influenzareplikation von großer Wichtigkeit ist. Auf einer molekularen Ebene wurde dies durch die NF-kB-abhängige virale Aktivierung des proapoptotischen Faktors TRAIL gezeigt, welcher die Virusvermehrung sowohl auto- als auch parakrin erhöht. Somit kann man sagen, dass NF-kB im Kontext einer Influenza-A-Virusinfektion sowohl proapoptotisch als auch proviral wirkt. Die Induktion der Apoptose ist ein weiteres, charakteristisches Merkmal, das man im Zusammenhang mit Virusinfektionen beobachten kann. Da die Rolle der Apoptose während einer Influenza-A-Virusinfektion noch unklar war, wurde diese Frage adressiert. Dabei wurde versucht mit einem wichtigen, virus-induzierten Apoptose-Effektor, nämlich Kaspase-3 zu interferieren. Überraschenderweise wurde die Influenzavermehrung in Anwesenheit eines Kaspase-3-Inhibitors stark negativ beeinflusst. Im Einklang mit diesem Befund konnte gezeigt werden, dass die Virustiter in Zellen, in denen XIAP überexprimiert wurde, rückläufig waren. Gegengleich führte Überexpression von Prokaspase-3 zu einem Titeranstieg. Mechanistisch scheint der Blockade der Virusvermehrung eine Retention der viralen RNP-Komplexe im Zellkern zu Grunde zu liegen, die die Bildung von reifen Viruspartikel verhindert. Die Erklärung dürfte in der Aktivität von Kaspase-3 zu finden sein, die an dem Abbau von Kernporenkomplexproteinen in apoptotischen Zellen beteiligt ist und was in Folge die freie Diffusion viraler RNPs ermöglichen dürfte. Abschließend entwickelte sich aufgrund der vorliegenden Arbeit eine neue Hypothese über die Rolle des IKK-NF-kB-Signalweges, seinen Einfluss auf die Apoptoseregulation in Influenza-infizierten Zellen und der Auswirkung auf das Virus. N2 - Activation of the transcription factor NF-kB is a hallmark of infections by viral pathogens including influenza-A-viruses (Hiscott J. et al., 2001). Since gene expression of many proinflammatory and antiviral cytokines, such as IFNb of TNF-a is controlled by NF-kB the concept emerged that NF-kB and its upstream regulator IKK are essential components of the innate antiviral immune response to infections with RNA viruses (Chu WM. et al., 1999). In contrast to this common view this work presents data that for efficient influenza virus production NF-kB activity is required. On a molecular level this is due to NF-kB-dependent viral induction of the proapoptotic factor TRAIL which enhances virus propagation in an auto- and parakrine fashion. Thus, NF-kB acts both proapoptotic and proviral in the context of an influenza virus infection. Induction of apoptosis is a hallmark observed upon infection with many viral pathogens, including influenza-A-virus. Since the consequences of apoptosis induction for the outcome of an influenza virus infection are not clear, we have addressed this issue by interfering with the function of a major virus-induced apoptosis effector, caspase-3. Surprisingly, influenza virus propagation was strongly impaired in the presence of a caspase-3 inhibitor in cultures cells. Consistent with these findings, virus yields are reduced in cells expressing XIAP and enhanced when procaspase-3 is overexpressed. Mechanistically, the block in virus propagation appears to be due to retention of the viral RNP complexes in the nucleus preventing formation of progeny virus particles. An explanation might given by an effect of caspase-3, which is involved in cleavage of protein of the nuclear pore complex in cells undergoing apoptosis, which results in fusion of the pores and might thus allow free diffusion of viral RNA complexes. Finally, this work presented here led to a new hypothesis concerning the role of the IKK-NF-kB-pathway, its influence on the regulation of apoptosis in influenza infected cells and the outcome for the virus. KW - Nuklearfaktor Kappa B KW - Influenza-A-Virus KW - Virusinfektion KW - NF-kB KW - Influenza A Virus KW - Apoptose KW - TRAIL KW - Export KW - NF-kB KW - influenza A virus KW - apoptosis KW - TRAIL KW - export Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-5901 ER - TY - THES A1 - Lasar, Andrea T1 - Funktion von NF-kappa B für die Differenzierung lymphoider Zellen und die inflammatorische Aktivierung von Endothelzellen T1 - Function of NF-kappa B for the differentiation of lymphoid cells and the inflammatory activation of endothelial cells N2 - Die Aktivität des Transkriptionsfaktors NF-kappa B wird hauptsächlich durch inhibitorische I kappa B-Proteine kontrolliert,die durch die I kappa B-Kinasen 1 und 2 phosphoryliert und anschließend degradiert werden.Dadurch werden ver-schiedene zelluläre Prozesse wie Differenzierung und Aktivierung beeinflusst. Um die Rolle von NF-kappa B in der Differenzierung lymphoider Zellen zu untersuchen,wurden nichtdegradierbare Mutanten der I kappa B-Proteine in trans-genen Mäusen mit Hilfe des Tet-off-Systems exprimiert.Dieses erlaubt die kon-ditionale,gewebespezifische Expression der Mutanten.Im Thymus von tTA/tetI kappa B alpha-transgenen Mäusen konnte eine doxyzyklinabhängige Reduktion der CD8+-Thymozyten beobachtet werden.Eine Einschränkung der Analyse späterer Ent-wicklungsstadien war die zeitlich begrenzte Expression des Transgens,die nur in frühen Entwicklungsstadien stattfand.Die B-Zellentwicklung wurde anhand eines in vitro Differenzierungssystems nachvollzogen,das die Differenzierung von prä-B-Zellen zu unreifen bzw.reifen B-Zellen erlaubt.Dabei zeigte sich,dass ein transdominantes I kappa B alpha beide Differenzierungsschritte nahezu vollstän-dig hemmt,aber nur,wenn das endogene I kappa B alpha nicht vorhanden ist. Die Beteiligung von NF-kappa B an der inflammatorischen ktivierung von Endothel-zellen wurde mit Hilfe von retroviralen Infektionen untersucht.Dabei wurden neben mutanten I kappa B-Proteinen auch kinase-inaktive oder konstitutiv-aktive Mutanten der I kappa B-Kinasen verwendet.Die transdominanten I kappa B-Proteine sowie die kinase-inaktive IKK2 waren in der Lage,die TNF-alpha-induzierte Ex-pression aller untersuchten Chemokine und Adhäsionsmoleküle komplett zu hem-men.Dagegen wurde durch die kinase-inaktive IKK1 nur ein Teil der untersuchten Moleküle in ihrer Expression beeinflusst.Interessanterweise war eine konstitu-tiv-aktive IKK2 schon in der Abwesenheit von TNF-alpha in der Lage,die Expres-sion der untersuchten Proteine zu aktivieren.Die durch die Mutanten veränderte Expression der Adhäsionsmoleküle und Chemokine hatte auch einen Einfluss auf die in vitro Adhäsion und Transmigration von Monozyten. N2 - The activity of the transcription factor NF-kappa B is mainly controlled by the inhibitory I kappa B proteins which are phosphorylated by the I kappa B kinases 1 and 2.This phosphorylation leads to the degradation of the I kappa B proteins thereby releasing NF-kappa B to the nucleus.The active NF-kappa B influences se-veral cellular processes like differentiation and activation. To investigate the role of NF-kappa B in the differentiation of lymphoid cells,nondegradable mutants of the I kappa B proteins were expressed in transge-nic mice based on the tet-off system.This allows the conditional tissue-speci-fic expression of the mutants.In the thymus of tTA/tetI kappa B alpha transge-nic mice,a doxycyclin-dependent reduction of the CD8+ thymocytes could be obser-ved.One restriction for the analysis of later stages of the development was the expression pattern of the transgene which was restricted to early developmental stages.The development of the transgenic B cells was investigated with an in vitro differentiation system which allows the differen-tiation to immature or mature B cells,respectively.The transdominant I kappa B alpha inhibits both steps of the differentiation almost completely,but only if the endogenous I kappa B alpha is absent. The involvement of NF-kappa B in the inflammatory activation of endothelial cells was studied by retroviral infections.In addition to the mutant I kappa B proteins,kinase-inactive or constitutively active versions of the I kappa B ki-nases were used.The transdominant I kappa B mutants as well as the kinase-inac-tive IKK2 were able to inhibit the TNF-alpha induced expression of all inve-stigated chemokines and adhesion molecules completely.In contrast,the kinase-inactive IKK1 influenced the expression of only a subset of the investigated genes.Interestingly,the constitutively active IKK2 could activate the expression of the investigated proteins already in the absence of TNF-alpha.The altered expression of adhesion molecules and chemokines also in-fluenced the in vitro adhesion and transmigration of monocytes. KW - NF-kappa B KW - I kappa B KW - B-Zelldifferenzierung KW - Tet-off-System KW - Entzündung KW - NF-kappa B KW - I kappa B KW - B cell differentiation KW - Tet-off system KW - inflammation Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-5058 ER - TY - THES A1 - Rennefahrt, Ulrike T1 - Die Rolle einer konstitutiv-aktiven MAP-Kinase SAPK-Beta bei der zellulären Transformation, Proliferation und Apoptose von NIH-3T3-Fibroblasten T1 - The role of a constitutively active MAP kinase SAPKbeta in cellular transformation, proliferation and apoptosis of NIH 3T3 fibroblasts N2 - Bei c-Jun N-terminalen Kinasen (JNKs) (auch als Stress-aktivierte Proteinkinasen SAPKs bezeichnet), handelt es sich um Mitglieder der Mitogen-aktivierten Proteinkinase Familie (MAPK), die die Genexpression als eine Antwort auf eine Vielzahl von physiologischen und nicht-physiologischen Stimuli regulieren. Gendeletionsexperimente (knockout) und der Einsatz von dominant-negativen Mutanten wiesen auf eine Funktion von SAPK/JNKs bei Prozessen der zellulären Differenzierung, dem Überleben und/oder Apoptose sowie onkogener Transformation hin. Direkte Analysen des transformierenden Potentials von SAPK/JNKs wurden bislang durch das Fehlen von konstitutiv-aktiven Mutanten verhindert. Erst unlängst konnte durch die Fusion der MAP Kinase mit seiner direkten, in der Kaskade vorgeschalteten, Aktivatorkinase solche Mutanten bereitgestellt werden. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde ein SAPKb-MKK7 Hybridprotein generiert, mit dessen Hilfe das transformierende Potential von aktiviertem SAPKb charakterisiert werden konnte. Die induzierte Expression von SAPKb-MKK7 führte zur morphologischen Transformation von NIH 3T3 Fibroblasten. Darüber hinaus bildeten diese Zellen kleine Foci aus transformierten Zellen, wuchsen in Soft-Agar und vergleichbar mit onkogenem Ras oder Raf, resultierte auch die Expression von aktiviertem SAPKb in der Zerstörung des F-Aktins. Des Weiteren steigerte die Expression von SAPKb-MKK7 die Proliferationsraten von NIH 3T3 Zellen. Im Gegensatz zu den akut transformierenden Onkogenen wie ras oder raf, ist SAPKb-MKK7 jedoch nicht in der Lage, das Überleben der transformierten Zellen zu bewirken. Unsere Daten schlagen daher vor, das konstitutiv-aktives SAPK/JNK zwar die Hauptaspekte zellulärer Transformation verursacht, aber nicht imstande ist, alle Veränderungen zu induzieren, die benötigt werden, um einen vollständig transformierten Phänotypen zu etablieren, weshalb insgesamt gesehen, sein transformierendes Potential deutlich schwächer ausgeprägt ist. Wir haben zusätzlich damit begonnen, dass tumorgene Potential von SAPKb-MKK7 direkt im Nacktmausmodell zu verifizieren. Die Injektion von SAPKb-MKK7 exprimierenden Fibroblasten resultierte in der Etablierung eines gut definierten Fibrosarkoms, wobei die Latenzzeit länger war als bei v-Raf transformierten Zellen. Somit ist die Expression von aktiviertem SAPK/JNK ausreichend, um die Tumorentwicklung in vivo zu initieren, auch wenn die lange Latenzzeit auf die Notwendigkeit zusätzlicher genetischer Veränderungen hinweist. N2 - The c-Jun N-terminal kinases (JNKs) (also known as stress-activated protein kinases, SAPKs), members of the mitogen-activated protein kinase (MAPK) family, regulate gene expression in response to a variety of physiological and environmental stimuli. Gene knockout experiments and the use of dominant interfering mutants have pointed to a role of SAPK/JNKs in the processes of cell differentiation, survival and/or apoptosis as well as oncogenic transformation. Direct analysis of the transforming potential of JNKs has been hampered so far by the lack of constitutively active forms of these kinases. Recently such mutants have become available by fusion of the MAPK with its direct upstream activator kinase. In the context of this PhD thesis a constitutively active SAPKb-MKK7 hybrid protein was generated and used to characterize the transforming potential of activated SAPKb. Inducible expression of SAPKb-MKK7 caused morphological transformation of NIH 3T3 fibroblasts. Additionally, these cells formed small foci of transformed cells, grew anchorage-independent in soft agar and similar to oncogenic Ras and Raf, expression of activated SAPKb resulted in the degradation of F-actin stress fibers. Furthermore, expression of SAPKb-MKK7 increased proliferation rates of NIH 3T3 cells. However, in contrast to the classical oncogenes like ras and raf, SAPKb-MKK7 is not able to selectively support the survival of the transformed cells. Therefore, our data suggest that constitutive SAPK/JNK activation elicits major aspects of cellular transformation, but is unable to induce the complete set of changes which are required to establish the fully transformed phenotype. We have also begun to directly determine the tumorigenic potential of SAPKb-MKK7 in the nude mouse. Injection of SAPKb-MKK7 expressing fibroblasts resulted in the establishement of a well defined fibrosarcoma, albeit at much later timepoints than in the case of v-Raf transformed cells. The long latency with which they develop tumors suggests the requirement of further genetic alterations. Thus expression of activated SAPK/JNK is sufficient to initiate tumor development in vivo. KW - MAP-Kinase KW - Zelldifferenzierung KW - SAPK KW - JNK KW - Signaltransduktion KW - Transformation KW - Fibroblasten KW - SAPK KW - JNK KW - signal transduction KW - transformation KW - fibroblasts Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-4158 ER - TY - THES A1 - Harder, Friedrich T1 - Untersuchungen zum in vivo Differenzierungspotenzial muriner und humaner hämatopoetischer sowie muriner neuraler Stammzellen T1 - Analysis of the in vivo differentiation potential of murine and human hematopoietic as well as murine neural stem cells N2 - Zusammenfassung Im Zuge der Säugerentwicklung entsteht aus der totipotenten Eizelle ein Organismus aus mehr als 200 verschiedenen Zelltypen. Dabei wird die Entwicklung und der Erhalt des Tieres von Stammzellen gewährleistet. Während der Embryonalentwicklung gibt es nur transient vorkommende Stammzelltypen, während der adulte Körper die Homoeostase mittels permanent vorhandener somatischer Stammzellen aufrechterhält. Als kennzeichnend für die somatischen Stammzellen galt, dass sie nur die Zellen ihres Gewebes ersetzen können. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob SSZ tatsächlich auf die Bildung von Zellen ihres Stammzellkompartiments beschränkt sind. Dazu wurden drei verschiedene Stammzelltypen, murine hämatopoetische und humane HSZ sowie murine NSZ in murine Präimplantationsblastozysten injiziert. Da dies die Zellen mit einer Umgebung exponiert, von der die Bildung aller Zelltypen des erwachsenen Tieres ausgeht. Es konnte gezeigt werden, dass zur Mitte der Schwangerschaft Nachkommen aller drei injizierten Stammzelltypen sich präferentiell in den fötalen hämatopoetischen Geweben befinden. Für humane hämatopoetische und murine NSZ wurde gezeigt, dass diese hämatopoetische Vorläufer in hämatopoetischen Geweben der Embryonen bilden, sowie dass Nachkommen dieser Zellen ein erythroides Genexpressionsmuster aktivieren. Der Vergleich adulter chimärer Tiere zeigte, dass HSZ zu nahezu gleichen Teilen neurale und hämatopoetische Gewebe besiedelt hatten. Nachkommen neuraler Stammzellen dagegen vor allem in neuralen Geweben adulter Tiere gefunden wurden. Aus diesen Ergebnisssen lässt sich ableiten, dass SSZ durch die Exposition mit der frühen embryonalen Mikroumgebung zur Bildung heterologer Zelltypen angeregt werden können. Außerdem demonstrieren diese Ergebnisse das unterschiedliche Entwicklungspotenzial von HSZ und NSZ und grenzen es gegenüber dem pluripotenten Differenzierungspotenzial von ES-Zellen ab. N2 - Summary During mammalian ontogeny an organism develops from a totipotent zygot that is composed of more than 200 distinct cell types. The development and the maintanance of the organism is dependent on somatic stem cells. Transient stem cell types exist during early embryonic development, but homoestasis of the adult is maintained by resident somatic stem cells. The restriction in committent to the exclusive generation of cells of their own stem cell system was considered as a hallmark of adult stem cells. The objective of the present thesis was to investigate whether somatic stem cells are truly restricted to the generation of cells belonging to their own stem cell system only. To this end three somatic stem cell types, murine hematopoietic, human hematopoietic and murine neural stem cells were injected into murine blastocysts. The blastocysts provides the injected stem cells with a microenvironment permissive for the generation of all cell types of the adult organism. It could be shown using this method that progeny of murine and human hematopoietic and murine neural stem cells preferentially engrafted the hematopoietic tissues of the developing embryo. Furthermore, injection of human hematopoietic and murine neural stem cells gave rise to hematopoietic progenitors cells in fetal hematopoietic tissues, and generated cells with an erythroid gene expression pattern. Comparison of adult chimeric animals revealed that progeny of hematopoietic stem cells had engrafted hematopoietic and neural tissues to a similar extent, whereas progeny of neural stem cells was preferentially detected in neural tissues. This result indicates, that somatic stem cells can generate heterologous cells if exposed to the early embryonic environment. Furthermore, it demonstrates the distinct and different developmental potentials of hematopoietic and neural stem cells and and distinguishes them from the pluripotent differentiation potential of ES-cells. KW - Maus KW - Mensch KW - Stammzelle KW - Neurogenese KW - Blutstammzelle KW - Zelldifferenzierung KW - Stammzellen KW - Hämatopoese KW - murin KW - human KW - Neurogenese KW - Stem cells KW - hematopoiesis KW - murine KW - human KW - neurogenesis Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-4214 ER - TY - THES A1 - Schneeberger, Daniela T1 - Molekulare und funktionelle Analyse der p21-aktivierten Kinase Mbt (mushroom bodies tiny) in der Augen- und Pilzkörperentwicklung von Drosophila melanogaster T1 - Molecular and functional analysis of the p21-aktivated kinase Mbt (mushroom bodies tiny) in eye- and mushroom body development of Drosophila melanogaster N2 - Diese Arbeit beschäftigt sich mit Mbt, einem hochkonservierten Signalmolekül aus der Familie der p21-aktivierten Kinasen (PAK) aus Drosophila, während der Augen- und Pilzkörperentwicklung. Mbt wird aufgrund von Sequenzhomologien der PAK Unterfamilie II (PAK4-6) zugeordnet. PAK4-6 binden präferentiell die aktivierten Rho-GTPasen Cdc42 und schwächer Rac, werden durch diese Bindung jedoch nicht aktiviert, sondern an bestimmte Zellkompartimente rekrutiert. In Struktur- Funktionsanalysen in vitro und in vivo konnte gezeigt werden, dass Mbt ebenfalls fast ausschließlich mit aktiviertem Cdc42 und kaum mit aktiviertem Rac interagiert. Diese Interaktion führt nicht zur Aktivierung von Mbt, sondern eher zu einer Verringerung der Kinaseaktivität. Eine weitere Funktion der Interaktion von Cdc42 und Mbt ist die Rekrutierung von Mbt an die Adhärenzverbindungen (AV) in sich entwickelnden Photorezeptorzellen. Außerdem kann katalytisch inaktives Mbt im Gegensatz zu Cdc42-bindungsdefizientem Mbt partiell die Mbt-Funktion in mbtP1-Fliegen übernehmen. Mbt hat also auch kinaseunabhängige Funktionen. Während der Pilzkörperentwicklung sind sind die Cdc42-Bindungsdomäne und die Kinasedomäne von Mbt ebenfalls essentiell, ob subzelluläre Lokalisation hier eine ähnlich wichtige Rolle spielt, wurde nicht untersucht. Als Mbt-Interaktionspartner wurden in einem Yeast-two-Hybrid Screen drei neuartige Proteine identifiziert. Zwei davon, CG8818 und CG14880, können als Substrat von Mbt fungieren. Allerdings kann nur für CG8818 eine direkte Bindung spezifisch mit aktiviertem Mbt nachgewiesen werden. Die Interaktion mit CG14880 scheint transient zu sein und nur für die Zeit der Phosphorylierungsreaktion anzudauern. Gegen CG8818 wurde ein Antiserum hergestellt, das nach seiner Charakterisierung in biochemischen und histologischen Ansätzen zum Einsatz kommen soll. In einem genetischen Screen wurden Mutationen in canoe als Verstärker und Mutationen in eip75b als Suppressor des mbtP3-Augenphänotyps gefunden. Eip75B ist ein putativer Steroidhormonrezeptor und wird während der Verpuppung exprimiert, also zu dem Zeitpunkt, wenn sich der mbt-Phänotyp ausbildet. Interessanterweise haben Mutationen in eip75b keinen Effekt auf den mbtP3-Pilzkörperphänotyp. Canoe ist wie Mbt an den AV von sich entwickelnden Photorezeptorzellen lokalisiert und spielt ebenfalls während deren Morphogenese eine Rolle. Canoe ist ein aktinbindendes Protein und könnte eine Verbindung von Mbt zum Cytoskelett darstellen, das der dynamischen Regulation bedarf, um morphogenetische Prozesse voranzutreiben. Eine direkte Interaktion kann nicht nachgewiesen werden. Auch während der Pilzkörperentwicklung scheinen Mbt und Canoe im gleichen Signalweg aktiv zu sein. Genetische Interaktion mit mbtP3 während der Augenentwicklung konnte außerdem für Mutationen in slingshot und twinstar gezeigt werden, die beide in die Regulation des Cytoskeletts involviert sind. Das Transmembranprotein Crumbs scheint ebenfalls zusammen mit Mbt in der Photorezeptorzellmorphogenese eine Rolle zu spielen. Außerdem weißen erste Experimente darauf hin, dass Mbt im ERK-MAP Kinase-Signalweg eine Rolle spielt. Durch die Entdeckung der direkten und indirekten Interaktionspartner bietet sich nun die Gelegenheit, die Funktion und Wirkungsweise von Mbt weiter zu entschlüsseln. Damit kann ein wesentlicher Beitrag zur Aufklärung der Rolle von PAK-Proteinen während morphogenetischer Prozesse und der Regulation der Zellzahl in der Entwicklung geleistet werden. N2 - In this work the function of Mbt, a higly conserved signaling molecule of the family of p21-activated kinases (PAK) from Drosophila, has been characterized during eyeand mushroom body development. Based on sequence homology, Mbt was classified as member of the PAK subfamily II (PAK4-6). PAK4-6 interact preferentially with activated Cdc42 and weakly with activated Rac. In contrast to PAK1-3 and DPAK this interaction does not lead to the activation of kinase activity but to the recruitment of PAK4-6 to specific cell compartments. A structure- function analysis in vitro and in vivo demonstrated that Mbt preferentially interacts with activated Cdc42 and weakly with Rac. This interaction does not lead to the activation but to the suppression of Mbt kinase activity. Furthermore, Cdc42 recruits Mbt to adherens junctions (AJ) in developing photoreceptor cells. In contrast to a Cdc42-binding deficient Mbt, a kinase dead Mbt protein can partially substitute for the loss of endogenous Mbt function in mbtP1-mutant flies. Thus, Mbt has kinase independent functions. The kinase domain and the Cdc42-binding domain are also essential for Mbt function during mushroom body development. The subcellular localization of Mbt during mushroom body development was not investigated. Three novel protein were identified as Mbt interacting proteins in a yeast-two-hybrid screen. Two of them, CG8818 and CG14880, are phosphorylation substrates of Mbt. However, only for CG8818 a direct interaction specifically with activated Mbt could be confirmed. The interaction with CG14880 seems to be very transient and to last just for the time of the phosphorylation reaction. For CG8818 an antiserum was generated which awaits its characterization and employment in biochemical and histological approaches. In a screen for modifiers of the mbtP3-eye phenotype mutations in canoe were found to enhance and mutations in eip75b were found to suppress the mbtP3-eye phenotype. eip75b encodes a putative steroid hormone receptor. It is expressed during puparium formation when the mbt-phenotype evolves. Interestingly, mutations in eip75b have no effect on the mbtP3-mushroom body phenotype. Canoe and Mbt colocalize at AJ in developing photoreceptor cells and Canoe, like Mbt, plays a role in photoreceptor cell morphogenesis. Canoe is an actin binding protein and could provide a link between Mbt and the cytoskeleton which needs to be regulated dynamically to drive morphogenetic processes. However, a direct interaction could not be shown. In mushroom body development Canoe and Mbt seem to function in the same developmental pathway. The mbtP3-eye phenotype was also modified by mutations in twinstar and slingshot. These proteins are regulators of actin dynamics and therefore another link to the cytoskeleton. The transmembrane protein Crumbs seems to function together with Mbt during photoreceptor cell morphogenesis as well. Last but not least, preliminary experiments suggest that Mbt is involved in the Erk-MAP Kinase pathway. These indirect and direct interaction partners await to be further characterized. Their identification offer a great opportunity to further gain insight into the processes regulated by Mbt KW - Taufliege KW - Pilzkörper KW - Auge KW - Ontogenie KW - Molekularbiologie KW - p21-aktivierte Kinase KW - PAK KW - Augenentwicklung KW - Mbt KW - Pilzkörperentwicklung KW - p21-activated kinase KW - PAK KW - eye development KW - Mbt KW - mushroom body development Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-4410 ER - TY - THES A1 - Ehrhardt, Christina T1 - Untersuchung Influenza Virus-induzierter Signalprozesse und deren Bedeutung in der Wirtszell-Abwehr T1 - Investigation of Influenza virus induced signal-transduction processes and their role in host defense N2 - Eine Influenza A Virus Infektion induziert die Expression zahlreicher Gene, einschließlich der TypI Interferone, die eine erste Abwehrlinie gegen virale Infektionen bilden. Hierbei ist IFNb das wichtigste Zytokin. IFNb wird durch einen multimeren Komplex, das Enhanceosom kontrolliert, das Bindungsstellen für die Transkriptionsfaktoren AP-1, NF-kB und IRF-3 in seiner Promotorsequenz besitzt. In früheren Arbeiten konnten wir zeigen, dass die Influenza Virus-induzierte AP-1 abhängige Genexpression über den JNK/SAPK-Signalweg erfolgt (Ehrhardt, 1999; Ludwig et al., 2001). Unter den, an DNA Elemente bindenden AP-1 Faktoren waren solche, die aufgrund von Phosphorylierung durch die JNKs reguliert werden, wie beispielsweise ATF-2. Weiterhin korrelierte die Induktion der AP-1 abhängigen Genexpression mit der starken Aktivierung von JNK und seiner upstream Regulatoren in permissiven Zellen. Die Virusmengen transfizierter und infizierter Zellen, in denen JNK inhibiert wurde, waren höher im Vergleich zu Virusmengen der Kontrollzellen. Demzufolge kann die Virus-induzierte Aktivierung von JNK und AP-1 nicht der Virusreplikation dienen, sondern gehört vielmehr zu einer antiviralen Immunantwort. Daten aus einem Virus-freien, auf Plasmiden basierenden vRNA Replikations-System deuten darauf hin, dass die JNK Aktivierung aus der Akkumulation viraler RNA resultiert. Entsprechend bewirkte die Infektion von Zellen mit einem Virus, dem das virale NS1 Protein fehlt, welches RNA binden und somit "wegfangen" kann, eine gesteigerte JNK Aktivität im Vergleich zu den Kontroll-Infektionen. Damit konnte das NS1 Protein als erstes virales Protein identifiziert werden, das der Virus- und dsRNA-induzierten Aktivierung des JNK/SAPK-Signalweges entgegen wirkt. Der Transkriptionsfaktor IRF-3 wird spezifisch infolge einer viralen Infektion aktiviert und ist daher ein potenter Kandidat, die schnelle und starke antivirale Genexpression zu regulieren. Infolge einer Influenza Virus Infektion wird IRF-3 phosphoryliert, wandert in den Kern und bindet dort an Promotoren, die die antivirale Genexpression steuern. Bislang sind die IRF-3 Kinase und zelluläre Signalwege, die eine IRF-3 Phosphorylierunge induzieren, unbekannt. Um in unserem Labor Signalmediatoren, die upstream von IRF-3 liegen, zu suchen, wurde ein IRF-3 responsives Promotor-Reportergen-Plasmid, aus dem IFNb Promotor stammend, konstruiert. Die kleine Rho-GTPase Rac1 wurde als erster nicht an RNA bindender, zellulärer Mediator identifiziert, der in die Influenza Virus-induzierte IRF-3 abhängige Genexpression involviert ist. Die Inaktivierung der Rho-GTPasen durch das spezifische Inhibitor Toxin B oder dominant negatives Rac1 resultierten in der Inhibierung der Virus- und dsRNA-induzierten IRF-3 Phosphorylierung und DNA Bindung, sowie der IRF-3 abhängigen Promotoraktivität, beispielsweise des IFNb Promotors. Damit konnten zwei wichtige Komponenten der Virus-induzierten Immunantwort identifiziert und charakterisiert werden. N2 - Infection of cells with Influenza A virus induces the expression of a variety of genes, including the type I interferons which are a first line of defense against viral infections. IFNb, the most important cytokine, is controlled by a higher order complex, the enhanceosom, which contains binding sites for the transcription factors AP-1, NF-kB and IRF-3. We could show that the Influenza Virus induced AP-1 dependent gene expression occurs via the JNK/SAPK pathway (Ehrhardt, 1999; Ludwig et al., 2001). Among the AP-1 factors which were identified to bind their cognate DNA element during viral infection are those, that are regulated via phosphorylation by JNKs, such as ATF-2. Accordingly, the induction of AP-1 dependent gene expression correlates with a strong activation of JNK and its upstream activators MKK4 and 7 in permissive cells. Virus yields from transfected and infected cells in which JNK signaling was inhibited by different approaches were higher compared to the levels from control cells. Therefore we conclude that virus-induced activation of JNK and AP-1 is not exploited by the virus to support its replication but rather is required for the innate antiviral immune response. Data obtained with a virus-free plasmid-based vRNA replication system indicated that JNK activation is a cause of viral RNA accumulation during infection. This was supported by the observation, that infection of cells with a virus lacking viral NS1 protein, which is known to bind and to sequester RNA from cellular signaling intermediates, caused a strongly enhanced JNK activity compared to control infections. Furthermore, the NS1 protein was identified as the first viral protein that antagonizes virus- and dsRNA-induced activation of the stress response signaling pathway mediated through Jun N-terminal kinase. IRF-3 is specificially activated in response to viral infection and is therefore the most potent candidate to regulate the fast and strong antiviral gene expression. After an Influenza virus infection IRF-3 becomes phosphorylated and migrates to the nucleus where it binds to antiviral gene promoters. However, the IRF-3 kinase and the cellular signaling pathways leading to IRF-3 phosphorylation are unknown. To investigate signaling mediators upstream of IRF-3, we have constructed an IRF-3 responsive promoter-reporter gene plasmid derived from the IFNb promoter. The small Rho-GTPase Rac1 was identified as the first non-RNA binding cellular mediator involved in the Influenza virus-induced IRF-3 dependent gene expression. Inactivation of these Rho GTPases by the specific inhibitor toxin B or dominant negative Rac1 resulted in the inhibition of virus- and dsRNA-induced IRF-3 phosphorylation and DNA binding as well as of IRF-3 dependent promoter activity, e.g. of the IFNb promoter. Thus two important components of virus-mediated immune response were identified and characterised. KW - Influenza-A-Virus KW - Interferon KW - Genexpression KW - Influenza A Virus KW - JNK/SAPK KW - IRF3 KW - Rac1 KW - dsRNA KW - Influenza A virus KW - JNK/SAPK KW - IRF3 KW - Rac1 KW - dsRNA Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-3870 ER - TY - THES A1 - Frey, Ulrich T1 - Kartierung krebsrelevanter Signalwege T1 - Mapping of oncogenetic pathways N2 - Die klassische Signaltransduktionskaskade, auch MAP Kinase Kaskade genannt, ist wesentlich an der Regulation zellulärer Vorgänge wie Proliferation, Differenzierung und Apoptose beteiligt. Proteinkinasen der Raf-Familie wirken dort als signalübertragende Elemente, welche Membranrezeptoren nachgeschaltet sind. Diese Proteine fungieren als Proto-Onkogene, eine Veränderung dieser Proteine kann sie in Onkogene überführen und sind wesentlich an der Krebsentstehung beteiligt. Während die Rolle von c-Raf als MEK-Aktivator innnerhalb des klassischen Signaltransduktionsweges gut charakterisiert ist, so ist nur wenig über die beiden anderen Isoformen A-Raf und B-Raf bekannt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei PC12 cDNA-Bibliotheken unter Verwendung des Two-Hybrid Systems mit A-Raf und mit c-Raf zur Isolierung neuer Raf-Interaktionspartner untersucht. Für c-Raf wurden die Wechselwirkungen mit den bekannten Interaktionspartnern bestätigt, es wurden jedoch keine neuen Bindungspartner identifiziert. Im A-Raf Two Hybrid Screen konnte zum einen Prolyl 4-Hydroxylase als Schlüsselenzym der Kollagensynthese isoliert werden. Es wurde keine Wechselwirkung zwischen Prolyl 4-Hydroxylase und c-Raf oder B-Raf beobachtet. Die Prolyl 4-Hydroxylase Bindungsstelle konnte innerhalb der N-terminalen variablen Region von A-Raf lokalisiert werden. Zum anderen wurde die Pyruvatkinase M2 als A-Raf spezifischer Bindungspartner identifiziert. Für diese Wechselwirkung war die c-terminale Region von A-Raf ausreichend. Durch Mutation zweier Aminosäuren im c-terminalen Teil von A-Raf konnte diese Wechselwirkung verhindert werden, wobei die Interaktion zu MEK und Ras dadurch nicht beeinträchtigt wurde. Ein kooperativer Effekt auf die Zelltransformation wurde durch Co-Transfektion von NIH Zellen mit onkogenem A-Raf und Pyruvatkinase M2 gezeigt. Diese führte zu doppelt so vielen Foci wie die Transfektion mit A-Raf alleine. Die Mutation der mutmaßlichen ATP-Bindungsstelle der Pyruvatkinase M2, welche die A-Raf Pyruvatkinase M2 Kooperation blockieren sollte, verhinderte diesen synergistischen Effekt. Diese Ergebnisse weisen auf eine Regulation der Pyruvatkinase M2 durch A-Raf hin und lassen den Schluss zu, dass die funktionelle Interaktion mit der Pyruvatkinase M2 durch onkogenes A-Raf für die Zelltransformation notwendig ist. Als zwei neue Raf-Interaktionspartner wurden Prolyl 4-Hydroxylase und Pyruvatkinase M2 identifiziert, welche Raf-Isoform spezifische Bindung zeigen. Auf diese Weise konnte eine direkte Verbindung zwischen der transformierenden MAP Kinase Kaskade und dem Energiestoffwechsel hergestellt werden. N2 - The MAP Kinase cascade belongs to a highly conserved signal transduction pathway and is crucial for the regulation of various cellular processes like proliferation, differentiation and apoptosis. Protein kinases of the Raf family serve as signal transducing proteins, which play an important role downstream of cellular membrane receptors. These proteins act as proto-oncogenes as they may be mutated into oncogenes which are substantially involved in the development of cancer. Whereas the role of c-Raf as a MEK activator is well established only little is known about the other two isoforms, A-Raf and B-Raf. In the context of this work two PC12 cDNA library were analysed using the yeast Two-Hybrid system with A-Raf and c-Raf as baits in order to isolate new Raf-interacting proteins. The Two hybrid screen with c-Raf resulted in the confirmation of already known interacting partner. No unknown interacting proteins were identified. The A-Raf screen yielded in the identification of prolyl 4-hydroxylase as a key enzyme of collagen synthesis. No positive interaction between c-Raf or B-Raf and prolyl 4-hydroxalase was detected. The binding domain of A-Raf could be mapped to the variable regulatory N-terminal region. As another new interacting protein of A-Raf Pyruvate kinase M2 (PK M2) was identified in this two hybrid screen. No positive interaction with c-Raf or B-Raf was detectable. The binding region of A-Raf was localized at the c-terminal kinase domain. Mutation of two amino acids within this domain resulted in an inhibition of interaction to PK M2, whereas the A-Raf binding to MEK or Ras was not abolished. An cooperative effect in cell transformation has been shown after co-transfection of NIH cells with A-Raf and PK M2. This co-transfection resulted in twice as much focus formation compared to transfection of A-Raf alone. The mutation of the putative ATP-binding site of PK M2, which should block the A-Raf PK M2 interaction inhibited this synergistic effect. These results point out A-Raf as a regulator of PK M2 and indicate that the functional interaction of oncogenetic transformed A-Raf with PK M2 is necessary for cell transformation. Using the yeast two hybrid-system two new A-Raf interacting proteins were identified: prolyl 4-hydroxylase and PK M2. The interaction to A-Raf was isoform specific as no positive interaction to B-Raf or c-Raf was detectable. Thus a direct link between the signal transduction pathway and the energy metabolism could be established. KW - Raf KW - Signaltransduktion KW - Pyruvate kinase KW - Karcinogenese KW - Two Hybrid KW - Raf KW - Signal transduction KW - Pyruvate kinase KW - Carcinogenesis KW - Two-hybrid Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-674 ER - TY - THES A1 - Otto, Ines Maria T1 - Klonierung und funktionelle Analyse des Aktinreorganisators p150-Spir T1 - Cloning and functional analysis of the p150-Spir actin reorganizator N2 - Die c-Jun-N-terminale Kinase (JNK), ein Mitglied der Familie der MAP-Kinasen (Mi-togen Activated Protein Kinases), wirkt als signalübertragender Effektor, der den klei-nen GTPasen der Rho–Familie Rac und Cdc42 nachgeschaltet ist. Rho-GTPasen spielen eine Schlüsselrolle in der Regulation von zellulären Aktinstrukturen und steuern Prozesse in der Zelle, die Änderungen der Aktinstruktur erfordern, wie z.B. Änderungen der Zellmorphologie, Zellmigration, Wachstum und Differenzierung. Genetische Studien an der Fruchtfliege Drosophila melanogaster konnten eine Rolle des Drosophila-JNK-Homologs DJNK(basket) in der Regulation von Zellbewegungen und Zellmorphologieänderungen während der Drosophila-Embryogenese zeigen. Inhibierung der Funktion von DJNK auf allen Stufen der DJNK-Signaltransduktions-kaskade führt zum sogenannten dorsal closure-Phänotyp der Embryonen mit fehlender Zellstreckung und fehlender Migration dorsaler Epithelzellen. Der molekulare Mechanismus, mit dessen Hilfe Rho-GTPasen Aktinstrukturen regu-lieren und wie JNK Einfluss auf Zellmorphologie und Zellbewegung nimmt, ist bisher nicht bekannt. Die Identifizierung neuer, mit JNK interagierender Proteine könnte zum besseren Verständnis der Funktion und Regulation von JNK führen. In dieser Arbeit wurde ein Yeast-Two-Hybrid-Screen mit dem Drosophila-Homolog DJNK/basket durchgeführt, der zur Entdeckung des Drosophila-Proteins p150-Spir als Interaktionspartner von DJNK führte. Der C-terminus des p150-Spir-Proteins enthält eine JNK-Interaktionsdomäne, ein DEJL-Motiv (Docking Site for Erk and JNK, LxL) und wird von aktivierten JNK-Proteinkinasen phosphoryliert. p150-Spir ist ein Multi-Domänen-Protein, das in seiner aminoterminalen Hälfte eine Aufeinanderfolge von vier WH2-Domänen (Wiskott Aldrich Homology Domain 2) enthält. WH2-Domänen binden monomeres Aktin, Proteine mit WH2 Domänen, wie z.B. WASP oder WAVE sind Aktinreorganisatoren. Die transiente Überexpression von p150-Spir in NIH3T3-Mausfibroblasten führt ebenfalls zu einer Aktinreorganisation. Eine weitere Domäne in p150-Spir ist eine modifizierte FYVE-Zinkfinger-Struktur (mFYVE) im zentralen Bereich des Proteins, die für die subzelluläre Lokalisation von p150-Spir von Bedeutung ist. Mutationen, welche die Zinkfingerstruktur zerstören, führen bei Überexpression in NIH3T3-Zellen zu einer zytoplasmatischen Lokalisation der mutierten p150-Spir-Proteine, während Wildtyp-p150-Spir perinukleär akkumuliert. Spir-Proteine sind evolutionär hoch konserviert. Es konnten Spir-ähnliche Sequenzen auf den humanen Chromosomen 16 und 18, in der Maus und in der Seescheide Ciona savignyi gefunden werden. Der höchste Grad an Konservierung besteht im Bereich der funktionellen Proteindomänen. Ein in allen Spir-Proteinen ent-haltenes, als Spir-Box bezeichnetes hoch konserviertes Sequenzmotiv befindet sich unmittelbar vor dem mFYVE-Zinkfinger. Die Spir-Box zeigt Strukturverwandschaft zur Rab-GTPase-Bindungsregion in Rabphilin 3A, einem Protein, das ebenfalls eine FYVE-Domäne besitzt. Rab-GTPasen sind wie FYVE-Domänenproteine in die Regulation zellulärer Vesikeltransportprozesse involviert. Das Vorhandensein beider Do-mänen in p150-Spir deutet auf eine Rolle des Proteins in zellulären Transportprozes-sen hin. Ein denkbares Modell wäre, daß p150-Spir unter der Kontrolle von JNK-Signalen zelluläre Aktinstrukturen reguliert, die für Transportprozessse in der Zelle von Bedeutung sind; p150-Spir fungiert damit möglicherweise als direktes Bindeglied zwischen MAPK-Signaltransduktionskaskaden und dem Aktinzytoskelett. N2 - Summary c-Jun-N-terminal kinases (JNKs) are members of the MAPK family (mitogen activated protein kinases) and act as downstream effectors of Rho family-GTPases, Rac and Cdc42. Rho family GTPases are involved in the regulation of cellular actin structures and control cellular processes which require remodelling of the actin skeleton, such as morphological changes, migration, growth and differentiation. A role for the Drosophila JNK-homolog DJNK/basket in the regulation of cell move-ment and cell shape changes during Drosophila embryogenesis arises from its func-tion in the process of dorsal closure. Inhibition of the DJNK-cascade results in a mu-tant phenotyp, where the dorsal elongation and migration of the epithelial cells fails. However, a direct link between JNK signaling and actin reorganization has not yet been established. A Yeast-Two-Hybrid-Screen using DJNK as a bait led to the discovery of the new Drosophila protein p150-Spir. p150-Spir is a multi-domain protein with a stretch of acidic amino acids, a cluster of 4 WH2-domains (Wiskott Aldrich Homology Domain 2), a Spir-Box and a modified FYVE zinc-finger motif (mFYVE). In addition, the C-terminus of p150-Spir harbors a docking site for ERK and JNK, LXL (DEJL-motif) and is phosphorylated by JNK in vitro and in vivo. When coexpressed with p150-Spir in NIH3T3 cells, JNK translocates to and colocalizes with p150-Spir at discrete spots around the nucleus. In its N-terminal part p150-Spir possesses 4 WH2-Domains. WH2-domains bind monomeric actin and WH2-family proteins, such as WASP and WAVE are involved in actin reorganization. We can show that in NIH3T3 mouse fibroblasts, p150-Spir co-localizes with F-actin and its overexpression induces clustering of filamentous actin around the nucleus. A modified FYVE zinc-finger structure (mFYVE) is located in the central region of the protein. FYVE-fingers mediate cell membrane localization of proteins. Disruption of the p150-Spir mFYVE-structure by deletion mutagenesis or cysteine/serine substitu-tions shows that the mFYVE-domain determines the subcellular localisation of p150-Spir. In contrast to the perinuclear distribution of the wild type p150-Spir, the mutated protein exhibits a uniform cytoplasmic distribution. Spir-family proteins are highly conserved among different species. Comparison of Drosophila p150-Spir sequences to EST data bases identified similar sequences in human (on chromosomes 16 and 18), mouse and the ascidian Ciona savignyi. A con-served sequence motif found in all Spir proteins - called Spir-Box - is located in the N-terminus, next to the mFYVE domain. Close inspection of the Spir-Box sequence revealed homology to the GTPase binding region of Rabphilin 3A, a FYVE domain containing protein which binds the small GTPase Rab3a. Rab-GTPases are involved in the regulation of cellular vesicle trafficking processes. The presence of a mFYVE domain in p150-Spir protein and a Spir-Box - a possible Rab-GTPase binding motif - suggests a potential function of Spir proteins in vesicel transport. In a possible model Spir initiates remodelling processes of the actin cytoskeleton, necessary for cellular transport processes under the control of JNK signals and thereby provides a direct link between MAPK-signaling and the actin cytoskeleton. KW - Taufliege KW - Actin KW - MAP-Kinase KW - Molekulargenetik KW - p150-Spir KW - JNK KW - Drosophila KW - MAPK KW - Aktin KW - Zytoskelett KW - WH2-Domäne KW - FYVE-Motiv KW - Vesikeltransport KW - Rab-GTPase KW - p150-spir KW - JNK KW - Drosophila KW - MAPK KW - actin KW - cytosceleton KW - WH2-domain KW - FYVE-motif KW - vesicle trafficking KW - Rab-GTPase Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1178402 ER - TY - THES A1 - Hartkamp, Jörg T1 - Regulation von MAPK Signalwegen durch die Sein/Threonin Kinase MLK3 T1 - regulation of MAPK signaling pathways through mixed lineage kinase 3 N2 - MAPK Kaskaden spielen eine Schlüsselrolle bei der Übertragung und der Umwandlung von extrazellulären Reizen in intrazelluläre Signale und regulieren dadurch unterschiedliche Prozesse wie Differenzierung, Zellproliferation oder Stress Antworten. 'Mixed Lineage Kinasen' (MLKs) bilden eine Familie von Serin/Threonin Proteinkinasen mit mehreren Protein/Protein Interaktionsdomänen (SH3, Cdc42 Rac interactive binding sequence/CRIB, Leuzin Zipper), die am engsten mit der Familie der MAPKK Kinasen verwandt ist. In der voliegenden Arbeit zeigen wir, dass MLK3 Cdc42/Rac induzierte JNK/SAPK Aktivität vermittelt, welches zu einer anschließenden Phosphorylierung und verstärkter transkriptioneller Aktivität des zur AP-1 Familie gehörenden immediate early Gens c-Jun führt. Zusätzlich phosphoryliert MLK3 die dualspezifischen Kinasen MEK1/2 direkt in vitro und in vivo an den für die Aktivierung wichtigen Serinen 217/221. Wohingegen dies nur zu einer ERK Aktivierung in Überexpressionssystemen führte, demonstrieren die Analysen überzeugend, dass endogenes MEK1/2, welches von MLK3 phosphoryliert worden ist, nicht in der Lage ist, diese Aktivität auf das physiologische Substrat ERK1/2 in vitro wie auch in vivo zu übertragen. Wir postulieren daher, dass MLK3 vermittelte MEK1/2 Phosphorylierung die dualspezifischen Kinasen von ERK1/2 Aktivierung entkoppelt. Zusätzlich zeigen wir, dass Überexpression von Wild Typ MLK3 zur morphologischen Transformation von NIH 3T3 Fibroblasten und Wachstum in Soft Agar führt. In Übereinstimmung mit den anderen Analysen ist MEK1/2 stark phosphoryliert jedoch von ERK1/2 Aktivierung in MLK3 transformierten Zellen entkoppelt. Weiterhin kooperiert MLK3 mit aktivierter MEK1 in Foci Bildung, was zeigt, dass MLK3 andere Signalwege als ERK1/2 in der Zelltransformation benutzt. Vielmehr ist in MLK3 transformierten Fibroblasten Wachstumsfaktor-induzierte ERK1/2 Aktivierung und Expression des immediate early Gens junB partiell blockiert. Unsere Analysen zeigen zum ersten Mal für eine MAPKK Kinase, dass sie MAPK Signalwege unterschiedlich reguliert. Während MLK3 auf der einen Seite JNK/SAPK aktiviert, entkoppelt es MEK1/2 induzierte Phosphorylierung von ERK1/2 Aktivierung und blockiert sogar Wachstumsfaktor-induzierte ERK1/2 Ativierung partiell. N2 - MAPK cascades play a key role in transducing and converting signals from extracellular stimuli into intracellular signals thereby regulating diverse processes like differentiation, proliferation or stress responses. Mixed lineage kinases (MLKs) form a family of serin/threonin protein kinases with multiple protein/protein interaction domains (SH3, Cdc42 Rac interactive binding sequence/CRIB, leucine zipper), which are most closely related to the MAPKK kinase family. In this work we show that MLK3 mediates Cdc42/Rac induced JNK/SAPK activation resulting in subsequent phosphorylation and enhanced transcriptional activity of the immediate early gene c-jun, which belongs to the family of AP-1 proteins. In addition MLK3 directly phosphorylates the dual specificity kinases MEK1/2 in vitro and in vivo on serines 217/221, which are important for activation. Whereas this only resulted in activation of the ERK1/2 pathway in overexpression systems, the analyses demonstrate convincingly that endogenous MEK1/2 phosphorylated by MLK3 is unable to transmit its activity in vitro and in vivo to its physiological substrat, ERK1/2. Therefore we postulate that MLK3 mediated MEK1/2 phosphorylation uncouples the dual specificity kinases from ERK1/2 activation. Furthermore we show that overexpression of wild type MLK3 leads to morphological transformation of NIH 3T3 fibroblasts and growth in soft agar. Consistent with the other analyses MEK1/2 is highly phosphorylated but uncoupled from ERK1/2 activation in MLK3 transformed cells. In addition MLK3 cooperates with activated MEK1 in foci formation which demonstrates that MLK3 utilizes pathways different from ERK1/2 for cell transformation. Furthermore growth factor induced ERK1/2 activation and induction of the immediate early gene junB is partially blocked in MLK3 transformed fibroblasts. Our data provide evidence for the first time that a MAPKK kinase differentially regulates MAPK pathways. On the one hand MLK3 activates JNK/SAPK but on the other hand it uncouples MEK1/2 phosphorylation from ERK1/2 activation and even blocks growth factor induced ERK1/2 activation partially. KW - MAP-Kinase KW - Signaltransduktion KW - Protein-Serin-Threonin-Kinasen KW - MLK3 KW - ERK KW - MEK KW - JNK KW - jun KW - Transformation KW - MLK3 KW - ERK KW - MEK KW - JNK KW - jun KW - transformation Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-312 ER - TY - THES A1 - Schmidt, Marc T1 - Die Rolle mitogener und stressinduzierter MAPK-Signalwege in der Regulation von keratinozytären Wachstums- und Differenzierungsvorgängen T1 - The role of mitogenic and stress-induced MAPK pathways in the regulation of growth and differentiation of keratinocytes N2 - Fehlgeleitete Proliferations- und Differenzierungsprozesse von Keratinozyten spielen eine entscheidende Rolle in der Pathogenese vieler Hauterkrankungen. Die intrazellulären Signalmechanismen, die die Balance zwischen Keratinozytenwachstum und -differen-zierung steuern, sind bislang weitgehend unbekannt. In dieser Arbeit wurde die Bedeutung Mitogen-aktivierter Proteinkinase (MAPK-) Signalwege in keratinozytären Wachstums- und Differenzierungsvorgängen untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß Induktion von Keratinozytendifferenzierung durch Erhöhung der extrazellulären Calciumkonzentration mit einer raschen und transienten Aktivierung des Raf/MEK/Erk- (MAPK-) Signalweges verbunden ist, während keine veränderte Aktivität der stressinduzierten MAPK Jnk und p38 nachweisbar war. Die calciuminduzierte Erk-Aktivierung unterschied sich in ihrer Kinetik von mitogener Erk-Aktivierung durch den Epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) und konnte durch Veränderungen der intrazellulären Calciumkonzentration moduliert werden. Während die mitogene Erk-Aktivierung durch die kleine GTPase Ras vermittelt wird, erfolgte calciuminduzierte Aktivierung von Erk Ras-unabhängig, was auf einen fundamentalen Unterschied mitogener und differenzierungsinduzierender Stimuli hinsichtlich ihrer Aktivierungsmechanismen der Raf/MEK/Erk-Kaskade hindeutet. Trotz der transienten Natur der calciuminduzierten Erk-Aktivierung waren die calcium-vermittelte Expression des Zellzykusinhibitors p21/Cip1 und des Differenzierungsmarkers Involucrin sensitiv für MEK-Inhibition, was auf eine wichtige Rolle des Raf/MEK/Erk-Signalweges in frühen Stadien des Differenzierungsprozesses hinweist. Wichtige Konvergenzpunkte zwischen calcium- und MAPK-abhängigen Signalwegen scheinen die beiden calciumbindenden S100-Proteine MRP8 und MRP14 zu sein. Beide Proteine werden in vitro differenzierungsabhängig exprimiert und translozieren sowohl nach Erhöhung der intrazellulären Calciumkonzentration als auch nach Stimulation stress-aktivierter MAPK an Zytoskelettstrukturen. Untersuchung der Expression von MRP8 und MRP14 in paraffin- und kryofixierten Serienschnitten gesunder und pathologisch veränderter Haut ergab, dass deren Expression normalerweise auf differenzierende Zellen im Haarfollikel beschränkt ist, jedoch in differenzierten Hautschichten hyperproliferativer oder tumoröser Haut massiv induziert werden kann. In der hier vorgestellten Arbeit wurden interessante neue Signalbeziehungen identifiziert, deren Entdeckung einen wichtigen Beitrag zum Verständnis der regulatorischen Mechanismen leisten könnte, durch die die Epidermis ihre funktionell wichtige Homöostase erhält. N2 - Abnormal proliferation and differentiation processes play an important role in the pathogenesis of various skin diseases. The intracellular signaling mechanisms governing the balance between growth and differentiation of keratinocytes are still largely unknown. In this thesis the role of mitogen-activated protein kinase (MAPK) cascades in keratinocyte growth and differentiation was analysed. Induction of keratinocyte differentiation by elevation of extracellular calcium levels resulted in a rapid and transient activation of the Raf/MEK/Erk (MAPK) pathway but did not increase activity of the stress-activated Jnk or p38 MAPKs. Calcium-induced Erk activation differed in kinetics from mitogenic Erk activation by epidermal growth factor (EGF) and and could be modulated by alterations of intracellular calcium levels. While EGF-induced Erk activation was mediated by the small GTPase Ras, calcium-induced Erk activity occurred independently of active Ras. This suggests that proliferative and differentiation-inducing stimuli use alternative mechanisms to activate the Raf/MEK/Erk pathway. Despite the transient nature of Erk activation, calcium-induced expression of the cell cycle inhibitor protein p21 and the differentiation marker involucrin were sensitive to MEK inhibition which implies a role for the Raf/MEK/Erk pathway in early stages of keratinocyte differentiation. The two calcium binding S100 proteins additionally studied here, MRP8 and MRP14, seem to represent important convergent points between calcium and MAPK signaling. In vitro both proteins are expressed in a differentiation-dependent manner in keratinocytes. Elevation of intracellular calcium levels as well as activation of stress-activated MAPKs resulted in translocation of MRP8/MRP14 complexes to the cytoskeleton. When expression of MRP8 and MRP14 was analysed in serial paraffin- or kryo-sections of healthy or diseased skin, signals in normal skin were largely restricted to differentiating cells of the hair follicle, however, additionally a strong induction of MRP8/14 expression was observed in differentiating epidermal layers of hyperproliferative or tumorigenic skin. In this thesis important novel signaling interactions were identified which provide new basic insights into the molecular mechanisms involved in the regulation of skin homeostasis which is essential for the maintenance of the multiple functions of the epidermis. KW - Keratinozyt KW - Zelldifferenzierung KW - MAP-Kinase KW - Signaltransduktion KW - Keratinozyten KW - Differenzierung KW - Calcium KW - MAP-Kinase KW - Signaltransduktion KW - S100-Protein KW - Raf/MEK/ERK KW - Keratinocyte KW - differentiation KW - calcium KW - MAPK KW - signal transduction KW - S100 protein KW - Raf/MEK/ERK Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-2013 ER - TY - THES A1 - Böhm, Jannic T1 - Regulation der BOB.1/OBF.1-Expression und der BOB.1/OBF.1-Proteinstabilität T1 - Regulation of the BOB.1/OBF.1 expression and of the BOB.1/OBF.1 protein stability N2 - Der transkriptionelle Koaktivator BOB.1/OBF.1 spielt eine wichtige Rolle in der oktamer-abhängigen Transkription in B-Lymphozyten. Mäuse, denen dieser Koaktivator fehlt, zeigen verschiedene Defekte in der B-Zellentwicklung. Besonders auffällig ist hierbei das völlige Fehlen der Keimzentren. Übereinstimmend mit diesem Phänotyp zeigten B-Zellen des Keimzentrums eine stark erhöhte BOB.1/OBF.1-Expression im Vergleich zu ruhenden B-Zellen. Im Gegensatz zu primären B-Zellen unterschiedlicher Entwicklungsstadien zeigen transformierte korrespondierende B-Zellen keine Regulation der BOB.1/OBF.1-Expression. T-Zellen exprimieren im Gegensatz dazu BOB.1/OBF.1 erst nach Stimulation mit PMA und Ionomycin. Um die unterschiedliche Regulation in B-Zellen versus T-Zellen zu untersuchen wurde der BOB.1/OBF.1-Promotor kloniert. Die Analyse der Promotor-Sequenz ergab Bindungsstellen für die Transkriptionsfaktoren CREB, NF-AT und ein SRY-Motiv. In Transfektionsstudien konnte eine deutliche Zellspezifität des Promotors gezeigt werden. Die erwartete induzierbare Aktivierung in T-Zellen war hingegen nur schwach. Die Analyse der BOB.1/OBF.1-Regulation in B-Zellen des Keimzentrums ergab, daß die verstärkte BOB.1/OBF.1-Expression nur partiell auf eine erhöhte Expression des BOB.1/OBF.1-Transkriptes zurück zu führen ist. Vielmehr zeigte sich eine deutliche Regulation des BOB.1/OBF.1-Proteins. In einem "yeast-two hybrid screen" mit der amino-terminalen Domäne von BOB.1/OBF.1 als "bait" (Köder) konnten die beiden Proteine SIAH1 und SIAH2 als Interaktionspartner identifiziert werden. Eine beschriebene Funktion von SIAH1 und SIAH2 liegt in der Regulation der Proteinstabilität ihrer Interaktionspartner. In Ko-Transfektionsexperimenten konnte gezeigt werden, daß SIAH1 die BOB.1/OBF.1-Proteinstabilität vermindert, ohne die transkriptionelle Expression zu beeinflussen. Die Inhibition des Proteasoms führt hierbei zu einer stark verminderten BOB.1/OBF.1-Degradation. Abschließend konnte gezeigt werden, daß die Aktivierung des B-Zellrezeptors zu einer Degradation von BOB.1/OBF.1 durch SIAH1 führt und folglich die transkriptionelle Aktivierung BOB.1/OBF.1-abhängiger Reporterkonstrukte vermindert wird. In einem zweiten "yeast-two hybrid screen" mit der carboxy-terminalen Domäne von BOB.1/OBF.1 als "bait", konnten die Interaktionspartner ABP 280 und Mcm7 identifiziert werden. Besonders die Rolle von Mcm7 in der Transkription könnte neue Aufschlüsse über die Wirkungsweise des transkriptionellen Aktivators BOB.1/OBF.1 geben. N2 - The BOB.1/OBF.1 coactivator is critically involved in mediating octamer-dependent transcriptional activity in B lymphocytes. Mice lacking this coactivator show various defects in B cell development most notably they completely lack germinal centers. Consistent with this phenotype, BOB.1/OBF.1 levels are massively upregulated in germinal center B cells as compared to resting B cells. In contrast to primary B cells, all transformed B cell lines express BOB.1/OBF.1 in comparable amounts. In T cells, BOB.1/OBF.1 expression can be induced by stimulation with PMA and ionomycin. To analyse the different regulation in B cells versus T cells, I cloned the BOB.1/OBF.1 promoter. Analyses of the promoter sequence showed binding sites for the transcription factors CREB, NF-AT and SRY/SOX-protein. Transfection experiments revealed a clear cell type specificity of the promoter. However the promoter was only poorly inducible in stimulated T-cells. I have addressed the mechanism of BOB.1/OBF.1 upregulation in germinal center B cells and found that only a minor part of this regulation can be attributed to increased levels of BOB.1/OBF.1-specific mRNA. Apparently, BOB.1/OBF.1 is also regulated at the protein level. In support of this suggestion I have been able to identify two related BOB.1/OBF.1 interacting proteins, SIAH1 and SIAH2, in a yeast two-hybrid screen using the amino-terminal domain as "bait". SIAH1 and SIAH2 are known regulators of protein stability. Cotransfection experiments revealed that coexpression of SIAH results in a destabilisation of BOB.1/OBF.1 protein without affecting mRNA levels. Furthermore, proteasome inhibitors block the degradation of BOB.1/OBF.1 protein. Finally B cell receptor cross-linking also resulted in the degradation of BOB.1/OBF.1 via SIAH1 and consequently reduced transcriptional activation of BOB.1/OBF.1-dependent reporters. Using the carboxy-terminal domain of BOB.1/OBF.1 as "bait", I identified in a second yeast-two hybrid screen the proteins ABP 280 and Mcm7 as potential interaction partners. Especially the role of Mcm7 in transcription could give new insights as to how BOB.1/OBF.1 is able to function as a transcriptional activator. KW - B-Lymphozyt KW - Zelldifferenzierung KW - Transkriptionsfaktor KW - BOB.1/OBF.1 KW - OCA-B KW - SIAH1 KW - B-Zelle KW - Keimzentrum KW - BOB.1/OBF.1-Promotor KW - BOB.1/OBF.1 KW - OCA-B KW - SIAH1 KW - B-cell KW - germinal center KW - BOB.1/OBF-1-promoter Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1180139 ER - TY - THES A1 - Matenia, Dorthe T1 - Die Rolle der Serin/Threonin Kinase Cot in Proliferation, Differenzierung und Apoptose N2 - Mitogene Signale werden von der Plasmamembran zum Zellkern über komplexe z.T. miteinander verknüpfte Signaltransduktionskaskaden übertragen. In der vorliegenden Arbeit wurde das Proto-Onkoprotein Cot als eine neue Komponente von mitogenen Signalkaskaden identifiziert, die die Fähigkeit hat, sowohl die klassische mitogene Kaskade als auch den JNK-Streß-Kinaseweg zu aktivieren. Wildtyp und aktiviertes Cot phosphorylieren und aktivieren MEK-1 und SEK-1 in vitro. Expression von onkogenem Cot in 293-, NIH3T3- und PC12- Zellen führt auch in vivo zu einer Phosphorylierung der endogenen Proteine c-Jun und ERK-1/2. In Bezug auf diese Fähigkeit, zwei unterschiedliche Signalkaskaden zu stimulieren, wurden die biologischen Effekte von Cot auf verschiedene Zelltypen, sowie seine tumorauslösende Wirkung in der Maus untersucht. Expression von onkogenem c-Raf-1 oder v-Mos führt zu einer Differenzierung in PC12-Zellen. Cot induziert ebenfalls Neuritenbildung in diesen Zellen. Ähnlich wie v-raf hat onkogenes cot eine antiapoptotische Wirkung auf 32D-Zellen nach IL-3-Entzug. In neugeborenen NSF/N-Mäusen induzierte retroviral-exprimiertes onkogenes Cot nach einer Latenzzeit von 7-10 Wochen B-Zell-Lymphome vergleichbar mit v-raf/v-myc induzierten Tumoren [191]. Diese Daten stimmen mit der Rolle von Cot in der klassischen mitogenen Kaskade überein und lassen darauf schließen, daß die simultane Aktivierung von JNK in diesem Zusammenhang keinen antagonistischen Effekt hat. Aktives NF-kB reguliert die Transkription einer Reihe von Ziel-Genen, die in verschiedenen zellulären Funktionen involviert sind. Viele Stimuli, Mitglieder der mitogenen Kaskade eingeschlossen, aktivieren NF-kB, so z.B. auch c-Raf-1, das mit Cot überlappende Effekte auf Apoptose-Suppression, Transformation und Differenzierung aufweist und auf der gleichen Ebene zu funktionieren scheint. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, daß Cot NF-kB aktiviert, dieses aber indirekt durch einen autokrinen Loop geschieht, der den EGFR und die Streß-Kinasekaskade involviert. Mit c-Raf-1 konnten in unserem Labor bereits ähnliche Ergebnisse gezeigt werden [234]. Eine direkte Interaktion zwischen Cot und der NF-kB-Aktivierung konnte durch die Identifikation von p105, einem Vorläuferprotein und Regulator von NF-kB, als Cot-Interaktionspartner in einem Two-Hybrid Screen gefunden werden. Die Tatsache, daß Cot mit IKKa und IkBa, beides NF-kB-Regulatoren, copräzipitiert, deutet ebenfalls auf einen direkten Mechanismus der Cot-abhängigen NF-kB-Aktivierung hin. Dieser Prozeß wird hauptsächlich durch den Transport der Komponenten des NF-kB-Transkriptionsfaktorkomplexes und seiner Regulatoren zwischen Zytosol und Nukleus kontrolliert. Das kleine G-Protein Ran spielt eine kritische Rolle in derartigen Transportprozessen und wurde interessanterweise ebenfalls in einem Two-Hybrid Screen als neuer Interaktionspartner von Cot identifiziert. Durch Coimmunopräzipitationsexperimente konnte dieses Ergebnis bestätigt werden. Diese Daten weisen auf einen neuen Mechanismus der NF-kB-Regulation durch Cot hin und geben neue Ansätze, die komplexen Funktionen von Cot in der Zelle zu diskutieren und weiter zu analysieren. N2 - Mitogenic signals initiated at the plasma membrane are transmitted to the nucleus through complex and partially connected signal transduction cascades. The proto oncoprotein Cot was identified in this thesis as a new component of mitogenic signalling cascades, which activates both, the classic cytoplasmic cascade and the JNK stress pathway. Wildtype and activated Cot phosphorylate and activate MEK-1 and SEK-1 in vitro. Moreover, expression of oncogenic Cot in 293, NIH3T3 and PC12 cells leads to phosphorylation of endogenous c-Jun and ERK 1/2 in vivo. To test the relevance of the ability of Cot to stimulate two different signalling cascades we have examined the effects of Cot on different cell types as well as on tumor induction in mice. Expression of oncogenic c-Raf-1 or v-Mos leads to differentiation of PC12 cells. Cot induces as well neurite outgrowth in these cells. Furthermore, oncogenic Cot shows similar to v-raf an antiapoptotic effect on 32D cells after IL-3 deprivation. Retrovirally expressed oncogenic Cot induces B-cell lymphomas in newborn NSF/N mice after a latency of 7-10 weeks similiar to v-raf/v-myc [191]. This data are consistent with the role of Cot in the classic mitogenic cascade and suggest that the simultaneously activated JNK stress pathway has no antagonistic effects in this context. Active NF-kB regulates transcription of a variety of target genes involved in distinct cellular functions. Many stimuli activate NF-kB including members of the mitogenic cascade, e.g. c-Raf-1, which seems to function on the same level as oncogenic Cot and has partially overlapping effects on apoptosis suppression, transformation and differentiation. The work presented in this thesis demonstrates that Cot activates NF-kB and that this activation occurs indirectly via an autocrine loop which involves the EGF-receptor and also results in the activation of the stresskinase pathway. Similar results have been obtained in our lab in the past with Raf-1 [234]. An additional more direct pathway from Cot to NF-kB activation was demonstrated by our identification of p105, a precursor protein and regulator of NF-kB, as Cot interaction partner in a Two-hybrid screen. Furthermore, Cot coprecipitates with IKKa and IkBa, which are both regulators of NF-kB. The process of NF-kB activation is mainly controlled by the shuttling of components of the active transcription factor complex as well as of its regulators between cytosol and the nucleus. It is assumed that the small GTPase Ran plays a crucial role in these transports. Interestingly, we observed in a Two-hybrid screen that Ran is interacting with Cot which also was confirmed by coimmunoprecipitation experiments. These results point to a new mechanism of NF-kB regulation by activated Cot and gives new starting points to analyse the complex functions of Cot in the cell. KW - Protein-Serin-Threonin-Kinasen KW - Apoptosis KW - Proliferation KW - Zelldifferenzierung KW - Molekularbiologie KW - Proto-Onkoprotein Cot KW - Apoptose KW - JNK-Streß-Kinase KW - proto oncoprotein Cot KW - apoptosis KW - JNK stress pathway Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1712 ER - TY - THES A1 - Neufeld, Bernd T1 - Neue Interaktionspartner der MAPKAP-Kinasen 3pK und MK2 T1 - New interaction partners of the MAPKAP-kinases 3pK and MK2 N2 - Auf der Suche nach physiologischen Substraten der MAPK-aktivierten Proteinkinasen (MAPKAP-Kinasen), 3pK und MAPKAP-K2 (MK2), wurden Mitglieder eines Säuger-Polycomb-Komplexes, HPH2 und das Protoonkoprotein Bmi1, als Interaktionspartner identifiziert. Proteine aus der Polycomb-Gruppe (PcG) sind dafür bekannt, multimere, Chromatin-assoziierte Proteinkomplexe zu bilden. Diese wirken als transkriptionelle Repressoren und spielen als solche eine wichtige Rolle sowohl in der Regulation von Entwicklungsprozessen als auch in der Kontrolle der zellulären Proliferation. HPH2 bindet im Hefe two-hybrid-System sowohl an 3pK als auch an MK2. Die Kinasen coimmunpräzipitieren auch mit den PcG-Proteinen. Weiterhin wurde festgestellt, daß nicht aktivierte und DNA-assoziierte 3pK, ähnlich wie Bmi1, in einem in vivo Repressionsassay als transkriptioneller Repressor wirkt. Dies unterstellt, daß 3pK, wie Bmi1, fähig sein muß, andere PcG-Proteine an das Zielgen zu rekrutieren, wo sich dann ein biologisch funktioneller Repressionskomplex rekonstituiert. Bmi1 ist ein Phosphoprotein und beide MAPKAP-Kinasen konnten in dieser Arbeit als in vitro Bmi1-Kinasen identifiziert werden. Da der Phosphorylierungsstatus von Bmi1 mit seiner Dissoziation und der anderer PcG-Proteine vom Chromatin korreliert, könnten die MAPKAP-Kinasen Regulatoren einer phosphorylierungs-abhängigen PcG-Komplex/Chromatin-Interaktion sein. 3pK und MK2 wurden hier als die ersten Kinasen identifiziert, die in Assoziation mit Proteinen von PcG-Komplexen vorliegen, was ein funktionelles Zusammenwirken von MAPK-Signaltransduktionsnetzwerk und der Regulation der PcG-Funktion nahe legt. Ein weiterer durch das two-hybrid-System und Coimmunpräzipitationsexperimente identifizierter Interaktionspartner beider hier analysierter MAPKAP-Kinasen ist der basische Helix-Loop-Helix- (bHLH) Transkriptionsfaktor E47. Dieses E2A-kodierte Protein bindet als Homo- bzw. Heterodimer mit gewebespezifischen bHLH-Proteinen an sogenannte E-Box-DNA-Motive und ist so in die Regulation gewebespezifischer Genexpression und Zelldifferenzierung involviert. In dieser Arbeit konnten 3pK und MK2 als in vitro Kinasen des in Zellen phosphoryliert vorliegenden Transkriptionsfaktors identifiziert werden. Weiterhin führte die transiente Expression jeder dieser Kinasen in einem Reportergenassay mit einem E-Box-Promotorkonstrukt zu einer Repression der transkriptionellen Aktivität von E47. Der bHLH-Transkriptionsfaktor E47 interagiert also mit beiden MAPKAP-Kinasen, 3pK und MK2, was die Kinasen als neu identifizierte Regulatoren der E47-abhängigen Genexpression präsentiert. Mit dieser Arbeit ist ein erster Aufschluß der physiologischen Aktivität der MAPKAP-Kinasen 3pK und MK2 als transkriptionelle Regulatoren gelungen. N2 - SUMMARY In a search for physiological substrates for the MAPK-activated protein kinases (MAPKAP kinases), 3pK and MAPKAPK-2 (MK2), constituents of a mammalian polycomb complex, HPH2 and the proto-oncoprotein Bmi1 were identified as interaction partners. Polycomb group (PcG) proteins are characterised to form large multimeric, chromatin-associated protein complexes with repressive transcriptional function. PcG complexes have an important role in the regulation of developmental processes and in the control of cellular proliferation. HPH2 binds to either kinase in a yeast two-hybrid assay and both, 3pK and MK2 are shown here to coimmunoprecipitate with HPH2 and Bmi1 or Bmi1 from mammalian cell lysates, respectively. Further, non-activated and DNA-bound 3pK could be identified as a transcriptional repressor of a chromatin-embedded gene in an artificial repression assay similar to the function of Bmi1. This suggests, that non-activated and DNA-bound 3pK, like Bmi1, must be able to recruit other PcG proteins to the target gene to reconstitute a functional repressive complex. Bmi1 is a phosphoprotein and both, 3pK and MK2 were identified in this paper to be in vitro Bmi1-kinases. Since the Bmi1 phosphorylation status was shown to be correlated with its dissociation from chromatin, it is likely that the MAPKAP kinases might be regulators of phosphorylation-dependent PcG-complex/chromatin interaction. In summary, the MAPK-activated protein kinases 3pK and MK2 are the first kinases identified to be assembled with members of PcG-protein complexes, suggesting a link of the MAPK signalling network to the regulation of PcG complex function. Another new interaction partner of both MAPKAP kinases which was identified by means of the two-hybrid system and coimmunoprecipitation experiments is the basic helix-loop-helix (bHLH) transcription factor E47. This E2A-encoded protein is known to be involved in the regulation of tissue-specific gene expression and cell differentiation. E47 is a phosphoprotein, and 3pK and MK2 were identified as E47-kinases in vitro. Further, expression of either kinase results in a repression of the transcriptional activity of overexpressed E47 in transient reporter gene assays with an E-box containing promoter construct. In summary, the MAPK-activated protein kinases 3pK and MK2 were identified to be assembled with the bHLH transcription factor E47 suggesting that these kinases are regulators of E47 activity and E47 dependent gene expression. These results provide first evidence for the physiological function of the MAPKAP kinases 3pK and MK2 as transcriptional regulators. KW - MAP-Kinase KW - Signaltransduktion KW - Molekularbiologie KW - intrazelluläre Signaltransduktion KW - MAPK-Signalwege KW - MAPKAP-Kinase KW - 3pK KW - MK2 KW - Polycomb KW - HPH2 KW - Bmi1 KW - Molecular biology KW - intracellular signal transduction KW - MAPK-Signalwege KW - MAPKAP kinase KW - 3pK KW - MK2 KW - Polycomb KW - HPH2 KW - Bmi1 KW - bHLH transcription factor Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1765 ER - TY - THES A1 - Gutbrod, Heidrun T1 - Untersuchungen zur genetischen Kontrolle des Melanom-induzierenden Gens von Xiphophorus T1 - Analyses for the genetic control of the melanoma inducing gene of Xiphophorus N2 - Die Melanomentstehung bei Rückkreuzungshybriden des Zahnkarpfens Xiphophorus wird durch die Überexpression des geschlechtschromosomalen Xmrk Onkogens verursacht. Im Wildtyp ist die Aktivität von Xmrk durch einen autosomalen Regulatorlocus R unterdrückt. Ziel dieser Arbeit war es, Erkenntnisse über die Expressionsregulation des Xmrk Onkogens zu gewinnen. Dazu wurden einerseits Experimente zur Kartierung von R durchgeführt, die eine Positionsklonierung des Gens erlauben würden. Zum anderen konnte durch die Analyse verschiedener Xmrk Mutanten ein genregulatorisches Element im Xmrk Onkogen identifiziert werden. N2 - The development of melanomas in Xiphophorus backcross hybrids is caused by overexpression of the sex linked oncogene Xmrk. The activity of Xmrk is repressed in wildtype fish by an autosomal regulatory locus, R. Aim of this study was to get insights into the regulation of the expression of the Xmrk oncogene. The work included experiments for mapping of R which is a prerequisite for a positional cloning strategy. The analysis of several Xmrk mutants led to the identification of a gene regulatory element in the Xmrk oncogene. KW - Schwertkärpfling KW - Melanom KW - Molekulargenetik KW - Xiphophorus KW - Xmrk KW - Rezeptortyrosinkinase KW - Fisch KW - AP-PCR KW - AFLP KW - Kartierung KW - Xiphophorus KW - Xmrk KW - receptor tyrosine kinase KW - fishes KW - AP-PCR KW - AFLP KW - mapping Y1 - 1999 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1370 ER -