TY - THES A1 - Hartmann, Thomas T1 - Nitrogen metabolism in Aspergillus fumigatus with emphasis on the oligopeptide transporter (OPT) gene family T1 - Stickstoffmetabolismus in Aspergillus fumigatus mit Schwerpunkt auf der Oligopeptidtransporter (OPT) Genfamilie N2 - The saprophytic filamentous fungus Aspergillus fumigatus has been gaining importance as an opportunistic human pathogen over the past decades. Advances in modern medicine have created a growing group of patients susceptible to infection with A. fumigatus, often contracting potentially deadly invasive aspergillosis. The virulence of this pathogen appears to be a multifactorial trait, a combination of physiological characteristics that enables the fungus to infect immunocompromised humans. This work concentrates on the nitrogen metabolism of A. fumigatus, which is essential for meeting the nutritional needs inside the human host. Using DNA microarrays, the transcriptional response during growth on three different secondary nitrogen sources was examined, which revealed the metabolic versatility of A. fumigatus, especially when challenged with proteins as the sole source of nitrogen. In-depth transcriptional profiling of the eight-member oligopeptide transporter (OPT) gene family underlined the importance of oligopeptide transport for growth on complex nitrogen sources like BSA or collagen. Heterologous expression of the opt genes in Saccharomyces cerevisiae showed their functionality as oligopeptide transporters, and characterized their substrate specificity. Using a Cre/loxP based genetic tool, a complete deletion of all opt genes in A. fumigatus was achieved. The resultant strain exhibited diminished growth on medium where the oligopeptide GPGG was the sole nitrogen source, but did not show any other in vitro phenotype. The opt deletion strain was not attenuated in virulence in a murine model of pulmonary aspergillosis, suggesting that the OPT gene family is not necessary for successful infection. The connection of oligopeptide transport and extracellular proteolytic activity was investigated by deleting the genes encoding Dpp4 and Dpp5, two dipeptidyl peptidases, or PrtT, the transcriptional regulator of major secreted proteases, in the complete opt deletion background. In contrast to the deletion of dpp4 and dpp5, which did not result in any additional phenotype, the absence of prtT led to a drastic growth defect on porcine lung agar. This suggests a synergistic action of extracellular proteolytic digest of proteins and transport of oligopeptide degradation products into the cell. Finally, this work established the bacterial β-Rec/six site-specific recombination system as a novel genetic tool for targeted gene deletion in A. fumigatus. N2 - Bedingt durch die medizinischen Fortschritte der vergangenen Jahrzehnte, hat sich die Zahl der Infektionen mit dem saprophytischen Schimmelpilz Aspergillus fumigatus drastisch erhöht. Die Virulenz von A. fumigatus für immungeschwächte Personen scheint hierbei auf einer Kombination an physiologischen Merkmalen und Fähigkeiten des Pilzes zu beruhen, weniger auf spezifischen Virulenzfaktoren. Diese Arbeit widmet sich dem Stickstoffmetabolismus von A. fumigatus, welcher essentiell für die Ernährung des Pilzes innerhalb des menschlichen Wirtes ist. Mittels DNA Microarrays gelang es die Reaktion des Pilzes auf das Vorhandensein dreier sekundärer Stickstoffquellen auf transkriptioneller Ebene zu erforschen, wobei sich besonders in Gegenwart von Protein die metabolische Vielseitigkeit von A. fumigatus zeigte. Tiefergehende transkriptionelle Studien der Oligopeptidtransporter (OPT) Genfamilie unterstrichen die Relevanz des Oligopeptidtransportes, während des Wachstums auf komplexen Stickstoffquellen wie BSA oder Collagen. Expression der opt Gene in Saccharomyces cerevisiae half deren Funktionalität als Oligopeptidtransporter und deren Substratspezifität zu untersuchen. Mittels eines Cre/loxP basierten Systems gelang es, sämtliche 8 opt Gene in A. fumigatus zu deletieren. Der daraus resultierende Stamm zeigte vermindertes Wachstum auf Medium mit dem Oligopeptid GPGG als einziger Stickstoffquelle, wuchs sonst allerdings wie der Wildtyp. Der Stamm zeigte keine verminderte Virulenz in einem Mausmodell für pulmonale Aspergillose, was darauf hindeutet, dass die OPT Genfamilie für einen erfolgreichen Infektionsverlauf nicht von nöten ist. Durch Deletion im OPT defizienten Stammhintergrund, entweder der zwei Dipeptidylpeptidasen Dpp4 und Dpp5, oder des transkriptionellen Regulators einiger zentraler sekretierter Proteasen PrtT, wurde die Verbindung zwischen Oligopeptidtransport und extrazellulärem Proteinabbau untersucht. Während die Deletion der Dipeptidylpeptidasen zu keinem weiteren Wachstumsphänotyp führte, resultierte das Entfernen des prtT Gens in einem drastischen Wachstumsdefekt auf einem Lungenagarmedium. Dies legt den Schluss nahe, dass sekretierte Proteasen und Oligopeptidtransporter synergistisch zusammenwirken, um extrazelluläres Protein als Nährstoffquelle zu erschließen. Schlussendlich gelang es in dieser Arbeit ebenfalls, das bakterielle β-Rec/six basierte Rekombinationssystem als genetisches Werkzeug zur gezielten Genmanipulation von A. fumigatus zu etablieren. KW - Aspergillus fumigatus KW - Stickstoffwechsel KW - Transkription KW - Stickstoffmetabolismus KW - Aspergillus fumigatus KW - oligopeptide transport Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-54027 ER - TY - THES A1 - Agarwal, Shruti T1 - Functional characterization of four CDK-like kinases and one Calmodulin-dependent kinase of the human malaria parasite, Plasmodium falciparum T1 - Funktionelle Charakterisierung von vier CDK-like kinasen und eine Calmodulin-dependent kinasen des human Malaria parasite, Plasmodium falciparum N2 - Malaria still persists as one of the deadliest infectious disease in addition to AIDS and tuberculosis. lt is a leading cause of high mortality and morbidity rates in the developing world despite of groundbreaking research on global eradication of the disease initiated by WHO, about half a century ago. Lack of a commercially available vaccine and rapid spread of drug resistance have hampered the attempts of extinguishing malaria, which still leads to an annual death toll of about one million people. Resistance to anti-malarial compounds thus renders search for new target proteins imperative. The kinome of the human malaria parasite Plasmodium falciparum comprises representatives of most eukaryotic protein kinase groups, including kinases which regulate proliferation and differentiation processes. Several reports till date have suggested involvement of parasite kinases in the human host and as well as in the mosquito vector. Kinases essential for life cycle stages of the parasite represent promising targets for anti-malarial compounds thus, provoking characterization of additional malarial kinases. Despite extensive research on most plasmodial enzymes, very little information is available regarding the four identified members of the cyclin dependent kinase like kinase (CLK) family. Thus, the present thesis dealt with the functional characterization of four members of the PfCLK kinase family of the parasite denoted as PfCLK-1/Lammer, PfCLK-2, PfCLK-3 and PfCLK-4 with a special focus on the first two kinases. Additionally, one Ca2+/Calmodulin dependent putative kinase-related protein, PfPKRP, presumed to be involved in sexual stage development of the parasite, was investigated for its expression in the life cycle of the parasite. In other eukaryotes, CLK kinases regulate mRNA splicing through phosphorylation of Serine/Arginine-rich proteins. Transcription analysis revealed abundance of PfCLK kinase genes throughout the asexual blood stages and in gametocytes. By reverse genetics approach it was demonstrated that all four kinases are essential for completion of the asexual replication cycle of P. falciparum. PfCLK 1/Lammer possesses two nuclear localization signals and PfCLK-2 possesses one of these signals upstream of the C-terminal catalytic domains. Protein level expression and sub-cellular localization of the two kinases was determined by generation of antiserum directed against the kinase domains of the respective kinase. Indirect immunofluorescence, Western blot and electron microscopy data confirm that the kinases are primarily localized in the parasite nucleus, and in vitro assays show that both enzymes are associated with phosphorylation activity. Finally, mass spectrometric analysis of co immunoprecipitated proteins shows interactions of the two PfCLK kinases with proteins, which have putative nuclease, phosphatase or helicase functions. PfPKRP on the other hand is predominantly expressed during gametocyte differentiation as identified from transcriptional analysis. Antiserum directed against the catalytic domain of PfPKRP detected the protein expression profile in both asexual and gametocyte parasite lysates. Via immunofluorescence assay, the kinase was localized in the parasite cytoplasm in a punctuated manner, mostly in the gametocyte stages. Reverse genetics resulted in the generation of PfPKRP gene-disruptant parasites, thus demonstrating that unlike CLK kinases, PfPKRP is dispensable for asexual parasite survival and hence might have crucial role in sexual development of the parasite. On one hand, characterization of PfCLK kinases exemplified the kinases involved in parasite replication cycle. Successful gene-disruption and protein expression of PfPKRP kinase on the other hand, demonstrated a role of the kinase in sexual stage development of the parasite. Both kinase families therefore, represent potential candidates for anti-plasmodial compounds. N2 - Malaria stellt neben AIDS und Tuberkulose weiterhin eine der bedeutendsten Infektionskrankheiten dar. Trotz intensiver, auf die Auslöschung der Krankheit abzielender Forschung, welche vor etwa 50 Jahren durch die Weltgesundheitsorganisation initiiert wurde, bleibt Malaria einer der Hauptgründe für hohe Mortalität und Morbidität in Entwicklungsländern. Das Fehlen eines Impfstoffes und die schnelle Ausbreitung von Resistenzen erschweren die Versuche, Malaria zu eliminieren, welche jährlich weiterhin eine Todesrate von einer Millionen Menschen aufweist. Aufgrund der Zunahme an Resistenzen ist die Suche nach neuen Angriffspunkten für Antimalariamedikamente zwingend erforderlich. Das Kinom des humanpathogen Parasiten Plasmodium falciparum besteht aus Vertretern der meisten eukaryotischen Proteinkinasegruppen, einschließlich einiger Kinasen, welche Proliferations- und Differenzierungsprozesse regulieren. Verschiedenen Berichten zufolge ist eine Rolle von Parasitenkinasen sowohl im menschlichen Wirt als auch in der die Krankenheit übertragende Mücke denkbar. Kinasen, welche für verschiedene Parasitenstadien essentiell sind, stellen viel versprechende Angriffspunkte für Malariamedikamente dar. Dies bestätigt die Bedeutung der Erforschung von weiteren, bisher uncharakterisierten Kinasen. Trotz extensiver Forschungsarbeit an den meisten Enzymen des Parasiten ist bisher sehr wenig über die vier identifizierten Mitglieder der Proteinfamilie Zyklin-abhängige Kinase-ähnlicher Kinasen (cyclin-dependent kinase like kinases, CLK) bekannt. Aufgrund dessen war die Charakterisierung der vier Mitglieder der PfCLK Kinasefamilie, PfCLK-1/PfLAMMER, PfCLK-2, PfCLK-3 und PfCLK-4 Bestandteil dieser Arbeit. Der Forschungsschwerpunkt lag hierbei auf den beiden erstgenannten Kinasen. Zusätzlich wurde die stadienspezifische Expression von PfPKRP, einer Kinase, welche vermutlich in der Entwicklung der Sexualstadien des Parasiten beteiligt ist, untersucht. In anderen Eukaryoten regulieren die CLK kinases das Spleißen von mRNA durch die Phosphorylierung von Serin-/Arginin-reichen Proteinen. Untersuchungen hinsichtlich der Expression der CLK kinase zeigten eine Transkriptabundanz in allen asexuellen Blutstadien sowie in Gametozyten. Mit Hilfe der Reverse-Genetics-Technik, wurde festgestellt, dass alle vier Kinasen essentiell sind für die asexuelle Replikation von P. falciparum. PfCLK-1/Lammer besitzt zwei Kernlokalisationssequenzen, während PfCLK-2 ein solches Signal stromaufwärts der C-terminalen katalytischen Domäne aufweist. Die Expression auf Proteinebene sowie die subzelluläre Lokalisation der beiden Kinasen wurde durch die Herstellung von Antiseren gegen die jeweilige Kinasedomainen hergestellt. Indirekte Immunfluoreszenzstudien, Westernblots und elektronenmikroskopische Daten bestätigten die Lokalisation vornehmlich in Zellkern des Parasiten. In-vitro-Studien demonstrierten, das beide Enzyme mit Phosphorylierungsaktivität assoziierte sind. Die massenspektrometrische Analyse von ko-immunopräzipitierten Proteinen zeigten Interaktionen der beiden PfCLK Kinasen mit Proteinen, welche vermutlich Nuklease-, Phosphatase- oder Helikase-Funktion besitzen. Im Gegensatz zu den CLK-Kinasen wird PfPKRP wird hauptsächlich während der Differenzierung der Gametozyten exprimiert wie Transkriptanalysen zeigten. Antiseren gegen die katalytische Domäne von PfPKRP detektierten jedoch Proteinexpression sowohl in Lysaten asexueller Parasiten als auch in Gametozytenlysaten. In Immunfluoreszenzstudien wurde ein punktiertes Expressionsmuster im Zytoplasma beobachtet, wobei die Expression vornehmlich in Gametozyten stattfand. Die Tatsache, dass die Herstellung einer PfPKRP-Knock out Mutante möglich war, zeigt, dass PfPKRP für das Überleben asexueller Parasiten entbehrlich ist, weshalb eine wichtige Rolle in der sexuellen Entwicklung der Parasiten möglich ist. Zum Einen dient die Charakterisierung der PfCLK-Kinasen als Beispiel für Kinasen, welche eine wichtige Rolle im Replikationszyklus der Parasiten spielen. Das erfolgreiche Ausschalten von PfPKRP sowie Untersuchungen zur Expression der PfPKRP-Kinase lassen zum Anderen eine Rolle in den Sexual- oder Transmissionstadien vermuten. Aufgrund dessen stellen beide Kinasefamilien viel versprechende Kandidaten für die Herstellung von malariamedikamenten dar. KW - Plasmodium falciparum KW - Kinasen KW - RNS-Spleißen KW - Malaria KW - Kinase KW - Calcium KW - Splicing Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48522 ER - TY - THES A1 - Konradt, Christoph T1 - Cross-talk between Shigella and cells of the adaptive immunity: The TTS effector IpgD inhibits T cell migration T1 - Cross-talk zwischen Shigella und Zellen des Adaptiven Immunsystems: Der TTS Effektor IpgD inhibiert die T Zell Migration N2 - Shigellosis, or bacillary dysentery, is a rectocolitis caused by the gram-negative, enteroinvasive bacteria of the genus Shigella. Shigellosis still remains a major public health burden with an estimated 80 million cases of bloody diarrhoea and 700.000 deaths per year, primarily in children under the age of 5. Shigella disrupts, invades, and causes inflammatory destruction of the colonic epithelium in humans through virulence effectors secreted by the type III secretion apparatus (TTSA). In contrast to the Shigella-induced manipulation of the host innate immune response, the impact of Shigella on the adaptive immunity has been poorly studied thus far. In order to understand why the naturally induced protective humoral response requires several infections to be primed and is of short duration, the work presented here investigates if Shigella is able to directly interact with T cells. Indeed, it has been shown that Shigella was able to invade and proliferate inside T cells. Furthermore, Shigella was able to inhibit T cell migration through a TTSA effector. Moreover, the Shigella effector IpgD, a phosphoinositide 4-phosphatase that specifically dephosphorylates phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate (PIP2) into phosphatidylinositol-(5)-monophosphate (PI(5)P), was identified as the effector responsible for the observed inhibition. It could be demonstrated that IpgD was responsible for a reduction of intracellular PIP2 levels in T cells. Further experiments showed a reduced level of phosphorylated ezrin, radixin and moesin (ERM) proteins in infected, as well as with IpgD transfected, T cells. The ERM protein family plays an imported role in signal transduction and motility and their activity is closely related to the binding of PIP2. Therefore, the low level of PIP2 leads to a dephosphorylation of the ERM proteins which inhibits T cells response to chemokine stimulation. Indeed, IpgD transfected T cells show a reduced ability to re-localise the ERM proteins upon chemokine stimulation. Targeting T cell motility, via TTSA effectors, could explain the low level of specific T cell priming during Shigella infection. This is the first report of Shigella induced manipulation of T cell function and on the inhibition of T cell migration by a bacterial effector. N2 - Shigellose oder Bakterieruhr ist eine von Bakterien der Gattung Shigella ausgelöste Dysenterie Erkrankung des Dickdarms. Mit jährlich über 80 Millionen Fällen von blutigen Durchfällen und 700000 Todesfällen, hauptsächlich bei Kindern unter 5 Jahren, stellt Shigella immer noch ein ernsthaftes Gesundheitsproblem dar. Shigella destabilisiert das menschliche Dickdarmgewebe und dringt in dieses ein, wo es eine akute Entzündung auslöst, die das Gewebe weiterhin zerstört. Verursacht wird dies durch bakterielle Effektoren, die durch ein Type III Sekretionssytem (TTSA) sekretiert werden. Verglichen mit der Anzahl an Studien über die Manipulation der angeborenen Immunabwehr gibt es nur wenige Studien über die Interaktionen von Shigella mit dem adaptiven Immunsystem. Um zu verstehen, warum für die Entwicklung einer humoralen Immunantwort mehrere Infektionen erforderlich sind, wurde im Rahmen dieser Arbeit untersucht, ob Shigella in der Lage ist, direkt mit TZellen zu interagieren. Es konnte gezeigt werden, dass Shigella in T-Zellen eindringen und sich vermehren kann. Darüber hinaus zeigt sich, dass Shigella in der Lage ist, durch TTSA-Effektoren die T-Zell-Migration zu hemmen. Der Shigella Effektor IpgD konnte als der für die Hemmung verantwortliche Effektor identifiziert werden. Bei IpgD handelt es sich um eine 4-Phosphoinositid-Phosphatase, die Phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphat (PIP2) zu Phosphatidyl-inositol-(5)- monophosphat (PI(5)P) dephosphoryliert. Es wurde deutlich, dass der Effektor IpgD, neben der Menge an PIP2, auch die Menge an phosphorylierten Ezrin, Radixin und Moesin (ERM) Proteinen in T-Zellen reduziert. Die ERM-Protein-Familie spielt in der Signaltransduktion und bei der Motilität von T-Zellen eine wichtige Rolle und ihre Phosphorylierung ist eng an die Bindung von PIP2 gekoppelt. Daher führt eine geringe Menge an PIP2 zu einer Dephosphorylierung der ERM-Proteine, was eine Stimulierung der T-Zellen durch Chemokine hemmt. In der Tat zeigten IpgDtransfizierte T-Zellen eine verminderte Fähigkeit zur Relokalisierung der ERM-Proteine nach einer Chemokine-Stimulation. In dieser Arbeit konnte erstmals die Manipulation von T-Zell-Funktionen durch Shigella und die Hemmung der T-Zell-Migration, ausgelöst durch einen bakteriellen TTSA-Effektor, gezeigt werden. KW - Medizinische Mikrobiologie KW - Shigella KW - Immunsystem KW - Shigella KW - immune sytem KW - host-pathogen-interaction Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-55397 ER - TY - THES A1 - Bauchart, Philippe Michel Paul T1 - Evaluation of the Zoonotic Risk of Escherichia coli Strains involved in Extraintestinal Infections of Humans and Animals. Characterization of New Virulences Factors in ExPEC T1 - Evaluierung des Zoonotischen Risikos von Escherichia coli Stämmen assoziiert mit Extraintestinalen Infektionen bei Menschen und Tieren. Charakterisierung Neuer Virulenzfaktoren von ExPEC N2 - Avian pathogenic Escherichia coli (APEC) represent a subset of the so-called extraintestinal pathogenic Escherichia coli (ExPEC) pathotype that can cause various extraintestinal infections in humans and animals. APEC are the causative agent of localized colibacillosis or systemic infection in poultry. In this latter case, the syndrome starts as an infection of the upper respiratory tract and develops into a systemic infection. Generally, ExPEC are characterized by a broad variety of virulence-associated factors that may contribute to pathogenesis. Major virulence factors, however, that clearly define this pathotype, have not been identified. Instead, virulence-associated genes of ExPEC and thus also of APEC could be used in a mix-and-match-fashion. Both pathotypes could not be clearly distinguished by molecular epidemiology, and this suggested a hypothetical zoonotic risk caused by APEC. Accordingly, the main scientific question of this study was to characterize common traits as well as differences of APEC and human ExPEC variants that could either support the possible zoonotic risk posed by these pathogenic E. coli strains or indicate factors involved in host specificity. Comparative genomic analysis of selected APEC and human ExPEC isolates of the same serotype indicated that these variants could not be clearly distinguished on the basis of (i) general phenotypes, (ii) phylogeny, (iii) the presence of typical ExPEC virulence genes, and (iv) the presence of pathoadaptive mutations. Allelic variations in genes coding for adhesins such as MatB and CsgA or their regulators MatA and CsgD have been observed, but further studies are required to analyze their impact on pathogenicity. On this background, the second part of this thesis focused on the analysis of differences between human ExPEC and APEC isolates at the gene expression level. The analysis of gene expression of APEC and human ExPEC under growth conditions that mimick their hosts should answer the question whether these bacterial variants may express factors required for their host-specificity. The transcriptomes of APEC strain BEN374 and human ExPEC isolate IHE3034 were compared to decipher whether there was a specific or common behavior of APEC and human ExPEC, in response to the different body temperatures of man (37°C) or poultry (41°C). Only a few genes were induced at 41 °C in each strain relative to growth at 37 °C. The group of down-regulated genes in both strains was markedly bigger and mainly included motility and chemotaxis genes. The results obtained from the transcriptome, genomic as well as phenotypic comparison of human ExPEC and APEC, supports the idea of a potential zoonotic risk of APEC and certain human ExPEC variants. In the third part of the thesis, the focus was set on the characterization of Mat fimbriae, and their potential role during ExPEC infection. Comparison of the mat gene cluster in K-12 strain MG1655 and O18:K1 isolate IHE3034 led to the discovery of differences in (i) DNA sequence, (ii) the presence of transcriptional start and transcription factor binding sites as well as (iii) the structure of the matA upstream region that account for the different regulation of Mat fimbriae expression in these strains. A negative role of the H-NS protein on Mat fimbriae expression was also proven at 20 °C and 37 °C by real-time PCR. A major role of this fimbrial adhesin was demonstrated for biofilm formation, but a significant role of Mat fimbriae for APEC in vivo virulence could not yet be determined. Interestingly, the absence of either a functional matA gene or that of the structural genes matBCDEF independently resulted in upregulation of motility in E. coli strains MG1655 and IHE3034 by a so far unknown mechanism. In conclusion, the results of this thesis indicate a considerable overlap between human and animal ExPEC strains in terms of genome content and phenotypes. It becomes more and more apparent that the presence of a common set of virulence-associated genes among ExPEC strains as well as similar virulence gene expression patterns and phylogenetic backgrounds indicate a significant zoonotic risk of avian-derived E. coli isolates. In addition, new virulence factors identified in human ExPEC may also play a role in the pathogenesis of avian ExPEC. N2 - Vogelpathogene Escherichia coli (APEC) sind eine Untergruppe der sogenannten extraintestinal pathogenen Escherichia coli (ExPEC), welche Infektionen außerhalb des Verdauungstraktes beim Menschen und vielen Tieren verursachen können. ExPEC sind durch eine Vielzahl Virulenz-assoziierter Faktoren charakterisiert, die zur Pathogenese beitragen können. Haupt-Virulenzfaktoren, die eine eindeutige Zuordnung zu diesem Pathotyp erlauben, wurden jedoch noch nicht identifiziert. Die Virulenz bei ExPEC und somit auch bei APEC scheint auf der kombinierten Expression von Virulenzfaktoren zu beruhen. Beide Pathotypen können daher nicht eindeutig aufgrund des Genomgehaltes sowie molekularer Epidemiologie voneinander unterschieden werden. In der vorliegenden Arbeit sollten Gemeinsamkeiten sowie Unterschiede bei ausgewählten APEC- und humanen ExPEC-Isolaten des gleichen Serotyps untersucht werden, um nähere Hinweise auf ein Zoonoserisiko zu erhalten oder um Faktoren zu charakterisieren, die zur Wirtsspezifität beitragen können. Vergleichende Analysen des Genomgehaltes zeigten, dass diese Varianten nicht aufgrund (i) genereller Phänotypen, (ii) ihrer Phylogenie, (iii) der Anwesenheit typischer Virulenz-assoziierter Gene sowie (iv) pathoadaptiver Mutationen voneinander unterschieden werden können. Interessanterweise wurden bei manchen Isolaten Allelvariationen in Genen beobachtet, die für Adhäsine wie MatB und CsgA sowie für ihre Regulatoren (MatA und CsgD) kodieren. Ihre mögliche Bedeutung für die Virulenz muß jedoch weiter analysiert werden. Im zweiten Abschnitt dieser Arbeit wurde untersucht, ob sich eng verwandte Vogel- und humane ExPEC-Isolate hinsichtlich ihrer Genexpression unterscheiden. Um zu untersuchen, ob die Körpertemperatur des Menschen (37 °C) oder von Geflügel (41 °C) einen unterschiedlichen Einfluß auf die bakterielle Genexpression hat und somit zur Wirtsspezifität beitragen kann, wurden die Transkriptome des APEC-Stammes BEN374 und des humanen ExPEC-Stammes IHE3034 nach Anzucht in vitro bei 37 °C bzw. 41 °C miteinander verglichen. Wachstum bei 41 °C führte nur bei wenigen Genen zu einer Induktion der Genexpression, wohingegen die Anzahl der reprimierten Gene bei dieser Temperatur in beiden Stämmen deutlich höher war und vor allem auf eine reduzierte Beweglichkeit und Chemotaxis hindeutete. Die Ergebnisse von vergleichender Genomik, Transkriptomik und Phänotypisierung humaner ExPEC- und APEC-Stämme unterstützen somit die Annahme, dass es ein Zoonoserisiko zwischen manchen APEC- und humanen ExPEC-Isolaten gibt. Im dritten Teil dieser Arbeit stand die Charakterisierung der Mat Fimbrien- Expression in E. coli sowie ihre Rolle bei der Infektion im Mittelpunkt. Der Vergleich der kodierenden matABCDEF Determinanten im E. coli K-12 Stamm MG1655 und im humanen ExPEC O18:K1 Isolat IHE3034 zeigte Unterschiede in (i) der jeweiligen Nukleotidsequenz, (ii) der Anwesenheit von Transkriptionsstartpunkten und Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen sowie (iii) der Struktur der „Upstream“-Region des Genclusters auf, die zur unterschiedlichen Fimbrienexpression in beiden Stämmen beitragen können. Eine Repression der Mat Fimbrienexpression durch das H-NS Protein wurde nachgewiesen. Zudem wurde gezeigt, dass Mat Fimbrien signifikant zur Biofilmbildung beitragen, wohingegen ein Beitrag zur in vivo-Virulenz nicht festgestellt wurde. Interessanterweise beeinflusste der MatA Regulator, aber auch die Mat Fimbrien- Strukturgene, die Flagellenexpression: die Abwesenheit von matA bzw. von matBCDEF führte in beiden E. coli Stämmen zu einer Induktion der Flagellenexpression und Motilität. Der zugrundeliegende Mechanismus ist noch unbekannt. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass es eine beträchtliche Überlappung des Genomgehaltes und der Phänotypen bei ExPEC-Stämmen, die von Menschen oder Tieren isoliert wurden, gibt. Das Vorhandensein eines gemeinsamen Virulenzgenpools, ihre Phylogenie und ähnliche Genexpressionsprofile legen nahe, dass ein Zoonoserisiko von APEC-Isolaten ausgehen kann. Die Identifizierung bislang unbekannter Virulenzfaktoren humaner ExPEC-Stämme kann sich daher auch auf das Verständnis der Pathogenese von APEC-Isolaten auswirken. Die Ergebnisse dieser Arbeit belegen auch, wie am Beispiel der Mat Fimbrien gezeigt, dass unterschiedliche E. coli-Phänotypen nicht nur auf einen unterschiedlichen Genomgehalt, sondern auch auf die unterschiedliche Regulation konservierter Determinanten zurückgeführt werden kann. KW - Escherichia coli KW - Virulenzfaktor KW - Zoonotisches Risiko KW - APEC KW - ExPEC KW - Mat Fimbrien KW - Biofilm KW - zoonotic risk KW - APEC KW - ExPEC KW - Mat fimbriae Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48848 ER - TY - JOUR A1 - Solbach, Werner A1 - Moll, Heidrun A1 - Röllinghoff, Martin T1 - Lymphocytes play the music but the macrophage calls the tune N2 - No abstract available KW - Immunologie Y1 - 1991 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-45889 ER - TY - JOUR A1 - Gillitzer, Reinhard A1 - Moll, Heidrun T1 - Simultaneous demonstration of two antigens with immunogold-silver staining and immunoenzymatic labeling N2 - A novel technique for independent and simultaneous labeling of two antigens expressed on individual cells (referred to as mixed labeling) is presented. The staining procedure combined three-step (streptavidin-biotin) immunogold-silver staining with three-step immunoenzymatic labeling. To ensure both high specificity and high sensitivity, particular emphasis was placed on designing a protocol that avoids immunological crossreactivity between the antibody reagents and overlapping of the final color products. Two examples for usage of this mixed labeling technique are described: lymphocyte subpopulations were identified in inflammatory lesions of human skin and infected host cells were characterized in the skin of mice infected with the obligatory intracellular parasite Leishmania major, a cause of human cutaneous leishmaniasis. Y1 - 1993 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-33019 ER - TY - JOUR A1 - Moll, Heidrun A1 - Fuchs, Harald A1 - Blank, Christine A1 - Röllinghoff, Martin T1 - Langerhans cells transport Leishmania major from the infected skin to the draining lymph node for presentation to antigen-specific T cells N2 - No abstract available KW - Immunologie KW - Langerhans cell KW - Leishmania major KW - T-cell Y1 - 1993 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-46023 ER - TY - THES A1 - Zdziarski, Jaroslaw Maciej T1 - Bacterial Genome Plasticity and its Role for Adaptation and Evolution of Asymptomatic Bacteriuria (ABU) Escherichia coli Strains T1 - Über die Bedeutung der bakteriellen Genomplastizität für die Adaptation und Evolution asymptomatischer Bakteriurie (ABU) Escherichia coli Isolate N2 - Asymptomatic bacteriuria (ABU) represents the long term bacterial colonization of the urinary tract, frequently caused by Escherichia coli (E. coli), without typical symptoms of a urinary tract infection (UTI). To investigate characteristics of ABU E. coli isolates in more detail, the geno- and phenotypes of eleven ABU isolates have been compared. Moreover, consecutive in vivo re-isolates of the model ABU strain 83972 were characterized with regard to transcriptomic, proteomic and genomic alterations upon long term in vivo persistence in the human bladder. Finally, the effect of the human host on bacterial adaptation/evolution was assessed by comparison of in vitro and in vivo-propagated strain 83972. ABU isolates represent a heterologous group of organisms. The comparative analysis of different ABU isolates elucidated the remarkable genetic and phenotypic flexibility of E. coli isolates. These isolates could be allocated to all four major E. coli phylogenetic lineages as well as to different clonal groups. Accordingly, they differed markedly in genome content, i.e., the genome size as well as the presence of typical UPEC virulence-associated genes. Multi locus sequence typing suggested that certain ABU strains evolved from UPEC variants that are able to cause symptomatic UTI by genome reduction. Consequently, the high E. coli genome plasticity does not allow a generalized view on geno- and phenotypes of individual isolates within a clone. Reductive evolution by point mutations, DNA rearrangements and deletions resulted in inactivation of genes coding for several UPEC virulence factors, thus supporting the idea that a reduced bacterial activation of host mucosal inflammation promotes the ABU lifestyle of these E. coli isolates. Gene regulation and genetic diversity are strategies which enable bacteria to live and survive under continuously changing environmental conditions. To study adaptational changes upon long term growth in the bladder, consecutive re-isolates of model ABU strain 83972 derived from a human colonisation study and from an in vitro long term cultivation experiment were analysed with regard to transcriptional changes and genome rearrangements. In this context, it could be demonstrated that E. coli, when exposed to different host backgrounds, is able to adapt its metabolic networks resulting in an individual bacterial colonisation strategy. Transcriptome and proteome analyses demonstrated distinct metabolic strategies of nutrients acquisition and energy production of tested in vivo re-isolates of strain 83972 that enabled them to colonise their host. Utilisation of D-serine, deoxy- and ribonucleosides, pentose and glucuronate interconversions were main up-regulated pathways providing in vivo re-isolates with extra energy for efficient growth in the urinary bladder. Moreover, this study explored bacterial response networks to host defence mechanisms: The class III alcohol dehydrogenase AdhC, already proven to be involved in nitric oxide detoxification in pathogens like Haemophilus influenzae, was shown for the first time to be employed in defending E. coli against the host response during asymptomatic bacteriuria. Consecutive in vivo and in vitro re-isolates of strain 83972 were also analysed regarding their genome structure. Several changes in the genome structure of consecutive re-isolates derived from the human colonisation study implied the importance of bacterial interactions with the host during bacterial microevolution. In contrast, the genome structure of re-isolates from the in vitro long term cultivation experiment, where strain 83972 has been propagated without host contact, was not affected. This suggests that exposure to the immune response promotes genome plasticity thus being a driving force for the development of the ABU lifestyle and evolution within the urinary tract. N2 - Asymptomatische Bakteriurie (ABU) stellt eine bakterielle Infektion der Harnblase über einen langen Zeitraum dar, die häufig von Escherichia coli hervorgerufen wird, ohne dass typische Symptome einer Harnwegsinfektion auftreten. Um die Charakteristika von ABU E. coli Isolaten genauer zu untersuchen, wurden die Geno- und Phänotypen von 11 ABU-Isolaten verglichen. Außerdem wurden in mehreren aufeinanderfolgenden in vivo-Reisolaten des Modell-ABU Stammes 83972 die Veränderungen im Transkriptom, Proteom und Genom während einer langfristigen Persistenz in der menschlichen Blase charakterisiert. Schließlich wurde der Effekt des menschlichen Wirtes auf die bakterielle Adaptation durch einen Vergleich von in vitro- mit in vivo-kultivierten Stämmen abgeschätzt. ABU-Isolate stellt eine heterogene Gruppe von Organismen dar. Diese können den vier phylogenetischen Hauptgruppen von E. coli sowie unterschiedlichen klonalen Gruppen zugeordnet werden. Dementsprechend unterscheiden sie sich erheblich bezüglich der Zusammensetzung des Genomes, der Genomgröße und auch der Ausstattung mit UPEC-typischen Virulenz-assoziierten Genen. Multi-Lokus-Sequenz-Typisierung legt nahe, dass bestimmte ABU Stämme sich durch Genomreduktion aus UPEC Stämmen entwickelt haben, die eine Harnwegsinfektion mit charakteristischen Symptomen auslösen konnten. Folglich erlaubt die hohe Genomplastizität von E. coli keine generalisierte Betrachtung einzelner Isolate eines Klons. Genomreduktion über Punktmutationen, Genom-Reorganisation und Deletionen resultierte in der Inaktivierung einiger Gene, die für einige UPEC Virulenz-Faktoren kodieren. Dies stützt die Vorstellung, dass eine verminderte bakterielle Aktivierung der Entzündung der Wirtsschleimhaut den Lebensstil von ABU (bei diesen E. coli-)Isolaten fördert. Genregulation und genetische Diversität sind Strategien, die es Bakterien ermöglichen unter sich fortlaufend ändernden Bedingungen zu leben bzw. zu überleben. Um die anpassungsbedingten Veränderungen bei einem langfristigen Wachstum in der Blase zu untersuchen, wurden aufeinanderfolgende Reisolate, denen eine langfristige in vivo-Kolonisierung im menschlichen Wirt beziehungsweise eine in vitro-Kultivierung vorausgegangen ist, im Hinblick auf Veränderungen Genexpression und Genomorganisation analysiert. In diesem Zusammenhang konnte gezeigt werden, dass E. coli in der Lage ist, seine metabolischen Netzwerke verschiedenen Wachstumsbedingungen anzupassen und individuelle bakterielle Kolonisierungsstrategien entwickeln kann. Transkriptom- und Proteom-Analysen zeigten verschiedene metabolische Strategien zur Nährstoffbeschaffung und Energieproduktion bei untersuchten in vivo-Reisolaten vom Stamm 83972, die es ihnen ermöglichen, den Wirt zu kolonisieren. Das Zurückgreifen auf D-Serin, Deoxy- und Ribonucleoside sowie die bidirektionale Umwandlung zwischen Pentose und Glucuronat waren hoch-regulierte Stoffwechselwege, die die in vivo-Reisolate mit zusätzlicher Energie für ein effizientes Wachstum in der Blase versorgen. Zudem wurden in dieser Studie die Netzwerke für eine Reaktion auf Abwehrmechanismen des Wirtes erforscht: Erstmals wurde hier die Rolle der Klasse-III-Alkoholdehydrogenase AdhC, bekannt durch ihre Bedeutung bei der Entgiftung von Stickstoffmonoxid, bei der Wirtsantwort während einer asymptomatischen Bakteriurie gezeigt. Aufeinanderfolgende in vivo- und in vitro-Reisolate vom Stamm 83972 wurden ebenfalls bezüglich ihrer Genomstruktur analysiert. Einige Veränderungen in der Genomstruktur der aufeinanderfolgenden Reisolate, die von einer humanen Kolonisierungsstudie stammen, implizieren die Bedeutung einer Interaktion der Bakterien mit dem Wirt bei der Mikroevolution der Bakterien. Dagegen war die Genomstruktur von Reisolaten eines langfristigen in vitro-Kultivierungsexperiments, bei dem sich der Stamm 83972 ohne Wirtskontakt vermehrt hat, nicht von Veränderungen betroffen. Das legt nahe, dass die Immunantwort eine Genomplastizität fördert und somit eine treibende Kraft für den ABU Lebensstil und die Evolution im Harnwegstrakt ist. KW - Escherichia coli KW - Evolution KW - Virulenz KW - Molekulargenetik KW - Asymptomatic Bacteriuria KW - Infection KW - UTI KW - UPEC Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-32879 ER - TY - JOUR A1 - Blank, Christine A1 - Fuchs, Harald A1 - Rappersberger, Klemens A1 - Röllinghoff, Martin A1 - Moll, Heidrun T1 - Parasitism of epidermal Langerhans cells in experimental cutaneous leishmaniasis with Leishmania major N2 - Murine epidermal Langerhans cells (LC) have been demonstrated to stimulate a vigorous T cell response to Leishmania major, a cause of human cutaneous leishmaniasis. It was therefore of interest to analyze whether LC can take up viable parasites. Epidermal cells were obtained from mouse ear skin for incubation with L. major and subsequent detection of intracellular parasites by cytochemistry. Freshly isolated LC, but not cultured LC, phagocytosed L. major and the uptake was inhibited by antibodies to the complement receptor type 3. Electron microscopic studies revealed the presence of viable amastigotes within Le. Moreover, with double-Iabeling techniques, L. major-containing LC could also be detected in infected skin. The results demonstrate that LC can internalize L. major. Since the number of organisms per infected LC remained consistently low, the prime task of LC may not be the promotion of parasite spreading but the presentation of L. major antigen to T cells and, thus, the regulation of the cellular immunity during cutaneous leishmaniasis. Y1 - 1993 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-45850 ER - TY - JOUR A1 - Pfeffer, K. A1 - Schoel, H. A1 - Gulle, H. A1 - Moll, Heidrun A1 - Kromer, S. A1 - Kaufmann, S. H. E. A1 - Wagner, H. T1 - Analysis of primary T cell responses to intact and fractionated microbial pathogens N2 - Freshly isolated human T lymphocytes were tested for their response to mycobacteria, mycobacteriallysates, 2 dimensional (2D) PAGE separated mycobacteriallysates, leishmania and defined leishmanial antigen preparations. While,o T cells proliferated vigourously in the presence of mycobacteria and mycobacteria derived lysates, a significant stimulation from 2 D gel separated lysates was not detected. In addition '10 T cells failed to respond towards leishmania or leishmanial components. In the ab T cell compartment some donors, presumably according to their state of immunity against mycobacteria, responded to mycobacteria, mycobacterial lysates and 2 D gel separated mycobacterial lysates. Neither freshly isolated '10 T cells nor ab T cells from naive donors did mount a significant immune response against leishmania. Y1 - 1991 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-46916 ER - TY - THES A1 - Peterson, Lisa T1 - CEACAM3-mediated phagocytosis of human-specific bacterial pathogens involves the adaptor molecule Nck N2 - Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecules (CEACAMs) are exploited by human-specific pathogens to anchor themselves to or invade host cells. Interestingly, human granulocytes express a specific isoform, CEACAM3, that can direct efficient, opsonin-independent phagocytosis of CEACAM-binding Neisseria, Moraxella and Haemophilus species. As opsonin-independent phagocytosis of CEACAM-binding Neisseria depends on Src-family protein tyrosine kinase (PTK) phosphorylation of the CEACAM3 cytoplasmic domain, we hypothesized that an SH2-containing protein might be involved in CEACAM3-initiated, phagocytosis-promoting signals. Accordingly, we screened glutathione-S-transferase (GST) fusion proteins containing SH2 domains derived from a panel of signaling and adapter molecules for their ability to associate with CEACAM3. In vitro pull-down assays demonstrated that the SH2 domain of the adapter molecule Nck (GST-Nck SH2), but not other SH2 domains such as the Grb2 SH2 domain, interact with CEACAM3 in a phosphotyrosine-dependent manner. Either deletion of the cytoplasmic tail of CEACAM3, or point-mutation of a critical arginine residue in the SH2 domain of Nck (GST-NckSH2R308K) that disrupts phosphotyrosine binding, both abolished CEACAM3-Nck-SH2 interaction. Upon infection of human cells with CEACAM-binding Neisseria, full-length Nck comprising an SH2 and three SH3 domains co-localized with tyrosine phosphorylated CEACAM3 and associated bacteria as analyzed by immunofluorescence staining and confocal microscopy. In addition, Nck could be detected in CEACAM3 immunoprecipitates confirming the interaction in vivo. Importantly, overexpression of a GFP-fusion protein of the isolated Nck SH2 domain (GFP-Nck-SH2), but not GFP or GFP-Nck SH2 R308K reduced CEACAM3-mediated phagocytosis of CEACAM-binding Neisseria suggesting that the adaptor molecule Nck plays an important role in CEACAM3-initiated signaling leading to internalization and elimination of human-specific pathogens. KW - Adaptorproteine KW - Signaltransduktion KW - Phagozytose KW - Neisseria gonorrhoeae KW - Carcino-embryonales Antigen KW - Angeborene Immunität KW - Src-Proteine KW - Nichtrezeptor-Tyrosinkinasen KW - CEACAM3 KW - Nck KW - ITAM KW - CEACAM3 KW - Nck KW - ITAM KW - gonococci KW - phagocytosis Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-46378 ER - TY - JOUR A1 - Hughes, Colin A1 - Müller, Dorothee A1 - Hacker, Jörg A1 - Goebel, Werner T1 - Genetics and pathogenic role of Escherichia coli hemolysin N2 - While clear evidence exists for the direct involvement of cytolysins in the pathogenesis of Gram-positive bacteria, the significance of Gram-negative haemolysins remains unclear. This paper presents briefly data indicating a role for haemolysin production in infections caused by Escherichia coli and also experiments which have allowed an analysis of the molecular basis of the haemolysis among pathogenic and non-pathogenic strains of this species. KW - Toxicity ; plasmids KW - gene-cloning Y1 - 1982 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-40082 ER - TY - THES A1 - Agarwal, Vaibhav T1 - Role of PspC interaction with human polymeric immunoglobulin receptor and Factor H in Streptococcus pneumoniae infections and host cell induced signalling N2 - Streptococcus pneumoniae ist ein Gram-positives Bakterium und ein Kommensale des humanen Nasenrachenraums. Pneumokokken sind andererseits auch die Verursacher schwerer lokaler Infektionen wie der Otitis media, Sinusitis und von lebensbedrohenden invasiven Erkrankungen. So sind Pneumokokken die wichtigsten Erreger einer ambulant erworbenen Pneumonie und sie sind häufige Verursacher von Septikämien und bakteriellen Meningitiden. Die initiale Phase der Pathogenese ist verbunden mit der Besiedelung der mukosalen Epithelzellen des Rachenraumes. Diese Kolonisierung erleichtert die Aufnahme der Bakterien in die Zelle bzw. deren Dissemination in submukosale Bereiche und den Blutstrom. Die Konversion des Kommensalen zu einem invasiven Mikroorganismus ist assoziiert mit der Anpassung des Krankheitserregers an die verschiedenen Wirtsnischen und wird auf der Wirtsseite durch die Zerstörung der transepithelialen Barriere begleitet. Die Anpassung des Erregers ist vermutlich ein in hohem Grade regulierter Prozess. Die Oberfläche von Streptococcus pneumoniae ist mit Proteinen bedeckt, die kovalent oder nicht kovalent mit der Zellwand verknüpft sind. Eine einzigartige Gruppe von Oberflächenproteinen in der Zellwand der Pneumokokken sind die cholinbindenden Proteine (CBPs). Für einige der CBPs konnte bereits die Bedeutung für die Virulenz gezeigt werden. PspC, auch als SpsA oder CbpA bezeichnet, ist ein multifunktionales Oberflächenprotein, das als Adhesin und Faktor H-Bindungsprotein eine wichtige Rolle in der Pathogenese der Pneumokokken hat. PspC vermittelt als Adhesin die Anheftung der Bakterien an die mukosalen Epithelzellen, indem es human-spezifisch an die sekretorische Komponente (SC) des polymeren Immunoglobulinrezeptors (pIgR) bindet. SC ist die Ektodomäne des pIgR und PspC kann ebenso die freie SC binden oder an die SC des sekretorischen IgA Moleküls binden. PspC interagiert auch mit dem löslichen Komplement Faktor H. Die SC und der Faktor erkennen zwei verschiedene Epitope im bakteriellen PspC Protein. Der genaue Mechanismus der jeweiligen Interaktionen unter physiologischen- bzw. wirtspezifischen Bedingungen ist noch nicht vollständig verstanden. In dieser Arbeit wurde die Auswirkung der PspC Interaktion mit dem humanen pIgR (hpIgR) bzw. dem Faktor H auf die Virulenz der Pneumokokken und die Wirtszellantwort, d.h. die induzierten Signalkaskaden in den eukaryotischen Zellen untersucht. Die molekulare Analyse und die Verwendung von spezifischen pharmakologischen Inhibitoren der Signalmoleküle zeigten, dass verschiedene Signalmoleküle an der PspC-pIgR vermittelten Internalisierung beteiligt sind. Die Aktivierung, d.h. die Phosphorylierung der Signalmoleküle wurde in Immunblots demonstriert. Die Studien zeigten, dass das Aktinzytoskelett und die Mikrotubuli für die bakterielle Aufnahme essentiell sind. Es konnte auch zum ersten Mal nachgewiesen werden, dass Cdc42 die entscheidende GTPase für die Invasion der Pneumokokken in die Wirtsepithelzellen, vermittelt über den PspC-hpIgR Mechanismus, ist. Der Einsatz von PI3-kinase und Akt Kinase Inhibitoren reduzierte signifikant die hpIgR-vermittelte Aufnahme der Pneumokokken in die Wirtszelle. Zusätzlich durchgeführte Infektionen von hpIgR exprimierenden Zellen zeigten eine zeitabhängige Phosphorylierung von Akt und der p85α Untereinheit der PI3-Kinase. Damit ist neben der GTPase Cdc42 der PI3K und Akt Signalweg entscheidend für die PspC-pIgR vermittelte Invasion der Pneumokokken. Des Weiteren sind an der Infektion mit Pneumokokken auch die Protein Tyrosin Kinasen Src, ERK1/2 und JNK beteiligt. Dabei wird die Src Kinase unabhängig von der PI3K in hpIgR exprimierenden Zellen aktiviert. Inhibitionsexperimente und genetische Knockdown Versuche mit siRNA bewiesen, dass die Endozytose der Pneumokokken über PspC-pIgR ein Clathrin und Dynamin abhängiger Mechanismus ist. Im weiterenn Teil der Arbeit wurde der Einfluss des PspC gebundenen Faktor H auf die Anheftung an und Invasion in die Epithelzellen analysiert. Die Bindung von Faktor H erfolgte unabhängig vom PspC-Subtyp. Die Bindungsversuche bewiesen, dass die Kapselmenge negativ korreliert mit der Bindung des Faktor H. Der Einsatz von Faktor H aus Maus oder Ratte zeigte keine typische Bindung. Daraus kann abgeleitet werden, dass diese Interaktion humanspezifisch ist. Die Infektionsexperimente demonstrierten, dass Faktor H die Adhärenz und die Invasion der Bakterien in die Nasenrachenraumzellen (Detroit562), alveolären Lungenepithelzellen (A549) und humanen Hirnendothelzellen (HBMEC) steigert. Der Faktor H hat Heparin Bindestellen. Diese Bindestellen vermitteln die Adhärenz der Faktor H gebundenen Pneumokokken mit Epithelzellen. Inhibitionsstudien mit spezifischen monoklonalen Antikörpern, die gegen die short consensus repeats (SCRs) von Faktor H gerichtet waren, konnten die essentielle Bedeutung der SCR19-20 für die Anheftung der Pneumokokken über Faktor H an die Wirtszellen nachweisen. Die Faktor H vermittelte Assoziation der Pneumokokken an polymorphonukleäre Leukozyten (PMNs) erfolgt über das Integrin CD11b/CD18. Die weiteren Inhibitionsstudien zeigten dann auch zum ersten Mal den Einfluss des Aktinzytoskeletts der Wirtszelle auf die Faktor H-vermittelten bakterieller Internalisierung und den dabei bedeutsamen Signaltransduktionswegen in der eukaryotischen Zelle. Dabei wurden insbesondere die Proteintyrosinkinasen und die PI3K als wichtige Signalmoleküle für die Faktor H vermittelte Invasion der Pneumokokken identifiziert. Die in dieser Arbeit erhaltenen Resultate belegen, dass die Faktor H vermittelte Infektion der Zellen mit S. pneumoniae ein konzertierter Mechanismus ist, bei dem Oberflächen-Glycosaminoglycane, Integrine und Signaltransduktionswege der Wirtsepithelzellen involviert sind. Des Weiteren wurde aufgezeigt, dass die PspC-pIgR-vermittelte Invasion in mukosale Epithelzellen unterschiedliche Signalwege wie z.B. den PI3K und Akt Weg induziert und abhängig von Cdc42 und einer Clathrin vermittelten Endozytosemechanismus ist. N2 - Streptococcus pneumoniae (pneumococci) are Gram-positive bacteria and commensals of the nasopharyngeal cavity. Besides colonization, pneumococci are responsible for severe local infections such as otitis media, sinusitis and life-threatening invasive diseases, including pneumonia, sepsis and meningitis. The surface of pneumococci is decorated with proteins that are covalently or non-covalently anchored to the cell wall. The most unique group of cell wall associated proteins in pneumococci are the choline-binding proteins (CBPs). PspC, also known as SpsA or CbpA, is a multifunctional choline-binding protein that plays an essential role in pneumococcal pathogenesis by functioning as an adhesin. PspC promotes adherence of pneumococci to mucosal epithelial cells by interacting in a human specific manner with the free secretory component (SC) or to SC as part of the secretory IgA (SIgA) or polymeric immunoglobulin receptor (pIgR). PspC also interacts specifically with the soluble complement Factor H. Apparently, PspC uses two different epitopes for binding the soluble host protein Factor H and SC of pIgR. However, the mechanism by which these independent interactions facilitate pneumococcal infections under physiological and host specific conditions have not yet been completely elucidated. This study aims to explore the impact of the PspC interaction with human pIgR (hpIgR) or complement regulator Factor H on pneumococcal virulence. Here the cellular and molecular basis of PspC-mediated adherence to and invasion of host epithelial and endothelial cells was demonstrated. The genetic approach, specific pharmacological inhibitors and immunoblot analysis demonstrated the complexity of the induced signal transduction pathways during PspC-hpIgR mediated pneumococcal uptake by host cells. Inhibition studies with specific inhibitors of actin cytoskeleton and microtubules demonstrated that the dynamics of host cell cytoskeleton are essential for pneumococcal uptake by mucosal epithelial cells. Moreover, this study reports for the first time that the small GTPase Cdc42 is essential for pneumococcal internalization into epithelial cells via the PspC-hpIgR mechanism. In addition, in infection experiments performed in presence of specific inhibitors of PI3-kinase/Akt and protein tyrosine kinase (PTKs), hpIgR-mediated pneumococcal uptake by host cells was significantly blocked. Amongst PTKs the Src kinase pathway, ERK1/2 and JNK pathways were implicated during pneumococcal ingestion by hpIgR expressing cells. In addition, inhibition experiments performed in the presence of individual inhibitors or with a combination of inhibitors suggested the independent activation of PI3-kinase/Akt and Src kinase pathways during pneumococcal infections of hpIgR expressing cells. By employing specific inhibitors and siRNA in cell culture infection experiments it was further demonstrated that pneumococcal endocytosis by host epithelial cells via the PspC-hpIgR mechanism depends on clathrin and dynamin. PspC recruits also Factor H to the pneumococcal cell surface. Consequently, the impact of pneumococcal cell surface bound Factor H on adherence to host cells and the molecular mechanism facilitating the uptake of Factor H bound pneumococci by epithelial cells was investigated. Flow cytometry and immunoblots revealed that S. pneumoniae has evolved the ability to recruit both purified Factor H as well as Factor H from human plasma or serum. Moreover, it was demonstrated that the recruitment of Factor H is independent of the PspC-subtypes and that capsular polysaccharide (CPS) interferes with its recruitment. Factor H bound to pneumococci significantly increased bacterial attachment to and invasion of host epithelial cells including nasopharyngeal cells (Detroit562), lung epithelial cells (A549), and human brain-derived endothelial cells (HBMEC). Blocking experiments demonstrated that bacteria bound Factor H interacts via the heparin binding sites on Factor H with eukaryotic cell surface glycosaminoglycans and that this interaction promotes pneumococcal adherence to host cells. In addition, inhibition studies with mAbs recognizing specifically different short consensus repeats (SCR) of Factor H suggested that SCR 19-20 of Factor H are essential for the pneumococcal interaction with host epithelial cells via Factor H. In the presence of Factor H, attachment of pneumococci to human polymorphonuclear leukocytes (PMNs) is enhanced. The integrin CD11b/CD18 was identified as the cellular receptor on PMNs. By using pharmacological inhibitors the impact of host cell cytoskeleton and signalling molecules, such as PTKs and PI3-kinase, for Factor H-mediated pneumococcal internalization into eukaryotic cells was shown. Taken together, the results revealed that Factor-H mediated pneumococcal infection requires a concerted role of host epithelial cell surface glycosaminoglycans, integrins and host cell signalling pathways. KW - Streptococcus pneumoniae KW - Polymeric Immunoglobulin receptor KW - Factor H Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-36526 ER - TY - JOUR A1 - Kunin, Calvin M. A1 - Hua, Tong Hua A1 - Van Arsdale-White, Laura A1 - Krishnan, Chandradekar A1 - Hacker, Jörg T1 - Isolation of a nicotinamide-requiring clone of Escherichia coli O18:K1:H7 from women with acute cystitis resembles strains found in neonatal meningitis N2 - During a study of the nutritional requirements of clinical isolates of Escherichia coli, we found that 21 (7.0%) of 301 strains required nicotinamide to grow in minimal medium. The nicotinamide- requiring strains were present in 16 (15.8%) of 101 cultures of urine from young women with acute cystitis, in 5 (5.0%) of 100 stool specimens from healthy adults, and in none of 100 blood samples from adult patients with bacteremia. Most of the strains belonged to serogroup OI8:KI:H7, were hemolytic, possessed type I fimbriae, and exhibited similar patterns of antibiotic susceptibility. Two of the urinary isolates expressed S fimbriae, and all 16 urinary isolates contained the s/aS homologue gene on their chromosomes. One of the stool isolates contained the s/aS gene. The urinary isolates closely resembled a large clone of E. coli that is reportedly associated with neonatal meningitis and sepsis. It may be possible to detect this and related clones by their requirement for nicotinamide and to screen strains for S fimbriae by relatively inexpensive hemagglutination methods, including the use of avian PI antigens to detect mannose- resistant, non-P-fimbriated E. coli; the agglutination of bovine erythrocytes; and the use of bovine mucin to detect sialyl galactosides in S fimbriae. Y1 - 1993 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-40406 ER - TY - JOUR A1 - Lück, P. Christian A1 - Bender, Larisa A1 - Ott, Manfred A1 - Helbig, Jürgen H. A1 - Hacker, Jörg T1 - Analysis of Legionella pneumophila serogroup 6 strains isolated from a hospital warm water supply over a three-year period by using genomic long-range mapping techniques and monoclonal antibodies N2 - Over a period of 3 years, Legionella pneumophila serogroup 6 strains were isolated from warm water outlets and dental units in the Dental Faculty and from the Surgery and Internal Medicine Clinics at the University of Dresden, Dresden, Germany. In the bacteriological unit of the above-mentioned facility, L. pneumophila serogroups 3 and 12 were grown frl,)m warm water specimens. The medical facilities are located in separate buildings connected with a ring pipe warm water system. All L. pneumophila serogroup 6 strains isolated from the warm water supply reacted with a serogroup-specific monoclonal antibody, but not with two other monoclonal antibodies which are subgroup specific, reacting with other serogroup 6 strains. The NolI genomic profiles obtained by pulsed-field gel electrophoresis of 25 serogroup 6 strains isolated from the Dental Faculty over a 3-year period, 1 isolate from the Internal Medicine Clinic, and 4 strains from the Surgery Clinic were identical. Furthermore, all these strains hybridized with a 3OO-kb NolI fragment when a legiolysin (lIy)-specific DNA probe was used. The NolI pattern, however, differed from those of six serogroup 6 strains of other origins, one serogroup 12 strain from the bacteriological unit, and another six unrelated strains of serogroups other than serogroup 6. L. pneumophila serogroup 6 strains which can be divided into only two subgroups by the use of monoclonal antibodies are differentiated in at least six Noli cleavage types obtained by pulsed-field electrophoresis. Y1 - 1991 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-40392 ER - TY - JOUR A1 - Van Die, I. A1 - Kramer, C. A1 - Hacker, Jörg A1 - Bergmans, H. A1 - Jongen, W. A1 - Hoekstra, W. T1 - Nucleotide sequence of the genes coding for minor fimbrial subunits of the F1C fimbriae of Escherichia coli N2 - F 1 C fimbriae allow uropathogenic Escherichia coli to adhere to specific epithelial surfaces. This adhesive property is probably due to the presence of minor fimbrial components in F1C fimbriae. The foe gene cluster encoding F1C fimbriae has been cloned, as described previously. Here we present the nucleotide sequence (2081 bp) coding for the F 1 C minor fimbria I subunits. The structural genes code for polypeptides of 175 (FocF), 166 (FocG), and 300 (FocH) amino acids. The deduced amino acids of the F 1 C minor subunits were compared with the reported sequences of the minor subunits of other types of fimbriae. The data show that the Foc minor subunits are highly homologous to the corresponding Sfa proteins, whereas homology to the minor subunits of type 1 and P fimbriae is much lower. KW - Pilus KW - Escherichia coli KW - Adherence KW - Urinary tract KW - Foc protein KW - Minor subunits KW - Sequencing KW - Homology Y1 - 1991 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-40353 ER - TY - CHAP A1 - Moch, Thomas A1 - Hoschützky, Heinz A1 - Hacker, Jörg A1 - Krönke, Klaus-D. A1 - Jann, Klaus T1 - Isolation and characterization of the \(\alpha\)-Sialyl-\(\beta\) 2-3-Galactosyl (S)-Specific Adhesin fimbriated Escherichia coli N2 - The \(\alpha\)-Sialyl-\(\beta\) 2-3-Galactosyl-specific adhesin (S adhesin) was isolated from cells of a recombinant Escherichia coli K-12 strain expressing the S-flmbrial adhesin complex. A crude cell extract was partiaUy dissociated into fimbriae and an adhesin-enriched fraction by heating to 7O°C. From the latter, adhesin was purified to apparent homogeneity (by fast protein liquid chromatography, immunoblot, and NaDodSO\(_4\)/PAGE) by differential ammonium sulfate precipitation, dissociation in 8 M guanidine hydrochloride, and high-resolution anion-exchange chromatography in 8 M urea. The purified adhesin formed an aggregate of M\(_r\)\(\approx\)10\(^6\) that was made up of one type of 12-kDa polypeptide (fimbrillin is 16.5 kDa). It had pI value of 4.7 (fimbriae has a pI value of 6). Adhesin and fimbrillin had different amino add compositions. The purified adhesins agglutinated human and bovine erythrocytes with the same speclfkity as the whole bacteria; purified fimbriae were not adhesive. Monoclonal anti-adhesin and anti-fimbriae antibodies were obtained. Monoclonal antiadhesin, but none of the anti-fimbriae, antibodies inhibited the agglutination of erythrocytes. The anti-adhesive antibodies were used in immuno-gold electron microscopy to localize adhesin exclusively on the fimbriae, with a possible preference to their tips. Y1 - 1987 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-40330 ER - TY - JOUR A1 - Chakraborty, Trinad A1 - Kathariou, Sophia A1 - Hacker, Jörg A1 - Hof, Herbert A1 - Huhle, Burkhard A1 - Wagner, Wilma A1 - Kuhn, Michael A1 - Goebel, Werner T1 - Molecular analysis of bacterial cytolysins N2 - Results of molecular and pathogenic studies of three different bacterial hemolysins (cytolysins) are presented. These exoproteins derive from the two gram-negative bacteria Escherichia coli and Aeromonas hydrophila and from the gram-positive pathogen Listeria monocytogenes. The hemolysin of E. coli is determined by an 8-kilobase (kb) region that includes four clustered genes (hlyC, hlyA, hlyB, and hlyD). This hemolysin determinant is part either of large transmissible plasmids or of the chromosome. The genes located chromosomally are found predominantly in E. coli strains that can cause pyelonephritis and/or other extraintestinal infections. A detailed analysis of the chromosomal hly determinants of one nephropathogenic E. coli strain revealed the existence of specific, large chromosomal insertions 75 kb and lOO kb in size that carry the hly genes but that also influence the expression of other virulence properties, i.e., adhesion and serum resistance. The direct involvement of E. coli hemolysin in virulence could be demonstrated in several model systems. The genetic determinants for hemolysin (cytolysin) formation in , A. hydrophila (aerolysin) and L. monocytogenes (listeriolysin) are less complex. Both cytolysins seem to be encoded by single genes, although two loci (aerB and aerC) that affect the expression and activity of aerolysin have been identified distal and proximal to the structural gene for aerolysin (aerA). Cytolysin-negative mutants of both bacteria were obtained by site-specific deletion and/or transposon mutagenesis. These mutants show a drastic reduction in the virulence of the respective bacteria. Y1 - 1987 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-40328 ER - TY - JOUR A1 - Hof, H. A1 - Christen, A. A1 - Hacker, Jörg T1 - Comparative therapeutic activities of Ciprofloxacin, Amoxicillin, Ceftriaxone and Cotrimoxazole in a new model of experimental infection with Escherichia coli N2 - A new mouse model for systemic infection with Escherichia coli is presented. Whereas in other models 107_108 bacteria have to be injected into an animal to induce toxic effects resulting in death within 24 hours, now, only 103_104 bacteria of an appropriate strain are required to produce a genuine infection characterized by an increase in the bacterial load over several days. The quantitative determination of bacterial counts per liver allows a more sensitive measurement than recording death rates. Furthermore, few animals are required for a definite result in contrast to the LDso determination of other models. The salient point regarding this new model is that conditioning of animals has to be achieved by incorporating the inoculum into agar which is injected subcutaneously. The resulting infection is completely dependent on the E. colicondistrain used. Whereas a hemolytic, uropathogenic strain is so virulent that an overwhelming infection develops within 48 hours after the injection of 103 bacterial cells, a non-hemolytic variant of this strain is completely avirulent, being unable to multiply in spite of the potentiating agar. The hemolytic E. coli strain ATCC 25922 is intermediate in virulence. The bacterial counts per liver increase steadily until death occurs five to seven days after the injection of 104 bacteria. This bacterial infection can be therapeutically influenced by daily treatment with various drugs. Ciprofloxacin, ceftriaxone and co-trimoxazole are able to cure the infection, whereas amoxicillin given orally is only moderately active against this ATCC strain, which is relatively resistant to amoxicillin. N2 - Vergleichende therapeutische Aktivitiiten von Ciprof/oxacin, Amoxicillin, Ceftriaxon und Co-trimoxazol in einem neuen Versuchsmodell fur die experimentelle Infektion mit Escherichia coli. Ein neues Mausmodell fur eine systemische Infektion mit Escherichia coli wird vorgestellt. In anderen Infektionsmodellen mussen 107_108 E. coli pro Maus injiziert werden, was zu einer Intoxikation fUhrt, so daB die Tiere innerhalb von 24 Stunden sterben. In diesem neuen Modell wird eine echte Infektion mit nur 103-104 Bakterien gesetzt, und es folgt dann uber mehrere Tage hinweg eine deutliche Vermehrung der Erreger. Diese kann exakt quantitativ durch die Bestimmung der Keimzahlen in der Leber kontrolliert werden, was eine viel empfindlichere Methode darstellt als die Feststellung von Mortalitatsraten. Weiterhin werden dabei weitaus weniger Mause benotigt, urn eine stichhaltige Aussage zu machen, als fUr eine Bestimmung der LDso erforderlich sind. Der entscheidende Punkt dieses neuen Modells ist, daB die Infektion mit den niedrigen Keimzahlen gebahnt werden muB. Diesgeschieht dadurch, daB das Inokulum in verflussigtem Agar suspendiert wird, bevor es subkutan injiziert wird. Der Infektionsverlauf ist wesentlich abhiingig von der Natur des verwendeten E. coli-Stammes. Wahrend z. B. ein hamolytischer, uropathogener Stamm so virulent ist, daB die Tiere einer fulminanten Infektion nach Injektion von nur 103 Keimen erliegen, ist eine nicht-hamolytische Mutante dieses Stammes vollig avirulent und kann sich selbst trotz der Beigabe von Agar nicht vermehren. Der hamolytische Stamm E. coli A TCC 25922 ist bezuglich seiner Virulenz intermediar, d. h. nach Injektion von 104 Bakterien nimmt die Keimzahl pro Leber standig zu und die Tiere sterben nach funf bis sieben Tagen an dieser Infektion. Gerade dieser Infektionsverlauf kann durch tagliche Verabreichung von Chemotherapeutika beeinfluBt weT-den. Ciprofloxacin, Ceftriaxon und Co-trimoxazol sind in der Lage, eine Ausheilung zu erzielen. Amoxicillin hat nach oraler Gabe nur eine maBige Wirkung aut die Infektion mit diesem ATCC-Stamm, der auch gegen Amoxicillin relativ resistent ist. Y1 - 1986 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-40313 ER - TY - JOUR A1 - Hacker, Jörg A1 - Hof, H. A1 - Hughes, C. A1 - Goebel, W. T1 - Salmonella typhimurium strains carrying hemolysin plasmids and cloned hemolysin. genes from Escherichia coli N2 - Like all other Salmonella typhimurium strains examined, the smooth variants SF1397 (L T2) and 1366 and also their semi-rough and rough derivatives are non-haemolytic. Nevertheless, two haemolysin (Hly) plasmids of E. coli belonging to the inc groups incFllI,lv (pSU316) and incIz (pHly152) were able to be introduced into these strains by conjugation and stably maintained. A considerable percentage of the Hly+ transconjugants obtained had lost parts of their O-side chains, a result of selection for the better recipient capability of « semi-rough» variants rather than the direct influence of the Hly+ plasmids themselves. In contrast to the incF1lI1V plasmid pSU316, which exhibited higher conjugation rates with rough recipients, the incIz plasmid pHly152 was accepted best by smooth strains. Transformation with cloned E. coli haemolysin (hly) determinant was inefficient ( <10-8) for smooth strains, but 102-103 times higher for rough recipients, and was increased by the use of Salmonella-modified DNA. The transform ants and transconjugants were relatively stable and showed the same haemolytic activity as the E. coli donor strains. The virulence of the Hly+ smooth, semi-rough and rough S. typhimurium strains was tested in two mouse models, and neither the mortality rate nor the ability to multiply within the mouse spleen was influenced by the hly determinants. KW - Salmonella typhimurium KW - Plasmid KW - Haemolysin KW - Escherichia coli KW - Virulence Y1 - 1985 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-40309 ER - TY - JOUR A1 - König, W A1 - Scheffer, J. A1 - Bremm, K. D. A1 - Hacker, Jörg A1 - Goebel, W. T1 - The role of bacterial adherence and toxin production from E. coli on leukotriene generation from human polymorphonuclear granulocytes N2 - No abstract available Y1 - 1985 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-40295 ER - TY - JOUR A1 - Knapp, Stefan A1 - Hacker, Jörg A1 - Then, Irene A1 - Müller, Dorothee A1 - Goebel, Werner T1 - Multiple copies of hemolysin genes and associated sequences in the chromosome of uropathogenic Escherichia coli strains N2 - The 06 serogroup Escherichia coli strain 536 carries two hemolysin (hly) determinants integrated into the chromosome. The two hly determinants are not completely identical, either functionally or structurally, as demonstrated by spontaneous deletion mutants carrying only one of them and by cloning each of the two determinants separately into cosmid vectors. Each hly determinant is independently deleted at a frequency of 10-4 , leading to variants which exhibit similar levels of internal hemolysin but different amounts of secreted hemolysin. The two hly determinants were also identified in the 04 E. coli strain 519. The three E. coli strains 251, 764, and 768, which belong to the serogroup 018, and the 04 strain 367 harbor a single chromosomal hly determinant, as demonstrated by hybridization with hly-gene-specific probes. However, a hybridization probe derived from a sequence adjacent to the hlyC-proximal end of the plasmid pHlyl52-encoded hly determinant hybridizes with several additional chromosomal bands in hemolytic 018 and 06 E. coli strains and even in E. coli K-12. The size ofthe probe causing the multiple hybridization suggests a 1,500- to 1,800-base pair sequence directly flanking hlyC. Spontaneous hemolysin-negative mutants were isolated from strains 764 and 768, which had lost the entire hly determinant but retained all copies of the hlyC-associated sequence. This sequence is not identical to a previously identified (J. Hacker, S. Knapp, and W. Goebel, J. Bacteriol. 154:1145-1154, 1983) somewhat smaller (about 850 base pairs) sequence flanking the other (hlyBb-proximal) end of the plasmid pHlyl52-encoded hly determinant which, as shown here, exists also in multiple copies in these hemolytic E. coli strains and in at least two copies in E. coli K-12. In contrast to the plasmid-encoded hly determinant which is directly flanked at both ends by these two diJJerent sequences, the chromosomal hly determinants are not immediately flanked by such sequences. Y1 - 1984 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-40278 ER - TY - JOUR A1 - Hacker, Jörg A1 - Knapp, S. A1 - Goebel, W. T1 - Spontaneous deletions and flanking regions of the chromosomal inherited hemolysin determinant of an Escherichia coli 06 strain N2 - The hemolytic Escherichia coli strain 536 (06) propagates spontaneous hemolysin- negative mutants at relatively high rates (10-3 to 10-4 ). One type of mutant (type I) lacks both secreted (external) and periplasmic (internal) hemolysin activity (HlYex - IHlYin -) and in addition shows no mannose-resistant hemagglutination (Mrh -), whereas the other type (type II) is HlYex -IHIYin + and Mrh +. The genetic determinants for hemolysin production (hly) and for mannose-resistant hemagglutination (mrh) of this strain are located on the chromosome. Hybridization experiments with DNA probes specific for various parts of the hly determinant reveal that mutants of type I have lost the total hly determinant, whereas those of type 11 lack only part of the hlyB that is essential for transport of hemolysin across the outer membrane. Using a probe that contains the end sequence of the plasmid pHly152-encoded hly determinant (adjacent to hlyB), we determined that a related sequence flanks also the hlyB-distal end of the chromosomal hly determinant of E. coli 536. In addition several other similar or even identical sequences are found in the vicinity of the hlyC- and the hlyB-distal ends of both the chromosomal and the plasmid hly determinants. Y1 - 1983 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-40260 ER - TY - JOUR A1 - Berger, Harald A1 - Hacker, Jörg A1 - Juarez, Antonio A1 - Hughes, Colin A1 - Goebel, Werner T1 - Cloning of the chromosomal determinants encoding hemolysin production and mannose-resistant hemagglutination in Escherichia coli N2 - We have cloned the chromosomal hemolysin determinants from Escherichia coli strains belonging to the four O-serotypes 04, 06, 018, and 075, The hemolysin-producing clones were isolated from gene banks of these strains which were constructed by inserting partial Sau3A fragments of chromosomal DNA into the cosmid pJC74. The hemolytic cosmid clones were relatively stable. The inserts were further sub cloned either as Sail fragments in pACYC184 or as BamHI-SaLI fragments in a recombinant plasmid (pANN202) containing cistron C (hlye) of the plasmid-encoded hemolysin determinant. Detailed restriction maps of each of these determinants were constructed, and it was found that, despite sharing overall homology, the determinants exhibited minor specific differences in their structure, These appeared to be restricted to cistron A (hlyA), which is the structural gene for hemolysin. In the gene banks of two of these hemolytic strains, we could also identify clones which carried the genetic determinants for the mannose-resistant hemagglutination antigens Vb and VIc. Both of these fimbrial antigens were expressed in the E. coli K-12 clones to an extent similar to that observed in the wild-type strains. These recombinant cosmids were rather unstable, and, in the absence of selection, segregated at a high frequency. Y1 - 1982 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-40255 ER - TY - JOUR A1 - Hof, H. A1 - Emmerling, P. A1 - Hacker, Jörg A1 - Hughes, C. T1 - The role of macrophages in primary and secondary infection of mice with Salmonella typhimurium N2 - Elimination of macrophages with high-molecular dextran sulphate (OS) markedly impairs resistance of mice to primary infection with smooth, virulent strains of Salmonella typhimurium, whereas stimulation of this system by killed Bordetella pertussis organisms increases resistance. In infection with rough, avirulent strains of S. iyphimurium the elimination of macro phages was not followed by an essential loss of resistance, and it appears that other non-specific defence mechanisms, for example the complement system, may have compensated for the lack of macrophages. Macrophages, therefore, play an important role in defence during primary infection with virulent strains. In immunity to challenge infection with S. typhimurium, macrophages play an even more significant role. Treatment with OS completely removes immunity, and both humoral and cell-mediated immune mechanisms seem to require the participation of macrophages. KW - Macrophage KW - Salmonella typhimurium KW - Dextran sulphate KW - Mouse KW - 0 antigen KW - Bordeiella pertussis Y1 - 1982 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-40248 ER - TY - THES A1 - Friedrich, Torben T1 - New statistical Methods of Genome-Scale Data Analysis in Life Science - Applications to enterobacterial Diagnostics, Meta-Analysis of Arabidopsis thaliana Gene Expression and functional Sequence Annotation T1 - Neue statistische Methoden für genomweite Datenanalysen in den Biowissenschaften - Anwendungen in der Enterobakteriendiagnostik, Meta-Analyse von Arabidopsis thaliana Genexpression und funktionsbezogenen Sequenzannotation N2 - Recent progresses and developments in molecular biology provide a wealth of new but insufficiently characterised data. This fund comprises amongst others biological data of genomic DNA, protein sequences, 3-dimensional protein structures as well as profiles of gene expression. In the present work, this information is used to develop new methods for the characterisation and classification of organisms and whole groups of organisms as well as to enhance the automated gain and transfer of information. The first two presented approaches (chapters 4 und 5) focus on the medically and scientifically important enterobacteria. Its impact in medicine and molecular biology is founded in versatile mechanisms of infection, their fundamental function as a commensal inhabitant of the intestinal tract and their use as model organisms as they are easy to cultivate. Despite many studies on single pathogroups with clinical distinguishable pathologies, the genotypic factors that contribute to their diversity are still partially unknown. The comprehensive genome comparison described in Chapter 4 was conducted with numerous enterobacterial strains, which cover nearly the whole range of clinically relevant diversity. The genome comparison constitutes the basis of a characterisation of the enterobacterial gene pool, of a reconstruction of evolutionary processes and of comprehensive analysis of specific protein families in enterobacterial subgroups. Correspondence analysis, which is applied for the first time in this context, yields qualitative statements to bacterial subgroups and the respective, exclusively present protein families. Specific protein families were identified for the three major subgroups of enterobacteria namely the genera Yersinia and Salmonella as well as to the group of Shigella and E. coli by applying statistical tests. In conclusion, the genome comparison-based methods provide new starting points to infer specific genotypic traits of bacterial groups from the transfer of functional annotation. Due to the high medical importance of enterobacterial isolates their classification according to pathogenicity has been in focus of many studies. The microarray technology offers a fast, reproducible and standardisable means of bacterial typing and has been proved in bacterial diagnostics, risk assessment and surveillance. The design of the diagnostic microarray of enterobacteria described in chapter 5 is based on the availability of numerous enterobacterial genome sequences. A novel probe selection strategy based on the highly efficient algorithm of string search, which considers both coding and non-coding regions of genomic DNA, enhances pathogroup detection. This principle reduces the risk of incorrect typing due to restrictions to virulence-associated capture probes. Additional capture probes extend the spectrum of applications of the microarray to simultaneous diagnostic or surveillance of antimicrobial resistance. Comprehensive test hybridisations largely confirm the reliability of the selected capture probes and its ability to robustly classify enterobacterial strains according to pathogenicity. Moreover, the tests constitute the basis of the training of a regression model for the classification of pathogroups and hybridised amounts of DNA. The regression model features a continuous learning capacity leading to an enhancement of the prediction accuracy in the process of its application. A fraction of the capture probes represents intergenic DNA and hence confirms the relevance of the underlying strategy. Interestingly, a large part of the capture probes represents poorly annotated genes suggesting the existence of yet unconsidered factors with importance to the formation of respective virulence phenotypes. Another major field of microarray applications is gene expression analysis. The size of gene expression databases rapidly increased in recent years. Although they provide a wealth of expression data, it remains challenging to integrate results from different studies. In chapter 6 the methodology of an unsupervised meta-analysis of genome-wide A. thaliana gene expression data sets is presented, which yields novel insights in function and regulation of genes. The application of kernel-based principal component analysis in combination with hierarchical clustering identified three major groups of contrasts each sharing overlapping expression profiles. Genes associated with two groups are known to play important roles in Indol-3 acetic acid (IAA) mediated plant growth and development as well as in pathogen defence. Yet uncharacterised serine-threonine kinases could be assigned to novel functions in pathogen defence by meta-analysis. In general, hidden interrelation between genes regulated under different conditions could be unravelled by the described approach. HMMs are applied to the functional characterisation of proteins or the detection of genes in genome sequences. Although HMMs are technically mature and widely applied in computational biology, I demonstrate the methodical optimisation with respect to the modelling accuracy on biological data with various distributions of sequence lengths. The subunits of these models, the states, are associated with a certain holding time being the link to length distributions of represented sequences. An adaptation of simple HMM topologies to bell-shaped length distributions described in chapter 7 was achieved by serial chain-linking of single states, while residing in the class of conventional HMMs. The impact of an optimisation of HMM topologies was underlined by performance evaluations with differently adjusted HMM topologies. In summary, a general methodology was introduced to improve the modelling behaviour of HMMs by topological optimisation with maximum likelihood and a fast and easily implementable moment estimator. Chapter 8 describes the application of HMMs to the prediction of interaction sites in protein domains. As previously demonstrated, these sites are not trivial to predict because of varying degree in conservation of their location and type within the domain family. The prediction of interaction sites in protein domains is achieved by a newly defined HMM topology, which incorporates both sequence and structure information. Posterior decoding is applied to the prediction of interaction sites providing additional information of the probability of an interaction for all sequence positions. The implementation of interaction profile HMMs (ipHMMs) is based on the well established profile HMMs and inherits its known efficiency and sensitivity. The large-scale prediction of interaction sites by ipHMMs explained protein dysfunctions caused by mutations that are associated to inheritable diseases like different types of cancer or muscular dystrophy. As already demonstrated by profile HMMs, the ipHMMs are suitable for large-scale applications. Overall, the HMM-based method enhances the prediction quality of interaction sites and improves the understanding of the molecular background of inheritable diseases. With respect to current and future requirements I provide large-scale solutions for the characterisation of biological data in this work. All described methods feature a highly portable character, which allows for the transfer to related topics or organisms, respectively. Special emphasis was put on the knowledge transfer facilitated by a steadily increasing wealth of biological information. The applied and developed statistical methods largely provide learning capacities and hence benefit from the gain of knowledge resulting in increased prediction accuracies and reliability. N2 - Die aktuellen Fortschritte und Entwicklungen in der Molekularbiologie stellen eine Fülle neuer, bisher kaum analysierter Daten bereit. Dieser Fundus umfasst unter Anderem biologische Daten zu genomischer DNA, zu Proteinsequenzen, zu dreidimensionalen Proteinstrukturen sowie zu Genexpressionsprofilen. In der vorliegenden Arbeit werden diese Informationen genutzt, um neue Methoden der Charakterisierung und Klassifizierung von Organismen bzw. Organismengruppen zu entwickeln und einen automatisierten Informationsgewinn sowie eine Informationsübertragung zu ermöglichen. Die ersten beiden vorgestellten Ansätze (Kapitel 4 und 5) konzentrieren sich auf die medizinisch und wissenschaftlich bedeutsame Gruppe der Enterobakterien. Deren Bedeutung für Medizin und Mikrobiologie geht auf ihre Funktion als kommensale Bewohner des Darmtraktes, ihre Nutzung als leicht kultivierbare Modellorganismen und auf die vielseitigen Infektionsmechanismen zurück. Obwohl bereits viele Studien über einzelne Pathogruppen mit klinisch unterscheidbaren Symptomen existieren, sind die genotypischen Faktoren, die für diese Unterschiedlichkeit verantwortlich zeichnen, teilweise noch nicht bekannt. Der in Kapitel 4 beschriebene umfassende Genomvergleich wurde anhand einer Vielzahl von Enterobakterien durchgeführt, die nahezu die gesamte Bandbreite klinisch relevanter Diversität darstellen. Dieser Genomvergleich bildet die Basis für eine Charakterisierung des enterobakteriellen Genpools, für eine Rekonstruktion evolutionärer Prozesse und Einflüsse und für eine umfassende Untersuchung spezifischer Proteinfamilien in enterobakteriellen Untergruppen. Die in diesem Kontext vorher noch nicht angewandte Korrespondenzanalyse liefert qualitative Aussagen zu bakteriellen Untergruppen und den ausschließlich in ihnen vorkommenden Proteinfamilien. In drei Hauptuntergruppen der Enterobakterien, die den Gattungen Yersinia und Salmonella sowie der Gruppe aus Shigella und E. coli entsprechen, wurden die jeweils spezifischen Proteinfamilien mit Hilfe statistischer Tests identifiziert. Zusammenfassend bilden die auf Genomvergleichen aufbauenden Methoden neue Ansatzpunkte, um aus der Übertragung der bekannten Funktionalität einzelner Proteine auf spezifische, genotypische Besonderheiten bakterieller Gruppen zu schließen. Aufgrund ihrer hohen medizinischen Relevanz war die Typisierung enterobakterieller Isolate entsprechend ihrer Pathogenität Ziel zahlreicher Studien. Die Microarray-Technologie bietet ein schnelles, reproduzierbares und standardisierbares Hilfsmittel für bakterielle Typisierung und hat sich in der Bakteriendiagnostik, Risikobewertung und Überwachung bewährt. Das in Kapitel 5 beschriebene Design eines diagnostischen Microarray beruht auf einer großen Anzahl verfügbarer Genomsequenzen von Enterobakterien. Ein hocheffizienter String-Matching-Algorithmus ist die Grundlage einer neuartigen Strategie der Sondenauswahl, die sowohl kodierende als auch nicht-kodierende Bereiche genomischer DNA berücksichtigt. Im Vergleich zu Diagnostika, die ausschließlich auf Virulenz-assoziierten Sonden beruhen, verringert dieses Prinzip das Risiko einer inkorrekten Typisierung. Zusätzliche Sonden erweitern das Anwendungsspektrum auf eine simultane Diagnostik der Antibiotikaresistenz bzw. eine Überwachung der Resistenzausbreitung. Umfangreiche Testhybridisierungen belegen eine überwiegende Zuverlässigkeit der Sonden und vor allem eine robuste Klassifizierung enterobakterieller Stämme entsprechend der Pathogruppen. Die Tests bilden zudem die Grundlage für das Training eines Regressionsmodells zur Klassifizierung der Pathogruppe und zur Vorhersage der Menge hybridisierter DNA. Das Regressionsmodell zeichnet sich durch kontinuierliche Lernfähigkeit und damit durch eine Verbesserung der Vorhersagequalität im Prozess der Anwendung aus. Ein Teil der Sonden repräsentiert intergenische DNA und bestätigt infolgedessen die Relevanz der zugrunde liegenden Strategie. Die Tatsache, dass ein großer Teil der von den Sonden repräsentierten Gene noch nicht annotiert ist, legt die Existenz bisher unentdeckter Faktoren mit Bedeutung für die Ausbildung entsprechender Virulenz-Phänotypen nahe. Ein weiteres Haupteinsatzgebiet von Microarrays ist die Genexpressionsanalyse. Die Größe von Genexpressionsdatenbanken ist in den vergangenen Jahren stark gewachsen. Obwohl sie eine Fülle von Expressionsdaten bieten, sind Ergebnisse aus unterschiedlichen Studien weiterhin schwer in einen übergreifenden Zusammenhang zu bringen. In Kapitel 6 wird die Methodik einer ausschließlich datenbasierten Meta-Analyse für genomweite A. thaliana Genexpressionsdatensätze dargestellt, die neue Erkenntnisse über Funktion und Regulation von Genen verspricht. Die Anwendung von Kernel-basierter Hauptkomponentenanalyse in Kombination mit hierarchischem Clustering identifizierte drei Hauptgruppen von Kontrastexperimenten mit jeweils überlappenden Expressionsmustern. In zwei Gruppen konnten deregulierte Gene wichtigen Funktionen bei Indol-3-Essigsäure (IAA) vermitteltem Pflanzenwachstum und -entwicklung sowie pflanzlicher Pathogenabwehr zugeordnet werden. Bisher funktionell nicht näher charakterisierte Serin-Threonin-Kinasen wurden über die Meta-Analyse mit der Pathogenabwehr assoziiert. Grundsätzlich kann dieser Ansatz versteckte Wechselbeziehungen zwischen Genen aufdecken, die unter verschiedenen Bedingungen reguliert werden. Bei der funktionellen Charakterisierung von Proteinen oder der Vorhersage von Genen in Genomsequenzen werden Hidden-Markov-Modelle (HMMs) eingesetzt. HMMs sind technisch ausgereift und in der computergestützten Biologie vielfach eingesetzt worden. Trotzdem birgt die Methodik das Potential zur Optimierung bezüglich der Modellierung biologischer Daten, die hinsichtlich der Längenverteilung ihrer Sequenzen variieren. Untereinheiten dieser Modelle, die Zustände, repräsentieren über ihre individuelle Verweildauer zugrunde liegende Verteilungen von Sequenzlängen. Kapitel 7 stellt eine Methode zur Anpassung einfacher HMM-Topologien an biologische Daten, die glockenkurvenartige Längenverteilungen zeigen, vor. Die Modellierung solcher Verteilungen wird dabei durch eine serielle Verkettung vervielfältigter Zustände gewährleistet, ohne dass die Klasse herkömmlicher HMMs verlassen wird. Auswertungen der Modellierungsleistung bei unterschiedlich stark optimierten HMM-Topologien unterstreichen die Bedeutung der entwickelten Topologieoptimierung. Zusammenfassend wird hier eine generelle Methodik beschrieben, die die Modelleigenschaften von HMMs über Topologieoptimierungen verbessert. Die Parameter dieser Optimierung werden mit Hilfe von Maximum-Likelihood und einem leicht einzubindenden Momentschätzer bestimmt. In Kapitel 8 wird die Anwendung von HMMs zur Vorhersage von Interaktionsstellen in Proteindomänen beschrieben. Wie bereits gezeigt wurde, sind solche Stellen aufgrund einer variablen Konserviertheit ihrer Position und ihres Typs schwer zu bestimmen. Eine Vorhersage von Interaktionstellen in Proteindomänen wird über die Definition einer neuen HMM-Topologie erreicht, die sowohl Sequenz- als auch Strukturdaten einbindet. Interaktionsstellen werden mit einem Posterior-Decoding-Algorithmus vorhergesagt, der zusätzliche Informationen über die Wahrscheinlichkeit einer Interaktion für alle Sequenzpositionen bereitstellt. Die Implementierung der Interaktionsprofil-HMMs (ipHMMs) basiert auf den etablierten Profil-HMMs und erbt deren Effizienz und Sensitivität. Eine groß angelegte Vorhersage von Interaktionsstellen mit ipHMMs konnte mutationsbedingte Fehlfunktionen in Proteinen erklären, die mit vererbbaren Krankheiten wie unterschiedlichen Tumortypen oder Muskeldystrophie assoziiert sind. Wie Profile-HMMs sind auch ipHMMs für groß angelegte Anwendungen geeignet. Insgesamt verbessert die HMM-gestützte Methode sowohl die Vorhersagequalität für Interaktionsstellen als auch das Verständnis molekularer Hintergründe bei vererbbaren Krankheiten. Im Hinblick auf aktuelle und zukünftige Anforderungen stelle ich in dieser Arbeit Lösungsansätze für eine umfassende Charakterisierung großer Mengen biologischer Daten vor. Alle beschriebenen Methoden zeichnen sich durch gute Übertragbarkeit auf verwandte Probleme aus. Besonderes Augenmerk wurde dabei auf den Wissenstransfer gelegt, der durch einen stetig wachsenden Fundus biologischer Information ermöglicht wird. Die angewandten und entwickelten statistischen Methoden sind lernfähig und profitieren von diesem Wissenszuwachs, Vorhersagequalität und Zuverlässigkeit der Ergebnisse verbessern sich. KW - Genomik KW - Hidden-Markov-Modell KW - Enterobacteriaceae KW - Genexpression KW - Microarray KW - Sequenzanalyse KW - diagnostischer Microarray KW - Sequence Analysis KW - diagnostic Microarray Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-39858 ER - TY - JOUR A1 - Gillitzer, Reinhard A1 - Berger, Rudolf A1 - Moll, Heidrun T1 - A reliable method for simultaneous demonstration of two antigens using a novel combination of immunogold-silver staining with immunoenzymatic labeling N2 - We have developed a reliable and sensitive immunohistochemical staining technique which allows the simultaneous demonstration of two different antigens expressed in or on the same cell (referred to as mixed labeling), together with the evaluation of the general histopathological appearance of the tissue. The staining procedure combines a three-step (streptavidin-biotin) immunogold-silver staining (IGSS) with a three-step immunoenzymatic labeling. For this purpose, we investigated the compatibility ofIGSS with various substrates of peroxidase or alkaline phosphatase (AP). Highly reliable and discernible mixed labeling was achieved only after iniriallabeling with IGSS followed by AP labeling using the substrates naphthol AS-MX phosphate/Fast Blue or naphthol AS-HI phosphate/New Fuchsin, respectively. To ensure utmost specificity, we applied FlTC-conjugated mouse monoclonal antibodies and rabbit anti-FlTC immunoglobulins visualized by AP-labeled immunoglobulins and the respective substrate in a final step. This novel approach provides an excellent means for demonstration of immunocompetent cells and unequivocal determination of the percentage of specific cell subsets in infiltrated tissue. The advantages of this method, as compared with double immunofluorescence or double immunoenzymatic labeling, were investigated and are discussed. (J Histochem Cytochem 38:307-313, 1990) KW - Immunohistochemistry; Immunogold-silver staining; FITC- anti-FITC system; Leucocyte subpopulations; Two-color staining Y1 - 1990 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-31092 ER - TY - JOUR A1 - Emmrich, F. A1 - Moll, Heidrun A1 - Simon, Markus M. T1 - Recombinant human interleukin 2 acts as a B cell growth and differentiation promoting factor N2 - Human B cells appropriately activated by a B cell mitogen are rendered susceptible to human Interleukin 2 (IL-2) as demonstrated with recombinant human IL-2 (rec. h IL-2). They show increased proliferation and drastically enhanced immunoglobulin secretion. Susceptibility to IL-2 is accompanied with the expression of the IL-2 receptor (Tac antigen) on B cells. The data suggest that IL-2 is one of the lymphokines directly involved in the activation of B lymphocytes. Y1 - 1985 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-34132 ER - TY - CHAP A1 - Handman, E. A1 - Mitchell, G. F. A1 - McConville, M. J. A1 - Moll, Heidrun T1 - Towards a carbohydrate-based vaccine against leishmaniasis N2 - No abstract available Y1 - 1987 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-33827 ER - TY - JOUR A1 - Moll, Heidrun A1 - Emmrich, F. A1 - Simon, Markus M. T1 - Recombinant human interleukin 2 directly provides signals for the proliferation and functional maturation of murine B lymphocytes N2 - In this study the effect of recombinant human interleukin 2 (rec.hIL-2) on the proliferation and maturation of B lymphocytes was investigated. It was found that the presence of rec.hIL 2 results in proliferation of mitogen (LPS)-activated B cell blasts. In addition, it is shown that highly enriched murine B cells can be induced by rec.hIL-2 to proliferate and to develop into antibody-secreting cells (PFC) in the presence of antigen (SRBC). When tested for its effect on B cell preparations enriched for resting (small) or activated (blasted) B lymphocytes, it was found that rec.hIL 2 provides signals for both B cell populations to develop into PFC. In contrast, induction of proliferation by the same lymphokine source was only seen in blasted B cells. The data indicate that IL 2 is involved in the generation of B effector cells by directly acting on their precursors thereby providing differentiation as well as proliferation signals. Y1 - 1985 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-34090 ER - TY - JOUR A1 - Simon, Markus M. A1 - Moll, Heidrun A1 - Prester, Marlot A1 - Nerz, Gaby A1 - Eichmann, Klaus T1 - Immunoregulation by mouse T-cell clones. I. Suppression and amplification of cytotoxic responses by cloned H-Y-specific cytolytic T lymphocytes. N2 - H-Y-specific and H-2Db-restricted, Lyt-1 "2+ T-cell clones (CTLL) with graded specific cytotoxic activities on male C57BL/6 (B6) target cells (1E3, +++; 2C5, ++; 2A5, +, 3E6, ±) were tested for their capacity to inhibit the generation of H-Y-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) in vitro. Addition of irradiated lymphocytes of CTLL 1E3 and CTLL 3E6 but not those of CTLL 2A5 or CTLL 2C5 abolished the generation of CTL from in vivo primed H-Y-specific precursor cells (CTLP) when added to fresh mixed-lymphocyte cultures (MLC). Exogenous sources of T-cell growth factors (TCGF) did not overcome suppression. Rather the presence of TCGF resulted in a further enhancement of suppressive activities in CTLL 1E3 and 3E6 and the induction of similar activities in cells from CTLL 2A5 and 2C5, which by themselves were not inhibitory. Moreover when added to similar MLC on Day 1 instead of Day 0, only irradiated cells of CTLL 3E6 but not those of the other three CTLL were suppressive. Induction of suppressive activities in H-Y-specific CTLL was independent of the appropriate male stimulator cells since it was also observed in MLC induced by irrelevant antigens (H-2, trinitrophenol). Furthermore at low cell numbers, irradiated lymphocytes from any of the CTLL consistently enhanced CTL activities generated from H-Y-specific CTLP. This augmenting activity, which was not TCGF, could be transferred by soluble mediators present in antigen-sensitized CTLL cultures. Thus, these data indicate (i) that cytotoxic effector cells can function as suppressor cells in the generation of CTL, (ii) that the cytotoxic activity of cloned CTL does not correlate with their capacity to suppress CTL responses, (iii) that the inhibition of CTL responses by CTLL is not due to simple consumption of T-cell growth factors produced in MLC, and (iv) that different CTL clones may interfere with the generation of CTL at different stages of their maturation. Moreover, the experiments suggest an antigen-independent enhancement of suppression by the interaction of CTL with lymphokines. Together with the augmenting activity evoked by cloned CTL the data provide strong evidence for the expression of multiple immunological functions by one particular subset of T cells and suggest that cytotoxic effector cells can differentially regulate the maturation and/or clonal expression of their precursor cells. Y1 - 1984 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-30892 ER - TY - JOUR A1 - Moll, Heidrun A1 - Eichmann, K. A1 - Simon, M. M. T1 - Immunoregulation by mouse T-cell clones. II. The same H-Y-specific T helper clone can provide help for the generation of cytotoxic lymphocytes and of antibody-secreting cells. N2 - Mouse H-Y-specific and I-Ab restricted T-cell clones have been established and compared for their helper effects in the differentiation ofboth T and B Iymphocytes. The results demonstrate that three individual T -cell clones and one subclone could help in the antigen-driven induction of cytotoxic Iymphocytes (CTL) from their precursor cells (CTL-P), and were able to activate B cells to develop into antibody-secreting cells (PFC) in the presence of SRBC, provided the cloned T cells were restimulated by H-Y antigen on antigen-presenting cells. In addition, antigen or lectin could induce the same H -Y -specific T -cell clones to secrete factor(s) expressing helper activities similar to that ofthe cloned T cells. Furthermore, it is shown that the T cell-derived soluble mediator(s) was distinct from T-cell growth factor (TCGF) and from immune interferon (lFN-y). The data reveal a new type ofT cell with helper potential for the activation ofCTL-P and B Iymphocytes, and suggest the existence of distinct T helper cells which can provide help for both cytotoxic and antibody responses by virtue of different Iymphokine activities. Y1 - 1985 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-30903 ER - TY - JOUR A1 - Frischholz., S. A1 - Röllinghoff, M. A1 - Moll, Heidrun T1 - Cutaneous leishmaniasis: Co-ordinate expression of granzyme A and lymphokines by CD4\(^+\) T cells from susceptible mice. JF - Immunology N2 - We have recently demonstrated that the frequency ofT cells expressing granzyme A is significantly higher in skin lesions and spleens of susceptible BALB/c mice compared with resistant C57BL/6 mice infected with Leishmania major, a cause of human cutaneous leishmaniasis. In the present study, we have performed in vitro studies to characterize the subpopulation, the antigen responsiveness and the lymphokine production pattern of granzyme A-expressing T cells in L. major-infected mice. Using a limiting dilution system for functional analysis of selected T cells at the clonallevel, we could show that granzyme A activity in infected BALB/c mice can be assigned to L. major-reactive CD4\(^+\) T cells secreting interleukin-2 (IL-2) and IL-4. Granzyme A production was most pronounced in the early phase of infection. On the other hand, granzyme A expression could not be detected in C57BL/6-derived T cells responding to L. major. The da ta support the suggestion that granzyme A is produced by L. major-responsive CD4\(^+\) T cells facilitating lesion formation and the dissemination of infection. Y1 - 1994 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-30954 VL - 82 SP - 255 EP - 260 ER - TY - CHAP A1 - Moll, Heidrun T1 - Experimental cutaneous leishmaniasis: Langerhans cells internalize Leishmania major and induce an antigen-specific T-cell response. N2 - No abstract available Y1 - 1993 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-30932 ER - TY - THES A1 - Albert-Weißenberger, Christiane T1 - Regulation of the Flagellar Biogenesis in Legionella pneumophila T1 - Die Regulation der Flagellenbiogenese in Legionella pneumophila N2 - The bacterial pathogen Legionella pneumophila replicates intracellularly in protozoa, but can also cause severe pneumonia, called Legionnaires' disease. The bacteria invade and proliferate in the alveolar macrophages of the human lung. L. pneumophila bacteria exhibit a biphasic life cycle: replicative bacteria are avirulent; in contrast, transmissive bacteria express virulence traits and flagella. Primarily aim of this thesis was to evaluate the impact of the regulatory proteins FleQ, FleR, and RpoN in flagellar gene regulation. Phenotypic analysis, Western blot and electron microscopy of regulatory mutants in the genes coding for FleQ, RpoN and FleR demonstrated that flagellin expression is strongly repressed and that these mutants are non-flagellated in transmissive phase. Transcriptomic studies of these putative flagellar gene expression regulators demonstrated that fleQ controls the expression of numerous flagellar biosynthetic genes. Together with RpoN, FleQ controls transcription of 14 out of 31 flagellar class II genes, coding for the basal body, hook, and regulatory proteins. Unexpectedly, 7 out of 15 late flagellar genes class III and IV) are expressed dependent on FleQ but independent of RpoN. Thus, in contrast to the commonly accepted view that enhancer binding proteins as FleQ always interact with RpoN to initiate transcription, our results strongly indicate that FleQ of L. pneumophila regulates gene expression RpoN-dependent as well as RpoN-independent. Moreover, transcriptome analysis of a fleR mutant strain elucidated that FleR does not regulate the flagellar class III genes as previously suggested. Instead FleR regulates together with RpoN numerous protein biosynthesis and metabolic genes. Based on these experimental results our modified model for the transcriptional regulation of flagellar genes in L. pneumophila is that flagellar class II genes are controlled by FleQ and RpoN, while flagellar class III and IV genes are controlled in a fleQ-dependent but rpoN-independent manner. Although all L. pneumophila strains share the same complex life style, various pathotypes have evolved. This is reflected by the genomes, which contain e.g. genomic islands. The genomic island Trb-1 of L. pneumophila Corby, carries all genes necessary for a type-IV conjugation system, an integrase gene and a putative oriT site. The second aim of this thesis was to investigate the implication of this genomic island in conjugative DNA transfer. Using conjugation assays we showed that the oriT site located on Trb-1 is functional and contributes to conjugation between different L. pneumophila strains. As this is the first oriT site of L. pneumophila known to be functional our results provide evidence that conjugation is a major mechanism for the evolution of new pathotypes in L. pneumophila. N2 - Das pathogene Bakterium Legionella pneumophila repliziert sich in der Natur intrazellulär in Protozoen. Beim Menschen kann das Bakterium eine schwere Pneumonie, die sogenannte Legionärskrankheit auslösen. Hierbei vermehren sich die Bakterien in Alveolarmakrophagen der Lunge. Der Lebenszyklus von L. pneumophila Bakterien ist gekennzeichnet durch zwei Phase: replikative Bakterien sind avirulent; im Gegensatz dazu sind transmissive Bakterien virulent und flagelliert. Hauptziel dieser Arbeit war es die Beteiligung der regulatorischen Proteins FleQ, FleR, and RpoN an der Flagellengenregulation zu ermitteln. Mutanten für die Gene welche für FleQ, FleR oder RpoN codieren exprimieren in der transmissiven Phase im Genesatz zum Wildtyp nur wenig Flagellin und sind nicht flagelliert. Nachgewiesen wurde dies durch eine phänotypische Analyse, Western blot und Ektronenmikroskopie. Studien des Transkripoms dieser Mutanten zeigten, daß FleQ die Expression zahlreicher Flagellenbiosynthesegenen kontrolliert. Gemeinsam mit RpoN kontrolliert FleQ die Transkription von 14 der 31 Klasse II Flagellengene, welche für Basalkörper, Haken und regulatorische Proteine codieren. Überraschenderweise sind 7 der 15 späten Flagellengenen (Klasse III und IV) abhängig von FleQ, aber unabhängig von RpoN exprimiert. Daher und entgegen der allgemeinen Auffassung dass sogenannte ‚enhancer binding' Proteine wie FleQ zur Transkriptionsinitiation immer mit RpoN interagieren, deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass FleQ von L. pneumophila Genexpression sowohl RpoN-abhängig, als auch RpoN-unabhängig reguliert. Ebenso anders als zuvor vorgeschlagen, verdeutlichen Studien des Transkriptoms einer fleR Mutante, dass FleR nicht die Expression der Klasse III Flagellengene induziert. Statt dessen reguliert FleR gemeinsam mit RpoN zahlreiche Gene der Proteinbiosynthese und des Metabolismus. Basierend auf diesen experimentellen Ergebnissen sind in unserem modifizierten Modell für die transkriptionelle Regulation der L. pneumophila Flagellengene die Flagellengene der Klasse II von FleQ und RpoN kontrolliert, während die Flagellengene der Klasse III und IV in einer fleQ-abhängigen aber rpoN-unabhängigen Weise kontrolliert sind. Obwohl alle L. pneumophila Stämme den zweiphasigen Lebenszyklus aufweisen haben sich unterschiedliche Pathotypen evolviert. Das ist auch in den Genomen sichtbar, die z. B. genomische Inseln enthalten. Die genomische Insel Trb-1 von L. pneumophila Corby trägt alle Gene eines Typ-IV Konjugationssystem, ein ntegrase-Gen und einen putative oriT-Bereich. Das zweite Ziel dieser Arbeit war es also zu untersuchen, inwieweit Trb-1 an konjugativem DNA-Transfer beteiligt ist. Mit Hilfe von Konjugationsexperimenten, zeigten wir, dass der oriT-Bereich von Trb-1 funktional ist und zur Konjugation zwischen verschiedenen L. pneumophila Stämmen beiträgt. Dies ist der erste oriT Bereich von L. pneumophila, dessen Funktionalität nachgewiesen wurde. Damit bekräftigen unsere Ergebnisse, dass Konjugation eine treibende Kraft für die Evolution neuer Pathotypen in L. pneumophila ist. KW - Legionella pneumophila KW - Genregulation KW - Legionella pneumophila KW - gene regulation Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-34335 ER - TY - JOUR A1 - Moll, Heidrun A1 - Röllinghoff, Martin T1 - T-cell reactivity to purified lipophosphoglycan from Leishmania major: A model for analysis of the cellular immune response to microbial carbohydrates. N2 - The major macromolecule on the surface o/Leishmania majorpromastigotes is a lipophosphoglycan (LPG). This glycoconjugate plays a key role in determining infectivity and survival of para-sites in the mammalian host cell. In addition, L. major LPG is able to induce a host-protective immune response. In this article, we summarise the evidence for recognition of highly purified LPG by T cells and we discuss the potential mechanisms of T-cell Stimulation by this non-protein antigen. KW - Leishmania KW - T lymphocytes KW - glycosyl phosphatidyl-inostitols. Y1 - 1991 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-33022 ER - TY - JOUR A1 - Tiu, W. U. A1 - Davern, K. M. A1 - Garcia, E. G. A1 - Moll, Heidrun A1 - Mitchell, Graham F. T1 - Monoclonal antibodies reacting with Schistosoma japonicum eggs and their target epitopes N2 - Ten monoclonal antibodies (McAbs) raised to Schistosoma japonicum eggs could be assigned using several serological and immunochemical techniques to 3 groups. The McAbs, termed A, B and C-McAbs, apparently recognize carbohydrate epitopes that can be located on the same antigen molecule. The antibodies, generally of IgM isotype, are idiotypically related. They are distinct from another IgM McAb (Group D-McAb) the carbohydrate target epitope of which can also be associated with the epitopes of A. B and C-McAbs. The McAbs produce large vacuolated bleb reactions in the circumoval precipitin test (COPT) and target epitopes have different representations in various life cycle stages such as immature and mature eggs, male and female worms (including S. mansoni). Antigens affinity purified on columns containing A, B, C and D-McAbs stimulate proliferation of T cells from egg-sensitized mice and elicit DTH reactions in such mice. This raises the possibility that the target antigens of these carbohydrate-reactive monoclonal antibodies are immunopathologic and involved in egg-induced granuloma formation. KW - Schistosoma japonicum; Egg antigen; Carbohydrate epitope; Circumoval precipitin test; Immunoassay Y1 - 1989 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-30916 ER - TY - JOUR A1 - Moll, Heidrun A1 - Mitchell, Graham F. T1 - Analysis of variables associated with the promotion of resistance, and its abrogation, in T cell-reconstituted nude mice infected with Leishmania major N2 - No abstract available Y1 - 1988 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-30949 ER - TY - JOUR A1 - Moll, Heidrun T1 - Development of helper T cell subsets: a central role for interleukin 12 N2 - No abstract available Y1 - 1993 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-30975 ER - TY - THES A1 - Keller, Christian T1 - The role of dendritic cells in the immunoregulation of leishmaniasis - transfection of dendritic cells with mRNA encoding a molecularly defined parasitic antigen T1 - Die Rolle dendritischer Zellen in der Immunregulation der Leishmaniose - Transfektion dendritischer Zellen mit mRNA eines molekular definierten Parasitenantigens N2 - Die kutane Leishmaniose ist eine Infektionskrankheit, die besonders in tropischen und Wüstenregionen endemisch ist, mit einer Inzidenz von 1,5 Millionen Fällen im Jahr und einer Prävalenz von 12 Millionen Infizierten weltweit. Die Infektion kann durch den intrazellulären Parasiten Leishmania major hervorgerufen werden. Am Mausmodell ist die Krankheit ausführlich untersucht. Wie dabei deutlich wurde, ist für die Immunität gegen den Erreger die Induktion einer Klasse von Interferon (IFN)--produzierenden CD4+ T-Helfer-Zellen (TH1-Zellen) entscheidend, welche Makrophagen dazu aktivieren, die von ihnen beherbergten Parasiten abzutöten. Die Umlenkung der Immunantwort in Richtung einer schützenden TH1-Antwort wird auch der Schlüssel zu einem effektiven Impfstoff sein. Ex vivo mit Leishmanienantigenen beladene dendritische Zellen sind vor einiger Zeit als Vakzine gegen L. major-Infektionen beschrieben worden. Ein einzelnes rekombinantes Antigen, LeIF (Leishmania homologue of eukaryotic ribosomal initiation factor 4a), ein parasitäres Protein, das die IL-12-Produktion durch dendritische Zellen stimuliert und das als mikrobiell konserviertes Strukturmolekül (pattern-associated molecular pattern; PAMP) diskutiert wird, vermittelte dabei, zum Pulsen von dendritischen Zellen verwendet, einen schützenden TH1-abhängigen Effekt. Der Einsatz rekombinanter Proteine ist jedoch mit etlichen Nachteilen verbunden, weshalb andere Methoden zur Verabreichung von Antigenen entwickelt wurden. Aus der Tumorforschung ist unlängst die RNA-Elektroporation dendritischer Zellen als eine sichere und vielseitige Methode hervorgegangen, bei der eine große Anzahl von RNA-Molekülen, die für ein bestimmtes Antigen kodieren, durch einen elektrischen Impuls in das Cytosol dendritischer Zellen gelangt. Die vorliegende Arbeit beschreibt zum ersten Mal die Transfektion dendritischer Zellen mit RNA eines molekular definierten Parasitenantigens. Zunächst erfolgte die Etablierung eines standardisierten Protokolls für die RNA-Transfektion mit dem enhanced green fluorescent protein (EGFP) als Reporterantigen. EGFP-RNA war gut translatierbar in einem In-vitro-Translationssystem, und es konnten sowohl eine Zellinie (fetal skin-derived dendritic cells; FSDC) als auch primäre, aus Knochenmarkkulturen der Maus gewonnene dendritische Zellen (bone marrow-derived dendritic cells; BMDC) mit einem Anteil von bis zu 90% bzw. 75% effizient EGFP-transfiziert werden. In beiden Zelltypen wurde die maximale Transfektionseffizienz mit 20 µg RNA erreicht, die mit größeren Mengen an RNA nicht weiter zu steigern war. Die Höhe der Antigenexpression, gemessen als mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) in der Durchflußzytometrie, war direkt proportional zur verwendeten RNA-Menge. In FSDC waren die Transfektionseffizienz und die MFI generell höher als in BMDC bei gleicher RNA-Menge. Zudem konnte gezeigt werden, daß eine Behandlung mit LPS die Kinetik beeinflußt: Die maximale Expression war höher und wurde auch eher erreicht, worauf zudem ein schnellerer Abfall folgte. In den Transfektionsexperimenten mit LeIF wurden zwei Varianten von LeIF-RNA verwendet: eine für die gesamte LeIF-Sequenz kodierende LeIF(fl)-RNA, und eine nur für die aminoterminale Hälfte der LeIF-Sequenz (226 Aminosäuren), dem immunogenen Teil des LeIF-Moleküls, kodierende LeIF(226)-RNA. Im Western Blot von Ganzzellysaten dendritischer Zellen war nur LeIF(fl) nach Transfektion nachzuweisen, wohingegen LeIF(226) in LeIF(226)-transfizierten BMDC nie nachzuweisen war. Da beide Konstrukte aber gut im zellfreien System translatierbar waren, stellte der fehlgeschlagene Nachweis von LeIF(226) kein Fehlschlagen der RNA-Translation, sondern vielmehr einen raschen Antigenabbau dar. Es bestand daher die Erwartung, daß LeIF(226)-transfizierte BMDC trotzdem in der Lage sein müßten, von LeIF(226) abgeleitete antigene Peptide an T-Zellen von mit rekombinantem LeIF (rLeIF) immunisierten BALB/c-Mäusen zu präsentieren. Diese Vermutung wurde durch Messung von IFN- in Stimulationsversuchen mit BMDC und T-Zellen bestätigt, die zeigten, daß am Tag 7 der Kultur mit rLeIF gepulste, LeIF(226)- und LeIF(fl)-transfizierte BMDC in der Tat antigenspezifisch T-Zellen aus LeIF-immunisierten Mäusen aktivierten. IL-4 hingegen wurde nicht produziert, was mit der Tatsache vereinbar ist, daß in Lymphknoten LeIF-vakzinierter Mäusen hauptsächlich T-Zellen vom TH1-Typ zu finden sind. In den Überständen LeIF-transfizierter BMDC-Kulturen, im Gegensatz zu rLeIF-gepulsten BMDC, waren die proinflammatorischen Zytokine IL-1β, IL-6, IL-10 und IL-12 nicht nachzuweisen. Dieser Effekt lag nicht am Elektroporationsvorgang, da die Zytokinproduktion von mit rekombinantem LeIF elektroporierten BMDC nur teilweise beeinträchtigt war. Die Expression von CD86 war nach LeIF-Transfektion zudem geringer als nach Pulsen mit rLeIF. LeIF-Transfektion führte mithin nicht zur Reifung dendritischer Zellen. LeIF-transfizierte BMDC könnten im Ergebnis als antigenspezifische Toleranzinduktoren fungiert haben, mit regulatorischen T-Zellen als Respondern. Der Effekt der Transfektion mit LeIF-RNA auf die immunstimulatorische Wirkung von BMDC war nicht signifikant erhöht, wenn BMDC am Tag 8 oder 9 der Kultur verwendet wurden. BMDC, die am Tag 8, und mehr noch am Tag 9 mit rLeIF gepulst wurden, induzierten hingegen eine energische T-Zell-Antwort. BMDC vom Tag 9 waren sogar in der Lage, naive T-Zellen zu aktivieren. Bevor eine starke, gegen LeIF gerichtete T-Zell-Antwort eingeleitet werden kann, müssen dendritische Zellen also letztlich – neben Präsentation des Antigens und Expression kostimulatorischer Moleküle – eine gewisse „Empfindlichkeit“ gegenüber dem Strukturmolekül LeIF besitzen, die mit ihrem Reifungsalter in Zusammenhang steht. Dieses dritte Signal wird nicht durch intrazelluläres LeIF nach Transfektion mit LeIF-RNA übermittelt, oder es wird unterdrückt. Darüber hinaus war nach Elektroporation von rLeIF die IL-12-Produktion von BMDC gänzlich aufgehoben, die Produktion von IL-1 bei höheren Antigendosen reduziert und die Produktion von IL-10 teilweise erhöht. Die Produktion von IL-6 war unbeeinflußt. Dieses veränderte Zytokinprofil legt eine Doppelnatur von LeIF als PAMP nahe: Neben der bei extrazellulärem Vorliegen von LeIF erwiesenen Eigenschaft, die Produktion von IL-12 zu stimulieren, welches die Resistenz des Wirtes gegen L. major steigert, könnte LeIF bei intrazellulärem Vorliegen auch zu Evasionsmechanismen des Parasiten vor dem Immunsystem des Wirtes beitragen, möglicherweise durch Wechselwirkung mit MAP (mitogen-activated protein)-Kinase-Signalwegen. Die Eigenschaften von LeIF als Adjuvans hängen also sowohl von der Verabreichungsmethode (Transfektion mit RNA bzw. Pulsen mit dem rekombinanten Protein) als auch vom Zielkompartiment (extra- bzw. intrazellulär) ab. Zusammenfassend konnte also in dieser Arbeit gezeigt werden, daß BMDC mit einem Parasitenantigen transfizierbar sind. Das Antigen wird dabei prozessiert und präsentiert, aber von dendritischen Zellen nicht als PAMP erkannt. Durch Transfektion mit antigenkodierender mRNA alleine werden mithin nicht alle notwendigen Signale für die Induktion einer potenten Immunantwort übermittelt. N2 - Cutaneous leishmaniasis is an infectious disease that is endemic especially in tropical and desert regions with an incidence of 1.5 million cases per year and a prevalence of 12 million people infected worldwide. The infection can be caused by the intracellular parasite Leishmania major. The disease has been studied extensively in the murine model. It has become apparent that the induction of a class of interferon (IFN)--producing CD4+ T helper cells (TH1 cells) that activate macrophages to kill the parasites they harbor is desicive for the establishment of immunity. The redirection of the host’s immune response towards a protective TH1 phenotype will also be the key to an effective vaccine. Dendritic cells (DC) loaded with leishmanial antigens ex vivo were lately described as vaccines against L. major infections. One single recombinant Leishmania antigen, LeIF (Leishmania homologue of eukaryotic ribosomal initiation factor 4a), which was identified as a protein that stimulates DC to secrete interleukin (IL)-12 and discussed as a pattern-associated molecular pattern (PAMP), was found to mediate a protective TH1-dependent effect when used for pulsing of DC. The application of recombinant proteins is tied to many disadvantages, which is why other methods of antigen administration have been developed. RNA electroporation of DC has recently emerged from tumor research as a safe and versatile method of antigen delivery, by which a large number of RNA molecules encoding a specific antigen gains access to the cytosol of DC by an electrical impulse. The present study describes, for the first time, transfection of DC with RNA encoding a molecularly defined parasite antigen. Initially, a standardized protocol for RNA transfection was established, using the enhanced green fluorescent protein (EGFP) as reporter antigen. EGFP-RNA was well translatable in an in vitro translation system, and both a DC cell line (fetal skin-derived DC; FSDC) and murine primary bone marrow-derived DC (BMDC) could be transfected efficiently, with a yield of up to 90% and 75%, respectively. In both cell types, maximal transfection efficiency was attained with 20 µg RNA and could not be further increased with larger amounts of RNA. The level of antigen expression, measured as the mean fluorescence intensity (MFI) by flow cytometry, was directly proportional to the amount of RNA used for transfection. In FSDC, transfection efficiency and MFI were generally higher than in BMDC when the same amounts of RNA were used. Furthermore, the kinetics was shown to be sensitive to treatment with lipopolysaccharide (LPS): the expression peak was higher and was reached sooner, followed by a more rapid decline. In transfection experiments with LeIF, two variants of LeIF-RNA were used: LeIF(fl)-RNA, encoding the complete LeIF sequence, and LeIF(226)-RNA, encoding only the aminoterminal half of the LeIF sequence (226 amino acids), the immunogenic part of LeIF. Only LeIF(fl) was detectable by Western Blot in whole cell lysates of BMDC after LeIF(fl)-RNA transfection, whereas LeIF(226) could never be detected in LeIF(226)-transfected BMDC. However, as both constructs were well translatable in a cell-free system, the failure to detect LeIF(226) in BMDC lysates did not represent a failure in RNA translation, but rather a rapid antigen degradation. It was therefore expected that LeIF(226)-transfected BMDC should nevertheless be able to present LeIF(226)-derived antigenic peptides to T cells from BALB/c mice primed with recombinant LeIF (rLeIF). This hypothesis was confirmed by measuring IFN- production in BMDC-T cell co-incubation assays, showing that rLeIF-pulsed, LeIF(226)- and LeIF(fl)-transfected day 7 BMDC did indeed activate T cells from LeIF-immunized mice in an antigen-specific manner. In contrast, IL-4 was not produced, which was consistent with the fact that T cells found in lymph nodes from LeIF-primed mice are primarily of the TH1 type. In the supernatants of LeIF-transfected BMDC cultures, in contrast to rLeIF-pulsed BMDC, the proinflammatory cytokines IL-1β, IL-6, IL-10 and IL-12 were not detected. This effect was not due to the electroporation procedure, as cytokine production by BMDC electroporated with rLeIF was only partially impaired. Also, the expression levels of CD86 were lower upon LeIF transfection than after pulsing with rLeIF. Thus, LeIF transfection did not induce maturation of DC. In conclusion, LeIF-transfected BMDC may have acted as semi-mature antigen-specific tolerance inducers, with regulatory T cells as responders. The effect of LeIF transfection on the immunostimulatory capacity of BMDC was not significantly increased when day 8 or 9 BMDC were used. However, day 8, and even more day 9 BMDC pulsed with rLeIF mounted a vigorous T cell response. Day 9 BMDC were able to activate naïve T cells. In conclusion, before a strong T cell response against LeIF can be induced, DC need to – besides presenting antigen and expressing co-stimulatory molecules – exhibit a susceptibility to the innate signaling molecule LeIF which is linked to their maturation age. This third signal is provided by extracellular rLeIF, but it is not conveyed – or is suppressed – by intracellular LeIF after LeIF-RNA transfection. Furthermore, electroporation of rLeIF abrogated IL-12 production by BMDC completely, the production of IL-1 was reduced with higher antigen doses, and the production of IL-10 was partially increased. The IL-6 production was unaffected. This altered cytokine profile suggests that LeIF as a PAMP might have a bipartite nature: besides exhibiting the capacity to stimulate IL-12 production upon extracellular presence, thereby enhancing host resistance against L. major, LeIF could also contribute to parasitic host evasion mechanisms from intracellular compartments of DC, possibly by interfering with mitogen-activated protein (MAP) kinase signaling pathways. Thus, the adjuvant properties of LeIF depend both on its mode of delivery (transfection with RNA vs. pulsing with the recombinant protein) and the targeted compartment (extra- vs. intracellular). From this work, it can be summarized that BMDC are well transfectable with a parasite antigen. The antigen is processed and presented, but it is not recognized as a PAMP by DC. Hence, transfection with antigen-encoding mRNA by itself does not convey all necessary signals for the elicitation of a potent immune response. KW - Elektroporation KW - Leishmania KW - Leishmania major KW - Immunbiologie KW - Immunologie KW - Dendritische Zelle KW - Transfektion KW - Impfung KW - Antigenpräsentation KW - EGFP KW - pathogen-associated molecular pattern KW - TH1/TH2 KW - Transfektion KW - EGFP KW - pathogen-associated molecular pattern KW - TH1/TH2 KW - transfection Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-26208 ER - TY - THES A1 - Schmitt, Susanne T1 - Vertical microbial transmission in Caribbean bacteriosponges T1 - Vertikale Weitergabe von Mikroorganismen in karibischen Schwämmen N2 - Bakterienhaltige Schwämme sind durch große Mengen an morphologisch und phylogenetisch unterschiedlichen Mikroorganismen im Mesohyl gekennzeichnet. Diese mikrobiellen Konsortien sind permanent, stabil und hoch-spezifisch mit den Wirts-Schwämmen assoziiert. Über die Entstehung und die Aufrechterhaltung dieser Assoziation ist jedoch wenig bekannt. Es war das erste Ziel dieser Doktorarbeit, Co-Speziation zwischen mediterranen und karibischen Schwämmen der Gattung Aplysina und assoziierten Cyanobakterien zu untersuchen. Die Wirtsphylogenie wurde sowohl mit 18S rDNA als auch mit ITS-2 Sequenzen erstellt. Das Alignment basierte auf der Sekundärstruktur des jeweiligen molekularen Markers und jeder phylogenetische Stammbaum wurde mit 5 verschiedenen Algorithmen berechnet. Die Gattung Aplysina erschien monophyletisch. Die verschiedenen Arten konnten einer Karibik- und einer Mittelmeer-Gruppe zugeordnet werden und der Ursprung der Gattung Aplysina im Urmeer Tethys erscheint möglich. Der Vergleich von Wirts- und Cyanobakterien-Phylogenie, welche auf 16S rDNA Sequenzen beruht, zeigte, dass die Topologie der Stammbäume sich nicht spiegelbildlich gegenübersteht. Es wird daher angenommen, dass keine Co-Speziation zwischen Aplysina Schwämmen und Cyanobakterien und wahrscheinlich auch nicht mit anderen Schwamm-spezifischen Mikroorganismen vorliegt. Das zweite Ziel dieser Doktorarbeit war, die vertikale Weitergabe von Mikroorganismen über Reproduktionsstadien in Schwämmen zu untersuchen. Eine umfangreiche elektronenmikroskopische Studie zeigte eine klare Korrelation, da bakterienhaltige Schwämme immer auch unterschiedliche mikrobielle Morphotypen in den Reproduktionsstadien aufwiesen, wohingegen in den Reproduktionsstadien bakterienarmer Schwämme keine Mikroorganismen gefunden wurden. Aus diesen Ergebnissen wird die Weitergabe des mikrobiellen Konsortiums über Reproduktionsstadien bakterienhaltiger Schwämme geschlossen. Basierend auf den vorherigen Ergebnissen wurde Ircinia felix für eine detaillierte Dokumentation der vertikalen Weitergabe von Mikroorganismen ausgewählt. Elektronenmikroskopische Aufnahmen zeigten, dass die Larven von I. felix im zentralen Bereich große Mengen an extrazellulären Mikroorganismen enthielten während der äußere Bereich nahezu frei von Mikroorganismen war. In I. felix Juvenilschwämmen waren die Mikroorganismen zwischen eng gepackten Schwammzellen lokalisiert. Die mikrobiellen Profile von I. felix Adult, Larven und Juvenilen wurden mittels Denaturierender-Gradienten-Gel-Elektrophorese (DGGE) verglichen. Ähnliche mikrobielle Diversitätsmuster waren im Adultschwamm und den respektiven Larven vorhanden. Dies deutet darauf hin, dass ein großer Anteil des adulten mikrobiellen Konsortiums vertikal weitergegeben wird. Im Gegensatz dazu schienen die mikrobiellen Konsortien von Larven, die von unterschiedlichen Adultindividuen stammten, insgesamt variabler zu sein. Die Bandenmuster der Juvenilschwämme waren eine Mischung aus Schwamm-spezifischen und Seewassermikroorganismen, was auf die Methodik der DNA-Extraktion zurückgeführt werden kann. Allerdings kann gesagt werden, dass mindestens die Hälfte des adulten mikrobiellen Konsortiums in der nächsten Generation vorhanden war. Schließlich wurde eine umfangreiche phylogenetische Analyse mit Sequenzen aus Adultschwämmen und Larven durchgeführt. Die Sequenzen wurden durch Sequenzierung von ausgeschnittenen DGGE-Banden der bakterienhaltigen Schwämme Agelas wiedenmayeri, I. felix und Smenospongia aurea gewonnen. Zusätzlich wurden bislang unveröffentlichte Sequenzen aus den Schwämmen Ectyoplasia ferox und Xestospongia muta verwendet, die im Labor erstellt worden waren. Die Identifizierung von 24 "vertical transmission clusters" in mindestens 8 verschiedenen, eubakteriellen Phyla zeigt, dass ein komplexes, aber einheitliches, mikrobielles Konsortium über die Reproduktionsstadien weitergegeben wird. Der Prozess der vertikalen Weitergabe ist spezifisch, da Mikroorganismen der bakterienhaltigen Schwämme, nicht aber Seewasser-Mikroorganismen weitergegeben werden. Zugleich scheint der Prozess der vertikalen Weitergabe nicht selektiv zu sein, da keine Unterscheidung zwischen einzelnen, Schwamm-spezifischen Mikroorganismen erfolgt. Insgesamt deutet vertikale Weitergabe auf eine mutualistische und seit langem bestehende Assoziation zwischen bakterienhaltigen Schwämmen und komplexen, mikrobiellen Konsortien hin. N2 - Bacteriosponges contain large amounts of morphologically and phylogenetically diverse microorganisms in their mesohyl. The association is permanent, stable and highly specific, however, little is known about the establishment and maintenance of this association. The first aim of this Ph.D. thesis was to examine cospeciation between eight Aplysina species from the Mediterranean and Caribbean and their cyanobacterial associates. Host phylogeny was constructed with 18S rDNA and ITS-2 sequences using an alignment based on the secondary structure of the molecular markers and five different algorithms each. The genus Aplysina appeared as monophyletic. Aplysina sponges could be distinguished into a Caribbean and a Mediterranean cluster and a possible Tethyan origin is suggested. Comparison of the host phylogeny to the 16S rDNA phylogeny of the cyanobacterial strains revealed the lack of a congruent pattern. Therefore it is proposed that Aplysina sponges have not cospeciated with their cyanobacterial phylotypes and probably also not with other sponge specific microbes. The second aim of this Ph.D. thesis was to examine vertical transmission of microorganisms through reproductive stages of sponges. A general transmission electron microscopy (TEM) suvey revealed a clear correlation in that bacteriosponges always contained many microorganisms in their reproductive stages whereas non-bacteriosponges were always devoid of microbes in their reproductive stages. The transmission of the microbial community via sponge reproductive stages is concluded. Based on the previous results Ircinia felix was chosen for a detailed documentation of vertical transmission. I. felix larvae contained large amounts of microorganisms extracellularly in the central region whereas the outer region was almost free of microbes as shown by TEM. In I. felix juveniles microorganisms were located between densely packed sponge cells. The microbial profiles of I. felix adult, larvae, and juveniles were compared using denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE). Similar microbial community patterns were found in adult and the respective larvae indicating that a large subset of the adult microbial community was vertically transmitted. In contrast, microbial communities of larvae pools released by different adult individuals seemed to be more variable. Juvenile banding patterns were a mixture of sponge specific and seawater microbes due to DNA extraction artefacts but demonstrated that at least half of the adult microbial community is present in the next generation. Finally, a comprehensive phylogenetic analysis was conducted by sequencing excised DGGE bands from adult and offspring of the bacteriosponges Agelas wiedenmayeri, I. felix, and Smenospongia aurea and by taking additional 16S rDNA sequences of Ectyoplasia ferox and Xestospongia muta (unpublished data of the laboratory). The identification of 24 vertical transmission clusters in at least 8 eubacterial phyla demonstrates that a complex and uniform microbial community is transferred via sponge reproductive stages. Vertical transmission is specific in that the microorganisms of bacteriosponges, but not those from seawater, are passed on, but unselective in that there appears to be no differentiation between individual sponge-specific lineages. In conclusion, vertical transmission points to a mutualistic and long-term association of bacteriosponges and complex microbial consortia. KW - Schwamm KW - Koevolution KW - mikrobielle Ökologie KW - mikrobielle Diversität KW - Vertikale Weitergabe KW - sponge KW - coevolution KW - microbial ecology KW - microbial diversity KW - vertical transmission Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-23621 ER - TY - THES A1 - Mäurer, André Germar Paul T1 - Analysis of the Chlamydophila pneumoniae and host transcriptome in the acute and iron depletion-mediated persistent infection T1 - Analyse des Transkriptoms von Chlamydophila pneumoniae und der Wirtszelle während der akuten und der durch Eisenmangel vermittelten persistenten Infektion N2 - The obligate intracellular gram-negative bacterium, Chlamydophila pneumoniae (Cpn), has a significant impact as an acute and chronic disease-causing pathogen. Its potential to undergo persistent infections has been linked to chronic diseases. Several in vitro cell culture models are used to study persistent conditions, mainly IFN_ stimulation, treatment with antibiotics and iron depletion. Little is known about changes in the Cpn transcriptome during the acute and persistent infection. Therefore, the Cpn transcriptome during its acute developmental cycle and iron depletion-mediated persistence was examined in this study. Based on expression profiles, genes with similar expression changes formed 12 clusters using the self-organizing map algorithm. While other studies define genes based on their onset of transcription, here the important feature for clustering was the expression profile. This turned out to be more appropriate for comparing the time specific relevance of a certain cluster of genes to their proposed functions in the cycle. The Cpn clusters were grouped into the 'Early', 'Mid' and 'Late' classes as described for Ctr. Additionally, a new gene expression class containing genes with steadily increasing expression at the end of the developmental cycle was defined and termed 'Tardy' class. Comparison of the Cpn clusters to published proteomics data showed that genes encoding elementary body (EB) proteins peaked in the 'Late' gene cluster. This indicated that genes of the ‘Late’ and ‘Tardy’ class have different roles in RB to EB re-differentiation. Moreover, using lexical comparison the EB mRNA profile was significantly linked to the ‘Tardy’ cluster class. This provided evidence that initial translation in the cycle might be directed from stable transcripts present in the infectious EB form. Based on these criteria the novel ‘Tardy’ class was separated from the ‘Late’ class. The gene ontologies were used to identify specific pathways and physiological functions active during the different phases of development. Additionally, the transcriptome of Cpn in the persistent stage was compared to that of the acute developmental cycle. The Cpn transcriptome was altered in the iron-depletion mediated persistence. Genes upregulated were linked to clusters at the beginning of the developmental cycle, and genes down-regulated were linked to clusters at the end of the developmental cycle. These data provided strong evidence that the Cpn transcriptome during persistence is a gene expression arrest in mid-development. In early acute infection convergently or divergently oriented gene pairs preferentially had an antagonistic expression profile, whereas tandemly oriented gene pairs showed a correlated expression profile. This suggests that the Cpn genome is organized mainly in tandemly arranged operons and in convergently or divergently oriented genes with favored antagonistic profiles. The microarray studies done with the Cpn strain CWL029 also showed expression signals for several genes annotated only for the Cpn strains AR39 and J138. BLAST comparison verified that these genes are also coded in the CWL029 genome. Several of these genes were convergently arranged with their neighboring gene and shared overlapping genome information. Among these were parB, involved in DNA segregation and rpsD, an alternative sigma factor responsible for the transcription at late stages of the developmental cycle. Both genes have been described to have major roles in the chlamydial cycle. These genes had an antagonistic expression profile at the beginning of the acute developmental cycle and in persistence, as described before to be predominant for convergently oriented genes. Real time RT-PCR analysis showed that full-length rpsD mRNA transcripts were down-regulated, whereas short-length rpsD mRNA transcripts were up-regulated during the persistent infection. This demonstrated that the rpsD promoter is activated during the persistent infection and that because of the collision of the RNA polymerases full length transcripts were down-regulated. This sigma factor-independent mechanism is known as ‘Transcriptional Interference’. This is the first description on how the alternative sigma factor rpsD might be down-regulated during persistent infections. Finally, the host cell transcriptome was analyzed in the acute and persistent infection mediated by the depletion of iron. Cpn infection triggered the upregulation of relB, involved in an alternative NF-KB signaling pathway. Several genes coding for cell cycle proteins were triggered, including cyclin G2 and cyclin D1 and inhibitors of CDK4. Taken together, this work provides insights into the modulation of the pathogen and the host transcriptome during the acute infection and the iron mediated persistent infection. N2 - Das obligat intrazelluläre, gram-negative Bakterium Chlamydophila pneumoniae (Cpn) wird mit akuten und chronischen Krankheiten in Verbindung gebracht. Besonders sein Potential persistente Infektionen zu durchlaufen ist mit chronischen Krankheiten korreliert worden und deshalb von besonderem Interesse. Verschiedene in vitro Zellkulturmodelle werden verwendet um persistente Infektionen zu untersuchen, darunter IFN_ Stimulation, Antibiotika Behandlung und Eisenmangel. Über die Genregulation von Cpn als auch der Wirtzelle in der akuten und persistenten Infektion ist jedoch wenig bekannt. In dieser Arbeit wurde das Cpn Transkriptom als auch das von epithelialen Wirtszellen in der akuten und in der durch Eisenmangel induzierten Infektion untersucht. Mittels eines Algorithmuses für ‚selbstorganisierende Netzwerke’ (SOM) wurden signifikant regulierte Gene aufgrund ihres Expressionsprofiles in 12 Cluster gegliedert. Diese 12 Cluster wurden wiederum in die Klassen der ‘Frühen’ (engl.: ‘Early’), ‘Mittleren’ (engl.: ‘Mid’) und ‘Späten’ (engl.: ‘Late’) Gene eingeteilt. Diese Unterteilung lehnt sich an schon beschriebenen Genexpressionsstudien für Ctr an. Weiterhin wurde die neue Klasse der ‘Verspäteten’ (engl.: ‘Tardy’) Gene eingeführt. Diese hatten am Ende des Entwicklungszykluses ein kontinuierlich ansteigendes Expressionsprofil. Mit publizierten Proteinen aus chlamydialen Elementarkörperchen (EK) korrelierten vor allem Gene aus den ‘Späte’ jedoch nicht aus den ‘Verspätete’ Klassen. Gene dieser beiden Klassen müssen also eine unterschiedliche Rolle im EK Redifferenzierungsprozess spielen. Weiterhin waren überdurchschnittlich viele mRNA Transkripte aus der Klasse der ‘Verspäteten’ Gene in den EK vorhanden. Dies führte zu der Annahme, daß ein Teil der initiale Proteinexpression von stabilen mRNA-Transkripten aus der infektiösen EK Form erfolgt. Anschließend wurden, Gene, die für spezifische Signalwege und physiologische Funktionen von Cpn kodieren, basierend auf der ‚Gene Ontology’ während des Entwicklungszykluses untersucht. Weiterhin wurde das Transkriptom von Cpn in der Persistenz mit dem Transkriptom der akuten Infektion verglichen. Unter Persistenzbedingungen zeigte Cpn ein verändertes Expressionsprofil. Hochregulierte Gene konnten akuten Clustern am Anfang des akuten Entwicklungszykluses und herunterregulierte Gene Clustern am Ende des akuten Entwicklungszykluses zugeordnet werden konnten. Dies legt nahe, daß es sich bei der Persistenz nicht um ein neues Transkriptionsprofil handelt, sondern eher um eine Arretierung des Transkriptomes in der Mitte des akuten Entwicklungszykluses. Weiterhin zeigten konvergent und divergent orientierte Gene am Anfang des Zyklus bevorzugt ein antagonistisches Expressionsprofil, während in Reihe angeordnete (‘tandem’) Gene ein korreliertes Expressionsprofil aufwiesen. Bei den mit dem Cpn Stamm CWL029 durchgeführten Mikroarrayexperimenten konnten auch Expressionswerte für einige ausschließlich für die Stämme AR39 und J138 beschriebenen Gene gemessen werden. Ein Vergleich mittels BLAST zeigte, daß diese Gene auch im CWL029 Genom kodiert sind. Dazu gehörten mehrere Gene, welche konvergent zu ihren Nachbargenen orientiert waren und eine Sequenzüberlappung mit diesen aufwiesen. Darunter fielen parB, welches eine Rolle für die Trennung der DNA in der Zellteilung spielt, und rpsD, ein alternativer Sigma-Faktor, der für die Transkription in der späten Phase des Entwicklungszyklus verantwortlich ist. Für beide Genpaare konnte in der frühen akuten und in der persistenten Infektion ein antagonistisches Expressionsprofil beobachtet werden, wie es bei konvergent orientierten Genpaaren überwiegt. Mittels quantitativer qRT-PCR wurde für rpsD gezeigt, dass vollständige mRNA-Fragmente in der Persistenz herunterreguliert, während kurze mRNA-Fragmente hochreguliert waren. Als Erklärung für diesen Effekt dient ein Modell, welches auf einer Kollision der RNA Polymerasen basiert. Dieser Sigma-Faktor unabhängige Mechanismus ist in der Literatur als ‘Transkriptionelle Interferenz’ bekannt und führt so trotz einer Promoteraktivierung zu einer verminderten Anzahl an vollständigen mRNA Transkripten. Die Herunterregulation von RpsD auf Proteinebene in der Cpn Persistenz ist beschrieben worden. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde das Wirtszelltranskriptom in der akuten und persistenten Infektion untersucht.Infektion mit Cpn führte zu einer Hochregulation von relB, welches an alternativen NF-KB Signalwegen beteiligt ist und das anti-apoptotische Potential verstärkt. Weiterhin waren Gene differentiell exprimiert, welche für die Zellzyklusproteine Cyclin-G2 und Cyclin-D1 sowie Inhibitoren von CDK4 kodieren. Zusammenfassend gibt diese Arbeit gibt einen Einblick sowohl in das Transkriptom des Pathogens als auch der Wirtszelle während der akuten und durch Eisenmangel ausgelösten persistenten Infektion als auch potentiellen Mechanismen zu Persistenzentstehung auf der Ebene der Genregulation. KW - Chlamydia pneumoniae KW - Infektion KW - Transkriptom KW - Eisenmangel KW - Transkiptom KW - Eisen KW - Chlamydien KW - Chlamydophila pneumoniae KW - Mikroarray KW - transkiptome KW - iron KW - Chlamydia KW - Chlamydophila pneumoniae KW - microarray Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-21415 ER - TY - THES A1 - Müller, Claudia Maria T1 - Studies on the Role of Histone-like Proteins in Gene Regulation in Uropathogenic Escherichia coli Isolate 536 T1 - Untersuchungen zur Rolle von Histon-ähnlichen Proteinen bei der Genregulation im Uropathogenen Escherichia coli Isolat 536 N2 - In this study, the role of histone-like proteins in gene regulation in uropathogenic Escherichia coli isolate 536 was monitored. The histone-like nucleoid structuring protein H-NS is a global regulator in Escherichia coli that has been intensively studied in non-pathogenic strains. No comprehensive study on the role of H-NS and it’s homolog StpA on gene expression in a pathogenic E. coli strain has been carried out so far. Moreover, we identified a third, so far uncharacterized member of the H-NS-like protein family in uropathogenic E. coli isolate 536, which was designated Hlp (H-NS-like protein). Hlp is a 134-amino acid protein, which shares 58 % sequence identity with H-NS. The gene coding for the Hlp protein, hlp, is found in several uropathogenic E. coli variants, but not in non-pathogenic E. coli K-12. In UPEC strains 536 and CFT073, Hlp is encoded on a possibly horizontally acquired 23-kb genomic region inserted into the serU locus. Studies on hlp transcription revealed, that the gene is transcribed monocistronically from a single promoter and that expression is repressed by H-NS. Purified Hlp protein was binding to its own and to the hns promoter, thereby mediating negative auto- and crossregulation. Furthermore, Hlp and H-NS were directly interacting, resulting in the formation of stable heteromers. Complementation studies with hns mutant strains in a K-12 background revealed that the Hlp protein had in vivo activity, being able to complement the lack of H-NS in terms of motility, growth, and repression of the proU, bgl, and clyA genes. When analyzing the role of the histone-like proteins in expression of virulence-associated genes by using DNA arrays and classical phenotypic assays, most of the observed effects were mediated by the H-NS protein alone. Expression profiling revealed that transcript level of more than 500 genes was affected by an hns mutation, resulting in increased expression of alpha-hemolysin, fimbriae and iron-uptake systems, as well as genes involved in stress adaptation. Furthermore, several other putative virulence factors were found to be part of the H-NS regulon. On the other hand, no effect of StpA alone was observed. An hns stpA double mutant, however, exhibited a distinct gene expression pattern that differed in great parts from that of the hns single mutant. This suggests a direct interaction between the two homologs and the existence of distinct regulons of H-NS and an H-NS/StpA heteromeric complex. Although the H-NS protein has – either as homomer or in complex with StpA – a marked impact on gene expression in pathogenic E. coli strains, its effect on urovirulence is ambiguous. At a high infection dose, hns mutants accelerate lethality in murine UTI and sepsis models relative to the wild type, probably due to increased production of alpha-hemolysin. At lower infectious dose, however, mutants lacking H-NS are attenuated through their impaired growth rate, which can only partially be compensated by the higher expression of numerous virulence factors. As seen with StpA, an hlp single mutant did not exhibit a notable phenotype under standard growth conditions. A severe growth defect of hns hlp double mutants at low temperatures, however, suggests a biological relevance of H-NS/Hlp heteromers under certain circumstances. Furthermore, these mutants expressed more capsular polysaccharide and curli fimbriae, thereby indicating a distinct role of H-NS and Hlp in regulation of these surface structures. The H-NS paralogs Hlp and StpA also modulated H-NS-mediated regulation of fimbrial adhesins, and are oppositely required for normal growth at low or high temperatures, respectively. Finally, expression levels of the three histone-like proteins H-NS, StpA and Hlp itself varied with different temperatures, thereby suggesting a flexible composition of the nucleoid-associated protein pool. Hence, we propose that the biological role of Hlp and StpA does not rely on a distinct function of the single protein, but rather on their interaction with the global regulator H-NS. N2 - In dieser Studie wurde die Rolle von Histon-ähnlichen Proteinen bei der Genregulation im uropathogenen Escherichia coli (UPEC) Isolat 536 untersucht. Das Histon-ähnliche Protein H-NS (engl. histone-like nucleoid structuring protein) ist ein globaler Regulator in E. coli, der in apathogenen Stämmen eingehend untersucht worden ist. Im Gegensatz dazu liegen noch keine umfassenden Studien zur Rolle von H-NS und des homologen Proteins StpA in einem pathogenen E. coli Stamm vor. Zudem konnten wir ein drittes, bis jetzt noch nicht charakterisiertes Mitglied der Familie von H-NS-ähnlichen Protein im uropathogenen E. coli Isolat 536 identifizieren, das Hlp benannt wurde (für H-NS-like protein). Hlp ist ein aus 134 Aminosäuren bestehendes Protein, dessen Sequenz zu 58 % identisch mit der des H-NS Proteins ist. Das Gen, das für das Hlp Protein kodiert, hlp, konnte in zahlreichen uropathogenen und Fäkalisolaten nachgewiesen werden, jedoch nicht im apathogenen E. coli K-12. In den UPEC Isolaten 536 und CFT073 ist das hlp Gen auf einer 23-kb großen genomischen Insel lokalisiert, die in den serU Lokus inseriert ist und möglicherweise über horizontalen Gentransfer erworben wurde. Untersuchungen zur Transkription des hlp Gens ergaben, dass das Gen monocistronisch von einem einzigen Promotor transkribiert, und dessen Expression durch H-NS reprimiert wird. Rekombinantes Hlp Protein war befähigt, sowohl an seinen eigenen, als auch an den hns Promotor zu binden, was zu negativer Auto- und Kreuzregulation führte. Zudem konnte gezeigt werden, dass Hlp und H-NS direkt miteinander interagieren, was zu stabilen Heteromeren führte. Komplementierungsstudien in hns Mutanten einiger K-12 Stämme ergaben, dass das Hlp Protein über in vivo Aktivität verfügt, was es befähigte, die Abwesenheit von H-NS bei zahlreichen Phänotypen wie z.B. Motilität, Wachstum, und Repression der proU, bgl und clyA Gene zu komplementieren. Die Rolle der Histon-ähnlichen Proteine bei der Expression von Virulenz-assoziierten Genen wurde mittels DNA Array Technologie, sowie klassischen phänotypischen Tests analysiert. Dabei wurden die meisten der beobachteten Effekte einzig durch das H-NS Protein bedingt. Die Expressionsstudien ergaben, dass über 500 Gene von einer hns Mutation beeinflusst wurden, was eine verstärkte Expression des alpha-Hämolysins, mehrerer Fimbrien und Eisenaufnahmesysteme sowie von Genen, die in Stress-Antworten involviert sind, bedingte. Des Weiteren konnten zahlreiche putative Virulenzfaktoren dem H-NS-Regulon zugeordnet werden. Andererseits konnten keine Effekt durch StpA beobachtet werden. Eine hns stpA Doppelmutante wies jedoch ein eindeutiges Expressionsmuster auf, das in großen Teilen von dem der hns Einzelmutante abwich. Dies legt nahe, dass beide Proteine direkt miteinander interagieren, was das Auftreten von unterschiedlichen Regulons zur Folge hat, die entweder durch H-NS oder einem heteromeren H-NS/StpA Komplex beeinflusst werden. Obwohl das H-NS Protein – entweder als Homomer oder als Komplex mit StpA – einen sehr starken Einfluss auf die Genexpression pathogener E. coli Stämme nimmt, bleiben dessen Effekte auf die tatsächliche Virulenz im Urogenitaltrakt unklar. In einem experimentellen Mausmodell der aufsteigenden Harnwegsinfektion bewirken hns Mutanten, in hoher Dosis verabreicht, eine rasch eintretende Lethalität, was vermutlich der verstärkten Produktion von alpha-Hämolysin zuzuschreiben ist. In verringerter Dosis verabreicht, sind diese Mutanten durch ihre langsameren Wachstumsraten jedoch attenuiert, was nur teilweise durch die vestärkte Expression zahlreicher Virulenzfaktoren kompensiert werden kann. Wie schon bei StpA beobachtet, besitzt eine hlp Mutante keinen offensichtlichen Phänotyp, zumindest unter Standard-Wachstumsbedingungen. Jedoch macht sich in hns hlp Doppelmutanten ein starker Wachstumsdefekt bei erniedrigten Temperaturen bemerkbar, was eine biologische Relevanz von H-NS/Hlp Heteromeren unter bestimmten Bedingungen nahe legt. Des Weiteren exprimierten diese Mutanten erhöhte Mengen an Kapsel-Polysacchariden und Curli-Adhesin, was als Indiz für eine besondere Rolle für H NS und Hlp bei der Regulation dieser Oberflächenstrukturen dienen kann. Zudem hatten beide H-NS-Paraloge Hlp und StpA einen modulierenden Effekt bei der H-NS-vermittelten Regulation weiterer Fimbrien-Adhesine und waren in gegenläufigen Maßen für normales Wachstum bei erhöhten bzw. erniedrigten Temperaturen notwendig. Zuletzt variierte das Expressionsniveau der drei Histon-ähnlichen Proteine H-NS, StpA und Hlp bei unterschiedlichen Temperaturen, was auf eine flexible Zusammensetzung verfügbarer Nucleoid-assoziierter Proteine hindeutet. Dies alles impliziert, dass die biologische Relevanz von Hlp, und StpA gleichermaßen, nicht auf gesonderten Funktionen des einzelnen Proteins beruht, sondern vielmehr auf deren Interaktionen mit dem globalen Regulatorprotein H-NS. KW - Escherichia coli KW - Pathogenität KW - Histone-like proteins KW - Genregulation KW - Histon-ähnliche Proteine KW - H-NS KW - StpA KW - Genregulation KW - UPECs KW - Histone-like proteins KW - H-NS KW - StpA KW - Gene regulation KW - UPECs Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-17617 ER - TY - THES A1 - Wu, Rongxue T1 - Integrins and SPARC : potential implications for cardiac remodeling N2 - Der enorme Umbau des Herzgewebes, wie man ihn nach Drucküberlastung des Ventrikels oder MyokardInfarkt beobachten kann, gilt als eine der kausalen Ursachen des Herzversagens. Die Veränderungen in der Architektur des Herzens beeinflussen die mechanischen Eigenschaften des Herzmuskels, begründet sind sie jedoch in Anpassungsprozessen auf der zellulären Ebene vor allem in einer Modulation der Expression bestimmter Gene. Gemeinsam mit Integrinen, den Transmembran-Rezeptoren, welche die extrazelluläre Umgebung mit dem intrazellulären Zytoskelett verbinden, gehören Proteine der extrazellulären Matrix (ECM) und matrizelluläre Proteine zu den Schlüsselkomponenten, die den Umbauprozess im Herzen steuern. Aus diesen Gründen hatte diese Doktorarbeit zum Ziel, die Rolle der Integrine für die Regulation der Genexpression und die Leistungsfähigkeit des Herzmuskels während der durch Drucküberlastung oder myokardialen Infarkt (MI) hervorgerufenen Wundheilungsprozesse zu analysieren. Um die Beteiligung von Integrin Beta 1 zu untersuchen, wurde ein experimentelles Modell der Drucküberlastung im Mausherzen (aortic banding; Konstriktion der Aorta; AB) eingesetzt, wobei Mäuse mit einer konditionalen, Herz-spezifischen Deletion des Integrin Beta 1 Gens untersucht wurden. Ein besonderes Augenmerk wurde dabei auf die physiologischen Unterschiede und eine veränderte Genexpression im gestressten Herzen in An- oder Abwesenheit von Integrin Beta 1 gelegt. Interessanterweise wurden die Mäuse, welche eine Kombination aus Integrin knock-out Allel und dem Kardiomyozyten-spezifischen konditionalen knock-out Allel von Integrin Beta 1 aufwiesen im normalen Mendelschen Verhältnis geboren und wuchsen normal auf. Obwohl diese Tiere immer noch geringe Mengen von Integrin Beta 1 in ihrem Herzen aufwiesen (exprimiert von nicht-Myozyten), besaßen diese Mäuse eine veränderte Herzfunktion und waren sehr sensitiv gegenüber AB. Im Gegensatz zu der kompensatorischen hypertrophischen Reaktion, die in Wildtyp Mäusen zu beobachten war, zeigte sich in den Integrin Beta 1–defizienten Mausherzen kein Gewebeumbau. Auch die erhöhte Expression von verschiedenen ECM Proteinen, insbesondere die verstärkte Expression des matrizellulären Proteins SPARC, unterblieb nach AB in den Integrin Beta 1–defizienten Tieren. Interessanterweise konnte auch eine transiente Erhöhung der SPARC mRNA während der Umbauprozesse im Herzen in Folge von myokardialem Infarkt (MI) mittels cDNA Makroarrays festgestellt werden. In der Tat fanden sich größere Mengen von SPARC bereits 2 Tage (~2,5-fach erhöht), 7 Tage (~4-fach erhöht) und 1 Monat (~2-fach erhöht) nach MI, während ein spezifischer Inhibitor der Integrin alpha v Untereinheit diese Hochregulation von SPARC in vivo verhinderte. Immunfluoreszenz Untersuchungen von Herzgewebe verdeutlichten, dass sich die erhöhte Expression von SPARC auf das Infarktareal beschränkte, dass die Expression von SPARC nach einer anfänglichen Erhöhung im Verlauf von 1 Monaten wieder auf das Anfangsniveau zurückging und dass die verstärkte Expression von der Einwanderung von Fibroblasten in das ischämische Herzgewebe begleitet war. In vitro stimulierten die Wachstumsfaktoren TGF-Beta 1 und PDGF-BB die Expression von SPARC durch Fibroblasten. Wie sich an Hand von ELISA und Western Blot Untersuchungen feststellen ließ, war die Inhibition von Integrin Beta v nicht in der Lage, die durch TGF-Beta 1 oder PDGF induzierte Sekretion von SPARC zu beeinflussen. Jedoch zeigte sich, dass Vitronektin, ein Ligand von Integrin alpha v, sowohl die Sekretion von TGF-Beta 1 als auch von PDGF-BB durch Kardiomyozyten induzierte und diese Reaktion wurde durch den Integrin alpha v Inhibitor komplett unterdrückt. In funktioneller Hinsicht wirkte SPARC auf die durch ECM Proteine induzierte Migration von Fibroblasten ein, so dass man davon ausgehen kann, dass die lokale Freisetzung von SPARC nach myokardialem Infarkt zur Wundheilung im Herzen beiträgt. Zusammenfassend läßt die Kombination der in vivo und in vitro erhobenen experimentellen Daten den Schluss zu, dass mehrere Integrin Untereinheiten eine entscheidende Rolle während der Gewebeumbildung im Herzen spielen. Integrin-abhängige Genexpressionsereignisse wie beispielsweise die erhöhte Expression von SPARC nach MI sind entscheidend an der Koordination der Wundheilung beteiligt. Diese Prozesse scheinen auf einer komplexen Wechselwirkung und Kommunikation zwischen verschiedenen Zelltypen wie Kardiomyozyten und Fibroblasten zu beruhen, um lokal begrenzt eine Heilung und Vernarbung des verletzten Gewebes zu regulieren. Die Aufklärung des fein abgestimmten Wechselspiels zwischen Integrinen matrizellulären Proteinen wie SPARC und Wachstumsfaktoren wird sicherlich zu einem besseren und klinisch nutzbarem Verständnis der molekularen Mechanismen des Gewebeumbaus im Herzen beitragen. N2 - The massive remodeling of the heart tissue, as observed in response to pressure overload or myocardial infarction, is considered to play a causative role in the development of heart failure. Alterations in the heart architecture clearly affect the mechanical properties of the heart muscle, but they are rooted in changes at the cellular level including modulation of gene expression. Together with integrins, the transmembrane receptors linking the extracellular environment to the cytoskeleton, extracellular matrix (ECM) proteins and matricellular proteins are key components of the remodeling process in the heart. Therefore, this thesis was aimed at analysing the role of integrins in the regulation of gene expression and heart muscle performance during cardiac wound repair induced by pressure overload or myocardial infarction (MI). To investigate the contribution of integrin Beta 1, we characterised the response of mice with a conditional, cardiac-specific deletion of the integrin Beta 1 gene in an experimental model of pressure overload by aortic banding (AB). In particular, we measured physiological alterations and gene expression events in the stressed heart in the presence or absence of integrin Beta 1. Interestingly, mice containing a knock-out allele and the ventricular myocyte-specific conditional allele of the integrin Beta 1 gene were born and grew up to adulthood. Though these animals still exhibited minor amounts of integrin Beta1 in the heart (expressed by non-myocytes), these mice displayed abnormal cardiac function and were highly sensitive to AB. Whereas a compensatory hypertrophic response to pressure overload was observed in wildtype mice, the integrin Beta 1-deficient mice were not able to undergo heart tissue remodeling. Furthermore, ECM gene expression was altered and, in particular, the increased expression of the matricellular protein SPARC after AB was abolished in integrin Beta 1–deficient mice. Interestingly, we also found a transient upregulation of SPARC mRNA during heart remodeling after MI using cDNA macroarrays. Indeed, increased SPARC protein levels were observed starting at day 2 (2.55±0.21fold, p<0.01), day 7 (3.72±0.28 fold, p<0.01) and 1 month (1.9±0.16 fold, p<0.01) after MI, which could be abolished by using an integrin alpha v inhibitor in vivo. Immunofluorescence analysis of heart tissue demonstrated that the increased SPARC expression was confined to the infarcted area and occurred together with the influx of fibroblasts into the heart. In vitro, either TGF-Beta 1 or PDGF-BB stimulated SPARC expression by fibroblasts. Inhibition of integrin alpha v did not interfere with TGF-Beta1 or PDGF induced SPARC secretion as determined by ELISA assays or Western blot. However, secretion of TGF-Beta1 and PDGF-BB by cardiomyocytes was induced by vitronectin, a ligand of integrin alpha v, and this response was blocked by the integrin alpga v inhibitor. Functionally, SPARC modulated the migratory response of fibroblasts towards ECM proteins suggesting that the local deposition of SPARC following MI contributes to scar formation. Taken together, our combined in vivo and in vitro data demonstrate that several integrin subunits play critical roles during tissue remodeling in the injured heart. Integrin-dependent gene expression events such as the upregulation of SPARC following MI are critical to orchestrate the healing response. These processes appear to involve complex cross-talk between different cell types such as cardiomyocytes and fibroblasts to allow for locally confined scar formation. The elucidation of the sophisticated interplay between integrins, matricellular proteins such as SPARC, and growth factors will undoubtedly provide us with a better and clinically useful understanding of the molecular mechanisms governing heart remodeling. KW - Integrine KW - Genexpression KW - Herzmuskel KW - Grundsubstanz KW - Extracellular matrix KW - gene expression KW - cardiac remodeling KW - migration Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-17531 ER - TY - THES A1 - Varadarajulu, Jeeva T1 - Integrin alpha(v) and Focal adhesion kinase - promising targets to limit smooth muscle cell migration N2 - Die Prävention einer Restenose nach PTCA ist eines der wichtigsten Ziele für Forscher und Kliniker. Etwa 1,5 Millionen Interventionen werden weltweit jährlich durchgeführt und mit Hilfe von Stentimplantationen können die meisten Patienten erfolgreich behandelt werden. Jedoch kommt es in bis zu 60 % der Fälle zu einer Restenosierung des behandelten Gefässes innerhalb von etwa 6 Monaten. Für die Entwicklung der Neointima, Hauptursache der Restenose, sind Wanderung glatter Gefässmuskelzellen (GMZ) und Ablagerungen von Proteinen der extrazellulären Matrix (EZM) verantwortlich. Signalkaskaden, die über Integrin Rezeptoren vermittelt werden, spielen in der Migration von GMZ eine zentrale Rolle. Viele Integrine binden über eine spezifische Aminosäuresequenz, die sogenannte RGD Sequenz, die in verschiedenen EZM Proteinen und in auf Zelloberflächen gebundenen Immunglobulinen vorkommt. Bisher konnte von verschiedenen Integrinantagonisten, wie Antikörpern, zyklischen Peptiden, Peptidomimetika und Nicht-Peptiden, gezeigt werden, dass die die pathologische Reaktion vermindern können, was auf die Bedeutung der Integrin vermittelten Signalkaskaden in der GMZ Migration hinweist. Wir konnten zeigen, dass die Wanderung von GMZ sowohl mit einem pharmakologischen Inhibitor, wie auch durch die endogene Überexpression eines FAK Inhibitors, der über ein AAV Vektorsystem übertragen wurde, gehemmt werden konnte. So stellt die Blockade der Integrin vermittelten Signalkaskaden ein vielversprechendes Ziel für die Inhibition der Restenose nach PTCA dar. Im ersten Teil der Arbeit konnten wir nach Stimulation von humanen GMZ mit Vitronektin (VN) eine verstärkte Tyrosinphosphorylierung (PTyr) verschiedener zellulärer Proteine nachweisen. Dabei zeigte sich eine besonders signifikante Phosphorylierung eines Proteins, das mittels Immunpräzipitation als “focal adhesion kinase” (FAK) identifiziert wurde. Die erhöhte PTyr zeigte sich auch am Tyrosinrest FAK Tyr-397, der Autophosphorylierungsstelle der Kinase. Die erhöhte PTyr von FAK war abhängig von der Stimulation durch VN und nicht zu beobachten, wenn die GMZ auf Poly-L-Lysin ohne spezifische Rezeptor Ligand Interaktion adhärierten. Mit Hilfe eines Integrin V Inhibitors konnte diese rezeptorvermittelte Aktivierung in einer dosisabhängigen Weise verhindert werden. Die Inhibition der durch VN stimulierten Migration (Haptotaxis) mit Hilfe des V Inhibitors korrelierte mit der Reduktion der Aktivierung Integrin vermittelter Signalwege, im Besonderen der PTyr von FAK. Interessanterweise konnte die Blockade von Integrin V nicht nur die durch VN stimulierte Haptotaxis, sondern auch die durch Wachstumsfaktoren induzierte Chemotaxis hemmen. Die Migrationsrate wurde mit Hilfe eines modifizierten Boyden-Migrationskammer Experiments ermittelt, das ein in vitro Modell zur Untersuchung von Zellwanderung darstellt. Der V Inhibitor hemmte auch die Invasion der GMZ in eine Matrigel Matrix und die Sekretion der Matrixmetalloproteinase 2. Eine Apoptose wurde bei den verwendeten Konzentrationen nicht induziert. FAK stellt ein wichtiges Schlüsselprotein in vielen zellulären Mechanismen dar. So konnte die Beteiligung von FAK in der Regulation der Zellmigration an verschiedenen Zellarten gezeigt werden. Die Überexpression von FRNK, der C-terminalen Domäne von FAK, ist in der Lage die in vitro Migration von GMZ wie auch die Neointimabildung in einem Schweinemodell zur Entwicklung der Restenose zu verhindern. FAK stellt somit ein vielversprechendes Ziel für die Inhibition der Restenoseentwicklung nach PTCA dar. Der letzte Teil der Arbeit konzentrierte sich auf die Identifikation von Bindungspartnern der N-terminalen Domäne von FAK mit Hilfe eines bakteriellen „two hybrid“ Systems. Es wurde als ein möglicher Bindungspartner ein 17,9 kDa grosses Protein gefunden. Das humane Homolog ist als AGS4 bezeichnet und stellt einen GTPase Aktivator dar. Es zeigte sich, dass es in der Lage ist, mit der N-terminalen Domäne von FAK zu interagieren, und dass es stark in hämatopoetischen Zellen exprimiert wird. Zusammenfassend kann man sagen, dass unsere Ergebnisse FAK als ein vielversprechendes Ziel für die Inhibition der GMZ Migration erscheinen lassen. Das Vorliegen verschiedener induzierter Signalwege kann durch die Rolle der EZM Proteine und der Wachstumsfaktoren in der Zellmigration erklärt werden. Das Ziel dieser Studie war die Signalkaskaden, die zu einer GMZ Migration und somit zu einer Restenose führen, zu unterbrechen. Die Ergebnisse zeigen, dass V Integrine und Signalkaskaden, die FAK vermittelt sind, wichtig für die Zellmigration sind. Die Unterbrechung dieser FAK vermittelten Signalwege, sei es durch einen pharmakologischen Inhibitor oder durch die Überexpression von FRNK führte zu einer Inhibition der Migration. N2 - The prevention of restenosis after percutaneous coronary intervention is a major task for researchers and clinicians in cardiovascular pharmacology. Nearly 1.5 million PTCA are performed every year worldwide and, due to the implantation of stents, most of the cases can be treated successfully. 60% of those patients develop restenosis within 6 months. SMC migration and ECM deposition are known to be responsible for neointima formation. Among many processes, integrin initiated signalling events play a central role in SMC migration. Many integrins recognize a specific RGD sequence which is present in several ECM proteins and cell surface immunoglobulin super family molecules. Until now, there are various integrin antagonists such as antibodies, cyclic peptides, peptidomimetics, and non-peptides have been shown to interfere with such pathological situations indicating the importance of integrin initiated signalling pathways in SMC migration. Therefore, in this study SMC migration induced by ECM proteins was inhibited either using pharmacological inhibitor or by overexpressing the endogenous inhibitor of FAK by AAV vector system. In the first part of the thesis, the effect of integrin-ligand stimulation on hCASMCs was studied. The tyrosine phosphorylation of many cellular proteins was observed from serum starved hCASMCs replated on VN but not on PL coated plates. The major tyrosine phosphorylated protein was identified as FAK by immunoprecipitation and also phosphorylation was found at Tyr 397, the autophosphorylation site of FAK. Further, VN induced the dose dependent migration of hCASMCs in haptotaxis assay. The integrin v inhibitor was used to block those ECM stimulated integrin signalling pathways and cell migration. It inhibited the ECM stimulated tyrosine phosphorylation in a dose dependent manner. Interestingly, specific potent antagonism of integrin v abrogated both ECM induced haptotaxis and growth factor induced chemotaxis. The inhibition of migration is consistent with the replating assay results that show interference with integrin induced signalling pathways particularly the FAK tyrosine phosphorylation. The integrin v inhibitor also is able to interfere with hCASMC invasion through matrigel by reducing MMP-2 secretion. Importantly, integrin v inhibitor did not induce the apoptosis in hCASMCs. FAK is a key player in many cellular events and its involvement in cell migration was extensively studied in various cell types. The present study explored the function of FAK in hCASMC migration by overexpression of FRNK, the C-terminal domain of FAK. Overexpression of FRNK inhibited the in vitro SMC migration as well as the neointima formation in a porcine restenosis model in vivo. The last part of this thesis focused on the identification of putative binding partners for the N-terminal domain of FAK by bacterial two-hybrid screen. One of the interesting binding partners was a putative protein of 17.9 kDa. Its human homolog is AGS4, which acts as a GTPase activator. The preliminary results revealed that it is able to interact with N-FAK domain and its expression is high in haematopoietic cells. Taken together the above results suggest that integrin v and FAK are promising targets for inhibition of SMC migration. Disruption of FAK-mediated signalling pathways by a pharmacological inhibitor or by overexpression of FRNK, which acts as dominant-negative regulator, resulted in decreased migration of SMCs and thus can lead to reduction of neointima formation. KW - Restenose KW - Blutgefäß KW - Glatte Muskulatur KW - Integrine KW - Signalkette KW - Integrin KW - AAV vector KW - restenosis KW - FAK KW - ECM KW - Integrin KW - AAV vector KW - restenosis KW - FAK KW - EZM Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-17484 ER - TY - THES A1 - Schneider, György T1 - Studies on the architecture and on transferability of pathogenicity islands of uropathogenic Escherichia coli strain 536 T1 - Untersuchungen zur genetischen Struktur und Übertragbarkeit von Pathogenitätsinseln des uropathogenen Escherichia coli Stammes 536 N2 - The establishment of genomic approaches including the sequence determination of complete bacterial genomes started a new era in microbiological research. Since then more than two hundred prokaryotic and eukaryotic genomes have been completely sequenced, and there are additional complete genome projects including different bacterial species and strains in progress (http://www.tigr.org, http://www.sanger.ac.uk). The continously growing amount of bacterial DNA sequence information gives us also the possibility to gain deeper insight into bacterial pathogenesis. With the help of comparative genomics, microbiological research can focus on those DNA sequences that are present in pathogenic bacteria but are absent in non-pathogenic strains. With this knowledge and with the help of molecular biological methods such as PCR,DNA-chip technology, subtractive hybridisation, transcriptomics and proteomics we can analyse in detail what makes a particular bacterial strain pathogenic. This knowledge also gives us the possibility to develop new vaccines, therapeutic approaches or diagnostic tools. The aim of this work was the structural and functional analysis of DNA regions of uropathogenic Escherichia coli strain 536 that belong to the flexible E. coli gene pool. The first part of this thesis focused on the identification and structural characterisation of pathogenicity island V of strain 536 (PAI V536). PAI V536 is integrated at the pheV tRNA gene at 64 minutes of the E. coli K-12 chromosome. In addition to the intact pheV tRNA gene, a truncated copy ('pheV) that represents the last 22 bp of this gene’s 3'-end was identified 49 kb downstream of pheV on PAI V536. The analysis of the DNA sequence flanked by pheV and 'pheV revealed characteristics that are typical of PAIs. This DNA region exhibits homology to IS-elements and prophages and also comprises determinants coding for the Pix fimbriae, a phosphoglycerate transport system, an autotransporter, as well as for hypothetical proteins. Downstream of 'pheV, the K15 capsule determinant (kpsK15) of this strain is located. Structural analysis of the 20-kb kpsK15 locus revealed a so far unknown genetic organisation indicative of recombination events between a group 2 and group 3 capsule gene cluster. Downstream of the capsule determinant, the genes encoding a type II secretion system (general secretion pathway -GSP) are located on PAI V536. The K15 capsule locus was functionally characterized. Specific inactivation of each of the regions 1 to 3 of the kpsK15 gene cluster, and the use of a K15 capsule-specific antiserum demonstrated that this determinant is the functional K15 capsule locus of strain 536. It has been shown in an experimental murine model of ascending urinary tract infection with suckling mice that the K15 capsule contributes to urovirulence. Interestingly, the K15 capsule is not involved in serum resistance of strain 536. Inactivation of the PAI V536-encoded type II secretion system excluded a role of this general secretion pathway for capsule biosynthesis and virulence of strain 536 in the murine ascending urinary tract infection model. In the second part of the thesis, the transferability of PAIs was further investigated. Using PAI II536 as a model, mobilisation of this island from strain 536 into suitable recipient strains was investigated. For this purpose, an antibiotic resistance cassette, the R6K origin of replication as well as plasmid pGP704 carrying the mobilisation region of plasmid RP4 have been inserted into PAI II536. Transformation with the helper plasmid RP4, resulted a derivative of strain 536 that was used as a donor for conjugation experiments, while for recipient the pir + laboratory strain SY327 was used. After deletion the circularised PAI II536 was mobilised with the help of the conjugative helper plasmid (RP4) into the recipient laboratory strain SY327. The frequency of this event was about 10-8. It was also demonstrated that in the transconjugant strains the mobilized PAI II536 could be permanently present as a circular form and also can be integrated into the chromosome at the same chromosomal insertion site (leuX) as in the donor strain 536. Furthermore, after mobilisation and chromosomal integration of PAI II536 it was possible to remobilise this PAI back to a PAI II536-negative derivative of strain 536. The results obtained in this thesis increase our knowledge of the structure and function of a pathogenicity island of uropathogenic E. coli strain 536 and shed some light on the mechanisms contributing to genome plasticity and evolution of pathogenic E. coli variants. N2 - Mit der Einführung von Genomanalytik einschließlich der Sequenzbestimmung bakterieller Genome, startete eine neue Ära in der mikrobiologischen Forschung. Seit Beginn dieser Ära sind mehr als 200 prokaryotische und eukaryotische Genome komplett sequenziert worden. Weitere Genomanalysen über verschiedene Bakterienspezies und Stämme sind in Arbeit(http://www.tigr.org, http://www.sanger.ac.uk). Durch die stetig anwachsende Menge an Informationen über bakterielle DNA Sequenzen, sind wir in der Lage, einen tieferen Einblick in die bakterielle Pathogenität zu bekommen. Mittels vergleichender Genomanalyse kann sich die mikrobiologische Forschung auf bestimmte DNA Sequenzen konzentrieren, welche in pathogenen Stämmen vorhanden sind, in apathogenen Stämmen aber fehlen. Mit diesem Wissen und durch molekularbiologische Methoden wie Polymerase Kettenreaktion, DNA-Chip- Technologie, Subtraktiver Hybridisierung, Transkriptom- und Proteom-Analyse können wir im Detail untersuchen, welche Faktoren für die Pathogenität eines speziellen Bakterienstammes verantwortlich sind. Diese Erkenntnisse geben uns auch die Möglichkeit neue Impfstoffe, therapeutische Verfahren und diagnostische Werkzeuge zu entwickeln. Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der Struktur und Funktion von DNA-Regionen des uropathogenen Escherichia coli Stammes 536, welche zum flexiblen Genpool von E. coli gehören. Der erste Teil dieser Arbeit konzentriert sich auf die Identifizierung und strukturelle Charakterisierung der Pathogenitätsinsel V des E. coli Stammes 536 (PAI V536). Die Integrationsstelle von PAI V536 liegt im E. coli K-12 Chromosom beim tRNA Gen pheV bei 64 Minuten. Zusätzlich zum intakten pheV tRNA Gen wurde auf der PAI V536 eine verkürzte Kopie des Gens (´pheV) 49 kb stromabwärts von pheV identifiziert. Diese Kopie repräsentiert die letzten 22 bp des 3´-Endes von pheV. Eine Analyse der von pheV und ´pheV eingeschlossenen DNASequenz zeigte typische Eigenschaften einer Pathogenitätsinsel. Die untersuchte DNA-Region besitzt Homologie zu IS-Elementen und Prophagen, außerdem beinhaltet sie Determinanten, die für Pix Fimbrien, ein Phosphoglycerat-Transportsystem, einen Autotransporter sowie für unbekannte Proteine kodieren können. Stromabwärts von ´pheV liegt die K15 Kapsel Determinante (kpsK15) des E. coli Stammes 536. Eine strukturelle Analyse des 20-kb kpsK15 Lokus zeigte eine bislang unbekannte genetische Anordnung, welche auf ein Rekombinationsereignis zwischen einem Gruppe 2 und einem Gruppe 3 Kapsel Gencluster hinweist. Stromabwärts der Kapsel Determinante sind auf der PAI V Gene lokalisiert, welche für ein Typ II Sekretionssystem („General Secretion Pathway“) kodieren. Der K15 Kapsel Lokus wurde funktional charakterisiert. Die spezifische Inaktivierung der Regionen 1 bis 3 des kpsK15 Genclusters und die Verwendung eines K15 Kapsel-spezifischen Antiserums zeigten, daß es sich tatsächlich um den funktionalen K15 Kapsellokus des E. coli Stammes 536 handelt. Im Tiermodel einer aufsteigenden Harnwegsinfektion bei neugeborenen und säugenden Mäusen, konnte gezeigt werden, daß die K15 Kapsel zur Urovirulenz beiträgt. Interessanterweise trägt die K15 Kapsel des E. coli Stammes 536 nicht zur Serumresistenz bei. Die Inaktivierung des in der PAI V536 kodierten Typ II Sekretionssystems schließt eine Rolle des „General Secretion Pathways“ bei der Kapsel Biosynthese und bei der Virulenz des E. coli Stammes 536 im Mausinfektionsmodel einer aufsteigenden Harnwegsinfektion aus. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Mobilisierung von Pathogenitätsinseln untersucht. PAI II536 wurde als Model genutzt, um den Transfer einer PAI von E. coli 536 in einen geeigneten Rezipientenstamm zu zeigen. Zu diesem Zweck wurde eine Antibiotikaresistenzkassette, der Replikationsstartpunkt RK6 und das Plasmid pGP704, das die Mobilisierungsregion des Plamides RP4 besitzt, in die PAI II536 inseriert. Nach Transformation des Helferplasmids RP4 wurde das daraus resultierende Derivat des E. coli Stammes 536 als Donor für Konjugationsexperimente mit dem Rezipientenstamm SY327 eingesetzt. Diese Mobilisierungsexperimente zeigten, daß die gesamte PAI II536 mit einer Frequenz von ungefähr 10-8 in einen Rezipientenstamm übertragen werden kann. In den Transkonjuganten konnte PAI II536 an derselben chromosomalen Insertionsstelle (leuX) wie im Donorstamm E. coli 536 inserieren. Weiterhin war es möglich PAI II536, nach Mobilisierung und chromosomaler Integration in einem Rezipientenstamm, wieder zurück in ein PAI II536 negatives Derivat von E. coli 536 zu transferieren. Die Ergebnisse dieser Arbeit erweitern unser Wissen hinsichtlich der Struktur und Funktion einer Pathogenitätsinsel des uropathogenen E. coli Stammes 536 und geben Aufschluß über den Mechanismus, der zur Genomplastizität und Evolution pathogener E. coli Varianten beiträgt. KW - Escherichia coli KW - Urogenitalsystem KW - Infektion KW - Pathogenität KW - Genanalyse KW - Escherichia coli KW - UTI KW - Pathogenitätsinseln KW - Kapsel KW - Übertrag KW - Escherichia coli KW - UTI KW - pathogenicity islands KW - capsule KW - transfer Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-14231 ER - TY - THES A1 - Trujillo Vargas, Claudia Milena T1 - Development of vaccines against allergic asthma using products derived from intracellular bacteria or helminths T1 - Entwicklung von Impstoffen gegen allergisches Asthma mit Hilfe von Komponenten aus intrazellulären Mikroorganismen und Helminthen N2 - Die „Hygiene Hypothese“ postuliert, dass der Kontakt mit Infektionserregern in der frühen Kindheit die Entwicklung von Th2-abhängigen allergischen Immunreaktionen verhindern kann, indem dadurch entweder eine vorrangig Th1-gerichtete Immunität etabliert wird oder alternativ die Bildung von regulatorischen T Zellen induziert wird. Basierend auf dieser Theorie zielte die vorliegende Arbeit darauf ab, Produkte von Mikroorganismen oder Würmern als mögliche Komponenten von Impfstoffen gegen Allergien zu testen. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden lebende BCG, Hitze abgetötete BCG (hk-BCG), CpG und PPD, die alle als Th1 Adjuvantien bekannt sind, auf ihre Effektivität getestet, allergisches Asthma in der Maus zu unterdrücken. Alle Adjuvantien konnten die durch Allergie induzierte Lungeneosinophilie, die Schleimproduktion in der Lunge und mit Ausnahme von PPD, die Lungenüberempfindlichkeit (AHR) unterdrücken, wenn sie zusammen mit OVA/alum verabreicht wurden. Die Lungeneosinophilie konnte jedoch nicht in IL-12 oder IFN-gamma defizienten Mäusen durch die Applikation von hk-BCG, CpG oder PPD verhindert werden. Interessanterweise waren jedoch lebende BCG in der Lage, die allergische Th2 Immunreaktion zu unterdrücken. Ebenso war die Wirkung von lebendem BCG unabhängig vom IL-10, TLR-2, TLR-4 oder MyD88 vermittelten Signalweg. Wurden Mäuse, die mit den verschiedenen Adjuvantien zusammen mit OVA/alum geimpft wurden, einer zweiten Runde OVA/alum Sensibilisierung unterzogen, so konnten nur lebende und hk-BCG die Entwicklung der Entzündung in der Lunge effektiv unterdrücken. Diese Wirkung konnte durch den adoptiven Transfer von CD4+ T Zellen auf naive Mäuse übertragen werden. Zusammenfassend zeigen diese Daten, daß lebende BCG am effektivsten, gefolgt von hk-BCG, CpG und schließlich PPD allergische Th2 Immunreaktionen unterdrücken konnten. Als nächstes wurde untersucht, ob eine Impfung mit dendritischen Zellen (DC) die Entwicklung von Th2 Zellen durch die Induktion von allergenspezifischen Th1 Zellen verhindern kann. Die Applikation von OVA-gepulsten aus dem Knochenmark stammenden-dendritischen Zellen (BM-DC), die mit CpG in vitro stimuliert wurden, konnten die Lungeneosinophilie und Entzündung in den Atemwegen in OVA-immunisierten Mäusen nicht reduzieren. OVA-spezifische IgG1 und IgE Antikörpermengen im Serum waren ebenfalls nicht vermindert. Versuche mit OVA-gepulsten Langerhans-zellen (LC) führten zu ähnlichen Ergebnissen wie mit BM-DC. Jedoch waren in Mäusen, die mit CpG/OVA gepulsten BM-DC behandelt wurden, deutlich erhöhte Werte an OVA-spezifischen IgG2a Antikörper im Serum nachzuweisen, was auf die Induktion einer allergenspezifischen Th1 Immunreaktion in vivo schließen läßt. Insgesamt zeigen die Ergebnisse aber, dass weder die Impfung mit OVA-gepulsten und CpG-stimulierten BM-DC noch mit OVA-gepulsten LC eine Verringerung der allergischen Th2 Immunreaktion in einem Mausmodell mit schwerem atopischem Asthma bewirkt. Im dritten Teil der Arbeit wurde NES, ein exkretorisches/sekretorisches Produkt des Helminthen Nippostrongylus brasiliensis, als ein neues mögliches Adjuvant zur Unterdrückung allergischer Reaktionen untersucht. Die Applikation von NES zusammen mit OVA/alum inhibierte deutlich die Entwicklung der Lungeneosinophilie, Becherzellmetaplasie und Schleimproduktion in der Lunge sowie die Entwicklung der AHR. Das verwendete NES enthielt geringe Mengen an LPS, die diese Wirkung erklären könnte. Allerdings war die Unterdrückung der Th2 Immunreaktion durch NES unabhängig von TLR-4 und konnte immer noch nachgewiesen werden, wenn LPS-depletiertes NES verwendet wurde. Schließlich konnte NES die OVA-induzierte Th2 Immunreaktion unabhängig von IL-10 und IFN-gamma reduzieren. Außerdem konnte der Verdau von NES mit Proteinase K oder eine Hitzebehandlung (kochen) den Th2-unterdrückenden Effekt nicht aufheben. Interessanterweise inhibierte NES in vivo eine OVA-spezifische Th2 Immunreaktion in Anwesenheit einer starken NES-spezifischen Th2 Reaktion. Zusammenfassend führen diese Ergebnisse zu dem Schluß, daß der Helminth N. brasiliensis Substanzen produziert, die die Entwicklung von allergischen Th2 Immunreaktionen beeinflussen. Diese Produkte und ihre Wirkmechanismen genauer zu charakterisieren, könnte zu sehr effektiven Adjuvantien führen, welche allergische Reaktionen unterdrücken könnten. Die Ergebnisse dieser Arbeit könnten zukünftig dazu beitragen, effiziente Impfungen zu entwickeln, die Menschen vor der Entwicklung von allergischen Immunreaktionen schützen. N2 - According to the hygiene hypothesis, the exposure to infectious agents in early childhood prevents the development of allergen-specific Th2 immune responses because it establishes Th1-based immunity or alternatively, induces the generation of T regulatory cells. Based on this theory, the present study pretended to identify promising microorganism-derived vaccine candidates against allergic asthma in the murine model. In the first part of this work, the efficacy of four different known Th1-inducing adjuvants, i.e. live BCG, heat-killed BCG, CpG and PPD, as components of vaccines aimed at inhibiting allergic asthma was compared. All the adjuvants were effective in inhibiting the development of allergen-induced airway eosinophilia, mucus production, and with the exception of PPD also airway hyperreactivity (AHR), when they were applied together with OVA/alum. Suppression of airway eosinophilia was not observed in IFN-gamma- or IL-12-deficient mice (hk-BCG, CpG-ODN and PPD). Interestingly, live BCG was still able to suppress allergen-induced Th2 responses in the absence of either IFN-gamma or IL-12. The effect of live BCG was also independent on IL-10-, TLR-2-, TLR-4- or MyD88-mediated signaling. When mice vaccinated with the different adjuvants together with OVA/alum were subjected to a second period of OVA/alum immunization, only live and hk-BCG were able to efficiently suppress the development of airway inflammation. This effect could be adoptively transferred by CD4+ T cells. Taken together our data suggest that live BCG>>hk-BCG>CpG>PPD are effective in suppressing allergen-induced Th2 responses. Secondly, the evaluation of a dendritic cell-based vaccination strategy leading to the induction of allergen-specific Th1 cells to protect against the development of allergen-specific Th2 responses was performed. The application of OVA-pulsed BM-DC maturated with CpG was unable to reduce airway eosinophilia and inflammation in OVA-immunized mice. OVA-specific IgG1 or IgE serum levels were also not reduced. The experiments using LC pulsed with OVA yielded similar results. However, the mice vaccinated with CpG/OVA pulsed BM-DC had greatly enhanced levels of OVA-specific IgG2a in the serum, suggesting the induction of allergen-specific Th1 responses in vivo. Thus, these data suggest that the vaccination of mice with OVA-pulsed BM-DC matured with CpG or OVA-pulsed LC did not result in a reduction of allergen-specific Th2 responses in a murine model of severe atopic asthma. Lastly, NES, an excretory/secretory product derived from the helminth Nippostrongylus brasiliensis was evaluated as a new potential adjuvant to prevent the development of allergic responses. The application of NES together with OVA/alum greatly inhibited the development of airway eosinophilia, airway goblet cell metaplasia and mucus production and the development of airway hyperreactivity after metacholine challenge. Furthermore, OVA-specific IgG1 and IgE levels in the serum were also strongly reduced. NES preparations contained small amounts of endotoxin, which may explain these results. However, the suppressive effects of NES on the development of allergen-specific Th2 responses was independent upon IFN-gamma or TLR-4 and still observed in mice treated with LPS-depleted NES. NES reduced OVA-induced Th2 responses also in a IL-10-independent manner. In addition, the digestion with proteinase K or the heat-treatment of NES did not abolish its ability to inhibit allergen-induced Th2 responses. Interestingly, NES suppress OVA-specific Th2 responses in vivo in the presence of a strong NES-specific Th2 environment. Taken together our results suggest that the helminth N. brasiliensis secretes substances which interfere with the development of allergic Th2 responses. In summary, distinct substances derived from microorganisms or helminths which may be used as potential adjuvants to prevent the development of allergic Th2 responses were identified. These findings contribute to the design of efficient vaccines protecting humans from developing allergic asthma. KW - Bronchialasthma KW - Impfstoff KW - BCG KW - Eingeweidewürmer KW - Asthma KW - Impfungen KW - BCG KW - Helminthen KW - Mäuse KW - Asthma KW - Vaccines KW - BCG KW - Helminths KW - mice Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-12992 ER - TY - THES A1 - Biswas, Kajal T1 - Analysis of Nitrogen starvation induced filamentous growth and characterization of putative essential genes in the human fungal pathogen, Candida albicans N2 - 1. Zusammenfassung Candida albicans ist ein opportunistisch pathogener Hefepilz, der sowohl oberflächliche Infektionen der Schleimhaut als auch lebensbedrohliche systemische Infektionen hervorrufen kann. Obwohl die Fähigkeit von C.albicans Infektionen auszulösen weitgehend vom Immunstatus des Wirts abhängt, besitzt der Pilz doch auch spezifische Eigenschaften, die eine Kolonisierung, Disseminierung und Anpassung an unterschiedliche Wirtsnischen ermöglichen und ihn vom harmlosen Kommensalen zum gefährlichen Krankheitsserreger werden lassen. Unter bestimmten Umweltbedingungen geht C.albicans vom Wachstum als sprossende Hefe zum invasiven, filamentösen Wachstum über, das eine wichtige Rolle in der Pathogenität des Pilzes spielt. Stickstoffmangel ist eines der Signale, die das filamentöse Wachstum in C.albicans induzieren, und die Kontrolle der Morphogenese durch die Verfügbarkeit von Stickstoff wurde in dieser Arbeit detailliert untersucht. Ammonium ist für Hefepilze eine bevorzugte Stickstoffquelle, die über spezifische Transporter in die Zelle aufgenommen wird. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass C.albicans zwei Ammoniumpermeasen besitzt, deren Expression durch Stickstoffmangel induziert wird. Während die Deletion von CaMEP1 oder CaMEP2 keinen Einfluss auf das Wachstum bei limitierenden Ammoniumkonzentrationen hatte, konnten mep1 mep2 Doppelmutanten bei Ammoniumkonzentrationen unter 5 mM nicht mehr wachsen. Im Gegensatz zu mep1 Mutanten bildeten mep2 Mutanten unter Stickstoffmangel keine Hyphen mehr und wuchsen ausschließlich in der Hefeform. CaMep2p hat also nicht nur eine Funktion als Ammoniumtransporter, sondern spielt auch eine Rolle bei der Induktion des filamentösen Wachstums. Weitere Experimente zeigten, dass CaMep2p ein weniger effizienter Ammoniumtransporter als CaMep1p ist, dafür aber stärker exprimiert wird, und dass dieser Unterschied wichtig für die Signalfunktion von CaMep2p ist. Durch Deletionsanalysen konnte bewiesen werden, dass die C-terminale, cytoplasmatische Domäne von CaMep2p essentiell für die Induktion des Hyphenwachstums ist, für den Ammoniumtransport jedoch nicht benötigt wird, und diese beiden Funktionen von CaMep2p daher voneinander getrennt werden können. In C.albicans gibt es mindestens zwei Signalwege die das filamentöse Wachstum steuern, eine MAP-Kinase-Kaskade und einen cAMP-abhängigen Signalweg, die in den Transkriptionsfaktoren Cph1p bzw. Efg1p enden. Bei Inaktivierung des einen oder des anderen Signalwegs induziert Stickstoffmangel kein filamentöses Wachstum mehr. Ein hyperaktives CaMEP2 Allel konnte den filamentösen Wachstumsdefekt sowohl von cph1 als auch efg1 Mutanten aufheben, nicht jedoch den einer cph1 efg1 Doppelmutante oder einer Mutante, der das G-Protein Ras1p fehlte, das beide Signalwege aktiviert. Umgekehrt wurde der filamentöse Wachstumsdefekt von mep2 Mutanten durch ein dominant-aktives RAS1 Allel bzw. durch die Zugabe von cAMP aufgehoben. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass CaMep2p bei Stickstoffmangel sowohl den MAP-Kinase- als auch den cAMP-abhängigen Signalweg aktiviert, um filamentöses Wachstum zu induzieren. In genügend hohen Konzentrationen reprimierte Ammonium das filamentöse Wachstum selbst wenn die Signalwege artifiziell aktiviert waren. Die bevorzugte Stickstoffquelle Ammonium ist deshalb ein Inhibitor der Morphogenese, der durch denselben Transporter in die Zelle aufgenommen wird, der bei Stickstoffmangel das filamentöse Wachstum von C.albicans induziert. Obwohl ein genaues Verständnis der Virulenzmechanismen von C.albicans auch neue Ansätze zur Bekämpfung von Infektionen durch diesen Pilz liefern kann, ist doch die Identifizierung und Charakterisierung von essentiellen Genen als potentielle Ziele für die Entwicklung neuer Antimykotika eine Strategie, die von der pharmazeutischen Industrie favorisiert wird. Aus diesem Grund wurden in Zusammenarbeit mit einem Industriepartner drei Gene von C.albicans ausgewählt, die in anderen Pilzen als essentiell beschrieben wurden, und im Rahmen dieser Arbeit funktionell charakterisiert. RAP1 codiert für das Repressor/Aktivator Protein 1, ein Transkriptionsfaktor und Telomerbindeprotein, das in der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae essentiell ist. Die Deletion des RAP1 Gens in C.albicans beeinträchtigte jedoch nicht die Lebensfähigkeit der Mutanten, so dass RAP1 kein vielversprechendes Ziel darstellt. CBF1 (centromere binding factor 1) ist in S.cerevisiae wichtig für die korrekte Chromosomenverteilung während der Mitose und außerdem auch für die transkriptionelle Aktivierung der Methioninbiosynthesegene; in den verwandten Hefen Kluyveromyces lactis und Candida glabrata ist CBF1 sogar essentiell. C.albicans cbf1 Mutanten wiesen jedoch keinen erhöhten Chromosomenverlust auf, so dass CBF1 hier offensichtlich keine Rolle bei der Chromosomensegregation spielt. Allerdings waren die Mutanten auxotroph für schwefelhaltige Aminosäuren und generell stark im Wachstum beeinträchtigt, was zeigte, dass Cbf1p für das normale Wachstum von C.albicans wichtig ist. YIL19 ist in S.cerevisiae ein essentielles Gen und hat eine Funktion bei der Reifung der 18S rRNA. YIL19 stellte sich auch in C.albicans als essentiell heraus. Konditionale Mutanten, in denen YIL19 durch induzierbare, FLP-vermittelte Rekombination aus dem Genom deletiert wurde, waren nicht lebensfähig und akkumulierten rRNA Vorstufen. Durch diese Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass YIL19 essentiell für diesen wichtigen zellulären Prozess und für die Lebensfähigkeit von C.albicans ist und sich möglicherweise als Ziel für die Entwicklung antifungaler Substanzen eignet. N2 - 1. Summary Candida albicans is an opportunistic human fungal pathogen that causes a variety of infections, ranging from superficial mucosal to deep-seated systemic infections, especially in immunocompromised patients. Although the ability of C.albicans to cause disease largely depends on the immune status of the host, the fungus also exhibits specific characteristics that facilitate colonization, dissemination, and adaptation to different host niches and thereby turn C.albicans from a harmless commensal to an aggressive pathogen. In response to various environmental stimuli C.albicans switches from growth as a budding yeast to invasive filamentous growth, and this morphogenetic switch plays an important role in C.albicans pathogenesis. Nitrogen limitation is one of the signals that induce filamentous growth in C.albicans, and the control of the morphogenetic transition by nitrogen availability was studied in detail in the present work. Ammonium is a preferred nitrogen source for yeasts that is taken up into the cells by specific transporters. It was found in this study that C.albicans possesses two major ammonium transporters, encoded by the CaMEP1 and CaMEP2 genes, expression of which is induced by nitrogen starvation. Whereas mep1 or mep2 single mutants grew as well as the wild-type strain on limiting concentrations of ammonium, deletion of both transporters rendered C.albicans unable to grow at ammonium concentrations below 5 mM. In contrast to mep1 mutants, mep2 mutants failed to filament and grew only in the yeast form under nitrogen starvation conditions, indicating that in addition to its role as an ammonium transporter CaMep2p also has a signaling function in the induction of filamentous growth. CaMep2p was found to be a less efficient ammonium transporter than CaMep1p and to be expressed at much higher levels, a distinguishing feature important for its signaling function. By the construction and analysis of serially truncated versions of CaMep2p, the C-terminal cytoplasmic tail of the protein was shown to be essential for signaling but dispensable for ammonium transport, demonstrating that these two functions of CaMep2p are separable. In C.albicans at least two signal transduction pathways, a MAP kinase cascade and a cAMP-dependent pathway ending in the transcriptional regulators Cph1p and Efg1p, respectively, control filamentous growth, and mutants defective in either one of these pathways are defective for filamentation under nitrogen starvation conditions. A hyperactive CaMEP2 allele rescued the filamentation defect of a cph1 or a efg1 mutant, but not of a cph1 efg1 double mutant or a mutant deleted for RAS1, which acts upstream of and activates both signaling pathways. Conversely, a dominant active RAS1 allele or addition of exogenous cAMP rescued the filamentation defect of mep2 mutants. These results suggest that CaMep2p activates both the MAP kinase and the cAMP pathway in a Ras1p dependent manner to promote filamentous growth under nitrogen starvation conditions. At sufficiently high concentrations, ammonium repressed filamentous growth even when the signaling pathways were artificially activated. Therefore, C.albicans has established a regulatory circuit in which a preferred nitrogen source, ammonium, serves as an inhibitor of morphogenesis that is taken up into the cell by the same transporter that induces filamentous growth in response to nitrogen starvation. Although a detailed understanding of virulence mechanisms of C.albicans may ultimately lead to novel approaches to combat infections caused by this pathogen, the identification and characterization of essential genes as potential targets for the development of antifungal drugs is a strategy favoured by most pharmaceutical companies. Therefore, C.albicans homologs of three genes that are essential in other fungi were selected in collaboration with an industrial partner and functionally characterized in this work. RAP1 encodes the repressor/activator protein 1, a transcription factor and telomere binding protein that is essential for viability in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. However, deletion of the C.albicans RAP1 homolog did not affect viability or growth of the mutants, suggesting that it is not a promising target. CBF1 (centromere binding factor 1) is necessary for proper chromosome segregation and transcriptional activation of methionine biosynthesis genes in S.cerevisiae and is essential for viability in the related yeasts Kluyveromyces lactis and Candida glabrata. Deletion of CBF1 in C.albicans did not result in an increased frequency of chromosome loss, indicating that it has no role in chromosome segregation in this organism. However, the C.albicans cbf1 mutants exhibited severe growth impairment, temperature sensitivity at 42°C, and auxotrophy for sulphur amino acids, suggesting that Cbf1p is a transcription factor that is important for normal growth of C.albicans. YIL19 is an essential gene in S.cerevisiae that is involved in 18S rRNA maturation. YIL19 was found to be an essential gene also in C.albicans. Conditional mutants in which the YIL19 gene could be excised from the genome by inducible, FLP-mediated recombination were non-viable and accumulated rRNA precursors, demonstrating that YIL19 is essential for this important cellular process and for viability of C.albicans and could serve as a target for the development of antifungal drugs. KW - Candida albicans KW - Pathogenität KW - Stickstoff KW - Candida albicans KW - ammonium permease KW - nitrogen regulation KW - essential gene Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-11554 ER - TY - THES A1 - Grozdanov, Lubomir Assenov T1 - Analysis of the genome organization and fitness traits of non-pathogenic Escherichia coli strain Nissle 1917 (O6:K5:H1) T1 - Untersuchungen zur Genomorganisation und zur Fitness des apathogener Escherichia coli Stammes Nissle 1917 (O6:K5:H1) N2 - In the last years more than one hundred microbial genomes have been sequenced, many of them from pathogenic bacteria. The availability of this huge amount of sequence data enormously increases our knowledge on the genome structure and plasticity, as well as on the microbial diversity and evolution. In parallel, these data are the basis for the scientific “revolution” in the field of industrial and environmental biotechnology and medical microbiology – diagnostics and therapy, development of new drugs and vaccines against infectious agents. Together with the genomic approach, other molecular biological methods such as PCR, DNA-chip technology, subtractive hybridization, transcriptomics and proteomics are of increasing importance for research on infectious diseases and public health. The aim of this work was to characterize the genome structure and -content of the probiotic Escherichia coli strain Nissle 1917 (O6:K5:H31) and to compare these data with publicly available data on the genomes of different pathogenic and non-pathogenic E. coli strains and other closely related species. A cosmid genomic library of strain Nissle 1917 was screened for clones containing the genetic determinants contributing to the successful survival in and colonization of the human body, as well as to mediate this strain’s probiotic effect as part of the intestinal microflora. Four genomic islands (GEI I-IVNissle 1917) were identifed and characterized. They contain many known fitness determinants (mch/mcm, foc, iuc, kps, ybt), as well as novel genes of unknown function, mobile genetic elements or newly identified putative fitness-contributing factors (Sat, Iha, ShiA-homologue, Ag43-homologues). All islands were found to be integrated next to tRNA genes (serX, pheV, argW and asnT, respectively). Their structure and chromosomal localization closely resembles those of analogous islands in the genome of uropathogenic E. coli strain CFT073 (O6:K2(?):H1), but they lack important virulence genes of uropathogenic E. coli (hly, cnf, prf/pap). Evidence for instability of GEI IINissle 1917 was given, since a deletion event in which IS2 elements play a role was detected. This event results in loss of a 30 kb DNA region, containing important fitness determinants (iuc, sat, iha), and therefore probably might influence the colonization capacity of Nissle 1917 strain. In addition, a screening of the sequence context of tRNA-encoding genes in the genome of Nissle 1917 was performed to identify genome wide potential integration sites of “foreign” DNA. As a result, similar “tRNA screening patterns” have been observed for strain Nissle 1917 and for the uropathogenic E. coli O6 strains (UPEC) 536 and CFT073. I. Summary 4 The molecular reason for the semi-rough phenotype and serum sensitivity of strain Nissle 1917 was analyzed. The O6-antigen polymerase-encoding gene wzy was identified, and it was shown that the reason for the semi-rough phenotype is a frame shift mutation in wzy, due to the presence of a premature stop codon. It was shown that the restoration of the O side-chain LPS polymerization by complementation with a functional wzy gene increased serumresistance of strain Nissle 1917. The results of this study show that despite the genome similarity of the E. coli strain Nissle 1917 with the UPEC strain CFT073, the strain Nissle 1917 exhibits a specific set of geno- and phenotypic features which contribute to its probiotic action. By comparison with the available data on the genomics of different species of Enterobacteriaceae, this study contributes to our understanding of the important processes such as horizontal gene transfer, deletions and rearrangements which contribute to genome diversity and -plasticity, and which are driving forces for the evolution of bacterial variants. At last, the fim, bcs and rfaH determinats whose expression contributes to the mutlicellular behaviour and biofilm formation of E. coli strain Nissle 1917 have been characterized. N2 - Bislang wurden die kompletten Genomsequenzen von mehr als 100 Bakterien ermittelt. Mehr als ein Drittel dieser Organismen wird als pathogen eingestuft. Die Verfügbarkeit dieser Sequenzinformation vergrößert unser Wissen über die bakterielle Genomstruktur und – plastizität sowie über mikrobielle Diversität und Evolution. Diese Daten bilden die Grundlage für viele Fortschritte auf dem Gebiet der Biotechnologie, der industriellen-, Umwelt- und medizinischen Mikrobiologie: neuartige Typisierung-, Diagnostik- und Therapieansätze sowie die Entwicklung neuer Medikamente und Impfstoffe basieren auf und profitieren von der ständig zunehmenden Menge an DNA-Sequenzen. Genomanalysen sind zusammen mit anderen molekularbiologischen Methoden wie PCR, DNA-Chiptechnologie, subtraktive Hybridisierung und Proteomanalysen von zunehmender Bedeutung für die Erforschung von Infektionskrankheiten und das öffentliche Gesundheitswesen. Ziel dieser Arbeit war die Analyse der Genomstruktur und des Genominhaltes des apathogenen Escherichia coli Stammes Nissle 1917 (O6:K5:H1) und der Vergleich mit verfügbaren Daten verschiedener pathogener und apathogener E. coli Stämme sowie anderer eng-verwandter Spezies. Eine Cosmid-Genbank des Stammes Nissle 1917 wurde nach Klonen durchsucht, die für Fitnessfaktoren kodieren, welche zur erfolgreichen Kolonisierung des menschlichen Verdauungstraktes und zum probiotischen Charakter dieses Stammes beitragen. Vier genomische Inseln (GEI I-IVNissle 1917) wurden nachgewiesen und charakterisiert. Auf diesen GEIs befinden sich verschiedene bekannte Fitness-Determinanten (mch/mcm, foc, iuc, kps, ybt), bislang nicht charakterisierte ORFs, mobile genetische Elemente und bislang für den Stamm Nissle 1917 nicht beschriebene Gene, die möglicherweise zur Fitness und Adaptabilität dieses Stammes beitragen. Die GEIs I-IVNissle 1917 sind jeweils mit einem tRNAGen assoziiert und ähneln hinsichtlich ihrer Struktur und chromosomalen Lokalisation entsprechenden Inseln im Genom des uropathogenen E. coli Stammes CFT073 (O6:K2(?):H1). Interessanterweise fehlen auf diesen wichtige Virulenzgene uropathogener E. coli (hly, cnf, prf/pap). Eine etwa 30 kb große Region der GEI IINissle 1917, die von IS2 Elementen flankiert wird, kann spontan deletieren, was zum Verlust verschiedener Fitnessdeterminanten (iuc, sat, iha) führt. Darüber hinaus wurde der chromosomale Sequenzkontext von tRNA-Genen mittels PCR auf die Integration von „Fremd-DNA“ hin untersucht, die durch horizontalen Gentransfer erworben wurde (tRNA Screening), und mit denen anderer apathogener und pathogener E. coli Stämme verglichen. Der genomweite Anteil an tRNA-Gen-assoziierter, möglicherweise horizontal erworbener DNA, die im I. Summary 2 apathogenen E. coli K-12 Stamm MG1655 fehlt, unterschied sich dabei nicht bedeutend im Stamm Nissle 1917 und den uropathogenen E. coli O6 Stämmen CFT073 und 536. Die Verbreitung von DNA-Regionen der GEIs des Stammes Nissle 1917 wurde mittels PCR bei apathogenen E. coli-Isolaten sowie bei uropathogenen E. coli O6:K5-Isolaten untersucht. Nur zwei UPEC O6:K5-Isolate enthielten alle GEI-Bereiche, die in diese Untersuchung einbezogen waren, unterschieden sich jedoch vom Stamm Nissle 1917 durch ihre Phänotypen. Die Makrorestriktionsanalyse der Genomstruktur des E. coli Stammes Nissle 1917 zeigte, daß letztere der des uropathogenen E. coli Stammes CFT073 sehr ähnelt. Um die Ursache für den semi-rauhen Phänotyp des Stammes Nissle 1917 zu untersuchen, wurden die wa* und wb* Determinanten dieses Stammes, die für die LPS-Biosynthese verantwortlich sind, kloniert und sequenziert. Das bislang unbekannte Serotyp O6-spezifische O-Antigenpolymerase-kodierende Gen wzy des Stammes Nissle 1917 wurde charakterisiert und mit dem des rauhen O6 Stammes 536 verglichen. Eine Punktmutation, die zu einem vorzeitigen Translationsstop der wzy-Transkripte des Stammes Nissle 1917 führt, wurde als Ursache für den semi-rauhen Phänotyp und damit auch die Serumsensitivität dieses Stammes verantwortlich gemacht. Zur Untersuchung der Kolonisierungsfähigkeit des E. coli Stammes Nissle 1917 wurden verschiedene Faktoren, die an der Biofilmbildung bzw. am multizellulären Verhalten beteiligt sind, sequenziert und näher analysiert. Die Seqenzierung der fim Determinante zeigte, daß das fimB Gen, das für die Expression der Typ 1-Fimbrien benötigt wird, durch die Insertion eines IS-Elementes inaktiviert wurde. Untersuchungen zum multizellulären Verhalten zeigten, daß der Stamm Nissle 1917 den sogenannten „rdar“ Morphotyp, hervorgerufen durch Expression von Curli-Fimbrien und Cellulose, bei 30 °C und bei 37 °C exprimiert, nicht jedoch die uropathogenen E. coli Stämme 536 und CFT073. Das Cellulosebiosynthese-Operon (bcs) sowie das Gen rfaH, das für einen Transkriptionsantiterminator kodiert, wurden im Stamm Nissle 1917 inaktiviert, um deren Bedeutung für den „rdar“ Morphotyp zu untersuchen. Während Cellulose für die Expression des „rdar“ Morphotyps benötigt wird, hatte die rfaHInaktivierung keinen Einfluß auf dieses mulizelluläre Verhalten des E. coli Stammes Nissle 1917. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, daß der apathogene E. coli Stamm Nissle 1917 durch eine spezifische Kombination phänotypischen Eigenschaften gekennzeichnet ist, die ihn von anderen bislang untersuchten E. coli Stämmen unterscheidet. An der Evolution dieses Stammes, möglicherweise aus einem pathogenen „Vorfahren“, waren vielfältige Gentransfer- und Deletionsprozesse sowie Punktmutationen beteiligt. KW - Escherichia coli KW - Genanalyse KW - Escherichia coli KW - Genomorganisation KW - Escherichia coli KW - genome organization Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-9304 ER - TY - THES A1 - Ramirez Pineda, José Robinson T1 - Dendritic cells activated by CpG motifs are potent inducers of a Th1 immune response that protects mice against leishmaniasis T1 - CpG-aktivierte dendritische-Zellen induzieren eine Th1 immunantwort die Mäuse gegen Leishmaniose schütz N2 - The present investigation report a protocol to obtain dendritic cells (DC) that protects mice against fatal leishmaniasis. DC were generated from bone marrow precursors, pulsed with leishmanial antigen and activated with CpG oligodeoxinucleotides. Mice that were vaccinated with these cells were strongly protected against the clinical and parasitological manifestations of leishmaniasis and developed a Th1 immune response. protection was solid and long-lasting, and was also dependent of the via of administration. Whe the mechanism of protection was studied, it was observed that the availability of the cytokine interleukin-12 at the time of vaccination was a key requirement, but that the source of this cytokine is not the donor cells but unidentified cells from the recipients. N2 - En esta tesis se reporta un prtocolo para obtener celulas dendriticas (CD) que inducen una respuesta protectora contra la leishmaniasis en ratones susceptibles. Las CD se generaron de precursores de medula osea, se pulsaron con antigeno de Leishmania y se activaron con oligonucleotidos que contienen motivos CpG. Cuando los ratones se vacunan con estas celulas se observa una fuerte proteccion clinica y parasitologica contra la leishmaniasis. Los ratones se protegen debido a que desarrollan una respuesta inmune de tipo Th1, en contraste con la respuesta Th2 desarrollada por los ratones control. La proteccion fue solida y duradera y fue dependiente de la via de administracion de las CD. Cuando se estudio el mecanismo de proteccion, se encontro que se requiere la presencia de la citokina interleukina 12 en el momento de la vacunacion, y que la fuente de esta citokina no son las celulas donadoras, sino celulas de los ratones recipientes. KW - Leishmaniose KW - Dendritische Zelle KW - Immunreaktion KW - Dendrtitischer Zellen KW - Th1 immunantwort KW - leishmaniose KW - CpG KW - Dendritic cells KW - Th1 response KW - leishmaniasis KW - CpG Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-8410 ER -