TY - THES A1 - Kreisz, Philipp T1 - Group S1 bZIP transcription factors regulate sink tissue development by controlling carbon and nitrogen resource allocation in \(Arabidopsis\) \(thaliana\) T1 - Gruppe S1 bZIP Transkriptionsfaktoren regulieren die Entwicklung von sink-Geweben durch Kontrolle der Verteilung von Kohlen- und Stickstoff Ressourcen in \(Arabidopsis\) \(thaliana\) N2 - The evolutionary success of higher plants is largely attributed to their tremendous developmental plasticity, which allows them to cope with adverse conditions. However, because these adaptations require investments of resources, they must be tightly regulated to avoid unfavourable trade-offs. Most of the resources required are macronutrients based on carbon and nitrogen. Limitations in the availability of these nutrients have major effects on gene expression, metabolism, and overall plant morphology. These changes are largely mediated by the highly conserved master kinase SNF1-RELATED PROTEIN KINASE1 (SnRK1), which represses growth and induces catabolic processes. Downstream of SnRK1, a hub of heterodimerising group C and S1 BASIC LEUCINE ZIPPER (bZIP) transcription factors has been identified. These bZIPs act as regulators of nutrient homeostasis and are highly expressed in strong sink tissues, such as flowers or the meristems that initiate lateral growth of both shoots and roots. However, their potential involvement in controlling developmental responses through their impact on resource allocation and usage has been largely neglected so far. Therefore, the objective of this work was to elucidate the impact of particularly S1 bZIPs on gene expression, metabolism, and plant development. Due to the high homology and suspected partial redundancy of S1 bZIPs, higher order loss-of-function mutants were generated using CRISPR-Cas9. The triple mutant bzip2/11/44 showed a variety of robust morphological changes but maintained an overall growth comparable to wildtype plants. In detail however, seedlings exhibited a strong reduction in primary root length. In addition, floral transition was delayed, and siliques and seeds were smaller, indicating a reduced supply of resources to the shoot and root apices. However, lateral root density and axillary shoot branching were increased, suggesting an increased ratio of lateral to apical growth in the mutant. The full group S1 knockout bzip1/2/11/44/53 showed similar phenotypes, albeit far more pronounced and accompanied by growth retardation. Metabolomic approaches revealed that these architectural changes were accompanied by reduced sugar levels in distal sink tissues such as flowers and roots. Sugar levels were also diminished in leaf apoplasts, indicating that long distance transport of sugars by apoplastic phloem loading was impaired in the mutants. In contrast, an increased sugar supply to the proximal axillary buds and elevated starch levels in the leaves were measured. In addition, free amino acid levels were increased in bzip2/11/44 and bzip1/2/11/44/53, especially for the important transport forms asparagine and glutamine. The increased C and N availability in the proximal tissues could be the cause of the increased axillary branching in the mutants. To identify bZIP target genes that might cause the observed shifts in metabolic status, RNAseq experiments were performed. Strikingly, clade III SUGARS WILL EVENTUALLY BE EXPORTED (SWEET) 8 genes were abundant among the differentially expressed genes. As SWEETs are crucial for sugar export to the apoplast and long-distance transport through the phloem, their reduced expression is likely to be the cause of the observed changes in sugar allocation. Similarly, the reduced expression of GLUTAMINE AMIDOTRANSFERASE 1_2.1 (GAT1_2.1), which exhibits glutaminase activity, could be an explanation for the abundance of glutamine in the mutants. Additional experiments (ATAC-seq, DAP� seq, PTA, q-RT-PCR) supported the direct induction of SWEETs and GAT1_2.1 by S1 bZIPs. To confirm the involvement of these target genes in the observed S1 bZIP mutant phenotypes, loss-of-function mutants were obtained, which showed moderately increased axillary branching. At the same time, the induced overexpression of bZIP11 in axillary meristems had the opposite effect. Collectively, a model is proposed for the function of S1 bZIPs in regulating sink tissue development. For efficient long-distance sugar transport, bZIPs may be required to induce the expression of clade III SWEETs. Thus, reduced SWEET expression in the S1 bZIP mutants would lead to a decrease in apoplastic sugar loading and a reduced supply to distal sinks such as shoot or root apices. The reduction in long� distance transport could lead to sugar accumulation in the leaves, which would then increasingly be transported via symplastic routes towards proximal sinks such as axillary branches and lateral roots or sequestered as starch. The reduced GAT1_2.1 levels lead to an abundance of glutamine, a major nitrogen transport form. The combined effect on C and N allocation results in increased nutrient availability in proximal tissues, promoting the formation of lateral plant organs. Alongside emerging evidence highlighting the power of bZIPs to steer nutrient allocation in other species, a novel but evolutionary conserved role for S1 bZIPs as regulators of developmental plasticity is proposed, while the generation of valuable data sets and novel genetic resources will help to gain a deeper understanding of the molecular mechanisms involved N2 - Der evolutionäre Erfolg höherer Pflanzen wird weitgehend auf ihre enorme Entwicklungsplastizität zurückgeführt, die es ihnen ermöglicht, widrigen Bedingungen zu trotzen. Da diese Anpassungen jedoch einen immensen Ressourceneinsatz erfordern, müssen sie streng reguliert werden, um unvorteilhafte Reaktionen zu vermeiden. Den Großteil der benötigten Ressourcen machen Makronährstoffe auf der Basis von Kohlenstoff und Stickstoff aus. Eine eingeschränkte Verfügbarkeit dieser Nährstoffe hat erhebliche Auswirkungen auf die Genexpression, den Stoffwechsel und die Morphologie der Pflanzen. Diese Veränderungen werden größtenteils durch die hochkonservierte Kinase SNF1-RELATED PROTEIN KINASE1 (SnRK1) vermittelt, die das Wachstum unterdrückt und katabole Prozesse einleitet. Downstream von SnRK1 wurde ein Netzwerk von heterodimerisierenden Transkriptionsfaktoren der Gruppe C und S1 BASIC LEUCINE ZIPPER (bZIP) identifiziert. Diese bZIPs wirken als Regulatoren der Nährstoffhomöostase und werden vor allem in starken sink-Geweben wie Blüten oder den Meristemen, die das Seitenwachstum von Sprossen und Wurzeln ermöglichen, exprimiert. Ihre potenzielle Beteiligung an der Steuerung von Entwicklungsreaktionen durch ihren Einfluss auf die Ressourcenzuteilung und -nutzung wurde bisher jedoch weitgehend vernachlässigt. Ziel dieser Arbeit war es daher, die Auswirkungen insbesondere von S1 bZIPs auf die Genexpression, den Stoffwechsel und die Pflanzenentwicklung zu erforschen. Aufgrund der hohen Homologie und der vermuteten teilweisen Redundanz der S1 bZIPs wurden mithilfe von CRISPR-Cas9 loss-of-function Mutanten höherer Ordnung erzeugt. Die Dreifachmutante bzip2/11/44 zeigte eine Vielzahl robuster morphologischer Veränderungen, behielt aber insgesamt ein mit Wildtyp-Pflanzen vergleichbares Wachstum bei. Im Detail jedoch wiesen die Keimlinge eine starke Verringerung der Primärwurzellänge auf. Darüber hinaus verzögerte sich der Blühzeitpunkt, und die Schoten und Samen waren kleiner, was auf eine geringere Versorgung der Spross- und Wurzelspitzen mit Ressourcen hinweist. Die Dichte der Seitenwurzeln und die axilläre Verzweigung des Sprosses waren jedoch erhöht, was auf ein erhöhtes Verhältnis von lateralem zu apikalem Wachstum in der Mutante hindeutet. Die Knockout-Mutante bzip1/2/11/44/53 zeigte ähnliche Phänotypen, wenn auch weitaus ausgeprägter und begleitet von Wachstumsverzögerungen. Metabolische Untersuchungen ergaben, dass diese Veränderungen in der Architektur mit reduzierten Zuckerspiegeln in distalen sink� Geweben wie Blüten und Wurzeln einhergingen. Die Zuckerspiegel waren auch in den Apoplasten der Blätter vermindert, was darauf hindeutet, dass der Ferntransport von Zucker durch apoplastische Phloembeladung in den Mutanten beeinträchtigt war. Im Gegensatz dazu wurden eine erhöhte Zuckerzufuhr zu den proximalen Achselknospen und erhöhte Stärkekonzentrationen in den Blättern gemessen. Zusätzlich war die Konzentration freier Aminosäuren in bzip2/11/44 und bzip1/2/11/44/53 10 erhöht, insbesondere für die wichtigen Transportformen Asparagin und Glutamin. Die erhöhte C- und N-Verfügbarkeit in den proximalen Geweben könnte die Ursache für die verstärkte axilläre Verzweigung in den Mutanten sein. Um bZIP-Zielgene zu identifizieren, die die beobachteten Verschiebungen im Stoffwechselstatus verursachen könnten, wurden RNAseq-Experimente durchgeführt. Auffallend ist, dass die Gene der Gruppe III SUGARS WILL EVENTUALLY BE EXPORTED (SWEET) unter den unterschiedlich exprimierten Genen sehr häufig vorkamen. Da SWEETs für den Zuckerexport in den Apoplasten und den Langstreckentransport durch das Phloem von entscheidender Bedeutung sind, ist ihre verringerte Expression wahrscheinlich die Ursache für die beobachteten Veränderungen in der Zuckerallokation. Ebenso könnte die verringerte Expression von GLUTAMIN AMIDOTRANSFERASE 1_2.1 (GAT1_2.1), die Glutaminase-Aktivität aufweist, eine Erklärung für die Häufigkeit von Glutamin in den Mutanten sein. Zusätzliche Experimente (ATAC-seq, DAP-seq, PTA, q-RT-PCR) bestätigten die direkte Induktion von SWEETs und GAT1_2.1 durch S1 bZIPs. Um die Beteiligung dieser Zielgene an den in den S1 bZIP� Mutanten beobachteten Phänotypen zu bestätigen, wurden loss-of-function-Mutanten untersucht, die eine mäßig erhöhte axilläre Verzweigung aufwiesen. Gleichzeitig hatte die induzierte Überexpression von bZIP11 in axillären Meristemen den gegenteiligen Effekt. Auf Basis dieser Ergebnisse wird ein Modell für die Funktion von S1 bZIPs bei der Regulierung der Entwicklung von sink-Geweben vorgeschlagen. Für einen effizienten Zuckertransport über große Entfernungen könnten bZIPs erforderlich sein, um die Expression von SWEETs der Gruppe III zu induzieren. Eine verringerte SWEET-Expression in den S1 bZIP-Mutanten würde zu einem Rückgang der apoplastischen Zuckerbeladung und einer verringerten Versorgung von distalen sink-Geweben wie den Spross- oder Wurzelspitzen führen. Die Verringerung des Ferntransports könnte zu einer Anhäufung von Zucker in den Blättern führen, der dann verstärkt über symplastische Wege zu proximalen sink� Geweben wie den axillären Meristem und Seitenwurzeln transportiert oder als Stärke gespeichert wird. Die verringerte GAT1_2.1 Expression führt zu einem Überfluss an Glutamin, einer wichtigen Stickstofftransportform. Die kombinierte Wirkung auf die C- und N-Allokation führt zu einer erhöhten Nährstoffverfügbarkeit in den proximalen Geweben und fördert die Bildung von seitlichen Pflanzenorganen. Neben neuen Erkenntnissen, die die Wirksamkeit von bZIPs bei der Steuerung der Nährstoffallokation in anderen Arten unterstreichen, wird eine neuartige, jedoch evolutionär konservierte Rolle für S1 bZIPs als Regulatoren der Entwicklungsplastizität vorgeschlagen, während die Generierung wertvoller Datensätze und neuer genetischer Ressourcen dazu beitragen wird, ein tieferes Verständnis der beteiligten molekularen Mechanismen zu gewinnen. KW - Molekularbiologie KW - Sugar allocation KW - Nitrogen allocation KW - Basic leucine zipper KW - Developmental plasticity KW - CRISPR Cas9 KW - Ackerschmalwand KW - CRISPR/Cas-Methode KW - Arabidopsis thaliana Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-321925 ER - TY - THES A1 - Kumar, Manish T1 - Structural and compositional effects on tree-water relation T1 - Strukturelle und Zusammenseztungseffekte auf die Beziehung zwischen Baum und Wasser N2 - Forests are essential sources of tangible and intangible benefits, but global climate change associated with recurrent extreme drought episodes severely affects forest productivity due to extensive tree die-back. On that, it appeals to an urgency for large-scale reforestation efforts to mitigate the impact of climate change worldwide; however, there is a lack of understanding of drought-effect on sapling growth and survival mechanisms. It is also challenging to anticipate how long trees can survive and when they succumb to drought. Hence, to ensure success of reforestation programs and sustainable forest productivity, it is essential to identify drought-resistant saplings. For that, profound knowledge of hydraulic characteristics is needed. To achieve this, the study was split into two phases which seek to address (1) how the hydraulic and anatomical traits influence the sapling’s growth rate under drought stress. (2) how plant water potential regulation and physiological traits are linked to species’ water use strategies and their drought tolerance. The dissertation is assembled of two study campaigns carried out on saplings at the Chair of Botany II, University of Würzburg, Germany. The first study involved three ecologically important temperate broadleaved tree species — saplings of 18-month (Acer pseudoplatanus, Betula pendula, and Sorbus aucuparia) — grown from seeds in contrasting conditions (inside a greenhouse and outside), with the latter being subjected to severe natural heat waves. In the second study, two additional temperate species (Fagus sylvatica and Tilia cordata) were added. The drying-out event was conducted using a randomised blocked design by monitoring plant water status in a climate-controlled chamber and a greenhouse. In campaign I, I present the result based on analysed data of 82 plants of temperate deciduous species and address the juvenile growth rate trade-off with xylem safety-efficiency. Our results indicate biomass production varies considerably due to the contrasted growing environment. High hydraulic efficiency is necessary for increased biomass production, while safety-efficiency traits are decoupled and species-specific. Furthermore, productivity was linked considerably to xylem safety without revealing a well-defined pattern among species. Moreover, plasticity in traits differed between stressed and non-stressed plants. For example, safety-related characteristics were more static than efficiency-related traits, which had higher intra-specific variation. Moreover, we recorded anatomical and leaf traits adjustments in response to a stress condition, but consistency among species is lacking. In campaign II, I combined different ways to estimate the degree of isohydry based on water potential regulation and connected the iso-anisohydric spectrum (i.e., hydroscape area, HSA) to hydraulic traits to elucidate actual plant performance during drought. We analysed plant water potential regulation (Ψpd and Ψmd) and stomatal conductance of 28-29 month saplings of five species. I used a linear mixed modelling approach that allowed to control individual variations to describe the water potential regulation and tested different conceptual definitions of isohydricity. The combined methods allowed us to estimate species' relative degree of isohydry. Further, we examined the traits coordination, including hydraulic safety margin, HSM; embolism resistance, P88; turgor loss, Ψtlp; stomata closure, Ps90; capacitance, C; cuticular conductance, gmin, to determine time to hydraulic failure (Thf). Thf is the cumulative effect of time to stomata closure (Tsc) and time after stomatal closure to catastrophic hydraulic failure (Tcrit). Our results show the species' HSA matches their stomatal stringency, which confirms the relationship between stomatal response and leaf water potential decline. Species that close stomata at lower water potential notably had a larger HSA. Isohydric behaviour was mostly associated with leaf hydraulic traits and poorly to xylem safety traits. Species' degree of isohydry was also unrelated to the species' time to death during drying-out experiments. This supports the notion that isohydry behaviours are linked to water use rather than drought survival strategies. Further, consistent with our assumptions, more isohydric species had larger internal water storage and lost their leaf turgor at less negative water potentials. Counter to our expectations, neither embolism resistance nor the associated hydraulic safety margins were related to metrics of isohydry. Instead, our results indicate traits associated with plant drought response to cluster along two largely independent axes of variation (i.e., stomatal stringency and xylem safety). Furthermore, on the temporal progression of plant drought responses, stomatal closure is critical in coordinating various traits to determine species' hydraulic strategies. Desiccation avoidance strategy was linked to Tsc and coordinated traits response of Ps90, Ψtlp, and HSA, whereas desiccation tolerance was related to Tcrit and traits such as lower P88 value, high HSM, and lower gmin. Notably, the shoot capacitance (C) is crucial in Thf and exhibits dichotomous behaviour linked to both Tsc and Tcrit. In conclusion, knowledge of growth rate trade-offs with xylem safety-efficiency combined with traits linked to species’ hydraulic strategies along the isohydry could substantially enhance our ability to identify drought-resistant saplings to ensure the success of reforestation programs and predicting sensitivity to drought for achieving sustainable forest ecosystems. N2 - Wälder sind wichtige Quellen materieller und immaterieller Vorteile, aber der globale Klimawandel, der mit wiederkehrenden extremen Dürreperioden einhergeht, beeinträchtigt die Produktivität der Wälder aufgrund des starken Absterbens von Bäumen erheblich. Deshalb werden dringend groß angelegte Aufforstungsmaßnahmen gefordert, um die Auswirkungen des Klimawandels weltweit abzumildern. Allerdings fehlt es an Kenntnissen über die Auswirkungen von Dürre auf das Wachstum und die Überlebensmechanismen von Jungbäumen. Es ist auch schwierig, vorherzusehen, wie lange Bäume überleben können und wann sie der Trockenheit erliegen. Um den Erfolg von Wiederaufforstungsprogrammen und die nachhaltige Produktivität der Wälder zu gewährleisten, ist es daher unerlässlich, trockenheitsresistente Setzlinge zu identifizieren. Dazu ist eine profunde Kenntnis der hydraulischen Eigenschaften erforderlich. Um dies zu erreichen, wurde die Studie in zwei Phasen aufgeteilt, in denen untersucht werden soll, (1) wie die hydraulischen und anatomischen Merkmale die Wachstumsrate der Setzlinge unter Trockenstress beeinflussen. (2) wie die Regulierung des pflanzlichen Wasserpotenzials und die physiologischen Merkmale mit den Wassernutzungsstrategien der Arten und ihrer Trockentoleranz zusammenhängen. Die Dissertation setzt sich aus zwei Studienkampagnen zusammen, die am Lehrstuhl für Botanik II der Universität Würzburg an Setzlingen durchgeführt wurden. In der ersten Studie wurden drei ökologisch wichtige Laubbaumarten der gemäßigten Zonen - 18-monatige Setzlinge (Acer pseudoplatanus, Betula pendula und Sorbus aucuparia) - aus Samen unter unterschiedlichen Bedingungen (in einem Gewächshaus und im Freien) aufgezogen, wobei letztere schweren natürlichen Hitzewellen ausgesetzt waren. In der zweiten Studie wurden zwei weitere gemäßigte Arten (Fagus sylvatica und Tilia cordata) hinzugefügt. Der Austrocknungsversuch wurde in einem randomisierten Blockdesign durchgeführt, bei dem der Wasserhaushalt der Pflanzen in einer klimatisierten Kammer und einem Gewächshaus überwacht wurde. In Kampagne I präsentiere ich die Ergebnisse, die auf den analysierten Daten von 82 Pflanzen gemäßigter Laubbaumarten basieren, und gehe auf den Kompromiss zwischen der Wachstumsrate von Jungpflanzen und der Sicherheitseffizienz des Xylems ein. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Biomasseproduktion aufgrund der unterschiedlichen Wachstumsbedingungen stark variiert. Eine hohe hydraulische Effizienz ist für eine erhöhte Biomasseproduktion notwendig, während die Sicherheitseffizienz entkoppelt und artspezifisch ist. Darüber hinaus war die Produktivität in erheblichem Maße mit der Xylemsicherheit verknüpft, ohne dass sich ein klar definiertes Muster zwischen den Arten ergab. Darüber hinaus war die Plastizität der Merkmale zwischen gestressten und nicht gestressten Pflanzen unterschiedlich. So waren beispielsweise sicherheitsbezogene Merkmale statischer als effizienzbezogene Merkmale, die eine stärkere intra-spezifische Variation aufwiesen. Darüber hinaus haben wir Anpassungen der anatomischen Merkmale und der Blatteigenschaften als Reaktion auf eine Stressbedingung festgestellt, aber es fehlt die Konsistenz zwischen den Arten. In Kampagne II kombinierte ich verschiedene Methoden zur Schätzung des Isohydrierungsgrads auf der Grundlage der Wasserpotenzialregulierung und verknüpfte das iso-anisohydrische Spektrum (d. h. die Hydroscape-Fläche, HSA) mit hydraulischen Merkmalen, um die tatsächliche Leistung der Pflanzen bei Trockenheit zu ermitteln. Wir analysierten die Regulierung des pflanzlichen Wasserpotenzials (Ψpd und Ψmd) und die stomatäre Leitfähigkeit von 28-29 Monate alten Setzlingen von fünf Arten. Ich verwendete einen linearen gemischten Modellierungsansatz, der die Kontrolle individueller Variationen zur Beschreibung der Wasserpotenzialregulierung ermöglichte, und testete verschiedene konzeptionelle Definitionen der Isohydrizität. Die kombinierten Methoden ermöglichten es uns, den relativen Grad der Isohydrizität der Arten zu schätzen. Darüber hinaus untersuchten wir die Koordination der Merkmale, einschließlich der hydraulischen Sicherheitsspanne (HSM), des Embolieresistenz (P88), des Turgorverlustes (Ψtlp), des Spaltöffnungsgrades (Ps90), der Kapazität (C) und des kutikulären Leitwertes (gmin), um die Zeit bis zum hydraulischen Versagen (Thf) zu bestimmen. Thf ist der kumulative Effekt der Zeit bis zum Schließen der Spaltöffnungen (Tsc) und der Zeit nach dem Schließen der Spaltöffnungen bis zum katastrophalen hydraulischen Versagen (Tcrit). Unsere Ergebnisse zeigen, dass die HSA der Arten mit ihrer Spaltöffnungsintensität übereinstimmt, was die Beziehung zwischen der Spaltöffnungsreaktion und dem Rückgang des Wasserpotenzials der Blätter bestätigt. Arten, die ihre Spaltöffnungen bei einem niedrigeren Wasserpotenzial schließen, hatten einen deutlich größeren HSA. Das isohydrische Verhalten stand hauptsächlich mit den hydraulischen Eigenschaften der Blätter in Verbindung und kaum mit den Sicherheitsmerkmalen des Xylems. Der Grad der Isohydrierung der Arten stand auch in keinem Zusammenhang mit der Zeit bis zum Absterben der Arten während der Austrocknungsversuche. Dies unterstützt die Annahme, dass das Isohydrie-Verhalten eher mit der Wassernutzung als mit Überlebensstrategien bei Trockenheit zusammenhängt. Darüber hinaus wiesen isohydrische Arten, wie von uns angenommen, einen größeren internen Wasserspeicher auf und verloren ihren Blattturgor bei weniger negativen Wasserpotentialen. Entgegen unseren Erwartungen standen weder die Embolieresistenz noch die damit verbundenen hydraulischen Sicherheitsspannen in Zusammenhang mit Isohydratisierungsmerkmalen. Stattdessen deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass sich die Merkmale, die mit der Reaktion der Pflanzen auf Trockenheit in Verbindung stehen, entlang zweier weitgehend unabhängiger Variationsachsen (d. h. stomatäre Strenge und Xylem-Sicherheit) gruppieren. Was den zeitlichen Verlauf der pflanzlichen Reaktionen auf Trockenheit betrifft, so ist der Stomataverschluss für die Koordinierung der verschiedenen Merkmale entscheidend, um die hydraulischen Strategien der Arten zu bestimmen. Die Strategie zur Vermeidung von Austrocknung war mit Tsc und koordinierten Merkmalen wie Ps90, Ψtlp und HSA verbunden, während die Austrocknungstoleranz mit Tcrit und Merkmalen wie einem niedrigeren P88-Wert, einem hohen HSM und einem niedrigeren gmin zusammenhing. Insbesondere die Sprosskapazität (C) ist für Thf entscheidend und zeigt ein dichotomes Verhalten, das sowohl mit Tsc als auch mit Tcrit zusammenhängt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das Wissen um die Wechselwirkungen zwischen der Wachstumsrate und der Sicherheitseffizienz des Xylems in Verbindung mit Merkmalen, die mit den hydraulischen Strategien der Arten entlang der Isohydrie zusammenhängen, unsere Fähigkeit, trockenheitsresistente Setzlinge zu identifizieren, erheblich verbessern könnte, um den Erfolg von Aufforstungsprogrammen zu gewährleisten und die Empfindlichkeit gegenüber Trockenheit vorherzusagen, um nachhaltige Waldökosysteme zu erreichen. KW - Wachstumsrate KW - hydraulic efficiency KW - phenotypic plasticity KW - growth rate KW - safety-efficiency trade-off KW - vulnerability curve KW - stomatal closure KW - desiccation time KW - hydroscape KW - cuticular conductance KW - shoot capacitance KW - Baum KW - Wasser KW - hydraulische Effizienz KW - Verwundbarkeitskurve KW - Stomatenverschluss KW - Hydroscape-Gebiet Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-326245 ER - TY - THES A1 - Iosip, Anda-Larisa T1 - Molecular Mechanosensing Mechanisms of the Carnivorous Plant \(Dionaea\) \(muscipula\) T1 - Molekulare Mechanismen der Mechanoperzeption in der fleischfressenden Pflanze \(Dionaea\) \(muscipula\) N2 - Plants are able to sense mechanical forces in order to defend themselves against predators, for instance by synthesizing repellent compounds. Very few plants evolved extremely sensitive tactile abilities that allow them to perceive, interpret and respond by rapid movement in the milliseconds range. One such rarity is the charismatic Venus flytrap (Dionaea muscipula) - a carnivorous plant which relies on its spectacular active trapping strategy to catch its prey. The snapping traps are equipped with touch-specialised trigger hairs, that upon bending elicit an action potential (AP). This electrical signal originates within the trigger hairs’ mechanosensory cells and further propagates throughout the whole trap, alerting the plant of potential prey. Two APs triggered within thirty seconds will set off the trap and more than five APs will initiate the green stomach formation for prey decomposition and nutrient uptake. Neither the molecular components of the plant’s AP nor the Venus flytrap’s fast closure mechanism have been fully elucidated yet. Therefore, the general objective of this study is to expound on the molecular basis of touch perception: from AP initiation to trap closure and finally to stomach formation. The typical electrical signal in plants lasts for minutes and its shape is determined by the intensity of the mechanical force applied. In contrast, the Venus flytrap’s one-second AP is of all-or-nothing type, similar in shape to the animal AP. In order to gain more insight into the molecular components that give rise to the Venus flytrap’s emblematic AP, the transcriptomic landscape of its unique mechanotransducer - the trigger hair – was compared to the rest of the non-specialised tissues and organs. Additionally, the transcriptome of the electrically excitable fully-developed adult trap was compared to non-excitable juvenile traps that are unable to produce sharp APs. Together, the two strategies helped with the identification of electrogenic channels and pumps for each step of the AP as follows: (1) the most specific to the trigger hair was the mechanosensitive channel DmMSL10, making up the best candidate for the initial AP depolarization phase, (2) the K+ outward rectifier DmSKOR could be responsible for repolarisation, (3) further, the proton pump DmAHA4, might kick in during repolarisation and go on with hyperpolarisation and (4) the hyperpolarization- and acid-activated K+ inward rectifier KDM1 might contribute to the re-establishment of electrochemical gradient and the resting potential. Responsible for the AP-associated Ca2+ wave and electrical signal propagation, the glutamate-like receptor DmGLR3.6 was also enriched in the trigger hairs. Together, these findings suggest that the reuse of genes involved in electrical signalling in ordinary plants can give rise to the Venus flytrap’s trademark AP. The Venus flytrap has been cultivated ever since its discovery, generating more than one hundred cultivars over the years. Among them, indistinguishable from a normal Venus flytrap at first sight, the ’ERROR’ cultivar exhibits a peculiar behaviour: it is unable to snap its traps upon two APs. Nevertheless, it is still able to elicit normal APs. To get a better understanding of the key molecular mechanisms and pathways that are essential for a successful trap closure, the ’ERROR’ mutant was compared to the functional wild type. Timelapse photography led to the observation that the ’ERROR’ mutants were able to leisurely half close their traps when repeated mechanostimulation was applied (10 minutes after 20 APs, 0.03 Hz). As a result of touch or wounding in non-carnivorous plants, jasmonic acid (JA) is synthesized, alerting the plants of potential predators. Curiously, the JA levels were reduced upon mechanostimulation and completely impaired upon wounding in the ’ERROR’ mutant. In search of genes accountable for the ’ERROR’ mutant’s defects, the transcriptomes of the two phenotypes were compared before and after mechanostimulation (1h after 10 APs, 0.01 Hz). The overall dampened response of the mutant compared to the wild type, was reflected at transcriptomic level as well. Only about 50% of wild type’s upregulated genes after touch stimulation were differentially expressed in ’ERROR’ and they manifested only half of the wild type’s expression amplitude. Among unresponsive functional categories of genes in ’ERROR’ phenotype, there were: cell wall integrity surveilling system, auxin biosynthesis and stress-related transcription factors from the ethylene-responsive AP2/ERF and C2H2-ZF families. Deregulated Ca2+-decoding as well as redox-related elements together with JA-pathway components might also contribute to the malfunctioning of the ’ERROR’ mutant. As the mutant does not undergo full stomach formation after mechanical treatment, these missing processes represent key milestones that might mediate growth-defence trade-offs under JA signalling. This confirms the idea that carnivory has evolved by recycling the already available molecular machineries of the ubiquitous plant immune system. To better understand the mutant’s defect in the trap snapping mechanism, the ground states (unstimulated traps) of the two phenotypes were compared. In this case, many cell wall-related genes (e.g. expansins) were downregulated in the ’ERROR’ mutant. For the first time, these data point to the importance of a special cell wall architecture of the trap, that might confer the mechanical properties needed for a functional buckling system - which amplifies the speed of the trap closure. This study provides candidate channels for each of the AP phases that give rise to and shape the sharp Venus flytrap-specific AP. It further underlines the possible contribution of the cell wall architecture to the metastable ready-to-snap configuration of the trap before stimulation - which might be crucial for the buckling-dependent snapping. And finally, it highlights molecular milestones linked to defence responses that ensure trap morphing into a green stomach after mechanostimulation. Altogether, these processes prove to be interdependent and essential for a successful carnivorous lifestyle. N2 - Pflanzen sind in der Lage, mechanische Einflüsse zu spüren, um sich gegen Fressfeinde zu verteidigen, indem sie zum Beispiel abweisende Verbindungen synthetisieren. Nur sehr wenige Pflanzen haben extrem sensible taktile Fähigkeiten entwickelt, die es ihnen ermöglichen, schnelle Bewegungen im Millisekundenbereich wahrzunehmen, zu interpretieren und darauf zu reagieren. Eine solche Rarität ist die charismatische Venusfliegenfalle (Dionaea muscipula) - eine fleischfressende Pflanze, die sich auf ihre spektakuläre aktive Fallenstrategie verlässt, um ihre Beute zu fangen. Die Schnappfallen sind mit berührungssensitiven Auslösehaaren ausgestattet, die beim Biegen ein Aktionspotenzial (AP) auslösen. Dieses elektrische Signal entsteht in den mechanosensorischen Zellen der Auslösehaare und breitet sich in der gesamten Falle aus, wodurch die Pflanze auf potenzielle Beute aufmerksam gemacht wird. Zwei APs, die innerhalb von dreißig Sekunden ausgelöst werden, lösen die Falle aus, und mehr als fünf APs leiten die Bildung des grünen Magens ein, der die Beute zersetzt und die Nährstoffe aufnimmt. Weder die molekularen Komponenten des AP der Pflanze noch der Schnellverschlussmechanismus der Venusfliegenfalle sind bisher vollständig geklärt. Daher besteht das allgemeine Ziel dieser Studie darin, die molekularen Grundlagen der Berührungswahrnehmung zu erforschen: von der Initiierung des AP bis zum Schließen der Falle und schließlich zur Magenbildung. Das typische elektrische Signal in Pflanzen dauert Minuten und seine Form wird durch die Intensität der angewandten mechanischen Kraft bestimmt. Im Gegensatz dazu ist das einsekündige AP der Venusfliegenfalle vom Alles-oder-Nichts-Typ und ähnelt in seiner Form dem tierischen AP. Um mehr Einblick in die molekularen Komponenten zu erhalten, die das emblematische AP der Venusfliegenfalle hervorbringen, wurde das Transkriptom ihres einzigartigen Mechanosensors - des Triggerhaars - mit den übrigen nicht spezialisierten Geweben und Organen verglichen. Darüber hinaus wurde das Transkriptom der elektrisch erregbaren, voll entwickelten adulten Falle mit nicht erregbaren juvenilen Fallen verglichen, die keine scharfen APs erzeugen können. Beide Strategien zusammen halfen bei der Identifizierung von elektrogenen Kanälen und Pumpen für jeden Schritt des AP: (1) Am spezifischsten für die Triggerhaare war der mechanosensitive Kanal DmMSL10, der der beste Kandidat für die anfängliche AP-Depolarisationsphase war, (2) der K+-Auswärtsgleichrichter DmSKOR könnte für die Repolarisation verantwortlich sein, (3) ferner, die H+-Pumpe DmAHA4, könnte während der Repolarisation einsetzen und mit der Hyperpolarisation fortfahren und (4) der durch Hyperpolarisation und Säure aktivierte K+-Einwärtsgleichrichter KDM1 könnte zur Wiederherstellung des elektrochemischen Gradienten und des Ruhepotentials beitragen. Der möglicherweise für die AP-assoziierte Ca2+-Welle und die elektrische Signalausbreitung verantwortliche Glutamatrezeptor DmGLR3.6 war ebenfalls in den Triggerhaaren angereichert. Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Wiederverwendung von Genen, die an der elektrischen Signalübertragung in gewöhnlichen Pflanzen beteiligt sind, zu dem für die Venusfliegenfalle typischen AP führen kann. Die Venusfliegenfalle wird seit ihrer Entdeckung kultiviert und hat im Laufe der Jahre mehr als hundert Kultivare hervorgebracht. Die Sorte "ERROR", die auf den ersten Blick nicht von einer normalen Venusfliegenfalle zu unterscheiden ist, weist ein besonderes Verhalten auf: Sie ist nicht in der Lage, ihre Fallen nach dem Auslösen von 2 APs zu schließen. Dennoch ist sie in der Lage, normale APs auszulösen. Um ein besseres Verständnis der molekularen Schlüsselmechanismen und -wege zu erhalten, die für ein erfolgreiches Schließen der Fallen notwendig sind, wurde die "ERROR"-Mutante mit dem funktionalen Wildtyp verglichen. Zeitrafferaufnahmen führten zu der Beobachtung, dass die ’ERROR’-Mutanten in der Lage waren, ihre Fallen bei wiederholter mechanischer Stimulation (10 Minuten nach 20 APs, 0,03 Hz) sehr langsam etwa zur Hälfte zu schließen. Bei nicht karnivoren Pflanzen wird infolge von Berührungen oder Verletzungen Jasmonsäure (JA) synthetisiert, die die Pflanzen vor potenziellen Fressfeinden warnt. Merkwürdigerweise waren die JA-Spiegel bei mechanischer Stimulation reduziert und bei Verwundung in der "ERROR"-Mutante im Gegensatz zum WT überhaupt nicht erhöht. Auf der Suche nach Genen, die für die Defekte der "ERROR"-Mutante verantwortlich sind, wurden die Transkriptome der beiden Phänotypen vor und nach der Mechanostimulation (1 Stunde nach 10 APs, 0,01 Hz) verglichen. Die insgesamt gedämpfte Reaktion der Mutante im Vergleich zum Wildtyp spiegelte sich auch auf transkriptomischer Ebene wider. Nur etwa 50 % der nach Berührungsstimulation hochregulierten Gene des Wildtyps wurden in "ERROR" unterschiedlich exprimiert, und sie wiesen nur die Hälfte der Expressionsamplitude des Wildtyps auf. Zu den nicht reagierenden funktionellen Genkategorien gehörten: das System zur Überwachung der Zellwandintegrität, die Auxin-Biosynthese und stressbezogene Transkriptionsfaktoren aus den auf Ethylen reagierenden AP2/ERF- und C2H2-ZF-Familien. Deregulierte Ca2+-decodierende sowie redoxbezogene Elemente könnten zusammen mit Komponenten des JA-Signalwegs ebenfalls zur Fehlfunktion der "ERROR"-Mutante beitragen. Da die Mutante nach mechanischer Behandlung keine vollständige Magenbildung durchläuft, stellen diese fehlenden Prozesse wichtige Meilensteine dar, die bei der JA-Signalübertragung einen Kompromiss zwischen Wachstum und Verteidigung vermitteln könnten. Dies bestätigt die Idee, dass sich Karnivorie durch die Wiederverwertung bereits vorhandener Signalwege und -komponenten entwickelt hat. Um den Defekt der Mutante im Fallenschnappmechanismus besser zu verstehen, wurden die Grundzustände (unstimulierte Fallen) der beiden Phänotypen verglichen. In diesem Fall waren viele zellwandbezogene Gene (z. B. Expansine) in der "ERROR"-Mutante herunterreguliert. Diese Daten weisen zum ersten Mal auf die Bedeutung einer speziellen Zellwandarchitektur der Falle hin, die möglicherweise die mechanischen Eigenschaften für ein Umklappen der Fallenhälften verleiht, was wiederum die Geschwindigkeit des Fallenschlusses erhöht. Diese Studie liefert Kandidatenkanäle für jede der AP-Phasen, die das scharfe Venusfliegenfallen-spezifische AP hervorbringen und formen. Sie unterstreicht außerdem den möglichen Beitrag der Zellwandarchitektur zur metastabilen, schnappbereiten Konfiguration der Falle vor der Stimulation - die für das durch das Umklappen der Fallenhälften bedingte Zuschnappen der Falle entscheidend sein könnte. Und schließlich werden molekulare Meilensteine hervorgehoben, die mit Abwehrreaktionen verbunden sind und dafür sorgen, dass sich die Falle nach mechanischer Stimulation in einen grünen Magen verwandelt. Insgesamt erweisen sich diese Prozesse als voneinander abhängig und wesentlich für eine erfolgreiche fleischfressende Lebens-weise. KW - carnivorous plants KW - action potential KW - trap closure KW - jasmonic acid KW - mechanosensation KW - touch KW - molecular pathways KW - wounding KW - defence mechanisms KW - transcriptomics KW - Venusfliegenfalle KW - Dionaea muscipula Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-287649 ER - TY - THES A1 - Hettwer, Anette T1 - Entwicklung und Charakterisierung einer löslichen und funktionalen BMP-2-Variante T1 - Development and characterization of a soluble BMP-2-variant N2 - Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) sind potente Differenzierungs- und Wachstumsfaktoren, die strukturell der Transforming Growth Factor-β (TGF-β) - Superfamilie zugeordnet werden. Sie spielen eine Schlüsselrolle in einer Vielzahl an zellulären Prozessen ab den frühen Stadien der Embryogenese. Dadurch sind BMPs nicht nur für die korrekte Festlegung der embryonalen Körperachse verantwortlich, sondern regulieren als multifunktionale Mediatoren neben der Morphogenese auch Proliferation, Differenzierung und Apoptose unterschiedlicher Zelltypen. Bone Morphogenetic Proteins sind somit für die Aufrechthaltung der Homöostase im adulten Körper mitverantwortlich. Ihre Funktionalität vermitteln die BMPs über eine Signalkaskade, indem sie als dimeres Protein spezifische transmembrane Serin/Threonin-Kinaserezeptoren von Typ I und Typ II in einem heteromeren Komplex assemblieren. Die intrazelluläre Signalweiterleitung verläuft über verschiedene Signalkaskaden (Smad-Proteine oder MAPKs), wodurch final im Zellkern Änderungen auf der Ebene der Gentranskription ausgelöst werden. Laut der namensgebenden Eigenschaft fungieren einige Wachstumsfaktoren als aktive Induktoren der Knochenbiosynthese. Ihre Anwesenheit ist essentiell für die vielen zellulären Prozesse, die während einer Frakturheilung auftreten, wobei eine Knochenneubildung ebenso stark abhängig ist vom Zusammenspiel verschiedener Stimulatoren und Inhibitoren, die die BMPs in ihrer Aktivität regulieren. Bedingt durch ihr großes Potential fanden die erstmals durch Marshal Urist 1965 aus Knochenmaterial isolierten BMP-Proteine ihren Einsatz in der regenerativen Medizin. Kommerziell erhältlich und bereits seit vielen Jahren in der klinischen Anwendung befindet sich derzeit das rhBMP-2 und rhBMP-7. Diese beiden Wachstumsfaktoren werden u.a. verwendet, um die Heilungsprozesse von langwierigen Schienbeinfrakturen zu verbessern, aber auch bei degenerativen Wirbelsäulenerkrankungen und in der Kieferchirurgie. Jedoch führt die schlechte Löslichkeit des BMPs aufgrund der ausgeprägten Aggregationstendenz zu gravierenden Problemen, nicht nur während der biotechnologischen Herstellung, sondern auch bei der klinischen Anwendung. Der Schwerpunkt des Optimierungsbedarfs der BMP-2 Herstellung im Rahmen dieser Doktorarbeit lag daher auf der Etablierung eines prokaryotischen Expressionssystems für die lösliche Produktion von BMP-2. Dafür wurde zunächst der Fokus auf die ungünstigen Löslichkeitseigenschaften des Wachstumsfaktors gelegt. Um die hohe Aggregationsneigung des BMP-2 während der Produktion in Escherichia coli zu minimieren, wurden anhand einer Algorithmus-basierten Analyse BMP-2-Varianten entworfen, in denen Aminosäuren mit stark hydrophoben Eigenschaften gegen solche mit hydrophilem Charakter ausgetauscht wurden. Hierdurch konnten die zur Aggregation neigenden Bereiche des BMP-2 weitestgehend eliminiert werden. Es wurden für die bezüglich ihrer Löslichkeit optimierten Proteinvarianten unterschiedliche Expressionsstrategien etabliert, wodurch dimere BMP-2-Muteine in angepassten chromatographischen Profilen mit einem Aufreinigungsschritt und ohne jegliche Renaturierungsmaßnahmen gewonnen wurden. Allerdings verbleiben hierbei Restmengen an bakteriellen Kontaminationen, die vorwiegend aus endogenen ribosomalen E. coli-Proteinen stammen und nicht vollständig entfernt werden konnten. Während der umfassenden in vitro Charakterisierung der BMP-2-Varianten konnte durch massenspektroskopische Analysen die Gesamtmasse beider Zielproteine bestätigt werden, wobei sequenzspezifische Fragmente eine eindeutige Identifikation der eingebrachten Mutationen ermöglichten. CD-spektroskopische Analysen erweitert um Auswertealgorithmen konnten die wesentlichen Wt-BMP-2-typischen Sekundärstrukturelemente identifizieren. Die neu generierten BMP-2-Varianten zeigen in der dynamischen Lichtstreuungsanalyse stark verminderte Aggregationstendenz im Vergleich zum Wildtyp-BMP-2. Dessen Aggregationsverhalten wurde durch die kombinierte Analytik seiner mikrofluidischen Diffusion und der dynamischen Lichtstreuung zum ersten Mal über den Konzentrationsbereich von 0.5 µM bis 100 mM genau charakterisiert. Erste zellbiologische Versuche verliefen ohne Erfolg, wodurch die biologische Aktivität der BMP-Varianten nicht abschließend geklärt werden konnte. Die simple Methode zur Expression und Aufreinigung der hydrophilisierte BMP-2-Muteine aus dieser Dissertation kann leicht in einen größeren Produktionsmaßstab überführt werden. BMP 2 kann dadurch schneller und kostengünstiger hergestellt werden. Final bleibt es jedoch erforderlich, die biologische Aktivität der neuen löslichen BMP-2-Varianten vollständig zu charakterisieren, um deren ganzes Funktionsspektrum zu entdecken. Der Fokus weiterer Forschung sollte zudem auf die verbleibende Oligomerisierungstendenz und die bestehende Kontamination mit Fremdproteinen gelegt werden, da diese beiden Faktoren letztendlich die Ausbeute an dimeren BMP-2 Varianten aus diesem System derzeit minimieren. N2 - Bone morphogenetic proteins (BMPs) are potent differentiation and growth factors that are structurally assigned to the transforming growth factor-β (TGF-β)-superfamily. They play key roles in a variety of cellular processes from the early stages of embryogenesis. Thereby, BMPs are not only responsible for the correct definition of the embryonic body axis, but also regulate proliferation, differentiation and apoptosis of different cell types as multifunctional mediators in addition to morphogenesis. Bone morphogenetic proteins are therefore jointly responsible for maintaining homeostasis in the adult body. The BMPs mediate their functionality via a signaling cascade by assembling specific transmembrane serine/threonine kinase receptors of type I and type II as a dimeric protein in a heteromeric complex. Intracellular signaling occurs via various signaling cascades (Smad proteins or MAPKs), which ultimately trigger changes in the cell nucleus at the level of gene transcription. According to the eponymous property, some growth factors act as active inducers of bone biosynthesis. Their presence is essential for many cellular processes that occur during fracture healing, while new bone formation is also heavily dependent on the interaction of various stimulators and inhibitors that regulate the activity of BMP’s. Due to their great potential, BMP proteins, which were first isolated from bone material by Marshal Urist in 1965, were used in regenerative medicine. The rhBMP-2 and rhBMP-7 are currently commercially available and have been in clinical use for many years. Among others, these two growth factors are used to improve the healing processes of lengthy tibia fractures, but also in degenerative spinal diseases and in jaw surgery. Due to the pronounced tendency to aggregate, the decreased solubility of BMP’s leads to serious problems, not only during biotechnological production but also in clinical use. The main focus of the need for optimization of BMP-2 production in the context of this doctoral thesis was the establishment of a prokaryotic expression system for the soluble production of BMP-2. For this purpose, the focus was initially placed on unfavorable solubility properties of the growth factor. In order to minimize the high aggregation tendency of BMP-2 during production in E. coli, BMP-2 variants were designed using an algorithm-based analysis, in which amino acids with strongly hydrophobic properties were exchanged for those with hydrophilic properties. Thereby, the areas of BMP-2 that tend to aggregate could mostly be eliminated. Different expression strategies were established for the protein variants optimized with regard to their solubility, whereby dimeric BMP-2 muteins were obtained in adapted chromatographic profiles with one purification step and without any renaturation measures. However, residual amounts of bacterial contamination remain, which originate mainly from endogenous ribosomal E. coli proteins and could not be completely removed. During the comprehensive in vitro characterization of the BMP-2 variants, the total mass of both target proteins could be confirmed by mass spectroscopic analysis, where sequence-specific fragments enabled unambiguous identification of the introduced mutations. CD spectroscopic analyzes extended by evaluation algorithms were able to identify the basic wt-BMP-2 typical secondary structure elements. In dynamic light scattering analysis, the newly generated BMP-2 variants show a greatly reduced aggregation tendency compared to wildtype-BMP-2. Its aggregation behavior was characterized for the first time over the concentration range from 0.5 µM to 100 mM by the combined analysis of its microfluidic diffusion sizing and dynamic light scattering. Initial cell biological experiments were not successful, whereby the biological activity of the BMP variants could not be conclusively clarified. The simple method for expression and purification of the hydrophilized BMP-2 muteins from this dissertation can easily be scaled up. However, it remains necessary to fully characterize the biological activity of the new soluble BMP-2 variants in order to discover their full range of functions. Further research should also focus on the remaining oligomerization tendency and the existing contamination with foreign proteins, as these two factors ultimately minimize the yield of dimeric BMP-2 variants from this system at present. KW - Knochen-Morphogenese-Proteine KW - BMP-2 Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-326800 ER - TY - THES A1 - Isasa, Emilie T1 - Relationship between wood properties, drought-induced embolism and environmental preferences across temperate diffuse-porous broadleaved trees T1 - Beziehung zwischen Holzeigenschaften, trockenheitsbedingter Embolie und Umweltpräferenzen bei zerstreutporigen Laubbäumen der gemäßigten Breiten N2 - In the scope of climate warming and the increase in frequency and intensity of severe heat waves in Central Europe, identification of temperate tree species that are suited to cope with these environmental changes is gaining increasing importance. A number of tree physiological characteristics are associated with drought-stress resistance and survival following severe heat, but recent studies have shown the importance of plant hydraulic and anatomical traits for predicting drought-induced tree mortality, such as vessel diameter, and their potential to predict species distribution in a changing climate. A compilation of large global datasets is required to determine traits related to drought-induced embolism and test whether embolism resistance can be determined solely by anatomical traits. However, most measurements of plant hydraulic traits are labour-intense and prone to measurement artefacts. A fast, accurate and widely applicable technique is necessary for estimating xylem embolism resistance (e.g., water potential at 50% loss of conductivity, P50), in order to improve forecasts of future forest changes. These traits and their combination must have evolved following the selective pressure of the environmental conditions in which each species occurs. Describing these environmental-trait relationships can be useful to assess potential responses to environmental change and mitigation strategies for tree species, as future warmer temperatures may be compounded by drier conditions. N2 - Im Rahmen der Klimaerwärmung und der Zunahme der Häufigkeit und Intensität schwerer Hitzewellen in Mitteleuropa gewinnt die Identifizierung von Baumarten der gemäßigten Zonen, die mit diesen Umweltveränderungen zurechtkommen, zunehmend an Bedeutung. Eine Reihe von physiologischen Merkmalen von Bäumen wird mit der Trockenstressresistenz und dem Überleben nach schweren Hitzewellen in Verbindung gebracht. Jüngste Studien haben jedoch gezeigt, wie wichtig pflanzenhydraulische und anatomische Merkmale für die Vorhersage der trockenheitsbedingten Baumsterblichkeit sind, z. B. der Gefäßdurchmesser, und wie wichtig diese wiederum für die Vorhersage der Artenverteilung in einem sich verändernden Klima sind. Eine Zusammenstellung großer globaler Datensätze ist erforderlich, um die Merkmale zu bestimmen, die mit trockenheitsbedingter Embolie zusammenhängen, und um zu prüfen, ob die Embolieresistenz allein durch anatomische Merkmale bestimmt werden kann. Die meisten Messungen der hydraulischen Eigenschaften von Pflanzen sind jedoch sehr arbeitsintensiv und anfällig für Messartefakte. Es wird ein schnelles, genaues und breit anwendbares Verfahren zur Schätzung der Xylem-Embolie-Resistenz (z. B. Wasserpotenzial bei 50 % Leitfähigkeitsverlust, P50) benötigt, um die Vorhersage künftiger Waldveränderungen zu verbessern. Diese Merkmale und ihre Kombination müssen sich unter dem Selektionsdruck der Umweltbedingungen, in denen die einzelnen Arten vorkommen, entwickelt haben. Die Beschreibung dieser Beziehungen zwischen Umwelt und Merkmalen kann nützlich sein, um potenzielle Reaktionen auf Umweltveränderungen und Schutzstrategien für Baumarten zu bewerten, da künftige wärmere Temperaturen mit trockeneren Bedingungen einhergehen könnten. KW - Pflanzenökologie KW - Klimaänderung KW - Dürrestress KW - Plant Ecology KW - Plant Biology KW - Climate change KW - Tree physiology KW - Plant hydraulic KW - Baumphysiologie KW - Klimawandel KW - Trockenstress KW - Pflanzenhydraulik Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-303562 ER - TY - THES A1 - Kopic, Eva T1 - On the physiological role of post-translational regulation of the \(Arabidopsis\) guard cell outward rectifying potassium channel GORK T1 - Die physiologische Rolle der posttranslationalen Regulation des auswärtsgleichrichtenden Kaliumkanals GORK in \(Arabidopsis\)-Schließzellen N2 - Das streng regulierte Gleichgewicht zwischen CO2-Aufnahme und Transpiration ist für Pflanzen essentiell und hängt von kontrollierten Turgoränderungen ab, die durch die Aktivität verschiedener Anionen- und Kationenkanäle verursacht werden. Diese Kanäle sind Teil von Signalkaskaden, die z. B. durch Phytohormone wie ABA (Abscisinsäure) und JA (Jasmonat) ausgelöst werden, die beide bei Trockenstress in den Schließzellen wirken. Darüber hinaus ist bekannt, dass JA an der Reaktion der Pflanze auf Pathogenbefall oder Verwundung beteiligt ist. GORK (guard cell outward rectifying K+ channel) ist der einzige bekannte, auswärts gleichrichtende K+-Kanal in Schließzellen und somit für den K+-Efflux beim Schließen der Stomata verantwortlich. Im Rahmen dieser Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass GORK ein wesentlicher Bestandteil des JA-induzierten Stomatschlusses ist. Dies gilt für beide Auslöser, sowohl die Blattverwundung als auch die direkte Anwendung von JA. Patch-Clamp-Experimente an Protoplasten von Schließzellen untermauerten dieses Ergebnis, indem sie GORK-K+-Auswärtsströme als direktes Ziel von JA-Signalen entlarvten. Da bekannt ist, dass zytosolische Ca2+-Signale sowohl bei ABA- als auch bei JA-Signalen eine Rolle spielen, wurde die Interaktion von GORK mit Ca2+-abhängigen Kinasen untersucht. Eine antagonistische Regulation von GORK durch CIPK5-CBL1/9-Komplexe und ABI2 konnte durch DEVC (double electrode voltage clamp) sowie Protein-Protein-Interaktions-Experimente identifiziert und durch in-vitro Kinase-Assays untermauert werden. Patch-Clamp-Aufzeichnungen an Protoplasten von Schließzellen der cipk5-2 Funktions-Verlust-Mutante zeigten die Bedeutung von CIPK5 für den JA-induzierten Stomaschluss via Aktivierung von GORK. Die Interaktion verschiedener CDPKs (Ca2+-abhängige Proteinkinasen) mit GORK wurde ebenfalls untersucht. Neben der Ca2+-Signalübertragung ist auch die Produktion von ROS (reaktive Sauerstoffspezies) für die ABA- und MeJA-Signalübertragung von Bedeutung. In DEVC-Experimenten konnte ein reversibler Effekt von ROS auf die GORK-Kanalaktivität nachgewiesen werden, was ein Teil der Erklärung für diese ROS-Effekte bei ABA- und MeJA-Signalen sein könnte. N2 - Maintaining the balance between CO2 uptake and transpiration is important for plants and depends on tightly controlled turgor changes caused by the activity of various anion and cation channels. These channels are part of signaling cascades triggered, for example, by phytohormones such as ABA (abscisic acid) and JA (jasmonate), both of which act during drought stress in guard cells. In addition, JA is known to be involved in the plant's response to pathogen attack or wounding. GORK (guard cell outward rectifying K+ channel) is the only known outward rectifying K+ channel in guard cells and therefore responsible for K+ efflux during stomatal closure. In the course of this work it could be demonstrated by stomatal aperture assays, that GORK is an essential part of JA-induced stomatal closure. This is true for both triggers, leaf wounding as well as direct MeJA (methyl jasmonate) application. Patch clamp experiments on guard cell protoplasts backed this finding by revealing GORK K+ outward currents as a target of JA signaling in guard cells. As cytosolic Ca2+ signals are known to be involved in both ABA as well as JA signaling, the interaction of GORK with Ca2+-dependent kinases was examined consequently. An antagonistic regulation of GORK by CIPK5-CBL1/9 complexes and ABI2 was identified by DEVC (double electrode voltage clamp) and protein-protein interaction experiments and backed up by in vitro kinase assays. Patch-clamp recordings on guard cell protoplasts of cipk5-2 kinase loss-of-function mutant revealed the importance of CIPK5 for JA-triggered stomatal closure via activation of GORK. The interaction of different CDPKs (Ca2+-dependent protein kinases) with GORK was also investigated. Besides Ca2+ signaling also ROS (reactive oxygen species) production is essential in ABA and MeJA signaling. In DEVC experiments a reversible effect of ROS on GORK channel activity could be demonstrated, which could be one piece in the explanation of those ROS effects in ABA and MeJA signaling. KW - Spaltöffnung KW - Patch-Clamp-Methode KW - Kaliumkanal KW - Posttranslationale Änderung KW - Stomaschluss KW - Jasmonate info Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-348806 ER - TY - THES A1 - Lu, Jinping T1 - The vacuolar TPC1 channel and its luminal calcium sensing site in the luminal pore entrance T1 - Der vakuoläre TPC1-Kanal und seine luminale Kalzium-Sensorstelle im luminalen Porenbereich N2 - The slowly activating vacuolar SV/TPC1 channel is ubiquitously expressed in plants and provides a large cation conductance in the vacuolar membrane. Thereby, monovalent (K+, Na+) and in principle also divalent cations, such as Ca2+, can pass through the channel. The SV/TPC1 channel is activated upon membrane depolarization and cytosolic Ca2+ but inhibited by luminal calcium. With respect to the latter, two luminal Ca2+ binding sites (site 1 Asp240/Asp454/Glu528, site 2 Glu239/Asp240/Glu457) were identified to coordinate luminal Ca2+. In this work, the characteristics of the SV/TPC1 channels in terms of regulation and function were further elucidated, focusing on the TPC1s of Arabidopsis thaliana and Vicia faba. For electrophysiological analysis of the role of distinct pore residues for channel gating and luminal Ca2+ sensing, TPC1 channel variants were generated by site-directed mutagenesis and transiently expressed as eGFP/eYFP-fusion constructs in Arabidopsis thaliana mesophyll protoplasts of the TPC1 loss-of-function mutant attpc1-2. 1. As visualized by confocal fluorescence laser-scanning microscopy, all AtTPC1 (WT, E605A/Q, D606N, D607N, E605A/D606N, E605Q/D606N/D607N, E457N/E605A/D606N) and VfTPC1 channel variants (WT, N458E/A607E/ N608D) were correctly targeted to the vacuole membrane. 2. Patch-clamp studies revealed that removal of one of the negative charges at position Glu605 or Asp606 was already sufficient to promote voltage-dependent channel activation with higher voltage sensitivity. The combined neutralization of these residues (E605A/D606N), however, was required to additionally reduce the luminal Ca2+ sensitivity of the AtTPC1 channel, leading to hyperactive AtTPC1 channels. Thus, the residues Glu605/Asp606 are functionally coupled with the voltage sensor of AtTPC1 channel, thereby modulating channel gating, and form a novel luminal Ca2+ sensing site 3 in AtTPC1 at the luminal entrance of the ion transport pathway. 3. Interestingly, this novel luminal Ca2+ sensing site 3 (Glu605/Asp606) and Glu457 from the luminal Ca2+ sensing site 2 of the luminal Ca2+-sensitive AtTPC1 channel were neutralized by either asparagine or alanine in the TPC1 channel from Vicia faba and many other Fabaceae. Moreover, the VfTPC1 was validated to be a hyperactive TPC1 channel with higher tolerance to luminal Ca2+ loads which was in contrast to the AtTPC1 channel features. As a result, VfTPC1 but not AtTPC1 conferred the hyperexcitability of vacuoles. When AtTPC1 was mutated for the three VfTPC1-homologous polymorphic site residues, the AtTPC1 triple mutant (E457N/E605A/D606N) gained VfTPC1-like characteristics. However, when VfTPC1 was mutated for the three AtTPC1-homologous polymorphic site residues, the VfTPC1 triple mutant (N458E/A607E/N608D) still sustained VfTPC1-WT-like features. These findings indicate that the hyperactivity of VfTPC1 is achieved in part by the loss of negatively charged amino acids at positions that - as part of the luminal Ca2+ sensing sites 2 and 3 – are homologous to AtTPC1-Glu457/Glu605/Asp606 and are likely stabilized by other unknown residues or domains. 4.The luminal polymorphic pore residues (Glu605/Asp606 in AtTPC1) apparently do not contribute to the unitary conductance of TPC1. Under symmetrical K+ conditions, a single channel conductance of about 80 pS was determined for AtTPC1 wild type and the AtTPC1 double mutant E605A/D606A. This is in line with the three-fold higher unitary conductance of VfTPC1 (232 pS), which harbors neutral luminal pore residues at the homologous sites to AtTPC1. In conclusion, by studying TPC1 channel from Arabidopsis thaliana and Vicia faba, the present thesis provides evidence that the natural TPC1 channel variants exhibit differences in voltage gating, luminal Ca2+ sensitivity and luminal Ca2+ binding sites. N2 - Der langsam aktivierende vakuoläre SV/TPC1-Kanal wird in Pflanzen ubiquitär exprimiert und besitzt eine große Kationenleitfähigkeit in der Vakuolen¬membran. Dabei können einwertige (K+, Na+) und im Prinzip auch zweiwertige Kationen, wie Ca2+, den Kanal passieren. Der SV/TPC1-Kanal wird bei Membrandepolarisation und zytosolischem Ca2+ aktiviert, aber durch luminales Calcium gehemmt. In Bezug auf letzteres wurden zwei luminale Ca2+-Bindungsstellen (Seite I Asp240/Asp454/Glu528, Seite II Glu239/Asp240/Glu457) zwecks Koordination von luminalem Ca2+ identifiziert. In dieser Arbeit wurden die Eigenschaften der SV/TPC1-Kanäle in Bezug auf Regulierung und Funktion weiter aufgeklärt, wobei der Schwerpunkt auf den TPC1-Proteinen von Arabidopsis thaliana und Vicia faba lag. Zur elektrophysiologischen Analyse der Rolle verschiedener Porenaminosäuren für das Kanal-Gating und die luminale Ca2+-Erkennung wurden TPC1-Kanalvarianten durch gezielte Mutagenese erzeugt und transient als eGFP/eYFP-Fusionskonstrukte in Mesophyll-Protoplasten der TPC1-Verlust¬mutante attpc1-2 von Arabidopsis thaliana exprimiert. 1. Mittels konfokaler Fluoreszenz-Laser-Scanning-Mikroskopie wurde anhand der eGFP- bzw. eYFP-Fluoreszenzsignale nachgewiesen, dass alle AtTPC1- (WT, E605A/Q, D606N, D607N, E605A/D606N, E605Q/D606N/D607N, E457N/E605A/D606N) und VfTPC1-Kanalvarianten (WT, N458E/A607E/ N608D) korrekt in die Vakuolenmembran eingebaut wurden. 2. Patch-Clamp-Studien zeigten, dass die Entfernung einer der negativen Ladungen an den Positionen Glu605 oder Asp606 bereits ausreichte, um die spannungsabhängige Kanalaktivierung mit höherer Spannungsempfindlichkeit zu fördern. Die kombinierte Neutralisierung dieser Reste (E605A/D606N) war jedoch erforderlich, um die luminale Ca2+-Empfindlichkeit des AtTPC1-Kanals zusätzlich zu reduzieren, was zu hyperaktiven AtTPC1-Kanälen führte. Die Aminosäurereste Glu605/Asp606 sind also funktionell mit dem Spannungssensor des AtTPC1-Kanals gekoppelt und modulieren dadurch das Kanaltor. Sie bilden eine neuartige luminale Ca2+-Sensorstelle 3 in AtTPC1 am luminalen Eingang des Ionentransportweges. 3. Interessanterweise waren diese Aminosäurereste Glu605/Asp606 der neuartigen luminalen Ca2+-Sensorstelle 3 und Glu457 von der luminalen Ca2+-Sensorstelle 2 des luminalen Ca2+-empfindlichen AtTPC1-Kanals im TPC1-Kanal von Vicia faba und vielen anderen Fabaceae entweder durch Asparagin oder Alanin neutralisiert. Darüber hinaus wurde der VfTPC1 als hyperaktiver TPC1-Kanal mit höherer Toleranz gegenüber luminalen Ca2+-Belastungen validiert, was im Gegensatz zu den Eigenschaften des AtTPC1-Kanals stand. Infolgedessen ist VfTPC1, nicht aber AtTPC1, für die hohe Erregbarkeit der Vakuolen verantwortlich. Wenn AtTPC1 für die drei VfTPC1-homologen polymorphen Stellen mutiert wurde, erhielt die AtTPC1-Dreifachmutante (E457N/E605A/D606N) VfTPC1-ähnliche Eigenschaften. Wenn VfTPC1 jedoch für die drei AtTPC1-homologen polymorphen Stellen mutiert wurde, behielt die VfTPC1-Dreifachmutante (N458E/A607E/N608D) weiterhin VfTPC1-WT-ähnliche Merkmale. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Hyperaktivität von VfTPC1 zum Teil durch den Verlust von negativ geladenen Aminosäuren an Positionen erreicht wird, die - als Teil der luminalen Ca2+-Sensorstellen 2 und 3 - homolog zu AtTPC1-Glu457/Glu605/Asp606 sind und wahrscheinlich durch andere unbekannte Reste oder Domänen stabilisiert werden. 4. Die luminalen polymorphen Porenreste (Glu605/Asp606 in AtTPC1) beeinflussen offenbar nicht die Einzelkanaleitfähigkeit von TPC1. Unter symmetrischen K+-Bedingungen wurde für den AtTPC1-Wildtyp und die AtTPC1-Doppelmutante E605A/D606A eine Einzelkanalleitfähigkeit von etwa 80 pS ermittelt. Dies steht im Einklang mit der dreifach höheren Einzelkanalleitfähigkeit von VfTPC1 (232 pS), der an den homologen Stellen zu AtTPC1 neutrale luminale Porenreste aufweist. Durch die Untersuchung von TPC1-Kanälen aus Arabidopsis thaliana und Vicia faba konnte in der vorliegenden Arbeit nachgewiesen werden, dass diese natürlichen TPC1-Kanalvarianten Unterschiede im Spannungs-Gating, der luminalen Ca2+-Empfindlichkeit und den luminalen Ca2+-Bindungsstellen aufweisen. KW - Arabidopsis thaliana KW - Vicia faba KW - vacuole KW - SV/TPC1 KW - luminal Ca2+ sensing sites KW - luminale Ca2+-Sensorstellen Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-251353 ER - TY - THES A1 - Schliermann [geb. Stratmann], Anna Theresa T1 - The Role of FGF Receptor 2 in GDF5 mediated Signal Transduction T1 - Die Rolle des FGF Rezeptors 2 in GDF5-vermittelter Signaltransduktion N2 - Bone morphogenetic proteins (BMPs) are involved in various aspects of cell-cell communication in complex life forms. They act as morphogens, help differentiate different cell types from different progenitor cells in development, and are involved in many instances of intercellular communication, from forming a body axis to healing bone fractures, from sugar metabolism to angiogenesis. If the same protein or protein family carries out many functions, there is a demand to regulate and fine-tune their biological activities, and BMPs are highly regulated to generate cell- and context-dependent outcomes. Not all such instances can be explained yet. Growth/differentiation factor (GDF)5 (or BMP14) synergizes with BMP2 on chondrogenic ATDC5 cells, but antagonizes BMP2 on myoblastic C2C12 cells. Known regulators of BMP2/GDF5 signal transduction failed to explain this context-dependent difference, so a microarray was performed to identify new, cell-specific regulatory components. One identified candidate, the fibroblast growth factor receptor (FGFR)2, was analyzed as a potential new co-receptor to BMP ligands such as GDF5: It was shown that FGFR2 directly binds BMP2, GDF5, and other BMP ligands in vitro, and FGFR2 was able to positively influence BMP2/GDF5-mediated signaling outcome in cell-based assays. This effect was independent of FGFR2s kinase activity, and independent of the downstream mediators SMAD1/5/8, p42/p44, Akt, and p38. The elevated colocalization of BMP receptor type IA and FGFR2 in the presence of BMP2 or GDF5 suggests a signaling complex containing both receptors, akin to other known co-receptors of BMP ligands such as repulsive guidance molecules. This unexpected direct interaction between FGF receptor and BMP ligands potentially opens a new category of BMP signal transduction regulation, as FGFR2 is the second receptor tyrosine kinase to be identified as BMP co-receptor, and more may follow. The integration of cell surface interactions between members of the FGF and BMP family especially may widen the knowledge of such cellular communication mechanisms which involve both growth factor families, including morphogen gradients and osteogenesis, and may in consequence help to improve treatment options in osteochodnral diseases. N2 - Bone morphogenetic proteins (BMPs) sind oft an interzellulärer Kommunikation beteiligt. Sie sind Morphogene, spielen eine Rolle in der Differenzierung von zahlreichen Zelltypen aus verschiedenen Vorgängerzellen während der Entwicklung, und sind an vielen weiteren Beispielen der Zell-Zell-Kommunikation beteiligt: von der Formation einer Körperachse bis hin zur Heilung von Knochenbrüchen, vom Zuckermetabolismus bis zur Angiogenese. Wann immer dasselbe Protein oder dieselbe Proteinfamilie so viele Funktionen erfüllt, bedarf es der Regulation und Feinabstimmung ihrer diversen biologischen Aktivitäten, und BMPs sind zu dem Erzielen zell- und kontextspezifischer Effekte in ihrer Wirkung entsprechend stark reguliert. Nicht in allen Fällen sind die Mechanismen solcher Regulation bisher bekannt. Growth/differentiation factor (GDF)5 (oder BMP14) agiert mit BMP2 auf den chondrogenen ATDC5 Zellen synergistisch, aber antagonisiert BMP2 auf den myoblastischen C2C12 Zellen. Diese kontextabhängige Diskrepanz konnte mithilfe der bekannten Regulatoren von BMP2/GDF5-mediierten Signalen nicht erklärt werden. Daher wurde ein Microarray durchgeführt, um neue, zellspezifische regulatorische Proteine zu identifizieren. Einer der identifizierten Kandidaten, fibroblast growth factor receptor (FGFR)2, wurde auf eine potentielle Funktion als neuer Korezeptor für BMP Liganden wie GDF5 analysiert: Es konnte gezeigt werden, dass FGFR2 BMP2, GDF5 und andere BMP Liganden in vitro direkt binden und die biologische Aktivität von BMP2 und GDF5 in Zellkultursystemen positiv beeinflussen konnte. Diese Beobachtungen waren unabhängig von der Kinaseaktivität des FGFR2, und unabhängig von den intrazellulären Mediatoren SMAD1/5/8, p42/p44, Akt und p38. Die erhöhte Kolokalisation von FGFR2 mit dem BMP Rezeptor IA in der Präsenz von BMP2 oder GDF5 weist darauf hin, dass der entsprechende Signalkomplex möglicherweise beide Rezeptoren gleichzeitig enthält; ähnlich, wie das für andere bekannte Korezeptoren von BMP Liganden wie etwa den repulsive guidance molecules der Fall ist. Die unerwartete direkte Interaktion von einem FGF Rezeptor mit BMP-Liganden ist möglicherweise nur ein Beispiel für einen generelleren Mechanismus. Tatsächlich ist FGFR2 bereits die zweite Rezeptortyrosinkinase, die als BMP-Korezeptor identifiziert wurde, und es ist möglich, dass es noch mehr gibt. Speziell im Bezug auf die FGF-BMP Interaktion bergen die hier dargestellten Ergebnisse Potential zu neuen Erkenntnissen. Die Proteinfamilien dieser beiden Wachstumsfaktoren sind häufiger an demselben zellulären Mechanismen beteiligt; etwa an der Entstehung von Morphogengradienten in der Entwicklung oder an der Osteogenese. Die Interaktion der FGF und BMP Proteinfamilien auf der Zelloberfläche könnte eine wertvolle Ergänzung zu der Untersuchung ihres Zusammenspiels im Zellinneren sein, und könnte in diesem Zusammenhang sogar langfristig die Behandlungsmöglichkeiten von osteochondralen Erkrankungen erweitern. KW - Molekularbiologie KW - FGF signaling KW - BMP signaling Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-192889 ER - TY - THES A1 - Li, Kunkun T1 - Dissecting the interconnection of Ca\(^{2+}\) and pH signaling in plants with a novel biosensor for dual imaging T1 - Untersuchung der Verknüpfung von Ca\(^{2+}\) und pH-Signalen in Pflanzen mit einem neuartigen Biosensor für duale Bildgebung N2 - Calcium ion (Ca2+) and protons (H+) are both regarded as second messengers, participating in plant growth and stress mechanisms. However, H+ signals in plant physiology are less well investigated compared to Ca2+ signals. If interconnections between these two second messengers exist remains to be uncovered because appropriate imaging tools to monitor Ca2+ and H+ simultaneously in the same cell as well as accurate bioinformatics analysis remain to be developed. To overcome this problem and unravel the role and possible interconnection of Ca2+ and H+ in plants, a new biosensor named CapHensor was developed and optimized to visualize intracellular Ca2+ and H+ changes simultaneously and ratiometrically in the same cell. The CapHensor consisted of an optimized green fluorescent pH sensor (PRpHluorin) and an established red fluorescent Ca2+ sensor (R-GECO1) that were combined in one construct via a P2A sequence. A P2A self-cleavage site between the two sensors allowed to express equal amounts but spatially separated sensors, which enabled artifact-free and ratiometric imaging of cellular Ca2+ and pH side-by-side. The function of the CapHensor was verified in pollen tubes, since they possess standing Ca2+ and pH gradients. We found better imaging quality and the signal-to-noise ratio to be enhanced in live-cell imaging when two R-GECO1 proteins were fused in tandem within the CapHensor construct. To guarantee exclusive subcellular localization and avoid mixed signals from different compartments, Nuclear Export Sequence (NES) and Nuclear Localization Sequence (NLS) were used to target PRpHluorin and R-GECO1 to distinct compartments. After optimization and verification its function, CapHensor was successfully expressed in different cell types to investigate the role of Ca2+ and H+ signals to control polar growth of pollen tube, stomatal movement or leaf defense signaling. Results obtained in the past indicated both Ca2+ gradients and pH gradients in pollen tubes play roles in polar growth. However, the role and temporal relationship between the growth process and changes in Ca2+ and pH have not been conclusively resolved. Using CapHensor, I found cytosolic acidification at the tip could promote and alkalization to suppress growth velocity in N. tabacum pollen tubes, indicating that cytosolic H+ concentrations ([H+]cyt) play an important role in regulation pollen tubes growth despite the accompanied changes in cytosolic Ca2+ concentrations ([Ca2+]cyt). Moreover, growth correlated much better with the tip [H+]cyt regime than with the course of the tip [Ca2+]cyt regime. However, surprisingly, tip-focused [Ca2+]cyt andII [H+]cyt oscillations both lagged behind growth oscillations approximately 33 s and 18 s, respectively, asking for a re-evaluation of the role that tip [Ca2+]cyt may play in pollen tube growth. Live-cell CapHensor imaging combined with electrophysiology uncovered that oscillatory membrane depolarization correlated better with tip [H+]cyt oscillations than with tip [Ca2+]cyt oscillations, indicative for a prominent role of [H+]cyt to also control electrogenic membrane transport. Using CapHensor, reading out cellular movement at the same time enabled to provide a precise temporal and spatial resolution of ion signaling events, pointing out a prominent role of [H+]cyt in pollen tube tip growth. For leaf cells, a special CapHensor construct design had to be developed, containing additional NES localization sequences to avoid overlapping of fluorescense signals from the nucleus and the cytosol. Once this was achieved, the role of Ca2+ and pH changes in guard cells, another typical single-cell system was investigated. Cytosolic pH changes have been described in stomatal movement, but the physiological role of pH and the interaction with changing Ca2+ signals were still unexplored. Combining CapHensor with the here developed technique to monitor stomatal movement in parallel, the role of Ca2+ and H+ in stomatal movement was studied in detail and novel aspects were identified. The phytohormone ABA and the bacterial elicitor flagellin (flg22) are typical abiotic and biotic stresses, respectively, to trigger stomatal closure. What kind of Ca2+ and H+ signals by ABA and flg22 are set-off in guard cells and what their temporal relationship and role for stomatal movement is were unknown. Similar [Ca2+]cyt increases were observed upon ABA and flg22 triggered stomatal closure, but [H+]cyt dynamics differed fundamentally. ABA triggered pronounced cytosolic alkalization preceded the [Ca2+]cyt responses significantly by 57 s while stomata started to close ca. 205 s after phytohormone application. With flg22, stomatal closure was accompanied only with a mild cytosolic alkalization but the [Ca2+]cyt response was much more pronounced compared to the ABA effects. Where the cytosolic alkalization originates from was unclear but the vacuole was speculated to contribute in the past. In this thesis, vacuolar pH changes were visualized by the dye BCECF over time, basically displaying exactly the opposite course of the concentration shift in the vacuole than observed in the cytosol. This is indicative for the vacuolar pH dynamics to be coupled strongly to the cytosolic pH changes. In stomatal closure signalling, reactive oxygen species (ROS) were proposed to play a major role, however, only very high concentration of H2O2 (> 200 µM), which resulted in the loss of membrane integrity, induced stomatal closure. Unexpectedly, physiological concentrations of ROS led to cytosolic acidificationIII which was associated with stomatal opening, but not stomatal closure. To study the role of [H+]cyt to steer stomatal movement in detail, extracellular and intracellular pH variations were evoked in N. tabacum guard cells and their behaviour was followed. The results demonstrated cytosolic acidification stimulated stomatal opening while cytosolic alkalization triggered stomatal closure accompanied by [Ca2+]cyt elevations. This demonstrated pH regulation to be an important aspect in stomatal movement and to feed-back on the Ca2+-dynamics. It was remarkable that cytosolic alkalization but not [Ca2+]cyt increase seemed to play a crucial role in stomatal closure, because more pronounced cytosolic alkalization, evoked stronger stomatal closure despite similar [Ca2+]cyt increases. Increases in [Ca2+]cyt, which are discussed as an early stomatal closure signal in the past, could not trigger stomatal closure alone in my experiments, even when extremely strong [Ca2+]cyt signals were triggered. Regarding the interaction between the two second messengers, [Ca2+]cyt and [H+]cyt were negatively correlated most of the times, which was different from pollen tubes showing positive correlation of [Ca2+]cyt and [H+]cyt regimes. [Ca2+]cyt elevations were always associated with a cytosolic alkalization and this relationship could be blocked by the presence of vanadate, a plasma membrane H+-pump blocker, indicating plasma membrane H+-ATPases to contribute to the negative correlation of [Ca2+]cyt and [H+]cyt. To compare with guard cells, cytosolic and nuclear versions of CapHensor were expressed in N. benthamiana mesophyll cells, a multicellular system I investigated. Mesophyll cell responses to the same stimuli as tested in guard cells demonstrated that ABA and H2O2 did not induce any [Ca2+]cyt and [H+]cyt changes while flg22 induced an increase in [Ca2+]cyt and [H+]cyt, which is different from the response in guard cells. I could thus unequivocally demonstrate that guard cells and mesophyll cells do respond differently with [Ca2+]cyt and [H+]cyt changes to the same stimuli, a concept that has been proposed before, but never demonstrated in such detail for plants. Spontaneous Ca2+ oscillations have been observed for a long time in guard cells, but the function or cause is still poorly understood. Two populations of oscillatory guard cells were identified according to their [Ca2+]cyt and [H+]cyt phase relationship in my study. In approximately half of the oscillatory cells, [H+]cyt oscillations preceded [Ca2+]cyt oscillations whereas [Ca2+]cyt was the leading signal in the other half of the guard cells population. Strikingly, natural [H+]cyt oscillations were dampened by ABA but not by flg22. This effect could be well explained by dampening of vacuolar H+ oscillations in the presence of ABA, but not through flg22. Vacuolar pH contributes to spontaneous [H+]cyt oscillations and ABA but not flg22 can block the interdependence of naturalIV [Ca2+]cyt and [H+]cyt signals. To study the role of [Ca2+]cyt oscillations in stomatal movement, solutions containing high and low KCl concentrations were applied aiming to trigger [Ca2+]cyt oscillations. The triggering of [Ca2+]cyt oscillations by this method was established two decades ago leading to the dogma that [Ca2+]cyt increases are the crucial signal for stomatal closure. However, I found stomatal movement by this method was mainly due to osmotic effects rather than [Ca2+]cyt increases. Fortunately, through this methodology, I found a strong correlation between cytosolic pH and the transport of potassium across the plasma membrane and vacuole existed. The plasma membrane H+-ATPases and H+-coupled K+ transporters were identified as the cause of [H+]cyt changes, both very important aspects in stomata physiology that were not visualized experimentally before. Na+ transport is also important for stomatal regulation and leaves generally since salt can be transported from the root to the shoot. Unlike well-described Ca2+- dependent mechanisms in roots, how leaves process salt stress is not at all understood. I applied salt on protoplasts from leaves, mesophyll cells and guard cells and combined live-cell imaging with Vm recordings to understand the transport and signaling for leaf cells to cope with salt stress. In both, mesophyll and guard cells, NaCl did not trigger Ca2+-signals as described for roots but rather triggered Ca2+ peaks when washing salt out. However, membrane depolarization and pronounced alkalinization were very reliably triggered by NaCl, which could presumably act as a signal for detoxification of high salt concentrations. In line with this, I found the vacuolar cation/H+ antiporter NHX1 to play a role in sodium transport, [H+]cyt homeostasis and the control of membrane potential. Overexpression of AtNHX1 enabled to diminish [H+]cyt changes and resulted in a smaller depolarization responses druing NaCl stress. My results thus demonstrated in contrast to roots, leaf cells do not use Ca2+-dependent signalling cascades to deal with salt stress. I could show Na+ and K+ induced [H+]cyt and Vm responses and Cl- transport to only have a minor impact. Summing all my results up briefly, I uncovered pH signals to play important roles to control pollen tube growth, stomatal movement and leaf detoxification upon salt. My results strongly suggested pH changes might be a more important signal than previously thought to steer diverse processes in plants. Using CapHensor in combination with electrophysiology and bioinformatics tools, I discovered distinct interconnections between [Ca2+]cyt and [H+]cyt in different cell types and distinct [Ca2+]cyt and [H+]cyt signals are initiated through diverse stimuli and environmental cues. The CapHensor will be very useful in the future to further investigate the coordinated role of Ca2+ and pH changes in controlling plant physiology. N2 - Kalziumionen (Ca2+) und Protonen (H+) werden beide als Botenstoffe angesehen, die am Pflanzenwachstum und an Mechanismen zur Stressbewältigung beteiligt sind. In der Pflanzenphysiologie sind H+-Signale jedoch im Vergleich zu Ca2+-Signalen weniger gut untersucht. Die Frage, ob zwischen diesen beiden Botenstoffen Zusammenhänge bestehen, muss noch geklärt werden, da geeignete bildgebende Verfahren zur gleichzeitigen Aufzeichnung von Ca2+ und H+ Signalen sowie eine genaue bioinformatische Analyse noch entwickelt werden müssen. Um dieses Problem zu überwinden und die Rolle und möglichen Zusammenhang von Ca2+ und H+ Signalen in Pflanzen zu entschlüsseln, wurde ein neuer Biosensor namens CapHensor entwickelt und optimiert, um intrazelluläre Ca2+- und H+-Veränderungen gleichzeitig und ratiometrisch zu untersuchen. Der CapHensor bestand aus einem optimierten grün fluoreszierenden pH-Sensor (PRpHluorin) und einem etablierten rot fluoreszierenden Ca2+-Sensor (R-GECO1), die über eine P2A-Sequenz in einem Konstrukt kombiniert wurden. Eine sogenannte P2A-„self-cleavage site“ zwischen den beiden Sensoren ermöglichte die Expression gleicher Mengen, aber räumlich getrennter Sensoren, was eine artefaktfreie und ratiometrische Darstellung von zellulärem Ca2+ und pH nebeneinander ermöglichte. Die Funktion des CapHensors wurde in Pollenschläuchen verifiziert, da diese einen ständigen Ca2+- und pH-Gradienten aufweisen. Wir stellten fest, dass die Qualität der Bildaufnahmen und das Signal-Rausch-Verhältnis bei der Bildgebung in lebenden Zellen verbessert wurden, wenn zwei R-GECO1-Proteine innerhalb des CapHensor-Konstrukts translational fusioniert wurden. Um eine ausschließliche zytosolische Lokalisierung zu gewährleisten und gemischte Signale aus verschiedenen Kompartimenten zu vermeiden, wurden sogenannte „Nuclear Export Sequence“ (NES) und die „Nuclear Localization Sequence“ (NLS) verwendet, um PRpHluorin und R-GECO1 in unterschiedlichen Kompartimente zu lokalisieren. Nach der Optimierung und Überprüfung seiner Funktionsweise wurde CapHensor erfolgreich in verschiedenen Zelltypen exprimiert, um die Rolle von Ca2+- und H+-Signalen bei der Kontrolle des polaren Wachstums von Pollenschläuchen, die Stomabewegung oder Abwehrmechanismen der Blätter zu untersuchen. Die in der Vergangenheit erzielten Ergebnisse deuten darauf hin, dass sowohl der Ca2+-Gradient als auch der pH-Gradient in Pollenschläuchen eine Rolle beim polaren Wachstum spielen, wobei dem Ca2+-Gradient zum Teil die Hauptrolle zugesprochen wird. Die Rolle und die zeitlicheVI Beziehung zwischen dem Wachstumsprozess und den Veränderungen von Ca2+ und pH sind jedoch noch nicht abschließend geklärt. Mit Hilfe von CapHensor fand ich heraus, dass eine zytosolische Ansäuerung an der Spitze die Wachstumsgeschwindigkeit in N. tabacumPollenschläuchen fördern und eine Alkalisierung die Wachstumsgeschwindigkeit unterdrücken kann, was darauf hindeutet, dass die zytosolische H+-Konzentration ([H+]cyt) trotz der damit einhergehenden Veränderungen der zytosolischen Ca2+-Konzentration ([Ca2+]cyt) eine wichtige Rolle bei der Regulierung des Wachstums von Pollenschläuchen spielt. Außerdem korrelierte das Wachstum viel besser mit dem [H+]cyt-Verlauf an der Spitze als mit dem Verlauf des [Ca2+]cytSignals. Überraschenderweise hinkten jedoch sowohl die [Ca2+]cyt- als auch die [H+]cytOszillationen an der Spitze den Wachstumsoszillationen um etwa 33 s bzw. 18 s hinterher, so dass die Rolle von [Ca2+]cyt an der Spitze für das Wachstum des Pollenschlauchs neu bewertet werden muss. Die CapHensor-Bildgebung an lebenden Zellen in Kombination mit Elektrophysiologie ergab, dass die oszillierende Membrandepolarisation besser mit den [H+]cyt-Oszillationen an der Spitze korrelierte als mit den [Ca2+]cyt-Oszillationen, was darauf hindeutet, dass [H+]cyt auch eine wichtige Rolle bei der Kontrolle des elektrogenen Membrantransports spielt. Mit Hilfe des CapHensors und dem gleichzeitigen Auslesen der Zellbewegungen konnte eine präzise zeitliche und räumliche Auflösung der Ereignisse erzielt werden, was auf eine herausragende Rolle von [H+]cyt beim Wachstum der Pollenschlauchspitze hinweist. Für den Einsatz des CapHensors in Blattzellen musste ein spezielles CapHensor-Konstrukt entwickelt werden, das zusätzliche NES-Lokalisierungssequenzen enthielt, um eine Überlappung der Fluoreszenzsignale aus dem Zellkern und dem Zytosol zu vermeiden. Nachdem dies erreicht war, wurde die Rolle von Ca2+- und pH-Änderungen in Schließzellen, einem gut beschriebenen Einzelzellsystem, untersucht. Veränderungen des zytosolischen pH-Werts wurden bei der Bewegung von Stomata in früheren Studien beschrieben, aber die physiologische Rolle dieser Veränderungen und die Interaktion mit sich verändernden Ca2+-Signalen waren noch unerforscht. Der Einsatz von CapHensor zusammen mit der von mir entwickelten Technik zur parallelen Erfassung der Stomatabewegung hat unser Verständnis der Rolle von Ca2+ und H+ bei der Stomatabewegung erheblich verbessert. Das Phytohormon ABA und der bakterielle Elicitor Flagellin (flg22) sind typische abiotische bzw. biotische Stressfaktoren, die das Schließen der Stomata auslösen. Welche Art von Ca2+- und H+-Signalen in den Schließzellen durch ABA und flg22 ausgelöst werden und in welchem zeitlichen Zusammenhang sie stehen und welche Rolle sieVII für die Bewegung der Stomata spielen, war bisher unbekannt. Bei der durch ABA und flg22 ausgelösten Schließung der Stomata wurde ein Anstieg von [Ca2+]cyt beobachtet, aber die Dynamik von [H+]cyt unterschied sich grundlegend und zeigte eine andere Dynamik. ABA löste eine ausgeprägte zytosolische Alkalisierung aus, die der [Ca2+]cyt-Antwort um 57 s deutlich vorausging, während die Spaltöffnungen erst ca. 205 s danach anfingen zu schliessen. Bei Flg22 ging das Schließen der Spaltöffnungen nur mit einer leichten zytosolischen Alkalisierung einher, aber die Ca2+-Reaktion war im Vergleich zur ABA-Reaktion viel ausgeprägter. Woher die zytosolische Alkalisierung stammt, war unklar, aber in der Vergangenheit wurde spekuliert, dass die Vakuole dazu beiträgt. In dieser Arbeit wurden vakuoläre pH-Änderungen mit Hilfe des Farbstoffs BCECF über die Zeit verfolgt, wobei die Konzentrationsverschiebung in der Vakuole im Grunde genommen genau den umgekehrten Verlauf aufwies als im Zytosol beobachtet. Dies deutet darauf hin, dass die Dynamik des vakuolären pH-Wertes stark an die Änderungen des zytosolischen pHWertes gekoppelt ist. Aus der Literatur ist bekannt, dass reaktive Sauerstoffspezies (ROS) bei der Signalgebung für das Schließen der Stomata eine wichtige Rolle spielen. Als ich jedoch definierte H2O2-Mengen auf die Zellen applizierte, führten nur unphysiologosch hohe H2O2-Konzentrationen (> 200 µM), die zu einem Verlust der Membranintegrität führten, zum Schließen der Stomata. Unerwarteterweise führten physiologische Konzentrationen von ROS zu einer Ansäuerung des Zytosols, die mit der Öffnung der Stomata, aber nicht mit der Schließung der Stomata in Verbindung gebracht wurde. Um die Rolle von [H+]cyt bei der Steuerung der stomatären Bewegung im Detail zu untersuchen, wurden extrazelluläre und intrazelluläre pH-Änderungen in N. tabacumSchließzellen hervorgerufen um deren Verhalten bei pH-Änderungen zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigten, dass eine zytosolische Ansäuerung die Öffnung der Stomata stimuliert, während eine zytosolische Alkalisierung die Schließung der Stomata auslöst, begleitet von einem Anstieg von [Ca2+]cyt. Dies beweist, dass die pH-Regulierung ein wichtiger Aspekt der stomatären Bewegung darstellt und auf die Ca2+-Dynamik einwirkt. Bemerkenswert war, dass die zytosolische Alkalisierung und nicht der Ca2+-Anstieg eine entscheidende Rolle bei der Schließung der Stomata zu spielen schien, da eine stärkere zytosolische Alkalisierung trotz eines ähnlichen [Ca2+]cyt - Anstiegs eine stärkere Schließung der Stomata hervorrief. Erhöhungen von [Ca2+]cyt, die in der Vergangenheit als frühes Stomataschließungssignal diskutiert wurden, konnten in meinen Experimenten den Stomataschluß nicht allein auslösen, selbst wenn extrem starke Ca2+-Signale ausgelöst wurden. Was die Interaktion zwischen den beiden Botenstoffen anbelangt, so warenVIII [Ca2+]cyt und [H+]cyt meist negativ miteinander korreliert, was sich von den Pollenschläuchen unterschied, die eine positive Korrelation zwischen [Ca2+]cyt und [H+]cyt aufwiesen. Ca2+- Erhöhungen waren immer mit einer Alkalisierung des Zytosols verbunden, und diese Beziehung konnte durch die Anwesenheit von Vanadat, ein H+-Pumpen Blocker blockiert werden, was darauf hindeutet, dass die H+-ATPasen der Plasmamembran zu der negativen Korrelation von [Ca2+]cyt und [H+]cyt beitragen. Im Vergleich zu den CapHensor-Reaktionen bei Schließzellen wurden zytosolische und Zellkern-lokalisierende Versionen von CapHensor in Mesophyllzellen von N. benthamiana, einem von uns untersuchten multizellulären System, exprimiert. Die Reaktionen der Mesophyllzellen auf die gleichen Stimuli wie bei den Schließzellen zeigten, dass ABA und H2O2 keine Veränderungen von [Ca2+]cyt und [H+]cyt hervorrufen, während flg22 einen Anstieg von [Ca2+]cyt und [H+]cyt bewirkt, der sich von der Reaktion in Schließzellen unterscheidet. Damit konnte ich eindeutig nachweisen, dass Schließ- und Mesophyllzellen in Bezug auf [Ca2+]cyt- und [H+]cyt-Änderungen sehr unterschiedlich auf dieselben Stimuli reagieren, ein Konzept, das zwar schon früher vorgeschlagen, aber noch nie so detailliert für Pflanzen nachgewiesen wurde. Ein Phänomen, das seit langem in Schließzellen beobachtet wird, dessen Funktion oder Ursache aber noch nicht verstanden ist, sind regelmäßige Ca2+-Oszillationen, die spontan auftreten. Interessanterweise wurden zwei Populationen von oszillierenden Schließzellen anhand ihrer [Ca2+]cyt- und [H+]cyt-Phasenbeziehung identifiziert. Bei etwa der Hälfte der oszillierenden Zellen gingen die [H+]cyt-Oszillationen den [Ca2+]cyt-Oszillationen voraus, während in der anderen Hälfte der Schließzellenpopulation [Ca2+]cyt das vorangehende Signal war. Auffallend ist, dass die natürlichen [H+]cyt-Oszillationen durch ABA gedämpft wurden, nicht aber durch flg22. Dieser Effekt lässt sich gut durch die Dämpfung der vakuolären H+-Oszillationen in Gegenwart von ABA erklären, aber nicht durch flg22, das ich mit BCECF sichtbar gemacht habe. Es zeigte sich, dass sowohl der vakuoläre pH-Wert zu spontanen [H+]cyt-Oszillationen beiträgt als auch, dass ABA, nicht aber flg22, den Zusammenhang der natürlichen [Ca2+]cyt- und [H+]cyt-Signale blockieren kann. Um die Rolle der [Ca2+]cyt-Oszillationen bei der Bewegung der Stomata zu untersuchen, wurden Lösungen mit hohen und niedrigen KCl-Konzentrationen verwendet, um [Ca2+]cyt-Oszillationen auszulösen. Das Auslösen von Ca2+-Oszillationen nach dieser Methode wurde in Studien vor zwei Jahrzehnten etabliert, und die Ergebniss daraus haben zu dem Dogma geführt, dass der Anstieg von [Ca2+]cyt das entscheidende Signal für die Schließung von Stomata ist. Ich habe jedoch herausgefunden, dass die Bewegung der Stomata mit dieser Methode hauptsächlich auf osmotischeIX Effekte und nicht auf die Auswirkungen der [Ca2+]cyt-Erhöhungen zurückzuführen waren. Glücklicherweise fand ich mit dieser Methode heraus, dass es eine starke Korrelation zwischen dem zytosolischen pH-Wert und dem Kaliumtransport über die Plasmamembran und die Vakuole gibt. Die H+-ATPasen der Plasmamembran und die H+-gekoppelten K+-Transporter wurden als Ursache für die pH-Änderungen identifiziert, beides sehr wichtige Aspekte in der Stomaphysiologie, die zuvor nicht experimentell sichtbar gemacht werden konnten. Der Transport von Natriumionen (Na+) ist für die Regulierung der Stomata und der Adaption von Blättern bei Salzstress wichtig, da Salz von der Wurzel zum Spross transportiert werden kann. Im Gegensatz zu den gut beschriebenen Ca2+-abhängigen Na+-Transportmechanismen in den Wurzeln ist überhaupt nicht bekannt, wie Blätter Salzstress verarbeiten. Ich habe Salz auf Protoplasten von Blättern, Mesophyllzellen und Schießzellen appliziert und „Live-Cell-Imaging“ mit Aufzeichnungen der Membranspannung kombiniert, um den Transport und die Signalreizweiterleitung bei Salzstress in Blättern zu verstehen. Sowohl in Mesophyll- als auch in Schließzellen löste NaCl keine Ca2+-Signale aus, wie sie für Wurzeln beschrieben wurden, sondern führte beim Auswaschen von Salz zu [Ca2+]cyt-Transienten. Eine Membrandepolarisation und eine ausgeprägte Alkalisierung wurden jedoch sehr zuverlässig durch NaCl ausgelöst, was vermutlich als Signal für die Entgiftung von hohen Salzkonzentrationen dienen könnte. Im Einklang damit konnte ich zeigen, dass der vakuoläre Kationen/H+-Antiporter NHX1 eine Rolle beim Natriumtransport, der zytosolischen pH-Homöostase und der Kontrolle des Membranpotenzials spielt. Die Überexpression von AtNHX1 ermöglichte es, [H+]cyt-Veränderungen zu vermindern und führte zu einer geringeren Depolarisationsreaktion unter NaCl-Stress. Meine Ergebnisse zeigen somit, dass Blattzellen im Gegensatz zu Wurzeln keine Ca2+-abhängigen Signalkaskaden nutzen, um mit Salzstress umzugehen, und ich konnte zeigen, dass Na+ und K+ die [H+]cyt- und Membranspannungs-Reaktionen auslöst und der Cl--Transport nur einen geringen Einfluss hat. Zusammenfassend habe ich festgestellt, dass pH-Signale eine wichtige Rolle bei der Kontrolle des Wachstums von Pollenschläuchen spielen, sowie bei der Bewegung der Stomata und der Entgiftung der Blätter durch Salz beteiligt sind. Meine Ergebnisse deuten stark darauf hin, dass pH-Änderungen ein wichtigeres Signal für die Steuerung verschiedener Prozesse in Pflanzen sein könnten als bisher angenommen. Durch den Einsatz des CapHensors in Kombination mit elektrophysiologischen und bioinformatischen Methoden konnte ich feststellen, dass in verschiedenen Zelltypen unterschiedliche Zusammenhänge zwischen [Ca2+]cyt und [H+]cyt bestehenX und dass unterschiedliche [Ca2+]cyt- und [H+]cyt-Signale durch verschiedene Stimuli und Umweltreize ausgelöst werden. Der CapHensor wird in Zukunft sehr nützlich sein, um die koordinierte Rolle von Ca2+- und pH-Änderungen bei der Steuerung der Pflanzenphysiologie weiter zu untersuchen. KW - Calcium KW - pH KW - live-cell imaging KW - pollen tubes KW - guard cells KW - mesophyll cells KW - Pflanzen KW - Biosensor KW - Bilderzeugung Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-249736 ER - TY - THES A1 - Lambour, Benjamin T1 - Regulation of sphingolipid long-chain bases during cell death reactions and abiotic stress in \(Arabidopsis\) \(thaliana\) T1 - Regulation von Sphingobasen während der Zelltodreaktion und abiotischem Stress in \(Arabidopsis\) \(thaliana\) N2 - Sphingobasen (LCBs) sind die Bausteine der Biosynthese von Sphingolipiden. Sie werden als Strukturelemente der pflanzlichen Zellmembran definiert und spielen eine wichtige Rolle für das Schicksal der Zellen. Komplexe Ceramide machen einen wesentlichen Teil der gesamten Sphingolipide aus, die einen großen Teil der eukaryotischen Membranen bilden. Gleichzeitig sind LCBs bekannte Signalmoleküle für zelluläre Prozesse in Eukaryonten und sind an Signalübertragungswegen in Pflanzen beteiligt. Es hat sich gezeigt, dass hohe LCB-Konzentrationen mit der Induktion des programmierten Zelltods sowie mit dem durch Pathogene ausgelösten Zelltod in Verbindung stehen. Mehrere Studien haben die regulierende Funktion der Sphingobasen beim programmierten Zelltod (PCD) in Pflanzen bestätigt: (i) Spontaner PCD und veränderte Zelltodreaktionen, die durch mutierte verwandte Gene des Sphingobasen-Stoffwechsels verursacht werden. (ii) Zelltodbedingungen erhöhen den Gehalt an LCBs. (iii) PCD aufgrund eines gestörten Sphingolipid-Stoffwechsels, der durch von nekrotrophen Krankheitserregern produzierte Toxine wie Fumonisin B1 (FB1) hervorgerufen wird. Um den Zelltod zu verhindern und die Zelltodreaktion zu kontrollieren, kann daher die Regulierung des Gehalts an freien LCBs entscheidend sein. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie stellten das Verständnis der Sphingobasen und Sphingolipidspiegel während der PCD in Frage. Wir lieferten eine detaillierte Analyse der Sphingolipidspiegel, die Zusammenhänge zwischen bestimmten Sphingolipidarten und dem Zelltod aufzeigte. Darüber hinaus ermöglichte uns die Untersuchung der Sphingolipid-Biosynthese ein Verständnis des Fluxes nach Akkumulation hoher LCB-Konzentrationen. Weitere Analysen von Abbauprodukten oder Sphingolipid-Mutantenlinien wären jedoch erforderlich, um vollständig zu verstehen, wie die Pflanze mit hohen Mengen an Sphingobasen umgeht. N2 - Sphingolipid long-chain bases (LCBs) are the building blocks of the biosynthesis of sphingolipids. They are defined as structural elements of the plant cell membrane and play an important role determining the fate of the cells. Complex ceramides represent a substantial fraction of total sphingolipids which form a major part of eukaryotic membranes. At the same time, LCBs are well known signaling molecules of cellular processes in eukaryotes and are involved in signal transduction pathways in plants. High levels of LCBS have been shown to be associated with the induction of programmed cell death as well as pathogen-derived toxin-induced cell death. Indeed, several studies confirmed the regulatory function of sphingobases in plant programmed cell death (PCD): (i) Spontaneous PCD and altered cell death reaction caused by mutated related genes of sphingobase metabolism. (ii) Cell death conditions increases levels of LCBs. (iii) PCD due to interfered sphingolipid metabolism provoked by toxins produced from necrotrophic pathogens, such as Fumonisin B1 (FB1). Therefore, to prevent cell death and control cell death reaction, the regulation of levels of free LCBs can be crucial. The results of the present study challenged the comprehension of sphingobases and sphingolipid levels during PCD. We provided detailed analysis of sphingolipids levels that revealed correlations of certain sphingolipid species with cell death. Moreover, the investigation of sphingolipid biosynthesis allowed us to understand the flux after the accumulation of high LCB levels. However, further analysis of degradation products or sphingolipid mutant lines, would be required to fully understand how high levels of sphingobases are being treated by the plant. KW - PCD KW - Sphingolipids KW - LCB KW - Ackerschmalwand KW - programmed cell death KW - arabidopsis thaliana KW - abiotic stress Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-325916 ER - TY - THES A1 - Fei, Lin T1 - Optogenetic regulation of osmolarity and water flux T1 - Optogenetische Regulation der Osmolarität und des Wasserflusses N2 - Optogenetics is a powerful technique that utilizes light to precisely regulate physiological activities of neurons and other cell types. Specifically, light-sensitive ion channels, pumps or enzymes are expressed in cells to enable their regulation by illumination, thus allowing for precise control of biochemical signaling pathways. The first part of my study involved the construction, optimization, and characterization of two optogenetic tools, KCR1 and NCR1. Elena Govorunova et al. discovered a lightgated potassium channel, KCR1, in the protozoan Hyphochytrium catenoides. Traditional potassium ion channels are classified as either ligand-gated or voltage-gated and possess conserved pore-forming domains and K+ -selective filters. However, KCR1 is unique in that it does not contain the signature sequence of previously known K+ channels and is a channelrhodopsin. We synthesized the KCR1 plasmid according to the published sequence and expressed it in Xenopus oocytes. Due to the original KCR1 current being too small, I optimized it into KCR1 2.0 to improve its performance by fusing LR (signal peptide LucyRho, enhances expression) at the N-terminal and T (trafficking signal peptide) and E (ER export signal peptide) at the C-terminal. Additionally, I investigated the light sensitivity, action spectrum, and kinetics of KCR1 2.0 in Xenopus oocytes. The potassium permeability of KCR1 2.0, PK/Pna  24, makes KCR1 2.0 a powerful hyperpolarizing tool that can be used to inhibit neuronal firing in animals. Inspired by KCR1, we used the KCR1 sequence as a template for gene sequence alignment with the sequences in H. catenoides. We found that NCR1 and KCR1 have similar gene sequences. NCR1 was characterized by us as a light-gated sodium channel. This NCR1 was also characterized and published by Govorunova et al. very recently, with the name HcCCR. Due to the original NCR1 current being too small, I optimized it into NCR1 2.0 to improve its performance by fusing LR at the N-terminal and T and E at the C-terminal, which significantly improved the expression level and greatly increased the current amplitude of NCR1. Full-length NCR1 2.0 contains 432 amino acids. To test whether the number of amino acids changes the characteristics of NCR1 2.0, we designed NCR1 2.0 (330), NCR1 2.0 (283), and NCR1 2.0 (273) by retaining the number of amino acids at 330, 280, and 273 in NCR1 2.0, respectively. As the number of amino acids decreased, the current in NCR1 2.0 increased. I also investigated the light sensitivity, action spectrum, and kinetics of NCR1 2.0 (273) in the Xenopus Abstract 2 oocytes. We performed four point mutations at amino acid positions 133 and 116 of NCR1 2.0 and analyzed the reversal potentials of the mutants. The mutations were as follows: NCR1 2.0 (273 D116H), NCR1 2.0 (273 D116E), NCR1 2.0 (283 V133H), and NCR1 2.0 (283 D116Q). The second part of this study focuses on light-induced water transport using optogenetic tools. We explored the use of optogenetic tools to regulate water flow by changing the osmolarity in oocytes. Water flux through AQP1 is driven by the osmotic gradient that results from concentration differences of small molecules or ions. Therefore, we seek to regulate ion concentrations, using optogenetic tools to regulate the flux of water noninvasively. To achieve this, I applied the light-gated cation channels XXM 2.0 and NCR1 2.0 to regulate the concentration of Na+ , while K + channel KCR1 2.0 was used to regulate K + concentration. As Na+ flows into the Xenopus oocytes, the membrane potential of the oocytes becomes positive, and Clcan influx through the light-gated anion channel GtACR1. By combining these optogenetic tools to regulate NaCl or KCl concentrations, I can change the osmolarity inside the oocytes, thus regulating the flux of water. I co-expressed AQP1 with optogenetic tools in the oocytes to accelerate water flux. Overall, I designed three combinations (1: AQP1, XXM 2.0 and GtACR1. 2: AQP1, NCR1 2.0 and GtACR1. 3: AQP1, KCR1 2.0 and GtACR1) to regulate the flow of water in oocytes. The shrinking or swelling of the oocytes can only be achieved when AQP1, light-gated cation channels (XXM 2.0/NCR1 2.0/KCR1 2.0), and light-gated anion channels (GtACR1) are expressed together. The illumination after expression of either or both alone does not result in changes in oocyte morphology. In sum, I demonstrated a novel strategy to manipulate water movement into and out of Xenopus oocytes, non-invasively through illumination. These findings provide a new avenue to interfere with water homeostasis as a means to study related biological phenomena across cell types and organisms. N2 - Die Optogenetik ist eine leistungsstarke Technik, die Licht zur präzisen Regulierung der physiologischen Aktivitäten von Neuronen und anderen Zelltypen einsetzt. Konkret werden Licht-empfindliche Ionenkanäle, Pumpen oder Enzyme in Zellen exprimiert, um ihre Regulierung durch Belichtung zu ermöglichen und so eine präzise Kontrolle biochemischer Signalwege zu ermöglichen. Der erste Teil meiner Studie umfasste die Konstruktion, Optimierung und Charakterisierung von zwei optogenetischen Werkzeugen, KCR1 und NCR1. Elena Govorunova und Mitarbeiter entdeckten einen lichtgesteuerten Kaliumkanal, KCR1, in dem Protozoen Hyphochytrium catenoides. Herkömmliche Kalium-Ionenkanäle werden entweder als ligandengesteuert oder spannungsgesteuert klassifiziert und verfügen über konservierte porenbildende Domänen und K+-selektive Filter. KCR1 ist jedoch insofern einzigartig, als er nicht die Signatursequenz der bisher bekannten K+-Kanäle enthält und ein Kanalrhodopsin ist. Wir synthetisierten das KCR1-Plasmid entsprechend der veröffentlichten Sequenz und exprimierten es in Xenopus-Oozyten. Da der ursprüngliche KCR1-Strom zu klein war, optimierte ich ihn zu KCR1 2.0, um seine Leistung zu verbessern, indem LR (Signalpeptid LucyRho, verbessert die Expression) am N-Terminus und T (Trafficking-Signalpeptid) und E (ER-Export-Signalpeptid) am C-Terminus fusioniert wurden. Außerdem untersuchte ich die Lichtempfindlichkeit, das Wirkungs-Spektrum und die Kinetik von KCR1 2.0 in Xenopus-Oozyten. Die Kaliumpermeabilität von KCR1 2.0, PK/PNa  24, macht KCR1 2.0 zu einem leistungsfähigen hyperpolarisierenden Werkzeug, das zur Hemmung von Nervenzellen in Tieren eingesetzt werden kann. Inspiriert von KCR1 verwendeten wir die KCR1-Sequenz als Vorlage für den Gen-Sequenzabgleich mit Sequenzen in H. catenoides. Wir fanden heraus, dass NCR1 und KCR1 ähnliche Gensequenzen haben. NCR1 wurde von uns als lichtgesteuerter Natriumkanal charakterisiert. NCR1 wurde ebenfalls von Govorunova et al. charakterisiert und vor kurzem unter dem Namen HcCCR veröffentlicht. Da der ursprüngliche NCR1-Strom zu gering war, optimierte ich ihn zu NCR1 2.0, um seine Leistung zu verbessern, indem ich LR am N-Terminus und T und E am C-Terminus fusionierte, was das Expressionsniveau erheblich verbesserte und die Stromamplitude von NCR1 stark erhöhte. NCR1 2.0 in voller Länge enthält 432 Aminosäuren. Um zu testen, ob die Anzahl der Aminosäuren die Eigenschaften von NCR1 2.0 verändert, haben wir NCR1 2.0 (330), NCR1 2.0 (283) und NCR1 2.0 (273) entwickelt, indem wir die Anzahl der Aminosäuren auf 330, 280 bzw. 273 in NCR1 2.0 verkürzt haben. Mit abnehmender Anzahl der Aminosäuren nahm der Strom in NCR1 2.0 zu. Ich untersuchte auch die Licht-Empfindlichkeit, das Wirkungsspektrum und die Kinetik von NCR1 2.0 (273) in Xenopus-Oozyten. Wir führten vier Punktmutationen an den Aminosäurepositionen 133 und 116 von NCR1 2.0 durch und analysierten die Umkehrpotentiale der Mutanten. Die Mutationen waren wie folgt: NCR1 2.0 (273 D116H), NCR1 2.0 (273 D116E), NCR1 2.0 (283 V133H), und NCR1 2.0 (283 D116Q). Der zweite Teil dieser Studie konzentriert sich auf den lichtinduzierten Wassertransport mit Hilfe optogenetischer Methoden. Wir untersuchten den Einsatz optogenetischer Werkzeuge zur Regulierung des Wasserflusses durch Veränderung der Osmolarität in Oozyten. Der Wasserfluss durch AQP1 wird durch den osmotischen Gradienten angetrieben, der durch Konzentrationsunterschiede kleiner Moleküle oder Ionen entsteht. Daher versuchen wir, die Ionenkonzentration mit optogenetischen Mitteln zu regulieren, um den Wasserfluss nicht-invasiv zu steuern. Zu diesem Zweck verwendete ich die lichtgesteuerten Kationenkanäle XXM 2.0 und NCR1 2.0 zur Regulierung der Na+-Konzentration, während der K+-Kanal KCR1 2.0 zur Regulierung der K+-Konzentration eingesetzt wurde. Wenn Na+ in die Xenopus-Oozyten fließt, wird das Membranpotential der Oozyten positiv, und Cl- kann durch den lichtgesteuerten Anionenkanal GtACR1 einströmen. Durch die Kombination dieser optogenetischen Werkzeuge zur Regulierung der NaCl- oder KCl-Konzentration kann ich die Osmolarität innerhalb der Oozyten verändern und so den Wasserfluss regulieren. Ich habe AQP1 zusammen mit optogenetischen Werkzeugen in den Oozyten exprimiert, um den Wasserfluss zu beschleunigen. Insgesamt habe ich drei Kombinationen entwickelt (1: AQP1, XXM 2.0 und GtACR1. 2: AQP1, NCR1 2.0 und GtACR1. 3: AQP1, KCR1 2.0 und GtACR1) zur Regulierung des Wasserflusses in den Eizellen. Das Schrumpfen oder Anschwellen der Oozyten kann nur erreicht werden, wenn AQP1, lichtgesteuerte Kationenkanäle (XXM 2.0/NCR1 2.0/KCR1 2.0) und lichtgesteuerte Anionenkanäle (GtACR1) gemeinsam exprimiert werden. Die Belichtung nach Expression von einem oder beiden allein führt nicht zu Veränderungen der Morphologie der Oozyten. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass ich eine neuartige Strategie zur nicht-invasiven Beeinflussung der Wasserbewegung in und aus Xenopus-Oozyten durch Licht demonstriert habe. Diese Ergebnisse eröffnen einen neuen Weg zur Beeinflussung der Wasserhomöostase als Mittel zur Untersuchung verwandter biologischer Phänomene in verschiedenen Zelltypen und Organismen. KW - aquaporins KW - Osmolarität KW - optogenetic KW - sodium KW - potassium Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-323092 ER - TY - THES A1 - Jaślan, Justyna Joanna T1 - R-type currents in \(Arabidopsis\) guard cells: properties and molecular nature T1 - R-type Ströme in \(Arabidopsis\) Schließzellen: Eigenschaften und molekularer Hintergrund N2 - In contrast to the well described molecular basis for S-type anion currents, the genes underlying R-type anion currents were unknown until 2010. Meyer S. and colleagues (2010) showed that, localized in the guard cell plasma membrane, AtALMT12 is an R-type anion channel involved in stomatal closure. However, knocking out AtALMT12 did not fully shut down R-type currents; the almt12 loss-of-function mutant has residual R-type-like currents indicating that ALMT12 is not the only gene encoding Arabidopsis thaliana R-type channels (Meyer S. et al., 2010). This PhD thesis is focussed on understanding the properties, regulation and molecular nature of the R-type channels in Arabidopsis thaliana plants. To fulfil these aims, the patch clamp technique was used to characterize electrical features of R-type currents in various conditions such as the presence/absence of ATP, variation in cytosolic calcium concentration or the presence of cytosolic chloride. Electrophysiological study revealed many similarities between the features of Arabidopsis thaliana R-type currents (Col0) and residual R-type currents (the almt12 loss-of-function mutant). Strong voltage dependency, channel activity in the same voltage range, position of maximal recorded current and blockage by cytosolic ATP all pointed to a shared phylogenetic origin of the channels underlying these R-type currents. Expression patterns of the ALMT family members for Col0 and the almt12 mutant revealed ALMT13 and AMT14 as potential candidates of the R-type channels. Electrical characterization of Col0, almt12 and the two double loss-of-function mutants (almt12/almt13 and almt12/almt14) strongly suggest that ALMT13 mediates the calcium-dependent R-type current component that is directly regulated by cytosolic calcium. Additionally, similarly to ALMT12, ALMT14 could participate as a calcium-independent R-type anion channel. Differences in response to the cytosolic calcium concentration between ALMT12, ALMT13 and ALMT14 suggest their possible involvement in different signalling pathways leading to stomatal closure. Moreover, a study performed for the two Arabidopsis thaliana ecotypes Col0 and WS showed drastically increased ALMT13 expression for WS, which is related to R-type current properties. The WS ecotype has calcium-dependent R-type current behaviour, while it is calcium-independent in Col0. Furthermore, this plant line showed lower peak current densities compared to Col0 and almt mutants. These facts strongly suggest interaction between ALMT12 and ALMT13, with ALMT13 as a repressor of the ALMT12. Acquired patch clamp data revealed sulphate-dependent increases in ALMT13 current. This could be caused by changes in absolute open probability and/or permeability for sulphate and possibly chloride and links ALMT13 with sulphate-mediated stomatal closure under drought stress. It was then confirmed that ATP affects R-type currents. In contrast to Vicia faba, ATP was identified as a negative regulator of the Arabidopsis thaliana R-type anion channels. The effect of ATP is ambiguous but there is a high probability that it is a result of direct block and phosphorylation. However, the phosphorylation site and place of ATP binding needs further investigation. The story of the ALMT family, as examined in this thesis, sheds light on the complexity of the stomatal closure process. N2 - Im Gegensatz zu den gut beschriebenen S-Typ Anionenströmen, die durch Kanäle der SLAC1 Familie vermittelt werden, waren die Gene, die für R-Typ Anionenkanäle kodieren bis 2010 unbekannt (Negi J. et al., 2008, Vahisalu T. et al., 2008). In diesem Jahr identifizierten Meyer S. und Kollegen AtALMT12 als R-Typ Anionenkanal, der in der Plasmamembran von Schließzellen lokalisiert und am Stomaschluss beteiligt ist. In almt12 Verlustmutanten sind jedoch restliche R-Typ Ströme messbar, die darauf hinweisen, dass ALMT12 nicht das einzige Gen ist, das in Arabidopsis thaliana für R-Typ Anionenkanäle kodiert (Meyer S. et al., 2010). Diese Dissertation konzentriert sich auf die Analyse der Eigenschaften, der Regulation und der molekularen Natur der R-Typ Kanäle in Arabidopsis thaliana Pflanzen. Dafür wurde die Patch Clamp Technik angewandt, um den Einfluss verschiedener Faktoren wie z.B. das Fehlen/Vorhandensein von ATP, Unterschiede in der zytosolischen Kalziumkonzentration oder das Vorhandensein von zytosolischem Chlorid auf die elektrische Eigenschaften der R-Typ Ströme der verschiedene Kanäle zu untersuchen. Die elektrophysiologischen Untersuchungen zeigten viele Ähnlichkeiten zwischen den Eigenschaften von R-Typ Ströme in Wildtyp Pflanzen (Col0) und den noch vorhandenen Strömen in der Verlustmutante almt12. Beide sind stark spannungsabhängig, zeigen Kanalaktivität im gleichen Spannungsbereich und werden durch zytosolisches ATP inhibiert, was auf einen gemeinsamen phylogenetischen Ursprung der R-Typ Anionenkanäle hinweist. Die Expressionsanalyse der Gene der ALMT-Familie zeigte, dass ALMT13 und ALMT14 weitere potenzielle Kandidaten für Anionenkanäle des R-Typs sind. Die elektrophysiologische Charakterisierung von Col0, almt12 und den beiden zweifachen Verlustmutanten almt12/almt13 und almt12/almt14 ermöglichte es, die durch ALMT13 vermittelten Ströme als kalziumabhängige Komponente der R-Typ Ströme zu spezifizieren. Dabei wird ALMT13 direkt durch zytosolisches Kalzium reguliert. ALMT14 vermittelt dagegen kalziumunabhängige Ströme, ähnlich wie ALMT12. Unterschiede in der Reaktion auf die zytosolische Kalziumkonzentration zwischen ALMT12, ALMT13 und ALMT14 deuten auf eine mögliche Beteiligung an verschiedenen Signalwegen hin, die zum Stomaschluss führen. Darüber hinaus wurde eine Studie für zwei Arabidopsis thaliana Ökotypen durchgeführt. Pflanzen des Ökotyps WS zeigten eine erhöhte Expression von ALMT13 im Vergleich zu Col0 Pflanzen, während die Expression von ALMT12 in beiden vergleichbar ist. Diese Unterschiede wirken sich auf die R-Typ Ströme aus, die nur in WS-Pflanzen kalziumabhängig sind und eine geringere Amplitude haben. Diese Fakten deuten stark auf eine Interaktion zwischen ALMT12 und ALMT13 hin, bei der ALMT13 als Repressor von ALMT12 wirkt. Die Auswertung der Patch-Clamp-Daten zeigte außerdem eine sulfatabhängige Zunahme der durch ALMT13 vermittelten R-Typ Ströme. Diese wird wahrscheinlich durch eine Änderung der Offenwahrscheinlichkeit und/oder der Permeabilität für Sulfat und möglicherweise für Chlorid verursacht, und die darauf hinweist, dass ALMT13 für frühe Antworten im sulfatvermittelten Stomaschluss bei Trockenstress eine Rolle spielt. Außerdem wurde gezeigt, dass ATP die R-Typ Ströme beeinflusst. In Arabidopsis thaliana Pflanzen wirkt ATP als negativer Regulator der Anionenkanäle vom R-Typ, nicht jedoch in Vicia faba (Hedrich R. et al., 1990). Der Mechanismus, über den ATP wirkt ist nicht eindeutig geklärt, aber es wird davon ausgegangen, dass es sich um eine direkte Inhibierung und Phosphorylierung handelt. Die Phosphorylierungsstelle und der Ort der ATP-Bindung bedürfen jedoch weiterer Untersuchungen. Die Geschichte der ALMT-Familie, wie sie in dieser Arbeit untersucht wird, wirft ein Licht auf die Komplexität des stomatalen Verschlussprozesses. KW - R-type currents KW - ALMT Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-188836 N1 - Parts of this thesis have been published in Jaślan, J., Marten, I., Jakobson, L., Arjus, T., Deeken, R., Sarmiento, C., De Angeli, A., Brosché, M., Kollist, H. and Hedrich, R. (2023), ALMT-independent guard cell R-type anion currents. New Phytol. https://doi.org/10.1111/nph.19124. ER - TY - THES A1 - Kunz, Marcel T1 - Diffusion kinetics of organic compounds and water in plant cuticular model wax under the influence of diffusing barrier-modifying adjuvants T1 - Diffusionskinetiken organischer Verbindungen und Wasser in pflanzlichem kutikulärem Modellwachs unter dem Einfluss von diffundierenden, barriere-modifizierenden Adjuvantien N2 - To reach their target site, systemic pesticides must enter the plant from a spray droplet applied in the field. The uptake of an active ingredient (AI) takes place via the barrier-forming cuticular membrane, which is the outermost layer of the plant, separating it from the surrounding environment. Formulations are usually used which, in addition to the AI, also contain stabilizers and adjuvants. Adjuvants can either have surface-active properties or they act directly as barrier-modifying agents. The latter are grouped in the class of accelerating adjuvants, whereby individual variants may also have surface-active properties. The uptake of a pesticide from a spray droplet depends essentially on its permeability through the cuticular barrier. Permeability defines a combined parameter, which is the product of AI mobility and AI solubility within the cuticle. In recent decades, several tools have been developed that allowed the determination of individual parameters of organic compound penetration across the cuticular membrane. Nevertheless, earlier studies showed that mainly cuticular waxes are the barrier-determining component of the cuticular membrane and additionally, it was shown that mainly the very-long-chain aliphatic compounds (VLCAs) are responsible for establishing an effective barrier. However, the barrier-determining role of the individual VLCAs, being classified according to their respective functional groups, is still unknown. Therefore, the following objectives were pursued and achieved in this work: (1) A new ATR-FTIR-based approach was developed to measure the temperature-dependent real-time diffusion kinetics of organic models for active ingredients (AIs) in paraffin wax, exclusively consisting of very-long chain alkanes. (2) The developed ATR-FTIR approach was applied to determine the diffusion kinetics of self-accelerating adjuvants in cuticular model waxes of different VLCA composition. At the same time, wax-specific changes were recorded in the respective IR spectra, which provided information about the respective wax modification. (3) The ATR-FTIR method was used to characterize the diffusion kinetics, as well as to determine the wax-specific sorption capacities for an AI-modeling organic compound and water in cuticular model waxes after adjuvant treatment. Regarding the individual chemical compositions and structures, conclusions were drawn about the adjuvant-specific modes of action (MoA). In the first chapter, the ATR-FTIR based approach to determine organic compound diffusion kinetics in paraffin wax was successfully established. The diffusion kinetics of the AI modelling organic compounds heptyl parabene (HPB) and 4-cyanophenol (CNP) were recorded, comprising different lipophilicities and molecular volumes typical for AIs used in pesticide formulations. Derived diffusion coefficients ranged within 10-15 m2 s-1, thus being thoroughly higher than those obtained from previous experiments using an approach solely investigating desorption kinetics in reconstituted cuticular waxes. An ln-linear dependence between the diffusion coefficients and the applied diffusion temperature was demonstrated for the first time in cuticular model wax, from which activation energies were derived. The determined activation energies were 66.2 ± 7.4 kJ mol-1 and 56.4 ± 9.8 kJ mol-1, being in the expected range of already well-founded activation energies required for organic compound diffusion across cuticular membranes, which again confirmed the significant contribution of waxes to the cuticular barrier. Deviations from the assumed Fickian diffusion were attributed to co-occurring water diffusion and apparatus-specific properties. In the second and third chapter, mainly the diffusion kinetics of accelerating adjuvants in the cuticular model waxes candelilla wax and carnauba wax were investigated, and simultaneously recorded changes in the wax-specific portion of the IR spectrum were interpreted as indications of plasticization. For this purpose, the oil derivative methyl oleate, as well as the organophosphate ester TEHP and three non-ionic monodisperse alcohol ethoxylates (AEs) C12E2, C12E4 and C12E6 were selected. Strong dependence of diffusion on the respective principal components of the mainly aliphatic waxes was demonstrated. The diffusion kinetics of the investigated adjuvants were faster in the n-alkane dominated candelilla wax than in the alkyl ester dominated carnauba wax. Furthermore, the equilibrium absorptions, indicating equilibrium concentrations, were also higher in candelilla wax than in carnauba wax. It was concluded that alkyl ester dominated waxes feature higher resistance to diffusion of accelerating adjuvants than alkane dominated waxes with shorter average chain lengths due to their structural integrity. This was also found either concerning candelilla/policosanol (n-alcohol) or candelilla/rice bran wax (alkyl-esters) blends: with increasing alcohol concentration, the barrier function was decreased, whereas it was increased with increasing alkyl ester concentration. However, due to the high variability of the individual diffusion curves, only a trend could be assumed here, but significant differences were not shown. The variability itself was described in terms of fluctuating crystalline arrangements and partial phase separation of the respective wax mixtures, which had inevitable effects on the adjuvant diffusion. However, diffusion kinetics also strongly depended on the studied adjuvants. Significantly slower methyl oleate diffusion accompanied by a less pronounced reduction in orthorhombic crystallinity was found in carnauba wax than in candelilla wax, whereas TEHP diffusion was significantly less dependent on the respective wax structure and therefore induced considerable plasticization in both waxes. Of particular interest was the AE diffusion into both waxes. Differences in diffusion kinetics were also found here between candelilla blends and carnauba wax. However, these depended equally on the degree of ethoxylation of the respective AEs. The lipophilic C12E2 showed approximately Fickian diffusion kinetics in both waxes, accompanied by a drastic reduction in orthorhombic crystallinity, especially in candelilla wax, whereas the more hydrophilic C12E6 showed significantly retarded diffusion kinetics associated with a smaller effect on orthorhombic crystallinity. The individual diffusion kinetics of the investigated adjuvants sometimes showed drastic deviations from the Fickian diffusion model, indicating a self-accelerating effect. Hence, adjuvant diffusion kinetics were accompanied by a distinct initial lag phase, indicating a critical concentration in the wax necessary for effective penetration, leading to sigmoidal rather than to exponential diffusion kinetics. The last chapter dealt with the adjuvant-affected diffusion of the AI modelling CNP in candelilla and carnauba wax. Using ATR-FTIR, diffusion kinetics were recorded after adjuvant treatment, all of which were fully explicable based on the Fickian model, with high diffusion coefficients ranging from 10-14 to 10-13 m2 s-1. It is obvious that the diffusion coefficients presented in this work consistently demonstrated plasticization induced accelerated CNP mobilities. Furthermore, CNP equilibrium concentrations were derived, from which partition- and permeability coefficients could be determined. Significant differences between diffusion coefficients (mobility) and partition coefficients (solubility) were found on the one hand depending on the respective waxes, and on the other hand depending on treatment with respective adjuvants. Mobility was higher in candelilla wax than in carnauba wax only after methyl oleate treatment. Treatment with TEHP and AEs resulted in higher CNP mobility in the more polar alkyl ester dominated carnauba wax. The partition coefficients, on the other hand, were significantly lower after methyl oleate treatment in both candelilla and carnauba wax as followed by TEHP or AE treatment. Models were designed for the CNP penetration mode considering the respective adjuvants in both investigated waxes. Co-penetrating water, which is the main ingredient of spray formulations applied in the field, was likely the reason for the drastic differences in adjuvant efficacy. Especially the investigated AEs favored an enormous water uptake in both waxes with increasing ethoxylation level. Surprisingly, this effect was also found for the lipophilic TEHP in both waxes. This led to the assumption that the AI permeability is not exclusively determined by adjuvant induced plasticization, but also depends on a “secondary plasticization”, induced by adjuvant-attracted co-penetrating water, consequently leading to swelling and drastic destabilization of the crystalline wax structure. The successful establishment of the presented ATR-FTIR method represents a milestone for the study of adjuvant and AI diffusion kinetics in cuticular waxes. In particular, the simultaneously detectable wax modification and, moreover, the determinable water uptake form a perfect basis to establish the ATR-FTIR system as a universal screening tool for wax-adjuvants-AI-water interaction in crop protection science. N2 - Um ihren Zielort zu erreichen, müssen systemische Pestizide aus einem auf dem Feld ausgebrachten Sprühtropfen in die Pflanze gelangen. Die Aufnahme eines Wirkstoffs (AI) erfolgt über die barrierebildende Kutikularmembran, die äußerste Schicht der Pflanze, die sie von der Umgebung trennt. In der Regel werden Formulierungen verwendet, die neben dem AI auch Stabilisatoren und Adjuvantien enthalten. Adjuvantien können entweder oberflächenaktive Eigenschaften haben oder sie wirken direkt als barrieremodifizierende Substanzen. Letztere werden in der Klasse der beschleunigenden Adjuvantien zusammengefasst, wobei einzelne Varianten auch oberflächenaktive Eigenschaften haben können. Die Aufnahme eines Pestizids aus einem Sprühtropfen hängt im Wesentlichen von seiner Durchlässigkeit durch die kutikuläre Barriere ab. Die Permeabilität ist ein kombinierter Parameter, der sich aus der Mobilität und der Löslichkeit des Wirkstoffs in der Kutikula ergibt. In den letzten Jahrzehnten wurden mehrere Methoden entwickelt, die die Bestimmung einzelner Parameter der Permeation organischer Verbindungen durch die Kutikularmembran ermöglichen. Frühere Studien zeigten jedoch, dass hauptsächlich kutikuläre Wachse die barrierebestimmende Komponente der Kutikula darstellen, und darüber hinaus wurde gezeigt, dass hauptsächlich die sehr langkettigen aliphatischen Verbindungen (VLCAs) für die Errichtung einer wirksamen Barriere verantwortlich sind. Die Rolle der einzelnen VLCAs, die nach ihren jeweiligen funktionellen Gruppen klassifiziert werden, ist jedoch in Bezug auf die Bestimmung der Barriereeigenschaften noch unbekannt. Daher wurde in dieser Arbeit folgende Ziele verfolgt und erreicht: (1) Ein neuer ATR-FTIR-basierter Ansatz wurde entwickelt, um die temperaturabhängige Echtzeit-Diffusionskinetik von organischen Modellen für Wirkstoffe (AI) in ausschließlich aus Alkanen bestehendem Paraffinwachs zu messen. (2) Der entwickelte ATR-FTIR-Ansatz wurde zur Bestimmung der Diffusionskinetik von selbstbeschleunigenden Adjuvantien in kutikulären Modellwachsen unterschiedlicher VLCA-Zusammensetzung angewendet. Gleichzeitig wurden wachsspezifische Veränderungen in den jeweiligen IR-Spektren aufgezeichnet, welche Informationen über die jeweilige Wachsmodifikation lieferten. (3) Die ATR-FTIR-Methode wurde zur Charakterisierung der Diffusionskinetik, sowie zur Bestimmung der wachsspezifischen Sorptionskapazitäten für eine AI-modellierende organische Verbindung und von Wasser in kutikulären Modellwachsen nach Adjuvans-Behandlung verwendet. Im Hinblick auf die einzelnen chemischen Zusammensetzungen und Strukturen wurden Rückschlüsse auf die adjuvansspezifischen Wirkweisen (MoA) gezogen. Im ersten Kapitel wurde der ATR-FTIR-basierte Ansatz zur Bestimmung der Diffusionskinetik organischer Verbindungen in Paraffinwachs erfolgreich etabliert. Es wurde die Diffusionskinetik der organischen AI-Modellverbindungen Heptylparaben (HPB) und 4-Cyanophenol (CNP) aufgezeichnet, die unterschiedliche Lipophilitäten und Molekülvolumina aufweisen, wie sie für AIs in Pestizidformulierungen typisch sind. Die abgeleiteten Diffusionskoeffizienten lagen im Bereich von 10-15 m2 s-1 und waren damit höher als die zuvor in rekonstituierten kutikulären Wachsen beobachteten Diffusionskoeffizienten. Zum ersten Mal wurde eine ln-lineare Abhängigkeit zwischen den Diffusionskoeffizienten und der angewandten Diffusionstemperatur in kutikulärem Modellwachs nachgewiesen, aus der schließlich Aktivierungsenergien abgeleitet wurden. Die ermittelten Aktivierungsenergien betrugen 66.2 ± 7.4 kJ mol-1 und 56.4 ± 9,8 kJ mol-1 und lagen damit im erwarteten Bereich der bereits gut begründeten Aktivierungsenergien, die für die Diffusion organischer Verbindungen durch kutikuläre Membranen erforderlich sind. Dies bestätigte abermals den signifikanten Beitrag der Wachse zur kutikulären Barriere. Abweichungen von der angenommenen Fick'schen Diffusion wurden auf die gleichzeitig stattfindende Wasserdiffusion und gerätespezifische Artefakte zurückgeführt. Im zweiten und dritten Kapitel wurde vor allem die Diffusionskinetik von beschleunigenden Adjuvantien in den kutikulären Modellwachsen Candelillawachs und Carnaubawachs untersucht und gleichzeitig aufgezeichnete Veränderungen im wachspezifischen Teil des IR-Spektrums als Hinweise auf eine Plastifizierung interpretiert. Zu diesem Zweck wurden das Ölderivat Methyloleat, sowie der Organophosphatester TEHP und drei nichtionische monodisperse Alkoholethoxylate (AEs) C12E2, C12E4 und C12E6 ausgewählt. Es wurde eine starke Abhängigkeit der Adjuvansdiffusion von den jeweiligen Hauptkomponenten der hauptsächlich aliphatisch strukturierten Wachse nachgewiesen. So war die Diffusionskinetik der untersuchten Adjuvantien in dem hauptsächlich aus n-Alkanen bestehenden Candelillawachs schneller als in dem von Alkylestern dominierten Carnaubawachs. Darüber hinaus waren die Gleichgewichtsabsorptionen, die auf Gleichgewichtskonzentrationen hinweisen, in Candelillawachs ebenfalls höher als in Carnaubawachs. Daraus wurde gefolgert, dass Wachse mit hohen Alkylesteranteilen aufgrund ihrer strukturellen Integrität einen höheren Widerstand gegen die Diffusion von beschleunigenden Adjuvantien aufweisen als Wachse mit kürzeren durchschnittlichen Kettenlängen. Dies wurde auch bei Candelilla/Policosanol- (n-Alkohol) oder Candelilla/Reiskleiewachs-Mischungen (Alkylester) festgestellt: Mit steigender Alkoholkonzentration nahm die Barrierefunktion ab, während sie mit steigender Alkylesterkonzentration zunahm. Aufgrund der hohen Variabilität der einzelnen Diffusionskurven konnte hier jedoch nur ein Trend vermutet werden, signifikante Unterschiede zeigten sich jedoch nicht. Die Variabilität selbst wurde mit schwankenden kristallinen Anordnungen und teilweiser Phasentrennung der jeweiligen Wachsmischungen erklärt, die sich zwangsläufig auf die Diffusion der Adjuvantien auswirkten. Die Diffusionskinetik hing jedoch auch stark von den untersuchten Adjuvantien ab. In Carnaubawachs wurde eine deutlich langsamere Methyloleat-Diffusion festgestellt, die mit einer weniger ausgeprägten Verringerung der orthorhombischen Kristallinität einherging als in Candelillawachs, während die TEHP-Diffusion deutlich weniger von der jeweiligen Wachsstruktur abhängig war und in beiden Wachsen eine erhebliche Plastifizierung bewirkte. Von besonderem Interesse war die AE-Diffusion in den untersuchten Wachsen. Auch hier wurden Unterschiede in der Diffusionskinetik zwischen Candelillamischungen und Carnaubawachs festgestellt. Diese hingen jedoch gleichermaßen vom Ethoxylierungsgrad der jeweiligen AEs ab. Das lipophile C12E2 zeigte in beiden Wachsen eine annähernd Fick‘sche Diffusionskinetik, die mit einer drastischen Verringerung der orthorhombischen Kristallinität einherging, insbesondere im Candelillawachs, während das hydrophilere C12E6 eine deutlich verzögerte Diffusionskinetik zeigte, die mit einer geringeren Auswirkung auf die orthorhombische Kristallinität einherging. Die individuellen Diffusionskinetiken der untersuchten Adjuvantien zeigten teilweise drastische Abweichungen vom Fick‘schen Diffusionsmodell, was auf einen selbstbeschleunigenden Effekt hindeutet. Die Diffusionskinetik der Adjuvantien wurde von einer ausgeprägten anfänglichen Verzögerungsphase begleitet, die auf das Erreichen einer kritischen Konzentration im Wachs hindeutet. Es wird angenommen, dass aufgrund der initialen Verzögerungsphase letztlich sigmoidale, statt Fick’sche Diffusionskinetiken vorlagen. Das letzte Kapitel befasste sich mit der adjuvansbeeinflussten Diffusion der für Wirkstoffe modellhaften organischen Substanz CNP in Candelilla- und Carnaubawachs. Mittels ATR-FTIR wurden Diffusionskinetiken nach Adjuvans-Behandlung aufgezeichnet, die alle auf der Grundlage des Fick‘schen Modells vollständig erklärbar waren, einhergehend mit hohen Diffusionskoeffizienten von 10-14 bis 10-13 m2 s-1. Es ist offensichtlich, dass die in dieser Arbeit vorgestellten Diffusionskoeffizienten durchweg eine durch die Plastifizierung bedingte erhöhte CNP-Mobilität belegen. Darüber hinaus wurden CNP-Gleichgewichtskonzentrationen abgeleitet, aus denen Verteilungs- und Permeabilitätskoeffizienten bestimmt werden konnten. Signifikante Unterschiede zwischen Diffusionskoeffizienten (Mobilität) und Verteilungskoeffizienten (Löslichkeit) wurden zum einen in Abhängigkeit von den jeweiligen Wachsen und zum anderen in Abhängigkeit von den jeweiligen Adjuvantien festgestellt. Die CNP-Mobilität war in Candelillawachs nur nach Behandlung mit Methyloleat höher als in Carnaubawachs. Die Behandlung mit TEHP und AEs führte zu einer höheren CNP-Mobilität in dem polaren, von Alkylestern dominierten Carnaubawachs. Die Verteilungskoeffizienten hingegen waren nach der Behandlung mit Methyloleat sowohl in Candelilla- als auch in Carnaubawachs deutlich niedriger als nach der Behandlung mit TEHP oder AE. Es wurden Modelle für den CNP-Penetrationsmodus unter Berücksichtigung der jeweiligen Adjuvantien in den beiden untersuchten Wachsen entwickelt. Der Grund für die drastischen Unterschiede in der Wirksamkeit der Adjuvantien liegt wahrscheinlich im Ko-Penetrieren von Wasser, dem Hauptbestandteil der auf dem Feld angewandten Spritzformulierungen. Insbesondere die untersuchten AEs begünstigten eine enorme Wasseraufnahme in beiden Wachsen mit zunehmendem Ethoxylierungsgrad. Überraschenderweise wurde dieser Effekt auch für das lipophile TEHP in beiden Wachsen gefunden. Dies führte zu der Vermutung, dass die AI-Permeabilität nicht ausschließlich durch die adjuvansinduzierte Plastifizierung bestimmt wird, sondern auch von einer "sekundären Plastifizierung" abhängt, die durch die Ko-Penetration von Wasser induziert wird und so zur Quellung und drastischen Destabilisierung der kristallinen Wachsstruktur führt. Die erfolgreiche Etablierung der vorgestellten ATR-FTIR-Methode stellt einen Meilenstein für die Untersuchung der Diffusionskinetik von Adjuvantien und AIs in kutikulären Wachsen dar. Insbesondere die gleichzeitig nachweisbare Wachsmodifikation und darüber hinaus die bestimmbare Wasseraufnahme bilden eine perfekte Grundlage, um das ATR-FTIR-System als universelles Screening-Tool für Wachs-Adjuvans-AI-Wasser-Interaktionen in der Pflanzenschutzwissenschaft zu etablieren. KW - Pflanzen KW - Kutikula KW - Adjuvans KW - Aktivierungsenergie KW - ATR-FTIR KW - Diffusion coefficient KW - Pesticide KW - wax Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-274874 ER - TY - THES A1 - Zhou, Yang T1 - The Exploitation of Opsin-based Optogenetic Tools for Application in Higher Plants T1 - Die Nutzung von optogenetischen Werkzeugen auf Opsin-Basis für die Anwendung in höheren Pflanzen N2 - The discovery, heterologous expression, and characterization of channelrhodopsin-2 (ChR2) – a light-sensitive cation channel found in the green alga Chlamydomonas reinhardtii – led to the success of optogenetics as a powerful technology, first in neuroscience. ChR2 was employed to induce action potentials by blue light in genetically modified nerve cells. In optogenetics, exogenous photoreceptors are expressed in cells to manipulate cellular activity. These photoreceptors were in the beginning mainly microbial opsins. During nearly two decades, many microbial opsins and their mutants were explored for their application in neuroscience. Until now, however, the application of optogenetics to plant studies is limited to very few reports. Several optogenetic strategies for plant research were demonstrated, in which most attempts are based on non-opsin optogenetic tools. Opsins need retinal (vitamin A) as a cofactor to generate the functional protein, the rhodopsin. As most animals have eyes that contain animal rhodopsins, they also have the enzyme - a 15, 15'-Dioxygenase - for retinal production from food-supplied provitamin A (beta-carotene). However, higher plants lack a similar enzyme, making it difficult to express functional rhodopsins successfully in plants. But plant chloroplasts contain plenty of beta-carotene. I introduced a gene, coding for a 15, 15'-Dioxygenase with a chloroplast target peptide, to tobacco plants. This enzyme converts a molecule of β-carotene into two of all-trans-retinal. After expressing this enzyme in plants, the concentration of all-trans-retinal was increased greatly. The increased retinal concentration led to increased expression of several microbial opsins, tested in model higher plants. Unfortunately, most opsins were observed intracellularly and not in the plasma membrane. To improve their localization in the plasma membrane, some reported signal peptides were fused to the N- or C-terminal end of opsins. Finally, I helped to identify three microbial opsins -- GtACR1 (a light-gated anion channel), ChR2 (a light-gated cation channel), PPR (a light-gated proton pump) which express and work well in the plasma membrane of plants. The transgene plants were grown under red light to prevent activation of the expressed opsins. Upon illumination with blue or green light, the activation of these opsins then induced the expected change of the membrane potential, dramatically changing the phenotype of plants with activated rhodopsins. This study is the first which shows the potential of microbial opsins for optogenetic research in higher plants, using the ubq10 promoter for ubiquitous expression. I expect this to be just the beginning, as many different opsins and tissue-specific promoters for selective expression now can be tested for their usefulness. It is further to be expected that the here established method will help investigators to exploit more optogenetic tools and explore the secrets, kept in the plant kingdom. N2 - Die Entdeckung, heterologe Expression und Charakterisierung von Channelrhodopsin-2 (ChR2) - einem lichtempfindlichen Kationenkanal, der in der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii vorkommt - führte zum Erfolg der Optogenetik als leistungsfähige Technologie, zunächst in den Neurowissenschaften. ChR2 wurde eingesetzt, um in genetisch veränderten Nervenzellen durch blaues Licht Aktionspotentiale zu induzieren. Bei der Optogenetik werden exogene Photorezeptoren in Zellen exprimiert, um die zelluläre Aktivität zu manipulieren. Diese Photorezeptoren waren anfangs hauptsächlich mikrobielle Opsine. Im Laufe von fast zwei Jahrzehnten wurden viele mikrobielle Opsine und ihre Mutanten für ihre Anwendung in den Neurowissenschaften erforscht. Bis jetzt ist die Anwendung der Optogenetik in der Pflanzenforschung jedoch auf sehr wenige Arbeiten beschränkt. Es wurden mehrere optogenetische Strategien für die Pflanzenforschung aufgezeigt, wobei die meisten Versuche auf optogenetischen Werkzeugen, die nicht Opsine sind, beruhen. Opsine benötigen Retinal (Vitamin A) als Kofaktor, um das funktionelle Protein, das Rhodopsin, zu generieren. Da die meisten Tiere Augen haben, die tierische Rhodopsine enthalten, verfügen sie auch über das Enzym - eine 15, 15'-Dioxygenase - zur Retinalproduktion aus mit der Nahrung zugeführtem Provitamin A (Beta-Carotin). Höheren Pflanzen fehlt jedoch ein ähnliches Enzym, was es schwierig macht, funktionale Rhodopsine erfolgreich in Pflanzen zu exprimieren. Aber die Chloroplasten der Pflanzen enthalten reichlich Beta-Carotin. Ich führte ein Gen, das für eine 15, 15'-Dioxygenase mit einem Chloroplasten-Zielpeptid kodiert, in Tabakpflanzen ein. Dieses Enzym wandelt ein Molekül β-Carotin in zwei Moleküle all-trans-Retinal um. Nach Expression dieses Enzyms in Pflanzen wurde die Konzentration von all-trans-Retinal stark erhöht. ... KW - optogenetics KW - opsins KW - higher plants Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-236960 ER - TY - THES A1 - Yu-Strzelczyk, Jing T1 - Generation and Characterization of novel proteins for light-activated hyperpolarization of cell membranes T1 - Generierung und Charakterisierung neuartiger Proteine für Licht-aktivierte Hyperpolarisation von Zellmembranen N2 - The light-gated cation channel Channelrhodopsin-2 was discovered and characterized in 2003. Already in 2005/2006 five independent groups demonstrated that heterologous expression of Channelrhodopsin-2 is a highly useful and simply applicable method for depolarizing and thereby activating nerve cells. The application of Channelrhodopsin-2 revolutionized neuroscience research and the method was then called optogenetics. In recent years more and more light-sensitive proteins were successfully introduced as “optogenetic tools”, not only in neuroscience. Optogenetic tools for neuronal excitation are well developed with many different cation-conducting wildtype and mutated channelrhodopsins, whereas for inhibition of neurons in the beginning (2007) only hyperpolarizing ion pumps were available. The later discovered light-activated anion channels (anion channelrhodopsins) can be useful hyperpolarizers, but only at low cytoplasmic anion concentration. For this thesis, I optimized CsR, a proton-pumping rhodopsin from Coccomyxa subellipsoidea, which naturally shows a robust expression in Xenopus laevis oocytes and plant leaves. I improved the expression and therefore the photocurrent of CsR about two-fold by N-terminal modification to the improved version CsR2.0, without altering the proton pump function and the action spectrum. A light pulse hyperpolarised the mesophyll cells of CsR2.0-expressing transgenic tobacco plants (N. tabacum) by up to 20 mV from the resting membrane potential of -150 to -200 mV. The robust heterologous expression makes CsR2.0 a promising optogenetic tool for hyperpolarization in other organisms as well. A single R83H point-mutation converted CsR2.0 into a light-activated (passive) proton channel with a reversal potential close to the Nernst potential for intra-/extra-cellular H+ concentration. This light-gated proton channel is expected to become a further useful optogenetic tool, e.g. for analysis of pH-regulation in cells or the intercellular space. Ion pumps as optogenetic tools require high expression levels and high light intensity for efficient pump currents, whereas long-term illumination may cause unwanted heating effects. Although anion channelrhodopsins are effective hyperpolarizing tools in some cases, their effect on neuronal activity is dependent on the cytoplasmic chloride concentration which can vary among neurons. In nerve cells, increased conductance for potassium terminates the action potential and K+ conductance underlies the resting membrane potential in excitable cells. Therefore, several groups attempted to synthesize artificial light-gated potassium channels but 2 all of these published innovations showed serious drawbacks, ranging from poor expression over lacking reversibility to poor temporal precision. A highly potassium selective light-sensitive silencer of action potentials is needed. To achieve this, I engineered a light-activated potassium channel by the genetic fusion of a photoactivated adenylyl cyclase, bPAC, and a cAMP-gated potassium channel, SthK. Illumination activates bPAC to produce cAMP and the elevated cAMP level opens SthK. The slow diffusion and degradation of cAMP makes this construct a very light-sensitive, long-lasting inhibitor. I have successfully developed four variants with EC50 to cAMP ranging from 7 over 10, 21, to 29 μM. Together with the original fusion construct (EC50 to cAMP is 3 μm), there are five different light- (or cAMP-) sensitive potassium channels for researchersto choose, depending on their cell type and light intensity needs. N2 - Der lichtgesteuerte Kationenkanal Channelrhodopsin-2 wurde 2003 entdeckt und charakterisiert. Bereits 2005/2006 zeigten fünf unabhängige Gruppen, dass die heterologe Expression von Channelrhodopsin-2 eine sehr nützliche und einfach anwendbare Methode zur Depolarisation und damit Aktivierung von Nervenzellen ist. Die Anwendung von Channelrhodopsin-2 revolutionierte die neurowissenschaftliche Forschung und die Methode wurde dann Optogenetik genannt. In den letzten Jahren wurden immer mehr lichtempfindliche Proteine als „optogenetische Werkzeuge“ eingeführt, und nicht nur in den Neurowissenschaften erfolgreich angewandt. Optogenetische Werkzeuge zur neuronalen Anregung sind mit vielen verschiedenen Kationen-leitenden Wildtyp- und mutierten Channelrhodopsinen gut entwickelt, während für die Hemmung von Neuronen zu Beginn (2007) nur hyperpolarisierende Ionenpumpen zur Verfügung standen. Die später entdeckten lichtaktivierten Anionenkanäle (Anionenkanalrhodopsine) können nützliche Hyperpolarisatoren sein, jedoch nur bei niedriger zytoplasmatischer Anionenkonzentration. Für diese Arbeit habe ich CsR optimiert, ein Protonen pumpendes Rhodopsin aus Coccomyxa subellipsoidea, das von Natur aus eine robuste Expression in Oozyten von Xenopus laevis und in Pflanzenblättern zeigt. Ich habe die Expression und damit den Photostrom von CsR etwa um das Zweifache durch N-terminale Modifikation verbessert, ohne die Protonenpump-Funktion und das Aktionsspektrum bei der verbesserten Version von CsR2.0 zu verändern. Ein Lichtpuls hyperpolarisierte die Mesophyllzellen von CsR2.0-exprimierenden transgenen Tabakpflanzen (N. tabacum) um bis zu 20 mV gegenüber dem Ruhe-Membranpotential von -150 bis -200 mV. Die robuste heterologe Expression macht CsR2.0 zu einem vielversprechenden optogenetischen Werkzeug für die Hyperpolarisation auch in anderen Organismen. Eine einzelne R83H-Punktmutation wandelte CsR2.0 um in einen Licht-aktivierten (passiven) Protonenkanal mit einem Umkehrpotential nahe dem Nernst-Potential für intra-/extrazelluläre H+-Konzentration. Es wird erwartet, dass dieser Licht-gesteuerte Protonenkanal ein weiteres nützliches optogenetisches Werkzeug wird, z. zur Analyse der pH-Regulation in Zellen oder dem Interzellularraum. Ionenpumpen als optogenetische Werkzeuge erfordern hohe Expressionsraten und eine hohe Lichtintensität für effiziente Pumpströme, wobei eine Langzeitbeleuchtung unerwünschte Erwärmungseffekte verursachen kann. Obwohl Anionen-Channelrhodopsine in einigen Fällen wirksame hyperpolarisierende Werkzeuge sind, hängt ihre Wirkung auf die neuronale Aktivität von der zytoplasmatischen Chloridkonzentration ab, die zwischen den Neuronen variieren kann. In Nervenzellen beendet eine erhöhte Leitfähigkeit für Kalium das Aktionspotential und die K+-Leitfähigkeit liegt dem Ruhe-Membranpotential in erregbaren Zellen zugrunde. Daher versuchten mehrere Gruppen, künstliche lichtgesteuerte Kaliumkanäle zu synthetisieren, aber alle diese veröffentlichten Innovationen zeigten schwerwiegende Nachteile, die von schlechter Expression über fehlende Reversibilität bis hin zu geringer zeitlicher Präzision reichten. Ein hoch Kalium-selektiver Licht-empfindlicher Inhibitor der Aktionspotentiale ist von hohem Wert für die Neurowissenschaft. Um dies zu erreichen, habe ich einen Licht-aktivierten Kaliumkanal durch genetische Fusion einer photoaktivierten Adenylylcyclase, bPAC, und eines cAMP-gesteuerten Kaliumkanals, SthK, konstruiert. Beleuchtung aktiviert bPAC zur Produktion von cAMP und der erhöhte cAMP-Spiegel öffnet SthK. Die langsame Diffusion und Degradation von cAMP macht dieses Konstrukt zu einem sehr Licht-empfindlichen, lang anhaltenden Inhibitor. Ich habe darüber hinaus erfolgreich vier Varianten mit EC50 für cAMP im Bereich von 7 über 10, 21 bis 29 µM entwickelt. Zusammen mit dem ursprünglichen Fusionskonstrukt (EC50 zu cAMP beträgt 3 μM) gibt es damit nun fünf verschiedene lichtempfindliche Kaliumkanäle, die je nach Zelltyp und Lichtintensitätsbedarf für optogenetische Experimente ausgewählt werden können. KW - neuronal silencing KW - optogenetics KW - hyperpolarization KW - Proteine Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-266752 ER - TY - THES A1 - Huang, Shouguang T1 - Role of ABA-induced Ca\(^{2+}\) signals, and the Ca\(^{2+}\)-controlled protein kinase CIPK23, in regulation of stomatal movements T1 - Rolle von ABA-abhängigen Ca\(^{2+}\) Signalen, und der Ca\(^{2+}\)-gesteuerten Proteinkinase CIPK23, bei der Regulation der Spaltöffnungsbewegungen N2 - Stomata are pores in the leaf surface, formed by pairs of guard cells. The guard cells modulate the aperture of stomata, to balance uptake of CO2 and loss of water vapor to the atmosphere. During drought, the phytohormone abscisic acid (ABA) provokes stomatal closure, via a signaling chain with both Ca2+-dependent and Ca2+-independent branches. Both branches are likely to activate SLAC1-type (Slow Anion Channel Associated 1) anion channels that are essential for initiating the closure of stomata. However, the importance of the Ca2+-dependent signaling branch is still debated, as the core ABA signaling pathway only possesses Ca2+-independent components. Therefore, the aim of this thesis was to address the role of the Ca2+-dependent branch in the ABA signaling pathway of guard cells. In the first part of the thesis, the relation between ABA-induced Ca2+ signals and stomatal closure was studied, with guard cells that express the genetically encoded Ca2+-indicator R-GECO1-mTurquoise. Ejection of ABA into the guard cell wall rapidly induced stomatal closure, however, only in ¾ of the guard cells ABA evoked a cytosolic Ca2+ signal. A small subset of stomata (¼ of the experiments) closed without Ca2+ signals, showing that the Ca2+ signals are not essential for ABA-induced stomatal closure. However, stomata in which ABA evoked Ca2+ signals closed faster as those in which no Ca2+ signals were detected. Apparently, ABA-induced Ca2+ signals enhance the velocity of stomatal closure. In addition to ABA, hyperpolarizing voltage pulses could also trigger Ca2+ signals in wild type guard cells, which in turn activated S-type anion channels. However, these voltage pulses failed to elicit S-type anion currents in the slac1/slah3 guard cells, suggesting that SLAC1 and SLAH3 contribute to Ca2+-activated conductance. Taken together, our data indicate that ABA-induced Ca2+ signals enhance the activity of S-type anion channels, which accelerates stomatal closure. The second part of the thesis deals with the signaling pathway downstream of the Ca2+ signals. Two types of Ca2+-dependent protein kinase modules (CPKs and CBL/CIPKs) have been implicated in guard cells. We focused on the protein kinase CIPK23 (CBL-Interacting Protein Kinase 23), which is activated by the Ca2+-dependent protein CBL1 or 9 (Calcineurin B-Like protein 1 or 9) via interacting with the NAF domain of CIPK23. The CBL1/9-CIPK23 complex has been shown to affect stomatal movements, but the underlying molecular mechanisms remain largely unknown. We addressed this topic by using an estrogen-induced expression system, which specifically enhances the expression of wild type CIPK23, a phosphomimic CIPK23T190D and a kinase dead CIPK23K60N in guard cells. Our data show that guard cells expressing CIPK23T190D promoted stomatal opening, while CIPK23K60N enhanced ABA-induced stomatal closure, suggesting that CIPK23 is a negative regulator of stomatal closure. Electrophysiological measurements revealed that the inward K+ channel currents were similar in guard cells that expressed CIPK23, CIPK23T190D or CIPK23K60N, indicating that CIPK23-mediated inward K+ channel AKT1 does not contribute to stomatal movements. Expression of CIPK23K60N, or loss of CIPK23 in guard cells enhanced S-type anion activity, while the active CIPK23T190D inhibited the activity of these anion channels. These results are in line with the detected changes in stomatal movements and thus indicate that CIPK23 regulates stomatal movements by inhibiting S-type anion channels. CIPK23 thus serves as a brake to control anion channel activity. Overall, our findings demonstrate that CIPK23-mediated stomatal movements do not depend on CIPK23-AKT1 module, instead, it is achieved by regulating S-type anion channels SLAC1 and SLAH3. In sum, the data presented in this thesis give new insights into the Ca2+-dependent branch of ABA signaling, which may help to put forward new strategies to breed plants with enhanced drought stress tolerance, and in turn boost agricultural productivity in the future. N2 - Stomata sind Poren in der Blattoberfläche, die von einem Paar von Schließzellen gebildet werden. Die Schließzellen kontrollieren den Öffnungsweite der stomatären Pore, um die Aufnahme von CO2 und den Verlust von Wasserdampf in die Atmosphäre auszubalancieren. Während Trockenperioden bewirkt das Phytohormon Abscisinsäure (ABA) einen Stomaschluss über eine Signalkaskade, welche über Ca2+-abhängige und Ca2+-unabhängige Pfade verfügt. Beide Pfade aktivieren wahrscheinlich Anionenkanäle aus der SLAC1 Familie (Slow Anion Channel Associated 1), welche essentiell sind um den Stomaschluss einzuleiten. Allerdings wird über die Wichtigkeit des Ca2+-abhängigen Pfades noch immer diskutiert, da der ABA-Hauptsignalweg ausschließlich Ca2+-unabhängige Komponenten beinhaltet. Aus diesem Grund war das Ziel dieser Thesis, die Rolle des Ca2+-abhängigen Pfades im ABA-Signalweg aufzulösen. Im ersten Teil der Thesis wurde mit Schließzellen, die den genetisch kodierten Ca2+-Sensor R-GECO1-mTurquoise exprimierten, der Zusammenhang zwischen ABA-induzierten Ca2+ Signalen und dem Stomaschluss untersucht. Die Injektion von ABA in die Zellwand von Schließzellen bewirkte einen schnellen Stomaschluss, jedoch wurde nur bei drei Vierteln der Zellen auch ein zytosolisches Ca2+ Signal erzeugt. Ein kleiner Teil der Stomata (in einem Viertel der Experimente) schloss sich ohne Ca2+ Signal, was zeigt, dass die Ca2+ Signale nicht essentiell für den ABA-induzierten Stomaschluss sind. Es schlossen sich jedoch Stomata schneller, in deren Schließzellen ABA-induzierte Ca2+ Signale detektiert wurden. ABA-induzierte Ca2+-Signale verbesserten also offenbar die Geschwindigkeit des Stomaschlusses. Neben ABA konnten Ca2+ Signale in wildtypischen Schließzellen auch durch hyperpolarisierende Spannungspulse erzeugt werden, welche daraufhin S-Typ Anionenkanäle aktivierten. Diese Spannungspulse konnten jedoch in slac1/slah3 Schließzellen keine S-typischen Anionenströme hervorrufen, was darauf hindeutet, dass SLAC1 und SLAH3 zur Ca2+-aktivierten Leitfähigkeit beitragen. Zusammengefasst deuten unsere Daten darauf hin, dass ABA-induzierte Ca2+ Signale die Aktivität von S-Typ Anionenkanälen verbessern und somit den Stomaschluss beschleunigen. Der zweite Teil der Thesis befasst sich mit dem Signalweg, der den Ca2+-Signalen nachgeschaltet ist. Es wurden zwei Typen Ca2+-abhängiger Proteinkinase-Module (CPKs und CBL/CIPKs) in Schließzellen nachgewiesen. Wir haben uns auf die Proteinkinase CIPK23 (CBL-Interacting Protein Kinase 23) konzentriert, welche von den Ca2+-abhängigen Proteinen CBL1 und CBL9 (Calcineurin B-Like Protein 1 oder 9) über Interaktion mit der NAF Domäne des CIPK23 aktiviert wird. Es konnte bereits gezeigt werden, dass der CBL1/CIPK23 Komplex die stomatäre Bewegung beinflusst, jedoch sind die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen bisher weitgehend unbekannt geblieben. Wir haben dieses Thema mit einem Östrogen-induzierten Expressionssystem untersucht, welches spezifisch in Schließzellen die Expression von wildtypischem CIPK23 erhöhte. Hinzu kamen Experimente mit einer phosphomimetischen CIPK23T190D und einer CIPK23K60N mit disfunktionaler Kinasedomäne. Unsere Daten zeigen, dass CIPK23T190D exprimierende Schließzellen eine verbesserte Stomaöffnung aufwiesen, während CIPK23K60N den ABA-induzierten Stomaschluss förderte, was auf eine negativ regulierende Rolle von CIPK23 beim Stomaschluss hindeutet. Elektrophysiologische Messungen zeigten, dass die einwärtsgerichteten K+-Ströme in CIPK23-, CIPK23T190D- oder CIPK23K60N-exprimierenden Schließzellen vergleichbar waren, was darauf hindeutet, dass die Aktivierung von AKT1 durch CIPK23 nicht zur stomatären Bewegung beiträgt. Allerdings führte die Expression von CIPK23K60N, wie auch der Verlust von CIPK23, in Schließzellen zu einer erhöhten S-typischen Anionenkanalaktivität, während eine CIPK23T190D-Expression diese Anionenkanalaktivität inhibierte. Diese Ergebnisse stimmen mit den Beobachtungen zu den gezeigten Veränderungen der stomatären Bewegung überein und deuten daher auf eine regulierende Rolle von CIPK23 für die stomatäre Bewegung durch die Inhibierung von S-Typ Anionenkanälen hin. Insgesamt beweisen unsere Befunde, dass die CIPK23-vermittelte stomatäre Bewegung nicht durch eine Interaktion von CIP23 mit AKT1, sondern durch die Regulierung der S-Typ Anionenkanäle SLAC1 und SLAH3 vermittelt wird. Zusammengefasst ergeben die in dieser Thesis präsentierten Daten neue Einblicke in den Ca2+-abhängigen Pfad des ABA-Signalwegs. Dies könnte in Zukunft helfen neue Strategien zur Zucht von Pflanzen mit verbesserter Trockenstresstoleranz zu entwickeln und somit die agrarwirtschaftliche Produktivität zu erhöhen. KW - Stomata KW - guard cells KW - ABA KW - OST1 KW - SLAC1 KW - anion channels KW - Ca2+ signal KW - CIPK23 KW - AKT1 KW - K+ channels KW - drought stress Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-204737 ER - TY - THES A1 - Henninger, Markus T1 - Funktion der zentralen metabolischen Kinase SnRK1 und von ihr abhängiger Transkriptionsfaktoren bei der Mobilisierung von Speicherstoffen während der \(Arabidopsis\) Keimlingsentwicklung T1 - Function of the central metabolic kinase SnRK1 and on it dependent transcription factors in the mobilization of storage compunds during \(Arabidopsis\) seedling development N2 - Pflanzen müssen sich während der Samenkeimung und Keimlingsentwicklung über eingelagerte Speicherstoffe heterotroph versorgen, bis sie, nach Etablierung ihres Photosyntheseapparats, einen autotrophen Lebensstil führen können. Diese Arbeit geht von der Hypothese aus, dass der evolutionär konservierten zentral-metabolischen Kinase Snf1-RELATED PROTEIN KINASE 1 (SnRK1) eine besondere Rolle bei der Mobilisierung von Speicherstoffen während der Keimlingsentwicklung zukommt. Während die Bedeutung von SnRK1 als zentraler Regulator katabolischer Prozesse unter Energiemangel- und Stresssituationen bereits gezeigt wurde, war die Funktion von SnRK1 im Zusammenhang mit der Samenkeimung weitgehend ungeklärt. In dieser Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass SnRK1 in Arabidopsis die Mobilisierung und Degradation von Speicherstoffen, insbesondere von Triacylglyceride (TAGs), Samenspeicherproteinen und Aminosäuren, steuert. Sowohl Studien zur Lokalisation von SnRK1:GFP-Fusionsproteinen als auch Kinaseaktivitätsassays unterstützen eine mögliche Funktion von SnRK1 während der Keimlingsentwicklung. Eine induzierbare snrk1-knockdown Mutante zeigt neben einem eingeschränkten Wurzel- und Hypokotylwachstum auch keine Ausbildung eines Photosyntheseapparats, was die zentrale Rolle der SnRK1 in diesem frühen Entwicklungsstadium untermauert. Durch Fütterungsexperimente mit Glukose konnte der Phänotyp einer snrk1 -Mutante in Keimlingen gerettet werden. Dies zeigt, dass der metabolische Block durch externe Gabe von Kohlenhydraten umgangen werden kann. Die zentrale Funktion von SnRK1 ist folgich der Abbau von Speicherstoffen und keine allgemeine Deregulation des pflanzlichen Stoffwechsels. Durch massenspektrometrische Untersuchungen von Keimlingen des Wildtyps und der snrk1-Mutante konnte gezeigt werden, dass TAGs in der Mutante in der spä- ten Keimlingsentwicklung ab Tag 4 langsamer abgebaut werden als im Wildtyp. Ebenso werden Samenspeicherproteine in der Mutante langsamer degradiert, wodurch die Verfügbarkeit von freien Aminosäuren in geringer ist. Entgegen der allgemeinen Annahme konnte gezeigt werden, dass während der Keimlingsentwicklung zumindest in Arabidopsis, einer ölhaltigen Pflanze, zunächst Kohlenhydrate in Form von Saccharose abgebaut werden, bevor die Degradation von TAGs und Aminosäuren beginnt. Diese Abbauprodukte können dann der Glukoneogenese zugeführt werden um daraus Glukose herzustellen. Mittels Transkriptom-Analysen konnten zentrale SnRK1-abhängige Gene in der Speicherstoffmobilisierung von TAG, beispielsweise PEROXISOMAL NAD-MALATE DEHYDROGENASE 2 (PMDH2) und ACYL-CoA-OXIDASE 4 (ACX4), und Aminosäuren identifiziert werden. Somit wurde ein Mechanismus der SnRK1-abhängigen Genregulation während der Samenkeimung in Arabidopsis gefunden. Bei der Degradation von Aminosäuren wird die cytosolische PYRUVATE ORTHOPHOSPHATE DIKINASE (cyPPDK), ein Schlüsselenzym beim Abbau bestimmter Aminosäuren und bei der Glukoneogenese, SnRK1-abhängig transkriptionell reguliert. Durch Koregulation konnte der Transkriptionsfaktor bZIP63 (BASIC LEUCINE ZIPPER 63) gefunden werden, dessen Transkription ebenfalls SnRK1-abhängig reguliert wird. Außerdem konnte die Transkription von cyPPDK in bzip63-Mutanten nur noch sehr schwach induziert werden. In Protoplasten konnte der cyPPDK-Promotor durch Aktivierungsexperimente mit bZIP63 und SnRK1α1 induziert werden. Durch Mutationskartierung und Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP)PCR konnte mehrfach eine direkte Bindung von bZIP63 an den cyPPDK-Promotor nachgewiesen werden. Zusammenfassend ergibt sich ein mechanistisches Arbeitsmodell, in dem bZIP63 durch SnRK1 phosphoryliert wird und durch Bindung an regulatorische G-Box cis-Elemente im cyPPDK- Promotor dessen Transkription anschaltet. Infolgedessen werden Aminosäuren abgebaut und wird über die Glukoneogenese Glukose aufgebaut. Dieser Mechanismus ist essentiell für die Übergangsphase zwischen heterotropher und autotropher Lebensweise, und trägt dazu bei, die im Samen vorhandenen Ressourcen dem Keimling zum idealen Zeitpunkt zugänglich zu machen. Darüber hinaus werden Gene im Abbau von verzweigtkettigen Aminosäuren ebenfalls durch bZIP63 reguliert. Dabei wird dem Keimling Energie in Form von Adenosin-Triphosphat (ATP) zur Verfügung gestellt. Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass die Mobilisierung von Speicherstoffen auch während der Keimlingsentwicklung direkt von SnRK1 abhängig ist. Die umfangreichen Datensätze der RNA-Seq-Analysen bieten zudem die Möglichkeit, weitere SnRK1-abhängige Gene der Speichermobilisierung zu identifizieren und somit einem besseren Verständnis der Keimlingsentwicklung beizutragen. Aufgrund der zentralen Bedeutung der SnRK1-Kinase in diesem entscheidenden Entwicklungsschritt ist davon auszugehen, dass diese Erkenntnisse mittelfristig auch für bessere Keimungsraten und somit bessere Erträge in der Landwirtschaft genutzt werden können. N2 - During seed germination and seedling establishment, seedlings must live heterotrophically on the resources stored in the seed. Only after establishing a fully functional photosynthetic apparatus, the young plant can change to an autotrophic lifestyle - one of the key features of plant life and metabolism. This work is based on the hypothesis that the evolutionarily conserved central metabolic kinase Snf1-RELATED PROTEIN KINASE 1 (SnRK1) plays a crucial role in the mobilization of storage compounds during seedling establishment. Whereas the importance of SnRK1 as a central regulator of catabolic processes during energy deprication and stress situations has already been demonstrated, so far, the function of SnRK1 in connection with seed germination had remained largely unresolved. Here, we shown for the first time that SnRK1 in Arabidopsis controls the degradation of storage resources, especially triacylglycerides (TAG), seed storage proteins and amino acids. Studies on the localization of SnRK1:GFP fusion proteins and as well as kinase activity assays support a possible function of SnRK1 during seedling establishment. An inducible snrk1-knockdown mutant is strongly impaired in root and hypocotyl growth and the plant do not develop a photosynthetic apparatus. Feeding experiments with glucose rescued the snrk1-mutant phenotype, showing that the metabolic block can be bypassed by external administration of carbohydrates. Thus, the central function of SnRK1 is concluded to be the degradation of the storage resources and rather than a general deregulation of the plant metabolism. Mass spectrometric investigations have shown that TAG degradation and seed storage proteins breakdown are partially impaired in the mutant. Thus, the availability of free amino acids in snrk1 mutant seedlings is lower in comparison to wildtype. It could be shown that - despite the fact that Arabidopsis is an oil-seed plant - carbohydrates, especially sucrose, are the primary resource compound for the seedling before the degradation of TAGs and amino acids is initiated. These degradation products can then be used in gluconeogenesis to produce glucose. Transcriptome analyses have identified key SnRK1-dependent genes, that play a key role in the storage resource catabolism, for example ACYL-CoA-OXIDASE 4 (ACX4) and PMDH2 in TAG breakdown. As an example of an enzyme involved in amino acid catabolism, cyPPDK was further investigated in the course of this study. During the degradation of amino acids, cyPPDK, a key enzyme in the degradation of certain amino acids and gluconeogenesis, is transcriptionally regulated in a SnRK1-dependent manner. Furthermore, it was discoverd that the SnRK1-dependent transcription factor bZIP63 (BASIC LEUCINE ZIPPER 63) is involved in the regulation of amino acid breakdown: In qRT-PCR experiments, bzip63-mutants showed no induction of cyPPDK, and co-regulation studies showed that cyPPDK and bZIP63 are subject to the same SnRK1-dependet regulation pattern during early seedling development. Finally, by mutation mapping and chromatin immunoprecipitation (ChIP)PCR, a direct binding of bZIP63 to the promoter could be demonstrated. Based on these results, a mechanistic working model was established, proposing bZIP63 to be phosphorylated by SnRK1 to then activate transcription of the cyPPDK promoter via binding to regulatory G-box cis elements. As a consequence, amino acids are degraded and the metabolites are used to produce glucose via gluconeogenesis. This additional source of energy enables the seedling to make the transition from heterotrophy to autotrophy. Additionally, the degradation of branched-chain amino acids is also regulated by bZIP63. Thereby, ATP is generated to fuel the seedlings energy demands. In summary, this study shows that SnRK1 plays an essential role in the mobilization of storage compounds in seedlings during the transition from heterotrophic to autotrophic life by supplying the seedling with the much-needed additional energy gained from the breakdown of TAGs and amino acids. Mining the extensive RNA-Seq data sets provided by this study will allow the identification of further SnRK1-dependent genes to further unravel this crucial signaling network. Due to the crucial role that these proteins play in early seedling development, these findings will enable future research to increase seedling vigor and finally crop yield. KW - SnRK1 KW - seedling establishment KW - transcription factor KW - Arabidopsis KW - Keimlingsentwicklung KW - bZIP KW - Transkriptionsfaktor Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-214305 ER - TY - THES A1 - von Rüden, Martin Frederik T1 - The Venus flytrap - Role of oxylipins in trap performance of Dionaea muscipula T1 - Die Venus Fliegenfalle – Die Rolle von Oxilipinen im Fallenverhalten von Dionaea muscipula N2 - A part of the plant kingdom consists of a variety of carnivorous plants. Some trap their prey using sticky leaves, others have pitfall traps where prey cannot escape once it has fallen inside. A rare trap type is the snap-trap: it appears only twice in the plant kingdom, in the genera Aldrovanda and Dionaea. Even Charles Darwin himself described Dionaea muscipula, the Venus flytrap, with the following words “This plant, commonly called Venus' fly-trap, from the rapidity and force of its movements, is one of the most wonderful in the world”. For a long time now, the mechanisms of Dionaea’s prey recognition, capture and utilization are of interest for scientists and have been studied intensively. Dionaea presents itself with traps wide-open, ready to catch insects upon contact. For this, the insect has to touch the trigger hairs of the opened trap twice within about 20-30 seconds. Once the prey is trapped, the trap lobes close tight, forming a hermetically sealed “green stomach”. Until lately, there was only limited knowledge about the molecular and hormonal mechanisms which lead to prey capture and excretion of digestive fluids. It is known that the digestion process is very water-consuming; therefore, the interplay of digestion-inducing and digestion inhibiting substances was to be analyzed in this work, to elucidate the fine-tuning of the digestive pathway. Special attention was given to the impact of phytohormones on mRNA transcript levels of digestion-related proteins after various stimuli as well as their effect on Dionaea’s physiological responses. Jasmonic acid (JA) and its isoleucine-conjugated form, JA-Ile, are an important signal in the jasmonate pathway. In the majority of non-carnivorous plants, jasmonates are critical for the defense against herbivory and pathogens. In Dionaea, this defense mechanism has been restructured towards offensive prey catching. One question in this work was how the frequency of trigger hair bendings is related to the formation of jasmonates and the induction of the digestion process. Upon contact of a prey with the trigger hairs in the inside of the trap, the trap closes and jasmonates are produced biosynthetically. JA-Ile interacts with the COI1- receptor, thereby activating the digestion pathway which leads to the secretion of digestive fluid and production of transporters needed to take up prey-derived nutrients. In this work it could be shown that the number of trigger hair bendings is positively correlated with the level and duration of transcriptional induction of several digestive enzymes/hydrolases. Abscisic acid (ABA) acts, along with many other functions, as the plant “drought stress hormone”. It is synthesized either by roots as the primary sensor for water shortage or by guard cells in the leaves. ABA affects a network of several thousand genes whose regulation prepares the plant for drought and initiates protective measurements. It was known from previous work that the application of ABA for 48 hours increased the required amount of trigger hair bendings to achieve trap closure. As the digestion process is very water-intensive, the question arose how exactly the interplay between the jasmonate- and the ABA-pathway is organized, and if ABA could stop the running digestion process once it had been activated. In the present work it could be shown that the application of ABA on intact traps prior to mechanically stimulating the trigger hairs (mechanostimulation) already significantly reduced the transcription of digestive enzymes for an incubation time as short as 4 h, showing that already short-term exposure to ABA counteracts the effects of jasmonates when it comes to initiating the digestion process, but does not inhibit trap closure. Incubation for 24 and 48 hours with 100 μM active ABA had no effect on trap reopening, only very high levels of 200 μM of active ABA inhibited trap reopening but also led to tissue necrosis. As the application of ABA could reduce the transcription of digestive hydrolases, it is likely that Dionaea can stop the digestion process, if corresponding external stimuli are received. Another factor, which only emerged later, was the effect of the wounding-induced systemic jasmonate burst. As efficient as ABA was in inhibiting marker hydrolase expression after mechanostimulation in intact plants, the application of ABA on truncated traps was not able to inhibit mechanostimulation-induced marker hydrolase expression. One reason might be that the ABA-signal is perceived in the roots, and therefore truncated traps were not able to react to it. Another reason might be that the wounding desensitized the tissue for the ABAsignal. Further research is required at this point. Inhibitors of the jasmonate pathway were also used to assess their effect on the regulation of Dionaea´s hunting cycle. Coronatine-O-methyloxime proved to be a potent inhibitor of mechanostimulation-induced expression of digestive enzymes, thus confirming the key regulatory role of jasmonates for Dionaea´s prey consumption mechanism. In a parallel project, the generation of in vitro cultures from sterilized seeds and single plant parts proved successful, which may be important for stock-keeping of future transgenic lines. Protoplasts were generated from leaf blade tissue and transiently transformed, expressing the reporter protein YFP after 24 h of incubation. In the future this might be the starting point for the generation of transgenic lines or the functional testing of DNA constructs. N2 - Ein Teil des Pflanzenreiches besteht aus einer Vielfalt fleischfressender Pflanzen. Einige fangen ihre Beute mit klebrigen Blättern, andere haben Grubenfallen, aus denen die Beute nicht mehr entkommen kann, wenn sie erst einmal hineingefallen ist. Ein seltener Fallentyp ist die Klappfalle: Sie kommt im Pflanzenreich nur zweimal vor, in den Gattungen Aldrovanda und Dionaea. Charles Darwin selbst beschrieb Dionaea muscipula, die Venusfliegenfalle, als "eine der schönsten Pflanzen der Welt". Die Mechanismen der Erkennung, des Fangs und der Nutzbarmachung von Beutetieren durch Dionaea sind seit langem von Interesse für die Wissenschaft und wurden intensiv untersucht. Dionaea hat weit geöffnete Fallen, die bei Kontakt Insekten fangen können. Dazu muss das Insekt innerhalb von ca. 20-30 Sekunden zweimal die Triggerhaare der geöffneten Falle berühren. Sobald die Beute gefangen ist, schließen sich die Fallenhälften fest und bilden einen hermetisch verschlossenen sogenannten „grünen Magen“. Bis vor einigen Jahren gab es nur wenige Informationen über die molekularen und hormonellen Mechanismen, die zu Beutefang und Sekretion von Verdauungsflüssigkeiten führen. Es ist bekannt, dass der Verdauungsprozess sehr viel Wasser verbraucht; daher sollte in dieser Arbeit das Zusammenspiel von verdauungsauslösenden und verdauungshemmenden Substanzen untersucht werden, um die Feinabstimmung des Verdauungsweges aufzuklären. Ein besonderes Augenmerk wurde auf den Einfluss von Phytohormonen auf die mRNATranskriptzahlen von Verdauungsproteinen nach verschiedenen Stimuli sowie auf deren Auswirkungen auf die physiologischen Reaktionen von Dionaea gelegt. Jasmonsäure (JA) und ihre mit Isoleucin konjugierte Form, JA-Ile, sind ein wichtiges Signal in pflanzlichen Signaltransduktionsprozessen. In der Mehrzahl der nicht-karnivoren Pflanzen sind Jasmonate entscheidend für die Abwehr von Herbivoren und Pathogenen. In Dionaea wurde dieser Abwehrmechanismus für den offensiven Beutefang umstrukturiert. Eine Frage in dieser Arbeit war also, wie die Häufigkeit der Triggerhaarberührungen mit der Bildung von Jasmonaten und dem Verdauungsvorgang miteinander in Verbindung steht. Beim Kontakt von Beute mit den Triggerhaaren im Inneren der Falle schließt sich diese, und es werden durch Biosynthese Jasmonate gebildet. JA-Ile interagiert mit dem COI1-Rezeptor und aktiviert so den Verdauungsweg, der zur Sekretion von Verdauungsflüssigkeit und zur Produktion von Transportern führt, welche zur Aufnahme von aus Beute gewonnenen Nährstoffen benötigt werden. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Anzahl der Triggerhaarberührungen positiv mit der Höhe und der Dauer der Transkriptionsinduktion mehrerer Verdauungsenzyme bzw. Verdauungshydrolasen korreliert. Abscisinsäure (ABA) fungiert neben vielen anderen Funktionen als pflanzliches „Trockenstresshormon“. Es wird entweder von Wurzeln als primärem Sensor für Wassermangel oder von Schließzellen in den Blättern synthetisiert. ABA beeinflusst ein Netzwerk von mehreren tausend Genen, deren Regulation die Pflanze auf Dürre vorbereitet und entsprechende Schutzmaßnahmen einleitet. Aus früheren Arbeiten war bekannt, dass die 48-stündige Inkubation einer Dionaea-Falle mit ABA die erforderliche Anzahl an Triggerhaarberührungen erhöhte, die für einen Fallenschluss notwendig sind. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass das Aufbringen von ABA auf intakte Fallen vor der mechanischen Stimulierung der Triggerhaare (Mechanostimulation) die Expression von Verdauungsenzymen bereits bei einer Inkubationszeit von nur 4 Stunden signifikant reduzierte. Das zeigte eindeutig, dass die kurzzeitige Einwirkung von ABA bereits die Effekte von Jasmonaten blockiert, wenn es um den Beginn des Verdauungsprozesses geht, aber keinen Einfluss auf den Fallenschluss hat. Eine Inkubation für 24 und 48 Stunden mit 100 μM aktiver ABA hatte keine Auswirkung auf das Wiederöffnen der Falle, nur sehr hohe Konzentrationen von 200 μM aktiver ABA hemmten das Wiederöffnen der Falle, führten aber auch zu Gewebenekrose. Da ABA die Transkription der Verdauungsenzyme reduzieren konnte, ist es wahrscheinlich, dass Dionaea den Verdauungsvorgang stoppen kann, wenn entsprechende externe Signale empfangen werden. Ein weiterer Einflussfaktor, welcher erst später erkannt wurde, war die Auswirkung des verwundungsbedingten, sprunghaften systemischen Anstiegs der Jasmonatkonzentration auf die Wirkung von extern aufgegebenen Phytohormonen. So wirksam ABA bei der Hemmung der Markerhydrolasen-Expression nach Mechanostimulation in intakten Pflanzen war, so konnte diese Inhibition nach Anwendung von ABA auf abgeschnittenen Fallen nicht mehr beobachtet werden. Ein Grund könnte sein, dass das ABA-Signal in den Wurzeln wahrgenommen wird und daher abgeschnittene Fallen nicht darauf reagieren konnten. Ein anderer Grund könnte sein, dass die Verwundung das Gewebe für das ABA-Signal desensibilisiert hat. An dieser Stelle besteht weiterer Forschungsbedarf. Ebenfalls wurden Inhibitoren des Jasmonat-Weges verwendet, um ihre Wirkung auf die Regulation des Beutefangzyklus von Dionaea zu untersuchen. Coronatine-O-methyloxim erwies sich als wirksamer Inhibitor der durch Mechanostimulation induzierten Expression von Verdauungsenzymen und bestätigte damit die zentrale regulatorische Rolle von Jasmonaten für den Beutefangmechanismus von Dionaea. Ein parallel laufendes Projekt war die Erzeugung von in vitro-Kulturen aus sterilisiertem Saatgut und einzelnen Pflanzenteilen, das sich als sehr erfolgreich erwies, was für die Erzeugung zukünftiger transgener Linien wichtig sein kann. Ebenfalls wurden Protoplasten aus Blattgewebe erzeugt, diese wurden transient transformiert und exprimierten YFP nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden. In Zukunft könnte dies der Ausgangspunkt für die Generierung transgener Linien sein und der Funktionsüberprüfung von DNA-Konstrukten sein. KW - Venusfliegenfalle KW - Protoplast KW - Abscisinsäure KW - Jasmonsäure KW - Antibiotikum KW - Dionaea KW - Herbicid KW - Celaflor Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-273854 ER - TY - THES A1 - Yang, Shang T1 - Characterization and engineering of photoreceptors with improved properties for optogenetic application T1 - Charakterisierung und Entwicklung von Photorezeptoren mit verbesserten Eigenschaften für die optogenetische Anwendung N2 - Optogenetics became successful in neuroscience with Channelrhodopsin-2 (ChR2), a light-gated cation channel from the green alga Chlamydomonas reinhardtii, as an easy applicable tool. The success of ChR2 inspired the development of various photosensory proteins as powerful actuators for optogenetic manipulation of biological activity. However, the current optogenetic toolbox is still not perfect and further improvements are desirable. In my thesis, I engineered and characterized several different optogenetic tools with new features. (i) Although ChR2 is the most often used optogenetic actuator, its single-channel conductance and its Ca2+ permeability are relatively low. ChR2 variants with increased Ca2+ conductance were described recently but a further increase seemed possible. In addition, the H+ conductance of ChR2 may lead to cellular acidification and unintended pH-related side effects upon prolonged illumination. Through rational design, I developed several improved ChR2 variants with larger photocurrent, higher cation selectivity, and lower H+ conductance. (ii) The light-activated inward chloride pump NpHR is a widely used optogenetic tool for neural silencing. However, pronounced inactivation upon long time illumination constrains its application for long-lasting neural inhibition. I found that the deprotonation of the Schiff base underlies the inactivation of NpHR. Through systematically exploring optimized illumination schemes, I found illumination with blue light alone could profoundly increase the temporal stability of the NpHR-mediated photocurrent. A combination of green and violet light eliminates the inactivation effect, similar to blue light, but leading to a higher photocurrent and therefore better light-induced inhibition. (iii) Photoactivated adenylyl cyclases (PACs) were shown to be useful for light-manipulation of cellular cAMP levels. I developed a convenient in-vitro assay for soluble PACs that allows their reliable characterization. Comparison of different PACs revealed that bPAC from Beggiatoa is the best optogenetic tool for cAMP manipulation, due to its high efficiency and small size. However, a residual activity of bPAC in the dark is unwanted and the cytosolic localization prevents subcellular precise cAMP manipulation. I therefore introduced point mutations into bPAC to reduce its dark activity. Interestingly, I found that membrane targeting of bPAC with different linkers can remarkably alter its activity, in addition to its localization. Taken together, a set of PACs with different activity and subcellular localization were engineered for selection based on the intended usage. The membrane-bound PM-bPAC 2.0 with reduced dark activity is well-tolerated by hippocampal neurons and reliably evokes a transient photocurrent, when co-expression with a CNG channel. (iv) Bidirectional manipulation of cell activity with light of different wavelengths is of great importance in dissecting neural networks in the brain. Selection of optimal tool pairs is the first and most important step for dual-color optogenetics. Through N- and C-terminal modifications, an improved ChR variant (i.e. vf-Chrimson 2.0) was engineered and selected as the red light-controlled actuator for excitation. Detailed comparison of three two-component potassium channels, composed of bPAC and the cAMP-activated potassium channel SthK, revealed the superior properties of SthK-bP. Combining vf-Chrimson 2.0 and improved SthK-bP “SthK(TV418)-bP” could reliably induce depolarization by red light and hyperpolarization by blue light. A residual tiny crosstalk between vf-Chrimson 2.0 and SthK(TV418)-bP, when applying blue light, can be minimized to a negligible level by applying light pulses or simply lowering the blue light intensity. N2 - Die Optogenetik wurde in den Neurowissenschaften mit Channelrhodopsin-2 (ChR2), einem lichtgesteuerten Kationenkanal aus der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii, als leicht anwendbares Werkzeug erfolgreich. Der Erfolg von ChR2 inspirierte die Entwicklung verschiedener photosensorischer Proteine als leistungsstarke Aktuatoren für die optogenetische Manipulation der biologischen Aktivität. Die derzeitige optogenetische Toolbox ist jedoch immer noch nicht perfekt und weitere Verbesserungen sind wünschenswert. In meiner Arbeit habe ich verschiedene optogenetische Werkzeuge mit neuen Funktionen entwickelt und charakterisiert. (i) Obwohl ChR2 der am häufigsten verwendete optogenetische Aktuator ist, sind seine Einzelkanal-Leitfähigkeit und seine Ca2 + -Permeabilität relativ gering. Kürzlich wurden ChR2-Varianten mit erhöhter Ca2 + -Leitfähigkeit beschrieben, eine weitere Verbesserung schien jedoch möglich. Darüber hinaus kann die H+-Leitfähigkeit von ChR2 bei längerer Beleuchtung zu einer Ansäuerung der Zellen und zu unbeabsichtigten Nebenwirkungen im Zusammenhang mit dem pH-Wert führen. Durch rationales Design entwickelte ich mehrere verbesserte ChR2-Varianten mit größerem Photostrom, höherer Kationenselektivität und geringerer H+-Leitfähigkeit. (ii) Die lichtaktivierte Chloridpumpe NpHR ist ein weit verbreitetes optogenetisches Werkzeug für die neuronale Inhibierung. Eine ausgeprägte Inaktivierung bei längerer Beleuchtung schränkt jedoch die Anwendung für eine lang anhaltende neuronale Hemmung ein. Ich konnte zeigen, dass die Deprotonierung der Schiffschen Base der Inaktivierung von NpHR zugrunde liegt. Durch die systematische Untersuchung optimierter Beleuchtungsschemata fand ich heraus, dass die Beleuchtung mit blauem Licht allein die zeitliche Stabilität des NpHR-vermittelten Photostroms erheblich verbessern kann. Eine Kombination aus grünem und violettem Licht eliminiert den Inaktivierungseffekt, ähnlich wie blaues Licht, führt jedoch zu einem höheren Photostrom und deswegen effektiverer Licht-induzierter Inhibierung. (iii) Photoaktivierte Adenylylcyclasen (PACs) erwiesen sich als nützlich für die Lichtmanipulation der zellulären cAMP-Spiegel. Ich habe einen praktischen in-vitro-Test für lösliche PACs entwickelt, der deren zuverlässige Charakterisierung ermöglicht. Ein Vergleich verschiedener PACs ergab, dass bPAC von Beggiatoa aufgrund seiner hohen Effizienz und geringen Größe das beste optogenetische Werkzeug für die cAMP-Manipulation ist. Eine Restaktivität von bPAC im Dunkeln ist jedoch unerwünscht und die cytosolische Lokalisierung verhindert eine subzellulär präzise cAMP-Manipulation. Ich habe daher Punktmutationen in bPAC eingeführt, um dessen Dunkelaktivität zu reduzieren. Interessanterweise fanden Ich heraus, dass das Membrantargeting von bPAC mit verschiedenen „Linkern“ zusätzlich zu seiner Lokalisierung seine Aktivität erheblich verändern kann. Zusammengenommen wurde eine Reihe von PACs mit unterschiedlicher Aktivität und subzellulärer Lokalisation für unterschiedliche Anwendungen konstruiert. Das membrangebundene PM-bPAC 2.0 mit reduzierter Dunkelaktivität wird von Hippocampus-Neuronen gut vertragen und erlaubt, bei gleichzeitiger Expression mit einem CNG-Kanal, zuverlässig einen Licht-induzierten Strom auszulösen. (iv) Die bidirektionale Manipulation der Zellaktivität mit Licht unterschiedlicher Wellenlänge ist für die Dissektion neuronaler Netze im Gehirn von großer Bedeutung. Die Auswahl der optimalen Werkzeugpaare ist der erste und wichtigste Schritt für die zweifarbige Optogenetik. Durch N- und C-terminale Modifikationen wurde eine verbesserte ChR-Variante (d. h. Vf-Chrimson 2.0) entwickelt und als Rotlicht-gesteuerter Aktuator zur Anregung ausgewählt. Ein detaillierter Vergleich von drei Zweikomponenten-Kaliumkanälen, bestehend aus bPAC und dem cAMP-aktivierten Kaliumkanal SthK, ergab die überlegenen Eigenschaften von SthK-bP. Die Kombination von vf-Chrimson 2.0 und verbessertem SthK-bP „SthK(TV418)-bP“ konnte zuverlässig eine Depolarisation durch rotes Licht und eine Hyperpolarisation durch blaues Licht induzieren. Ein restliches, kleines Übersprechen zwischen vf-Chrimson 2.0 und SthK(TV418)-bP kann beim Anlegen von blauem Licht durch Anlegen von Lichtimpulsen oder durch einfaches Verringern der Intensität von blauem Licht auf ein vernachlässigbares Maß minimiert werden. KW - Optogenetics KW - ChR2 KW - NpHR KW - PAC KW - Bidirectional manipulation Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-205273 ER - TY - THES A1 - Muralidhara, Prathibha T1 - Perturbations in plant energy homeostasis alter lateral root plasticity via SnRK1-bZIP63-ARF19 signalling T1 - Störungen in der pflanzlichen Energiehomöostase verändern die laterale Wurzelplastizität vermittelt durch das SnRK1-bZIP63-ARF19-Signalmodul N2 - Photosynthetic plants have a remarkable ability to modify their metabolism and development according to ever changing environmental conditions. The root system displays continuous growth of the primary root and formation of lateral roots enabling efficient water and nutrient uptake and anchorage of the plant in soil. With regard to lateral roots, development is post-embryonic, originating from the pericycle of the primary root. Coordinated activity of several molecular signalling pathways controlled by the hormone auxin is important throughout all stages of lateral root development.At first, two adjacent Xylem Pole Pericycle (XPP) cells are activated and the nuclei of these cells migrate towards a common cell wall.This is followed by XPP cells acquiring volume thus swelling up.The XPP cells then undergo anticlinal cell division, followed by a series of periclinal and anticlinal divisions,leading to lateral root primordia.These break through the radial cell layers and emerge out the primary root. Although root system plasticity is well-described in response to environmental cues such as ion nutrition in the soil, little is known on how root development is shaped according to the endogenous energy status of the plant.In this study, we were able to connect limited perturbations in photosynthetic energy supply to lateral root development.We established two experimental systems – treatment with low light and unexpected darkness which led to short-term energy imbalance in the plant.These short perturbations administered, showed an increase in the emerged lateral root density and decrease in root hexose availability and activation of the low energy marker gene ASN1 (ASPARAGINE SYNTHETASE 1).Although not demonstrated, presumably, these disturbances in the plant energy homeo-stasis activates SnRK1 (SNF1 RELATED KINASE 1),an evolutionary conserved kinase mediat-ing metabolic and transcriptional responses towards low energy conditions. In A. thaliana, two catalytic α-subunits of this kinase (SnRK1.α1 and SnRK1.α2) are functionally active and form ternary complexes with the regulatory β- and γ- subunits. Whereas unexpected darkness results in an increase in emerged lateral root density, the snrk1.α1 loss-of-function mutant displayed decrease in emerged lateral root density. As this effect is not that pronounced in the snrk1.α2 loss-of-function mutant, the α1 catalytic subunit is important for the observed lateral root phenotype under short-term energy perturbations. Moreover, root expression patterns of SnRK1.α1:GFP supports a role of this catalytic subunit in lateral root development. Furthermore, the lateral root response during short-term perturbations requires the SnRK1 downstream transcriptional regulator bZIP63 (BASIC LEU-CINE ZIPPER 63), as demonstrated here by a loss-of-function approach. Phenotypic studies showed that in comparison to wild-type, bzip63 mutants displayed decreased lateral root density upon low-light and unexpected darkness conditions. Previous work has demonstrat-ed that SnRK1 directly phosphorylates bZIP63 at three serine residues. Alanine-exchange mutants of the SnRK1 dependent bZIP63 phosphorylation sites behave similarly to bzip63 loss-of-function mutants and do not display increased lateral root density upon short-term unexpected darkness. This data strongly supports an impact of SnRK1-bZIP63 signalling in mediating the observed lateral root density phenotype. Plants expressing a bZIP63:YFP fu-sion protein showed specific localization patterns in primary root and in all developmental stages of the lateral root. bzip63 loss-of-function mutant lines displayed reduced early stage lateral root initiation events under unexpected darkness as demonstrated by Differen-tial Interference Contrast microscopy (DIC) and the use of a GATA23 reporter line. This data supports a role of bZIP63 in early lateral root initiation. Next, by employing Chromatin Immunoprecitation (ChIP) sequencing, we were able to iden-tify global binding targets of bZIP63, including the auxin-regulated transcription factor (TF) ARF19 (AUXIN RESPONSE FACTOR 19), a well-described central regulator of lateral root development. Additional ChIP experiments confirmed direct binding of bZIP63 to an ARF19 promoter region harboring a G-Box cis-element, a well-established bZIP63 binding site. We also observed that short-term energy perturbation upon unexpected darkness induced tran-scription of ARF19, which was impaired in the bzip63 loss-of-function mutant. These results propose that bZIP63 mediates lateral root development under short-term energy perturba-tion via ARF19. In conclusion, this study provides a novel mechanistic link between energy homeostasis and plant development. By employing reverse genetics, confocal imaging and high-throughput sequencing strategies, we were able to propose a SnRK1-bZIP63-ARF19 signalling module in integrating energy signalling into lateral root developmental programs. N2 - Photosynthestisch aktive Pflanzen haben die bemerkenswerte Fähigkeit, ihren Stoffwechsel und ihre Entwicklung an sich ständig ändernde Umweltbedingungen anzupassen. Das pflanz- liche Wurzelsystem weist ein kontinuierliches Primärwurzelwachstum und eine Ausbildung von Seitenwurzeln auf, wodurch eine effiziente Wasser- und Nährstoffaufnahme sowie die Verankerung der Pflanze im Boden ermöglicht werden. Die Entwicklung der Seitenwurzeln verläuft post-embryonal, ausgehend vom Perizykel der Primärwurzel. Die koordinierte Aktivi- tät mehrerer molekularer Signalwege, die durch das Hormon Auxin gesteuert werden, ist in allen Stadien der Seitenwurzelentwicklung wichtig. Bei diesem Prozess werden zunächst zwei benachbarte Xylem-Pol-Perizykel-Zellen (XPP) aktiviert, deren Zellkerne zu einer gemeinsa- men Zellwand migrieren. Daraufhin schwillt das Volumen der XPP-Zellen an, bevor sich diese zunächst antiklinal teilen. Durch sukzessive periklinale und antiklinale Teilungen entstehen so Seitenwurzel-Primordien. Diese durchbrechen die radialen Zellschichten und treten aus der Primärwurzel aus. Während die Plastizität des Wurzelsystems als Reaktion auf Umwelteinflüsse, wie z.B. die Ver- sorgung mit Ionen aus dem Boden, bereits umfassend erforscht wurde, so ist die Abhängigkeit der Wurzelentwicklung vom endogenen Energiezustand der Pflanze weitgehend unbekannt. In dieser Arbeit konnten wir geringfügige Störungen der photosynthetischen Energieversor- gung mit der Seitenwurzelentwicklung in Verbindung bringen. Pflanzen wurden Schwachlicht oder unerwarteter Dunkelheit ausgesetzt und damit ein kurzzeitiges Energieungleichgewicht erzeugt. Hierdurch zeigte sich eine Zunahme der Seitenwurzeldichte bei gleichzeitiger Ab- nahme der Verfügbarkeit von Hexosen in der Wurzel und Aktivierung des Energieverarmungs- Markergens ASN1 (ASPARAGIN-SYNTHETASE 1). Obwohl dieser Mechanismus noch nicht ge- klärt ist, aktiviert die Störung der pflanzlichen Energie-Homöostase vermutlich SnRK1 (SNF1 RELATED KINASE 1), eine evolutionär konservierte Kinase, die metabolische und transkriptio- nelle Reaktionen auf niederenergetische Bedingungen vermittelt. In Arabidopsis sind zwei ka- talytische α-Untereinheiten dieser Kinase (SnRK1.α1 und SnRK1.α2) funktionell aktiv und bil- den ternäre Komplexe mit den regulatorischen β- und γ-Untereinheiten. Während eine uner- wartete Dunkelheit zu einer Zunahme der Dichte der auswachsenden Seitenwurzeln führt, zeigte die Snrk1.α1 Funktionsverlustmutante den gegenteiligen Effekt. Da dieser Effekt in der Funktionsverlustmutante von snrk1.α2 weniger stark ausgeprägt ist, scheint die katalytische Untereinheit α1 für den beobachteten Seitenwurzel-Phänotyp unter kurzfristigen Energiestö- rungen eine wichtige Rolle zu spielen. Das Expressionsmuster von SnRK1.α1:GFP in der Wur- zel unterstützt die mögliche Rolle dieser katalytischen Untereinheit bei der Seitenwurzelent- wicklung weiter. Darüber hinaus erfordert die Seitenwurzelbildung während kurzfristiger Störung des pflanzli- chen Energiehaushalts den SnRK1-nachgeschalteten Transkriptionsregulator bZIP63 (BASIC LEUCINE ZIPPER 63). Phänotypische Studien zeigten, dass bzip63-Funktionsverlust-Mutanten im Vergleich zum Wildtyp nach der Kultivierung unter Schwachlicht oder nach unerwarteter Dunkelheit eine geringere Seitenwurzeldichte aufwiesen. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass SnRK1 bZIP63 direkt an drei Serinresten phosphoryliert. Alanin-Austauschmutanten der SnRK1-abhängigen bZIP63-Phosphorylierungsstellen verhielten sich ähnlich wie bzip63-Funk- tionsverlustmutanten und zeigten bei kurzzeitiger unerwarteter Dunkelheit keine erhöhte Seitenwurzeldichte. Diese Daten weisen deutlich auf einen Einfluss des SnRK1-bZIP63-Signal- wegs auf den beobachteten Seitenwurzeldichte Phänotyp hin. Pflanzen, die ein bZIP63:YFP- Fusionsprotein exprimieren, zeigten ein spezifisches bZIP63 Lokalisierungsmuster in der Pri- märwurzel, sowie in allen Entwicklungsstadien der Seitenwurzel. bzip63-Funktionsverlustmu- tantenlinien zeigten reduzierte Seitenwurzel- Initiationsereignisse bei unerwarteter Dunkel- heit, wie durch Differentialinterferenzkontrast-Mikroskopie (DIC) und der Verwendung einer GATA23-Reporterlinie nachgewiesen wurde. Diese Ergebnisse deuten auf eine Rolle von bZIP63 bei der frühen Seitenwurzel-Initiierung hin. Durch die Anwendung der Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP)-Sequenzierungsmethode konnten wir daraufhin globale Bindungsziele von bZIP63 identifizieren, einschließlich des au- xinregulierten Transkriptionsfaktors ARF19 (AUXIN RESPONSE FACTOR 19), einem gut be- schriebenen zentralen Regulator der Seitenwurzelentwicklung. Zusätzliche ChIP-Experimente bestätigten die direkte Bindung von bZIP63 an eine ARF19-Promotorregion, die ein G-Box cis- Element, eine bekannte bZIP63-Bindungsstelle, beherbergt. Wir beobachteten auch, dass kurzfristige Energiestörungen bei unerwarteter Dunkelheit die Transkription von ARF19 indu- zierte, die in der bzip63-Funktionsverlustmutante beeinträchtigt war. Diese Ergebnisse legen nahe, dass bZIP63 die Seitenwurzelentwicklung unter kurzfristiger Energiestörung über ARF19 vermittelt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Studie eine neuartige mechanistische Verbin- dung zwischen Energiehomöostase und Pflanzenentwicklung herstellt. Durch den Einsatz von reverser Genetik, konfokaler Mikroskopie und Hochdurchsatz-Sequenzierungsstrategien konnten wir einen SnRK1-bZIP63-ARF19-Signalweg zur Integration von Energiesignalen in Sei- tenwurzelentwicklungsprogramme aufdecken. KW - Arabidopsis thaliana KW - Lateral root development KW - SnRK1-bZIP complex Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-205636 ER - TY - THES A1 - Staiger, Simona T1 - Chemical and physical nature of the barrier against active ingredient penetration into leaves: effects of adjuvants on the cuticular diffusion barrier T1 - Chemische und physikalische Beschaffenheit der Barriere gegenüber Wirkstoffen: Adjuvantieneffekte auf die kutikuläre Diffusionsbarriere N2 - Agrochemicals like systemic active ingredients (AI) need to penetrate the outermost barrier of the plant, known as the plant cuticle, to reach its right target site. Therefore, adjuvants are added to provide precise and efficient biodelivery by i.a. modifying the cuticular barrier and increasing the AI diffusion. This modification process is depicted as plasticization of the cuticular wax which mainly consists of very long-chain aliphatic (VLCA) and cyclic compounds. Plasticization of cuticular waxes is pictured as an increase of amorphous domains and/or a decrease of crystalline fractions, but comprehensive, experimental proof is lacking to date. Hence, the objective of this thesis was to i) elucidate the permeation barrier of the plant cuticle to AIs in terms of the different wax fractions and ii) holistically investigate the modification of this barrier using selected oil and surface active adjuvants, an aliphatic leaf wax and an artificial model wax. Therefore, the oil adjuvant methyl oleate (MeO) and other oil derivatives like methyl linolenate (MeLin), methyl stearate (MeSt) and oleic acid (OA) were selected. Three monodisperse, non-ionic alcohol ethoxylates with increasing ethylene oxide monomer (EO) number (C10E2, C10E5, C10E8) were chosen as representatives of the group of surface active agents (surfactants). Both adjuvant classes are commonly used as formulation aids for agrochemicals which are known for its penetration enhancing effect. The aliphatic leaf wax of Schefflera elegantissima was selected, as well as a model wax comprising the four most abundant cuticular wax compounds of this species. Permeation, transpiration and penetration studies were conducted using enzymatically isolated cuticles of Prunus laurocerasus and Garcinia xanthochymus. Cuticular permeability to the three organic solutes theobromine, caffeine and azoxystrobin differing in lipophilicity was measured using a steady-state two-chamber system separated by the isolated leaf cuticles of the evergreen species P. laurocerasus and G. xanthochymus. Treating the isolated cuticles with methanol selectively removed the cyclic fraction, and membrane permeability to the organic compounds was not altered. In contrast, fully dewaxing the membranes using chloroform resulted in a statistically significant increase in permeance for all compounds and species, except caffeine with cuticles of G. xanthochymus due to a matrix-specific influence on the semi-hydrophilic compound. Crystalline regions may reduce the accessibility to the lipophilic pathway across the waxes and also block hydrophilic domains in the cuticle. Knowing that the aliphatic wax fraction builds the cuticular diffusion barrier, the influence of the adjuvants on the phase behaviour of an aliphatic cuticular wax as well as the influence on the cuticular penetration of AIs were investigated. Differential scanning calorimetry (DSC) and Fourier-transform infrared spectroscopy (FTIR) were selected to investigate the phase behaviour and thus possible plasticization of pure Schefflera elegantissima leaf wax, its artificial model wax comprising the four most abundant compounds (n-nonacosane, n-hentriacontane, 1-triacontanol and 1-dotriacontanol) and wax adjuvant mixtures. DSC thermograms showed a shift of the melting ranges to lower temperatures and decreased absolute values of the total enthalpy of transition (EOT) for all adjuvant leaf wax blends at 50 % (w/w) adjuvant proportion. The highest decrease was found for C10E2 followed by MeO > OA and C10E8 > MeLin > MeSt. The aliphatic crystallinity determined by FTIR yielded declined values for the leaf and the artificial wax with 50 % MeO. All other adjuvant leaf wax blends did not show a significant decrease of crystallinity. As it is assumed that the cuticular wax is formed by crystalline domains which consist of aliphatic hydrocarbon chains and an amorphous fraction comprising aliphatic chain ends and functional groups, the plasticizers are depicted as wax disruptors influencing amorphization and/or crystallization. The adjuvants can increase crystalline domains using the aliphatic tail whereas their more hydrophilic head is embedded in the amorphous wax fraction. DSC and FTIR showed similar trends using the leaf wax and the model wax in combination with the adjuvants. In general, cuticular transpiration increased after adding the pure adjuvants to the surface of isolated cuticles or leaf envelopes. As waxes build the cuticular permeation barrier not only to AIs but also to water, the adjuvant wax interaction might affect the cuticular barrier properties leading to increased transpiration. Direct evidence for increased AI penetration with the adjuvants was given using isolated cuticles of P. laurocerasus in combination with the non-steady-state setup simulation of foliar penetration (SOFP) and caffeine at relative humidity levels (RH) of 30, 50 and 80 %. The increase in caffeine penetration was much more pronounced using C10E5 and C10E8 than MeO but always independent of RH. Only C10E2 exhibited an increased penetration enhancing effect positively related to RH. The role of the molecular structure of adjuvants in terms of humectant and plasticizer properties are discussed. Hence, the current work shows for the first time that the cuticular permeation barrier is associated with the VLCAs rather than the cyclic fraction and that adjuvants structurally influence this barrier resulting in penetration enhancing effects. Additionally, this work demonstrates that an artificial model wax is feasible to mimic the wax adjuvant interaction in conformity with a leaf wax, making it feasible for in-vitro experiments on a larger scale (e.g. screenings). This provides valuable knowledge about the cuticular barrier modification to enhance AI penetration which is a crucial factor concerning the optimization of AI formulations in agrochemistry. N2 - Um ihren optimalen Wirkort in der Pflanze zu erreichen, müssen Agrochemikalien wie systemische Wirkstoffe zunächst die Kutikula überwinden, die die äußerste Barriere der Pflanze darstellt. Es werden sogenannte Adjuvantien verwendet, die unter anderem die kutikuläre Barriere modifizieren, um eine präzise und effiziente Bereitstellung des Wirkstoffs wie auch eine erhöhte Wirkstoffdiffusion zu ermöglichen. Diese Modifikation wird als Weichmachereffekt der Adjuvantien im kutikulären Wachs verstanden. Die Wachse umfassen hauptsächlich langkettige Aliphaten (VLCA) und zyklische, organische Komponenten. Da die Wachse aus kristallinen, für Wirkstoffe unzugänglichen und amorphen, zugänglichen Bereichen bestehen, wird angenommen, dass der Weichmacherprozess eine Zunahme der amorphen Phase und/oder eine Abnahme der kristallinen Phase hervorruft. Allerdings sind umfassende, experimentelle Beweise bisher nicht verfügbar. Daher lag der Schwerpunkt dieser Arbeit auf i) der Aufklärung, wie die verschiedenen Wachsfraktionen zur kutikulären Permeationsbarriere gegenüber Wirkstoffen beitragen und ii) der ganzheitlichen Untersuchung der kutikulären Penetrationsbarriere hinsichtlich eines aliphatischen Pflanzen- und Modelwachses und des Einflusses ausgewählter Öl- und Tensid-Adjuvantien. Hierfür wurden die Öle Methyloleat (MeO), Methyllinolenat (MeLin), Methylstearat (MeSt) und Ölsäure (OA) und drei monodisperse, nicht-ionische Alkoholethoxylate (C10E2, C10E5, C10E8) mit zunehmender Ethylenoxidmonomerzahl (EO) verwendet. Beide Gruppen sind gängige Hilfsstoffe der Formulierung von Agrochemikalien, die für die Aufnahmebeschleunigung des Wirkstoffs bekannt sind. Das aliphatische Blattwachs von Schefflera elegantissima wurde verwendet wie auch ein Modelwachs, dass die vier Hauptkomponenten dieses kutikulären Blattwachses enthielt. Permeabilitäts-, Transpirations- und Penetrationsstudien wurden unter Verwendung enzymatisch isolierter Kutikeln von Prunus laurocerasus und Garcinia xanthochymus durchgeführt. Die kutikuläre Permeabilität gegenüber drei organischen Stoffen unterschiedlicher Lipophilie (Theobromin, Coffein und Azoxystrobin) wurde an isolierten Blattkutikeln der immergrünen Spezies Prunus laurocerasus und Garcinia xanthochymus mittels des Zweikammersystems im steady-state Zustand gemessen. Die zyklische Wachsfraktion konnte mit Hilfe von Methanol aus den isolierten Membranen extrahiert werden und die Membranen wiesen keine Veränderung in der Permeabilität gegenüber den drei Wirkstoffen auf. Im Gegensatz dazu konnte ein signifikanter Anstieg der Permeabilität für alle Substanzen und Spezies beobachtet werden, nachdem die Membranen vollkommen mittels Chloroform entwachst wurden. Einzig und allein für Coffein und Membranen von G. xanthochymus konnte keine Veränderung des Leitwerts festgestellt werden, was auf einen Matrix-spezifischen Einfluss auf semi-hydrophile Substanzen zurückzuführen ist. Hydrophile Bereiche in der Kutikula können durch kristalline, aliphatische Wachse blockiert werden und sind somit unzugänglich für hydrophile Substanzen. Auf Basis dieses neu gewonnenen Wissens der kutikulären Diffusionsbarriere wurde der Einfluss der Adjuvantien auf das Phasenverhalten eines aliphatischen Wachses wie auch ihr Einfluss auf die kutikuläre Wirkstoffpenetration untersucht. Dynamische Differenzkalorimetrie (DSC) und Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie (FTIR) wurden verwendet, um das Phasenverhalten des Blattwachses von Schefflera elegantissima, ihres artifiziellen Modelwachses, das die vier Hauptkomponenten n-Nonacosan, n-Hentriacontan, 1-Triacontanol und 1-Dotriacontanol enthielt, und mögliche Weichmachereffekte durch Adjuvantien zu untersuchen. Mittels DSC konnten Schmelzbereiche, die zu niedrigeren Temperaturen verschobenen waren, und verringerte Beträge der Übergangsenthalpien (EOT) für alle Blattwachs-Adjuvantien-Mischungen bei 50 % Adjuvans-Zugabe (w/w) festgestellt werden. Die stärkste Abnahme wurde für C10E2 gefunden, gefolgt von MeO > OA und C10E8 > MeLin > MeSt. Die mittels FTIR bestimmte aliphatische Kristallinität war bei einem MeO-Anteil von 50 % signifikant gegenüber dem puren Blattwachs vermindert. Alle anderen Adjuvantien zeigten keine signifikanten Veränderungen der Kristallinität im Vergleich zum nativen Blattwachs. Es wird angenommen, dass das kutikuläre Wachs aus kristallinen und amorphen Bereichen aufgebaut ist: erstere umfassen aliphatische Kohlenwasserstoffketten, letztere ihre Kettenenden und funktionellen Gruppen. Die Weichmacheradjuvantien können auf diese Bereiche mit einer Erhöhung der amorphen und/oder Erniedrigung der kristallinen Fraktion einwirken. Sie können mit ihrer aliphatischen Kette in die kristallinen Bereiche eindringen und diese erhöhen, wohingegen sich ihr hydrophilerer Kopf in der amorphen Phase verteilen kann. DSC und FTIR zeigten ähnliche Trends für das Pflanzen- und das Modelwachs in Kombination mit den Adjuvantien. Im Allgemeinen wiesen die isolierten Kutikeln und Blattumschläge von P. laurocerasus und G. xanthochymus erhöhte Leitwerte in Verbindung mit den Adjuvantien auf. Da die Wachse nicht nur die Permeationsbarriere für Wirkstoffe, sondern auch für Wasser darstellen, wird angenommen, dass die Wachs-Adjuvans-Interaktion verantwortlich für die erhöhte Transpiration ist. Erhöhte Wirkstoffpenetration durch Adjuvantien wurde mittels des non-steady-state Versuchs der Simulation der Blattpenetration (SOFP) an isolierten, kutikulären Membranen von P. laurocerasus unter Verwendung von Koffein bei relativen Luftfeuchten (RH) von 30, 50 und 80 % nachgewiesen. Die Zunahme der Flussrate unter Verwendung von C10E5 und C10E8 war deutlich höher als für C10E2, jedoch unabhängig von der RH. Nur für C10E2 konnte eine Abhängigkeit des Effekts von der Luftfeuchte festgestellt werden. Die Rolle der molekularen Struktur der Adjuvantien in Bezug auf „Humectant“- und Weichmachereigenschaften wird diskutiert. Die vorliegende Arbeit zeigt zum ersten Mal, dass die kutikuläre Permeationsbarriere mit den VLCAs und nicht mit der zyklischen Fraktion assoziiert ist und dass Adjuvantien wie Öle und Tenside diese Barriere strukturell beeinflussen können, was zu einer erhöhten Penetration führt. Außerdem veranschaulicht diese Arbeit, dass ein artifizielles Modelwachs die Wachs-Adjuvans-Interaktion eines Blattwachses imitieren kann und es gut geeignet für in-vitro Experimente ist, die in größerem Maßstab durchgeführt werden (z.B. Screenings). Das liefert bedeutsames Wissen über die kutikuläre Barriere und ihre Modifikation zur Erhöhung der Wirkstoffpenetration, die wichtige Faktoren in Bezug auf die optimierte Wirkstoffformulierung in der Agrarchemie darstellen. KW - Adjuvans KW - Pflanzenschutzmittel KW - Kutikula KW - Adjuvant KW - Plant Protection KW - Plant cuticle KW - Diffusion Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-199375 ER - TY - THES A1 - Schäbler, Stefan T1 - Charakterisierung des circadianen Drosophila Metaboloms unter Zuhilfenahme massenspektrometrischer Methoden T1 - Characterization of the circadian Drosophila metabolome by applying mass-spectrometry-based approaches N2 - Die Fähigkeit sich an die Rotation der Erde und den daraus resultierenden Tag- und Nacht-Rhythmus anzupassen, basiert auf einer komplexen Regulation verschiedener physiologischer Prozesse. Auf molekularer Ebene liegt diesen Prozessen eine Orchestration von Uhr-Genen zugrunde – auch als innere Uhr bezeichnet – die einen aktivierenden bzw. reprimierenden Einfluss auf die Expression einer Vielzahl weiterer Gene hat. Ausgehend von dieser Regulation lassen sich auf unterschiedlichsten Ebenen tageszeitabhängige, wiederkehrende Rhythmen beobachten. Während diese wiederkehrenden Rhythmen auf einigen Ebenen bereits gut erforscht und beschrieben sind, gibt es weitere Ebenen wie den Metabolismus, über die das Wissen bisher noch begrenzt ist. So handelt es sich bei Drosophila beispielsweise um den Organismus, dessen innere Uhr auf molekularer Ebene wahrscheinlich mit am besten charakterisiert ist. Dennoch ist bisher nur wenig über Stoffklassen bekannt, deren Metabolismus durch die innere Uhr kontrolliert wird. Zwar konnte bereits gezeigt werden, dass sich eine gestörte innere Uhr auf die Anlage der Energiespeicher auswirkt, inwiefern dies allerdings einen Einfluss auf dem intermediären Stoffwechsel hat, blieb bisher weitgehend unerforscht. Auch die Frage, welche Metaboliten wiederkehrende, tageszeitabhängige Rhythmen aufweisen, wurde bisher nur für eine begrenzte Anzahl Metaboliten untersucht. Bei der hier durchgeführten Arbeit wurden deshalb zunächst die globalen Metabolit-Profile von Fliegen mit einer auf molekularer Ebene gestörten inneren Uhr (per01) mit Fliegen, die über eine funktionale Uhr verfügen (CantonS), zu zwei Zeitpunkten verglichen. Um die Anzahl der zeitgleich untersuchten Gewebe und somit die Komplexität der Probe zu reduzieren, wurden hierfür die Köpfe von den Körpern der Fliegen getrennt und separat analysiert. Beide Körperteile wurden sowohl auf kleine hydrophile als auch auf hydrophobe Metaboliten hin mittels UPLC-ESI-qTOF-MS untersucht. Die anschließend durchgeführte, statistische Analyse brachte hervor, dass sich Unterschiede zwischen den beiden Fliegenlinien besonders in den Spiegeln der essentiellen Aminosäuren, den Kynureninen, den Pterinaten sowie den Spiegeln der Glycero(phospho)lipiden und Fettsäureester zeigten. Bei den Lipiden zeigte sich, dass die Auswirkungen weniger ausgeprägt für die Anlage der Speicher- und Strukturlipide als für die Intermediate des Lipidabbaus, die Diacylglycerole (DAGs) sowie die Acylcarnitine (ACs), waren. Um zu bestätigen, dass die inneren Uhr tatsächlich einen regulatorischen Einfluss auf die ausgemachten Stoffwechselwege hat, wurden anschließend die Spiegel aller Mitglieder darauf hin untersucht, ob diese wiederkehrende, tageszeitabhängige Schwankungen aufweisen. Hierfür wurden Proben alle zwei Stunden über drei aufeinanderfolgende Tage genommen und analysiert, bevor mittels JTK_CYCLE eine statistische Analyse der Daten durchgeführt und die Metaboliten herausgefiltert wurden, die ein rhythmisches Verhalten bei einer Periodenlänge von 24h zeigten. Hierbei bestätigte sich, dass besonders die Mitglieder des intermediären Lipidmetablismus hiervon betroffen waren. So konnten zwar auch für einige Aminosäuren robuste Rhythmen ausgemacht werden, besonders ausgeprägt waren diese jedoch erneut bei den DAGs und den ACs. Die abschließende Untersuchung letzterer unter Freilaufbedingungen (DD) sowie in per01 brachte hervor, dass die ausgemachten Rhythmen unter diesen Bedingungen entweder nicht mehr detektiert werden konnten oder deutlich abgeschwächt vorlagen. Lediglich zwei kurzkettige ACs zeigten auch unter DD-Bedingungen statistisch signifikante Rhythmen in ihren Spiegeln. Dies spricht dafür, dass neben der Regulation durch die innere Uhr weitere Faktoren, wie beispielsweise das Licht, eine entscheidende Rolle zu spielen scheinen. N2 - The ability to adapt to the rotation of the earth and to the resulting day and night rhythm is based on a complex regulation of various endogenous processes. At the molecular level, these processes are based on an orchestration of clock genes - also known as the endogenous clock – which have an activating or repressing influence on the expression of diverse clock-controlled genes. Based on this regulation, recurring rhythms depending on the time of day can be observed at various levels, ranging from gene expression to behavior. While these recurring rhythms have been well characterized on certain output levels, little is known, however, on other levels like their influence on metabolism. Drosophila for example, is an organism whose endogenous clock is probably best characterized at the molecular level. However, little is known about substance classes and metabolic pathways that are controlled by the endogenous clock. It has already been shown that an impaired endogenous clock affects energy storage, but how an impaired clock influences intermediary lipid metabolism remains still unknown. Additionally, little is known on metabolites or metabolite classes, that display recurring, time-dependent rhythms. So far this has only been studied for certain metabolites or metabolite classes. Therefore, we compared global metabolite profiles at two timepoints between flies with an impaired endogenous clock (per01) and WT flies, possessing a functional clock (CantonS). In order to reduce the number of different tissues studied at once and thus the complexity of the sample, fly heads were separated from fly bodies and analyzed separately. In both body parts levels of small hydrophilic and hydrophobic metabolites were studied using UPLC-ESI-qTOF-MS. The subsequent statistical analysis revealed differences between the two fly lines, associated with the metabolism of essential amino acids, kynurenines, pterinates, glycero(phospho)lipids and fatty acid esters. Closer inspection of the lipid classes being affected revealed, that the effects were less pronounced for the formation of storage- and structural- lipids, compared to the intermediates of lipid degradation, the diacylglycerols (DAGs) and acylcarnitines (ACs). In order to confirm that the endogenous clock has indeed a regulatory influence on these metabolic pathways, the levels of all members were studied in a time-course experiment to determine, whether they display recurring, time-of-day-dependent fluctuations. For this purpose, samples were taken every two hours for three consecutive days, with heads and bodies analyzed separately, before a statistical analysis was carried out using JTK_CYCLE. The results were then filtered for those metabolites that showed a rhythmic behavior with a period length of 24 hours. The results confirmed that members of the intermediary lipid metabolism were particularly affected. Although robust rhythms could be detected for some amino acids, multiple DAG and AC species showed even more pronounced rhythms. The subsequent analysis of the latter under freerunning conditions (DD) and in per01 showed that the identified rhythms either diminished completely under these conditions or were significantly weakened. Only two short-chain ACs showed statistically significant rhythms in their levels under DD conditions. This suggests that in addition to regulation by the internal clock, other factors, such as light, seem to play a crucial role. KW - Drosophila KW - Lipidomik KW - LC-MS KW - Biochemische Analyse KW - Tagesrhythmus KW - QTOF KW - metabolomics KW - circadian rhythms KW - Metabolomik Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-251908 ER - TY - THES A1 - Thomas, Sarah Katharina T1 - Design of novel IL-4 antagonists employing site-specific chemical and biosynthetic glycosylation T1 - Herstellung neuer IL-4 basierter Antagonisten durch zielgerichtete chemische und biosynthetische Glykosylierung N2 - The cytokines interleukin 4 (IL-4) and IL-13 are important mediators in the humoral immune response and play a crucial role in the pathogenesis of chronic inflammatory diseases, such as asthma, allergies, and atopic dermatitis. Hence, IL-4 and IL-13 are key targets for treatment of such atopic diseases. For cell signalling IL-4 can use two transmembrane receptor assemblies, the type I receptor consisting of receptors IL-4R and γc, and type II receptor consisting of receptors IL-4R and IL-13R1. The type II receptor is also the functional receptor of IL-13, receptor sharing being the molecular basis for the partially overlapping effects of IL-4 and IL-13. Since both cytokines require the IL-4R receptor for signal transduction, this allows the dual inhibition of both IL-4 and IL-13 by specifically blocking the receptor IL-4R. This study describes the design and synthesis of novel antagonistic variants of human IL-4. Chemical modification was used to target positions localized in IL-4 binding sites for γc and IL-13R1 but outside of the binding epitope for IL-4R. In contrast to existing studies, which used synthetic chemical compounds like polyethylene glycol for modification of IL-4, we employed glycan molecules as a natural alternative. Since glycosylation can improve important pharmacological parameters of protein therapeutics, such as immunogenicity and serum half-life, the introduced glycan molecules thus would not only confer a steric hindrance based inhibitory effect but simultaneously might improve the pharmacokinetic profile of the IL-4 antagonist. For chemical conjugation of glycan molecules, IL-4 variants containing additional cysteine residues were produced employing prokaryotic, as well as eukaryotic expression systems. The thiol-groups of the engineered cysteines thereby allow highly specific modification. Different strategies were developed enabling site-directed coupling of amine- or thiol- functionalized monosaccharides to introduced cysteine residues in IL-4. A linker-based coupling procedure and an approach requiring phenylselenyl bromide activation of IL-4 thiol-groups were hampered by several drawbacks, limiting their feasibility. Surprisingly, a third strategy, which involved refolding of IL-4 cysteine variants in the presence of thiol- glycans, readily allowed synthesis of IL-4 glycoconjugates in form of mixed disulphides in milligram amount. This approach, therefore, has the potential for large-scale synthesis of IL-4 antagonists with highly defined glycosylation. Obtaining a homogenous glycoconjugate with exactly defined glycan pattern would allow using the attached glycan structures for fine-tuning of pharmacokinetic properties of the IL-4 antagonist, such as absorption and metabolic stability. The IL-4 glycoconjugates generated in this work proved to be highly effective antagonists inhibiting IL-4 and/or IL-13 dependent responses in cell-based experiments and in in vitro binding studies. Glycoengineered IL-4 antagonists thus present valuable alternatives to IL-4 inhibitors used for treatment of atopic diseases such as the neutralizing anti-IL-4R antibody Dupilumab. N2 - Die Zytokine Interleukin-4 (IL-4) und IL-13 sind zentrale Mediatoren in der humoralen Immunantwort und sind wesentlich an der Entstehung chronisch inflammatorischer Erkrankungen, wie Asthma, Allergien und atopischer Dermatitis beteiligt. Daher werden IL- 4 und IL-13 als wichtige therapeutische Angriffspunkte für die Behandlung atopischer Erkrankungen betrachtet. Zur Signaltransduktion aktiviert IL-4 zwei heterodimere Rezeptorkomplexe, den Typ I Rezeptor bestehend aus den Untereinheiten IL-4R und γc und den Typ II Rezeptor, der sich aus IL-4R und IL-13R1 zusammensetzt. Der Typ II Rezeptor wird auch von IL-13 zur Signalweiterleitung genutzt, wodurch sich die teilweise überschneidenden Funktionen der beiden Zytokine erklären lassen. Die überlappende Rezeptornutzung erlaubt es durch eine gezielte Blockade des IL-4R-Rezeptors sowohl IL-4, als auch IL-13 gleichzeitig zu inhibieren. Ziel dieser Arbeit war die Herstellung neuartiger IL-4 basierter Antagonisten. Dazu wurden ausgewählte Positionen innerhalb der IL-4 Bindestelle für γc and IL-13R1, jedoch außerhalb des Bindeepitops für IL-4R gezielt chemisch modifiziert. Im Gegensatz zu bereits existierenden Studien, die synthetische Gruppen wie Polyethylenglykol (PEG) zur chemischen Modifizierung von IL-4 nutzten, wurden in dieser Arbeit Glykane als natürliche Alternative zu PEG an IL-4 gekoppelt. Da sich Glykosylierung auf wichtige pharmakologische Eigenschaften proteinbasierter Therapeutika, wie Immunogenität oder Serum Halbwertszeit, positiv auswirken kann, würde der Zucker in dieser Strategie nicht nur den auf sterischer Hinderung basierenden inhibitorischen Effekt vermitteln, sondern könnte gleichzeitig zu einer Optimierung der pharmakologischen Eigenschaften des IL-4 Inhibitors beitragen. Zur chemischen Zucker-Kopplung wurden zusätzliche Cystein-Reste in IL-4 eingebracht, deren freie Thiol-gruppen eine hochspezifische Modifizierung der IL-4 Mutanten erlauben. Die IL-4 Cystein-Mutanten wurden rekombinant in prokaryotischen und eukaryotischen Expressionssystemen hergestellt. Anschließend wurden verschiedene Strategien entwickelt, die eine ortsspezifische Kopplung Amin- und Thiol-haltiger Zucker an die eingebrachten Cystein-Reste in IL-4 ermöglichen. Eine Linker-basierte Reaktion, sowie ein Kopplungsansatz, der eine Aktivierung der Thiol-Gruppe mittels Bromselenobenzol erforderte, wiesen einige Nachteile auf, die eine erhebliche Einschränkung ihrer technischen Durchführbarkeit zur Folge hatte. Eine dritte Strategie hingegen, die eine Rückfaltung derIL-4 Cystein-Mutanten in Anwesenheit von Thiol-Glykanen involvierte, erlaubte eine effiziente Herstellung von IL-4 Glykokonjugaten in Form gemischter Disulfide im Milligrammbereich. Dieser Ansatz könnte somit zur Produktion homogen glykosylierter IL-4 Antagonisten im Großmaßstab eingesetzt werden. Die Herstellung homogener Glykokonjugate mit klar definierten Glykosylierungsmuster würde es erlauben über die gekoppelten Glykanstrukturen die pharmakologischen Eigenschaften von IL-4, wie Absorption und metabolische Stabilität, gezielt zu modulieren. Die hergestellten IL-4 Glykokonjugate erwiesen sich als hochwirksame Antagonisten, die die Aktivität von IL-4 und IL-13 in zellbasierten Experimenten inhibieren konnten. Glykosylierte IL-4 Antagonisten stellen somit eine vergleichbare Alternative zu gängigen IL-4 Inhibitoren dar, die zur Behandlung von atopischen Erkrankungen eingesetzt werden, wie beispielweise der neutralisierende anti-IL-4R Antikörper Dupilumab. KW - Glykosylierung KW - Modifizierung KW - Interleukin KW - Inhibitor KW - Entzündung KW - Glykomodifizierung KW - Interleukin-4 Antagonist KW - TH2 Immunantwort KW - Proteinmodifizierung KW - Rezeptorblocker Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-175172 ER - TY - THES A1 - Kucka, Kirstin Michaela T1 - Charakterisierung eines neuen Tumor Nekrose Faktor (TNF) Rezeptor 2 (TNFR2) Agonisten: Der heteromere, membranständige Ligand Lymphotoxin α\(_2\)β T1 - Characterization of a novel tumor necrosis factor (TNF) receptor 2 (TNFR2) agonist: the heteromeric, membrane bound ligand lymphotoxin α\(_2\)β N2 - Seit mehr als zwei Jahrzehnten ist bekannt, dass nicht nur der Tumor Nekrose Faktor-α (=TNF-α) sondern auch Lymphotoxin-α (=LTα) in Form von Trimeren an TNFR1 und TNFR2 binden kann. Durch diese Fähigkeit an beide Rezeptoren zu binden, haben diese zwei Liganden eine essentielle Rolle in der Entwicklung und dem Verlauf von Autoimmunerkrankungen. Bereits mit Beginn der 1990er Jahren wurde gezeigt, dass LTα nicht nur in Form von Homotrimeren vorliegt, sondern auch mit dem verwandten TNF-Superfamilie Liganden Lymphotoxin β (=LTβ) Heterotrimere bilden kann. Hierbei lagern sich LTα und LTβ in Form von LTα2β und LTαβ2 zusammen. Die initialen Experimente mit diesen Heterotrimeren zeigten bereits Unterschiede von LTα2β und LTαβ2. Während LTα2β wie LTα an den TNFR1 bindet, kann LTαβ2 weder an TNFR1 noch TNFR2 binden und interagiert mit einem eigenen Rezeptor namens Lymphotoxin β Rezeptor (=LTβR). Da bereits zwei Liganden (TNF und LTα) für TNFR1 und TNFR2 bekannt waren, wurde LTα2β bis heute nicht weiter charakterisiert. LTαβ2 hingegen war lange Zeit der einzige bekannte Ligand für den LTβR, weshalb die LTαβ2-LTβR-Interaktion ausführlich untersucht wurde. Diese Arbeit fokusiert sich auf die Charakterisierung von LTα2β. Hierfür wurde die einzige bekannte Eigenschaft aus den 90er Jahren von LTα2β nämlich die Bindung an TNFR1 aufgegriffen und um die Rezeptoren TNFR2 und LTβR erweitert. Diese Arbeit zeigt, dass LTα2β nicht nur an den TNFR1, sondern auch an TNFR2 und schwach an LTβR bindet. Trotz der asymmetrischen Bindestellen kann membrangebundenes LTα2β TNFR1 und TNFR2 nicht nur binden, sondern ist auch in der Lage diese zu aktivieren. Diese Arbeit gibt erste Einblicke in die Komplexizität dieses Heterotrimers indem gezeigt wird, dass LTα2β sowohl in seiner löslichen als auch in seiner membrangebundenen Form den TNFR1 aktivieren kann, während der TNFR2 nur durch das membranständige LTα2β aktiviert wird. Aufgrund der aktivierenden Eigenschaften von membranständigem LTα2β und LTαβ2 auf die murine (=mu) Panc02-Zelllinie wird ein ersten Ausblick auf mögliche weitergehende Experimente in mausbasierten Modellen gegeben. Die erzielten Ergebnisse zeigen, dass mit membranständigem LTα2β ein neuer TNFR2 Agonist gefunden wurde. N2 - Since more than two decades it is known, that not only the Tumor Necrosis Factor-α (=TNF-α) but also lymphotoxin-a (=LTα) bind to TNFR1 and TNFR2. Because of their ability to interact with both of these two receptors, the two ligands play a crucial role in the development and persistence of autoimmune diseases. Already at the beginning of the 1990th, it has been shown that LTα forms homotrimers but is also able to form heterotrimers with the related TNF-Superfamily ligand lymphotoxin-β (=LTβ). Thereby, LTα and LTβ associate to form LTα2β and LTαβ2. Initial experiments already have shown differences between LTα2β and LTαβ2. While LTα2β can bind to TNFR1 like LTα, LTαβ2 can bind neither to TNFR1 nor to TNFR2 but interacts with its own receptor called LTβR. Due to the fact that already two ligands (LTα and TNF) for TNFR1 and TNFR2 were known, LTα2β was not further characterized. Since LTαβ2 was the only known ligand for the LTβR, this LTαβ2-LTβR interaction was further and intensively investigated. This work is focused on LTα2β and its characterization. For this purpose the initial and only finding reported for in the 1990th namely the binding to TNFR1 were taken up and expanded for the interaktion with TNFR2 and LTβR. The results of this work show that LTα2β can not only bind to TNFR1, but also to TNFR2 and weaker to LTβR. Despite its asymmetric binding sites, membrane bound LTα2β was shown not only to bind, but also to be able to activate TNFR1 and TNFR2. This work shows that LTα2β can activate the TNFR1 receptor in its soluble and membrane bound form while TNFR2 can only be activated by membrane bound LTα2β. Due to the activating properties of membrane bound LTα2β and LTαβ2 on murine (=mu) Panc02 cells a first outlook on further experiments in mouse based models will be given. These findings show, that membrane bound LTα2β is a new TNFR2 agonist. KW - Ligand KW - Agonist KW - Lymphotoxin KW - Ligand-Rezeptor-Interaktion KW - TNF Superfamilie KW - TNFR2 Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-249824 ER - TY - THES A1 - von Meyer, Katharina T1 - Molecular characterization of defensin-like proteins in the fertilization process of \(Nicotiana\) \(tabacum\) T1 - Molekulare Charakterisierung Defensin-ähnlicher Proteine beim Befruchtungsvorgang in \(Nicotiana\) \(tabacum\) N2 - Flowering plants or angiosperms have developed a fertilization mechanism that involves a female egg and central cell, as well as two male sperm cells. A male gametophyte carries the two non-mobile sperm cells, as they need to be delivered to the female gametophyte, the embryo sac. This transport is initiated by a pollen grain that is transmitted onto the stigma of the angiosperm flower. Here it hydrates, germinates, and forms a pollen tube, which navigates through the female plant tissue towards the ovary. The pollen tube grows into an ovule through the funiculus and into one of the two synergid cells. There, growth arrests and the pollen tube bursts, releasing the two sperm cells. One of the sperm cells fuses with the egg cell, giving rise to the embryo, the other one fuses with the central cell, developing into the endosperm, which nourishes the embryo during its development. After a successful fertilization, each ovule develops into a seed and a fruit is formed. This usually consists of several fertilized ovules. The directional growth of the pollen tube through the maternal tissues towards the ovule, as well as sperm cell release, requires a complex communication between the male and the female gametophyte to achieve reproductive success. Over the last years many studies have been performed, contributing to the understanding of cell-cell communication events between the two gametophytes, nevertheless still many aspects remain to be elucidated. This work focused on two topics: i.) Analysis of biological processes affected by pollination and fertilization in the Nicotiana tabacum flower and identification of cysteine rich proteins (CRPs) expressed via isolating and sequencing RNA from the tissue and analyzing the resulting data. ii.) Identification of the defensin-like protein (DEFL) responsible for pollen tube attraction towards the ovule in tobacco. First, tissue samples of pollen tubes and mature ovules were taken at different stages of the fertilization process (unpollinated ovules, after pollination, and after fertilization of the flower). RNA was then isolated and a transcriptome was created. The resulting reads were assembled and transcriptome data analysis was performed. Results showed that pollen tubes and mature ovules differ severely from each other, only sharing about 23 % of the transcripts, indicating that different biological processes are dominant in the two gametophytes. A MapMan analysis revealed that in the pollen tube the most relevant biological processes are related to the cell wall, signaling, and transport, which supports the fact that the pollen tube grows fast to reach the ovule. On the other hand, in the ovule the values of highest significance were obtained for processes related to protein synthesis and regulation. Upon comparing the transcripts in the ovule before and after pollination, as well as after fertilization, it showed that pollination of the flower causes a bigger alteration in the ovule on the transcriptomic level compared to the step from pollination to fertilization. A total of 953 CRPs were identified in Nicotiana tabacum, including 116 DEFLs. Among those, the peptide responsible for pollen tube attraction towards the ovule should be found. Based on in-silico analysis four candidate peptides were chosen for further analysis, two of which had increased expression levels upon pollination and fertilization and the other two displayed an opposite expression. Quantitative real time PCR experiments were performed for the candidates, confirming the in-silico data in vivo. The candidate transcripts were then expressed in a cell free system and applied to pollen tubes in order to test their effect on the growing cells. Positive controls were used, where pollen tubes grew towards freshly dissected ovules. The four candidates did not provoke a pollen tube attraction towards the peptide, leaving open the chance to work on the 112 remaining DEFLs in the future. N2 - Für den Befruchtungsvorgang von Blütenpflanzen, bzw. Angiospermen werden je eine weibliche Eizelle und Zentralzelle, sowie zwei männliche Spermazellen benötigt. Da diese Spermazellen immobil sind, werden diese zum weiblichen Gametophyten, dem Embryosack, transportiert. Dieser Vorgang wird eingeleitet, indem ein Pollenkorn auf die Narbe des Blütenstempels gelangt. Dort hydriert es, keimt aus und bildet einen Pollenschlauch aus, welcher sich mittels Richtungswachstum durch den Griffel zum Fruchtknoten der Pflanze hin ausdehnt. Der Pollenschlauch wächst daraufhin durch den Funikulus zu den Samenanlagen hin, in eine der beiden Synergiden hinein, wo das Zellwachstum eingestellt wird. Der Pollenschlauch platzt und die zwei Spermazellen werden freigegeben. Eine dieser Spermazellen verschmilzt mit der Eizelle, woraus ein Embryo entsteht, während die andere Spermazelle mit der Zentralzelle verschmilzt, die sich zum Endosperm entwickelt und den Embryo während seiner Entwicklung mit Nährstoffen versorgt. Nach einer erfolgreichen Befruchtung bildet sich aus jeder Eizelle ein Samen aus, in der Regel bilden mehrere befruchtete Eizellen dann einen Fruchtkörper. Eine erfolgreiche Fortpflanzung erfordert eine hochkomplexe Kommunikation zwischen männlichem und weiblichem Gametophyten, die sowohl beim Richtungswachstum des Pollenschlauchs durch das weibliche Pflanzengewebe hin zu den Samenanlagen eine essentielle Rolle spielt, als auch bei der Freisetzung der Spermazellen. Während der letzten Jahre wurden viele Studien durchgeführt, die zum Verstehen dieser Zell-Zell Kommunikation beigetragen haben, dennoch gibt es einige unbekannte Aspekte, die noch zu untersuchen sind. Diese Arbeit konzentriert sich auf zwei Themen: i.) Die Analyse der biologischen Prozesse, die von der Bestäubung und Befruchtung der Blüte in Nicotiana tabacum beeinflusst werden, sowie die Identifizierung von cysteinreichen Proteinen (CRPs), die während dieses Prozesses exprimiert werden. Hierfür wurde RNA aus dem Gewebe isoliert, sequenziert und die resultierenden Daten analysiert. ii.) Die Identifizierung des Defensin-ähnliche Proteins (DEFL), welches für das Anlocken des Pollenschlauchs zu den Samenanlagen hin in Tabak verantwortlich ist. Zunächst wurden Gewebeproben von Pollenschläuchen, sowie von reifen Samenanlagen in verschiedenen Stadien der Befruchtung entnommen (unbestäubte Samenanlagen, nach der Bestäubung und nach Befruchtung der Blüte). Von diesen Geweben wurde im Anschluss die RNA isoliert und ein Transkriptom erstellt. Die erhaltenen Sequenzfragmente wurden zusammengesetzt und die resultierenden Daten analysiert. Die Ergebnisse zeigten, dass sich Pollenschläuche und Samenanlagen stark voneinander unterscheiden; nur 23 % der Transkripte wurden in beiden Geweben gefunden. Eine Untersuchung mit MapMan hat gezeigt, dass die relevantesten biologischen Prozesse im Pollenschlauch mit Zellwand, Signalwegen und Transportvorgängen assoziiert sind. Diese Ergebnisse unterstützen die These, dass der Pollenschlauch schnell wachsen muss, um die Spermazellen zu den Samenanlagen zu transportieren. In den Samenanlagen haben hingegen die Prozesse den höchsten Signifikanzwert, welche mit Proteinsynthese und –regulation zusammenhängen. Wenn man die Transkripte in den Samenanlagen vor der Bestäubung, nach der Bestäubung, sowie nach der Befruchtung betrachtet, stellt man fest, dass die Bestäubung mit einer größeren Veränderung auf Transkriptomlevel einhergeht als der Schritt zwischen Bestäubung und Befruchtung. Es konnten insgesamt 953 CRPs in Nicotiana tabacum identifiziert werden, wovon 116 DEFLs sind. Es sollte herausgefunden werden, welches dieser DEFLs für das Anlocken des Pollenschlauchs zu den Samenanlagen hin verantwortlich ist. Auf Basis von in-silico Analysen wurden vier Kandidatentranskripte ausgewählt, die näher untersucht wurden; bei zweien davon wurde ein ansteigendes Expressionsniveau bei Bestäubung und Befruchtung festgestellt; die anderen beiden Kandidaten zeigten ein gegensätzliches Expressionsmuster. Mittels quantitativer real-time PCR konnten die in-silico Daten in-vivo bestätigt werden. In einem zell-freien System wurden die Kandidatentranskripte exprimiert und auf Pollenschläuche gegeben, um ihren Effekt auf die wachsenden Zellen zu beobachten. Als Positivkontrollen wurden frisch präparierte Samenanlagen verwendet. Keines der vier Kandidatenproteine hat ein Anlocken der Pollenschläuche bewirkt, sodass noch die 112 verbleibenden DEFLs zur weiteren Untersuchung bereitstehen. KW - Samenpflanzen KW - Fortpflanzung KW - Plant fertilization KW - Fortpflanzungsmechanismen KW - Blütenpflanzen Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-192141 ER - TY - THES A1 - Duan, Xiaodong T1 - Development of new channelrhodopsin versions with enhanced plasma membrane targeting and high calcium/sodium conductance T1 - Entwicklung neuer Channelrhodopsin-Versionen mit verbessertem Plasmamembrantargeting und hoher Na+- und Ca2+-Leitfähigkeit N2 - The technique to manipulate cells or living animals by illumination after gene transfer of light-sensitive proteins is called optogenetics. Successful optogenetics started with the use of the light-gated cation channel channelrhodopsin-2 (ChR2). After early demonstrations of the power of ChR2, further light-sensitive ion channels and ion pumps were recruited to the optogenetic toolbox. Furthermore, mutations and chimera of ChR2 improved its versatility. However, there is still a need for improved optogenetic tools, e.g. with higher permeability for calcium or better expression in the plasma membrane. In this thesis, my work focuses on the design of highly functional channelrhodopsins with enhanced Na+ and Ca2+ conductance. First, I tested different N-terminal signal peptides to improve the plasma membrane targeting of Channelrhodopsins. We found that a N-terminal peptide, named LR, could improve the plasma membrane targeting of many rhodopsins. Modification with LR contributed to three to ten-fold larger photocurrents (than that of the original version) of multiple channelrhodopsins, like ChR2 from C. reinhardtii (CrChR2), PsChR, Chrimson, CheRiff, CeChR, ACRs, and the light-activated pump rhodopsins KR2, Jaw, HR. Second, by introducing point mutation, I could further improve the light sensitivity and photocurrent of different channelrhodopsins. For instance, ChR2-XXM 2.0, ChR2-XXL 2.0 and PsChR D139H 2.0 exhibited hundred times larger photocurrents than wild type ChR2 and they show high light sensitivity. Also, the Ca2+ permeable channelrhodopsins PsCatCh 2.0f and PsCatCh 2.0e show very large photocurrents and fast kinetics. In addition, I also characterized a novel bi-stable CeChR (from the acidophilic green alga Chlamydomonas eustigma) with a much longer closing time. Third, I analysed the ion selectivity of different ChRs, which provides a basis for rational selection of channelrhodopsins for different experimental purposes. I demonstrate that ChR2, Chronos, Chrimson, CheRiff and CeChR are highly proton conductive, compared with wild type PsChR. Interestingly, Chronos has the lowest potassium conductance among these channelrhodopsins. Furthermore, I found that mutation of an aspartate in TM4 of ChR2 (D156) and PsChR (D139) to histidine obviously increased both the sodium and calcium permeability while proton conductance was reduced. PsChR D139H 2.0 has the largest sodium conductance of any published channelrhodopsin variants. Additionally, I generated PsCatCh 2.0e which exhibits a ten-fold larger calcium current than the previously reported Ca2+ transporting CrChR2 mutant CatCh. In summary, my research work 1.) described strategies for improving plasma membrane trafficking efficiency of opsins; 2.) yielded channelrhodopsins with fast kinetics or high light sensitivity; 3.) provided optogenetic tools with improved calcium and sodium conductance. We could also improve the performance of channelrhodopsins with distinct action spectra, which will facilitate two-color neural excitation, both in-vitro and in-vivo. N2 - Die Technik, Zellen oder lebende Tiere nach dem Gentransfer lichtempfindlicher Proteine durch Belichtung zu manipulieren, wird als Optogenetik bezeichnet. Erfolgreiche Optogenetik begann mit der Verwendung des lichtgesteuerten Kationenkanals Channelrhodopsin-2 (ChR2). Nach frühen erfolgreichen Versuchen mit ChR2 wurden weitere lichtempfindliche Ionenkanäle und Ionenpumpen als optogenetische Werkzeuge etabliert. Darüber hinaus verbesserten Mutationen und Chimären von ChR2 seine Vielseitigkeit. Es besteht jedoch immer noch ein Bedarf an verbesserten optogenetischen Werkzeugen, z. mit höherer Permeabilität für Calcium oder besserer Expression in der Plasmamembran. In dieser Arbeit beschäftige ich mich mit dem Design hochfunktioneller Channelrhodopsine mit verbesserter Na+- und Ca2+-Leitfähigkeit. Zuerst habe ich verschiedene N-terminale Signalpeptide getestet, um die Anreicherung von Channelrhodopsinen in der Plasmamembran (“Plasmamembran-Targeting”) zu verbessern. Wir fanden heraus, dass ein N-terminales Peptid namens LR das Plasmamembran-Targeting vieler Rhodopsine verbessern kann. Die Modifikation mit LR trug zu drei- bis zehnfach größeren Photoströmen (als die der Originalversion) von mehreren Channelrhodopsinen bei, wie ChR2 von C. reinhardtii (CrChR2), PsChR, Chrimson, CheRiff, CeChR, ACRs und der lichtaktivierten Pump-Rhodopsine KR2, Jaw, HR. Zweitens konnte ich durch Mutagenese die Lichtempfindlichkeit und/oder den Photostrom verschiedener Channelrhodopsine weiter verbessern. Beispielsweise zeigten ChR2-XXM 2.0, ChR2-XXL 2.0 und PsChR D139H 2.0 hundertmal größere Photoströme als Wildtyp-ChR2 und sie zeigen eine hohe Lichtempfindlichkeit. Auch die Ca2+-permeablen Kanalrhodopsine PsCatCh 2.0f und PsCatCh 2.0e zeigen sehr große Photoströme und eine schnelle Kinetik. Außerdem habe ich ein neues bistabiles CeChR (aus der azidophilen Grünalge Chlamydomonas eustigma) mit einer viel längeren Schließzeit charakterisiert. Drittens analysierte ich die Ionenselektivität verschiedener ChRs, die eine Grundlage für die rationale Selektion von Channelrhodopsinen für verschiedene experimentelle Zwecke bietet. Ich zeige, dass ChR2, Chronos, Chrimson, CheRiff und CeChR im Vergleich zu Wildtyp-PsChR eine hohe Protonenleitfähigkeit aufweisen. Interessanterweise weist Chronos die niedrigste Kaliumleitfähigkeit unter diesen Channelrhodopsinen auf. Außerdem fand ich, dass die Mutation eines Aspartats in TM4 von ChR2 (D156) und PsChR (D139) zu Histidin offensichtlich sowohl die Natrium- als auch die Calciumpermeabilität erhöht, während die Protonenleitfähigkeit verringert ist. PsChR D139H 2.0 weist die größte Natriumleitfähigkeit aller veröffentlichten Channelrhodopsin-Varianten auf. Zusätzlich erzeugte ich PsCatCh 2.0e, das einen zehnmal größeren Calciumstrom als die zuvor berichtete Ca2+-transportierende CrChR2-Mutante CatCh aufweist. Zusammenfassend ergab meine Dissertationsarbeit: 1.) Strategien zur Verbesserung der Expression von Opsinen in der Plasmamembran; 2.) Gut exprimierende Channelrhodopsine mit schneller Kinetik oder hoher Lichtempfindlichkeit; 3.) Neue optogenetische Werkzeuge mit verbesserter Calcium- und Natriumleitfähigkeit. Auch konnte ich die Leistung von Channelrhodopsinen mit unterschiedlichen Aktionsspektren verbessern, was die zweifarbige neuronale Anregung sowohl in vitro als auch in vivo erleichtern sollte. KW - Optogenetik KW - Channelrhodopsinen KW - optogenetic KW - channelrhodopsin KW - molecular engineering KW - voltage clamp Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-188397 ER - TY - THES A1 - Bergmann Bueno, Amauri T1 - Ecophysiological adaptations of cuticular water permeability of plants to hot arid biomes T1 - Ökophysiologische Anpassungen der kutikulären Wasserpermeabilität von Pflanzen an heiße aride Biome N2 - Arid environments cover almost one-third of the land over the world. Plant life in hot arid regions is prone to the water shortage and associated high temperatures. Drought-stressed plants close the stomata to reduce water loss. Under such conditions, the remaining water loss exclusively happens across the plant cuticle. The cuticular water permeability equals the minimum and inevitable water loss from the epidermal cells to the atmosphere under maximally stomatal closure. Thus, low cuticular water permeability is primordial for plant survival and viability under limited water source. The assumption that non-succulent xerophytes retard water loss due to the secretion of a heavier cuticle is often found in the literature. Intuitively, this seems to be plausible, but few studies have been conducted to evaluate the cuticular permeability of xerophilous plants. In chapter one, we investigated whether the cuticular permeability of Quercus coccifera L. grown in the aridest Mediterranean-subtype climate is indeed lower than that of individuals grown under temperate climate conditions. Also, the cuticular wax chemical compositions of plants grown in both habitats were qualitatively and quantitatively analysed by gas-chromatography. In few words, our findings showed that although the cuticular wax deposition increased in plants under Mediterranean climate, the cuticular permeability remained unaltered, regardless of habitat. The associated high temperatures in arid regions can drastically increase the cuticular water permeability. Thereby, the thermal stability of the cuticular transpirational barrier is decisive for safeguarding non-succulent xerophytes against desiccation. The successful adaptation of plants to hot deserts might be based on finding different solutions to cope with water and heat stresses. Water-saver plants close the stomata before the leaf water potential drastically changes in order to prevent damage, whereas water-spender plants reduce the leaf water potential by opening the stomata, which allow them to extract water from the deep soil to compensate the high water loss by stomatal transpiration. In chapter two, we compare the thermal stability of the cuticular transpiration barrier of the desert water-saver Phoenix dactylifera L. and the water-spender Citrullus colocynthis (L.) Schrad. In short, the temperature-dependent increase of the cuticular permeability of P. dactylifera was linear over the whole temperature range (25-50°C), while that of C. colocynthis was biphasic with a steep increase at temperatures ≥ 40°C. This drastic increase of cuticular permeability indicates a thermally induced breakdown of the C. colocynthis cuticular transpiration barrier, which does not occur in P. dactylifera. We further discussed how the specific chemical composition of the cutin and cuticular waxes might contribute to the pronounced thermal resistance of the P. dactylifera cuticular transpiration barrier. A multitude of morpho and physiological modifications, including photosynthetic thermal tolerance and traits related to water balance, led to the successful plant colonisation of hot arid regions over the globe. High evaporative demand and elevated temperatures very often go along together, thereby constraining the plant life in arid environments. In chapter 3, we surveyed cuticular permeability, leaf thermal tolerance, and cuticular wax chemical composition of 14 non-succulent plant species native from some of the hottest and driest biomes in South-America, Europe, and Asia. Our findings showed that xerophilous flowering plants present high variability for cuticular permeability and leaf thermal tolerance, but both physiological features could not be associated with the species original habitat. We also provide substantial evidence that non-succulent xerophytes with more efficient cuticular transpirational barrier have higher leaf thermal tolerance, which might indicate a potential coevolution of these features in hot arid biomes. We further discussed the efficiency of the cuticular transpiration barrier in function to the cuticular wax chemical composition in the general discussion section. N2 - Trockene Trockene Lebensräume bedecken fast ein Drittel der Landoberfläche der Erde. Das Pflanzenleben in Trockengebieten ist durch Wasserknappheit und hohe Temperaturen gekennzeichnet. Durch Trockenheit beanspruchte Pflanzen schließen die Stomata, um den Wasserverlust zu reduzieren. Unter diesen Bedingungen erfolgt der verbleibende Wasserverlust ausschließlich über die pflanzliche Kutikula. Die kutikuläre Wasserpermeabilität entspricht dem minimalen und unvermeidbaren Wasserverlust aus den Epidermiszellen an die Atmosphäre. Daher ist eine niedrige kutikuläre Wasserpermeabilität für die Lebensfähigkeit der Pflanzen unter begrenzter Wasserverfügbarkeit entscheidend. Die Annahme, dass xerophile Pflanzen den Wasserverlust aufgrund der Ausbildung einer speziellen Kutikula verringern, findet sich häufig in der Literatur. Intuitiv erscheint dies plausibel, jedoch wurden nur wenige Studien durchgeführt, um die kutikuläre Wasserpermeabilität von xerophilen Pflanzen zu untersuchen. Im ersten Kapitel wurde getestet, ob die kutikuläre Wasserpermeabilität von Quercus coccifera L., angezogen im ariden Klima des mediterranen Subtyps, tatsächlich geringer ist als die von Pflanzen derselben Art, die unter gemäßigten Klimabedingungen kultiviert wurden. Außerdem wurde die chemische Zusammensetzung der kutikulären Wachse von Pflanzen, die in beiden Habitaten angezogen wurden, quantitativ und qualitativ durch Gaschromatographie mit Flammenionisationsdetektion- beziehungsweise Massenspektrometrie-Kopplung analysiert. Die Ergebnisse zeigen, dass die kutikuläre Wasserpermeabilität unter beiden Anzuchtbedingungen vergleichbar war, obwohl die Pflanzen, die unter dem mediterranen Klima wuchsen, eine höhere Menge an kutikulären Wachsen aufwiesen. Die hohen Temperaturen in trockenen Regionen können die Wasserdurchlässigkeit der pflanzlichen Kutikula drastisch erhöhen. Dabei ist die thermische Stabilität der kutikulären Transpirationsbarriere entscheidend für den Austrocknungsschutz xerophiler Pflanzen. Die erfolgreiche Anpassung von Wüstenpflanzen kann auf verschiedenen Strategien zur Bewältigung von Wassermangel und Hitze beruhen. Wassersparende Pflanzen (water-save plants) schließen die Stomata, bevor sich das Wasserpotenzial drastisch ändert, um Schädigungen zu verhindern. Wasserverschwendende Pflanzen (water-spender plants) reduzieren das Wasserpotenzial durch das Öffnen der Stomata. Dadurch können diese Pflanzen Wasser aus tiefen Bodenschichte nachziehen, um den hohen stomatären Wasserverlust zu kompensieren. Im zweiten Kapitel wurde die thermische Stabilität der kutikulären Transpirationsbarriere der beiden Wüstenpflanzen Phoenix dactylifera L. (saver) und Citrullus colocynthis (L.) Schrad. (spender) verglichen. Der temperaturabhängige Anstieg der kutikulären Wasserpermeabilität von P. dactylifera verlief linear über einen Temperaturbereich von 25°C bis 50°C. Dagegen war der temperaturabhängige Anstieg der kutikulären Wasserpermeabilität von C. colocynthis zweiphasig. Der steile Anstieg der kutikulären Permeabilität bei Temperaturen ≥ 35°C weist auf eine thermisch induzierte Schädigung der kutikulären Transpirationsbarriere hin. Die spezielle chemische Zusammensetzung der Kutinmatrix und der kutikulären Wachse trägt zur ausgeprägten thermischen Resistenz der kutikulären Transpirationsbarriere von P. dactylifera bei. Die erfolgreiche Besiedlung von heißen und trockenen Regionen der Erde beruht auf einer Vielzahl von morphologischen und physiologischen Anpassungen wie der fotosynthetischen Hitzetoleranz. Eine hohe Verdunstungskapazität und hohe Temperaturen treten oft zusammen auf, wodurch das Pflanzenleben in ariden Klimazonen eingeschränkt wird. In Kapitel 3 wurde die kutikuläre Wasserpermeabilität, die kutikuläre Wachszusammensetzung sowie die fotosynthetische Hitzetoleranz von 14 nicht-sukkulenten Pflanzenarten aus einigen der heißesten und trockensten Biome Südamerikas, Europas und Asiens untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass die ausgewählten xerophilen Pflanzen eine hohe Variabilität in der kutikulären Wasserpermeabilität und der fotosynthetischen Hitzetoleranz aufwiesen. Beide physiologischen Merkmale konnten jedoch nicht mit dem ursprünglichen Standort der Arten assoziiert werden. Dennoch weisen xerophile Pflanzen mit einer effizienteren kutikulären Transpirationsbarriere eine höhere Hitzetoleranz auf, was auf eine mögliche Koevolution dieser Merkmale in trockenen Biomen hinweisen könnte. Darüber hinaus wurde die Effizienz der kutikulären Transpirationsbarriere in Zusammenhang mit der chemischen Zusammensetzung der kutikulären Wachse diskutiert KW - Plant cuticle KW - Arid biomes KW - Cuticular transpiration KW - Cuticular waxes KW - Water stress KW - Heat stress Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-167832 ER - TY - THES A1 - Seufert, Pascal T1 - Chemical and physical structure of the barrier against water transpiration of leaves: Contribution of different wax compounds T1 - Chemischer und physikalischer Aufbau der Wassertranspirationsbarriere von Blättern: Beitrag verschiedener Wachskomponenten N2 - The cuticle is constituted of the biopolymer cutin and intra- and epicuticular waxes. In some cases, it has epicuticular wax crystals, protruding from the epicuticular wax film. One of the most important tasks is protection against desiccation. Many investigations were conducted to find the transport limiting component of the cuticle. It is evidentially confirmed that the waxes form this barrier. These waxes are multifactorial blends made of very-long-chain aliphatic (VLCA) compounds and triterpenoids (TRP). The VLCAs were proposed to constitute the transpiration barrier to water. However, experimental confirmation was lacking so far. The present study focuses on the development of a method to selectively extract TRPs from the cuticle and the impact of the removal on the transpiration barrier. The plants deployed in this study exhibited several features. They had no epicuticular crystals on their surfaces, were astomatous, had a rather durable and possibly isolatable cuticle. A broad range of wax compositions was covered from plants with no TRP content and low wax load like Hedera helix and Zamioculcas zamiifolia to plants with high TRP content and high wax load like Nerium oleander. The selective extraction was conducted using a sequence of solvents. TRPs were extracted almost exhaustively from CMs with the first MeOH extract. Only a minor amount of shorter chained VLCAs was obtained. The remaining waxes, consisting mostly of VLCAs and some remnant TRPs, were removed with the following TCM extract. After the extractions, the water permeance of native cuticular membranes (CM), MeOH extracted (M) and dewaxed cuticular discs (MX) was investigated gravimetrically. Compared to the water permeance of CMs, Ms showed no or only a small increase in water conductance. MXs, however, always showed strongly increased values. The knowledge about the wax compounds constituting the transport-limiting properties is vital for different projects. For various issues, it would be favourable to have a standardized wax mixture as an initial point of research. It could be used to develop screening procedures to investigate the impact of adjuvants on cuticular waxes or the influence of wax constituents on the properties of cuticular waxes. This work concentrated on the development of an artificial wax mixture, which mimics the physical properties of a plant leaf wax sufficiently. As target wax, the leaf wax of Schefflera elegantissima was chosen. The wax of this plant species consisted almost exclusively of VLCAs, had a rather simple composition regarding compound classes and chain length distribution and CMs could be isolated. Artificial binary, ternary and quaternary waxes corresponding to the conditions within the plant wax were investigated using differential scanning calorimetry (DSC), X-ray diffraction (XRD) techniques and Fourier-transform infrared (FTIR) spectroscopy. Phase diagrams were mapped out for a series of binary, ternary and quaternary wax mixtures. FTIR experiments were conducted using, ternary and a quaternary artificial wax blends. The blends were chosen to represent the conditions within the wax of the adaxial CM plant wax. The FTIR experiments exhibited an increasing resemblance of the artificial wax to the plant wax (adaxial CM wax) with an increasing number of compounds in the artificial wax. The same trend was found for DSC thermograms. Thermograms of ternary and quaternary blends exhibited more overlapping peaks and occurred in a temperature range more similar to the range of the whole leaf plant wax. The XRD spectrum at room temperature showed good conformity with the quaternary blend. The current work illustrates a method for selective extraction of TRPs from isolated CMs. It gives direct experimental proof of the association of the water permeance barrier with the VLCA rather than to the TRPs. Furthermore, the possibility to mimic cuticular waxes using commercially available wax compounds is investigated. The results show promising feasibility for its viability, enabling it to perform as a standardized initial point for further research (e.g. to examine the influence of different constituents on waxes), revealing valuable knowledge about the structure and the chemistry-function relationship of cuticular waxes. N2 - Die Kutikula ist eine der vielen Anpassungen, die Pflanzen entwickelten um nach der Besiedelung des Landes mit den Herausforderungen ihrer neuen Umgebung fertig zu werden. Sie überzieht überirdische Pflanzenorgane, wie Blüten oder Blätter und erfüllt verschiedene Aufgaben. Hierzu besteht sie aus dem biopolymer Kutin und intra- sowie epikutikulären Wachs. Studien, die sich mit der Lokalisierung der transporteinschänkenden Barriere beschäftigten, zeigten, dass die Wachse sie bilden. Diese sind vielschichtige Mischungen aus langkettigen aliphatischen Verbindungen (VLCA) und pentazyklischen Verbindung wie Triterpenen (TRP). Es wird davon ausgegangen, dass VLCAs die Barriere aufbauen, ein direkter experimenteller Nachweis dafür wurde jedoch noch nicht erbracht. In dieser Arbeit wurde daher ein Verfahren zur selektiven Extraktion von TRPs aus isolierten kutikulären Membranen (CM) entwickelt und deren Auswirkung auf die Transpirationsbarriere untersucht. Die untersuchten Pflanzen wiesen keine epikutikuläre Kristalle auf, hatten keine Stomata auf der Kutikula der Blattoberseite und es war möglich ihre Kutikula zu isolieren. Die Zusammensetzung der Wachse variierte von wenig Wachs ohne TRPs (z. B. Hedera helix, Zamioculcas zamiifolia) hin zu pflanzen mit großer Wachsmenge und hohem TRP- Anteil (Nerium oleander). Die selektive Extraktion wurde durch die sequenzielle Nutzung zweier Lösemittel erreicht. TRPs wurden fast vollständig mit Methanol (MeOH) entfernt, während VLCAs überwiegend nur mit Chloroform (TCM) extrahiert werden konnten. Die gravimetrische Bestimmung der Wassertranspiration von unbehandelten, mit Methanol extrahierten (M) und entwachsten Membranen (MX) in Transpirationskammern zeigte bei allen untersuchten Pflanzenarten einen einheitlichen Trend auf. Im Vergleich zu CMs erhöhte sich die Transpirationsrate bei Ms nicht oder nur geringfügig, während bei MXs ein starker Anstieg festgestellt werden konnte. Diese Ergebnisse stellen den ersten direkten experimentellen Nachweis der Verbindung von VLCAs zur Transpirationsbarriere kutikulärer Wachse dar. Mit dem Wissen, sich bei der Untersuchung der Permeation durch die Kutikula sich nur auf die VLCA Fraktion beschränken zu müssen können weitere Projekte effizient angegangen werden. Ein leicht erhältliches Standartwachsgemisch könnte Ausgangspunkt für die Untersuchung des Einflusses verschiedener Pflanzenwachskomponenten auf deren physikalische Eigenschaften dienen. Als Zielwachs diente das Blattwachs von Schefflera elegantissima. Es bestand fast ausschließlich aus VLCAs, hatte eine recht einfache Zusammensetzung bezüglich der Stoffklassen und Kettenlängenverteilung und die Kutikula war isolierbar. Mit Hilfe von dynamische Differentialkalorimetrie (DSC), Röntgenbeugung (XRD) und Fouriertransformierter Infrarot (FTIR) Spektroskopie wurden binäre, ternäre und quaternäre Gemische, die Verhältnisse im Pflanzenwachs wiederspiegelten, untersucht und Phasendiagramme erstellt. Phasendiagramme wurden von einer Reihe der binären Gemische, bestehend aus Alkanen oder Alkoholen, ternären Gemischen aus zwei Alkanen und einem Alkohol und quaternären Gemischen aus zwei Alkanen und zwei Alkoholen erstellt. FTIR-spektroskopische Versuche zeigten mit zunehmender Komponentenzahl eine erhöhte Ähnlichkeit der artifiziellen Wachse zum Pflanzenwachs (adaxiale isolierte Kutikula). Ein ähnlicher Trend wurde für die Ähnlichkeit der Thermogramme der artifiziellen Gemische zum Pflanzenwachs (aus dem Extrakt ganzer Blätter) ersichtlich. Das Diffraktogramm des quaternären Waches stimmte auf Raumtemperatur gut mit dem des Pflanzenwachses (adaxiale isolierte Kutikula) ein. Diese Arbeit beschreibt eine Methode zur selektiven Extraktion von TRPs aus isolierten kutikulären Membranen. Sie zeigt einen direkten experimentellen Nachweis für die Assoziation der Transpirationsbarriere zu den VLCAs und nicht zu den TRPs. Zusätzlich wird die Möglichkeit kutikulare Wachse mit Hilfe von kommerziell erhältlichen Wachskomponenten nachzustellen untersucht, was vielversprechende Ergebnisse liefert. Dieses Wachs könnte daher als standardisierter Ausgangspunkt für weitere Experimente (z. B. zur Untersuchung des Einflusses verschiedener Wachskomponenten auf dessen physikalische Eigenschaften) dienen. Dies könnte wertvolle Informationen über die Struktur und die Beziehung zwischen chemischer Zusammensetzung und der Funktion kutikulärer Wachse liefern. KW - Kutikula KW - Transpiration KW - Kutikularwachs KW - FT-IR-Spektroskopie KW - Differential scanning calorimetry KW - Very-long-chain aliphatic KW - X-ray diffraction KW - Selective extraction Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-208963 ER - TY - THES A1 - Scheide-Nöth, Jan-Philipp T1 - Activation of the Interleukin-5 receptor and its inhibition by cyclic peptides T1 - Aktivierung des IL-5 Rezeptors und dessen Inhibierung durch zyklische Peptide N2 - The cytokine interleukin-5 (IL-5) is part of the TH2-mediated immune response. As a key regulator of eosinophilic granulocytes (eosinophils), IL-5 controls multiple aspects of eosinophil life. Eosinophils play a pathogenic role in the onset and progression of atopic diseases as well as hypereosinophilic syndrome (HES). Here, cytotoxic proteins and pro-inflammatory mediators stored in intracellular vesicles termed granula are released upon activation thereby causing local inflammation to fight the pathogen. However, if such inflammation persists, tissue damage and organ failure can occur. Due to the close relationship between eosinophils and IL-5 this cytokine has become a major pharmaceutical target for the treatment of atopic diseases or HES. As observed with other cytokines, IL-5 signals by assembling a heterodimeric receptor complex at the cell surface in a stepwise mechanism. In the first step IL-5 binds to its receptor IL-5Rα (CD125). This membrane-located complex then recruits the so-called common beta chain βc (CD131) into a ternary ligand receptor complex, which leads to activation of intracellular signaling cascades. Based on this mechanism various strategies targeting either IL-5 or IL-5Rα have been developed allowing to specifically abrogate IL-5 signaling. In addition to the classical approach of employing neutralizing antibodies against IL 5/IL-5Rα or antagonistic IL-5 variants, two groups comprising small 18 to 30mer peptides have been discovered, that bind to and block IL-5Rα from binding its activating ligand IL-5. Structure-function studies have provided detailed insights into the architecture and interaction of IL-5IL-5Rα and βc. However, structural information for the ternary IL-5 complex as well as IL-5 inhibiting peptides is still lacking. In this thesis three areas were investigated. Firstly, to obtain insights into the second receptor activation step, i.e. formation of the ternary ligand-receptor complex IL-5•IL-5Rα•βc, a high-yield production for the extracellular domain of βc was established to facilitate structure determination of the ternary ligand receptor assembly by either X-ray crystallography or cryo-electron microscopy. In a second project structure analysis of the ectodomain of IL-5Rα in its unbound conformation was attempted. Data on IL-5Rα in its ligand-free state would provide important information as to whether the wrench-like shaped ectodomain of IL-5Rα adopts a fixed preformed conformation or whether it is flexible to adapt to its ligand binding partner upon interaction. While crystallization of free IL-5Rα failed, as the crystals obtained did not diffract X rays to high resolution, functional analysis strongly points towards a selection fit binding mechanism for IL-5Rα instead of a rigid and fixed IL-5Rα structure. Hence IL-5 possibly binds to a partially open architecture, which then closes to the known wrench-like architecture. The latter is then stabilized by interactions within the D1-D2 interface resulting in the tight binding of IL-5. In a third project X-ray structure analysis of a complex of the IL-5 inhibitory peptide AF17121 bound to the ectodomain of IL-5Rα was performed. This novel structure shows how the small cyclic 18mer peptide tightly binds into the wrench-like cleft formed by domains D1 and D2 of IL-5Rα. Due to the partial overlap of its binding site at IL-5Rα with the epitope for IL-5 binding, the peptide blocks IL-5 from access to key residues for binding explaining how the small peptide can effectively compete with the rather large ligand IL-5. While AF17121 and IL-5 seemingly bind to the same site at IL-5Rα, functional studies however showed that recognition and binding of both ligands differ. With the structure for the peptide-receptor complex at hand, peptide design and engineering could be performed to generate AF17121 analogies with enhanced receptor affinity. Several promising positions in the peptide AF17121 could be identified, which could improve inhibition capacity and might serve as a starting point for AF17121-based peptidomimetics that can yield either superior peptide based IL-5 antagonists or small-molecule-based pharmacophores for future therapies of atopic diseases or the hypereosinophilic syndrome. N2 - Das Zytokin Interleukin-5 (IL-5) nimmt eine zentrale Rolle im Zellzyklus von eosinophlien Granulozyten (Eosinophile) ein, indem es beispielsweise die Differenzierung, Aktivierung und Apoptose dieser Zellen steuert. Als Immunantwort auf Pathogene kommt es zur Aktivierung von Eosinophilen. Dieses führt zur Freisetzung von in intrazellulären Vesikeln (Granula) gespeicherten zytotoxischen Proteinen und proinflammatorischen Mediatoren, wodurch lokale Entzündungen verursacht werden, um den Erreger zu bekämpfen. Fehlregulationen (übermäßige Produktion) von eosinophilen Granulozyten können zu Gewebeschäden und Organversagen führen, wenn diese über einen längeren Zeitraum bestehen, und sind insbesondere mit dem Ausbruch und Fortschreiten von atopischen Erkrankungen sowie dem Hypereosinophilen Syndrom (HES) assoziiert. IL-5 muss, um die Eosinophilen aktivieren zu können, an einen heterodimeren Transmembranrezeptor binden. Im ersten Schritt bindet IL-5 an seinen zytokin-spezifischen Rezeptor IL-5Rα (CD125). Dieser membrangebundene Komplex rekrutiert dann die sogenannte gemeinsame („common“) beta-Kette βc (CD131) in einen ternären Liganden Rezeptorkomplex, was zur Aktivierung von intrazellulären Signalkaskaden führt. Aufgrund dieser engen Beziehung zwischen Eosinophilen und IL-5 ist dieses Zytokin in den Fokus der pharmazeutischen Industrie für die Behandlung atopischer Erkrankungen oder HES gerückt. Bisherige Therapien basieren auf der Unterdrückung der Immunreaktion durch Corticosteroide, neutralisierende gegen IL 5/IL-5Rα gerichtete Antikörper oder antagonistische IL-5 Varianten. Eine alternative Therapiemöglichkeit stellen IL-5 inhibierende Peptide dar, welche an IL 5Rα binden und hierbei die Bindung des aktivierenden Liganden (IL-5) hemmen. Derzeit stehen Strukturen vom binären IL-5IL-5Rα Komplex und von βc im ungebundenen Zustand zur Verfügung. Zudem konnten wichtige Wechselwirkungen im binären Komplex identifiziert werden. Allerdings sind vom ternären IL-5 Komplex und den IL-5 inhibierenden Peptiden keinerlei Strukturdaten bekannt. Um im Rahmen dieser Arbeit Einblicke in den zweiten Rezeptoraktivierungsschritt, d.h. die Bildung des ternären Ligand-Rezeptor Komplexes IL-5•IL-5Rα•βc, zu erhalten, wurde ein Herstellungsverfahren für die extrazelluläre Domäne von βc etabliert. Zusammen mit den optimierten Reinigungsverfahren für IL-5 und IL 5Rα konnte hiermit eine gute Grundlage für zukünftige Strukturanalysen des ternären IL-5 Komplexes geschaffen werden. In einem zweiten Projekt wurde versucht, die Struktur der Ektodomäne von IL 5Rα in ihrem freien Zustand aufzuklären. Diese Strukturdaten würden wichtige Informationen darüber liefern, ob die bisher bekannte „Schraubenschlüssel“-Architektur der IL-5Rα Ektodomäne in einer rigiden, vorgebildeten Konformation vorliegt, oder ob die Architektur der Ektodomäne bei Bindung flexibel an ihren Liganden angepasst wird. Während die Kristallisation von IL-5Rα ohne einen Bindepartner fehlschlug, deuten neue Funktionsanalysen auf einen „selection fit binding mechanism“ für IL-5Rα hin. Der relativ große Ligand IL-5 bindet daher sehr wahrscheinlich an eine teilweise „offene“ Rezeptorkonformation, die erst nach Bindung die bekannte „Schraubenschlüssel“-Architektur annimmt. In einem dritten Projekt wurde eine Strukturanalyse des Komplexes des IL-5 inhibierenden AF17121 Peptids gebunden an die Ektodomäne von IL-5Rα durchgeführt. Anhand dieser neuen Struktur lässt sich erklären, wie das kleine zyklische 18mer Peptid effektiv mit dem wesentlich größeren Liganden IL-5 um die Bindung am Rezeptor konkurrieren kann. Aufgrund der Überlappung der Bindestellen von AF17121 und IL-5 am Rezeptor IL 5Rα blockiert das Peptid den Zugang von IL-5 an seinen Rezeptor. Obwohl AF17121 und IL-5 in einem ähnlich Strukturbereich in IL-5Rα binden, zeigen funktionelle Studien, dass sich Erkennung und Bindung beider Liganden unterscheiden. Mit der vorliegenden Struktur vom Peptid Rezeptor Komplex konnte ein strukturbasiertes Peptid-Design durchgeführt und so AF17121 Varianten mit verbesserter Rezeptorbindung erzeugt werden. Dabei wurden mehrere Positionen im Peptid AF17121 identifiziert, die dessen Inhibierungseigenschaften möglicherweise verbessern. Somit konnte ein weiterer Grundstein für die Entwicklung von effektiveren Peptid-basierten IL 5 Antagonisten oder sogar nicht-peptidischen Inhibitoren für zukünftige Therapieansätze gegen atopische Erkrankungen oder HES gelegt werden. KW - Interleukin 5 KW - Eosinophiler Granulozyt KW - atopic diseases KW - eosinophil KW - interleukin-5 signaling KW - peptide-based interleukin-5 inhibitor KW - peptide engineering KW - receptor KW - functional studies KW - structure analysis Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-182504 ER - TY - THES A1 - Lange, Manuel T1 - Mutanten im RES-Oxylipin Signalweg von \(Arabidopsis\) \(thaliana\) T1 - Mutants in RES-Oxylipin Signaling in \(Arabidopsis\) \(thaliana\) N2 - Reaktive elektrophile Spezies-Oxylipine (RES-Oxylipine) finden sich in Pflanzen- und Tierzellen und zeichnen sich durch eine für sie typische Anordnung von Atomen aus: einer α,β ungesättigten Carbonyl Gruppe. In Pflanzenzellen gehören unter anderem 2-(E)-Hexenal und die Vorstufe der Jasmonsäure 12-Oxophytodiensäure (OPDA) zu den RES-Oxylipinen, in Tierzellen z.B. Prostaglandin A1 (PGA). RES-Oxylipine üben Signalfunktionen aus, wie dies in Pflanzenzellen funktioniert ist jedoch noch nicht bekannt. Ziel dieser Arbeit ist dabei einen möglichen RES-Oxylipin Signalweg aufzuklären und die beteiligten Gene zu identifizieren. Es konnte aber gezeigt werden, dass die Expressionsrate von bestimmten Genen wie z.B. GST6 durch RES-Oxylipine spezifisch induziert wird. Zur Untersuchung des RES-Oxylipin Signalweges wurde der GST6 Promotor vor das Luciferase-Gen fusioniert, um so ein RES-Oxylipin spezifisches Reportersystem zu erhalten. Die Ethylmethansulfonat mutagenisierten Linien wurden auf geänderte Luciferase-Aktivität hin untersucht. Dabei wurden drei Mutanten isoliert, die in dieser Arbeit näher untersucht wurden. Eine zeigte basal erhöhte Luciferase-Aktivität (constitutive overexpresser 3 = coe3) und die anderen beiden erniedrigte Luciferase-Aktivität nach PGA Gabe (non responsive 1 und 2 = nr1 und nr2). In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Phänotypen in allen 3 Mutanten rezessiv vererbt werden und die Mutanten nicht zueinander allel sind. Zudem war die veränderte Luciferase-Aktivität nicht durch geänderte Phytohormonspiegel oder durch Mutationen im GST6 Promotor erklärbar. Auf die Gabe von RES, wie Benzylisothiocyanat oder Sulforaphan, sowie auf endogene RES-Oxylipine, wie OPDA und Hexenal, reagierten die Mutanten auf ähnliche Weise, wie nach PGA Gabe. Weiterführende Untersuchungen zeigten, dass sich die drei Mutanten stark voneinander unterschieden. Das Transkriptom kontrollbehandelter coe3 Pflanzen unterschied sich stark von dem der GST6::LUC Pflanzen. Die Mutante war trockenstressresistenter zudem war sie sensibler gegenüber NaCl, was jedoch nicht von einer veränderten Reaktion auf Abscisinsäure herrührte. Des Weiteren war der Chlorophyllabbau bei dunkel inkubierten Blättern geringer. Bei der Lokalisierung der Mutation, die noch nicht abgeschlossen ist, konnten Chromosom 2 und 5 als die wahrscheinlichsten Kandidaten ermittelt werden. Weitere Analysen sind nötig um den Bereich weiter eingrenzen zu können. Die Mutante nr1, die sich durch verminderte Reaktion auf RES-Oxylipine auszeichnete, zeigte einen kleineren Wuchs und ein deutlich verzögertes Blühen. Außerdem wies die Mutante erhöhte Argininspiegel in ihren Blättern auf. Das Transkriptom unterschied sich sowohl bei kontrollbehandelten, als auch bei PGA behandelten nr1 Pflanzen massiv von denen der gleichbehandelten Kontrollen. Auch die nr1 schien trockenstressresistenter zu sein, sie war im Gegensatz zur coe3 aber robuster gegenüber höheren Konzentrationen an NaCl. Mit Hilfe eines „Next Generation Genome-Mappings“ war es möglich die Mutation am Ende von Chromosom 3 zu lokalisieren und auf fünf mögliche Gene einzugrenzen. Weitere Untersuchungen müssen nun klären, welches dieser Gene ursächlich für den Phänotyp der geänderten Luciferase-Aktivität ist. Die zweite Mutante mit einer reduzierten Reaktion auf RES-Oxylipine war die nr2. Überraschender Weise unterschied sich das Transkriptom kontrollbehandelter nr2 Pflanzen deutlich stärker von dem der gleichbehandelten GST6::LUC Pflanzen, als das nach PGA Gabe der Fall war. Sie reagierte nur mit sehr schwacher Luciferase-Aktivität auf Verwundung und war zudem deutlich sensibler gegenüber Trockenheit. Für eine zukünftige Lokalisation der ursächlichen Mutation wurden entsprechende Kreuzungen durchgeführt aus deren Samen jederzeit mit einer Selektionierung begonnen werden kann. Mit dieser Arbeit konnte ein erster großer Schritt in Richtung Identifikation der, für die geänderte Luciferase-Aktivität, verantwortlichen Mutation gemacht werden, sowie erste Reaktionen der Mutanten auf abiotische Stressfaktoren untersucht werden. Somit ist man der Entdeckung von Signaltransduktionsfaktoren, die RES-Oxylipinabhängig reguliert werden, einen wichtigen Schritt näher gekommen. N2 - Reactive electrophilic species oxylipins (RES-oxylipins) can be found in plant and animal cells and contain an α,β unsaturated carbonyl group. In plant cells 2-(E)-hexenal and 12-oxo-phytodienoic acid (OPDA), the precursor of jasmonic acid, belong to the RES-oxylipins, in animal cells prostaglandin A1 (PGA). RES-oxylipins play an important role in signal transduction but it is still unknown how this functions in plant cells. In previous publications, it could be shown, that RES-oxylipins induce the expression of certain genes like GST6 specifically. To further investigate the possibility of a RES-oxylipin pathway the GST6 promotor was fused to the luciferase gene to get a RES-oxylipin sensitive reporter system. The ethyl methanesulfonate (EMS) mutagenized lines were screened for altered luciferase activity under basal conditions and after treatment with PGA. Three lines were selected for further investigation: one with a constitutive higher luciferase activity (constitutive overexpresser 3 = coe3) and two with a reduced luciferase activity after PGA treatment (non responsive 1 and 2 = nr1 and nr2). In this thesis, it could be shown, that the mutation, which is responsible for the altered luciferase activity, is recessive and not allelic to each other. Furthermore, neither altered phytohormone levels nor mutations in the GST6 promotor are responsible for the changes in the luciferase activity. The response of these mutants to RES, like benzyl isothiocyanate (BITC) or sulforaphane, or endogenous RES-oxylipins, like OPDA or hexenal, is comparable to the response to PGA treatment. Further investigations show huge differences between the mutants. Control treated coe3 plants had very different transcriptomes compared to the control line. The coe3 mutant was more resistant to drought stress but more susceptible to salt compared to the control. This was not due to a changed response to abscisic acid (ABA). Another observed phenotype was the reduced chlorophyll depletion in dark incubated leaves. The localization of the mutation could not be completed within this thesis but chromosome 2 and 5 could be identified as most likely positions. Further investigations on this topic are needed to complete the localization. The nr1 mutant showed a reduced growth and delayed flowering phenotype and higher arginine levels could be detected in the leaves. The transcriptome exhibited huge differences after both control treatment and PGA treatment compared to the GST6::LUC. In drought experiments, the nr1 was also more resistant but, compared to the coe3, also more robust against higher salt concentrations. By next generation genome mapping it was possible to locate the mutation, which was responsible for the changes in luciferase activity after PGA treatment, at the end of chromosome 3. So there are five genes left who might be responsible for the observed phenotypes. Further investigations have to show which one is the one causing the phenotype. The nr2, as the third mutant investigated in this thesis showed highest differences to the GST6::LUC line after control treatment. It only had weak luciferase activity after wounding and was more susceptible to drought then the control. For further mapping experiments of the mutation in the nr2 mutant, F2 lines were generated. These are now ready to use to set up a mapping population. With this thesis it was possible to provide a milestone in identification of the mutations responsible for the changes in luciferase activity and in investigation of different abiotic stress responses. Now we are one step closer to discover signal transduction factors which are regulated by RES-oxylipins. KW - Arabidopsis thaliana KW - RES-Oxylipine Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-166085 ER - TY - THES A1 - Lindenberg [verh. Schubert], Annekathrin T1 - Timing of sensory preferences in \(Camponotus\) Ants T1 - Zeitliche Anpassung sensorischer Präferenzen in \(Camponotus\) Ameisen N2 - Ants belong to the most successful insects living on our planet earth. One criterion of their tremendous success is the division of labor among workers that can be related to age (age¬– or temporal polyethism) and/ or body size (size–related polymorphism). Young ants care for the queen and brood in the nest interior and switch to foraging tasks in the outside environment with ongoing age. This highly flexible interior–exterior transition probably allows the ant workers to properly match the colony needs and is one of the most impressive behaviors a single worker undergoes during its life. As environmental stimuli are changing with this transition, workers are required to perform a new behavioral repertoire. This requires significant adaptions in sensory and higher¬–order integration centers in the brain, like the mushroom bodies. Furthermore, foragers need proper time measuring mechanisms to cope with daily environmental changes and to adapt their own mode of life. Therefore, they possess a functional endogenous clock that generates rhythms with a period length of approximately 24 hours. The species–rich genus of Camponotus ants constitute a rewarding model to study how behavioral duties of division of labor were performed and modulated within the colony and how synaptic plasticity in the brain is processed, as they can divide their labor to both, age and body size, simultaneously. In my PhD thesis, I started to investigate the behavioral repertoire (like foraging and locomotor activity) of two sympatric Camponotus species, C. mus and C. rufipes workers under natural and under controlled conditions. Furthermore, I focused on the division of labor in C. rufipes workers and started to examine structural and ultrastructural changes of neuronal architectures in the brain that are accompanied by the interior–exterior transition of C. rufipes ants. In the first part of my thesis, I started to analyze the temporal organization of task allocation throughout the life of single C. rufipes workers. Constant video–tracking of individually labeled workers for up to 11 weeks, revealed an age–related division of labor of interior and exterior workers. After emergence, young individuals are tended to by older ones within the first 48 hours of their lives before they themselves start nurturing larvae and pupae. Around 52% switch to foraging duties at an age of 14–20 days. The workers that switched to foraging tasks are mainly media–sized workers and seem to be more specialized than nurses. Variations in proportion and the age of switching workers between and within different subcolonies indicate how highly flexible and plastic the age–related division of labor occurs in this ant species. Most of the observed workers were engaged in foraging tasks exclusively during nighttime. As the experiments were conducted in the laboratory, they are completely lacking environmental stimuli of the ants´ natural habitat. I therefore asked in a second study, how workers of the two closely related Camponotus species, C. rufipes and C. mus, adapt their daily activity patterns (foraging and locomotor activity) under natural (in Uruguay, South America) and controlled (in the laboratory) conditions to changing thermal conditions. Monitoring the foraging activity of both Camponotus species in a field experiment revealed, that C. mus workers are exclusively diurnal, whereas C. rufipes foragers are predominantly nocturnal. However, some nests showed an elevated daytime activity, which could be an adaption to seasonally cold night temperatures. To further investigate the impact of temperature and light on the differing foraging activity patterns in the field, workers of both Camponotus species were artificially exposed to different thermal regimes in the laboratory, simulating local winter and summer conditions. Here again, C. mus workers display solely diurnal locomotor activity, whereas workers of C. rufipes shifted their locomotor activity from diurnal under thermal winter conditions to nocturnal under thermal summer conditions. Hence, the combination of both, field work and laboratory studies, shows that daily activity is mostly shaped by thermal conditions and that temperature cycles are not just limiting foraging activity but can be used as zeitgeber to schedule the outside activities of the nests. Once an individual worker switches from indoor duties to exterior foraging tasks, it is confronted with an entirely new set of sensory information. To cope with changes of the environmental conditions and to facilitate the behavioral switch, workers need a highly flexible and plastic neuronal system. Hence, my thesis further focuses on the underlying neuronal adaptations of the visual system, including the optic lobes as the primary visual neuropil and the mushroom bodies as secondary visual brain neuropil, that are accompanied with the behavioral switch from nursing to foraging. The optic lobes as well as the mushroom bodies of light–deprived workers show an `experience–independent´ volume increase during the first two weeks of adulthood. An additional light exposure for 4 days induces an `experience–dependent´ decrease of synaptic complexes in the mushroom body collar, followed by an increase after extended light exposure for 14 days. I therefore conclude, that the plasticity of the central visual system represents important components for the optimal timing of the interior–exterior transitions and flexibility of the age–related division of labor. These remarkable structural changes of synaptic complexes suggest an active involvement of the mushroom body neuropil in the lifetime plasticity that promotes the interior–exterior transition of Camponotus rufipes ants. Beside these investigations of neuronal plasticity of synaptic complexes in the mushroom bodies on a structural level, I further started to examine mushroom body synaptic structures at the ultrastructural level. Until recently, the detection of synaptic components in projection neuron axonal boutons were below resolution using classical Transmission Electron Microscopy. Therefore, I started to implement Electron Tomography to increase the synaptic resolution to understand architectural changes in neuronal plasticity process. By acquiring double tilt series and consecutive computation of the acquired tilt information, I am now able to resolve individual clear–core and dense–core vesicles within the projection neuron cytoplasm of C. rufipes ants. I additionally was able to reveal single postsynaptic Kenyon cell dendritic spines (~62) that surround one individual projection neuron bouton. With this, I could reveal first insights into the complex neuronal architecture of single projection neuron boutons in the olfactory mushroom body lip region. The high resolution images of synaptic architectures at the ultrastructural level, received with Electron Tomography would promote the understanding of architectural changes in neuronal plasticity. In my PhD thesis, I demonstrate that the temporal organization within Camponotus colonies involves the perfect timing of different tasks. Temperature seems to be the most scheduling abiotic factors of foraging and locomotor activity. The ants do not only need to adapt their behavioral repertoire in accordance to the interior–exterior switch, also the parts in the peripheral and central that process visual information need to adapt to the new sensory environment. N2 - Ameisen gehören zu den erfolgreichsten Insekten unserer Erde. Hauptverantwortlich für ihren enormen Erfolg ist die Arbeitsteilung der Arbeiterinnenkaste. Ameisenarbeiterinnen können sich ihre Aufgaben abhängig ihrer Körpergröße teilen (Größenpolymorphismus), indem unterschiedlich große Tiere verschiedenen Aufgaben in der Kolonie nachgehen. Zusätzlich kann die Arbeitsteilung aber auch altersbedingt sein (auch genannt Alters– oder zeitlicher Polyethismus): Junge Ameisen kümmern sich um die Königin und Brut innerhalb des Nestes, bevor sie mit zunehmendem Alter das Nest verlassen und zu Futtersammlerinnen (Furageuren) werden. Der extrem anpassungsfähige Wechsel von Innen¬– zu Außendiensttieren ist einer der erstaunlichsten Verhaltensweisen, die Arbeiterinnen an den Tag legen und ermöglicht es ihnen, den unterschiedlichen Bedürfnissen ihrer Kolonie nachzugehen. Der Übergang der Ammentätigkeit zum Furagieren ist mit beträchtlichen Veränderungen der sensorischen Umgebung der einzelnen Arbeiterinnen verbunden und erfordert eine Verhaltensanpassung an diese neuen Gegebenheiten. Wenn sich die Verhaltensweisen der Arbeiterinnen ändert, führt das zu Anpassungen der sensorischen und höheren Verschaltungszentren in bestimmten Gehirnarealen. Eines dieser sensorischen Verarbeitungszentren sind die Pilzkörper. Außerdem müssen Furageure in der Lage sein, tägliche Veränderungen ihrer Umwelt wahrzunehmen, um ihre Verhaltensweisen stets optimal an die sich ändernde Umwelt anzupassen. Dafür brauchen sie eine funktionierende innere Uhr, die rhythmisch mit einer Periodenlänge von ca. 24 Stunden läuft. Die artenreiche Gattung der Camponotus Ameisen ist ein geeigneter Organismus, um die Verhaltensweisen die mit der Arbeitsteilung der Arbeiterinnenkaste einhergehen, zu untersuchen, da sowohl der Größenpolymorphismus als auch der Alterspolyethismus zeitgleich in dieser Gattung auftauchen können. Dadurch eignen sich Camponotus Ameisen auch hervorragend, um strukturelle Veränderungen synaptischer Komplexe im Gehirn, die sich durch die Arbeitsteilung ändern können, zu untersuchen. In meiner Doktorarbeit habe ich damit angefangen, die Verteilung von bestimmten Aufgaben (Ammen und Furageure) von C. rufipes Arbeiterinnen zu untersuchen. Mithilfe von Videoaufnahmen über elf Wochen, konnte ich sowohl eine altersabhängige, als auch eine größenabhängige Arbeitsteilung zwischen Ammen und Furageuren für diese Art zeigen. Frisch geschlüpfte Tiere wurden innerhalb der ersten 48 Stunden von anderen Ammen umsorgt, bevor sie selbst zu Ammen wurden und Aufgaben wie Brutpflege übernommen haben. Nach rund 14–20 Tagen sind 53% der Ammen zu Furageuren gewechselt. Zusätzlich zu der altersabhängigen Arbeitsteilung konnte ich zeigen, dass die Körpergröße der Ammen deutlich breiter gestreut ist als die der Furageure, was in einer höheren Spezialisierung der Furageure resultiert. Proportionale Unterschiede des Alters und der Größe der Tiere, die diesen Wechsel vollzogen haben zeigen, wie hoch flexibel und anpassungsfähig die Arbeitsteilung innerhalb der Arbeiterinnenkaste sein kann. Die meisten der beobachteten Furageure waren außerdem fast ausschließlich nachtaktiv. Da ich diese Experimente im Labor durchgeführt habe, fehlt es komplett an der natürlichen sensorischen Umgebung der Tiere. In dem zweiten Teil meiner Doktorarbeit habe ich mich damit beschäftigt, ob sich tägliche Aktivitätsmuster (Furagier– und Bewegungsaktivität) von Arbeiterinnen zweier nah verwandter Camponotus Arten (C. rufipes und C. mus) unter natürlichen Bedingungen (in Uruguay, Südamerika) und unter kontrollierten Bedingungen (im Labor), in Abhängigkeit von den abiotischen Faktoren Licht und Temperatur, verändern können. Meine Ergebnisse zeigen, dass C. mus Arbeiterinnen unter natürlichen Bedingungen strikt tagaktiv sind, wohingegen C. rufipes Arbeiterinnen vornehmlich nachts furagierten. Ein paar C. rufipes Nester zeigten allerdings eine erhöhte Furagieraktivität tagsüber, was auf die saisonal kalten Nächte zurückzuführen sein könnte. Um den Einfluss von Licht und Temperatur, der sich auf die Furagieraktivität im Feld gezeigt hat, genauer untersuchen zu können, wurden Arbeiterinnen beider Camponotus Arten verschiedenen Licht– und Temperaturbedingungen im Labor ausgesetzt. Auch hier zeigten Arbeiterinnen der Gattung C. mus eine strikt tagaktive Bewegungsaktivität, wohingegen C. rufipes Arbeiterinnen von tagaktiv unter Winter Temperaturbedingungen zu nachaktiv unter Sommer Temperaturbedingungen wechselten. Die Kombination aus den Ergebnissen der Feld– und Laborstudien zeigen deutlich, dass die generelle Aktivität der beiden Arten hauptsächlich durch Licht und Temperatur beeinflusst wird und dass Temperaturzyklen nicht nur ein limitierender Faktor der Furagieraktivität sind, sondern auch als Zeitgeber dienen können um Aktivität generell zu regulieren. Wenn der Übergang von Innen– zu Außendiensttieren stattgefunden hat, ändert sich die komplette sensorische Umgebung der Furageure. Um diese Veränderungen verarbeiten zu können, brauchen Arbeiterinnen ein hoch anpassungsfähiges und flexibles neuronales System. Daher beschäftigte ich mich in meiner Doktorarbeit außerdem mit den zugrundeliegenden neuronalen Anpassungen der visuellen Verarbeitungsregionen im Gehirn, wie die optischen Loben und die Pilzkörper, die mit dem Wechsel von Ammen zu Furageuren einhergehen. Ich konnte zeigen, dass die optischen Loben und die Pilzkörper von im Dunkeln gehaltenen Arbeiterinnen eine `Erfahrungs–unabhängige´ Volumenszunahme innerhalb der ersten zwei Wochen nach dem Schlupf zeigen. Eine folgende Lichtexposition von vier Tagen führte zu einer `Erfahrungs–abhängigen´ Abnahme der synaptischen Strukturen im Pilzkörper, die allerdings durch eine länger anhaltende Lichtexposition von 14 Tagen wieder anstieg. Diese Plastizität des zentralen visuellen Nervensystems repräsentiert eine wichtige Komponente für die optimale zeitliche Anpassung des Wechsels von Ammen zu Furageuren und die enorme Flexibilität der altersabhängigen Arbeitsteilung. Außerdem scheinen die Pilzkörper durch diese beeindruckenden strukturellen Veränderungen der synaptischen Komplexe aktiv an dieser neuronalen Plastizität beteiligt zu sein und daher den Übergang von Innen– zu Außendiensttieren in C. rufipes Ameisen zu unterstützen. Neben meinen Untersuchungen zur neuronalen Plastizität synaptischer Komplexe im Pilzkörper auf der strukturellen Ebene, habe ich damit begonnen, diese Plastizität der neuronalen Komplexe auch auf Ultrastruktur Ebene zu untersuchen. Durch die zu geringe Auflösungsmöglichkeit der klassischen Transmissions Elektronenmikroskopie, konnten bisher einzelne synaptischer Komponenten in den axonalen Endigungen der Projektionsneurone nicht detektiert werden. Deswegen habe ich damit angefangen, die Methode der Elektronen Tomographie zu etablieren um die Auflösung synaptischer Komplexe zu verbessern. Mit dieser höheren Auflösung ist es möglich, bauliche Veränderungen der synaptischen Komplexe in Plastizitätsprozessen besser zu verstehen. Mit der Durchführung von `double tilt´ Serien und der anschließenden Verarbeitung der erhaltenen Bildinformation, war es mir möglich, einzelne `clear–core´ und `dense–core´ Vesikel innerhalb des Zytoplasmas der Projektionsneurone von C. rufipes Ameisen detektieren. Außerdem konnte ich mit dieser Methode einzelne postsynaptische dendritische Dornen der Kenyon Zellen (~62) identifizieren, die ein einzelnes Endknöpfchen eines Projektionsneurons umgeben. In diesem Teil meiner Arbeit konnte ich erste Einblicke in die komplexe neuronale Bauweise einzelner Endigungen der Projektionsneurone in der olfaktorischen Region der Pilzkörper zeigen. Die hochauflösenden Bilder synaptischer Komplexe auf dem Ultrastruktur Level, die man mit der Elektronen Tomographie erzielen kann, bringen das Verständnis baulicher Veränderungen innerhalb der neuronales Plastizität voran. In meiner Doktorarbeit konnte ich zeigen, dass die zeitliche Organisation verschiedener Aufgaben innerhalb der Kolonien von Camponotus Ameisen einer perfekten Zeitplanung bedarf. Hier scheinen die abiotischen Faktoren Temperatur und Licht den größten Einfluss auf die Furagieraktivität und die generelle Aktivität zu haben. Die Ameisenarbeiterinnen müssen nicht nur ihre Verhaltensweise nach dem Übergang von Ammen zu Furageuren anpassen, es müssen sich auch die Teile des Gehirns, die für die Verarbeitung visueller Reize zuständig sind, dieser neuen sensorischen Umgebung anpassen. KW - Rossameise KW - Pilzkörper KW - Arbeitsteilung KW - Furagieraktivität KW - foraging activity KW - Neuronales visuelles System KW - neuronal visual system KW - Camponotus rufipes Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-160948 ER - TY - THES A1 - Tang, Ruijing T1 - Optogenetic Methods to Regulate Water Transport and Purify Proteins T1 - Optogenetische Methoden zur Regulierung des Wassertransports und zur Reinigung von Proteinen N2 - Water transport through the water channels, aquaporins (AQPs), is involved in epithelial fluid secretion and absorption, cell migration, brain edema, adipocyte metabolism, and other physiological or pathological functions. Modulation of AQP function has therapeutic potential in edema, cancer, obesity, brain injury, glaucoma, etc. The function of AQPs is in response to the osmotic gradient that is formed by the concentration differences of ions or small molecules. In terms of brain edema, it is a pathophysiological condition, resulting from dysfunction of the plasma membrane that causes a disorder of intracellular ion homeostasis and thus increases intracellular fluid content. Optogenetics can be used to regulate ion transport easily by light with temporal and spatial precision. Therefore, if we control the cell ion influx, boosting the water transport through AQPs, this will help to investigate the pathological mechanisms in e.g. brain edema. To this end, I investigated the possibility for optogenetic manipulating water transport in Xenopus oocytes. The main ions in Xenopus oocyte cytoplasm are ~10 mM Na+, ~50 mM Cl- and ~100 mM K+, similar to the mammalian cell physiological condition. Three light-gated channels, ChR2-XXM 2.0 (light-gated cation channel), GtACR1 (light-gated anion channel) and SthK-bPAC (light-gated potassium channel), were used in my study to regulate ion transport by light and thus manipulate the osmotic gradient and water transport. To increase water flow, I also used coexpression of AQP1. When expressing ChR2-XXM 2.0 and GtACR1 together, mainly Na+ influx was triggered by ChR2-XXM2.0 under blue light illumination, which then made the membrane potential more positive and facilitated Cl- influx by GtACR1. Due to this inward movement of Na+ and Cl-, the osmotic gradient was formed to trigger water influx through AQP1. Large amounts of water uptake can speedily increase the oocyte volume until membrane rupture. Next, when co-expressing GtACR1 and SthK-bPAC, water efflux will be triggered with blue light because of the light-gated KCl efflux and then oocyte shrinking could be observed. I also developed an optogenetic protein purification method based on a light-induced protein interactive system. Currently, the most common protein purification method is based on affinity chromatography, which requires different chromatography columns and harsh conditions, such as acidic pH 4.5 - 6 and/or adding imidazole or high salt concentration, to elute and collect the purified proteins. The change in conditions could influence the activity of target proteins. So, an easy and flexible protein purification method based on the photo-induced protein interactive system iLID was designed, which regulates protein binding with light in mild conditions and does not require a change of solution composition. For expression in E. coli, the blue light-sensitive part of iLID, the LOV2 domain, was fused with a membrane anchor and expressed in the plasma membrane, and the other binding partner, SspB, was fused with the protein of interest (POI), expressed in the cytosol. The plasma membrane fraction and the soluble cytosolic fraction of E. coli can be easily separated by centrifugation. The SspB-POI can be then captured to the membrane fraction by light stimulation and released to clean buffer in the dark after washing. This method does not require any specific column and functions in mild conditions, which are very flexible at scale and will facilitate extensive protein engineering and purification of proteins, sensitive to changed buffer conditions. N2 - Der Wassertransport durch die Wasserkanäle, Aquaporine (AQPs), ist unter anderem an der Sekretion und Absorption der Epithelflüssigkeit, der Zellmigration, dem Hirnödem und dem Adipozytenstoffwechsel beteiligt. Die Modulation der AQP-Funktion hat therapeutisches Potenzial bei Ödemen, Krebs, Fettleibigkeit, Hirnverletzungen, Glaukom usw. Die Funktion von AQPs reagiert auf den osmotischen Gradienten, der durch Konzentrationsunterschiede von Ionen oder kleinen Molekülen gebildet wird. In Bezug auf das Hirnödemhandelt es sich um einen pathophysiologischen Zustand, der aus einer Funktionsstörung der Plasmamembran resultiert und eine Störung der intrazellulären Ionenhomöostase verursacht und somit den intrazellulären Wassergehalt erhöht. Die Optogenetik kann verwendet werden, um den Ionentransport durch Licht mit zeitlicher und räumlicher Präzision leicht zu regulieren. Wenn wir also den Ioneneinstrom in die Zelle erhöhen, wird dies den Wasserimport durch AQPs fördern. ... KW - Optogenetics KW - Aquaporin KW - ChR2 KW - GtACR1 KW - SthK-bPAC KW - Protein Purification KW - iLID Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-231736 ER - TY - THES A1 - Müller, Heike Milada T1 - Anpassung an Trocken- und Salzstress: Untersuchungen an Modellpflanzen und Extremophilen T1 - Adaptation to drought and salt stress: studies on model plants and extremophiles N2 - Die wahrscheinlich größten Probleme des 21. Jahrhunderts sind der Klimawandel und die Sicherstellung der Nahrungsmittelversorgung für eine steigende Zahl an Menschen. Durch die Zunahme von extremen Wetterbedingungen wie Trockenheit und Hitze wird der Anbau konventioneller, wenig toleranter Nutzpflanzen erschwert und die dadurch notwendige, steigende Bewässerung der Flächen führt darüber hinaus zu einer zusätzlichen Versalzung der Böden mit für Pflanzen toxischen Natrium- und Chlorid-Ionen. Kenntnisse über Anpassungsstrategien salztoleranter Pflanzen an Salzstress, aber auch detailliertes Wissen über die Steuerung der Transpiration und damit des Wasserverlusts von Pflanzen sind daher wichtig, um auch künftig ertragreiche Landwirtschaft betreiben zu können. In dieser Arbeit habe ich verschiedene Aspekte der pflanzlichen Stressphysiologie bearbeitet, die im Folgenden getrennt voneinander zusammengefasst werden. I. Funktionelle Unterschiede der PYR/PYL-Rezeptoren von Schließzellen Entscheidend für den Wasserstatus von Pflanzen ist die Kontrolle des Wasserverlusts durch Spaltöffnungen (Stomata), die von einem Paar Schließzellen gebildet werden. Externe Faktoren wie Licht, Luftfeuchtigkeit und CO2, sowie interne Faktoren wie das Phytohormon Abszisinsäure (ABA) regulieren über Signalkaskaden die Stomaweite und dadurch den Wasserverlust. Die zugrunde liegenden Signalkaskaden überlappen teilweise. Vor allem der Stomaschluss durch erhöhtes CO2 und ABA weisen viele Gemeinsamkeiten auf und die Identifizierung des Konvergenzpunktes beider Signale ist immer noch aktueller Gegenstand der Forschung. Von besonderem Interesse sind dabei die in Schließzellen exprimierten ABA-Rezeptoren der PYR/PYL-Familie. Denn obwohl bislang nicht nachgewiesen werden konnte, dass CO2 zu einem Anstieg des ABA-Gehalts von Schließzellen führt deuten einige Studien darauf hin, dass die ABA-Rezeptoren selbst am CO2-Signalweg beteiligt sind. Durch Untersuchungen der Stomareaktion von Arabidopsis ABA-Rezeptormutanten konnte ich in dieser Arbeit zeigen, dass die in Schließzellen exprimierten ABA-Rezeptoren der PYR/PYL-Familie funktionale Unterschiede aufweisen. Fünffach-Verlustmutanten der ABA-Rezeptoren PYR1, PYL2, 4, 5 und 8 (12458) waren in ihrem ABA-induzierten Stomaschluss beeinträchtigt und nur die Komplementation mit PYL2 und in geringerem Maße PYR1 konnte die ABA-Sensitivität wiederherstellen. Die Stomata von 12458-Verlustmutanten waren außerdem insensitiv gegenüber erhöhtem CO2, was auf eine Beteiligung der ABA-Rezeptoren am CO2-induzierten Stomaschluss hindeutet und diese Sensitivität konnte nur durch die Komplementation mit PYL4 oder PYL5, nicht aber mit PYL2 wiederhergestellt werden. Somit konnten in dieser Arbeit erstmals funktionelle Unterschiede der PYR/PYLs beim Stoma-Schluss nachgewiesen werden. Alle externen und internen Stomaschluss-Signale haben außerdem Einfluss auf die Genexpression der Schließzellen und führen zu individuellen expressionellen Adaptionen. In vorangegangenen Microarray Studien konnte gezeigt werden, dass jeder Stimulus auch die Expression eines distinkten Sets an ABA-Rezeptoren beeinflusst. Im Rahmen dieser Arbeit konnte ich außerdem zeigen, dass die Expression der ABA-Rezeptoren bereits auf kleine Änderungen der ABA-Konzentration der Schließzellen reagiert und dass diese sich außerdem in ihrer Sensitivität gegenüber ABA unterschieden. Geringe Änderungen der ABA-Konzentration von Schließzellen haben demnach Auswirkungen auf deren Rezeptor-zusammensetzung. Darüber hinaus konnte ich zeigen, dass die Rezeptoren die Expression unterschiedlicher nachgeschalteter Gene beeinflussen, was darauf hindeutet, dass Anpassungen des Rezeptorpools durch geringe Änderungen des ABA-Gehalts von Schließzellen schlussendlich auf genexpressioneller Ebene zur längerfristigen Adaption an externe Bedingungen führen und die Rezeptoren auch hier funktional verschieden sind. II. Stomatäre Besonderheiten der toleranten Dattelpalme (Phoenix dactylifera) Dattelpalmen kommen natürlicherweise an besonders trockenen und heißen Standorten vor, an denen es aufgrund der harschen Bedingungen nur sehr wenigen Pflanzen möglich ist überhaupt zu wachsen. Ein naheliegender Grund für die herausragende Toleranz dieser Art gegenüber wasserlimitierenden Bedingungen ist eine Anpassung der stomatären Regulation zu Gunsten des Wasserhaushalts. In dieser Arbeit konnte ich durch vergleichende Untersuchungen der lichtabhängigen Transpiration sowie dem ABA-induzierten Stomaschluss grundlegende Unterschiede in der Stomaphysiologie der Dattelpalmen und der eher sensitiven Modellpflanze Arabidopsis thaliana nachweisen. Blattgaswechselmessungen zeigten, dass Dattelpalmen in der Lage sind die Spaltöffnungen bei niedrigen Lichtintensitäten, bei denen Arabidopsis bereits deutlich geöffnete Stomata aufwies, geschlossen zu halten. Der bedeutendste Unterschied in der Stomaphysiologie von Dattelpalmen und Arabidopsis lag aber im ABA-induzierten Stomaschluss. Während über die Petiole verabreichtes ABA bei Arabidopsis innerhalb von 15 Minuten zu einem vollständigen Stomaschluss führte, konnte ich in dieser Arbeit zeigen, dass der ABA-induzierte Stomaschluss der Datteln nitratabhängig ist. ABA allein führte nur zu einem sehr langsamen Stomaschluss der innerhalb einer Stunde nicht vollständig abgeschlossen war. Nur in Gegenwart von Nitrat führte die ABA-Gabe in den Transpirationsstrom der Fiederblätter der Datteln zu einem schnellen und vollständigen Stomaschluss. In Arabidopsis wird der in Schließzellen vorkommende Anionenkanal AtSLAC1 durch eine über den ABA-Signalweg vermittelte Phosphorylierung aktiviert, was schlussendlich zur Aktivierung spannungsabhängiger Kationenkanäle und zum Ausstrom von Kalium aus den Schließzellen führt. Es konnte gezeigt werden, dass die Nitratabhängigkeit der ABA-Antwort der Schließzellen von Dattelpalmen auf Eigenschaften von PdSLAC1 zurückzuführen ist und dieser Kanal nur in Anwesenheit von extrazellulärem Nitrat aktivierbar ist. Mittlerweile konnte, unter anderem basierend auf diesen Ergebnissen, eine Tandem-Aminosäuresequenz identifiziert werden, die die SLAC-Homologe monokotyler Pflanzen wie der Dattelpalme von der dikotyler Pflanzen unterscheidet und zumindest teilweise für die nitratabhängige Aktivierung des Stomaschlusses vieler monokotyler verantwortlich ist. III. Die Salztoleranz von Phoenix dactylifera und Chenopodium quinoa Sowohl Dattelpalmen als auch C. quinoa weisen, verglichen mit den meisten anderen Pflanzen, eine hohe Toleranz gegenüber NaCl-haltigen Böden auf. In dieser Arbeit habe ich die Salztoleranz beider Arten untersucht, um so Strategien zu identifizieren, die diesen Pflanzen diese gesteigerte Toleranz ermöglichen. Dattelpalmen können natürlicherweise auf salzigen Böden wachsen. Makroskopisch weisen diese Pflanzen aber keine Anpassungen wie bspw. Salzdrüsen auf und bislang ist unklar wie Dattelpalmen mit dem NaCl aus dem Boden umgehen. In dieser Arbeit konnte ich zeigen, dass der Natriumgehalt der Fiederblätter der Datteln durch eine sechswöchige Bewässerung mit 600mM NaCl, was ungefähr der Konzentration von Meerwasser entspricht, nicht zunimmt. Demnach sind Datteln so genannte „Exkluder“, also Pflanzen, die eine übermäßige Natriumaufnahme in photosynthetisch aktives Gewebe vermeiden. Der Natriumgehalt der Wurzeln dagegen nahm unter Salzstress aber zu. Diese Zunahme war allerdings in unterschiedlichen Bereichen der Wurzeln verschieden stark. Flammenphotometrische Messungen ergaben einen vom Wurzelansatz ausgehenden graduellen Anstieg des Natriumgehalts, der an der Wurzelspitze am höchsten war. Darüber hinaus konnte eine Induktion von PdSOS1, einem putativen Na+/H+-Antiporter in diesen unteren, natriumhaltigen Bereichen nachgewiesen werden. Eine hohe SOS1-Aktivität gilt bereits in anderen toleranten Arten als Schlüsselmerkmal für deren Toleranz und die gesteigerte Expression von PdSOS1 deutet auf eine erhöhte Natrium-Exportrate aus der Wurzel zurück in den Boden in diesen unteren Bereichen hin, was schlussendlich den Ausschluss von Natrium vermitteln könnte. In sensitiven Arten führt Salzstress häufig zu einer Abnahme der Kaliumkonzentration des Gewebes. Interessanterweise war dies weder für das Blatt- noch das Wurzelgewebe der Dattelpalmen der Fall. Der Kaliumgehalt beider Gewebe blieb trotz der Bewässerung der Pflanzen mit Salzwasser konstant. Auf expressioneller Ebene konnte ich darüber hinaus zeigen, dass PdHAK5, ein putativer hochaffiner Kaliumtransporter, der unter Kontrollbedingungen überwiegend in den oberen Wurzelabschnitten exprimiert wurde, durch den Salzstress dort reprimiert wurde. PdKT, ebenfalls ein putatives Kalium-Transportprotein dagegen, wurde nicht durch die Salzbehandlung beeinflusst, was zusammengenommen darauf hindeutet, dass das Aufrechterhalten des Kaliumgehalts bei Salzstress durch die differentielle Regulation verschiedener Kaliumaufnahmesysteme gewährleistet wird. Der effiziente Ausschluss von Natrium zusammen mit dem hohen K+/Na+-Verhältnis könnten demnach Schlüsselmerkmale für die hohe Salztoleranz von Phoenix dactylifera darstellen. Quinoa ist, ähnlich wie die Dattelpalme, eine salztolerante Nutzpflanze. Im Gegensatz zu Dattelpalmen weist Quinoa allerdings besondere Strukturen auf der Epidermis auf, die so genannten epidermalen Blasenhaare (englisch: epidermal bladder cells, EBCs). Die Funktion dieser ballonartig vergrößerten Zellen als externe Salzspeicher wird seit längerem diskutiert. Flammenphotometrische Messungen des Natriumgehalts von Quinoa unter Salzstressbedingungen ergaben, dass Quinoa anders als Dattelpalmen, Natrium in die oberirdischen, photosynthetisch aktiven Organe aufnimmt. Auch die Zunahme des Natriumgehalts der EBCs konnte ich nachweisen. Junge Blätter haben eine hohe Dichte an intakten EBCs, was deren Funktion als externe Salzspeicher besonders zum Schutz dieser jungen Blätter nahelegt. mRNA-Sequenzierungen ergaben darüber hinaus, dass die EBCs bereits unter Kontrollbedingungen viele in grundlegende Stoffwechselprozesse involvierte Gene sowie membranständige Transportproteine differentiell exprimieren. Diese Unterschiede im Transkriptom der EBCs zum Blattgewebe zeigen, dass katabole Stoffwechselwege nur eine untergeordnete Rolle in den hochspezialisierten EBCs spielen und deren Stoffwechsel auf dem Import energiereicher Zucker und Aminosäuren basiert. Mittels qPCR-Messungen und RNA-Sequenzierungen konnte ich die gewebespezifische Expression verschiedener Transportproteine nachweisen, die eine gerichtete Aufnahme von Natrium in EBCs ermöglichen könnten. Besonders die differentielle Expression eines Natriumkanals der HKT1-Familie deutet auf dessen Beteiligung an der Natriumbeladung der EBCs hin. CqHKT1.2 wurde ausschließlich in EBCs exprimiert und die elektrophysiologische Charakterisierung dieses Transportproteins ergab eine spannungsabhängige Natriumleitfähigkeit. Dieser Natriumkanal kann demnach die Natriumaufnahme bei Membranspannungen nahe dem Ruhepotential in die EBCs vermitteln und die Deaktivierung des CqHKT1.2 bei depolarisierenden Membranspannungen kann darüber hinaus einen Efflux von Na+ aus den EBCs verhindern. Auch das Expressionsmuster eines putativen Na+/H+-Antiporters (CqSOS1) der nur sehr gering in EBCs aber deutlich höher in Blattgewebe exprimiert wurde, deutet auf eine indirekte Beteiligung dieses SOS1 an der Beladung der EBCs hin. Bereits charakterisierte SOS1-Proteine anderer Pflanzen zeigten unter physiologischen Bedingungen eine Natriumexport-Aktivität. CqSOS1 könnte demnach den Export von Natrium aus Mesophyll- und Epidermiszellen der Blätter in den Apoplasten vermitteln, welches dann über CqHKT1.2 in die EBCs aufgenommen wird. Trotz der Natriumaufnahme in die oberirdischen Teile und die EBCs führte die Salzbehandlung ähnlich wie bei den Datteln nicht zu einer Abnahme des bemerkenswert hohen Kaliumgehalts. Mittels qPCR-Untersuchungen konnte ich die Expression verschiedener HAK-Orthologe nachweisen, deren Aktivität die Aufrechterhaltung des Kaliumgehalts unter Salzstress vermitteln könnten. Frühere Studien konnten zeigen, dass Salzstress bei Quinoa wie bei vielen salztoleranten Arten zu einem Anstieg der Konzentration von kompatiblen gelösten Substanzen und besonders von Prolin führt. In dieser Arbeit konnte ich die hohe Expression eines Prolintransporters in EBCs nachweisen, was eher auf einen importbasierten Anstieg der Prolinkonzentration als auf die Synthese innerhalb der EBCs schließen lässt. Zusammengefasst ergaben der Anstieg des Natriumgehalts der EBCs in Verbindung mit den Ergebnissen der RNA-Sequenzierung und den ergänzenden qPCR Messungen, dass die EBCs von Quinoa bereits unter Kontrollbedingen für die Aufnahme von überschüssigen Ionen unter Salzstress spezialisierte Zellen sind, deren Spezialisierung auf dem Import von energiereichreichen Zucken und anderen Substanzen basiert. N2 - The greatest problem faced by the 21st century are climate change and maintaining the food security for an increasing number of people. The increase in extreme weather events, such as drought and heat, makes it difficult to cultivate conventional crops that are not stress tolerant. As a result, increasing irrigation of arable land leads to additional salinization of soils with plant-toxic sodium and chloride ions. Knowledge about the adaptation strategies of salt-tolerant plants to salt stress as well as detailed knowledge about the control of transpiration and thus of the water loss of these plants are therefore important in order to be able to guarantee productive agriculture in the future. In this work, I have worked on various aspects of plant stress physiology, which will be summarized separately below. I. Functional differences of guard cell PYR / PYL receptors A tight regulation of the transpirational water loss through stomata, which are formed by a pair of guard cells, is crucial for regulating the water status of plants. External factors such as light, humidity and CO2 as well as internal factors such as the phytohormone ABA regulate the stoma width and thus the loss of water via individual signal cascades. However, the underlying signaling cascades partly overlap. In particular, the cascades involved in stomatal closure due to increasing CO2 and ABA overlap and the identification of a convergence point of both signals is still the subject of ongoing research. In this context, the ABA receptors of the PYR/PYL family that are expressed in guard cells are of particular interest. Although it has not yet been demonstrated that CO2 leads to an increase in the ABA content of guard cells, some studies indicate that the ABA receptors themselves are involved in the CO2 signaling pathway By studying the stomatal response of Arabidopsis ABA receptor mutants, I demonstrated that the PYR / PYL family ABA receptors expressed in guard cells show functional differences. Pentuple knock out mutants of the ABA receptors PYR1, PYL2, 4, 5, and 8 (12458) showed impairment in ABA-induced stomatal closure, and only complementation with PYL2 and, to a lesser extent, PYR1 could restore ABA sensitivity. Additionally, the stomata of the 12458 knockout mutants were also insensitive to elevated CO2 and the sensitivity could only be restored be the complementation with the receptors PYL4 and PYL5 suggesting an involvement of the ABA receptors in the CO2-induced stomatal closure. Furthermore, all external and internal stimuli that lead to stomatal closure influence the gene expression of guard cells leading to individual adaptions on the gene expression level. Previous microarray studies have shown that each stimulus also affects the expression of a distinct set of ABA receptors. In this work, I showed that the expression of ABA receptors already responded to small changes in the ABA concentration of guard cells and that the receptor expression also differed in their sensitivity to ABA. Small changes in the ABA concentration of guard cells could therefore influence their receptor composition. In addition, I was able to show that the receptors affect the expression of different downstream genes, suggesting that adjustments of the receptor pool by small changes in the ABA content of guard cells ultimately lead to long-term adaptations to external conditions at the gene expression level. II. Specific features of the stomata of the extremely tolerant date palm (Phoenix dactylifera) Date palms naturally occur in particularly dry and hot locations, where due to the harsh conditions only very few plant species are able to grow at all. One possible reason for the outstanding tolerance of this species to water-limiting conditions is an adaptation of the stomatal regulation in favor of maintaining water balance. In this work, I was able to demonstrate fundamental differences in the stomatal physiology of date palm and the rather sensitive model plant Arabidopsis thaliana by comparative studies of light-dependent transpiration and ABA-induced stoma closure. Leaf gas exchange measurements showed that date palm can keep the stomata closed at low light intensities, where Arabidopsis already had clearly opened stomata. However, the most significant difference in the stomatal physiology between date palm and Arabidopsis was found in the ABA-induced stomatal closure. While ABA fed via the petiole resulted in complete stomatal closure within 15 minutes in Arabidopsis, I showed that ABA-induced stomatal closure is nitrate-dependent in date palm. ABA alone only resulted in a very slow stomatal closure that was not fully completed within one hour. Only in the presence of nitrate did the feeding of ABA into the transpiration stream of date palm pinates lead to a rapid and complete stomatal closure. In Arabidopsis, the guard cell-expressed anion channel AtSLAC1 is activated by ABA signaling-mediated phosphorylation, triggering voltage-dependent cation channels to open and ultimately channeling potassium out of the guard cells. It could be shown that the nitrate dependence of the ABA response of the date palm guard cells is due to properties of PdSLAC1 and that this channel can only be activated in the presence of extracellular nitrate. Based on these results, a tandem amino acid sequence has now been identified, that distinguishes the SLAC homologues of monocotyledonous plants (including date palm) from dicotyledonous plants (including Arabidopsis) and is at least partially responsible for the nitrate-dependent activation of the stoma conductance of many monocots. III. The strategies behind the salt tolerance of P. dactylifera and Chenopodium quinoa Both date palms and C. quinoa have a high tolerance to NaCl-containing soils compared to most other plant species. In this work, I studied the salt tolerance of both species to identify strategies that allow these plants to grow under salt stress conditions. Date palm naturally grows on saline soils along the coast of the Arabian Peninsula. However, they do not possess any macroscopic adaptations such as salt glands. So far it is unclear how date palms handle excessive NaCl from the soil. In this work, I was able to show that the sodium content of date palm pinates does not increase after a six-week irrigation with 600mM NaCl, which is roughly the concentration of seawater. Accordingly, date palm is a so-called "excluder", i.e. a plant that avoids excessive sodium uptake into photosynthetically-active tissue. The sodium content of roots, however, increased under salt stress. But this increase was different in different areas of the roots. Flame photometric measurements revealed a gradual increase in sodium content from upper to lower parts of the roots, which was highest at the root tip. In addition, induction of PdSOS1, a putative Na+/H+ antiporter in these lower sodium-containing regions has been demonstrated. High SOS1 activity is already considered to be a key feature of tolerance in other species, and increased expression of PdSOS1 indicates increased sodium export rates from the root back into the soil in these lower areas, which could ultimately mediate the exclusion of sodium. In sensitive plant species, salt stress often leads to a decrease in the potassium concentration of the tissue. Interestingly, this was not the case for date palm leaf or root tissue. The potassium content of both tissues remained constant despite irrigation of the plants with salt water. On the expression level, I also showed that PdHAK5, a putative high-affinity potassium transporter predominantly expressed in the upper root sections under control conditions, was repressed by the salt stress there. In contrast, PdKT, also a putative potassium transport protein, was not affected by the salt treatment, suggesting that maintenance of potassium content in salt stress is ensured by the differential regulation of various potassium uptake systems. The efficient exclusion of sodium together with the high K+/Na+ ratio could therefore be key features of the high salt tolerance of Phoenix dactylifera. Quinoa, like the date palm, is a salt-tolerant crop but in contrast to date palms quinoa has special structures on the epidermis, the so-called epidermal bladder cells (EBCs). The function of these balloon-like enlarged cells as external salt dumpers has been proposed. Flame photometric measurements of the sodium content of quinoa under salt stress conditions showed that quinoa, unlike date palm, absorbs sodium in the above-ground, photosynthetically active parts. I was also able to prove the increase in the sodium content of the EBCs. Young leaves are equipped with a high density of intact EBCs, suggesting their function as external salt stores, especially for the protection of these young leaves. In addition, mRNA sequencing revealed that the EBCs, already under control conditions, differentially express many genes involved in basic metabolic processes as well as membrane-bound transport proteins. These differences in the transcriptome of EBCs to leaf tissue show that catabolic pathways such as photosynthesis play only a minor role in the highly specialized EBCs and their metabolism is based on the import of high energy compounds such as sugars or amino acids. Using qPCR measurements and RNA sequencing, I was able to demonstrate the tissue-specific expression of various transport proteins, which could allow unidirectional uptake of sodium in EBCs. In particular, the differential expression of a sodium channel of the HKT1 family indicates its involvement in the sodium loading of the EBCs. CqHKT1.2 was expressed exclusively in EBCs and the electrophysiological characterization of this transport protein revealed a voltage-dependent sodium conductivity. Thus, this sodium channel can mediate sodium uptake into EBCs at normal membrane voltages, and deactivation of CqHKT1.2 at depolarized membrane voltages can prevent efflux of Na+ out of the EBCs. The expression pattern of a putative Na+/H+ antiporter (CqSOS1), which is expressed only very low in EBCs but significantly higher in leaf tissue, indicates an indirect involvement of this SOS1 in the loading of the EBCs. SOS1 proteins from other plant species that have already been characterized showed a sodium export activity under physiological conditions. Thus, CqSOS1 could mediate the export of sodium from mesophyll and epidermis cells of the leaves in the apoplasts, which is then absorbed into the EBCs via CqHKT1.2. Similar to the results of date palm, the sodium uptake into the above ground parts and the EBCs of quinoa during the salt treatment did not lead to a decrease in the remarkably high potassium content of quinoa. Using qPCR studies, I was able to demonstrate the expression of various HAK orthologues, the activity of which could mediate the maintenance of potassium levels under salt stress. Previous studies have shown that salt stress in quinoa, as in many tolerant species, leads to an increase in the concentration of compatible solutes and particularly proline. In this work, I was able to demonstrate the high expression of a proline transporter in EBCs, suggesting an import-based increase in proline concentration rather than synthesis within the EBCs. In summary, the increase in sodium in EBCs together with the RNA-Seq analyses and the complementary qPCR measurements revealed that the Quinoa EBCs under control conditions are already equipped for the uptake of excess ions under salt stress, with a metabolism that strongly depends on the import of high-energy compounds such as sugars and amino acids. KW - Botanik KW - Salzresistenz KW - Dürreresistenz KW - abiotische Stresstoleranz von Pflanzen KW - abiotic stress tolerance of plants Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-179005 ER - TY - THES A1 - Kumari, Khushbu T1 - The role of lipid transfer proteins (LTPs) during the fertilization process in Arabidopsis thaliana T1 - Untersuchungen zur Rolle von Lipidtransferproteinen (LTPs) während des Befruchtungsprozesses in Arabidopsis thaliana N2 - Double fertilization is a defining characteristic of flowering plants (angiosperms). As the sperm cells of higher plants are non-motile, they need to be transported to the female gametophyte via the growing pollen tube. The pollen-tube journey through the female tissues represents a highly complex process. To provide for successful reproduction it demands intricate communication between the cells of the two haploid gametophytes - the polar growing pollen tube (carrying the two non-motile sperm cells) and the ovule (hosting the egg cell/synergid cells). The polar growth of the pollen tube towards the female gamete is guided by different signaling molecules, including sugars, amino acids and peptides. Some of these belong to the family of lipid transfer proteins (LTPs), which are secreted cysteine-rich peptides. Depending on the plant species several lines of evidence have also suggested potential roles for LTPs during pollen germination or pollen-tube guidance. Although Arabidopsis thaliana has 49 annotated genes for LTPs, several of which are involved in plant immunity and cell-to-cell communication, the role of most members of this family during fertilization is unknown. The aim of this project was therefore to systematically identify LTPs which play a role in the fertilization process in A. thaliana, particularly during pollen tube guidance. To identify candidate proteins, the expression profile of LTPs in reproductive tissue was investigated. This was accomplished by in-silico bioinformatic analysis using different expression databases. Following confirmion of these results by qRT-PCR analysis, seven Type-I nsLTPs (LTP1, LTP2, LTP3, LTP4, LTP5, LTP6 and LTP12) were found to be exclusively expressed in pistils. Except for LTP12, all other pistil expressed LTPs were transcriptionally induced upon pollination. Using reporter-based transcriptional and translational fusions the temporal and spatial expression patterns together with protein localizations for LTP2, 3, 4, 5, 6, and 12 were determined in planta. Stable transgenic plants carrying PromLTP::GUS constructs of the six different LTP candidates showed that most of LTPs were expressed in the stigma/stylar region and were induced upon pollination. With respect to protein localization on the cellular level, they split into two categories: LTP2, LTP5 and LTP6 were localized in the cell wall, while LTP3, LTP4 and LTP12 were specifically targeted to the plasma membrane. For the functional characterization of the candidate LTPs, several T-DNA insertion mutant plant lines were investigated for phenotypes affecting the fertilization process. Pollen development and quality as well as their in-vitro germination rate did not differ between the different single ltp mutant lines and wildtype plants. Moreover, in-vivo cross pollination experiments revealed that tube growth and fertilization rate of the mutant plants were similar to wildtype plants. Altogether, no discernible phenotype was evident in other floral and vegetative parts between different single ltp mutant lines and wildtype plants. As there was no distinguishable phenotype observed for single ltp-ko plants, double knock out plants of the two highly homologous genes LTP2 (expressed in the female stigma, style and transmitting tract) and LTP5 (expressed in the stigma, style, pollen pollen-tube and transmitting tract) were generated using the EPCCRISPR-Cas9 genome editing technique. Two ltp2ltp5 mutant transgenic-lines (#P31-P2 and #P31-P3) with frameshift mutations in both the genes could be established. Further experiments showed, that the CRISPR/Cas9-mediated knock-out of LTP2/LTP5 resulted in significantly reduced fertilization success. Cell biological analyses revealed that the ltp2ltp5 double mutant was impaired in pollen tube guidance towards the ovules and that this phenotype correlated with aberrant callose depositions in the micropylar region during ovule development. Detailed analysis of in-vivo pollen-tube growth and reciprocal cross pollination assay suggested that, the severely compromised fertility was not caused by any defect in development of the pollen grains, but was due to the abnormal callose deposition in the embryo sac primarily concentrated at the synergid cell near the micropylar end. Aberrant callose deposition in ltp2ltp5 ovules pose a complete blockage for the growing pollen tube to change its polarity to enter the funiculus indicating funicular and micropylar defects in pollen tube guidance causing fertilization failure. Our finding suggests that female gametophyte expressed LTP2 and LTP5 play a crucial role in mediating pollen tube guidance process and ultimately having an effect on the fertilization success. In line with the existence of a N-terminal signal peptide, secreted LTPs might represent a well-suited mobile signal carrier in the plant’s extracellular matrix. Previous reports suggested that, LTPs could act as chemoattractant peptide, imparting competence to the growing pollen tube, but the molecular mechanism is still obscure. The results obtained in this thesis further provide strong evidence, that LTP2/5 together regulate callose homeostasis and testable models are discussed. Future work is now required to elucidate the detailed molecular link between these LTPs and their potential interacting partners or receptors expressed in pollen and synergid cells, which should provide deeper insight into their functional role as regulatory molecules in the pollen tube guidance mechanism. N2 - Die ‚doppelte Befruchtung‘ ist ein charakteristisches Merkmal von Blütenpflanzen (Angiospermen). Da im Gegensatz zu vielen anderen Organismen die Spermien höherer Pflanzen nicht beweglich sind, müssen sie über den wachsenden Pollenschlauch zum weiblichen Gametophyten transportiert werden. Die je nach Pflanze durchaus lange Reise des Pollenschlauchs durch das weibliche Gewebe ist ein sehr komplexer Vorgang. Um eine erfolgreiche Reproduktion zu gewährleisten, ist eine fein abgestimmte Kommunikation zwischen den Zellen der beiden haploiden Gametophyten erforderlich - dem polar wachsenden Pollenschlauch (welcher die beiden nicht beweglichen Spermien trägt) und der Samenanlage (in der sich die Eizellen und Synergiden befinden). Das polare Wachstum des Pollenschlauchs in Richtung des weiblichen Gameten wird von verschiedenen Signalmolekülen gesteuert, darunter Zucker, Aminosäuren und Cystein-reiche Peptide (CRPs). Einige dieser Signalmoleküle gehören zur Familie der Lipidtransferproteine (LTPs), welche ebenfalls zur Klasse der CRPs gehören. Abhängig von der Pflanzenart deuten mehrere Hinweise auf eine mögliche Rolle von LTPs während der Pollenkeimung oder der Pollenschlauch-Navigation hin. Obwohl das Genom von Arabidopsis thaliana für mehr als 49 annotierte LTP-Gene kodiert, von denen einige an der ‚angeborenen Immunitätsreaktion‘ von Pflanzen sowie der Kommunikation von Zelle zu Zelle beteiligt sind, ist die physiologische Rolle der meisten Mitglieder dieser Familie während des Befruchtungsvorgangs bisher unbekannt. Ziel dieses Projekts war es daher, systematisch solche LTPs zu identifizieren, die eine Rolle bei der Befruchtung von A. thaliana spielen, insbesondere bei der Navigation des Pollenschlauchs zur Eizelle. Um diese LTP Proteine zu identifizieren, wurde zunächst das Expressionsprofil von LTPs in reproduktiven Gewebe untersucht. Dies wurde durch bioinformatische ‚in-silico‘ Analyse unter Verwendung verschiedener Expressionsdatenbanken erreicht. Nach Bestätigung dieser Ergebnisse durch qRT-PCR- Analyse wurde festgestellt, dass sieben Typ-I-LTPs (LTP1, LTP2, LTP3, LTP4, LTP5, LTP6 und LTP12) präferentiell im Stempel exprimiert werden. Mit Ausnahme von LTP12 wurden darüber hinaus alle anderen Stempel-exprimierten LTPs nach Bestäubung auf transkriptioneller Ebene induziert. Unter Verwendung von Reporter-basierten Transkriptions- und Translationsfusionen wurden die zeitlichen und räumlichen Expressionsmuster zusammen mit Proteinlokalisationen für LTP2, 3, 4, 5, 6 und 12 ‚in planta‘ bestimmt. Stabile transgene Pflanzen, die PromLTP::GUS-Konstrukte der sechs verschiedenen LTP- Kandidaten exprimierten, zeigten, dass die meisten LTPs in der Stigma/Stylar-Region abundant waren und tatsächlich bei der Bestäubung induziert wurden. Die anschließende Proteinlokalisierung auf zellulärer Ebene klassifizierte diese LTPs in zwei Kategorien: LTP2, LTP5 und LTP6 wurden in der Zellwand lokalisiert, während LTP3, LTP4 und LTP12 spezifisch an der Plasmamembran lokalisierten. Zur funktionellen Charakterisierung der Kandidaten-LTPs wurden mehrere T-DNA- Insertionsmutanten auf Phänotypen hinsichtlich des Befruchtungsprozesses untersucht. Die Pollenentwicklung sowie die ‚in-vitro‘ Keimrate des Pollens unterschieden sich dabei nicht zwischen den verschiedenen LTP-Mutantenlinien und Wildtyp-Pflanzen. Darüber hinaus ergaben ‚in-vivo‘ Kreuzbestäubungsexperimente, dass das Pollenschlauchwachstum und die Befruchtungsrate der mutierten Pflanzen im Vergleich zu Wildtyp-Pflanzen ähnlich waren. Insgesamt war kein erkennbarer Phänotyp in der Blütenentwickung oder der vegetativen Entwicklung zwischen verschiedenen LTP-Einzel-Mutanten und Wildtyp-Pflanzen erkennbar. Aufgrund möglicher funktioneller Redundanz, und der Tatsache, dass für einzelne LTP ‚knock- out‘ Pflanzen kein unterscheidbarer Phänotyp beobachtet wurde, wurden Verlustmutanten der beiden hoch homologen und ko-exprimierten Gene LTP2 und LTP5 unter Verwendung der EPC-CRISPR-Cas9-Genomeditiertechnik erzeugt. Zwei ltp2ltp5-mutierte transgene Linien (# P31-P2 und # P31-P3) mit In-Frame-Mutationen in beiden Genen konnten dabei etabliert werden. Weitere Experimente zeigten, dass das CRISPR/Cas9-vermittelte Ausschalten von LTP2 und LTP5 zu einem signifikant verringerten Befruchtungserfolg in diesen Linien führte. Zellbiologische Analysen ergaben, dass die ltp2ltp5 Doppelmutante in der Pollenschlauch- Navigation zu den Ovulen hin beeinträchtigt war und dass dieser Phänotyp mit Kalloseablagerungen in der Region der Mikropyle während der Ovulen-Entwicklung in diesen Linien korrelierte. Eine detaillierte Analyse des ‚in-vivo‘ Wachstums der Pollenschläuche sowie eines wechselseitigen Bestäubungstests ergab, dass die stark beeinträchtigte Befruchtung nicht durch einen Entwicklungsdefekt im männlichen Gametophyten, dem Pollen, verursacht wurde. Stattdessen konnte die beeinträchtigte Befruchtung auf die abnormale Kalloseabscheidung im weiblichen Gametophyten, dem Embryosack, zurückgeführt werden. Interessanterweise, konzentrierte sich die Kalloseabscheidung in der ltp2ltp5 Doppelmutante hauptsächlich im Bereich der Synergiden, am mikropylaren Ende des Embryosacks. Für den wachsenden Pollenschlauch stellen diese im Vergleich zum Wildtyp untypischen Kalloseablagerungen in ltp2ltp5-Mutanten in der Nähe der Eizellen möglicherweise eine Blockade für die Perzeption von Ovulen-Signalen dar. Dies behindert die erforderliche Richtungsänderung des polar gerichteten Wachstums und somit die Fähigkeit des Pollenschlauchs, entlang des Funikulus zu wachsen und in die Mikropyle eindringen zu können. Diese Beobachtung zeigt, dass funikuläre und mikropylare Defekte in der Pollenschlauch-Navigation den Befruchtungserfolg vermindern. Die Ergebnisse dieser Dissertation legen nahe, dass der weibliche Gametophyt, in welchem LTP2 und LTP5 exprimiert werden, eine entscheidende Rolle bei der Regulation der Pollenschlauch-Navigation spielt und letztendlich auch einen messbaren Einfluss auf den Befruchtungserfolg hat. Aufgrund der Existenz eines N-terminalen Signalpeptids und der damit verbundenen Sekretion in den Apoplasten könnten LTPs als Signalmoleküle in der extrazellulären Matrix der Pflanze fungieren. Frühere Arbeiten deuteten bereits an, dass LTPs als chemoattraktive Peptide wirken könnten und dem wachsenden Pollenschlauch die Kompetenz verleihen könnten, die Signale der Eizellen wahrzunehmen. Der zugrundeliegende molekulare Mechanismus ist jedoch noch immer unbekannt. Die in dieser Dissertation erzielten Ergebnisse liefern jedoch starke Hinweise darauf, dass LTP2/5 zusammen die Homöostase der Kallosebildung regulieren. Mögliche Modelle zur Aktivität von LTPs im Kontext der Regulation der Kallose-Homöostase werden vorgestellt und diskutiert. Zukünftige Arbeiten sind nun erforderlich, um die detaillierte molekulare Verbindung zwischen diesen LTPs und ihren potenziellen Interaktionspartnern oder Rezeptoren, die in Pollen- und Synergidzellen exprimiert werden, aufzuklären. Diese sollten einen tieferen Einblick in die funktionelle Rolle von LTP2 und LTP5 als regulatorische Moleküle für die Pollenschlauch- Navigation geben. KW - Fertilization in angiosperm KW - Lipid Transfer Protein Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-199613 ER - TY - THES A1 - Voß, Lena Johanna T1 - Änderungen der Membranspannung und der Osmolarität als Auslöser für Calciumsignale in Pflanzen – Studien an Schließzellen von Nicotiana tabacum und Polypodium vulgare T1 - Induction of Calcium Signals by Changes in Membrane Potential and Osmolarity – Studies on Guard Cells of Nicotiana tabacum and Polypodium vulgare N2 - Stomata sind kleine Poren in der Blattoberfläche, die Pflanzen eine Anpassung ihres Wasserhaushalts an sich ändernde Umweltbedingungen ermöglichen. Die Öffnungsweite der Stomata wird durch den Turgordruck der Schließzellen bestimmt, der wiederum durch Ionenflüsse über die Membranen der Zelle reguliert wird. Ein Netzwerk von Signaltransduktionswegen sorgt dafür, dass Pflanzen die Stomabewegungen an die Umgebungsbedingungen anpassen können. Viele molekulare Komponenten dieser Signaltransduktionketten in Schließzellen von Angiospermen sind inzwischen bekannt und Calcium spielt darin als Signalmolekül eine wichtige Rolle. Weitgehend unbekannt sind dagegen die Mechanismen, die zur Erzeugung von transienten Erhöhungen der Calciumkonzentration führen. Auch die molekularen Grundlagen der Regulierung der Stomaweite in Nicht-Angiospermen-Arten sind bisher nur wenig verstanden. Um zur Aufklärung dieser Fragestellungen beizutragen, wurden in dieser Arbeit Mechanismen zur Erhöhungen der cytosolischen Calciumkonzentration sowie elektrophysiologische Eigenschaften von Schließzellen untersucht. Der Fokus lag hierbei insbesondere auf der Visualisierung cytosolischer Calciumsignale in Schließzellen. Im ersten Teil der Arbeit wurde durch die Applikation hyperpolarisierender Spannungspulse mittels TEVC (Two Electrode Voltage Clamp) gezielt eine Erhöhung der cytosolischen Calciumkonzentration in einzelnen Schließzellen von Nicotiana tabacum ausgelöst. Um die Dynamik der cytosolischen Calciumkonzentration dabei zeitlich und räumlich hoch aufgelöst zu visualisieren, wurde simultan zu den elektrophysiologischen Messungen ein Spinning-Disc-System für konfokale Aufnahmen eingesetzt. Während der Applikation hyperpolarisierender Spannungspulse wurde eine transiente Vergrößerung des cytosolischen Volumens beobachtet. Diese lässt sich durch einen osmotisch getriebenen Wasserfluss erklären, der durch die Veränderung der Ionenkonzentration im Cytosol verursacht wird. Diese wiederum wird durch die spannungsabhängige Aktivierung einwärtsgleichrichtender Kaliumkanäle in der Plasmamembran der Schließzellen und durch den Kompensationsstrom der eingestochenen Mikroelektrode hervorgerufen. Mit Hilfe des calciumsensitiven Farbstoffs Fura-2 konnte gezeigt werden, dass die Erhöhung der freien cytosolischen Calciumkonzentration während der Applikation hyperpolarisierender Spannungspulse durch zwei Mechanismen verursacht wird. Der erste Mechanismus ist die Aktivierung hyperpolarisationsaktivierter, calciumpermeabler Kanäle (HACCs) in der Plasmamembran, die schon 1998 von Grabov & Blatt beschrieben wurde. Zusätzlich zu diesem Mechanismus der Calciumfreisetzung, konnte ein zweiter bislang unbekannter Mechanismus aufgedeckt werden, bei dem Calcium aus intrazellulären Speichern in das Cytosol freigesetzt wird. Dieser Mechanismus hängt mit der oben beschriebenen Vergrößerung des cytosolischen Volumens zusammen und ist wahrscheinlich durch die Änderungen der mechanischen Spannung der Membran bzw. der Osmolarität innerhalb der Zelle bedingt. Diese könnten zu einer Aktivierung mechanosensitiver, calciumpermeabler Kanäle führen. Der zweite Teil der Arbeit beschäftigt sich mit den molekularen Grundlagen der Regulierung von Stomata in Nicht-Angiospermen. In Schließzellen von Polypodium vulgare konnten durch die Anwendung der TEVC-Technik ähnliche spannungsabhängige Ströme über die Plasmamembran gemessen werden wie in Angiospermen. Ebenso wurden durch die Applikation hyperpolarisierender Spannungspulse an Schließzellen von Polypodium und Asplenium Erhöhungen der cytosolischen Calciumkonzentration ausgelöst, die auf die Existenz spannungsabhängiger, calciumpermeabler Kanäle in der Plasmamembran hinweisen. Die Diffusion von Fluoreszenzfarbstoffen in die Nachbarschließzellen nach der iontophoretischen Beladung in Polypodium, Asplenium, Ceratopteris und Selaginella zeigte, dass in diesen Arten eine symplastische Verbindung zwischen benachbarten Schließzellen besteht, die an Schließzellen von Angiospermen bisher nicht beobachtet werden konnte. Anhand elektronenmikroskopischer Aufnahmen von Polypodium glycyrrhiza Schließzellen konnte gezeigt werden, dass diese Verbindung wahrscheinlich durch Plasmodesmata zwischen benachbarten Schließzellen gebildet wird. Durch die Analyse der Calciumdynamik in benachbarten Schließzellen nach hyperpolarisierenden Spannungspulsen stellte sich heraus, dass die Calciumhomöostase trotz symplastischer Verbindung in beiden Schließzellen unabhängig voneinander reguliert zu werden scheint. Im Rahmen der Untersuchungen an Farnschließzellen wurde desweiteren eine Methode zur Applikation von ABA etabliert, die es erlaubt mithilfe von Mikroelektroden das Phytohormon iontophoretisch in den Apoplasten zu laden. Im Gegensatz zu den Schließzellen von Nicotiana tabacum, die auf eine so durchgeführte ABA-Applikation mit dem Stomaschluss reagierten, wurde in Polypodium vulgare auf diese Weise kein Stomaschluss ausgelöst. Da die ABA-Antwort der Farnstomata aber auch von anderen Faktoren wie Wachstumsbedingungen abhängig ist (Hõrak et al., 2017), kann eine ABA-Responsivität in dieser Farnart trotzdem nicht vollkommen ausgeschlossen werden. Die Freisetzung von Calcium aus intrazellulären Speichern, wie sie in dieser Arbeit gezeigt wurde, könnte eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Stomaweite spielen. Zur Aufklärung dieser Fragestellung wäre die Identifizierung der Kanäle, die an der osmotisch/mechanisch induzierten Calciumfreisetzung aus internen Speichern beteiligt sind, von großem Interesse. Weiterführende Studien an Schließzellen von Farnen könnten die physiologische Bedeutung der aus Angiospermen bekannten Ionenkanäle für die Stomabewegungen in evolutionär älteren Landpflanzen aufklären und so maßgeblich zum Verständnis der Evolution der Regulierunsgmechanismen von Stomata beitragen. Außerdem stellt sich die Frage, welche Rolle die hier gezeigte symplastische Verbindung der Nachbarschließzellen durch Plasmodesmata für die Funktion der Stomata spielt. N2 - Stomata are small pores in the leaf surface that allow plants to adapt their water balance to changing environmental conditions. The turgor pressure of the guard cells determines the width of the stomatal aperture and is regulated by ion fluxes in or out of the guard cell. A network of different signal transduction pathways is necessary for the adaption of stomatal movements to ambient conditions. Many of these transduction pathways have been described in detail and many of their components have been identified. It is a well known fact that calcium acts as a second messenger in pathways regulating stomatal movements. However, the mechanisms that lead to transient elevations of the cytosolic calcium concentration are largely unknown. The molecular basis of the regulation of stomatal aperture in non-angiosperm species is also poorly understood. In order to gain new insights into these topics, mechanisms of calcium elevation and electrophysiological properties of guard cells were studied, focussing especially on the visualization of the cytosolic calcium concentration in guard cells. In the first part of this study, the application of hyperpolarizing voltage pulses by means of TEVC (Two Electrode Voltage Clamp) was used to specifically trigger an increase in the cytosolic calcium concentration in individual guard cells in the angiosperm model plant Nicotiana tabacum. To visualize the dynamics of the cytosolic calcium concentration with high temporal and spatial resolution, a spinning disc system for confocal imaging was used simultaneously with the electrophysiological recordings. During the application of hyperpolarizing voltage pulses a transient increase in cytosolic volume was observed. This increase can be explained by an osmotically driven water flux caused by changes of the cytosolic ion concentration. These in turn are caused by the voltage-dependent activation of inward rectifying potassium channels in the guard cell plasma membrane and by the compensating current from the impaled microelectrode. Using the calcium-sensitive dye Fura-2, it could be shown that two mechanisms lead to the elevation of the cytosolic calcium concentration during the application of hyperpolarizing voltage pulses. The first mechanism is the activation of hyperpolarization-activated calcium permeable channels (HACCs) in the plasma membrane, which has already been described in 1998 by Grabov & Blatt. In addition to this mechanism of calcium release, a second previously unknown mechanism was discovered in which calcium is released into the cytosol from intracellular stores. This mechanism is related to the increase in cytosolic volume we described above and is probably caused by changes in membrane tension or osmolarity within the cell. These changes could lead to an activation of mechanosensitive calciumpermeable channels. The second part of this thesis deals with the molecular basis of the regulation of stomata in non-angiosperms. In guard cells of Polypodium vulgare voltage-dependent currents across the plasma membrane similar to those described in angiosperm model plants could be measured using TEVC. Furthermore, the application of hyperpolarizing voltage pulses induced increases in cytosolic calcium concentration in guard cells of Polypodium and Asplenium indicating the existence of voltage-dependent calcium permeable channels in the plasma membrane. The diffusion of iontophoretically injected fluorescent dyes into the neighboring guard cells in Polypodium, Asplenium, Ceratopteris and Selaginella showed that in these species a symplastic connection between neighboring guard cells exists, which could not be observed in guard cells of angiosperms. Electron microscopic images of Polypodium glycyrrhiza guard cells showed that this connection is probably formed by plasmodesmata between adjacent guard cells. Analysis of the calcium dynamics in neighboring guard cells after hyperpolarizing voltage pulses revealed that calcium homeostasis seems to be regulated independently in both guard cells despite their symplastic connection. As part of the investigations on guard cells of ferns, a new method for the application of ABA was established, which allows the phytohormone to be charged iontophoretically into the apoplast with the aid of microelectrodes. In contrast to the guard cells of Nicotiana tabacum, which reacted with loss of turgor and subsequential stomatal closure to this method of ABA-application, no closure of the stomata could be induced in Polypodium vulgare in this way. However, since the ABA response of fern stomata is also dependent on other factors such as growth conditions (Hõrak et al., 2017), an ABA-responsiveness in this fern species can still not be completely excluded. The release of calcium from intracellular stores, as shown in this work, could play an important role for the regulation of stomatal aperture. To clarify this question, the identification of the channels involved in osmotically/mechanically induced calcium release from internal stores would be of great interest. Further studies on fern guard cells could clarify the physiological significance of ion channels known from angiosperms for the stomatal movements in early land plants, and thus contribute significantly to the understanding of the evolution of stomatal regulation. In addition, the question arises as to what role the symplastic connection of the neighboring guard cells through plasmodesmata plays for the function of stomata. KW - Schließzelle KW - Nicotiana tabacum KW - Polypodium vulgare KW - Calcium Imaging KW - Elektrophysiologie KW - Schließzellen KW - Farne KW - Abscisinsäure KW - Oregon Green-BAPTA KW - Fura-2 KW - Hyperpolarisierung KW - guard cells KW - ferns KW - abscisic acid KW - hyperpolarisation Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-219639 ER - TY - THES A1 - Reyer, Antonella T1 - Charakterisierung des Channelrhodopsin-2 aus Chlamydomonas reinhardtii als nicht-invasives, optogenetisches Werkzeug zur funktionellen Analyse elektrischer Signale in Pflanzen T1 - Characterisation of Channelrhodopsin-2 from Chlamydomonas reinhardtii as a non-invasiv, optogenetic tool for the functional analysis of electical signals in plants N2 - Ebenso wie Tiere verfügen Pflanzen über die Fähigkeit elektrische Signale zu generieren. Dabei repräsentieren elektrische Signale – Membranpotentialänderungen an der Plasmamembran – die frühesten Antworten, welche an Pflanzenzellen im Zuge veränderter externer und intrinsischer Bedingungen beobachtet werden können. Stimuli wie Kälte, Hitze, Verwundung, Herbivorie und Pathogene, aber auch physiologische Prozesse, wie Wachstum und Bestäubung führen zur Änderung des Potentials der Plasmamembran pflanzlicher Zellen. Die meisten dieser Membranpotentialänderungen bestehen aus einer schnellen Depolarisation, gefolgt von einer Repolarisation des Membranpotentials, deren Kinetik, in Abhängigkeit des Stimulus hoch variabel sein kann. Das Wissen über die molekularen Grundlagen der Generierung und Weiterleitung elektrischer Signale in Pflanzen ist im Gegensatz zu Tieren nur wenig verstanden. Eine Ausnahme stellen ‚klassisch-erregbare‘ Pflanzen wie die Venusfliegenfalle oder die Mimose dar. In diesen Pflanzen führt ein Berührungsreiz zur Auslösung eines charakteristischen Aktionspotentials, welches in der Folge zu einer, auf differentiellen Turgoränderungen basierenden, nastischen Bewegung führt. In allen anderen Pflanzen ist die Kinetik der Membranpotentialänderungen sehr variabel, abhängig vom Stimulus und dem physiologischen Zustand der Zellen und – mit Ausnahme der Reaktion auf einen Kältestimulus – lediglich nach langen Latenzzeiten wiederholbar. Dieser Umstand verhindert eine systematische Analyse der molekularen Basis elektrischer Signale in den meisten Pflanzen. Ziel dieser Arbeit war es daher, auf der Basis des Channelrhodopsin-2 (ChR2) aus der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii, welches bereits seit 2005 in der Neurobiologie genutzt wird, ein nicht-invasives Werkzeug zur funktionellen Analyse elektrischer Signale in Pflanzen zu etablieren. ChR2 ist ein Blaulicht-aktivierter Kationenkanal, der für seine Funktion all trans-Retinal als Cofaktor benötigt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Varianten des ChR2, mit einem Schwerpunkt auf ChR2-C128T und vor allem ChR2-D156C, auch bekannt als ChR2-XXL eingesetzt. ChR2 konnte bereits durch M. Baumann im Rahmen ihrer Dissertation funktionell im transienten Expressionssystem Nicotiana benthamiana dargestellt werden. In der vorliegenden Arbeit wurde das System weiter ausgebaut und die besonders aussichtsreichen ChR2-Varianten nicht nur in N. benthamiana, sondern auch in stabilen Arabidopsis thaliana Linien funktionell charakterisiert. Dabei konnte mit dem ChR2-XXL ein geeignetes optogenetisches Werkzeug zur Untersuchung elektrischer Signale in Pflanzen identifiziert werden. ChR2-XXL bietet die Möglichkeit das Membranpotential durch kurze, 5 s Blaulichtpulse im Mittel um 95 mV zu depolarisieren und im Anschluss die Repolarisationsphase zu untersuchen. Blaulicht-induzierbare, ChR2-XXL-vermittelte Depolarisationen konnten, reproduzierbar und beliebig oft an den gleichen Zellen wiederholt ausgelöst werden. Dadurch ermöglicht ChR2-XXL die bisher nur unzureichend bekannten molekularen Komponenten der Repolarisation des Membranpotentials in Pflanzen zu erforschen. In tierischen Zellen generieren spannungsabhängige Natriumkanäle die Depolarisation, während spannungsabhängige Kaliumkanäle die Depolarisationskinetik bestimmen. Die im Vergleich zu tierischen Zellen veränderten Ionengradienten lassen vermuten, dass die pflanzliche Depolarisation im Wesentlichen durch Ca2+-abhängige Anionenkanäle vermittelt wird, die durch den Efflux von Cl- das Membranpotential depolarisieren. Für die Repolarisation wird zum einen die Beteiligung von auswärtsgleichrichtenden Kaliumkanälen postuliert. Zum anderen wird auch eine Beteiligung der Plasmamembran (PM) H+-ATPasen vermutet, welche gleichzeitig einen essentiellen Beitrag zur Generierung des Ruhepotentials leisten. In der vorliegenden Arbeit wurde es durch den Einsatz von ChR2-XXL möglich, beide potentiellen Komponenten der Repolarisationsphase, Kaliumkanäle und PM H+-ATPasen, erstmals durch eine nicht-invasive, Anionen-unabhängige Methode der Depolarisation zu untersuchen. Durch den Einsatz von Mutanten und Kaliumkanalinhibitoren konnte ein möglicher Beitrag des auswärtsgleichrichtenden Kaliumkanals Arabidopsis thaliana GUARD CELL OUTWARD RECTIFYING K+ CHANNEL (AtGORK) an der Repolarisationsphase in Arabidopsis Mesophyllzellen nahezu ausgeschlossen werden. Der auswärtsgleichrichtende Kaliumkanal GORK öffnet erst bei Membranpotentialen positiv vom Gleichgewichtspotential für Kaliumionen (EK (-118 mV)). Da die ChR2-induzierbaren Depolarisationen ebenso wie viele natürliche Stimuli, diesen Wert kaum erreichen oder nur geringfügig überschreiten, leistet der GORK einen geringfügigen Beitrag bei der Repolarisation. Dies ließ vermuten, dass die Repolarisation von EK bis zum Ruhepotential bei ca. -180 mV dagegen möglicherweise durch die PM H+-ATPasen bewerkstelligt wird. Die Wirkung des PM H+-ATPase Inhibitors Natriumorthovanadat, sowie des PM H+-ATPase Aktivators Fusicoccin auf die Repolarisationsphase konnten diese Hypothese unterstützen. Die Hemmung der PM H+-ATPasen verlangsamte die Repolarisationskinetik während eine Aktivierung der PM H+-ATPasen diese beschleunigte. So wurde es erstmals möglich den genauen Einfluss der PM H+-ATPasen auf Wiederherstellung des Membranpotentials während der Repolarisation in Mesophyllzellen zu studieren. Darüber hinaus wurde beobachtet, dass in Gegenwart des Kaliumkanalblockers Ba2+ die Repolarisation ebenfalls beschleunigt werden konnte. In Übereinstimmung mit dem ‚Pump-and-Leak‘-Modell (Alberts et al. 2002) deutet dies darauf hin, dass schwach einwärtsgleichrichtende Kaliumkanäle, wie der ARABIDOPSIS K+ TRANSPORTER 2 (AKT2) dem PM H+-ATPasen Protonengradienten entgegenwirken und somit das Ruhepotential aus der Summe der bewegten Ladungen von Pumpen und Kaliumkanälen bestimmt wird. Das mögliche Potenzial optogenetischer, Rhodopsin-basierter Werkzeuge für die molekulare Analyse elektrischer Signale, insbesondere unter Einsatz der breiten Palette lichtgesteuerter Pumpen und Kanäle, ihrer spektralen Diversität und ihrer Einkreuzung in ausgewählte Arabidopsis Mutanten wird diskutiert. N2 - Like animals, plants have the ability to generate electrical signals – membrane potential changes on the plasma membrane. Electrical signals represent the earliest answers that can be observed in plant cells in the course of changing external and internal conditions. Stimuli such as cold, heat, wounding, herbivory and pathogens, as well as physiological processes such as growth and pollination, lead to changes in the potential of the plasma membrane of plant cells. Most of these membrane potential changes consist of rapid depolarization, followed by repolarization of the membrane potential, the kinetics of which can be highly variable depending on the stimulus. In contrast to animals, knowledge about the molecular basis of the generation and transmission of electrical signals in plants is poorly understood. Exceptions include "classically excitable plants" such as the Venus fly trap or mimosa, in which a touch stimulus leads to the triggering of a characteristic action potential, which subsequently leads to an elastic movement based on differential turgor changes. In all other plants, the kinetics of membrane potential changes are highly variable, depending on the stimulus and the physiological state of the cells and – with the exception of the reaction to a cold stimulus – can only be repeated after long latency periods. This prevents a systematic analysis of the molecular basis of electrical signals in most plants. The aim of this work was therefore to establish a non-invasive tool for the functional analysis of electrical signals in plants based on the channelrhodopsin-2 ChR2 from the green alga Chlamydomonas reinhardtii, which has been used in neurobiology since 2005. ChR2 is a blue light-activated cation channel that needed all-trans retinal as a cofactor in order to function. In this work, different variants of the ChR2, with a focus on C128T and especially D156C, also known as ChR2-XXL, were used. ChR2 could already be functionally represented by M. Baumann in the context of her dissertation in the transient expression system Nicotiana benthamiana. In the present work, the system was expanded and particularly promising ChR2 variants were characterized not only in N. benthamiana, but also in stable Arabidopsis thaliana lines. The ChR2-XXL identified a suitable optogenetic tool for examining electrical signals in plants. ChR2-XXL offers the possibility to depolarize the membrane potential by short, 5 s blue light pulses on average by 95 mV and then to investigate the repolarization phase. Blue light-inducible, ChR2-XXL-mediated depolarizations could be triggered reproducibly and repeatedly on the same cells as often as desired. ChR2-XXL enables research into the previously inadequate molecular components of the repolarization of the membrane potential in plants. In animal cells, voltage-dependent sodium channels generate depolarization, while voltage-dependent potassium channels determine the depolarization kinetics. The ion gradients changed compared to animal cells suggest that plant depolarization is essentially due to Ca2+-dependent anion channels, which depolarize the membrane potential through the efflux of Cl-. For repolarization, the involvement of outward rectifying potassium channels is postulated. On the other hand, participation of PM H+-ATPases is also suspected, which at the same time make an essential contribution to the generation of the resting potential. In the present work, the use of ChR2-XXL made it possible for the first time to investigate both potential components of the repolarization phase, potassium channels and PM H+-ATPases, using a non-invasive, anion-independent method of depolarization. Through the use of mutants and potassium channel inhibitors, a possible contribution of the outward rectifying potassium channel Arabidopsis thaliana GUARD CELL OUTWARD RECTIFYING K+ CHANNEL (GORK) to the repolarization phase in Arabidopsis mesophyll cells could almost be excluded. The outward-rectifying potassium channel GORK only opens at membrane potentials more positive than the equilibrium potential for potassium ions (EK (-118 mV)). Since the ChR2-inducible depolarizations, like many natural stimuli, hardly reach this value or only exceed it slightly, GORK makes a minor contribution to repolarization. This suggested that the repolarization from EK to the resting potential at approximately -180 mV, on the other hand, may be accomplished by PM H+-ATPases. The effects of the PM H+-ATPase inhibitor sodium orthovanadate and the PM H+-ATPase activator fusicoccin on the repolarization phase supported this hypothesis. The repolarization kinetics were slowed by inhibition of the PM H+-ATPases and accelerated by their activation. This made it possible for the first time to study the exact influence of the PM H+-ATPases on restoring the membrane potential during repolarization in mesophyll cells. It was also observed that repolarization could be accelerated in the presence of the potassium channel blocker Ba2+. In accordance with the 'pump-and-leak' model, this indicates that weakly inwardly-rectifying potassium channels, such as the Arabidopsis K+ Transporter 2 (AKT2) counteract the PM H+-ATPase-generated proton gradient and thus the resting potential from the sum of the moving charges of pumps and potassium channels is determined. The potential of optogenetic, rhodopsin-based tools for the molecular analysis of electrical signals, in particular using the wide range of light-controlled pumps and channels, their spectral diversity and their intersection with selected Arabidopsis mutants is discussed. KW - pflanzliche Elektrophysiologie KW - Channelrhodopsin-2 KW - elektrische Signale KW - Arabidopsis thaliana KW - Optogenetik Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-218671 ER - TY - THES A1 - Lehmann, Julian T1 - Hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie beleuchtet den Oligomerisierungsstatus pflanzlicher Membranproteine T1 - Super-resolution microscopy elucidates the stoichiometry of plant membrane proteins N2 - SLAC/SLAH Anionenkanäle, die zur Familie der langsamen Anionenkanäle gehören, repräsentieren Schlüsselproteine in der pflanzlichen Stressantwort. Neben ihrer Aufgabe in Stresssituationen, ist eine Untergruppe der Kanäle für die Beladung der Leitgefäße mit Nitrat und Chlorid in der Stele der Pflanzenwurzeln verantwortlich. Biophysikalische und pflanzenphysiologische Studien stellten heraus, dass vor Allem der Anionenkanal SLAH3 für die Beladung der Xylem Leitgefäße mit Nitrat und Chlorid verantwortlich ist. Ihm zur Seite gestellt werden noch die elektrisch inaktiven Homologe SLAH1 und SLAH4 in der Wurzel exprimiert. Sie steuern die Aktivität von SLAH3 durch die Assemblierung zu SLAH1/SLAH3 oder SLAH3/SLAH4 Heteromeren. Neben der Kontrolle durch Heteromerisierungsereignisse, werden SLAH3 Homomere sehr spezifisch und schnell durch zytosolische Ansäuerung aktiviert. Obwohl bereits die Kristallstruktur des bakteriellen Homologs HiTehA zu pflanzlichen SLAC/SLAH Anionenkanälen bekannt ist, welche HiTehA als Trimer charakterisiert, sind die Stöchiometrie und der Polymerisierungsgrad der pflanzlichen SLAC/SLAHs bisher noch unbekannt. Die Fluoreszenzmikroskopie umfasst viele etablierte Anwendungsmethoden, wie die konfokale Laserrastermikroskopie (CLSM), Techniken mit verbesserter Auflösung, wie die Mikroskopie mit strukturierter Beleuchtung (SIM) und hochauflösende Methoden, welche durch die Lokalisationsmikroskopie (z.B. dSTORM und PALM) oder die Expansionsmikroskopie (ExM) vertreten werden. Diese unterschiedlichen Mikroskopie-methoden ermöglichen neue Einblicke in die Organisation von Proteinen in biologischen Systemen, die bis auf die molekulare Ebene hinunterreichen. Insbesondere im Bereich der hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie sind im Gegensatz zu tierischen Frage-stellungen bisher jedoch nur wenige Untersuchungen in pflanzlichen Geweben durchgeführt worden. Die Lokalisationsmikroskopie ermöglicht die Quantifizierung einzelner Moleküle in nativen Systemen und lässt überdies Rückschlüsse auf den Polymerisierungsgrad von Proteinen zu. Da Poly- und Heteromerisierung von Proteinen oftmals mit der Funktionalität eines entsprechenden Proteins einhergeht, wie es bei den SLAC/SLAH Anionenkanälen der Fall ist, wurden in dieser Arbeit PALM Messungen zur Untersuchung des Polymerisierungsgrades und Interaktionsmuster der Anionenkanäle angewendet. Ferner wurden Expressionsmuster der SLAC/SLAHs untersucht und zudem Mikroskopieanwendungen im Pflanzengewebe etabliert und verbessert. In Bezug auf die Mikroskopieanwendungen konnten wir in Arabidopsis thaliana (At) Wurzeln die polare Verteilung von PIN Proteinen mittels SIM bestätigen und die gruppierte Verteilung in der Plasmamembran am Zellpol auflösen. In Wurzel-querschnitten war es möglich, Zellwände zu vermessen, den Aufbau der Pflanzenwurzel mit den verschiedenen Zelltypen zu rekonstruieren und diesen in Zusammenhang mit Zellwanddicken zu bringen. Anhand dieser Aufnahmen ließ sich die Auflösungsgrenze eines SIM-Mikroskops bestimmen, weshalb diese Probe als Modellstruktur für Auflösungsanalysen, zur Kontrolle für die korrekte Bildverarbeitung bei hochauflösender Bildgebung und andere Fragestellungen empfohlen werden kann. Für die Expansionsmikroskopie in pflanzlichen Proben konnten ein enzym- und ein denaturierungsbasiertes Präparationsprotokoll etabliert werden. Dabei wurden ganze At Setzlinge, Wurzelabschnitte und Blattstücke gefärbt, expandiert und mit zwei bis drei Mal verbesserter Auflösung bildlich dargestellt. In diesem Zusammenhang waren Aufnahmen ganzer Wurzel- und Blattproben mit beeindruckender Eindringtiefe und extrem geringem Hintergrundsignal möglich. Zudem wurden die Daten kritisch betrachtet, Probleme aufgezeigt, gewebespezifische Veränderungen dargestellt und limitierende Faktoren für die ExM in Pflanzenproben thematisiert. Im Fokus dieser Arbeit stand die Untersuchung der SLAC/SLAH Proteine. SLAH2 wird in den Wurzeln vornehmlich in Endodermis- und Perizykelzellen exprimiert, was anhand verschiedener At SLAH2 YFP Mutanten untersucht werden konnte. Dies unterstützt die Annahme, dass SLAH2 bei der Beladung der Leitgefäße mit Nitrat maßgeblich beteiligt ist. Es ist denkbar, dass SLAH2 ebenfalls eine wachstumsbeeinflussende Funktion über die Regulation von Nitratkonzentrationen zugeschrieben werden kann. Darauf deuten vor allem die verstärkte Expression von SLAH2 im Bereich der Seitenwurzeln und die heterogene Expression in der Elongations-, Differenzierungs- und meristematischen Zone hin. Die Membranständigkeit von SLAH4 konnte nachgewiesen werden und FRET FLIM Untersuchungen zeigten eine hohe Affinität von SLAH4 zu SLAH3, was die beiden Homologe als Interaktionspartner identifiziert. Für die Bestimmung des Oligomerisierungsgrades mittels PALM wurden die pflanzlichen Anionenkanäle in tierischen COS7-Zellen exprimiert. Die elektrophysiologische Funktionalität der mEOS2-SLAC/SLAH-Konstrukte wurde mit Hilfe von Patch-Clamp-Versuchen in COS7-Zellen überprüft. Um Expressionslevel, Membranständigkeit und die Verteilung über die Membran der SLAC/SLAHs zu verifizieren, wurden dSTORM-Aufnahmen herangezogen Schließlich ermöglichten PALM-Aufnahmen die Bestimmung des Polymerisierungs-grades der SLAC/SLAH Anionenkanäle, die stöchiometrischen Veränderungen bei Heteromerisierung von SLAH3 mit SLAH1 oder SLAH4 und auch der Einfluss einer zytosolischer Ansäuerung auf den Polymerisierungsgrad von SLAH3 Homomeren. Zudem weisen die Oligomerisierungsanalysen von SLAH3 Mutanten darauf hin, dass die Aminosäuren Histidin His330 und His454 entscheidend an der pH sensitiven Regulierung von SLAH3 beteiligt sind. Durch die erhobenen Daten konnten also entscheidende, neue Erkenntnisse über die Regulationsmechanismen von pflanzlichen Anionenkanälen auf molekularer Ebene gewonnen werden: Unter Standardbedingungen liegen SLAC1, SLAH2 und SLAH3 hauptsächlich als Dimer vor. Auf eine zytosolische Ansäuerung reagiert ausschließlich SLAH3 mit einer signifikanten stöchiometrischen Veränderung und liegt im aktiven Zustand vor Allem als Monomer vor. Der Oligomerisierungsgrad von SLAC1 und SLAH2 bleibt hingegen bei einer zytosolischen Ansäuerung unverändert. Ferner kommt es bei der Interaktion von SLAH3 mit SLAH1 oder SLAH4 zur Formierung eines Heterodimers, welches unbeeinflusst durch den zytosolischen pH bleibt. Im Gegensatz dazu bleiben die elektrisch inaktiven Untereinheiten SLAH1 und SLAH4 monomerisch und assemblieren ganz spezifisch nur mit SLAH3. Die hochauflösende Fluoreszenz-mikroskopie, insbesondere PALM erlaubt es also Heteromerisierungsereignisse und Änderungen im Poylmerisierungsgrad von Membranproteinen wie den SLAC/SLAHs auf molekularer Ebene zu untersuchen und lässt so Rückschlüsse auf physiologische Ereignisse zu. N2 - Anion channels of the slow anion channel family (SLAC/SLAH) are general master switches of plant stress responses. In addition a subgroup of channels load the vascular tissue in roots with nitrate and chloride. The activity of the main nitrate and chloride loading anion channel, SLAH3, is controlled by heteromerization with the electro-physiologically silent subunits SLAH1 and SLAH4 or alternatively by cytosolic acidification. Although the crystal structure of a bacterial homologue (HiTehA) of plant SLAC/SLAH anion channels is already known and suggests a trimeric structure, the stoichiometry and the multimerization level of the plant anion channel counterparts are still undiscovered. Fluorescence microscopy encompasses numerous well-established application methods like confocal laser scanning microscopy (CLSM), high resolution techniques like structured illumination microscopy (SIM) and super resolution microscopy represented by single molecule localization microscopy (e.g. dSTORM and PALM) or recently upcoming methods like expansion microscopy (ExM). These different application methods open new fields of insight into the biological organization of proteins, even down to the molecular level. In comparison to faunal studies, very little floral enquiries have been conducted, especially in the super resolution-sector. Single-molecule localization microscopy enables individual molecules to be quantified in the native environment and therefore allows conclusions regarding protein stoichiometry. As protein stoichiometry often involves cellular function of the corresponding protein, we used PALM applications and single molecule counting strategies to analyze the stoichiometric distribution of anion channel complexes. Moreover, in this study, expression patterns of the SLAC/SLAH proteins were investigated and different microscopic applications on plant specific issues could be improved and established. Referring to microscopic applications, we confirmed the polar orientation of PIN proteins via SIM and succeeded in resolving the clustered distribution in the plasma membrane at the cellular pole. Besides we were also able to measure cellwall dimensions of root cross sections from Arabidopsis thaliana seedlings and therefore succeeded in concluding the root architecture, designating the various cell types within the root, comparing them with cellwall thickness and evaluating resolution limits of the SIM microscope. Due to these reasons, this specimen can be recommended as a model structure for resolution analyses, control measurements regarding tissue-intactness after image processing for super-resolution images, or further questions. We turned out to establish two different protocols for ExM-studies in plants. One is based on enzymatic digestion and the other one on denaturation. We were able to label, expand and image whole At-seedlings, root- and leaf segments and thereby improved the resolution 2 3 fold. In this regard we managed to comprehensively depict the intact structure of leaves and roots with impressive penetration depth and extremely low background. We also examined our data and identified tissue-specific changes, discuss problems and possible limits of ExM in plants. The major part of this work was the investigation of SLAC/SLAH proteins. The expression of SLAH2 in roots is mainly located in endodermal and pericycle cells which was observed in various At-SLAH2-YFP mutants. Thus, strengthening the hypothesis, that SLAH2 has a major role in loading the vascular tissue with nitrate. The heterogeneous expression levels of SLAH2 in the meristematic-, elongation- and differentiation zone and moreover the upregulation in areas of lateral root formation also suggests that SLAH2 has an effect on plant growth by regulating nitrate levels. SLAH4 is located in the plasma membrane and FRET FLIM measurements showed a high affinity to SLAH3, validating the two homologues as interaction partners. For PALM-stoichiometry analyses, the plant anion channels were expressed in mammalian COS7-cells, in order to avoid endogenous falsification of the stoichiometries, as well as impractical reasons of PALM imaging in plant tissue. Hence, checking the electrophysiological functionality of mEOS2-SLAC/SLAH constructs via patch-clamp measurements. dSTORM-measurements were used to verify expression levels, correct membrane-association and the distribution of the SLAC/SLAHs in COS7 cells. We determined the multimerization level of SLAC/SLAHs upon cytosolic acidification and monitor stoichiometric changes upon heteromerization of SLAH3 with SLAH1 and SLAH4. On the basis of our data the following valuable new insights into the regulation mechanisms of plant anion channels were revealed: under control conditions, SLAC1, SLAH2 and SLAH3 are mainly depicted as dimers. Upon cytosolic acidification with NaOAc the stoichiometries of SLAC1 and SLAH2 remained unchanged, whereas the amount of dimeric SLAH3 is significantly reduced and shifts to a mainly monomeric distribution. It could also be assessed that SLAH3 interacts with SLAH1 or SLAH4, thereby forming a heterodimer, which is barely separable by acidification. In contrast, for SLAH1 and SLAH4 no affinity was observed. Moreover, the stoichiometries of different SLAH3-mutants indicated a crucial role of the amino acids histidin His330 and His454 in the pH-sensitive regulation of SLAH3. Hence, super-resolution micrsocopy, especially PALM allows the quantification of polymerization- and heteromerization-levels of proteins like the SLAC/SLAH anion-channels on the molecular level and therefore enabling physiological conclusions. KW - Fluoreszenzmikroskopie KW - Membranproteine KW - Oligomerisation KW - Superresolution microscopy KW - SLAC/SLAH KW - PALM stoichiometry Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-211762 ER - TY - THES A1 - Schäfer, Nadine T1 - Eine vergleichende biophysikalische Analyse von Hitze- und Trockentoleranzstrategien der Wüstenpflanze Phoenix dactylifera und Nutzpflanzen der gemäßigten Klimazonen T1 - A comparative biophysical analysis of heat and drought tolerance strategies of the desert plant Phoenix dactylifera and crops of temperate climates N2 - Der Klimawandel geht einher mit einem Anstieg der globalen Durchschnittstemperatur und einem dadurch induzierten Wassermangel. Diese beiden abiotischen Stressfaktoren führen zu einer Reduzierung der landwirtschaftlichen Erträge und Biomassen von Kulturpflanzen. Daher ist eine Anpassung der betroffenen Pflanzenarten an das sich ändernde Klima erforderlich, um die landwirtschaftliche Produktivität in Zukunft aufrechtzuerhalten. Gegenwärtig ist unser Wissen über Strategien zur Toleranz gegenüber abiotischem Stress sowie über Genom- und Transkriptionsinformationen auf wenige Modellorganismen von Angiospermen beschränkt, so dass diese Informationen die Basis für die Forschung an Trockenheit und Hitzestress darstellen. Die Untersuchung der Stressadaption innerhalb und zwischen verschiedenen Pflanzengattungen ist von besonderer Relevanz. Vor diesem Hintergrund habe ich im Rahmen meiner Doktorarbeit die Überlebensstrategie der extremophilen Wüstenpflanze Phoenix dactylifera (Dattelpalme) im Vergleich zu zwei Mesophilen, der Kulturpflanze Hordeum vulgare (Gerste) und der Modellpflanze Arabidopsis thaliana, untersucht. Dattelpalmen sind nicht sukkulente Wüstenpflanzen, die auch unter extremen Trocken- und Hitzebedingungen in den Wüsten der Arabischen Halbinsel wachsen und ertragreich Früchte produzieren. In Phoenix dactylifera ist bislang weder die Molekularbiologie und –physiologie der Schließzellen, vor allem der Anionenkanäle, verstanden, noch wurde der Hitzeschutz ihrer Zuckertransportproteine untersucht. Um die stomatäre Reaktion auf das Trockenstresshormon ABA (Abscisinsäure) zu verstehen, klonierten wir die Hauptkomponenten des schnellen ABA-Signalwegs von Schließzellen und analysierten den Öffnungsmechanismus der Anionenkanäle aus der Dattelpalme und der Gerste vergleichend zu dem Anionenkanal aus Arabidopsis im heterologen Expressionssystem der Xenopus Oozyten. Beide monokotyledonen Pflanzenarten (Gerste und Dattelpalme) besitzen stomatäre Komplexe, die aus Schließzellen und Nebenzellen bestehen. Dies unterscheidet die Monokotyledonen von den Dikotyledonen, die normalerweise Stomakomplexe aufweisen, die nur aus einem Paar Schließzellen gebildet werden. Interessanterweise schlossen sich Dattelpalmen- und Gerstenstomata als Reaktion auf das Trockenstresshormon ABA nur in Gegenwart von extrazellulärem Nitrat. Der heterolog-exprimierte Anionenkanal PdSLAC1 wird durch die ABA-Kinase PdOST1 aktiviert und diese Aktivierung wird durch die Koexpression der PP2C-Phosphatase ABI1 gehemmt. Daher wird PdSLAC1 wie seine Orthologen aus Gerste und Arabidopsis durch ein ABA-abhängiges Phosphorylierungs-/Dephosphorylierungsnetzwerk gesteuert. PdOST1 aktivierte den Anionenkanal PdSLAC1 jedoch nur in Gegenwart von extrazellulärem Nitrat - eine elektrische Eigenschaft, die PdSLAC1 mit HvSLAC1 der Gerste gemein hat, sich jedoch von AtSLAC1 unterscheidet. Angesichts der Tatsache, dass in Gegenwart von Nitrat ABA den Stomaschluss verstärkt und beschleunigt, deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass bei Dattelpalmen und Gerste Nitrat als Ligand zum Öffnen von SLAC1 benötigt wird. Dies initiiert die Depolarisation der Schließzellen und leitet schließlich den Stomaschluss ein, um den Wasserverlust der Pflanzen unter Trockenstressbedingungen zu minimieren. Um die monokotyledone spezifische Nitratabhängigkeit von SLAC1 zu verstehen, führten wir ortsgerichtete Mutagenesestudien auf Basis eines 3D-Modells durch, welche zudem vergleichende Studien an Chimären von Monokotylen- und Dikotylen-SLAC1 Anionenkanälen umfassten. Unsere Struktur-Funktions-Forschung identifizierte zwei Aminosäurenreste auf der Transmembrandomäne 3 (TMD3), die eine wesentliche Rolle bei der Nitrat-abhängigen Regulierung von SLAC1 Anionenkanälen monokotyledoner Pflanzen spielen. Die phylogenetische Analyse ergab schließlich, dass während der Evolution die für Monokotlyedonen spezifische Nitrat-abhängige Regulierung erst nach der Trennung in Monokotyledonen und Dikotyledonen auftrat. Durch die Nitrat-sensitive Regulierung von SLAC1 Anionenkanälen beruht der schnelle Stomaschluss von Monokotyledonen auf dem Zusammenspiel des Trockenstresshormons ABA und dem Stickstoffhaushalt der Pflanze. Da der ABA-Signalweg von Arabidopsis umfassend untersucht wurde, könnte die Entdeckung des monokotyledonen spezifischen Nitrat-abhängigen Motivs in TMD3 nun als Stellschraube zur Verbesserung der Züchtungsprogramme dikotyledoner Nutzpflanzen dienen. Wüstenpflanzen leiden nicht nur unter Trockenheit, sondern auch unter extremem Hitzestress. Wir konnten zeigen, dass hitzebelastete Dattelpalmen große Mengen der flüchtigen Kohlenwasserstoffverbindung Isopren (2-Methyl-1,3-Butadien) produzieren und emittieren. Durch die vorübergehende Freisetzung von Isopren kann die Pflanze die Photosynthese auch bei extremen Temperaturen betreiben. Es ist jedoch nicht bekannt, ob und wie Isopren in Hitzeperioden auch Transportprozesse durch biologische Membranen schützt. Um den Einfluss von Isopren auf den Transmembrantransport zu untersuchen, identifizierten und klonierten wir den Protonen-gekoppelten Saccharosetransporter 1 (PdSUT1) der Dattelpalme und verglichen seine elektrischen Eigenschaften mit ZmSUT1 (Zea mays Sucrose Transporter 1) im heterologen Expressionssystem der Xenopus Oozyten. Interessanterweise waren das elektrische Verhalten, die kinetischen Eigenschaften und die Temperaturabhängigkeit beider Transporter ähnlich. Die Anwendung von Isopren veränderte jedoch massiv die Affinität von ZmSUT1 zu seinem Substrat Saccharose, während die Affinität des Transporters der Dattelpalme nur schwach beeinflusst wurde. Es wird angenommen, dass die Membranfluidität unter Hitzestress erniedrigt ist, welches durch Interkalierung von Isopren mit den Fettsäureketten biologischer Membrane einhergeht. Dies und die Unempfindlichkeit von PdSUT1 gegenüber Isopren deuten darauf hin, dass der Saccharosetransporter PdSUT1 aus der Wüstenpflanze auch bei hohen Temperaturen Saccharose mit hoher Affinität transportiert. Zukünftige Studien müssen nun klären, ob der flüchtige Kohlenwasserstoff Isopren einen direkten Einfluss auf den Transporter selbst hat oder Isopren in die Membran integriert und damit indirekt die Eigenschaften von Transportproteinen beeinflusst. Unabhängig von der Wirkungsweise von Isopren sollte nicht unerwähnt bleiben, dass PdSUT1 gegenüber Isopren weniger empfindlich ist als sein Ortholog ZmSUT1 aus Mais. Dies kann auf eine Anpassung des Saccharosetransporters an die extremen Hitzeperioden und die damit einhergehende Isoprenemission von Dattelpalmen zurückzuführen sein. N2 - Low water availability and heat stress present major barriers to achievíng high biomass and full yield potential in crops. Global climate change is accompanied by a subtle increase in the severity of these abiotic stresses. Thus, the adaptation of crop species to the changing climate is required in order to sustain agricultural productivity in the future. Currently, our knowledge of plant strategies for abiotic stress tolerance as well as genomic and transcriptional information is limited to a few model angiosperms, providing a starting point for the understanding of responses to drought and/or heat stress, within and across species. In the framework of my PhD thesis, we followed a different strategy to learn about abiotic stress tolerance: we studied the survival strategy of the extremophilic desert plant Phoenix dactylifera (date palm) in comparison to the crop Hordeum vulgare (barley) and the model plant Arabidopsis thaliana, both from temperate zones. Date palms grow and produce fruits even under extreme drought and heat conditions in the deserts of the Arabian Peninsula. Neither the molecular biology and physiology of guard cells nor the heat protection of transport protein mediated sugar and ion transport processes have been studied so far in this non-succulent desert plant, Phoenix dactylifera. To understand the stomatal response to the water stress phytohormone ABA (abscisic acid), we cloned the major components for guard cell fast abscisic acid signaling and analysed the anion channel opening mechanism of the date palm side by side with barley and Arabidopsis in Xenopus oocytes. Both monocot plant species (barley and date palm) possess stomatal complexes consisting of guard cells and subsidiary cells. This distinguishes monocot species from dicots, which usually exhibit stomatal complexes formed by a pair of guard cells only. Interestingly, date palm and barley stomata closed in response to the drought stress hormone ABA only in the presence of extracellular nitrate. Heterologously expressed Phoenix SLAC1-type anion channel PdSLAC1 is activated by the ABA kinase PdOST1 and this activation is inhibited by the coexpression of PP2C phosphatase ABI1 – thus like its counterparts from barley and Arabidopsis, PdSLAC1 is controlled by an ABA-dependent phosphorylation/dephosphorylation network. However, PdOST1 did activate the desert plant anion channel PdSLAC1 only in the presence of extracellular nitrate – an electrical property that PdSLAC1 shares with the barley SLAC1 but distinguishes both monocot SLAC1 channels from AtSLAC1. Given that, in the presence of nitrate, ABA enhanced and accelerated stomatal closure, our findings indicate that the guard cell osmotic motor driving stomatal closure in date palm and barley uses nitrate as the signal to open the major anion channel SLAC1. This initiates guard cell depolarization and finally stomatal closure to prevent plant wilting under drought stress conditions. To understand the monocot-specific SLAC1 nitrate dependency, we performed a 3D-model- based site-directed mutagenesis study including chimeric channels between monocot and dicot SLAC1 anion channels. Our structure-function research identified two residues on transmembrane domain 3 (TMD3) that play an essential role in nitrate-dependent gating of monocot SLAC1-type anion channels. Phylogenetic analysis finally revealed that during evolution the monocot specific nitrate-dependent gating was established after the split between monocots and dicots. Thus, the success of monocot species may in part rely on the integration of drought signals (ABA) and the nitrogen nutrition status of the plant via nitrate-sensitive gating of SLAC1 anion channels. Since the Arabidopsis ABA-signaling pathway has been extensively studied, the discovery of the monocot-specific nitrate dependent motif on TMD3 could now serve as a set screw to improve the breeding programs of dicot agricultural crops. Desert plants not only suffer from drought but also from extreme heat stress. We could show that heat-stressed date palms produce and emit high amounts of the volatile hydrocarbon compound isoprene (2-Methyl-1,3-Butadien). The temporary release of isoprene allows the plant to perform photosynthesis even under extreme temperatures. However, it is not known whether and how isoprene also protects transport processes across biological membranes in periods of heat. To study the influence of isoprene on transmembrane transport, we identified and cloned the date palm proton-coupled sucrose transporter 1 (PdSUT1) and compared its electrical properties with ZmSUT1 (Zea mays Sucrose Transporter 1) in the heterologous expression system of Xenopus oocytes. Interestingly, the electrical behavior, the kinetic properties and the temperature dependence of both carriers were similar. However, the response to isoprene application massively altered the affinity of ZmSUT1 to its substrate sucrose while the affinity of the date palm transporter was only weakly affected. The intercalation of isoprene with the fatty acid chains of biological membranes is believed to decrease the membrane fluidity under heat stress. This and the insensitivity of PdSUT1 towards isoprene may indicate that the desert plant sucrose transporter PdSUT1 transports sucrose with high affinity even at high temperatures. Future studies must now clarify whether the volatile hydrocarbon isoprene has a direct influence on the carrier itself or isoprene integrates into the membrane and thus indirectly influences the properties of transport proteins. Regardless of the mode of action of isoprene, it remains to be noted that PdSUT1 is less sensitive to isoprene than its orthologue from maize. This may be an adaptation of the sucrose carrier to the extreme heat periods and the accompanying isoprene emission from date palms. KW - Dattelpalme KW - Gerste KW - Elektrophysiologie KW - Hitzestress KW - Schließzelle KW - Anionenkanal KW - Zuckertransporter KW - SLAC1 KW - SUT1 KW - Signaltransduktion KW - ZmSUT1 KW - Phoenix dactylifera KW - Hordeum vulgare KW - Zea mays Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-186491 ER - TY - THES A1 - Zhu, Mo T1 - Germination and differentiation of \(Blumeria\) \(graminis\) ascospores and effects of UV-C and white light irradiation on \(B.\) \(graminis\) conidial prepenetration T1 - Keimung und Differenzierung von \(Blumeria\) \(graminis\) Ascosporen und Effekte von UV-C und Weißlichtbestrahlung auf die Konidienpräpenetration von \(B.\) \(graminis\) N2 - Blumeria graminis, the obligate biotrophic grass powdery mildew, is a highly pathogenic fungus capable of inflicting foliar diseases and of causing severe yield losses. There is asexual and sexual propagation in the life cycle of B. graminis. In the epidemiological processes of this pathogen, both types of spores - asexual conidia and sexual ascospores – are crucial. Conidia of B. graminis are demonstrated to perceive cuticular very-long-chain aldehydes as molecular signal substances notably promoting germination and differentiation of the infection structure (the appressorium) – the prepenetration processes – in a concentration- and chain-length-dependent manner. Conidial germination and appressorium formation are known to be dramatically impeded by the presence of free water on the host surface. However, sexually formed ascospores are reported to easily germinate immersed in water. There are abundant assays on conidial prepenetration processes. However, with respect to the stimulating effects of very-long-chain aldehydes and to the influence of the presence of free water, ascosporic prepenetration processes are still obscure. In order to study the effects of very-long-chain aldehydes on the ascosporic prepenetration processes of wheat powdery mildew fungus B. graminis f. sp. tritici, Formvar®-based in vitro systems were applied to exclude the secondary host effects (such as host resistance) and to reproducibly provide homogeneous hydrophobic substratum surfaces. By the presence of even-numbered very-long-chain aldehydes (C22 - C30), the appressorium formation of the ascospores was notably triggered in a chain-length dependent manner. N-octacosanal (C28) was the most inducing aldehyde tested. Unlike conidia, ascospores could easily differentiate immersed in water and showed a more variable differentiation pattern even with a single germ tube differentiating an appressorium. To evaluate the alternative management against barley powdery mildew fungus Blumeria graminis f. sp. hordei, the suppressing effects of UV-C irradiation on the developmental processes of conidia on artificial surfaces (in vitro) and on host leaf surfaces (in vivo) were assayed. In vitro and in vivo, a single dose of 100 J m-2 UV-C was adequate to decrease conidial germination to < 20 % and to reduce appressorium formation to values < 5 %. UV-C irradiation negatively affected colony pustule size and vegetative propagation. Under photoperiodic conditions of 2h light/16h dark, 6h dark/12h light or 6h dark/18h light, UV-C-treated conidia showed photoreactivation (photo-recovery). White light-mediated photoreactivation was most effective immediately after UV-C irradiation, suggesting that a prolonged phase of darkness after UV-C application increased the efficacy of management against B. graminis. UV-C irradiation increased transcript levels of three putative photolyase genes in B. graminis, indicating those were probably involved in photoreactivation processes. However, mere white light or blue light (wavelength peak, 475 nm) could not induce the up-regulation of these genes. To determine whether visible light directly impacted the prepenetration and penetration processes of this powdery mildew pathogen, conidia of Blumeria graminis f. sp. hordei and Blumeria graminis f. sp. tritici were inoculated onto artificial surfaces and on host leaf surfaces. Samples were analyzed after incubation periods under light conditions (white light intensity and spectral quality). Increasing white light intensities directly impaired conidial prepenetration processes in vitro but not in vivo. Applying an agar layer under the wax membrane compensated for conidial water loss as a consequence of high white light irradiation. Light stimulated in vitro and in vivo the appressorium elongation of B. graminis in a wavelength-dependent manner. Red light was more effective to trigger the elongation of appressorium than blue light or green light assayed. Taken together, the findings of this study demonstrate that 1) a host surface recognition principle based on cuticular very-long-chain aldehydes is a common feature of B. graminis f. sp. tritici ascospores and conidia; 2) the transcriptional changes of three putative photolyase genes in B. graminis are mediated in a UV-C-dependent manner; 3) light directly affected the (pre)penetration processes of B. graminis. N2 - Blumeria graminis, der obligate biotrophe Grasmehltau, ist ein hochpathogener Pilz, der in der Lage ist, Blätter zu schädigen und in Getreidekulturen schwere Ertragsverluste zu verursachen. Im Lebenszyklus von B. graminis kommen sowohl sexuelle als auch asexuelle Reproduktion vor. In den epidemiologischen Prozessen dieses Erregers sind beide Arten von Sporen - asexuelle Konidien und sexuelle Ascosporen - von entscheidender Bedeutung. Conidien von B. graminis reagieren nachweislich auf kutikuläre, sehr langkettige Aldehyde als molekulare Signalstoffe, die insbesondere die Keimung und Differenzierung der Infektionsstruktur (das Appressorium) - die Präpenetrationsprozesse - konzentrations- und kettenlängenabhängig fördern. Es ist bekannt, dass die Konidienkeimung und Appressoriumbildung durch die Anwesenheit von freiem Wasser auf der Wirtsoberfläche dramatisch behindert wird, während sexuell gebildete Ascosporen unter diesen Bedingungen keimen. Es gibt zahlreiche Untersuchungen zu Konidien-Präpenetrationsprozessen. Im Hinblick auf die stimulierende Wirkung von langkettigen Aldehyden und den Einfluss von freiem Wasser sind die askosporischen Präpenetrationsprozesse jedoch noch unklar. Um die Effekte langkettiger Aldehydmoleküle auf die ascosporischen Präpenetrationsprozesse von Weizenmehltaupilz zu untersuchen, wurde B. graminis f. sp. tritici auf Formvar®-basierten In-vitro-Systemen angewendet. Dadurch konnten sekundäre Wirtseffekte (wie Wirtsresistenz) ausgeschlossen und homogene hydrophobe Substratoberflächen reproduzierbar bereitgestellt werden. Die Anwesenheit geradzahliger sehr langkettiger Aldehyde (C22 – C30) erhöhte deutlich die Ausbilung des Appressoriums von Ascosporen. Von den getesteten Aldehyden zeigte n-Octacosanal (C28) die größte Induktionskraft. Im Gegensatz zu Konidien konnten bei Ascosporen auch unteri Anwesenheit von freiem Wasser variable Differenzierungsmuster festgestellt werden, bei denen auch einzelne Keimröhren zur Differenzierung des Appressoriums führten. Zur Bewertung der alternativen Bekämpfung gegen Gerstenmehltaupilz Blumeria graminis f. sp. hordei wurde die Unterdrückungswirkung von UV-C-Strahlung auf die Entwicklungsprozesse von Konidien auf künstlichen Oberflächen (in vitro) und auf Wirtsblattoberflächen (in vivo) untersucht. In vitro und in vivo war eine Einzeldosis von 100 J m-2 UV-C ausreichend, um die Konidienkeimung auf < 20 % zu verringern und die Appressoriumsbildung auf Werte < 5 % zu reduzieren. Die UV-C-Bestrahlung beeinflusste die Größe der Kolonepusteln und die vegetative Vermehrung negativ. UV-C behandelte Konidien wurden unterschiedlichen Lichtverhältnissen ausgesetzt: 2 h hell / 16 h dunkel, 6 h dunkel / 12 h hell und 6 h dunkel / 18 h hell. Dabei zeigten sie unterschiedliche Photoreaktivierungsaktivitäten. Die Weißlicht-vermittelte Photoreaktivierung war unmittelbar nach der UV-C-Behandlung am effektivsten, was darauf hindeutet, dass eine verlängerte Phase der Dunkelheit nach der UV-C-Anwendung die Wirksamkeit des Managements gegen B. graminis erhöhte. UV-C-Bestrahlung erhöhte die Transkriptmengen von drei mutmaßlichen Photolyase-Genen in B. graminis, was darauf hindeutet, dass sie wahrscheinlich an Photoreaktivierungsprozessen beteiligt waren. Weißes oder blaues Licht (Wellenlängen-Peak, 475 nm) konnte die Hochregulation dieser Gene nicht induzieren. Um zu bestimmen, ob sichtbares Licht direkt auf die Präpenetrations- und Penetrationsvorgänge dieses Mehltau-Erregers einwirkt, wurden Konidien von Blumeria graminis f. sp. hordei und Blumeria graminis f. sp. tritici auf künstliche Oberflächen und auf Wirtsblattoberflächen inokuliert. Die Proben wurden nach Inkubationunter verschiedenen Lichtbedingungen (Weißlichtintensität und Spektralqualität) analysiert. Das Auftragen einer Agarschicht unter der Wachsmembran kompensierte den Wasserverlust der Konidien als Folge der Bestrahlung mit hoher Lichtintensität. Zunehmende Weißlichtintensitäten beeinträchtigten Konidienpräpenetrationsprozesse direkt in vitro, aber nicht in vivo. Eine wellenlängenabhängige Stimulation der Verlängerung des Appressoriums konnte sowohl in vitro als auch in vivo beobachtet werden. Dabei war rotes Licht wirksamer, um die Verlängerung des Appressoriums auszulösen, als blaues oder grünes Licht. Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse dieser Studie, dass 1) ein Prinzip der Wirtsoberflächenerkennung basierend auf kutikulären, sehr langkettigen Aldehyden ein gemeinsames Merkmal von B. graminis f sp. tritici Ascosporen und Konidien ist; 2) die Transkriptionsänderungen von drei putativen Photolyase-Genen in B. graminis in einer UV-C-abhängigen Weise vermittelt werden und 3) Licht direkt die (Vor-) Penetrationsvorgänge von B. graminis beeinflusste. KW - Powdery mildew fungus KW - Germination and differentiation KW - Cuticle KW - Irradiation KW - Blumeria graminis KW - Bestrahlung Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-166470 ER - TY - THES A1 - Kreckel, Jennifer T1 - Das Adapterprotein TRAF2 und seine Bedeutung für die Todesrezeptor-vermittelte Signaltransduktion T1 - The adaptor protein TRAF2 and its meaning for the death receptor induced signal transduction N2 - Während die Rolle des tumor necrosis factor (TNF) receptor associated factor (TRAF)2 in der Signaltransduktion der TRAF-interagierenden Rezeptoren der TNF Receptor (TNFR)- Superfamily (TNFRSF) bereits in der Vergangenheit umfassend erforscht wurde, ist die Rolle und Funktion dieses Adapterproteins für die Signalgebung der Todesrezeptoren nicht vollständig aufgeklärt. Die unklare Funktion der Really Interesting New Gene (RING) E3 Ligase Domäne in TRAF2 und die Abhängigkeit von Caspasen für die Aktivierung des klassischen nuclear factor κB (NFκB)-Signalweges führten in dieser Arbeit zur Herstellung von CRISPR/Cas9 knockout (KO) Zellen, bei denen TRAF2 in der Kolorektalkarzinomzelllinie HCT116 als auch in den Fibrosarkomzellen HT1080 ausgeschaltet wurde. Diese Zellen wurden zuvor so modifiziert, dass die Apoptose „downstream“ der Caspase-8-Aktivierung nicht weiter induzierbar war. HCT116-Zellen exprimierten hierzu ein mutiertes Allel der Phosphoinositide 3-kinase (PI3K) und HT1080-Bcl2-TNFR2 Zellen das anti-apoptotische Protein B-cell lymphoma 2 (Bcl2). Im Fokus dieser Arbeit waren die Todesrezeptoren TNFR1, TNF-Related Apoptosis Inducing Receptor (TRAILR)1/2 und Cluster of Differentiation(CD)95. In den TRAF2-KO Zelllinien war der alternative NFκB Signalweg konstitutiv aktiv und der TNFR1-induzierte klassische NFκB-Signalweg inhibiert. Die proinflammatorische Signalgebung in Form der Interleukin (IL)8 Produktion war in den CD95-artigen Todesrezeptoren signifikant, aber nicht vollständig, reduziert und erfolgte Caspase-8-Aktivität unabhängig. Der Effekt der TRAF2-Deletion konnte durch eine Rekonstitution von TRAF2, jedoch nicht durch eine Überexpression von TRAF1 wiederhergestellt werden. Des Weiteren führte die TRAF2-Defizienz zu einer verstärkten Procaspase-8- Prozessierung nach Aktivierung von Todesrezeptoren, die überraschenderweise mit einer Reduktion der Caspase-8-Aktivität einherging. Die Prozessierung der Procaspase-8, jedoch nicht die Aktivierung des klassischen NFκB-Signalweges wurde vermutlich durch eine verringerte Rekrutierung von cellular inhibitor of apoptosis protein (cIAP)1 an den TNFR1 erreicht. Die Expression der anti-apoptotischen Proteine FADD-like ICE (FLICE) Inhibitory Protein (FLIP)Long(L), FLIPShort(S) und cIAP1 wurde nicht von der TRAF2-Depletion beeinflusst. Somit konnte in dieser Arbeit ein nicht-obligatorischer Effekt von TRAF2 auf die Regulation der proinflammatorischen Todesrezeptor-vermittelten Signaltransduktion nachgewiesen werden, die durch TRAF1 nicht ersetzt werden kann. Des Weiteren wurde eine bisher nicht beschriebene, stabilisierende Wirkung von TRAF2 auf die Capsase-8-Aktivität gezeigt. N2 - The role of tumor necrosis factor (TNF) receptor associated factor (TRAF)2 in signaltransduction of TRAF-interacting receptors of the TNF Receptor (TNFR)- Superfamily (TNFRSF) is well-studied during the last decades. The role and the function of this adapter protein for the signaling of death receptors, however, still remains largely unclear. Ambiguous E3 ligase function of their TRAF2-Really Interesting New Gene (RING) domain and the dependency from caspase-8 for classical nuclear factor κB (NFκB) activation resulted in this work in the generation of TRAF2-Knockout (KO) CRISPR/Cas9 cells both in the colorectal carcinoma cell line HCT116 and in the fibrosarcoma cell line HT1080. These cell lines were previously modified to gain apoptosis-resistance downstream the activation of caspase-8. Therefore, HCT116 cells expressed a mutated allele of the phosphoinositide-3-kinase (PI3K) and HT1080-TNFR2 cells expressed the anti-apoptotic protein B-cell lymphoma 2 (Bcl2). Focus of this study was the death receptors TNFR1, TNF-Related Apoptosis Inducing Receptor (TRAILR)1/2 and Cluster of Differentiation (CD)95. TRAF2-KO cells displayed a constitutive active alternative NFκB pathway and inhibition of the TNFR1-induced classical NFκB pathway. The stimulation of proinflammatory signaling in the form of upregulation of interleukin (IL)8 production was reduced partially but significantly in CD95-type death receptors and in a caspase-8-activity independent way. The reconstitution of TRAF2 but not an overexpression of TRAF1 was able to reverse the effects of TRAF2 deficiency. Additionally, the TRAF2-depletion increased DR-induced procaspase-8-processing, surprisingly resulting in the downregulation of caspase-8-activity. Processing of procaspase-8, but not the activation of the classical NFκB-pathway were presumably achieved by an inhibition of the recruitment of cellular inhibitor of apoptosis protein 1 (cIAP1) to the TNFR1. Expression of the anti-apoptotic proteins FLICE Inhibitory Protein (FLIP)Long(L), FLIPShort(S) and cIAP1 were unaffected by TRAF2-depletion. Taken together, this work was able to show a non-obligate effect of TRAF2 in the regulation of DR-induced proinflammatory signaling, which was not restorable by TRAF1. Furthermore, we saw a stabilizing effect of TRAF2 on caspase-8 activity, which was not described previously. KW - Adapterproteine KW - TRAF KW - Signaltransduktion KW - TRAF2 KW - Todesrezeptor Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-200384 ER - TY - THES A1 - Walper [geb. Schwarz], Elisabeth T1 - Identifizierung und Charakterisierung von Transkriptionsfaktoren in der pflanzlichen Antwort auf das Oxylipin 9-Hydroxyoktadekatriensäure (9-HOT) T1 - Identification and characterization of transcription factors in the plant signaling Response to the oxylipin 9-hydroxyoctadekatrienoic acid (9-HOT) N2 - Oxylipine werden in der Pflanze unter Stressbedingungen gebildet. Die dafür notwendige Oxidation von Fettsäuren wird entweder nicht-enzymatisch über Radikale wie reaktive Sauerstoffspezies (ROS) oder enzymatisch über Lipoxygenasen katalysiert. Abhängig von der Position der Oxidation in der Fettsäure entstehen dabei C13- oder C9-Oxylipine. Sehr gut erforscht sind C13-Oxylipine wie Jasmonsäure (JA), die bei biotischem Stress und Verwundung gebildet werden und bei exogener Gabe das Wurzelwachstum von Arabidopsis thaliana hemmen. Die C9-Oxylipine wie 9-Hydroxyoktadekatriensäure (9-HOT) sind erst wenig erforscht. Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung von Transkriptionsfaktoren, mit dem Fokus auf 9-HOT-vermittelte Signalwegen in Arabidopsis thaliana. Da bekannt ist, dass auch sie zu einer Hemmung des Wurzelwachstums führen, wurde dazu die Untersuchung des Wurzelwachstums von 10 Tage alten Keimlingen etabliert. Funktionsgewinn-Mutanten des Transkriptionsfaktors TGA5 sowie des TGA5-Zielgens CYTOCHROM P450 MONOOXYGENASE CYP81D11 zeigten auf 9-HOT ein verglichen mit Col-0 deutlich besseres Wurzelwachstum. Die AtTORF-Ex-Kollektion, eine große Sammlung an Überexpressions-Linien verschiedener Transkriptionsfaktoren, wurde hinsichtlich Wurzelwachstums auf dem Oxylipin 9-HOT analysiert. Die Gesamtheit der untersuchten Pflanzen enthielt 263 unabhängige TF-Expressions-Konstrukte. Von 6087 untersuchten Pflanzen zeigten 201 Pflanzen keine Hemmung des Wurzelwachstums auf 9-HOT. Dabei konnten 80 verschiedene Transkriptionsfaktoren identifiziert werden, deren Überexpression die Wurzelwachstums-hemmende Wirkung von 9-HOT kompensiert. Es zeigte sich eine Häufung von Transkriptionsfaktoren der ERF- (ethylene responsive factor) Familie. Die verstärkte Expression der nahe verwandten Transkriptionsfaktoren ERF106 und ERF107 ermöglichte sowohl auf 9-HOT als auch auf 9-KOT ein längeres Wurzelwachstum im Vergleich zum Wildtyp. Die Genexpression von ERF106 und ERF107 wird durch Überflutung aktiviert. Durch Überflutung wird im Wildtyp die Expression von Hypoxia-Antwort-Genen wie HRE1, SUS4 oder PDC1 induziert. In den Funktionsverlust-Mutanten sind diese Gene in der Expression aber nicht beeinflusst. Auch ist nach Überflutung im normalen Tag / Nacht-Rhythmus kein signifikanter Unterschied im Überleben zwischen Col-0 und den Mutanten erf106, erf107 und erf106xerf107 nachweisbar. Zur Identifikation möglicher Ziel-Gene von ERF106 und ERF107 wurden Transkriptom-Analysen durchgeführt. Die Funktionsverlust-Mutanten erf106, erf107 und erf106xerf107 zeigten weder im Grundzustand noch nach 4 Stunden Überflutung Veränderungen in den bekannten Hypoxia-Antwort-Genen. Die Funktionsgewinn-Mutanten von ERF106 und ERF107 zeigten in der Transkriptom-Analyse eine deutliche Aktivierung von Genen, die wichtig für Entgiftung und Stressabwehr sind. Ebenso wurden wichtige Biosynthese-Gene aus der Camalexin- und Glukosinolat-Synthese in den Funktionsgewinn-Mutanten verstärkt exprimiert. Des Weiteren konnte eine verringerte Expression von Genen beobachtet werden, die wichtig für die Regulation der Eisen-Aufnahme sind, darunter bHLH-Transkriptionsfaktoren, der Eisen-Transporter IRON REGULATED TRANSPORTER 1 (IRT1) und die Eisen-Reduktase FERRIC REDUCTION OXIDASE 2 (FRO2). Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit durch die Untersuchung der AtTORF-Ex-Kollektion mehrere TF identifiziert, die wichtige Abwehr-Gene gegen Stress- und Vergiftung sowie bedeutende Gene im Bereich der Biosynthese und Eisenaufnahme regulieren können, um so die Antwort auf C9-Oxylipine zu beeinflussen. N2 - Oxylipins are built under stress conditions. They are the results of fatty acids oxidation that occurs either non-enzymatically by the action of free radicals like reactive oxygen species (ROS) or enzymatically by lipoxygenases conversion. There are two kinds of oxylipins, C13- or C9-, according to the position of the oxidation on the fatty acid back bone. Whereas C13-oxlipins like jasmonic acid (JA) are well characterized, little is known about C9-oxylipins like 9-hydroxyoctadecatrienoic acid (9-HOT). Both of them are generated as consequence of biotic stress or wounding and a common phenotypical mark is their ability to inhibit root growth of Arabidopsis seedlings. Preliminary studies have demonstrated that overexpression of the transcription factor TGA5 or its target gene CYTOCHROM P450 MONOOXYGENASE CYP81D11 make the plants more resistant than wildtype Col-0 to oxylipins-driven root inhibition. The aim of the work presented in this thesis was to identify and characterize transcription factors involved in 9-HOT induced signaling. At the beginning, a screening aiming at the identification of transcription factors involved in the 9-HOT signaling was set up. The root growth of 10 day old seedlings from the AtTORF-Ex-collection grown on 9-HOT containing medium was analyzed. All analyzed plants harbor 263 independent TF expression constructs. Of 6087 analyzed plants 201 plants showed no inhibition of root growth on 9-HOT. Plant overexpressing 80 different transcription factors showed a long root-phenotype on 9-HOT containing medium, indicating that in this plants the 9-HOT activated signaling was impaired. Among them, ERF-transcription factor family was overrepresented. Overexpression of the closely related ERF106 and ERF107 enabled longer root growth compared to wild-type on 9-HOT as well as on 9-KOT. Analysis of the stimuli inducing the alteration of the expression of ERF106 and ERF107, identified submergence as one of the main one. Under hypoxic conditions in wildtype, the expression of hypoxia-response-genes like HRE1, SUS4 or PDC1 is induced. Expression levels of these genes are not affected in erf106, erf107 and erf106xerf107 loss-of-function mutants. Examination of the survival rate after submergence did not reveal significant differences between Col-0 and the loss-of-function-mutants erf106, erf107 und erf106xerf107, at least under normal day-night-rhythm. To identify target genes of ERF106 and ERF107, transcriptome analysis were performed. The loss-of-function-mutants erf106, erf107 and of their double mutant did not show any differences in the known hypoxia responses, neither in control nor 4 hours after submergence. The gain-of-function-mutants of ERF106 and ERF107 exhibit a distinct gene activation of genes important for detoxification and stress regulation and defense. Moreover, genes for camalexin and glucosinolate biosynthesis pathway were up-regulated in these gain-of-function mutants. Genes crucial for regulation of iron uptake like bHLH transcription factors, iron transporter IRON REGULATED TRANSPORTER 1 (IRT1) and iron reductase FERRIC REDUCTION OXIDASE 2 (FRO2), whereas, show a reduced expression in these mutants. The analysis of the AtTORF-Ex-collection revealed some interesting TFs that can regulate genes important for stress response and detoxification, and thereby influence the response to C9-oxylipins. KW - Oxylipine KW - 9-HOT KW - Transkriptionsfaktor KW - 9-Hydroxyoktadekatriensäure KW - AtTORF-Ex-Kollektion KW - Stress KW - Signalling Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-128047 ER - TY - THES A1 - Graus, Dorothea T1 - Auswirkungen einer V-PPase-Überexpression auf Nicotiana benthamiana Blattzellen und deren physiologische Bedeutung unter Salzbelastung T1 - The Effects of V-PPase overexpression on Nicotiana benthamiana leaf cells and their physiological significance under saline load N2 - Vakuoläre PPasen (V-PPase) in Landpflanzen dienen dem Transport von Protonen in die Vakuole und dem Aufbau eines elektrochemischen Gradienten, während sie gleichzeitig durch Hydrolyse eine Anreicherung des toxischen PPi im Cytosol verhindern. Zahlreiche Publikationen bewiesen bereits positive Effekte der stabilen V-PPase-Überexpression in Pflanzen. Unter anderem zeigte die Ackerschmalwand, Tabak, Reis und Tomate eine erhöhte Biomasse und gesteigerte Stresstoleranz auf Grund einer erhöhten stabilen V-PPase Ex-pression. Um die zugrundeliegenden Prozesse ohne potenzielle pleiotropische Effekte während der Pflanzenentwicklung zu analysieren, wurden in der vorliegenden Dissertation die physiologischen Auswirkungen einer transienten V-PPase-Überexpression in Nicotiona benthamiana Blättern und die Einflussnahme von NaCl quantitativ erfasst. Zu diesem Zweck wurden zwei endogene V-PPasen (NbVHP1 und NbVHP2) aus N. bentha-miana zunächst bioinformatisch und dann auf Transkriptionsebene mittels quantitativer Real-Time-PCR identifiziert. Die endogenen V-PPasen wurden mittels der Agrobakterien-Infiltrationstechnik transient in N. benthamiana Blättern und ihre vakuoläre Lokalisation mit Hilfe von Fluoreszenzmarkern bestätigt. Die Protonenpump-Funktion der überexprimierten NbVHPs konnte mit der Patch-Clamp-Technik anhand des vier-fach erhöhten Protonenpump-stroms in den isolierten Mesophyllvakuolen verifiziert werden. Im Zuge der elektro-physiologischen Charakterisierung der endogenen N. benthamiana V-PPasen konnte die für V-PPasen typische Sensitivität gegenüber cytosolischem Calcium bestätigt werden, welche sich bei einem erhöhten Calcium-Spiegel in einer Hemmung der Pumpströme äußerte. Ferner wurde ihre gleichartige Substrataffinität (Km von 65 µM PPi) unabhängig des vakuolären pHs zwischen 5,5 und 7,5 festgestellt. Der Vergleich dieser Ergebnisse mit analog durchgeführten Messungen an der bereits publizierten AtVHP1 von A. thaliana bestätigte die große Homo-logie der V-PPasen von Landpflanzen. Im Gegensatz zu den erwünschten Auswirkungen der stabilen V-PPase Überexpression resultierte diese starke transiente Überexpression nach drei Tagen im Absterben makroskopischer Blattbereiche. Das Ausmaß dieser Nekrosen wurde anhand des vorhandenen PhotosystemII in den transformierten Blättern mit der Puls-Amplituden-Modulations-Technik quantifiziert. Die analoge transiente Überexpression einer löslichen PPase (IPP1) führte allerdings zu keinerlei negativen Effekten für die Pflanze, wodurch die erhöhte Protonentransportaktivität im Gegensatz zur Hydrolyseaktivität der V-PPasen als Ursache des Zellsterbens verifiziert werden konnte. Aufgrund dieser unerwarteten negativen Auswirkungen der transienten V-PPase-Überex-pression auf die Blattvitalität wurde zusätzlich die Salzstresstoleranz der Blätter untersucht. Unter Berücksichtigung des kurzen Transformations- und damit Beobachtungszeitfensters wurde ein Salzapplikationsverfahren etabliert, bei dem simultan mit der Agrobakterien-infiltration 200 mM NaCl direkt in den Blattapoplasten eingeführt wurde. Anhand einer Zu-nahme in sowohl der Transskriptmenge der V-PPase als auch des PPi-induzierten Protonen-pumptransportes über den Tonoplasten wurde gezeigt, dass die NaCl-Anwesenheit im Blatt eine erhöhte Aktivität der endogenen V-PPasen des N. benthaminan Pflanzen bewirkte. Der gleichzeitige tendenzielle Rückgang der V-ATPase-Pumpaktivität in salzbehandelten Mesophyllvakuolen lässt vermuten, dass die V-PPasen eine größere Rolle bei der Bewahrung des vakuolären pH-Wertes und der protonenmotorische Kraft (PMF) unter Salzstress ein-nimmt. Interessanterweise führte die Salzapplikation bei einer V-PPase-Überexpression zu keinen additiven negativen Effekten, sondern verhinderte sogar das Auftreten der Nekrosen. Um dieses Phänomen zu ergründen, wurde zunächst mit Hilfe von Apoplastenwaschungen und Natrium-Konzentrationsmessungen bestätigt, dass das injizierte NaCl im Blatt verblieb und von den Blattzellen aufgenommen wurde. Für weitere Studien der Ursachen der Nekrosen wurden in-vivo-pH-, Membranpotenzial- und Metabolitmessungen durchgeführt. Während in V-PPase-überexprimierenden Zellen der vakuoläre pH-Wert zu Kontrollvakuolen signifikant sank, blieb er mit zusätzlicher Salzbehandlung auf Kontrollniveau. Des Weiteren schwächte die Salzapplikation die starke Depolarisation der Plasmamembran nach V-PPase-Über-expression um mehr als die Hälfte ab. Hingegen konnten keine nennenswerten Ver-änderungen im Metabolit- und Ionengehalt des Blattgewebes bei V-PPase-Überexpression festgestellt werden. Lediglich der Natrium- und Chlorid-Spiegel waren bei salz-behandelten Blättern erwartungsgemäß erhöht. Diese Ergebnisse bekräftigten, dass der stark erhöhte V-PPase-vermittelte Protonenpumpstrom und weniger metabolische Veränderungen für die Nekrosen von V-PPase-überexprimierte Pflanzen verantwortlich ist. Diese negativen Auswirkungen werden offensichtlich durch die Salzbehandlung stark vermindert, da die Aufnahme der Salz-ionen über Protonen-Na+/K+-Antiporter wie NHX antagonistisch auf die V-PPase verursachte Protonenanreicherung und die daraus folgende Veränderung des Membran-potentials und der PMF entgegenwirkt. In diese Arbeit wurde in einem neuen Blickwinkel deutlich, dass die natürliche Expressions-kontrolle der V-PPase in ausdifferenzierten Pflanzenzellen sich den Umweltbedingungen anpasst, um das Gleich-gewicht zwischen den positiven und negativen Auswirkungen der Pumpaktivität zu halten. N2 - The plant vacuolar PPases (V-PPase) transport protons across the tonoplast from the cytosol into the vacuole. This establishes a trans-tonoplast electrochemical gradient and prevents the accumulation of toxic PPi in the cytosol. Many publications have already shown positive effects of stable V-PPase overexpression in plants. Arabidopsis, tobacco, rice and tomato for example, all showed increased biomass and greater stress tolerance with stable V-PPase overexpression. To understand the underlying processes without potential pleiotropic effects during plant development, we characterised V-PPase in Nicotiana benthamiana leaves using an electrophysiological approach, and investigated its physiology in overexpressing plants, concentrating on its regulation by NaCl. Two endogenous V-PPases (NbVHP1 and NbVHP2) from N. benthamiana were identified using bioinformatics and quantified with real-time PCR. Endogenous V-PPases were transiently overexpressed using Agrobacteria in N. benthamiana leaves, with their vacuolar localisation confirmed by fluorescence labelling. The proton pump activity of the NbVHPs was verified by a fourfold increase in the patch clamp-recorded proton current response of isolated mesophyll vacuoles. For the electrophysiological characterisation of the endogenous V-PPases, the V-PPase-typical cytosolic calcium sensitivity was confirmed; the proton pump became inhibited with increased calcium levels. Furthermore, their similar substrate affinity, a Km of 65 μM PPi, was found to be independent of the vacuolar pH between 5.5 and 7.5. Both attributes were comparable to the already published AtVHP1 of Arabidopsis thaliana, showing a high homology of plant V-PPases. The physiological effects of V-PPase overexpression was obvious from the time-delayed death of transformed cells. In contrast to the desired effects of stable V-PPase over-expression, this strong transient overexpression resulted in macroscopic dead leaf areas after three days. The extent of these necroses was quantified by counting the existing photosystems in the transformed leaves using the pulse-amplitude modulation technique (PAM). In contrast, no necrosis was found in plants where a soluble PPase (IPP1) was over-expressed. This supports the hypothesis that the increased proton transport activity of V-PPases, not the hydrolysis activity, is the cause of cell death. Because of these unexpected negative effects of transient V-PPase over-expression on leaf vitality, the salt stress tolerance of the leaves was also examined. The short transformation and observation time window meant we needed to establish a new way of salt application; we injected 200 mM NaCl directly into the leaf apoplast simultaneously with the agrobacterial material. Absorption of NaCl by leaf cells was confirmed by apoplast washing and sodium concentration measurements. The NaCl treatment increased the amount of transcripts of endogenous V-PPases in tobacco and increased the PPi-induced proton transport across the vacuolar membrane. The concomitant decline in V-ATPase pumping activity in saline-treated mesophyll vacuoles indicates that V-PPases have a significant role in maintaining the vacuolar pH and proton motive force (PMF) under saline conditions. Interestingly, simultaneous salt administration with V-PPase overexpression did not result in an additive negative effect but did prevent the occurrence of necrotic leaf areas. For further analysis of the necrosis, in vivo pH, membrane potential and metabolite measurements were performed. Under V-PPasen over-expression and salt treatment, the vacuolar pH remained constant and did not decrease as it did in non-salt-treated V-PPase over-expressing cells. Furthermore, the salt application attenuated the strong depolarisation of the plasma membrane by more than a half in V-PPase overexpressing plants, but no noteworthy changes in cell metabolism could be detected by metabolite and ion concentration measurements. Only the Na+ and Cl- levels were, as expected, increased in salt-treated leaves. This decrease in vacuolar pH alongside a membrane depolarisation confirms that the strong proton pump current of the V-PPase overexpressing vacuoles is the cause of the observed necrosis. These negative effects are obviously greatly reduced by salt treatment, since the uptake of the salt ions via proton:Na+/K+ antiporters such as NHX acts as an antagonist to V-PPase-induced proton accumulation in the vacuole and the consequent change in membrane potential and PMF. This work reveals in a new perspective, that the natural expression control of V-PPase in differentiated plant cells adapts to environmental conditions to balance the positive and negative effects of pumping activity. KW - Pyrophosphatase KW - Vakuole KW - Nicotiana benthamiana KW - Membrantransport KW - Salzstress KW - transiente Transformation Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-193676 ER - TY - THES A1 - Fröschel, Christian T1 - Genomweite Analyse der zellschichtspezifischen Expression in der Arabidopsis-Wurzel nach Inokulation mit pathogenen und mutualistischen Mikroorganismen T1 - Genome-wide analysis of cell-type specific expressed genes in the Arabidopsis-root after inoculation with pathogenic and mutualistic microorganisms N2 - Obwohl Pflanzenwurzeln mit einer Vielzahl von Pathogenen in Kontakt kommen, sind induzierbare Abwehrreaktionen der Wurzel bisher kaum beschrieben. Aufgrund der konzentrischen Zellschicht-Organisation der Wurzel wird angenommen, dass bei einer Immunantwort in jeder Zellschicht ein spezifisches genetisches Programm aktiviert wird. Eine Überprüfung dieser Hypothese war bisher wegen methodischen Limitierungen nicht möglich. Die zellschichtspezifische Expression Epitop-markierter ribosomaler Proteine erlaubt eine Affinitätsaufreinigung von Ribosomen und der assoziierten mRNA. Diese Methodik, als TRAP (Translating Ribosome Affinity Purification) bezeichnet, ermöglicht die Analyse des Translatoms und wurde dahingehend optimiert, pflanzliche Antworten auf Befall durch bodenbürtige Mikroorganismen in Rhizodermis, Cortex, Endodermis sowie Zentralzylinder spezifisch zu lokalisieren. Die Genexpression in der Arabidopsis-Wurzel nach Inokulation mit drei Bodenorganismen mit unterschiedlichen Lebensweisen wurde vergleichend betrachtet: Piriformospora indica kann als mutualistischer Pilz pflanzliches Wachstum und Erträge positiv beeinflussen, wohingegen der vaskuläre Pilz Verticillium longisporum für erhebliche Verluste im Rapsanbau verantwortlich ist und der hemibiotrophe Oomycet Phytophthora parasitica ein breites Spektrum an Kulturpflanzen befällt und Ernten zerstört. Für die Interaktionsstudien zwischen Arabidopsis und den Mikroorganismen während ihrer biotrophen Lebensphase wurden sterile in vitro-Infektionssysteme etabliert und mittels TRAP und anschließender RNA-Sequenzierung eine zellschichtspezifische, genomweite Translatomanalyse durchgeführt (Inf-TRAP-Seq). Dabei zeigten sich massive Unterschiede in der differentiellen Genexpression zwischen den Zellschichten, was die Hypothese der zellschichtspezifischen Antworten unterstützt. Die Antworten nach Inokulation mit pathogenen bzw. mutualistischen Mikroorganismen unterschieden sich ebenfalls deutlich, was durch die ungleichen Lebensweisen begründbar ist. Durch die Inf-TRAP-Seq Methodik konnte z.B. im Zentralzylinder der Pathogen-infizierten Wurzeln eine expressionelle Repression von positiven Regulatoren des Zellzyklus nachgewiesen werden, dagegen in den mit P. indica besiedelten Wurzeln nicht. Dies korrelierte mit einer Pathogen-induzierten Inhibition des Wurzelwachstums, welche nicht nach Inokulation mit P. indica zu beobachten war. Obwohl keines der drei Mikroorganismen in der Lage ist, den Zentralzylinder direkt zu penetrieren, konnte hier eine differentielle Genexpression detektiert werden. Demzufolge ist ein Signalaustausch zu postulieren, über den äußere und innere Zellschichten miteinander kommunizieren. In der Endodermis konnten Genexpressionsmuster identifiziert werden, die zu einer Verstärkung der Barriere-Funktionen dieser Zellschicht führen. So könnte etwa durch Lignifizierungsprozesse die Ausbreitung der Mikroorganismen begrenzt werden. Alle drei Mikroorganismen lösten besonders im Cortex die Induktion von Genen für die Biosynthese Trp-abhängiger, antimikrobieller Sekundärmetaboliten aus. Die biologische Relevanz dieser Verteilungen kann nun geklärt werden. Zusammenfassend konnten in dieser Dissertation erstmals die durch Mikroorganismen hervorgerufenen zellschichtspezifischen Antworten der pflanzlichen Wurzel aufgelöst werden. Vergleichende bioinformatische Analyse dieses umfangreichen Datensatzes ermöglicht nun, gezielt testbare Hypothesen zu generieren. Ein Verständnis der zellschichtspezifischen Abwehrmaßnahmen der Wurzel ist essentiell für die Entwicklung neuer Strategien zur Ertragssteigerung und zum Schutz von Nutzpflanzen gegen Pathogene in der Landwirtschaft. N2 - Although plant roots are surrounded by a plethora of microorganisms, their interactions are poorly characterized on a molecular level. Due to the concentric organization of the root cell-layers, it is anticipated that these layers contribute to pathogen defense by providing specific genetically defined programs, which build up barriers to restrict infection. Because of methodical limitations, this theory was not confirmed, yet. Immunoprecipitation of cell-layer specific expressed epitope-tagged ribosomes allows an isolation of ribosome/mRNA complexes that subsequently can be analyzed. This approach is called “Translating Ribosome Affinity Purification” (TRAP). It was optimized to identify cell-layer specific induced defenses and to be combined with a system to inoculate plant roots directly with soil-born microorganisms. Hence, this method enables molecular dissection of infected Arabidopsis-roots to unravel expression patterns found in rhizodermis, cortex, endodermis and central cylinder, respectively. Comparative studies were performed with three species of microorganisms having different life-styles: On the one hand the beneficial fungus Piriformospora indica, that can promote plant growth and crop yield and on the other hand two pathogens with the vascular fungus Verticillium longisporum, causing damage in oilseed rape production and the hemibiotrophic Oomycet Phytophthora parasitica, which causes plant damage on many crop plants. After performing TRAP with infected roots, the cell-type specific mRNA was analyzed via RNA-Sequencing resulting in a genome-wide impression of differentially expressed genes (Inf-TRAP-Seq). Massive differences occurred among the cell-layers approving the theory of cell-type specific immune responses. Moreover the defense responses varied according to inoculation with pathogenic or beneficial microorganisms probably due to their life-style. For example by using the newly established Inf-TRAP-Seq approach it was shown that positive regulators of cell proliferation were expressionally repressed in central cylinder of pathogen-infected roots but not in P. indica colonized roots. This correlates with the observation that root growth is suppressed after inoculation with pathogens but not after inoculation with P. indica. Although none of the three microorganisms is able to penetrate the central cylinder, differentially expressed genes were detected in this layer suggesting an exchange of signals to enable communication between inner and outer layers. Expression patterns were identified in the endodermis, that could lead to reinforcement of barrier functions of this cell-layer for example by lignification-processes. By this means the propagation of the microorganisms is restricted. All three microorganisms elicited induction of genes involved in biosynthesis of Trp-derived secondary metabolites, especially in the cortex. Now the biological relevance of these distributions can be investigated additionally. Hence, within this thesis for the first time a cell-type specific resolution was obtained regarding defense responses in the Arabidopsis-root triggered by microorganisms. A huge dataset was generated. This can be analyzed extensively by bioinformatics and its applications to set up new hypotheses, which can be tested by further approaches. An understanding of cell-type defined root defense responses is essential to facilitate new strategies for protecting crop plants against pathogens and to increase crop yield in agriculture. KW - Schmalwand KW - Wurzel KW - Phytophthora KW - Piriformospora indica KW - Verticillium KW - Wurzelzellschichten KW - Zellschichtspezifische Expression KW - Zentralzylinder KW - Cortex KW - Rhizodermis KW - Endodermis KW - cell-type specific KW - Inf-TRAP-Seq Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-146439 ER - TY - THES A1 - Glenz, René T1 - Die Rolle von Sphingobasen in der pflanzlichen Zelltodreaktion T1 - The role of sphingobases in plant cell death reaction N2 - Sphingobasen bilden das Grundgerüst und die Ausgangsbausteine für die Biosynthese von Sphingolipiden. Während komplexere Sphingolipide einen wichtigen Bestandteil von eukaryotischen Membranen bilden, sind Sphingobasen, die auch als long-chain bases (LCBs) bezeichnet werden, als Signalmoleküle bei zellulären Prozessen in Eukaryoten bekannt. Im tierischen System wurden antagonistische Effekte von nicht-phosphorylierten Sphingobasen (LCBs) und ihren phosphorylierten Gegenstücken (LCB-Ps) bei vielen Zellfunktionen, insbesondere der Apoptose, nachgewiesen und die zugrundeliegenden Signalwege umfassend aufgeklärt. Im Gegensatz dazu sind in Pflanzen weniger Belege für einen antagonistischen Effekt und mögliche Signaltransduktionsmechanismen bekannt. Für eine regulatorische Funktion von Sphingobasen beim programmierten Zelltod (PCD) in Pflanzen existieren mehrere Hinweise: (I) Mutationen in Genen, die den Sphingobasen-Metabolismus betreffen, führen zum Teil zu spontanem PCD und veränderten Zelltodreaktionen. (II) Die Gehalte von LCBs sind bei verschiedenen Zelltod-auslösenden Bedingungen erhöht. (III) Nekrotrophe Pathogene produzieren Toxine, wie Fumonisin B1 (FB1), die mit dem Sphingolipid-Metabolismus der Wirtspflanze interferieren, was wiederum die Ursache für den dadurch ausgelösten PCD darstellt. (IV) Die Behandlung von Pflanzen mit LCBs, nicht aber mit LCB-Ps, führt zu Zelltod. In dieser Arbeit wurde die Rolle von Sphingobasen in der pflanzlichen Zelltodreaktion untersucht, wobei der Fokus auf der Überprüfung der Hypothese eines antagonistischen, Zelltod-hemmenden Effekts von LCB-Ps lag. Anhand von Leitfähigkeit-basierten Messungen bei Blattscheiben von Arabidopsis thaliana wurde der durch Behandlung mit LCBs und separater oder gleichzeitiger Zugabe von LCB-Ps auftretende Zelltod bestimmt. Mit dieser Art der Quantifizierung wurde der an anderer Stelle publizierte inhibierende Effekt von LCB-Ps auf den LCB-induzierten Zelltod nachgewiesen. Durch parallele Messung der Spiegel der applizierten Sphingobasen im Gewebe mittels HPLC-MS/MS konnte dieser Antagonismus allerdings auf eine reduzierte Aufnahme der LCB bei Anwesenheit der LCB-P zurückgeführt werden, was auch durch eine zeitlich getrennte Behandlung mit den Sphingobasen bestätigt wurde. Darüber hinaus wurde der Einfluss einer exogenen Zugabe von LCBs und LCB-Ps auf den durch Pseudomonas syringae induzierten Zelltod von A. thaliana untersucht. Für LCB-Ps wurde dabei kein Zelltod-hemmender Effekt beobachtet, ebenso wenig wie ein Einfluss von LCB-Ps auf den PCD, der durch rekombinante Expression und Erkennung eines Avirulenzproteins in Arabidopsis ausgelöst wurde. Für LCBs wurde dagegen eine direkte antibakterielle Wirkung im Zuge der Experimente mit P. syringae gezeigt, die den in einer anderen Publikation beschriebenen inhibierenden Effekt von LCBs auf den Pathogen-induzierten Zelltod in Pflanzen relativiert. In weiteren Ansätzen wurden Arabidopsis-Mutanten von Enzymen des Sphingobasen-Metabolismus (LCB-Kinase, LCB-P-Phosphatase, LCB-P-Lyase) hinsichtlich veränderter in-situ-Spiegel von LCBs/LCB-Ps funktionell charakterisiert. Der Phänotyp der Mutanten gegenüber Fumonisin B1 wurde zum einen anhand eines Wachstumstests mit Keimlingen und zum anderen anhand des Zelltods von Blattscheiben bestimmt und die dabei akkumulierenden Sphingobasen quantifiziert. Die Sensitivität der verschiedenen Linien gegenüber FB1 korrelierte eng mit den Spiegeln der LCBs, während hohe Gehalte von LCB-Ps alleine nicht in der Lage waren den Zelltod zu verringern. In einzelnen Mutanten konnte sogar eine Korrelation von stark erhöhten LCB-P-Spiegeln mit einer besonderen Sensitivität gegenüber FB1 festgestellt werden. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit stellen die Hypothese eines antagonistischen Effekts von phosphorylierten Sphingobasen beim pflanzlichen Zelltod in Frage. Stattdessen konnte in detaillierten Analysen der Sphingobasen-Spiegel die positive Korrelation der Gehalte von LCBs mit dem Zelltod gezeigt werden. Die hier durchgeführten Experimente liefern damit nicht nur weitere Belege für die Zelltod-fördernde Wirkung von nicht-phosphorylierten Sphingobasen, sondern tragen zum Verständnis der Sphingobasen-Homöostase und des Sphingobasen-induzierten PCD in Pflanzen bei. N2 - Sphingobases are the building blocks for the biosynthesis of sphingolipids. While complex sphingolipids form a major part of eukaryotic membranes, sphingobases, which are also called long-chain bases (LCBs), are well-known signaling molecules of cellular processes in eukaryotes. In the animal system, antagonistic effects of nonphosphorylated sphingobases (LCBs) and their phosphorylated counterparts (LCB-Ps) have been reported in many cell functions, with a particular focus on apoptosis, and the underlying signaling pathways have been elucidated in detail. In contrast, few records of an antagonistic effect and the potential signal transduction mechanisms have been established in plants. Several lines of evidence point to a regulatory function of sphingobases in plant programmed cell death (PCD): (i) Mutations in genes related to sphingobase metabolism may cause spontaneous PCD and altered cell death reactions. (ii) Levels of LCBs are increased under different cell death conditions. (iii) Necrotrophic pathogens produce toxins, like fumonisin B1 (FB1), interfering with sphingolipid metabolism of the host plant and, thus, causing PCD. (iv) Treatment of plants with LCBs, but not LCB-Ps, induces cell death. In the present study the role of sphingobases in plant cell death reactions, with a focus on the examination of the hypothesis of an antagonistic cell death-inhibitory effect of LCB-Ps, has been investigated. Using conductivity-based measurements of Arabidopsis thaliana leaf discs, cell death induced by treatment with LCBs and separated or combined feeding of LCB-Ps was determined. That kind of quantification allowed the verification of an inhibitory effect of LCB-Ps on LCB-induced cell death, which was published elsewhere. However, by simultaneous measurement of the applied sphingobase levels in the tissue with HPLC-MS/MS, this antagonism could be explained by a reduced uptake of the LCB in the presence of the LCB-P, which was also confirmed by a separated treatment with the sphingobases. In addition to that an impact of exogenous applied LCBs and LCB-Ps on cell death in A. thaliana induced by Pseudomonas syringae has been investigated. For LCB-Ps no cell death inhibitory effect was observed. Similarly, there was no impact for LCB-Ps on the cell death induced by recombinant expression of an avirulence protein in Arabidopsis. For LCBs, a direct antibacterial effect against P. syringae was shown in this work. This puts previous findings of an inhibitory effect of LCBs on pathogen-induced cell death in plants into a new perspective. In further approaches, Arabidopsis mutants of enzymes of the sphingobase metabolism (LCB kinase, LCB-P phosphatase, LCB-P lyase) were functionally characterized with regard to altered in situ levels of LCBs/LCB-Ps. The phenotype of the mutants in response to fumonisin B1 was determined in a growth assay with seedlings, and by cell death measurements in leaf discs, which were accompanied by quantification of sphingobase levels. The sensitivity of different lines to FB1 was closely correlated with the levels of LCBs, while high contents of LCB-Ps alone were not able to reduce cell death. Some mutants even showed a correlation of highly enhanced LCB-P levels with a pronounced sensitivity to FB1. The results of the present study challenge the hypothesis of an antagonistic effect of phosphorylated sphingobases on plant cell death. Instead, a detailed analysis of sphingobase levels revealed a positive correlation of LCB contents with cell death. The conducted experiments not only provide further evidence for a cell death-promoting effect of nonphosphorylated sphingobases, but also contribute to the comprehension of sphingobase homeostasis, as well as of the sphingobase-induced PCD in plants. KW - Sphingolipide KW - Phytosphingosine KW - Ackerschmalwand KW - Pseudomonas syringae KW - Zelltod KW - Sphingobasen (LCB, LCB-P) KW - Ackerschmalwand KW - programmierter Zelltod KW - Sphingobases KW - Arabidopsis KW - programmed cell death Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-187903 ER - TY - THES A1 - Tian, Yuehui T1 - Characterization of novel rhodopsins with light-regulated cGMP production or cGMP degradation T1 - Charakterisierung neuartiger Rhodopsine mit Licht-regulierter cGMP-Produktion oder cGMP-Degradation N2 - Photoreceptors are widely occurring in almost all kingdoms of life. They mediate the first step in sensing electromagnetic radiation of different wavelength. Absorption spectra are found within the strongest radiation from the sun and absorption usually triggers downstream signaling pathways. Until now, mainly 6 classes of representative photoreceptors are known: five water-soluble proteins, of these three classes of blue light-sensitive proteins including LOV (light-oxygen-voltage), BLUF (blue-light using FAD), and cryptochrome modules with flavin (vitamin B-related) nucleotides as chromophore; while two classes of yellow and red light-sensitive proteins consist of xanthopsin and phytochrome, respectively. Lastly, as uniquely integral membrane proteins, the class of rhodopsins can usually sense over a wide absorption spectrum, ranging from ultra-violet to green and even red light. Rhodopsins can be further divided into two types, i.e., microbial (type I) and animal (type II) rhodopsins. Rhodopsins consist of the protein opsin and the covalently bound chromophore retinal (vitamin A aldehyde). In this thesis, I focus on identification and characterization of novel type I opsins with guanylyl cyclase activity from green algae and a phosphodiesterase opsin from the protist Salpingoeca rosetta. Until 2014, all known type I and II rhodopsins showed a typical structure with seven transmembrane helices (7TM), an extracellular N-terminus and a cytosolic C-terminus. The proven function of the experimentally characterized type I rhodopsins was membrane transport of ions or the coupling to a transducer which enables phototaxis via a signaling chain. A completely new class of type I rhodopsins with enzymatic activity was identified in 2014. A light-activated guanylyl cyclase opsin was discovered in the fungus Blastocladiella emersonii which was named Cyclop (Cyclase opsin) by Gao et al. (2015), after heterologous expression and rigorous in-vitro characterization. BeCyclop is the first opsin for which an 8 transmembrane helices (8TM) structure was demonstrated by Gao et al. (2015). Earlier (2004), a novel class of enzymatic rhodopsins was predicted to exist in C. reinhardtii by expressed sequence tag (EST) and genome data, however, no functional data were provided up to now. The hypothetical rhodopsin included an N-terminal opsin domain, a fused two-component system with histidinekinase and response regulator domain, and a C-terminal guanylyl cyclase (GC) domain. This suggested that there could be a biochemical signaling cascade, integrating light-induction and ATP-dependent phosphate transfer, and as output the light-sensitive cGMP production. One of my projects focused on characterizing two such opsins from the green algae Chlamydomonas reinhardtii and Volvox carteri which we then named 2c-Cyclop (two-component Cyclase opsin), Cr2c-Cyclop and Vc2c-Cyclop, respectively. My results show that both 2c-Cyclops are light-inhibited GCs. Interestingly, Cr2c-Cyclop and Vc2c-Cyclop are very sensitive to light and ATP-dependent, whereby the action spectra of Cr2c-Cyclop and Vc2c-Cyclop peak at ~540 nm and ~560 nm, respectively. More importantly, guanylyl cyclase activity is dependent on continuous phosphate transfer between histidine kinase and response regulator. However, green light can dramatically block phosphoryl group transfer and inhibit cyclase activity. Accordingly, mutation of the retinal-binding lysine in the opsin domain resulted in GC activity and lacking light-inhibition. A novel rhodopsin phosphodiesterase from the protist Salpingoeca rosetta (SrRhoPDE) was discovered in 2017. However, the previous two studies of 2017 claimed a very weak or absent light-regulation. Here I give strong evidence for light-regulation by studying the activity of SrRhoPDE, expressed in Xenopus laevis oocytes, in-vitro at different cGMP concentrations. Surprisingly, hydrolysis of cGMP shows a ~100-fold higher turnover than that of cAMP. Light can enhance substrate affinity by decreasing the Km value for cGMP from 80 μM to 13 μM, but increases the maximum turnover only by ~30%. In addition, two key single mutants, SrRhoPDE K296A or K296M, can abolish the light-activation effect by interrupting a covalent bond of Schiff base type to the chromophore retinal. I also demonstrate that SrRhoPDE shows cytosolic N- and C- termini, most likely via an 8-TM structure. In the future, SrRhoPDE can be a potentially useful optogenetic tool for light-regulation of cGMP concentration, possibly after further improvements by genetic engineering. N2 - Photorezeptoren sind in fast allen Lebewesen vorzufinden. Sie vermitteln den ersten Schritt bei der Detektion von elektromagnetischer Strahlung unterschiedlicher Wellenlänge. Ihre Absorptionsspektren finden sich innerhalb des Bereichs der stärksten Sonnenstrahlung (UV bis nahes IR) und die Absorption löst normalerweise nachgelagerte Signalwege aus. Bis jetzt sind hauptsächlich 6 Klassen von Photorezeptoren bekannt: als wasserlösliche Proteine zunächst drei Klassen von Blaulicht-empfindlichen Modulen, die LOV-Domäne (Light/Oxygen/Voltage), die BLUF-Domäne (Blue Light sensing, Using FAD) und Cryptochrom mit Flavinen (Vitamin B-Komplex) als Chromophor, sowie Xanthopsine, die hauptsächlich für gelbes Licht und Phytochrome, die für Rotlicht empfindlich sind. Als integrale Membranproteine kann die Klasse der Rhodopsine jedoch ein breiteres Absorptionsspektrum aufweisen, je nach Rhodopsin empfindlich für UV/blaues, grünes oder sogar rotes Licht. Rhodopsine bestehen aus dem Protein Opsin und dem kovalent gebundenen Chromophor Retinal (Vitamin A-Aldehyd). Sie können weiter in zwei Typen unterteilt werden, mikrobielle (Typ I) und tierische (Typ II) Rhodopsine. In dieser Dissertation konzentriere ich mich auf die Identifizierung und Charakterisierung von neuen Typ I Opsinen mit Guanylylcyclase-Aktivität aus Grünalgen und einem Phosphodiesterase-Opsin aus dem Protisten Salpingoeca rosetta. Bis 2014 wiesen alle bekannten Rhodopsine eine typische Struktur mit sieben Transmembranhelices (7TM), einem extrazellulären N-Terminus und einem zytosolischen C- Terminus auf. Die nachgewiesene Funktion der experimentell charakterisierten Rhodopsine vom Typ I ist der Membrantransport von Ionen oder die Kopplung an einen Transducer, der die Phototaxis über eine Signalkette ermöglicht. Eine völlig neue Klasse von Typ-I Rhodopsinen mit enzymatischer Aktivität wurde 2014 gefunden. Ein lichtaktiviertes Guanylyl-Cyclase- Opsin wurde im Pilz Blastocladiella emersonii (Be) entdeckt, das von Gao et al. (2015) nach heterologer Expression und gründlicher in-vitro-Charakterisierung Cyclop (Cyclase opsin) genannt wurde. BeCyclop ist das erste Opsin, für das eine Struktur mit 8 Transmembranhelices (8TM) demonstriert wurde (Gao et al., 2015). Bereits früher (2004) wurde durch expressed sequence tag (EST) und Genom-Daten vorhergesagt, dass eine neue Klasse von enzymatischen Rhodopsinen in Chlamydomonas reinhardtii existiert, jedoch gelang bisher keine funktionelle Expression. Eines dieser hypothetischen Rhodopsine umfasste eine N-terminale Opsin- Domäne, ein fusioniertes Zweikomponentensystem mit Histidinkinase- und Regulator-Domäne und eine C-terminale Guanylylcyclase (GC). Dies legte nahe, dass das Protein eine biochemische Signalkaskade inkorporieren könnte, die Licht-Absorption und ATP-abhängigen Phosphattransfer integriert und eine lichtempfindliche cGMP-Produktion bewirkt. Eines meiner Projekte konzentrierte sich auf die Charakterisierung von zwei solchen Opsinen aus den Grünalgen C. reinhardtii und Volvox carteri, die wir nun 2c-Cyclop (Zweikomponenten-Cyclase-Opsin), d.h. Cr2c-Cyclop und Vc2c-Cyclop, nennen. Meine Ergebnisse zeigen, dass beide 2c-Cyclops durch Licht gehemmte GCs sind. Interessanterweise sind Cr2c-Cyclop und Vc2c-Cyclop sehr empfindlich gegenüber Licht und die cGMP- Produktion ist ATP-abhängig, wobei die Wirkungsspektren von Cr2c-Cyclop und Vc2c-Cyclop bei ~540 nm bzw. ~560 nm ihren Höhepunkt erreichen. Ich konnte zeigen, dass die Guanylyl- Cyclase-Aktivität von einem kontinuierlichen Phosphat-Transfer zwischen Histidinkinase und Response-Regulator abhängt. Grünes Licht kann jedoch den Phosphoryl-Gruppen-Transfer dramatisch blockieren und die Cyclase-Aktivität inhibieren. Dementsprechend führte die Mutation des Retinal-bindenden Lysins in der Opsindomäne zu einer cGMP Produktion ohne jegliche Lichtinhibierung. Eine neuartige Rhodopsin-Phosphodiesterase aus dem Protisten Salpingoeca rosetta (SrRhoPDE) wurde im Jahr 2017 entdeckt. Die vorangegangenen zwei Studien von 2017 zeigten jedoch eine sehr schwache oder fehlende Lichtregulation der PDE-Aktivität. Hier konnte ich eine starke Lichtregulation beweisen, indem ich die Aktivität von SrRhoPDE, exprimiert in Xenopus laevis Oozyten, in-vitro bei verschiedenen cGMP-Konzentrationen untersuchte. Überraschenderweise zeigt die Hydrolyse von cGMP einen etwa 100-fach höheren Umsatz als der von cAMP. Licht kann die Substrataffinität durch Verringern des Km-Werts für cGMP von 80 µM auf 13 µM erhöhen, erhöht jedoch den maximalen Umsatz nur um ~30%. Darüber hinaus können zwei Einzelmutanten, SrRhoPDE K296A oder K296M, den Lichtaktivierungseffekt aufheben, indem sie eine kovalente Bindung vom Schiff-Base-Typ an das Chromophor Retinal unterbrechen. Ich zeige auch, dass SrRhoPDE zytosolische N- und C-Termini aufweist, höchstwahrscheinlich über eine 8-TM-Struktur. In Zukunft könnte SrRhoPDE ein potentiell nützliches optogenetisches Werkzeug für die Lichtregulation der cGMP-Konzentration sein, möglicherweise nach weiteren Verbesserungen durch Gentechnik. KW - Photoreceptor KW - Rhodopsin KW - guanylyl cyclase (GC) KW - two-component Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-168143 ER - TY - THES A1 - Ferber, Elena T1 - Transkriptionelle, metabolische und physiologische Anpassung nach Selbstintoxikation mit reaktiven Sekundärstoffen: die Glukosinolat-Bombe in Arabidopsis thaliana T1 - Transcriptional, metabolic and physiological adaptation after self-intoxication with reactive secondary substances: the glucosinolate bomb in Arabidopsis thaliana N2 - In Brassicaceae werden bei einer Gewebszerstörung unreaktive Glukosinolate durch das Enzym Myrosinase hydrolysiert. Es entstehen reaktive Substanzen wie Isothiocyanate (ITCs). Da diese Reaktion sehr schnell erfolgt wird sie auch als Senföl-Glukosid-Bombe bezeichnet. In Arabidopsis thaliana erfolgt nach Verwundung und Pathogeninfektion eine massive Akkumulation des ITCs Sulforaphan (SF), welches eine reaktive elektophile Spezies (RES) darstellt. Zu der Gruppe der RES zählen auch einige Oxylipine mit einer α,β-ungesättigten Carbonylgruppen wie 12-oxo-Phytodiensäure (OPDA) oder Phytoprostan A1 (PPA1). Die Fähigkeit der kovalenten Modifikation von Peptiden und Proteinen gilt als essentiell sowohl für die toxischen als auch die Gen-induzierenden Eigenschaften der RES. Neben ihrer Reaktivität spielt auch die Lipophilie eine Rolle für die Fähigkeit über Membranen zu diffundieren und unspezifisch an Proteine zu binden. Die in der vorliegenden Arbeit durchgeführten Transkriptomanalysen an Arabidopsis-Keimlingen mit sub-toxischen Konzentrationen von SF, Benzylisothiocyanat (BITC) und dem Oxylipin Prostaglandin A1 (PGA1) zeigten, dass strukturell sehr verschiedene RES einen gemeinsamen Satz von 55 Genen induzieren. Unter diesen befanden sich verschiedene Hitzeschock-, Stressassoziierte- und Detoxifizierungsgene. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Aktivierung über eine Muster-spezifische Erkennung der RES erfolgt. Als einen möglichen Mechanismus der RES-vermittelten Geninduktion wird die Regulation durch die Veränderung des zellulären Redox-Potentials als Folge kovalenter Modifikation von GSH durch RES diskutiert. Die Untersuchung der GSH-Gehalte sowie des Redox-Potential nach Behandlung mit sub-toxischen RES-Konzentrationen in Arabidopsis-Keimlingen zeigte jedoch unter den getesteten Bedingungen keine Veränderung. Neben dem Erkennungs- und Signaltransduktionsmechanismus ist auch die biologische Bedeutung von RES für die Vermittlung einer Stresstoleranz noch weitgehend unklar. Durch die Untersuchung der Genexpression in Arabidopsis-Pflanzen nach Verwundung konnte gezeigt werden, dass eine wundinduzierte Akkumulation von SF zur Induktion einiger Gene der Hitzeschockreaktion (HSR) im Wildtyp, jedoch nicht in der myrosinase-defiziten tgg1tgg2-Mutante führte. Auch in der Transkriptomanalyse war nach RES-Gabe ebenfalls eine starke Induktion hitze-responsiver Gene, deren Regulation über den Masterregulator dem Hitzeschock-TF A1 vermittelt wird, zu beobachten. Besonders die Induktion der HSPs, welche als Chaperone fungieren und damit Thiolgruppen von Proteinen vor Modifikation schützen können, haben vermutlich bei chemischer Intoxikation protektive Eigenschaften für die Zellen. Tatsächlich zeigte sich unter den gewählten Bedingungen die hsfa1a,b,d,e-Mutante empfindlicher gegenüber ITCs als der Wildtyp. Die Fähigkeit, eine HSR ausbilden zu können, scheint in Arabidopsis bei chemischer Intoxikation eine bedeutende Rolle zu spielen. Eine Vorbehandlung mit RES wie SF, BITC oder dem HSP90-Inhibitor Radicicol in Arabidopsis-Keimlingen konnte eine Schutzwirkung vor chemischer Intoxikation vermitteln. Dies erfolgte jedoch nicht nach Behandlung mit moderater Hitze (zwei Stunden, 37 °C). Somit scheint die HSR alleine nicht ausreichend für den Aufbau eines effektiven Schutzes vor BITC-Intoxikation zu sein. Als metabolische Antwort von Arabidopsis-Keimlingen auf Intoxikation mit RES konnte eine konzentrationsabhängige Senkung der maximalen Quantenausbeute am Photosystem II (PSII), sowie gleichzeitig eine Akkumulation an TAG-Spezies beobachtet werden. Diese metabolische Reaktion ist in der Literatur bereits als Schutz gegen Hitzestress beschrieben. Die Bedeutung der TAG-Akkumulation nach chemischem ITC-Stress ist noch unklar. N2 - In Brassicaceae, unreactive glucosinolates are hydrolyzed by the enzyme myrosinase during tissue destruction. Reactive substances such as isothiocyanates (ITCs) are formed. Since this reaction takes place very quickly, it is also called mustard oil bomb. In Arabidopsis thaliana, after wounding and pathogen infection, a massive accumulation of the ITC Sulforaphan (SF) occurs, which is a reactive electophilic species (RES). The group of RES also includes some oxylipins with a α,β-unsaturated carbonyl group such as 12-oxo-phytodienoic acid (OPDA) or phytoprotane A1 (PPA1). The ability to covalently modify peptides and proteins is considered essential for the toxic and gene inducing properties of RES. In addition to their reactivity, lipophilia also plays a role in the ability to diffuse across membranes and bind unspecifically to proteins. The transcriptome analyses performed on Arabidopsis-seedlings with sub-toxic concentrations of SF, benzylisothiocyanate (BITC) and oxylipin prostaglandin A1 (PGA1) showed that structurally very different RES induce a common set of 55 genes. Among the induced genes were several heat shock, stress associated and detoxification genes. These observations suggest that activation is via pattern-specific recognition of RES. As a possible mechanism of RES-mediated gene induction, regulation by alteration of the cellular redox potential as result of covalent modification of GSH by RES is discussed. However, the study of GSH levels and redox potential after treatment with sub-toxic RES concentrations in Arabidopsis-seedlings showed no change under the tested conditions. In addition to the recognition and signal transduction mechanism for RES, the biological significance of RES for the mediation of stress tolerance is still largely unclear. By studying the gene expression of Arabidopsis-plants after wounding, it was shown that wound induced accumulation of SF led to the induction of some genes of heat shock response (HSR) in the wild type, but not in the myrosinase-deficient tgg1tgg2-mutant. Also in transcriptome analysis a strong induction of heat-responsive genes could be observed after RES administration, whose regulation is mediated by the master regulator of the heatshock-TF A1 (HSFA1). In particular, the induction of HSPs, which act as chaperones and can thus protect thiol groups of proteins from modification, presumably have protective properties for the cells during chemical intoxication. In fact, under the conditions tested, the hsfa1a,b,d,e-mutants were more sensitive to ITCs than the wild type. The ability to form HSR seems to play an important role in chemical intoxication in Arabidopsis. Pretreatment with RES such as SF, BITC or the HSP90 inhibitor radicicol in Arabidopsis-seedlings could mediate a protective effect against chemical intoxication. However, this was not done after treatment with moderate heat (two hours, 37 °C). Thus, HSR alone does not seem to be sufficient to provide effective protection against BITC intoxication. As a metabolic response of Arabidopsis-seedlings to intoxication with RES, a concentration-dependent reduction of the maximum quantum yield at the photosystem II (PSII), as well as an accumulation of TAG species could be observed. This metabolic reaction is already described in the literature as protection against heat stress. The significance of TAG accumulation after chemical stress in the form of ITC intoxication is still unclear. KW - Ackerschmalwand KW - Glucosinolate KW - Isothiocyanate KW - reaktive elektrophile Spezies KW - Sulforaphan KW - Schmalwand Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-185116 ER - TY - THES A1 - Beck, Sebastian T1 - Using optogenetics to influence the circadian clock of \(Drosophila\) \(melanogaster\) T1 - Die Verwendung der Optogenetik zur Beeinflussung der circadianen Uhr von \(Drosophila\) \(melanogaster\) N2 - Almost all life forms on earth have adapted to the most impactful and most predictable recurring change in environmental condition, the cycle of day and night, caused by the axial rotation of the planet. As a result many animals have evolved intricate endogenous clocks, which adapt and synchronize the organisms’ physiology, metabolism and behaviour to the daily change in environmental conditions. The scientific field researching these endogenous clocks is called chronobiology and has steadily grown in size, scope and relevance since the works of the earliest pioneers in the 1960s. The number one model organism for the research of circadian clocks is the fruit fly, Drosophila melanogaster, whose clock serves as the entry point to understanding the basic inner workings of such an intricately constructed endogenous timekeeping system. In this thesis it was attempted to combine the research on the circadian clock with the techniques of optogenetics, a fairly new scientific field, launched by the discovery of Channelrhodopsin 2 just over 15 years ago. Channelrhodopsin 2 is a light-gated ion channel found in the green alga Chlamydomonas reinhardtii. In optogenetics, researches use these light-gated ion channels like Channelrhodopsin 2 by heterologously expressing them in cells and tissues of other organisms, which can then be stimulated by the application of light. This is most useful when studying neurons, as these channels provide an almost non-invasive tool to depolarize the neuronal plasma membranes at will. The goal of this thesis was to develop an optogenetic tool, which would be able to influence and phase shift the circadian clock of Drosophila melanogaster upon illumination. A phase shift is the adaptive response of the circadian clock to an outside stimulus that signals a change in the environmental light cycle. An optogenetic tool, able to influence and phase shift the circadian clock predictably and reliably, would open up many new ways and methods of researching the neuronal network of the clock and which neurons communicate to what extent, ultimately synchronizing the network. The first optogenetic tool to be tested in the circadian clock of Drosophila melanogaster was ChR2-XXL, a channelrhodopsin variant with dramatically increased expression levels and photocurrents combined with a prolonged open state. The specific expression of ChR2-XXL and of later constructs was facilitated by deploying the three different clock-specific GAL4-driver lines, clk856-gal4, pdf-gal4 and mai179-gal4. Although ChR2-XXL was shown to be highly effective at depolarizing neurons, these stimulations proved to be unable to significantly phase shift the circadian clock of Drosophila. The second series of experiments was conducted with the conceptually novel optogenetic tools Olf-bPAC and SthK-bPAC, which respectively combine a cyclic nucleotide-gated ion channel (Olf and SthK) with the light-activated adenylyl-cyclase bPAC. These tools proved to be quite useful when expressed in the motor neurons of instar-3 larvae of Drosophila, paralyzing the larvae upon illumination, as well as affecting body length. This way, these new tools could be precisely characterized, spawning a successfully published research paper, centered around their electrophysiological characterization and their applicability in model organisms like Drosophila. In the circadian clock however, these tools caused substantial damage, producing severe arrhythmicity and anomalies in neuronal development. Using a temperature-sensitive GAL80-line to delay the expression until after the flies had eclosed, yielded no positive results either. The last series of experiments saw the use of another new series of optogenetic tools, modelled after the Olf-bPAC, with bPAC swapped out for CyclOp, a membrane-bound guanylyl-cyclase, coupled with less potent versions of the Olf. This final attempt however also ended up being unsuccessful. While these tools could efficiently depolarize neuronal membranes upon illumination, they were ultimately unable to stimulate the circadian clock in way that would cause it to phase shift. Taken together, these mostly negative results indicate that an optogenetic manipulation of the circadian clock of Drosophila melanogaster is an extremely challenging subject. As light already constitutes the most impactful environmental factor on the circadian clock, the combination of chronobiology with optogenetics demands the parameters of the conducted experiments to be tuned with an extremely high degree of precision, if one hopes to receive positive results from these types of experiments at all. N2 - Nahezu alle Lebewesen der Erde haben sich an den Tag-Nacht-Zyklus angepasst, die einflussreichste und verlässlichste wiederkehrende Veränderung der Umwelt-bedingungen, verursacht durch die axiale Rotation des Planeten. Daraus resultierend haben viele Tiere komplizierte innere Uhren entwickelt, welche ihre Physiologie, ihren Stoffwechsel und ihr Verhalten an die tägliche Veränderung der natürlichen Bedingungen anpassen. Das Wissenschaftsfeld, das sich der Erforschung dieser inneren Uhren widmet, wird Chronobiologie genannt und hat seit der Arbeit der ersten Pioniere ab 1960 stetig an Größe und Relevanz gewonnen. Der prominenteste Modellorganismus für die Erforschung der circadianen Uhr ist Drosophila melanogaster, deren Uhr als Ansatzpunkt dient, die grundlegenden Vorgänge eines derart komplexen, endogenen Taktsystems zu verstehen. In dieser Thesis wurde versucht die Forschung an der circadianen Uhr mit den Techniken der Optogenetik zu kombinieren, eines jungen Forschungsfeldes, welches durch die Entdeckung von Channelrhodpsin 2 vor über 15 Jahren eröffnet wurde. Channelrhodopsin 2 ist ein Licht-gesteuerter Ionenkanal, der in der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii entdeckt wurde. In der Optogenetik nutzen Forscher diese Licht-gesteuerten Ionenkanäle, indem sie sie in den Zellen anderer Organismen exprimieren, welche dann durch Licht stimuliert werden können. Dies ist besonders nützlich bei der Untersuchung von Neuronen, da diese Kanäle ein nahezu nicht-invasives Werkzeug zur Depolarisation neuronaler Membranen bieten. Das Ziel dieser Thesis war es, ein optogenetisches Werkzeug zu entwickeln, welches die circadiane Uhr von Drosophila melanogaster durch Licht manipulieren und deren Phase verschieben kann. Eine Phasenverschiebung ist die adaptive Antwort der circadianen Uhr auf einen äußeren Reiz, welcher eine Veränderung des natürlichen Lichtzyklus signalisiert. Ein optogenetisches Werkzeug, das die Phase der inneren Uhr verlässlich verschieben kann, würde viele neue Möglichkeiten zur Erforschung des neuronalen Uhrnetzwerks eröffnen und wie die Neuronen miteinander kommunizieren um das Netzwerk zu synchronisieren. Das erste optogenetische Werkzeug das in der circadianen Uhr von Drosophila melanogaster getestet wurde war „ChR2-XXL“, eine Channelrhodopsin-Variante mit erhöhter Expression und Photoströmen, gepaart mit einem verlängerten geöffneten Zustand. Die spezifische Expression von ChR2-XXL und auch die späterer Konstrukte wurde durch die Verwendung der drei Uhr-spezifischen GAL4-Treiberlinien clk856-gal4, pdf-gal4 und mai179-gal4 bewerkstelligt. Obwohl bereits gezeigt wurde, dass ChR2-XXL höchst effektiv die Depolarisierung von Neuronen bewirkt, waren diese Stimulationen jedoch nicht in der Lage die Phase der circadianen Uhr von Drosophila signifikant zu verschieben. Die zweite Serie an Versuchen wurde mit den konzeptionell neuartigen optogenetischen Werkzeugen Olf-bPAC und SthK-bPAC durchgeführt, welche jeweils einen durch zyklische Nukleotide gesteuerten Ionenkanal (Olf und SthK) mit der Licht-gesteuerten Adenylatcyclase bPAC kombinieren. Diese Werkzeuge erwiesen sich als äußert nützlich, solange sie in den Motoneuronen von Drosophila-Larven im dritten Larvenstadium exprimiert wurden, wo sie bei Beleuchtung die Larven sowohl paralysierten, als auch deren Körperlänge beeinflussten. Auf diese Weise konnten diese neuen Werkzeuge präzise charakterisiert werden, was in der erfolgreichen Veröffentlichung eines Forschungsartikels mündete, welcher hauptsächlich von der elektrophysiologischen Charakterisierung der Werkzeuge handelte und von deren Anwendungsmöglichkeiten in Modellorganismen wie Drosophila. In der circadianen Uhr verursachten diese Werkzeuge jedoch substantielle Schäden und produzierten schwere Arrhythmie und Anomalien in der neuronalen Entwicklung. Die Verwendung einer temperatur-sensitiven GAL80-Linie um die Expression zu verzögern, erzeugte ebenfalls keinerlei positive Ergebnisse. Für die letzte Serie an Experimenten wurde eine weitere Reihe neuer optogenetischer Werkzeuge verwendet, orientiert an Olf-bPAC und SthK-bPAC, wobei bPAC durch die membrangebundene Guanylatcyclase „CyclOp“ ausgetauscht wurde, welche wiederrum mit weniger wirkstarken Olf-Varianten kombiniert wurde. Dieser letzte Ansatz scheiterte jedoch ebenfalls. Obwohl diese neuen Werkzeuge in der Lage waren die Neuronenmembran bei Beleuchtung effektiv zu depolarisieren, vermochten sie es letztendlich nicht eine Phasenverschiebung zu bewirken. Zusammengenommen zeigen diese überwiegend negativen Ergebnisse, dass die optogenetische Manipulation der circadianen Uhr von Drosophila melanogaster ein extrem anspruchsvolles Thema ist. Da Licht bereits ohnehin den einflussreichsten Umweltfaktor für die circadiane Uhr darstellt, verlangt die Kombination von Chronobiologie und Optogenetik eine extrem präzise Feinabstimmung der Versuchsparameter, um überhaupt darauf hoffen zu dürfen, positive Ergebnisse mit derlei Versuchen zu erzeugen. KW - Chronobiologie KW - Optogenetik KW - Taufliege KW - Optogenetics KW - Chronobiology KW - Channelrhodopsin KW - Drosophila melanogaster Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-184952 ER - TY - THES A1 - Dindas, Julian T1 - Cytosolic Ca\(^2\)\(^+\), a master regulator of vacuolar ion conductance and fast auxin signaling in \(Arabidopsis\) \(thaliana\) T1 - Zytosolisches Ca\(^2\)\(^+\), ein zentraler Regulator der vakuolären Ionenleitfähigkeit und der schnellen Auxin-Signaltransduktion in \(Arabidopsis\) \(thaliana\) N2 - Das Phytohormon Auxin erfüllt wichtige Funktionen bei der Initiierung von pflanzlichen Geweben und Organen, wie auch in der Steuerung des Wurzelwachstums im Zusammenspiel mit äußeren Reizen wie Schwerkraft, Wasser- und Nähstoffverfügbarkeit. Diese Funktionen basieren dabei vor allem auf der Auxin-abhängigen Regulation von Zellteilung und -streckung. Wichtig für letzteres ist dabei die Kontrolle des Zellturgors durch die Vakuole. Als Speicher für Nährstoffe, Metabolite und Toxine sind Vakuolen von essentieller Bedeutung. Vakuolär gespeicherte Metabolite und Ionen werden sowohl über aktive Transportprozesse, als auch passiv durch Ionenkanäle, über die vakuoläre Membran mit dem Zytoplasma ausgetauscht. In ihrer Funktion als second messenger sind Kalziumionen wichtige Regulatoren, aber auch Gegenstand vakuolärer Transportprozesse. Änderungen der zytosolischen Kalziumkonzentration wirken nicht nur lokal, sie werden auch mit einer Signalweiterleitung über längere Distanzen in Verbindung gebracht. Im Rahmen dieser Arbeit wurden elektrophysiologische Methoden mit bildgebenden Methoden kombiniert um Einblicke in das Zusammenspiel zwischen zytosolischen Kalziumsignalen, vakuolärer Transportprozesse und der Auxin-Physiologie im intakten pflanzlichen Organismus zu gewinnen. Kalziumsignale sind an der Regulierung vakuolärer Ionenkanäle und Transporter beteiligt. Um dies im intakten Organismus zu untersuchen wurden im Modellsystem junger Wurzelhaare von Arabidopsis thaliana Messungen mit intrazellulären Mikroelektroden durchgeführt. Mittels der Zwei-Elektroden-Spannungsklemm-Technik konnte bestätigt werden, dass die vakuoläre Membran der limitierende elektrische Wiederstand während intravakuolärer Messungen ist und so gemessene Ionenströme in der Tat nur die Ströme über die vakuoläre Membran repräsentieren. Die bereits bekannte zeitabhängige Abnahme der vakuolären Leitfähigkeit in Einstichexperimenten konnte weiterhin mit einer einstichbedingten, transienten Erhöhung der zytosolischen Kalziumkonzentration korreliert werden. Durch intravakuoläre Spannungsklemmexperimente in Wurzelhaarzellen von Kalziumreporterpflanzen konnte dieser Zusammenhang zwischen vakuolärer Leitfähigkeit und der zytosolischen Kalziumkonzentration bestätigt werden. Die Vakuole ist jedoch nicht nur ein Empfänger zytosolischer Kalziumsignale. Da die Vakuole den größten intrazellulären Kalziumspeicher darstellt, wird seit Langem diskutiert, ob sie auch an der Erzeugung solcher Signale beteiligt ist. Dies konnte in intakten Wurzelhaarzellen bestätigt werden. Änderungen des vakuolären Membranpotentials wirkten sich auf die zytosolische Kalziumkonzentration in diesen Zellen aus. Während depolarisierende Potentiale zu einer Erhöhung der zytosolischen Kalziumkonzentration führten, bewirkte eine Hyperpolarisierung der vakuolären Membran das Gegenteil. Thermodynamische Überlegungen zum passiven und aktiven Kalziumtransport über die vakuoläre Membran legten dabei den Schluss nahe, dass die hierin beschriebenen Ergebnisse das Verhalten von vakuolären H+/Ca2+ Austauschern wiederspiegeln, deren Aktivität durch die protonenmotorische Kraft bestimmt wird. Im Rahmen dieser Arbeit stellte sich weiterhin heraus, dass zytosolisches Kalzium ebenso ein zentraler Regulator eines schnellen Auxin-induzierten Signalweges ist, über den der polare Transport des Hormons reguliert wird. Im gleichen Modellsystem junger Wurzelhaare konnte gezeigt werden, dass die externe Applikation von Auxin eine sehr schnelle, Auxinkonzentrations- und pH-abhängige Depolarisation des Plasmamembranpotentials zur Folge hat. Synchron zur Depolarisation des Plasmamembranpotentials wurden im Zytosol transiente Kalziumsignale registriert. Diese wurden durch einen von Auxin aktivierten Einstrom von Kalziumionen durch den Ionenkanal CNGC14 hervorgerufen. Experimente an Verlustmutanten als auch pharmakologische Experimente zeigten, dass zur Auxin-induzierten Aktivierung des Kalziumkanals die Auxin-Perzeption durch die F-box Proteine der TIR1/AFB Familie erforderlich ist. Durch Untersuchungen der Auxin-abhängigen Depolarisation wie auch des Auxin-induzierten Einstroms von Protonen in epidermale Wurzelzellen von Verlustmutanten konnte gezeigt werden, dass die sekundär aktive Aufnahme von Auxin durch das hochaffine Transportprotein AUX1 für die schnelle Depolarisation verantwortlich ist. Nicht nur die zytosolischen Kalziumsignale korrelierten mit der CNGC14 Funktion, sondern ebenso die AUX1-vermittelte Depolarisation von Wurzelhaaren. Eine unveränderte Expression von AUX1 in der cngc14 Verlustmutante legte dabei den Schluss nahe, dass die Aktivität von AUX1 posttranslational reguliert werden muss. Diese Hypothese erfuhr Unterstützung durch Experimente, in denen die Behandlung mit dem Kalziumkanalblocker Lanthan zu einer Inaktivierung von AUX1 im Wildtyp führte. Die zytosolische Beladung einzelner epidermaler Wurzelzellen mit Auxin hatte die Ausbreitung lateraler und acropetaler Kalziumwellen zur Folge. Diese korrelierten mit einer Verschiebung des Auxin-Gradienten an der Wurzelspitze und unterstützten somit eine hypothetische Kalziumabhängige Regulation des polaren Auxin Transports. Ein Model für einen schnellen, Auxin induzierten und kalziumabhängigen Signalweg wird präsentiert und dessen Bedeutung für das gravitrope Wurzelwachstum diskutiert. Da die AUX1-vermittelte Depolarisation in Abhängigkeit von der externen Phosphatkonzentration variierte, wird die Bedeutung dieses schnellen Signalwegs ebenso für die Anpassung des Wurzelhaarwachstums an eine nicht ausreichende Verfügbarkeit von Phosphat diskutiert. N2 - The phytohormone auxin performs important functions in the initiation of plant tissues and organs, as well as in the control of root growth in conjunction with external stimuli such as gravity, water and nutrient availability. These functions are based primarily on the auxin-dependent regulation of cell division and elongation. Important for the latter is the control of the cell turgor by the vacuole. As storage for nutrients, metabolites and toxins, vacuoles are of vital importance. Vacuolar stored metabolites and ions are exchanged across the vacuolar membrane with the cytoplasm via active transport processes as well as passively through ion channels. In their function as second messenger, calcium ions are important regulators but also subject to vacuolar transport processes. Changes in the cytosolic calcium concentration not only act locally, but are also associated with signal transduction over longer distances. In this work, electrophysiological methods were combined with imaging techniques to gain insights into the interaction between cytosolic calcium signals, vacuolar transport processes and auxin physiology in the intact plant organism. Calcium signals are involved in the regulation of vacuolar ion channels and transporters. In order to investigate this in the intact organism, intracellular microelectrode measurements were performed in the model system of bulging Arabidopsis thaliana root hairs. By means of the two-electrode voltage-clamp technique, it could be confirmed that the vacuolar membrane is the limiting electrical resistance during intravacuolar measurements and thus measured ion currents actually represent only the currents across the vacuolar membrane. The already known time-dependent decrease of vacuolar conductivity during intravacuolar experiments could be further correlated with an impalement-related, transient increase of the cytosolic calcium concentration. Intravacuolar voltage-clamp experiments in root hair cells of calcium reporter plants confirmed this relationship between vacuolar conductivity and the cytosolic calcium concentration. However, the vacuole is not just a recipient of cytosolic calcium signals. Since the vacuole represents the largest intracellular calcium reservoir, it has long been argued that it is also involved in the generation of such signals. This could be confirmed in intact root hair cells. Changes in the vacuolar membrane potential affected the cytosolic calcium concentration in these cells. While depolarizing potentials led to an increase of the cytosolic calcium concentration, hyperpolarization of the vacuolar membrane caused the opposite. Thermodynamic considerations of passive and active calcium transport across the vacuolar membrane suggested that the results described herein reflect the behaviour of vacuolar H+/Ca2+ exchangers whose activity is determined by the proton motive force. In addition, cytosolic calcium has been shown to be a key regulator of a rapid auxin-induced signaling pathway that regulates polar transport of the hormone. In the same model system of bulging root hairs it could be shown that the external application of auxin results in a very fast, auxin concentration- and pH-dependent depolarization of the plasma membrane potential. Synchronous with the depolarization of the plasma membrane potential, transient calcium signals were recorded in the cytosol. These were caused by an auxin-activated influx of calcium ions through the ion channel CNGC14. Experiments on loss-of-function mutants as well as pharmacological experiments showed that the auxin-induced activation of the calcium channel requires auxin-perception by the F-box proteins of the TIR1/AFB family. Investigations of auxin-dependent depolarization as well as the auxin-induced influx of protons into epidermal root cells of loss-of-function mutants showed that the secondary active uptake of auxin by the high-affinity transport protein AUX1 is responsible for the rapid depolarization Not only the cytosolic calcium signals correlated with CNGC14 function, but also the AUX1-mediated depolarization of root hairs. An unchanged expression of AUX1 in the cngc14 loss-of-function mutant suggested that the activity of AUX1 must be post-translationally regulated. This hypothesis was supported by experiments in which treatment with the calcium channel blocker lanthanum led to inactivation of AUX1 in the wild type. The cytosolic loading of individual epidermal root cells with auxin resulted in the spread of lateral and acropetal calcium waves. These correlated with a shift of the auxin gradient at the root apex and thus supported a hypothetical calcium-dependent regulation of polar auxin transport. A model for a rapid, auxin-induced and calcium-dependent signaling pathway is presented and its importance for gravitropic root growth is discussed. Since AUX1-mediated depolarization varied with external phosphate concentration, the importance of this rapid signaling pathway is also discussed for the adaptation of root hair growth to an inadequate availability of phosphate. KW - Ackerschmalwand KW - Auxine KW - Vakuole KW - Calcium KW - Elektrophysiologie KW - Pflanzenhormone KW - Hormontransport KW - Ionenleitfähigkeit KW - Signaltransduktion KW - Arabidopsis thaliana Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-158638 ER - TY - THES A1 - Hürter, Anna-Lena T1 - Funktion von Anionenkanälen bei der Entwicklung der Wurzelknöllchen- und Arbuskulären Mykorrhiza-Symbiose in \(Medicago\) \(truncatula\) T1 - Role of \(Medicago\) \(truncatula\) anion channels in the development of Arbuscular Mycorrhiza and Root Nodule Symbiosis N2 - Bei der arbuskulären Myorrhiza-Symbiose (AM) und der Wurzelknöllchen-Symbiose (RNS) handelt es sich um symbiotische Interaktionen, die einen großen Vorteil für Pflanzenwachstum und kultivierung mit sich bringen. Während bei der AM Pilze die Pflanze mit verschiedenen Nährstoffen aus dem Boden versorgen, stellen die in den Wurzelknöllchen lokalisierten Rhizobien der Pflanze fixierte Stickstoffverbindungen zur Verfügung. Folglich ist es von großem Interesse, die Entwicklung dieser Symbiosen im Detail zu verstehen. Für die Erkennung der arbuskulären Mykorrhiza-Pilze und der Stickstoff-fixierenden Rhizobien durch die Pflanze sind lösliche symbiotische Signalmoleküle essentiell, die zu der Gruppe der Lipochitinoligosaccharide (LCOs) gehören. Während der Entwicklung der AM und der RNS erkennen die Pflanzenwurzeln diese LCOs über Lysin-Motiv-Rezeptor-ähnliche Kinasen der Plasmamembran. Eine der ersten Antworten der Wurzelzellen auf Nod-LCOs ist eine Depolarisierung des Membranpotentials. An dieser Antwort sind mit großer Wahrscheinlichkeit Anionenkanäle der Plasmamembran beteiligt, da sie auch bei Depolarisierungen als Antwort auf andere Stimuli bzw. Stressantworten involviert sind. In Arabidopsis stellt die S-Typ-Familie eine bedeutende Gruppe von Anionenkanälen dar, die von Calcium-abhängigen Kinasen (CPKs) aktiviert werden. Da Nod-LCOs repetitive Veränderungen des zytosolischen Calcium-Levels induzieren, wurde in dieser Arbeit die Hypothese aufgestellt, dass Calcium-Signale CPKs aktivieren. CPKs sorgen im Gegenzug für die Stimulation von S-Typ-Anionenkanälen in Wurzelzellen. Die Änderungen des Membranpotentials in M. truncatula-Wurzelhaarzellen als Antwort auf Nod- und Myc-LCOs wurden mittels intrazellulärer Mikroelektroden analysiert. Es wurde gezeigt, dass Nod-LCOs in M. truncatula-Wurzelhaarzellen eine Depolarisierung des Membranpotentials induzieren. Doch Wurzelhaarzellen reagieren nicht nur auf Nod-LCOs. So konnte in dieser Studie zum ersten Mal eine Depolarisierung als Antwort auf sulfatisierte Myc-LCOs nachgewiesen werden. Eine zweite Gruppe von Myc-LCOs, denen die Sulfatgruppe fehlt, löste keine Reaktion des Membranpotentials aus. Diese Daten deuten darauf hin, dass Wurzelhaarzellen für die Erkennung von sulfatisierten LCOs von symbiotischen Pilzen und Bakterien dasselbe Perzeptionssystem nutzen. Diese Schlussfolgerung wird von Experimenten unterstützt, in denen vor der Stimulation durch Nod-LCOs ein sulfatisierter Myc-LCO hinzugegeben wurde. Diese sukzessive Zugabe von zwei Stimuli führte zu einer einzigen Depolarisierung. Die sulfatisierten Myc-LCOs unterdrückten die Antwort des Membranpotentials auf Nod-LCOs. Die Beziehung zwischen Nod-LCO-induzierten zytosolischen Calcium-Signalen und Änderungen des Membranpotentials wurde mit einer Kombination aus intrazellulären Mikroelektroden und Imaging eines Calcium-sensitiven Fluoreszenzfarbstoffs analysiert. In Messungen der zytosolischen Calcium-Konzentration wurde keine transiente Zunahme innerhalb der ersten vier Minuten nach der Applikation der Nod-LCOs beobachtet. Die durch Nod-LCOs induzierten Depolarisierungen traten früher auf und erreichten ihr Maximum normalerweise nach drei Minuten. Demnach geht die Depolarisierung des Membranpotentials den zytosolischen Calcium-Signalen voraus. Diese Beobachtung wurde von simultanen Messungen beider Antworten bestätigt. Um der Möglichkeit einer Beteiligung von S-Typ-Anionenkanälen an der LCO-abhängigen Depolarisierung nachzugehen, wurden zwei in den Wurzeln exprimierte M. truncatula-Orthologe der AtSLAC1-Anionenkanal-Familie identifiziert. Die klonierten Anionenkanäle, MtSLAC1, MtSLAH2-3A und MtSLAH2-3B zeigten bei der Untersuchung in Xenopus-Oozyten die typischen Charakteristika von S-Typ-Anionenkanälen. So konnte gezeigt werden, dass MtSLAH2-3A und MtSLAH2-3B eine Proteinkinase sowie externes Nitrat zur Aktivierung benötigen. Außerdem zeichnen sie sich durch eine sehr viel höhere Permeabilität für Nitrat im Vergleich zu Chlorid aus. Ähnlich wie bei AtSLAH3 macht eine Koexpression mit AtSLAH1 genau wie eine intrazelluläre Azidifikation MtSLAH2-3A und MtSLAH2-3B zu Anionenkanälen, die unabhängig von externem Nitrat und einer Phosphorylierung durch eine Proteinkinase aktiv sind. Weil S-Typ-Anionenkanäle eine hohe Permeabilität für Nitrat aufweisen, wurde der Einfluss von Änderungen der extrazellulären Anionenkonzentration auf die Nod-LCO-induzierte Depolarisierung analysiert. Es stellte sich heraus, dass eine Verringerung der extrazellulären Nitratkonzentration die Antwort beschleunigt. Eine Erhöhung der extrazellulären Chlorid- und Sulfatkonzentration hingegen führte zu einer Verstärkung der Depolarisierung. Diese Beobachtung spricht dafür, dass andere Anionenkanal-Typen wie ALMT-Kanäle an der Depolarisierung des Membranpotentials durch LCOs beteiligt sind. Die Daten dieser Arbeit zeigen eine Abhängigkeit der Nod-LCO-induzierten Änderungen des Membranpotentials vom M. truncatula-Genotyp. Neben Nod-LCOs lösen auch sulfatisierte Myc-LCOs eine Depolarisierung des Membranpotentials aus. Vermutlich werden sulfatisierte Nod- und Myc-LCOs von demselben Rezeptorsystem erkannt. Die Nod-LCO-induzierte Depolarisierung ist unabhängig von Änderungen des zytosolischen Calcium-Levels. Folglich sind in die Depolarisierung keine S-Typ-Anionenkanäle involviert, die ausschließlich durch Calcium-abhängige Protein-Kinasen aktiviert werden. Interessanterweise lassen sich die MtSLAH2-3-Anionenkanäle aus M. truncatula im Gegensatz zu AtSLAH3 von Calcium-unabhängigen SnRK2/OST1-Proteinkinasen aktivieren. Dies ermöglicht die Aktivierung der MtSLAH2-3-Anionenkanäle in Abwesenheit eines Calcium-Signals. In weiterführenden Studien sollten die Genexpressionsprofile von Calcium-unabhängigen Proteinkinasen wie SnRK2 und S-Typ-Anionenkanälen aus M. truncatula sowie deren Interaktionen untersucht werden. So könnte eine Aussage darüber getroffen werden, ob diese Proteinkinasen die Anionenkanäle MtSLAH2-3 Nod-LCO-spezifisch aktivieren. Außerdem wäre es von großem Interesse, verschiedene M. truncatula-Mutanten zu untersuchen, denen Gene für MtSLAH2-3A, MtSLAH2-3B und R-Typ-Anionenkanäle fehlen. Diese Experimente könnten zur Identifizierung von Genen führen, die an der frühen Entwicklung der Symbiose beteiligt sind und erklären, warum nur eine kleine Gruppe von Pflanzen dazu in der Lage ist, eine RNS einzugehen, während die AM im Pflanzenreich weit verbreitet ist. N2 - Arbuscular Mycorrhiza (AM) and Root Nodule Symbiosis (RNS) are symbiotic interactions with a high benefit for plant growth and crop production. In the soil, AM fungi supply the plant with a broad range of nutrients, whereas the rhizobium bacteria in the root nodules provide fixed nitrogen sources. Thus, it is of great interest to understand the developmental process of these symbiotic interactions. For recognition of AM fungi and nitrogen-fixing bacteria by plants, diffusible symbiotic signals are essential, which belong to the group of lipochitinoligosaccharides (LCOs). During the development of AM and RNS, plant roots sense these LCOs with pairs of lysin motiv domain receptor-like kinases that are located in the plasma membrane. One of the earliest Nod-LCO-triggered responses of root cells represents the depolarization of the plasma membrane. It is likely that plasma membrane anion channels are essential for this reaction, as these channels are required for depolarization in response to a number of other stimuli/stress responses. In Arabidopsis, the S-type family is a prominent group of anion channels that are activated by calcium-dependent Protein Kinases (CPKs). As Nod-LCOs can trigger repetitive elevations of the cytosolic calcium level, we hypothesized that calcium signals activate CPKs, which in turn stimulate S-type anion channels in root cells. The membrane potential changes of M. truncatula root hair cells in response to Nod- and Myc-LCOs were analyzed by using intracellular micro electrodes. In accordance with previous studies in M. sativa, Nod-LCOs evoked a membrane depolarization in root hairs cells of M. truncatula. Root hair cells not only were sensitive to Nod-LCOs, but for the first time a depolarization response was also shown in response to sulphated Myc-LCOs. However, a second group of Myc-LCO-signals, which lack the sulfate group, did not initiate any reaction of the membrane potential. These data thus suggest that root hair cells use the same perception system to sense sulfated LCOs of symbiotic fungi and bacteria. This conclusion was supported by experiments in which a sulfated Myc-LCO was applied, prior to stimulation with Nod LCOs. This successive application of two stimuli resulted only in a single transient depolarization, as sulfated Myc-LCOs repressed plasma membrane responses to Nod-LCOs. The relations between Nod-LCO-induced cytosolic calcium signals and membrane potential changes were studied with a combination of intracellular micro electrodes and calcium sensitive reporter dye imaging. In measurements of the cytosolic calcium concentration the first transient increase was not observed within four minutes after application of Nod-LCOs. Nod-LCO-induced depolarizations occurred earlier and normally peaked after three minutes. In contrast to current models as well as the initial hypothesis of this project, the membrane depolarization thus precedes the cytosolic calcium signals, which was confirmed by simultaneous measurement of both responses. As S-type anion channels are good candidates for the induction of the LCO-dependent depolarization, we indentified two root-expressed M. truncatula orthologues of AtSLAC1-family. The cloned S-type anion channels, MtSLAC1, MtSLAH2-3A and MtSLAH2-3B showed typical characteristics of S-type anion channels, when studied in Xenopus oocytes. Thereby we could show that both M. truncatula anion channels, MtSLAH2-3A and MtSLAH2-3B, need a protein kinase and external nitrate for activation. They are characterized by a much higher permeability for nitrate compared to chloride. Similarly, to AtSLAH3 coexpression with AtSLAH1 or intracellular acidification rendered MtSLAH2-3A/B independent from phosphorylation via protein kinases and external nitrate. Because S-type anion channels show a high permeability for nitrate, we tested the influence of changes in the extracellular anion concentration on the Nod-LCO induced depolarization. It turned out that the response was accelerated when the concentration gradient for nitrate was decreased. However, increasing the extracellular chloride and sulfate concentrations also enhanced the magnitude of the depolarization, which indicates that other types of anion channels, such as ALMT channels may contribute to the LCO-triggered depolarization of root hairs. The data generated in this project show that the Nod-LCO induced membrane potential change is strongly dependent on the genotype of M. truncatula. This early response in the recognition of symbiotic microorganisms is also induced by sulfated Myc-LCOs, which seem to be perceived via the same receptor system as Nod-LCOs. In contrast to our expectations, the depolarization response to Nod-LCOs is independent of changes in the cytosolic calcium level. Consequently, S-type anion channels, activated solely by calcium-dependent protein kinases are not involved in this response. Interestingly, in contrast to the Arabidopsis SLAH3, the SLAH2-3s from M. truncatula are activated via calcium-independent SnRK2/OST1-like kinases which would allow the activation of the channels even in the absence of calcium transients. Thus, in future studies the expression profile and interaction of calcium-independent protein kinases like SnRK2s and S-type anion channels in M. truncatula should be determined to investigate whether these proteins are capable of activating MtSLAH2-3A/B in a Nod-LCO-specific manner. Moreover, the further analysis of M. truncatula mutants that lack MtSLAH2-3A/B as well as M. truncatula R-type anion channels will be of great interest. These experiments can thus lead to the identification of genes that are involved in early symbiosis-related events, which may explain why only a small group of plants is able to develop root nodules, whereas the interaction with mycorrhiza is found for a large variety of plant species. KW - Schneckenklee KW - Wurzelknöllchen KW - Mykorrhiza KW - Depolarisation KW - Membranpotential KW - Wurzelknöllchensymbiose KW - Arbuscular Mycorrhiza KW - S-Typ-Anionenkanäle KW - Membrandepolarisierung KW - Calcium-Oszillationen KW - Root Nodule Symbiosis KW - S-Type-Anionchannels KW - Membrane depolarisation KW - calcium oscillations KW - Anionentranslokator KW - VA-Mykorrhiza KW - Arbuskuläre Mykorrhiza KW - Anionenkanal Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-158419 ER - TY - THES A1 - Huang, Hua T1 - Comparative investigation of the chemical composition and the water permeability of fruit and leaf cuticles T1 - Vergleichende Untersuchung zur chemischen Zusammensetzung und zur Wasserpermeabilität der Kutikula von Früchten und Blättern N2 - The plant cuticle is a continuous extracellular protective layer covering the outermost surfaces of higher plants that are in contact with the surrounding atmosphere. The primary function of the cuticular lipid membrane, which is mainly composed of biopolymer cutin and cuticular waxes, is to protect the plant organs against uncontrolled water loss. The chemical composition and the biophysical properties of cuticular waxes affect the rate of water diffusion across the cuticle. Fruit transpiration plays an important role in the development and the maintenance of fruit quality. The fruit has been suggested to present better dehydration stress tolerance than the leaf. However, the differences in transpiration and the chemical composition of cuticular waxes between fruit and leaf have yet to be comprehensively investigated. The present study aims to investigate the water permeability and cuticular wax composition of fruit and leaf cuticles of a wide range of plant species and to elucidate the different roles of the cuticular wax components in the transpiration barrier. To address these objectives, fruit and leaf samples from 17 species were investigated. The cuticular transpiration of intact fruits and astomatous adaxial leaf surfaces and the minimum leaf conductance obtained by leaf drying curves for intact leaves were gravimetrically determined for a variety of plant species. The chemical composition of cuticular waxes of fruits and leaves was thoroughly analysed by gas chromatography with flame ionization and mass spectrometry. The water permeability of fruits ranged from 3.7 x 10-5 m s-1 (Prunus domestica subsp. syriaca) to 37.4 x 10-5 m s-1 (Coffea arabica), whereas permeability for leaves varied between 1.6 x 10-5 m s-1 (Cornus officinalis) and 4.5 x 10-5 m s-1 (Prunus domestica subsp. syriaca (L.)). The interspecies range of water permeability of fruits was significantly higher than that of leaves. Chemical analyses of the cuticular waxes demonstrated that fatty acids, primary alcohols, n-alkanes, aldehydes and alkyl esters were the predominant very-long-chain aliphatic compound classes of fruit and leaf surfaces. Sterols, such as β-sitosterol and campesterol, and triterpenoids, such as oleanolic acid, ursolic acid, α-amyrin and ß-amyrin, were the major cyclic compound classes in the cuticular wax membrane. The amount and composition of cuticular waxes of both fruits and leaves varied at an intraspecific level. There were no significant correlations between the total cuticular wax load or the individual cuticular wax composition and the water permeability of fruits or leaves independently or together. After combining the fruit and leaf data set, a significant correlation between the average chain length of very-long-chain aliphatic compounds and permeabilities was detected, i.e. the longer the average chain length, the lower the water permeability. Interestingly, n-Nonacosane (C29) was abundantly detected in fruit waxes of Rosaceae species. These fruits exhibited a relatively low transpiration level, which was very close to their leaf cuticular permeability. The present study suggests that the lower cuticular permeability of leaves, in comparison to that of fruits, may be attributed to the longer average chain length of aliphatic compounds. The accumulation of total wax, triterpenoids and aliphatic compounds may not contribute to the transpiration barrier directly. The present results are highly consistent with the previous model assumptions for the cuticular structure and transport barrier. Furthermore, this comparative study on leaf and fruit cuticles provides further insights linking the cuticular wax chemistry to the physiological properties of the plant cuticle. N2 - Die pflanzliche Kutikula ist eine kontinuierliche extrazelluläre Schutzschicht, welche die oberirdischen primären Abschlussgewebe höherer Pflanzen bedeckt, die in Kontakt mit der umgebenden Atmosphäre stehen. Die primäre Funktion der lipophilen Kutikularmembran, die hauptsächlich aus dem Biopolymer Kutin und kutikulären Wachsen aufgebaut ist, besteht darin, die Pflanzenorgane vor unkontrolliertem Wasserverlust zu schützen. Die chemische Zusammensetzung und die biophysikalischen Eigenschaften von kutikulären Wachsen beeinflussen weitgehend die Geschwindigkeit der Wasserdiffusion über die Kutikula. Die Transpiration von Früchten spielt eine wichtige Rolle in der Ausbildung und Beständigkeit von Fruchtqualitätsmerkmalen. Unterschiede in der Transpiration und der chemischen Zusammensetzung der kutikulären Wachse zwischen Frucht und Blatt sollten untersucht werden. Die vorliegende Studie zielt darauf ab, die Wasserpermeabilität und die kutikuläre Wachszusammensetzung von Früchten und Blättern aus einem breiten Spektrum von Pflanzenarten zu untersuchen und die verschiedenen Rollen der kutikulären Wachskomponenten in den Transpirationsbarriereeigenschaften aufzuklären. Um diesen Zielen näherzukommen, wurden Frucht- und Blattproben von 17 Arten untersucht. Die kutikuläre Transpiration von intakten Früchten und astomatären adaxialen Blattoberflächen ausgewählter Arten sowie der minimale Leitwert von deren Blättern, ermittelt durch Austrocknungskurven mit intakten Blättern, wurden gravimetrisch bestimmt. Die chemische Zusammensetzung der kutikulären Wachse von Früchten und Blättern wurde durch Gaschromatographie mit Flammenionisation und Massenspektrometrie nachgewiesen. Die Wasserdurchlässigkeit von Früchten reichte von 3,7 x 10-5 m s-1 (Prunus domestica subsp. syriaca) bis 37,4 x 10-5 m s-1 (Coffea arabica), während die Werte für Blätter zwischen 1,6 x 10-5 m s-1 (Cornus officinalis) und 4,5 x 10-5 m s-1 variierten (Prunus domestica subsp. syriaca). Der interspezifische Vergleich der Wasserdurchlässigkeit von Früchten war deutlich höher als die der Blätter. Chemische Analysen der kutikulären Wachse zeigten, dass Fettsäuren, primäre Alkohole, n-Alkane, Aldehyde und Alkylester die häufigsten sehr langkettigen aliphatischen Verbindungsklassen für Früchte und Blätter waren. Sterole wie β-Sitosterol und Campesterol und Triterpenoide zum Beispiel Oleanolsäure, Ursolsäure, α-Amyrin und ß-Amyrin, waren die wichtigsten zyklischen Verbindungsklassen in den kutikulären Wachsmischungen. Die Menge und Zusammensetzung der kutikulären Wachse, sowohl von Früchten als auch von Blättern, variierte auf intraspezifischer Ebene. Es waren keine signifikanten Korrelationen zwischen der Menge der kutikulären Wachsablagerung oder der kutikulären Wachszusammensetzung und der Wasserdurchlässigkeit von Frucht- und/oder Blattoberflächen zu erkennen. Wurden die Frucht- und Blattdatensätze zusammen untersucht, so war eine signifikante Korrelation zwischen der durchschnittlichen Kettenlänge von sehr langkettigen aliphatischen Verbindungen und der Permeabilität festzustellen, ging eine längere durchschnittliche Kettenlänge mit geringerer Wasserdurchlässigkeit einher. Interessanterweise wurden große Mengen an n-Nonacosan in Fruchtwachsen der untersuchten Rosaceae-Arten nachgewiesen. Diese Früchte zeigten ein relativ niedriges Transpirationsniveau, das sehr nahe an der Permeabilität ihrer Blattkutikeln lag. Die vorliegende Studie liefert weitere Belege dafür, dass der im Allgemeinen niedrigere minimale Leitwert von Blättern auf die – im Vergleich zur Kutikula von Früchten – längere durchschnittliche Kettenlänge der aliphatischen Verbindungen zurückzuführen ist. Die Anhäufung von Gesamtwachs, Triterpenoiden oder aliphatischen Verbindungen trägt nicht direkt zur Transpirationsbarriere bei. Die vorliegenden Ergebnisse decken sich in hohem Maße mit den bisherigen Modellannahmen zur Struktur der Kutikula und der von ihr vermittelten Funktion als Transpirationsbarriere. Darüber hinaus gibt diese Vergleichsstudie über die Kutikula von Früchten und Blättern zahlreiche Einblicke, die dabei helfen können, die kutikuläre Wachschemie mit den physiologischen Eigenschaften der pflanzlichen Kutikula zu verknüpfen. KW - Cuticle KW - Transpiration barrier KW - Fruit KW - Leaf KW - Permeability KW - ACL KW - Cuticular water permeabilities KW - Cuticular waxes KW - Aliphatics KW - Cyclics KW - Chain-length distribution Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-152948 ER - TY - THES A1 - Pedrotti, Lorenzo T1 - The SnRK1-C/S1-bZIPs network: a signaling hub in Arabidopsis energy metabolism regulation T1 - Das SnRK1-C/S1-bZIP-Netzwerk: ein Signalknoten in der Regulation des Arabidopsis Energie-Metabolismus N2 - The control of energy homeostasis is of pivotal importance for all living organisms. In the last years emerged the idea that many stress responses that are apparently unrelated, are actually united by a common increase of the cellular energy demand. Therefore, the so called energy signaling is activated by many kind of stresses and is responsible for the activation of the general stress response. In Arabidopsis thaliana the protein family SnF1- related protein kinases (SnRK1) is involved in the regulation of many physiological processes but is more known for its involvement in the regulation of the energy homeostasis in response to various stresses. To the SnRK1 protein family belong SnRK1.1 (also known as KIN10), SnRK1.2 (KIN11), and SnRK1.3 (KIN12). SnRK1 exerts its function regulating directly the activity of metabolic enzymes or those of key transcription factors (TFs). The only TFs regulated by SnRK1 identified so far is the basic leucine zipper (bZIP) 63. bZIP63 belongs to the C group of bZIPs (C-bZIPs) protein family together with bZIP9, bZIP10, and bZIP25. SnRK1.1 phosphorylates bZIP63 on three amino acids residues, serine (S) 29, S294, and S300. The phosphorylation of tbZIP63 is strongly related to the energy status of the plant, shifting from almost absent during the normal growth to strongly phosphorylated when the plant is exposed to extended dark. bZIPs normally bind the DNA as dimer in order to regulate the expression of their target genes. C-bZIPs preferentially form dimers with S1-bZIPs, constituting the so called C/S1- bZIPs network. The SnRk1 dependent phosphorylation of bZIP63 regulates its activation potential and its dimerization properties. In particular bZIP63 shift its dimerization preferences according to its phosphorylation status. The non-phosphorylated form of bZIP63 dimerize bZIP1, the phosphorylates ones, instead, forms dimer with bZIP1, bZIP11, and bZIP63 its self. Together with bZIP63, S1-bZIPs are important mediator of part of the huge transcriptional reprogramming induced by SnRK1 in response to extended dark. S1-bZIPs regulate, indeed, the expression of 4'000 of the 10'000 SnRK1-regulated genes in response to energy deprivation. In particular S1-bZIPs are very important for the regulation of many genes encoding for enzymes involved in the amino acid metabolism and for their use as alternative energy source. After the exposition for some hours to extended dark, indeed, the plant make use of every energy substrate and amino acids are considered an important energy source together with lipids and proteins. Interestingly, S1- bZIPs regulate the expression of ETFQO. ETFQO is a unique protein that convoglia the electrons provenienti from the branch chain amino acids catabolism into the mitochondrial electron transport chain. The dimer formed between bZIP63 and bZIP2 recruits SnRK1.1 directly on the chromatin of ETFQO promoter. The recruitment of SnRK1 on ETFQO promoter is associated with its acetylation on the lysine 14 of the histone protein 3 (K14H3). This chromatin modification is normally asociated with an euchromatic status of the DNA and therefore with its transcriptional activation. Beside the particular case of the regulation of ETFQO gene, S1-bZIPs are involved in the regulation of many other genes activated in response of different stresses. bZIP1 is for example an important mediator of the salt stress response. In particular bZIP1 regulates the primary C- and N-metabolism. The expression of bZIP1, in response of both salt ans energy stress seems to be regulated by SnRK1, as it is the expression of bZIP53 and bZIP63. Beside its involvement in the regulation of the energy stress response and salt response, SnRK1 is the primary activators of the lipids metabolism during see germination. SnRK1, indeed, controls the expression of CALEOSINs and OLEOSINs. Those proteins are very important for lipids remobilization from oil droplets. Without their expression seed germination and subsequent establishment do not take place because of the absence of fuel to sustain these highly energy costly processes, which entirely depend on the catabolism of seed storages. N2 - Die Kontrolle der Energiehomöostase ist für alle lebenden Organismen von großer Bedeutung. In den letzten Jahren kam die Idee auf, dass viele Stressantworten, die scheinbar unabhängig voneinander sind, durch den Energiebedarf doch miteinander verbunden sind. Das sogenannte Energie-Signaling wird von vielen verschiedenen Stress- Arten aktiviert und ist verantwortlich für die Aktivierung der allgemeinen Stressantwort. In Arabidopsis thaliana ist die Proteinfamilie der SnF1-verwandten Proteinkinasen (SnRK1) an der Regulation vieler physiologischer Prozesse beteiligt. Auch bei der Regulation der Energiehomöostase als Folge von Stress spielen SnRK1-Kinasen eine wichtige Rolle. Proteine aus der SnRK1-Familie sind SnRK1.1, auch als KIN10 bezeichnet, SnRK1.2 (KIN11) und SnRK1.3 (KIN12). SnRK1-Proteine können die Aktivität von metabolischen Enzyme oder bestimmten Transkriptionsfaktoren (TF) direkt regulieren. Bislang wurde nur für den basischen Leucin-Zipper (bZIP) TF bZIP63 die Regulation durch SnRK1 gezeigt. bZIP63 gehört zur Gruppe C der bZIP Proteinfamilie (C-bZIP). Ebenfalls zu Gruppe C werden bZIP9, bZIP10 und bZIP25 zugeordnet. SnRK1.1 phosphoryliert das bZIP63- Protein an Serin (S) 29, S294 und S300. Der Grad der Phosphorylierung von bZIP63 steht in direktem Zusammenhang mit dem Energiehaushalt der Pflanze. Unter normalen Bedingungen wird bZIP63 kaum phosphoryliert, während bei verlängerter Nacht bZIP63 stark phosphoryliert wird. bZIP TF bilden untereinander Dimere aus und binden so an die DNA um die Expression ihrer Zielgene zu regulieren. C-bZIP TF bilden bevorzugt Dimere mit bZIP TF der Gruppe S1, bekannt als das C/S1-bZIP-Netzwerk. Die SnRK1-abhängige Phosphorylierung von bZIP63 steuert das Aktivierungspotential und die Dimerisierungseigenschaften. Besonders bei bZIP63 ändern sich die Dimerisierungspartner in Abhängigkeit des Phosphorylierungsgrads. Nicht-phosphoryliert dimerisiert bZIP61 mit bZIP1, im phosphorylierten Zustand dagegen bildet bZIP63 Dimere neben bZIP1 auch mit bZIP11 und bZIP63. S1-bZIP TF sowie bZIP63 sind wichtige Regulatoren der transkriptionellen Reprogrammierung, die durch SnRK1 bei verlängerter Dunkelheit induziert wird. S1-bZIP TF regulieren die Expression von 4'000 der 10'000 durch SnRK1 regulierten Gene in der Energieverarmungsantwort. Besonders S1-bZIP TF sind sehr wichtig für die Regulation vieler Gene, die für Enzyme aus dem Aminosäuremetabolismus codieren und als alternative Energiequelle der Pflanze bekannt sind. Wird die Nacht für einige Stunden verlängert, greift die Pflanze auf jede mögliche Energiequelle zurück. Als Energiequelle werden besonders Aminosäuren, aber auch Lipiden und Proteinen herangezogen. Interessanterweise regulieren S1-bZIP TF die Expression von ETFQO. ETFQO ist ein besonderes Protein, das die Elektronen aus dem Metabolismus verzweigter Aminosäuren in die mitochondriale Elektronentransportkette steuert. Das Dimer aus bZIP63 und bZIP2 rekrutiert SnRK1.1 direkt an das Chromatin des ETFQO-Promotors. Dieser Rekrutierung folgt die Acetylierung des Histonproteins 3 (K14H3) am Lysin 14. Diese Modifikation des Chromatins führt normalerweise zu einem euchromatischen Status der DNA und der nachfolgenden transkriptionellen Aktivierung. Neben der Regulation des ETFQO-Gens sind S1-bZIP TF auch an der Regulation von vielen anderen Genen in Folge von verschiedenen Stressen beteiligt. bZIP1 ist beispielsweise ein wichtiger Regulator der Antwort auf Salz-Stress. Auch der primäre Kohlenstoff- und Stickstoffmetabolismus werden von bZIP1 reguliert. Es wird angenommen, dass die Expression von bZIP1 wie auch von bZIP53 und bZIP63 in der Antwort auf Salzstress und Energieverarmung durch SnRK1 gesteuert wird. Abgesehen von der Regulation der Antwort auf Energieverarmung und Salzstress spielen SnRK1-Proteine auch bei der Aktivierung des Lipidmetabolismus während der Keimung eine Rolle. SnRK1 kontrolliert die Expression von CALEOSINs und OLEOSINs. Diese beiden Proteine sind sehr wichtig für die Mobilisierung von Lipiden aus Öltröpfchen. In Abwesenheit von SnRK1 finden aufgrund von Energiemangel weder die Keimung noch die nachfolgende Entwicklung statt. KW - Ackerschmalwand KW - Homöostase KW - Proteinkinasen KW - Stress-Syndrom KW - SnRK1 KW - bZIPs KW - mitochondria KW - energy metabolism Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-116080 ER - TY - THES A1 - Gutermuth, Timo T1 - Identifizierung und Charakterisierung des Signalweges zur Aktivierung von Anionenkanälen während des Pollenschlauchwachstums T1 - Identification and characterization of union channel activation during pollen tube growth N2 - Pollenschläuche sind ein Modellsystem zur Untersuchung pflanzlicher Wachstumsprozesse. Zellwachstum in Pollenschläuchen zeichnet sich durch den gerichteten Transport und Fusion von Vesikeln mit der apikalen Zellmembran des Pollenschlauchs aus. Der Vesikeltransport erfolgt entlang des Pollenschlauchs durch Aktin-Filamente bis an die Organell- und Zytoskelett-freie apikale Zone, wo sich die Vesikel sammeln und in oszillierenden Wachstumsschüben mit der apikalen Zellmembran fusionieren (Yang et al., 1998; Zonia et al., 2001, Gu et al., 2005; Chen et al., 2003; Gu et al., 2005; de Graaf et al., 2005; Lee et al., 2008; Cheung et al., 2010; Quin und Yang et al., 2011). Die polaren Wachstumsprozesse des Pollenschlauches sind an ein Ionenflussmuster gekoppelt, welches durch den Einsatz der Vibrating Probe-Technik zeitlich aufgelöst werden konnten. Es konnte ein zeitversetzter oszillierender Einstrom von Calcium, Kalium und Protonen sowie der zeitgleich mit den Wachstumsschüben auftretende oszillierende Ausstrom von Chlorid aus der Pollenschlauchspitze nachgewiesen werden (Kühtreiber und Jaffe et al., 1990; Holdaway-Clarke et al., 1997; Feijo et al., 1999, Messerli et al., 1999, Zonia et al., 2001). Die Inhibierung des Chloridausstroms resultiert in einem sofortigen Wachstumsstopp und verdeutlicht die Notwendigkeit des Anionenausstroms für das polare Zellwachstum in Pollenschläuchen (Breygina et al., 2009). Durch die in dieser Arbeit durchgeführten Experimente konnten die an dem Anionenausstrom beteiligten Anionenkanäle, sowie deren Ca2+-abhängigen regulatorischen Komponenten identifiziert und mit Hilfe der TEVC-Technik elektrophysiologisch an intakten Arabidopsis thaliana-Pollenschläuchen charakterisiert werden. Weiterhin konnte die physiologische Rolle der für den Anionenausstrom verantwortlichen Kanäle auf das polare Zellwachstum in Arabidopsis thaliana Pollenschläuchen nachgewiesen werden. Durch Transkriptionsanalysen wurde die Expression des S-Typ-Anionenkanals SLAH3 sowie der R-Typ-Anionenkanäle ALMT12, ALMT13 und ALMT14 in Arabidopsis thaliana Pollenschläuchen belegt und deren transkriptionelle Regulation durch die Anionenkonzentration und Komposition des Keimungsmediums nachgewiesen werden. Eine elektrophysiologische Charakterisierung an intakten Arabidopsis thaliana Pollenschläuchen konnte sowohl einen Anstieg der SLAH3 vermittelten S-Typ-Ströme, als auch ALMT12-, ALMT13- und ALMT14 vermittelte R Typ-Anionenströme bei steigenden Anionenkonzentrationen im Keimungsmedium nachweisen. Die Charakterisierung der Verlustmutanten von SLAH3, ALMT12, ALMT13 und ALMT14 resultierte in einer Abnahme des Anionenausstroms und einer Reduktion des Längenwachstums der getesteten Mutanten. Es konnten ebenfalls die regulatorischen Komponenten der Signalkette zur Anionenkanalaktivierung identifiziert werden. Die Aktivierung von SLAH3 und ALMT12 durch die Calcium-abhängigen Kinasen CPK2, CPK20 und CPK6 aus Arabidopsis thaliana Pollenschläuchen konnte mittels einer Kombination von elektrophysiologischen- und molekularbiologischen Techniken nachgewiesen werden. Somit wurden nicht nur die für den Anionenausstrom verantwortlichen Anionenkanäle identifiziert, sondern auch die Signalkette zu deren Aktivierung durch spitzenlokalisierte Calcium-abhängige Kinasen aufgeklärt werden. Diese Signalkaskade führt ebenfalls durch die artifizielle Erhöhung der zytoplasmatischen Calciumkonzentration durch das Calcium-Ionophor A23187 zu einem Anstieg des S Typ- und R Typ Anionenkanalaktivität in Arabidopsis thaliana-Pollenschläuchen. Eine intensivere Charakterisierung des entdeckten Calcium-vermittelten Anionenausstroms erfolgte am transgenen pLat52-Chlorid-Sensor bzw. an YC3.6 Tabak Pollenschläuchen durch die Kombination von TEVC-Technik und Fluoreszensmikroskopie. Dies ermöglichte die simultane Messung der zytoplasmatischen Calcium- bzw. Chloridkonzentration in Nicotiana tabacum Pollenschläuchen bei gleichzeitiger Ableitung der Ganzzellströme. Die elektrophysiologische und fluoreszenzmikroskopische Charakterisierung erbrachte erstmals den Nachweis für eine exklusive Lokalisation von hyperpolarisations-aktivierten Calciumkanälen in der Pollenschlauchspitze, welche sich durch die Verwendung der TEVC-Technik gezielt aktivieren ließen. Diese Aktivierung der spitzenlokalisierten Calciumkanäle induziert den Anionenausstrom durch den Anstieg der apikalen Calciumkonzentration. Die Inhibierung der Calciumkanäle durch den Calciumkanalblocker Lanthan führt zu einem vollständigen Verlust des Calciumeinstroms und des daraus resultierenden Anioneneinstroms. Durch die Inhibierung der Calciumkanäle kommt es gleichzeitig zu einer Akkumulation von Chlorid in der apikalen Zone, die zum Anschwellen der Pollenschlauchspitze führt. Die Inhibierung der Anionenkanäle durch Niflumsäure hat hingegen keinen Einfluss auf den spitzenlokalisierten Calciumeinstrom, sondern reduziert nur den gemessenen Anionenausstrom. Somit wird ein kausaler Zusammenhang zwischen der Erhöhung der apikalen Ca2+-Konzentration und einer Anionenkanalaktivierung weiter verdeutlicht. Durch die Anwendung der TEVC-Technik an intakten Pollenschläuchen konnten erstmals Aktionspotenzial ähnliche Depolarisierungstransienten, welche sich auf die apikale Zone des Pollenschlauchs beschränken und zeitgleich mit dem Anionenausstrom stattfinden, nachgewiesen werden. Durch diese Arbeit kann erstmals ein Modell des Calcium-vermittelten oszillierenden Anionenausstroms aus der Pollenschlauchspitze aufgestellt werden. Dieses verknüpft die Regulation der beteiligten R-Typ-Anionenkanäle ALMT12, ALMT13 und ALMT14 und des S-Typ-Anionenkanals SLAH3 durch die Calcium-abhängigen Kinasen CPK2, CPK20 und CPK6 mit dem spitzenlokalisierten oszillierenden Calciumeinstrom. Das Modell verdeutlicht die physiologische Bedeutung des simultanen Ca2+-Ein- und Anionenausstroms für das polare Zellwachstum von Pollenschläuchen.   N2 - In this study pollen tubes were used as a model cell system to study plant polar growth. Polar cell growth is characterized by a vectorial transport of vesicles to the apical dome of pollen tubes. Vesicles fuse with the apical plasma membrane leading to a polar elongation of the tube tip. Vesicle transport to the clear zone is mediated by F actine bundles and these vesicles serve as a pool of membranes for the surface increase. In an oscillatory growth pulse the vesicle move from the clear zone to the apical plasma membrane in order to fuse with the plasma membrane (Yang et al., 1998; Zonia et al., 2001, Gu et al., 2005; Chen et al., 2002; Gu et al., 2005; de Graaf et al., 2005; Lee et al., 2008; Cheung et al., 2010; Quin und Yang et al., 2011). Pollen tube elongation is associated with a distinct pattern of ion fluxes that cannot be uncoupled from the growth process. A tip localized influx of calcium, potassium and protons, as well as the simultaneous oscillatory apical efflux of chloride are features of growing pollen tubes (Kühtreiber und Jaffe et al., 1990; Holdaway-Clarke et al., 1997; Feijo et al., 1999, Messerli et al., 1999, Zonia et al., 2001). Inhibition of apical chloride efflux leads to an instantaneous pollen tube growth arrest (Breygina et al., 2009) demonstrating the importance of the oscillatory apical chloride efflux for cell elongation. Within the framework of this dissertation, I was able to identify the anion channels responsible for anion fluxes and to characterize the regulatory components for channel activation by using the TEVC technique in intact pollen tubes. A quantitative analysis of ion channel transcripts in Arabidopsis thaliana pollen tubes via qRT-PCR demonstrated the expression of the S-type anion channel SLAH3, the R-type anion channels ALMT12, ALMT13 and ALMT14 as well as their transcriptional regulation by different anion concentrations. The electrophysiological characterization of the anion currents in intact pollen tubes revealed an anion concentration that depends on an increase in SLAH3 mediated S-type currents and ALMT12, ALMT13 and ALMT14 mediated R-type currents with rising anion concentrations in the germination medium. The electrophysiological characterization of slah3, almt12, almt12 x almt13 and almt12 x almt14 knock-out mutant pollen tubes resulted in decreased anion currents and a reduction in pollen tube length compared to the wild-type. An activation of SLAH3 and ALMT12 by the calcium dependent kinases CPK2, CPK20 and CPK6 in Arabidopsis thaliana pollen tubes was proven with a combination of electrophysiological and molecular biology techniques. Strong evidence is presented here for the regulation of oscillatory anion efflux by simultaneous calcium influx at the pollen tube tip via calcium dependent kinases. An increase of the cytoplasmic calcium concentration by the calcium ionophore A23187 leads to an increase of S-type and R-Type anion channel current in Arabidopsis thaliana pollen tubes. In order to substantiate the hypothesis of a Ca2+-dependent anion channel activation mechanism in pollen tubes a combination of TEVC technique and fluorescence microscopy was applied with transgenic tobacco pollen tubes expressing the genetically encoded anion- and Ca2+-reporters Cl--Sensor and YC3.6, respectively. This technique enabled the simultaneous measurement of the cytoplasmic calcium- or chloride concentration along with voltage-clamp experiments. The application of 1 sec lasting hyperpolarization pulses with the TEVC technique and simultaneous live-cell Ca2+- and anion imaging demonstrated the existence of hyperpolarization activated calcium channels in the pollen tube tip. The activation of the tip localized calcium channels by -200 mV pulses evoked a decrease in apical anion concentration depending on an elevation of the calcium concentration at the pollen tube tip. Inhibition of the calcium channels by lanthan abolished the calcium influx and subsequently the anion efflux. Inhibiting the Ca2+ channels resulted in an apical accumulation of the cytoplasmic anion concentration and led to pollen tube tip swelling. Anion channel inhibition by niflumic acid did not alter tip localized calcium influx providing sufficient evidence for a causal relationship between Ca2+- and anion channel activity. Furthermore, evidence is presented for the existence of membrane potential spikes in the pollen tube tip caused by the Ca2+-dependent anion channel activation that look very similar to action potentials and were located in the pollen tube tip. This local restriction of the Ca2+-dependent anion channel activation to the region of growth shows the necessity of the anion efflux for the pollen tube elongation. On the basis of this dissertation I was able to propose a model of a calcium-dependent anion channel activation mechanism in the pollen tube tip, which involves the R-type anion channels ALMT12, ALMT13 and ALMT14 and the S-type anion channel SLAH3 being regulated by the calcium dependent kinases CPK2, CPK20 and CPK6. The model highlights the physiological relevancy of the interplay between the tip focused anion efflux and Ca2+ influx for the pollen tube growth process.   KW - Pollenschlauch KW - Pollenschlauch Calcium Anionen Kanal Kinase KW - pollen tube calcium anion channel kinase Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-139232 ER - TY - THES A1 - Horn, Hannes T1 - Analysis and interpretation of (meta-)genomic data from host-associated microorganisms T1 - Analyse und Interpretation von (meta-)genomischen Daten aus Wirt-assoziierten Mikroorganismen N2 - Host–microbe interactions are the key to understand why and how microbes inhabit specific environments. With the scientific fields of microbial genomics and metagenomics, evolving on an unprecedented scale, one is able to gain insights in these interactions on a molecular and ecological level. The goal of this PhD thesis was to make (meta–)genomic data accessible, integrate it in a comparative manner and to gain comprehensive taxonomic and functional insights into bacterial strains and communities derived from two different environments: the phyllosphere of Arabidopsis thaliana and the mesohyl interior of marine sponges. This thesis focused first on the de novo assembly of bacterial genomes. A 5–step protocol was developed, each step including a quality control. The examination of different assembly software in a comparative way identified SPAdes as most suitable. The protocol enables the user to chose the best tailored assembly. Contamination issues were solved by an initial filtering of the data and methods normally used for the binning of metagenomic datasets. This step is missed in many published assembly pipelines. The described protocol offers assemblies of high quality ready for downstream analysis. Subsequently, assemblies generated with the developed protocol were annotated and explored in terms of their function. In a first study, the genome of a phyllosphere bacterium, Williamsia sp. ARP1, was analyzed, offering many adaptions to the leaf habitat: it can deal with temperature shifts, react to oxygen species, produces mycosporins as protection against UV–light, and is able to uptake photosynthates. Further, its taxonomic position within the Actinomycetales was infered from 16S rRNA and comparative genomics showing the close relation between the genera Williamsia and Gordonia. In a second study, six sponge–derived actinomycete genomes were investigated for secondary metabolism. By use of state–of–the–art software, these strains exhibited numerous gene clusters, mostly linked to polykethide synthases, non–ribosomal peptide synthesis, terpenes, fatty acids and saccharides. Subsequent predictions on these clusters offered a great variety of possible produced compounds with antibiotic, antifungal or anti–cancer activity. These analysis highlight the potential for the synthesis of natural products and the use of genomic data as screening toolkit. In a last study, three sponge–derived and one seawater metagenomes were functionally compared. Different signatures regarding the microbial composition and GC–distribution were observed between the two environments. With a focus on bacerial defense systems, the data indicates a pronounced repertoire of sponge associated bacteria for bacterial defense systems, in particular, Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, restriction modification system, DNA phosphorothioation and phage growth limitation. In addition, characterizing genes for secondary metabolite cluster differed between sponge and seawater microbiomes. Moreover, a variety of Type I polyketide synthases were only found within the sponge microbiomes. With that, metagenomics are shown to be a useful tool for the screening of secondary metabolite genes. Furthermore, enriched defense systems are highlighted as feature of sponge-associated microbes and marks them as a selective trait. N2 - Mikroben–Wirt Interaktionen sind der Schlüssel, um zu verstehen “Wie?” und “Warum?” Mikroben in bestimmten Umgebungen vorkommen. Mithilfe von Genomik und Metagenomik lassen sich Einblicke auf dem molekularen sowie ökolgischen Level gewinnen. Ziel dieser Arbeit war es, diese Daten zugänglich zu machen und zu vergleichen, um Erkenntnisse auf taxonomischer und funktionaler Ebene in bakterielle Isolate und bakterielle Konsortien zu erhalten. Dabei wurden Daten aus zwei verschiedenen Umgebungen erhoben: der Phyllosphäre von Arabidopsis thaliana und aus der Mesohyl–Matrix mariner Schwämme. Das Ziel war zunächst, bakterieller Genome denovo zu assemblieren. Dazu wurde ein Protokoll, bestehend aus 5 Schritten, entwickelt. Durch Verwendung verschiedener Soft- ware zum Assemblieren konnte SPAdes als am besten geeignet für die gegebenen Daten herausgearbeitet werden. Durch anfängliches Filtern der Daten konnte erste Kontamina- tion entfernt werden. Durch das Anwenden weiterer Methoden, welche ursprünglich für metagenomische Datensätze entwickelt wurden, konnten weitere Kontaminationen erkannt und von den “echten” Daten getrennt werden. Ein Schritt, welcher in den meisten pub- lizierten Assembly–Pipelines fehlt. Das Protokoll ermöglicht das Erstellen hochqualitativer Assemblies, welche zur weiteren Analyse nicht weiter aufbereitet werden müssen. Nachfolgend wurden die generierten Assemblies annotiert. Das Genom von William- sia sp. ARP1 wurde untersucht und durch dessen Interpretation konnten viele Anpassungen an die Existenz in der Phyllosphäre gezeigt werden: Anpassung an Termperaturveränderun- gen, Produktion von Mycosporinen als Schutz vor UV–Strahlung und die Möglichkeit, von der Pflanze durch Photosynthese hergestellte Substanzen aufzunehmen. Seine taxonomische Position wurde aufgrund von 16S rRNA sowie vergleichende Genomik bestimmt. Dadurch konnte eine nahe Verwandtschaft zwischen den Gattungen Williamsia und Gordonia gezeigt werden. In einer weiteren Studie wurden sechs Actinomyceten–Genome, isoliert aus Schwämmen, hinsichtlich ihres Sekundärmetabolismus untersucht. Mihilfe moderner Software konnten in zahlreiche Gen–Cluster identifiziert werden. Zumeist zeigten diese eine Zugehörigkeit zu Polyketidsynthasen, Nichtribosomalen Peptidsynthasen, Terpenen, Fettsäuren oder Sac- chariden. Durch eine tiefere Analyse konnten die Cluster mit chemischen Verbindungen assoziiert werden, welche antibakterielle oder fungizide Eigenschaften besitzen. In der letzten Untersuchung wurden Metagenome von drei Schwämmen sowie Meerwasser auf funktioneller Ebene verglichen. Beobachtet wurden Unterschiede in deren mikrobiellen Konsortien und GC–Gehalt. Schwamm–assoziierte Bakterien zeigten ein ausgeprägtes Inventar an Verteidigungsmechanismen gegenüber deren Vertretern aus dem Meerwasser. Dies beinhaltete vor allem: Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, das Restriktions-Modifikationssystem, DNA Phosphorothioation, oder Gene, welche das Wachstum von Phagen hemmen können. Gene für Sekundärmetabolite waren zwischen Schwamm– und Meerwasser–Metagenomen unterschiedlich stark ausgeprägt. So konnten Typ I Polyketidsynthasen ausschließlich in den Schwamm–Metagenomen gefunden werden. Dies zeigt, dass metagenomische Daten ebenso wie genomische Daten zur Untersuchung des Sekundärmetabolismus genutzt werden können. Des Weiteren zeigt die Anhäufung an Verteidigungsmechanismen eine Anpassung von Schwamm–assoziierten Mikroben an ihre Umgebung und ist ein Hinweis auf deren mögliche selektive Eigenschaft. KW - Bakterien KW - Meeresschwämme KW - Metagenom KW - Phyllosphäre KW - Ackerschmalwand KW - Metagenomics KW - Genomics KW - Phyllosphere KW - Sponges KW - Bacteria KW - Deep sequencing KW - Arabidopsis thaliana KW - Bioinformatics Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-152035 ER - TY - THES A1 - Müller, Stephanie T1 - Plant thermotolerance: The role of heat stress-induced triacylglycerols in \(Arabidopsis\) \(thaliana\) T1 - Thermotoleranz in Pflanzen: Die Rolle von Hitzestress induzierten Triacylglycerolen in \(Arabidopsis\) \(thaliana\) N2 - Plants are exposed to high temperature, especially during hot summer days. Temperatures are typically lowest in the morning and reach a maximum in the afternoon. Plants can tolerate and survive short-term heat stress even on hot summer days. A. thaliana seedlings have been reported to tolerate higher temperatures for different time periods, a phenomenon that has been termed basal thermotolerance. In addition, plants have the inherent capacity to acclimate to otherwise lethal temperatures. Arabidopsis thaliana seedlings acclimate at moderately elevated temperatures between 32–38° C. During heat acclimation, a genetically programmed heat shock response (HSR) is triggered that is characterized by a rapid activation of heat shock transcription factors (HSFs), which trigger a massive accumulation of heat shock proteins that are chiefly involved in protein folding and protection. Although the HSF-triggered heat-shock response is well characterized, little is known about the metabolic adjustments during heat stress. The aim of this work was to get more insight into heat-responsive metabolism and its importance for thermotolerance. In order to identify the response of metabolites to elevated temperatures, global metabolite profiles of heat-acclimated and control seedlings were compared. Untargeted metabolite analyses revealed that levels of polyunsaturated triacylglycerols (TG) rapidly increase during heat acclimation. TG accumulation was found to be temperature-dependent in a temperature range from 32–50° C (optimum at 42° C). Heat-induced TG accumulation was localized in extra-chloroplastic compartments by chloroplast isolation as well as by fluorescence microscopy of A. thaliana cell cultures. Analysis of mutants deficient in all four HSFA1 master regulator genes or the HSFA2 gene revealed that TG accumulation occurred independently to HSF. Moreover, the TG response was not limited to heat stress since drought and salt stress (but not short-term osmotic, cold and high light stress) also triggered an accumulation of TGs. In order to reveal the origin of TG synthesis, lipid analysis was carried out. Heat-induced accumulation of TGs does not derive from massive de novo fatty acid (FA) synthesis. On the other hand, lipidomic analyses of A. thaliana seedlings indicated that polyunsaturated FA from thylakoid galactolipids are incorporated into cytosolic TGs during heat stress. This was verified by lipidomic analyses of A. thaliana fad7/8 transgenic seedlings, which displayed altered FA compositions of plastidic lipids. In addition, wild type A. thaliana seedlings displayed a rapid conversion of plastidic monogalactosyldiacylglycerols (MGDGs) into oligogalactolipids, acylated MGDGs and diacylglycerols (DGs). For TG synthesis, DG requires a FA from the acyl CoA pool or phosphatidylcholine (PC). Seedlings deficient in phospholipid:diacylglycerol acyltransferase1 (PDAT1) were unable to accumulate TGs following heat stress; thus PC appears to be the major FA donor for TGs during heat treatment. These results suggest that TG and oligogalactolipid accumulation during heat stress is driven by post-translationally regulated plastid lipid metabolism. TG accumulation following heat stress was found to increase basal thermotolerance. Pdat1 mutant seedlings were more sensitive to severe heat stress without prior acclimatization, as revealed by a more dramatic decline of the maximum efficiency of PSII and lower survival rate compared to wild type seedlings. In contrast, tgd1 mutants over-accumulating TGs and oligogalactolipids displayed a higher basal thermotolerance compared to wild type seedlings. These results therefore suggest that accumulation of TGs increases thermotolerance in addition to the genetically encoded heat shock response. N2 - Pflanzen sind besonders während der Sommerzeit hohen Temperaturschwankungen ausgesetzt. Temperaturen sind am Morgen meist niedrig und erreichen ihr Maximum während des Nachmittags. Pflanzen können Hitzestress im Sommer jedoch für eine kurze Zeit tolerieren. Arabidopsis thaliana Keimlinge können höhere Temperaturen für verschiedene Zeitspannen tolerieren, was als Basale Thermotoleranz beschrieben wird. Zusätzlich können Pflanzen durch Akklimatisierung eine Toleranz zu andernfalls letalen Temperaturen erwerben. A. thaliana Keimlinge beginnen sich bereits bei moderat erhöhten Temperaturen zwischen 32–38° C zu akklimatisieren. Während der Hitzeakklimatisierung wird eine genetisch programmierte Hitzeschockantwort (HSR) ausgelöst, welche durch eine rasche Aktivierung von Hitzeschock-Transkriptionsfaktoren (HSF) eingeleitet wird. Dies führt wiederum zu einem enormen Anstieg von einer Reihe von Hitzeschockproteinen (HSP), welche an der Faltung und dem Schutz der Proteine beteiligt sind. Obwohl die HSF-induzierte Hitzeschockantwort bereits gut charakterisiert ist, ist über die metabolomische Anpassung während des Hitzestress nur wenig bekannt. Das Ziel dieser Arbeit war es mehr Kenntnisse von hitze-respondierenden Metaboliten zu erhalten sowie deren Bedeutung für die Thermotoleranz. Zur Identifizierung von thermosensitiven Metaboliten, wurden die Metabolitprofile von Hitze akklimatisierten und Kontrollkeimlingen miteinander verglichen. Mittels ungerichteter Metabolit Analyse wurde ein rascher Anstieg von vielfach ungesättigten Triacylglycerolen (TG) während der Hitzeakklimatisierung nachgewiesen. Der TG Anstieg ist temperaturabhängig in einem Bereich von 32–50° C (Optimum bei 42° C). Der hitzeinduzierte TG Anstieg konnte mittels Chloroplastenisolierung sowie der separaten Analyse von Wurzel und Spross in den extrachloroplastidären Kompartimenten lokalisiert werden. Dies konnte durch Fluoreszenz Mikroskopie in Zellkulturen von A. thaliana bestätigt werden. Die Analyse von Mutanten, die einen Defekt in allen vier HSFA1 Masterregulatoren oder in dem HSFA2 Gen besitzen, zeigte, dass der Anstieg der TGs keine Abhängigkeit von den HSFs aufweist. Zudem ist der TG Anstieg nicht nur auf die Hitzestressantwort begrenzt, sondern auch durch Trockenheit und Salzstress induzierbar, jedoch nicht durch kurzzeitigen osmotischen-, Kälte- und Hochlichtstress. Zur Aufklärung des Ursprungs der TG Synthese wurde eine Lipidanalyse durchgeführt. Die hitzeinduzierte TG Akkumulation durch eine massive De Novo Fettsäuresynthese konnte ausgeschlossen werden. Die Untersuchung des Lipidoms von A. thaliana Keimlingen nach Hitze bot jedoch Hinweise auf einen Einbau von vielfach ungesättigten Fettsäuren aus thylakoiden Galaktolipiden in zytosolische TGs. Dies konnte durch die Untersuchung des Lipidoms von fad7/8 transgenen A. thaliana Keimlingen mit veränderter Fettsäure Komposition der plastidären Lipide bestätigt werden. Der Wildtyp von A. thaliana wies zudem eine rasche Umwandlung von plastidärem Monogalactosyldiacylglycerolen (MGDGs) zu Oligogalaktolipiden, acylierten MGDGs und Diacylglycerolen (DGs) auf. Für die TG Biosynthese wird eine Fettsäure aus dem Acyl-CoA Pool oder von Phosphatidylcholin (PC) auf ein DG übertragen. Keimlinge, die einen Defekt in der Phosolipid:Diacylglycerol Acyltransferase (PDAT1) aufweisen, waren nicht in der Lage TGs nach Hitzestress zu akkumulieren, auf PC als der wesentliche Fettsäure-Donor für TGs nach Hitzestress hinweist. Die Ergebnisse deuten auf einen TG und Oligogalaktolipid Anstieg durch einen posttranskriptionell regulierten Lipidumbau während des Hitzestress hin. Es konnte gezeigt werden, dass der TG Anstieg nach Hitzestress zu einer erhöhten Thermotoleranz führt. Keimlinge der pdat1 Mutanten waren ohne Akklimatisierung empfindlicher gegenüber massiven Hitzestress, da sowohl ein dramatischer Abfall der maximalen Effizienz des Photosystems II und eine niedrigere Überlebensrate im Vergleich zu Keimlingen des Wildtyps nachgewiesen wurden. Im Gegensatz dazu zeigten tgd1 Mutanten, welche eine Überakkumulation von TGs und Oligogalaktolipiden aufweisen, eine höhere Thermotoleranz auf als Keimlinge des Wildtyps. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die TG Akkumulation die Thermotoleranz zusätzlich zu der genetisch kodierten Hitzeschockantwort erhöht. KW - Triglyceride KW - Ackerschmalwand KW - Hitzestress KW - thermotolerance KW - Thermotoleranz KW - lipid remodeling KW - Lipidumbau Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-152829 ER - TY - THES A1 - Slaby, Beate Magdalena T1 - Exploring the microbiome of the Mediterranean sponge \(Aplysina\) \(aerophoba\) by single-cell and metagenomics T1 - Untersuchungen am Mikrobiom des Mittelmeerschwamms \(Aplysina\) \(aerophoba\) mittels Einzelzell- und Metagenomik N2 - Sponges (phylum Porifera) are evolutionary ancient, sessile filter-feeders that harbor a largely diverse microbial community within their internal mesohyl matrix. Throughout this thesis project, I aimed at exploring the adaptations of these symbionts to life within their sponge host by sequencing and analyzing the genomes of a variety of bacteria from the microbiome of the Mediterranean sponge Aplysina aerophoba. Employed methods were fluorescence-activated cell sorting with subsequent multiple displacement amplification and single-cell / ‘mini-metagenome’ sequencing, and metagenomic sequencing followed by differential coverage binning. These two main approaches both aimed at obtaining genome sequences of bacterial symbionts of A. aerophoba, that were then compared to each other and to references from other environments, to gain information on adaptations to the host sponge environment and on possible interactions with the host and within the microbial community. Cyanobacteria are frequent members of the sponge microbial community. My ‘mini-metagenome’ sequencing project delivered three draft genomes of “Candidatus Synechococcus spongiarum,” the cyanobacterial symbiont of A. aerophoba and many more sponges inhabiting the photic zone. The most complete of these genomes was compared to other clades of this symbiont and to closely related free-living cyanobacterial references in a collaborative project published in Burgsdorf I*, Slaby BM* et al. (2015; *shared first authorship). Although the four clades of “Ca. Synechococcus spongiarum” from the four sponge species A. aerophoba, Ircinia variabilis, Theonella swinhoei, and Carteriospongia foliascens were approximately 99% identical on the level of 16S rRNA gene sequences, they greatly differed on the genomic level. Not only the genome sizes were different from clade to clade, but also the gene content and a number of features including proteins containing the eukaryotic-type domains leucine-rich repeats or tetratricopeptide repeats. On the other hand, the four clades shared a number of features such as ankyrin repeat domain-containing proteins that seemed to be conserved also among other microbial phyla in different sponge hosts and from different geographic locations. A possible novel mechanism for host phagocytosis evasion and phage resistance by means of an altered O antigen of the lipopolysaccharide was identified. To test previous hypotheses on adaptations of sponge-associated bacteria on a broader spectrum of the microbiome of A. aerophoba while also taking a step forward in methodology, I developed a bioinformatic pipeline to combine metagenomic Illumina short-read sequencing data with PacBio long-read data. At the beginning of this project, no pipelines to combine short-read and long-read data for metagenomics were published, and at time of writing, there are still no projects published with a comparable aim of un-targeted assembly, binning and analysis of a metagenome. I tried a variety of assembly programs and settings on a simulated test dataset reflecting the properties of the real metagenomic data. The developed assembly pipeline improved not only the overall assembly statistics, but also the quality of the binned genomes, which was evaluated by comparison to the originally published genome assemblies. The microbiome of A. aerophoba was studied from various angles in the recent years, but only genomes of the candidate phylum Poribacteria and the cyanobacterial sequences from my above-described project have been published to date. By applying my newly developed assembly pipeline to a metagenomic dataset of A. aerophoba consisting of a PacBio long-read dataset and six Illumina short-read datasets optimized for subsequent differential coverage binning, I aimed at sequencing a larger number and greater diversity of symbionts. The results of this project are currently in review by The ISME Journal. The complementation of Illumina short-read with PacBio long-read sequencing data for binning of this highly complex metagenome greatly improved the overall assembly statistics and improved the quality of the binned genomes. Thirty-seven genomes from 13 bacterial phyla and candidate phyla were binned representing the most prominent members of the microbiome of A. aerophoba. A statistical comparison revealed an enrichment of genes involved in restriction modification and toxin-antitoxin systems in most symbiont genomes over selected reference genomes. Both are defense features against incoming foreign DNA, which may be important for sponge symbionts due to the sponge’s filtration and phagocytosis activity that exposes the symbionts to high levels of free DNA. Also host colonization and matrix utilization features were significantly enriched. Due to the diversity of the binned symbiont genomes, a within-symbionts genome comparison was possible, that revealed three guilds of symbionts characterized by i) nutritional specialization on the metabolization of carnitine, ii) specialization on sulfated polysaccharides, and iii) apparent nutritional generalism. Both carnitine and sulfated polysaccharides are abundant in the sponge extracellular matrix and therefore available to the sponge symbionts as substrates. In summary, the genomes of the diverse community of symbionts in A. aerophoba were united in their defense features, but specialized regarding their nutritional preferences. N2 - Schwämme (Phylum Porifera) sind evolutionär alte, sessile Filtrierer, die eine äußerst vielfältige mikrobielle Gemeinschaft in ihrer internen Mesohylmatrix beherbergen. Das Ziel meiner Doktorarbeit war es, die Anpassungen dieser Symbionten an das Leben in ihrem Schwammwirt zu erforschen. Dazu habe ich die Genome einer Vielzahl von Bakterien aus dem Mikrobiom des Mittelmeer-Schwammes Aplysina aerophoba sequenziert und analysiert. Meine angewandten Methoden waren die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung mit anschließender so genannter „multiple displacement amplification“ und Einzelzell- / „Mini-Metagenom“-Sequenzierung und metagenomischer Sequenzierung gefolgt von „differential coverage binning“. Diese beiden Ansätze zielten darauf ab, Genomsequenzen von bakteriellen Symbionten von A. aerophoba zu erhalten, die dann sowohl miteinander, als auch mit Referenzen aus anderen Habitaten verglichen wurden. So sollten Informationen gewonnen werden über Anpassungen an ein Leben im Wirtsschwamm und über mögliche Interaktionen mit dem Wirt und innerhalb der mikrobiellen Gemeinschaft. Cyanobakterien sind häufig Mitglieder der bakteriellen Gemeinschaft in Schwämmen. Mein "Mini-Metagenom"-Sequenzierprojekt lieferte drei Genom-Entwürfe von „Candidatus Synechococcus spongiarum,“ dem cyanobakteriellen Symbionten von A. aerophoba und vieler weiterer Schwämme, die die photische Zone bewohnen. Das vollständigste dieser Genome wurden mit anderen Kladen dieses Symbionten verglichen und mit nah verwandten, freien lebenden Cyanobakterien-Referenzen in Burgsdorf I *, Slaby BM * et al. (2015; * geteilte Erstautorenschaft). Obwohl die vier Kladen von „Ca. Synechococcus spongiarum“ aus den vier Schwammarten A. aerophoba, Ircinia variabilis, Theonella swinhoei und Carteriospongia foliascens auf der Ebene der 16S-rRNA-Gensequenzen zu etwa 99% identisch waren, unterschieden sie sich deutlich auf Genom-Ebene. Nicht nur die Genomgrößen waren von Klade zu Klade verschieden, sondern auch der Gengehalt und eine Reihe von Merkmalen, einschließlich Proteinen mit genannten „eukaryotic-like domains,“ leucinreiche „repeats“ oder Tetratricopeptid-„repeats“. Auf der anderen Seite teilten die vier Kladen eine Reihe von Merkmalen wie Ankyrin-„repeat“-Domänen-haltige Proteine, die auch in anderen Phyla von Schwammsymbionten in verschiedenen Wirtsschwämmen und aus verschiedenen geografischen Orten konserviert zu sein schienen. Ein möglicher neuartiger Mechanismus zur Phagozytose-Vermeidung und zur Phagenresistenz mittels eines veränderten O-Antigens des Lipopolysaccharids wurde identifiziert. Um vorherige Hypothesen über die Anpassung von Schwamm-assoziierten Bakterien auf ein breiteres Spektrum des Mikrobioms von A. aerophoba zu testen und gleichzeitig in der Methodik voran zu schreiten, entwickelte ich einen bioinformatischen Arbeitsablauf, um metagenomische Illumina-„short-read“-Sequenzdaten mit PacBio-„long-reads“ zu kombinieren. Zu Beginn dieses Projektes gab es keine veröffentlichte Methodik zur Verknüpfung von „short-reads“ und „long-reads“ für die Metagenomik, und auch jetzt gibt es keine veröffentlichten Projekte mit einem vergleichbaren Ziel von nicht-gezieltem „Assembly“, „Binning“ und Analyse eines Metagenoms. Ich habe eine Auswahl von „Assembly“-Programmen und Einstellungen auf einem simulierten Testdatensatz getestet, der die Eigenschaften der realen metagenomischen Daten widerspiegelt. Die entwickelte „Assembly“-Methode verbesserte nicht nur die Gesamtstatistik, sondern auch die Qualität der einzelnen, „gebinnten“ Genome, die durch Vergleich zu den ursprünglich veröffentlichten Genom-Sequenzen evaluiert wurde. Das Mikrobiom von A. aerophoba wurde in den letzten Jahren aus verschiedenen Blickwinkeln untersucht, aber nur Genome des Candidatus-Phylum Poribakterien und die Cyanobakteriensequenzen aus meinem oben beschriebenen Projekt wurden bisher veröffentlicht. Durch die Anwendung meiner neu entwickelten „Assembly“-Methodik auf einen metagenomischen Datensatz von A. aerophoba bestehend aus einem PacBio-„long-read“-Datensatz und sechs Illumina-„short-read“-Datensätzen, die für das anschließende „differential coverage binning“ optimiert waren, zielte ich darauf ab, eine größere Anzahl und Vielfalt von Symbionten zu sequenzieren. Die Ergebnisse dieses Projektes sind derzeit bei The ISME Journal in Review. Die Komplementierung von Illumina „short-read“ mit PacBio „long-read“-Sequenzdaten für das „binning“ dieses hochkomplexen Metagenoms hat die Gesamt-„assembly“-Statistik sowie die Qualität der „gebinnten“ Genome deutlich verbessert. Siebenunddreißig Genome aus 13 Bakterienphyla und Candidatus-Phyla wurden „gebinnt“, die die prominentesten Mitglieder des Mikrobioms von A. aerophoba darstellten. Ein statistischer Vergleich zeigte eine Anreicherung von Genen, die mit Restriktionsmodifikationen und Toxin-Antitoxin-Systemen zusammenhängen, in den meisten Symbionten-Genomen im Vergleich zu ausgewählten Referenzgenomen. Beides sind Mechanismen zur Verteidigung gegen eindringende Fremd-DNA, die für Schwamm-Symbionten aufgrund der Schwamm-Filtration und Phagozytose-Aktivität wichtig sein können, die die Symbionten hohen Konzentrationen von freier DNA aussetzen. Auch mögliche Wirtskolonisations- und Matrixnutzungsmechanismen waren signifikant angereichert. Wegen der Vielfalt der „gebinnten“ Symbionten-Genome war ein Genom-Vergleich innerhalb der Symbionten möglich, der drei Gilden von Symbionten zum Vorschein brachte, die gekennzeichnet waren durch i) Ernährungsspezialisierung auf die Metabolisierung von Carnitin, ii) Spezialisierung auf sulfatierte Polysaccharide und iii) scheinbaren Nahrungs-Generalismus. Sowohl Carnitin als auch sulfatierte Polysaccharide sind in der extrazellulären Schwammmatrix reichlich vorhanden und stehen so den Schwammsymbionten als Substrat zur Verfügung. Die Genome der diversen Symbionten-Gemeinschaft in A. aerophoba waren in ihren Verteidigungsmechanismen vereint, aber spezialisiert hinsichtlich ihrer Ernährung. KW - Metagenom KW - metagenomics KW - single-cell genomics KW - sponge microbiome KW - differential coverage binning KW - PacBio sequencing KW - Illumina HiSeq KW - hybrid assembly KW - Aplysina aerophoba KW - Mikroorganismus Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-151869 ER - TY - THES A1 - Gehring, Jennifer T1 - Functional analysis of the latrophilin homolog dCirl in Drosophila melanogaster T1 - Funktionelle Analyse des latrophilin Homologs dCirl in Drosophila melanogaster N2 - Latrophilin, alternatively named calcium-independent receptor of α-latrotoxin (CIRL), resembles a prototype of the adhesion class G-protein coupled receptors (GPCRs). Initially identified as a high-affinity receptor for α-latrotoxin, a component of the black widow spider, latrophilins are now associated with various distinct functions, such as synaptic exocytosis, tissue polarity and fertility (Tobaben et al., 2002; Langenhan et al., 2009; Promel et al., 2012). Despite these exploratory efforts the precise subcellular localisation as well as the endogenous ligand of CIRL still remains elusive. In this work genetic experiments, imaging approaches and behavioural studies have been used to unravel the localisation and physiological function of the latrophilin homolog dCirl in Drosophila melanogaster. Containing only one latrophilin homolog together with its genetic accessibility and well-established transgenic approaches, Drosophila seemed an ideally suited model organism. The present study showed that dCirl is widely expressed in the larval central nervous system including moto- and sensory neurons. Further, this work revealed that removal of the latrophilin homolog does not greatly affect synaptic transmission but it seems that aspects of the postsynaptic structural layout are controlled by dCIRL in the fruit fly. Additionally, dCirl expression at the transcriptional level was confirmed in larval and adult chordotonal organs, specialised mechanosensors implicated in proprioception (Eberl, 1999). Expression of dCIRL at the protein level could not yet been confirmed in moto- and sensory neurons likely due to low endogenous expression. However, behavioural studies using dCirl knockout mutant larvae indicated a putative mechanosensory function of dCIRL regarding touch sensitivity and locomotion behaviour. The second part of this thesis presents a strategy to examine interactions between several presynaptic proteins in living cells. The attempt described in this work is based on the discovery that GFP when split into two non-fluorescent fragments can form a fluorescent complex. The association of the fragments can be facilitated by fusing them to two proteins that interact with each other. Therefore, the split GFP method enables direct visualization of synaptic protein interactions in living cells. In initial experiments I could show that full length reporter protein fusions with n-Synaptobrevin (n-Syb), Synaptotagmin (Syt) and Syntaxin (Syx) allow expression in Drosophila and confirmed that fusion to either end of each synaptic protein did not impair expression or influence the viability of transgenic flies. Further, transgenes containing protein fusions of Syx, Syt, and n-Syb with split GFP fragments were established in previous studies (Gehring, 2010). The present work characterises the interaction of these protein fusions during different stages of synaptic vesicle turnover at active zones such as synaptic vesicle docking at the presynaptic membrane and vesicle fusion. These results suggest that the spGFP assay seems only partly suitable for resolving fast and transient protein-protein interactions at larval Drosophila active zones in vivo. N2 - Latrophilin, auch als Calcium-unabhängiger Rezeptor für α-Latrotoxin (CIRL) bezeichnet, repräsentiert einen Prototyp der Adhäsions G-Protein gekoppelten Rezeptorklasse. Ursprünglich als hoch-affiner Rezeptor für α-Latrotoxin entdeckt, werden Latrophiline heute mit zahlreichen verschiedenen Funktionen, wie synaptischer Exozytose, Gewebepolarität und Fertilität assoziiert (Tobaben et al., 2002; Langenhan et al., 2009; Promel et al., 2012). Trotz dieser Fortschritte sind die genaue subzelluläre Lokalisation sowie der endogene Ligand noch weitgehend unbekannt. Diese Studie verwendet genetische Ansätze, bildgebende Verfahren und Verhaltensstudien, um die Lokalisation und physiologische Funktion des Latrophilinhomologs dCirl in Drosophila melanogaster aufzuklären. Die Tatsache, dass Drosophila nur ein einziges Latrophilin Homolog besitzt, zusammen mit den genetischen Möglichkeiten und den sehr gut etablierten transgenen Methoden, machen die Fruchtfliege zu einem idealen Modellorganismus. Die erhobenen Daten belegen, dass dCirl verstärkt im larvalen Nervensystem, einschließlich motorischer und sensorischer Neurone, exprimiert wird. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass in dCirl Knockout-Mutanten die basale synaptische Transmission unverändert ist, vermutlich aber Teile der postsynaptischen Struktur durch dCIRL in der Fruchtfliege kontrolliert werden. Zusätzlich konnte nachgewiesen werden, dass dCirl auf Transkriptionsebene in den larvalen und adulten Chordotonalorganen exprimiert wird, spezifische Mechanosensoren, die an der Propriozeption beteiligt sind (Eberl, 1999). Die Expression von dCIRL auf Proteinebene in motorischen und sensorischen Neuronen konnte aufgrund niedriger endogener Expressionslevel noch nicht verifiziert werden. Allerdings deuten Verhaltensstudien, die Berührungsempfindlichkeit und Lokomotion untersuchen, auf eine mögliche mechanosensorische Funktion von dCIRL in den Larven von Drosophila hin. Der zweite Teil dieser Arbeit zeigt eine Strategie auf, die es ermöglicht, das Zusammenspiel verschiedener präsynaptischer Proteine in vivo zu untersuchen. Die hier beschriebene Methode basiert auf der Entdeckung, dass sich zwei nicht-fluoreszierende Fragmente des grün leuchtenden Proteins (GFP), zu einem fluoreszierenden Komplex zusammenlagern können. Diese geteilten GFP-Fragmente (split-GFPs) werden mit zwei unterschiedlichen Proteinen fusioniert, die miteinander interagieren. Die split-GFP Methode ermöglicht so eine direkte Visualisierung von Protein-Protein-Interaktionen in lebenden Zellen. In ersten Experimenten konnte ich zeigen, dass Synaptobrevin (n-Syb), Synaptotagmin (Syt) und Syntaxin (Syx), die mit vollständigen Fluorophoren markiert wurden, für die Expression in Drosophila geeignet sind und bestätigen, dass sowohl die N-terminale als auch die C-terminale Proteinfusion möglich ist. Zudem konnte durch diese Versuche die Überlebensfähigkeit der transgenen Fliegen überprüft werden. In vorangegangenen Studien wurden Transgene hergestellt, die Proteinfusionen von n-Syb, Syt und Syx mit split-GFP Fragmenten enthalten (Gehring, 2010). Die vorliegende Arbeit charakterisiert die Wechselwirkung dieser Proteinfusionen während unterschiedlicher Stufen der synaptischen Vesikelfreisetzung an der aktiven Zone, wie beispielsweise dem Vesikel-docking an der präsynaptischen Membran und der Vesikelfusion. Die Ergebnisse dieser Studie deuten darauf hin, dass die split-GFP Technik nur bedingt geeignet ist um schnelle und transiente Protein-Protein Interaktionen an der larvalen aktiven Zone von Drosophila in vivo darzustellen. KW - Taufliege KW - G-Protein gekoppelte Rezeptor KW - Drosophila melanogaster KW - Cirl KW - Latrophilin Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-101061 ER - TY - THES A1 - Münch, Miriam T1 - Funktionelle Untersuchungen zur Oxylipin-abhängigen Regulation von Hitzeschockproteinen in \(Arabidopsis\) \(thaliana\) T1 - Functional Significance of Oxylipin-induced Heat Shock Protein Accumulation in \(Arabidopsis\) \(thaliana\) N2 - Oxylipine sind Signalmoleküle, die durch enzymatische Oxidation oder durch Autoxidation von mehrfach ungesättigten Fettsäuren entstehen. Sie akkumulieren während einer Vielzahl von biotischen und abiotischen Stressen und spielen eine bedeutende Rolle bei der Abwehr verschiedener Stressoren. In vielen physiologischen Entwicklungsprozessen sind Oxylipine ebenfalls wichtig. Eine bisher wenig erforschte Untergruppe dieser Oxylipine bilden reaktive elektrophile Spezies, die sog. RES-Oxylipine. Hierzu gehören unter anderem der Jasmonsäure-Vorläufer 12 Oxophytodiensäure (OPDA), aber auch (E)-2-Hexenal oder Phytoprostan A1 (PPA1). Diese Substanzen sind aufgrund einer α,β ungesättigten Carbonylgruppe elektrophil und damit chemisch reaktiv. Diese Reaktivität wird als Grund für ihre biologische Aktivität angesehen: RES-Oxylipine sind Induktoren einer Reihe von Genen. Allerdings ist bisher wenig über den Signalweg sowie die Funktionen der RES-Oxylipine in Arabidopsis thaliana bekannt. Fast die Hälfte (40 %) aller durch OPDA-induzierten Gene in A. thaliana sind abhängig von TGA-Transkriptionsfaktoren, jedoch werden OPDA-responsive Hitzeschockgene (z.B. Hitzeschockproteine) unabhängig von TGA-Transkriptionsfaktoren induziert. Außerdem gibt es Hinweise auf eine Akkumulation des RES-Oxylipins OPDA, aber auch des non-RES-Oxylipins Jasmonsäure (JA) durch eine Behandlung mit 38° C in A. thaliana. Eine exogene Applikation von JA bewirkt jedoch, im Gegensatz zu OPDA, keine Genexpression von Hitzeschockgenen in Arabidopsis. Ziel dieser Arbeit war es, die Funktion der RES-Oxylipine OPDA und Prostaglandin A1 (PGA1, ein Analogon zu PPA1) während der Hitzeschockantwort in Arabidopsis thaliana, sowie die TGA-unabhängige Signaltransduktion der Hitzeschockgene, aufzuklären. Durch einen Vergleich zweier bereits veröffentlichter Transkriptomdaten in silico konnte die Überschneidung des Hitze-induzierten- (1 h, 37 °C) und des OPDA-induzierten-Transkriptoms (4 h, 75 µM) genau analysiert werden. Es werden 30 Gene sowohl von OPDA als auch durch 37 °C mehr als dreifach hochreguliert. Dieses Ergebnis konnte durch realtime qPCR vier repräsentativer Gene (HSP101, HSP26.5, DREB2A, HSFA2) bestätigt werden. Allerdings zeigten sich deutliche Unterschiede in der Stärke und Kinetik der Induktion: Hitze (37 °C) hat einen sehr viel stärkeren Einfluss auf die Hochregulation der Genexpression als die getesteten RES-Oxylipine OPDA und PGA1 (unter 10 % der Induktion durch 37 °C, Ausnahme DREB2A). Zudem resultiert eine Hitzebehandlung in einer schnellen und transienten Genexpression, das Maximum ist nach 1 bis 2 h erreicht während die Addition von RES-Oxylipinen eine langsamere Induktion der Genexpression bewirkt (Maximum nach 4 bis 6 h). Eine Genexpressionsanalyse mit verschiedenen Signaltransduktionsmutanten half bei der Aufklärung möglicher Signaltransduktionskomponenten der RES-Oxylipine. So konnte gezeigt werden, dass der putative OPDA-Rezeptor Cyclophilin 20-3 sowie sein Interaktionspartner, das Protein Serin-Acetyltransferase 1, keine Bedeutung in der Regulation von Hitzeschockgenen durch RES-Oxylipine haben. Die Hitze-Masterregulatoren HSFA1 a,b,d (und e) jedoch sind für die Induktion der Hitzeschockgene HSP101, HSP26.5 und HSFA2 durch RES-Oxylipine essentiell und für DREB2A zumindest teilweise notwendig. Dennoch spielt der durch Hitze induzierbare Transkriptionsfaktor HSFA2 in der Signaltransduktion von RES-Oxylipinen (bezüglich der Hitzeschockgeninduktion) keine Rolle. Durch ein Screening strukturell verschiedener RES hinsichtlich ihrer Induktion von HSP101 konnte geklärt werden, dass nicht die Anwesenheit einer α,β ungesättigten Carbonylgruppe, sondern vielmehr die Eigenschaft der Elektrophilie für die Induktion des HSP101 verantwortlich ist. Auch das RES Sulforaphan vermittelt, wie die RES-Oxylipine OPDA und PGA1, die Induktion der Hitzeschockgene über die HSFA1-Transkritionsfaktoren. Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit lag in der Quantifizierung der endogenen Oxylipine in zehn Tage alten Arabidopsis-Keimligen nach einer Hitzebehandlung unter Kurztag-Lichtbedingungen. Weder während eines kurzzeitigen Hitzestresses (bis zu 8 h) noch während einer längerfristigen Hitzebehandlung (bis zu 7 Tage) steigt der Gehalt des RES Oxylipins OPDA signifikant an. Das non-RES-Oxylipin Jasmonsäure hingegen akkumuliert transient (Maximum 2 h nach Beginn eines Hitzestresses) und signifikant, allerdings ist dieser Anstieg in seiner Stärke (13fach) nicht vergleichbar mit einer Akkumulation beispielsweise nach Verwundung (hier ist ein 1000facher Anstieg möglich). In weiteren Experimenten wurde eine mögliche Korrelation der endogenen Oxylipin-Akkumulation (verursacht durch Verwundung oder osmotischen Stress) mit der Genexpression von Hitzeschockgenen untersucht. … N2 - Oxylipins are important signalling molecules, which are typically produced during a variety of biotic and abiotic stresses. Oxylipins are generated by oxygenation of polyunsaturated fatty acids. This oxygenation can be catalysed by enzymes or non-enzymatically by ROS. In general, Oxylipins are important in defence processes against various stresses and play an important role in plant development. A subgroup of Oxylipins are reactive electrophile species, termed RES-Oxylipins. For instance, the jasmonic acid precursor 12-oxyphytodienoic acid (OPDA), (E) 2 hexenal or Phytoprostane A1 (PPA1) are RES-Oxylipins. They are characterized by the presence of an α,β unsaturated carbonyl group, which is responsible for their reactivity and biological activity. But until now, little is known about the signalling pathways and the functions of this RES-Oxylipins in Arabidopsis thaliana. Almost half of all (40 %) OPDA-induced genes in A. thaliana are dependent on TGA transcription factors. However, the OPDA-induced heat shock genes are not dependent on TGA transcription factors. Furthermore, it has been published that the RES-Oxylipin OPDA and also the non-RES-Oxylipin jasmonic acid (JA) accumulate during heat (38 °C). Admittedly, the exogenous application of jasmonic acid on Arabidopsis does not lead to the induction of heat shock genes. Aim of this work was to study the in vivo relevance of the RES-Oxylipins OPDA and Prostaglandine A1 (PGA1, an analogue of PPA1) in the heat response of Arabidopsis thaliana. Additionally, the signal transduction components, which are required for induction of heat-responsive genes by RES-Oxylipins, should also be clarified. When comparing heat- and ODA-induced transcriptome data in silico (1 h, 37 °C vs. 4 h, 75 µM OPDA), 30 genes were found to be strongly (more than 3fold) upregulated by both, moderate heat and OPDA. Performing real time PCR analysis of four representative genes (HSP101, HSP26.5, DREB2A, HSFA2) confirms this result. However, there is a great difference between the strength and the kinetic of the induction by OPDA or heat, respectively. Moderate heat (37 °C) induces the gene expression much stronger and faster than OPDA or PGA1 (induction by RES-Oxylipins is under 10 % of the induction by heat, except DREB2A). Gene expression analysis with different signal transduction mutants were important to reveal the (TGA-independent) signalling pathway of RES-Oxylipins. The putative OPDA-receptor Cyclophilin 20-3 and its interacting protein, the serin acetyltransferase 1 are not required for the upregulation of heat shock genes by RES-Oxylipins. But the results also clearly indicate that the master regulators of heat shock, HSFA1 a,b,d (and e), are essential for induction of HSP101, HSP26.5 and HSFA2 by RES-Oxylipins and at least partial necessary for the induction of DREB2A. The heat-inducible transcription factor HSFA2 plays no role in the signalling pathway of RES-Oxylipins (inducing heat shock genes). A screening of structural different RES could show, that the electrophilic property itself and not the presence of an α,β unsaturated carbonyl group is important for the induction of HSP101. The RES Sulforaphane induces the heat shock genes via the HSFA1 transcription factors, like the RES-Oxylipins OPDA and PGA1. The quantification of endogenous oxylipins in 10 day old Arabidopsis seedlings during heat (under light) was another part of this work. Seedlings did not accumulate OPDA in the response to heat, neither during a short-term (up to 8 h) nor a long-term (up to 7 days) heat stress. In the case of JA, a transient and significant increase could be detected. In comparison to an accumulation of JA after wounding (a 1000fold increase is possible), the increase (13fold) caused by heat treatment is very weak. A possible correlation between the endogenous Oxylipin accumulation (due to wounding or osmotic stress) and the induction of heat shock genes was analysed. … KW - Schmalwand KW - Hitzeschock-Proteine KW - Oxylipine KW - Arabidopsis thaliana KW - reaktive elektrophile Spezies KW - RES-Oxylipine Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-140299 ER - TY - THES A1 - Gao, Shiqiang T1 - Characterizing new photoreceptors to expand the Optogenetic toolbox T1 - Charakterisierung neuer Photorezeptoren zur Erweiterung der Optogenetik N2 - Optogenetics is a method to control the cell activity with light by expression of a natural or engineered photoreceptor via genetic modification technology. Optogenetics early success came with the light-gated cation channel "Channelrhodopsin-2" in neurons and expanded from neuroscience to other research fields such as cardiac research and cell signaling, also due to the enrichment by new photoreceptors. In this study, I focus on searching and characterizing new photoreceptors to expand the optogenetic tool box. In this work I characterize three newly discovered microbial rhodopsins and some engineered mutants of them. The first rhodopsin is a proton pump from the diatom Fragilariopsis cylindrus, Fragilariopsis Rhodopsin or abbreviated: FR. I cloned the full-length FR and proved it to be a light-activated proton pump with high efficacy in comparison to Bacteriorhodopsin (BR). During this study, I also developed a new method to improve the plasma membrane targeting of several microbial rhodopsins. I also obtained a FR mutant (channel-like FR or chFR) which behaves like a light-gated proton channel. FR can be used for optogenetic hyperpolarization or alkalization of a cell while the chFR could be used for depolarization or lowering of the cellular pH. The induction of FR expression under iron-limited conditions in the diatom indicated an alternative energy generation mechanism of F. cylindrus when iron-containing enzymes are scarce. I then characterized a new microbial rhodopsin with novel light-regulated Guanylyl Cyclase (GC) activity. This rhodopsin guanylyl cyclase from the fungus Blastocladiella emersonii (B.e. CyclaseOpsin or BeCyclOp) has been proven by me to be an efficient light-gated GC with high specificity and fast kinetics. BeCyclOp also has a novel structure with eight transmembrane helices, containing a long cytosolic N-terminus which participates in the tight regulation of the GC activity. In collaboration with Prof. Alexander Gottschalk (Univ. Frankfurt/M.), BeCyclOp has been tested in muscle cells and sensory neurons of Caenorhabditis elegans and proven to be a powerful optogenetic tool in a living animal. I also generated a BeCyclOp mutant with enhanced light sensitivity. Already more than ten years ago, guanylyl cyclase rhodopsins were suggested to exist in Chlamydomonas reinhardtii by analyzing genomic sequence data. But until now no functional proof existed. By further cloning and sequencing I discovered such a rhodopsin with light-regulated guanylyl cyclase activity. This functional Cyclaseopsin (COP6c) is quite different to BeCyclOp, as it was proven to be a light-inhibited GC. Cop6c is much larger than BeCyclOp with a His-Kinase and a response regulator domain between the rhodopsin and the cyclase domain. I also introduced a new strategy for generating optogenetic tools by fusing the photoactivated adenylyl cyclase bPAC to two different CNG channels. These new tools function via light-gated cAMP production and subsequent CNG channel activation. These tools combined the properties of bPAC (highly sensitive to blue light) and CNG channels (high single-channel conductance and high Ca2+ permeability), as demonstrated by expression in Xenopus oocytes. As a further benefit the fusing of bPAC to CNG channels leads to a bPAC with a more than tenfold reduced dark activity which is a valuable improvement for bPAC itself as an optogenetic tool. N2 - Als Optogenetik wird die Technik bezeichnet, durch genetische Veränderung Photorezeptoren in Zellen einzubringen, um die Zellaktivität mit Licht zu steuern. Frühe Erfolge der Optogenetik wurden mit dem Licht-gesteuerten Kationenkanal "Channelrhodopsin-2" in Neuronen von lebenden Tieren erzielt. Die Anwendung erweiterte sich von den Neurowissenschaften zu anderen Forschungsfeldern, wie Herzforschung und Zellbiologie, auch durch die Bereicherung mit neuen Photorezeptoren. Hier konzentriere ich mich auf die Suche und Charakterisierung neuer Photorezeptoren. In dieser Arbeit werden drei neu entdeckte, natürliche mikrobielle Rhodopsine, sowie ausgewählte Mutanten, charakterisiert. Das erste Rhodopsin ist eine Protonenpumpe aus der Kieselalge (Diatomee) Fragilariopsis cylindrus, Fragilariopsis-Rhodopsin, abgekürzt FR. Ich klonierte FR und bewies, dass FR eine Licht-aktivierte Protonenpumpe mit hoher Wirksamkeit ist. In dieser Studie zeige ich auch eine Methode, um die Plasmamembran-Lokalisation von FR und mehreren anderen Rhodopsinen zu verbessern. Ich identifizierte eine FR-Mutante (chFR), die sich wie ein Licht-gesteuerter Protonenkanal verhält. FR kann für die Licht-gesteuerte Hyperpolarisation oder Alkalisierung der Zelle verwendet werden, während chFR möglicherweise verwendet werden könnte, um den zellulären pH Licht-gesteuert abzusenken. Die Induktion der FR-Expression unter Eisenmangel-Bedingungen legt einen neuen Energieerzeugungsmechanismus von F. cylindrus nahe, wenn Eisen-haltige Enzyme in den Chloroplasten fehlen. Ich habe dann ein neues mikrobielles Rhodopsin mit Licht-geregelter Guanylylcyclase (GC) Aktivität untersucht. Für dieses Cyclaseopsin aus dem Pilz Blastocladiella emersonii (BeCyclOp) konnte ich zeigen, dass es sich um eine effiziente lichtgesteuerte GC mit hoher Spezifität und schneller Kinetik handelt. BeCyclOp hat eine für ein Opsin neuartige Struktur mit acht Transmembranhelices. Für den langen cytosolischen N-Terminus zeigte ich eine Beteiligung an der Regulierung der GC-Aktivität. BeCyclOp wurde im Labor von Prof. A. Gottschalk (Univ. Frankfurt/M.) in den Muskelzellen und sensorischen Neuronen von Caenorhabditis elegans getestet und erwies sich als ein leistungsfähiges Werkzeug in optogenetisch veränderten, lebenden Tieren. Ich habe dann auch eine BeCyclOp Mutante mit verbesserter Lichtempfindlichkeit hergestellt. Bereits vor über zehn Jahren wurden anhand genomischer Daten Guanylylcyclase-Rhodopsine in Chlamydomonas reinhardtii postuliert, konnten aber funktionell bisher nicht nachgewiesen werden. Durch Klonieren von verschiedenen Chlamydomonas reinhardtii Stämmen gelang es mir, solch ein Opsin (Cop6c) zu entdecken, dessen Guanylylcyclase-Aktivität eindeutig Licht-reguliert ist. COP6c ist ganz anders als BeCyclOp, nicht nur weil die GC-Aktivität durch Licht inhibiert wird. Außerdem ist Cop6c ein viel größeres Protein mit einer zusätzlichen His-Kinase-, sowie einer Transducer-Domäne zwischen der Rhodopsin- und der Cyclase-Domäne. Schlussendlich zeige ich auch eine neue Strategie zur Erzeugung von optogenetischen Werkzeugen durch Fusion der Licht-aktivierten Adenylyl-Cyclase (AC) bPAC mit CNG-Kanälen. Diese neuen "Werkzeuge" funktionieren über Licht-gesteuerte cAMP-Produktion und die anschließende Aktivierung eines cAMP-sensitiven Kationen-(CNG-) Kanals. Hierbei werden die positiven Eigenschaften von bPAC (sehr empfindlich auf blaues Licht) und CNG-Kanälen (hohe Leitfähigkeit bei hoher Ca2+-Durchlässigkeit) kombiniert. Darüber hinaus konnte ich demonstrieren, dass die Fusion der bPAC an den CNG-Kanal zu einer bPAC mit stark reduzierter AC-Aktivität im Dunkeln führte, was allein schon eine gute Verbesserung der bPAC als optogenetische Werkzeug ist. KW - Photorezeptor KW - Optogenetik KW - Optogenetics KW - photoreceptors KW - microbial rhodopsin KW - Characterizing New Photoreceptors to Expand the Optogenetic Toolbox KW - Guanylyl Cyclase KW - proton pump Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-112941 ER - TY - THES A1 - Kums, Juliane T1 - Entwicklung und Charakterisierung von \(Gaussia\) \(princeps\) Luziferase-Antikörper-Fusionsproteinen T1 - Development and characterization of \(Gaussia\) \(princeps\) luciferase antibody fusion proteins N2 - Antikörper, die Oberflächenantigene erkennen, sind sowohl in der Diagnostik als auch in der Therapie verschiedener Erkrankungen von enormer Bedeutung. Damit Antikörper in diesen Bereichen eingesetzt werden können, ist es sehr wichtig, dass die Interaktion eines Antikörpers oder auch eines Antikörperkonjugats mit seinem Antigen oder Fc-Rezeptoren ausreichend charakterisiert wird. Hierfür werden meist zellfreie Verfahren angewandt, wie die isotherme Titrationskalorimetrie oder die Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie. Diese unterliegen verschiedenen Limitationen, beispielsweise der Verfügbarkeit von rekombinantem Antigen. Vor allem aber werden zelluläre Einflüsse, die die Bindungseigenschaften der Antikörper beeinflussen, nicht berücksichtigt. Aber auch die derzeit angewandten Verfahren für zelluläre Bindungsstudien können problematisch sein, da sie meist auf Antikörpern basieren, die biochemisch markiert worden sind, was zu funktionellen Beeinträchtigungen führen kann. Außerdem zeigen solche Antikörper häufig keine einheitliche Stöchiometrie der jeweiligen Reporterstoffe und die Reproduzierbarkeit des Markierungsverfahrens ist in den meisten Fällen nicht gewährleistet. Positionsspezifische Markierungen sind jedoch vergleichsweise sehr aufwendig. Um die genannten Probleme zu umgehen, wurden in der vorliegenden Arbeit am Beispiel des Fn14-spezifischen Antikörpers 18D1 Antikörper-Fusionsproteine hergestellt und charakterisiert, die an verschiedenen Positionen genetisch mit der Gaussia princeps Luziferase (GpL) fusioniert worden sind. Dabei zeigte sich, dass die Positionierung der Luziferase am C-Terminus der leichten Kette des Antikörpers (GpL(CT-LC)) die Bindungseigenschaften der GpL-18D1-IgG1-Fusionsproteine an Fn14 und an die verschiedenen Fcγ-Rezeptoren (FcγR) nicht oder nur in geringem Umfang beeinflusst. Auch die agonistische Aktivität der GpL-18D1-IgG1-Fusionsproteine, welche abhängig ist von der Oligomerisierung über Protein G oder der FcγR-Bindung, wurde durch die GpL-Markierung nicht wesentlich beeinflusst. Diese Ergebnisse ließen sich am Bespiel von 18D1 ebenfalls auf die dimeren Antikörper-Isotypen IgG2, mIgG1 und mIgG2A übertragen. GpL-Fusionsproteine der Antikörper E09-IgG1 (CD95-spezifisch), G28.5-IgG1 (CD40-spezifisch) und BHA10-IgG1 (LTβR-spezifisch) zeigten gleichfalls keine gravierenden Veränderungen der Bindungseigenschaften oder den funktionellen Eigenschaften, was für eine breite Anwendbarkeit von GpL-Antikörper-Fusionsproteinen spricht. Zusammenfassend betrachtet zeigen die hier präsentierten Ergebnisse, dass die genetische Fusion der Gaussia princeps Luziferase an das C-terminale Ende der leichten Antikörperkette eine sehr gute Möglichkeit darstellt, Antigen-Antikörper-Interaktionen zu charakterisieren ohne dabei mit den Eigenschaften des Antikörpers zu interferieren. Dabei besticht dieser Ansatz im Vergleich zu anderen gängigen Verfahren durch seine Reproduzierbarkeit, eine einfache Handhabung, geringe Kosten und eine extrem hohe Sensitivität. Außerdem könnte dieses Antikörper-Fusionsproteinformat zukünftig auch in vielen Bereichen als Tracer eingesetzt werden mit dem Vorteil, dass keinerlei Radioaktivität benötigt werden würde. N2 - Antibodies raised against surface proteins are of enormous importance for diagnosis and therapy of various diseases. In the development of antibodies for these areas there is a high need for detailed characterization of the interactions of an antibody/antibody-conjugate with its antigen and Fc-receptors. Currently this binding properties are mostly evaluated by cell free assays like surface plasmon resonance and isothermal titration calorimetry. These methods have principle limitations, for example the need of recombinantly produced antigens and the fact that cellular factors which can influence the antigen-antibody interaction cannot be considered. However, the presently used methods for binding studies with intact cells have various limitations, too, e.g. the need for labeled antibodies. Biochemical labeling can influence the binding properties of the antibody and also its functional characteristics. Additionally the resulting antibody-populations can be heterogeneous relating to the amount of biochemical-labeling and the position of the labeling. Also the labeling procedure is not very reproducible. Side specific labeling methods on the other side are typically quite elaborate. To overcome these limitations, on the example of the Fn14-specific antibody 18D1-IgG1 antibody fusion protein formats were investigated which were genetically fused with the Gaussia princeps luciferase (GpL) at different sites of the antibody. Binding studies with these variants showed, that the C-terminus of the antibody light chain (e.g. with GpL, GpL(CT-LC)) is the best suited position for genetic antibody labeling, because GpL domain tagging to this position did not or only very weakly influence the binding properties of the antibody to Fn14 and the Fcγ-receptors. Moreover, the agonistic activity of the antibody which requires oligomerization through protein G or Fcγ-receptor binding for full appearance was not affected. Similar results were obtained for the dimeric 18D1 isotypes IgG2, mIgG1 and mIgG2A. Furthermore, GpL fusion proteins of the antibodies E09-IgG1 (CD95-specific), G28.5-IgG1 (CD40-specific) und BHA10-IgG1 (LTβR-specific) showed no big differences neither in their binding properties to their antigen and Fcγ-receptors nor with respect to their functional activities, indicating a broad applicability of GpL antibody fusion proteins. Summing up, the herein presented results reveal that C-terminal GpL-tagging of the antibody light chain is a versatile tool to characterize the binding properties of an antibody to its antigen without influencing the original properties of the antibody. The GpL antibody fusion proteins of this type are very easily manageable, show a high reproducibility, are cost-efficient and allow very sensitive cellular binding studies and could be used as tracer molecules in the future. KW - Luciferasen KW - zelluläre Bindungsstudien KW - 18D1 KW - Antikörper KW - Fn14 KW - TWEAK KW - cellular binding studies KW - Rekombinantes Protein KW - Gaussia princeps Luziferase Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-146777 ER - TY - THES A1 - Lind, Christof Martin T1 - Während der Evolution von Landpflanzen geriet der Anionenkanal SLAC1 unter die Kontrolle des ABA-Signalwegs T1 - During the evolution of land plants the anion channel SLAC1 became a part of the ABA signaling pathway N2 - Die ersten Landpflanzen standen vor der Herausforderung sich mit der wechselnden Verfügbarkeit von Wasser an Land arrangieren zu müssen. Daraus ergab sich die Notwendigkeit den Wasserverlust zu minimieren und dennoch ausreichend CO2 für die Photosynthese aufzunehmen (Raven, 2002). Im Laufe der Evolution der Pflanzen entstanden mehrere Anpassungen an diese neuen Gegebenheiten, die schließlich auch zur Entstehung von regulierbaren Öffnungen, den Stomata, in der Blattepidermis führte. Zwei Schließzellen umschließen das Stoma und regulieren über die Aufnahme oder Abgabe von osmotisch-aktiven Teilchen ihren Turgordruck und damit die Öffnungsweite des Stomas. Das Kation Kalium und die Anionen Chlorid und Nitrat repräsentieren die Hauptosmotika, die je nach Bedarf durch Transportproteine über die Plasmamembran der Schließzellen geschleust werden. In den Samenpflanzen wie zum Beispiel der Modellpflanze Arabidopsis thaliana, ist der Signalweg in Schließzellen, der bei Trockenheit zu einem schnellen Schluss des Stomas führt bereits sehr gut untersucht. Bei Wassermangel synthetisiert die Pflanze das Trockenstresshormon ABA (Abscisinsäure). Das Hormon wird durch ABA-Rezeptoren erkannt und resultiert schließlich in der Aktivität der Proteinkinase OST1. Daraufhin reguliert diese Kinase zum einen die Transkription ABA-abhängiger Gene, die der Pflanze eine langfristige Adaptation an Trockenheit und Austrocknungstoleranz verleiht. Zum anderen, phosphoryliert OST1 den Anionenkanal SLAC1 und aktiviert ihn so. Die Aktivität des Kanals initiiert schließlich den Stomaschluss durch einen Ausstrom von Anionen aus den Schließzellen, der mit einer Depolarisation der Schließzellmembran einhergeht. Der ABA-Signalweg, der zur transkriptionellen Regulation von Genen und der damit verbunden Trockentoleranz führt ist ein sehr stark konservierter und evolutiv sehr alter Signalweg, der in allen Geweben von Pflanzen bei Trockenheit beschritten wird. Der schnelle ABA-Signalweg, der die Aktivität der SLAC1 Anionenkanäle reguliert, ist auf Schließzellen begrenzt. Da sich Schließzellen aber erst spät in der Evolution von Landpflanzen etablierten, erhob sich die Frage, wann in der Evolution geriet SLAC1 unter die Kontrolle das ABA-Signalwegs? Geht diese Regulation von SLAC1 mit der Entstehung von Schließzellen einher oder bestand dieser Regulationsmechanismus bereits in Pflanzen, die keine Schließzellen besitzen. Zur Beantwortung dieser Frage untersuchte ich die einzelnen Komponenten des Signalwegs und ihre Beziehungen zu einander im heterologen Expressionssystem der Xenopus laevis Oozyten. Im Laufe dieser Arbeit wurden Schlüsselelemente des ABA-Signalwegs aus sechs verschiedenen Versuchspflanzen kloniert und in Oozyten charakterisiert. Für die Untersuchung der Evolution des schnellen ABA-Signalwegs wurden die sechs Versuchspflanzen aus je einem rezenten Vertreter der Grünalgen (Klebsormidium nitens), der Lebermoose (Marchantia polymorpha), der Laubmoose (Physcomitrella patens), der Lycophyten (Selaginella moellendorffii) und der Farne (Ceratopteris richardii) ausgewählt und mit der Samenpflanze Arabidopsis thaliana verglichen. Die sechs Pflanzengruppen spalteten sich an unterschiedlichen Zeitpunkten im Laufe der pflanzlichen Evolution von der Entwicklung der restlichen Pflanzen ab und erlauben so einen bestmöglichen Einblick in den jeweiligen Entwicklungsstand der Landpflanzen während der Entstehung der einzelnen Pflanzenfamilien. Obwohl sich die ersten Stomata erst in den Laubmoosen entwickelten, besitzen schon die Grünalgen OST1-Kinasen und SLAC1-Kanäle. Interessanterweise konnte wir zeigen, dass schon die frühen OST1-Kinasen aus Algen und Moosen dazu in der Lage sind, in den höher entwickelten Samenpflanzen die Rolle in der Regulation der ABA-abhängigen Expression von Genen zu übernehmen. Außerdem zeigte sich im Laufe meiner biophysikalischen Untersuchungen, dass alle dreizehn getesteten OST1-Kinasen aus den sechs unterschiedlichen Versuchspflanzenarten in Lage sind, den Anionenkanal SLAC1 aus Arabidopsis in Xenopus Oozyten zu aktivieren. Diese Austauschbarkeit von den AtSLAC1-aktivierenden Kinasen deutet auf eine sehr starke Konservierung der Struktur und Funktion von OST1 hin. Anders verhielt es sich bei der funktionellen Analyse der Anionenkanäle aus den verschiedenen Versuchspflanzen: Hier bildete nur der evolutionär gesehen jüngsten SLAC-Kanal AtSLAC1 aus Arabidopsis ein funktionelles Pärchen mit OST1. Die SLAC1 Kanäle aus der Grünalge, dem Lebermoos, den Lycophyten und dem Farn blieben ohne messbare Aktivität bei einer Co-expression mit den verschiedenen OST1 Kinasen. Nur beim Laubmoos (Physcomitrella patens) konnte noch ein funktionelles Kinase-Anionenkanal Pärchen gefunden werden. Struktur-Funktionsuntersuchungen erlaubten mir schließlich zu zeigen, dass bestimmte funktionelle Domänen sowohl im N-terminus als auch im C-terminus von SLAC1 erforderlich sind, um eine Aktivierung des Kanals durch OST1 Kinasen sicherzustellen. N2 - Since the beginnings of the colonization of the land, plants had to overcome numerous obstacles. In this new environment the major challenge was the preservation of water supply despite the severe changes in the availability of water. Due to these new requirements plants had to balance water loss and the necessary uptake of CO2 for photosynthesis. Along the evolution of land plants they evolved numerous adaptations to the new environment like the cuticle and adjustable stomata. The stomata are small pores embedded in the epidermis of the leaves. A pair of guard cells regulates the aperture of the pore (stoma) via their turgor pressure. Potassium and the counter ions chloride and nitrate are the major osmolytes driving the opening and closing of the stoma. Specialized transport proteins regulate the ion fluxes across the plasma membrane of guard cells. In seed plants like the model plant Arabidopsis thaliana, the control of guard cells under drought stress conditions is well understood. Upon water shortage the plants produce the phytohormone ABA (abscisic acid). Following the perception of ABA by its receptors, the phytohormone activates the protein kinase OST1. The activated kinase on the one hand controls the expression of ABA dependent genes that lead to drought-adaptation and tolerance. On the other hand, the OST1 kinase phosphorylates and activates SLAC1-type anion channels. In turn, the activation of SLAC1 leads to the release of anions, thereby initiating guard cell depolarization which leads to the release of anions together with potassium. This depolarization step represents the initiation of ABA-dependent stomatal closure. The transcriptional ABA signaling pathway that regulates gene expression and the adaptation to drought stress is a very ancient and conserved pathway. It can be found in all plant tissues during periods of water shortage. In contrast, the ABA pathway leading to the activation of SLAC1 is restricted to guard cells only. Guard cells evolved rather late during the evolution of land plants. Therefore, the question arises, when did the ancient ABA signaling pathway co-opt SLAC1? Did the control of SLAC1 activity through the ABA-signaling pathway already exist before the stomata appeared in early land plants or did it co-evolve with stomata rather recently? To answer these questions, we investigated the relationship between the single components of the signaling cascade in the heterologous expression system of Xenopus laevis oocytes. To investigate the evolution of fast ABA signaling, we cloned the key players of the signaling cascade from six different model plants and functionally characterized the ABA-signaling components in oocytes. The model plants were chosen from green algae (Klebsormidium nitens), liverworts (Marchantia polymorpha), mosses (Physcomitrella patens), lycophytes (Selaginella moellendorffii) and ferns (Ceratopteris richardii) and their ABA-signaling components were compared to those of the seed plant Arabidopsis thaliana. These plant families diverged during evolution of land plants at distinct evolutionary steps. Thus these plant species should allow us insights into the evolution of land plants. Although the first stomata were found in mosses, already the green algae Klebsormidium nitens expressed SLAC1-type anion channels and the OST1 kinase. Gene expression studies with Arabidopsis protoplasts revealed that already the OST1 kinase of green algae is able to regulate ABA-dependent gene expression in seed plants. This indicates that the substrate specificity of OST1 kinases remained highly conserved during evolution. This notion was reinforced by biophysical investigations in the oocyte system. All thirteen tested OST1 kinases originating from the six model plants were capable to activate the evolutionary youngest SLAC channel AtSLAC1 from Arabidopsis in the heterologous expression system. Thus the structure and function of OST1 kinases is highly conserved during the evolution of land plants. In contrast, SLAC1 channels originating from ferns, lycophytes, liverworts and algae could not be activated by any of the OST1 kinases. Only the SLAC1 channel and the OST1 kinase of the seed plant Arabidopsis thaliana formed a functional anion channel/kinase-pair. Apart from Arabidopsis SLAC1, only the moss (Physcomitrella patens) PpSLAC1 could be activated by the Arabidopsis and one of the moss OST1 kinases. Subsequent detailed structure-function analysis revealed several essential domains in the anion channel’s N-terminus and C-terminus which are important for the functional interaction between SLACs and OSTs. KW - Evolution KW - Abscisinsäure KW - ABA KW - OST1 KW - Signaltransduktion KW - Anionentranslokator KW - Spaltöffnung KW - SLAC1 Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-141669 ER - TY - THES A1 - Baumann, Melanie T1 - Optogenetische Simulation und Analyse elektrischer und Calcium-basierter Signale in Pflanzen T1 - Optogenetic simulation and analysis of electrical and Calcium based signals in plants N2 - Funktionelle Expression von ChR2 in Pflanzen In der vorliegenden Arbeit konnte erstmalig die funktionelle Expression des licht-aktivierten Channelrhodopsin-2 aus Chlamydomonas reinhardtii in höheren Pflanzen gezeigt werden. Obwohl die erfolgreiche Transformation auf der Basis der Integration einer Expressionskassette für WT-ChR2 in Pflanzen genetisch nachgewiesen werden konnte, war ein funktioneller Nachweis nicht möglich. Demgegenüber war die funktio-nelle Expression aller getesteten ChR2-Mutanten im transienten Expressionsansatz er-folgreich und konnte schließlich auf der Basis der im Rahmen dieser Arbeit generierten Konstrukte auch für stabil transformierte Arabidopsis-Pflanzen bestätigt werden. ChR2 wurde in Arabidopsis-Protoplasten sowie Tabak-Epidermis- und Mesophyllzellen an der Plasmamembran lokalisiert, zeigte jedoch aufgrund der Überexpression eine starke Überladung des Endomembransystems. Elektrophysiologische Messungen mit Hilfe der Einstichtechnik belegten, dass ChR2 sowohl in Arabidopsis-Keimlingen als auch im Tabakmesophyll funktionell ist, wobei sich die erzeugten Blaulicht-vermittelten Depolarisationen weitaus erfolgreicher im Ta-baksystem darstellten. Alle eingesetzten ChR2-Mutanten waren funktionell und zeigten in Einstichmessungen mit Oozytendaten korrelierende Kinetiken. Die Mutante C128A wurde hinsichtlich der erzielten lichtinduzierten Membranpotentialdepolarisationen als effektivste ChR2-Variante identifiziert. Calcium-Messungen mit dem Reporterprotein Aequorin lieferten keinen Beweis für einen direkt durch ChR2-C128A vermittelten Calcium-Einstrom in Arabidopsis-Protoplasten. Jedoch konnte ein cytosolischer Calcium-Anstieg ca. 3min nach Blau-lichtapplikation beobachtet werden. Dies deutet darauf hin, dass die durch ChR2 vermittelten Membranpotentialänderungen zu einer Aktivierung endogener, Calcium-permeabler Ionenkanäle führen könnte. Für die ChR2-L132C Mutante konnte allerdings in ersten Messungen ein direkter Calcium-Anstieg nach Lichtgabe beobachtet werden.   Transkriptionelle Änderungen aufgrund ChR2-basierter, elektrischer Signalmuster In RNA-Seq-Analysen mit transient transformierten Tabakblättern konnte die Bedeu-tung der Signalsignatur elektrischer bzw. Calcium-basierter Signale verifiziert werden: Die Applikation zweier in ihrer Form gänzlich unterschiedlicher elektrischer Signal-muster lieferte ein signifikant unterschiedlich reguliertes Set an Genen, wobei einige wenige durch beide Behandlungen induziert werden konnten. Langanhaltende Depolari-sationen regulierten deutlich mehr Gene und waren daher in ihrer Wirkung weitaus ef-fektiver als kurze, repetitive Depolarisationen. Die bioinformatische Analyse dieser Daten zeigte, dass die Nachahmung eines im Zuge der Pathogenantwort bekannten, langen Depolarisationspulses Gene der Flagellin-induzierten Signaltransduktion adressierte, während kurze, wiederkehrende Pulse mit gleichem Informationsgehalt diese nicht regulierten. N2 - Functional expression of ChR2 in plants The current work for the first time proves the functional expression of the light gated ChR2 derived from the unicellular green algae Chlamydomonas reinhardtii in higher plants. In line with its function ChR2 was localized primarily at the plasma membrane in Ara-bidopsis protoplasts and Tobacco epidermal and mesophyll cells. However, overexpres-sion as well as codon-usage often resulted in overloading of the endomembrane system such as Golgi and ER. Electrophysiological recordings by means of the impalement technique proved ChR2 function in Arabidopsis seedlings as well as Tobacco mesophyll cells. Blue light induced depolarization, however, was more efficient in the Tobacco system. In contrast to the WT protein all ChR2-mutants tested in this study were shown to be functional. Channel kinetics gained from Xenopus oocyte TEVC measurements corre-lated well with observed depolarization and repolarization kinetics of individual mu-tants. Highest depolarization levels were generated by the mutant C128A. Using the Calcium reporter Aequorin, measurements provided no evidence for ChR2-C128A mediated Calcium-influx in Arabidopsis protoplasts. However, a delayed Cal-cium increase approximately 3min following blue light application suggests that ChR2 mediated membrane potential changes activated endogenous Calcium permeable ion channels. Preliminary experiments using the L132C mutant showed cytosolic Calcium elevation directly after light stimulation. All ChR2 mutants tested in this study are suited for generating defined depolarization patterns in plants, whereas simulation of specific Calcium signatures seems possible with ChR2 variants based on the L123C mutation. Transcriptional changes based on ChR2-mediated, electrical patterns Transcriptional analyses of transiently transformed Tobacco leaves verified the im-portance of signature shape of electrical or Calcium-based signals in plants: Application of two blue light triggered depolarization patterns differing in shape revealed two sets of significantly differentially regulated genes, although a small number of genes was regulated by both stimuli. Sustained depolarizations regulated more genes and thus turned out to be more effective than short, repetitive depolarizations. Bioinformatic analyses of the data generated by RNA-Seq revealed the power of elec-trical signal application. Mimicking known electrical pathogen responses by applying a sustained depolarization pattern indeed addressed genes involved in flagellin signaling. In contrast, repetitive depolarization pulses regulated a completely different set of genes. KW - Channelrhodopsin-2 KW - Calcium KW - Membranpotential KW - membrane potential KW - Pflanzen Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-87974 ER - TY - THES A1 - Kottmair, Mathias T1 - Bambi – Charakterisierung eines inhibitorischen BMP-Pseudorezeptors T1 - Bambi - characterization of an inhibitoric BMP pseudoreceptor N2 - Die TGF-β-Proteinfamilie umfasst eine Vielzahl von zumeist homodimeren sezernierten Liganden in höheren Tieren, die viele Vorgänge und Entwicklungen im Embryo wie im adulten Lebewesen über absolute oder graduelle Einflussnahme steuern. Die Signalweiterleitung ins Zytoplasma und den Nukleus erfolgt über promisk paarig rekrutierte Typ-I- und Typ-II-Rezeptoren, ehe vorwiegend rezeptorabhängig verschiedene SMAD-Proteine von Typ-I-Kinasen der Rezeptoren aktiviert werden, in den Kern translozieren und die Transkription induzieren. Zu jedem Zeitpunkt dieser Signalweiterleitung kann mittels verschiedener endogener Inhibitoren regulatorisch eingegriffen werden. Dem bisher einzig bekannten membranständigen Pseudorezeptor Bambi (BMP and Activine membrane bound inhibitor) wurde in vorangegangenen Arbeiten inhibitorisches Potential gegenüber dem BMP- und Activin-vermittelten Signalweg über Bindung an distinkte ligandenadressierte Rezeptoren zugeschrieben, wobei die genaue Wirkweise bislang noch vollkommen unklar war. In der vorliegenden Arbeit wurde initial ein Homologiemodell der extrazellulären Domäne von hBambi anhand der gelösten Kristallstruktur der extrazellulären Domäne von BR1A im gebundenen Zustand (PDB-ID: 1REW) erstellt. Anhand dieses Modells wurde eine Arbeitshypothese entwickelt und es gelang in der Folge, biologisch aktives rekombinantes Protein zum einen aus transfizierten Insektenzellen sowie aus der Renaturierung aus bakteriellen Einschlusskörpern in hinreichender Menge herzustellen und chromatographisch aufzureinigen. Nach einer vergleichenden Qualitätskontrolle beider Exprimate wurden mittels CD-Spektroskopie und analytischer Gelfiltration der Anteil der Sekundärstrukturelemente sowie der Oligomerisierungsgrad erfolgreich bestimmt. In SPR-Bindestudien wurde der Beweis erbracht, dass hBambi-ECD Affinität zu annähernd allen getesteten Liganden der BMP-/GDF-Gruppe, die den SMAD-1/-5-/-8-Signalweg aktivieren, zeigt. Bekannte Typ-I- und Typ-II-Bindungsmutanten von BMP-2 wurden ebenfalls von hBambi-ECD quasi wildtypisch gebunden. Verschiedene Rezeptorektodomänen sowie ActivinA wurden, wie bisher in der Literatur fälschlich angenommen wurde, hingegen nicht gebunden. Die propagierte Homooligomerisierung von Bambi wird überdies nicht über die extrazelluläre Domäne vermittelt. Eingesetzt in Stimulationsversuche mit BMP-responsiven Zellen wurde eine konzentrationsabhängige inhibierende Wirkung von freier hBambi-ECD auf die BMP-2-vermittelte Signalweiterleitung mit unterschiedlichen Nachweismethoden ermittelt, welche die Ergebnisse aus den SPR-Versuchen erfolgreich bestätigten. In einem weiteren Teil dieser Arbeit wurden verschiedene chimäre Konstrukte aus für Bambi- und BR1A-Domänen kodierenden Sequenzen kloniert, in HEK Ad293-Zellen zusammen mit BMP- und Activin-responsiven Reportergenkonstrukten transient transfiziert und Stimulationsversuche mit BMP-2 und ActivinA durchgeführt. Wildtypisches Bambi zeigte hierbei ein ambivalentes Verhalten in Bezug auf die Regulation des BMP-2-Signals: geringe Mengen wirken agonistisch, höhere Mengen antagonistisch auf die Ausbildung des Reporters. Im Fall von ActivinA zeigte sich hingegen kein antagonistischer Einfluss von Bambi. In den Experimenten mit chimären Varianten erfolgte durch die erhaltenen Daten die Eingrenzung der Bindestelle von hBambi-ECD an BMP-2 auf den Bereich der Typ-I-Bindestelle. Ein direkter Einfluss der intrazellulären Domäne auf den BMP-2-Signalweg wurde ausgeschlossen. Weiterhin konnte gerade in Versuchen mit einem Antikörper gegen BR1A-ECD eine weitere Eigenheit der Bindung von Bambi an den Liganden offenbart werden: so bildet das Konstrukt aus hBambi-ECD und der intrazellulären BR1A-Domäne mit zugehöriger GS-Box und Typ-I-Kinase einen korrekt in den signalaktiven heterohexameren Komplex rekrutierten funktionellen Typ-I-Rezeptor. Mit den in dieser Arbeit erzielten Ergebnissen, nämlich der gelungenen Erstellung eines Herstellungsprotokolls der ECD, deren erfolgreich identifizierten Bindepartnern sowie der Charakterisierung der Bindung an BMP-2 ist der Grundstein für die Strukturaufklärung von hBambi-ECD gelegt, welche weitere Klarheit in die Funktionalität dieses Modulators der BMP-/GDF-vermittelten Signalweiterleitung bringen wird. Ebenso sind erste das Verständnis der ICD aufklärende Ergebnisse erzielt worden, die das Fundament für weitere Experimente und darauf folgende Kenntnisgewinne darstellen werden. N2 - The protein family of TGF-β-proteins consists of a huge number of predominantly homodimeric secreted ligands in higher animals, regulating many processes and developmental procedures in embryonic and adult forms via absolute or gradual influence. Signal transduction to cytoplasm and nucleus occurs by the aid of promiscuous, pairwisely recruited type-I- and type-II-receptors, usually activating a variety of receptor-dependent nucleus-permissive SMAD-proteins by an intracellular kinase-phosphorylation-cascade. After translocation they induce transcription of bre-promoted genes. Every signal transduction step may be interfered by endogenous inhibitors. So far the known membrane-bound pseudoreceptor Bambi (BMP and activine membrane-bound inhibitor) is hypothesized to have inhibitory potential against BMP- and activin-mediated signaling pathway via binding of distinct ligand-dependent receptors. However, its proper function still remains unclear. At the beginning of this work a homology model of the extracellular domain of hBambi was built based on a solved 3D-structure of BR1A-ECD bound to its ligand (PDB-ID: 1REW). Upon this model a work hypothesis was issued and biologically active recombinant protein was obtained successfully, both from transfected insect cells and from refolding ex bacterial inclusion bodies in sufficient amount and purified by chromatography, respectively. After comparative quality control of both samples the degree of oligomerisation and secondary structure composition was analyzed via CD spectroscopy and analytical gelfiltration runs. Binding affinity towards nearly all ligands of BMP-/GDF-group assigned to SMAD-1/-5-/-8-signaling was shown for hBambi-ECD by SPR experiments. Known BMP-2-mutants lacking affinity for type-I- or type-II-receptors exhibited wildtype-like binding to hBambi-ECD, respectively. Contrary to the current opinion, neither various ectodomains of receptors nor ActivinA did show any specific binding. Moreover, proposed homooligomerisation of Bambi is not mediated via ECD. Introduction of hBambi-ECD into stimulation experiments on several BMP-responsive cells with differing detection modes yielded in concentration-dependent inhibition of BMP-2-signalling, confirming the results of SPR-attempts well. In a further part of this work various chimeric constructs consisting of Bambi- and BR1A-coding sequence were cloned and effectively co-transfected into HEK Ad293 cells together with plasmids coding for BMP- and Activin-dependent reporters. Stimulation experiments with BMP-2 and ActivinA provided insights into Bambi participation within cellular processes. Full length Bambi exhibited ambivalent behaviour with respect to BMP-2-signaling: small amounts have an agonistic effect, while increasing levels revert it into an antagonistic one with respect to reporter formation. Regarding ActivinA no antagonistic effect was observed. Assays with chimeric constructs led to a containment for Bambi-epitope to the type-I-binding-site of BMP-2. Direct impact of Bambi-ICD on BMP-2-signaling could be blackballed. Furthermore, attempts with an antibody against BR1A-epitope revealed another feature of Bambi-binding to the ligand: a construct of Bambi-ECD fused to intracellular BR1A-domain including kinase and GS-Box forms a functional type-I-receptor correctly orientated and incorporated into heterohexameric signaling-complex. Upon gained results within this work, namely the successful establishment of a purification protocol for the extracellular domain of hBambi, the identification of its binding partners as well as the characterization of a prominent binding partner the basis for successful structure determination of hBambi-ECD aiming to unravel the function of this modulator of BMP-/GDF-signaling is laid. Likewise, first knowledge of the ICD was acquired that will be the basis for further experiments leading to continuative scientific findings. KW - Knochen-Morphogenese-Proteine KW - BMP KW - Rezeptor KW - Inhibitor KW - Activin KW - Transforming Growth Factor KW - Bambi KW - Inhibitor KW - Activin KW - TGF Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-103530 ER - TY - THES A1 - Önel, Ayla T1 - Synthese und Relevanz von Oxylipinen in Blättern, Wurzeln und Samen von \(Arabidopsis\) \(thaliana\) T1 - Synthesis and relevance of oxylipins in leaves, roots and seeds of \(Arabidopsis\) \(thaliana\) N2 - Die Lipidoxidation kann sowohl enzymatisch als auch nicht enzymatisch erfolgen. Der erste Schritt der enzymatischen Oxidation wird durch Lipoxygenasen katalysiert, von welchen es in Arabidopsis thaliana sechs verschiedene Isoformen gibt. Dabei werden die Lipoxygenasen nach dem Kohlenstoffatom klassifiziert, welches sie oxidieren. Somit gehören die LOX1 und LOX5 zu den 9-Lipoxygenasen, während LOX2, LOX3, LOX4 und LOX6 zu den 13 Lipoxygenasen zählen. Während der Samenalterung findet vermehrt eine Lipidperoxidation statt, welche mit einem Verfall des Samens sowie einer verringerten Keimrate korreliert. Im Rahmen dieser Arbeit wurde zunächst erfolgreich ein System zur künstlichen Samenalterung von Arabidopsis thaliana etabliert. Bei der künstlichen Alterung stiegen ähnlich wie bei der natürlichen Samenalterung oxidierte Lipide an und die Keimrate fiel ab. Nach Alterung konnte ein Anstieg von sechs verschiedenen oxidierten Triacylglycerolen detektiert werden. Es konnte in dieser Arbeit mit Hilfe von Mutanten mit Defekten in mehreren der Lipoxygenase Gene gezeigt werden, dass die Oxidation dieser veresterten Fettsäuren zum größten Teil nicht enzymatisch erfolgt. Bei der Alterung stiegen zudem enzymatisch gebildete 9 Lipoxygenase Produkte wie freie Hydroxy- und Ketofettsäuren an. Bei einer Analyse der freien oxidierten Fettsäuren konnte ebenfalls mit Lipoxygenase Mutanten ermittelt werden, dass diese hauptsächlich via LOX1 oxidiert werden. Die Untersuchung der Keimraten der Lipoxygenase Mutanten nach Alterung zeigte in mehreren Versuchen eine leicht erhöhte Keimrate der lox1 im Vergleich zum Wildtyp. Eine exogene Behandlung von Wildtyp Samen mit verschiedenen 9-Lipoxygenase Produkten, welche bei der Alterung ansteigen, führte allerdings nicht zu einer Keimungshemmung. Somit scheinen Produkte wie Hydroxy- und Ketofettsäuren der 9-Lipoxygenase LOX1 nicht die Hauptursache für die Keimungshemmung nach Alterung zu sein. Darüber hinaus konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass eine Behandlung der Blüten des Wildtyps mit Methyljasmonat zu einer signifikant höheren Keimrate der Samen im Vergleich zu Samen von unbehandelten Pflanzen nach Alterung führt. Ein „Lipidprofiling“ der Samen von mit Methyljasmonat behandelten Pflanzen wies signifikant geringere Gehalte sowohl an freien als auch veresterten oxidierten Fettsäuren auf, was mit einer erhöhten Lebensfähigkeit korrelierte. Diese Erkenntnisse könnten von großer Relevanz für die Landwirtschaft sein, falls eine Übertragung auf Nutzpflanzen möglich ist. Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit war eine eingehende Untersuchung der Rolle und Funktion der LOX6. Mit Hilfe von GUS Färbungen konnte eine Lokalisation der LOX6 in Blättern und Wurzeln nachgewiesen werden. Zudem wurde ein 35SLOX6GFP Konstrukt erstellt und in Arabidopsis thaliana Pflanzen stabil transformiert. Mit den selektionierten Linien könnte in Zukunft auch die intrazelluläre Lokalisation der LOX6 untersucht werden. Außerdem wurden Konstrukte mit dem Reportergen GFP und AOS sowie LOX2 hinter dem 35S Promotor kloniert, welche ebenfalls für weitere Lokalisations- und Kolokalisationsstudien genutzt werden können. Zudem wurde mit der Klonierung eines Konstruktes begonnen, um in Zukunft einen spezifischen LOX6 Antikörper herstellen und auch die endogene LOX6 Lokalisation in dem Wildtyp analysieren zu können. Um die Produkte der LOX6 zu untersuchen, wurden 35SLOX6 Linien sowie die lox6 Mutante verwendet. Obwohl Hydroxyfettsäuren und Jasmonate Folgeprodukte der LOX6 sind, wiesen die 35SLOX6 Linien weder basal, noch nach Stress erhöhte Gehalte dieser im Vergleich zum Wildtyp auf. Somit geben die 35SLOX6 Linien einen Hinweis darauf, dass LOX6 im Wildtyp nicht limitierend für die Produktion von Hydroxyfettsäuren und Jasmonaten sein könnte. Um zu untersuchen, ob das Substrat der LOX6 der limitierende Faktor sein könnte, wurde eine Behandlung mit α Linolensäure durchgeführt. Dabei entstanden allerdings nicht mehr Folgeprodukte der LOX6, sondern es fand sowohl in den 35SLOX6 Linien als auch in dem Wildtyp eine massive nicht enzymatische radikalische Oxidation der Fettsäuren statt. Um festzustellen, ob sich durch eine LOX6 Überexpression das Metabolom ändert, wurde eine „untargeted Analyse“ mit 35SLOX6 Linien durchgeführt. Diese zeigte vier Metabolite, welche in den 35SLOX6 Linien im Vergleich zum Wildtyp unterschiedlich stark vorhanden waren. Zudem sollte untersucht werden, ob sich die Physiologie und Stressresistenz in den Überexpressionslinien im Vergleich zum Wildtyp unterscheiden. Dabei zeichneten sich die 35SLOX6 Linien durch kleinere, hellere und rundere Blätter aus. Zudem wurden die Wurzeln der 35SLOX6 Linien bei Fraßversuchen mit Pocellio scaber im Vergleich zum Wildtyp weniger bevorzugt gefressen. Diese Erkenntnisse sowie die generierten Konstrukte und Pflanzenlinien können in der Zukunft einen weiteren Einblick in die vielfältigen Funktionen und Produkte der LOX6 gewähren. N2 - Lipidoxidation can take place enzymatically and non-enzymatically. The first step of the enzymatic oxidation is catalysed via lipoxygenases. In Arabidopsis thaliana there are six lipoxygenase isoforms. The lipoxygenases are characterized by the carbon atom they oxidise. LOX1 and LOX5 are 9-lipoxygenases, while LOX2, LOX3, LOX4 and LOX6 are 13 lipoxygenases. During seed ageing lipid peroxidation takes place, which correlates with a deterioration of the seed and a lower germination rate. First, a method for artificial ageing of Arabidopsis thaliana seeds was successfully established as a part of this work. During artificial seed ageing, oxidised lipids increased and the germination rate decreased similar to natural ageing. During artificial ageing an accumulation of six oxidised triacylglycerols could be detected. In this work, it could be shown with the help of mutants with defects in the lipoxygenase genes, that the oxidation of esterified fatty acids mainly takes place non-enzymatically. Moreover, enzymatically formed free 9-lipoxygenase products such as hydroxy and keto fatty acids increase during the process of ageing. An analysis of the free fatty acids in lipoxygenase mutants lead to the conclusion that they are formed primarily by LOX1. The lox1 mutant showed a slightly higher germination rate than the wild type after seed ageing in the majority of the experiments. However, an exogenous treatment of wild type seeds with free 9-lipoxygenase products, which increase during ageing, did not inhibit the germination rate. Therefore, LOX1 (9-lipoxygenase) products like hydroxy and keto fatty acids do not seem to be the main cause for the inhibition of germination after ageing. In addition, this work shows that a methyl jasmonate treatment of wild type flowers leads to a significant higher germination rate of their seeds after ageing in comparison to the seeds of untreated wild type plants. A lipid profiling revealed significantly lower levels of oxidised esterified as well as free fatty acids after ageing in seeds of treated wild type plants compared to untreated ones, which correlates with a higher germination rate. These findings could be of great value for the agriculture if they are transferable to crop plants. Another focus of this work was set on investigating the function and relevance of LOX6. The localization of LOX6 in leaves and roots could be confirmed with the help of GUS stainings. Furthermore, a 35SLOX6GFP construct was generated and stably transformed in Arabidopsis thaliana plants. With the selected lines it will be possible to investigate the intracellular localization of LOX6 in the future. Moreover, constructs with the reporter gene GFP and AOS or LOX2 were cloned behind the 35S promoter which can also be used for additional localization and co-localization experiments. To analyse the endogenous localization of LOX6 in the wild type, the cloning of a construct was started to generate a specific antibody in the future. To investigate the different products of LOX6, 35SLOX6 lines and the lox6 mutant were used. Although hydroxy fatty acids and jasmonates are secondary products of LOX6, neither basal nor after different stress treatments elevated levels could be detected in the overexpression lines compared to the wild type. This finding indicates that LOX6 may not be limiting for the production of jasmonates and hydroxy fatty acids in the wild type. Moreover, to investigate if the substrate of LOX6 could be a limiting factor, a treatment with α linolenic acid was performed. However, this did not lead to more LOX6 secondary products but rather to a massive increase of non-enzymatic radical triggered oxidation of fatty acids in the 35SLOX6 lines as well as in the wild type. To examine whether an overexpression of LOX6 leads to changes in the metabolom, an untargeted analysis with 35SLOX6 lines was performed. This analysis revealed four metabolites, which were present in different amounts in 35SLOX6 lines and the wild type. Apart from that, the physiology and stress resistance of the 35SLOX6 lines should be investigated for differences compared to the wild type. The overexpression lines exhibited smaller, rounder and paler leaves. In feeding experiments, the roots of 35SLOX6 plants were less attractive to the rough woodlouse Porcellio scaber than the wild type. The insights of this work, together with the generated constructs and plant lines could help to gain a better understanding of the versatile functions and products of LOX6 in the future. KW - Jasmonate KW - Lipoxygenase KW - Oxylipine KW - Samen KW - Arabidopsis thaliana KW - Jasmonate KW - Künstliche Samenalterung KW - Lipoxygenase 6 KW - Oxylipine Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-141647 ER - TY - THES A1 - Asmus, Elisabeth T1 - Mode of Action of Adjuvants for Foliar Application T1 - Wirkmechanismen von Adjuvantien für die Blattflächenapplikation N2 - Adjuvants are compounds added to an agrochemical spray formulation to improve or modify the action of an active ingredient (AI) or the physico-chemical characteristics of the spray liquid. Adjuvants can have more than only one distinct mode of action (MoA) during the foliar spray application process and they are generally known to be the best tools to improve agrochemical formulations. The main objective for this work was to elucidate the basic MoA of adjuvants by uncoupling different aspects of the spray application. Laboratory experiments, beginning from retention and spreading characteristics, followed by humectant effects concerning the spray deposit on the leaf surface and ultimately the cuticular penetration of an AI, were figured out to evaluate overall in vivo effects of adjuvants which were also obtained in a greenhouse spray test. For this comprehensive study, the surfactant classes of non-ionic sorbitan esters (Span), polysorbates (Tween) and oleyl alcohol polyglycol ether (Genapol O) were generally considered because of their common promoting potential in agrochemical formulations and their structural diversity. The reduction of interfacial tension is one of the most crucial physico-chemical properties of surfactants. The dynamic surface tension (DST) was monitored to characterise the surface tension lowering behaviour which is known to influence the droplet formation and retention characteristics. The DST is a function of time and the critical time frame of droplet impact might be at about 100 ms. None of the selected surfactants were found to lower the surface tension sufficiently during this short timeframe (chapter I). At ca. 100 ms, Tween 20 resulted in the lowest DST value. When surfactant monomers are fully saturated at the droplet-air-interface, an equilibrium surface tension (STeq) value can be determined which may be used to predict spreading or run-off effects. The majority of selected surfactants resulted in a narrow distribution of STeq values, ranging between 30 and 45 mN m- 1. Nevertheless, all surfactants were able to decrease the surface tension considerably compared to pure water (72 mN m- 1). The influence of different surfactants on the wetting process was evaluated by studying time-dependent static contact angles on different surfaces and the droplet spread area on Triticum aestivum leaves after water evaporation. The spreading potential was observed to be better for Spans than for Tweens. Especially Span 20 showed maximum spreading results. To transfer laboratory findings to spray application, related to field conditions, retention and leaf coverage was measured quantitatively on wheat leaves by using a variable track sprayer. Since the retention process involves short time dynamics, it is well-known that the spray retention on a plant surface is not correlated to STeq but to DST values. The relationship between DST at ca. 100 ms and results from the track sprayer showed increasing retention results with decreasing DST, whereas at DST values below ca. 60 mN m- 1 no further retention improvement could be observed. Under field conditions, water evaporates from the droplet within a few seconds to minutes after droplet deposition on the leaf surface. Since precipitation of the AI must essentially being avoided by holding the AI in solution, so-called humectants are used as tank-mix adjuvants. The ability of pure surfactants to absorb water from the surrounding atmosphere was investigated comprehensively by analysing water sorption isotherms (chapter II). These isotherms showed an exponential shape with a steep water sorption increase starting at 60% to 70% RH. Water sorption was low for Spans and much more distinct for the polyethoxylated surfactants (Tweens and Genapol O series). The relationship between the water sorption behaviour and the molecular structure of surfactants was considered as the so-called humectant activity. With an increasing ethylene oxide (EO) content, the humectant activity increased concerning the particular class of Genapol O. However, it could be shown that the moisture absorption across all classes of selected surfactants correlates rather better with their hydrophilic-lipophilic balance values with the EO content. All aboveground organs of plants are covered by the cuticular membrane which is therefore the first rate limiting barrier for AI uptake. In vitro penetration experiments through an astomatous model cuticle were performed to study the effects of adjuvants on the penetration of the lipophilic herbicide Pinoxaden (PXD) (chapter III). In order to understand the influence of different adjuvant MoA like humectancy, experiments were performed under three different humidity levels. No explicit relationship could be found between humidity levels and the PXD penetration which might be explained by the fact that humidity effects would rather affect hydrophilic AIs than lipophilic ones. Especially for Tween 20, it became obvious that a complex balance between multiple MoA like spreading, humectancy and plasticising effects have to be considered. Greenhouse trials, focussing the adjuvant impact on in vivo action of PXD, were evaluated on five different grass-weed species (chapter III). Since agrochemical spray application and its following action on living plants also includes translocation processes in planta and species dependent physiological effects, this investigation may help to simulate the situation on the field. Even though the absolute weed damage was different, depending both on plant species and also on PXD rates, adjuvant effects in greenhouse experiments displayed the same ranking as in cuticular penetration studies: Tween 20 > Tween 80 > Span 20 ≥ Span 80. Thus, the present work shows for the first time that findings obtained in laboratory experiments can be successfully transferred to spray application studies on living plants concerning adjuvant MoA. A comparative analysis, using radar charts, could demonstrate systematic derivations from structural similarities of adjuvants to their MoA (summarising discussion and outlook). Exemplarily, Tween 20 and Tween 80 cover a wide range of selected variables by having no outstanding MoA improving one distinct process during foliar application, compared to non-ethoxylated Span 20 and Span 80 which primarily revealed a surface active action. Most adjuvants used in this study represent polydisperse mixtures bearing a complex distribution of EO and aliphatic chains. From this study it seems alike that adjuvants having a wide EO distribution offer broader potential than adjuvants with a small EO distribution. It might be a speculation that due to this broad distribution of single molecules, all bearing their individual specific physico-chemical nature, a wide range of properties concerning their MoA is covered. N2 - Adjuvantien sind chemische Verbindungen, die einer Pflanzenschutzformulierung hinzugefügt werden, um die Wirkung der Aktivsubstanz oder die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Spritzbrühe zu verbessern oder zu modifizieren. Sie können mehr als nur einen einzigen bestimmten Wirkmechanismus während der Blattflächenapplikation aufweisen, sodass sie gemeinhin als wirksamste Hilfsmittel in Pflanzenschutzformulierungen benutzt werden. Der Schwerpunkt dieser Arbeit lag darauf, ihre wesentlichen Wirkmechanismen aufzuklären, indem verschiedene Aspekte der Applikation entkoppelt und unabhängig voneinander untersucht wurden. Hierzu wurden Laborversuche durchgeführt, beginnend mit dem Retentions- und Spreitungsverhalten, über die „humectant“- Eigenschaft, den Tropfenrückstand betreffend und schließlich die kutikuläre Penetration einer Aktivsubstanz. Um schlussendlich die ineinander übergreifenden in vivo Mechanismen von Adjuvantien zusammenfassend bewerten zu können, wurde zusätzlich ein Gewächshausprayversuch ausgeführt. Für diese mechanismenübergreifende Studie wurden aufgrund ihrer allgemein begünstigenden Eigenschaften in Formulierungen und ihrer strukturellen Vielfalt die Tensidklassen der Sorbitanester (Span), Polysorbate (Tween) und Oleylalkoholpolyglykolether (Genapol O) verwendet. Die Absenkung der Grenzflächenspannung ist eine der wesentlichen physikalisch-chemischen Eigenschaften von Tensiden. Die dynamische Oberflächenspannung (DST) wurde untersucht, um das Verhalten beim Absenken der Oberflächenspannung einzuschätzen, welches die Tropfenbildung und die Retentionseigenschaften beeinflusst. Die DST ist zeitabhängig und das kritische Zeitfenster, in dem ein Tropfen auf die Pflanzenoberfläche auftrifft, beläuft sich auf ca. 100 ms. Innerhalb dieses Zeitrahmens konnte keines von den ausgewählten Tensiden die Oberflächenspannung hinreichend herabsetzen (vgl. Kapitel I). Bei ca. 100 ms wies Tween 20 die niedrigsten DST-Werte auf. Bei vollständiger Absättigung der Tropfen-Luft-Grenzfläche durch Tensidmonomere kann eine statische Oberflächenspannung (STeq) bestimmt werden. Diese physikalische Größe kann benutzt werden, um Spreitungs- und „run-off“- Effekte abzuschätzen. Der Großteil der betrachteten Tenside zeigte ähnliche STeq-Ergebnisse zwischen 30 und 45 mN m- 1. Somit waren alle Tenside in der Lage, die Oberflächenspannung von Wasser (72 mN m- 1) beträchtlich abzusenken. Der Einfluss von Tensiden auf den Benetzungsprozess wurde sowohl mit Hilfe von zeitabhängigen, statischen Kontaktwinkelmessungen auf verschiedenen Oberflächen, als auch nach der Wasserverdunstung auf Basis der Spreitungsfläche der Tropfen auf Triticum aestivum Blättern analysiert. Dabei zeigte die Klasse der Spans, besonders Span 20, ein besseres Benetzungsverhalten als die Klasse der Tweens. Um die Erkenntnisse aus dem Labor auf die Sprayapplikation auf dem Feld zu übertragen, wurden Retention und Blattbedeckung quantitativ auf Weizenoberflächen mit Hilfe eines „tracksprayers“ bestimmt. Da der Retention ein sehr schnell ablaufender, dynamischer Prozess zugrunde liegt, korreliert sie nicht mit der statischen, sondern mit der dynamischen Oberflächenspannung. Die Beziehung zwischen DST, bei ca. 100 ms und den „tracksprayer“- Ergebnissen zeigte eine Retentionszunahme bei abnehmender DST. Dabei konnte keine weitere Retentionsverbesserung bei DST-Werten unterhalb von ca. 60 mN m- 1 erzielt werden. Nachdem der Tropfen auf der Blattoberfläche gelandet ist, verdunstet Wasser unter Feldbedingungen aus dem Sprühtropfen innerhalb weniger Sekunden bis Minuten. Da das Auskristallisieren der Aktivsubstanz zwingend vermieden werden muss, werden sog. „humectants“ (dt. Feuchthaltemittel) als Tankmix-Adjuvantien eingesetzt, um die Aktivsubstanz in Lösung zu halten. Die Fähigkeit von Tensiden, Wasser aus der umgebenden Atmosphäre zu binden, wurde mit Hilfe von Wassersorptionsisothermen umfassend analysiert (vgl. Kapitel II). Diese Isothermen zeigten einen exponentiellen Verlauf mit einem steilen Anstieg der Wassersorption, beginnend ab ca. 60 bis 70% RH (relative Luftfeuchte). Dabei zeigten Spans eine geringere Wassersorption als die polyethoxylierten Tenside (Tweens und Genapol O). Die Beziehung zwischen dem Wassersorptionsverhalten und der molekularen Struktur der Tenside wurde als sog. „humectant Aktivität“ betrachtet. Speziell für die Klasse der Genapol O Tenside, wurde mit zunehmenden Ethylenoxidgehalt (EO) eine Zunahme der „humectant Aktivität“ nachgewiesen. Es konnte jedoch auch gezeigt werden, dass die Wassersorption über alle Klassen der hier ausgewählten Tenside eher mit dem „hydrophilic-lipophilic-balance“- Wert (HLB) als mit dem EO-Gehalt korreliert. Die Kutikula ist eine Membran, die alle oberirdischen Pflanzenorgane bedeckt. Damit stellt sie die wichtigste transportlimitierende Barriere für die Aufnahme von Pflanzenschutzmittelwirkstoffen dar. Um die Wirkung von Adjuvantien auf die Penetration des lipophilen Herbizids Pinoxaden (PXD) zu bestimmen, wurden in vitro Penetrationsexperimente durch eine astomatäre Modellkutikula durchgeführt (vgl. Kapitel III). Um den Einfluss verschiedener Wirkmechanismen, wie z.B. die der „humectant“- Eigenschaft zu verstehen, wurden diese Versuche unter drei verschiedenen Luftfeuchtebedingungen durchgeführt. Hierbei konnte kein klarer Zusammenhang zwischen der relativen Luftfeuchte und der PXD-Penetration nachgewiesen werden. Eine Ursache dafür könnte sein, dass sich Luftfeuchteeffekte eher auf hydrophile als auf lipophile Stoffe auswirken. Vielmehr wurde deutlich, dass hier eine komplexe Kombination aus verschiedenen Wirkmechanismen, wie z.B. Spreitungs-, „humectant“- und Weichmachereffekte, zum Tragen kommt. Um den Einfluss von Adjuvantien auf die in vivo Wirkung von PXD zu analysieren, wurden Gewächshausstudien mit fünf verschiedenen Ungräsern durchgeführt (vgl. Kapitel III). Da die Applikation von Pflanzenschutzwirkstoffen auch deren nachfolgende Wirkung auf lebende Pflanzen, wie z.B. Translokationsprozesse in planta und speziesspezifische physiologische Effekte beinhaltet, kann diese Untersuchung helfen, die Situation auf dem Feld besser zu simulieren. Durch die sowohl verschiedenen Pflanzenspezies als auch PXD-Konzentrationen variierte die absolute Schädigung der Ungräser stark. Dennoch kam es zur gleichen Reihenfolge der Auswirkung der Adjuvantien wie in den in vitro Kutikula-Penetrationsversuchen: Tween 20 > Tween 80 > Span 20 ≥ Span 80. Somit konnte in der vorliegenden Arbeit zum ersten Mal gezeigt werden, dass Erkenntnisse aus Laborversuchen, die die Wirkmechanismen von Adjuvantien betreffen, erfolgreich auf die Sprayapplikation auf Pflanzen übertragen werden können. Um eine systematische Herleitung der Wirkmechanismen von Adjuvantien abschließend zusammenzufassen, vergleichen und bewerten zu können, wurde dies mit Hilfe von Netzdiagrammen grafisch dargestellt (vgl. Zusammenfassende Diskussion und Ausblick). Dabei konnten Zusammenhänge zwischen strukturellen Ähnlichkeiten von Adjuvantien und deren Wirkmechanismen gefunden werden. Tween 20 und Tween 80 beispielsweise deckten ein sehr breites Spektrum an Mechanismen ab, zeigten dabei aber keinen herausragenden Wirkmechanismus einen bestimmten Prozess betreffend. Im Gegensatz dazu wiesen die nicht-ethoxylierten Span 20 und Span 80 hauptsächlich nur den oberflächenaktiven Mechanismus auf. Fast alle Adjuvantien, die in dieser Arbeit analysiert wurden, stellen komplexe polydisperse Mischungen dar, denen eine komplizierte Verteilung von EO-Gruppen und aliphatischen Ketten zugrunde liegt. Aus den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit kann gemutmaßt werden, dass Adjuvantien mit einer eher breiten EO-Verteilung ein breiteres Anwendungsspektrum bieten können als Adjuvantien mit einer kleineren Verteilung. Es lässt sich vermuten, dass durch das Vorhandensein einer enormen Vielzahl einzelner Moleküle, die jeweils einen individuellen spezifischen physikalisch-chemischen Charakter aufweisen, ein großes Spektrum von Eigenschaften bezüglich der Sprayapplikation abgedeckt wird. KW - Adjuvans KW - Pflanzenschutzmittel KW - Adjuvant KW - Plant Protection KW - Kutikula KW - Plant Protection Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-138159 ER - TY - THES A1 - Förster, Sabrina T1 - Regulation des Kaliumausstroms im ABA- und Jasmonatvermittelten Stomaschluss T1 - Regulation of Potassium Efflux in the ABA- and Jasmonate-controlled Stomatal Closure N2 - Stomata sind mikroskopisch kleine Poren in der Blattoberfläche der Landpflanzen, über die das Blattgewebe mit CO2 versorgt wird. Als Schutz vor Austrocknung oder einer Infektion durch Pathogene entwickelte sich ein Mechanismus, um die Porenweite durch Bewegung der sie umgebenden Schließzellen an die Bedürfnisse der Pflanze anzupassen. Ein eng geknüpftes Signalnetzwerk kontrolliert diese Bewegungen und ist in der Lage, externe wie interne Stimuli zu verarbeiten. Der Schließvorgang wird osmotisch durch den Turgorverlust in den Schließzellen angetrieben, der durch den Efflux von Ionen wie K+ ausgelöst wird. In dieser Arbeit wurde die Regulation durch Phosphorylierung des wichtigsten K+-Effluxkanals für den Stomaschluss, GORK, untersucht. Folgende Erkenntnisse wurden durch elektrophysiologische Untersuchungen mit der DEVC-Methode gewonnen: GORK wird durch OST1 auf Ca2+- unabhängige und durch CBL1/9-CIPK5 und CBL1-CIPK23 auf Ca2+-abhängige Weise phosphoryliert und damit aktiviert. CBL1 muss CIPK5 an der Plasmamembran verankern und Ca2+ binden. CIPK5 benötigt ATP und eine Konformationsänderung, um GORK zu phosphorylieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurde auch zum ersten Mal gezeigt, dass die PP2CPhosphatase ABI2 direkt mit einem Kanal interagiert und dessen Aktivität hemmt. ABI2 interagiert auch mit den Kinasen OST1, CIPK5 und CIPK23, sodass die Kontrolle der Kanalaktivität auf multiple Weise stattfinden kann. OST1 und ABI2 verbinden die GORKRegulation mit dem ABA-Signalweg. Schließzellen von gork1-2, cbl1/cbl9 und cipk5-2 sind insensitiv auf MeJA, nicht aber auf ABA. Dies stellt eine direkte Verbindung zwischen dem Jasmonatsignalweg und der Ca2+-Signalgebung dar. Im Rahmen dieser Arbeit konnten weitere Hinweise für das komplexe Zusammenspiel der Phytohormone ABA, JA und des Pseudomonas- Effektors Coronatin gefunden werden. Hier konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass Schließzellen je nach Inkubationszeit unterschiedlich auf MeJA und das Phytotoxin Coronatin reagieren. ABA und Coronatin verhalten sich dabei antagonistisch zueinander, wobei der Effekt der Stimuli auf die Stomaweite von der zeitlichen Abfolge der Perzeption abhängt. Der Jasmonat-Signalweg in Schließzellen löst eine geringe ABA-Synthese sowie den Proteinabbau durch das Ubiquitin/26S-Proteasom-System aus und benötigt ABA-Rezeptoren (PYR/PYLs), um einen Stomaschluss einzuleiten. Durch diese Arbeit konnte somit die JA-gesteuerte Regulation des Kaliumefflux-Kanals GORK entschlüsselt sowie einige Unterschiede zwischen den ABA, JA und Coronatin-vermittelten Schließzellbewegungen aufgedeckt werden. N2 - Stomata are microscopically small pores in the leaf surface of land plants, through which the leaf tissue is supplied with CO2. To protect the plant from both desiccation and infection by pathogens, a mechanism evolved to adjust the pore width to the plant’s needs by movement of the surrounding guard cells. A dense signaling network controls these movements and is able to integrate external as well as internal stimuli. Stomatal closure is osmotically driven by the loss of turgor in guard cells caused by efflux of ions such as K+. In this work, we investigated the regulation by phosphorylation of the main K+ efflux channel for stomatal closure, GORK. The following results were obtained with electrophysiological measurements via the DEVC- technique: GORK is phosphorylated by OST1 in a Ca2+- independent and by CBL1/9-CIPK5 as well as CBL1-CIPK23 in a Ca2+-dependent manner. CBL1 anchors CIPK5 at the plasma membrane and must bind Ca2+ for activation of CIPK5. CIPK5 requires both ATP binding and a conformational change for phosphorylation of GORK. For the first time it was shown that the PP2C phosphatase ABI2 interacts directly with an ion channel and inhibits its activity. ABI2 also interacts with the kinases OST1, CIPK5 and CIPK23, implying a control by ABI2 over channel activity in multiple ways. OST1 and ABI2 link GORK regulation with the ABA signaling pathway. Guard cells of gork1-2, cbl1/cbl9 and cipk5-2 are insensitive to MeJA, but not to ABA. This represents a direct connection between JA signal transduction and Ca2+ signaling. In this work, further hints could be found for the complex interplay of the phytohormones ABA, JA and the effector Coronatine of Pseudomonas. Here it was shown for the first time that guard cells respond differently to MeJA and the phytotoxin Coronatine, based on incubation time. Depending on the temporal sequence of perception, ABA and Coronatine act antagonistically on the pore width. Jasmonate signal transduction in guard cells leads to a minor synthesis of ABA as well as protein degradation via the ubiquitin/ 26S proteasome system and initiates stomatal closure requiring ABA receptors (PYR/PYLs). This work describes the JA-controlled regulation of the potassium efflux channel GORK as well as some differential aspects of ABA, JA and Coronatine triggered stomatal movements. KW - Ackerschmalwand KW - Stomata KW - Arabidopsis thaliana KW - Phophorylierung KW - Phytohormon KW - Spaltöffnung KW - Kaliumkanal KW - Abscisinsäure KW - Jasmonsäure KW - Pflanzenhormon Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-115455 ER - TY - THES A1 - Hartmann, Laura T1 - Die funktionelle Rolle der Transkriptionsfaktoren bZIP1 und bZIP53 in der Arabidopsis thaliana- Wurzel nach Salstress T1 - The functional role of bZIP1 and bZIP53 transcription factors in salt treated roots of Arabisopsis thaliana N2 - Die zunehmende Versalzung des Bodens führt weltweit zu starken Ernteeinbußen. Ob- wohl die Wurzeln der Pflanzen als erstes mit dem Salzstress in Berührung kommen, ist noch nicht viel über Signaltransduktionswege in Wurzeln zur Anpassung der Pflanze an Salzstress bekannt. Die bZIP-Transkriptionsfaktoren der Gruppe S1, bZIP1 und bZIP53, werden gewebespezifisch in der Wurzel nach Salzstress aktiviert. In dieser Arbeit werden diese bZIPs in ein Netzwerk eingeordnet, von der Aktivierung der Tran- skriptionsfaktoren bis zur Funktion in der Regulation des Stoffwechsels in der salzgest- ressten Pflanze. Die Aktivierung von bZIP1 kann über verschiedene sowohl ionische als auch osmotische Stimuli erfolgen und ist abhängig von Calcium, der HEXOKINASE 1 und SnRK1- Kinasen (Snf1 RELATED PROTEIN KINASE 1). Die dunkelinduzierte Expression von bZIP1 wird HXK1-abhängig durch Glucose inhibiert, bei Energiemangelbedingungen ist die Aktivierung von bZIP1 SnRK1-abhängig. Beide Enzyme spielen auch in der salzinduzierten Expression von bZIP1 eine Rolle. Über Transkriptom- und Me- tabolomanalysen kann gezeigt werden, dass bZIP1 und bZIP53 an der Umprogram- mierung des Kohlenhydrat- und Aminosäuremetabolismus teilhaben. Besonders Gene der Glukoneogenese (PYRUVAT ORTHOPHOSPHAT DIKINASE und FRUCTOSE- 1,6-BISPHOS- PHATASE) bzw. des Aminosäurekatabolismus (BRANCHED- CHAIN AMINO ACID TRANSAMINASE 2, METHYLCROTONYL- COA-CARBOXYLASE A und HOMOGENTISATE 1,2-DIOXYGENASE ) werden von den Transkriptionsfaktoren reguliert. Das spricht für eine Umprogrammierung des Metabolismus und der Mobilisierung von Energie aus Aminosäuren zur Anpassung an die Stressbedingungen. Die Transkriptionsfaktoren der Gruppe S1 bilden vorzugsweise Heterodimere mit der Gruppe C. Mit Mutantenanalysen, die zum einen die Transkriptionsfaktoren des C/S1-Netzwerks und zum anderen Komponenten der Abscisinsäure (ABA) abhängigen Signaltransduktion beinhalten, konnte ein Signaltransduktionsnetzwerk aufgestellt werden, das die Antwort auf abiotischen Stress mittels des Signalwegs über ABA, SnRK2 und AREB (ABA RESPONSIVE ELEMENTS-BINDING PROTEIN) mit der SnRK1-vermittelten Antwort auf Energiemangelbedingungen in der Pflanze verknüpft. Die gefundenen stress- bzw. energieresponsiven Gene konnten nach den Mutantenana- lysen auf Grund ihrer unterschiedlichen Regulation in vier Klassen eingeteilt werden, wovon nur eine, die Klasse 4, von dem C/S1 Netzwerk reguliert wird. Die Klassen 1- 3 sind unabhängig von den bZIP-Transkriptionsfaktoren der Gruppe C. Die Klasse 1 bilden typische ABA-responsive Gene, die von den Gruppe A-bZIPs reguliert werden. Faktoren der Gruppe A sind auch an der Expression der Gene der Klasse 2 beteiligt, diese werden aber auch durch bZIP1 und bZIP53 induziert. Dieser Klasse konnten Gene zugeordnet werden, die im Abbau verzweigtkettiger Aminosäuren eine Rolle spielen. Am Aminosäureabbau sind außerdem die Gene der Klasse 2 beteiligt. Für diese Gene konnte eine Expressionsregulation durch bZIP1 und bZIP53 gezeigt werden. Für die Bestimmung möglicher Heterodimerisierungspartner bedarf es noch weiterer Analysen. Dieses Model, das den abitoschen Stress abhängigen ABA-Signalweg mit dem ener- gieabhängigen SnRK1-Signaltransduktionsweg verknüpft, zeigt die präzise Regulation von mindestens 4 Gen-Klassen, deren Expression durch die Kombination verschiedener bZIP-Transkriptionsfaktoren aktiviert wird. N2 - Increasing salinization of soil has led to significant crop loss worldwide. Notwith- standing the fact that plant roots are the first to be affected by salt stress, signal transduction pathways in roots for salt stress adaptation are still mostly unknown In this work the group S1 bZIP transcription factors bZIP1 and bZIP53 that are spe- cifically induced by salt stress in roots, were functionally characterized with respect to their role in salt stress response in plants. Transcriptional activation of bZIP1 can be mediated by both ionic and osmotic stimuli and is dependent on Ca2+, HEXO- KINASE 1 (HXK1) and the SnRK1 kinases (Snf1 RELATED PROTEIN KINASE 1). Dark induced expression of bZIP1 is inhibited by glucose depending on HXK1 acti- vity. In starvation conditions the transcription of bZIP1 is mediated by SnRK1. Here both signaling enzymes are shown to be involved in salt induced bZIP1 transcripti- on. Transcriptome and metabolome analyses reveal an important function of bZIP1 and bZIP53 concerning the reprogramming of primary carbohydrate and amino acid metabolism during salt stress in the Arabidopsis root. Particularly genes involved in gluconeogenesis (PYRUVAT ORTHOPHOSPHAT DIKINASE and FRUCTOSE-1,6- BISPHOSPHATASE )or amino acid catabolism (BRANCHED- CHAIN AMINO ACID TRANSAMINASE 2, METHYLCROTONYL- COA-CARBOXYLASE A and HOMO- GENTISATE 1,2-DIOXYGENASE) are regulated by these transcription factors. This points to reprogramming of metabolism and remobilization of energy by amino acid degradation under stress. Group S1 bZIPs preferably form heterodimers with group C bZIP transcription factors. Mutant analyses of C/S1 bZIPs and ABA signaling com- ponents, respectively, revealed a complex network connecting abiotic stress responses via ABA-SnRK2-AREB (ABA RESPONSIVE ELEMENTS-BINDING PROTEIN) to SnRK1 mediated starvation responses. The detected genes were grouped in four classes according to their different regulation, of which only class 4 is regulated by the C/S1 network. Classes 1-3 are controlled independently of group C transcription factors. Class 1 contains typical ABA responsive genes, regulated by group A bZIPs. These are also involved in gene expression of class 2 genes, which are as well induced by bZIP1 and bZIP53. Genes of branched chain amino acid catabolism belong to this class. Al- so involved in amino acid catabolism are genes of class 2, these genes were shown to be transcriptionally regulated by bZIP1 and bZIP53. Further analyses are required to reveal possible heterodimerization partners. This model, that links the abiotic stress responding ABA pathway to the energy dependent SnRK1 signaling pathway, reveals at least four gene classes that are very precisely regulated by combining different bZIP transcription factors. KW - Salzstress KW - salt KW - Transkriptionsfaktor KW - Ackerschmalwand KW - transcription factors KW - root KW - Wurzel Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-99423 ER - TY - THES A1 - Carmona Arana, José Antonio T1 - Regulation Tumornekrosefaktor (TNF) Rezeptor assoziierter Signalwege durch das Adapterprotein TRAF1 T1 - Regulation of tumor necrosis receptor (TNF) associated pathways through the adapter protein TRAF1 N2 - TWEAK ist ein zu der TNF-Superfamilie (Tumor Necrosis Factor) zugehöriges Zytokin, welches in Form löslicher und membranständiger Moleküle vorkommt. Beide Formen des Liganden können an den Rezeptor (Fn14) binden. Viele verschiedene intrazelluläre Signalwege werden durch den Fn14 aktiviert, beispielweise Erk1/2, JNK, Jun und STAT3, vor allem jedoch das NFkB. Lösliches und membranständiges TWEAK zeigen eine ähnliche Aktivierungseffizienz bezüglich des alternativen NFkB-Signalwegs, wohingegen membranständiges TWEAK weit besser als lösliches TWEAK den klassischen NFkB-Signalweg aktiviert. In der vorliegenden Arbeit wurde zunächst die TWEAK-vermittelte Induzierbarkeit von verschiedenen Zielgenen des NFkB-Systems untersucht. Lösliches TWEAK zeigte einen weit schwächeren aktivierenden Effekt auf den klassischen NFkB-Signalweg als TNF, das ein sehr guter Aktivator des klassischen NFkB-Systems ist (Abb. 5, 6). Nichtsdestotrotz war TWEAK imstande eine stärkere TRAF1-Induktion als TNF herbeizuführen (Abbildung 7, 8). TRAF1 ist ein durch NFkB-System stark reguliertes Gen. Um posttranskriptionelle TRAF1-Modifikationen als Ursache für die unerwartet gute TRAF1-Induktion durch lösliches TWEAK auszuschließen, wurde die TRAF1-Expression nach Proteasom- und Caspasen-Inhibition untersucht (Abbildung 9). Dies ergab keinen Hinweis auf einen Einfluss dieser Prozessen auf der TRAF1-Expression. Mittels des IKK2-spezifischen Inhibitor TPCA-1 wurde die TWEAK-vermittelte TRAF1-Induktion Zelltyp-abhängig gehemmt, wohingegen die TNF-vermittelte Induktion von TRAF1 in allen Zelllinien vollständig inhibiert wurde (Abbildung 13). Versuche mit dem NEDD8-aktivierenden Enzym (NAE) Inhibitor MLN4924, resultierten in einer totalen Inhibition der TRAF1-Expression in allen TWEAK- und TNF-stimulierten Zellen (Abbildung 14). Diese Befunde sprechen dafür, dass bei der TWEAK-vermittelten TRAF1-Expression beide Zweige des NFkB-Signalwegs Zelltyp-abhängig beteiligt sind. Die Oligomerisierung der Liganden der TNF-Familie verstärkt oft ihre Aktivität. Oligomerisiertes TWEAK imitiert die biologische Aktivität von membranständigem TWEAK. Lösliches TWEAK wurde mit einem anti-Flag Antikörper oligomerisiert und die TRAF1-Induktion durch den alternativen NFkB-Signalweg wurde analysiert Oligomerisiertes TWEAK aktivierte Zelltyp-unabhängig den klassischen NFkB-Signalweg stärker als lösliches TWEAK, wohingegen kein Effekt auf die TRAF1-Induktion oder auf die Aktivierung den alternativen NFkB-Signalweg festgestellt wurde (Abbildung 11, 12). TWEAK ist imstande die TRAF2-vermittelte CD40-Induktion des klassischen NFkB-Signalwegs zu hemmen (Abbildung 16, 17). Um den Beitrag von TWEAK-Induziertem TRAF1 zur CD40-Inhibition zu herauszufinden, wurden TRAF1-stabil transfizierte 786O- und U2OS-Zellen hergestellt (Abbildung 19). Die CD40-Induzierte IkBa-Degradation und IL8/6 Produktion war in den TRAF1-Transfektanten als auch in mit löslichem TWEAK vorbehandelte Zellen stark inhibiert (Abbildung 21, 22), wobei die CD40-Expression und CD40/CD40L-Interaktion unverändert blieb (Abbildung 20). Diese Ergebnisse sprechen für einen wichtigen Beitrag des Adaptorprotein TRAF1 in der TWEAK-vermittelte Inhibition der CD40-induzierte Aktivierung des klassischen NFkB-Signalwegs. N2 - The multifunctional cytokine TWEAK belongs to the TNF-Superfamily. As typically for the members of this family TWEAK occurs in a membrane-associated and a soluble form. Both forms of TWEAK are able to bind their cognate receptor Fn14, but they differ in their capability to activate Fn14. The TWEAK/Fn14 axis activates various intracellular signaling pathways leading to the activation of Erk1/2, JNK, Jun or STAT3, but above all the two NFkB-pathway. A superiority of membrane TWEAK over soluble TWEAK to activate the classical NFkB pathway is well known, but both TWEAK forms show no significant difference in the activation of the non-canonical NFkB pathway. Soluble TWEAK was compared with TNF, a typical and strong inducer of classical NFkB in this work and showed a inferior ability in the production of IL8 and degradation of IkBa (Figure 5, 6) two hallmarks of the classical NFkB pathway. Nevertheless, soluble TWEAK induced more powerful than TNF the expression of TRAF1, a NFkB-controlled protein participating in the signal transduction of several inflammatory signaling pathways (Figure 7). Experiments using proteasom- and caspase-inhibitors were perfomed and showed no significant contribution of these processes to the differential TRAF1-expression by TNF and soluble TWEAK (Figure 9). The IKK2 inhibitor TPCA-1 blocked TNF-induced TRAF1 expression in all cell lines investigated. Contrary, soluble TWEAK-induced TRAF1 expression was only inhibited by TPCA-1 in a subset of cell lines (Figure 13). Experiments blocking both NFkB pathways, performed with the NEDD8-activating enzyme inhibitor MLN4924, revealed a total inhibition of TWEAK- and TNF-induced TRAF1 expression (Figure 14). In sum, these results suggests that both NFkB signaling pathways are able to induce TRAF1. Oligomerisation of ligands from the TNF-family often results in strong enhancement of their biological activity. Oligomerization of soluble Flag-tagged TWEAK with an anti-Flag antibody produced ligand complexes which mimics the biological features of membrane TWEAK. These complexes showed neither enhanced TRAF1 induction nor a stronger activation of the alternative NFkB pathway compared to soluble TWEAK (Figure 11). However, oligomerized Flag-TWEAK revealed a strongly increased capability to trigger the activation of the classical NFkB pathway. TWEAK-priming can inhibit TRAF2-mediated CD40-induction of the classical NFkB pathway (Figure 16, 17). In order to establish the contribution of the TWEAK-induced TRAF1 to this effect, TRAF1 stable transfectants were generated (Figure 19). CD40-induced degradation of IkBa as well as CD40-associated production of IL8/6 were strongly inhibited in TWEAK-primed cells and TRAF1 transfectants (Figure 21, 22), although expression of CD40 and CD40/CD40L interaction were not affected (Figure 20). These results indicate a contribution of the adaptor protein TRAF1 to TWEAK-mediated inhibition of CD40-induced NFkB activation. KW - Antigen CD40 KW - TWEAK KW - CD40 KW - NFKB KW - TRAF1 KW - TNF KW - TRAF2 KW - IL8 KW - cIAP KW - Sleeping Beauty KW - TPCA1 KW - Nuklearfaktor Kappa B KW - Signalkette Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-128735 ER - TY - THES A1 - Friedrich, Alexandra T1 - Beeinflussung des Na+-D-Glukose-Kotransporters SGLT1 und der Na+-Nukleosidtransporter CNT durch Peptidmotive des Regulatorproteins RS1 im Darm T1 - Effects of RS1-derived peptides on Na+-D-glucose cotransporter SGLT1 and Na+- nucleoside cotransporters CNTs in small intestine N2 - Der Natrium-D-Glukose Kotransporter 1 (SGLT1) spielt eine wichtige Rolle bei der Aufnahme von Glukose aus dem Darmlumen in die Enterozyten des Darms. Anhand von Untersuchungen an Xenopus laevis-Oozyten konnte in unserem Labor das Protein RS1 als posttranslationales Regulatorprotein für SGLT1 und diverse andere Transporter ermittelt werden. Es wurde eine regulatorische Domäne aus RS1 mit vielen potentiellen Phosphorylierungsstellen isoliert (RS1-Reg) und gezeigt dass RS1-Reg die Abschnürung von Transporter enthaltenen Vesikeln vom Transgolgi-Netzwerk hemmt. Neben SGLT1 reguliert RS1 auch die konzentrierenden Nukleosidtransporter (CNTs) am TGN. Die Regulation der Transporter ist vom Phosphorylierungszustand von RS1-Reg abhängig. So wurde durch Versuche an Oozyten von Xenopus laevis und Injektion von RS1-Reg Mutanten gezeigt, dass die Phosphorylierung von RS1-Reg an einigen Stellen zu einer Inhibition von SGLT1 führte, während der Nukleosidtransporter CNT1 durch die dephosphorylierte Mutante herunterreguliert wurden. Neben der phosphorylierungsabhängigen Regulation konnte für SGLT1 auch gezeigt werden, dass die Herunterregulation nur unter Niedrigzucker-Bedingungen erfolgte, nicht jedoch bei hohen Glukosekonzentrationen. Für die CNTs war eine derartige Zuckerabhängigkeit nicht zu beobachten. Im Rahmen der vorliegenden Studie wurde untersucht, ob die Ergebnisse aus den Oozytenmessungen auch in vivo in einem Säugetier gezeigt werden können. Hierzu wurden Mutanten der regulatorischen Domäne (RS1-Reg) des Maus-Proteins, welche den phosphorylierten Zustand simulierten (RS1-Reg (S19E)), oder die Phosphorylierung verhinderten (RS1-Reg (S19A)) eingesetzt. Diese wurden an ein Nanohydrogel gekoppelt, um eine Aufnahme in die Enterozyten im Darm zu gewährleisten. Es wurde in der RS1KO-Mausohne funktionelles RS1 gezeigt, dass auch im in vivo-System eine Herunterregulation von SGLT1 durch mRS1-Reg (S19E), nicht jedoch durch mRS1-Reg (S19A) erfolgte, während die CNTs nur durch mRS1-Reg (S19A) inhibiert wurden. Des Weiteren führte mRS1-Reg (S19A) in der Wildtypmaus bei niedrigen Zuckerkonzentrationen zu einer Stimulation von SGLT1, was für eine Kompetition mit dem endogenen RS1-Proteins spricht. Es konnte indirekt der Beweis erbracht werden, dass über Nanohydrogele längere Proteine in die Zelle gebracht werden können und dort funktionell freigesetzt werden. N2 - The Sodium-D-glucose cotransporter 1 (SGLT1) is important for the uptake of glucose from the intestinal lumen into the enterocytes. In experiments with Xenopus-laevis oocytes, which were performed in our laboratory, we identified protein RS1 as a regulatory protein for SGLT1. A sequence of 80 aminoacids was identified to be the regulatory domain of RS1 (RS1-Reg) and prevents the constriction of transporter-containing vesicles from the transgolgi-network (TGN). Besides SGLT1, RS1 is able to regulate concentrative nucleoside transporters (CNTs) and the organic cation transporter 2 (OCT2). The regulation of the transporters depends on the phosphorylation-state of RS1-Reg. While SGLT1 is inhibited by the phosphorylated form of the regulatory domain, CNTs are regulated by the dephosphorylated form. In addition, the regulation of SGLT1 depends on the glucose concentration of the cells. RS1 only inhibits SGLT1 under low glucose conditions, while the regulation of CNTs is independent of glucose. In the following study we analyzed whether the results of the oocyte measurements could be reproduced in vivo. For this, we used mutants of the mouse regulatory domain (mRS1-Reg). In one mutant, the phosphorylation was mimicked (mRS1-Reg (S19E)), in a second mutant, phosphorylation was prevented (mRS1-Reg (S19A)). The mutants were coupled to nanohydrogels, to enable the uptake into enterocytes. By usage of a mouse-strain without functional RS1 and a wildtype-mouse-strain, I was able to discriminate between direct effects of the mutant and competition of mutants with endogenous RS1. Only mRS1-Reg (S19E) down regulates SGLT1, but not mRS1-Reg (S19A), while CNTs were downregulated by mRS1-Reg (S19A) but not by mRS1-Reg (S19E). In the wildtype-mouse mRS1-Reg (S19A) leads to an increase of SGLT1-activity which could be due to a competition with the endogenous RS1. The fact, that some peptides were able to regulate transporters leads to the conclusion, that longer proteins can be transported into cells by nanohydrogels and that these proteins are released in the cells in a functional active state. KW - Glucosetransport KW - SGLT1 KW - RS1 KW - Regulation KW - Glatter Krallenfrosch KW - Oozyte KW - Glucosetransportproteine KW - Darm Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-127394 ER - TY - THES A1 - Böhm, Jennifer T1 - Die Nährstoffresorption in den Fallen von Dionaea muscipula weist Parallelen zur Nährsalzaufnahme in Wurzeln auf T1 - Uptake of prey-derived nutrients in Dionaea muscipula traps displays similarities with the uptake of soil-derived nutrients into roots of non-carnivorous plants N2 - Die Venusfliegenfalle, Dionaea muscipula, weckte aufgrund ihrer karnivoren Lebensweise schon sehr früh das Interesse vieler Wissenschaftler. Für karnivore Pflanzen, die auf Nährstoff-armen Böden wachsen, spielen Insekten als Beute und somit als Nährstofflieferant eine entscheidende Rolle. So können die Pflanzen durch die Verdauung der Beute mit wichtigen Makro- und Mikronährstoffen, wie Stickstoff, Phosphat, Kalium oder Natrium versorgt werden. Aus diesem Grund sollte im Rahmen meiner Arbeit ein besonderes Augenmerk auf die molekularen Mechanismen der Kationenaufnahme während der Nährstoffresorption gerichtet werden. Insbesondere die aus dem Insekt stammenden Nährstoffe Kalium und Natrium waren dabei von großem Interesse. Im Allgemeinen sind Kaliumionen für Pflanzen eine essentielle anorganische Substanz und von großer physiologischer Bedeutung für die Entwicklung, den Metabolismus, die Osmoregulation, das Membranpotential und viele zelluläre Prozesse. Analysen der Kaliumaufnahme an Wurzeln von Modellpflanzen wie Arabidopsis thaliana und Reis zeigten, dass die Aufnahme von K+ ein Zusammenspiel von hoch-affinen K+-Transportern der HAK5-Familie und nieder-affinen Kaliumkanälen (AKT1/AtKC1) erfordert, die in ein komplexes (De-)Phosphorylierungsnetzwerk eingebunden sind. In der vorliegenden Arbeit war es mir möglich das Netzwerk zur Kaliumaufnahme in den Drüsen der Venusfliegenfalle zu entschlüsseln. Es konnten Orthologe zum Kaliumtransporter HAK5 aus Arabidopsis (DmHAK5) und zum Kaliumkanal AKT1 (DmKT1) identifiziert und im heterologen Expressionssystem der Xenopus laevis Oozyten elektrophysiologisch charakterisiert werden. Dabei zeigte sich, das DmKT1 durch einen Ca2+-Sensor/Kinase-Komplex aus der CBL/CIPK-Familie phosphoryliert und somit aktiviert wird. Phylogenetische Analysen von DmKT1 bestätigten die Eingruppierung dieses Kaliumkanals in die Gruppe der pflanzlichen Shaker-Kaliumkanäle des AKT1-Typs. Die Transporteigenschaften zeigten zudem, dass DmKT1 bei hyperpolarisierenden Membranpotentialen aktiviert wird und einen K+-selektiven Einwärtsstrom vermittelt. In Oozyten konnte eine Kaliumaufnahme bis zu einer externen Konzentration von ≥1 mM beobachtet werden. DmKT1 repräsentiert also einen Kaliumkanal mit einer hohen Transportkapazität, der die nieder-affine Kaliumaufnahme in die Drüsenzellen der Venusfliegenfalle vermitteln kann. Unterhalb einer externen Kaliumkonzentration von 1 mM würde der anliegende elektrochemische Kaliumgradient einen Kaliumausstrom und somit einen Verlust von Kalium favorisieren. Hoch-affine K+/H+-Symporter können durch die Ausnutzung des Protonengradienten eine Kaliumaufnahme im mikromolaren Bereich gewährleisten. In Wurzelhaaren von Arabidopsis vermittelt der Transporter AtHAK5 die Kaliumaufnahme unter Kaliummangelbedingungen. DmHAK5, ein Ortholog zu AtHAK5, ist in Dionaea Drüsen exprimiert und konnte zum ersten Mal im heterologen Expressionssystem der Xenopus Oozyten im Detail charakterisiert werden. Interessanterweise zeigte sich, dass DmHAK5 wie der K+-Kanal DmKT1 durch denselben CBL/CIPK-Komplex posttranslational reguliert und aktiviert wird. Die Transporteigenschaften von DmHAK5 wiesen auf einen Transporter mit einer breiten Substratspezifität hin, sodass sich DmHAK5 neben Kalium auch für Ammonium permeabel zeigte. Affinitätsuntersuchungen von DmHAK5 zu seinem Substrat Kalium klassifizierten das Protein als einen hoch-affinen Kaliumtransporter, der im Symport mit Protonen die Kaliumaufnahme im mikromolaren Konzentrationsbereich vermitteln kann. Das Kaliumtransportmodul besteht also aus dem K+-selektiven Kanal DmKT1 und dem K+/H+-Symporter DmHAK5, die die hoch- und nieder-affine Kaliumaufnahme in den Drüsenzellen während der Beuteverdauung in Dionaea muscipula Fallen ermöglichen. Beide Transportmodule werden Kalzium-abhängig durch die Kinase CIPK23 und den Ca2+-Sensor CBL9 auf posttranslationaler Ebene reguliert. Zusammenfassend gelang es in dieser Arbeit Einblicke in die Kationenaufnahme während der Nährstoffresorptionsphase der Venusfliegenfalle, Dionaea muscipula, zu gewinnen. Dabei wurde klar, dass Dionaea muscipula im Laufe ihrer Evolution zu einer karnivoren Pflanze, nicht neue Transportmodule zur Nährstoffresorption aus der Beute entwickelte, sondern bekannte aus Wurzeln stammende Transportmodule umfunktionierte. Auf molekularer Ebene konnten die biophysikalischen Charakteristika der K+- und Na+-Transportproteine, sowie ihre Regulation entschlüsselt werden. Diese Erkenntnisse wurden schließlich in den Kontext des Beutefangs der Venusfliegenfalle gebracht und diskutiert. N2 - The Venus flytrap, Dionaea muscipula, is one of the most exciting carnivorous plants. Since the time of Charles Darwin, scientists are interested in the highly specialized mechanisms, which enable Dionaea plants to grow on nutrient-poor habitats. These Dionaea plants have the possibility to catch insects and to purchase the necessary nutrients from their prey. For catching the prey, the Venus flytrap evolved morphological adaptions in form of bilobed leaf traps. Trigger hairs are arranged inside the traps and by touching these mechano-sensory organs an electrical signal spreading over the lobes leads to the fast trap-closure. By continual mechanical stimulation of the trigger hairs by the caught insect, the edges of the lobes are sealed hermetically and an “external stomach” is formed. The prey digestion starts with the secretion of lytic enzymes from the glands. These glands, which are covering the inner surface of the trap-lobes, are also responsible for the nutrient-uptake. Insects represent an important nutrient-provider for carnivorous plants. The capture of prey mainly contributes to the nutrient-supply like nitrogen, phosphorous, potassium and sodium. Within the scope of this work, my focus was on the molecular uptake mechanism of prey-derived cations, such as potassium and sodium. Potassium is an essential macronutrient for plants in general. Studies on the K+ uptake systems in roots revealed a complex potassium uptake network consisting of high-affinity uptake carriers such as HAK5 and low-affinity potassium channels such as the AKT1/AtKC1 module. In glands of Dionaea muscipula a HAK5-like potassium transporter (DmHAK5) and an orthologue of AKT1 (DmKT1) were identified within the framework of my Ph.D.-thesis. Following the heterologous expression in Xenopus laevis oocytes, electrophysiological measurements revealed that DmKT1 is activated by phosphorylation through a Ca2+-sensor-protein kinase complex of the CBL/CIPK family. Its transport properties and structural homology to the Arabidopsis AKT1 K+ channel classified DmKT1 as a member of the hyperpolarisation-activated, inwardly rectifying plant Shaker potassium channel family. Due to the electrochemical gradient for K+ ions across the gland plasma membrane, the K+ selective channel DmKT1 can acquire external K+ down to concentrations of 1 mM. Thus, the peculiar electrophysiological properties assigned the low-affinity high-capacity potassium uptake system in Dionaea gland to DmKT1. Below 1 mM, K+ fluxes reverse their direction and the plant would lose the essential macronutrient. In root hairs of Arabidopsis high-affinity transporters (HAK5) are expressed which are believed to facilitate K+ accumulation from potassium depleted soils. Interestingly an orthologue of HAK5 was shown to be expressed also in the trap lobes of Dionaea. Thus, DmHAK5 was cloned and for the first time a HAK5-like protein could be analysed in Xenopus oocytes. Interestingly, DmHAK5 K+/H+-co-transporter was post translationally activated by the same CBL/CIPK complex just like the DmKT1 Shaker channel. Compared to DmKT1, DmHAK5 is of low selectivity and against all assumptions, the transporter is permeable for and not inhibited by NH4+. A Km value of 127 μM, describes DmHAK5 as a high-affinity transporter that is apparently the only system capable of operating at micromolar K+ concentrations. To overcome the outward-directed chemical gradient at low external K+ concentrations, DmHAK5 utilises the electrochemical gradient of protons and acts as a K+/H+-co-transporter. The reported findings demonstrate the contribution of DmKT1 and DmHAK5 in the highly regulated potassium uptake network utilizing K+ from captured insects. The high-capacity of DmKT1 and the high-affinity of DmHAK5 enable Dionaea glands to acquire potassium from high to very low levels during the digestion and resorption process. Taken together, these studies elucidated the molecular origin and regulation of cation uptake during prey digestion and nutrient resorption of the Venus flytrap. For efficient potassium and sodium uptake into gland cells Dionaea muscipula co-opted root-derived transport modules and the associated regulatory components rather than inventing new uptake systems during its evolution to a carnivorous plant. KW - Venusfliegenfalle KW - Dionaea muscipula KW - HAK5-like KW - AKT1-like KW - HKT1-like KW - Falle KW - Nährstoffaufnahme KW - Molekularbiologie Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-123958 ER - TY - THES A1 - Jaborsky, Mario T1 - Extraflorale Nektarien der Pappeln Populus trichocarpa und Populus tremula x P. tremuloides : Unterschiede und Gemeinsamkeiten T1 - Extrafloral nectaries of poplar "Populus trichocarpa" and "Populus tremula x P. tremuloides" : differences and similarities N2 - In der vorliegenden Arbeit wurden extraflorale Nektarien (EFN) von Populus trichocarpa (Ptr) und Populus tremula x Populus tremuloides (Ptt) hinsichtlich ihrer funktionellen Eigenschaften bei der indirekten Herbivoren-Abwehr untersucht. Die gewonnenen Erkenntnisse lassen sich wie folgt zusammenfassen: Nektarien-Funktion und -Regulation: Beide untersuchten EFN-Arten sind in der Lage, die jeweilige Pappel indirekt vor Schädigung durch Herbivoren zu schützen. Dies zeigte nicht zuletzt der jeweils beobachtete kontinuierliche Besuch verschiedenster Insektenarten. Vor allem Ameisen aber auch Bienen zählten zu Besuchern sowohl von Ptr als auch Ptt. Die Effektivität so angelockter Besucher konnte durch Interaktionsversuche mit Bienen bestätigt werden und belegte, dass allein die Anwesenheit von Bienen zu einer eindeutigen Reduktion des herbivoren Blattschadens führt (Ptr und Ptt). Obwohl beide Pflanzen derselben Gattung (Populus) angehören, konnte bestätigt werden, dass Ptr und Ptt unterschiedliche Herbivoren-Abwehrstrategien entwickelt haben. Während es sich bei Ptt-EFN um konstitutiv vorhandene Organe handelt, zeigten Ptr-Pflanzen eine gezielte Bildung von Nektarien/Nektar erst nach Herbivorenbefall. Dabei scheinen spezifische, durch Herbivoren erzeugte Signale für die Induktion verantwortlich zu sein. Die Freisetzung der nach Herbivorenbefall typischen, flüchtigen organischen Verbindungen (VOCs) in Ptr konnte zwar als Jasmonsäure-abhängig identifiziert, der Jasmonsäure-Signalweg, der schon als Auslöser für extraflorale Nektar-Produktion bei z.B. Limabohne gezeigt worden war, als alleiniges Steuerelement aber ausgeschlossen werden. Ein Zusammenspiel mehrerer Hormone bei der Regulation der indirekten Herbivoren-Abwehr in Ptr durch Nektarien/Nektar-Induktion ist deshalb sehr wahrscheinlich. Dies bekräftigten auch die Transkriptomanalysen von Ptt-Nektarien. Hier konnte gezeigt werden, dass sowohl Jasmonsäure als auch Auxin und Salicylsäure eine wichtige Rolle spielen. Darüber hinaus lieferten verschiedene differentiell regulierte Gencluster, die in Zusammenhang mit Nektarien-Funktion, -Entwicklung und biotischem Stress stehen, deutliche Hinweise auf die entscheidende Rolle extrafloraler Nektarien bei der Herbivoren-Abwehr. Nektar-Produktion: Die Analyse extrafloraler Nektar-Proteine und zugehöriger Transkripte zeigte nicht nur, dass beide Pappelarten über eine ähnliche, von antimikrobiellen Proteinen dominierte Nektar-Proteinzusammensetzung verfügen, sondern auch, dass bei beiden die Produktion dieser Proteine hauptsächlich direkt in den Drüsenorganen stattfindet. Es deutete außerdem alles darauf hin, dass der Zucker des Ptt-Nektars direkt im Nektarienparenchym produziert wird, und dass dafür ein apoplastischer Schritt notwendig ist, der gleichzeitig über das „Source und Sink“ Verhältnis den Nachschub von Saccharose ins Nektarienparenchym reguliert. Nektar-Sekretion: Die unterschiedlichen Hauptsekretionsarten der beiden Pappeln konnten ebenfalls gezeigt werden. Während Ptt-Nektar eindeutig granulokrin sekretiert wird, konnte dieser Weg für Ptr ausgeschlossen werden. Deshalb scheint Ptr holokrine Sekretion zu bevorzugen. In Ptt fanden sich außerdem Belege für eine parallel ablaufende ekkrine Sekretion. Hierfür wird die initiale Abgabe osmotisch wirksamer Substanzen und nachfolgend Wasser vorausgesetzt. Der Anionenkanal PttSLAH3 zeigte sich, ausgehend von der Anionenzusammensetzung des Nektars und der Lokalisation des Proteins in den epidermalen Drüsenzellen als optimales Transportprotein für diesen Schritt. Die typischen Eigenschaften eines S-Typ-Anionenkanals vom Typ des Arabidopsis-SLAH3, wie Nitratabhängigkeit und spezifische Anionenpermeabilität wiesen darauf hin, dass PttSLAH3 für die finale „nasse“ Sekretion verantwortlich sein kann. Im Unterschied zu AtSLAH3 scheint die Aktivierung von PttSLAH3 allerdings auf andere Weise zu erfolgen. Denn im Gegensatz zum Arabidopsis-Ortholog, zeigte PttSLAH3 in Xenopus-Oozyten bereits ohne koexprimierte Kinase Aktivität. Grundsätzlich konnte eine Aktivierung durch Phosphorylierung aber nicht ausgeschlossen werden. Es deutete vielmehr alles darauf hin, dass bereits Oozyten-endogene Kinasen eine entscheidende Rolle bei der Aktivierung von PttSLAH3 spielen. Eine entsprechende Phosphorylierungsstelle konnte jedoch nicht ausgemacht werden. Allerdings deuteten die Ergebnisse im Weiteren darauf hin, dass die unterschiedliche Struktur der AtSLAH3- und PttSLAH3-Termini, im Besonderen die des N-Terminus, für die konstitutive Aktivität des Pappel-Kanals verantwortlich ist. Damit kommt PttSLAH3 eine Sonderstellung innerhalb der SLAC/SLAH-Familie zu, die weiterer Untersuchungen bedarf. N2 - In this study extrafloral nectaries (EFN) of Populus trichocarpa (Ptr) and Populus tremula x Populus tremuloides (Ptt) were analyzed in terms of their functional properties regarding indirect defense against herbivores. The findings can be summarized as follows: Nectary function and regulation: Both EFN-types were able to protect poplar leaves from damage by herbivores. This finding was confirmed in Ptr as well as Ptt, by continuous visits of various insect species, particularly ants and bees. Protection mediated by these visitors could be confirmed with interaction studies using bees, in which the presence of bees led to a significant reduction of leaf herbivory (Ptr and Ptt). Although both plants belong to the same genus (Populus), it turned out that Ptr and Ptt have developed different EFN-based herbivore defense strategies. While Ptt-EFN are constitutively present and secreting, Ptr plants revealed nectary and nectar formation only upon herbivore attack. However, herbivore-specific elicitors, may be responsible for the induction in Ptr. Even though the release of herbivore-induced volatile organic compounds (VOCs) could be identified as jasmonic acid-dependent, the jasmonic acid signaling pathway, in contrast to studies with lima bean, could be excluded for triggering extrafloral nectar secretion in Ptr. Therefore, regulation of Ptr-EFN-based herbivore defense is very likely controlled via an interaction of several hormones. This finding was confirmed by transcriptome analysis in Ptt-nectaries, where jasmonic acid, auxin and salicylic acid appeared to be involved. In addition, various differentially regulated gene clusters associated with nectary function, development and biotic stress, clearly indicated the crucial role of extrafloral nectaries regarding herbivore defense. Nectar production: The analysis of extrafloral nectar proteins and associated transcripts revealed that nectar of both species is composed from a similar blend of antimicrobial proteins. In addition, it seems that in both species these proteins are synthesized predominantly in the nectaries themselves. Moreover, Ptt-nectar-specific sugar production appears to be executed mainly in the nectary parenchyma. There an apoplastic step is required to process sucrose, provided by the phloem, which as a result regulates the source and sink relationship and thereby maintains sucrose supplies. Nectar secretion: For both poplars two different secretion types could be confirmed. While Ptt nectar is secreted clearly granulocrine, this secretion type could be excluded for Ptr. Therefore, Ptr seems to prefer holocrine secretion. In the case of Ptt evidences of a possible parallel eccrine secretion could be found. Prerequisite is an initial release of osmotically active substances followed by water efflux. Starting with anion composition of the nectar and the localization of the protein in the epidermal nectary cells, one might suggest that the anion channel PttSLAH3 is an optimal transport protein for this initial step. The observed biophysical characteristics, such as nitrate dependency and specific anion permeability, were typical of an S-type anion channel like SLAH3 in Arabidopsis. This indicated that PttSLAH3 may be responsible for such a “wet” secretion in Ptt. However, in contrast to AtSLAH3, PttSLAH3 seems to be activated differently. Unlike the Arabidopsis-orthologe, PttSLAH3 expressed in Xenopus oocytes revealed channel activity, even in the absence of co-expressed kinases. However, phosphorylation by specific kinases could not be excluded in general. Instead, all of the available evidence suggests that oocyte endogenous kinases play a crucial role in the activation of PttSLAH3, although no corresponding phosphorylation site could be identified. Nevertheless, the results are indicating that structural differences of the AtSLAH3- and PttSLAH3-termini, in particular the N-terminus, are responsible for the constitutive activity of the poplar channel. Therefore PttSLAH3 takes on a special position within the SLAC/SLAH-family, however further investigations are necessary. KW - Pappel KW - extraflorale Nektarien KW - Herbivoren-Abwehr-Strategie KW - Nektar-Sekretion KW - extrafloral nectaries KW - herbivore defense strategies KW - nectar secretion KW - Nektarium KW - Westliche Balsampappel Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85240 ER - TY - THES A1 - Bellwon, Patricia T1 - Kinetic assessment by in vitro approaches - A contribution to reduce animals in toxicity testing T1 - Evaluierung der Kinetik anhand von in vitro Systemen - Ein Beitrag um die Anzahl von Tierversuchen zur Toxizitätsprüfung zu reduzieren N2 - The adoption of directives and regulations by the EU requires the development of alternative testing strategies as opposed to animal testing for risk assessment of xenobiotics. Additionally, high attrition rates of drugs late in the discovery phase demand improvement of current test batteries applied in the preclinical phase within the pharmaceutical area. These issues were taken up by the EU founded 7th Framework Program “Predict-IV”; with the overall goal to improve the predictability of safety of an investigational product, after repeated exposure, by integration of “omics” technologies applied on well established in vitro approaches. Three major target organs for drug-induced toxicity were in focus: liver, kidney and central nervous system. To relate obtained dynamic data with the in vivo situation, kinetics of the test compounds have to be evaluated and extrapolated by physiologically based pharmacokinetic modeling. This thesis assessed in vitro kinetics of the selected test compounds (cyclosporine A, adefovir dipivoxil and cisplatinum) regarding their reliability and relevance to respective in vivo pharmacokinetics. Cells were exposed daily or every other day to the test compounds at two concentration levels (toxic and non-toxic) for up to 14 days. Concentrations of the test compounds or their major biotransformation products were determined by LC-MS/MS or ICP-MS in vehicle, media, cells and plastic adsorption samples generated at five different time-points on the first and the last treatment day. Cyclosporine A bioaccumulation was evident in primary rat hepatocytes (PRH) at the high concentration, while efficient biotransformation mediated by CYP3A4 and CYP3A5 was determined in primary human hepatocytes (PHH) and HepaRG cells. The lower biotransformation in PRH is in accordance with observation made in vivo with the rat being a poor model for CYP3A biotransformation. Further, inter-assay variability was noticed in PHH caused by biological variability in CYP3A4 and CYP3A5 activity in human donors. The inter-assay variability observed for PRH and HepaRG cells was a result of differences between vehicles regarding their cyclosporine A content. Cyclosporine A biotransformation was more prominent in HepaRG cells due to stable and high CYP3A4 and CYP3A5 activity. In addition, in vitro clearances were calculated and scaled to in vivo. All scaled in vitro clearances were overestimated (PRH: 10-fold, PHH: 2-fold, HepaRG cells: 2-fold). These results should be proven by physiologically-based pharmacokinetic modeling and additional experiments, in order to verify that these overestimations are constant for each system and subsequently can be diminished by implementation of further scaling factors. Brain cell cultures, primary neuronal culture of mouse cortex cells and primary aggregating rat brain cells, revealed fast achieved steady state levels of cyclosporine A. This indicates a chemical distribution of cyclosporine A between the aqueous and organic phases and only minor involvement of biological processes such as active transport and biotransformation. Hence, cyclosporine A uptake into cells is presumably transport mediated, supported by findings of transporter experiments performed on a parallel artificial membrane and Caco-2 cells. Plastic adsorption of cyclosporine A was significant, but different for each model, and should be considered by physiologically based pharmacokinetic modeling. Kinetics of adefovir dipivoxil highlights the limits of in vitro approaches. Active transporters are required for adefovir uptake, but were not functional in RPTECT/TERT1. Therefore, adefovir uptake was limited to passive diffusion of adefovir dipivoxil, which itself degrades time-dependently under culture conditions. Cisplatinum kinetics, studied in RPTEC/TERT1 cells, indicated intracellular enrichment of platinum, while significant bioaccumulation was not noted. This could be due to cisplatinum not reaching steady state levels within 14 days repeated exposure. As shown in vivo, active transport occurred from the basolateral to apical side, but with lower velocity. Hence, obtained data need to be modeled to estimate cellular processes, which can be scaled and compared to in vivo. Repeated daily exposure to two different drug concentrations makes it possible to account for bioaccumulation at toxic concentrations or biotransformation/extrusion at non-toxic concentrations. Potential errors leading to misinterpretation of data were reduced by analyses of the vehicles as the applied drug concentrations do not necessarily correspond to the nominal concentrations. Finally, analyses of separate compartments (medium, cells, plastic) give insights into a compound’s distribution, reduce misprediction of cellular processes, e.g. biotransformation, and help to interpret kinetic data. On the other hand, the limits of in vitro approaches have also been pointed out. For correct extrapolation to in vivo, it is essential that the studied in vitro system exhibits the functionality of proteins, which play a key role in the specific drug induced toxicity. Considering the benefits and limitations, it is worth to validate this long-term treatment experimental set-up and expand it on co-culture systems and on organs-on-chips with regard to alternative toxicity testing strategies for repeated dose toxicity studies. N2 - Die Erlassung von Richtlinien und Verordnungen durch die EU führte zu der Entwicklung von alternativen Testmethoden als Ersatz von Tierversuchen zur Risikobewertung von Xenobiotika. Des Weiteren weisen hohe Ausfallraten von Arzneimitteln in der späten Entwicklungsphase auf die Notwendigkeit hin, die bisher verwendeten Testmethoden der präklinischen Phase zu verbessern. Diese Punkte wurden in dem im siebten Rahmenprogramm der EU finanzierten Projekt „Predict-IV“ aufgegriffen. Ziel des Projektes war es, die Vorhersage der Arzneimittelsicherheit durch integrierte „omics“-Technologien, angewendet an etablierten in vitro Ansätzen, zu verbessern. Dabei standen drei Zielorgane bzgl. Arzneimittel-induzierter Organtoxizität im Mittelpunkt: Leber, Niere und zentrales Nervensystem, die jeweils durch Zelllinien oder primäre Zellen vertreten waren. Um die in vitro generierten Dynamik-Daten mit der in vivo Situation in Korrelation zu bringen, muss die Kinetik der Testsubstanz berücksichtigt und die Ergebnisse mit Hilfe von physiologisch-basierter pharmakokinetischer Modellierung extrapoliert werden. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, Kinetik-Daten der gewählten Testsubstanzen (Cyclosporin A, Adefovir dipivoxil und Cisplatin) in vitro zu erheben und bzgl. ihrer Zuverlässigkeit sowie ihrer Relevanz verglichen mit in vivo Daten zu beurteilen. Hierfür wurden kultivierte Zellen täglich bzw. jeden zweiten Tag für zwei Wochen mit zwei verschiedenen Konzentrationen (toxisch und nicht toxisch) des Arzneimittels behandelt. Der Gehalt des applizierten Arzneimittels oder die Hauptmetaboliten wurden mittels LC MS/MS oder ICP-MS in Vehikel, Medium und Zellen sowie die vom Plastik adsorbierte Menge in Proben bestimmt, die am ersten und letzten Behandlungstag zu fünf unterschiedlichen Zeitpunkten gewonnen wurden. Eine eindeutige Bioakkumulation von Cyclosporin A wurde in primären Rattenhepatozyten nach Behandlung mit der hohen Konzentration festgestellt. Eine effiziente CYP3A4- und CYP3A5-vermittelte Biotransformation von Cyclosporin A wurde für primäre humane Hepatozyten sowie HepaRG Zellen beobachtet. Diese Ergebnisse stimmten mit der in vivo Situation überein. Ratten sind aufgrund ihrer geringen CYP3A Aktivität schlechte Tiermodelle für CYP3A-Biotransformationsstudien. Des Weiteren wurden Interassay-Schwankungen bei primären human Hepatozyten bemerkt, die auf die biologische Variabilität der CYP3A4- sowie CYP3A5-Aktivität zwischen den menschlichen Spendern zurückzuführen sind. Rattenhepatozyten und HepaRG Zellen hingegen wiesen Interassay-Schwankungen auf, die durch unterschiedliche Cyclosporin A Behandlungskonzentrationen zwischen den Replikaten verursacht wurden. Die Cyclosporin A Biotransformation war in HepaRG Zellen am stärksten ausgeprägt, was durch stabile und wesentlich höhere CYP3A4- und CYP3A5-Aktivität in HepaRG Zellen zu erklären ist. Zusätzlich wurden die in vitro Clearance-Werte bestimmt und auf in vivo Clearance-Werte extrapoliert. Alle extrapolierten Werte waren zu hoch geschätzt (primäre Rattenhepatozyten: 10fach, primäre human Hepatpzyten: 2fach, HepaRG Zellen: 2fach). Diese Ergebnisse sollten mittels physiologisch-basierter pharmakokinetischer Modellierung sowie durch weitere Experimente überprüft werden, um zu ermitteln, ob diese hohen Schätzungen für jedes System konstant sind und somit durch die Einführung von weiteren Skalierungsfaktoren verringert werden können. Kultivierte Gehirnzellen, primäre Nervenzellkulturen der Kortex von Mäusen und primäre Hirnzellaggregate der Ratte, zeigten schnell erreichte Cyclosporin A Gleichgewichtskonzentrationen. Diese Ergebnisse deuteten auf eine Verteilung von Cyclosporin A zwischen der wässrigen und organischen Phase hin, wobei biologische Prozesse nur eine untergeordnete Rolle spielen. Daher scheint die intrazelluläre Cyclosporin A Aufnahme Transporter-vermittelt zu sein. Ergebnisse der Transporter Experimente, die an einer künstlichen Membran und Caco-2 Zellen durchgeführt wurden, unterstützten diese Hypothese. Messungen der Plastikbindung von Cyclosporin A zeigten signifikante, aber für jedes Zellsystem unterschiedliche, Adsorptionsraten, die mittels physiologisch-basierter pharmakokinetischer Modellierung berücksichtigt werden sollten. Die Kinetik von Adefovir dipivoxil machte auf die Nachteile von in vitro Versuchen aufmerksam. Für die intrazelluläre Aufnahme von Adefovir sind aktive Transportproteine nötig, die jedoch in der Nierenzelllinie RPTEC/TERT1 nicht funktionell vorhanden sind. Daher war die Aufnahme von Adefovir auf die passive Diffusion von Adefovir dipivoxil beschränkt, das aber auch zeitabhängig unter den experimentellen Konditionen zerfiel. Die an RPTEC/TERT1 Zellen untersuchte Kinetik von Cisplatin deutete auf eine intrazelluläre Platin-Anreicherung hin, die jedoch nicht in einer signifikanten Bioakkumulation resultierte. Möglicherweise sind innerhalb von 14 Tagen die Gleichgewichtskonzentrationen von Cisplatin noch nicht erreicht. Die Kinetikprofile von Cisplatin in Medium ließen einen aktiven, von der basolateralen zur apikalen Seite gerichteten Cisplatin Transport erkennen, wie schon in vivo beschrieben, wobei die Geschwindigkeit dieser Transportprozesse in vitro langsamer zu sein scheint als in der intakte Niere. Daher müssen die generierten Daten zur Schätzung von zellulären Prozessen modelliert werden, um durch anschließende Extrapolation mit in vivo Daten verglichen werden zu können. Abschließend bleibt zu sagen, dass das experimentelle Design vorteilhaft war. Wiederholte tägliche Administration von zwei unterschiedlichen Konzentrationen eines Medikaments ermöglichte die Erfassung von Bioakkumulation bei toxischen Konzentrationen sowie Biotransformation/Export bei nicht-toxischen Konzentrationen. Potenzielle Fehler, die zu einer Fehlinterpretation führen könnten, wurden durch die exakte Bestimmung der tatsächlich applizierten Arzneimittelmenge reduziert, da nicht immer die applizierte Konzentration mit der Nominalkonzentration übereinstimmt. Darüber hinaus erwies es sich als Vorteil, die Arzneimittelkonzentrationen in den einzelnen Kompartimenten (Medium, Zellen und Plastik) zu bestimmen. Somit konnten zum einen Erkenntnisse über die Verteilung der Substanz gewonnen werden und zum anderen Fehleinschätzungen von zellulären Prozessen, z.B. Biotransformation, verhindert werden, was letzten Endes bei die Interpretation von Kinetik-Daten behilflich ist. Jedoch, wurden auch die Grenzen von in vitro Ansätzen deutlich. Für eine korrekte Extrapolation ist es unverzichtbar, dass die untersuchten in vitro Systeme funktionierende Proteine aufweisen, die bei der untersuchten Arzneimittel-induzierten Toxizität eine Schlüsselrolle übernehmen. Abschließend kann festgehalten werden, dass es, unter Berücksichtigung der Vor- und Nachteile, von Nutzen sein kann diesen Versuchsansatz der Langzeitbehandlung zu validieren und darüber hinaus auf Co Kultursysteme sowie Organ-Chips anzuwenden hinsichtlich der Entwicklung von Alternativmethoden für Toxizitätsstudien bei wiederholter Gabe. KW - cell culture KW - pharmacokinetics KW - repeated dose KW - in vitro KW - toxicity testing KW - Zellkultur KW - In vitro KW - Pharmakokinetik KW - Toxizitätstest Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-122693 ER - TY - THES A1 - Hellmann, Tina Verena T1 - Einfluss des Corezeptors Repulsive Guidance Molecule b (RGMb) auf den Signalweg der Knochenwachstumsfaktoren T1 - Influence of the coreceptor Repulsive Guidance Molecule b (RGMb) on the Bone Morphogenetic Protein signaling pathway N2 - Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) bilden die größte Untergruppe der Transforming Growth Factor-β (TGF-β) Superfamilie sekretierter Wachstumsfaktoren. Sie haben Schlüsselfunktionen während der frühen Embryogenese inne und regulieren darüber hinaus die Organogenese sowie die Homöostase zahlreicher Organe und Gewebe. BMPs vermitteln ihre Signale über zwei Typen transmembranärer Serin-/Threoninkinaserezeptoren, die als Typ I und Typ II Rezeptoren bezeichnet werden. Den etwa zwanzig BMP-Liganden stehen dabei nach aktuellem Kenntnisstand nur fünf Typ I und drei Typ II Rezeptorkinasen gegenüber, wodurch sich insbesondere die BMP-Familie durch eine hohe Promiskuität der Ligand-Rezeptor-Interaktion auszeichnet. Damit dennoch Liganden-spezifische Signale vermittelt werden können, müssen die Signaleigenschaften dieser Faktoren komplex reguliert werden. Die Mehrzahl der Regulationsmechanismen beeinflusst die Signaltransduktion negativ. Kürzlich wurden jedoch die ersten, spezifisch auf die BMP-Familie wirkenden membranassoziierten Agonisten beschrieben – die Corezeptoren der Repulsive Guidance Molecule (RGM) Familie bestehend aus RGMa, RGMb und RGMc. Für das Familienmitglied RGMb werden neben pro-BMP-Prozessen allerdings auch hemmende Wirkungen auf die BMP-abhängige Signaltransduktion diskutiert. Um diese teils widersprüchlichen Funktionen zu beleuchten, wurde RGMb im Rahmen dieser Arbeit umfangreich biochemisch und biophysikalisch charakterisiert. Zunächst konnte erfolgreich ein Verfahren zur Herstellung und Isolierung von hochreinem rekombinanten RGMb Corezeptorprotein etabliert werden. Dies ermöglichte die Entwicklung umfangreicher in vitro Interaktionsstudien mit verschiedenen Liganden sowie Rezeptorektodomänen der TGF-β Superfamilie basierend auf dem Verfahren der Oberflächen-Plasmonresonanz (Surface Plasmon Resonance, SPR). Dadurch konnte gezeigt werden, dass RGMb spezifisch und hochaffin mit Wachstumsfaktoren der BMP-Familie, nicht aber mit Vertretern anderer Untergruppen der TGF-β Superfamilie wechselwirkt. Im Widerspruch zu Literaturdaten konnten darüber hinaus keine direkten Interaktionen zwischen RGMb und den analysierten Typ I und Typ II Rezeptorektodomänen nachgewiesen werden. Zellbasierte Kompetitionsanalysen ergaben, dass der lösliche RGMb Corezeptor BMP-induzierte Signale dosisabhängig inhibiert, während die membranverankerte RGMb-Variante eine Verstärkung des BMP-Signals durch eine Erniedrigung der halbmaximalen Ligandenkonzentration hervorruft. Mittels Oberflächen-Plasmonresonanz konnte im Rahmen von Coinjektionsstudien außerdem beobachtet werden, dass RGMb die Bindung der untersuchten BMP-Liganden an die Typ I Rezeptorektodomänen hemmt. Daraus kann geschlossen werden, dass RGMb an das Typ I Rezeptorbindeepitop der BMP-Liganden bindet und dadurch deren Signalaktivität neutralisiert. Ein abweichendes Bild zeigt sich für die Beeinflussung der BMP/Typ II Rezeptorinteraktion durch RGMb. So wurde im Rahmen von SPR-basierten Coinjektionsstudien beobachtet, dass BMP-Liganden in Gegenwart des Corezeptors RGMb ausschließlich mit der Ektodomäne des Typ II Rezeptors ActR IIB, nicht aber mit den Rezeptoren ActR-II oder BMPR-II interagieren können. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass zwar der Kernbereich des Typ II Rezeptorepitops durch die Interaktion des Liganden mit RGMb unbeeinflusst bleibt, jedoch eine partielle periphere Überlagerung bei gleichzeitiger Bindung von RGMb und den Typ II Rezeptoren für die Ausbildung der beobachteten Selektivität verantwortlich sein muss. Um diese Wechselwirkungen auch auf zellulärer Ebene analysieren zu können, wurden fluoreszenzbasierte Fusionskonstrukte für BMP-Rezeptoren sowie für RGMb synthetisiert und ein funktionelles Färbeprotokoll für die konfokale Mikroskopie etabliert. Die biochemischen Analysen sowie die in dieser Arbeit präsentierten umfassenden Charakterisierungen der Corezeptorinteraktionen mit einer Vielzahl an BMP-Liganden sowie deren Rezeptoren grenzen das RGMb-Bindeepitop ein und bilden so einen idealen Ausgangspunkt für die genaue Identifizierung und Charakterisierung dieses Epitops mittels gerichteter Mutagenese. Darüber hinaus weisen die vorliegenden in vitro Bindungsstudien auf einen deutlich komplexeren als bisher in der Literatur angenommenen, möglicherweise völlig neuartigen Modulationsmechanismus des BMP-Signalweges durch den Corezeptor RGMb hin. So wird in Anwesenheit von RGMb die Typ II Rezeptorspezifität und vermutlich auch die Lokalisierung der BMP-Liganden in bestimmten Membrankompartimenten - etwa Lipid Rafts - selektiv reguliert, wodurch BMP-induzierte Signale fein moduliert werden könnten. Die in dieser Arbeit synthetisierten fluoreszenzbasierten Fusionskonstrukte stellen zudem zusammen mit den etablierten Protokollen zur konfokalen Mikroskopie effektive Werkzeuge für eine zukünftige detaillierte Aufklärung (z. B. durch FRET-Studien) der komplexen RGMb-abhängigen Regulation des BMP-Signalweges auf zellulärer Ebene dar. N2 - Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) comprise the largest subgroup of the Transforming Growth Factor-β (TGF-β) superfamily of secreted growth factors. They are key regulators of early embryogenesis and orchestrate the development as well as the homeostasis of several tissues and organs in adult organisms. BMPs transduce their signals through two types of transmembrane serine/threonine kinase receptors termed type I and type II receptors. An imbalance in BMP-ligand and receptor numbers - about twenty different BMP-ligands face only five type I and three type II receptors - causes a pronounced promiscuity in ligand/receptor interactions. Therefore, a complex regulatory network is necessary to enable specific signaling of each BMP ligand despite a temperospatial expression overlap. Most of the discovered regulatory processes inhibit BMP-signal transduction. Recently, the first membrane-associated BMP-specific agonists - the Repulsive Guidance Molecule (RGM) family of coreceptors comprised of RGMa, RGMb and RGMc - have been discovered. Aside from stimulatory effects, evidence for a potential inhibitory activity of the RGM family member RGMb on BMP-induced signal transduction has previously been described. To clarify these contradictory RGMb functions, extensive biochemical and biophysical characterizations were carried out. In the course of this work, an efficient expression and purification strategy was established resulting in great yields of highly pure recombinant RGMb coreceptor protein. Subsequent in vitro binding assays based on surface plasmon resonance (SPR) showed that RGMb specifically interacts with BMP ligands, while no binding to other subfamily members could be detected. Contradicting published data, no direct interactions of the RGMb coreceptor with type I and type II receptor ectodomains were determined. Furthermore, cell-based competition assays revealed that soluble RGMb protein lacking the glycosylphosphatidylinositol anchor dose-dependently inhibits BMP-induced signal transduction. Characterizing the influence of the membrane anchored RGMb coreceptor on BMP signaling pointed to a more complex situation. Hence, only minor deviations of the BMP-dependent signal transduction in RGMb-transfected compared to control cells could be detected. These differences could possibly indicate a sensitizing activity of the RGMb coreceptor on BMP-signaling as it has been described before. SPR-based co-injection experiments revealed that BMP ligands bound to RGMb lose their ability to interact with type I receptor ectodomains. Thus, the coreceptor blocks the type I receptor binding epitope, thereby neutralizing the signaling activity of BMP ligands. However, comparative experiments using BMP variants pointed out that the coreceptor/ligand interface involves other binding hot spot residues than the type I receptor/ligand interaction. Analyzing the influence of RGMb on the BMP/type II receptor interaction based on SPR measurements led to a different outcome: In the presence of the RGMb coreceptor, BMP ligands were solely able to interact with the extracellular domain of the type II receptor ActR IIB, while no binding could be detected with neither ActR II nor BMPR II ectodomains. Hence, binding of the coreceptor does not directly interfere with the BMP ligand/type II receptor core interface, whereas a partial peripheral overlap of RGMb with the type II receptor epitope may evoke the observed selectivity for ActR IIB. In order to clarify the observed interactions in the cellular context, RGMb and BMP receptor fusion constructs based on the SNAP-/CLIP-tag® technology as well as efficient labeling protocols and confocal microscopic procedures were established. The biochemical characterization of RGMb along with the extensive interaction studies of this coreceptor with a multiplicity of BMP-ligands and their receptors presented in this work, narrow down the location of the RGMb binding epitope, thus providing an ideal starting point for the subsequent determination of the coreceptor binding domain by site directed mutagenesis. Moreover, the presented in vitro binding studies point to a more complex and possibly novel regulatory mechanism of the BMP signal transduction by RGMb than previously assumed. Thus, the presence of the coreceptor selectively regulates the type II receptor specificity and potentially also the recruitment of BMP-ligands into certain membrane compartments (e.g. lipid raft-domains), herewith fine-tuning BMP-induced signals. The SNAP- and CLIP tag® fusion constructs produced in this work together with the established protocols for confocal microscopy analyses provide efficient tools for subsequent extensive examinations of theses regulatory processes in living cells (e.g. by FRET measurements). KW - Knochen-Morphogenese-Proteine KW - Rezeptor KW - Transforming Growth Factor KW - Bone morphogenetic protein KW - Transforming Growth Factor KW - coreceptor KW - BMP Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85568 ER - TY - THES A1 - Saupe, Stefanie T1 - Funktion des Lipidtransferproteins 2 (LTP2) und dessen Rolle bei der Bildung von durch Agrobacterium tumefaciens induzierten Wurzelhalsgallen an Arabidopsis thaliana T1 - Function of lipid transfer protein 2 (ltp2) and its function in Agrobacterium tumefaciens induced crown gall development on Arabidopsis thaliana N2 - In Tumoren an Arabidopsis thaliana, induziert über Agrobacterium tumefaciens (Stamm C58), ist von den 49 bekannten Lipidtransferproteinen (LTPs) nur die Expression von LTP2 stark erhöht (Deeken et al., 2006). Mutanten ohne LTP2-Transkripte (ltp2KO) entwickeln deutlich kleinere Tumore als der Wildtyp. Durch die permanenten Zellstreckungs- und Dehnungsprozesse besitzen Tumore keine intakte Epidermis (Efetova et al., 2007). Dies wiederum führt zum Verlust einer vollständigen Cuticula-Schicht, welche von der Epidermis produziert wird und dieser als Barriere zur Umwelt aufgelagert ist. Um den transpirationsbedingten Wasserverlust zu minimieren, werden in Tumoren langkettige Aliphaten in die äußeren Zellschichten eingelagert (Efetova et al., 2006). Ein ähnliches Szenario findet um Verwundungsareale statt (Kolattukudy et al., 2001). Die Gen-Expression von LTP2 wird nicht durch tumorinduzierende Agrobakterien ausgelöst. Faktoren wie Verwundung, sowie die Applikation des Trockenstress-Phytohormons Abscisinsäure (ABA) begünstigen die LTP2-Gen-Expression positiv. Außerdem ist der LTP2-Promotor in Gewebe aktiv, in welchem sekundäre Zellwandmodifikationen auftreten, sowie insbesondere in Abscissionsschichten von welkenden Organen. Ungerichtete Lipidanalysen der ltp2KO-Mutante im Vergleich zum Wildtyp zeigten nur signifikante Veränderungen in der Menge definierter Sphingolipide – obwohl bislang eine Beteiligung von LTP2 am Transfer von Phospholipiden postuliert wurde. Allerdings kann das LTP2-Protein, wie Protein-Lipid-Overlay-Analysen demonstrierten, weder komplexen Sphingolipide noch Sphingobasen binden. Neben Sphingobasen sind auch langkettige Fettsäuren Bestandteile von Sphingolipiden und diese sind wiederum Bindepartner von LTP2. Um eine eventuelle Beteiligung von LTP2 an der Bildung von Suberin von Tumoren zu zeigen, wurde dieses analysiert. Die GC-MS-Analysen des Tumor-Suberins haben jedoch veranschaulicht, dass durch das Fehlen von LTP2-Transkripten das Lipidmuster nicht beeinträchtigt wird. Eine Überexpression von LTP2 im gesamten Kormophyten war trotz drei unabhängiger experimenteller Ansätze nicht möglich. Daher wurde das Protein ektopisch in epidermalen Zellen exprimiert (CER5Prom::LTP2). Die Transgenen CER5Prom::LTP2 wiesen einige morphologische Besonderheiten auf, wie verminderte Oberflächenhydrophobizität, aberrante Blüten- und Blattmorphologien etc., die typisch für Wachsmutanten sind. GC-MS-Analysen der cuticulären Wachse dieser transgenen Pflanzen zeigten, einen erhöhten Gehalt an C24- und C26-Fettsäuren, wohingegen die korrespondierenden Aliphaten wie Aldehyde und Alkane dezimiert waren. Unterstützend zeigten Lokalisationsanalysen, dass das LTP2-Protein an/in der Plasmamembran assoziiert ist. Somit kann die These aufgestellt werden, dass LTP2 langkettigen, unverzweigten Aliphaten (Fettsäuren) an der Grenzfläche Plasmamembran/Zellwand transferiert, die zur Versieglung und Festigung von Zellwänden benötigt werden. N2 - Out of 49 known lipid transfer protein (LTP) only the expression of LTP2 is highly increased in tumors induced on Arabidopsis thaliana via Agrobacterium tumefaciens (strain C58; Deeken et al., 2006). Mutants with no LTP2 transcripts (ltp2KO) develop significantly smaller tumors than the wild-type. Due to the permanent cell stretch and elongation processes tumors do not possess an intact epidermal layer (Efetova et al., 2007). This leads to the loss of a complete cuticle layer, which is produced by the epidermis and builds up a barrier to the environment. To minimize the transpirational water loss, long-chain aliphatic compounds are incorperated into the outer cell layers of tumors (Deeken et al., 2006). The gene expression of LTP2 is not triggered by tumor-inducing agrobacteria. Instead, factors such as wounding and the application of the phytohormone abscisic acid (ABA) induce the LTP2 gene expression. In addition, the LTP2 promoter is highly active in tissue, in which secondary cell wall modifications occur, and in the abscission zone of wilting organs. Untargeted lipid analyzes of ltp2KO mutant in comparison to the wild type showed significant changes in the amount of defined sphingolipids only - although the involvement of LTP2 has been postulated for the transfer of phospholipids. However, the LTP2 protein, as protein-lipid overlay analysis demonstrated, binds neither complex sphingolipids nor sphingobases. Instead LCFAs, which are part of sphingolipids are binding partners of LTP2. In order to show a possible involvement of LTP2 in the formation of tumor-suberin GC-MS analyzes were performed. These demonstrated that the composition of the lipid-pool is not altered in ltp2KO plants. Overexpression of LTP2 was not possible in spite of three independent experimental approaches. The protein was instead expressed ectopically in epidermal cells (CER5Prom::LTP2). The transgenes CER5Prom::LTP2 showed some morphological abnormities, such as reduced surface hydrophobicity, aberrant flowers and leaf morphologies, which are typical for wax mutants. GC-MS analyzes of the cuticular wax of those transgenic lines revealed an increased amount of C24- and C26- fatty acids. Furthermore LTP2 was localized at the plasma membrane. Thus, this thesis proposes a role of LTP2 in the transfer of long chain, unbranched aliphatics (fatty acids), which are needed to seal up and strengthen cell walls at the interface plasma membrane and cell wall. KW - Ackerschmalwand KW - Suberin KW - Cutinase KW - Agrobacterium tumefaciens KW - Lipid-Carrier-Proteine KW - Lipidtransferprotein KW - Fettsäure KW - Aliphaten Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-105449 ER - TY - THES A1 - Chintalapati, Chakravarthi T1 - Ornithine decarboxylase is the receptor of regulatory protein RS1 (RSC1A1) mediating RS1 dependent shortterm regulation of glucose transporter SGLT1 T1 - Ornithindecarboxylase ist der Rezeptor des regulatorischen Proteins RS1 (RSC1A1) vermittelnde RS1 abhängig kurzfristige Regulierung der Glucose-Transporter SGLT1 N2 - RS1 is the intron less singel copy gene involved in regulation of plasme membrane transporters. Ornithine decarboxylase is identified as the receptor of RS1 specific for the release of vesicles containing SGLT1 specifically at the trans-golgi network. RS1 decreases the activity of ODC there by inhibiting the release of vesicles containing specifically SGLT1. N2 - Das Protein RS1 welches spezifisch in Säugetieren vorkommt hat ein Molekulargewicht von 67 kDa und wird von einem intronfreien „ single copy gene“ kodiert. Es ist an der Regulation verschiedener in der Plasmamembran enthaltenen Transportern beteilig. Der am besten untersuchte Zieltransporter für RS1 ist der Na+-Glukose-Kotransporter SGLT1, welcher sowohl auf transkripioneller, wie auch auf posttranskripioneller Ebene reguliert wird. RS1 ist am Transgolgi-Netzwerk (TGN) lokalisiert und blockiert hier die Abschnürung von Transporter-enthaltenen Vesikeln. Es enthält N-Terminal ein 83 Aminosäure langes Fragment (RS1-Reg) welches für die glukoseabhängige posttranskripionelle Regulation von SGLT1 verantwortlich ist. Die Komplexität dieser Regulation wird dadurch ersichtlich, dass RS1-Reg 20 Serine in Konsensussequenzen für verschiedenste Kinasen sowie zweimal das Tripeptid QSP und einmal das Oktapeptid SDSDRIEP enthält. Diese Peptide können SGLT1 wie RS1- reg glukoseabhängig regulieren. In der vorliegenden Studie wurde das Protein Ornithin- Decarboxylase (ODC) als Rezeptor für die von RS1 vermittelte spezifische Regulation von SGLT1 identifiziert. Die Identifizierung erfolgte zunächst durch „yeast two hybrid screening“ und dann durch Immunkopräzipitation. Zunächst wurde die Interaktion von ODC mit den ersten 312 Aminosäuren von RS1 gefunden. In weiterführenden Experimenten zeigte sich, dass bereits RS1-Reg für die Interaktion ausreicht. Nach Koexpression von ODC mit SGLT1 in Xenopus laevis-Oocyten konnte eine erhörte Aktivität des SGLT1 gezeigt werden. Durch Hemmung der endogenen ODC Aktivität in Oozyten durch den spezifischen ODC-Blocker Difluoromethylornithin (DFMO) wurde die durch SGLT1 vermittelte Aufnahme von Glukose gehemmt. Da DFMO keinen additiven Effekt gegenüber dem Exocytoseblocker Brefeldin A zeigte, scheint diese Aktivierung auf einer Regulation der Abschnürung Transporter- enthaltender Vesikel zu beruhen. Es wurde außerdem gezeigt, dass Putrescin, ein Produkt von ODC, in der Lage ist die Regulation von SGLT1 durch RS1-Reg zu blockieren. Dies legt den Schluss nahe, dass die Regulation von SGLT1 durch RS1-Reg auf einer Inhibition von ODC durch RS1-Reg beruht. In gleicher Weise konnte der inhibitorische Effekt des Tripeptids QEP durch Putrescin blockiert werden. QEP ähnelt der phosphorylierten Form QSP in RS1- reg. Die Tatsache, dass QEP die enzymatische Aktivität von ODC hemmte war ein Nachweis für die Interaktion eines aktivierten Peptidmotifs aus RS1-Reg. Die erzielten Ergebnisse sind für die Entwicklung neuer pharmakologischer Therapien, bei denen die Regulation der Glukoseabsorption durch RS1 beeinflußt wird, von Bedeutung. KW - RS1 KW - ODC KW - exocytosis KW - polyamines KW - Ornithindecarboxylase Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85622 ER - TY - THES A1 - Karl, Ingolf T1 - Die Bedeutung von TRAF2 bei TRAIL-induzierter Apoptose und Nekroptose T1 - Relevance of TRAF2 in TRAIL-induced apoptosis and necroptosis N2 - Die vorliegende Arbeit behandelt TRAIL-induzierte Apoptose und Nekroptose in verschiedenen Zelllinien. Im Speziellen wurden die verschiedenen Funktionen des TNF receptor-associated factor 2 (TRAF2) untersucht. Hierzu wurde ein transienter Knockdown etabliert und dessen Wirkung auf die Suszeptibilität der Zellen gegenüber dem Zytokin TRAIL untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass ein Knockdown von TRAF2 nicht nur zur Sensitivierung für Apoptose führt, sondern auch in Nekroptose-kompetenten Zellen zu einer Verstärkung der durch Caspaseinhibition mittels zVAD-fmk nach TRAIL-Stimulation induzierten Nekroptose führt. Mittels des Zytokins Fc-TWEAK wurde Fn14-vermittelt TRAF2 aus dem Zytosol in ein Triton X100-unlösliches Kompartiment rekrutiert und dadurch physiologisch depletiert. Dies führte zwar kaum zu gesteigerter TRAIL-abhängiger Apoptose, sensitivierte jedoch analog zum TRAF2-Knockdown RIP3-exprimierende Zellen für Nekroptose. Durch Vergleich RIP3-negativer (HeLa-Leervektor) mit RIP3-exprimierenden Zellen (HeLa RIP3, HT29, HaCaT) konnte die Essentialität von RIP3 für die Nekroptose herausgestellt werden und Einsatz des RIP1-Kinase-Inhibitors Necrostatin-1 sowie des MLKL-Inhibitors Necrosulfonamide belegte die Beteiligung der Nekroptosomkomponenten RIP1 und MLKL. Antagonismus putativen autokrinen TNFs bewies, dass es sich bei dem durch Fc-TWEAK verstärkten Zelltod um einen direkten TRAIL-Effekt handelte und Inhibition kanonischen NFkBs durch IKK2-Inhibitor TPCA-1, dass die TRAF2-Knockdown-vermittelte Sensitivierung gegenüber TRAIL nicht auf verändertes NFkB-Signalling zurückzuführen ist. Einsatz des SMAC-Mimetikums BV6 rekapitulierte zudem stark das im TRAF2-Knockdown Gesehene und unterstrich die Bedeutung der cIAPs. Immunpräzipitation von Caspase 8 unter nekroptotischen Bedingungen zeigte bei TRAF2-Knockdown eine Depletion von TRAF2 und cIAP1/2 sowie RIP1 und RIP3 aus dem Komplex mit Caspase 8. Insgesamt wird deutlich, dass TRAF2 einerseits antiapoptotisch wirkt als K48-Ubiquitinligase, die die Halbwertszeit aktiver Caspase 8-Komplexe determiniert und andererseits eine antinekroptotische Funktion hat, da es durch Rekrutierung von cIAP1/2 an RIP1 die TRAIL-induzierte Nekroptose verhindert, wenn die Caspasen inhibiert sind. N2 - This study focussed on TRAIL-induced apoptosis and necroptosis in a number of different cell lines. In detail, the different functions of TNF receptor-associated factor 2 (TRAF2) were examined. Establishment of a transient TRAF2 knockdown discovered not only sensitization for apoptosis upon treatment with the cytokine TRAIL but also enhanced necroptosis in cells competent for this alternative programmed cell death mode. Physiological recruitment of TRAF2 into a triton x100- insoluble compartment using Fn14 ligand Fc-TWEAK revealed no stronger apoptosis after TRAIL treatment, but featured enhanced necroptosis. Comparing RIP3-negative cells (HeLa) with RIP3-expressing cells (HeLa RIP3, HT29, HaCaT) confirmed necroptosis and the necessity of RIP3 for necroptosis. Using RIP1 kinase inhibitor necrostatin 1 and MLKL inhibitor necrosufonamide fortified the involvement of the necroptosome components RIP1 and MLKL in TRAIL-induced necroptosis. Antagonizing putative autocrine TNF verified the thesis that the enhanced cell death phenotype observed upon Fc-TWEAK pre-treatment was indeed a genuine TRAIL signalling effect. Inhibition of classical NFB via TPCA-1 ruled out possibly altered NFB signalling due to TRAF2 knockdown. SMAC mimetics with BV6 strongly recapitulated the TRAF2 knockdown-induced phenotype in TRAIL-derived apoptosis and necroptosis and emphasizes cIAP1/2 relevance. Under necroptotic conditions, immunoprecipitation of caspase 8 complexes revealed depletion of TRAF2, cIAP1/2, RIP1 and RIP3 upon TRAF2 knockdown. Summarizing, by determining the shelf life of activated caspase 8, TRAF2 directly acts antiapoptotically. Moreover, by recruiting cIAP1/2 to RIP1, TRAF2 inhibits TRAIL-induced necroptosis, under conditions where caspases are inhibited. KW - Nekrose KW - Apoptose KW - Signaltransduktion KW - TRAF2 KW - Nekroptose KW - NFkB-Signalling KW - RIP3 KW - TWEAK KW - Signalweg Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-114506 ER - TY - THES A1 - Kasang, Christa T1 - Untersuchung der Effekte von Prednisolon auf die HIV-Progression und Ermittlung der Medikamentenresistenz in antiretroviral-unbehandelten HIV-Patienten in Tansania T1 - Progression of HIV disease under corticosteroid treatment and occurrence of antiretroviral drug resistances in therapy naive HIV infected patients in Tanzania N2 - Die Progression der HIV Infektion ist vermutlich bedingt von einer unspezifischen generalisierten Immunaktivierung des Patienten (Sousa, Carneiro et al. 2002; Hazenberg, Otto et al. 2003). Somit könnte ein immunsuppressives Medikament wie das Kortisonpräparat Prednisolon die Progression der Erkrankung verlangsamen. Im Rahmen nicht-kontrollierter Studien konnte die Stabilisierung der CD4+ T-Lymphozyten in HIV-Patienten durch den Einsatz von Kortison beobachtet werden (Andrieu, Lu et al. 1995; Lu, Salerno-Goncalves et al. 1995). Dieser Effekt konnte auch mit niedrig dosiertem Prednisolon (5 mg/Tag) nachgewiesen werden (Ulmer, Muller et al. 2005). Jedoch zeigen neuere Ergebnisse, dass der CD4+ T-Lymphozytenwert bei Studien zu Immunmodulatoren kein verlässlicher Surrogatmarker für die Progression ist (Abrams, Levy et al. 2009). In der vorliegenden Arbeit sollte untersucht werden, ob sich zum Einen der stabilisierende Effekt von niedrig dosiertem Prednisolon (5 mg pro Tag) auf CD4+ T-Lymphozyten in einer kontrollierten Studie bestätigt, ob zum Zweiten die CD4+ T-Lymphozytenstabilisierung auf eine Senkung der Immunaktivierung zurückgeführt werden kann und ob zum Dritten die CD4+ TLymphozytenstabilisierung die klinische Krankheitsprogression verlangsamt. Im Rahmen der ProCort-Studie sollte außerdem eine Bestimmung der Prävalenz medikamentenresistenter HIV-Infektionen bei ART unbehandelten Patienten erfolgen. Hierbei wurden die WHO Kriterien überprüft, die als Einschlusskriterien für Patienten in Resistenz-Überwachungsstudien ein Höchstalter von 25 Jahren festgelegt hat. In unserer Untersuchung wurden demgegenüber Proben von Patienten mit höherem Alter und bereits therapierten Partnern analysiert.Methoden: Im Rahmen einer doppelblinden randomisierten klinischen Studie (ProCort1) im Bugando Medical Center (BMC) in Mwanza, Tansania, wurden 326 HIV-Patienten eingeschlossen, die zuvor noch nie mit ART behandelt wurden und einen CD4+ TLymphozytenwert von mindestens 300/μl aufwiesen. In 14 Visiten wurden, während einer zweijährigen Behandlungsdauer entweder mit 5mg Prednisolon täglich oder mit Placebo, die CD4+ T-Lymphozytenwerte und das Auftreten von Progression der HIV-Infektion bestimmt. Primärer Studienendpunkt war die Krankheitsprogression, definiert als ein Unterschreiten von 200 CD4-Zellen/μl oder dem Auftreten AIDS-definierender Erkrankungen. Um die immunologische Wirkungsweise von Prednisolon in HIV-infizierten Patienten zu untersuchen wurden sowohl in den tansanischen Studienpatienten als auch in einer mit 5 mg Prednisolon behandelten deutschen Kohorte die Lymphozytenaktivierungsmarker CD38/HLADR auf CD3/CD8-Zellen, der Monozytenaktivierungsmarker sCD14 und der Entzündungsmarker suPAR bestimmt. Um die Prävalenz der HIV Medikamentenresistenz (HIVDR) in der ProCort Studienpopulation zu ermitteln wurden 88 Proben der ART unbehandelten Patienten sequenziert. Ergebnisse: Die Ergebnisse der ProCort Studie zeigten eine statistisch signifikante Stabilisierung der CD4+ T-Lymphozytenwerte im Vergleich zum Ausgangswert durch Einsatz einer niedrig dosierten Prednisolonbehandlung (5 mg täglich). In der Intent to treat Analyse wurde ein Zugewinn von +20,1 Zellen/μl pro Jahr für den Prednisolonarm (p < 0.0001) im Vergleich zu -54,2 Zellen/μl pro Jahr für den Placeboarm (p < 0.0001) bestimmt. Die CD4+ T-Lymphozytenwerte zum Zeitpunkt der Startvisite waren im Prednisolonarm statistisch signifikant niedriger (Mean 512.14 Zellen/μl ± S.E.M. 13.39) als im Placeboarm (Mean 554.40 ± S.E.M 15.75; p = 0.042). Dies bedeutet eine schlechtere Ausgangslage für die mit Prednisolon behandelten Patienten. Trotzdem entwickelten nur vier Patienten mit Prednisolonbehandlung im Vergleich zu 11 Patienten mit Placebobehandlung AIDS, was eine statistisch signifikante Verringerung der Progressionsrate bedeutet (p=0.0196). In 16 Patienten versus 18 Patienten fielen die CD4+ T-Lymphozytenwerte unter die Werte von 200 Zellen/μl. Die Behandlung mit Prednisolon war nicht mit einer höheren Rate von unerwünschten Ereignissen oder höherer Viruslast assoziiert. N2 - Background: A combination-therapy approach with antiretroviral substances (ARVs), also called antiretroviral therapy (ART) is at present, the best and almost the only treatment option for HIV infected individuals. While combination ART is the best treatment to prevent the onset of AIDS in HIV infection, it is still not available for millions of patients in resourcelimited areas, despite the substantial improvements achieved in the past 10 years. There is a justified concern of the acceleration of HIV-drug-resistance (HIVDR) development caused by first-line ART medication available in countries with restricted resources, as the ART available often has low genetic barriers causing resistance mutations (Barth, Wensing et al. 2008). There is a strong need for treatment that is inexpensive and effective of delaying the progress of the illness in the asymptomatic phase. HIV-associated general immune activation is a strong predictor for HIV disease progression, suggesting that chronic immune activation may drive HIV pathogenesis (Sousa, Carneiro et al. 2002; Hazenberg, Otto et al. 2003). Therefore immunomodulating agents like the corticosteroid prednisolone may decelerate HIV disease progression. This is the rationale for the use of prednisolone in HIV therapy. In nonrandomised monocentric observational studies it was shown that certain corticosteroids has a stabilizing effect on the CD4+T-lymphocytes in HIV-infected patients (Andrieu, Lu et al. 1995; Lu, Salerno-Goncalves et al. 1995). This effect could also be proven with low dose prednisolone (5 mg daily) (Ulmer, Muller et al. 2005). However, recent studies demonstrate that the CD4+T-lymphocytes are not stable predicting markers for HIV progression (Abrams, Levy et al. 2009). This thesis examines, first if the CD4+T-lymphocytes stabilizing effect of 5 mg prednisolone can be proven in a double-blind controlled randomized clinical trial, second if this effect is dependent of the reducing generalized immune activation and third if the CD4+T-lymphocytes stabilizing effect reduces the clinical progression of HIV infection. A study to identify the prevalence of HIVDR was also conducted within the ProCort study. To validate the current WHO tHIVDR survey criteria, focused on patients age below 25 years, our study included also patients over 25 years with partners already on treatment as well. Methods:The ProCort Study (Progression of HIV-Disease under Low Dose Corticosteroids) was designed as a double blinded randomized clinical trial including 326 ART-naïve patients in Bugando Medical Centre in Mwanza, Tansania, with a minimum cell count of 300 CD4+Tlymphocytes per μl. Patients were treated with either 5mg prednisolone daily or with placebo for two years. The CD4+T-lymphocytes were measured in 14 visits and progression factors were evaluated. Progression was defined as qualifying for start of ART either due to CD4 Cell 11 count below 200 cells per μl or due to developing AIDS defining symptoms. Immune activation markers were determined both for the ProCort patients and for a German cohortstudy group receiving 5 mg Prednisolon. The lymphocyte activation marker CD3/CD8/CD38/HLADR, monocyte activation marker sCD14 and markers for inflammation suPAR was targeted during the study. To identify the HIVDR in the ProCort study population sequencing was conducted in 88 sequentially enrolled ART-naïve patients. Results:The results of the ProCort study showed a statistical significant stabilizing effect of CD4+T-lymphocyte count compared to baseline counts in 5 mg prednisolone treated patients. In an intent-to-treat analysis, average changes in CD4+T-lymphocyte counts versus baseline were +20,1 cells/μl per year for prednisolone (P = 0.0002) and -54,2 cells/μl per year for placebo (P = 0.0027). The Baseline CD4+T-lymphocyte count recovery were significantly lower in the prednisolone arm (mean 512.14 cells/μl ± S.E.M. 13.39) than in the placebo arm (554.40 ± 15.75 P = 0.042) which implies a disadvantage for this group. However, only four patients treated with prednisolone and 11 patients treated with placebo developed stage C opportunistic diseases (Kaplan Meyer analysis, p = 0.0196 Gehan-Breslow-Wilcoxon test). For the CD4+T-lymphocyte counts 16 patients, compared to 18 patients in the placebo group? fall under 200 cell/μl. Prednisolone treatment was not associated with an increase in adverse events or HIV viral load. A statistically significant reduction in immune activation markers were obtained by 5 mg prednisolone therapy in both the German and the Tanzanian study group. In the Tanzanian study group the lymphocyte activation change to baseline, determined by CD38/HLADR-expression on CD8+ T lymphocytes, showed a significantly reduction of activation in prednisolone-treated patients compared to an increase in the untreated patients (-4.101% compared to 2.637%, p = 0.0018). The analysis of the immune system activation markers for inflammation (suPAR) showed a significant reduced difference to baseline in prednisolone-treated patients compared to untreated patients (-0.147 ng/ml, compared to 0,325 ng/ml, p<0.0001). In the results for monocytes activation markers for soluble CD14 just failed the significant difference between prednisolone and placebo treated patients (4.030 ng/ml, vs. 3.513 ng/ml, p=0.062). In the German Study cohort lymphocyte activation determined by CD38-expression on CD8+ T lymphocytes was significantly lower in prednisolone-treated patients compared to untreated patients (55.40% versus 73.34%, p = 0.0011). Similarly, we detected for monocyte activation markers lower levels of sCD14 (3.6 ng/ml vs. 6.11 ng/ml, p = 0.0048), and of LBP (2.18 ng/ml compared to 3.45 ng/ml; p = 0.0386) and for inflammation markers suPAR antigen (2.17 ng/ml vs. 2.56 ng/ml, p = towards lower levels of sCD40L (2.70 pg/ml vs. 3.60 pg/ml, p = 0.0782). 12 Viral load in both groups were similar (0.8 x 105 copies/ml compared to 1.1 x 105 copies/ml, p = 0.3806) (Kasang, Ulmer et al. 2012). By sequencing the HIV samples of ProCort patients we identified the HIV-1 subtype frequency A1: 34%, A1D: 7%, C: 26%, CRF10_CD: 4%, D: 28%, B: 1%. Twenty patients of the 88 were aged <25 years (meeting the WHO-initiated transmitted HIVDR surveillance criteria) and 68 patients were aged 25–63 years. The frequency of HIVDR in the study population was 14.8% (95%; CI 0.072–0.223) and independent of NVP-resistance induced by prevention of mother-to-child transmission programs. Patients >25 years had a significantly higher HIVDR frequency than younger patients (19.1%, versus 0%, P = 0.0344). ART-naïve patients aged over 25 years exhibited significantly higher HIVDR than younger patients. Detection of traces of ARVs in individuals with HIVDR suggests that besides transmission, undisclosed misuse of ARVs may constitute a significant factor in the generation of the observed high HIVDR rate. Discussion: The results in the context of the ProCort Study showed that treatment with 5 mg per day prednisolone for two years in ART-naive HIV patients is safe in an African setting and was associated with a significant increase of CD4+T-lymphocyte counts compared to the placebo group. In addition, prednis olone-treated patients developed significantly fewer AIDSdefining conditions, indicating that prednisolone slows HIV disease progression. This can be explained by the justified reduction of general immune activation in low-dose prednisolone treated patients. We suggest low-dose prednisolone as a treatment option for asymptomatic HIV infection in resource-limited settings. Additionally it should be clarified if low-dose prednisolone therapy is also an option for an ART combined treatment. So far, the reported prevalence of HIVDR in eligible patient populations is below 5% across Sub-Saharan Africa (WHO 2012). Our study identified that patients over 25 years of age showed a significant higher prevalence of HIVDR than younger patients (p=0.0344). By phylogenetic alignment for two samples of treated partners and untreated patients we demonstrate a transmission of HIVDR probably achieved by treatment to the therapy naïve patient. Detection of traces of ARVs in some other individuals with HIVDR suggests that besides transmission, undisclosed misuse of ARVs may constitute a significant factor in the generation of the observed high HIVDR rate. The current WHO HIVDR survey that is solely focused on the transmission of HIVDR and that excludes patients over 25 years of age may therefore result in substantial underestimation of the prevalence of HIVDR in the therapynaïve population. A modification of WHO HIVDR survey criteria is strongly recommended KW - Retroviren KW - HIV KW - Tansania KW - Immunsystem KW - Resistenz KW - AIDS KW - Prednisolon KW - Glucocorticosteroide KW - Immunaktivierung KW - HIVDR KW - klinische Studie KW - Tanzania KW - HIV KW - Immunactivation KW - Resistances KW - Prednisolone Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85638 ER - TY - THES A1 - Bieber, Michael T1 - Funktionelle Charakterisierung zweier Lipid Transfer Proteine in der Arabidopsis thaliana Pathogenantwort T1 - Functional characterization of two lipid transfer proteins involved in Arabidopsis thaliana pathogen defense response N2 - Die Multigenfamilie der Lipid Transfer Proteine (LTP) stellt eine Gruppe von kleinen Proteinen dar, welche in allen höheren Landpflanzen vorkommen. In der Modellpflanze Arabidopsis thaliana werden 92 Proteine zur Klasse der LTPs gezählt. Die Benennung der Proteinfamilie basiert auf dem beobachteten in vitro Transfer von Lipiden zwischen zwei Membranen. Alle LTPs weisen ein konserviertes, 8 Cysteine beinhaltendes Motiv und eine hydrophobe Tasche auf, welche für die Bindung hydrophober Moleküle verantwortlich ist. Aufgrund ihrer Signalsequenz werden LTPs über den sekretorischen Weg in den extrazellulären Raum geschleust. Für einige pflanzliche LTPs konnte eine derartige Sekretion bereits nachgewiesen werden. Für andere LTPs wird eine Funktion in der Kutinbildung, der Embryogenese oder der pflanzlichen Immunantwort gegen Phytopathogene postuliert. Letzteres wurde für DIR1 (DEFECTIVE IN INDUCED RESISTANCE 1) und AZI1 (AZELAIC ACID INDUCED 1) nachgewiesen, während von LTPIV.4 (At4g55450) nur bekannt ist, dass die Expression spezifisch in Antwort auf Pathogene induziert ist. Aus diesem Grund wurde in der vorliegenden Arbeit die Funktion von LTPIV.4 und AZI1 in Bezug auf die pflanzliche Pathogenantwort in Arabidopsis thaliana untersucht. Anhand von GFP-Fusionsproteinen konnte für LTPIV.4 und AZI1 eine Endoplasmatische Retikulum-Lokalisierung detektiert werden. Auch eine gewebespezifische Promotoraktivität von LTPIV.4 an den Leitgeweben und in jungen sich entwickelnden Blättern konnte identifiziert werden. Diese Erkenntnisse lassen darauf schließen, dass LTPIV.4 möglicherweise an der Signaltransduktion am/im Leitgewebe mitverantwortlich ist. Im Fokus dieser Arbeit stand die spezifische Einordnung von LTPIV.4 in der Ausbildung der lokalen bzw. systemischen Immunantwort von Arabidopsis thaliana. Anhand einer Infektion von Wildtyppflanzen und LTPIV.4 Mutanten mit zwei verschiedenen Pseudomonasstämmen konnte eine LTPIV.4-abhängige Steigerung der pflanzlichen Resistenz gegen die biotrophen Bakterien nachgewiesen werden. In der Resistenz gegen den nekrotrophen Pilz Sclerotinia hingegen zeigte sich keine LTPIV.4 Abhängigkeit. Da die Hormone Salicylsäure (SA) und Jasmonsäure (JA) in der Ausbildung der pflanzlichen Abwehr gegen verschiedene Pathogene wichtig sind, wurden die Hormonlevel von SA und JA in ltpIV.4, 35S::LTPIV.4 sowie in Wildtyppflanzen analysiert. Die untersuchten Phytohormongehalte zeigten eine LTPIV.4 unabhängige, schnelle Akkumulation von SA nach der Infektion mit virulenten (vir) Pseudomonas syringae pv. maculicola (Psm) und eine spätere Erhöhung der JA-Gehalte. Es konnte somit kein regulatorischer Effekt von LTPIV.4 auf die SA- sowie die JA-Gehalte detektiert werden. Die Expression von SAG13 (SENESCENCE-ASSOCIATED GENE 13) und OXI1 (OXIDATIVE SIGNAL-INDUCIBLE 1), welche eine Funktion im programmierten Zelltod (PCD) haben beziehungsweise durch oxidativen Stress induziert werden, war hingegen erhöht in konstitutiv LTPIV.4 exprimierenden Pflanzen, verglichen mit dem Wildtyp von LTPIV.4. Als ein weiterer Ansatzpunkt für die funktionelle Charakterisierung von LTPIV.4 wurde die in vitro Identifizierung möglicher Substrate mittels Lipid-Protein-Interaktionsanalysen, sowie einer unspezifischen Metabolomanalyse herangezogen. Bei den Interaktionsanalysen konnten Phosphatidsäuren (PA), Phosphatidylglycerine (PG), Monogalactosyldiacylglycerole (MGDG) und auch Digalactosyldiacylglycerole (DGDG) als Interaktionspartner von LTPIV.4 identifiziert werden. Die Metabolomanalyse zeigte einen quantitativen Unterschied zwischen Wildtyp/35S::LTPIV.4 und ltpIV.4 bei einigen MGDG, DGDG und PG Spezies. Aus den in dieser Arbeit gewonnen Daten lässt sich somit schließen, dass LTPIV.4 nach Pathogen/Schaden-assoziierte molekulare Muster- (PAMP/ DAMP-) Erkennung, z.B. von Psm, SA-abhängig vermehrt gebildet wird. Da die konstitutive Expression von LTPIV.4 sowohl zu erhöhter OXI1 und SAG13 Expression als auch zu erhöhter Resistenz gegenüber Psm führt, lässt sich ein Modell aufstellen, in dem LTPIV.4 als positiver Regulator des PCD die Pathogenresistenz von Arabidopsis erhöht. Der zugrunde liegende Mechanismus ist unbekannt. Die Bindung von PAs, PGs, MGDGs und DGDGs an LTPIV.4 in vitro könnte darauf hindeuten, dass auch in vivo hydrophobe Moleküle gebunden und möglicherweise transportiert werden und dies ein Teil der Pathogenantwort ist. Es wäre z.B. denkbar, dass eine mögliche Translokation von LTPIV.4 über das ER in das Zytoplasma oder den apoplastischen Raum erfolgt. Dort interagiert LTPIV.4 mit durch ROS gebildeten, oxidierten Lipiden oder DAMPs und löst entweder symplastisch durch eine Interaktion in der Infizierten Zelle oder in intakten Nachbarzellen durch eine weitere Signaltransduktionskaskade den PCD sowie eine erhöhte ROS Bildung aus, oder das LTP interagiert spezifisch mit oxidierten Lipiden oder DAMPs von abgestorbenen Nachbarzellen, und löst eine intrazelluläre Signalkaskade mit Initiierung des PCD sowie erhöhter ROS-Bildung aus. AZI1 wurde als zweites LTP in dieser Arbeit einbezogen. Ausgehend von der Beobachtung, dass die konstitutive Expression von AZI1 die Resistenz gegen das nekrotrophe Pathogene Botrytis cinerea erhöht, sollte in der vorliegenden Arbeit detailiert untersucht werden, ob AZI1 eine Rolle in der Resistenz gegen das nekrotrophe Pathogen Sclerotinia sclerotiorum spielt. Die azi1-1 Mutante zeigte hierbei jedoch eine erhöhte Resistenz gegen den nekrotrophen Pilz Sclerotinia sclerotiorum. Da bisher keine Unterschiede in der Genexpression von spezifischen Markergenen in WT und azi1-1 Pflanzen nach Sklerotiniainfektion festgestellt werden konnte und es auch für LTPs bekannt ist, dass sie eine Rolle in der Kutikulasynthese spielen, wäre eine Hypothese, dass die unterschiedlichen Infektionsphänotypen mit Sclerotinia und Botrytis auf eine strukturelle Veränderung der Kutikulabeschaffenheit zurückzuführen sind. Weiterhin konnte für AZI1 eine mögliche Rolle in der Verwundungsantwort detektiert werden, da sowohl die AZI1 Genexpression, als auch die erhaltenen basal signifikant erhöhten 12-oxo-Phytodiensäure (OPDA)-Gehalte auf eine negativ regulatorische Rolle von AZI1 in der Verwundungs-abhängigen JA-Signaltransduktion hindeuten. N2 - Functional characterization of two lipid transfer proteins involved in Arabidopsis thaliana pathogen defense response KW - Lipid-Carrier-Proteine KW - Lipid Transfer Proteine KW - plant pathogen resistance KW - pflanzliche Pathogenresistenz KW - lipid transfer proteins KW - Arabidopsis thaliana KW - Arabidopsis thaliana KW - Pseudomonas syringae KW - Pseudomonas syringae KW - AZI1 KW - AZI1 KW - Ackerschmalwand KW - Resistenz KW - Pseudomonas syringae Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-97682 ER - TY - THES A1 - Trebing, Johannes T1 - CD70-abhängige und spezifische Aktivierung von TRAILR1 oder TRAILR2 durch scFv:CD70-TRAIL-Mutanten T1 - CD70-restricted specific activation of TRAILR1 or TRAILR2 using scFv:CD70-TRAIL mutants N2 - Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, den T-Zell-inhibierenden Effekt eines CD70-blockierenden Antikörpers mit einer Fc-unabhängigen Zelltod-induzierenden Aktivität auf CD70-exprimierende Tumoren zu kombinieren. Dazu wurden Fusionsproteine hergestellt und untersucht, die aus einer CD70-bindenden scFv-Domäne sowie aus einer TRAIL-Domäne bestehen. Der CD70-spezifische monoklonale Antikörper lαhCD70 sowie der beretis bekannte hCD70-spezifische Antikörper 1F6 blockieren mit hoher Effizienz die CD27/CD70-Interaktion von CD70-exprimierenden Zelllinien (Mino, OVCAR-3, U-266) und inhibieren dadurch die Induktion der IL8-Produktion durch diese Zellen in kokultivierten HT1080-CD27-Zellen. IL8 wird durch den klassischen NFκB-Signalweg reguliert und ist für den pro-angiogenetischen Effekt von entscheidender Bedeutung (Abb. 2, 3). Mit Hilfe zellulärer Gleichgewichtsbindungsstudien mit mono- und trimeren scFv:lαhCD70-GpL-Fusionsproteinen (Abb. 4) auf Mino- und OVCAR-3-Zellen konnte gezeigt werden, dass die Trimerisierung in beiden Zelllinien zu einer Steigerung der apparenten Affinität der scFv:lαhCD70-CD70 Interaktion führt und damit einen Effekt auf die CD70-Belegung hat (Abb. 5). Für die Konstruktion der Fusionsproteine wurde sowohl Wildtyp-TRAIL als auch TRAIL-Mutanten mit Präferenz für den TRAILR1 oder TRAILR2 verwendet. Die TRAILR-Präferenz der verwendeten TRAIL-Mutanten (wt, mutR1, mutR2) wurde nicht nur in zellulären GpL-Bindungsstudien (Abb. 7) sondern zusätzlich auch in TRAILR Immobilisierungsexperimenten (Abb. 8) bewiesen. Hier zeigte sich, dass bei TRAILR1 keine Interaktion mit TRAILmutR2, so wie bei TRAILR2 keine signifikante Bindung mit TRAILmutR1 erfolgte. Nur der TRAIL-Wildtyp band signifikant an beide TRAIL-Todesrezeptoren. Vitalitätsexperimente (Abb. 10) und Western-Blot Analysen der Caspase-Prozessierung (Abb. 11) bestätigten die starke TRAILR1- bzw. TRAILR2-Spezifität der TRAILmutR1- und TRAILmutR2-Varianten. Im Gegensatz zu den unvernetzten löslichen TRAIL-Trimeren waren nur die quervernetzten TRAIL-TNC-Varianten in der Lage, eine signifikante Apoptose-Signalkaskade bei relativ geringen Konzentrationen zu induzieren. Die toxischen ED50-Konzentrationen der unoligomerisierten TRAIL-Formen lagen um einen Faktor 100 höher als die der oligomerisierten Varianten. Zusammenfassend zeigten die ED50-Werte der Zytotoxizitätsexperimente von M2-oligomerisierten zu -unoligomerisierten trimeren TRAIL-Varianten bei allen Fusionskonstrukten und Zelllinien eine eindeutige Verstärkung der Apoptoseinduktion durch die M2-Quervernetzung. Bei Jurkat- und Mino-Zellen konnte größtenteils erst nach Oligomerisierung überhaupt eine Bioaktivität bzw. eine Zelltodinduktion beobachtet werden. In OVCAR-3-Zellen zeigte sich eine 100-1000 fache apoptotische Verstärkung durch die Oligomerisierung (Abb. 10). Weiterhin zeigten Zytotoxizitätsexperimente, dass sich durch Bindung an hCD70 das Ausmaß der Toxizität der Fusionsproteine auf allen CD70-exprimierenden Zelllinien 10-100x verstärkte (Abb. 15, 17). In Übereinstimmung mit der verstärkten TRAIL-Todesrezeptor-Aktivierung durch die CD70-Bindung der scFv-TRAIL-Fusionsproteine, konnte durch eine CD70-Blockade die Caspase-8 Aktivierung und die Prozessierung von Caspase-3 signifikant unterbunden werden (Abb. 18). Die Trimerisierung des scFv:lαhCD70-Antikörpers führte zu keiner Apoptose und beeinflußte auch nicht die Aktivität von TRAIL (Abb. 19) was belegt, dass die beobachteten Effekte auf einer stärkeren TRAIL-induzierten Apoptose nach CD70-Bindung der Konstrukte beruhen muss. Die Fusionsproteine beseitigen somit nachweislich einerseits das Problem der limitierenden Aktivität von löslichem TRAIL über ihre Verankerung an CD70 (Abb. 15-20) und anderseits die potentielle unerwünschte CD70-vermittelte protumorale CD27-Stimulation (Abb. 3). Darüber hinaus könnten die TRAILR-spezifischen TRAIL-Mutanten helfen, Nebeneffekte zu reduzieren, die primär durch den jeweils anderen TRAIL-Todesrezeptor vermittelt werden. Jedoch sind weiter Forschungen insbesondere in vivo Experimente notwendig, um Aussagen über Funktionalität, Halbwertszeiten, sowie Effektivität und Verträglichkeit treffen zu können. N2 - The aim of this work was to generate constructs that combine the CD27 stimulation inhibitory effect of blocking CD70 antibodies with an antibody-dependent cellular cytotoxicity(ADCC)-independent, cell death inducing molecule. To reach this goal we generated fusion proteins consisting of the apoptosis-inducing TNF family member TRAIL and a single-chain variable fragment (scFv) derived from a high affinity lama anti-human CD70 antibody (lαhCD70). A fusion protein of scFv:lαhCD70 and TNC-TRAIL, a stabilized form of soluble TRAIL, showed strongly enhanced apoptosis induction upon CD70 binding. In addition, this construct efficiently interfered with the CD70-CD27 interaction. The introduction of recently identified TRAIL-mutations that discriminate between TRAILR1 and TRAILR2 binding into the TRAIL-part of scFv:lαhCD70-TNC-TRAIL resulted in the TRAIL death receptor-specific fusion proteins with CD70-dependent activity. The fusion proteins eliminate on the one hand the problem of the limited activity of soluble TRAIL by anchoring to CD70 what confers membrane TRAIL-like activity to the constructs (Fig. 15-20). On the other hand, the constructs have the potential to block the unwanted CD70-mediated protumorale CD27 stimulation (Fig. 3). In addition, the TRAILR1-specific TRAIL mutant (Fig. 7, 8) could reduce unrecognized side effects mediated by TRAILR2 and vice versa. However, further research, particularly in vivo experiments are necessary to state about functionality, half-lives, as well as efficacy and tolerability of the constructs. KW - Apoptosis KW - CD70 KW - Antikörper KW - T-Lymphozyt KW - CD27 KW - scFv KW - TRAIL KW - TRAILR-Mutants KW - Antibodies KW - Antigen KW - Single chain KW - Recombinant protein Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-111592 ER - TY - THES A1 - Horntrich, Claudia T1 - Die Funktion von Membranlipidnanodomänen für Signaltransduktionsprozesse in Pflanzen T1 - Analysis of signalling processes in Lipid Membrane domains N2 - In vielen tierischen Zellen und in Hefe wurden Membrandomänen als Plattformen für die Etablierung von Signalkomplexen bereits gut beschrieben (Foster et al., 2003) und entsprechend ihrer Resistenz gegenüber nicht-ionischen Detergenzien charakterisiert (Shogomori et al., 2003). Die Behandlung von Membranen mit solchen Detergenzien kann zu Artefakten führen und die Anwesenheit eines Proteins in diesen so genannten „DRMs“ bedeutet noch nicht, dass es auch in nativen Membrandomänen lokalisiert ist. Allerdings muss man sich, mangels besserer Methoden zur Aufreinigung von Membrandomänen, heute noch der Methode der DRM-Aufreinigung durch Detergenzien bedienen, um eine erste Vorstellung von der Proteinzusammensetzung dieser bestimmten Membranbereiche zu erhalten. Mittels Sterolreduktion der DRMs durch die Behandlung der isolierten Membranfraktionen mit MCD und anschließender HPLC-ESI-Massenspektrometrie, konnten 80 Proteine identifiziert werden, die somit als potentiell in Membrandomänen lokalisiert gelten können. Unter diesen befanden sich die beiden Arabidopsis-Remorine AtRem1.2 und AtRem1.3, die Ca2+-abhängige Proteinkinase CPK21 und die Proteinphosphatase 2C ABI1. Dieses Phosphatase-Kinase-Paar reguliert den membranständigen, im Mesophyll exprimierten, Anionenkanal SLAH3 in ABA-abhängiger Weise (Geiger et al., 2011). Mit Hilfe biochemischer, massenspektrometrischer und mikroskopischer Methoden konnte gezeigt werden, dass die Phosphatase ABI1 in Abwesenheit von ABA die Interaktion zwischen der Kinase CPK21 und dem Anionenkanal SLAH3 unterbindet. Dies geschieht indem SLAH3 und CPK21 aus den Membrandomänen in die umgebenden Membranbereiche verlagert werden und somit eine phosphorylierungsabhängige Aktivierung des Anionenkanals verhindert wird (Demir et al., 2013). Unter den in Nanodomänen lokalisiert Proteinen, konnte auch die NADPH-Oxidase AtrbohD als schwach sterolabhängig identifiziert werden. Diese zeigte im Gegensatz zu der homologen Oxidase AtrbohF, nach transienter Koexpression in Arabidopsis-Epidermiszellen zwar eine Lokalisation in distinkten Membrandomänen, aber keine Kolokalisation mit dem zuvor etablierten Membrandomänenmarker AtRem1.3 (Demir et al., 2013). Dieses Ergebnis impliziert, dass es verschiedene Arten von Membrandomänen geben könnte und dass die beiden Oxidasen (zumindest zeitweise) in unterschiedlichen Membrankompartimenten lokalisiert und dadurch womöglich auch unterschiedlich reguliert sein können. Nach Koexpression der Oxidase AtrbohD mit den weiteren 12 der insgesamt 16 Arabidopsis-Remorinen, konnte eine Kolokalisation der Oxidase mit AtRem1.4 bestätigt werden. Das Remorin AtRem1.4 zeigt in weiteren Versuchen nicht nur eine deutliche Lokalisierung in anderen sterolreichen Membrandomänen als AtRem1.3, es zeigt auch eine eindeutige laterale Immobilität und kann somit als ein Marker für Membrandomänen etabliert werden. Somit bestätigt sich die Annahme, dass es auch in Pflanzen unterschiedliche Arten von Membrankompartimenten gibt. Zu diesem Zeitpunkt war noch kein, die Funktion der Oxidase regulierender Interaktionspartner von AtrbohD bekannt, um die Frage des Zusammenhangs zwischen Lokalisation und Funktion der Oxidase beantworten zu können. Mit Hilfe verschiedener mikroskopischer Techniken (BiFC, SE-FRET, AB-FRET) zur Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen, konnte aus einer Auswahl von fünf Mesophyll-lokalisierten und Ca2+-unabhängigen Snrk2-Kinasen, zwei potentielle Interaktionspartner identifiziert werden. Genau wie mit der homologen Oxidase AtrbohF (Sirichandra et al., 2007), interagiert die ABA-abhängige Kinase OST1/Snrk2.6 auch mit AtrbohD. Bei dem zweiten potentiellen Interaktionspartner handelt es sich um Snrk2.7. Die Behandlung der transfizierten und in den Interaktionsmessungen eingesetzten Zellen mit der sterolreduzierenden Reagenz MCD resultierte in einem signifikanten Anstieg der zuvor gemessenen Interaktionseffizienzen (EFRET) aller fünf ausgewählten Snrk2-Kinasen mit AtrbohD. Eine Interaktion zwischen zwei Proteinen muss nicht zwingend bedeuten, dass sie eine funktionelle Einheit in einem Signalweg darstellen. Aus diesem Grund wurde der Einfluss der identifizierten potentiellen Interaktionspartner auf die ROS-Produktionsaktivität der NADPH-Oxidase AtrbohD untersucht. Es zeigt sich, dass Snrk2.7 die ROS-Produktion durch die Oxidase auf ein vergleichbar hohes Niveau steigern kann, wie die zu diesem Zeitpunkt als Interaktionspartner der Oxidase AtrbohD identifizierte Ca2+-abhängige Kinase CPK5 (Dubiella et al., 2013). Die Kinase Snrk2.7 interagiert also nicht nur mit AtrbohD, sondern kann die Oxidase auch phosphorylieren (wahrscheinlich an einer der beiden für die Phosphorylierung von AtrbohD als essentiell beschriebenen Positionen S343 oder S347 (Nühse et al., 2007) und nicht an der untersuchten Position S39) und somit aktivieren. Dem hingegen zeigt OST1, trotz einer zuvor bestätigten Interaktion mit AtrbohD, nicht die Fähigkeit diese Oxidase auch aktivieren zu können. Die Snrk2.7-vermittelte Aktivität von AtrbohD ist ebenfalls deutlich durch eine Behandlung der transfizierten Zellen mit MCD induzierbar. Die NADPH-Oxidase AtrbohD wird also in Abhängigkeit ihrer Lokalisierung in spezifischen Membrandomänen reguliert. Wenn die zwei essentiellen Phosphorylierungsstellen durch eine Punktmutation ausgeschaltet werden und die Oxidase nicht mehr als Antwort auf Pathogene aktiviert werden kann, lokalisiert diese nicht mehr in den AtRem1.4-markierten Membrandomänen. Auch zeigt sich, dass die Aktivität der Oxidase, induziert durch eine Interaktion mit der nicht in Membrandomänen lokalisierten Snrk2-Kinase Snrk2.7, gesteigert werden kann, wenn durch MCD die sterolreichen Membrandomänen abgereichert werden. Eventuell dienen Membrandomänen, zumindest im pflanzlichen System, nicht nur der Etablierung von Signalkomplexen, sondern in einigen Fällen auch der Negativregulierung von bestimmten Proteinaktivitäten, wie zum Beispiel in diesem Fall, der Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS). N2 - In animal cells and yeast, membrane domains have been extensively characterized as signalling platforms (Foster et al., 2003) and characterized upon their resistance to treatment with non-ionic detergents (Shogomori et al., 2003). Such treatment of membranes can result in formation of artefacts and the appearance of a protein in these so-called “DRMs” is not necessarly related with its localization in native membrane domains. The lack of improved preparative methods, results in further use of DRM preparation to get a first insight into the protein composition of special membrane areas. The protein composition of isolated and MCD-treated detergent resistant membrane (DRM) fractions from purified plasma membrane of Arabidopsis thaliana was investigated by HPLC-ESI mass spectrometry. Eighty proteins could be identified which are thought to be localized in sterol rich membrane domains. Among these sterol-dependent proteins the two Remorins AtRem1.2 and AtRem1.3 and two essential ABA signalling components, namely the protein phosphatase 2C ABI1 and the kinase CPK21, could be identified. This phosphatase-kinase pair was very recently demonstrated to regulate the stomatal aperture via SLAH3-mediated anion release in an ABA-dependent manner (Geiger et al., 2011). Using biochemical, mass spectrometrical and microscopic approaches it could be shown that, in absence of ABA, the phosphatase ABI1 prevents the interaction between CPK21 and SLAH3 by dislocation of both proteins from membrane domains to surrounding membrane areas, which inhibits the phosphorylation and the activation of the channel (Demir et al., 2013). Among the potentially membrane domain localized proteins, the NADPH-oxidase AtrbohD could be identified to be weakly dependent upon a sterol rich environment. In contrast to the homologous AtrbohF, the isoform D shows no colocalization upon coexpression with the established membrane domain marker AtRem1.3 (Demir et al., 2013). This result implies that there must be co-residing membrane domains and that both oxidases are (at least temporarily) located in different membrane compartments. This could imply functionally different membrane platformes to regulate specific signalling cascades. After Coexpression of AtrbohD with 12 of the altogether 16 Remorin proteins, a colocalization with AtRem1.4 could be confirmed. In further experiments not only a clear localization in other membrane domains than the ones marked by AtRem1.3, but also a clear lateral immobility could be proofed for AtRem1.4, which therefore can be accepted as a marker for another kind of membrane domains. Regarding these results, the existence of diverse Types of membrane compartments, also in plants, can be accepted. At this time point of the investigations, no interaction partner of AtrbohD was known to regulate the function of the oxidase. Therefore, the relationship between localization and function of the oxidase was still an open question. Using different microscopic techniques (BiFC, SE-FRET, AB-FRET) to study protein-protein interactions, two potential interaction partners out of a set of five mesophyll expressed Ca2+-independent Snrk2-kinases, could be identified. The ABA-dependent kinase OST1/Snrk2.6, which also interacts with AtrbohF (Sirichandra et al., 2007), was demonstrated to be a potential interaction partner of AtrbohD as well as Snrk2.7. The treatment of transfected cells with MCD leads to a significant induction of the measured interaction efficiencies (EFRET) of all the five analysed Snrk2-kinases with AtrbohD. An interaction between two proteins does not automatically mean a functional regulation of a signalling pathway, therefore the influence of the identified potential interacting partners of AtrbohD on the ROS-producing activity was analysed. At this time point the Ca2+-dependent kinase CPK5 was identified to be an interacting and phosphorylating partner of AtrbohD. The kinase Snrk2.7 can induce the ROS-producing activity of AtrbohD to a similar level than CPK5, which means Snrk2.7 is not only interacting with AtrbohD, but also regulating its activity. The phosphorylation and activation of AtrbohD by Snrk2.7 is probably mediated by one of the two essential phosphorylation sites S343 and S347 (Nühse et al., 2007), but not on the analysed S39. In contrast, the kinase OST1 is indeed interacting with AtrbohD, but obviously not regulating its activity. The Snrk2.7-mediated ROS-producing activity of AtrbohD is also inducible upon treatment of the transfected cells with MCD. The NADPH-oxidase AtrbohD is regulated in dependency to its localization in specific membrane domains. Mutation oft the two essential phosphorylation sites leads to a dislocation from AtRem1.4-marked membrane domains. Treatment with MCD, that means disruption of the sterol rich membrane environment, resulted in significantly increased ROS-producing activity of AtrbohD upon interaction with the non-domain located kinase Snrk2.7. Probably the membrane domains do not only function as signalling platforms in plants, but in some cases also for negative regulation of certain protein activity, such as the production of reactive oxygen species (ROS). KW - Membrandomänen KW - AtrbohD KW - ROS KW - Ackerschmalwand KW - Plasmamembran KW - Signalpeptide Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-107362 ER - TY - THES A1 - Fiebig, Juliane T1 - Twisted gastrulation - ein BMP-Modulatorprotein mit dualer Funktionalität T1 - Twisted gastrulation - a BMP-specific modulator with dual functionality N2 - Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) sind extrazellulär vorkommende Wachstumsfaktoren und werden der Superfamilie der Transforming Growth Factors β (TGF-β) zugeordnet. Entgegen ihrem Namen spielen sie nicht nur eine Rolle bei der Ausbildung und Regeneration der Knochenmatrix, sondern regulieren bereits während der Embryonalentwicklung zahlreiche Abläufe. Unter anderem sind sie an der Festlegung der Körperachsen und Entwicklung der Organanlagen beteiligt. Später steuern sie das Wachstum von Organen und Geweben und sind schließlich im adulten Organismus für deren Homöostase und Regeneration verantwortlich. Bei fast allen Mitgliedern der TGF-β Superfamilie erfolgt die Signalbildung nach derzeitigem Kenntnisstand durch die Bindung an transmembrane Serin/Threonin-Kinaserezeptoren, die in zwei Untergruppen unterteilt werden können. Dabei werden von einem Liganden jeweils zwei Typ I- und zwei Typ II-Rezeptoren gebunden, wodurch ein aktiver Komplex entsteht, der im Inneren der Zelle eine Signalkaskade auslöst. Um die vielseitigen Aufgaben der BMPs spezifisch vermitteln zu können, gibt es zahlreiche Mechanismen, die Signalbildung stringent neben der Ligand-Rezeptor-Interaktion zu regulieren. Die Small Mothers Against Decapentaplegic (Smad)-Signalkaskade im Zellinneren wird beispielsweise durch die Interaktion der inhibitorischen Smads mit rezeptor-regulierten Smads oder durch den proteasomalen Abbau der rezeptor-regulierten Smads durch die Bindung von Ubiquitin-Ligasen der Smurf-Familie beeinflusst. Auch auf Membranebene besteht die Möglichkeit der negativen Signalmodulation durch Pseudorezeptoren oder der Verstärkung der Signalbildung durch positive Effektoren wie beispielsweise aktivitätssteigernde Co-Rezeptoren. Ein Charakteristikum der TGF-β Superfamilie stellt jedoch die Vielzahl an sekretierten, löslichen Modulatorproteinen dar. Die meist glykosylierten Proteine üben, bis auf wenige Ausnahmen, einen antagonistischen Effekt auf die BMPs aus. Bei dem BMP-spezifischen Modulatorprotein Twisted gastrulation handelt es sich um ein extrazelluläres Glykoprotein, das im Gegensatz zu den meisten anderen BMP-Modulatoren jedoch eine duale Funktion als Besonderheit aufweist. Es zeigt zum einen eine anti-BMP-Wirkung, indem es den BMP-inhibierenden Einfluss von Chordin durch Bildung eines stabilen ternären Komplexes verstärkt; andererseits kann Twisted gastrulation in Gegenwart spezifischer Metalloproteasen eine proteolytische Spaltung von Chordin und die anschließende Freisetzung von aktivem BMP fördern und so eine BMP-Aktivität vermittelnde Wirkung aufweisen. Twisted gastrulation hat keine beziehungsweise nur eine äußerst geringe Homologie zu anderen (Modulator)Proteinen. Um daher den komplexen Wirkmechanismus detailliert molekular beschreiben zu können, ist die Aufklärung der Struktur /Funktions-beziehungen essentiell. Im Rahmen dieser Arbeit konnten unterschiedliche Expressionsstrategien für die rekombinante Herstellung von Twisted gastrulation etabliert werden, welche eine umfassende Charakterisierung des Proteins in vitro ermöglichen. Erste Kristallisationsversuche von isoliertem Twisted gastrulation für die Aufklärung der dreidimensionalen Struktur mittels Röntgenbeugung verliefen ohne Erfolg, allerdings gelang die Präparation stabiler ternärer Proteinkomplexe für weiterführende Kristallisationsansätze. Hochdurchsatzverfahren für die Expression und Interaktionsanalyse erlauben zudem die Untersuchung einer Vielzahl von Twisted gastrulation-Proteinvarianten. Auf diese Weise konnten Aminosäuren identifiziert werden, die an der Wechselwirkung von Twisted gastrulation mit seinem Interaktionspartner BMP 2 beteiligt sind. Dies ermöglichte eine detaillierte Lokalisation des Bindeepitops im N-terminalen Bereich von Twisted gastrulation. Dabei konnte auch gezeigt werden, dass die Glykosylierung von Twisted gastrulation für die Wechselwirkung mit BMP-2 von Bedeutung ist. Eine experimentelle Strukturanalyse von Twisted gastrulation für die detaillierte Aufklärung des Mechanismus der Interaktion mit BMP-2 und anderen Modulatorproteinen bleibt allerdings weiterhin aufgrund der Einzigartigkeit dieses Modulatorproteins zwingend erforderlich. Für eine Fortsetzung der Untersuchungen bietet der stabile ternäre Komplex eine gute Voraussetzung in Hinblick auf weitere Kristallisationsansätze. N2 - Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) are secreted growth factors belonging to the superfamily of Transforming Growth Factors β (TGF-β). In contrast to their name they are not only involved in bone morphogenesis and regeneration, but also regulate numerous events during embryonic development. Furthermore, they play a key role in body axis determination, embryonic patterning as well as organogenesis, later in the adult organism these factors control organ and tissue homeostasis and regeneration. At the current state of research all classical members of the TGF-β family signal through transmembrane serine/threonine kinase receptors, which can be subdivided into type I- and type II-receptors. For receptor activation the ligand induces receptor heteromerisation forming an active complex containing type I- and type II-receptors which subsequently triggers intracellular signaling cascades. To ensure highly specific signaling a complex network of regulatory mechanisms has evolved. The Small Mothers Against Decapentaplegic (Smad) signaling cascade for example is modulated by inhibitory Smads interacting with the receptor-regulated Smads or through proteasomal degradation of the receptor-regulated Smads by binding to ubiquitin-ligases of the Smurf-family. In the membrane, pseudoreceptors such as BAMBI lacking a kinase domain or GPI-anchored co-receptors such as the RGM-receptor family or Cripto can positively or negatively regulate BMP/TGF-β signaling. A highlight of the TGF-β superfamily is the multitude of different secreted soluble modulator proteins. Most present glycoproteins, which act as BMP-antagonists by interfering with BMP-signaling. The BMP-specific modulator Twisted gastrulation is such an extracellular glycoprotein, which however features an unique dual function. On the one hand, by forming a stable ternary complex it strongly enhances the BMP-antagonizing (anti-BMP) activity of another BMP-modulator Chordin. On the other hand, upon proteolytic processing of Chordin in this ternary complex in the presence of specific metalloproteases such as Tolloid, Twisted gastrulation facilitates the dissociation of the ternary complex releasing active BMP an thereby exerts a pro (moting) BMP-activity. Twisted gastrulation exhibits very low if at all any homology to other proteins and seems also unique among the large variety of BMP-modulator proteins. To understand its dual mode of action on a molecular level analysis of the structure/function-relationship is a pre-requisite. In this project we have established different strategies for recombinant production of Twisted gastrulation for a comprehensive in vitro characterization. Although crystallization of Twisted gastrulation for X-ray diffraction analysis failed, we could successfully prepare stable ternary complexes consisting BMP-2, a type II-receptor and Twisted gastrulation which are ideally suited for protein crystallization. High-throughput expression and interaction-analysis schemes allowed us to study a multitude of single amino acid variants of Twisted gastrulation. This resulted in the identification of several amino acid residues in Twisted gastrulation, which form the binding epitope for BMP-2 confirming its supposed location in the N-terminal half of Twisted gastrulation. We could also show that the N-glycosylation of Twisted gastrulation is involved in high-affinity BMP binding and required for its BMP-modulatory activity in vivo. For a full analysis of its molecular mechanism of BMP-2 interaction and its interplay with other modulator proteins, a structure analysis of Twisted gastrulation is required in the near future. Providing efficient recombinant sources and the preparation of stable ternary complexes will likely facilitate this. KW - Knochen-Morphogenese-Proteine KW - Twisted gastrulation KW - Bone Morphogenetic Proteins KW - Transforming Growth Factor KW - Gastrulation Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-107270 ER - TY - THES A1 - Hartmann, Sonja T1 - Relevance of antibodies targeting the beta1-adrenergic receptor for renal function T1 - Relevanz von Antikörpern gegen den beta1-adrenergen Rezeptor für die Nierenfunktion N2 - Functionally active (conformational) autoantibodies directed against the β1-adrenergic receptor (β1-AR) are supposed to have a pathogenic relevance in human heart failure, particularly in idiopathic dilated cardiomyopathy (DCM). Prevalence of anti-β1-autoantibodies (anti-β1-aabs) in the healthy population is almost negligible, whereas it amounts to up to 30% in heart failure patients with idiopathic DCM. As β1-ARs are not restricted to the heart and are also highly expressed in particular segments of the nephron, it is conceivable that such autoantibodies might also affect kidney function to some extent through the activation of renal β1-ARs. In the kidney, β1-ARs are highly abundant in the juxtaglomerular apparatus, the distal convoluted tubules, the collecting duct, and the renal arteries. However, the functional significance of β1-ARs at these particular sites along the nephron is poorly understood, as are the effects of conformational stimulating anti-β1-aabs on renal β1-ARs. From the available literature, it is well known that the β1-adrenergic system is involved in, e.g., the regulation of renin-secretion from juxtaglomerular cells. In addition, the β1-adrenergic system is thought to be involved in the regulation of the urine pH via type B-intercalated cells in the collecting duct. In contrast, the regulation of salt- and fluid-secretion in the medullary collecting duct appears to occur independently from the SNS. As a consequence, the present work aimed to unravel the potential pathophysiological links between renal function, alterations in the cardiovascular system, and circulating agonist-like anti- β1-abs. We analyzed possible renal effects of anti-β1-abs in a human-analogous rat model. After immunization with a GST-fusion protein containing the second extracellular loop (β1-ECII) of the human β1-AR, Lewis-rats develop functionally active, stimulating, conformational anti-β1-ECII-abs. Within the first 6 months, anti-β1-ECII-ab-positive animals develop a hypertensive phenotype, which after 9 months evolves into a DCM phenotype. In n=40 GST/ β1-ECII-immunized Lewis rats and n=40 age-matched, 0.9% NaCl-injected control animals, we sequentially (i.e. at months 1, 2, 3, 6, 9, 12, 15, and 18 after start of immunization) analyzed the changes in renal function on a molecular, functional, and structural level. We could show that the presence of stimulating anti-β1-ECII-abs – even though having detrimental effects on the heart – has only a minor impact on kidney function and structure. Within the first 3 months after induction of anti-β1-ECII-abs, the levels and activity of renin were significantly increased in immunized compared to corresponding control animals, which was confirmed by experiments on isolated perfused kidneys, in which anti-β1-ECII-abs were able to directly induce the liberation of renin. However, within several weeks the initial anti-β1-ECII-ab-mediated RAAS activation was counter-regulated by auto-regulatory mechanisms activated in the kidney. Similarly, glomerular filtration rate (GFR) and renal blood flow (RBF) were initially decreased in the presence of the stimulating anti-β1-ECII-abs, but returned to control values within 3 months after immunization of the animals. Although expression of several pro-fibrotic markers was significantly up-regulated in anti-β1-ECII-ab-positive rats, no significant differences were noted on a histomorphological level with regard to the occurrence of renal fibrosis, glomerular damage, tubular damage, and perivascular fibrosis. Only a mild decrease in glomerular filtration function was observed in the kidneys of anti-β1-ECII-ab-positive animals from immunization-month 12 on, apparent by increased levels of urinary protein. Even though anti-β1-ECII-abs were able to induce mild changes in renal function, their effects were not strong enough to critically damage the kidneys in our rat-model. Differences between immunized anti-β1-ECII-ab-positive and corresponding control rats at later time-points (that is, from immunization-month 12 on) are most likely secondary to the progressive heart failure phenotype that immunized animals develop in the course of the experiment. The present study is the first to focus on the effects of stimulating anti-β1-ECII-abs on the kidney, and on the prevalence of these effects for the heart (referred to as cardio-renal crosstalk). Although our results were obtained in a rat model, they might contribute to better understand the situation in anti-β1-AR-aab-positive human patients. Following the results of our experiments, treatment of such patients should focus on direct and specific neutralization/elimination of stimulating anti-β1-ECII-aab or at least comprise therapeutic strategies that counteract the anti-β1-ECII-aab-effects on the heart by standard treatment for heart failure (i.e. ACE inhibitors, AT1-receptor blockers, and β-blockers) according to current guidelines. N2 - Funktionell aktive, konformationelle Autoantikörper, die gegen den β1-adrenergen Rezeptor (β1-AR) gerichtet sind, sind vermutlich pathologisch relevant bei Herzinsuffizienz, insbesondere bei der idiopathischen Dilativen Kardiomyopathie (DCM). Die Prävalenz solcher Antikörper ist in der gesunden Population vernachlässigbar, wohingegen sie bei der idiopathischen DCM 30% erreicht. Da β1-AR nicht nur im Herzen, sondern auch in der Niere stark exprimiert werden, ist naheliegend, dass solche Antikörper über eine Stimulation renaler β1-AR auch die Nierenfunktion beeinflussen können. In der Niere werden β1-AR überwiegend im juxtaglomerulären Apparat, im distalen Tubulus, in den Sammelrohren und in den renalen Arterien exprimiert. Die Bedeutung der in diesen Bereichen hohen Expression von β1-AR für die Nierenfunktion ist noch nicht vollständig geklärt, ebenso wie die renalen Effekte von stimulierenden β1-AR-Antikörpern. Aus der Literatur ist bekannt, dass das β1-adrenerge System unter anderem an der Renin-Sekretion der juxtaglomerulären Zellen beteiligt ist. Außerdem wird vermutet, dass das β1-adrenerge System in die Regulation des pH-Wertes des Urins über die Typ B-interkalierenden Zellen des Sammelrohrs eingreift, wohingegen die Regulation der Salz- und Wasserexkretion im medullären Sammelrohr wahrscheinlich unabhängig vom sympathischen Nervensystem abläuft. Die vorliegende Arbeit zielt darauf ab, die potentiellen pathophysiologischen Zusammenhänge zwischen renaler Funktion, Änderungen innerhalb des kardiovaskulären Systems und zirkulierenden, agonist-ähnlichen anti-β1-Autoantikörpern darzustellen. Wir haben die möglichen renalen Effekte der anti-β1-AK in einem human-ähnlichen Ratten-Modell untersucht. Nach Immunisierung mit einem GST-Fusionsprotein, welches den zweiten extrazellulären Loop des β1-AR beinhaltet, entwickeln Lewis-Ratten funktionell aktive, stimulierende Antikörper gegen β1-ECII. Anti-β1-ECII-AK-positive Tiere entwickeln nach ca. 6 Monaten einen hypertensiven Phänotyp, welcher nach 9 Monaten in einen DCM Phänotyp übergeht. Wir haben Änderungen der renalen Funktion auf molekularer, funktioneller, und struktureller Ebene in n=40 GST/ β1-ECII-immunisierten Lewis-Ratten und n=40 altersgleichen 0.9% NaCl-injizierten Kontrolltieren sequenziell (d.h. 1, 2, 3, 6, 9, 12, 15 und 18 Monate nach Beginn der Immunisierung) analysiert. Wir konnten zeigen, dass die stimulierenden anti-β1-ECII-Antikörper – obwohl sie eine schädigende Wirkung auf das Herz haben – die Nierenfunktion und -Struktur nur gering beeinflussen. In den ersten Monaten nach Induktion der anti-β1-ECII-AK stieg die Reninkonzentration und -aktivität in den immunisierten Tieren im Vergleich zu den entsprechenden Kontrollen signifikant an. Dieses Ergebnis konnte im Model der isolierten perfundierten Niere bestätigen werden, in dem anti-β1-ECII-AK eine direkte Freisetzung von Renin induzierten. Diese frühe AK-vermittelte Aktivierung des RAAS wurde jedoch innerhalb weniger Wochen durch autoregulatorische Mechanismen der Niere aufgehoben. Ebenso waren anfangs die glomeruläre Filtrationsrate und der renale Blutfluss in anti-β1-ECII-AK-positiven Ratten vermindert, kehrten jedoch nach 3 Monaten zu den Werten der Kontrolltiere zurück. Obwohl die Expression mehrerer pro-fibrotischer Marker signifikant erhöht war, konnten keine signifikanten Veränderungen auf histomorphologischer Ebene hinsichtlich des Auftretens renaler Fibrose, glomerulärer und tubulärer Schädigung, oder perivaskulärer Fibrose festgestellt werden. Lediglich die glomeruläre Filtrationsfunktion war ab dem 12. Immunisierungsmonat zunehmend beeinträchtigt, was sich an einer progredienten Proteinurie zeigte. Obwohl anti-β1-ECII-AK durchaus einen gewissen Effekt auf die Nierenfunktion haben, ist ihr Einfluss nicht stark genug um die Niere kritisch zu schädigen. Unterschiede zwischen immunisierten und Kontrolltieren, welche zu späteren Zeitpunkten (d.h. ab dem 12. Immunisierungsmonat) auftreten, sind wahrscheinlich sekundäre Effekte der progredienten Herzinsuffizienz, die die immunisierten Tiere im Verlauf des Experiments entwickeln. Unsere Studie ist die Erste, die sich mit den Effekten von stimulierenden anti-β1-AK auf die Niere und ihre Zusammenhänge mit der antikörper-induzierten Herzinsuffizienz (dem sogenannten kardio-renalen „Crosstalk“) befasst. Obwohl unsere Ergebnisse in einem Tiermodell erzielt wurden, könnten sie von großem Nutzen sein, um die Krankheitsentwicklung von anti-β1-Autoantikörper-positiven Patienten besser zu verstehen. Unseren Ergebnissen zufolge sollte die Behandlung von Autoimmun-DCM auf eine möglichst direkte und spezifische Neutralisierung/Eliminierung von anti-β1-Autoantikörpern abzielen und gleichzeitig alle kardio- und renal-protektiven Elemente der Standard-Therapie der Herzinsuffizienz (d.h. Gabe von ACE-Hemmern, AT1-Rezeptor-Inhibitoren und β-Blockern) einschließen. KW - Nierenfunktion KW - Beta-1-Rezeptor KW - kidney KW - Antikörper KW - beta1-adrenergic receptor KW - antibodies Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-106285 ER - TY - THES A1 - Rienmüller, Florian Christian T1 - Untersuchung der oxidativen und pH-abhängigen Regulation der vakuolären Protonen-ATPase und calciumabhängigen vakuolären Membranleitfähigkeiten von Arabidopsis thaliana T1 - Investigation of the oxidative and pH dependent regulation of vacuolar proton-ATPase and calcium dependent vacuolar membrane conductance of Arabidopsis thaliana N2 - Im Rahmen der hier vorliegenden Arbeit konnten neue Erkenntnisse zur oxidativen, pH- und ATP-abhängigen Regulation der V-ATPase-Funktion in Mesophyllvakuolen von A. thaliana erarbeitet werden. Dazu wurden Patch-Clamp-Experimente an der vakuolären Protonen-ATPase durchgeführt, die eine elektrophysiologische Untersuchung der Protonentransporteigenschaften und deren Regulation ermöglichten. Zusätzlich gestattete die Anwendung von intrazellulären Mikroelektroden zusammen mit einem Fluoreszenz-Bildgebungsverfahren an intakten Wurzelrhizodermiszellen von A. thaliana Keimlingen die in vivo Untersuchung von vakuolären Membranleitfähigkeiten und deren Regulation durch cytosolisches Calcium. Durch die Patch-Clamp-Technik konnte die Spannungsabhängigkeit der V-ATPase bei verschiedenen luminalen pH-Werten erfasst werden. Mit Hilfe thermodynamischer Berechnungen konnte daraus eine Abnahme der Protonentransportrate pro hydrolysiertem ATP-Molekül bei gleichzeitigem Anstieg der vakuolären Protonenkonzentration berechnet werden. Durch die Kombination verschiedener pH-Werte in Cytosol bzw. Vakuole und zusätzlich ansteigenden ATP-Konzentrationen konnten tiefere Einblicke in die pH-abhängige Regulation der V-ATPase-Aktivität erlangt werden. Es konnte aufgezeigt werden, dass eine Abweichung des vakuolären pH-Wertes wesentlich stärker auf die ATP-Bindungsaffinität und Transportkapazität des Enzyms wirkt, als Änderungen der Protonenkonzentration auf cytosolischer Seite. Daraus konnte abgeleitet werden, dass cytosolische bzw. luminale pH-Änderungen auf das gesamte Membran-durchquerende Enzym wirken und jeweils auf die andere Membranseite der V-ATPase weitergegeben werden. Zusätzlich wurden die in dieser Arbeit erhobenen Daten zur V-ATPase im Rahmen einer Zusammenarbeit von Prof. Dr. Ingo Dreyer (Universidad Politecnica, Madrid, Spanien) für die Erstellung eines mathematischen Modells genutzt. Es untermauert einen Rückkopplungsmechanismus der Protonenkonzentration auf die maximale Protonentransportrate (vmax) und die ATP-Affinität (Km) und schlägt eine pH-abhängige Dissoziation der Protonen von der V-ATPase, auch unter ungünstigen intrazellulären Bedingungen, vor. Die Ausweitung der Regulationsstudien unter Einbeziehung verschiedener Mutanten konnte in Zusammenarbeit mit Jun. Prof. Dr. Thorsten Seidel und Mitarbeitern (Universität Bielefeld, Deutschland) eine oxidative Inhibierung der V-ATPase-Aktivität durch den Wegfall von Disulfidbrücken innerhalb des Pumpproteins erfassen und mögliche Auswirkungen von Disulfidbindungen auf die Protonenkopplungsrate aufzeigen. Mit Hilfe von intrazellulären Mikroelektroden konnte im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit der Nachweis erbracht werden, dass vakuoläre Leitfähigkeiten von Atrichoblasten in A. thaliana durch Stressfaktoren – verursacht durch den Einstich von intrazellulären Mikroelektroden – deutliche Veränderungen zeigen. Durch die Kombination der Zwei-Elektroden-Spannungsklemme mit einem Fluoreszenz-Bildgebungsverfahren konnte eine Methode zur simultanen Aufzeichnung von Calciumänderungen und elektrischen Membranleitfähigkeiten an Trichoblastenvakuolen entwickelt werden. Dadurch konnte in weiterführenden Untersuchungen in vivo nachgewiesen werden, dass ein transienter Anstieg der cytosolischen Calciumkonzentration zu einer reversiblen Zunahme der Ströme von vakuolären Membranleitfähigkeiten führt, deren unbekannter Ursprung allerdings bereits bekannten Transportproteinen noch zugeordnet werden muss. N2 - This dissertation provides new insights into the oxidative, pH- and ATP-dependent regulation of the V-ATPase function in A. thaliana. For this purpose the proton transport and its regulation was examined electrophysiologically by patch-clamp experiments on mesophyll cells. Additionally intracellular microelectrodes combined with the application of fluorescence imaging on intact root epidermal cells of A. thaliana seedlings allowed investigation of vacuolar membrane conductance and their regulation via cytosolic calcium in vivo. The voltage dependency of the V-ATPase was recorded at various luminal pH values by the patch-clamp technique. Furthermore thermodynamic calculations showed a decrease of the proton transport rate per hydrolyzed ATP molecule due to an increase of the vacuolar proton concentration. Different cytosolic and vacuolar pH-values combined with increasing ATP-concentrations also provided deeper insights into the principles of the pH dependent regulation of the V-ATPase activity. Changes in the cytosolic and luminal pH values on either side of the membrane were found to affect the entire function of the enzyme and thus seem to be transferred to the other side within the V-ATPase. Additionally the data of this dissertation was used by Prof. Dr. Ingo Dreyer (University Politecnica, Madrid, Spain) in the context of cooperation to create a mathematic model. It confirms a feedback system of the proton concentration on the maximum proton transport rate (vmax) and the ATP binding affinity (Km). This model proposes a pH-dependent dissociation of the protons from the V-ATPase also under unfavorable intracellular conditions. Further examinations of the V-ATPase regulation with different mutants in collaboration with Jun. Prof. Dr. Thorsten Seidel and co-workers (University of Bielefeld, Germany) revealed oxidative inhibition of V-ATPase activity due to the removal of disulfide-bond formation within the pump protein. Additionally a possible effect of disulfide-bridge formation on proton coupling rate was shown. The intracellular microelectrode measurements on intact root cells in the second part demonstrate that changes in the vacuolar membrane conductance of A. thaliana atrichoblasts are related to stress factors caused by the impalement of the electrodes. Further studies by a new method combining the application of fluorescence imaging with the two-electrode voltage-clamp allowed recording of calcium changes and electric membrane conductance within trichoblasts simultaneously. As a result it could be shown that a transient rise of cytosolic calcium is linked to increasing currents of vacuolar membrane conductances in vivo. The unknown origin of these conductances however has to be dedicated to known transport proteins. KW - Ackerschmalwand KW - oxidative and pH dependent regulation KW - Biomembran KW - V-ATPasen KW - Leitfähigkeit KW - vacuolar proton-ATPase KW - calcium dependent membrane conductance KW - oxidative and pH dependent regulation KW - oxidative und pH-abhängige Regulation KW - calciumabhängige Membranleitfähigkeiten KW - Arabidopsis thaliana Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-104891 ER - TY - THES A1 - Zhang, Yi T1 - Regulation of Agrobacterial Oncogene Expression in Host Plants T1 - Regulierung der Expression der Onkogene aus Agrobakterien in Wirtspflanzen N2 - Virulent Agrobacterium tumefaciens strains transfer and integrate a DNA region of the tumor-inducing (Ti) plasmid, the T-DNA, into the plant genome and thereby cause crown gall disease. The most essential genes required for crown gall development are the T-DNA-encoded oncogenes, IaaH (indole-3-acetamide hydrolase), IaaM (tryptophan monooxygenase) for auxin, and Ipt (isopentenyl transferase) for cytokinin biosynthesis. When these oncogenes are expressed in the host cell, the levels of auxin and cytokinin increase and cause cell proliferation. The aim of this study was to unravel the molecular mechanisms, which regulate expression of the agrobacterial oncogenes in plant cells. Transcripts of the three oncogenes were expressed in Arabidopsis thaliana crown galls induced by A. tumefaciens strain C58 and the intergenic regions (IGRs) between their coding sequences (CDS) were proven to have promoter activity in plant cells. These promoters possess eukaryotic sequence structures and contain cis-regulatory elements for the binding of plant transcription factors. The high-throughput protoplast transactivation (PTA) system was used and identified the Arabidopsis thaliana transcription factors WRKY18, WRKY40, WRKY60 and ARF5 to activate the Ipt oncogene promoter. No transcription factor promoted the activity of the IaaH and IaaM promoters, despite the fact that the sequences contained binding elements for type B ARR transcription factors. Likewise, the treatment of Arabidopsis mesophyll protoplasts with cytokinin (trans-zeatin) and auxin (1-NAA) exerted no positive effect on IaaH and IaaM promoter activity. In contrast, the Ipt promoter strongly responded to a treatment with auxin and only modestly to cytokinin. The three Arabidopsis WRKYs play a role in crown gall development as the wrky mutants developed smaller crown galls than wild-type plants. The WRKY40 and WRKY60 genes responded very quickly to pathogen infection, two and four hours post infection, respectively. Transcription of the WRKY18 gene was induced upon buffer infiltration, which implicates a response to wounding. The three WRKY proteins interacted with ARF5 and with each other in the plant nucleus, but only WRKY40 together with ARF5 increased activation of the Ipt promoter. Moreover, ARF5 activated the Ipt promoter in an auxin-dependent manner. The severe developmental phenotype of the arf5 mutant prevented studies on crown gall development, nevertheless, the reduced crown gall growth on the transport inhibitor response 1 (TIR1) tir1 mutant, lacking the auxin sensor, suggested that auxin signaling is required for optimal crown gall development. In conclusion, A. tumefaciens recruits the pathogen defense related WRKY40 pathway to activate Ipt expression in T-DNA-transformed plant cells. IaaH and IaaM gene expression seems not to be controlled by transcriptional activators, but the increasing auxin levels are signaled via ARF5. The auxin-depended activation of ARF5 boosts expression of the Ipt gene in combination with WRKY40 to increase cytokinin levels and induce crown gall development. N2 - Virulente Bakterien des Stamms Agrobakterium tumefaciens, transferieren und integrieren einen Teil ihrer DNA, die T-DNA aus dem Tumor induzierenden Plasmid (Ti), in das Pflanzengenom. Dadurch wird die Tumorbildung induziert und die Krankheit bricht aus. Die wichtigsten Gene, die für die Entwicklung eines Tumors benötigt werden, sind auf der T-DNA lokalisierte Onkogene: IaaH (indole-3-aceetamide hydrolase), IaaM (tryptophan monooxygenase) für die Auxin Biosynthese und Ipt (isopentenyl transferase) für die Cytokinin Biosynthese. Werden diese Onkogene in der Wirtszelle exprimiert, steigt der Gehalt an Auxin und Cytokinin und fördert die Zellteilung. Das Ziel dieser Arbeit war es die molekularen Mechanismen, die die Expression der agrobakteriellen Onkogene in Pflanzenzellen regulieren, aufzuklären. Transkripte der drei Onkogene wurden in Tumoren an Arabidopsis thaliana exprimiert. Die Tumore wurden durch den A. tumefaciens Stamm C58 induziert. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Sequenzabschnitte zwischen den Onkogenen (IGRs: intergenic regions) eine Promoteraktivität in der Pflanzenzelle besitzen. Diese Promoter haben eukaryotische Sequenzstrukturen und enthalten cis-Elemente, an die pflanzliche Transkriptionsfaktoren binden. Mit Hilfe der PTA (high-throughput protoplast transactivation) Methode wurden die pflanzlichen Transkriptionsfaktoren WRKY18, WRKY40, WRKY60 und ARF5 von Arabidopsis thaliana identifiziert, welche den Promoter des Ipt Onkogens aktivieren. Für IaaH und IaaM konnte kein Transkriptionsfaktor, der die Promotersequenzen aktiviert, identifiziert werden, obwohl die Promotersequenzen Bindedomänen für den Typ B ARR Transkriptionsfaktor enthalten. Ebenso zeigte die Behandlung von Arabidopsis Protoplasten aus dem Mesophyll mit Cytokinin (trans-zeatin) und Auxin (1-NAA) keinen positiven Effekt auf die Aktivität des IaaH und des IaaM Promoters, wohingegen der Ipt Promoter stark auf eine Behandlung mit Auxin und leicht auf eine Behandlung mit Cytokinin reagierte. Die drei WRKYs aus Arabidopsis spielen eine Rolle in der Tumorentwicklung, da die wrky Mutante kleinere Tumore zeigt, als die Wild Typ Pflanzen. Die Gene WRKY40 und WRKY60 reagieren sehr schnell, innerhalb von zwei, beziehungsweise vier Stunden, auf eine Pathogen Infektion. Die Transkription des WRKY18 Gens wurde durch die Infiltration von Puffer in Blätter induziert, dies lässt auf eine Reaktion im Zusammenhang mit Wunderzeugung schließen. Die drei WRKY Proteine interagieren mit einander und mit ARF5 im Zellekern der Pflanzenzelle, aber nur WRKY40 und ARF5 können gemeinsam den Ipt Promoter aktivieren. Zusätzlich kann ARF5 den Ipt Promoter, in Abhängigkeit von Auxin, aktivieren. Wegen starker Entwicklungsstörungen der arf5 Mutante, konnte das Tumorwachstum an dieser Mutante nicht untersucht werden. Das reduzierte Tumorwachstum an der tri1 (transport inhibitor response, TIR) Mutante, der ein Auxinsensor fehlt, deutet auf die Notwendigkeit des Auxinsignalwegs für optimales Tumorwachstum hin. Zusammengefasst benutzt A. tumefaciens den WRKY40 Signalweg, der mit der Pathogen Abwehr verbunden ist, um die Ipt Expression in der mit T-DNA transformierten Pflanzenzelle zu aktivieren. Die Genexpression von IaaH und IaaM schein nicht von Transkriptionsfaktoren abhängig zu sein, aber erhöhte Auxin Werte werden von ARF5 erkannt. Die Auxin abhängige Aktivierung von ARF5 verstärkt die Expression des Ipt Gens gemeinsam mit WRKY40 um die Cytokin Werte in der Pflanzenzelle zu erhöhen und somit die Tumorentwicklung einzuleiten. KW - Agrobacterium tumefaciens KW - Transcription factor KW - Onkogen KW - Genexpression KW - Oncogene KW - Regulation Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-102578 ER - TY - THES A1 - Dally, Iris T1 - Entwicklung eines bioartifiziellen Rekonstruktionsgewebes für die Luftröhrenchirugie und Umsetzung in einen GMP-Prozess T1 - Development of a bioartificial tissue for reconstruction of the trachea and its implementation in a GMP process N2 - Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines vaskularisierten, autologen Implantats zur Behandlung von schweren Verletzungen der Trachea im Umfeld der guten Herstellungspraxis. Die Matrix besteht aus einem circa 14 cm langen Stück porcinen, azellularisierten Dünndarm und BioVaSc (Biological Vascularized Scaffold) genannt wird. Dieses wird dann mit isolierten und kultivierten Zellen des Patienten besiedelt und reift für zwei Wochen in einem speziell hierfür entwickelten Bioreaktorsystem. Danach erfolgt die Analyse bzw. die Implantation in den Patienten. Nach der Präparation und Überprüfung der Qualität, erfolgte die Azellularisierung der BioVaSc zur Entfernung der porcinen Zellen und der enzymatische Abbau der DNS, unter Erhalt des natürlichen Gefäßsystems. Hierfür ist Natriumdesoxycholat verwendet worden, wobei Rückstände davon das Ansiedeln der autologen Zellen negativ beeinflussen könnten. Deshalb wurde ein Test etabliert, mit dessen Hilfe, das Auswaschen der Azellularisierungsdetergenz bis zur Sterilisation nachweisbar war. Des Weiteren könnten in der BioVaSc natürlicherweise enthaltene Endotoxine Immunreaktionen im späteren Empfänger auslösen. Die gesetzlichen Grenzwerte konnten durch Modifikationen des Protokolls, unter Berücksichtigung der guten Herstellungspraxis, erreicht werden. Weiterhin konnte histologisch eine weitgehende DNS- und Zellfreiheit nachgewiesen werden, in der quantitativen Analyse ergab sich eine Abreicherung von 97% im Vergleich zum Ausgangsmaterial. Zur Bestimmung der funktionellen Stabilität der azellularisierten Matrix wurde die maximal tolerable Zugspannung bestimmt. Zur Besiedlung der Gefäße der Matrix wurden mikrovaskuläre Endothelzellen und für das Lumen Fibroblasten und Skelettmuskelzellen verwendet. Die Protokolle zur Isolation und Kultur sind hierzu unter den Bedingungen der guten Herstellungspraxis etabliert, optimiert und mit, soweit möglich, zertifizierten Reagenzien durchgeführt worden. Zur genauen Charakterisierung der Zellen wurden diese immunhistologisch über vier Passagen analysiert, wobei sich je nach Zelltyp und Differenzierungsstadium unterschiedliche Expressionsmuster ergaben. Zur Herstellung des autologen Implantats wurden zunächst die mikrovaskulären Endothelzellen in das vorhandene Gefäßsystem der BioVaSc eingebracht und dann für sieben Tage im etablierten Bioreaktorsystem kultiviert. Danach erfolgte die Besiedlung des Lumens mit Skelettmuskelzellen und Fibroblasten und die weitere siebentägige Kultur im Bioreaktorsystem. Die Besiedlung des Gefäßsystems musste optimiert werden, um sowohl die Besiedlungsdichte zu steigern als auch die Effizienz zu erhöhen. Das Lumen konnte mit der etablierten Methode vollständig besiedelt werden. Nach vierzehntägiger Kultur im Bioreaktorsystem erfolgte die Kontrolle der Zellvitalität, wobei sowohl in den Gefäßstrukturen als auch im Lumen der BioVaSc vitale Zellen nachweisbar waren. Histologische Analysen zeigten, dass die mikrovaskulären Endothelzellen in den verbliebenen vaskulären Strukturen CD31 und den vWF exprimieren. Wohingegen die histologische Unterscheidung zwischen Fibroblasten und Skelettmuskelzellen nicht möglich ist. Zusätzlich wurde die BioVaSc mit upcyte mvEC der Firma Medicyte besiedelt. Nach der vierzehntägigen Kultur im Bioreaktorsystem waren die Zellen sowohl in den Gefäßstrukturen als auch im Lumen und im Bindegewebe vital nachweisbar. In der histologischen Analyse konnte die Ausbildung von CD31, eNOS und vWF nachgewiesen werden. Des Weiteren wurde die Matrix mit mesenchymalen Stammzellen besiedelt, um zu analysieren, ob die Scherkräfte die Ausbildung endothelialer Marker stimulieren können. Nach vierzehntägiger Kultur konnte in den histologischen Analysen keine Ausbildung von CD31 oder dem vWF gefunden, allerdings vitale Zellen nachgewiesen werden. N2 - In this work, a vascularized implant for the treatment for tracheal defects was developed according to GMP standards. For this purpose, a part of porcine small intestine was prepared, decellularized and sterilized. The remaining matrix, trademarked BioVaSc “Biological, Vascularized Scaffold”, was colonized with isolated and cultured cells from the patient and then matured for two weeks in a bioreactor system. Finally, the prepared for implantation autologous implant was extensively characterized. After the integrity check of the vessel system the decellularization process was started, which is performed by removing the porcine cells with sodium desoxycholat and enzymatic degradation of the residual DNA. As traces of sodium desoxycholat could negatively affect the seeding of the autologous cells, a test was established to demonstrate the depletion of sodium desoxycholat to acceptable traces in the final matrix preparation. Furthermore, the porcine starting material for the BioVaSc contains endotoxins, which could trigger immune reactions in the recipient if not efficiently removed. The legal limit for endotoxine levels in pharmaceutical products could be achieved through modifications of the protocol. In order to establish a GMP compliant process, specially certified chemicals were used wherever possible. The protocol was optimized until histological analysis showed only few residual cells and DNA residues. The quantitative DNA analysis revealed a decrease of 97 % of the initial DNA content. To determine storage stability, a tensile test to check elasticity of the BioVaSc was established. To colonize the matrix, autologous microvascular endothelial cells, fibroblasts and skeletal muscle cells were used. The protocols were established and optimized under GMP conditions and, wherever possible, certified reagents were used. For accurate characterization of these cells, immunohistology analyses were performed at each of the four passages for all cell types. For the final manufacturing of the autologous implant, microvascular endothelial cells were introduced into the vascular system of the BioVaSc and were cultured for seven days in a custom made bioreactor system under defined shear stress conditions resembling the human blood pressure. This was followed by culturing of skeletal muscle cells and fibroblasts in the lumen of the gut, followed by an additional seven-day culture period. Colonization of the vascular system had to be optimized in order to increase the population density as well as the efficiency of reseeding. The lumen was fully populated with fibroblasts and skeletal muscle cells by the established protocol. However, the discrimination between fibroblasts and skeletal muscle cells with normal histology was difficult because no fitting antibody was available. After a two-week culture in the custom made bioreactor system the analysis showed vital cells in the vascular structures and in the lumen of the BioVaSc. Further histological analysis were performed. In order to explore alternative cell sources, the BioVaSc was reseeded with upcyte mvEC. These transfected cells are highly proliferative and show typical endothelial markers. After fourteen days of culture in the bioreactor system, cells could be detected in vascular structures, lumen and in connective tissue. Live / dead staining and MTT identified vital cells within vascular structures. The histological analysis revealed expression of CD31, eNOS and vWF. Furthermore, the matrix was reseeded with mesenchymal stem cells; to test if shear stress triggers differentiation into endothelial like cells. This was checked through displaying the corresponding endothelial markers in histological analyses. After fourteen days of culture in the bioreactor system, histological analyzes show no expression of CD31 or vWF factor. Vital cells could be detected. KW - Regenerative Medizin KW - Luftröhre KW - GMP-Regeln KW - bioartifizielles Rekonstruktionsgewebe KW - bioartificial tissue KW - Tissue Engineering KW - Advanced Therapy Medicinal Product KW - Arzneimittel für neuartige Therapien KW - windpipe KW - Trachea Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-98422 ER - TY - THES A1 - Gueta, Ronnie T1 - Untersuchungen zur Struktur und Funktion von Channelrhodopsinen T1 - Structural and functional analysis of channelrhodopsins N2 - Die zur Gruppe der mikrobiellen Rhodopsine gehörenden lichtaktivierbaren Ionenkanäle Channelrhodopsin 1 (ChR1) und Channelrhodopsin 2 (ChR2) aus dem Augenfleck von C. rheinhardtii sind Bestandteile des visuellen Systems und an der Phototaxis beteiligt. Sie bestehen aus einem zytosolisch gelegenen C Terminus, dessen Funktion noch ungeklärt ist und einem, für die Kanalaktivität verantwortlichen, N terminalen Bereich aus sieben Transmembranhelices. Der lichtsensitive Kofaktor all trans Retinal ist kovalent an einen Lysinrest (K257) der siebten Transmembranhelix gebunden. Bei einer Belichtung mit Blaulicht isomerisiert das Chromophor zur 13 cis Form, was eine Konformationsänderung und das Öffnen des Kanals zur Folge hat. Im Zuge dessen strömen ein und zweiwertige Kationen in die Zelle und eine Depolarisation findet statt. Um einen tieferen Einblick in Struktur und funktionelle Mechanismen zu bekommen, wurden Wildtyp und Mutanten von Ch1 und ChR2 heterolog in Oozyten von X. laevis exprimiert. In Bakteriorhodopsin bilden die Seitenketten von T90 und D115 eine für Stabilität und Funktion wichtige Wasserstoffbrücke aus. Durch elektrophysiologische, fluoreszenzmikroskopische und biochemische Verfahren wurden Mutanten der entsprechenden Reste in ChR2 (C128, D156) untersucht. Diese zeigten eine deutlich verlangsamte Kinetik und eine 10 bis 100fache Erhöhung der Lichtempfindlichkeit. Die identischen Auswirkungen von Mutationen beider Reste deuten auf eine Bindung mit funktioneller Bedeutung zwischen C128 und D156 hin. Im Falle von ChR2 C128T, C128A und D156A konnte der Kanal nach Anregung mit Blaulicht, durch grünes und violettes Licht vorzeitig geschlossen werden. Diese Lichtqualitäten entsprechen den Absorptionswellenlängen zweier Intermediate des Photozyklus von ChR2 (P390 und P520). Durch Veränderung des externen pH-Wertes konnten Hinweise auf eine protonenabhängige Gleichgewichtsreaktion dieser Intermediate gefunden werden. Auch in dem für Protonen höher leitfähigen ChR1 konnten Hinweise auf eine Interaktion zwischen den Resten C167 und D195 gefunden werden. Elektrische Messungen von Mutanten zeigten eine deutliche Erhöhung des Photostroms bei verhältnismäßig geringem Anstieg der Schließzeit. Der Einfluss dieser Mutationen auf die Kinetik war somit weniger ausgeprägt als bei ChR2. Einen besonderen Stellenwert unter allen Channelrhodopsin Mutanten nehmen ChR2 D156C und ChR1 D195C ein. Mit einem Photostrom von 5 µA bei ChR1 D195C und bis zu 50 µA bei ChR2 D156C konnten für diese die höchsten Photoströme aller bisher charakterisierten ChR1 bzw. ChR2 Varianten nachgewiesen werden. Durch fluoreszenzmikroskopische Quantifizierung konnte für alle im Rahmen dieser Arbeit erstellten ChR1 und ChR2 Mutanten eine erhöhte Proteinmenge sowohl in Anwesenheit als auch Abwesenheit zusätzlichen all trans Retinals während der Inkubation nachgewiesen werden. Die Fluoreszenzintensitäten korrelierten hierbei mit der Höhe der Stromamplituden und erreichten ein Maximum bei ChR2 D156C. Biochemische Experimente mit der Gesamtmembranfraktion von ChR2 exprimierenden Oozyten lieferten Hinweise auf eine dimere Quartärstruktur von Channelrhodopsinen, was durch die Kristallstruktur einer Chimäre aus ChR1 und ChR2 von (Kato et al., 2012) bestätigt wurde. Unter der Annahme, dass die Poren in den Proteomeren gebildet werden, konnte eine gegenseitige Beeinflussung der Regionen in heterodimeren Kanälen aus ChR2 Wildtyp und Mutanten aufgrund kinetischer Unterschiede bei kurzer und langer Belichtung oder der Verwendung von unterschiedlichen Lichtintensitäten nachgewiesen werden. Eine Voraussetzung für diesen Effekt ist eine synchrone Anregung beider Untereinheiten. Die Interaktion von Channelrhodopsin Untereinheiten konnte in vivo mithilfe der bimolekularen Fluoreszenzkomplementation nachgewiesen werden. Dabei zeigte sich, dass die Wechselwirkung nicht nur auf identische Untereinheiten in Homodimeren beschränkt ist, sondern auch bei Heterodimeren aus verschiedenen ChR2 Untereinheiten und sogar zwischen ChR2 und ChR1 möglich ist. N2 - The microbial type rhodopsins Channelrhodopsin 1 (ChR1) and Channelrhodopsin 2 (ChR2) are located in the eyespot of the green algae Chlamydomonas rheinhardtii. They are light activated cation channels and play an important role in phototaxis. They are comprised of a cytosolic C terminal part of unknown function and a transmembranal N terminal part responsible for channel activity. The latter consists of seven transmembrane helices and the chromophore all trans Retinal, which is bound covalently as a Schiff base to a lysine residue. When activated with blue light, the chromophore isomerizes to the 13 cis state, followed by a conformational change of the protein and opening of the channel. The resulting influx of mono and divalent cations leads to a depolarization of the cell. To get a deeper insight in structure and function of ChR1 and ChR2, wildtype and mutants have been heterologously expressed in oocytes of Xenopus laevis. In bacteriorhodopsin, a hydrogen bond between the amino acids T90 and D115 is vital for protein stability and proper pump function. Mutants of the corresponding amino acids in ChR2 (C128, D156) were generated and analyzed electrophysiologically. They displayed a significant deceleration of closing time and a 10 100fold increase in light sensitivity. The identical impact of these mutations on kinetics suggests an interaction between these residues, probably also by the formation of a hydrogen bond. In the case of ChR2 C128T, C128A and D156A closing could be accelerated via green and violet light application. These wavelengths correspond to the absorption wavelengths of the photointermediates P390 and P520 in the photocycle of ChR2. Furthermore, a possible proton-dependent equilibrium between these intermediates was identified by varying external proton concentrations. Electrophysiological analyses of C167 and D195 mutants in ChR1 hinted towards an interaction similar to the one between the homologous residues C128 and D156 in ChR2. Both, ChR1 C167 and ChR1 D195 displayed increased current amplitudes, accompanied by only a small increase in closing time. The impact of these mutations on channel kinetics was less pronounced than in ChR2. The mutants ChR2 D156C and ChR1 D195C are of particular importance. Photocurrent amplitudes of 5 µA for ChR1 and 50 µA for ChR2 at 100 mV render these mutants the ones with the highest current amplitudes of all channelrhodopsin variants characterized up till now. In comparison to wildtype channelrhodopsins, quantification by fluorescence microscopy revealed an increased protein amount in oocytes expressing ChR1 and ChR2 mutants, both in absence and presence of additional all trans Retinal during incubation. The fluorescence intensities correlated to the increased photocurrent amplitudes, reaching a maximum in the ChR2 D156C mutant. Immunoblot experiments with total membrane fractions of oocytes expressing ChR2, bacteriorhodopsin and halorhodopsin hinted towards a dimeric quartenary structure of the channel. This has been confirmed by the recently published crystal structure of a chimaeric ChR1/ChR2 protein (Kato et al., 2012). Assuming the pore in a channel dimer is formed by the protomers, interference or crosstalk between the subunits has been identified. Oocytes expressing mixtures of channelrhodopsins demonstrated differences in kinetics when illumination length and light intensity was varied. A prerequisite for this effect is a simultaneous excitation of both subunits. The interaction of channelrhodopsin-subunits in vivo has been demonstrated by bimolecular fluorescence complementation assays. It was shown, that oligomerization is not restricted to identical subunits in a homodimer but also possible between different ChR2 variants in a heterodimer and even between ChR1 and ChR2. KW - Ionenkanal KW - Chlamydomonas reinhardii KW - Glatter Krallenfrosch KW - Rhodopsin KW - Channelrhodopsin KW - Kationenkanal KW - Channelrhodopsin KW - Cation channel Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85693 ER - TY - THES A1 - Stangl, Christoph T1 - Lichtgesteuerte Manipulation Zentraler Second Messenger in Pflanzen T1 - Manipulation of Crucial Second Messengers in Plants by light N2 - In der vorliegenden Arbeit wurden lichtaktivierte Nucleotidcyclasen auf Basis der lichtaktivierten Adenylatcyclase bPAC (=BlaC, Ryu et al., 2010; Stierl et al., 2011), sowie der direkt lichtaktivierbare Kationenkanal Channelrhodopsin-2 (Nagel et al., 2003) eingesetzt, um lichtinduzierte und damit nicht-invasive Manipulationen der Second Messenger cAMP, cGMP und Calcium, sowie des Membranpotentials in Pflanzenzellen vorzunehmen. Nach transienter Transfektion von N. benthamiana konnte sowohl die Expression der beiden Channelrhodopsinvarianten C128A::YFP und C128T::YFP (unveröffentlichte Daten von R. Gueta und G. Nagel, 2008, Berndt et al., 2009; Bamann et al., 2010), als auch deren Lokalisation in der Plasmamembran von Protoplasten fluoreszenzmikroskopisch gezeigt werden. Die Funktion von Channelrhodopsin als lichtaktivierbarer Kationenkanal konnte in dieser Arbeit erstmals elektrophysiologisch in Pflanzenzellen nachgewiesen werden. In Einstichmessungen im Mesophyllgewebe von N. benthamiana wurden reproduzierbar blaulichtinduzierte Depolarisationen der Plasmamembran erzielt, die in Dauer und Frequenz über das applizierte Lichtmuster steuerbar waren. In Patch-Clamp-Messungen an epidermalen Protoplasten von N. benthamiana, welche transient Channelrhodopsin-2-C128A und Channelrhodopsin-2-C128T exprimierten, konnten zudem blaulichtinduzierte Einwärts-Ströme gezeigt werden. Die Expression der beiden verwendeten Channelrhodopsinvarianten schien hierbei annähernd unabhängig von der vorliegenden Konzentration des zugegebenen Retinals. Des Weiteren konnte in A. thaliana sowohl die Expression als auch die Funktion der lichtaktivierbaren Adenylatcyclase bPAC::YFP (Stierl et al., 2011), sowie einer hieraus durch gezielte Mutation (nach Ryu et al., 2010) abgeleiteten lichtaktivierbaren Guanylatcyclase (bPGC::YFP) erstmalig in höheren Pflanzen gezeigt werden. Nach Bestätigung der Funktion dieser beiden lichtaktivierbaren Nucleotidcyclasen in transient transfizierten Protoplasten von A. thaliana wurden zwei stabil transgene Pflanzenlinien generiert. ZUSAMMENFASSUNG DER ARBEIT - 190 - Pflanzen dieser Linie exprimierten neben dem konstitutiv unter der Kontrolle des 35S-CaMV-Promotors exprimierten Calciumreporterprotein Aequorin zusätzlich und unter der Kontrolle eines östrogeninduzierbaren Glucocorticoidpromotors (Zuo et al., 2000) die lichtaktivierten Nucleotidcyclasen bPAC::YFP bzw. bPGC::YFP. In beiden stabil transgenen Pflanzenlinien wurden Expression und Funktion der jeweiligen lichtaktivierten Nucleotidcyclase gezeigt. In Messungen an einem modifizierten Luminometer konnten weiterhin erstmals blaulichtinduzierte Calciumsignaturen in Pflanzenzellen generiert werden. Auf die Folge von Blaulichtpulsen kam es wiederholt zum Calciumeinstrom in Zellen der erstellten transgenen Pflanzenlinien. Neben der Möglichkeit, sowohl die Konzentration der cyclischen Nucleotide als auch des cytoplasmatischen Calciums über Licht zu manipulieren, wurde durch diese Pflanzen ein direkter Zusammenhang beider Second Messenger gezeigt. Weiterhin sind phänotypische Auffälligkeiten der erstellten Pflanzenlinien beobachtet worden. Es kam zur Verzögerung des Keimungszeitpunktes bPAC::YFP-exprimierender Samen im Licht, jedoch wuchsen die Pflanzen im Anschluss an die verzögerte Keimung normal und uneingeschränkt weiter. In bPAC::YFP-exprimierenden Pollen von Nicotiana SR-1 konnte zudem das Wachstum der Pollenschläuche durch blaues Licht gestoppt werden. bPGC::YFP-exprimierende Pollen hingegen zeigten auch im blauen Licht unverändertes Pollenschlauchwachstum. Neben den beiden erfolgreich generierten, stabil transgenen Pflanzenlinien wurden in analogen Ansätzen transgene A. thaliana Col-0 Aequorin Zellkulturlinien generiert, die neben dem konstitutiv aktiven Calciumreporterprotein Aequorin ebenso bPAC::YFP bzw. bPGC::YFP unter der Kontrolle des östrogeninduzierbaren Glucocorticoidpromotors (Zuo et al., 2000) exprimierten. Auch hier konnten Expression und Funktion beider Nucleotidcyclasen immunologisch und fluoreszenzmikroskopisch gezeigt werden. Über den Einsatz einer sog. 2A-Sequenz wurde weiterhin ein funktionsfähiges Fusionskonstrukt aus dem cAMP-aktivierten Kationenkanal CNGA2 (C460W-E583M, nach Rich et al., 2001) und der lichtaktivierten Adenylatcyclase EuPACα (Iseki et al., 2002) erstellt. Die Funktion dieses Fusionskonstruktes wurde elektrophysiologisch sowie immunologisch gezeigt. N2 - In this study, light-activated nucleotide cyclases based on bPAC (= BlaC, Ryu et al., 2010; Stierl et al., 2011), and the direct light-activated cation channel channelrhodopsin-2 (Nagel et al., 2003) have been used to non-invasively manipulate the level of the second messengers cAMP, cGMP and calcium as well as the membrane potential in plant cells by means of light. After transient transfection of N. benthamiana, the expression of the two channelrhodopsin variants C128A and C128T (unpublished data from Ronnie Gueta and G. Nagel 2008; Berndt et al., 2009; Bamann et al., 2010) as well as their correct localization in the plasma membrane, was shown by fluorescence microscopy imaging. The general function of channelrhodopsin as a light-activated cation channel was shown for the first time electrophysiologically in higher plants. Using impalement measurements on leaf discs, blue-light-induced depolarizations of the plasma membrane could reproducibly be evoked, which followed the given light pattern in duration and frequency. By Patch-Clamp recordings on N. benthamiana protoplasts, clear blue-light-induced inward currents were demonstrated. The expression of both employed channelrhodopsin variants C128A and C128T was almost independent from supplementation of Retinal during their expression. Furthermore, expression and function of the light activated adenylyl cyclase bPAC::YFP (Stierl et al., 2011) and a therefrom derived light activated guanylyl cyclase bPGC::YFP (according to Ryu et al., 2010) was shown for the first time in higher plants. Two stable transgenic plant lines have been generated, which, aside to the constitutively expressed calcium reporter protein Aequorin, express the light-activated nucleotide cyclases bPAC::YFP and bPGC::YFP, respectively, under the control of an estrogen-inducible glucocorticoid promotor (Zuo et al., 2000). Also in these transgenic plants, expression and function of both light-activated nucleotide cyclases was shown. ZUSAMMENFASSUNG DER ARBEIT - 192 - For the first time, blue-light-induced calcium signatures in plant cells were evoked by illumination of leafdiscs of the transgenic plant lines as an implication of an elevated cNMP-level. Beside the possibility to manipulate cNMP-levels as well as the free cytoplasmic calcium concentration in those plants by means of light, a direct interrelation between these two second messengers was shown. Also physiological impairments in the generated plant lines were observed. The germination of bPAC::YFP expressing seeds was considerably delayed when grown in light. Further, the pollen tube growth of transiently bPAC::YFP-transfected pollen of Nicotiana SR-1 was fully stopped by illumination with blue light, whereas normal growth was documented under dark conditions. In contrast, bPGC-transfected pollen did not show affected growth of their pollen tubes neither in darkness nor upon blue light illumination. Beside the generated stable transgenic plant lines, two stable transgenic Arabidopsis thaliana Col-0-Aequorin cell-culture lines have been generated in an analogous approach. Also in this case, the expression of bPGC::YFP and bPAC::YFP was estrogen-inducibly expressed under control of the glucocorticoid-promotor (Zuo et al., 2000), and expression as well as function was shown by means of fluorescence microscopy imaging and cNMP-quantification using ELISA. Furthermore, a fused construct of the cAMP-gated cation channel CNGA2 (C460W-E583M, according to Rich et al., 2001) and the light activated adenylyl-cyclase EuPACα (Iseki et al., 2002) was cloned using a 2A-sequence (Tang et al., 2009) and expressed in oocytes. The function of this construct has been shown electrophysiologically and immunologically. KW - Calciumion KW - Sekundärer Bote KW - Cyclo-AMP KW - Cyclo-GMP KW - Calcium KW - cAMP KW - cGMP KW - lichtgesteuerte Manipulation KW - Calcium KW - cAMP KW - cGMP KW - lightinduced manipulation KW - Pflanzen KW - Licht Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85940 ER - TY - THES A1 - Maierhofer, Tobias T1 - Funktionelle Charakterisierung von SLAC1-homologen Anionenkanälen aus Arabidopsis thaliana T1 - Functional characterization of SLAC1-homologous anion channels from Arabidopsis thaliana N2 - S-Typ (slow)-Anionenkanäle vermitteln in Schließzellen den Efflux von Chlorid und Nitrat, welcher letztendlich zum Schließen der Stomata, z.B. als Antwort auf Trockenstress, führt. Dabei kommt dem Phytohormon Abscisinsäure (ABA) eine zentrale Rolle zu. Es wird als Antwort auf Trockenheit synthetisiert und vermittelt über eine schnelle ABA-Signaltransduktionskette die Aktivierung von S-typ Anionenkanälen. SLAC1 war die erste Komponente eines S-Typ-Anionenkanals, die in Schließzellen identifiziert wurde. Durch die Expression in Xenopus Oozyten, konnte SLAC1 als S-Typ-Anionenkanal funktionell charakterisiert werden und seine Regulation über Kinasen (OST1, CPK21/23) und Phosphatasen (ABI1, ABI2) beschrieben werden. Mit diesen Untersuchungen gelang ein entscheidender Durchbruch bei der Entschlüsselung von Netzwerken, welche den Anionentransport in Schließzellen als Antwort auf Trockenstress regulieren. Im Laufe dieser Arbeit konnte in Schließzellen von Arabidopsis auch die Expression des SLAC1 Homolog 3 (SLAH3) nachgewiesen werden. Die Koexpression von SLAH3 mit der Ca2+-abhängigen Proteinkinase CPK21 in Xenopus Oozyten führte zu Nitrat-induzierten Anionenströmen. Dabei wurde die Aktivität dieses S-Typ-Anionenkanals, sowohl durch Phosphorylierung, als auch durch Kalzium und Nitrat gesteuert. Ähnlich wie bei der Regulation von SLAC1 konnte die Aktivität von SLAH3 durch die Proteinphosphatase ABI1, aus der Familie der PP2Cs, blockiert werden. Diese Eigenschaft von ABI1 passt sehr gut zur bekannten Rolle dieser Phosphatase in Schließzellen: ABI1 ist ein negativer Regulator der ABA-Signalkaskade und wird durch ABA inhibiert. Unsere biophysikalischen Analysen führten schließlich zur Rekonstitution des schnellen ABA-Signaltransduktionsweges. Die Bindung von ABA an den Komplex aus ABA-Rezeptor (RCAR/PYL/PYR) und ABI1 bewirkt die Inaktivierung von ABI1 und somit die Aktivierung von CPK21. Für deren volle Aktivität ist eine ABA-abhängige Erhöhung der zytosolischen Ca2+-Konzentration notwendig. Die aktivierte Kinase CPK21 ist schließlich in der Lage, den Anionenkanal SLAH3 zu phosphorylieren und in der Anwesenheit von Nitrat zu aktivieren. Somit liefert die Identifizierung und Charakterisierung von SLAH3, als den Nitrat-, Kalzium- und ABA-sensitiven Anionenkanal in Schließzellen, Einblicke in die Beziehung zwischen der Reaktion dieses Zelltyps auf Trockenstress, der Funktion von Nitrat als Signalmolekül und dem Nitratmetabolismus. Für die meisten höheren Pflanzen stellt Nitrat die wichtigste Stickstoffquelle dar. Die Nitrataufnahme über die Wurzel repräsentiert daher den entscheidenden Schritt für den Stickstoff-Metabolismus. Ausgehend von den Zellen des Wurzelkortex muss das Nitrat für den Langstreckentransport in die oberen Pflanzenorgane, in die Xylemgefäße der Stele eingebracht werden. Die Identifikation von Proteinen und Genen, die für den Nitrattransport verantwortlich sind, ist für das Verständnis der Nitrataufnahme und -verteilung in der Pflanze eine Grundvoraussetzung. Dabei scheinen Protonen-gekoppelte Transporter der NRT1-, bzw. NRT2-Klasse, die Verschiebung von Nitrat aus dem Boden in die Wurzeln zu bewerkstelligen. Aus der Endodermis, bzw. den Xylem-Parenchymzellen muss Nitrat anschließend in das extrazelluläre Medium der Xylemgefäße freigegeben werden, um über den Transpirationssog in den Spross zu gelangen. Auch am Transport dieses Anions in das Xylem ist mit NRT1.5 ein Nitrattransporter der NRT1-Klasse beteiligt, jedoch ergaben Experimente an NRT1.5-Verlustmutanten, dass weitere Transportmechanismen für den Efflux von Nitrat in das Xylem existieren müssen. Im Rahmen dieser Doktorarbeit konnte das SLAC1-Homolog 2 (SLAH2) funktionell in Xenopus Oozyten exprimiert werden. Mit Hilfe der BIFC-Methode wurde gezeigt, dass dabei die Interaktion mit der Ca2+-abhängigen Proteinkinase CPK21 essentiell ist. Elektrophysiologische Experimente verdeutlichten, dass SLAH2 einen Nitrat-selektiven S-Typ-Anionenkanal repräsentiert, dessen Aktivität gleichzeitig durch die Anwesenheit eben dieses Anions im externen Medium reguliert wird. Durch die Promoter:GUS-Technik gelang es, die Lokalisation von SLAH2 exklusiv in den Zellen der Wurzelstele von Arabidopsis nachzuweisen. Aufgrund des stark negativen Membranpotentials pflanzlicher Zellen und der vorliegenden Anionengradienten, dürften Anionenkanäle in erster Linie den Ausstrom von Anionen vermitteln. Da in Nitrat-Aufnahme-Experimenten an SLAH2-Verlustmutanten, im Vergleich zu Wildtyp-Pflanzen, ein geringerer Nitratgehalt im Spross, dagegen eine höhere Konzentration dieses Anions in den Wurzeln zu detektieren war, scheint der S-Typ-Anionenkanal SLAH2 am Transport von Nitrat aus den Wurzeln in die Blätter beteiligt zu sein. Dabei könnte er entweder direkt an der Beladung des Xylems mit Nitrat mitwirken, oder diese durch seine potentielle Funktion als Nitratsensor regulieren. N2 - S-type (slow)-anion channels in guard cells mediate the efflux of chloride and nitrate which finally leads to the closing of stomata, e.g. in response to drought stress. Hereby the phytohormone abscisic acid (ABA) plays a central role. It is synthesized in response to drought and mediates the activation of S-type anion channels via a fast ABA signal transduction pathway. SLAC1 was the first component of S-type anion channels that was identified in guard cells. Following expression in Xenopus oocytes, SLAC1 could be functionally characterized as a S-type anion channel and its regulation via kinases (OST1, CPK21/23) and phosphatases (ABI1, ABI2) could be demonstrated. These studies represented a crucial breakthrough in decoding networks that regulate the anion transport in guard cells in response to drought stress. In the course of this work the expression of the SLAC1 homolog 3 (SLAH3) was detected in guard cells of Arabidopsis, too. In line with the phosphorylation-dependent activation of SLAC1, coexpression of SLAH3 with the Ca2+-dependent protein kinase CPK21 in Xenopus oocytes resulted in nitrate-induced anion currents. Thus the activity of this S-type anion channel was controlled by phosphorylation as well as via calcium and nitrate. Similar to the regulation of the activity of SLAC1, SLAH3 could be blocked by the protein phosphatase ABI1, a member of the PP2C family. This property of ABI1 is well in line with its known physiological role in guard cells: ABI1 represents a negative regulator of ABA signaling and is inhibited by ABA. Our biophysical and biochemical analyses resulted in the reconstitution of the fast ABA signal transduction pathway: Binding of ABA to the complex of the ABA receptor (RCAR/PYL/PYR) and ABI1 leads to the inactivation of ABI1 and thus to the activation of CPK21. For its full activity an ABA-dependent increase in the cytosolic Ca2+ concentration is necessary. The activated kinase CPK21 is finally able to phosphorylate and activate the anion channel SLAH3 in the presence of nitrate. Thus, the identification and characterization of SLAH3 as the nitrate, calcium and ABA sensitive anion channel in guard cells, provides insights into the relationship between the reaction of this cell type to drought stress, the function of nitrate as a signaling molecule and the nitrate metabolism. Nitrate represents the most important nitrogen source for the majority of higher plants. Nitrate uptake by roots is therefore a decisive step in the nitrogen metabolism of plants. Starting from the cells of the root cortex nitrate is loaded into the xylem vessels of the stele for long-distance transport into the aerial plant organs. The identification of proteins and genes that are responsible for the transport of nitrate is a basic requirement for the understanding of nitrate uptake and distribution in the plant. Thereby proton coupled transporters of the NRT1 and NRT2 class seem to be responsible for the translocation of nitrate from the soil to the root. From the endoderm and the xylem parenchyma cells nitrate is then released into the extracellular medium of the xylem vessels to enter the transpiration stream to the shoot. NRT1.5, a transporter of the NRT1 family, was shown to be involved in this process. However, experiments on NRT1.5-deficient mutants showed that additional transport mechanisms for the efflux of nitrate into the xylem must exist. In the course of this dissertation the SLAC1 homolog 2 (SLAH2) was functionally expressed in Xenopus oocytes. With the help of the BIFC method it could be shown that hereby the interaction with the Ca2+-dependent protein kinase CPK21 is essential. Electrophysiological experiments demonstrated that SLAH2 represents a nitrate-selective S-type anion channel whose activity is regulated by the presence of this anion in the external medium. The localization of SLAH2 exclusively in the cells of the Arabidopsis root stele was detected via the promoter:GUS technique. Due to the hyperpolarized membrane potential of plant cells and the outward-directed anion gradients, it is likely that anion channels primarily mediate the efflux of anions. Nitrate uptake experiments on SLAH2 loss of function mutants revealed a lower nitrate content in the shoot compared to wild-type plants, whereas a higher concentration of this anion was detected in the roots. This indicates that the S-type anion channel SLAH2 is involved in the transport of nitrate from the roots into the leaves. Thereby SLAH2 could either be directly responsible for the xylem loading with nitrate or it could regulate this process by its potential function as a nitrate sensor. KW - Ackerschmalwand KW - Anionentranslokator KW - Nitration KW - Schließzelle KW - Stomaschluss KW - SLAC1 KW - S-Typ KW - stomatal closure KW - SLAC1 KW - S-type KW - Schmalwand Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85406 ER - TY - THES A1 - Schulz, Alexander T1 - Molekulare Mechanismen des protonengekoppelten Zuckertransportes in Mesophyllvakuolen von Arabidopsis thaliana T1 - Molecular mechanism of the proton-coupled sugar transport in mesophyll vacuoles of Arabidopsis thaliana N2 - Im Rahmen dieser Arbeit konnten neue Erkenntnisse zum Zuckertransport über die Vakuolenmembran von Arabidopsis thaliana sowie dessen Energetisierung durch die V-ATPase erlangt werden. Hierfür wurden Patch-Clamp-Experimente konzipiert, die eine direkte Erfassung der Transportmechanismen, Transporteigenschaften sowie Triebkräfte des vakuolären Zuckertransportes ermöglichten. Zusätzlich wurden Lokalisations- und Interaktionsstudien zu ausgewählten Transportern mit Hilfe der konfokalen Laser Scanning Mikroskopie durchgeführt. Im Einzelnen wurden folgende Aspekte hinsichtlich des pflanzlichen Zuckertransports und dessen Energetisierung bearbeitet. Mittels der Patch-Clamp-Technik konnten vakuoläre glucose- und saccharose-induzierte Protonen-Transportkapazitäten in Mesophyllvakuolen von Wildtyp-pflanzen aufgelöst werden, die eindeutig einen Antiportmechanismus für beide Zucker zur Beladung der Vakuole vorschlagen. Dabei zeigten die Glucose- und Saccharoseantiporter eine geringe Affinität und hohe Transportkapazität für den jeweiligen Zucker. Auf molekularer Ebene konnte die protonengekoppelte Glucose- und Saccharoseaufnahme in die Vakuolen maßgeblich dem putativen Monosaccharid¬transporter AtTMT1/2 zugeordnet werden, der folglich als erster Glucose-Saccharose/Protonen-Antiporter identifiziert wurde. Im Zuge dieser Untersuchungen wurden der Zucker- und der pH-Gradient als Triebkräfte der Zuckertransportaktivität herausgearbeitet. In diesem Zusammenhang konnte ferner ein Beitrag zur quan¬titativen Charakterisierung der V-ATPase geleistet werden, welche den Einfluss der V-ATPase aufgrund ihrer pH-abhängigen H+-Pumpaktivität auf die pH-Homöostase belegt. Demzufolge scheint die V-ATPase als pH-regulierter Energielieferant für die Zuckertransporter zu fungieren. Darüber hinaus wurde die mitogenaktivierte Proteinkinase AtVIK1 als potentieller Regulationsfaktor von AtTMT1 identifiziert. Dies gelang durch den Nachweis einer spezifischen physikalischen Interaktion zwischen AtTMT1 und AtVIK1 mittels der Bimolekularen Fluoreszenzkomplemen¬tation. Neben der AtTMT1/2-vermittelten Aufnahme der beiden Zucker Glucose und Saccharose wurde ebenso die Zuckerentlassung aus der Vakuole näher charakterisiert. Mit Hilfe vergleichender Patch-Clamp-Analysen von verschiedenen Zuckertransporter-Verlustmutanten konnte AtERDl6 als Glucose/Protonen-Symporter identifiziert werden, der sich für den Glucoseexport aus der Vakuole verantwortlich zeigt. In Bezug auf den Saccharosetransport aus der Vakuole konnte erstmals die Saccharose/Protonen-Symportfunktion von AtSUC4 in planta nach dessen transienter Überexpression in Zuckertransporter-Verlustmutanten eindeutig aufgelöst und nachgewiesen werden. Desweiteren offenbarten die hier erlangten Ergebnisse bezüglich der Glucose/Saccharose-Beladung und -Entladung von Mesophyllvakuolen, dass weitere protonengekoppelte Zuckertransporter, neben AtTMT1/2 and AtERDl6, in diesem Zelltyp existieren, deren molekulare Natur es jedoch noch gilt herauszufinden. N2 - This work provides new insights into the sugar transport across the vacuolar membrane of Arabidopsis thaliana and its energization by the V-ATPase. For this, patch-clamp experiments were specifically designed enabling low-resolution current recordings for the direct detection and characterization of the transport mechanisms, transport properties and driving forces of the vacuolar sugar transport. In addition, localization and interaction studies on selected transporters have been performed by using the confocal laser scanning microscopy. In particular, following aspects of plant sugar transport and its energization were studied. In patch-clamp experiments on mesophyll vacuoles of wild type plants, prominent glucose- and sucrose-induced proton transport capacities were resolved, which could be clearly related to an antiport mechanism used for loading the vacuole with both sugars. Thereby, the vacuolar glucose and sucrose antiporter showed a low-affinity and a high transport-capacity for the respective sugar. On the molecular level, the proton-coupled uptake of both sugars, glucose and sucrose, into the vacuole could be mainly associated with the putative monosaccharide transporter AtTMT1/2, which was consequently identified as the first glucose-sucrose/proton-antiporter. In the course of these studies, the sugar- and the pH-gradient were revealed as driving forces of the sugar transport activity. In this context, a contribution was made to a quantitative characterization of the V-ATPase that proved the influence of the V-ATPase on the pH homeostasis based on the pH dependency of the H+-pump activity. Hence, the V-ATPase seems to function as a pH-regulated energy source for the sugar transporters. Moreover, a specific physical interaction between AtTMT1 and the mitogen-activated protein kinase AtVIK1 was detected via bimolecular fluorescence complementation assays identifiying AtVIK1 as a potential regulatory factor of AtTMT1. Beside the AtTMT1/2-mediated glucose and sucrose uptake into the vacuole, the sugar release from the vacuole was also characterized. By means of comparative patch-clamp studies on mutants lacking different sugar transporters, AtERDl6 was identified as glucose/proton symporter and appears to be responsible for glucose export from the vacuole. Concerning the export of sucrose out of the vacuole, for the first time direct evidence for the sucrose/proton symport function of AtSUC4 in planta was provided after its transient overexpression in certain sugar-transporter knockout lines. Furthermore, the studies on wild type and sugar-transporter knockout lines regarding vacuolar glucose/sucrose loading and unloading also revealed that in addition to AtTMT1/2 and AtERDl6 further proton-coupled sugar transporters - of yet unknown molecular identity - must be present in mesophyll cells. KW - Ackerschmalwand KW - Vakuole KW - Saccharose KW - Glucose KW - Mesophyll KW - Protonenpumpe KW - AtTMT1/2 KW - AtSUC4 KW - AtERDl6 KW - V-ATPase KW - Mesophyllvakuole KW - Glucose/Saccharose Transport KW - Antiport KW - Symport KW - AtTMT1/2 KW - AtSUC4 KW - AtERDl6 KW - V-ATPase KW - mesophyll vacuole KW - glucose/sucrose transport KW - antiport KW - symport KW - Glucosetransport Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85596 ER - TY - THES A1 - Kamke, Janine T1 - Single-cell genomics of the candidate phylum Poribacteria T1 - Einzelzell-genomische Analysen des Candidatus Phylums Poribacteria N2 - Marine sponges are the most ancient metazoans and of large ecological importance as drivers of water and nutrient flows in benthic habitats. Furthermore marine sponges are well known for their association with highly abundant and diverse microbial consortia. Microorganisms inhabit the extracellular matrix of marine sponges where they can make up to 35% of the sponge’s biomass. Many microbial symbionts of marine sponges are highly host specific and cannot, or only in very rare abundances, be found outside of their host environment. Of special interest is the candidate phylum Poribacteria that was first discovered in marine sponges and still remains almost exclusive to their hosts. Phylogenetically Poribacteria were placed into the Planctomycetes, Verrucomicrobia, Chlamydiae superphylum and similarly to many members of this superphylum cell compartmentation has been proposed to occur in members of the Poribacteria. The status as a candidate phylum implies that no member of Poribacteria has been obtained in culture yet. This restricts the investigations of Poribacteria and their interactions with marine sponges to culture independent methods and makes functional characterisation a difficult task. In this PhD thesis I used the novel method of single-cell genomics to investigate the genomic potential of the candidate phylum Poribacteria. Single-cell genomics enables whole genome sequencing of uncultivated microorganisms by singularising cells from the environment, subsequent cell lysis and multiple displacement amplification of the total genomic DNA. This process yields sufficient amounts of DNA for whole genome sequencing and genome analysis. This technique and its relevance for symbiosis studies are discussed in this PhD thesis. Through the application of single-cell genomics it was possible to increase the number of single-amplified genomes of the candidate phylum Poribacteria from initially one to a total of six. Analyses of these datasets made it possible to enhance our understanding of the metabolism, taxonomy, and phylum diversity of Poribacteria and thus made these one of the best-characterised sponge symbionts today. The poribacterial genomes represented three phylotypes within the candidate phylum of which one appeared dominant. Phylogenetic and phylogenomic analyses revealed a novel phylogenetic positioning of Poribacteria distinctly outside of the Planctomycete, Verrucomicorbia, Chlamydiae superphylum. The occurrence of cell compartmentation in Poribacteria was also revisited based on the obtained genome sequences and revealed evidence for bacterial microcompartments instead of the previously suggested nucleotide-like structures. An extensive genomic repertoire of glycoside hydrolases, glycotransferases, and other carbohydrate active enzymes was found to be the central shared feature between all poribacterial genomes and showed that Poribacteria are among those marine bacteria with the largest genomic repertoire for carbohydrate degradation. Detailed analysis of the carbohydrate metabolism revealed that Poribacteria have the genomic potential for degradation of a variety of polymers, di- and monosaccharaides that allow these symbionts to feed various nutrient sources accessible through the filter-feeding activities of the sponge host. Furthermore the poribacterial glycobiome appeared to enable degradation of glycosaminoglycan chains, one of the main building blocks of extracellular matrix of marine sponges. Different lifestyles resulting from the poribacterial carbohydrate degradation potential are discussed including the influence of nutrient cycling in sponges, nutrient recycling and scavenging. The findings of this thesis emphasise the long overlooked importance of heterotrophic symbionts such as Poribacteria for the interactions with marine sponges and represent a solid basis for future studies of the influence heterotrophic symbionts have on their sponge hosts. N2 - Marine Schwämme sind die ältesten rezenten Vertreter der Metazoen. Durch ihre Lebensweise als Nahrungsfiltrierer und den damit verbundenen Einfluss auf Nährstoffzyklen sind sie von großer ökologischer Relevanz. Des Weiteren zeichnen sich marine Schwämme durch das Zusammenleben mit hoch abundanten und diversen mikrobiellen Konsortien aus. Diese Mikroorganismen finden sich meist in der extrazellulären Matrix des Schwamms und können mehr als 35% der Biomasse ihres Wirtes ausmachen. Viele mikrobielle Symbionten mariner Schwämme sind hochgradig Wirts-spezifisch und können außerhalb des Schwamms, wenn überhaupt, nur in sehr geringer Anzahl gefunden werden. Von besonderem Interesse ist das Candidatus Phylum Poribacteria, dessen Vertreter erstmals in Schwämmen detektiert wurden, und bis heute fast ausschließlich in Schwämmen zu finden sind. Phylogenetisch wurden die Poribacteria dem Planctomycetes, Verrucomicrobia, Chlamydiae (PVC) Superphylum zugeordnet. Einige Vertreter dieses Superphylums zeigen einen kompartimentierten Zellplan auf, eine Eigenschaft, die auch für Poribacteria vermutet wird. Der Status der Poribacteria als Candidatus Phylum zeigt das Fehlen von Vertretern dieses Phylums in Reinkultur an. Dies beschränkt die Untersuchung von Poribacteria auf kultivierungs-unabhängige Methoden, was die funktionelle Charakterisierung dieser Symbionten erheblich erschwert. In dieser Doktorarbeit wurde das Candidatus Phylum Poribacteria mit Hilfe der Einzelzellgenomik untersucht. Diese Methode ermöglicht es aus vereinzelten mikrobiellen Zellen genomische Komplett-DNA zu gewinnen und diese, mit Hilfe der so genannten „multiple displacement amplification“ so hochgradig anzureichern, dass eine Sequenzierung und anschließende Analyse erfolgen kann. Die Anwendung dieser Methode im Allgemeinen und in der Symbiose Forschung wird in dieser Doktorarbeit diskutiert. Die Einzelzellgenomik ermöglichte die Anzahl poribakterieller Datensätze, von zunächst einem auf sechs Genome zu erhöhen. Die Analyse dieser Genome konnte unser Verständnis vom metabolischen Potential, der Taxonomie und der Diversität innerhalb dieses Phylums deutlich zu verbessern. Die poribakteriellen Genome beschrieben drei Phylotypen, von denen einer deutlich dominierte. Die phylogenetische Position des Phylums Poribacteria wurde außerdem anhand von phylogenetischen und phylogenomischen Berechnungen neu zugeordnet, und resultierte in einer deutlichen Positionierung außerhalb des PVC Superphylums. Weiterhin wurden genomische Hinweise auf einen kompartimentierten Zellplan in Poribacteria gefunden. Diese deuten aber nicht, wie vorher vermutet, auf eine Zellkern-ähnliche Struktur hin, sondern auf bakterielle Mikrokompartimente mit noch ungeklärter Funktion. Die Analysen des genomischen Potentials zeigte in allen Datensätzen eine hohe Frequenz von Genen, die für Glycosidasen, Glycosyltransferasen und weiteren Proteinen der so-genannten „carbohydrate active enzymes“ kodieren, was ein ausgeprägtes Vermögen zum Kohlehydratabbau aufzeigt. Das genomische Potential von Poribacteria zum Abbau von Kohlehydratpolymeren, Di- und Monosacchariden konnte durch detaillierte Analyse des Kohlehydratmetabolismus genau beschrieben werden. Außerdem schienen Poribacteria Glycosaminoglycanketten, die zentrale Bausteine der extrazellulären Matrix des Schwammes sind, abbauen zu können. Die aus dem poribakteriellen Glycobiome resultierenden möglichen Lebensweisen als Wiederverwerter von Nährstoffen, Mitesser, oder auch der Einfluss von Poribacteria auf Nährstoffzyklen im Schwamm werden in dieser Doktorarbeit diskutiert. Die Ergebnisse dieser Doktorarbeit machen Poribacteria zu den genomische am besten beschriebenen Schwammsymbionten und zeigen die lange übersehene Relevanz heterotropher Symbionten in marinen Schwämmen. KW - Bakterien KW - Schwämme KW - Einzelzellgenomik KW - Single-cell genomics KW - Poribacteria KW - Sponges KW - Bacteria KW - Symbiose KW - Genanalyse Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85042 ER - TY - THES A1 - Wittek, Anke T1 - Vergleichende elektrophysiologische Untersuchungen zweier Saccharose/H +-Symporter, ZmSUT1 (Zea mays) und UmSrt1 (Ustilago maydis) T1 - Comparative electrophysiological studies of two suc/H+-symporter ZmSUT1 (Zea mays) and UmSrt1 (Ustilago maydis) N2 - Bei der Betrachtung des Pathosystems Ustilago maydis/Zea mays kommen sich Proteine unterschiedlicher Organismen sehr nahe. Die derzeitige Hypothese zur lokalen Szenerie in der ausgebildeten Interaktionszone von Pflanze und Pilz spricht zwei SUC-Transportern dabei wichtige Rollen in der Pflanze/Pilz Interaktion zu. UmSrt1, der erste beschriebene pilzliche SUC-Transporter aus dem Maispathogen Ustilago maydis (Wahl et al., 2010) und ZmSUT1, der aus Zea mays stammende low affinity SUC-Transporter (Carpaneto et al., 2005) werden als Gegenspieler im Konkurrenzkampf um die extrazelluläre SUC beschrieben (Wahl et al., 2010). ZmSUT1 ist in der Plasmamembran der Geleitzellen lokalisiert und dort für die Beladung des Phloems mit SUC aus dem Apoplasten zuständig. UmSrt1, für den eine Lokalisation in der Plasmamembran in Hefen gezeigt werden konnte, sorgt als „high affinity“ Transporter mit dem Import extrazellulärer SUC für die Kohlenhydratversorgung der pilzlichen Entwicklung und Ernährung (Wahl et al., 2010). Gegenstand der vorliegenden Arbeit waren vergleichende elektrophysiologische Charakterisierungen der SUC-Transporteigenschaften von ZmSUT1 und UmSrt1. Durch heterologe Expression der Proteine in Xenopus Oozyten und anschließende Messungen unter Verwendung der DEVC-Technik wurden die Eigenschaften des SUC-Transports beider SUC-Transporter im Hinblick auf ihre Konzentrations-, pH-, Spannungsabhängigkeit, sowie auf die Substratspezifität hin untersucht. Diese vergleichenden Studien zur Charakterisierung beider Transportproteine ergaben ihren physiologischen Aufgaben entsprechende Unterschiede. ZmSUT1 konnte ein Verhalten als „low affinity/high capacity“ Transporter mit Affinitäten gegenüber SUC im millimolaren Bereich mit einer spannungsunabhängigen Transportaktivität bestätigt werden. Zudem konnte die Transportaktivität als stark H+-abhängig beschrieben werden (Carpaneto et al., 2005), deren Optimum nahe des physiologischen Bereichs des Apoplasten bestimmt werden konnte. Des Weiteren wurden Untersuchungen zur Substratspezifität angefertigt, die ZmSUT1 eindeutig eine Typ-II SUT Zugehörigkeit (Sivitz et al., 2005; Reinders et al., 2006; Sun et al., 2010) mit einem engen Substratspektrum belegen. Für UmSrt1 dagegen wurde ein Transportverhalten als „high affinity/low capacity“ Transporter mit höheren Affinitäten gegenüber SUC im mikromolaren Bereich ermittelt (Wahl et al., 2010). Darüber hinaus beschreiben die Ergebnisse dieser Arbeit eine weitestgehend H+-unabhängige Transportaktivität in einem weiten pH-Wert Bereich. Im Profil der Substratspezifität zeigte sich neben SUC als primärem Substrat ein eher unspezifischer Transport weiterer Mono-, Di- und Trisaccharide. Die postulierte SUC-Spezifität von UmSrt1 (Wahl et al., 2010) konnte mit den vorliegenden Ergebnissen nicht bestätigt werden. Mit einem effektivem Import von SUC mittels UmSrt1 in den Pilz umgeht U. maydis die Hydrolyse von SUC im pflanzlichen Apoplasten und damit die Bildung extrazellulärer Glukose, die ein Signal in der pflanzlichen Pathogenabwehr darstellt (Herbers et al., 1996b; Ehness et al., 1997; Kocal et al., 2008). Somit scheint es für Ustillago maydis möglich zu sein, eine von der Wirtspflanze Zea mays weitestgehend „unbemerkte“ Aufnahme von Kohlenhydraten über einen breiten pH-Wert Bereich bewerkstelligen zu können. Die vielfach höheren Affinitäten gegenüber SUC und H+ verschaffen UmSrt1 im Konkurrenzkampf um die extrazelluläre SUC einen klaren Vorteil gegenüber ZmSUT1. Diese Daten deuten darauf hin, dass U. maydis auch unter Stressbedingungen der Pflanze und damit resultierenden Schwankungen der H+-Konzentrationen in der Lage ist, den SUC-Import für seine eigene Ernährung sicher zu stellen. Das Gebiet posttranslationaler Modifikationen von SUC-Transportern ist weitestgehend unerforscht. In planta Versuche deuteten darauf hin, dass Redox-aktive Substanzen den Zuckertransport beeinflussen. Im Oozytensystem wurde deshalb die Aktivität von ZmSUT1 in Anwesenheit der Redox-aktiven Substanzen GSH, GSSG, H2O2 und DTT getestet. Der geringfügige Einfluss dieser Substanzen auf SUC-induzierte Ströme von ZmSUT1 deuten jedoch darauf hin, dass SUC-Transporter nicht ein direktes Ziel von Redox-Veränderungen darstellen. Um die Struktur des pflanzlichen SUC-Transporters ZmSUT1 näher zu beleuchten und die an der Bindung von SUC involvierten Aminosäuren zu identifizieren, wurde auf der Basis der bereits bekannten Struktur von LacY aus E.coli, ebenfalls einem Vertreter der MFS, ein 3D-Modell für ZmSUT1 erstellt. Die AS, die in LacY an der Bindung des Substrats beteiligt sind, wurden bereits identifiziert (Vadyvaloo et al., 2006). Darauf aufbauend wurden im Rahmen einer Mutagenesestudie gezielt AS im Protein ZmSUT1 ausgewählt, die in verwandten SUC-Transportern konserviert und in homolgen Positionen zu den in LacY bereits identifizierten AS vorliegen. In diesen ausgewählten Positionen wurden mittels gerichteter Mutagenese acht Mutanten generiert. Die elektrophysiologische Charakterisierung dieser ZmSUT1-Mutanten identifizierte zwei Mutanten, die in der SUC-/H+-Translokation gestört waren sowie zwei WT-ähnliche. Es konnten vier Mutanten mit erniedrigten Affinitäten gegenüber SUC identifiziert werden, von denen zwei zusätzlich Veränderungen in ihrer Substratspezifität aufweisen. Diese vier AS werden als mögliche Kandidaten angesehen, an der Bindung und/oder Translokation von SUC beteiligt zu sein. N2 - Within the Ustilago maydis/Zea mays pathosystem suc transport proteins of different organisms are coming close to each other and compete for sugar in the plant apoplast. It could be shown that two suc transport proteins play an important role in the plant/fungal interaction-zone. UmSrt1, the first described fungal suc-transporter of Ustilago maydis (Wahl et al., 2010), and ZmSUT1, a low affinity transporter from Zea mays (Carpaneto et al., 2005) are thought to have the role of opposing players in extracellular suc-transport (Wahl et al., 2010). ZmSUT1 is localized in the plasma membrane of companion cells and there it is responsible for loading the phloem with suc from the apoplast. The high affinity transporter UmSrt1, whose localization in the yeast plasma membrane has been shown, ensures the carbohydrate supply needed for fungal growth and development by importing extracellular suc (Wahl et al., 2010). The topic of this dissertation is an electrophysiological characterization of the suc-transport performance of ZmSUT1 and UmSrt1 in terms of concentration-, pH- and voltage-dependence as well as substrate specificity. These characterizations have been measured by the heterologous expression of the proteins in Xenopus oocytes and subsequent measurements via DEVC-technique. The results of these comparative studies characterize both transport proteins and present differences originating from their physiological responsibilities. ZmSUT1 was shown to be a „low affinity/high capacity“ transporter with affinities for suc and H+ in millimolar ranges and a voltage-independent transport activity. A strong H+-dependent transport activity had been shown by Carpaneto et al. (2005). This dissertation adds the finding that the optimum corresponds with the physiological environment of the apoplast. Further experiments regarding substrate specificity of ZmSUT1 have been conducted and show clearly that this protein belongs to the type-II SUT`s (Sivitz et al., 2005; Reinders et al., 2006; Sun et al., 2010; Sun et al., 2012) with a narrow spectrum of selectivity. On the other hand, for UmSrt1 a „high affinity/low capacity“ performance with values for suc affinity in micromolar ranges could be confirmed (Wahl et al., 2010). Furthermore the results of this dissertation show a H+-independent transport activity over a broad pH range. In addition to suc as the primary substrate, a broad substrate specificity involving mono-, di, and trisaccharides was shown for UmSrt1. The postulated high suc specificity for UmSrt1 (Wahl et al.) could not be confirmed. Efficient import of suc into the fungus, U. maydis seem to avoid extracellular glucose production by suc hydrolysis and therewith plant defence responses (Herbers et al., 1996b; Ehness et al., 1997; Kocal et al., 2008). For U. maydis it seems to be possible to import carbohydrates in an undetected way by UmSrt1 over a broad pH range. UmSrt1 exhibits high affinities for suc and H+, which leads to a more efficient transport of sugar compared to ZmSUT1. Thus U. maydis is able to import suc for its own feeding even under stress conditions when oscillating apoplastic H+-concentrations may occur. Up to now the posttranslational modifications of suc-transporters are nearly unexplored. In planta it was shown that redox-active substances reduce the sugar import markedly. To test whether suc-transporters are regulated by redox-active substances, such as GSH, GSSG, H2O2 and DTT, we expressed ZmSUT1 in oocytes and monitored its activity in response to the latter substances. Since ZmSUT1 activity was only weakly influenced by redox-active substances, the redox-status of plant cells seem not to regulate SUC-transporter directly. In order to examine the structure of the plant suc-transporter ZmSUT1 and further characterize the suc bindingsite by identification of involved amino acids, a 3-D model was prepared. The basis of the 3-D model was the known structure of LacY from E. coli, which also is an MFS-member. The amino acids, which in LacY are responsible for substrate binding, have already been identified (Vadyvaloo et al., 2006). According to the model, amino acids in homologous positions to those identified in LacY were selected for a mutagenesis study of ZmSUT1. Mutations were introduced in selected positions by targeted mutagenesis and eight mutants were generated. The results of electrophysiological characterization of the mutants showed two mutants with disturbance in suc-/H+-translocation and two others with a WT-like transport profile. Furthermore four mutants with modified affinity for suc have been identified. Whilst all of these four mutants show a lower affinity for suc, two of them additionally showed a modified profile in their substrate specificity. These four mutants are considered to be possible candidates regarding the involvement of theses amino acids in binding and translocation of suc. KW - Saccharose KW - corn KW - Mais KW - Ustilago zeae KW - sucrose KW - transporter KW - Stofftransport Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85279 ER - TY - THES A1 - Rudolf, Ronald T1 - Transcriptional Regulation of and by NFATc1 in Lymphocytes T1 - Transkriptionelle Regulation von und durch NFATc1 in Lymphozyten N2 - The transcription factor NFATc1 has been shown to regulate the activation and differentiation of T-cells and B-cells, of DCs and megakaryocytes. Dysregulation of NFAT signaling was shown to be associated with the generation of autoimmune diseases, malignant transformation and the development of cancer [71]. The primary goal of this work was to gain insights on Nfatc1 induction and regulation in lymphocytes and to find new direct NFATc1 target genes. Three new BAC -transgenic reporter mouse strains (tgNfatc1/Egfp, tgNfatc1/DE1 and tgNfatc1/DE2) were applied to analyze Nfatc1 induction and regulation in primary murine B- and T-cells. As a result, we were able to show the persistent requirement of immunoreceptor-signaling for constant Nfatc1 induction, particularly, for NFATc1/αA expression. Furthermore, we showed that NF-κB inducing agents, such as LPS, CpG or CD40 receptor engagement, in combination with primary receptor-signals, positively contributed to Nfact1 induction in B-cells [137]. We sought to establish a new system which could help to identify direct NFATc1 target genes by means of ChIP and NGS in genom-wide approaches. We were able to successfully generate a new BAC-transgene encoding a biotinylatable short isoform of NFATc1, which is currently injected into mice oocyte at the TFM in Mainz. In addition, in vivo biotinylatable NFATc1–isoforms were cloned and stably expressed in the murine B-cell lymphoma line WEHI-231. The successful use of these cells stably overexpressing either the short NFATc1/αA or the long NFATc1/βC isoform along with the bacterial BirA biotin ligase was confirmed by intracellular stainings, FACS analysis, confocal microscopy and protein IP. By NGS, we detected 2185 genes which are specifically controlled by NFATc1/αA, and 1306 genes which are exclusively controlled by NFATc1/βC. This shows that the Nfatc1 locus encodes “two genes” which exhibit alternate, in part opposite functions. Studies on the induction of apoptosis and cell-death revealed opposed roles for the highly inducible short isoform NFATc1/αA and the constantly expressed long isoform NFATc1/βC. These findings were confirmed by whole transcriptome-sequencing performed with cells overexpressing NFATc1/αA and NFATc1/βC. Several thousand genes were found to be significantly altered in their expression profile, preferentially genes involved in apoptosis and PCD for NFATc1/βC or genes involved in transcriptional regulation and cell-cycle processes for NFATc1/αA. In addition we were able to perform ChIP-seq for NFATc1/αA and NFATc1/βC in an ab-independent approach. We found potential new target-sites, but further studies will have to address this ambitious goal in the future. In individual ChIP assays, we showed direct binding of NFATc1/αA and NFATc1/βC to the Prdm1 and Aicda promoter regions which are individually controlled by the NFATc1 isoforms. N2 - Der Transkriptionsfaktor NFATc1 wurde als Regulator der Aktivierung und Differenzierung für T-Zellen, B-Zellen, Dendritische-Zellen und Megakaryozyten beschrieben. Autoimmunerkrankungen und die Entstehung von Krebs wurden mit Fehlregulationen der NFAT-Signalwege in Verbindung gebracht [71]. Ziel dieser Arbeit war der Gewinn neuer Erkenntnisse über die Induktion und Regulation von NFATc1 in Lymphozyten. Darüber hinaus sollten Gene, welche direkt durch NFATc1 gebunden und reguliert werden, identifiziert werden. Um die Induktion und Regulation von NFATc1 in primären T- und B-Zellen untersuchen zu können, wurden drei BAC transgene Reporter Maus Linien (tgNfatc1/Egfp, tgNfatc1/DE1 and tgNfatc1/DE2) verwendet. Dadurch war es uns möglich zu zeigen, dass es einer ununterbrochenen Antigen-Rezeptor Stimulation bedarf, um NFATc1, im Besonderen die Transkription der kurzen Isoform NFATc1/αA, dauerhaft zu induzieren. Zusätzlich konnten wir zeigen, dass Induktoren wie LPS, CpG oder auch die Stimulation des CD40-Rezeptors, die die Expression des Transkriptionsfaktors NF-B zur Folge haben, einen positiven Einfluss auf die Nfatc1-Induktion haben [137]. Unser Interesse lag darin, ein System zu etablieren, dass es uns ermöglichen sollte, neue NFATc1-Zielgene durch ChIP assays und Genom-weite Sequenzierungen zu ermitteln. Es ist uns gelungen, ein neues BAC-Transgen, welches für eine in vivo biotinylierbare Variante des NFATc1/αA Proteins kodiert, zu erzeugen. Dieses Konstrukt wird zum gegenwärtigen Zeitpunkt - in Zusammenarbeit mit der Universität Mainz (TFM) - in die Vorkerne von Maus-Eizellen injiziert. Ferner wurden biotinylierbare NFATc1-Isoformen kloniert und mit Hilfe retroviraler Plasmide stabil in WEHI-231 B-Lymphom-Zellen integriert. Durch intrazellulare Färbungen, FACS-Analysen, Konfokalmikroskopie und Immunpräzipitationen konnten wir eine erfolgreiche in vivo Biotinylierung in NFATc1/αA- und NFATc1/βC-exprimierenden WEHI-231 Zellen nachweisen. Mittels Next-Generation-Sequencing, in Kollaboration mit TRON, Univ. Mainz, konnten wir 2185 Gene, die spezifisch durch NFATc1/αA kontrolliert wurden, und 1306 Gene, die ausschließlich durch die Überexpression von NFATc1/βC reguliert wurden, identifizieren. Diese Ergebnisse zeigen, dass im Nfatc1 Locus „zwei Gene“ mit alternativer, zum Teil gegensätzlicher Funktion, kodiert sind. Untersuchungen zu Apoptose und Zelltod haben entgegengesetzte Eigenschaften der stark induzierbaren, kurzen Isoform NFATc1/αA und der stetig exprimierten langen Isoform NFATc1/βC aufgezeigt. Daten von Sequenzierungen des gesamten Transkriptoms, die mit NFATc1/αA und -βC überexprimierenden WEHI-231 Zellen durchgeführt wurden (TRON, Mainz), bestätigten diese Befunde. Es zeigte sich, dass es wesentliche Veränderungen der Expressionsprofile Tausender von Genen gab. In WEHI-231-Zellen, die NFATc1/βC überexprimierten, waren viele dieser Gene an Apoptose und Zelltod beteiligt. Demgegenüber waren in NFATc1/αA-Zellen vor allem Gene betroffen, die an transkriptionaler Regulation und dem Zellzyklus beteiligt waren. Überdies war es uns möglich, ChIPseq Assays für NFATc1/αA und NFATc1/βC in einem Antikörper-unabhängigen Ansatz durchzuführen. Dadurch konnten wir neue NFATc1-Bindungstellen identifizieren. Es bedarf jedoch noch weiterer Untersuchungen, um diese Ergebnisse der Genom-weiten ChIPseq Assays zu bestätigen. Durch weitere ChIP Experimente konnten wir eine direkte Bindung von NFATc1/αA und NFATc1/βC an die regulatorischen Regionen der Prdm1- und Aicda-Gene nachweisen. Die Transkription beider Gene wurde durch die Überexpression von NFATc1/αA und -βC deutlich reguliert und spielt offenbar bei der Bildung von Plasma-B-Zellen, die für die Antikörper-Produktion verantwortlich sind, eine wesentliche Rolle. KW - Lymphozyt KW - Transkriptionsfaktor KW - Lymphozyten KW - NFATc1 KW - Lymphocytes KW - NFATc1 KW - Genregulation KW - Maus Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-83993 ER - TY - THES A1 - Reisberg, Eva T1 - Der Einfluss von Trichomen und kutikulären Lipiden auf die bakterielle Besiedelung von Arabidopsis thaliana-Blättern T1 - The influence of trichomes and cuticular lipids on Arabidopsis thaliana leaf-associated bacterial communities N2 - Die oberirdischen Oberflächen von Pflanzen sind von komplexen mikrobiellen Konsortien besiedelt deren Zusammensetzung von verschiedenen Faktoren abhängig ist. In der vorliegenden Promotionsarbeit wurden zwei Eigenschaften pflanzlicher Oberflächen auf mögliche Auswirkungen auf ihre bakterielle Besiedelung hin untersucht. Dazu wurden Wildtyplinien und Mutanten von Arabidopsis thaliana eingesetzt. Zunächst wurde die bakterielle Besiedelung von A. thaliana Wildtyplinien in kultivierungsbasierten Experimenten untersucht. Es wurde hierbei ein Überblick über die kultivierbare Diversität auf Pflanzen, die unter kontrollierten Bedingungen im Klimaschrank gewachsen waren und Pflanzen, die einen Freilandaufenthalt durchlaufen hatten, gewonnen. Der Einfluss von nicht-drüsigen Trichomen von A. thaliana auf die Quantität und Diversität der bakteriellen Besiedelung wurde am A. thaliana Col-0-Wildtyp mit normaler Behaarung und der trichomlosen gl1-Mutante untersucht. Mithilfe von DAPI-Färbungen und nachfolgender Zellzählung wurden die bakteriellen Gemeinschaften der beiden Pflanzenlinien quantifiziert. Dabei zeigten sich keine pflanzenlinienspezifischen Unterschiede. Durch die Amplifizierung der bakteriellen 16S rRNA-Gene der Gemeinschaft und den nachfolgenden Einsatz der Denaturierenden Gradientengelelektrophorese (DGGE) wurde ein Überblick über die Diversität der vorherrschenden Bakteriengruppen gewonnen. Obwohl Trichome als bevorzugte Siedlungsplätze von Bakterien gelten, wurden hier auch hinsichtlich der Diversität der bakteriellen Gemeinschaften keine Unterschiede zwischen den untersuchten Pflanzenlinien gefunden. Als weiteres artspezifisches Merkmal von Pflanzenoberflächen wurde die Zusammensetzung der kutikulären Wachse als Einflussfaktor untersucht. Dafür wurden vier eceriferum-Mutanten (cer) von A. thaliana in Landsberg erecta (Ler) Wildtyp-Hintergrund eingesetzt, die sich hinsichtlich der kutikulären Wachszusammensetzung ihrer Blätter unterschieden. Zur Untersuchung der Diversität der bakteriellen Besiedelung wurde zunächst ein DGGE-Screening durchgeführt. Hier zeigten sich deutliche pflanzenlinienspezifische Unterschiede, die vor allem die Gemeinschaften der cer9- und der cer16-Mutante betrafen. Zur genaueren Charakterisierung der bakteriellen Gemeinschaften der fünf Pflanzenlinien wurde die Amplicon-Pyrosequenzierung eingesetzt. Hierbei stellte sich die bakterielle Diversität auf allen Pflanzenlinien entsprechend des Phyllosphärenhabitats moderat divers und ungleich verteilt dar. Die Identifizierung der sequenzierten Phylotypen ließ eine bakterielle Kerngemeinschaft erkennen. Weiterhin wurden 35 Phylotypen identifiziert, die differenziell auf einzelnen Pflanzenlinien auftraten. Hier handelte es sich um den pflanzenlinienspezifischen Teil der bakteriellen Gemeinschaften. Die statistische Analyse zeigte deutlich divergente Muster für die analysierten Bakteriengemeinschaften der fünf Pflanzenlinien. Vor allem die Gemeinschaften der cer6-, cer9- und cer16-Linie konnten in einer UniFrac-basierten Clusteranalyse von den anderen Pflanzenlinien abgegrenzt werden. Diese Ergebnisse zeigen klar, dass die Mutationen in der Wachsbiosynthese zu divergenten bakteriellen Gemeinschaften führten. N2 - The above-ground parts of plants are colonized by diverse microbial consortia. Their composition is determined by several different factors. In the present study, two common features of plant surfaces and their potential effects on phyllosphere bacteria were investigated. Wildtype lines and several mutants of Arabidopsis thaliana were chosen for these investigations. Initially the bacterial communities on A. thaliana were investigated by a cultivation based approach. First insights into the culturable bacterial diversity on plants, that were grown under controlled climatic conditions or had experienced an outdoor growth period, could be provided. The influence of non-glandular trichomes of A. thaliana leaf surfaces on the quantity and diversity of associated bacterial communities was studied. The A. thaliana Col-0 wildtype which has trichomes on its leaves and the trichomeless gl1-mutant were used for the experiments. For quantification of the bacterial communities DAPI-staining and counting of total cells was applied. No plant line-specific differences were observed. To gain an overview on the diversity of the microbiota of the two plant lines, 16S rRNA-gene-based Denaturing Gradientgelelectrophoreses (DGGE) was used. Trichomes have been described to be preferred colonization sites for bacteria. However, in these experiments no differences in the diversity of the bacterial communities on the two plant lines were observed. Moreover the potential effect of plant cuticular wax composition on phyllosphere bacterial communities was studied. Consequently, four eceriferum (cer) wax mutants with distinct alterations in cuticular wax composition and the A. thaliana Landsberg erecta wildtype were selected. For diversity analysis of the communities an initial DGGE-screening was conducted. The community profiles and subsequent statistical analyses showed distinct patterns for the five plant lines, especially for the cer9 and the cer16 mutant. For a more detailed community analysis, a next generation amplicon pyrosequencing approach was conducted. Upon application of this methodology the communities on all five plant lines were shown to be moderately diverse and uneven, typical for phyllosphere habitats. Identification of community members showed a bacterial core community shared by all plant lines. However, a considerable plant line-specific community was detected, consisting of 35 phylotypes which were differentially present on certain plant lines. Statistical analyses of the sequenced bacterial communities showed distinct patterns for the five plant lines. Specifically, the cer6, cer9 and cer16-mutant communities formed distinct clusters in a UniFrac-based analysis. The results showed that the mutations affecting the wax biosynthesis of the investigated plant lines led to divergent associated bacterial communities. KW - Ackerschmalwand KW - Bakterien KW - Phyllosphäre KW - phyllosphere KW - amplicon pyrosequencing KW - bacterial communities KW - Arabidopsis thaliana KW - cuticular waxes KW - Botanik KW - Mikrobiologie KW - Bakterien KW - Ökologie KW - Phyllosphäre KW - Kutikula KW - Vielfalt KW - Schmalwand Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-83971 ER - TY - THES A1 - Niemann, Sylvia T1 - Seed Coat Permeability of Active Ingredients T1 - Permeabilität von Samenschalen für Aktivsubstanzen N2 - The seed coat is the barrier controlling exchange of solutes between the plant embryo and its environment. This exchange is of importance for example in the uptake of germination inhibitors or in the uptake of agrochemicals applied as seed treatment. A thorough understanding of the basic mechanisms underlying solute permeation across the seed coat would help to improve the effectiveness of seed treatment formulations. In seed treatment formulations, additives can be used to enhance or decrease mobility or uptake of the active ingredient (AI). In the present study the seed coat barrier properties and the seed coat permeation process was examined with the model species Pisum sativum and with a set of model solutes. The lipophilic fraction of the seed coat was analysed by gas chromatography and mass spectrometry and it was found that the total lipophilic compartment of the seed coat represents 0.61 % of the weight of a swollen seed coat. The seed is covered by a lipophilic cuticle. The seed coat coverage with cuticular waxes is ten to 18-fold lower than wax coverage of pea leaves, though. In order to examine sorption of solutes in the small lipophilic compartment of the seed coat, seed coat/water partition coefficients were determined. These cover a much smaller range than the corresponding n-octanol/water partition coefficients. The lipophilic sorption compartment as calculated from the seed coat/water partition coefficient data is smaller than the analysed total lipophilic compartment of the seed coat since not all of the lipid components can act as sorption compartment. During seed swelling, the pea seed nearly doubles its weight. The uptake of water is driven by the very low water potential of the dry seed and controlled by the seed coat hydraulic conductivity both of which increase during seed swelling. Depending on the available form of water, water uptake can take place by diffusion from air humidity or by mass flow from liquid water. Water uptake by a seed in moist sand takes place by a combination of both uptake mechanisms. The basic transport mechanism underlying solute permeation of seed coats was analysed by steady-state experiments with a newly devised experimental setup. The permeance P for permeation of the set of model compounds across isolated seed coat halves ranged from 3.34 x 10-8 m s-1 for abamectin to 18.9 x 10-8 m s-1 for caffeine. It was found that solute permeation across the seed coat takes aqueous pathways. This was concluded from the facts that molar volume instead of lipophilicity of the solutes determine permeation and that the temperature effect on permeation is very small. This is in contrast to typical leaf and fruit cuticular uptake where lipophilic pathways dominate. Solute uptake across the seed coat can take place by two different mechanisms both of which take aqueous pathways. Uptake can be by diffusion and in the presence of a bulk flow of water driven by a water potential difference also by solvent drag. The presence of the solvent drag uptake mechanism shows that the aqueous pathways form an aqueous continuum across the seed coat. These findings indicate that the seed coat covering cuticle does not form a continuous barrier enclosing the seed. In order to examine solute uptake across the seed coat under conditions close to a situation taking place in the field, the process of uptake of a seed treatment AI in the field was simulated. In the situation of a treated seed in the field, the seed treatment residue dissolves and then the AI can move either into the surrounding soil or across the seed coat into the seed. Uptake across the seed coat can take place either by diffusion or during seed swelling by the solvent drag mechanism. Since the seed treatment residue depletes over time, non-steady-state uptake takes place. To simulate these processes, laboratory scale seed treatment methods were established to produce treated seeds and isolated treated seed coat halves. Experimental setups for non-steady-state uptake experiments were established with whole treated seeds and with isolated treated seed coat halves as simplified screening tool. By modelling of the AI uptake as a first-order process the rate constant k and the final relative uptake amount Mt→∞ M0-1 were obtained. With k and Mt→∞ M0-1 a quantification and comparison of the uptake curves was possible. Both in the experiments with whole treated seeds and with isolated treated seed coats, uptake of metalaxyl-M was much faster than uptake of sedaxane. In the uptake of a seed treatment AI, not only the solute's molar volume but also its water solubility determine uptake. The solute's water solubility is important for dissolution of the AI from the seed treatment residue and thus determines availability of the AI for uptake. Water solubility also controls the possible concentration in solution and thus the driving force for diffusive uptake. Furthermore, the AI amount taken up by solvent drag is determined by concentration in the inflowing water and thus by water solubility. In the experiments with whole treated seeds the additive effects on uptake were smaller than in the experiments with isolated treated seed coats or not significant. Adigor functions as an emulsifier and can lead to a slight increase of AI mobilisation from the seed treatment residue. NeoCryl A-2099 can cause a slowed down release of the AI from the seed treatment residue. The effects of both additives were smaller than the effect caused by different AI physico-chemical properties. Therefore, the most important factor determining uptake of a seed treatment AI are the AI's physico-chemical properties, especially its water solubility. N2 - Die Samenschale fungiert als Barriere, welche den Stoffaustausch zwischen dem pflanzlichen Embryo und seiner Umgebung kontrolliert. Dieser Stoffaustausch ist beispielsweise bei der Aufnahme von keimungshemmenden Substanzen oder aufgebeizten Pestiziden von Bedeutung. Ein besseres Verständnis des zugrundeliegenden Mechanismus bei der Permeation über die Samenschale wäre hilfreich für die Optimierung von Beizmittelformulierungen. Bei der Formulierung von Beizprodukten kann die Mobilität oder Aufnahme der Wirkstoffe je nach Bedarf durch Zugabe von Additiven beschleunigt oder verlangsamt werden. In der vorliegenden Arbeit wurden daher die Barriereeigenschaften der Samenschale und der Permeationsprozess über die Samenschale anhand der Modellpflanze Pisum sativum und mit einem Set von Modellsubstanzen untersucht. Die lipophile Fraktion der Samenschale wurde mittels Gaschromatographie und Massenspektrometrie analysiert. Hierdurch konnte ermittelt werden, dass das komplette lipophile Kompartiment der Samenschale 0.61 % des Gewichtes ausmacht. Die Samenschale wird, wie es auch bei Blättern der Fall ist, von einer lipophilen Kutikula bedeckt. Die Bedeckung mit kutikulären Wachsen ist bei Erbsensamen allerdings zehn- bis 18-fach geringer als bei Blättern von Erbsenpflanzen. Um die Sorption von Substanzen in dem kleinen lipophilen Kompartiment der Samenschale zu untersuchen, wurden Samenschale/Wasser Verteilungskoeffizienten bestimmt. Diese erfassen einen sehr viel kleineren Größenbereich als die entsprechenden n-Oktanol/Wasser Verteilungskoeffizienten. Das lipophile Sorptionskompartiment, welches mittels der Samenschale/Wasser Verteilungskoeffizienten berechnet wurde, ist kleiner als das analysierte lipophile Kompartiment, da nicht alle analysierten lipophilen Samenschalenbestandteile als Sorptionskompartiment fungieren können. Bei der Quellung von Erbsensamen kommt es nahezu zu einer Verdoppelung des Gewichtes. Die Wasseraufnahme wird durch das sehr niedrige Wasserpotential des trockenen Samens angetrieben und über die hydraulische Leitfähigkeit der Samenschale kontrolliert, wobei beide während der Quellung ansteigen. Je nachdem in welcher Form das verfügbare Wasser vorliegt kann die Wasseraufnahme durch Diffusion aus Luftfeuchte oder über einen Massenfluss aus flüssigem Wasser erfolgen. Ein Same in feuchtem Sand nimmt Wasser mittels einer Kombination beider Mechanismen auf. Der zugrunde liegende Transportmechanismus in der Substanzpermeation über Samenschalen wurde mit einem neu entwickelten Versuchsaufbau in Steady-State Versuchen analysiert. Der Leitwert P für die Permeation der Modellsubstanzen lag hierbei zwischen 3.34 x 10-8 m s-1 für Abamectin und 18.9 x 10-8 m s-1 für Koffein. Die Substanzpermeation über die Samenschale verläuft über wässrige Permeationswege. Dies wurde daraus geschlossen, dass das molare Volumen anstelle der Substanzlipophilie den Leitwert bestimmt und dass der Temperatureffekt auf die Permeation klein ist. Dies ist im Gegensatz zur typischen Permeation über die Kutikeln von Blättern und Früchten, welche meist über lipophile Wege verläuft. Substanzaufnahme kann durch zwei verschiedene Mechanismen über die wässrigen Wege durch die Samenschale stattfinden. Aufnahme kann sowohl durch Diffusion stattfinden oder, in Gegenwart eines Volumenflusses von Wasser welcher durch eine Wasserpotentialdifferenz angetrieben wird, auch durch den solvent drag Mechanismus. Das Vorhandensein des solvent drag Aufnahmemechanismus beweist, dass die wässrigen Wege in der Samenschale ein wässriges Kontinuum durch die Samenschale bilden. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Kutikula, welche der Samenschale aufliegt, keine kontinuierliche Barriere um den Samen bildet. Um den Aufnahmeprozess von Substanzen unter anwendungsnahen Bedingungen zu untersuchen, wurde die Aufnahme eines aufgebeizten Pflanzenschutzmittelwirkstoffes im Feld in Versuchen simuliert. In der Situation eines gebeizten Samens im Feld löst sich der Beizrückstand an und der Wirkstoff kann sich entweder in Richtung umgebender Erde oder über die Samenschale in das Sameninnere bewegen. Die Aufnahme über die Samenschale kann mittels Diffusion oder durch den solvent drag Mechanismus erfolgen. Da der Beizmittelrückstand auf der Samenoberfläche mit der Zeit verarmt, liegt eine non-steady-state Aufnahmesituation vor. Um diese Prozesse zu simulieren, wurden Versuchsaufbaue für non-steady-state Versuche mit ganzen gebeizten Samen sowie als vereinfachtes Modell mit isolierten gebeizten Samenschalen etabliert. Indem die gemessene Wirkstoffaufnahme als Prozess erster Ordnung modelliert wurde, konnten die Geschwindigkeitskonstante k sowie die finale relative Aufnahmemenge Mt→∞ M0-1 berechnet werden. Mit k und Mt→∞ M0-1 konnten dann die Aufnahmekurven quantifiziert und verglichen werden. Sowohl in den Versuchen mit ganzen gebeizten Samen als auch in den Versuchen mit isolierten gebeizten Samenschalen war die Aufnahme von Metalaxyl-M um ein Vielfaches schneller als die Aufnahme von Sedaxane. Bei der Aufnahme von einem Beizmittelwirkstoff über die Samenschale spielt nicht nur das molare Volumen des Wirkstoffes eine Rolle, sondern auch seine Wasserlöslichkeit. In den Versuchen mit ganzen gebeizten Erbsen war der Effekt der Additive kleiner als in den Versuchen mit isolierten gebeizten Schalen oder nicht signifikant. In beiden Fällen war der Additiv-Effekt kleiner als der Effekt, der durch die Unterschiede in den Substanzeigenschaften hervorgerufen wurde. Daher sind die physikalisch-chemischen Eigenschaften des Wirkstoffes, insbesondere seine Wasserlöslichkeit, die wichtigsten Faktoren welche die Aufnahme in den gebeizten Samen bestimmen. KW - Samenschale KW - Permeation KW - Saatgutbeizung KW - seed coat KW - permeation KW - seed treatment Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-79585 ER - TY - THES A1 - Glöckner, Volker T1 - Untersuchungen zur Diversität, Abundanz und vertikalen Weitergabe von Bakterien in marinen Schwämmen T1 - Investigation of the diversity, abundance and vertical transmission of bacteria in marine sponges N2 - Marine Schwämme (Phylum Porifera) gehören mit ihrem ersten Auftreten im Präkambrium vor ungefähr 580 Millionen Jahren zu den ältesten Vertretern der Metazoen weltweit. Ähnlich lange leben sie wahrscheinlich schon in Symbiose mit Mikroorganismen. In der vorliegenden Doktorarbeit soll der karibische Schwamm Ectyoplasia ferox als Modellsystem zur Erforschung der Schwamm-assoziierten mikrobiellen Konsortien, deren Weitergabe und Interaktionen mit dem Schwamm, vorgestellt werden. Mit Hilfe von 16S rRNA-Genbanken sowie der denaturierenden Gradienten-Gelelektrophorese (DGGE) konnte gezeigt werden, dass Symbionten aus sechs der in E. ferox gefundenen acht Phyla sowie der „sponge-associated unclassified lineage” SAUL vertikal an die nächste Schwammgeneration weitergegeben werden. Mittels phylogenetischer Analysen wurden insgesamt 21 „vertical transmission“ (VT) Cluster identifiziert, von denen 19 in „sponge specific“ Cluster (SSC) bzw. „sponge coral“ Clustern (SCC) lagen. Daraus kann man schließen, dass ein Großteil des mikrobiellen Konsortiums von E. ferox über die reproduktiven Stadien weitergegeben wird. Auch konnten zwei Cyanobakterien identifiziert werden, die nicht in den reproduktiven Stadien vorhanden waren und höchstwahrscheinlich horizontal aus dem umgebenden Meerwasser aufgenommen wurden. Eine Reduzierung von 50% der Symbionten im Mesohyl nach dem „spawning“ zeigte erstmalig experimentell auf, dass Schwammsymbionten aus dem Schwamm in das umgebende Meerwasser gelangen können. In dieser Arbeit wurde zum ersten Mal der „presence vs. activity“-Vergleich zur Feststellung der metabolischen Aktivität von Bakterien auf die DGGE-Methode übertragen. Es konnte gezeigt werden, dass die meisten mikrobiellen Symbionten im Adult-Schwamm, Embryo- sowie Larvalstadium metabolisch aktiv waren. Erste Versuche die Anzahl von Symbionten in den Larven von E. ferox mittels Antibiotika zu reduzieren, verliefen positiv. So wiesen die mit Antibiotika behandelten Larven in der DGGE eine deutliche Reduzierung der Bandenintensität auf. Die Verfügbarkeit aller reproduktiver Stadien von E. ferox sowie die Möglichkeit die Larven im Labor experimentell zu manipulieren, machen E. ferox zu einem geeigneten Modellschwamm für zukünftige Studien bezüglich der vertikalen Weitergabe von Symbionten. N2 - Marine sponges (Phylum: Porifera) first appeared during Precambrian times 580 million years ago and are therefore the oldest metazoans on earth. It is most likely that they are living together in symbiosis with microorganisms from that day on. In this doctoral thesis I introduce the Caribbean sponge Ectyoplasia ferox as a model system for detailed investigations of the sponge associated microbial community, their mode of transmission to the next generation and interactions with their host sponge. The application of 16S rRNA gene clone libraries and denaturing gradient gel electrophoreses (DGGE) revealed that symbionts from six out of eight bacterial phyla as well as the ‘sponge-associated unclassified lineage’ (SAUL) were vertically transmitted to the next sponge generation. Phylogenetic analysis identified 21 vertical transmission (VT) clusters, from which 19 VT-clusters were affiliated with sponge-specific clusters (SSC) and sponge-coral clusters (SCC), respectively. This indicated that the majority of the microbial consortia of E. ferox has been passed on vertically via reproductive stages to the next generation. Furthermore two cyanobacterial clades were identified, which were absent from the reproductive stages and therefore seem to have be acquired horizontally from the surrounding seawater. Spawning led to a reduction of 50% of the sponge symbionts in the mesohyl, presenting for the first time experimental evidence, as to how sponge symbionts could end up in surrounding seawater. Moreover the presence vs. activity comparison that was undertaken to assess the metabolic activity of bacteria inside reproductive stages has been applied to DGGE for the first time. The results showed that most of the symbionts were metabolically active in the adult sponge as well as in the embryos and larvae. Initial experiments to reduce the amount of symbiotic bacteria inside larvae were positive. In the antibiotic treated larvae, the DGGE pattern showed a significantly reduced banding pattern intensity. The availability of E. ferox and its reproductive stages, as well as the possibility to maintain and to manipulate larvae in the laboratory makes E. ferox a suitable model-system for future research on vertical transmission. KW - Meeresschwämme KW - Bakterien KW - vertikale Weitergabe KW - Schwammsymbionten KW - Mikroorganismen KW - Symbionten KW - vertical transmission KW - sponge KW - microorganism KW - symbionts KW - Symbiose KW - Vertikale Übertragung KW - Schwamm Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-79327 ER - TY - THES A1 - Solanki, Narendra T1 - Novelty choice in Drosophila melanogaster T1 - Neuigkeitseffekt im Mustersehen von Drosophila melanogaster N2 - This study explores novelty choice, a behavioral paradigm for the investigation of visual pattern recognition and learning of the fly Drosophila melanogaster in the flight simulator. Pattern recognition in novelty choice differs significantly from pattern recognition studied by heat conditioning, although both paradigms use the same test. Out of the four pattern parameters that the flies can learn in heat conditioning, novelty choice can be shown for height (horizontal bars differing in height), size and vertical compactness but not for oblique bars oriented at +/- 45°. Upright and inverted Ts [differing in their centers of gravity (CsOG) by 13°] that have been extensively used for heat conditioning experiments, do not elicit novelty choice. In contrast, horizontal bars differing in their CsOG by 13° do elicit novelty choice; so do the Ts after increasing their CsOG difference from 13° to 23°. This indicates that in the Ts the heights of the CsOG are not the only pattern parameters that matter for the novelty choice behavior. The novelty choice and heat conditioning paradigms are further differentiated using the gene rutabaga (rut) coding for a type 1 adenylyl cyclase. This protein had been shown to be involved in memory formation in the heat conditioning paradigm. Novelty choice is not affected by mutations in the rut gene. This is in line with the finding that dopamine, which in olfactory learning is known to regulate Rutabaga via the dopamine receptor Dumb in the mushroom bodies, is dispensable for novelty choice. It is concluded that in novelty choice the Rut cAMP pathway is not involved. Novelty choice requires short term working memory, as has been described in spatial orientation during locomotion. The protein S6KII that has been shown to be involved in visual orientation memory in walking flies is found here to be also required for novelty choice. As in heat conditioning the central complex plays a major role in novelty choice. The S6KII mutant phenotype for height can be rescued in some subsets of the ring neurons of the ellipsoid body. In addition the finding that the ellipsoid body mutants ebo678 and eboKS263 also show a mutant phenotype for height confirm the importance of ellipsoid body for height novelty choice. Interestingly some neurons in the F1 layer of the fan-shaped body are necessary for height novelty choice. Furthermore, different novelty choice phenotypes for different pattern parameters are found with and without mushroom bodies. Mushroom bodies are required in novelty choice for size but they are dispensable for height and vertical compactness. This special circuit requirement for the size parameter in novelty choice is found using various means of interference with mushroom body function during development or adulthood. N2 - Diese Studie untersucht Novelty Choice, ein Verhaltens-Paradigma für die Untersuchung der visuellen Mustererkennung und des Lernens der Fliege Drosophila melanogaster im Flugsimulator. Mustererkennung in Novelty Choice unterscheidet sich deutlich von Mustererkennung durch heat conditioning, obwohl beide Paradigmen den gleichen Test verwenden. Von den vier Muster-Parametern, die die Fliegen im heat conditioning für die Musterunterscheidung lernen kann, lernt sie in Novelty Choice nur die Höhe (horizontale Balken in unterschiedlicher Höhe), Größe und vertikale Kompaktheit, nicht dagegen die schrägen Balken im Winkel von +/- 45°. Aufrechte und umgekehrte Ts [hinsichtlich ihrer Schwerpunkte (CsOG) um 13° voneinander verschieden], die bisher weitgehend für heat conditioning Experimente verwendet werden, lösen kein Novelty Choice aus. Im Gegensatz dazu reagiert die Fliege auf horizontale Balken, die sich in ihren CsOG um 13° unterscheiden, mit Novelty Choice. Auch die Ts lösen Novelty Choice aus, wenn ihre CsOG-Differenzen von 13° auf 23° erhöht wird. Dies deutet darauf hin, dass in den Ts die Höhen der CsOG nicht die einzigen relevanten Musterparameter für Novelty Choice Verhalten sind. Die Novelty Choice und heat conditioning Paradigmen unterscheiden sich darüber hinaus in der Rolle des Gens rutabaga (rut), das eine Typ-1-Adenylylcyclase codiert. Für dieses Protein wurde gezeigt, dass es bei der Gedächtnisbildung in der heat conditioning beteiligt ist. Novelty Choice wird nicht durch Mutationen im Gen rut beeinflusst. Dies steht im Einklang mit der Erkenntnis, dass Dopamin, das bei olfaktorischem Lernen bekanntermaßen Rutabaga über den Dopamin-Rezeptor Dumb in den Pilzkörpern reguliert, entbehrlich für die Novelty Choice ist. Die Schlussfolgerung ist, dass der Rut cAMP Signalweg bei der Novelty Choice nicht beteiligt ist. Novelty choice erfordert kurzfristigen Arbeitsgedächtnisspeicher, wie in der räumlichen Orientierung während der Fortbewegung beschrieben wurde. Das Protein S6KII, für welches gezeigt wurde, dass es am visuellen Orientierungsgedächtnis laufender Fliegen beteiligt ist, wird hier als ebenso notwendig für Novelty Choice entdeckt. Wie in heat conditioning spielt der Zentralkomplex eine wichtige Rolle in Novelty Choice. Der S6KII Mutantenphänotyp für Höhe kann in einigen Untergruppen der Ring-Neuronen des Ellipsoidkörpers gerettet werden. Weiterhin kann festgestellt werden, dass die Ellipsoidkörper-Mutanten ebo678 und eboKS263, welche ebenfalls einen Mutantenphänotyp für Höhe zeigen, die Bedeutung des Ellipsoidkörpers für die Novelty Choice hinsichtlich des Höheparameters bestätigen. Interessanterweise sind einige Neuronen in der F1-Schicht des Fächerförmigen Körpers notwendig für Novelty Choice (für Höhe). Darüber hinaus werden mit und ohne Pilzkörper unterschiedliche Phänotypen für verschiedene Musterparameter bei Novelty Choice gefunden. Die Pilzkörper sind in der Novelty Choice für Größe erforderlich, aber für Höhe und vertikale Kompaktheit sind sie entbehrlich. Diese spezielle Schaltungsvoraussetzung für den Größenparameter in Novelty Choice wird unter Verwendung verschiedener Mittel der Interferenz mit Pilzkörperfunktionen während der Entwicklung oder im Erwachsenenalter gefunden. KW - Drosophila melanogaster KW - Drosophila melanogaster Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-78377 N1 - Aus datenschutzrechtlichen Gründen wurde der Zugriff auf den Volltext zu diesem Dokument gesperrt. Eine inhaltlich identische neue Version ist erhältlich unter: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-103219 ER - TY - THES A1 - Blachutzik, Jörg O. T1 - Visualisierung von Plasmamembran-Domänen in Arabidopsis thaliana T1 - Visualization of plasma membrane domains in Arabidopsis thaliana N2 - Unter Verwendung fluoreszenzmarkierter Remorine der taxonomischen Gruppe 1b wurden Nanodomänen in Arabidopsis Plasmamembranen (PM) unter Verwendung hoch auflösender Laser Scanning-Systeme sichtbar gemacht. In diesen kompartimentierten Membranbereichen lagerten sich Sterol-abhängige Remorine aus verschiedenen Pflanzen-familien zusammen und zeigten dort Kolokalisation. Dies wurde statistisch belegt durch hohe Pearson und Spearman Korrelationskoeffizienten. Remorine konnten schließlich als pflanzliche Markerproteine für kompartimentierte Membranbereiche etabliert werden. Die Nanodomänen zeigten zu keinem Zeitpunkt laterale Bewegungen in der PM und scheinen sowohl von zytoskelettären Strukturen als auch von Komponenten der Zellwand stabilisiert zu werden. Möglicherweise spielen transmembrane Tetraspanine sowie GPI-verankerte SKU5-Proteine eine Rolle bei der stabilen Verankerung. Für zwei native Arabidopsis Remorine wurden posttranslationale Modifikationsstellen aufgedeckt, die der Anheftung dieser hydrophilen Proteine an die PM dienen. Weiterhin scheinen gleichartige Remorine miteinander zu interagieren. Beispielsweise waren im Zytosol lokalisierte Remorin-Mutanten bei einer gleichzeitigen Expression der entsprechenden Vollängenproteine erneut an der PM zu finden. Für die Remorine wurde postuliert, dass sie mit anderen Proteinen interagieren und dabei makromolekulare Strukturen ausbilden. Den Remorinen könnte daher eine Aufgabe bei der molekularen Organisation pflanzlicher Membrandomänen zukommen, indem sie ein filamentartiges Netzwerk innerhalb distinkter Domänen ausbilden, das möglicherweise zur Stabilität und Aufrechterhaltung dieser spezialisierten Bereiche beiträgt. Unter Einbeziehung der STED-Mikroskopie wurde eine empirische Größenverteilung von 97±4nm Durchmesser für PM-ständige Domänen in Arabidopsis ermittelt. Hinsichtlich der physiologischen Relevanz konnte gezeigt werden, dass die Domänen eine Rolle bei der ABA-vermittelten, kalziumabhängigen Regulation des Anionenkanals SLAH3 einnehmen. SLAH3 wird durch kalziumabhängige Kinasen aus der CDPK-Familie aktiviert, im Speziellen durch CPK21 und CPK23. Beide Kinasen werden durch die ABA-sensitiven Phosphatasen ABI1 und ABI2 reguliert. Die spezifisch stattfindenden Interaktionen zwischen SLAH3 und CPK21, sowie zwischen CPK21 und ABI1 waren auf Nanodomänen beschränkt und wurden durch die Methodik der bimolekularen Fluoreszenzkomplementation erstmals in planta nachgewiesen, mit Remorinen der taxonomischen Gruppe 1b als etablierte Markerproteine für Membrandomänen. N2 - In this work, membrane nanodomains have been visualized in planta via confocal microscopy of group 1b Remorin proteins fused to fluorescent proteins. Within these nanodomains, sterol-dependent Remorins originating from different plant species accumulated as shown by multiple color colocalization microscopy, and through which it was statistically verified by high Spearman and Pearson correlation coefficients. Thus, group 1b Remorins were established here as reliable marker proteins for plasma membrane (PM) nanodomains in plants. Since individual domains did not exhibit any kind of lateral movement within the plane of the membrane, a stabilization of them from cytoskeletal components as well as from components of the cell wall was presumed. Other proteins such as trans-membrane Tetraspanins and GPI-anchored proteins like SKU5 were ruled out as possible candidates being involved in the maintenance of domains´ lateral stability. For two Remorins originating from Arabidopsis thaliana, sites of posttranslational lipid modifications, which allow the proteins to anchor to the plasma membrane, were revealed. In experiments using truncated Remorins with these modification sites deleted, the mutant Remorins appeared to be no longer located at the PM but rather within the cytosol. Truncated Remorins re-appeared at the PM as soon as the full length Remorin proteins were co-expressed. In close proximity to the sites of lipid modifications a highly conserved C-terminal region, whose likely role is to facilitate homo-Remorin protein interactions, was uncovered. Therefore Remorins could possibly be involved in the molecular organization of a filamentous protein structure that could help mediate the stability and maintenance of individual domains. As well, the sizes of individual nanodomains were empirically measured in Arabidopsis thaliana mesophyll cells with STED microscopy, which allowed for optical measurements of domains with 60nm resolution, and were narrowly distributed in a histogram of domain diameters with an average diameter of 97 ± 4nm. One possible physiological role of PM-based nanodomains was demonstrated to be the ABA-mediated, calcium-dependent regulation of the SLAH3 anion channel. At the inception of the regulation, SLAH3 becomes activated upon phosphorylation by calcium-dependent protein kinases of the CDPK-family, CPK21 and CPK23. Both CPK´s in turn are regulated by the ABA-dependent phosphatases ABI1 and ABI2. As visualized by fluorescence colocalization microscopy for the first time, the interactions between SLAH3 and CPK21, as well as interactions between CPK21 and ABI1 were restricted to PM compartments. As well, these protein interactions were corroborated by also imaging them in planta using the bimolecular fluorescence complementation technique - involving group 1b Remorins as the established marker proteins for PM nanodomains. KW - Plasmamembran KW - Fluoreszmikroskopie KW - Ackerschmalwand KW - plasma membrane KW - fluorescence microscopy KW - Remorin KW - protoplasts KW - Protoplasten Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-71925 ER - TY - THES A1 - Derrer, Carmen T1 - Biophysikalische Aufschlüsselung des Transportzyklus von ZmSUT1, einem H+/Saccharose Symporter aus Mais T1 - Biophysical analysis of the transport cycle of ZmSUT1, a H+/sucrose symporter from maize N2 - Die Mesophyllzellen vollentwickelter Blätter stellen den Hauptort der Photosynthese höherer Pflanzen dar. Diese autotrophen Zellen (source-Gewebe) produzieren einen Überschuss an Kohlenstoff-Assimilaten, die für die Versorgung anderer heterotropher Gewebe und Organe, wie z.B. Früchten oder Wurzeln (sink-Gewebe), genutzt werden. Das Langstrecken-Transportsystem höherer Pflanzen, das Phloem, transportiert die Photoassimilate durch den gesamten Pflanzenkörper. Der zwischen source- und sink-Geweben herrschende hydrostatische Druckunterschied wird von osmotisch aktiven Substanzen generiert und treibt den Massenstrom in diesem Gefäßsystem an. Der nicht-reduzierende Zucker Saccharose stellt in den meisten höheren Pflanzen die Haupttransportform der photosynthetisch hergestellten Kohlenstoffverbindungen im Phloem dar. Protonen-gekoppelte Saccharosetransporter reichern Saccharose im Phloemgewebe mit einer 1000-fach höheren Konzentration (bis zu 1M), verglichen zum extrazellulären Raum, an. Aufgrund dieser einzigartigen Fähigkeit üben diese Carrier eine essentielle Rolle in der Phloembeladung aus und gewährleisten so die Versorgung der gesamten Pflanze mit Photoassimilaten. Saccharosetransporter können diese Energie-aufwändige Aufgabe nur durch eine enge Kopplung des zeitgleichen Transports von Saccharose und Protonen bewerkstelligen. Molekulare Einblicke in diesen physiologisch außerordentlich wichtigen Prozess der Zuckertranslokation sind jedoch bis heute immer noch sehr lückenhaft. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Saccharosetransporter ZmSUT1 aus Mais im heterologen Expressionssystem der Xenopus Oozyten exprimiert. ZmSUT1 generiert in Oozyten ungewöhnlich hohe Ströme im µA-Bereich, was diesen Zuckertransporter für präzise elektrophysiologische Messungen geradezu prädestiniert. Erste elektrophysiologische Messungen zur Substratspezifität zeigten, dass der synthetische Süßstoff Sucralose kein Substrat für ZmSUT1 darstellt. Darüber hinaus gelang es, Sucralose als kompetitiven Inhibitor der Saccharose-induzierten Transportströme von ZmSUT1 zu identifizieren. Die Verwendung dieses Saccharose-Derivats ermöglichte es, den Transportmechanismus in einzelne Schritte zu zerlegen und diese zu quantifizieren. Durch hochauflösende elektrophysiologische Messungen konnten transiente Ströme in der Abwesenheit jeglichen Substrats detektiert werden, die jedoch in der Anwesenheit sättigender Saccharosekonzentrationen erloschen. Diese sogenannten presteady-state Ströme (Ipre) zeichneten sich durch eine schnelle und eine langsame Komponente in der Relaxationskinetik der Ströme aus. Ipre konnten mit dem Binden der Protonen an den Transporter innerhalb des elektrischen Feldes der Membran in Verbindung gebracht werden. Somit führte die Analyse der presteady-state Ströme zur Aufklärung des ersten Schritts - dem Binden der Protonen - im Transportzyklus von ZmSUT1. Interessanterweise reduzierte der kompetitive Inhibitor Sucralose die langsame Komponente der presteady-state Ströme in Abhängigkeit von der Sucralosekonzentration, während die schnelle Komponente von Ipre unbeeinflusst blieb. Um dieses Verhalten erklären zu können und einen weiteren Schritt im Transportzyklus von ZmSUT1 zu studieren, wurde die Methode der Spannungsklemmen-Fluorometrie zur Untersuchung der Konformationsänderung von ZmSUT1 etabliert. Tatsächlich gelang es, zum ersten Mal die intramolekulare Bewegung eines pflanzlichen Transportproteins zu visualisieren. Detaillierte Analysen zeigten, dass die Konformationsänderungen von ZmSUT1, unabhängig von Saccharose, mit einer schwachen pH-Abhängigkeit auftraten. Interessanterweise wurde die Beweglichkeit des Transporters durch die Applikation des kompetitiven Inhibitors Sucralose deutlich reduziert. Dieser Effekt deutet, zusammen mit dem Sucralose-induzierten Verschwinden der langsamen Komponente der Ipre darauf hin, dass Sucralose den Transporter in seiner auswärts-gerichteten Konformation arretiert. Somit repräsentiert die Zugänglichkeit der extrazellulären Protonenbindestelle und folglich die Konformationsänderung den Geschwindigkeits-bestimmenden Schritt im Reaktionszyklus von ZmSUT1. Zusammenfassend gelang es in dieser Arbeit, das Binden der Protonen und den Zusammenhang mit der Bewegung des Proteins, von einer auswärts-gerichteten in eine einwärts-gerichtete Konformation, aufzuklären. Mit der Hilfe der Erkenntnisse aus dieser Arbeit konnte ein mechanistisches Modell für den Transportzyklus von ZmSUT1 entwickelt werden, anhand dessen alle Ergebnisse schlüssig erklärt und diskutiert werden konnten. N2 - Higher plants produce carbohydrates via photosynthesis in mesophyll cells of their leaves. These autotrophic cells export the excess of photoassimilates (source-tissue) to supply heterotrophic tissues, such as fruits and roots (sink-tissues), with carbon compounds. According to the Munch hypothesis, osmolytes generate the hydrostatic pressure difference between the source- and sink-tissues that drives the mass flow within the phloem vasculature. In most higher plants the non-reducing disaccharide sucrose represents the main mobile carbohydrate. Proton-driven sucrose transporter play a pivotal role in loading the phloem vessels for long distance transport of sucrose throughout the entire plant body. The strongly hyperpolarized plant membrane potential and the exceptional ability of sucrose carriers to accumulate sucrose quantities of more than 1 M in phloem cells, indicate that plants evolved transporters with unique functional properties. The transporter protein can achieve this task only because proton and sucrose transport are tightly coupled to each other. The knowledge about individual steps in the transport cycle of sucrose carriers is, however, still fragmentary. Within the scope of this work, the sucrose transporter ZmSUT1 from maize was expressed in the heterologous expression system of Xenopus oocytes. ZmSUT1 was found to mediate sucrose-induced proton currents in the µA range, predestinating this carrier for precise electrophysiological measurements of kinetic parameters in Xenopus oocytes. A basic electrophysiological characterization revealed that ZmSUT1 do not transport the synthetic sweetener sucralose but is competitively inhibited by this sucrose derivate. Having this tool in hands, individual steps of the ZmSUT1 transport cycle were dissected and quantified with sophisticated electrophysiological and fluorescence-based methods. Thereby transient currents in the absence of any substrate, which disappeared in the presence of saturating sucrose quantities, could be measured. These so-called presteady-state currents were composed of a fast and a slowly decaying current component and could be associated with the binding of protons to a binding site at the transporter within the electrical field of the membrane. Thus, the study of presteady-state currents allowed us to individually characterize the first step in the transport cycle of ZmSUT1 – the binding of protons to ZmSUT1. Interestingly, the slow current component disappeared in the presence of the competitive inhibitor sucralose. To understand this behavior and to elucidate conformational rearrangements within the carrier associated with the transport of sucrose, we visualized movements of ZmSUT1 using the voltage clamp fluorometry technique. Indeed, we for the first time were able to monitor conformational changes of a plant transport protein. Detailed analysis revealed that conformational changes of ZmSUT1 occur in the absence as well as in the presence of its substrate. However, upon application of the inhibitor sucralose the movements of the ZmSUT1 proteins were markedly reduced. This fact, taken together with the disappearance of the slow presteady-state component, let us conclude that sucralose seem to lock ZmSUT1 in its outward-facing conformation. The rate-limiting step of the reaction cycle is determined by the accessibility of the extracellular proton binding site and thus by conformational changes of the ZmSUT1 protein. Taken together our studies resolved the first step in the reaction cycle of a plant sucrose transporter - the binding of protons to the carrier - and its interrelationship with the alternating movement of the protein. Based on these results a mechanistic transport model of plant sucrose transporters was drawn and discussed. KW - Mais KW - Saccharose KW - Symport KW - ZmSUT1 KW - Transport KW - Saccharose KW - Spannungsklemmen-Fluorometrie KW - VCF KW - presteady-state Ströme KW - sucrose KW - transport KW - voltage clamp fluorometry KW - presteady-state Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-78949 ER - TY - THES A1 - Rümer, Stefan T1 - Untersuchungen zur oxidativen Bildung von Stickstoffmonoxid in Pflanzen sowie zur Visualisierung von Stickstoffmonoxid mittels Fluoreszenzfarbstoffen T1 - Oxidative NO formation in plants and visualisation of nitric oxide with fluorescence indicators? N2 - Stickstoffmonoxid (NO) ist ein gasförmiges, relativ stabiles Radikal, das in Pflanzen u. a. durch Reduktion aus Nitrit unter Katalyse des Enzyms Nitratreduktase gebildet wird. In tierischen Organismen wird NO dagegen über einen oxidativen Syntheseweg aus der Ami-nosäure L-Arginin katalysiert durch verschiedene Isoformen der NO-Synthasen (NOS) hergestellt. Es besitzt im tierischen System vielfältige Funktionen u. a. als Neurotransmitter sowie Blutfluss und -druck regulierendes Agens. Im Pflanzenreich werden NO u. a. Aufgaben bei der Regulierung von Spaltöffnungen, der Abwehr von Pathogenen sowie der Differenzierung der Xylemelemente zugeschrieben. Die vorliegende Arbeit verfolgte zwei Ziele: - Erforschung alternativer oxidativer Synthesewege von NO in Pflanzen und - Untersuchung der NO-Spezifität der DAF-Fluoreszenzfarbstoffe ausgehend Diskrepanzen zwischen Daten aus Floureszenzanalysen und der Gasphasen-Chemilumineszenz in früheren Arbeiten unserer Arbeitsgruppe und zahlreichen weiteren Publikationen. a) NO-Produktion aus Hydroxylaminen Hydroxylamin ist ein Zwischenprodukt bei der bakteriellen Denitrifizierung und wurde auch als Intermediat bei der Nitratreduktion in Pflanzen diskutiert. Hier wird gezeigt, dass Tabaksuspensionzellen in der Lage waren, exogenes Hydroxylamin schon in sehr niedrigen Konzentrationen (4 µM) zu NO zu oxidieren. Auch ein anderes HA-Derivat, nämlich der Hemmstoff der Alternativen Oxidase (AOX) in Mitochondrien, Salicylhydroxamsäure (SHAM), wurde zu NO oxidiert. Die Vermutung, reaktive Sauerstoffspezies (ROS) könn-ten bei diesem Oxidationsprozess eine Rolle spielen, wurde überprüft: Nach Einwirkung des ROS-abbauenden Enzyms Superoxid-Dismutase (SOD) konnte aber überraschender-weise keine Verminderung, sondern eher eine Steigerung der NO-Emission beobachtet werden. Die Rolle der SOD in diesem Reaktionsprozess ist daher noch nicht verstanden. b) NO-Detektion mittels Fluoreszenzindikatoren Zur Visualisierung und Lokalisierung von NO in tierischen und pflanzlichen Zellen und Geweben (in situ) mittels mikroskopischer (LSM) oder fluorimetrischer Methoden werden Fluoreszenzfarbstoffe, z. B. DAF-2 oder DAF-FM verwendet. Diese Farbstoffe reagieren mit NO zu stark fluoreszierenden Triazol-Derivaten. Eine Situation, in der Pflanzen u. a. mit NO-Freisetzung reagieren, ist der Pathogenbefall. Wir untersuchten die Reaktion von Tabaksuspensionszellen auf den pilzlichen Elicitor Cryptogein, ein Protein des Oomyceten Phytophthora cryptogea. Im Filtrat der Zellen, die mit Cryptogein behandelt wurden, zeigte sich nach Zugabe von DAF-Farbstoffen ein starker Fluoreszenzanstieg. Um die fluoreszenzerhöhenden Stoffe zu charakterisieren, wurde das Filtrat vor der DAF-Zugabe verschiedentlich behandelt. Bei Zugabe von KCN bzw. Katalase zum Überstand, verringerte sich der Fluoreszenzanstieg. Gleichzeitige Behandlung der Zellen mit Cryptogein sowie dem NADPH-Oxidase-Inhibitor DPI unterband den Fluoreszenzanstieg im Überstand nahezu komplett. Enzym-Assays mit Amplex Rot zeigten die Anhäufung von H2O2 im Filtrat der elicitierten Zellen. Neben ROS werden von Pflanzenzellen auch Peroxidasen in den Apoplasten sekretiert, die mit Hilfe von H2O2 für eine verstärkte Quervernetzung der Zellwand sorgen. Sowohl in unbehandelten Kontrollzellen als auch in elicitierten Zellen wurde Peroxidase-Aktivität nachgewiesen. Nach Zugabe von H2O2 und DAF-2 zum Filtrat von Kontrollzellen ergab sich ein Fluoreszenzanstieg ähnlich dem im Filtrat von behandelten Zellen. Mit Hilfe eines einfachen In-vitro-Systems aus Meerettich-Peroxidase (MR-PO), Wasser-stoffperoxid (H2O2) und DAF-2 konnten noch höhere Fluoreszenzwerte erzielt werden, was die Vermutung der Fluoreszenzerhöhung ohne Anwesenheit von NO erhärtete. Um diese nicht aus einer Reaktion mit NO resultierenden DAF-Produkte näher zu charak-terisieren, wurden Trennungen mittels Umkehrphasen-Hochdruck-Flüssigkeitschro-matographie mit Fluoreszenzdetektion (RP-HPLC-FL) und Massenspektrometrie (UPLC-MS) durchgeführt. Dabei wurden tatsächlich zwei neue Reaktionsprodukte festgestellt, die sich eindeutig von DAF-2T unterschieden. Letzteres konnte nur bei Hinzufügen des NO-Donors DEA-NO detektiert werden. Zur Erfassung von intrazellulären Reaktionsprodukten von DAF wurden die chromatogra-phischen Trennmethoden auch auf Extrakte von mit DAF-2 DA aufgeladenen und danach elicitierten Zellen angewandt. Bei dieser Auftrennung tauchten noch mehr DAF-Reaktionsprodukte auf. Die Hauptfluoreszenz, die auch bei nicht inkubierten Zellen auf-trat, konnte auf eine Reihe sehr früh eluierender Substanzen zurückgeführt werden. Die zwei DAF-Derivate aus dem Überstand inkubierter Zellen bzw. der In-vitro-Reaktion (MR-PO+H2O2+DAF-2) tauchten jedoch überhaupt nicht auf. Vorläufige massenspektrometrische Analysen legen nahe, dass es sich bei den in Abwe-senheit von NO gebildeten zwei Verbindungen um isomere Dimere von DAF-2 handelt. N2 - Nitric oxide is a diatomic, gaseous, relatively stable radical that is mainly synthesized via a reduction of nitrate/nitrite or via an oxidation of amino groups. The latter pathway has been attributed a major role in NO production from the amino acid L-arginine catalysed by three different isoforms of NO-synthases (NOS). In animals, NO fulfils a variety of well-known functions e. g. as neurotransmitter, blood-flow and -pressure regulating agent. In the plant kingdom, it plays a role in the regulation of stomatal movement, in the defense against pathogens and in xylogenesis. Major aims of this work were: - to search for alternative oxidative pathways for nitric oxide from reduced nitrogen compounds and - to unravel previous inconsistencies described in our group on NO production in plants as detected by gas phase chemiluminescence or by fluorescing NO specific dyes. a) NO production by oxidation of hydroxylamine (HA) Hydroxylamine was discussed as an intermediate in nitrate reduction in plants and appears conjugated to carbonyl compounds as oximes. Here it is shown that tobacco suspension cells are able to oxidize exogenous hydroxylamine to nitric oxide when applied in concen-trations as low as 4 µM. This was also observed after addition of another hydroxylamine, salicylhydroxamic acid (SHAM), which is a frequently applied inhibitor of mitochondrial Alternative Oxidase (AOX). Preliminary observations suggest that reactive oxygen species (ROS) play a role as oxidants. Addition of superoxide dismutase (SOD), an enzyme de-grading ROS, led to an even higher output of NO from hydroxylamine, which may indicate an involvement of H2O2. b) DAF-fluorescence without NO Fluorescent dyes (DAF-2, DAF-FM, DAR-4M) have been used widely to visualize NO production in tissues and single cells, mostly in connection with the LSM technique. By reaction with NO, these dyes form stable and highly fluorescing triazol-derivatives (e. g. DAF-2T). Much of the present knowledge on NO in plants is based on the use of these dyes. One important example out of many is the induction of NO production by treating plants with compounds (elicitors) provoking a hypersensitive response in specific target plants. Here, the system tobacco and the elicitor cryptogein, a peptide secreted from the oomycete Phytophthora cryptogea was used. This elicitor is specific for tobacco, and in-duces programmed cell death in tobacco suspension cells. When DAF-2 was added to a filtrate of cells preincubated with cryptogein, a strong fluo-rescence increase was observed. Addition of potassium cyanide (KCN) or catalase lowered this increase. Simultaneous treatment of cells with cryptogein and DPI, an NADPH-oxidase inhibitor, abolished fluorescence almost completely. Assays using the H2O2-sensitive dye amplex red indicated an accumulation of H2O2 in the filtrate of elicited cells. Besides ROS, plants secrete peroxidase enzymes into the apoplast which catalyze the crosslinking of cell wall polymers using H2O2. Peroxidase activity was observed both in the filtrate of control cells and cryptogein-treated cells. Addition of H2O2 and DAF-2 to the filtrate of untreated cells gave a fluorescence increase similar to that observed after addi-tion of DAF-2 to the filtrate of cryptogein-elicited cells, which was a first hint that fluores-cence could be induced without NO. An in-vitro-system consisting of horseradish-peroxidase (MR-PO), H2O2 and DAF-2 re-sulted in strong fluorescence increase, confirming that fluorescence took place even in the complete absence of NO. To further characterize suspected novel DAF-derivatives not related to NO, they were analysed by reverse-phase high-pressure liquid chromatography with fluorescence detection (RP-HPLC-FL) and mass spectrometry (UPLC-MS). Indeed, two new DAF-reaction products were discovered which could be clearly separated from DAF-2T. The reaction product of DAF-2 and NO was detected only when the NO-donor DEA-NO was added to the reaction mixture of the in-vitro-system (HR-PO + H2O2 + DAF-2), revealing three peaks, the two novel DAF-derivatives and DAF-2T. In order to elucidate intracellular reaction products formed inside DAF-2 DA preloaded cells during elicitation, extracts of suspension cells were also submitted to RP-HPLC-FL. In this case, a larger number of DAF-derivatives were found. Even in non-incubated cells, bulk fluorescence originated from a group of early eluting novel compounds. However, none of them could be matched with the two derivatives found in the cell filtrate or in vitro. Preliminary mass spectrometrical analyses suggest the two novel, highly fluorescing compounds formed in the absence of NO in vitro or the filtrate of elicited cells to represent isomeric dimers of DAF-2 which are linked via the amino-groups after reduction. KW - Stickstoffmonoxid KW - Synthese KW - Pflanzen KW - Nachweis KW - oxidative NO-Bildung KW - DAF KW - Fluoreszenz KW - Hydroxylamin KW - Salicylhydroxamsäure KW - nittric KW - oxide DAF KW - fluorescence KW - hydroxylamine KW - oxidative NO-formation Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-77115 ER - TY - THES A1 - Larisch, Christina T1 - Laser Mikrodissektion als Tool für gewebespezifische Expressionsanalysen in Pflanzen: Methodik und Anwendung T1 - Laser Microdissection as a tool for tissue specific expression analyses in plants: method and application N2 - Die Laser Mikrodissektion konnte in der vorliegenden Arbeit als geeignetes Tool für Expressionsanalysen pflanzlicher Gewebe weiterentwickelt werden. Nach einer umfangreichen Optimierung der Technik und Anpassung an die jeweiligen Gegebenheiten der zu analysierenden pflanzlichen Gewebe konnten unterschiedliche physiologische Fragestellungen an verschiedenen Pflanzen bearbeitet werden. Methodische Fortschritte Bei den Arbeiten an infiltrierten Arabidopsis-Pflanzen zeigten sich die methodischen Verbesserungen besonders deutlich: i. Die Zeit der Probengenerierung konnte um 60 80 % reduziert werden, wobei gleichzeitig die Qualität und Quantität der isolierten RNA erheblich verbessert wurden. ii. Dadurch konnte auf die in Deeken et al. (2008) beschriebene Voramplifikation, die stets zum Verlust niedrig exprimierter Gene führt, verzichtet und eine deutlich größere Zahl an im Phloem exprimierten Genen identifiziert werden. iii. Dass dabei 95 % der bei Deeken et al. beschriebenen Phloem-Gene wiedergefunden wurden, zeigt die hohe Reproduzierbarkeit der LMPC-Technik, die durch die Optimierung erreicht werden konnte. Pathogenantwort im Arabidopsis-Phloem iv. Die Laser Mikrodissektion konnte entsprechend i iii eingesetzt werden, um Phloem-Proben von Arabidopsis-Blütenstielen nach Pathogenbefall zu sammeln. v. Bei der Suche nach entsprechenden Phloem-mobilen Signalen, die in systemischen Geweben zur Auslösung der SAR führen, zeigte sich, dass im Phloem der Arabidopsis-Blütenstiele v. a. der Jasmonsäureweg angeschaltet wird. SAR-Marker fanden sich kaum induziert. vi. Im Vergleich der Mikroarray- und qPCR-Ergebnisse wird deutlich, dass mittels LMPC die Vorgänge im Phloem deutlich besser aufgelöst werden können, da die Untersuchungen an kompletten Blütenstielen deutliche Abweichungen gegenüber den Phloem-Arrays aufwiesen. Die Analysen der Mikroarrays sowie die zugehörigen Zeitreihenexperimente sind noch nicht abgeschlossen. Pappel-Holzstrahlen als Schaltstelle der saisonalen Umsteuerung vii. Die Laser Mikrodissektion kann alternativ auch in einem inversen Ansatz angewendet werden. viii. Über auf diese Weise angereicherte Holzstrahlen der Pappel war es möglich, tiefgreifende Einblicke in die Saisonalität der Pappel zu erlangen. ix. Zusammen mit Metabolit- und qPCR-Analysen lieferten diese Ergebnisse einen zeitlichen Ablaufplan der zugrundeliegenden physiologischen Prozesse, insbesondere bei der Umsteuerung von der Dormanz zur Wiederaufnahme des aktiven Wachstums im Frühjahr. N2 - In this dissertation, the Laser Microdissection could be further improved for usage as an adequate tool for expression analyses of plant tissues. Following a large optimization of the technique itself and an adaptation to the conditions of the plant tissues to be analyzed, different physiological questions could be processed using distinct plant species. Methodic improvements Especially while working with infiltrated Arabidopsis plants the methodic improvements were visible: i. The time for sample-generation could be decreased by 60-80 %, at the same time quality and quantity of the isolated RNA could be significantly enhanced. ii. By this the in Deeken et al. (2008) described pre-amplification step, which always leads to loss of low expressed genes, could be omitted, and a considerable higher number of phloem-expressed genes could be identified. iii. Finding 95 % of the in Deeken et al. specified genes in the new list demonstrates the high reproducibility of the LMPC-technique which could be achieved by the optimization. Pathogen response in the Arabidopsis phloem iv. The Laser Microdissection could be used accordingly to i-iii to collect phloem-samples of Arabidopsis inflorescence stalks after a pathogen infection. v. By searching for corresponding phloem-mobile signals that lead to an induction of SAR in systemic tissues it appeared that predominantly the jasmonic acid pathway activated in the phloem of Arabidopsis inflorescence stalks. SAR-marker genes were hardly induced. vi. Comparison of the microarray- and qPCR-data revealed that LMPC shows the processes in the phloem more specific, because analyses of complete inflorescence stalks showed explicit differences to the phloem-microarrays. Analyses of the microarrays as well as the corresponding time course experiments are not yet completed. Poplar wood rays as switch point of seasonal remodeling vii. Alternatively, the Laser Microdissection can be used in an inverted approach. viii. By this approach enriched poplar wood rays allowed deep insight into seasonality of poplar. ix. Together with metabolite- and qPCR-analyses these results provided a timetable of underlying physiological processes, especially during the remodeling from dormancy to resumption of active growth in spring. KW - Pappel KW - Ackerschmalwand KW - Laser KW - Mikrodissektion KW - Pflanzengewebe KW - Genexpression KW - Laser Mikrodissektion KW - Saisonalität KW - Holzstrahlen KW - systemische Resistenz KW - Laser Microdissection KW - seasonality KW - wood rays KW - systemic resistance Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-70182 ER - TY - THES A1 - Gohlke, Jochen T1 - Die Rolle von DNA-Methylierungen in der Entwicklung und Physiologie vonAgrobacterium-induzierten Arabidopsis-Tumoren T1 - The role of DNA methylation in development and physiology of Agrobacterium-induced Arabidopsis tumors N2 - Agrobacterium tumefaciens ist ein pathogenes Bodenbakterium, welches nach Integration seiner T-DNA in das pflanzliche Genom die Bildung von tumorartigen Wucherungen, den sogenannten Wurzelhalsgallen, an einer Reihe unterschiedlicher Wirtspflanzen verursacht. Die Expression der T-DNA-codierten Onkogene resultiert in der Proliferation und Differenzierung der sogenannten Wurzelhalsgallen, einem Prozess, welcher mit weitreichenden transkriptionellen und physiologischen Veränderungen verbunden ist. Für DNA-Methylierungen ist bekannt, dass diese zu Genexpressionsveränderungen beitragen, welche neoplastisches Wachstum in Säugetieren begünstigen. Über die Funktion epigenetischer Prozesse für die Physiologie und Entwicklung pflanzlicher Tumore ist bisher hingegen wenig bekannt. Daher wurde in dieser Arbeit das Methylierungsmuster von Wurzelhalsgallen, welche an Arabidopsis thaliana induziert wurden, sowohl genomweit als auch auf Basis einzelner Gene bestimmt. Dabei zeigte sich, dass die Onkogene ipt, iaaH und iaaM welche mit der T-DNA ins Genom integriert werden und die Proliferation auslösen, im Tumorgewebe unmethyliert vorliegen. Dennoch sind die Onkogene empfänglich gegenüber epigenetischen Modifikationen, da die siRNA-vermittelte Methylierung sowohl ihre Transkription als auch das Tumorwachstum unterbindet. Eine genomweite Studie der DNA-Methylierungsmuster mittels Tiling-Array-Analysen von immunopräzipitierter methylierter DNA zeigte ein global hypermethyliertes Tumor-Genom im Vergleich zum tumorfreien Sprossgewebe. Diese Beobachtungen stehen im Gegensatz zu den Methylierungsmustern der meisten Säuger-Tumore, welche typischerweise mit globaler Hypomethylierung und lokaler Hypermethylierung von Promotor-Sequenzen assoziiert sind. Im Unterschied dazu waren die Promoter-Sequenzen im Pflanzentumor eher hypomethyliert. Die Methylierungsunterschiede zwischen Wurzelhalsgallen und Sprossgewebe korrelierten mit transkriptionellen Veränderungen. Speziell Gene, welche in Entwicklungsprozessen und Zellteilung involviert sind, waren von Methylierungsänderungen betroffen. Dies impliziert, dass insbesondere diese Prozesse epigenetisch kontrolliert werden. Die Methylierung von Genen, welche einer transkriptionellen Kontrolle durch ABA unterliegen, war durch eine ABA-Behandlung induzierbar. DNA-Methylierungen kontrollieren somit wahrscheinlich essenzielle physiologische Prozesse während der Tumorentwicklung wie beispielsweise die ABA-vermittelte Trockenstressanpassung. Arabidopsis-Mutanten, welche in Nicht-CG-Methylierungsprozessen beeinträchtigt sind, entwickelten größere Tumore als die Kontrollpflanzen der entsprechenden Wildtypen. Dies weist auf eine Inhibierung des Tumor-Wachstums durch ein hypermethyliertes Genom, insbesondere der Nicht-CG-Motive hin. Insgesamt zeigen die Ergebnisse, dass Genexpression, physiologische Prozesse und die Entwicklung pflanzlicher Tumore einer Regulation durch DNA-Methylierung unterliegen. N2 - Agrobacterium tumefaciens is a plant pathogen which causes formation of crown gall tumors on a wide range of host species as a result of integration of its T-DNA into the plant genome. Expression of the T-DNA encoded oncogenes triggers proliferation and differentiation of crown galls, a process which is associated with severe global gene expression and physiological changes. DNA methylation changes are known to contribute to transcriptional changes which facilitate neoplastic growth in mammals. However, the role of epigenetic processes in physiology and development of plant tumors is not yet understood. Therefore, in this study the methylation pattern of Arabidopsis crown galls was analyzed on a genome-wide and single gene level. The proliferation-provoking oncogenes ipt, iaaH and iaaM, which are integrated into the plant genome along with the T-DNA, were shown to be unmethylated in the tumor genome. Nevertheless, they are susceptible to epigenetic modifications as siRNA-mediated methylation prevented both oncogene transcription and subsequent tumor development. The genome-wide analysis of DNA methylation by methylcytosine immunoprecipitation and tiling arrays revealed a globally hypermethylated tumor genome compaired to that of the tumor-free stems. This contrasts the methylation patterns in most mammalian cancers, which are typically associated with global hypomethylation and local hypermethylation of gene promoters. In crown gall tumors, promoters where rather hypomethylated. Methylation differences of crown galls and stem tissue correlated well with transcriptional changes. Especially genes involved in development and cell division were differentially methylated, implying that these processes are epigenetically controlled in the tumor. Methylation of genes which are known to be transcriptionally inhibited in an ABA-dependent manner was inducible upon ABA treatment. This suggests that DNA methylation controls essential physiological processes during crown gall development, such as ABA-mediated drought stress adaption. Arabidopsis mutants impaired in non-CG methylation developed larger tumors than wild-type controls, which indicates that hypermethylation of non-CG motifs inhibits plant tumor growth. In summary, the results of this study provide evidence that gene expression, physiological processes and the development of plant tumors are regulated by DNA methylation. KW - Abscisinsäure KW - Ackerschmalwand KW - DNS KW - Methylierung KW - Wurzelhalsgalle KW - DNA-Methylierung KW - Wurzelhalsgallen KW - ABA KW - Tumorentwicklung KW - DNA methylation KW - crown galls KW - ABA KW - tumor development Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-77732 ER -