TY - THES A1 - Göhler, Antonia T1 - Untersuchung Karbohydrat-bindender Proteine mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung T1 - Studying carbohydrate binding proteins with high temporal and spatial resolution N2 - Das menschliche Genom verschlüsselt 30000 bis 40000 Proteine, von denen ein Großteil kovalent gebundene Karbohydrat-Gruppen an Asparagin-, Serin-, Threonin- oder Hydroxylysin-Resten trägt. Diese sogenannten Glykoproteine sind allgegenwärtige Bestandteile der extrazellulären Matrix von Zelloberflächen. Sie steuern Zell-Zell- und Zell-Matrix-Kommunikationen, können bei der roteinfaltung helfen bzw. die Proteinstabilität erhöhen oder Immunantworten regulieren. Die Auslösung von biologischen Prozesse erfordert aber Übersetzer der zuckerbasierten Informationen. Solche Effektoren sind die Lektine, unter ihnen auch die Galektine. Galektine binden spezifisch β-Galaktosen, weisen strukturelle Übereinstimmungen in der Aminosäuresequenz ihrer Zuckererkennungsdomänen (CRDs) auf und zeigen ein „jelly-roll“-Faltungsmuster, bestehend aus einem β-Sandwich mit zwei antiparallelen Faltblättern. Strukturell werden die CRDs in drei verschiedenen, topologischen Formen präsentiert. Proto-Typen existieren als nicht-kovalent verknüpfte Dimere der CRDs, Chimera-Typen besitzen neben der CRD eine Nicht-Lektin-Domäne und bei den Tandem-Repeat-Typen sind zwei verschiedene CRDs über ein kurzes Linker-Peptid kovalent verbunden. Galektine werden sowohl in normalem wie auch pathogenem Gewebe exprimiert und das zunehmende Wissen über die Beteiligung an verschiedenen Krankheiten und Tumorwachstum liefert die Motivation, strukturelle Aspekte und die Vernetzung von Lektinen detailliert, insbesondere im Hinblick auf ihre intrafamiliären Unterschiede, zu untersuchen. Durch die Kombination verschiedener Spektroskopie-Techniken mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung, basierend auf der Verwendung von Fluorophoren (intrinsisch und extrinsisch), werden in dieser Arbeit die Eigenschaften von Galektinen näher untersucht. Mit Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS) und Anisotropie-Messungen wird gezeigt, dass eine Liganden-Bindung bei Proto-Typ-Galektinen mit einer Verringerung des hydrodynamischen Radius einhergeht. Bei Tandem-Repeat- und Chimera-Typen bleibt der Radius konstant. Dafür skaliert die Diffusionskonstante von Tandem-Repeat-Typen anormal mit der molaren Masse. Die Anisotropie-Messungen werden parallel zu den FCS-Messungen durchgeführt, um einen Einfluss des Fluoreszenzmarkers auszuschließen. Mit Hilfe dieser Technik wird außerdem gezeigt, dass unterschiedliche Dissoziationskonstanten und Kinetiken für den Bindungsprozess innerhalb der Proto-Typ-Gruppe möglichweise auf unterschiedliche Konformationsdynamiken zurückgehen. Der Vergleich von hGal-1 und cG-1B verdeutlicht, dass strukturelle Ähnlichkeiten zwar ein identisches Bindungsverhalten hervorrufen können, der Oxidationsprozess der Proteine aber unterschiedlich ablaufen kann. Beide Methoden können so als sehr sensitive Techniken zur Untersuchung von Strukturmerkmalen bei Galektinen etabliert werden, wobei die Übertragbarkeit auf andere Glykoproteine gewährleistet ist. Weiterhin gilt Quervernetzung als eine der wichtigsten Eigenschaften von Galektinen, da durch die Vernetzung von Glykoproteinen auf der Zelloberfläche Signalwege aktiviert und Immunantworten reguliert werden. Um die räumliche organisation und Quervernetzung von hGal-1 auf den Oberflächen von Neuroblastomzellen nachzuweisen, eignet sich das hochauflösende Mikroskopieverfahren dSTORM sehr gut. Durch Verwendung des photoschaltbaren Fluorophors Alexa647 als spezifischem Marker für hGal-1, einem Standard-Weitfeld-Aufbau und verschiedenen Analyseverfahren, kann eine Clusterformation von hGal-1 auf der Zelloberfläche bestätigt werden. hGal-1 bildet Cluster mit einem mittleren Durchmesser von 81±7 nm aus. Der Durchmesser ist unabhängig von der Konzentration, während die Anzahl der Cluster davon abhängt. Für die Clusterausbildung ist ein Startpunkt, also eine minimale Dichte der Galektin-Moleküle, notwendig. Durch Blockierung der CRDs mit Laktose wird die Clusterbildung unterdrückt und die Spezifität der CRDs gegenüber β-Galaktosen erneut herausgestellt. Anders als dimeres hGal-1 binden Monomere deutlich schlechter an die Membranrezeptoren. Es werden keine Cluster ausgebildet, eine Quervernetzung von Membranrezeptoren ist nicht möglich. Außerdem kann es durch die Monomere zu einer vollständigen Markierung und damit Abkugellung der Zellen kommen. Möglicherweise wird der Zelltod induziert. Hochauflösende Mikroskopieverfahren sind durch den Markierungsprozess limitiert. Die bioorthogonale Click-Chemie eröffnet jedoch neue Möglichkeiten zur Markierung und Visualisierung von Biomolekülen, ohne die Notwenigkeit genetischer Manipulationen. Es werden modifizierte Zuckermoleküle in die Zellmembranen eingebaut, über eine 1,3-polare Cycloaddition mit einem Alkin markiert und ihre Verteilung mit Hilfe von dSTORM untersucht. Es wird nachgewiesen, dass die Zuckermoleküle in Clustern auftreten und Click-Chemie trotz dem Katalysator Kupfer an lebenden Zellen durchführbar ist. Die Bewegung der Gesamtcluster wird mittels Mean Square Displacement aufgeschlüsselt und eine Diffusionskonstante für Cluster im Bereich von 40 - 250 nm bestimmt. Zusammenfassend stellt die Kombination verschiedener Spektroskopie-Techniken ein gutes Werkzeug zur Untersuchung von Karbohydrat-bindendenden Proteinen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung dar und ermöglicht einen neuen Einblick in die Biologie der Galektine. N2 - The human genome encodes 30,000 to 40,000 proteins of which the majority have covalently linked carbohydrates at the amino acids asparagine, serine, hreonine and hydroxylysine. These so called glycoproteins are embedded in the extracellular matrix and presented on cell surfaces. Glycoproteins are important membrane proteins, which are involved in cell-cell or cell-matrix interactions, protein folding or missfolding and the regulation of immune responses. The glycan chains harbour ideal properties for high-density storage of biological information; they are the basis of the sugar code. To translate its structural information into physiological effects the interplay with endogenous lectins is important. Lectins, among them the family of galectins, translate the sugarbased information into biosignaling. Galectins are carbohydrate-binding proteins that bind β-galactosides. They share a core sequence consisting of 130 amino acids, and a β-sandwich fold with two antiparallel β-sheets. Structurally, they are divided into three groups: proto-types exist as non-covalent dimers of two carbohydrate-recognition domains (CRD). The chimera-types have a lectin and a non-lectin domain and tandem-repeat-types contain of two different CRDs covalently linked by a short peptide. They are differentially expressed by various normal and pathological tissues. Due to the documented relation between lectins and different diseases (tumour growth, immune responses) it is important to study structural properties and their cross-linking ability in solution, especially in view of their intrafamily diversification. Therefore different spectroscopic techniques are used. Intrinsic and extrinsic fluorophores allow fluorescent measurements with high spatial and temporal resolution. Combining FCS and anisotropy measurements structural information about lectins, glycoproteins and their relations are monitored. For prototype galectins the hydrodynamic radius decrease upon ligand binding. Tandemrepeat- and chimera-types do not change their dimensions whereas their diffusion constants, measured with FCS, scale anomalous with the molar mass. Anisotropy measurements are carried out in parallel. Since an intrinsic fluorophore of the protein (tryptophan) is exploited, no labelling is necessary. With the help of this technique I am able to show that different binding constants and kinetics of the binding process within the galectin-family are caused by various conformational dynamics. Comparing hGal1 and cG-1B, the oxidation processes reveal differences despite of structural and binding similarities. These two techniques are very sensitive and applicable to study structural characteristics of galectins. Cross-linking between galetins and glycoproteins on the cell surface have been proposed to function as an „on-off“-switch that regulates cell proliferation, differentiation and immune responsiveness. Direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) provide an opportunity to study the spatial organization and cross-linking ability of hGal-1 interacting with β-galactose specific receptors on the cell surface of neuroblastoma cells. Alexa647, which can be switched reliable between an on- and a very stable off-state, is used as specific galectin marker. Measurements are done on a standard widefield setup and a spot analysis of single molecules in order to resolve clustering and cross-linking of galectins with a spatial resolution of better than 50 nm. The mean cluster size of hGal-1 molecules on the cell surface of neuroblastoma cells is 81±7 nm. The cluster diameter is independent of the protein concentration, a starting point or minimal galectin density for cluster formation is needed and the specificity of the CRDs for galactosides is underlined. Monomeric hGal-1 molecules show a different binding behaviour. On the one hand there are less localizations detectable and on the other hand I find very densly labelled, spherically shaped cells. This can maybe interpreted as hGal1-induced apoptosis. Existing labeling strategies limitate the value of super-resolution microscopy. The bioorthogonal click-chemistry creates a new field for labeling and visualizing biomolecules in vivo without the requirement of genetic manipulation. By hijacking a cell’s biosynthetic machinery, a metabolic precursor functionalized with a bioorthogonal chemical tag is incorporated into target biomolecules, including glycans, lipids, proteins and nucleic acids. Because of this I combine click-chemistry and the super-resolution technique dSTORM for specific labelling of metabolized sugar molecules. The cluster formation of sugar molecules on living and fixed cells in the presence of copper is being studied. Copper has no negative influence on the living cells. The mean square displacement decode cluster movement and determine cluster diameters in the range of 40 - 250 nm. In summary, we show that a combination of various temporal and spatial highresolution fluorescence techniques can be used advantageously to obatin new insights into the biology of galectins. KW - Fluoreszenz KW - Glykoproteine KW - Fluoreszenzspektroskopie KW - Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie KW - Anisotropie KW - dSTORM-Mikroskopie KW - Galektine KW - Fluorescence KW - Microscopy KW - anisotropy KW - glycoproteins KW - galectins KW - fluorescence correlation spectroscopy KW - dSTORM Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-76665 ER - TY - THES A1 - Götz, Ralph T1 - Super-resolution microscopy of plasma membrane receptors and intracellular pathogens T1 - Hochauflösende Mikroskopie von Plasmamembran Rezeptoren und intrazellulären Pathogenen N2 - Humans tend to believe in what they can see with their own eyes. Hence, visualization methods like microscopy have always been extremely popular since their invention in the 17th century. With the advent of super-resolution microscopy, the diffraction limit of ~200 - 250 nm could be overcome to enable more detailed insights into biological samples. Especially the single molecule localization microscopy method dSTORM offers the possibility of quantitative bioimaging. Hereby, the repetitive photoswitching of organic dyes in the presence of thiols is exploited to enable a lateral resolution of 20 nm. Another, recently introduced super-resolution method is expansion microscopy (ExM) which physically expands the sample to increase the resolution by the expansion factor from four to even twenty. To enable this, the sample is embedded into a hydrogel, homogenized using an unspecific proteinase and expanded in distilled water. Within this thesis, both methods were used to shed light on plasma membrane receptor distributions and different bacterial and fungal pathogens. In the first part of this thesis dSTORM was used to elucidate the “Receptome”, the entirety of all membrane receptors, of the cell line Jurkat T-cells and primary T-cells. Within this project we could successfully visualize and quantify the distribution of the plasma membrane receptors CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD11a, CD20, CD28, CD45, CD69 and CD105 with receptor densities ranging from 0.8 cluster/µm² in case of CD20 and 81.4 cluster/µm² for the highly abundant CD45 in activated primary T-cells at the basal membrane. Hereby, we could also demonstrate a homogeneous distribution of most receptors, while only few were clustered. In the case of CD3-clusters were detected in Jurkat T-cells and in primary activated T-cells, but not in naïve ones, demonstrating the activation of this receptor. This was followed by the application of dSTORM to three different clinical projects involving the receptors CD38, BCMA and CD20 which are immunotherapeutic targets by monoclonal antibodies and CAR T-cells. In the first two projects dSTORM was applied to determine the receptor upregulation upon exposure of various drugs to MM1.S cells or primary multiple myeloma patient cells. This increase in membrane receptor expression can subsequently enhance the efficacy of therapies directed against these receptors. Within the CD20-project, the superior sensitivity of dSTORM compared to flow cytometry could be demonstrated. Hereby, a substantially higher fraction of CD20-positive patient cells was detected by dSTORM than by flow cytometry. In addition, we could show that by dSTORM CD20-positive evaluated cells were eradicated by immunotherapeutic CAR T-cell treatment. These studies were followed by whole cell super-resolution imaging using both LLS-3D dSTORM and 10x ExM to exclude any artifacts caused by interactions with the glass surface. In 10x ExM signal amplification via biotinylated primary antibodies and streptavidin ATTO 643 was essential to detect even single antibodies directed against the heterodimer CD11a with standard confocal microscopes. Albeit probably not quantitative due to the process of gelation, digestion and expansion during the ExM protocol, even some putative dimers of the receptor CD2 could be visualized using 10x ExM-SIM, similar to dSTORM experiments. Within the second part of this thesis, expansion microscopy was established in bacterial and fungal pathogens. ExM enabled not only an isotropic fourfold expansion of Chlamydia trachomatis, but also allowed the discrimination between the two developmental forms by the chlamydial size after expansion into reticulate and elementary bodies. Hereafter, a new α-NH2-ω-N3-C6-ceramide was introduced enabling an efficient fixation and for the first time the use of lipids in both, 4x and 10x ExM, termed sphingolipid ExM. This compound was used to investigate the ceramide uptake and incorporation into the cell membrane of Chlamydia trachomatis and Simkania negevensis. For Chlamydia trachomatis the combined resolution power of 10x ExM and SIM even allowed the visualization of both bacterial membranes within a distance of ~30 nm. Finally, ExM was applied to the three different fungi Ustilago maydis, Fusarium oxysporum and Aspergillus fumigatus after enzymatic removal of the fungal cell wall. In case of Ustilago maydis sporidia this digestion could be applied to both, living cells resulting in protoplasts and to fixed cells, preserving the fungal morphology. This new protocol could be demonstrated for immunostainings and fluorescent proteins of the three different fungi. N2 - Menschen neigen schon immer dazu, vor allem das zu glauben, was sie mit eigenen Augen sehen können, weswegen mikroskopische Methoden seit ihrer Erfindung im 17. Jahrhundert schon immer sehr beliebt waren. Mit der Einführung der hochauflösenden Mikroskopie konnte das Auflösungslimit von ~200 - 250 nm durchbrochen werden, was genauere Einblicke in biologische Proben ermöglichte. Insbesondere die Einzelmolekül-Lokalisations-Mikroskopie Methode dSTORM bietet hierbei die Möglichkeit der quantitativen Bildgebung. Sie nutzt das wiederholte Schalten organischer Farbstoffe in Anwesenheit von Thiolen, was eine Auflösung von bis zu 20 nm möglich macht. Eine weitere kürzlich entwickelte hochauflösende Mikroskopiemethode ist die Expansionsmikroskopie (ExM), in welcher die Probe isotrop vier- bis sogar zwanzigfach vergrößert wird, womit sich auch die Auflösung um diesen Faktor vergrößert. Um dies zu ermöglichen, wird die Probe in ein Hydrogel eingebettet, mittels einer unspezifischen Proteinase homogenisiert und in destilliertem Wasser expandiert. Innerhalb dieser Arbeit wurden beide Methoden genutzt, um sowohl die Verteilung von Plasmamembran Rezeptoren als auch unterschiedliche bakterielle und pilzliche Pathogene zu beleuchten Im ersten Teil dieser Arbeit wurde dSTORM genutzt, um das „Rezeptom“, die Gesamtheit aller Membranrezeptoren, sowohl von Jurkat T-Zellen als auch von primären Patientenzellen zu entschlüsseln. In dieser Arbeit konnten die Rezeptoren CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD11a, CD20, CD28, CD45, CD69 und CD105 erfolgreich visualisiert und quantifiziert werden, welche Dichten von 0,8 Cluster pro µm² im Falle von CD20 und 81,4 Cluster pro µm² für den stark exprimierten Rezeptor CD45 in aktivierten primären T-Zellen auf der basalen Membran aufwiesen. Hierbei konnten wir für einen Großteil der Rezeptoren eine homogene Verteilung nachweisen, wohingegen nur wenige andere Rezeptoren Cluster zeigten. Für CD3 konnten sowohl in Jurkat T-Zellen als auch in aktivierten primären Zellen Cluster detektiert werden, was auf deren Aktivierung hinweist, wohingegen CD3 in naiven Zellen homogen verteilt war. Im Weiteren wurde dSTORM im Rahmen von drei klinischen Fragestellungen angewandt, in welche die Rezeptoren CD38, BCMA und CD20 involviert waren, die in Immuntherapien mit monoklonalen Antikörpern oder auch CAR T-Zellen adressiert werden. In den beiden erstgenannten Projekten wurde dSTORM genutzt, um die Erhöhung der Rezeptoren-Expression nach Zugabe verschiedener Medikamente sowohl in der Zelllinie MM1.S als auch in primären Zellen von Patienten mit multiplen Myelomen zu bestimmen. Durch das CD20-Projekt hingegen wurde die überlegene Sensitivität von dSTORM gegenüber der Durchflusszytometrie unter Beweis gestellt. Hier konnte verglichen mit der Durchflusszytometrie eine deutlich höhere CD20-positive Fraktion in Patientenzellen detektiert werden, welche nach Behandlung mit CD20 CAR T-Zellen eliminiert wurde. Hierauf folgte hochauflösende Bildgebung ganzer Zellen sowohl mit LLS-3D dSTORM als auch 10x ExM, um Interaktionen mit der Glasoberfläche ausschließen zu können. Bei 10x ExM wurde eine Signalamplifikation mittels Biotin und Streptavidin ATTO 643 benötigt, wonach sogar einzelne Antikörper, welche gegen den Heterodimer CD11a gerichtet waren, an einem herkömmlichen konfokalen Mikroskop detektiert werden konnten. Obwohl dies aufgrund der Prozesse von Gelierung, Verdau und Expansion während des ExM-Protokolls vermutlich nicht quantitativ ist, konnten sogar mutmaßliche Dimere des Rezeptors CD2 mit 10x ExM-SIM visualisiert werden, welche ähnlich in dSTORM Experimenten auftraten. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Expansionsmikroskopie für bakterielle und pilzliche Pathogene eingesetzt. ExM ermöglichte nicht nur eine isotrope vierfache Expansion von Chlamydia trachomatis, sondern auch die Unterscheidung der beiden Entwicklungsformen, der Retikulär- und Elementarkörperchen, aufgrund der Größe der einzelnen Chlamydien. Anschließend wurde ein neues α-NH2-ω-N3-C6-Ceramid eingeführt, was eine effiziente Fixierung und zum ersten Mal die Nutzung von Lipiden in 4x und 10x ExM ermöglichte, was wir Sphingolipid ExM nannten. Diese Verbindung wurde genutzt, um die Ceramid-Aufnahme und den -Einbau in die Zellmembran von Chlamydia trachomatis und Simkania negevensis zu untersuchen. Im Falle von Chlamydia trachomatis wurde die hohe Auflösung von 10x ExM mit SIM kombiniert, was die Visualisierung beider bakterieller Membranen in einem Abstand von ~30 nm ermöglichte. Hiernach wurde ExM bei den drei unterschiedlichen Pilzen Ustilago maydis, Fusarium oxysporum und Aspergillus fumigatus nach enzymatischen Verdau der pilzlichen Zellwand angewandt. Im Falle von Ustilago maydis Sporidien konnte der Verdau sowohl an lebenden Zellen, was in Protoplasten resultierte, als auch an fixierten Zellen verwendet werden, was die Morphologie erhielt. Mittels dieses neuen Protokolls konnten sowohl Immunfärbungen als auch fluoreszierende Proteine der drei genannten Pilze expandiert werden. KW - Mikroskopie KW - Microscopy KW - Super-resolution microscopy KW - Hochauflösende Mikroskopie Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-207165 ER - TY - THES A1 - Panzer, Sabine T1 - Spotlight on Fungal Rhodopsins: A Microscopic and Electrophysiological Study T1 - Pilzliche Rhodopsine im Rampenlicht: eine Mikroskopische und Elektrophysiologische Studie N2 - Microbial rhodopsins are abundant membrane proteins often capable of ion transport and are found in all three domains of life. Thus, many fungi, especially phyto-associated or phyto-pathogenic ones, contain these green-light-sensing photoreceptors. Proteins that perceive other wavelengths are often well characterized in terms of their impact on fungal biology whereas little is known about the function of fungal rhodopsins. In this work, five fungal rhodopsins, UmOps1 and UmOps2 from the corn smut Ustilago maydis as well as ApOps1, ApOps2 and ApOps3 from the black yeast Aureobasidium pullulans, were characterized electrophysiologically using mammalian expression systems and the patch-clamp technique to explore their ion transport properties. The latter three were modified using a membrane trafficking cassette, termed “2.0” that consists of the lucy rho motif, two Kir2.1 Golgi apparatus trafficking signals and a Kir2.1 endoplasmic reticulum export signal, what resulted in better plasma membrane localization. Rhodopsin mutants were created to identify amino acid residues that are key players in the ion transport process. Current enhancement in the presence of weak organic acids, that was already described before for the fungal rhodopsin CarO from Fusarium fujikuroi (García-Martínez et al., 2015; Adam et al., 2018), was investigated for the U. maydis rhodopsins as well as for ApOps2 by supplementing acetate in the patch-clamp electrolyte solutions. All five rhodopsins were found to be proton pumps unidirectionally transporting protons out of the cytosol upon green-light exposure with every rhodopsin exhibiting special features or unique characteristics in terms of the photocurrents. To name just a few, UmOps1, for example, showed a striking pH-dependency with massive enhancement of pump currents in the presence of extracellular acidic pH. Moreover, especially ApOps2 and ApOps3 showed very high current densities, however, the ones of ApOps3 were impaired when exchanging intracellular sodium to cesium. Concerning the mutations, it was found, that the electron releasing group in UmOps1 seems to be involved in the striking pH effect and that the mutation of the proton donor site resulted in almost unfunctional proteins. Moreover, a conserved arginine inside ApOps2 was mutated to turn the proton pump into a channel. Regarding the effect of weak organic acids, acetate was able to induce enhanced pump currents in UmOps1 and ApOps2, but not in UmOps2. Due to the capability of current production upon light illumination, microbial rhodopsins are used in the research field of optogenetics that aims to control neuronal activity by light. ApOps2 was used to test its functionality in differentiated NG108-15 cells addressing the question whether it is a promising candidate that can be used as an optogenetic tool. Indeed, this rhodopsin could be functionally expressed in this experimental system. Furthermore, microscopic studies were done to elucidate the localization of selected rhodopsins in fungal cells. Therefore, conventional (confocal laser scanning or structured illumination microscopy) as well as novel super-resolution techniques (expansion or correlated light and electron microscopy) were used. This was done on U. maydis sporidia, the yeast-like form of this fungus, via eGFP-tagged UmOps1 or UmOps2 expressing strains. Moreover, CarO-eYFP expressing F. fujikuroi was imaged microscopically to confirm the plasma membrane and tonoplast localization (García-Martínez et al., 2015) with the help of counterstaining experiments. UmOps1 was found to reside in the plasma membrane, UmOps2 localized to the tonoplast and CarO was indeed found in both of these localizations. This work gains further insight into rhodopsin functions and paves the way for further research in terms of the biological role of rhodopsins in fungal life cycles. N2 - Mikrobielle Rhodopsine sind häufig vorkommende Membranproteine, welche oft fähig sind, Ionen zu transportieren. Sie kommen in allen drei Domänen vor. So weisen auch Pilze – vor allem pflanzenassoziierte oder pflanzenpathogene – diese Grünlichtrezeptoren auf. Proteine, die andere Wellenlängen empfangen können, sind bereits häufig gut in Bezug auf ihren Einfluss auf die Pilzbiologie untersucht, wohingegen nur wenig über die Funktion der pilzlichen Rhodopsine bekannt ist. Hier wurden fünf Rhodopsine, UmOps1 und UmOps2 des Maisbeulenbrandes Ustilago maydis, sowie ApOps1, ApOps2 und ApOps3 des schwarzen Hefepilzes Aureobasidium pullulans bezüglich ihrer Ionentransport-Eigenschaften mit Hilfe von Säugerzelllinien und der Patch-Clamp Technik untersucht. Die drei letzteren wurden mit der „2.0“-Modifikation ausgestattet, bestehend aus dem lucy rho Motif, zwei Kir2.1 Golgiapparat Transfer- und einem Kir2.1 Endoplasmatischen Retikulum-Export-Signal, was zu einer besseren Plasmamembran-Lokalisierung der Proteine führte. Es wurden weiterhin Rhodopsin-Mutanten hergestellt um Aminosäuren zu identifizieren, welche im Ionentransport Schlüsselfunktionen einnehmen. Des Weiteren wurde der Effekt von schwachen organischen Säuren auf den Ionentransport der U. maydis Rhodopsine und auf ApOps2 mittels Supplementation der Patch-Clamp-Elektrolyten mit Acetat untersucht. Dieser Effekt wurde bereits früher für CarO aus Fusarium fujikuroi nachgewiesen (García-Martínez et al., 2015; Adam et al., 2018) und bezeichnet eine Erhöhung der lichtinduzierten Ströme durch die extrazelluläre Anwesenheit schwacher organischer Säuren. Alle fünf untersuchten Rhodopsine wurden als Grünlicht getriebene Pump-Rhodopsine identifiziert, welche Protonen unidirektional aus dem Zytosol transportieren. Hierbei zeigten die lichtinduzierten Ströme jedes Rhodopsins spezielle Eigenschaften und Merkmale. Unter anderem zeigte UmOps1 eine unerwartete pH-Abhängigkeit indem die Pumpströme bei extrazellulärem sauren pH massiv erhöht wurden. Des Weiteren zeigten sowohl ApOps2 als auch ApOps3 sehr hohe Stromdichten, wobei jedoch die von ApOps3 rapide abnahm, sobald intrazelluläres Natrium durch Caesium ersetzt wurde. Bezüglich der Rhodopsin- Mutanten konnte gezeigt werden, dass die Proton-Releasing-Group von UmOps1 wahrscheinlich in die erstaunliche pH-Abhängigkeit involviert ist und dass die Mutation des Proton-Donors zu meist nicht funktionalen Proteinen führt. Ein konserviertes Arginin in ApOps2 wurde mutiert um das Pump-Rhodopsin in einen Kanal umzuwandeln. Der Schwache-Organische-Säure-Effekt konnte für UmOps1 und ApOps2, nicht aber für UmOps2 nachgewiesen werden. Wegen ihrer Ionentransport-Eigenschaften werden mikrobielle Rhodopsine in der Optogenetik eingesetzt um neuronale Zellen mittels Lichts zu steuern. Hier wurde ApOps2 benutzt um dessen Funktionalität in ausdifferenzierten NG108-15 Zellen zu testen und ob dieses Rhodopsin ein vielversprechender Kandidat für optogenetische Anwendungen wäre. In der Tat gelang es, ApOps2 funktional in diesem Testsystem zu exprimieren. Des Weiteren wurde die Lokalisation von UmOps1 und UmOps2 in Sporidien (hefeähnliche Form von U. maydis) mittels eGFP-Label untersucht, sowie die Plasmamembran- und Tonoplast-Lokalisierung von CarO-eYFP in F. fujikuroi (García- Martínez et al., 2015) mittels Gegenfärbungen bestätigt. Hierfür wurden konventionelle (konfokale Laserraster-, sowie strukturierte Beleuchtungsmikroskopie) und auch neuartige hochaufgelöste Mikroskopie-Methoden (Expansions- und korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie) verwendet. Es konnten hier weitere Einblicke in die Funktionen pilzlicher Rhodopsine gewonnen werden, welche den Weg für weitere Forschung in Bezug auf den Einfluss dieser Proteine auf das Leben der Pilze ebnen. KW - Opsin KW - Microscopy KW - Patch-clamp KW - Ustilago maydis KW - Aureobasidium pullulans KW - Expansion Microscopy Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-271859 ER - TY - THES A1 - Niehörster, Thomas T1 - Spektral aufgelöste Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie mit vielen Farben T1 - Spectrally resolved fluorescence lifetime imaging microscopy with many colours N2 - Die Fluoreszenzmikroskopie ist eine vielseitig einsetzbare Untersuchungsmethode für biologische Proben, bei der Biomoleküle selektiv mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert werden, um sie dann mit sehr gutem Kontrast abzubilden. Dies ist auch mit mehreren verschiedenartigen Zielmolekülen gleichzeitig möglich, wobei üblicherweise verschiedene Farbstoffe eingesetzt werden, die über ihre Spektren unterschieden werden können. Um die Anzahl gleichzeitig verwendbarer Färbungen zu maximieren, wird in dieser Arbeit zusätzlich zur spektralen Information auch das zeitliche Abklingverhalten der Fluoreszenzfarbstoffe mittels spektral aufgelöster Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie (spectrally resolved fluorescence lifetime imaging microscopy, sFLIM) vermessen. Dazu wird die Probe in einem Konfokalmikroskop von drei abwechselnd gepulsten Lasern mit Wellenlängen von 485 nm, 532nm und 640nm angeregt. Die Detektion des Fluoreszenzlichtes erfolgt mit einer hohen spektralen Auflösung von 32 Kanälen und gleichzeitig mit sehr hoher zeitlicher Auflösung von einigen Picosekunden. Damit wird zu jedem detektierten Fluoreszenzphoton der Anregungslaser, der spektrale Kanal und die Ankunftszeit registriert. Diese detaillierte multidimensionale Information wird von einem Pattern-Matching-Algorithmus ausgewertet, der das Fluoreszenzsignal mit zuvor erstellten Referenzpattern der einzelnen Farbstoffe vergleicht. Der Algorithmus bestimmt so für jedes Pixel die Beiträge der einzelnen Farbstoffe. Mit dieser Technik konnten pro Anregungslaser fünf verschiedene Färbungen gleichzeitig dargestellt werden, also theoretisch insgesamt 15 Färbungen. In der Praxis konnten mit allen drei Lasern zusammen insgesamt neun Färbungen abgebildet werden, wobei die Anzahl der Farben vor allem durch die anspruchsvolle Probenvorbereitung limitiert war. In anderen Versuchen konnte die sehr hohe Sensitivität des sFLIM-Systems genutzt werden, um verschiedene Zielmoleküle voneinander zu unterscheiden, obwohl sie alle mit demselben Farbstoff markiert waren. Dies war möglich, weil sich die Fluoreszenzeigenschaften eines Farbstoffmoleküls geringfügig in Abhängigkeit von seiner Umgebung ändern. Weiterhin konnte die sFLIM-Technik mit der hochauflösenden STED-Mikroskopie (STED: stimulated emission depletion) kombiniert werden, um so hochaufgelöste zweifarbige Bilder zu erzeugen, wobei nur ein einziger gemeinsamer STED-Laser benötigt wurde. Die gleichzeitige Erfassung von mehreren photophysikalischen Messgrößen sowie deren Auswertung durch den Pattern-Matching-Algorithmus ermöglichten somit die Entwicklung von neuen Methoden der Fluoreszenzmikroskopie für Mehrfachfärbungen. N2 - Fluorescence microscopy is an important and near-universal technique to examine biological samples. Typically, biomolecules are selectively labelled with fluorophores and then imaged with high contrast. This can be done for several target molecules simultaneously, using different fluorophores that are usually distinguished by their spectra. This thesis describes a method to maximize the number of simultaneous stainings. Not only the spectral information but also the temporal information of the fluorescence decay is exploited by means of spectrally resolved fluorescence lifetime imaging microscopy (sFLIM). Using a confocal laser scanning microscope, the sample is excited by three alternatingly pulsed lasers at 485 nm, 532 nm, and 640 nm. Fluorescence light is detected on 32 spectrally separated detection channels with high time resolution of a few picoseconds. Thus, in this setup, we record the excitation laser, the spectral channel, and the time of arrival for each fluorescence photon. This detailed multi-dimensional information is then processed by a pattern-matching algorithm that compares the fluorescence signal with reference patterns of the used fluorophores to determine the contribution of each fluorophore in each pixel. Using this technique we imaged five different stainings per excitation laser, implying that 15 simultaneous stainings should theoretically be achievable. Current constraints in the sample preparation procedure limited the number of simultaneous stainings to nine. In additional experiments, we exploited the sensitivity of the sFLIM system to image several different target molecules simultaneously with the same fluorophore, taking advantage of slight changes in the fluorescence behaviour of the fluorophore due to environmental changes. We also combined sFLIM with stimulated emission depletion (STED) to perform super-resolution multi-target imaging with two stainings that operated with one common STED laser. Thus, the simultaneous exploitation of several photophysical parameters, in combination with algorythmic evaluation, allowed us to devise novel modes of multi-target imaging in fluorescence microscopy. KW - Fluoreszenzmikroskopie KW - Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie KW - Konfokale Mikroskopie KW - STED-Mikroskopie KW - Fluoreszenz KW - Mustervergleich KW - Pattern Matching KW - sFLIM KW - TCSPC KW - Mikroskopie KW - Microscopy Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-296573 ER -