TY - THES A1 - Schwarze, Simone T1 - Untersuchung von Faltungs- und Funktionsdynamik isolierter Proteindomänen mittels Fluoreszenzlöschung T1 - Investigation of folding and function dynamics of isolated Protein Domains using fluorescence quenching N2 - Proteine bestehen aus einer spezifischen Sequenz verschiedener Aminosäuren, die ihre charakteristische Funktion bestimmt. Die große Variabilität an Aminosäuresequenzen ermöglichte die Evolution einer nahezu unbegrenzten Anzahl an Proteinen. Meistens nehmen diese Schlüsselpositionen ein, von robusten Baustoffen bis hin zu molekularen Maschinen. Daher kann eine Fehlfunktion gravierende Auswirkungen auf das Leben haben, z.B. Krankheiten wie Alzheimer oder Epilepsi. Um die Funktionen und Fehlfunktionen zu verstehen, ist eine umfassende Kenntnis der Proteinfaltung, der Protein-Protein Assoziation, sowie den Dynamiken innerhalb von Proteinen erforderlich. Diese Vorgänge wurden in dieser Arbeit an drei isolierten Proteindomänen durch die Anwendung der Fluoreszenzlöschmechanismen der H-Dimerbildung und des photoinduzierten Elektronentransfers untersucht. Der entfaltete Zustand der Bindungsdomäne BBL, das Teil des 2-oxo-acid Dehydrogenasekomplexes ist, wurde unter physiologischen Bedingungen mit Zirkulardichroismus (CD) und einer Kombination aus photoinduziertem Elektronentransfer und Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie analysiert. Beide Methoden zeigten übereinstimmend anhand von 20 in BBL einzeln eingefügten konservativen Punktmutationen, dass Seitenketteninteraktionen keine Auswirkungen auf die Sekundärstruktur des denaturierten Zustandes, den Ausgangspunkt der Faltung, haben. Mit Hilfe der Dekonvolation der CD-Spektren wurde zudem gezeigt, dass die Reststruktur im denaturierten Zustand der helikalen Proteindomäne von β-Strängen und β-Kehren dominiert wird, die eine entscheidende Funktion bei der Faltung in den nativen Zustand haben könnten. Die N-terminale Domäne (NTD), der für die Materialforschung hochinteressanten Spinnen-seidenfaser, ist für die Polymerisation des Spinnenseidenfadens auf den pH-Wechsel von pH 7 auf pH 6 hin verantwortlich. Dieser für die Proteinfunktion wichtige Prozess wurde durch die Einbringung eines extrinsischen Fluoreszenzschalters, basierend auf der H-Dimerbildung, mit der Stopped-Flow-Technik untersucht. Es wurde gezeigt, dass die NTDs 104 mit einer Rate von 3 x 10^8 M-1 s-1 assoziieren und somit nahezu das Geschwindigkeitslimit der Protein-Protein Assoziation erreicht wird. Zwei geladenen Seitenketten, der D39 und D40, kommt eine entscheidende Funktion in dem Prozess zu, da eine Mutation dieser die Assoziation verhindert. Des Weiteren wurde gezeigt, dass sich die NTD auf eine Erhöhung der Ionenstärke entgegengesetzt zu anderen Proteinen verhält: die Dissoziation wird beschleunigt, die Assoziation nicht beeinflusst. Gleiches Verhalten wurde auf den einzelnen Austausch der übrigen protonierbaren Aminosäureseitenketten hin beobachtet, ausgenommen die Mutation der E119, welche die Dissoziation verlangsamt. Daher scheint der makromolekulare Dipol, der auf Grund der Ladungsverteilung in der NTD entsteht, die Assoziation maßgeblich zu beeinflussen. Glutamatrezeptoren sind an der schnellen synaptischen Signalweiterleitung im Nervensys-tem von Vertebraten beteiligt. Die Konformationen der Ligandenbindungsdomäne (LBD) haben dabei entscheidende Auswirkungen auf die Funktion des Gesamtrezeptors. Diese wurden mit einer Kombination aus photoinduziertem Elektronentransfer und Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie untersucht. Mit dieser Methode wurde ein dynamisches Bild der gebundenen sowie ungebundenen Form der AMPA-spezifischen Glutamatrezeptor 2-LBD gezeigt. Es wurde zudem gezeigt, dass sich die Dynamiken in Abhängigkeit der Bindung von den Agonisten Glutamat und AMPA, dem partiellen Agonisten Kainate oder Cyclothiazid (CTZ), welches eine Dimerisierung der LBDs bewirkt, unterschiedlich verändern. Dies könnte eine Auswirkung auf die Funktion der Rezeptoren haben. Die Anwendung der Fluoreszenzlöschmechanismen der H-Dimerbildung und des photoinduzierten Elektronentransfers in dieser Arbeit hat gezeigt, dass diese die Möglichkeit bieten, unterschiedlichste Fragestellungen zu beantworten und so Einblicke in dynamische Funktionsweisen von Proteinen eröffnen. Kombiniert mit etablierten Fluoreszenzmethoden ist es so möglich quantitativ Kinetiken auf unterschiedlichen Zeitskalen zu untersuchen. N2 - Proteins are composed of a specific sequence of variable amino acids that specify their specific function. The vast variability of possible amino acid sequences allowed for the evolution of a nearly infinite number of different proteins. Mostly these will have key positions, reaching from strong building material to molecular machines. Therefore a malfunction will have an immense effect on life, i.e. diseases like Alzheimer disease or epilepsy. In order to understand the function and malfunction an intense understanding of the protein folding, the protein-protein association, as well as the protein dynamics is essential. These processes have been investigated in this thesis with three isolated protein domains by the application of the fluorescence quenching mechanisms of the H-dimer-formation and by the photoinduced electron transfer. The unfolded state of the binding domain BBL, which is part of the 2-oxo-acid-dehydrogenase-complex, was analysed under physiological conditions by circular dichroism (CD), and a combination of photoinduced electron transfer and fluorescence correlation spectroscopy. Both methods showed accordingly, using 20 singly implanted conservative point mutations in BBL, that side-chain interactions have no effect on the secondary struc-ture of the denatured condition, the initial state of the folding. Using deconvolution on the CD spectra it was shown in addition, that the remaining structure of the helical protein domain in the denatured state is dominated by β-strands and β-turns. These may have a decisive function during the folding in the native state. The N-terminal domain of the spider silk fibre, which is of high interest for the material research, is responsible for the polymerisation of the spider silk fibre during the pH-change from pH 7 to pH 6. This important process for the protein function was investigated with the Stopped-Flow technique by the application of an extrinsic fluorescence switch, based on the H-dimer formation. It was shown, that NTDs associate with a rate of 3 x 10^8 M-1 s-1, and so nearly reach the speed limit of the protein-protein association. In this process two charged side chains, the D39 and D40, have a decisive function, as a mutation of these will 106 avoid the association. Furthermore it was shown, that the NTD will react in opposition to other proteins on the increase of the ionic strength: the dissociation will be speeded up, and the association is not influenced. The identical behaviour was observed with the single ex-change of the other protonable amino acid side chains, except for the mutation of E119, which retards dissociation. Therefore the macromolecular dipol, that is formed by the charge distribution of the NTD, is obviously influencing the association. Glutamate receptors participate in the fast synaptic signal transfer in vertebrates. Here dif-ferent conformations of the ligand binding domain (LBD) have decisive effects on the function of the entire receptor. These have been investigated with a combination of photoin-duced electron transfer and fluorescence correlation spectroscopy. Using this method a dynamic behaviour of the bound and unbound form of the AMPA specific glutamate receptor 2 LBD was shown. Furthermore it was shown, that the dynamics will change differently in dependence of the binding of the agonist glutamate and AMPA, the partial agonist kainate or Cyclothiazide (CTZ), which effects a dimerization of the LBDs. This may have an effect on the function of the receptors. The use of the fluorescence quenching mechanisms of the H-dimer formation and the pho-toinduced electron transfer in this thesis has shown, that these offer the opportunity to an-swer a large range of questions and open a view to the dynamic functionality of proteins. Combined with established fluorescence methods it is possible to quantitatively investigate kinetic rates at different time scales. KW - Protein-Protein-Wechselwirkung KW - Fluoreszenzlöschung KW - Domäne KW - Proteindynamiken KW - H-Dimerbildung KW - Photoinduzierter Elektronentransfer KW - Spinnenseide KW - Glutamatrezeptor KW - BBL KW - protein dynamics KW - fluorescence quenching KW - Proteindomänen Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-107080 ER - TY - THES A1 - Wäldchen, Sina T1 - Super-Resolution-Mikroskopie zur Visualisierung und Quantifizierung von Glutamatrezeptoren und ADHS-assoziierten Proteinen T1 - Super-resolution microscopy for visualization and quantification of Glutamate receptors and ADHD-associated proteins N2 - Die Entwicklung hochauflösender Fluoreszenzmikroskopiemethoden hat die Lichtmikroskopie revolutioniert. Einerseits ermöglicht die höhere erzielte räumliche Auflösung die Abbildung von Strukturen, die deutlich unterhalb der beugungsbedingten Auflösungsgrenze liegen. Andererseits erhält man durch Einzelmoleküllokalisationsmikroskopiemethoden wie dSTORM (Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) Informationen, welche man für quantitative Analysen heranziehen kann. Aufgrund der sich dadurch bietenden neuen Möglichkeiten, hat sich die hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie rasant entwickelt und kommt mittlerweile zur Untersuchung einer Vielzahl biologischer und medizinischer Fragestellungen zum Einsatz. Trotz dieses Erfolgs ist jedoch nicht zu verleugnen, dass auch diese neuen Methoden ihre Nachteile haben. Dazu zählt die Notwendigkeit relativ hoher Laserleistungen, welche Voraussetzung für hohe Auflösung ist und bei lebenden Proben zur Photoschädigung führen kann. Diese Arbeit widmet sich sowohl dem Thema der Photoschädigung durch Einzelmoleküllokalisationsmikroskopie, als auch der Anwendung von dSTORM und SIM (Structured Illumination Microscopy) zur Untersuchung neurobiologischer Fragestellungen auf Proteinebene. Zur Ermittlung der Photoschädigung wurden lebende Zellen unter typischen Bedingungen bestrahlt und anschließend für 20−24 h beobachtet. Als quantitatives Maß für den Grad der Photoschädigung wurde der Anteil sterbender Zellen bestimmt. Neben der zu erwartenden Intensitäts- und Wellenlängenabhängigkeit, zeigte sich, dass die Schwere der Photoschädigung auch von vielen weiteren Faktoren abhängt und dass sich Einzelmoleküllokalisationsmikroskopie bei Berücksichtigung der gewonnenen Erkenntnisse durchaus mit Lebendzellexperimenten vereinbaren lässt. Ein weiteres Projekt diente der Untersuchung der A- und B-Typ-Glutamatrezeptoren an der neuromuskulären Synapse von Drosophila melanogaster mittels dSTORM. Dabei konnte eine veränderte Anordnung beider Rezeptortypen infolge synaptischer Plastizität beobachtet, sowie eine absolute Quantifizierung des A-Typ-Rezeptors durchgeführt werden. Im Mittelpunkt eines dritten Projekts standen Cadherin-13 (CDH13) sowie der Glucosetransporter Typ 3 (GluT3), welche beide mit der Aufmerksamkeitsdefizit-Hyperaktivitätsstörung in Verbindung gebracht werden. CDH13 konnte mittels SIM in serotonergen Neuronen, sowie radiären Gliazellen der dorsalen Raphekerne des embryonalen Mausgehirns nachgewiesen werden. Die Rolle von GluT3 wurde in aus induzierten pluripotenten Stammzellen differenzierten Neuronen analysiert, welche verschiedene Kopienzahlvariation des für GluT3-codierenden SLC2A3-Gens aufwiesen. Die Proteine GluT3, Bassoon und Homer wurden mittels dSTORM relativ quantifiziert. Während die Deletion des Gens zu einer erwartenden Verminderung von GluT3 auf Proteinebene führte, hatte die Duplikation keinen Effekt auf die GluT3-Menge. Für Bassoon und Homer zeigte sich weder durch die Deletion noch die Duplikation eine signifikante Veränderung. N2 - The emergence of super-resolution microscopy techniques caused a revolution of light microscopy. On the one hand, the higher achieved structural resolution allows for the visualization of structures below the diffraction limit. On the other hand, single molecule localization microscopy methods like dSTORM (Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) provide information that can be used for quantitative analysis. The new possibilities, offered by these approaches, lead to rapid development of the same and by now they are applied to investigate a broad range of biological and medical questions. Besides this success, it can’t be denied, that these methods also have some disadvantages like the necessity of relative high laser intensities that are needed for the high resolution and might cause photodamage in living samples. This work deals with the issue of photodamage induced by single molecule localization microscopy methods as well as the examination of neurobiological problems on protein level by the usage of dSTORM and SIM (Structured Illumination Microscopy). To identify photodamage, living cells were irradiated at typical conditions and were observed for 20−24 h afterwards. As a quantitative measure for the severity of photodamage, the fraction of dying cells was determined. Besides the expected dependency on intensity and wavelength, a lot of other factors showed to affect the severity. It could be demonstrated that single molecule localization microscopy can be combined with live-cell imaging if one takes those results into account. Another project aimed for the investigation of A- and B-type Glutamate receptors at the neuromuscular junction of Drosophila melanogaster via dSTORM. Thus, an altered arrangement of both receptor types could be observed and A-type receptors could be quantified absolutely. A third project focused on cadherin-13 (CDH13) and glucose transporter 3 (GluT3), which are connected with attention deficit hyperactivity disorder. CDH13 could be detected in serotonergic neurons and radial glial cells of dorsal raphe in embryonic mouse brains using SIM. The role of GluT3 was analyzed in neurons, differentiated from induced pluripotent stem cells, which possessed different copy-number variations of the gene SLC2A3, which codes for GluT3. Proteins GluT3, Bassoon and Homer were quantified relatively using dSTORM. While the deletion of the gene resulted in an expected decrease of GluT3 at the protein level, the duplication didn’t affect the amount of GluT3. In the case of Homer and Bassoon, neither the deletion, nor the duplication caused any significant changes. KW - Mikroskopie KW - Einzelmolekülmikroskopie KW - Quantitative Mikroskopie KW - Glutamatrezeptor KW - Aufmerksamkeitsdefizit-Syndrom KW - dSTORM KW - Photoschädigung KW - Neuromuskuläre Synapse KW - Glucosetransporter Typ3 KW - Cadherin-13 Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-192834 ER - TY - THES A1 - Rajab, Suhaila T1 - Untersuchung von Sub-Millisekunden Dynamiken und allosterischer Kommunikation in Ligandenbindedomänen ionotroper Glutamatrezeptoren T1 - Investigation of sub-millisecond dynamics and allosteric communication in ionotropic glutamate receptor ligand binding domains N2 - Ionotrope Glutamatrezeptoren (iGluRs) sind ligandengesteuerte Ionenkanäle und vermitteln den Großteil der exzitatorischen Signalweiterleitung im gesamten zentralen Nervensystem. Darüber hinaus spielen iGluRs eine entscheidende Rolle bei der neuronalen Entwicklung und Funktion, einschließlich Lernprozessen und Gedächtnisbildung. Da eine Fehlfunktion dieser Rezeptoren mit zahlreichen neurodegenerativen Erkrankungen verbunden ist, stellen iGluRs zudem wichtige Zielproteine für die pharmakologische Wirkstoffentwicklung dar. Im Allgemeinen wird zwischen drei Untergruppen ionotroper Glutamatrezeptoren unterschieden, welche aufgrund ihrer Selektivität für einen bestimmten Liganden benannt sind: AMPA-, Kainate-, und NMDA-Rezeptoren. Die iGluRs jeder dieser Untergruppen bestehen in der Regel aus vier Untereinheiten, welche wiederum aus vier semiautonomen Domänen aufgebaut sind: (i) die aminoterminale Domäne (ATD), (ii) die Ligandenbindedomäne (LBD), (iii) die Transmembrandomäne (TMD) und (iv) die carboxyterminale Domäne (CTD). Die Ligandenbindedomäne, welche wiederum aus zwei Lobes (D1 und D2) besteht und in ihrer Struktur einer Muschelschale ähnelt, vollzieht bei Bindung eines Neurotransmitters eine Konformationsänderung, wobei sie sich um den gebundenen Agonisten herumschließt. Diese Konformationsänderung der LBD wird auf die Transmembrandomäne, welche den membranüberspannenden Ionenkanal ausbildet, übertragen, was in einer Umlagerung der Transmembranhelices und infolgedessen der Öffnung des Ionenkanals resultiert. Die Konformationsänderung der LBD ist demnach die treibende Kraft, welche dem Öffnen und Schließen des Ionenkanals zugrunde liegt. Aus diesem Grund stellt die isolierte Ligandenbindedomäne, welche als lösliches Protein hergestellt werden kann, ein etabliertes Modellsystem zur Untersuchung der strukturellen und funktionellen Zusammenhänge innerhalb des Funktionsmechanismus ionotroper Glutamatrezeptoren dar. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Konformationsdynamiken der in Escherichia coli-Bakterien exprimierten isolierten Ligandenbindedomänen der drei homologen Untergruppen – AMPA-, Kainate- und NMDA-Rezeptoren – sowohl als Monomer als auch als Dimer untersucht. Hierbei wurden im ungebundenen Apo-Zustand der Proteine signifikante Kinetiken im Bereich von Nanosekunden bis Mikrosekunden festgestellt, welche bei Bindung eines Agonisten sowie bei Dimerisierung erheblichen Veränderungen zeigen. Darüber hinaus wurde allosterische Kommunikation zwischen den LBDs der NMDA-Untergruppe untersucht, wobei in der Tat ein deutlicher allosterischer Effekt in Bezug auf die Konformationsdynamiken der Proteine gemessen werden konnte. Weiterhin wurde ein PET-FCS-basiertes Verfahren zur Messung der Dissoziationskonstante der Bindung eines Liganden an die LBD eines AMPA-Rezeptors entwickelt. Zuletzt wurde außerdem ermittelt, ob ein Unterschied zwischen vollen und partiellen Agonisten hinsichtlich ihres Einflusses auf die Konformationsdynamiken einer AMPA-Rezeptor LBD besteht, was nachgewiesenermaßen nicht der Fall ist. Alle Messungen wurden auf Einzelmolekülebene auf Zeitskalen von Nanosekunden bis Millisekunden basierend auf Fluoreszenzfluktuationen unter Verwendung des photoinduzierten Elektronentransfers (PET) in Kombination mit Korrelationsspektroskopie (PET-FCS) durchgeführt. Zu diesem Zweck wurden PET-basierte Fluoreszenzsonden entwickelt, um Konformationsänderungen auf einer räumlichen Skala von einem Nanometer zu detektieren. Durch die Experimente innerhalb dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die PET-FCS-Methode eine vielversprechende Ergänzung zu allen bisher bestehenden Methoden zur Untersuchung der Konformationsdynamiken der Ligandenbindedomäne ionotroper Glutamatrezeptoren darstellt und daher eine aussichtsreiche Möglichkeit zur Erweiterung des zukünftigen Verständnisses der Funktionsweise von iGluRs bietet. N2 - Ionotropic glutamate receptors (iGluRs) are ligand-gated ion channels that mediate most of the excitatory signal transmission throughout the central nervous system. In addition, iGluRs play a crucial role in neural development and function, including learning and memory. Since receptor malfunction contributes to a variety of neurological diseases, iGluRs are key targets for drug development in pharmacology. Furthermore, ionotropic glutamate receptors are divided into three major subgroups, all of which are named due to their selectivity for a certain ligand: AMPA, Kainate and NMDA. Members of each subgroup usually consist of four subunits, which in turn comprise four semi-autonomous domains: (i) the amino terminal domain (ATD), (ii) the ligand binding domain (LBD), (iii) the transmembrane domain (TMD), and (iv) the carboxy terminal domain (CTD). Upon binding a neurotransmitter the ligand binding domain, which adopts a clamshell-like structure consisting of two domains (D1 and D2), undergoes a conformational change by closing around the ligand and trapping it within the binding cleft. The conformational change of the LBD is then transferred to the transmembrane domain which forms the membrane-spanning ion channel, which results in rearrangement of the transmembrane helices and consequently in opening of the ion channel. Accordingly, the conformational change of the LBD is the driving force underlying opening and closing of the ion channel. The isolated ligand binding domain can be produced as soluble protein and represents a well-established model system for exploring structural and functional relationships within the functional mechanism of ionotropic glutamate receptors. As part of this thesis, ligand binding domains of all three homologues – AMPAR, KainateR and NMDAR – have been expressed in Escherichia coli bacterial cells and conformational dynamics of the proteins both as monomer and as dimer have been investigated. In the unbound apo state of the proteins, significant kinetics have been observed in the nanosecond to microsecond time range which undergo considerable changes upon agonist binding or dimerization. In addition, allosteric communication between LBDs of the NMDA subgroup has been investigated, whereby a distinct allosteric effect regarding the conformational dynamics of the protein could actually be measured. Furthermore, a PET-FCS-based tool for measuring the dissociation constant of a ligand for an AMPA receptor LBD has been developed. Finally, it has been investigated whether full and partial agonists have different effects on the conformational dynamics of an AMPA receptor LBD, which has been found clearly not to be the case. All measurements have been performed at the single-molecule level on time scales from nanoseconds to milliseconds based on fluorescence fluctuations using photoinduced electron transfer (PET) fluorescence quenching in combination with correlation spectroscopy (PET-FCS). To this end, PET-based fluorescence probes have been engineered to monitor conformational changes on the one-nanometer scale. The experiments that have been carried out within this thesis introduce PET-FCS as a promising tool to complement all previously existing methods for studying conformational dynamics of ionotropic glutamate receptor ligand binding domains and hence offer a promising opportunity to expand future understanding of how iGluRs work. KW - Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie KW - Glutamatrezeptor KW - Einzelmolekülspektroskopie KW - Proteinsynthese KW - Photoinduzierter Elektronentransfer KW - photoinduced electron transfer KW - Ionotrope Glutamatrezeptoren KW - ionotropic glutamate receptors KW - Ligandenbindedomäne KW - ligand binding domain Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-244946 ER -