TY  - THES
A1  - Pietschmann, Thomas
T1  - Molekularbiologische Untersuchungen zur Funktion des Hüllproteins des Humanen Foamyvirus
T1  - Molecular studies on the envelope protein of the human foamy virus
N2  - Im Rahmen dieser Arbeit wurde gezeigt, dass fremde virale Hüllproteine wie das Env Protein des murinen Leukämievirus (MLV) oder das Glykoprotein des Virus der vesiklären Stomatitis (VSV) nicht in der Lage sind, die Funktion des homologen HFV Hüllproteins in Bezug auf die Viruspartikelfreisetzung des Humanen Foamyvirus zu übernehmen. Offenbar werden für die HFV Viruspartikelmorphogenese und -freisetzung spezifische Interaktionen zwischen dem Kapsid und dem homologen Hüllprotein benötigt. Mutationsanalysen ergaben, dass die membranspannende Domäne des HFV Hüllproteins in diesem Zusammenhang spezifische Aufgaben erfüllt, die nicht durch heterologe Formen der Membranverankerung übernommen werden können. Die Analyse der Fusionsaktivität verschiedener Hüllproteinmutanten zeigte, dass die zytoplasmatische Domäne des Proteins nicht essentiell für die Fusionsaktivität benötigt wird. Umfangreichere Deletionen, die auch Teile der langen membranspannenden Domäne des Proteins einschlossen, führten dagegen zum Verlust der Fusionseigenschaften des Hüllproteins. Innerhalb der membranspannenden Domäne des HFV Hüllproteins befindet sich ein konserviertes Lysin-Prolin Motiv, dessen Mutation sich auf den zellulären Transport und auf die Fusionsaktivität des Proteins auswirkte. Es zeichnet sich ab, dass die lange membranspannende Domäne des HFV Hüllproteins nicht nur als Membranverankerung dient, sondern zusätzlich für verschiedene Funktionen des Hüllproteins von Bedeutung ist.
N2  - In the course of these studies it was shown that heterologous viral envelope proteins like the Env protein of MLV (murine leukemia virus) and the glycoprotein of VSV (vesicular stomatitis virus) are not able to substitute for the HFV Env protein in HF virus (human foamy virus) particle morphogenesis. These data suggest that HFV capsids require specific interactions with their homologous envelope protein in order to be enveloped and released from the cell. A mutational analysis revealed that the long membrane-spanning domain (MSD) of HFV Env plays a key role in this respect, since it cannot be replaced by alternative forms of membrane anchorage. The analysis of fusion activity of various HFV env mutants showed that the cytoplasmic domain (CyD) is not required to mediate membrane fusion. However, fusogenicity was lost when C-terminal parts of the MSD were deleted. Furthermore, it was shown, that mutations of the conserved lysine-proline motif within the MSD result in altered transport and fusion activity of HFV Env. Together, these data imply that the MSD of HFV Env does not only function as a domain that anchors the protein in the lipid bilayer. Instead, it appears that it adopts a specific conformation that is required to mediate different functions of the HFV Env protein.
KW  - Spumaviren
KW  - Hüllproteine
KW  - Molekularbiologie
KW  - Foamyvirus
KW  - Retroviren
KW  - Hüllprotein
KW  - Morphogenese
KW  - Fusion
KW  - foamy virus
KW  - retro virus
KW  - envelope protein
KW  - morphogenesis
KW  - fusion
Y1  - 2000
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1879
ER  - 
TY  - THES
A1  - Shityakov, Sergey
T1  - Molecular modelling and simulation of retroviral proteins and nanobiocomposites
T1  - Simulationen und Interaktionen viraler Proteine sowie von   Kohlenstoffenanoröhren mit Membranen und Proteinen
N2  - Molecular modelling and simulation are powerful methods in providing important in-formation on different biological systems to elucidate their structural and functional proper-ties, which cannot be determined in experiment. These methods are applied to analyse versa-tile biological systems: lipid membrane bilayers stabilized by an intercalated single wall carbon nanotube and retroviral proteins such as HIV protease and integrase. HIV-1 integrase has nuclear localization signals (NLS) which play a crucial role in nuclear import of viral preintegration complex (PIC). However, the detailed mechanisms of PIC formation and its nuclear transport are not known. Previously it was shown that NLSs bind to the cell transport machinery e.g. proteins of nuclear pore complex such as transportins. I investigated the interaction of this viral protein HIV-1 integrase with proteins of the nuclear pore complex such as transportin-SR2 (Shityakov et al., 2010). I showed that the transportin-SR2 in nuclear import is required due to its interaction with the HIV-1 integrase. I analyzed key domain interaction, and hydrogen bond formation in transportin-SR2. These results were discussed in comparison to other retroviral species such as foamy viruses to better understand this specific and efficient retroviral trafficking route. The retroviral nuclear import was next analyzed in experiments regarding the retroviral ability to infect nondividing cells. To accomplish the gene transfer task successfully, ret-roviruses must efficiently transduce different cell cultures at different phases of cell cycle. However, promising and safe foamy viral vectors used for gene transfer are unable to effi-ciently infect quiescent cells. This drawback was due to their inability to create a preintegra-tion complex (PIC) for nuclear import of retroviral DNA. On the contrary, the lentiviral vec-tors are not dependant on cell cycle. In the course of reverse transcription the polypurine tract (PPT) is believed to be crucial for PIC formation. In this thesis, I compared the transduction frequencies of PPT modified FV vectors with lentiviral vectors in nondividing and dividing alveolar basal epithelial cells from human adenocarcinoma (A549) by using molecular cloning, transfection and transduction techniques and several other methods. In contrast to lentiviral vectors, FV vectors were not able to effi-ciently transduce nondividing cell (Shityakov and Rethwilm, unpublished data). Despite the findings, which support the use of FV vectors as a safe and efficient alternative to lentiviral vectors, major limitation in terms of foamy-based retroviral vector gene transfer in quiescent cells still remains. Many attempts have been made recently to search for the potential molecules as pos-sible drug candidates to treat HIV infection for over decades now. These molecules can be retrieved from chemical libraries or can be designed on a computer screen and then synthe-sized in a laboratory. Most notably, one could use the computerized structure as a reference to determine the types of molecules that might block the enzyme. Such structure-based drug design strategies have the potential to save off years and millions of dollars compared to a more traditional trial-and-error drug development process. After the crystal structure of the HIV-encoded protease enzyme had been elucidated, computer-aided drug design played a pivotal role in the development of new compounds that inhibit this enzyme which is responsible for HIV maturation and infectivity. Promising repre-sentatives of these compounds have recently found their way to patients. Protease inhibitors show a powerful sustained suppression of HIV-1 replication, especially when used in combi-nation therapy regimens. However, these drugs are becoming less effective to more resistant HIV strains due to multiple mutations in the retroviral proteases. In computational drug design I used molecular modelling methods such as lead ex-pansion algorithm (Tripos®) to create a virtual library of compounds with different binding affinities to protease binding site. In addition, I heavily applied computer assisted combinato-rial chemistry approaches to design and optimize virtual libraries of protease inhibitors and performed in silico screening and pharmacophore-similarity scoring of these drug candidates. Further computational analyses revealed one unique compound with different protease bind-ing ability from the initial hit and its role for possible new class of protease inhibitors is dis-cussed (Shityakov and Dandekar, 2009). A number of atomistic models were developed to elucidate the nanotube behaviour in lipid bilayers. However, none of them provided useful information for CNT effect upon the lipid membrane bilayer for implementing all-atom models that will allow us to calculate the deviations of lipid molecules from CNT with atomistic precision. Unfortunately, the direct experimental investigation of nanotube behaviour in lipid bilayer remains quite a tricky prob-lem opening the door before the molecular simulation techniques. In this regard, more de-tailed multi-scale simulations are needed to clearly understand the stabilization characteristics of CNTs in hydrophobic environment. The phenomenon of an intercalated single-wall carbon nanotube in the center of lipid membrane was extensively studied and analyzed. The root mean square deviation and root mean square fluctuation functions were calculated in order to measure stability of lipid mem-branes. The results indicated that an intercalated carbon nanotube restrains the conformational freedom of adjacent lipids and hence has an impact on the membrane stabilization dynamics (Shityakov and Dandekar, 2011). On the other hand, different lipid membranes may have dissimilarities due to the differing abilities to create a bridge formation between the adherent lipid molecules. The results derived from this thesis will help to develop stable nanobiocom-posites for construction of novel biomaterials and delivery of various biomolecules for medi-cine and biology.
N2  - Molekulare Modellierung und Simulationen sind leistungsstarke Methoden, um wich-tige Informationen von verschiedenen biologischen Systemen, welche nicht durch Experi-mente erschlossen werden können, darzustellen, und deren strukturelle und funktionelle Ei-genschaften aufzuklären. Diese Arbeit untersucht in Simulationen Interaktionen viraler Proteinen sowie von Kohlenstoffenanoröhren mit Membranen und Proteinen. Die HIV-1 Integrase besitzt Kernlokalisierungssignale („nuclear localization signals [NLS]“), welche eine entscheidende Rolle beim Import des viralen Präintegrationskomplexes („preintegration complex [PIC]“) in den Zellkern spielen. Die Ausbildung des PIC und sein Import in den Zellkern sind im Detail noch nicht bekannt. Es wurde bereits gezeigt, dass die NLS an Moleküle des Zelltransportsystems binden, wie z.B. an Transportinkernporen. Im Rahmen meiner Arbeit untersuchte ich die Interaktionen der viralen HIV-1 Integrase mit Proteinen der Kernporen wie dem Transportin-SR2 Protein (Shityakov et al., 2010). Hierbei wurden die möglichen Interaktionen des Transportin-SR2 Protein mit der HIV-1-Integrase und die Bedeutung dieser Interaktionen mit dem Import in den Kern aufgezeigt. Zudem wur-den die Interaktionen der Schlüsseldomänen und die Ausbildung von Wasserstoffbrücken-bindungen im dem Transportin-SR2 Protein untersucht. Die Ergebnisse wurden mit Protein-komplexen andere retroviralen Spezies, wie z.B. dem humanen Spumaretrovirus („human foamy virus [HFV]“), verglichen, um diesen spezifischen und sehr effizienten retroviralen Transportweg in die Wirtszelle zu entschlüsseln. Der experimentelle Teil dieser Arbeit beschäftigte sich damit, den retroviralen Kern-import zu untersuchen, um die Fähigkeit des Retrovirus, nicht teilende Zellen zu infizieren, besser zu verstehen verstanden wird. Um dies zu bewerkstelligen, müssen Retroviren Zellkul-turen in verschiedenen Stadien des Zellzyklus effizient transduzieren. Vielversprechende und sichere- HFV- Vektoren, welche in der Gentherapie eingesetzt werden könnten, sind nicht in der Lage, diese Effizienz bei ruhenden Zellen zu gewährleisten. Dies rührte daher, dass diese nicht in der Lage waren, einen PIC für den Transport der retroviralen DNA auszubilden. Lentivirale Vektoren sind dagegen nicht auf einen bestimmten Zellzyklus angewiesen. Für die reverse Transkription ist der Polypurinteil („polypurine tract [PPT]“) essentiell für die Ausbildung der PIC. In dieser Doktorarbeit vergleiche ich die Transduktionsfrequenz von PPT-modifizierten HFV-Vektoren mit denen von lentiviralen Vektoren in nichtteilenden und tei-lenden Lungenkarzinomepithelzellen. Hierbei wurden Methoden wie Klonierung, Transfektion, und Transduktion (wie auch weitere Methoden) angewendet. Im Gegensatz zu lentiviralen Vektoren konnten HFV-Vektoren sich nicht teilende Zellen in meinen Versuchen nicht effizient transduzieren (Shityakov und Rethwiln, unveröffentlicht). Trotz der Befunde, dass HFV-Vektoren sichere und effiziente Alternativen zu lentiviralen Vektoren darstellen, bestehen immer noch große Einschränkungen, diese HFV-basierten, retroviralen Vektoren für Gentherapien bei ruhenden Zellen einzusetzen. Viele Versuche wurden unternommen, um mögliche, vielversprechende Moleküle, welche als Wirkstoffe für eine HIV-Therapie eingesetzt werden könnten, zu finden. Diese Moleküle können aus chemischen Substanzbibliotheken bezogen werden oder am Computer in silico entworfen und dann synthetisiert werden. Digitalisierte Strukturen können als Refe-renzen benutzt werden, um besser herauszufinden, wie diese Moleküle Typen diverse Enzy-me blokieren könnten. Strukturbasiertes Wirkstoffdesign hat das Potential, viele Jahre und Geld an Entwicklungskosten einzusparen. Nachdem die Kristallstruktur der HIV-kodierten Proteasen aufgeklärt war, spielte das computergestützte Wirkstoffdesign eine zentrale Rolle bei der Entwicklung neuer Wirkstoffe gegen die Protease. Vielversprechende Vertreter dieser Wirkstoffklasse werden seit kurzem nun auch für die Behandlung von Patienten eingesetzt. Proteaseinhibitoren zeigen eine wir-kungsvolle und langanhaltende Inhibition der HIV-1-Replikation; besonders dann, wenn sie in Kombinationstherapien eingesetzt werden. Aber diese Wirkstoffe werden immer weniger effektiv, je resistenter die HIV-Stämme durch Mutationen in den retroviralen Proteasen wer-den. Im Rahmen meiner Arbeit mit computergestütztem Wirkstoffdesign nutzte ich Model-lierungsmethoden wie den „lead expansion algorithm“ (Tripos®) um virtuelle Wirkstoffbibli-otheken mit verschiedenen Affinitäten zur Proteasebindungsstelle zu erstellen. Zusätzlich wandte ich Verfahren der computergestützten, kombinatorischen Chemie an, um virtuelle Bibliotheken von Proteaseinhibitoren zu designen, und zu verbessern. Parallel dazu wurde eine in silico Selektion sowie eine Einteilung nach Pharmakophorähnlichkeiten für diese Kandidaten vorgenommen. Weiterführende computergestützte Analysen förderten einen ein-zigartigen Wirkstoff zu Tage, welcher neuartige Proteasebindungseigenschaften aufweist, und dessen Rolle für eine potentiell neuartige Klasse von Proteaseinhibitoren schon beschrieben wurde (Shityakov und Dandekar, 2009). Eine Reihe von Modellen mit atomarer Auflösung wurden bereits entwickelt, um das Verhalten von Nanoröhren in Lipid-Doppelschichten aufzuklären. Die Auswirkungen auf die molekular Dynamik einer einschichtigen Karbonnanoröhre, welche in das Zentrum einer Lipid-Doppelschicht eingefügt wurde, wurden intensiv studiert und analysiert. Die Normalabweichung und Fluktuationen wurden berechnet, um eine Aussage über die Stabilität der Lipid-Doppelschichten treffen zu können. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass eine eingefügte Karbonnanoröhre die Freiheit für Konformationsänderungen bei nahegelegenen Lipiden einschränkt und dadurch einen Einfluss auf die Membranstabilität hat (Shityakov und Dandekar, 2011). Es kann aber außer-dem sein, dass verschiedene Lipid-Doppelschichten Unterschiede in ihrer Fähigkeit, Brücken zwischen benachbarten Lipiden auszubilden, aufweisen. Viren und Karbonnanoröhren werden damit in verschiedenen dynamischen Simulati-onen untersucht, um mehr über ihre Interaktionen mit Proteinen und Membranen zu erfahren.
KW  - Kohlenstoff
KW  - Nanoröhre
KW  - Retroviren
KW  - Proteine
KW  - virale Proteine
KW  - retroviral proteins
KW  - nanobiocomposites
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-56960
ER  -