TY  - JOUR
A1  - Maueler, W.
A1  - Barnekow, A.
A1  - Eigenbrodt, E.
A1  - Raulf, F.
A1  - Falk, H. F.
A1  - Telling, A.
A1  - Schartl, Manfred
T1  - Different regulation of oncogene expression in tumor and embryonal cells of Xiphophorus
N2  - Melanoma formation in the poeciliid fish Xiphophorus is mediated primarily by a cellular oncogene, designated Tu. Elimination of Tu-specific genes releases the transforming function of Tu and leads to melanoma formation. Southern blot analyses revealed a tight linkage of a v-erb B related gene to the Tu-locus and Northern blot analyses of RNA of solid melanomas indicated a coordinated deregulation and for mutational activation of several oncogenes. In order to get a better insight into the regulation of oncogene expression in normal and transformed cells of Xiphophorus, we studied the expression of Xsrc, Xras, Xmyc, Xerb A, Xsis, and the v-erb B related gene in a melanoma derived cell line (PSM) and an embryonic cell line (A2) under conditions of low growth factor supply. Both celllines express the Xsrc, Xmyc, and Xras genes, while PSM cells in addition express the v-erb B related gene and A2 cells the Xsis gene. In PSM cells serum deprivation leads to an accumulation of most of the oncogene mRNAs analysed. This is most apparent for a 5.0 kb transcript of the v-erb B related gene, probably due to an increase in transcript stability. The levels of these mRNAs returned to normal within 2h after stimulation with 10% fetal calf serum. At the protein level we observed an initial decrease followed by an increase of the n-p60c-src kinase (the protein product of tbe Xsrc gene) activity in cells deprived of serum. Serum stimulation restored a normal pp60"-src kinase activity. In contrast serum deprivation of A2 cells reduced the transcript amounts of each of the oncogenes analysed. The same holds true for one beta-tubulin transcript, while the level of a second beta-tubulin transcript was unaffected. Serum stimulation led to a reactivation of Xras and Xsrc after a delay of approximately 48b. The pp60(c-src) kinase activity was found to be 6-10 times lower as compared to the PSM cells and did not differ between serum deprived and serum stimulated cells. Enzyme activities and isoenzyme patterns of several glycolytic enzymes were found to be not affected by serum deprivation and stimulation in both celllines.
KW  - Schwertkärpfling
KW  - Tumorzelle
Y1  - 1988
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-86240
ER  - 
TY  - THES
A1  - Hayen, Wiebke
T1  - Determinanten der Tumorzellmigration
T1  - Determinants of tumor cell migration
N2  - Hyaluronsäure (HS) ist ein weit verbreitetes Glykosaminoglykan in der Extrazellulärmatrix vieler Gewebe und tritt in erhöhten Konzentrationen in der Umgebung solider Tumore auf. Es ist bekannt, daß HS die Zellmigration vieler Zellarten stimuliert. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Rolle der HS in der Tumorzellmigration auf der Basis eines dreidimensionalen Fibringel-Systems, in welches Tumorzell-bedeckte Microcarrier eingebettet wurden, untersucht. Ein Vergleich zwischen zwei- und dreidimensionaler Migration unterverschiedenen Bedingungen ergab, daß die dreidimensionale Migration nicht von HS-spezifischen Oberflächenrezeptoren abhängt, sondern hauptsächlich von der Porosität der Matrix. In zweidimensionalen Systemen war die Migration durch Antikörper gegen den HS-Rezeptor CD44 inhibierbar, unter dreidimensionalen Bedingungen jedoch nicht. Zur Bestimmung der strukturellen Eigenschaften der Fibringele wurden spektrometrische Messungen, konfokale Mikroskopie, Kompaktionsmessungen und Flüssigkeitspermeation herangezogen. Eine weitere Lokalisation ergab ein intrazelluläres Auftreten von HS vorwiegend perinukleär mit dem Zytoskelett assoziiert. Ein direkter Einfluß auf die Aktinpolymerisation konnte ausgeschlossen werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die direktionale Migration von Tumorzellen auf Endothelzellen sowohl in dreidimensionalen Fibringelsystemen als auch unter zweidimensionalen Bedingungen untersucht. Endothelzell-konditioniertes Medium wurde weiter aufgereinigt und es konnten massenspektrometrisch mehrere potentiell chemotaktisch aktive Moleküle im Medium bestimmt werden.
N2  - Hyaluronic acid (HA) is a glycosaminoglycan which is ubiquitously present in the extracellular matrix of many tissues and increased concentrations are found in the environment of solid tumors. In the first part of this work the role of HA in tumor cell migration based on a three-dimensional fibrin gel-sytem was investigated. The comparison of two- and threedimensional migration resulted in the conclusion that threedimensional migration mainly depends on the porosity of the matrix and not on specific HA-receptors. The HA-induced migration could be inhibited under two-dimensional conditions by antibodies to the HA-receptor CD44 while in three-dimensional systems the migration was unaffected by these antibodies. The structural properties of the fibrin gels were analyzed by turbidity measurement, confocal microscopy, compaction assay and liquid permeation. Further experiments resulted in perinuclear localization of this macromolecule. A direct mechanical influence of HA on actin polymerization could not be detected. The second part of this work concentrated on the directional migration of tumor cells to endothelial cells. In three-dimensional cocultures of tumor cells and endothelial cells it was found that the tumor cells were chemotactically attracted by endothelial cells. This effect could be verified in two-dimensional Boyden chamber assays. Endothelial-derived conditioned medium was further purified and possible chemotaxins for tumor cell migration could be identified by mass spectrometry.
KW  - Tumorzelle
KW  - Zellmigration
KW  - Hyaluronsäure
KW  - Endothelzelle
KW  - Tumorzellmigration
KW  - Hyaluronsäure
KW  - Fibrin
KW  - Tumor cell migration
KW  - hyaluronic acid
KW  - fibrin
Y1  - 2001
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1180784
ER  - 
TY  - THES
A1  - Wolf, Katarina
T1  - Migration of tumor cells and leukocytes in extracellular matrix : proteolytic and nonproteolytic strategies for overcoming tissue barriers
T1  - Migration von Tumorzellen und Leukozyten in extrazellulärer Matrix : proteolytische und nicht-proteolytische Strategien zur Überwindung von Gewebsbarrieren
N2  - The extracellular matrix within connective tissues represents a structural scaffold as well as a barrier for motile cells, such as invading tumor cells or passenger leukocytes. It remains unclear how different cell types utilize matrix-degrading enzymes for proteolytic migration strategies and, on the other hand, non-proteolytic strategies to overcome 3D fibrillar matrix networks. To monitor cell migration, a 3D collagen model in vitro or the mouse dermis in vivo were used, in combination with time-lapse video-, confocal- or intravital multiphoton-microscopy, and computer-assisted cell tracking. Expression of proteases, including several MMPs, ADAMs, serine proteases and cathepsins, was shown by flow cytometry, Western blot, zymography, and RT-PCR. Protease activity by migrating HT-1080 fibrosarcoma cells resulting in collagenolysis in situ and generation of tube-like matrix defects was detected by three newly developed techniques:(i) quantitative FITC-release from FITC-labelled collagen, (ii) structural alteration of the pyhsical matrix structure (macroscopically and microscopically), and (iii) the visualization of focal in situ cleavage of individual collagen fibers. The results show that highly invasive ollagenolytic cells utilized a spindle-shaped "mesenchymal" migration strategy, which involved beta1 integrindependent interaction with fibers, coclustering of beta1 integrins and matrix metalloproteinases (MMPs) at fiber bundling sites, and the proteolytic generation of a tube-like matrix-defect by MMPs and additional proteases. In contrast to tumor cells, activated T cells migrated through the collagen fiber network by flexible "amoeboid" crawling including a roundish, elliptoid shape and morphological adaptation along collagen fibers, which was independent of collagenase function and fiber degradation. Abrogation of collagenolysis in tumor cells was achieved by a cocktail of broad-spectrum protease inhibitors at non-toxic conditions blocking collagenolysis by up to 95%. While in T cells protease inhibition induced neither morphodynamic changes nor reduced migration rates, in tumor cells a time-dependent conversion was obtained from proteolytic mesenchymal to non-proteolytic amoeboid migration in collagen lattices in vitro as well as the mouse dermis in vivo monitored by intravital microscopy. Tumor cells vigorously squeezed through matrix gaps and formed constriction rings in regions of narrow space, while the matrix structure remained intact. MMPs were excluded from fiber binding sites and beta1 integrin distribution was non-clustered linear. Besides for fibrosarcoma cells, this mesenchymal-toameboid transition (MAT) was confirmed for epithelial MDA-MB-231 breast carcinoma cells. In conclusion, cells of different origin exhibit significant diversity as well as plasticity of protease function in migration. In tumor cells, MAT could respresent a functionally important cellular and molecular escape pathway in tumor invasion and migration.
N2  - Die extrazelluläre Matrix (EZM) des Bindegewebes stellt sowohl ein strukturelles Gerüst als auch eine Barriere für migrierende Zellen dar, wie z.B. invadierende Tumorzellen oder zirkulierende Leukozyten. Es ist bisher unklar, wie diese verschiedenen Zelltypen matrix-degradierende Enzyme für eine proteolytische Migrationsstrategie benutzen bzw. ob und wie sie ohne deren Hilfe durch das Gewebe gelangen. Um Zellmigration in EZM zu untersuchen, wurde ein dreidimensionales Kollagenmodell in vitro wie auch Maus-Dermis in vivo eingesetzt und Zellmigration mittels Zeitraffer-Video-, Konfokal- und Multiphoton-Mikroskopie sowie computer-gestützter Zelltracking-Analyse dargestellt. Expression von Proteasen verschiedener Klassen, wie der MMPs, ADAMs, Serinproteasen und Cathepsine, wurde mittels Durchfluss-Zytometrie, Western blot, Zymographie oder RT-PCR detektiert. Gegen Kollagen gerichtete zelluläre Protease-Aktivität wurde mit Hilfe drei neu entwickelter Techniken dargestellt: (i)quantitative Messung von löslichem FITC aus FITC-markiertem fibrillären Kollagen, (ii) mikro-und makroskopische Reorganisation der physikalischen Matrix-Struktur, und (iii) Visualisierung der Topologie fokaler Degradation von Matrixfasern. Die Ergebnisse zeigen, dass hochinvasive spindelförmige HT-1080 Fibrosarkomzellen eine sogenannte "mesenchymale" Migrationsstrategie mit folgenden Charakteristika entwickelten: (i) beta1 Integrin-abhängige Interaktion mit Kollagenfasern, (ii) das "Co-clustering" von beta1 Integrinen und Matrix-Metalloproteinasen an Faserzugstellen und (iii) eine röhrenförmige, durch Proteasen verursachte Matrixdefektbildung. Im Gegensatz zu proteolytischen Tumorzellen migrierten T-Zellen rundlich-elliptoid mittels flexibler Morphodynamik, ähnlich wie Amöben, durch das Kollagennetzwerk und orientierten sich entlang Kollagenfasern, wobei sie keine biochemisch und strukturell detektierbare Faserdegradation zeigten. Um Tumorzell-vermittelte Kollagenolyse zu hemmen, wurde ein Cocktail, bestehend aus Breitspektrum-Protease-Inhibitioren, etabliert, der die Kollagenolyse unter nicht-toxischen Bedingungen um bis zu 98% blockierte. Während in T-Zellen keine morphodynamischen Veränderungen detektiert wurden, entwickelten Tumorzellen eine Verschiebung von proteolytisch mesenchymaler zu unverminderter nicht-proteolytisch amöboider Migration (mesenchymale-amöboide Transition - MAT) aus, sowohl in Kollagenmatrices in vitro als auch in Maus-Dermis in vivo, dargestellt mittels Intravital-Multiphoton-Mikroskopie. Die Tumorzellen "quetschten" sich dabei durch Lücken in der Matrix und bildeten sogenannte Konstriktionsringe aus, während die Matrixstruktur intakt blieb. MMPs lokalisierten nicht mehr an Faser-Kontakstellen auf der Zelloberfläche, und beta1 Integrine lagen nicht mehr geclustert vor. Neben HT-1080 Fibrosarkomzellen wurde MAT auch für MDA-MB-231 Brustkrebszellen epithelialer Herkunft nach Protease-Blockade detektiert. Somit entwickeln migrierende Zellen verschiedener Herkunft eine signifikante Diversität wie auch Plastizität bei der Migration durch EZM aus, resultierend aus der Funktionalität von Matrix-Proteasen. In Tumorzellen könnte MAT einen funktionell wichtigen zellulären und molekularen Anpassungsmechanismus für die Tumorinvasion und -migration darstellen.
KW  - Zellmigration
KW  - Grundsubstanz
KW  - Tumorzelle
KW  - Leukozyt
KW  - Zellmigration
KW  - Invasion
KW  - Karzinomzellen
KW  - Leukozyten
KW  - Matrixproteasen
KW  - Kollagenasen
KW  - Proteaseinhibitoren
KW  - cell migration
KW  - invasion
KW  - carcinoma cells
KW  - leukozytes
KW  - matrix proteases
KW  - collagenases
KW  - protease inhibitors
Y1  - 2002
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-5670
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TY  - THES
A1  - Mihlan, Sabrina [geb. Jasper]
T1  - Identifikation von Zonula Occludens 2 (ZO-2) als neuen LASP-1 Interaktionspartner und Aufklärung der LASP-1/ZO-2 Kern-Zytosol Translokation
T1  - Identification of zonula occludens 2 (ZO-2) as a new LASP-1binding partner and the elucidation of LASP-1/ZO-2 nucleo-cytoplasmatic shuttling
N2  - LASP-1 (LIM und SH3 Domänen Protein) ist ein in Zellen ubiquitär vorkommendes Protein, welches in verschiedenen Tumorgeweben eine pathophysiologische Überexpression aufweist. Das Protein besitzt eine LIM Domäne, zwei Aktinbindungsregionen sowie eine SH3 Domäne und bindet einerseits an dynamischen Aktinstrukturen wie den fokalen Kontakten, Lamellopodien und Membranfortsätzen, kann andererseits aber auch in den Zellkern translokalisieren. Für Aktinstrukturen wirkt LASP-1 als Gerüstprotein und ist wichtig für die Migration und Proliferation der Zellen. Die Funktion von LASP-1 im Zellkern ist noch nicht bekannt, da aber in Tumorzellen eine erhöhte nukleare Akkumulation von LASP-1 beobachtet werden konnte, deren Intensität mit der Tumorgröße sowie dem Langzeitüberleben der Patientinnen korreliert, ist LASP-1, zusätzlich zu seiner Funktion als Strukturprotein, vermutlich auch ein Transkriptionsfaktor oder ein transkriptioneller Kofaktor. Eine Herunterregulation von LASP-1 in verschiedenen Tumorentitäten führt zur Inhibition der Proliferation und Migration. In dieser Arbeit konnte der bisher unbekannte Zellkernimport und -export von LASP-1 aufgeklärt werden. Maßgeblich daran beteiligt ist ein durch Pulldown Experimente neu identifizierter LASP-1 Bindungspartner: das Zonula Occludens 2 Protein (ZO-2). Mittels Immunpräzipitationen und Immunfluoreszenzen wurde diese Interaktion bestätigt. Nach Phosphorylierung von LASP-1 an Ser-146 durch Aktivierung der cAMP-abhängigen Proteinkinase (PKA) kommt es zu einer partiellen Ablösung des LASP-1/ZO-2 Komplexes aus den fokalen Kontakten hin zu einer vermehrten Kernlokalisation beider Proteine. Dies lässt sich durch Kern/Zytosol Trennungen belegen. Dabei ist die Bindung von LASP-1 an ZO-2 essentiell für die Translokation in den Zellkern, da bei einem ZO-2 Knockdown auch nach PKA Aktivierung LASP-1 zytosolisch lokalisiert bleibt. Wie Mutationsanalysen zeigen, findet die Interaktion zwischen der C-terminalen SH3 Domäne im LASP-1 und der Prolin-reichen SH3-Bindungssequenz im Bereich der Aminosäuren 1103-1121 am C-Terminus im ZO-2 statt. Die Translokation des Komplexes in den Kern erfolgt dabei über das Kernlokalisationssignal im ZO-2, da die LASP-1 Sequenz selbst keine nukleare Importsequenz aufweist. Im Zellkern konnte die direkte Interaktion von LASP-1 und ZO-2 mittels Duolink® Proximity Ligation Assay sichtbar gemacht werden. Der Export der Proteine erfolgt über das Protein CRM1. Eine Inhibition der Kernexportmaschinerie mit Leptomycin B erhöht die Konzentration beider Proteine im Zellkern. Das nukleare Exportsignal (NES) im LASP-1 konnte durch Punktmutationen N-terminal der Leucin-reichen Aminosäuresequenz 70-77 zugeordnet werden (NLRLKQQS). Im letzten Schritt dieses Zyklus erfolgt die Relokalisation von LASP-1 zurück an die Zellmembranstrukturen. Der neu gefundene Signalweg dient wahrscheinlich zur Weiterleitung von externen Stimuli in den Kern und zur Genregulation - mit LASP-1 als Transkriptionsfaktor oder transkriptionellen Kofaktor.
N2  - LASP-1 (LIM and SH3 protein) is ubiquitously expressed at basal levels, but was found to be pathophysiologically overexpressed in several cancer entities. LASP-1 exhibits one LIM domain, two actin binding domains and one SH3 domain. On the one hand, LASP-1 is predominantly localized at focal contacts, lamellopodia and membrane ruffles, on the other hand a nuclear localization is observed. LASP-1 works as actin-binding scaffolding protein and is essential for migration and proliferation. Silencing of LASP-1 by RNA- interference in various cancer cell lines results in a strong inhibition of proliferation and migration. However, in tumor cells, an additional striking nuclear localization of the protein was observed, which significantly correlates with tumor size and a poor long term survival of the patients. Therefore, LASP-1 might act additionally as transcription factor or transcriptional co-factor In this work, a novel LASP-1 binding partner, zonula occludens protein 2 (ZO-2), was identified and its role in the signal transduction pathway of LASP-1 nucleo-cytoplasmic shuttling was established. Upon LASP-1 phosphorylation at Ser-146 by activated cAMP-dependent protein kinase A (PKA), LASP-1 binding to Zyxin and F-actin decreases and the protein detaches, in complex with ZO-2, from the plasma membrane and translocates into the nucleus. These results were confirmed by nuclear and cytosolic separation assays. Pull-down assays with mutants revealed that ZO-2 binds with its proline-rich sequence (amino acids 1103-1121) to the SH3 domain in LASP-1. LASP-1 exhibits no nuclear localization signal and requires ZO-2 to shuttle into the nucleus. In situ proximity ligation assay confirmed the direct binding between LASP-1 and ZO-2 and visualized the shuttling. Inhibition of the nuclear export system by Leptomycin B results in an accumulation of both proteins in nuclei. Nuclear export is regulated by the newly identified nuclear export signal in LASP-1 (amino acids 70-77) and mediated by CRM1. Finally LASP-1 relocalizes to focal contacts. This new identified pathway serves presumably as a signal transductor from the focal contacts to the nucleus for gene regulation.
KW  - Tumorzelle
KW  - Skleroproteine
KW  - Transkriptionsfaktor
KW  - Überexpression
KW  - Zellkern
KW  - Kern-Zytosoltranslokation
KW  - ZO-2
KW  - Phosphorylierung
KW  - LASP-1
KW  - nuclear cytosolic translocation
KW  - ZO-2
KW  - phosphorylation
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73442
ER  - 
TY  - THES
A1  - Kuger, Sebastian
T1  - Radiosensibilisierung humaner Tumorzelllinien unterschiedlicher Entitäten durch den dualen PI3K/mTOR-Inhibitor NVP-BEZ235 alleine oder in Kombination mit dem MEK-Inhibitor AZD6244: Einfluss des Behandlungsschemas und der Hypoxie
T1  - Radiosensitization of human cancer cell lines of different tumor entities with the dual PI3K/mTOR inhibitor NVP-BEZ235 solely or in combination with the MEK inhibitor AZD6244: Effects of the treatement schedule and of hypoxia
N2  - Eine wichtige Standardtherapie in der modernen Behandlung von Krebserkrankungen ist die Strahlentherapie, in welcher Tumorzellen mittels ionisierender Strahlung geschädigt und abgetötet werden. Dabei soll die Schädigung des umgebenden Normalgewebes möglichst gering gehalten und trotzdem eine maximale Schädigung des Tumorgewebes erreicht werden. Deshalb sind neue Strategien zur Steigerung der Radiosensitivität des Tumorgewebes sehr wichtig, die es erlauben, bei gleicher Dosis eine verstärkte Strahlenantwort im Tumorgewebe zu erreichen. Hier kommen zunehmend sog. Radiosensibilisatoren zum Einsatz, die unter anderem onkogene Signalwege in den Tumorzellen inhibieren. Der PI3K/Akt/mTOR Signalweg stellt hierbei einen wichtigen Ansatzpunkt dar, da er in vielen Tumorentitäten dereguliert vorliegt und diese Signalkaskade bekanntermaßen einen Einfluss auf die zelluläre Strahlensensitivität hat. Obwohl es für diesen Signalweg schon eine Reihe von Inhibitoren gibt, für die bereits neben einer anti-proliferativen Wirkung auch ein radiosensibilisierender Effekt nachgewiesen wurde (z.B. Wortmannin und Rapamycin), machten eine geringe Spezifität, starke Nebenwirkungen und negative Rückkopplungsmechanismen im Signalweg, die die Wirkung des Inhibitors kompensieren, die Entwicklung neuer Inhibitoren notwendig. Das Imidazoquinolinderivat NVP-BEZ235 inhibiert den PI3K/Akt/mTOR Signalweg an mehreren Stellen gleichzeitig, indem es kompetitiv zu ATP das katalytische Zentrum von PI3K und mTOR blockiert. Für diesen kleinmolekularen, dualen Inhibitor gibt es bereits erste vielversprechende Forschungsergebnisse hinsichtlich einer radiosensibilisierenden Wirkung, allerdings sind die zugrunde liegenden molekularbiologischen Mechanismen noch nicht vollständig geklärt. Deshalb war das Ziel der vorliegenden Dissertation, in drei Teilprojekten mehrere Aspekte der NVP-BEZ235-induzierten Radiosensibilisierung aufzuklären: a) Einfluss des Behandlungsschemas für NVP-BEZ235 in vier Glioblastomzelllinien mit unterschiedlichem PTEN und TP53 Mutationsstatus, b) Einfluss der Sauerstoffversorgung (Hypoxie, Normoxie, reoxygeniert nach Bestrahlung) auf die strahlensensibilisierende Wirkung von NVP-BEZ235 in zwei Mammakarzinomzelllinien, c) gleichzeitige Inhibierung des MAPK Signalwegs durch AZD6244 und der PI3K/Akt/mTOR Signalkaskade durch NVP-BEZ235 in zwei Zelllinien mit unter-schiedlichem Mutationsstatus aus verschiedenen Tumorentitäten, um synergistische Effekte zu untersuchen. Um diese Fragestellungen zu beantworten, wurde im Rahmen - 142 -
der Dissertation eine Auswahl an humanen Tumorzelllinien mit unterschiedlich deregulierten Signalwegen bearbeitet. Dabei wurde die Expression von Schlüsselproteinen der MAPK/Erk und der PI3K/Akt/mTOR Signalwege analysiert und mit zellbiologischen Daten verschiedener phänotypischer Endpunkte nach Inhibitor Behandlung und Bestrahlung integriert (Proliferationsrate, klonogenes Überleben, Zellzyklusaberrationen, DNS-Schäden und -Reparatur, Zelltod und Autophagie).
Im Teilprojekt zum Behandlungsschema der NVP-BEZ235 Inhibierung und Bestrahlung konnte in vier Glioblastomzelllinien mit Behandlungsschema I (NVP-BEZ235 Behandlung 24 Stunden vor Bestrahlung) kein radiosensibilisierender Effekt hinsichtlich klonogenem Überleben nachgewiesen werden, wohingegen Behandlungsschema II (NVP-BEZ235 Behandlung 1 h vor und im Anschluss an die Bestrahlung) unabhängig vom Mutationsstatus in allen vier Zelllinien eine starke Radiosensibilisierung bewirkte. Auf molekularer Ebene war zwischen beiden Behandlungsschemata für das antiapoptotische Protein Akt ein großer Unterschied zu beobachten, welches bei Behandlung nach Schema I zum Zeitpunkt der Bestrahlung überaktiviert, nach Behandlung mit Schema II hingegen inhibiert war. Weiterhin resultierte Behandlungsschema I in einem erhöhten Anteil der Zellen in der radioresistenteren G1-Phase des Zellzyklus zum Zeit-punkt der Bestrahlung. Behandlungsschema II führte hingegen nach Bestrahlung zu einer verminderten Expression des Reparaturproteins Rad51 und damit zu verminderter DNS-Schadensreparatur und schließlich zu einem stabilen Arrest in der G2/M-Phase des Zellzyklus sowie zu verstärkter Apoptose (erhöhte Spaltung von PARP, erhöhter Anteil hypodiploider Zellen). Somit zeigen diese Ergebnisse, dass unabhängig vom PTEN und TP53 Mutationsstatus eine Radiosensibilisierung nur durch das Behandlungsschema II erreicht werden konnte. Ferner deuten die Ergebnisse der Proteinexpression darauf hin, dass durch NVP-BEZ235 ein negativer Rückkopplungsmechanismus ausgelöst wird, wodurch die PI3K/Akt/mTOR Signalkaskade 24h nach Zugabe des Inhibitors aktiviert und synergistische Effekte mit ionisierender Bestrahlung aufgehoben wurden.
Im Teilprojekt zur Abhängigkeit der NVP-BEZ235 Inhibition vom Sauerstoffgehalt wurden in den beiden Brustkrebszelllinien MCF-7 (ER-positiv) und TN MDA-MB-231 (TP53 mutiert) normoxische, hypoxische und nach Bestrahlung reoxygenierte Kulturbedingungen im Hinblick auf die Koloniebildungsfähigkeit nach NVP-BEZ235 Behandlung und Bestrahlung untersucht. Die beobachtete Radiosensibilisierung war unter allen getesteten Bedingungen auf gleichem Niveau. In beiden Zelllinien bewirkte NVP-BEZ235 eine Inhibition des antiapoptotischen HIF-1α Proteins, eine stabile Inaktivierung des PI3K/Akt/mTOR Signalweges und eine Aktivierung der Autophagie. Nach Bestrahlung waren zudem erhöhte residuale DNS-Schäden und ein stabiler Arrest in der G2/M-Phase des Zellzyklus unter allen Oxygenierungsbedingungen in beiden Zelllinien zu beobachten. Eine Apoptose Induktion (Spaltung von PARP, hypodiploide Zellen) trat nur in der TP53 wildtypischen MCF-7 Zelllinie nach NVP-BEZ235 Behandlung auf. Somit konnte in beiden Zelllinien in allen pathophysiologisch relevanten Oxygenierungszuständen eine sauerstoffunabhängige Radiosensibilisierung durch NVP-BEZ235 gezeigt werden.
Der bisher nicht erforschte Aspekt zur synergistischen Wirkung des MEK Inhibitors AZD6244 und des dualen PI3K/Akt/mTOR Inhibitors NVP-BEZ235 nach Bestrahlung wurde an der Glioblastomzelllinie SNB19 und der Lungenkarzinomzelllinie A549 anhand der Koloniebildungsfähigkeit der behandelten Zellen untersucht. Eine Behandlung mit dem MEK Inhibitor bewirkte lediglich eine moderate Radiosensibilisierung, wohin-gegen der duale PI3K/Akt/mTOR Inhibitor beide Zelllinien in stärkerem Maße sensibilisierte. Eine Kombination beider Inhibitoren resultierte bei keiner Zelllinie in einer Verstärkung der durch NVP-BEZ235 induzierten Radiosensibilisierung. Eine mögliche Erklärung für die fehlende Synergie im Bezug auf die Radiosensibilisierung können die gegensätzlichen Effekte der beiden Inhibitoren auf den Zellzyklus sein. Auf Proteinebene führte eine simultane Behandlung mit beiden Substanzen zur Inhibition beider Signalwege. Darüber hinaus war in SNB19 Zellen eine verstärkte Dephosphorylierung von Rb und ein erhöhter Anteil an G1-Phase Zellen bei kombinierter Gabe der Inhibitoren zu beobachten.
Im Rahmen dieser Arbeit konnte somit die radiosensibilisierende Wirkung von NVP-BEZ235 in Abhängigkeit vom Behandlungsschema gezeigt werden. Ferner wurde nachgewiesen, dass die Radiosensibilisierung unabhängig von der Sauerstoffversorgung sowie von den PTEN und TP53 Mutationsstatus der Tumorzellen ist. Die kombinierte Inhibition der MAPK und PI3K/Akt/mTOR Signalwege resultierte zwar in einem verstärkten zytostatischen, aber nicht in einem verstärkten radiosensibilisierenden Effekt. Da allerdings eine große Anzahl verschiedener Inhibitoren der MAPK/Erk und der PI3K/Akt/mTOR Signalkaskade verfügbar sind, sollte die kombinatorische Inhibition dieser Signalwege systematisch weiter verfolgt werden. Die vorliegende Arbeit liefert auch weitere grundlegende Erkenntnisse zu den molekularen Mechanismen der Radiosensibilisierung durch NVP-BEZ235, die auch auf Verknüpfungen und Wechselwirkungen mit anderen als den bisher bekannten Proteinen hindeuten, die für jeden Inhibitor aufgeklärt werden müssen, um eine effektive radiosensibilisierende Wirkung vorher-sagen zu können.
N2  - One important treatment option in modern cancer treatment is the radiotherapy, in which tumor cells are killed using the effects of ionizing radiation. A major clinical challenge is the minimization of toxicity to normal tissue with an optimized efficacy in tumor tissue at the same time. In order to meet this requirement, novel strategies are neces-sary to increase the radiosensitivity of tumor tissue aiming at an enhanced radiation response in tumor cells at unchanged doses. For this purpose radiosensitizers are increasingly used, which often also inhibit oncogenic pathways in tumor cells. The PI3K/Akt/mTOR signaling cascade represents a key target since it is deregulated in many tumor types and since it is known that this pathway influences the cellular radiosensitivity. Even though a number of inhibitors with proven antiproliferative and radiosensitizing properties are already available for the PI3K/Akt/mTOR pathway (e.g. Wortmannin and Rapamycin), some substantial drawbacks such as low specificity, strong side effects and negative feedback loops within the pathway causing failure of pathway inhibition, necessitate the development of novel inhibitors. NVP-BEZ235 is an imidazoquinoline derivate, which acts as a dual inhibitor of the PI3K/Akt/mTOR path-way by inhibiting the catalytic domain of PI3K and mTOR in an ATP competitive man-ner. There are already promising results published about a radiosensitizing effect of this small molecule inhibitor, however, the underlying molecular mechanisms are still not sufficiently clarified. For this reason, the aim of this doctoral thesis was to clarify several aspects of NVP-BEZ235-induced radiosensitization: a) impact of the treatment scheme of NVP-BEZ235 on four glioblastoma cell lines with different PTEN and TP53 mutational status, b) impact of oxygen supply (hypoxia, normoxia, reoxygenation after irradiation) on the radiosensitizing effect of NVP-BEZ235 in two breast cancer cell lines, c) simultaneous inhibition of the MAPK/Erk pathway with AZD6244 and the PI3K/Akt/mTOR pathway with NVP-BEZ235 in two cell lines differing in their muta-tional background and their origin in order to investigate synergistic effects on radiosensitization. In order to meet these aims, a selection of human tumor cell lines with differentially deregulated pathways was used in this thesis. The expression of key proteins of the PI3K/mTOR and MAPK/Erk pathways were analyzed and integrated with pheno-typic data (proliferation rate, clonogenic survival, cell cycle alterations, DNA damage and repair, cell death, autophagy) after inhibitor treatment and irradiation of cells. For this purpose, proliferation and colony forming assays as well as flow cytometry and Western blot analyses have been performed.
The subproject investigating the treatment schemes of NVP-BEZ235 inhibition in com-bination with irradiation demonstrated in four glioblastoma cell lines that treatment scheme I (NVP-BEZ235 treatment 24 h before irradiation) could not generate a radio-sensitizing effect considering clonogenic survival. However, treatment scheme II (NVP-BEZ235 treatment 1 h before and after irradiation) resulted in a strong radiosensitization in each cell line independently of the mutation status. At protein level, a remarkable difference between the two treatment schemes was observed for the expression of the anti-apoptotic protein Akt, which was overexpressed at the time of irradiation under scheme I, whilst it was inhibited under treatment of scheme II. Scheme I also resulted in an elevated proportion of cells in the more resistent G1-phase of the cell cycle at the time of irradiation. On the other hand, scheme II caused a reduced expression of the repair protein Rad51 and a diminished DNA repair after irradiation. Also, a stable arrest in the G2/M-phase of the cell cycle and increased apoptosis (increased cleavage of PARP and elevated proportions of hypodiploid cells) were noticed under scheme II conditions. Thus, these findings demonstrate a radiosensitization only under conditions of treatment scheme II and that this radiosensitization was independent of PTEN and TP53 mutations. Moreover, the data on protein expression indicate a negative feedback loop that was induced by NVP BEZ235 resulting in an activation of the PI3K/Akt/mTOR pathway 24 h after inhibitor treatment and leading to abrogation of the synergistic effects with irradiation.
The impact of the oxygen supply on NVP BEZ235 inhibition was studied within the second subproject, using the breast cancer cell lines MCF-7 (ER-positive) and TN MDA-MB-231 (TP53 mutated) under normoxia, hypoxia and reoxygenation after irra-diation with respect to colony formation after NVP-BEZ235 treatment and irradiation. A radiosensitization was observed for each condition at the same level. NVP BEZ235 caused in each cell line an inhibition of the anti-apoptotic HIF-1α protein, a stable inactivation of the PI3K/Akt/mTOR pathway and an activation of autophagy. An increase of residual DNA damage and a stable arrest in the G2/M phase of the cell cycle were also noticed for all oxygen conditions after irradiation in both cell lines. An induction of apoptosis (cleavage of PARP, hypodiploid cells) was only seen after NVP BEZ235 treatment in the wildtype TP53 MCF-7 cell line. Thus, a radiosensitization independent of the oxygen supply became apparent for all oxygen conditions tested.
The aspect of the synergistic effect after irradiation of the MEK inhibitor AZD6244 and of the dual PI3K/mTOR inhibitor NVP-BEZ235 was examined for the first time within the third subproject. For this purpose, the colony formation ability was analyzed for the glioblastoma cell line SNB19 and for the lung carcinoma cell line A549. The MEK in-hibitor AZD6244 only caused a moderate radiosensitization whereas the dual PI3K/Akt/mTOR inhibitor NVP-BEZ235 resulted in a stronger radiosensitization com-pared to AZD6244. A combinatorial treatment with both inhibitors did not show a gain of the radiosensitizing effect of NVP-BEZ235 in any cell line. One possible explanation for the missing synergy in terms of radiosensitization could be the adverse effects on the cell cycle observed after combined inhibition. At the protein level the simultaneous treatment with both inhibitors caused an inhibition of both pathways. An increased dephosphorylation of Rb and an elevated proportion of G1 phase cells were observed in SNB19 cells after combinatorial treatment.
Within the scope of this doctoral thesis a radiosensitizing effect of NVP-BEZ235 was clearly demonstrated depending on the treatment scheme. It was shown that the radiosensitization was independent of the oxygen supply and the PTEN and TP53 mutational status of the tumor cells. The simultaneous inhibition of the MAPK/Erk and PI3K/Akt/mTOR pathways caused an increased cytostatic effect on tumor cells, but did not result in an elevated radiosensitization. However, a large number of different inhibi-tors of the MAPK/Erk and the PI3K/Akt/mTOR signaling cascades are available so far and therefore the specific examination of a combinatorial inhibition of these pathways should be continued. This doctoral thesis also provides basic research findings of the molecular mechanisms of radiosensitization induced by NVP-BEZ235 pointing to links and interactions with so far unknown proteins. These protein and network interactions should be clarified for each inhibitor in order to predict a specific effect on radiosensiti-zation.
KW  - Strahlensensibilisator
KW  - NVP-BEZ235
KW  - Strahlentherapie
KW  - Tumorzelle
Y1  - 2015
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-126715
ER  -