TY  - THES
A1  - Geissinger, Ulrike
T1  - Vaccinia Virus-mediated MR Imaging of Tumors in Mice: Overexpression of Iron-binding Proteins in Colonized Xenografts
T1  - Vaccinia Virus-vermittelte MR Bildgebung von Tumoren in Maeusen: Ueberexpression von Eisen-bindenden Proteinen in kolonisierten Heterotransplantaten
N2  - Vaccinia virus plays an important role in human medicine and molecular biology ever since the 18th century after E. Jenner discovered its value as a vaccination virus against smallpox. After the successful eradication of smallpox, vaccinia virus, apart from its use as a vaccine carrier, is today mainly used as a viral vector in molecular biology and increasingly in cancer therapy. The capability to specifically target and destroy cancer cells makes it a perfect agent for oncolytic virotherapy. Furthermore, the virus can easily be modified by inserting genes encoding therapeutic or diagnostic proteins to be expressed within the tumor. The emphasis in this study was the diagnosis of tumors using different vaccinia virus strains. Viruses with metal-accumulating capabilities for tumor detection via MRI technology were generated and tested for their usefulness in cell culture and in vivo. The virus strains GLV-1h131, GLV-1h132, and GLV-1h133 carry the gene encoding the two subunits of the iron storage protein ferritin under the control of three different promoters. GLV-1h110, GLV-1h111, and GLV-1h112 encode the bacterial iron storage protein bacterioferritin, whereas GLV-1h113 encodes the codon-optimized version of bacterioferritin for more efficient expression in human cells. GLV-1h22 contains the transferrin receptor gene, which plays an important role in iron uptake, and GLV-1h114 and GLV-1h115 contain the murine transferrin receptor gene. For possibly better iron uptake the virus strains GLV-1h154, GLV-1h155, GLV-1h156, and GLV-1h157 were generated, each with a version of a ferritin gene and a transferrin receptor gene. GLV-1h154 carries the genes that encode bacterioferritin and human transferrin receptor, GLV-1h155 the human ferritin H-chain gene and the human transferrin receptor gene. GLV-1h156 and GLV-1h157 infected cells both express the mouse transferrin receptor and bacterioferritin or human ferritin H-chain, respectively. The virus strains GLV-1h186 and GLV-1h187 were generated to contain a mutated form of the ferritin light chain, which was shown to result in iron overload and the wildtype light chain gene, respectively. The gene encoding the Divalent Metal Transporter 1, which is a major protein in the uptake of iron, was inserted in the virus strain GLV-1h102. The virus strain GLV-1h184 contains the magA gene of the magnetotactic bacterium Magnetospirillum magnetotacticum, which produces magnetic nanoparticles for orientation in the earth’s magnetic field. Initially the infection and replication capability of all the virus strains were analyzed and compared to that of the parental virus strain GLV-1h68, revealing that all the viruses were able to infect cells of the human cancer cell lines A549 and GI-101A. All constructs exhibited a course of infection comparable to that of GLV-1h68. Next, to investigate the expression of the foreign proteins in GI-101A and A549 cells with protein analytical methods, SDS-gelelectrophoresis, Western blots and ELISAs were performed. The proteins, which were expressed under the control of the strong promoters, could be detected using these methods. To be able to successfully detect the protein expression of MagA and DMT1, which were expressed under the control of the weak promoter, the more sensitive method RT-PCR was used to at least confirm the transcription of the inserted genes. The determination of the iron content in infected GI-101A and A549 cells showed that infection with all used virus strains led to iron accumulation in comparison to uninfected cells, even infection with the parental virus strain GLV-1h68. The synthetic phytochelatin EC20 was also shown to enhance the accumulation of different heavy metals in bacterial cultures. In vivo experiments with A549 tumor-bearing athymic nude mice revealed that 24 days post infection virus particles were found mainly in the tumor. The virus-mediated expression of recombinant proteins in the tumors was detected successfully by Western blot. Iron accumulation in tumor lysates was investigated by using the ferrozine assay and led to the result that GLV-1h68-infected tumors had the highest iron content. Histological stainings confirmed the finding that iron accumulation was not a direct result of the insertion of genes encoding iron-accumulating proteins in the virus genome. Furthermore virus-injected tumorous mice were analyzed using MRI technology. Two different measurements were performed, the first scan being done with a seven Tesla small animal scanner seven days post infection whereas the second scan was performed using a three Tesla human scanner 21 days after virus injection. Tumors of mice injected with the virus strains GLV-1h113 and GLV-1h184 were shown to exhibit shortened T2 and T2* relaxation times, which indicates enhanced iron accumulation. In conclusion, the experiments in this study suggest that the bacterioferritin-encoding virus strain GLV-1h113 and the magA-encoding virus strain GLV-1h184 are promising candidates to be used for cancer imaging after further analyzation and optimization.
N2  - Das Vaccinia Virus spielt in der Humanmedizin und Molekularbiologie eine wichtige Rolle seit E. Jenner im 18. Jahrhundert seinen Nutzen als Impfvirus entdeckt hat. Nach der erfolgreichen Ausrottung der Pocken, wird das Vaccinia Virus heutzutage neben der Anwendung als Impfstoffträger hauptsächlich als viraler Vektor in der Molekularbiologie und in zunehmendem Maße in der Krebstherapie verwendet. Die Fähigkeit Krebszellen gezielt zu zerstören, macht es zu einem perfekten Wirkstoff für die onkolytische Virotherapie. Des Weiteren kann das Virus durch das Inserieren von Genen, die für therapeutische oder diagnostische Proteine kodieren, und im Tumor exprimiert werden, modifiziert werden. Der Schwerpunkt dieser Arbeit war die Tumordiagnose mit Hilfe verschiedener Vaccinia Virusstämme. Viren mit der Fähigkeit, Metalle anzureichern wurden zur Tumordetektion mittels Kernspintomographie hergestellt und auf ihre Nutzbarkeit in Zellkultur und in vivo getestet. Die Virusstämme GLV-1h132, GLV-1h132 und GLV-1h133 tragen das Gen, welches für die zwei Untereinheiten des Eisenspeicherproteins Ferritin kodieren unter der Kontrolle von drei verschiedenen Promotoren. GLV-1h110, GLV-1h111, und GLV-1h112 tragen das Gen, welches für das bakterielle Eisenspeicherprotein Bacterioferritin kodiert, wohingegen das inserierte Gen in GLV-1h113 für die codon-optimierte Version dieses Proteins kodiert, die eine effizientere Expression in humanen Zellen ermöglichen soll. GLV-1h22 beinhaltet das Transferrin-Rezeptor-Gen, welches eine wichtige Rolle in der Eisenaufnahme spielt, und GLV-1h114 und GLV-1h115 beinhalten das murine Transferrin-Rezeptor-Gen. Für eine möglicherweise bessere Eisenaufnahme wurden die Virusstämme GLV-1h154, GLV-1h155, GLV-1h156 und GLV-1h157 mit je einer Version eines Ferritin-Gens und eines Transferrin-Rezeptor-Gens generiert. GLV-1h154 trägt die Gene, die für Bacterioferritin und den humanen Transferrin Rezeptor kodieren, GLV-1h155 trägt die Gene für die humane Ferritin H-Untereinheit und den humanen Transferrin Rezeptor. Zellen, die mit GLV-1h156 und GLV-1h157 infiziert wurden, exprimierten den Maus-Transferrin-Rezeptor und Bacterioferritin beziehungsweise die humane Ferritin-H-Untereinheit. Die Virusstämme GLV-1h186 und GLV-1h187 wurden mit einer mutierten Form der leichten Untereinheit von Ferritin, für die eine Überladung mit Eisen gezeigt wurde, beziehungsweise mit der leichten Untereinheit des wildtypischen Gens ausgestattet. Das Gen, das für den Divalenten Metal Transporter 1 kodiert, welches ein bedeutendes Protein für die Aufnahme von Eisen darstellt, wurde in den Virusstamm GLV-1h102 inseriert. Der Virusstamm GLV-1h184 trägt das magA Gen des magnetotaktischen Bakteriums Magnetospirillum magnetotacticum, welches magnetische Nanopartikel zur Orientierung im Erdmagnetfeld produziert. Zunächst wurde die Infektions- und Replikationsfähigkeit aller Viren analysiert und mit der des Ausgangsstammes GLV-1h68 verglichen, was zeigte, dass alle Viren in der Lage waren humane Krebszellen der Zelllinien GI-101A und A549 zu infizieren. Alle Konstrukte zeigten einen vergleichbaren Infektionsverlauf zu GLV-1h68. Als nächstes, um die Expression der fremden Proteine in GI-101A und A549 Zellen zu untersuchen, wurden SDS-Gelelektrophorese, Western Blots und ELISAs durchgeführt. Die Proteine, welche unter der Kontrolle von starken Promotoren exprimiert wurden, konnten mit diesen Methoden detektiert werden. Um die Expression von MagA und DMT1 zu detektieren, welche unter der Kontrolle des schwachen Promotors exprimiert wurden, wurde die sensitivere Methode RT-PCR angewendet, mit der zumindest die Transkription der Gene nachgewiesen werden konnte. Die Bestimmung des Eisengehaltes in infizierten GI-101A und A549 Zellen zeigte, dass die Infektion mit allen Viren im Vergleich zu uninfizierten Zellen zu einer Eisenanreicherung führte, sogar die Infektion mit dem Ausgangsstamm GLV-1h68. Für das synthetische Phytochelatin EC20 wurde auch eine Anhäufung von verschiedenen Schwermetallen in Bakterienkulturen gezeigt. In vivo Experimente mit A549 tumor-tragenden athymischen Nacktmäusen ergaben, dass Viruspartikel 24 Tage nach der Infektion hauptsächlich im Tumor gefunden wurden. Die von den Viren vermittelte Expression der rekombinanten Proteine in den Tumoren wurde erfolgreich mit Hilfe von Western Blots detektiert. Die Eisenansammlung in Tumorlysaten wurde mit dem Ferrozine Assay untersucht und führte zu dem Ergebnis, dass Tumore, die mit GLV-1h68 infiziert wurden, den höchsten Eisengehalt vorwiesen. Histologische Färbungen bestätigten die Erkenntnis, dass die Eisenansammlung nicht ein direktes Resultat der Insertion von eisenansammelnden Genen in das Virusgenom war. Darüberhinaus wurden tumortragende Mäuse, denen Virus injiziert wurde, mittels Kernspintomographie analysiert. Zwei verschiedene Messungen wurden durchgeführt, wobei die erste Messung sieben Tage nach Virusinjektion mit einem sieben Tesla Kleintier-Scanner durchgeführt wurde und die zweite Messung mit einem humanen drei Tesla Scanner 21 Tage nach Virusinjektion. Tumore von Mäusen, die mit den Virusstämmen GLV-1h113 und GLV-1h184 injiziert wurden, zeigten verkürzte T2- und T2*-Relaxationszeiten, was auf eine verbesserte Eisenakkumulation hinweist. Zusammenfassend deuten die Experimente dieser Studie darauf hin, dass der Virusstamm GLV-1h113, welcher für Bacterioferritin kodiert, und der Virusstamm GLV-1h184, welcher für MagA kodiert, nach weiterer Untersuchung und Optimierung vielversprechende Kandidaten für die Krebs Bildgebung sind.
KW  - Vaccinia-Virus
KW  - NMR-Tomographie
KW  - Tumor
KW  - Krebsbildgebung
KW  - Tumordetektion
KW  - Vaccinia Virus
KW  - Tumor detection
KW  - MRI
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48099
ER  - 
TY  - THES
A1  - Wang, Huiqiang
T1  - Enhanced Replication of Vaccinia Virus GLV-1h68 in Cancer Stem-like Cells of Human Breast Cancer Cell Preparations
T1  - Verbesserte Replikation desVerbesserte Replikation des Vaccinia Virus GLV-1h68 in Präparation von Tumorstammzell-ähnlichen Zellen
N2  - There is more and more evidence for the cancer stem cell hypothesis which believes that cancers are driven by a cellular subcomponent that has stem cell properties which is self-renewal, tumorigenicity and multilineage differentiation capacity. Cancer stem cells have been connected to the initiation of tumors and are even found to be responsible for relapses after apparently curative therapies have been undertaken. This hypothesis changes our conceptual approach of oncogenesis and shall have implications in breast cancer prevention, detection and treatment, especially in metastatic breast cancer for which no curative treatment exists. Given the specific stem cell features, novel therapeutic pathways can be targeted. Since the value of vaccinia virus as a vaccination virus against smallpox was discovered by E. Jenner at 18th century, it plays an important role in human medicine and molecular biology. After smallpox was successfully eradicated, vaccinia virus is mainly used as a viral vector in molecular biology and increasingly in cancer therapy. The outstanding capability to specifically target and destroy cancer cells makes it a perfect agent for oncolytic virotherapy. Furthermore, the virus can easily be modified by inserting genes which encode therapeutic or diagnostic proteins to be expressed when a tumor is infected. The emphasis in this study was the establishment of methods for the enrichment of human breast cancer stem-like cells from cancer cell lines and characterization of those cancer stem-like cells in vitro and in vivo. Furthermore, by using the Genelux Corporation vaccinia virus strain GLV-1h68, the isolated cancer stem-like cells can be targeted not only in vitro but also in vivo more efficiently. Side-population (SP) cells within cancers and cell lines are rare cell populations known to be enriched cancer stem-like cells. In this study, we used Hoechst 33342 staining and flow cytometry to identify SP cells from the human breast cancer cell lines MCF-7 and GI-101A as models for cancer stem-like cells. Considering the cytotoxicity of Hoechst dye and the restriction of instrument, we did not carry out further studies by this method. Utilizing in vitro and in vivo experimental systems, we showed that human breast cancer cell line GI-101A with aldehyde dehydrogenase activity (ALDH) have stemlike properties. Higher ALDH activity identifies the tumorigenic cell fraction which is capable of self-renewal and of generating tumors that could recapitulate the heterogeneity of the parental tumor. Furthermore, the cells with higher ALDH activity display significant resistance to chemotherapy and ionizing radiation, which proves their stem-like properties again. The cells which have higher ALDH activity also are more invasive compared to cells which have lower ALDH activity, which connects the cancer stem-like cells with cancer metastases. By analyzing the popular human breast cancer stem cells surface markers CD44, CD49f and CD24, it was discovered that the cells with higher ALDH activity have stronger CD44 and CD49f expression than in those cells with lower ALDH activity, which further confirms their stem-like properties. Finally, the cells with higher ALDH activity and lower ALDH activity were infected in vitro and used in virotherapy in a mouse xenograft model was performed. The results indicated that the vaccinia virus GLV-1h68 can replicate in cells with higher ALDH activity more efficiently than cells with lower ALDH activity. GLV-1h68 also can selectively target and eradicate the xenograft tumors which were derived from cells with higher ALDH activity. The epithelial-mesenchymal transition (EMT) is a key developmental program that is often activated during cancer invasion and metastases. EMT was induced in immortalized human mammary epithelial cells (HMLEs) and in GI-101A cells, which results in the acquisition of mesenchymal traits and in the expression of stem cell markers. Furthermore, the EMT-induced GI-101A cells showed resistance to chemotherapy and invasion capacity. CD44+/CD24- cells were enriched during the EMT induction. Following flow cytometry sorting by using CD44, CD24 and ESA surface marker, the sorted cells were tested in a mouse model regarding tumorigenicity. Unexpectedly, we found that CD44+/CD24+/ESA+ cells could initiate tumors more efficiently rather than CD44+/CD24-/ESA+ and other fractions in EMTinduced GI-101A cells. We also infected the CD44+/CD24+/ESA+ and CD44+/CD24- /ESA+ cells in vitro and performed virotherapy in a mouse xenograft model. The results indicated that the vaccinia virus GLV-1h68 is able to replicate in CD44+/CD24+/ESA+ cells more efficiently than in CD44+/CD24-/ESA+ cells. GLV-1h68 was also capable to selectively target and eradicate the xenograft tumors which derived from CD44+/CD24+/ESA+ cells. Moreover, CD44- cells have much lower tumorigenicity in the mouse model and CD44- cells derived-tumors are not responsive to vaccinia virotherapy. In summary, we have successfully established an in vitro and in vivo system for the identification, characterization and isolation of cancer stem-like cells from the human breast cancer cell line GI-101A by using the ALDEFLUOR assay. The vaccinia virus GLV-1h68 was able to efficiently target and eradicate the higher ALDH activity cells and tumors derived from those cells. Although contrary to the current assumption, CD44+/CD24+/ESA+ cells in the EMT-induced GI-101A cell line showed stem-like properties and GLV-1h68 was able to efficiently target and eradicate the CD44+/CD24+/ESA+ cells and tumors which derived from those cells. Finally, improved understanding of cancer stem cells may have tremendous relevance for how cancer should be treated. It is menacing that cancer stem cells are resistant to almost all anti-tumor approaches which have already been established for the treatment of metastatic diseases such as ionizing radiation, hormonal therapy, chemotherapy, and small molecular inhibitors. Therefore, it is promising that our results suggest that these cancer stem cells may be susceptible to treatment with oncolytic vaccinia virus.
N2  - Immer mehr experimentelle Hinweise stützen die Krebsstammzell-Hypothese, wonach Krebs durch eine zelluläre Teilkomponente angetrieben wird, die Stammzell- Eigenschaften hat, das heißt die Fähigkeit sich selbst zu erneuern, Tumorigenität und die Fähigkeit sich in verschiedene Richtungen zu differenzieren. Krebsstammzellen wurden mit der Enstehung von Tumorerkrankungen in Verbindung gebracht, und werden sogar für Rückfälle verantwortlich gemacht, nachdem scheinbar erfogreiche Behandlungen durchgeführt wurden. Diese Hypothese verändert unser Verständnis der Onkogenese und wird Auswirkungen auf die Brustkrebs-Prävention, -Erkennung und -Behandlung haben, vor allem in metastasierendem Brustkrebs, für den es keine kurative Behandlung gibt. Angesichts der besonderen Merkmale von Stammzellen können neue therapeutische Wege angestrebt werden. Seit sein Nutzen als Impfvirus gegen die Pocken von E. Jenner im 18. Jahrhundert entdeckt wurde, spielt das Vaccinia-Virus in der Humanmedizin und Molekularbiologie eine wichtige Rolle. Nachdem die Pocken erfolgreich ausgerottet wurden, wird das Vaccinia-Virus hauptsächlich als viraler Vektor in der Molekularbiologie und in zunehmendem Maße in der Krebstherapie verwendet. Die außerordentliche Fähigkeit, Krebszellen gezielt zu zerstören, macht es zu einem perfekten Wirkstoff für die onkolytische Virotherapie. Des Weiteren kann das Virus durch das Inserieren von Genen modifiziert werden, die für therapeutische oder diagnostische Proteine kodieren und im infizierten Tumor exprimiert werden. Der Schwerpunkt dieser Arbeit war die Etablierung von Methoden für die Anreicherung menschlicher Stammzell-ähnlicher Brustkrebszellen von Krebszelllinien und die Charakterisierung dieser Krebsstammzell-ähnlichen Zellen in vitro und in vivo. Darüber hinaus können mit Hilfe des Vaccinia-Virus-Stammes GLV- 1h68 von Genelux Corporation die isolierten Krebsstammzell-ähnlichen Zellen nicht nur in vitro, sondern auch in vivo effizienter eliminiert werden. Side-Population- (SP-) Zellen in Krebserkrankungen und Zelllinien sind seltene Zellpopulationen die dafür bekannt sind, reich an Krebsstammzell-ähnlichen Zellen zu sein. In dieser Studie verwendeten wir eine Hoechst 33342-Färbung und Durchflusszytometrie, um SP-Zellen aus der menschlichen Brustkrebs-Zelllinie MCF- 7 zu identifizieren, als Modell für Krebsstammzell-ähnliche Zellen. In Anbetracht der Zytotoxizität des Hoechst-Farbstoffes und der Beschränkung des Instruments, wurde diese Methode nicht weiter verfolgt. Mit Hilfe von Experimenten in vitro und in vivo wurde gezeigt, dass die menschliche Brustkrebs-Zelllinie GI-101A mit Aldehyd-Dehydrogenase-Aktivität (ALDH) Stammzell-ähnliche Eigenschaften hat. Höhere ALDH-Aktivität identifiziert die tumorigene Zellfraktion, die zur Selbsterneuerung und zur Erzeugung von Tumoren fähig ist, was die Heterogenität des ursprünglichen Tumors deutlich macht. Darüber hinaus weisen Zellen mit hoher ALDH-Aktivität eine beachtliche Fähigkeit zur Resistenz gegen Chemotherapie und ionisierende Strahlung auf, was wiederum ihre Stammzell-ähnlichen Eigenschaften beweist. Ferner sind Zellen mit hoher ALDHAktivität im Vergleich zu Zellen mit niedriger ALDH-Aktivität stärker invasiv, was die Krebsstammzell-ähnlichen Zellen mit Krebsmetastasierung in Verbindung bringt. Bei der Analyse der gängigen Oberflächenmarker CD44, CD24 und CD49f in menschlichen Brustkrebs-Stammzellen beobachteten wir, dass Zellen mit hoher ALDH-Aktivität CD44 und CD49f stärker exprimieren als Zellen mit niedriger ALDHAktivität, was wiederum deren Stammzell-ähnliche Eigenschaften aufzeigt. Schließlich wurden die Zellen mit hoher und niedriger ALDH-Aktivität in vitro infiziert und Virotherapie im Maus-Xenograft-Modell durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass das Vaccinia-Virus GLV-1h68 in Zellen mit höherer ALDH-Aktivität effizienter replizieren kann als in Zellen mit niedrigerer ALDH-Aktivität. GLV-1h68 kann auch selektiv Xenograft-Tumore finden und zerstören, welche von Zellen mit hoher ALDHAktivität abstammten. Der epithelial-mesenchymale Übergang (EMT) ist ein essentieller Entwicklungs- Schritt, der häufig während der Invasion und Metastasierung in Krebserkrankungen aktiviert wird. Wir induzierten EMT in immortalisierten humanen Brust-Epithelzellen (HMLEs) und GI-101A-Zellen, was im Erwerb von mesenchymalen Eigenschaften und der Expression von Stammzell-Markern resultiert. Außerdem zeigten die EMTinduzierten GI-101A-Zellen Chemoresistenz und Fähigkeit zur Invasion. CD44+CD24--Zellen waren während der EMT-Induktion angereichert. Es wurden durchflusszytometrische Sortierung mit Hilfe von CD44-, CD24- und ESAOberflächenmarkern durchgeführt, und die sortierten Zellen wurden danach auf Tumorigenität in einem Mausmodell getestet. Unerwarteterweise fanden wir, dass CD44+CD24-ESA+-Zellen effizienter Tumore initiieren konnten als CD44+CD24- ESA+-Zellen und andere Fraktionen in EMT-induzierten GI-101A-Zellen. Wir haben auch die infizierten CD44+CD24+ESA+- und CD44+CD24-ESA+-Zellen in vitro infiziert und Virotherapie im Maus-Xenograft-Modell durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass das Vaccinia-Virus GLV-1h68 in CD44+CD24+ESA+-Zellen effizienter replizieren kann als CD44+CD24-ESA+-Zellen. GLV-1h68 konnte selektiv Xenograft- Tumore finden und eliminieren, die von CD44+CD24+ESA+-Zellen abstammten. Darüber hinaus haben CD44--Zellen eine sehr niedrige Tumorigenität im Mausmodell und Tumore, die von CD44--Zellen abstammen, sprechen nicht auf Vaccinia-Virotherapie an. Zusammenfassend haben wir erfolgreich ein System zur Identifizierung, Charakterisierung und Isolierung von Krebsstammzell-ähnlichen Zellen aus der menschlichen Brustkrebs-Zelllinie GI-101A in vitro und in vivo mit Hilfe des ALDEFLUOR-Assays etabliert. Das Vaccinia-Virus GLV-1h68 konnte zielgenau Zellen mit erhöhter ALDH-Aktivität oder daraus etablierte Tumore finden und zerstören. Obwohl, im Gegensatz zur gängigen Annahme, CD44+CD24+ESA+-Zellen in der EMT-induzierten GI-101A-Zelllinie Stammzell-ähnliche Eigenschaften zeigten, konnte GLV-1h68 zielgenau CD44+CD24+ESA+-Zellen oder daraus etablierte Tumore finden und zerstören. Schließlich kann ein verbessertes Verständnis der Krebsstammzellen eine enorme Bedeutung dafür haben, wie Krebs behandelt werden sollte. Es ist verhängnisvoll, dass Krebsstammzellen gegen fast alle Anti-Tumor-Ansätze, die bereits für die Behandlung von Metastasen etabliert wurden, resistent sind, wie ionisierende Strahlung, Hormontherapie, Chemotherapie und kleine molekulare Inhibitoren. Gerade deshalb ist es vielversprechend, dass unsere Ergebnisse darauf hin deuten, dass diese Krebsstammzellen auf Behandlung mit dem onkolytischen Vaccinia-Virus ansprechen.
KW  - Vaccinia Virus
KW  - Brustkrebs
KW  - Stammzelle
KW  - cancer stem cells
KW  - vaccinia virus
KW  - human breast cancer
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-64750
ER  - 
TY  - THES
A1  - Kirscher, Lorenz
T1  - Melanogene rekombinante Vaccinia-Viren als diagnostisches und therapeutisches Agenz zur Tumorbehandlung
T1  - Melanogenic recombinant Vaccina Viruses as diagnostic and therapeutic agent for tumor treatment
N2  - Die gängigen therapeutischen Behandlungsmethoden für die verschiedensten Krebserkrankungen zeigen nach wie vor Mängel bezüglich der Effizienz sowie zahlreiche Nebenwirkungen während und nach der Behandlung. Maßgeblich für diese Defizite ist die teilweise geringe Sensitivität der meisten konventionellen diagnostischen Systeme und damit einhergehend die oftmals zu späte Identifikation entarteter Gewebsbereiche. Zur Lösung dieser Problematik bieten onkolytische Vaccinia-Viren einen Ansatz, sowohl die Effizienz der Therapie wie auch die Diagnostik zu verbessern. In beiden Fällen sind die Tumorzell-spezifische Vermehrung der Viren und die Möglichkeit entscheidend, die Viren als Vektorsystem zur Expression therapeutischer oder diagnostischer Fremdgenkassetten zu nutzen.
Um ein auf Vaccinia-Virus-basierendes Reportersystem zum diagnostischen Nachweis von Krebszellen mittels Tiefengewebs-Tomographie bereit zu stellen, wurden die für die murine Tyrosinase (mTyr) und das Tyrosinase-Helferprotein 1 (Tyrp1) kodierenden Gene in das Genom eines onkolytischen Vaccinia-Virus inseriert. Die Tyrosinase ist das Schlüsselenzym der Melaninsynthese. Bereits die solitäre Expression der Tyrosinase führt in der transformierten Zelle zur Melaninproduktion. Das Tyrosinase-Helferprotein 1 ist an der Prozessierung und Stabilisierung der Tyrosinase beteiligt. Bereits in verschiedenen Studien konnte gezeigt werden, dass Melanin als Reportermolekül für die Magnetresonanz sowie für die multispektrale optoakustische Tomographie einsetzbar ist. Es wurde deswegen angestrebt, die Kombination aus dem therapeutischen Potential des onkolytischen Vaccinia-Virus und der diagnostischen Anwendung des Melanins als Reporter auszunutzen. Sämtliche in dieser Arbeit aufgeführten rekombinanten Vaccinia-Viren (rVACV) wurden von der Firma Genelux Corporation zur Verfügung gestellt und in dieser Arbeit hinsichtlich der therapeutischen Effizienz und des diagnostischen Potentials untersucht. In ersten Zellkultur-Versuchen wurde anhand verschiedener konstitutiv melanogener rVACV-Konstrukte festgestellt, dass die Kombination aus dem Vaccinia-Virus-spezifischen synthetic early/late Promotor und dem Enzym Tyrosinase (GLV-1h327) bzw. den Enzymen Tyrosinase und Tyrosinase-Helferprotein 1 (GLV-1h324) die höchste Melaninsynthese-Rate zeigte. Anschließend wurde mittels der Bestimmung der spektralen Absorption und der Enzymaktivität der viral kodierten Melanin synthetisierenden Enzyme sowie mikroskopischer Analysen gezeigt, dass es mit diesen auf
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Vaccinia-Virus-basierenden melanogenen Reportersystemen möglich ist, die Melaninsynthese in nicht-melanogenen Zellen zu induzieren.
Anhand elektronenmikroskopischer Untersuchungen in Zellkultur und ex vivo konnte gezeigt werden, dass die nach rVACV-Infektion stattfindende Melaninsynthese in den Lysosomen der Wirtszelle abläuft. Eine Analyse der atomaren Zusammensetzung des viral vermittelten Melanins ergab, dass es sich um eine Mischform aus Eu- und Phäomelanin handelt. Dieser Melanin-Mix ähnelte dem Melanin aus Haut und Augen, jedoch lagen an Melanin-gebundene Metallionen in erhöhtem Maß vor...
N2  - The common therapeutic approaches available to treat various cancers still have deficiencies concerning their efficiency and side effects. Decisive for these deficiencies is the poor sensitivity of most of the conventional diagnostic systems and associated with that the late, sometimes too late, identification of tumorous tissue. The oncolytic vaccinia virus is an opportunity to enhance the efficiency of both the therapy and the diagnosis of tumor tissue. In both cases, the specificity for tumor cells and the simplicity of inserting foreign gene cassettes into the viral genome are key factors. 
The genes encoding murine tyrosinase (mTyr) and tyrosinase related protein 1 (Tyrp1) were inserted into the genome of an oncolytic vaccinia virus. Tyrosinase is the key enzyme during melanogenesis and expression of this enzyme alone can lead to melanin production. Tyrp1 is involved in processing and stabilizing tyrosinase. Various studies have demonstrated melanin to be an excellent reporter molecule for MRI (magnetic resonance imaging) and MSOT (multispectral optoacoustic tomography). Therefore, melanogenic oncolytic vaccinia viruses were constructed to combine the therapeutic potential of this virus with diagnostic abilities of melanin. All recombinant vaccinia viruses (rVACV) mentioned were kindly provided by Genelux Corporation. In this thesis, we tested for their therapeutic efficiency and diagnostic potential. Initial cell culture experiments have shown that the combination of vaccinia virus-specific synthetic early/late promoter and the melanogenic enzyme tyrosinase (GLV-1h327) or the enzymes mTyr and Tyrp1 (GLV-1h324) have the highest melanin synthesis rate. It was observed that the infection of non-melanin producing cells with an rVACV-based melanogenic reporter system resulted in melanogenesis. Electron microscopy showed that the viral associated melanogenesis is localized in the lysosomes of the infected host cell. The atomic composition analysis of the virus-mediated melanin molecules revealed a mixture of eu- and pheomelanin. The virus-associated melanin is comparable to that in the skin and eye but showed higher amounts of melanin-bound metal ions. ...
KW  - Melanin
KW  - Vaccinia Virus
KW  - Onkolyse
KW  - MSOT
KW  - MRT
KW  - Tyrosinase
Y1  - 2014
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-112074
ER  -