TY - THES A1 - Subota, Ines T1 - Switches in trypanosome differentiation: ALBA proteins acting on post-transcriptional mRNA control T1 - Steuerungsmechanismen der Differenzierung in Trypanosomen: die Rolle von ALBA Proteinen in post-transkriptioneller mRNA Kontrolle N2 - Trypanosoma brucei is a digenetic eukaryotic parasite that develops in different tissues of a mammalian host and a tsetse fly. It is responsible for sleeping sickness in sub-saharan Africa. The parasite cycle involves more than nine developmental stages that can be clearly distinguished by their general morphology, their metabolism and the relative positioning of their DNA-containing organelles. During their development, trypanosomes remain exclusively extracellular and encounter changing environments with different physico-chemical properties (nutritional availability, viscosity, temperature, etc.). It has been proposed that trypanosomes use their flagellum as a sensing organelle, in agreement with the established role of structurally-related cilia in metazoa and ciliates. Recognition of environmental triggers is presumed to be at the initiation of differentiation events, leading to the parasite stage that is the best suited to the new environment. These changes are achieved by the modification of gene expression programmes, mostly underlying post-transcriptional control of mRNA transcripts. We first demonstrate that the RNA-binding proteins ALBA3/4 are involved in specific differentiation processes during the parasite development in the fly. They are cytosolic and expressed throughout the parasite cycle with the exception of the stages found in the tsetse fly proventriculus, as shown by both immunofluorescence and live cell analysis upon endogenous tagging with YFP. Knock-down of both proteins in the developmental stage preceding these forms leads to striking modifications: cell elongation, cell cycle arrest and relocalization of the nucleus in a posterior position, all typical of processes acting in parasites found in the proventriculus region. When ALBA3 is over-expressed from an exogenous copy during infection, it interferes with the relocalization of the nucleus in proventricular parasites. This is not observed for ALBA4 over-expression that does not visibly impede differentiation. Both ALBA3/4 proteins react to starvation conditions by accumulating in cytoplasmic stress granules together with DHH1, a recognized RNA-binding protein. ALBA3/4 proteins also partially colocalize with granules formed by polyA+ RNA in these conditions. We propose that ALBA are involved in trypanosome differentiation processes where they control a subset of developmentally regulated transcripts. These processes involving ALBA3/4 are likely to result from the specific activation of sensing pathways. In the second part of the thesis, we identify novel flagellar proteins that could act in sensing mechanisms. Several protein candidates were selected from a proteomic analysis of intact flagella performed in the host laboratory. This work validates their flagellar localization with high success (85% of the proteins examined) and defines multiple different patterns of protein distribution in the flagellum. Two proteins are analyzed during development, one of them showing down-regulation in proventricular stages. The functional analysis of one novel flagellar membrane protein reveals its rapid dynamics within the flagellum but does not yield a visible phenotype in culture. This is coherent with sensory function that might not be needed in stable culture conditions, but could be required in natural conditions during development. In conclusion, this work adds new pieces to the puzzle of identifying molecular switches involved in developmental mRNA control and environmental sensing in trypanosome stages in the tsetse fly. N2 - Trypanosoma brucei ist ein digenetischer, eukaryotischer Parasit, der zwischen Säugetier und Tsetsefliege alterniert, in welchen er unterschiedliche Gewebe besiedelt. Er ist die Ursache für die Schlafkrankheit in Afrika südlich der Sahara. Der Lebenszyklus der Trypanosomen besteht aus mehr als neun Parasitenstadien, die eindeutig anhand ihrer Morphologie, ihres Metabolismus und der Positionierung ihrer DNA Organellen unterschieden werden können. Trypanosomen bleiben ausschließlich extrazellulär und kommen im Laufe ihres Infektionszyklus mit sich verändernden Umwelteinflüssen in Berührung, z. B. Temperaturschwankungen, Variation in vorhandenen Energiequellen, erhöhte Viskosität usw. In Übereinstimmung mit der anerkannten sensorischen Funktion die Cilien in Vielzellern ausüben, wurde für diese Rolle das strukturverwandte Flagellum in Trypanosomen vorgeschlagen. Die Erkennung wechselnder Umweltparameter ist der vermutliche Auslöser für Differenzierungsprozesse, die ein Entwicklungsstadium hervorbringen, welches am besten an die neue Umgebung angepasst ist. Dies wird durch eine Modifizierung der Genexpression erreicht, die in Trypanosomen fast ausschließlich auf posttranskriptioneller Ebene erfolgt. Diese Arbeit zeigt, dass die RNA bindenden Proteine ALBA3 und ALBA4 an der Differenzierung von Trypanosomen in der Tsetsefliege beteiligt sind. Immunfluoreszenzanalyse und Lebendvideomikroskopie von Zellen, die eine an YFP gekoppelte Variante der Proteine enthalten, haben gezeigt, dass sich ALBA3/4 im Zytosol befinden und dass sie in jedem Parasitenstadium exprimiert sind, mit Ausnahme derer, die im Proventrikel der Tsetsefliege zu finden sind. Das Herunterregulieren der Proteine in vorangehenden Stadien, führt zu markanten Veränderungen, die mit denjenigen, die in Parasiten im Proventrikel zu finden sind, vergleichbar sind: z. B. Verlängerung der Zelle, Zellzyklusarrest und Lokalisierung des Zellkerns in eine posteriore Position. Im Gegenteil dazu findet die Umpositionierung des Zellkerns nicht statt, wenn ALBA3 während der Entwicklung des Parasiten in der Tsetsefliege überexprimiert wird. Ein vergleichbarer Effekt wird mit ALBA4 Überexpression nicht erreicht, welches die Entwicklung nicht negativ zu beeinflussen scheint. Wenn Trypanosomen Hungerstress ausgesetzt sind, reichern sich beide ALBA Proteine zusammen mit DHH1, einem anerkannten RNA bindenden Protein, in zytoplasmatischen Aggregaten an, die nur teilweise mit denjenigen kolokalisieren, die durch polyA+ RNA in diesen Bedingungen verursacht werden. Diese Arbeit zeigt, dass ALBA Proteine eine wichtige Rolle in der Entwicklung von Trypanosomen spielen und legt nahe, dass sie an der entwicklungsbedingten Kontrolle eines Teils der mRNA Expression beteiligt sind. Der zweite Teil dieser Arbeit handelt von der Identifizierung neuer flagellarer Proteine, die eine sensorische Funktion haben könnten. Hierfür wurden mehrere Proteinkandidaten aus einer durchgeführten Proteomanalyse intakter Flagellen gewählt. Die vorliegende Arbeit bestätigt die flagellare Lokalisierung der Proteine mit großem Erfolg (85% der untersuchten Proteine) und zeigt, dass sie unterschiedliche Verteilungsmuster vorweisen. Zwei der Proteine werden während der Infektion des Parasiten in der Tsetsefliege untersucht, was aufdeckt, dass eines davon in den Stadien im Proventrikel herunterreguliert ist. Die Funktionsstudie eines neu identifizierten flagellaren Membranproteins weist seine schnelle Dynamik im Flagellum auf, führt jedoch zu keinem sichtbaren Phänotyp in Laborbedingungen. Diese Beobachtung passt zu der Annahme, dass Proteine mit sensorischer Funktion in stabilen Laborverhältnissen nicht essentiell sind aber eine wichtige Rolle während der Entwicklung des Parasiten in natürlichen Bedingungen spielen. Zusammenfassend fügt diese Arbeit Teile zum Puzzle der Identifizierung molekularer Schalter, die in Trypanosomenstadien in der Tsetsefliege an der mRNA Kontrolle und der Erkennung der Umwelt beteiligt sind. KW - Trypanosoma brucei KW - Parasit KW - Entwicklung KW - Tsetsefliege KW - Trypanosomen KW - parasitärer Entwicklungszyklus KW - Differenzierung KW - Tsetse Fliege KW - ALBA Proteine KW - Kontrolle der Genexpression KW - trypanosomes KW - parasite cycle KW - differentiation KW - tsetse fly KW - ALBA proteins KW - gene expression control KW - flagellar sensing proteins KW - FLAMM KW - Genexpression Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85707 N1 - Durchführung der Experimente am Institut Pasteur, Arbeitsgruppe Trypanosome Cell Biology Unit, Paris, Frankreich ER - TY - JOUR A1 - Alizadehrad, Davod A1 - Krüger, Timothy A1 - Engstler, Markus A1 - Stark, Holger T1 - Simulating the complex cell design of Trypanosoma brucei and its motility JF - PLOS Computational Biology N2 - The flagellate Trypanosoma brucei, which causes the sleeping sickness when infecting a mammalian host, goes through an intricate life cycle. It has a rather complex propulsion mechanism and swims in diverse microenvironments. These continuously exert selective pressure, to which the trypanosome adjusts with its architecture and behavior. As a result, the trypanosome assumes a diversity of complex morphotypes during its life cycle. However, although cell biology has detailed form and function of most of them, experimental data on the dynamic behavior and development of most morphotypes is lacking. Here we show that simulation science can predict intermediate cell designs by conducting specific and controlled modifications of an accurate, nature-inspired cell model, which we developed using information from live cell analyses. The cell models account for several important characteristics of the real trypanosomal morphotypes, such as the geometry and elastic properties of the cell body, and their swimming mechanism using an eukaryotic flagellum. We introduce an elastic network model for the cell body, including bending rigidity and simulate swimming in a fluid environment, using the mesoscale simulation technique called multi-particle collision dynamics. The in silico trypanosome of the bloodstream form displays the characteristic in vivo rotational and translational motility pattern that is crucial for survival and virulence in the vertebrate host. Moreover, our model accurately simulates the trypanosome's tumbling and backward motion. We show that the distinctive course of the attached flagellum around the cell body is one important aspect to produce the observed swimming behavior in a viscous fluid, and also required to reach the maximal swimming velocity. Changing details of the flagellar attachment generates less efficient swimmers. We also simulate different morphotypes that occur during the parasite's development in the tsetse fly, and predict a flagellar course we have not been able to measure in experiments so far. KW - multiparticle collision dynamics KW - human african trypanosomiasis KW - biology KW - cytoskeleton KW - flow KW - flagellar motility KW - tsetse fly KW - propulsion KW - cytokinesis KW - parasites Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-144610 VL - 11 IS - 1 ER - TY - JOUR A1 - Schuster, Sarah A1 - Krüger, Timothy A1 - Subota, Ines A1 - Thusek, Sina A1 - Rotureau, Brice A1 - Beilhack, Andreas A1 - Engstler, Markus T1 - Developmental adaptations of trypanosome motility to the tsetse fly host environments unravel a multifaceted in vivo microswimmer system JF - eLife N2 - The highly motile and versatile protozoan pathogen Trypanosoma brucei undergoes a complex life cycle in the tsetse fly. Here we introduce the host insect as an expedient model environment for microswimmer research, as it allows examination of microbial motion within a diversified, secluded and yet microscopically tractable space. During their week-long journey through the different microenvironments of the fly´s interior organs, the incessantly swimming trypanosomes cross various barriers and confined surroundings, with concurrently occurring major changes of parasite cell architecture. Multicolour light sheet fluorescence microscopy provided information about tsetse tissue topology with unprecedented resolution and allowed the first 3D analysis of the infection process. High-speed fluorescence microscopy illuminated the versatile behaviour of trypanosome developmental stages, ranging from solitary motion and near-wall swimming to collective motility in synchronised swarms and in confinement. We correlate the microenvironments and trypanosome morphologies to high-speed motility data, which paves the way for cross-disciplinary microswimmer research in a naturally evolved environment. KW - none KW - tsetse fly KW - Trypanosoma KW - biophysics KW - microswimmer KW - sleeping sickness KW - structural biology Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-158662 VL - 6 ER - TY - THES A1 - Schuster, Sarah T1 - Analysis of \(Trypanosoma\) \(brucei\) motility and the infection process in the tsetse fly vector T1 - Analyse der Motilität von \(Trypanosoma\) \(brucei\) und dem Infektionsprozess in der Tsetsefliege N2 - African trypanosomes are protist pathogens that are infective for a wide spectrum of mammalian hosts. Motility has been shown to be essential for their survival and represents an important virulence factor. Trypanosoma brucei is transmitted by the bite of the bloodsucking tsetse fly, the only vector for these parasites. The voyage through the fly is complex and requires several migration, proliferation and differentiation steps, which take place in a defined order and in specific fly tissues. The first part of this doctoral thesis deals with the establishment of the trypanosome tsetse system as a new model for microswimmer analysis. There is an increasing interdisciplinary interest in microbial motility, but a lack of accessible model systems. Therefore, this work introduces the first enclosed in vivo host parasite system that is suitable for analysis of diverse microswimmer types in specific microenvironments. Several methods were used and adapted to gain unprecedented insights into trypanosome motion, the fly´s interior architecture and the physical interaction between host and parasite. This work provides a detailed overview on trypanosome motile behavior as a function of development in diverse host surroundings. In additional, the potential use of artificial environments is shown. This can be used to partly abstract the complex fly architecture and analyze trypanosome motion in defined nature inspired geometries. In the second part of the thesis, the infection of the tsetse fly is under investigation. Two different trypanosome forms exist in the blood: proliferative slender cells and cell cycle arrested stumpy cells. Previous literature states that stumpy cells are pre adapted to survive inside the fly, whereas slender cells die shortly after ingestion. However, infection experiments in our laboratory showed that slender cells were also potentially infective. During this work, infections were set up so as to minimize the possibility of stumpy cells being ingested, corroborating the observation that slender cells are able to infect flies. Using live cell microscopy and fluorescent reporter cell lines, a comparative analysis of the early development following infection with either slender or stumpy cells was performed. The experiments showed, for the first time, the survival of slender trypanosomes and their direct differentiation to the procyclic midgut stage, contradicting the current view in the field of research. Therefore, we can shift perspectives in trypanosome biology by proposing a revised life cycle model of T. brucei, where both bloodstream stages are infective for the vector. N2 - Afrikanische Trypanosomen sind pathogene Protisten, die ein breites Spektrum von Säugetierwirten infizieren. Es wurde gezeigt, dass die Zellmotilität für das Überleben der Parasiten essenziell ist und einen wichtigen Virulenzfaktor darstellt. Trypanosoma brucei wird durch den Biss der blutsaugenden Tsetsefliege übertragen, dem einzigen Vektor für diese Parasiten. Der Entwicklungszyklus in der Fliege ist komplex und beinhaltet mehrere Migrations-, Proliferations- und Differenzierungsschritte, die in einer definierten Reihenfolge und in spezifischen Fliegenorganen stattfinden. Der erste Teil dieser Doktorarbeit beschäftigt sich mit der Etablierung des Trypanosomen Tsetse Systems als ein neues Modell für Motilitätsanalysen. Es besteht ein wachsendes interdisziplinäres Interesse an mikrobieller Motilität, aber es fehlen zugängliche Mikroschwimmersysteme. Deswegen stellt diese Arbeit das erste abgeschlossene in vivo Wirt Parasit System vor, das für Analysen von verschiedenen Mikroschwimmertypen in spezifischen Umgebungen geeignet ist. Verschiedene Methoden wurden benutzt und adaptiert, um sowohl Einblicke in die Trypanosomenbewegung, die innere Fliegenarchitektur als auch die physikalischen Wechselwirkungen zwischen Wirt und Parasit zu erhalten. Diese Arbeit bietet einen detaillierten Überblick über das motile Verhalten von Trypanosomen als Funktion der Entwicklung in diversen Wirtsumgebungen. Zusätzlich ist die potenzielle Nutzung von artifiziellen Umgebungen gezeigt. Diese können benutzt werden, um die komplexe Architektur der Fliege teilweise zu abstrahieren und die Trypanosomenbewegung in definierten und von der Nature inspirierten Geometrien zu analysieren. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Infektion der Fliege genauer betrachtet. Im Blut existieren zwei verschiedene Trypanosomenformen: proliferierende ‘slender’ und Zellzyklus arretierte ‘stumpy’ Zellen. Bisherige Literatur besagt, dass stumpy Zellen präadaptiert sind, um in der Fliege zu überleben, wohingegen slender Zellen kurz nach der Aufnahme sterben. Dennoch konnten Infektionsexperimente in unserem Labor zeigen, dass auch slender Zellen potenziell infektiös sind. Während dieser Arbeit wurden weitere Infektionen so durchgeführt, dass die Möglichkeit für die Aufnahme von stumpy Zellen minimiert wurde und die Infektionskapazität der slender Zellen bestätigt werden konnte. Durch Lebendzell Mikroskopie mit fluoreszenten Reporterzelllinien wurde eine vergleichende Analyse für die frühe Entwicklung von slender und stumpy Parasiten nach der Infektion durchgeführt. Die Experimente zeigten zum ersten Mal das Überleben von slender Trypanosomen in der Tsetsefliege und ihre direkte Differenzierung in das prozyklische Mitteldarmstadium. Sie widersprechen demnach der aktuellen Auffassung im Forschungsbereich. Demzufolge können wir von einem Perspektivwechsel in der Trypanosomenbiologie sprechen und schlagen einen revidierten Lebenszyklus für T. brucei vor, in dem beide Blutstromformen für den Vektor infektiös sind. KW - Motilität KW - Trypanosomen KW - Tsetsefliege KW - Parasit KW - tsetse fly KW - motility KW - trypanosome KW - vector-parasite interaction KW - microswimming Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-192691 ER - TY - JOUR A1 - Schuster, Sarah A1 - Lisack, Jaime A1 - Subota, Ines A1 - Zimmermann, Henriette A1 - Reuter, Christian A1 - Mueller, Tobias A1 - Morriswood, Brooke A1 - Engstler, Markus T1 - Unexpected plasiticty in the life cycle of Trypanosoma brucei JF - eLife N2 - African trypanosomes cause sleeping sickness in humans and nagana in cattle. These unicellular parasites are transmitted by the bloodsucking tsetse fly. In the mammalian host’s circulation, proliferating slender stage cells differentiate into cell cycle-arrested stumpy stage cells when they reach high population densities. This stage transition is thought to fulfil two main functions: first, it auto-regulates the parasite load in the host; second, the stumpy stage is regarded as the only stage capable of successful vector transmission. Here, we show that proliferating slender stage trypanosomes express the mRNA and protein of a known stumpy stage marker, complete the complex life cycle in the fly as successfully as the stumpy stage, and require only a single parasite for productive infection. These findings suggest a reassessment of the traditional view of the trypanosome life cycle. They may also provide a solution to a long-lasting paradox, namely the successful transmission of parasites in chronic infections, despite low parasitemia. KW - trypanosoma KW - sleeping sickness KW - tsetse fly KW - transmission KW - life cycle KW - development Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-261744 VL - 10 ER -