TY - THES A1 - Jauch, Mandy T1 - Die Serin/Arginin Proteinkinase 79D (SRPK79D) von Drosophila melanogaster und ihre Rolle bei der Bildung Aktiver Zonen von Synapsen T1 - The serine/arginine protein kinase 79D (SRPK79D) of Drosophila melanogaster and its role in the formation of active zones of synapses N2 - Synapsen als Stellen der Kommunikation zwischen Neuronen besitzen spezialisierte Bereiche – Aktive Zonen (AZs) genannt –, die aus einem hoch komplexen Netzwerk von Proteinen aufgebaut sind und die Maschinerie für den Prozess der Neurotransmitter-Ausschüttung und das Vesikel-Recycling beinhalten. In Drosophila ist das Protein Bruchpilot (BRP) ein wichtiger Baustein für die T-förmigen Bänder („T-Bars“) der präsynaptischen Aktiven Zonen. BRP ist notwendig für eine intakte Struktur der Aktiven Zone und eine normale Exocytose von Neurotransmitter-Vesikeln. Auf der Suche nach Mutationen, welche die Verteilung von Bruchpilot im Gewebe beeinträchtigen, wurde eine P-Element-Insertion im Gen CG11489 an der Position 79D identifiziert, welches eine Kinase kodiert, die einen hohen Grad an Homologie zur Familie der SR Proteinkinasen (SRPKs) von Säugern aufweist. Die Mitglieder dieser Familie zeichnen sich durch eine evolutionär hoch konservierte zweigeteilte Kinasedomäne aus, die durch eine nicht konservierte Spacer-Sequenz unterbrochen ist. SRPKs phosphorylieren SR-Proteine, die zu einer evolutionär hoch konservierten Familie Serin/Arginin-reicher Spleißfaktoren gehören und konstitutive sowie alternative Spleißprozesse steuern und damit auf post-transkriptioneller Ebene die Genexpression regulieren. Mutation des Srpk79D-Gens durch die P-Element-Insertion (Srpk79DP1) oder eine Deletion im Gen (Srpk79DVN Nullmutante) führt zu auffälligen BRP-Akkumulationen in larvalen und adulten Nerven. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass diese BRP-Akkumulationen auf Ultrastruktur-Ebene ausgedehnten axonalen Agglomeraten elektronendichter Bänder entsprechen und von klaren Vesikeln umgeben sind. Charakterisierung durch Immuno-Elektronenmikroskopie ergab, dass diese Strukturen BRP-immunoreaktiv sind. Um die Bildung BRP-enthaltender Agglomerate in Axonen zu verhindern und damit eine intakte Gehirnfunktion zu gewährleisten, scheint die SRPK79D nur auf niedrigem Niveau exprimiert zu werden, da die endogene Kinase mit verschiedenen Antikörpern nicht nachweisbar war. Wie in anderen Arbeiten gezeigt werden konnte, ist die Expression der PB-, PC- oder PF-Isoform der vier möglichen SRPK79D-Varianten, die durch alternativen Transkriptionsstart in Exon eins beziehungsweise drei und alternatives Spleißen von Exon sieben zustande kommen, zur Rettung des Phänotyps der BRP-Akkumulation im Srpk79DVN Nullmutanten-Hintergrund ausreichend. Zur Charakterisierung der Rescue-Eigenschaften der SRPK79D-PE-Isoform wurde mit der Klonierung der cDNA in einen UAS-Vektor begonnen. Offenbar beruht die Bildung der axonalen BRP-Agglomerate nicht auf einer Überexpression von BRP in den betroffenen Neuronen, denn auch bei reduzierter Expression des BRP-Proteins im Srpk79DVN Nullmutanten-Hintergrund entstehen die BRP-Agglomerate. In Köpfen der Srpk79DVN Nullmutante ist die Gesamtmenge an Bruchpilot-Protein im Vergleich zum Wildtyp nicht deutlich verändert. Auch die auf Protein-Ebene untersuchte Expression der verschiedenen Isoformen der präsynaptischen Proteine Synapsin, Sap47 und CSP weicht in der Srpk79DVN Nullmutante nicht wesentlich von der Wildtyp-Situation ab, sodass sich keine Hinweise auf verändertes Spleißen der entsprechenden prä-mRNAs ergeben. Jedes der sieben bekannten SR-Proteine von Drosophila ist ein potentielles Zielprotein der SRPK79D. Knock-down-Experimente für die drei hier untersuchten SR-Proteine SC35, X16/9G8 und B52/SRp55 im gesamten Nervensystem durch RNA-Interferenz zeigten allerdings keinen Effekt auf die Verteilung von BRP im Gewebe. Hinsichtlich der Flugfähigkeit der Tiere hat die Srpk79DVN Nullmutation keinen additiven Effekt zum Knock-down des BRP-Proteins, denn die Doppelmutanten zeigten bei der Bestimmung des Anteils an flugunfähigen Tieren vergleichbare Werte wie die Einzelmutanten, die entweder die Nullmutation im Srpk79D-Gen trugen, oder BRP reduziert exprimierten. Vermutlich sind Bruchpilot und die SR Proteinkinase 79D somit Teil desselben Signalwegs. Durch Doppelfärbungen mit Antikörpern gegen BRP und CAPA-Peptide wurde abschließend entdeckt, dass Bruchpilot auch im Median- und Transvers-Nervensystem (MeN/TVN) von Drosophila zu finden ist, welche die Neurohämal-Organe beherbergen. Aufgabe dieser Organe ist die Speicherung und Ausschüttung von Neuropeptid-Hormonen. Daher ist zu vermuten, dass das BRP-Protein neben Funktionen bei der Neurotransmitter-Exocytose möglicherweise eine Rolle bei der Ausschüttung von Neuropeptiden spielt. Anders als in den Axonen der larvalen Segmental- und Intersegmentalnerven der Srpk79DVN Nullmutante, die charakteristische BRP-Agglomerate aufweisen, hat die Mutation des Srpk79D-Gens in den Axonen der Va-Neurone, die das MeN/TVN-System bilden, keinen sichtbaren Effekt auf die Verteilung von Brp, denn das Muster bei Färbung gegen BRP weist keine deutlichen Veränderungen zum Wildtyp auf. N2 - Synapses as sites of communication between neurons contain specialized regions termed active zones (AZs) which are composed of a highly complex network of proteins comprising the exocytotic machinery for neurotransmitter release and vesicle recycling. In Drosophila the Bruchpilot (BRP) protein is an important building block of the T-shaped ribbons („T-bars“) at presynaptic active zones. By screening for mutations affecting the tissue distribution of Bruchpilot, a P-transposon insertion in the Srpk gene at the position 79D has been identified (Srpk79D, CG11489). This gene codes for a kinase which shows high homology to the mammalian family of serine/arginine protein kinases (SRPKs). Members of this family have an evolutionarily highly conserved bipartite kinase domain in common which is separated by a non-conserved spacer sequence. SRPKs phosphorylate SR proteins, an evolutionarily highly conserved family of serine/arginine-rich splicing factors that control the processes of constitutive and alternative splicing. Mutation of the Srpk79D gene caused by the P-element insertion (Srpk79DP1) or by a deletion in the gene (Srpk79DVN null mutant) leads to conspicuous accumulations of BRP in larval and adult axons. This thesis shows that these BRP accumulations at the ultrastructural level correspond to extensive axonal agglomerates of electron-dense ribbons surrounded by clear vesicles. Using immuno electron microscopy, these accumulation were characterized as BRP immuno-reactive structures. To prevent the assembly of BRP containing agglomerates in axons and to maintain intact brain function the SRPK79D seems to be expressed only at low levels because the endogenous kinase was not detectable using various antibodies. It was shown in other thesis that the expression of the PB, PC or PF isoform of the four possible SRPK79D variants resulting from two alternative transcription start sites in exon one and three, respectively, and alternative splicing of exon seven is sufficient to rescue the phenotype of BRP accumulation in the Srpk79DVN null-mutant background. Cloning of the cDNA for the SRPK79D-PE isoform into a UAS vector has been started in order to characterize the ability of this isoform to rescue the BRP-phenotype. It seems as if the formation of axonal BRP agglomerates is not due to BRP overexpression in the affected neurons as was shown by reduced expression of the BRP protein in the Srpk79DVN null-mutant background which still leads to BRP agglomerates. The overall amount of Bruchpilot protein in adult heads of the Srpk79DVN null mutant is not clearly altered compared to wild type. No clear alteration was observed between Srpk79DVN null-mutant and wild-type flies comparing the expression of different presynaptic proteins like Synapsin, Synapse-associated protein of 47 kDa (Sap47), and Cysteine string protein (CSP). The experiment does not point towards altered splicing of the corresponding pre-mRNAs. Each of the seven known SR proteins of Drosophila is a potential target protein of the SRPK79D. Pan-neuronal knock-down experiments for the three SR proteins SC35, X16/9G8, and B52/SRp55 investigated in this thesis by RNA interference did not show an effect on the tissue distribution of BRP. It was shown that the Srpk79DVN null mutation has no additive effect on the knock-down of the BRP protein regarding the flight ability of the respective animals because the double mutants showed similar values of non-flyers as each of the single mutants with either null mutation of the Srpk79D gene or knock-down of BRP. Presumably, Bruchpilot and the SR protein kinase 79D are part of the same signaling pathway. Performing double fluorescence stainings with antibodies against BRP and the CAPA peptides it was shown that Bruchpilot is also present in the median and transverse nerve system (MeN/TVN) of Drosophila containing the neurohaemal organs. These organs are responsible for storage and release of neuropeptide hormones. In contrast to the larval segmental and intersegmental nerves of the Srpk79DVN null mutant which show characteristic BRP agglomerates, mutation of the Srpk79D gene does not affect the distribution of BRP in the axons of the Va neurons which form the MeN/TVN system. The staining pattern of BRP in these nerves does not show clear alterations in the Srpk79DVN null mutant compared to wild type. The finding that BRP is present in the median and transverse nerve system opens the field for speculation of a role for the Bruchpilot protein not only in the neurotransmitter exocytosis but also in the release of neuropeptides. KW - Taufliege KW - Serin KW - Arginin KW - Proteinkinasen KW - Synapse KW - Genexpression KW - Aktive Zone KW - Serin/Arginin Proteinkinase KW - SRPK KW - Bruchpilot KW - Drosophila KW - Synapse KW - Motorische Endplatte KW - Nervenzelle KW - Neurotransmitter KW - active zone KW - serine/arginine protein kinase KW - SRPK KW - Bruchpilot Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-53974 ER - TY - THES A1 - Funk, Natalja T1 - Das Sap47-Gen aus Drosophila melanogaster : Gezielte Mutagenisierung und Suche nach Interaktionspartnern T1 - The Sap47 gene of Drosophila melanogaster: mutagenesis and identification of interaction partners N2 - SAP47 ist ein Synapsenassoziiertes Protein von 47 kDa aus Drosophila melanogaster, das zu einer neuen Proteinfamilie gehört. Um eine Sap47 Mutante zu erzeugen wurden drei Methoden eingesetzt: Gezielte Mutagenese durch homologe Rekombination, RNA interference (RNAi) und Transposon Remobilisierung. Um einen Interaktionspartner für das SAP47 Protein zu identifizieren wurden ein Yeast-Two-Hybrid System und das "CytoTrap" Verfahren eingesetzt. N2 - SAP47 (synapse-associated protein of 47 kDA) of Drosophila melanogaster belongs to a novel protein family of unknown function. Three techniques were used for Sap47 mutagenesis: "gene targeting" by homologous recombination, RNA interference (RNAi) and Jump-out mutagenesis. A standard yeast-two-hybrid system and the "CytoTrap" assay were used to identify interaction partners for the SAP47 protein. KW - Taufliege KW - Molekulargenetik KW - Sap47 KW - Synapse KW - RNA interference KW - Gezeilte Mutagenese KW - Sap47 KW - synapse KW - RNA interference KW - gene targeting Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-7667 ER - TY - THES A1 - Leibold, Christian T1 - Das Cystein String Protein von Drosophila melanogaster - Invivo-Funktionsanalyse verschiedener Proteindomänen am Modellsystem der larvalen neuromuskulären Synapse T1 - The Cysteine string protein of Drosophila melanogaster - Invivo-functional analysis of different protein domains using the larval neuromuscular junction as a model system N2 - Cystein String Proteine (CSPs) wurden als synaptische Vesikelproteine entdeckt. In Drosophila werden sie in den funktionellen Synapsen und sekretorischen Organellen aller Entwicklungsstufen exprimiert. Es konnte gezeigt werden, dass CSPs an der regulierten Neurotransmitterausschüttung beteiligt sind und mehrere, von Insekten bis zum Menschen konservierte Domänen besitzen: eine N-terminale Phosphorylierungsstelle der Protein Kinase A (PKA), eine J-Domäne mit 50%iger Homologie zum bakteriellen Chaperone-Protein DnaJ, eine Linker-Domäne, einen Cystein String aus elf aufeinander folgenden Cysteinen, die durch zwei Cystein-Paare flankiert werden und einen variableren C-Terminus. Es wurden Interaktionen mit den Proteinen HSC70, SGT, Syntaxin, Synaptobrevin/VAMP, verschiedenen Untereinheiten von G-Proteinen, Synaptotagmin, sowie spannungsabhängigen Ca2+-Kanälen beschrieben. csp-Nullmutanten CspU1 von Drosophila melanogaster zeigen einen temperatursensitiven Phänotyp, in dem adulte Fliegen von CspU1 reversibel bei 37°C innerhalb von drei Minuten paralysieren. An der neuromuskulären Synapse dritter Larven von CspU1 kann bei nicht-permissiver Temperatur von 32°C eine reversible Blockade der synaptischen Transmission beobachtet werden. In der vorliegenden Arbeit sollten mit Hilfe des larvalen Nerv-Muskel-Präparats dritter Larven elektrophysiologische Untersuchungen an verschiedenen csp-Mutanten durchgeführt werden. Hierdurch sollte die Bedeutung der einzelnen Domänen für die Funktion von csp weiter aufgeklärt werden. Am larvalen Nerv-Muskel-Präparat von Drosophila ist eine Arbeit auf Einzel-Zell-Niveau möglich. Die Segmentierung, die wiederkehrende Anordnung von Muskeln und innervierenden Motoneuronen, sowie das Vorkommen vieler auch im Gehirn von Drosophila lokalisierter synaptischer Proteine machen die larvale neuromuskuläre Synapse für die vorliegenden Fragestellungen. Wie in vielen anderen Arbeiten, wurden elektrophysiologische Messungen an dem Longitudinalmuskel 6 durchgeführt. Alle Messungen evozierter Muskelpotentiale (EJP) wurden, wenn nicht anders erwähnt, mit 0,2Hz Stimulusfrequenz durchgeführt. Die Reiz-Intensität wurde an jedes Präparat individuell angepasst und betrug das 2 ½ -fache des Initial-Schwellenwertes, bei dem ein vollständiges EJP ausgelöst wurde. Zunächst konnte der in der Literatur beschriebene larvale Block der synaptischen Transmitterausschüttung bei erhöhter Temperatur nicht reproduziert, jedoch durch Rückkreuzungen der Nullmutante CspU1 gegen den Wildtyp w1118 wiederhergestellt werden. Das „Rescue“-Konstrukt scDNA1, welches die Grundlage für alle weiteren mutierten Formen von csp darstellt, rettete den larvalen temperatursensitiven Phänotyp im csp-Nullmutantenhintergrund von CspU1 vollständig. Larvale Mutanten der Linie SSP, bei denen der Cystein String durch einen Serin String ausgetauscht worden war (Serine-string protein), zeigten in Übereinstimmung mit den adulten Fliegen den bekannten temperatursensitiven Phänotyp. Larvale Mutanten der Linie CLP (Cysteine-less protein) zeigten im Gegensatz zu adulten Tieren dieser Linie keinen temperatursensitiven Phänotyp, sondern ein wildtypisches Verhalten. Für die Mutante L∆8, die im Nullmutantenhintergrund von CspU1 roc ein in der Linker-Domäne um acht Aminosäuren verkürztes CSP-Protein exprimiert, wurden verschiedene elektrophysiologische Phänotypen beobachtet: Larven der X-chromosomalen Linie zeigten den bekannten temperaturabhängigen Block der synaptischen Transmission. Larven der Insertionslinie für das 3. Chromosom zeigten keine Temperatursensitivität, sondern wildtypisches Verhalten. In immunhistochemischen Untersuchungen konnte für die X-chromosomale Linie eine deutlich schwächere Expression des L∆8-Proteins beobachtet werden. Larven der Linie C∆27, die ein im C-terminalen Bereich von CSP um 27 Aminosäuren verkürztes CSP-Protein exprimieren, im Nullmutantenhintergrund CspU1 roc konnten anhand des Phänotyps in zwei Gruppen unterteilt werden. Unabhängig vom Insertionsort zeigte eine Gruppe den bekannten larvalen temperatursensitiven Phänotyp. Die zweite Gruppe zeigte auch bei erhöhter Temperatur wildtypisches Verhalten. Im zweiten Teil der Arbeit wurde versucht, eine neue Deletionsmutante für csp durch Remobilisierung einer P-Insertion (P#1617, flybase, Bloomington) im ersten Exon zu erzeugen, da in der Nullmutante CspU1 möglicherweise auch benachbarte Gene betroffen sind. Nach Überprüfung der erzeugten Mutanten durch Western und Southern Blot, immunhistochemische Experimente und elektrophysiologische Untersuchungen am Nerv-Muskel-Präparat 3. Larven konnte keine Deletionsmutante mit temperaturabhängigem Phänotyp isoliert werden, die ausschließlich csp betraf. N2 - Cysteine string proteins (CSPs) were detected as synaptic vesicle proteins. In Drosophila they are expressed in functional synapses and secretory organelles of all developmental stages. CSPs were shown to be involved in regulated neurotransmitter release and contain several domains, which are conserved from insects to man: N-terminal phosphorylation site for protein kinase A (PKA), “J”-domain with 50% homology to a bacterial chaperone-protein DnaJ, “linker”-domain, cysteine string consisting of eleven following cysteines, flanked by two pairs of cysteines and the more variable C-terminus. Interactions with the following proteins have been described: HSC70, SGT, Syntaxin, Synaptobrevin/VAMP, several subunits of G-proteins, Synaptotagmin, and voltage-dependent Ca2+-channels. Csp-null mutants (CspU1) of Drosophila melanogaster exhibit a temperature sensitive phenotype. Adult flies of CspU1 paralyse reversibly at 37°C within three minutes. At the neuromuscular junction of 3rd instar larvae of CspU1 a reversible blockade of synaptic transmission can be observed at non-permissive temperature of 32°C. Electrophysiological studies at the larval nerve-muscle-preparation of 3rd instar larvae of different csp-mutants were performed in this Ph.D. thesis in order to investigate the relevance of the different CSP domains for the function of csp. Using the larval nerve-muscle-preparation of Drosophila studies at single-cell-levels are possible. The clear segmentation, iterated position of the body wall muscles and localization of many proteins, which are also present in the brain, account for the larval neuromuscular junction as an ideal model-system for the study of synaptic transmission. As described in previous work, electrophysiological studies have been performed at longitudinal muscle 6. All recordings of evoked junction potentials (EJP) were performed with 0.2Hz stimulus frequency (if not described in a different way). Stimulus intensity was adjusted 2 ½ times to initial threshold for a complete EJP, individually for each preparation. In the beginning larval blockade of synaptic transmitter release as described in literature could not be reproduced. Backcrossing for 12 generations of CspU1 with w1118 could restore the temperature-dependent blockade of synaptic transmission in 3rd instar larvae. “Rescue”-construct scDNA1, which was further used as template for all mutated forms of CSP used in this study, completely rescued the larval temperature-sensitive phenotype in csp-null mutant background. Larval mutants of SSP (serine-string protein, serine-string replaces cysteine-string) showed the temperature-sensitive phenotype, as known from their adult flies. In contrast to their adult flies larval mutants of CLP (cysteine-less protein) showed no temperature-sensitive phenotype, but wild type-like behaviour. For the mutant L∆8 (deletion of eight conserved amino acids of linker domain) in null mutant background of CspU1 roc two different phenotypes could be observed: The X-chromosomal strain showed the known temperature-dependent blockade of synaptic transmission. In contrast, 3rd instar larvae of the strain with insertion on the 3rd chromosome showed no temperature sensitivity, but wild type-like behaviour. In immunhistochemical staining a weaker L∆8-protein expression could be observed for the X-chromosomal line. Due to their different phenotype and independent of insertion locus, larval C∆27-mutants could be divided into two groups. One group revealed the known larval temperature-sensitive phenotype. The second group showed also at elevated temperature wild type-like behaviour. In the second part of the current work a new mutant for csp should be created because of the possibility that additional genes are influenced in the null-mutant CspU1. Therefore a deletion in the csp-Locus should be created in a jump-out mutagenesis. In the strain P1617 (flybaase, Bloomington) the PZ-element, which is located in the non-translated region of the 1st exon of csp, was remobilized. Characterization of the jump-out mutants by western and southern blot analysis, immunhistochemical experiments and electrophysiological studies at nerve-muscle-preparations of 3rd instar larvae failed to isolate a jump-out mutant with described temperature-dependent phenotype and affection only of csp. KW - Taufliege KW - Cysteinderivate KW - Temperaturabhängigkeit KW - Drosophila KW - CSP KW - Synapse KW - temperatursensitiv KW - Drosophila KW - CSP KW - Synapse KW - temperature sensitive Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-7481 ER - TY - THES A1 - Huber, Saskia T1 - Charakterisierung von SAP47 in Drosophila melanogaster und der dazugehörigen Proteinfamilie T1 - Characterization of SAP47 in Drosophila melanogaster and its protein familiy N2 - In der Arbeit wird ein synapsenassoziiertes Protein, das SAP47 und seine zugehörige Proteinfamilie charakterisiert. N2 - A synapse associated protein, SAP47, and its protein family is characterized. KW - Taufliege KW - Synapse KW - Proteine KW - Molekularbiologie KW - Drosophila KW - Synapse KW - SAP47 KW - BSD KW - Drosophila KW - synapse KW - SAP47 KW - BSD Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-7777 ER -