TY - THES A1 - Schwarz, Jessica Denise T1 - Genome-wide reporter screens identify transcriptional regulators of ribosome biogenesis T1 - Genomweite Reporterscreens identifizieren transkriptionelle Regulatoren ribosomaler Biogenese N2 - Cellular growth and proliferation are among the most important processes for cells and organisms. One of the major determinants of these processes is the amount of proteins and consequently also the amount of ribosomes. Their synthesis involves several hundred proteins and four different ribosomal RNA species, is highly coordinated and very energy-demanding. However, the molecular mechanims of transcriptional regulation of the protein-coding genes involved, is only poorly understood in mammals. In this thesis, unbiased genome-wide knockout reporter screens were performed, aiming to identify previously unknown transcriptional regulators of ribosome biogenesis factors (RiBis), which are important for the assembly and maturation of ribosomes, and ribosomal proteins (RPs), which are ribosomal components themself. With that approach and follow-up (validation) experiments, ALDOA and RBM8A among others, could be identified as regulators of ribosome biogenesis. Depletion of the glycolytic enzyme ALDOA led to a downregulation of RiBi- and RPpromoter driven reporters on protein and transcript level, as well as to a downregulation of ribosome biogenesis gene transcripts and of mRNAs of other genes important for proliferation. Reducing the amount of the exon junction complex protein RBM8A, led to a more prominent downregulation of one of the fluorescent reporters, but this regulation was independent of the promoter driving the expression of the reporter. However, acute protein depletion experiments in combination with nascent RNA sequencing (4sU-Seq) revealed, that mainly cytosolic ribosomal proteins (CRPs) were downregulated upon acute RBM8A withdrawal. ChIP experiments showed RBM8A binding to promoters of RP genes, but also to other chromatin regions. Total POL II or elongating and initiating POL II levels were not altered upon acute RBM8A depletion. These data provide a starting point for further research on the mechanisms of transcriptional regulation of RP and RiBi genes in mammals. N2 - Zelluläres Wachstum und Proliferation zählen zu den wichtigsten Prozessen für Zellen und Organismen. Eine der größten Determinanten dieser Prozesse ist die Menge an Proteinen und in der Konsequenz auch die Menge an Ribosomen. Deren Synthese erfordert mehrere hundert Proteine und vier verschiedene ribosomale RNA-Spezies, ist stark koordiniert und sehr energiefordernd. Dennoch sind die molekularen Mechanismen der transkriptionellen Regulation der beteiligten protein-kodierenden Gene in Säugetieren nur schlecht verstanden. In dieser Arbeit wurden hypothesenfreie genomweite Knockout-Reporterscreens mit dem Ziel durchgeführt, bisher unbekannte transkriptionelle Regulatoren von ribosomalen Biogenesefaktoren (RiBis), welche wichtig für den Zusammenbau und die Reifung der Ribosomen sind, und ribosomalen Proteinen (RPs), welche selbst ribosomale Bestandteile sind, zu identifizieren. Durch diesen Ansatz und nachfolgende (Validierungs- )Experimente, konnten unter anderem ALDOA und RBM8A als Regulatoren ribosomaler Biogenese identifiziert werden. Eine Depletion des glykolytischen Enzyms ALDOA führte sowohl zu einer Herunterregulation von RiBi- und RP-Promotor-gesteuerten Reportern auf Protein- und Transkriptebene, als auch zu einer Herunterregulation von ribosomalen Biogenesegentranskripten und von mRNAs anderer für die Proliferation wichtiger Gene. Eine Reduktion der Menge des Exon-Junction-Komplexproteins RBM8A führte zu einer deutlicheren Herunterregulation eines der beiden fluoreszierenden Reporter, aber diese Regulation war unabhängig vom Promotor, der die Expression des Reporters steuert. Akute Proteinabbauexperimente in Verbindung mit einer Sequenzierung naszenter RNA (4sU-Seq) zeigten allerdings, dass hauptsächlich zytosolische ribosomale Proteine (CRPs) nach akuter RBM8A-Depletion herunterreguliert waren. ChIP-Experimente zeigten RBM8A-Bindung an Promotoren von RP-Genen, aber auch an andere Chromatinregionen. Gesamt-POL II- oder elongierende und initiierende POL II-Mengen waren nach akuter RBM8A-Depletion nicht verändert. Diese Daten stellen einen Ausgangspunkt für weitere Forschung zu den Mechanismen transkriptioneller Regulation von RP- und RiBi-Genen in Säugetieren dar. KW - Ribosom KW - Fructosebisphosphat-Aldolase KW - Transkription KW - Genregulation KW - ribosome biogenesis KW - Rbm8a KW - genetic screen KW - reporter screen Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-279010 ER - TY - THES A1 - Gupta, Shishir Kumar T1 - Re-annotation of Camponotus floridanus Genome and Characterization of Innate Immunity Transcriptome Responses to Bacterial Infections T1 - Re-Annotation des Camponotus floridanus Genoms und Charakterisieren der unspezifischen Immun-Transkriptom-Antwort auf bakterielle Infektionen N2 - The sequencing of several ant genomes within the last six years open new research avenues for understanding not only the genetic basis of social species but also the complex systems such as immune responses in general. Similar to other social insects, ants live in cooperative colonies, often in high densities and with genetically identical or closely related individuals. The contact behaviours and crowd living conditions allow the disease to spread rapidly through colonies. Nevertheless, ants can efficiently combat infections by using diverse and effective immune mechanisms. However, the components of the immune system of carpenter ant Camponotus floridanus and also the factors in bacteria that facilitate infection are not well understood. To form a better view of the immune repository and study the C. floridanus immune responses against the bacteria, experimental data from Illumina sequencing and mass-spectrometry (MS) data of haemolymph in normal and infectious conditions were analysed and integrated with the several bioinformatics approaches. Briefly, the tasks were accomplished in three levels. First, the C. floridanus genome was re-annotated for the improvement of the existing annotation using the computational methods and transcriptomics data. Using the homology based methods, the extensive survey of literature, and mRNA expression profiles, the immune repository of C. floridanus were established. Second, large-scale protein-protein interactions (PPIs) and signalling network of C. floridanus were reconstructed and analysed and further the infection induced functional modules in the networks were detected by mapping of the expression data over the networks. In addition, the interactions of the immune components with the bacteria were identified by reconstructing inter-species PPIs networks and the interactions were validated by literature. Third, the stage-specific MS data of larvae and worker ants were analysed and the differences in the immune response were reported. Concisely, all the three omics levels resulted to multiple findings, for instance, re-annotation and transcriptome profiling resulted in the overall improvement of structural and functional annotation and detection of alternative splicing events, network analysis revealed the differentially expressed topologically important proteins and the active functional modules, MS data analysis revealed the stage specific differences in C. floridanus immune responses against bacterial pathogens. Taken together, starting from re-annotation of C. floridanus genome, this thesis provides a transcriptome and proteome level characterization of ant C. floridanus, particularly focusing on the immune system responses to pathogenic bacteria from a biological and a bioinformatics point of view. This work can serve as a model for the integration of omics data focusing on the immuno-transcriptome of insects. N2 - Das Sequenzieren mehrerer Ameisen Genome innerhalb der letzten 6 Jahre eröffnete neue Forschungswege, um nicht nur die genetische Grundlade sozialer Arten, sondern auch komplexere Systeme wie generelle Immunantworten zu untersuchen. Ähnlich zu anderen sozialen Insekten leben Ameisen in Kolonien, oft mit einer sehr hohen Dichte mit genetisch übereinstimmenden oder nah verwandten Individuen. Das Sozialverhalten und die engen Lebensumstände führen dazu, dass sich Krankheiten in Kolonien schnell ausbreiten können. Dennoch können Ameisen mit der Nutzung ihrer komplexen Immunsystemmechanismen Infektionen effektiv abwehren. Die Zusammensetzung des Immunsystems der Rossameise Camponotus floridanus (C. floridanus) und die Faktoren der Bakterien, welche die Infektionen verursachen sind noch nicht gut untersucht. Um einen besseren Überblick über die verschiedenen Gruppen der Immun- Gene zu bekommen und um die Immunantworten von C. floridanus gegen Bakterien zu untersuchen haben wir experimentelle Daten der Illumina Sequenzierung und der Massenspektrometrie (MS) aus der Hämolymphe unter normalen und unter infizierten Bedingungen analysiert und über verschiedene bioinformatische Ansätzen zusammengefasst. Die Aufgabe wurde in drei Ebenen unterteilt. Zuerst wurde das Genom von C. floridanus neu annotiert, die Verbesserung der existierenden Annotation wurde rechnerisch und mit Transkriptom- Daten erreicht. Mit der Nutzung der auf Homologie- basierenden Methoden, der umfassenden Überprüfung der Literatur und der Nutzung von mRNA Genexpressionsanalysen wurde für C. floridanus dieser Überblick erstellt. Anschließend wurden größere Protein- Protein- Interaktionen (PPI) und Signalnetzwerke von C. floridanus rekonstruiert und analysiert und daraufhin wurden die Infektions-induzierten funktionalen Module im Netzwerk entdeckt und die Expressionsdaten über Netzwerke abgebildet. Zusätzlich wurden die Anteile der Immunantwort bei der Interaktion mit Bakterien mittels der Rekonstruktion von zwischenartlichen PPI Netzwerken identifiziert und diese Interaktionen wurden mit Literaturwerten validiert. In der dritten und letzten Phase wurden Daten der Stadium- spezifischen Massenspektrometrie (MS) von Larven- und Arbeiterameisen analysiert und die Unterschiede in den Immunantworten aufgezeichnet. Zusammengefasst lieferten alle drei Omiks- Ebenen jeweils viele Ergebnisse, zum Beispiel führte die neue Annotation und das Transkription- Profil zu einer generellen Verbesserung der strukturellen und funktionalen Annotation und dem Aufspüren von alternativen Splicing- Ereignissen. Die Netzwerkanalyse deckte die unterschiedlich exprimierten topologisch wichtigen Proteine und die aktiven funktionalen Module auf, die Analyse der MS- Daten erbrachte Ergebnisse über die Stadium- spezifischen Unterschiede in der Immunantwort von C. floridanus gegen bakterielle Pathogene. Rundum, beginnend mit der neuen Annotation des Genoms von C. floridanus stellt diese Arbeit eine Transkriptom- und Protein Charakterisierung der Ameise C. floridanus dar. Besonders lag der Fokus auf die Antworten des Immunsystems auf Pathogene Bakterien aus biologischer- und bioinformatischer Sicht. Diese Arbeit kann als Vorlage für die Integration von Omiks Daten dienen, welche sich auf die Immun- Transkriptome von Insekten fokussieren. KW - Camponotus floridanus KW - Genom KW - Camponotus floridanus KW - Innate immunity KW - Transcriptome KW - Interactome KW - Host-pathogen interactions KW - Host-endosymbiont interactions KW - Re-annotation KW - Gene-prediction KW - Ants KW - Comparative genomics KW - Transkription KW - Immunreaktion KW - Re-Annotation KW - Immun-Transkriptom Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-140168 ER - TY - THES A1 - Jung, Lisa Anna T1 - Targeting MYC Function as a Strategy for Tumor Therapy T1 - Hemmung der MYC-Funktion als Strategie für die zielgerichtete Tumortherapie N2 - A large fraction of human tumors exhibits aberrant expression of the oncoprotein MYC. As a transcription factor regulating various cellular processes, MYC is also crucially involved in normal development. Direct targeting of MYC has been a major challenge for molecular cancer drug discovery. The proof of principle that its inhibition is nevertheless feasible came from in vivo studies using a dominant-negative allele of MYC termed OmoMYC. Systemic expression of OmoMYC triggered long-term tumor regression with mild and fully reversible side effects on normal tissues. In this study, OmoMYC’s mode of action was investigated combining methods of structural biology and functional genomics to elucidate how it is able to preferentially affect oncogenic functions of MYC. The crystal structure of the OmoMYC homodimer, both in the free and the E-box-bound state, was determined, which revealed that OmoMYC forms a stable homodimer, and as such, recognizes DNA via the same base-specific DNA contacts as the MYC/MAX heterodimer. OmoMYC binds DNA with an equally high affinity as MYC/MAX complexes. RNA-sequencing showed that OmoMYC blunts both MYC-dependent transcriptional activation and repression. Genome-wide DNA-binding studies using chromatin immunoprecipitation followed by high-throughput sequencing revealed that OmoMYC competes with MYC/MAX complexes on chromatin, thereby reducing their occupancy at consensus DNA binding sites. The most prominent decrease in MYC binding was seen at low-affinity promoters, which were invaded by MYC at oncogenic levels. Strikingly, gene set enrichment analyses using OmoMYC-regulated genes enabled the identification of tumor subgroups with high MYC levels in multiple tumor entities. Together with a targeted shRNA screen, this identified novel targets for the eradication of MYC-driven tumors, such as ATAD3A, BOP1, and ADRM1. In summary, the findings suggest that OmoMYC specifically inhibits tumor cell growth by attenuating the expression of rate-limiting proteins in cellular processes that respond to elevated levels of MYC protein using a DNA-competitive mechanism. This opens up novel strategies to target oncogenic MYC functions for tumor therapy. N2 - Eine Vielzahl humaner Tumore entsteht durch die aberrante Expression des Onkoproteins MYC. Da MYC als Transkriptionsfaktor viele zelluläre Prozesse reguliert, ist er auch maßgeblich an der Entwicklung von normalem Gewebe beteiligt. Die direkte Hemmung von MYC stellt eine große Herausforderung für die Wirkstoffentwicklung dar. Studien mit dem dominant-negativen MYC-Allel namens OmoMYC belegten, dass MYC ein potenzieller Angriffspunkt für die zielgerichtete Tumortherapie ist. Die systemische Expression dieser MYC-Mutante löste eine dauerhafte Tumorregression aus und zeigte milde sowie vollständig reversible Nebenwirkungen. In der vorliegenden Arbeit wurde der molekulare Wirkmechanismus von OmoMYC untersucht, wobei sowohl Methoden der Strukturbiologie als auch der funktionalen Genomik angewendet wurden. Die Kristallstruktur des OmoMYC Proteins wurde im freien und E-Box-gebundenen Zustand bestimmt. Dadurch konnte gezeigt werden, dass OmoMYC ein stabiles Homodimer bildet. Als solches erkennt es DNA mittels derselben basenspezifischen Interaktionen wie der MYC/MAX-Komplex. Dabei bindet OmoMYC DNA mit einer ähnlichen Affinität wie das MYC/MAX-Heterodimer. Die genomweite Expressionsanalyse mittels RNA-Sequenzierung identifiziert eine Reduktion sowohl der MYC-abhängigen Transkriptionsaktiverung als auch der Transkriptionsrepression durch OmoMYC. Mittels Chromatin-Immunpräzipitation gefolgt von einer Hochdurchsatz-Sequenzierung wird gezeigt, dass OmoMYC mit MYC/MAXKomplexen auf Chromatin konkurriert und so deren Besetzung global an Konsensus-Bindestellen verringert. Die stärkste Reduktion zeigt sich an Promoterregionen mit schwacher Affinität für die MYC-Bindung, welche durch onkogene MYC-Proteinmengen aufgefüllt werden. Gene set enrichment-Analysen unter Berücksichtigung von OmoMYC-regulierten Genen erlaubten die Identifizierung von Tumor-Subgruppen mit hohen MYC-Proteinmengen in zahlreichen Tumorentitäten. Zusammen mit einem fokussierten shRNA-Screen können so neue Zielproteine für die Bekämpfung von MYC-getriebenen Tumoren, wie zum Beispiel ATAD3A, BOP1 und ADRM1, identifiziert werden. Zusammenfassend weisen die Ergebnisse darauf hin, dass OmoMYC spezifisch das Tumorzellwachstum inhibiert, indem es die Expression von zentralen Proteinen limitiert, welche durch erhöhte MYC-Proteinmengen reguliert werden. Somit können neue Strategien zur Tumortherapie identifiziert werden, die auf onkogene Funktionen von MYC zielen. KW - Myc KW - Kristallstruktur KW - Transkription KW - Bauchspeicheldrüsenkrebs KW - DNS-Bindung KW - OmoMYC KW - promoter invasion Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-146993 ER - TY - THES A1 - Jänicke, Laura Annika T1 - Regulation of MYC Activity by the Ubiquitin-Proteasome System T1 - Regulation der MYC Aktivität durch das Ubiquitin-Proteasom-System N2 - The oncogenic MYC protein is a transcriptional regulator of multiple cellular processes and is aberrantly activated in a wide range of human cancers. MYC is an unstable protein rapidly degraded by the ubiquitin-proteasome system. Ubiquitination can both positively and negatively affect MYC function, but its direct contribution to MYC-mediated transactivation remained unresolved. To investigate how ubiquitination regulates MYC activity, a non-ubiquitinatable MYC mutant was characterized, in which all lysines are replaced by arginines (K-less MYC). The absence of ubiquitin-acceptor sites in K-less MYC resulted in a more stable protein, but did not affect cellular localization, chromatin-association or the ability to interact with known MYC interaction partners. Unlike the wild type protein, K-less MYC was unable to promote proliferation in immortalized mammary epithelial cells. RNA- and ChIP-Sequencing analyses revealed that, although K-less MYC was present at MYC-regulated promoters, it was a weaker transcriptional regulator. The use of K-less MYC, a proteasomal inhibitor and reconstitution of individual lysine residues showed that proteasomal turnover of MYC is required for MYC target gene induction. ChIP-Sequencing of RNA polymerase II (RNAPII) revealed that MYC ubiquitination is dispensable for RNAPII recruitment and transcriptional initiation but is specifically required to promote transcriptional elongation. Turnover of MYC is required to stimulate histone acetylation at MYC-regulated promoters, which depends on a highly conserved region in MYC (MYC box II), thereby enabling the recruitment of BRD4 and P-TEFb and the release of elongating RNAPII from target promoters. Inhibition of MYC turnover enabled the identification of an intermediate in MYC-mediated transactivation, the association of MYC with the PAF complex, a positive elongation factor, suggesting that MYC acts as an assembly factor transferring elongation factors onto RNAPII. The interaction between MYC and the PAF complex occurs via a second highly conserved region in MYC’s amino terminus, MYC box I. Collectively, the data of this work show that turnover of MYC coordinates histone acetylation with recruitment and transfer of elongation factors on RNAPII involving the cooperation of MYC box I and MYC box II. N2 - Der Transkriptionsfaktor MYC ist an der Regulation einer Vielzahl biologischer Prozesse beteiligt ist und spielt bei der Tumorentstehung und des Tumorwachstum eine entscheidende Rolle. MYC ist ein kurzlebiges Protein, das durch das Ubiquitin-Proteasom-System abgebaut wird. Die Ubiquitinierung von MYC hat auch einen stimulierenden Einfluss auf dessen transkriptionelle Aktivität. Dabei blieb jedoch der Mechanismus, der dieser Beobachtung zugrunde liegt, bislang ungeklärt. Um den direkten Einfluss von Ubiquitinierung auf die Aktivität von MYC zu untersuchen, wurde in der vorliegenden Arbeit eine MYC Mutante analysiert, in der alle Lysine zu Argininen mutiert wurden (K-less MYC). Die Mutation der Ubiquitin-Verknüpfungsstellen resultierte in einem stabileren Protein, hatte jedoch keinen Einfluss auf die zelluläre Lokalisation oder Assoziation mit bekannten Interaktionspartnern. Im Vergleich zu Wildtyp (WT) MYC war K-less MYC jedoch in der Vermittlung MYC-induzierter biologischer Phänotypen stark beeinträchtigt. Mittels RNA- und ChIP-Sequenzierungen konnte gezeigt werden, dass K-less MYC zwar an MYC-regulierte Promotoren bindet, in der transkriptionellen Aktivität aber stark beeinträchtigt ist und diese Zielgene nicht aktivieren kann. Dabei war K-less MYC noch in der Lage, RNA Polymerase II (RNAPII) zu den Zielpromotoren zu rekrutieren und die Transkription dort zu initiieren, jedoch war der Übergang zur Elongation blockiert. Die Verwendung eines Proteasom-Inhibitors sowie die Rekonstitution einzelner Lysine in K-less MYC zeigten, dass der proteasomale Abbau von MYC für die Aktivierung von Zielgenen benötigt wird. Der proteasomale Abbau ist für die Histon-Acetylierung von Bedeutung, die von einer hoch konservieren Region in MYC, der MYC Box II, abhängt. Durch die WT MYC-vermittelte Induktion der Histon-Acetylierung können folglich die Proteine BRD4 und P-TEFb an die Promotoren rekrutiert werden. Diese Proteine spielen bei dem Übergang der initiierenden RNAPII zur elongierenden RNAPII eine essentielle Rolle. Darüber hinaus ermöglichte die Inhibition des MYC Abbaus die Identifizierung eines Zwischenschritts der MYC-abhängigen Transaktivierung: die Assoziation von MYC mit dem positiven Elongationskomplex, dem PAF-Komplex. Dieser wird über eine zweite hochkonservierte Region in MYC, der MYC Box I, rekrutiert. Somit kann angenommen werden, dass MYC als eine Verbindungsstelle fungiert, die positive Elongationsfaktoren auf die RNAPII transferiert. Zusammenfassend resultieren die Daten dieser Arbeit in einem Model, nach dem der proteasomale Abbau von MYC die Histon-Acetylierung mit der Rekrutierung und dem Transfer von Elongationsfaktoren auf die RNAPII koordiniert, was der Kooperation von MYC Box I und MYC Box II bedarf. KW - Myc KW - Ubiquitinierung KW - Transkription KW - RNS-Polymerase II KW - Elongation (Transkription) KW - Proteasomaler Abbau Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-123339 ER -