TY - THES A1 - Winkel, Karoline T1 - Synaptonemalkomplexprotein SYCP1: Bindungspartner, Polymerisationseigenschaften und evolutionäre Aspekte T1 - Synaptonemal complex protein SYCP1: binding partners, polymerization properties and evolutionary aspects N2 - Synaptonemal Komplexe (SC) sind evolutionär konservierte, meiosespezifische, proteinöse Strukturen, die maßgeblich an Synapsis, Rekombination und Segregation der homologen Chromosomen beteiligt sind. Sie zeigen eine dreigliedrige strickleiter-artige Organisation, die sich aus i) zwei Lateralelementen (LE), an die das Chromatin der Homologen angelagert ist, ii) zahlreichen Transversalfilamenten (TF), welche die LE in einer reißverschlussartigen Weise miteinander verknüpfen, und iii) einem zentralen Element (CE) zusammensetzt. Die Hauptproteinkomponenten der Säuger-SC sind das Transversalfilamentprotein SYCP1 und die Lateralelementproteine SYCP2 und SYCP3. Wie sich die SC-Struktur zusammenfügt war bisher nur wenig verstanden; es war nicht bekannt wie die TF innerhalb der LE-Strukturen verankert sind und dabei die homologen Chromosomen verknüpfen. Aufgrund dessen wurde die Interaktion zwischen den Proteinen SYCP1 und SYCP2 untersucht. Mit der Hilfe verschiedenster Interaktionssysteme konnte gezeigt werden, dass der C-Terminus von SYCP1 mit SYCP2 interagieren kann. Aufgrund der Bindungsfähigkeit zu beiden Proteinen, SYCP1 und SYCP3, kann angenommen werden, dass SYCP2 als Linker zwischen diesen Proteinen fungiert und somit möglicherweise das fehlende Bindungsglied zwischen den Lateralelementen und Transversalfilamenten darstellt. Obwohl die SC-Struktur in der Evolution hochkonserviert ist, schien dies nicht für seine Protein-Untereinheiten zuzutreffen. Um die Struktur und Funktion des SC besser verstehen zu können, wurde ein Vergleich zwischen den orthologen SYCP1 Proteinen der evolutionär entfernten Spezies Ratte und Medaka erstellt. Abgesehen von den erheblichen Sequenzunterschieden die sich in 450 Millionen Jahren der Evolution angehäuft haben, traten zwei bisher nicht identifizierte Sequenzmotive hervor, CM1 und CM2, die hochgradig konserviert sind. Anhand dieser Motive konnte in Datenbankanalysen erstmals ein Protein in Hydra vulgaris nachgewiesen werden, bei dem es sich um das orthologe Protein von SYCP1 handeln könnte. Im Vergleich mit dem SYCP1 der Ratte zeigten die Proteine aus Medaka und Hydra, neben den hoch konservierten CM1 und CM2, vergleichbare Domänenorganisationen und im heterologen System zudem sehr ähnliche Polymerisationseigenschaften. Diese Ergebnisse sprechen für eine evolutionäre Konservierung von SYCP1. N2 - Synaptonemal complexes (SCs) are evolutionarily conserved, meiosis-specific proteinaceous structures critically involved in synapsis, recombination and segregation of homologous chromosomes. They show a tripartite ladder-like organization including i) two lateral elements (LEs), to which the chromatin of the homologs is attached, ii) numerous transverse filaments (TFs), that link the two lateral elements in a zipper-like way, and iii) a central element (CE). Major protein components of mammalian SCs are the transverse filaments protein SYCP1, and the lateral element proteins SYCP2 and SYCP3. How SCs become assembled was poorly understood; in particular it was not known how TFs assemble at the plane of LEs to interconnect the homologous chromosomes. Therefore, I have investigated possible interactions between SYCP1 and SYCP2. Using different interaction traps, I was able to show that the C-terminus of SYCP1 interacts with SYCP2. Because of its binding to both, SYCP1 and SYCP3, it can be proposed that SYCP2 acts as a linker between these proteins and therefore would be the missing connecting piece between LEs and TFs. Although the SC-structure is conserved in evolution this appears not to be the case for its protein components. For a better understanding of the conserved SC structure und function, I compared ortholog SYCP1 proteins of evolutionary distant species, namely rat and medaka fish. Despite of the sequence-differences that accumulated during 450 million years of evolution, sequence identity was highest at the level of two previously unidentified motifs (CM1 & CM2). Utilizing these motifs in a database analysis a protein of Hydra vulgaris could be found for the first time. It can be proposed that this protein is the orthologous of SYCP1. Besides the highly conserved motifs the proteins of medaka and hydra show quite similar domain organization and polymerization properties in comparison with rat SYCP1. These results suggest an evolutionary conservation of SYCP1. KW - Meiose KW - Chromosom KW - Evolution KW - Synaptonemalkomplex KW - Strukturproteine KW - Meiosis KW - Synaptonemal complex KW - Chromosomes KW - Structural proteins KW - Evolution Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-43955 ER - TY - JOUR A1 - Randlkofer, Barbara A1 - Jordan, Florian A1 - Mitesser, Oliver A1 - Meiners, Torsten A1 - Obermaier, Elisabeth T1 - Effect of vegetation density, height, and connectivity on the oviposition pattern of the leaf beetle Galeruca tanaceti N2 - Vegetation structure can profoundly influence patterns of abundance, distribution, and reproduction of herbivorous insects and their susceptibility to natural enemies. The three main structural traits of herbaceous vegetation are density, height, and connectivity. This study determined the herbivore response to each of these three parameters by analysing oviposition patterns in the field and studying the underlying mechanisms in laboratory bioassays. The generalist leaf beetle, Galeruca tanaceti L. (Coleoptera: Chrysomelidae), preferentially deposits its egg clutches on non-host plants such as grasses. Earlier studies revealed that oviposition within structurally complex vegetation reduces the risk of egg parasitism. Consequently, leaf beetle females should prefer patches with dense, tall, or connected vegetation for oviposition in order to increase their reproductive success. In the present study, we tested the following three hypotheses on the effect of stem density, height, and connectivity on oviposition: (1) Within habitats, the number of egg clutches in areas with high stem densities is disproportionately higher than in low-density areas. The number of egg clutches on (2) tall stems or (3) in vegetation with high connectivity is higher than expected for a random distribution. In the field, stem density and height were positively correlated with egg clutch presence. Moreover, a disproportionately high presence of egg clutches was determined in patches with high stem densities. Stem height had a positive influence on oviposition, also in a laboratory two-choice bioassay, whereas stem density and connectivity did not affect oviposition preferences in the laboratory. Therefore, stem height and, potentially, density, but not connectivity, seem to trigger oviposition site selection of the herbivore. This study made evident that certain, but not all traits of the vegetation structure can impose a strong influence on oviposition patterns of herbivorous insects. The results were finally compared with data on the movement patterns of the specialised egg parasitoid of the herbivore in comparable types of vegetation structure. KW - Blattkäfer KW - Galeruca tanaceti KW - Hautflügler KW - Eulophidae KW - Oomyzus galerucivorus KW - Coleoptera KW - Chrysomelidae KW - tansy leaf beetle KW - vegetation structure KW - Oomyzus galerucivorus KW - Hymenoptera KW - Eulophidae Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-49665 ER - TY - JOUR A1 - Lambeets, Kevin A1 - Vandegehuchte, Martijn L. A1 - Maelfait, Jean-Pierre A1 - Bonte, Dries T1 - Integrating environmental conditions and functional life-history traits for riparian arthropod conservation planning N2 - River banks are naturally disturbed habitats, in which local flood events and the landscape structure are expected to govern riparian species assemblages. Not solely effects of flooding per se, but also related changes in vegetation structure will affect species’ distribution. By elucidating the relationships between species’ occurrence and multivariate habitat conditions on a restricted spatial scale, insight into conservation strategies to preserve riparian species is gained. Ordination and grouping methods revealed important environmental and functional trait constraints on species composition of predatory riparian arthropod assemblages. Mainly flooding disturbance appeared to affect spider and carabid beetle species composition. Habitat affinity and dispersal ability were retained as important traits explaining similarity between arthropod assemblages. River banks similar in species composition differed in absolute and functional group species richness. Furthermore, Poisson regressions demonstrated the importance of variation in discharge regime, sediment composition and vegetation structure for the preservation of rare riparian arthropods. Whereas hygrophilic species benefited from increased vegetation cover, xerothermophilic specialists were favoured by increased flooding disturbance. In contrast to flight-active riparian carabids occurring throughout the river system, especially cursorial spiders are expected to go extinct under increased anthropogenic alterations of discharge regimes. We show the importance of a dynamic and evidence-based approach of river management on a local scale to preserve vulnerable riparian arthropods. In general, river restoration should generate the required heterogeneity in environmental conditions (e.g. dynamic processes) at the river bank level, thereby increasing the sustainability of riverine landscapes. More-over, we argue that the understanding of functional responses towards environmental factors results in general and widely applicable guiding concepts for species conservation. KW - Laufkäfer KW - Flussufer KW - carabid beetles KW - flooding disturbance KW - multi-species approach KW - lowland river banks KW - river restoration KW - spiders Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-50148 ER - TY - THES A1 - Breher, Stephanie T1 - Die kardiale Funktion von Popdc1 in der Maus: Vom Gen zum Phän T1 - The cardiac function of Popdc1 in mouse: From gene to phene N2 - Die Popeye domain containing (Popdc)-Gene bilden eine evolutionär stark konservierte Genfamilie mit präferenzieller Expression im Herzen und in der Skelettmuskulatur. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Popdc1 in kardialen Myozyten in Glanzstreifen, lateralen Membranen und im T-Tubuli-System exprimiert wird und mit Ionenkanälen und anderen myozytären Membranproteinen wie Cav1.2, Caveolin 3 und NCX1 kolokalisiert ist. Im ventrikulären Reizleitungssystem ist die Expression von Popdc1 gegenüber dem ventrikulären Arbeitsmyokard erhöht, während Atrium und Sinusknoten nahezu äquivalente Expressionsdomänen aufweisen. Mithilfe von elektrophysiologischen Untersuchungen konnte bei den Popdc1-Nullmutanten eine stressinduzierte Sinusbradykardie festgestellt werden, die altersabhängig auftritt und auf Sinuspausen zurückzuführen ist. Histologische Untersuchungen, unter Zuhilfenahme des Sinusknotenmarkers HCN4, zeigten einen Zellverlust im inferioren Teil des Sinusknotens. Popdc1 ist ein Transmembranprotein, das eine 150 Aminosäure umfassende, stark konservierte Popeye-Domäne aufweist. Für diese Domäne konnte auf struktureller Ebene eine Homologie zu zyklischen Nukleotid-Bindungsdomänen vorhergesagt und eine Bindung an cAMP und cGMP experimentell demonstriert werden. Es handelt sich bei den Popdc-Proteinen um einen neuen Zweig der Bindungsproteine für zyklische Nukleotidmonophosphate (cNMP). Die Bindungssequenz weist signifikante Unterschiede zu anderen bereits identifizierten cNMP-Bindungsproteinen auf. Weiterhin wurde die Interaktion von Popdc1 mit TREK1, einem Mitglied der Tandemporenkanäle untersucht. Es zeigte sich, dass Popdc1 nach Koexpression in Froschoozyten, den TREK1-Strom erhöht und dass die β-adrenerge Inhibition des TREK1 Kanals durch Popdc1 verstärkt wird. Im Arbeitsmyokard, im kardialen Reizleitungssystem und in kotransfizierten Cos7-Zellen werden beide Proteine überlappend exprimiert. Diese Daten zeigen, dass Popdc1 eine wichtige Funktion bei der Regulation der Schrittmacheraktivität, der Aufrechterhaltung der Sinusknotenmorphologie und der Modulation von Ionenkanälen aufweist. Interessanterweise wurden von unserer Arbeitsgruppe bereits die gleichen Phänotypen für die Popdc2 Maus beschrieben, sodass die Popdc Genfamilie überlappende und redundante Funktionen aufweist. N2 - The Popeye domain containing (Popdc) family is a highly evolutionary conserved gene family, which shows no homology to other genes. This family shows a preferential expression in the heart and skeletal muscle. In the present study it is shown that Popdc1 protein in the heart was predominantly localized to the intercalated disc, lateral membranes and T-tubularsystem, where it was co-localized with other cardiac membrane proteins such as Cav1.2, Caveolin 3 and NCX1. The expression of Popdc1-LacZ transgene as well as Popdc1 protein was elevated in the ventricular conduction system compared to the ventricular working myocardium. In contrast, expression in atrial tissue was equivalent to the expression in the sinus node. Electrophysiological measurements in Popdc1 null mutants revealed a stressinduced and age-dependent sinus bradycardia, which was due to an increase in sinus pauses and independent of the nature of stress. Histological examinations with the help of the sinus node marker HCN4 revealed structural alterations in the inferior part of the sinus node in 8 months old Popdc1-mice. Biochemical examinations of Popdc1 showed that Popdc1 is a transmembrane protein. The N-terminus is extracellular and glycosylated, while the Cterminus is intracellular and harbours a highly conserved 150 amino acid-long Popeye domain. For this domain, a predicted homology to cyclic nucleotide binding domains was observed. Binding of cAMP and cGMP was experimentally demonstrated and thus, the Popdc proteins constitute a novel branch of the cyclic nucleotide binding protein family. Furthermore interaction of Popdc1 with the tandem pore channel TREK1 was examined. After co-injection of Popdc1 the TREK1 current was increased in Xenopus oocytes. Furthermore, β-adrenergic inhibition of TREK1 current was enhanced in the presence of Popdc1. In working myocardium, conduction tissue as well as in co-transfected Cos7 cells the two proteins showed a similar distribution. In conclusion, Popdc1 is involved in cardiac pacemaker activity, maintaining sinus node morphology and modulating ion channels that contribute to the setting of the membrane potential in cardiac myocytes. Interestingly, a highly similar phenotype was observed for the Popdc2 mouse mutant and therefore the Popdc gene family displays overlapping and redundant functions. KW - Sinusknoten KW - Genexpression KW - Elektrophysiologie KW - Popdc1 KW - Transmembranprotein KW - Sinusknotenbradykardie KW - cAMP-Bindung KW - Popdc1 KW - transmembrane protein KW - sinus bradycardia KW - cAMP binding Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-37283 ER - TY - JOUR A1 - Gros, Andreas A1 - Poethke, Hans Joachim A1 - Hovestadt, Thomas T1 - Sex-specific spatio-temporal variability in reproductive success promotes the evolution of sex-biased dispersal N2 - Abstract: Inbreeding depression, asymmetries in costs or benefits of dispersal, and the mating system have been identified as potential factors underlying the evolution of sex-biased dispersal. We use individual-based simulations to explore how the mating system and demographic stochasticity influence the evolution of sex-specific dispersal in a metapopulation with females competing over breeding sites, and males over mating opportunities. Comparison of simulation results for random mating with those for a harem system (locally, a single male sires all offspring) reveal that even extreme variance in local male reproductive success (extreme male competition) does not induce male-biased dispersal. The latter evolves if the between-parch variance in reproductive success is larger for males than females. This can emerge due to demographic stochasticity if the habitat patches are small. More generally, members of a group of individuals experiencing higher spatio-temporal variance in fitness expectations may evolve to disperse with greater probability than others. KW - sex-biased dispersal KW - demographic stochasticity KW - metapopulation KW - individual-based simulation KW - sex-specific competition Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48711 ER - TY - JOUR A1 - Bonte, Dries A1 - Clercq, Nele De A1 - Zwertvaegher, Ingrid A1 - Lens, Luc T1 - Repeatability of dispersal behaviour in a common dwarf spider: evidence for different mechanisms behind short- and long-distance dispersal N2 - Abstract: 1. The response of dispersal towards evolution largely depends on its heritability for which upper limits are determined by the trait's repeatability. 2. In the Linyphiid spider E. atra, we were able to separate long- and short-distance dispersal behaviours (respectively ballooning and rappelling) under laboratory conditions. By performing repeated behavioural trials for females, we show that average dispersal trait values decrease with increasing testing days. By comparing mated and unmated individuals during two periods (before and after mating for the mated group, and the same two periods for the unmated group), we show that mating has no effect on the mean displayed dispersal behaviour or its within-individual variation. Repeatabilities were high and consistent for ballooning motivation, but not for rappelling. 3. Ballooning motivation can be regarded as highly individual-specific behaviour, while general pre-dispersal and rappelling behaviours showed more individual variation. Such difference in repeatability between long-and short-distance dispersal suggests that short-and long-distance dispersal events are triggered by different ecological and evolutionary mechanisms. Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48242 ER - TY - JOUR A1 - Bonte, Dries A1 - Hovestadt, Thomas A1 - Poethke, Hans Joachim T1 - Sex-specific dispersal and evolutionary rescue in metapopulations infected by male killing endosymbionts N2 - Background: Male killing endosymbionts manipulate their arthropod host reproduction by only allowing female embryos to develop into infected females and killing all male offspring. Because the resulting change in sex ratio is expected to affect the evolution of sex-specific dispersal, we investigated under which environmental conditions strong sex-biased dispersal would emerge, and how this would affect host and endosymbiont metapopulation persistence. Results: We simulated host-endosymbiont metapopulation dynamics in an individual-based model, in which dispersal rates are allowed to evolve independently for the two sexes. Prominent male-biased dispersal emerges under conditions of low environmental stochasticity and high dispersal mortality. By applying a reshuffling algorithm, we show that kin-competition is a major driver of this evolutionary pattern because of the high within-population relatedness of males compared to those of females. Moreover, the evolution of sex-specific dispersal rescues metapopulations from extinction by (i) reducing endosymbiont fixation rates and (ii) by enhancing the extinction of endosymbionts within metapopulations that are characterized by low environmental stochasticity. Conclusion: Male killing endosymbionts induce the evolution of sex-specific dispersal, with prominent male-biased dispersal under conditions of low environmental stochasticity and high dispersal mortality. This male-biased dispersal emerges from stronger kin-competition in males compared to females and induces an evolutionary rescue mechanism. KW - Metapopulation KW - Theoretische Ökologie KW - Endosymbiont KW - Wirt KW - Parasit KW - Host-parasite interactions KW - individual-based model Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-45351 ER - TY - THES A1 - Hauff, Cornelia T1 - Aspects of the mode of action of bispecific T cell engager (BiTE) antibodies T1 - Wirkmechanismus eines bispezifischen T cell engager Antikörpers N2 - Bispecific T cell engager (BiTE) display a novel design among the class of bispecific antibodies and hold great promise to fight diverse cancers. BiTE molecules consist of two different binding entities derived from two human IgG antibodies connected by a short peptide linker. Their binding arms are directed against the CD3e chain of the T cell receptor on T cells and against an antigen that is specific for (e.g., CD19 for lymphoma in MT103) or over-expressed on (e.g., EpCAM for epithelial cancer in MT110) tumor cells. Without requirement for pre- or co-stimulation, BiTE molecules efficiently redirect CD3+ T cells towards tumor cells expressing the relevant target antigen. Only a BiTE molecule simultaneously bound to both tumor cell and T cell activates the T cell to exert its cytolytic function resulting in tumor cell death. In T cells stimulated with both BiTE and target cells, elevated levels of caspase activation and increased expression of cytotoxic and signaling proteins are observed. These include cytolytic proteins granzyme B and perforin, activation markers CD69 and CD25 and adhesion molecules CD2 and LFA-1. Activated T cells secrete the usual mix of cytokines, among them pro-inflammatory cytokines IFN-g and TNF-a. The membrane of tumor cells expressing the relevant target antigen is perforated during the attack of BiTE-stimulated effector cells as can be concluded from adenylate kinase release from the cytosol of tumor cells. Ca2+-chelator EGTA completely blocked BiTE-mediated activation of caspases and tumor cell lysis. As perforin is strictly Ca2+-dependent, a major role for this pore-forming protein is assumed for the elimination of tumor cells via BiTE-stimulated T cells. Granzyme B and caspases are main players in BiTE-mediated elimination of tumor cells. Inhibitors of granzyme B or caspases reduce or block, respectively the activation of caspases. However, other signals of apoptosis (cleavage of PARP and fragmentation of DNA) were only reduced by granzyme B inhibitor or caspase inhibitor. Most interestingly, the lytic capacity of BiTE molecules was not impaired by granzyme B inhibitor or caspase inhibitor. It seems that there is no requirement for granzyme B and caspases to be present simultaneously. Instead the data presented provide evidence that they can be replaced one at a time by related proteins. Pre-incubation of effector cells with the glucocorticoids dexamethasone or methylprednisolone resulted in markedly decreased secretion of cytokines by T cells yet only a small reduction in the expression of activation markers and adhesion molecules on T cells and specific lysis of tumor cells upon BiTE stimulation. Soluble factors secreted in an undirected manner by BiTE-stimulated T cells do not mediate tumor cell death by themselves. Bystander cells negative for the antigen that is recognized by the BiTE molecule will not be compromised by BiTE activity. The cytokine TGF-b reduced proliferation as well as granzyme B and perforin expression of BiTE-stimulated T cells. Redirected lysis by BiTE-activated T cells was also decreased under the influence of TGF-b, however lysis was still performed at a reasonable rate (72 % of target cells). TGF-b does not exert a deleterious effect on lytic potential of BiTE-stimulated T cells. The minimal anticipated biological effect level for the BiTE MT110 was determined for the entry of MT110 into phase I clinical studies. Experiments analyzing redirected lysis of tumor cells, expression of activation marker CD25 and cytokine release by T cells revealed a MABEL value of 50 pg/ml for MT110. N2 - Bispecific T cell engager stellen mit ihrem neuartigen Design eine eigene Gruppe unter den bispezifischen Antikörpern dar und zeigen sich vielversprechend im Kampf gegen unter-schiedliche Krebsarten. BiTE Moleküle bestehen aus zwei unterschiedlichen Bindungsstellen, die von zwei humanen IgG Antikörpern abgeleitet sind und durch einen kurzen Peptidlinker verbunden sind. Die Bindungsstellen sind gerichtet gegen die CD3e Kette des T-Zell-Rezeptors auf T-Zellen und gegen ein Antigen, das auf den Tumorzellen ausschließlich (CD19 bei Lymphomen in MT103) oder in erhöhtem Maße (EpCAM bei epithelialem Krebs in MT110) exprimiert wird. BiTE Moleküle richten CD3+ T-Zellen gegen Tumorzellen, die das relevante Zielantigen präsentieren. Dabei sind sie nicht auf Vor- oder Kostimulation angewiesen. Nur wenn das BiTE Molekül gleichzeitig an Tumorzelle und T-Zelle gebunden ist, aktiviert es die T-Zelle zytolytisch zu wirken und die Tumorzelle zu töten. T-Zellen, die mit BiTE und zugleich Targetzellen stimuliert wurden, zeigen erhöhte Raten von Caspaseaktivierung und vermehrte Expression von zytotoxischen und Signalproteinen. Diese beinhalten die zytolytischen Proteine Granzyme B und Perforin, die Aktivierungs-marker CD69 und CD25 und die Adhäsionsmoleküle CD2 und LFA-1. Aktivierte T-Zellen sezernieren die übliche Mischung an Zytokinen, darunter die pro-inflammatorischen Zytokine IFN-g und TNF-a. Die Freisetzung von Adenylatkinase aus dem Zytosol von Tumorzellen lässt darauf schließen, dass die Membran von Tumorzellen, die das relevante Zielantigen exprimieren, während dem Angriff von BiTE-stimulierten Effektorzellen durchlöchert wird. Der Ca2+ Chelator EGTA verhinderte die BiTE-vermittelte Aktivierung von Caspasen und Lyse von Tumorzellen vollständig. Da Perforin in Abhängigkeit von Ca2+ wirkt, wird für dieses porenbildende Protein eine entscheidende Rolle in der Beseitigung von Tumorzellen mittels BiTE-stimulierter T-Zellen angenommen. Granzyme B und Caspasen sind die Hauptakteure in der BiTE-vermittelten Beseitigung von Tumorzellen. Inhibitoren von Granzyme B oder den Caspasen vermindern bzw. hemmen die Aktivierung von Caspasen. Andere Apoptosesignale (PARP-Spaltung und DNA-Fragmentierung) werden von Granzyme B- oder Caspase-Inhibitoren jedoch lediglich reduziert. Bemerkenswerterweise wurde die lytische Kapazität von BiTE Molekülen durch einen Granzyme B- oder Caspase-Inhibitor nicht beeinträchtigt. Es scheint, dass keine Notwendigkeit für die gleichzeitige Anwesenheit von Granzyme B und Caspasen besteht. Stattdessen erbringen die vorgestellten Ergebnisse einen Hinweis dafür, dass diese Proteine jeweils einzeln durch verwandte Proteine ersetzt werden können. Präinkubation von Effektorzellen mit den Glucocorticoiden Dexamethason oder Methylpred-nisolon bewirkte eine deutlich verminderte Zytokinsekretion von T-Zellen, jedoch nur eine geringe Abnahme der Expression von Aktivierungsmarkern und Adhäsionsmolekülen auf T-Zellen und der spezifischen Lyse von Tumorzellen in Folge von BiTE-Stimulierung. Lösliche Faktoren, die von BiTE-stimulierten T-Zellen nicht zielgerichtet abgegeben werden, vermitteln keine Lyse von Tumorzellen. Zellen, die sich in der Nachbarschaft des Tumors befinden, aber das Antigen nicht exprimieren, das vom BiTE Moleküle erkannt wird, werden daher durch BiTE Aktivität nicht in Mitleidenschaft gezogen. Das Zytokin TGF-b verminderte die Proliferation von BiTE-stimulierten T-Zellen sowie deren Expression von Granzyme B und Perforin. Die gerichtete Lyse von BiTE-aktivierten T-Zellen war unter dem Einflusss von TGF-b ebenfalls vermindert. Trotzdem erreichten die Lysisraten Werte von 72 %. TGF-b übt keinen schädlichen Effekt auf das lytische Potential von BiTE-stimulierten T-Zellen aus. Die MT110-Konzentration, bei der der geringste biologische Effekt erwartet wird, wurde für den Eintritt von MT110 in klinische Studien der Phase I bestimmt. Auf Grundlage von Experimenten zur gerichteten Lyse von Tumorzellen, zur Expression des Aktivierungsmarker CD25 auf T-Zellen und zu Freisetzung von Zytokinen aus T-Zellen, ergab sich ein MABEL-Wert von 50 pg/ml für MT110. KW - Antikörper KW - Krebs KW - Therapie KW - T-Lymphozyt KW - bispezifische Antikörper KW - Krebstherapie KW - T cell KW - bispecific antibody KW - cancer therapy Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48369 ER - TY - THES A1 - Blume, Constanze T1 - Cellular functions of VASP phosphorylations T1 - Die zellulären Funktionen der VASP-Phosphorylierungen N2 - Members of the enabled/vasodilator-stimulated phosphoprotein (Ena/VASP) family are important regulators of the actin cytoskeleton dynamics. VASP functions as well as its interactions with other proteins are regulated by phosphorylation at three sites - serine157 (S157), serine239 (S239), and threonine278 (T278) in humans. cAMP- and cGMP- dependent protein kinases phosphorylate S157 and S239, respectively. In contrast, the kinase responsible for T278 was as yet unknown and identified in the first part of this thesis. In a screen for T278 phosphorylating kinases using a phospho-specific antibody against phosphorylated T278 AMP-activated protein kinase (AMPK) was identified in endothelial cells. Mutants of AMPK with altered kinase-activity modulate T278-phosphorylation levels in cells. AMPK-driven T278-phosphorylation impaired stress fiber formation and changed cell morphology in living cells. AMPK is a fundamental sensor of cellular and whole body energy homeostasis. Zucker Diabetic Fatty (ZDF) rats, which are an animal model for type II diabetes mellitus, were used to analyze the impact of phosphorylated T278 in vivo. AMPK-activity and T278-phosphorylation were substantially reduced in arterial vessel walls of ZDF rats in comparison to control animals. These findings demonstrate that VASP is a new AMPK substrate, that VASP phosphorylation mediates the effects of metabolic regulation on actin cytoskeleton rearrangements, and that this signaling system becomes down-regulated in diabetic vessel disorders in rats. In the second part of this thesis, a functional analysis of differential VASP phosphorylations was performed. To systematically address VASP phosphorylation patterns, a set of VASP phosphomimetic mutants was cloned. These mutants enable the mimicking of defined phosphorylation patterns and the specific analysis of single kinase-mediated phosphorylations. VASP localization to the cell periphery was increased by S157- phosphorylation and modulated by phosphorylation at S239 and T278. Latter phosphorylations synergistically reduced actin polymerization. In contrast, S157- phosphorylation had no effect on actin-dynamics. Taken together, the results of the second part show that phosphorylation of VASP serves as a fine regulator of localization and actin polymerization activity. In summary, this study revealed the functions of VASP phosphorylations and established novel links between signaling pathways and actin cytoskeleton rearrangement. N2 - Die Mitglieder der Enabled/Vasodilator-stimulated phosphoprotein (Ena/VASP) Familie sind bedeutende Regulatoren der Aktinzytoskelettdynamik. Die Funktionen und die Protein-Protein-Wechselwirkungen von VASP werden durch Phosphorylierungen an drei Aminosäureresten reguliert. Im Fall von humanem VASP sind dies Serin157 (S157), Serin239 (S239) und Threonin278 (T278). S157 und S239 sind Substrate der cAMP- und cGMP-abhängigen Proteinkinasen. Die Kinase, die T278-Phosphorylierung vermittelt, ist nicht bekannt. Der erste Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der Identifizierung der T278-phosphorylierenden Kinase. Mit Hilfe eines phospho-spezifischen Antikörpers gegen das phosphorylierte T278 (pT278) wurde in Endothelzellen eine systematischen Suche nach T278-phosphorylierenden Kinasen durchgeführt. Dabei wurde die AMP-aktivierte Proteinkinase (AMPK) entdeckt. Mutanten der AMPK, welche eine veränderte Kinaseaktivität besitzen, erhöhten bzw. reduzierenten das Niveau der pT278. Die T278-Phosphorylierung durch die AMPK reduzierte die Stressfaserbildung und führt zu einer veränderten Zellmorphologie. Die AMPK ist ein fundamentaler Sensor des zellulären und Organismus-umfassenden Energiehaushalts. Zur Analyse der Funktion der pT278 in vivo wurden Zucker Diabetic Fatty (ZDF) Ratten, ein Tiermodell für den Diabetes mellitus Typ II, verwendet. Die AMPK-Aktivität und die pT278 waren in arteriellen Gefäßwänden von ZDF-Ratten im Vergleich zu Kontrolltieren deutlich reduziert. Diese Ergebnisse zeigen, dass VASP ein neues Substrat der AMPK ist, dass die T278-Phosphorylierung metabolische Signale an das Aktin-Zytoskelett koppelt und, dass bei diabetischen Ratten dieser Signaltransduktionsweg supprimiert ist. Im zweiten Teil wurde die Bedeutung der VASP-Phosphorylierungsmuster für die Aktin- bildung und die VASP-Lokalisation untersucht. Hierzu wurden systematisch VASP- Phoshorylierungsmutanten generiert. Diese Mutanten imitieren fixierte Phosphorylierungen oder erlauben einzelne Phosphorylierungen durch die jeweilige Kinase. Die Untersuchungen zeigten, dass S157-phosphoryliertes VASP (pS157) sich an der Zellperipherie anreichert, wobei die S239- und T278-Phosphorylierungen diesen Lokalisationseffekt modulieren. Phosphoryliertes S239 und T278 reduzierten synergistisch die Aktinpolymerisation. Im Gegensatz hierzu beeinflusste pS157 die Aktindynamik nicht. Dies zeigt, dass die VASP- Phosphorylierungen als Feinregulator für die Lokalisation und die Aktinpolymerisationsak- tivität fungierten. Zusammenfassend identifiziert diese Studie die Funktionen der einzelnen VASP- Phosphorylierungen und deckt neue Verbindungen von Signalwegen zur Aktinzytoskelett- Reorganisation auf. KW - Vasodilatator-stimuliertes Phosphoprotein KW - Phosphorylierung KW - Actin-bindende Proteine KW - Actin-Polymerisation KW - PKA KW - PKG KW - AMPK KW - Metabolismus KW - Actin-Polymerisation KW - PKA KW - PKG KW - AMPK KW - Metabolism Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48321 ER - TY - JOUR A1 - Bonte, Dries A1 - Hovestadt, Thomas A1 - Poethke, Hans-Joachim T1 - Evolution of dispersal polymorphism and local adaptation of dispersal distance in spatially structured landscapes N2 - Many organisms show polymorphism in dispersal distance strategies. This variation is particularly ecological relevant if it encompasses a functional separation of short- (SDD) and long-distance dispersal (LDD). It remains, however, an open question whether both parts of the dispersal kernel are similarly affected by landscape related selection pressures. We implemented an individual-based model to analyze the evolution of dispersal traits in fractal landscapes that vary in the proportion of habitat and its spatial configuration. Individuals are parthenogenetic with dispersal distance determined by two alleles on each individual‘s genome: one allele coding for the probability of global dispersal and one allele coding for the variance of a Gaussian local dispersal with mean value zero. Simulations show that mean distances of local dispersal and the probability of global dispersal, increase with increasing habitat availability, but that changes in the habitat's spatial autocorrelation impose opposing selective pressure: local dispersal distances decrease and global dispersal probabilities increase with decreasing spatial autocorrelation of the available habitat. Local adaptation of local dispersal distance emerges in landscapes with less than 70% of clumped habitat. These results demonstrate that long and short distance dispersal evolve separately according to different properties of the landscape. The landscape structure may consequently largely affect the evolution of dispersal distance strategies and the level of dispersal polymorphism. Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-47856 ER - TY - THES A1 - Liang, Chunguang T1 - Tools for functional genomics applied to Staphylococci, Listeriae, Vaccinia virus and other organisms N2 - Genome sequence analysis A combination of genome analysis application has been established here during this project. This offers an efficient platform to interactively compare similar genome regions and reveal loci differences. The genes and operons can be rapidly analyzed and local collinear blocks (LCBs) categorized according to their function. The features of interests are parsed, recognized, and clustered into reports. Phylogenetic relationships can be readily examined such as the evolution of critical factors or a certain highly-conserved region. The resulting platform-independent software packages (GENOVA and inGeno), have been proven to be efficient and easy to handle in a number of projects. The capabilities of the software allowed the investigation of virulence factors, e.g., rsbU, strains’ biological design, and in particular pathogenicity feature storage and management. We have successfully investigated the genomes of Staphylococcus aureus strains (COL, N315, 8325, RN1HG, Newman), Listeria spp. (welshimeri, innocua and monocytogenes), E.coli strains (O157:H7 and MG1655) and Vaccinia strains (WR, Copenhagen, Lister, LIVP, GLV-1h68 and parental strains). Metabolic network analysis Our YANAsquare package offers a workbench to rapidly establish the metabolic network of such as Staphylococcous aureus bacteria in genome-scale size as well as metabolic networks of interest such as the murine phagosome lipid signalling network. YANAsquare recruits reactions from online databases using an integrated KEGG browser. This reduces the efforts in building large metabolic networks. The involved calculation routines (METATOOL-derived wrapper or native Java implementation) readily obtain all possible flux modes (EM/EP) for metabolite fluxes within the network. Advanced layout algorithms visualize the topological structure of the network. In addition, the generated structure can be dynamically modified in the graphic interface. The generated network as well as the manipulated layout can be validated and stored (XML file: scheme of SBML level-2). This format can be further parsed and analyzed by other systems biology software, such as CellDesigner. Moreover, the integrated robustness-evaluation routine is able to examine the synthesis rates affected by each single mutation throughout the whole network. We have successfully applied the method to simulate single and multiple gene knockouts, and the affected fluxes are comprehensively revealed. Recently we applied the method to proteomic data and extra-cellular metabolite data of Staphylococci, the physiological changes regarding the flux distribution are studied. Calculations at different time points, including different conditions such as hypoxia or stress, show a good fit to experimental data. Moreover, using the proteomic data (enzyme amounts) calculated from 2D-Gel-EP experiments our study provides a way to compare the fluxome and the enzyme expression. Oncolytic vaccinia virus (VACV) We investigated the genetic differences between the de novo sequence of the recombinant oncolytic GLV-1h68 and other related VACVs, including function predictions for all found genome differences. Our phylogenetic analysis indicates that GLV-1h68 is closest to Lister strains but has lost several ORFs present in its parental LIVP strain, including genes encoding CrmE and a viral Golgi anti-apoptotic protein, v-GAAP. Functions of viral genes were either strain-specific, tissue-specific or host-specific comparing viral genes in the Lister, WR and COP strains. This helps to rationally design more optimized oncolytic virus strains to benefit cancer therapy in human patients. Identified differences from the comparison in open reading frames (ORFs) include genes for host-range selection, virulence and immune modulation proteins, e.g. ankyrin-like proteins, serine proteinase inhibitor SPI-2/CrmA, tumor necrosis factor (TNF) receptor homolog CrmC, semaphorin-like and interleukin-1 receptor homolog proteins. The contribution of foreign gene expression cassettes in the therapeutic and oncolytic virus GLV-1h68 was studied, including the F14.5L, J2R and A56R loci. The contribution of F14.5L inactivation to the reduced virulence is demonstrated by comparing the virulence data of GLV-1h68 with its F14.5L-null and revertant viruses. The comparison suggests that insertion of a foreign gene expression cassette in a nonessential locus in the viral genome is a practical way to attenuate VACVs, especially if the nonessential locus itself contains a virulence gene. This reduces the virulence of the virus without compromising too much the replication competency of the virus, the key to its oncolytic activity. The reduced pathogenicity of GLV-1h68 was confirmed by our experimental collaboration partners in male mice bearing C6 rat glioma and in immunocompetent mice bearing B16-F10 murine melanoma. In conclusion, bioinformatics and experimental data show that GLV-1h68 is a promising engineered VACV variant for anticancer therapy with tumor-specific replication, reduced pathogenicity and benign tissue tropism. N2 - Genom Sequenz Analyse Im Zuge der vorliegenden Doktorarbeit wurden verschiedene Programme zur Genomanalyse kombiniert, um eine effiziente Plattform zum interaktiven Vergleich lokaler Ähnlichkeiten bzw. Unterschiede in Genomen bereitzustellen. Damit können Gene und Operons schnell untersucht und “local collinear blocks” entsprechend ihrer Funktion kategorisiert werden. Phylogenetische Beziehungen, wie beispielsweise die Evolution spezifischer Elemente oder stark konservierter Regionen können leicht überprüft werden. Die hierfür entwickelte plattformunabhängige Software (GENOVA und inGeno) hat sich in mehreren Projekten als effizient und leicht handhabbar bewährt. Die Programme erlauben die Untersuchung von Virulenzfaktoren auf Sequenz- oder Annotationsebene. Während der vorliegenden Doktorarbeit konnten so die Genome von verschiedenen Staphylococcus aureus, Listeria spp., Escherichia coli und Vaccinia Stämmen untersucht werden. Metabolische Netzwerk Analyse Unser “YANAsquare” Programmpaket bietet eine Oberfläche um schnell metabolische Netzwerke vom genomweiten Anzatz bis hinunter zum Einzelnetzwerk zu analysieren. Dafür greift YANA mit Hilfe des integrierten KEGG-Browsers auf Onlinedatenbanken zu, um die notwendigen Informationen zum metabolischen Reaktionsweg bereitzustellen und reduziert so maßgeblich den Arbeitsaufwand beim Beschreiben von Netzwerke. Die implementierten Methoden zur Berechnung (METATOOL, eigene Implementation in Java) des Netzwerkes liefern exakt alle die möglichen Elementarmoden (EM/EP) für die Metabolite zurück. Durch den Einsatz von fortgeschrittenen Layout Algorithmen wird anschliessend die Darstellung der Netzwerktopologie möglich. Außerdem kann in der grafischen Darstellung das generierte Netzwerklayout dynamisch verändert werden. Das Speichern der Daten erfolgt im XML (SBML level-2) Format und erlaubt so die Weiterverwendung in anderen systembiologischen Programmen, wie dem “CellDesigner”. Mit Hilfe einer gen-Knockout Simulations Methode kann der Einfluss von einzelnen Mutationen im gesamten Netzwerk auf die Syntheseraten untersucht werden. Wir konnten mit dieser Methode Einzel- sowie Mehrfachgenknockouts und deren Effekte auf die Elementarmoden analysieren. Die Methode wurde ebenfalls auf Proteomdaten und extrazelluläre Metabolite von Staphylokokken angewandt, um Änderungen bezüglich der Flussverteilung zu untersuchen. Die Simulationen zu verschieden Zeitpunkten und unter verschiedenen Stessbedingungen zeigen große Übereinstimmung mit experimentell erhobenen Daten. Onkolytischer Vaccinia Virus (VACV) Wir haben die genetischen Unterschiede zwischen der de novo Sequenz des rekombinanten onkolytischen Virus GLV-1h68 und anderen VACVs untersucht und gefundene Unterschiede funktionell charakterisiert. Die phylogenetische Analyse zeigt das GLV-1h68 mit dem Lister Stamm am nächsten verwandt ist. Auffällig ist dabei der Verlust von einigen open reading frames (ORFs), die noch im Eltern LIVP Stamm vorhanden sind (CrmE, v-GAAP). Beim Vergleich der Funktion viraler Gene aus Lister, WR und COP Stämmen treten stamm-, gewebe- und wirtsspezifische Gene auf. Diese Tatsache ermöglicht die Optimierung der onkolytischen Virusstämme für den Einsatz bei humanen Krebstherapien. Die beim Vergleich identifizierten Unterschiede zwischen den ORFs enthalten Gene für die Wirtsselektion, Virulenz und immunmodulierende Proteine (Ankyrin ähnliche Proteine, Serine-Proteinasen Inhibitor SPI-2/CrmA, Tumor Nekrose Faktor (TNF) Rezeptorhomolog CrmC, semaphorinähnliche und Interleukin-1 rezeptorhomologe Proteine). An den Loki F14.5L, J2R und A56R des GLV-1h68 Virus wurden die Vorteile der eingesetzten fremden Genexpressionskassetten untersucht. So zeigt GLV-1h68 mit F14.5L-Inaktivierung gegenüber der F14.5L-Revertanten Viren eine reduzierte Virulenz. Das erlaubt die Schlussfolgerung, dass die Insertion von fremden Genexpressionskassetten in nicht-essentielle Loki zur Verminderung der Virulenz von VACVs führt, besonders, wenn der nicht-essentielle Lokus selbst ein Virulenzgen enthält. Das Replikationsvermögen, welches ausschlaggebend für die onkolytische Aktivität des Virus ist, wird trotz der verminderten Virulenz nicht eingeschränkt. Die reduzierte Pathogenität des GLV-1h68 Virus wurde durch experimentelle Daten unserer Kollaborationspartner in männlichen Mäusen mit Ratten C6 Gliom und in immunokompetenten Mäusen mit B16-F10 Mausmelanom nachgewiesen. Zusammenfassend zeigen experimentelle und bioinformatisch gewonnene Daten, dass GLV-1h68 eine vielversprechende VACV Variante für die Krebstherapie mit tumorspezifischer Replikation, verringerter Pathogenität und hoher Gewebsspezifität ist. KW - Genanalyse KW - Bioinformatik KW - Systembiologie KW - bacterial KW - virulence KW - systems biologie KW - genomic KW - algorithm KW - metabolic KW - network KW - pathway KW - flux KW - Bacterial KW - genomics KW - algorithm KW - tool KW - metabolic Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48051 ER - TY - JOUR A1 - Heisswolf, Annette A1 - Reichmann, Stefanie A1 - Poethke, Hans-Joachim A1 - Schröder, Boris A1 - Obermaier, Elisabeth T1 - Habitat quality matters for the distribution of an endangered leaf beetle and its egg parasitoid in a fragmented landscape N2 - Fragmentation, deterioration, and loss of habitat patches threaten the survival of many insect species. Depending on their trophic level, species may be differently affected by these factors. However, studies investigating more than one trophic level on a landscape scale are still rare. In the present study we analyzed the effects of habitat size, isolation, and quality for the occurrence and population density of the endangered leaf beetle Cassida canaliculata Laich. (Coleoptera: Chrysomelidae) and its egg parasitoid, the hymenopteran wasp Foersterella reptans Nees (Hymenoptera: Tetracampidae). C. canaliculata is strictly monophagous on meadow sage (Salvia pratensis), while F. reptans can also parasitize other hosts. Both size and isolation of habitat patches strongly determined the occurrence of the beetle. However, population density increased to a much greater extent with increasing host plant density ( = habitat quality) than with habitat size. The occurrence probability of the egg parasitoid increased with increasing population density of C. canaliculata. In conclusion, although maintaining large, well-connected patches with high host plant density is surely the major conservation goal for the specialized herbivore C. canaliculata, also small patches with high host plant densities can support viable populations and should thus be conserved. The less specialized parasitoid F. reptans is more likely to be found on patches with high beetle density, while patch size and isolation seem to be less important. KW - Fragmentierung KW - Pflanzenfressende Insekten KW - Eiparasitismus KW - Metapopulation KW - Habitat fragmentation KW - herbivore KW - host plant density KW - metapopulation KW - multitrophic Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-47740 ER - TY - THES A1 - Kelber, Christina T1 - The olfactory system of leafcutting ants: neuroanatomy and the correlation to social organization T1 - Das olfaktorische System der Blattschneiderameisen: Neuroanatomie und Korrelation zur sozialen Organisation N2 - In leaf-cutting ants (genera Atta and Acromyrmex), the worker caste exhibits a pronounced size-polymorphism, and division of labor is largely dependent on worker size (alloethism). Behavioral studies have shown a rich diversity of olfactory-guided behaviors, and the olfactory system seems to be highly developed and very sensitive. To allow fine-tuned behavioral responses to different tasks, adaptations within the olfactory system of different sized workers are expected. In a recent study, two different phenotypes of the antennal lobe of Atta vollenweideri workers were found: MG- and RG-phenotype (with and without a macroglomerulus, MG). The existence of the macroglomerulus is correlated to the body size of workers, with small workers showing the RG-phenotype and large workers showing the MG-phenotype. In the MG, the information about the releaser component of the trail-pheromone is processed. In the first part of my PhD-project, I focus on quantifying behavioral differences between different sized workers in Atta vollenweideri. The study analyzes the trail following behavior; which can be generally performed by all workers. An artificial trail consisting of the releaser component of the trail-pheromone in decreasing concentration was used to test the trail-following performance of individual workers. The trail-following performance of the polymorphic workers is depended of the existence of the MG in the antennal lobe. Workers possessing the MG-phenotype were significantly better in following a decreasing trail then workers showing the RG-phenotype. In the second part I address the question if there are more structural differences, besides the MG, in the olfactory system of different sized workers. Therefore I analyze whether the glomerular numbers are related to worker size. The antennal lobes of small workers contain ~390 glomeruli (low-number; LN-phenotype), and in large workers I found a substantially higher number of ~440 glomeruli (high-number; HN-phenotype). All LN-phenotype workers and some of the small HN-phenotype workers do not possess an MG (LN-RG-phenotype and HN-RG-phenotype) at all, whereas the remaining majority of HN-phenotype workers do possess an MG (HN-MG-phenotype). Mass-stainings of antennal olfactory receptor neurons revealed that the sensory tracts divide the antennal lobe into six clusters of glomeruli (T1-T6). In the T4-cluster ~50 glomeruli are missing in the LN-phenotype workers. Selective staining of single sensilla and their associated receptor neurons showed that T4-glomeruli are innervated by receptor neurons from the main type of olfactory sensilla, the Sensilla trichodea curvata which are also projecting to glomeruli in all other clusters. The other type of olfactory sensilla, the Sensilla basiconica, exclusively innervates T6-glomeruli. Quantitative analyses revealed a correlation between the number of Sensilla basiconica and the volume of T6 glomeruli in different sized workers. The results of both behavioral and neuroanatomical studies in Atta vollenweideri suggest that developmental plasticity of antennal-lobe phenotypes promotes differences in olfactory-guided behavior which may underlie task specialization within ant colonies. The last part of my project focuses on the evolutionary origin of the macroglomerulus and the number of glomeruli in the antennal lobe. I compared the number, volumes and position of the glomeruli of the antennal lobe of 25 different species from all three major Attini groups (lower, higher and leaf-cutting Attini). The antennal lobes of all investigated Attini comprise a high number of glomeruli (257-630). The highest number was found in Apterostigma cf. mayri. This species is at a basal position within the Attini phylogeny, and a high number of glomeruli might have been advantageous in the evolution of the advanced olfactory systems of this Taxa. The macroglomerulus can be found in all investigated leaf-cutting Attini, but in none of the lower and higher Attini species. It is found only in large workers, and is located close to the entrance of the antennal nerve in all investigated species. The results indicate that the presence of a macroglomerulus in large workers of leaf-cutting Attini is a derived overexpression of a trait in the polymorphic leaf-cutting species. It presumably represents an olfactory adaptation to elaborate foraging and mass recruitment systems, and adds to the complexity of division of labor and social organization known for this group. N2 - Die Arbeiterinnenkaste der Blattschneideameisen zeigt einen ausgeprägten Größenpolymorphismus. Man findet hier einen Alloethismus; unterschiedlich große Arbeiterinnen führen verschiedene Arbeiten im Stock durch. Verschiedene Verhaltensversuche haben gezeigt, dass viele Verhaltensweisen der Arbeiterinnen olfaktorisch gesteuert werden und dass das olfaktorische System hoch entwickelt und sehr sensitiv ist. Es ist wahrscheinlich, dass sich im olfaktorischen System verschieden großer Arbeiterinnen Anpassungen finden lassen, die gut abgestimmte Verhaltensantworten auf die verschiedenen Aufgaben der Tiere ermöglichen. Und tatsächlich zeigt eine aktuelle Studie, dass zwei verschiedene Phänotypen des Antennallobus der Arbeiterin bei Atta vollenweideri existieren, der MG- und der RG-Phänotyp (mit oder ohne Makroglomerulus, MG). Die Existenz des Makroglomerulus kann mit der Körpergröße der Tiere korreliert werden: bei kleinen Arbeiterinnen findet man den RG-Phänotyp, bei großen den MG-Phänotyp. Im Makroglomerulus wird die olfaktorische Information über den verhaltensauslösenden Bestandteil des Spurpheromons verarbeitet. Im ersten Tel meiner Doktorarbeit versuche ich, Verhaltensunterschiede verschieden großer Atta vollenweideri Arbeiterinnen zu quantifizieren. Dazu konzentriere ich mich auf das Spurfolgeverhalten, dass bei Arbeiterinnen jeder Größe beobachtet werden kann. Um die Spurfolgeleistung einzelner Arbeiterinnen zu testen, wurde eine künstlich gelegte Spur mit abnehmender Konzentration des verhaltensauslösenden Bestandteils des Spurpheromons verwendet. Die Spurfolgeleistung der Arbeiterinnen hängt von der Existenz des Makroglomerulus im Antennallobus ab. Im zweiten Teil meiner Doktorarbeit untersuche ich die Neuroanatomie des olfaktorischen Systems bei verschieden großen Atta vollenweideri Arbeiterinnen auf eventuelle weitere anatomische Unterschiede neben dem Makroglomerulus – im Besonderen ob die Anzahl an Glomeruli bei verschieden großen Tieren unterschiedlich ist. Die Antennalloben kleiner Arbeiterinnen beinhalten cirka 390 Glomeruli (geringe Anzahl, LN-Phänotyp), die Antennalloben großer Arbeiterinnen dagegen cirka 440 Glomeruli (hohe Anzahl, HN-Phänotyp). Alle Arbeiterinnen mit dem LN-Phänotyp und einige mit dem HN-Phänotyp besitzen keinen Makroglomerulus (LN-RG-Phänotyp und HN-RG-Phänotyp). Die meisten Tiere mit HN-Phänotyp besitzen jedoch einen Makroglomerulus (HN-MG-Phänotyp). Massenfärbungen der olfaktorischen Rezeptorneuron-Axone zeigen, dass der Antennennerv sich in sechs Trakte teilt und so die Glomeruli in sechs verschiedene Glomerulicluster unterteilt werden können (T1-T6). Bei den Arbeiterinnen mit LN-Phänotyp fehlen cirka 50 Glomeruli im T4-Cluster. Einzelsensillenfärbungen zeigen, dass die Rezeptorneuronen der olfaktorischen Sensilla trichodea curvata alle sechs Cluster, also auch das T4-Cluster innervieren. Ein weiterer Sensillentyp, die Sensilla basiconica, innerviert ausschließlich Glomeruli im T6-Cluster. Quantitative Analysen ergeben eine Korrelation zwischen der Anzahl der Sensilla basiconica auf der Arbeiterinnenantenne und des durchschnittlichen Volumens der T6-Glomeruli bei verschieden großen Tieren. Die Ergebnisse der Verhaltensversuche und der neuroanatomischen Studien könnten darauf hinweisen, dass Unterschiede im Verhalten auf olfaktorische Reize möglicherweise durch die Entwicklungsplastizität der Antenallobus-Phänotypen ausgelöst werden. Dies könnte innerhalb der Kolonie die Grundlage der Spezialisierung von Arbeiterinnen auf bestimmte Arbeiten sein. Den letzten Teil meiner Doktorarbeit nimmt eine Untersuchung über den evolutionären Ursprung des Makroglomerulus und der Anzahl der Glomeruli im Antennallobus ein. Dazu verglich ich in den Antennalloben 25 verschiedener Arten aus den drei Attini-Gruppen (basale, höhere und blattschneidende Attini) die Anzahl, das Volumen und die Position der Glomeruli. Die Antennalloben aller untersuchten Arten bestehen aus sehr vielen Glomeruli (257-630). Der Makroglomerulus findet sich in allen untersuchten blattschneidenden Attini-Arten, aber nie in den untersuchten basalen und höheren Attini-Arten. Er findet sich nur bei größeren Arbeiterinnen und befindet sich immer in der Nähe des Antennennerveingangs. Dies bedeutet, dass es sich bei der Existenz des Makroglomerulus in den großen Blattschneidearbeiterinnen um eine abgeleitete Überexpression eines Merkmals innerhalb der polymorphen blattschneidenden Attini-Arten handelt. Der Makroglomerulus ist wahrscheinlich eine olfaktorische Anpassung an das hoch entwickelte Fouragier- und Rekrutiersystem dieser Arten. Er ist ein Baustein der komplexen Arbeitsteilung und der komplexen sozialen Organisation, die für die Arten dieser Gruppe bekannt sind. KW - Gehirn KW - Polymorphismus KW - Arbeitsteilung KW - Geruchswahrnehmung KW - Antennallobus KW - Glomeruli KW - olfaktorische Rezeptorneurone KW - Brain KW - polymorphism KW - antennal lobe KW - glomeruli KW - dvision of labor Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-47769 ER - TY - THES A1 - Fröhle, Kerstin T1 - Mechanismen zur Regulierung der Nestgröße während des Koloniewachstums bei Blattschneiderameisen T1 - Mechanisms of nest size regulation during colony growth in leaf-cutting ants N2 - Die Strukturen der Ameisennester, so wird seit einiger Zeit vermutet, entstehen aufgrund eines selbstorganisierten Prozesses, bei dem die einzelne Ameise nur über lokale Informationen verfügt, ohne eine Übersicht über das globale Muster zu haben. Die Gesamtstruktur resultiert demnach viel eher durch multiple Interaktionen, die entweder direkt zwischen den Individuen oder zwischen den Individuen und ihrer Umgebung stattfinden. Ziel dieser Arbeit war es, die Kriterien zu untersuchen, nach denen sich die Blattschneiderameisen während des Nestbaus richten, um so die Frage zu beantworten, ob es für die Entstehung der Strukturen nur der Interaktion mit der Umgebung bedarf oder ob direkte soziale Interaktionen auch einen Einfluss darauf haben. Betrachtet wurde dazu die Kontrolle der Nestgröße während verschiedener Stadien der Kolonieentwicklung: in der Gründungsphase, in der die Königin die Entscheidungen alleine und ohne soziale Interaktionen fällt; in der darauf folgenden Etablierungsphase, in der Arbeiterinnen entweder alleine oder in kleinen Gruppen die bereits existierenden Strukturen verändern; sowie im adulten Stadium, in der die Bautätigkeit von mehreren Tausend Arbeiterinnen ausgeführt werden kann. Königinnen graben unverzüglich nach dem Hochzeitsflug ein Gründungsnest, das aus einem vertikalen Tunnel und einer horizontalen Kammer besteht, in welcher die erste Brut und der Pilz gezüchtet werden. Um ein Gründungsnest zu graben, muss die Königin zuerst mit ihren Mandibeln kopfüber am Boden graben. Hierbei legt sie einen Tunnel an, der einen etwas größeren Durchmesser als sie selbst besitzt. Ist dann die gewünschte Tunnellänge erreicht, so wechselt sie vom vertikalen Tunnel zum horizontalen Kammergraben, worauf anschließend der Tunnel verschlossen wird. Die Frage, die sich nun stellt, ist, wie Atta vollenweideri Königinnen die Länge des Tunnels bewerten, um den Wechsel zum Kammergraben einzuleiten. Aufgrund der Ergebnisse wird angenommen, dass die Königinnen sowohl die Länge des Tunnels, wahrscheinlich über Propriozeption, als auch die Grabezeit abschätzen und mit einer internen Referenz vergleichen. Wurde demnach weder die erwartete Länge noch die maximal schon investierte Zeit erreicht, so fuhren die Königinnen fort den Tunnel zu verlängern. Der Wechsel vom Tunnel zum Kammergraben wurde dann eingeleitet, wenn die Königinnen, in Abhängigkeit von den jeweiligen Bodenbedingungen, entweder zuerst die erwartete Länge oder die zu investierende Zeit erreicht hatten. Daraufhin fingen sie an die Kammer zu bauen, wobei sie die nun ausgegrabenen Lehmpartikel dazu benutzten, den Tunnel zu verschließen. Diese wurden von oben bis unten komplett verschlossen, womit die Kammergrößen von den Tunnellängen abhängig waren. Wurden die Königinnen jedoch mit Tunneln konfrontiert, die experimentell über die erwartete Länge hinaus verlängert wurden, so wurden diese nicht mehr über die komplette Strecke, sondern in mehreren Teilabschnitten verschlossen. Dies deutet darauf hin, dass bei der Regulierung der Kammergröße ein weiterer Mechanismus involviert ist. Nach 2-3 Monaten schlüpfen in der Regel die ersten Arbeiterinnen, womit die Kolonie in die Wachstumsphase eintritt. Mit dem Wachsen der Kolonie wird das Gründungsnest verändert, wobei die Arbeiterinnen die bereits existierende Pilzkammer vergrößern und neue Tunnel anlegen. Nach welchen Kriterien sie sich dabei richten, war allerdings nicht bekannt. Gezeigt werden konnte, dass Acromyrmex lundi Arbeiterinnen anfangen ein Nest zu vergrößern, wenn sich der frei für die Ameisen zur Verfügung stehende Platz innerhalb des Nestes reduziert und dass sie aufhören, wenn wiederum genügend Platz vorhanden ist. Eine Zunahme in der Gruppengröße (1, 2, 6 und 12 Tiere) bewirkte somit, einen proportionalen Anstieg des ausgegrabenen Volumens und damit der Arbeitsleistung der Kolonie. Ob beim Graben aber eher die schon vorhandenen Pilzkammer vergrößert oder neue Tunnel angelegt werden, hing von der Stimuluskombination ab. So bewirkte ein Platzmangel, ausgelöst durch eine, relativ zur Nestgröße, große Zahl an Arbeiterinnen, das bereits existierende Tunnel verlängert oder neue angelegt wurden. Eine Kammervergrößerung konnte dagegen nur beobachtet werden wenn Pilz vorhanden und der Platz in der Kammer reduziert war. Die Arbeiterinnen reagierten dabei, auf dieselben Stimuli mit denselben Verhaltensmustern, unabhängig davon ob sie alleine oder in einer Gruppe gruben. Je mehr Ameisen sich aber in der Gruppe befanden desto mehr wurden die Kammern zunächst vergrößert, wobei sich jedoch keine Korrelation mit der Gruppengröße zeigte. Dies lässt darauf schließen, dass die Vergrößerung von den sich gleichzeitig am Graben beteiligenden Ameisen abhängt, die die Kammern so lange vergrößern bis genügend Platz vorhanden ist. Die Zahl der Ameisen die sich jedoch am Graben beteiligen nimmt mit steigender Gruppengröße zu, weswegen die Kammern bei großen Ameisenzahlen größer wurden. Gleichzeitig mit dem Vergrößern fingen die Ameisen jedoch an ausgegrabene Lehmpartikel in der Kammer zu deponieren. Dies bewirkte, dass vor allem größere Kammern im Nachhinein verkleinert wurden, bis ein bestimmter Abstand zum Pilz erreicht war, bei dem eventuell zwei Ameisen aneinander vorbeilaufen konnten. Somit hatte die Einlagerung der Lehmpartikel in der Kammer zur Folge, dass die Kammergröße im Nachhinein besser dem Pilzvolumen angepasst wurde. Ähnlich wie bei der Kammervergrößerung verhielt es sich beim Anlegen der Tunnel. Auch diese wurden umso breiter je mehr Tiere sich gleichzeitig am Graben beteiligten und wurden dann im Nachhinein durch Einlagerung von Lehmpartikeln auf eine bestimmte Breite reduziert. Zusätzlich wurden die Tunnel aber auch umso länger je mehr Ameisen sich in der Gruppe befanden, weshalb die Nestgröße über die Größe der Gruppe reguliert wurde. Acromyrmex lundi Nester bestehen in der Regel aus einer großen zentralen Pilzkammer und aus mehreren Tunneln, die diese mit der Erdoberfläche verbinden. Wie die Ameisen in dem adulten Stadium die Größe der Pilzkammer regulieren, wurde bisher noch nicht untersucht. Als mögliche Kriterien, nach denen sich die Ameisen richten könnten, wurde sowohl das vorhandene Pilzvolumen als auch die Anzahl an Arbeiterinnen in Betracht gezogen. Gezeigt werden konnte, dass die Kammern umso größer werden, je mehr Pilzvolumen vorhanden ist. Aufgrund dessen wird angenommen, dass der Pilz beim Bau der Pilzkammer als Vorlage dient und somit das Grabeverhalten räumlich organisiert. Eine Erhöhung der Ameisenzahlen bewirkte dagegen eine Vergrößerung des Nestvolumens durch das Anlegen von Tunneln. Dadurch nahm das insgesamt ausgegrabene Volumen und damit die Grabeaktivität mit der Größe der Kolonie zu. Allerdings stieg es nicht, wie bei den kleinen Gruppen beobachtet werden konnte, proportional zur Koloniegröße an. Vermutet wird, dass sowohl die Kammer- als auch die Nestvergrößerung über die Individuendichte reguliert wird. Demnach würden die Tiere anfangen zu graben, wenn die Individuendichte über einen Schwellenwert ansteigt und aufhören, wenn die Dichte wiederum unter diesen Schwellenwert fällt. Allerdings gibt es Hinweise darauf, dass die Grabeaktivität nicht nur über die Individuendichte, sondern zusätzlich noch durch ein rhythmisches Graben in der Nacht geregelt zu sein scheint. Zusammengenommen konnte also gezeigt werden, dass Königinnen auf Stimuli in ihrer Umgebung reagieren, indem sie die Tiefe des Gründungsnestes durch das Abschätzen der schon gegrabenen Tunnellänge bestimmen. Das Nestgraben erfolgt allerdings nicht nach einem einfachen Stimulus-Antwort-Mechanismus, sondern die Königinnen richten sich zusätzlich noch nach der Zeit, was einen internen Messfaktor darstellt. Ebenfalls scheint die Kammergröße durch mindestens zwei Mechanismen reguliert zu werden. Somit fließen sowohl bei der Bestimmung der Tunnellänge als auch bei der Regulation der Kammergröße mehrere Kriterien in die Entscheidung mit ein. Ebenso wie die Königinnen reagieren einzelne Individuen auf unterschiedliche Stimuli in ihrer Umgebung, wodurch unterschiedliche Neststrukturen entstehen können. So fangen Ameisen an ein Nest zu vergrößern, wenn sich der zur Verfügung stehende Platz innerhalb des Nestes reduziert. Wächst der Pilz so reduziert sich der Abstand zwischen Pilz und Kammerwand, was für die Tiere ein Signal ist, die Kammer zu vergrößern. Dabei wird der Pilz als Vorlage verwendet, der das Graben räumlich organisiert. Ist der Platz innerhalb des Nestes dagegen aufgrund des Koloniewachstums reduziert, so fangen die Arbeiterinnen an Tunnel auszugraben, so dass die Nestgröße der Koloniegröße angepasst wird. Allerdings, so wird vermutet, hängt die Anzahl der sich am Graben beteiligenden Ameisen sowie auch deren Arbeitsleistung von der Größe der Gruppe ab. Demnach sind die Individuen nicht nur sensitiv auf die Stimuli, die aus ihrer Umgebung kommen, sondern ändern ihr Verhalten auch in Abhängigkeit von dem sozialen Umfeld, in dem sie sich befinden. N2 - The emergence of ant nest structures is discussed as a self-organized process in which the single ant has only local information without an overview over the global system. The entire structure rather results from numerous interactions between the individuals directly or between the individuals and their environment. The aim of this work was to investigate the criteria leaf-cutting ants comply with during nest construction in order to answer the question if nest structures can emerge solely from interactions of the ants with their environment or if direct social interactions are additionally necessary. For this purpose the control of nest size during different stages of colony ontogeny was considered: in the colony founding phase in which the queen has to make her decisions alone and without social interactions, in the following establishing phase in which the workers modify the structures either alone or in small groups as well as in the adult phase in which the building activity can be performed by several thousand ants. Founding queens dig a founding nest immediately after the nuptial flight. The founding nest consists of a vertical tunnel and a horizontal chamber, in which the first brood and the fungus are reared. A queen starts by digging headfirst into the ground with her mandibles excavating a tunnel slightly wider than her own diameter. Once the desired tunnel length is reached, she switches from vertical tunnel to horizontal chamber digging and starts to close the tunnel with the now excavated clay particles. It is unclear how Atta vollenweideri queens estimate the tunnel length in order to initiate the switch to chamber digging. The results of this study suggest that queens estimate both the tunnel length, probably through proprioception, as well as the digging time and compare them with an internal reference. Accordingly, the queens continued tunnel digging if neither the expected length nor the maximal invested time was reached. The switch from tunnel to chamber digging was initiated as, depending on soil conditions, the queens reached first either the expected tunnel length or the invested time. The queens then started chamber digging and used the now excavated particles to close the tunnels. As the tunnels were closed from top to bottom chamber sizes varied in dependence on the tunnel length. However, if the queens were confronted with tunnels that had experimentally been elongated beyond the desired length, then these tunnels were not closed over the whole distance but in several sections, indicating that a further mechanism is involved in the regulation of chamber size. The first workers generally eclose after 2-3 month at which point the colony enters the growth phase. With the growth of the colony, the founding nest is altered through the enlargement of the already existing fungus chamber and construction of new tunnels. The rules that guide worker digging behaviour are unknown. This study shows that Acromyrmex lundi workers start to enlarge a nest if the available free space within the nest is reduced and that they stop when enough space is available. An increase in group size (1, 2, 6 and 12ants) resulted in an increase of excavated volume, so that the digging effort of the colony rose proportionally with group size. However, whether the pre-existing fungus chamber was enlarged during the digging process or new tunnels were built depended on the stimulus combination. A lack of space triggered through a large number of workers relative to nest size, lead to lengthening of already existing tunnels or building of new ones. On the other hand chambers were only enlarged if fungus was present and the space inside the chamber reduced. Workers reacted to the same stimuli with the same behaviour pattern independent of whether they were digging alone or within a group. However, with increasing group size the chambers were increasingly enlarged but not in proportion to group size. This suggests that the enlargement depends on the number of ants participating in digging simultaneously who enlarge the chamber until they have enough space. The number of ants participating in digging however increases with increasing group size which is why the chambers were bigger in larger groups. Simultaneously with the enlargement of the structure the ants started to deposit the excavated clay particles in the chamber. As a consequence, especially the bigger chambers were reduced in size afterwards until a defined distance between chamber wall and fungus was reached. This distance was approximately the width of two ants. The deposition of the clay particles thus resulted in a better adaptation of the chamber size to the fungus volume. Similar results could be seen for tunnel construction. These were also enlarged according to the number of ants simultaneously participating in digging and reduced in width afterwards through the deposition of clay particles. But tunnels additionally increased in length in dependence on the group size, so that group size regulates the nest size. Grown Acromyrmex lundi nests consist of a big central chamber and of several tunnels connecting the chamber with the surface. How the size of the fungus chamber is regulated in the adult phase was so far unknown. Both the existing fungus volume and the number of ants were considered as possible criteria. The results of this study show that the chambers increased in size as more fungus volume was available. This suggests that during chamber construction the fungus volume serves as a template organising the digging behaviour in space. In contrast, an increase in the number of ants caused an enlargement of the nest volume through the building of tunnels. Thus the overall excavated volume and hence the digging activity increased with group size. However, this increase was not proportional to colony size as could be shown in the small groups. It is assumed that both the chamber as well as the nest enlargement is regulated over the density of the individuals. Thus the digging process would be initiated if the density exceeds a threshold value and stopped if it in turn falls below the threshold value. However there is evidence that the digging activity may be regulated additionally by a rhythmical digging during the night. Taken together it could be shown that the queens react to stimuli in the environment by assessing the depth of the founding nest through the estimation of the tunnel length already dug. Nest construction, however, is not regulated over a simple stimulus response mechanism as queens’ additional factor in the already invested digging time indicating an internal cue. Chamber size also seems to be regulated by at least two mechanisms. Thus in the assessment over the tunnel length as well as in the regulation of the chamber size more than one criteria was integrated into the decision process. Like the queens, single individuals reacted to different stimuli in their environment whereby different nest structure emerged. The ants start to enlarge a nest if the available space within the nest is reduced. When the fungus grows the distance between the fungus and the chamber wall is reduced which is a signal for the ants to enlarge the chamber. The fungus is thereby used as a template coordinating the digging process in space. If, on the other hand, the space is reduced due to colony growth, ants start to construct tunnels whereby nest size is adjusted to colony size. However, it is assumed that the number of digging ants as well as their digging effort depends on group size. According to this, individuals are not just sensitive to stimuli of the environment but change their behaviour additionally in dependence of the social context. KW - Nestgröße KW - Koloniegröße KW - Blattschneiderameisen KW - Grabeverhalten KW - Ameisenstaat KW - nest size KW - colony size KW - leaf-cutting ants KW - digging behavior Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-46311 ER - TY - THES A1 - Böhme, Linda T1 - Cellular response to double-stranded RNA in Chlamydia trachomatis-infected human host cells T1 - Zelluläre Antwort auf doppelsträngige RNA in Chlamydia trachomatis-infizierten humanen Wirtszellen N2 - Chlamydien sind Gram-negative, obligat-intrazelluläre Bakterien, die für ein weites Spektrum an relevanten Krankheiten verantwortlich sind. Auf Grund ihres zweiphasigen Entwicklungszyklusses sind Chlamydien von einer intakten Wirtszelle abhängig, um sich erfolgreich vermehren und im Organismus ausbreiten zu können. Daher haben Chlamydien anspruchsvolle Strategien entwickelt, um das Immunsystem des Wirtes auszuschalten oder den programmierten Zelltod ihrer Wirtszelle zu verhindern. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob eine Infektion mit C. trachomatis einen Einfluss auf die zelluläre Antwort auf dsRNA nehmen kann. Die Synthese von dsRNA ist ein charakteristisches Merkmal der Replikation von Viren, welche sowohl die Apoptose induzieren als auch das Immunsystem aktivieren kann. Um eine chlamydiale und virale Co-Infektion zu simulieren, wurden Chlamydien-infizierte Epithelzellen mit der synthetischen dsRNA Polyinosin-Polycytidinsäure (polyI:C) transfiziert. Im ersten Teil der Arbeit wurde untersucht, ob Chlamydien die durch dsRNA eingeleitete Apoptose verhindern können. Eine signifikante Reduktion der dsRNA-induzierten Apoptose konnte in infizierten Zellen beobachtet werden. Es zeigte sich, dass die Prozessierung der Initiator-Caspase-8 in infizierten Zellen unterblieb. Dies war von der frühen bakteriellen Proteinsynthese abhängig und für die dsRNA-vermittelte Apoptose spezifisch, da der durch TNFalpha bewirkte Zelltod nicht auf der Ebene der Caspase-8 verhindert werden konnte. Die Aktivierung von zellulären Faktoren, die bei der Apoptoseinduzierung eine wichtige Rolle spielen, beispielsweise PKR und RNase L, war in infizierten Zellen jedoch unverändert. Stattdessen konnte durch RNA Interferenz-vermittelte Depletion gezeigt werden, dass der zelluläre Caspase-8-Inhibitor cFlip eine entscheidende Rolle bei der chlamydialen Blockierung der dsRNA-vermittelten Apoptose spielt. Mittels Co-Immunopräzipitation konnte ein erster Hinweis darauf gefunden werden, dass C. trachomatis eine Anreicherung von cFlip im dsRNA-induzierten Komplex von Caspase-8 und FADD bewirkt. Im zweiten Teil der Arbeit wurde untersucht, ob Chlamydien die Immunantwort auf virale Infektionen beeinflussen, welche vor allem die Expression von Interferonen und Interleukinen beinhaltet. Es stellte sich heraus, dass die Aktivierung des Interferon regulatory factor 3 (IRF-3) und des zur Familie von NF-kappaB Trankriptionsfaktoren gehörenden p65, zwei zentralen Regulatoren der Immunantwort auf dsRNA, in infizierten Epithelzellen verändert war. Die Degradation von IkappaB-alpha, des Inhibitors von NF-kappaB, war in infizierten Zellen beschleunigt, begleitet von einer Veränderung der Translokation des Transkriptionsfaktors in den Zellkern. Im Gegensatz dazu wurde die nukleäre Translokation von IRF-3 durch die Infektion signifikant verhindert. Die hier vorgestellten Daten zeigen erstmals, dass eine Infektion mit C. trachomatis die zelluläre Antwort auf dsRNA signifikant verändern kann und implizieren einen Einfluss von chlamydialen Infektionen auf den Ausgang von viralen Superinfektionen. N2 - Chlamydia are Gram-negative obligate intracellular bacteria responsible for a wide spectrum of relevant diseases. Due to their biphasic developmental cycle Chlamydia depend on an intact host cell for replication and establishment of an acute infection. Chlamydia have therefore evolved sophisticated strategies to inhibit programmed cell death (PCD) induced by a variety of stimuli and to subvert the host immune system. This work aimed at elucidating whether an infection with C. trachomatis can influence the cellular response to double-stranded RNA (dsRNA). The synthesis of dsRNA is a prominent feature of viral replication inside infected cells that can induce both PCD and the activation of a cellular innate immune response. In order to mimic chlamydial and viral co-infections, Chlamydia-infected cells were transfected with polyinosinic:polycytidylic acid (polyI:C), a synthetic dsRNA. In the first part of this work it was investigated whether C. trachomatis-infected host cells could resist apoptosis induced by polyI:C. A significant reduction in apoptosis, determined by PARP cleavage and DNA fragmentation, could be observed in infected cells. It could be shown that processing of the initiator caspase-8 was inhibited in infected host cells. This process was dependent on early bacterial protein synthesis and was specific for dsRNA because apoptosis induced by TNFalpha was not blocked at the level of caspase-8. Interestingly, the activation of cellular factors involved in apoptosis induction by dsRNA, most importantly PKR and RNase L, was not abrogated in infected cells. Instead, RNA interference experiments revealed the crucial role of cFlip, a cellular caspase-8 inhibitor, for chlamydial inhibition of dsRNA-induced apoptosis. First data acquired by co-immunoprecipitation experiments pointed to an infection-induced concentration of cFlip in the dsRNA-induced death complex of caspase-8 and FADD. In the second part of this work, the chlamydial influence on the first line of defense against viral infections, involving expression of interferons and interleukins, was examined. Activation of the interferon regulatory factor 3 (IRF-3) and the NF-kappaB transcription factor family member p65, both central regulators of the innate immune response to dsRNA, was altered in Chlamydia-infected epithelial cells. polyI:C-induced degradation of IkappaB-alpha, the inhibitor of NF-kappaB, was accelerated in infected cells which was accompanied by a change in nuclear translocation of the transcription factor. Translocation of IRF-3, in contrast, was significantly blocked upon infection. Together the data presented here demonstrate that infection with C. trachomatis can drastically alter the cellular response to dsRNA and imply an impact of chlamydial infections on the outcome of viral super-infections. KW - Chlamydia trachomatis KW - Signaltransduktion KW - Immunreaktion KW - Doppelhelix KW - RNS KW - Apoptosis KW - Apoptose KW - doppelsträngige RNA KW - Immunantwort KW - Apoptosis KW - Chlamydia trachomatis KW - double-stranded RNA KW - innate immunity KW - signal transduction Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-46474 ER - TY - THES A1 - Triphan, Tilman T1 - The Central Control of Gap Climbing Behaviour in Drosophila melanogaster T1 - Die zentrale Kontrolle des Kletterverhaltens bei Drosophila melanogaster N2 - In this work, a behavioural analysis of different mutants of the fruit fly Drosophila melanogaster has been carried out. Primarily, the gap climbing behaviour (Pick & Strauss, 2005) has been assayed as it lends itself for the investigation of decision making processes and the neuronal basis of adaptive behaviour. Furthermore it shows how basic motor actions can be combined into a complex motor behaviour. Thanks to the neurogenetic methods, Drosophila melanogaster has become an ideal study object for neurobiological questions. Two different modules of climbing control have been examined in detail. For the decision making, the mutant climbing sisyphus was analysed. While wild-type flies adapt the initiation of climbing behaviour to the width of the gap and the probability for a successful transition. climbing sisyphus flies initiate climbing behaviour even at clearly insurmountable gap widths. The climbing success itself is not improved in comparison to the wild-type siblings. The mutant climbing sisyphus is a rare example of a hyperactive mutant besides many mutants that show a reduced activity. Basic capabilities in vision have been tested in an optomotor and a distance-estimation paradigm. Since they are not affected, a defect in decision making is most probably the cause of this behavioural aberration. A second module of climbing control is keeping up orientation towards the opposite side of the gap during the execution of climbing behaviour. Mutants with a structural defect in the protocerebral bridge show abnormal climbing behaviour. During the climbing attempt, the longitudinal body axis does not necessarily point into the direction of the opposite side. Instead, many climbing events are initiated at the side edge of the walking block into the void and have no chance to ever succeed. The analysed mutants are not blind. In one of the mutants, tay bridge1 (tay1) a partial rescue attempt used to map the function in the brain succeeded such that the state of the bridge was restored. That way, a visual targeting mechanism has been activated, allowing the flies to target the opposite side. When the visibility of the opposing side was reduced, the rescued flies went back to a tay1 level of directional scatter. The results are in accord with the idea that the bridge is a central constituent of the visual targeting mechanism. The tay1 mutant was also analysed in other behavioural paradigms. A reduction in walking speed and walking activity in this mutant could be rescued by the expression of UAS-tay under the control of the 007Y-GAL4 driver line, which concomitantly restores the structure of the protocerebral bridge. The separation of bridge functions from functions of other parts of the brain of tay1 was accomplished by rescuing the reduced optomotor compensation in tay1 by the mb247-GAL4>UAS-tay driver. While still having a tay1-like protocerebral bridge, mb247-GAL4 rescue flies are able to compensate at wild-type levels. An intact compensation is not depended on the tay expression in the mushroom bodies, as mushroom body ablated flies with a tay1 background and expression of UAS-tay under the control of mb247-GAL4 show wild-type behaviour as well. The most likely substrate for the function are currently unidentified neurons in the fan-shaped body, that can be stained with 007Y-GAL4 and mb247-GAL4 as well. N2 - In der vorliegenden Arbeit wurde eine Verhaltensanalyse verschiedener Mutanten der Fruchtfliege Drosophila melanogaster durchgeführt. Dazu wurde primär das Lücken-überwindungsparadigma (Pick & Strauss, 2005) herangezogen, das sich auf besondere Weise zur Erforschung von Entscheidungsfindung und adaptivem Verhalten anbietet. Weiterhin zeigt sich hier, wie einfache motorische Aktionen zu einem komplexen motorischen Verhalten zusammengefügt werden können. Dank der Möglichkeiten der Gentechnik bietet sich Drosophila hier als Studienobjekt an. Zwei Module der Kletterkontrolle wurden genauer untersucht. Im Bezug auf die Entscheidungsfindung wurde die Mutante climbing sisyphus getestet. Während der Wildtyp sein Kletterverhalten sehr genau an die Lückenbreite und die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Überquerung anpasst (Pick & Strauss, 2005), werden bei climbing sisyphus auch bei einer unmöglich zu überquerenden Lücke noch Kletteraktionen initiiert. Der Klettererfolg selbst ist im Vergleich zum Wildtyp nicht verbessert. Die Mutante climbing sisyphus ist ein seltenes Beispiel einer hyperaktiven Mutante neben vielen Mutanten die eine reduzierte Aktivität zeigen. Grundlegende Fähigkeiten im visuellen Bereich wurden in der Optomotorik und im Entfernungsschätzen getestet und sind in climbing sisyphus nicht beeinträchtigt, ein Defekt in der Entscheidungsfindung ist wahrscheinlich Ursache des gestörten Verhaltens. Ein zweites Modul der Kletterkontrolle betrifft die Aufrechterhaltung der Orientierung hin zur gegenüberliegenden Seite der Lücke. Mutanten mit einem Strukturdefekt in der Protozerebralbrücke des Zentralkomplexes zeigen ein abnormes Kletterverhalten. Die Körperlängsachse zeigt während des Klettervorgangs nicht in die Richtung der gegenüberliegenden Seite. Stattdessen werden oft Klettervorgänge am seitlichen Rand des Klettersteges initiiert, die keinerlei Aussicht auf Erfolg haben. Die untersuchten mutanten Fliegen sind nicht blind. In einem der Stämme, tay bridge1 (tay1), gelang zur funktionellen Kartierung eine partielle Rettung dieses Verhaltens durch die Expression des wildtypischen Gens in einem kleinen Teil des Nervensystems. Das Wiederherstellen der wildtypischen Brückenstruktur in tay1 aktiviert einen visuellen Zielmechanismus, der eine Ausrichtung der Fliegen auf die gegenüberliegende Seite ermöglicht. Wenn die Sichtbarkeit der gegenüberliegenden Seite reduziert wird, geht dieser Rettungseffekt verloren. Die Brücke ist nach diesen Befunden ein zentraler Bestandteil der visuell gesteuerten Zielmotorik. Die tay1 Mutante wurde auch in weiteren Verhaltensexperimenten untersucht. So konnte eine in dieser Mutante vorliegende Reduktion der Laufgeschwindigkeit und Laufaktivität durch die Expression von UAS-tay unter der Kontrolle des Treibers 007Y-GAL4 zusammen mit der Struktur der Brücke gerettet werden. Eine Rettung der reduzierten Kompensation für optomotorische Stimuli in tay1 durch den Treiber mb247-GAL4 erlaubte eine Trennung von tay1 Defekten in der Brücke von Defekten in anderen Teilen des Gehirns. Trotz einer tay1-typischen unterbrochenen Brücke sind mit mb247-GAL4>UAS-tay gerettete Fliegen in der Lage eine Stimulation mit optomotorischen Reizen auf wildtypischem Niveau zu kompensieren. Diese Kompensation hängt nicht von den Pilzkörpern ab, da auf chemischen Wege pilzkörperablatierte Fliegen mit einer Expression von UAS-tay unter der Kontrolle von mb247-GAL4 sich trotz tay1 Hintergrund ebenfalls wildtypisch verhalten. Die wahrscheinlichsten Träger für diese Rettung sind noch nicht identifizierte Neurone im Fächerförmigen Körper des Zentralkomplexes, die mit 007Y-GAL4 und mb247-GAL4 angefärbt werden können. KW - Taufliege KW - Drosophila KW - Bewegungsverhalten KW - Mutante KW - Verhaltensanalyse KW - Drosophila KW - Behaviour KW - Locomotion Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-43666 ER - TY - THES A1 - Friedrich, Torben T1 - New statistical Methods of Genome-Scale Data Analysis in Life Science - Applications to enterobacterial Diagnostics, Meta-Analysis of Arabidopsis thaliana Gene Expression and functional Sequence Annotation T1 - Neue statistische Methoden für genomweite Datenanalysen in den Biowissenschaften - Anwendungen in der Enterobakteriendiagnostik, Meta-Analyse von Arabidopsis thaliana Genexpression und funktionsbezogenen Sequenzannotation N2 - Recent progresses and developments in molecular biology provide a wealth of new but insufficiently characterised data. This fund comprises amongst others biological data of genomic DNA, protein sequences, 3-dimensional protein structures as well as profiles of gene expression. In the present work, this information is used to develop new methods for the characterisation and classification of organisms and whole groups of organisms as well as to enhance the automated gain and transfer of information. The first two presented approaches (chapters 4 und 5) focus on the medically and scientifically important enterobacteria. Its impact in medicine and molecular biology is founded in versatile mechanisms of infection, their fundamental function as a commensal inhabitant of the intestinal tract and their use as model organisms as they are easy to cultivate. Despite many studies on single pathogroups with clinical distinguishable pathologies, the genotypic factors that contribute to their diversity are still partially unknown. The comprehensive genome comparison described in Chapter 4 was conducted with numerous enterobacterial strains, which cover nearly the whole range of clinically relevant diversity. The genome comparison constitutes the basis of a characterisation of the enterobacterial gene pool, of a reconstruction of evolutionary processes and of comprehensive analysis of specific protein families in enterobacterial subgroups. Correspondence analysis, which is applied for the first time in this context, yields qualitative statements to bacterial subgroups and the respective, exclusively present protein families. Specific protein families were identified for the three major subgroups of enterobacteria namely the genera Yersinia and Salmonella as well as to the group of Shigella and E. coli by applying statistical tests. In conclusion, the genome comparison-based methods provide new starting points to infer specific genotypic traits of bacterial groups from the transfer of functional annotation. Due to the high medical importance of enterobacterial isolates their classification according to pathogenicity has been in focus of many studies. The microarray technology offers a fast, reproducible and standardisable means of bacterial typing and has been proved in bacterial diagnostics, risk assessment and surveillance. The design of the diagnostic microarray of enterobacteria described in chapter 5 is based on the availability of numerous enterobacterial genome sequences. A novel probe selection strategy based on the highly efficient algorithm of string search, which considers both coding and non-coding regions of genomic DNA, enhances pathogroup detection. This principle reduces the risk of incorrect typing due to restrictions to virulence-associated capture probes. Additional capture probes extend the spectrum of applications of the microarray to simultaneous diagnostic or surveillance of antimicrobial resistance. Comprehensive test hybridisations largely confirm the reliability of the selected capture probes and its ability to robustly classify enterobacterial strains according to pathogenicity. Moreover, the tests constitute the basis of the training of a regression model for the classification of pathogroups and hybridised amounts of DNA. The regression model features a continuous learning capacity leading to an enhancement of the prediction accuracy in the process of its application. A fraction of the capture probes represents intergenic DNA and hence confirms the relevance of the underlying strategy. Interestingly, a large part of the capture probes represents poorly annotated genes suggesting the existence of yet unconsidered factors with importance to the formation of respective virulence phenotypes. Another major field of microarray applications is gene expression analysis. The size of gene expression databases rapidly increased in recent years. Although they provide a wealth of expression data, it remains challenging to integrate results from different studies. In chapter 6 the methodology of an unsupervised meta-analysis of genome-wide A. thaliana gene expression data sets is presented, which yields novel insights in function and regulation of genes. The application of kernel-based principal component analysis in combination with hierarchical clustering identified three major groups of contrasts each sharing overlapping expression profiles. Genes associated with two groups are known to play important roles in Indol-3 acetic acid (IAA) mediated plant growth and development as well as in pathogen defence. Yet uncharacterised serine-threonine kinases could be assigned to novel functions in pathogen defence by meta-analysis. In general, hidden interrelation between genes regulated under different conditions could be unravelled by the described approach. HMMs are applied to the functional characterisation of proteins or the detection of genes in genome sequences. Although HMMs are technically mature and widely applied in computational biology, I demonstrate the methodical optimisation with respect to the modelling accuracy on biological data with various distributions of sequence lengths. The subunits of these models, the states, are associated with a certain holding time being the link to length distributions of represented sequences. An adaptation of simple HMM topologies to bell-shaped length distributions described in chapter 7 was achieved by serial chain-linking of single states, while residing in the class of conventional HMMs. The impact of an optimisation of HMM topologies was underlined by performance evaluations with differently adjusted HMM topologies. In summary, a general methodology was introduced to improve the modelling behaviour of HMMs by topological optimisation with maximum likelihood and a fast and easily implementable moment estimator. Chapter 8 describes the application of HMMs to the prediction of interaction sites in protein domains. As previously demonstrated, these sites are not trivial to predict because of varying degree in conservation of their location and type within the domain family. The prediction of interaction sites in protein domains is achieved by a newly defined HMM topology, which incorporates both sequence and structure information. Posterior decoding is applied to the prediction of interaction sites providing additional information of the probability of an interaction for all sequence positions. The implementation of interaction profile HMMs (ipHMMs) is based on the well established profile HMMs and inherits its known efficiency and sensitivity. The large-scale prediction of interaction sites by ipHMMs explained protein dysfunctions caused by mutations that are associated to inheritable diseases like different types of cancer or muscular dystrophy. As already demonstrated by profile HMMs, the ipHMMs are suitable for large-scale applications. Overall, the HMM-based method enhances the prediction quality of interaction sites and improves the understanding of the molecular background of inheritable diseases. With respect to current and future requirements I provide large-scale solutions for the characterisation of biological data in this work. All described methods feature a highly portable character, which allows for the transfer to related topics or organisms, respectively. Special emphasis was put on the knowledge transfer facilitated by a steadily increasing wealth of biological information. The applied and developed statistical methods largely provide learning capacities and hence benefit from the gain of knowledge resulting in increased prediction accuracies and reliability. N2 - Die aktuellen Fortschritte und Entwicklungen in der Molekularbiologie stellen eine Fülle neuer, bisher kaum analysierter Daten bereit. Dieser Fundus umfasst unter Anderem biologische Daten zu genomischer DNA, zu Proteinsequenzen, zu dreidimensionalen Proteinstrukturen sowie zu Genexpressionsprofilen. In der vorliegenden Arbeit werden diese Informationen genutzt, um neue Methoden der Charakterisierung und Klassifizierung von Organismen bzw. Organismengruppen zu entwickeln und einen automatisierten Informationsgewinn sowie eine Informationsübertragung zu ermöglichen. Die ersten beiden vorgestellten Ansätze (Kapitel 4 und 5) konzentrieren sich auf die medizinisch und wissenschaftlich bedeutsame Gruppe der Enterobakterien. Deren Bedeutung für Medizin und Mikrobiologie geht auf ihre Funktion als kommensale Bewohner des Darmtraktes, ihre Nutzung als leicht kultivierbare Modellorganismen und auf die vielseitigen Infektionsmechanismen zurück. Obwohl bereits viele Studien über einzelne Pathogruppen mit klinisch unterscheidbaren Symptomen existieren, sind die genotypischen Faktoren, die für diese Unterschiedlichkeit verantwortlich zeichnen, teilweise noch nicht bekannt. Der in Kapitel 4 beschriebene umfassende Genomvergleich wurde anhand einer Vielzahl von Enterobakterien durchgeführt, die nahezu die gesamte Bandbreite klinisch relevanter Diversität darstellen. Dieser Genomvergleich bildet die Basis für eine Charakterisierung des enterobakteriellen Genpools, für eine Rekonstruktion evolutionärer Prozesse und Einflüsse und für eine umfassende Untersuchung spezifischer Proteinfamilien in enterobakteriellen Untergruppen. Die in diesem Kontext vorher noch nicht angewandte Korrespondenzanalyse liefert qualitative Aussagen zu bakteriellen Untergruppen und den ausschließlich in ihnen vorkommenden Proteinfamilien. In drei Hauptuntergruppen der Enterobakterien, die den Gattungen Yersinia und Salmonella sowie der Gruppe aus Shigella und E. coli entsprechen, wurden die jeweils spezifischen Proteinfamilien mit Hilfe statistischer Tests identifiziert. Zusammenfassend bilden die auf Genomvergleichen aufbauenden Methoden neue Ansatzpunkte, um aus der Übertragung der bekannten Funktionalität einzelner Proteine auf spezifische, genotypische Besonderheiten bakterieller Gruppen zu schließen. Aufgrund ihrer hohen medizinischen Relevanz war die Typisierung enterobakterieller Isolate entsprechend ihrer Pathogenität Ziel zahlreicher Studien. Die Microarray-Technologie bietet ein schnelles, reproduzierbares und standardisierbares Hilfsmittel für bakterielle Typisierung und hat sich in der Bakteriendiagnostik, Risikobewertung und Überwachung bewährt. Das in Kapitel 5 beschriebene Design eines diagnostischen Microarray beruht auf einer großen Anzahl verfügbarer Genomsequenzen von Enterobakterien. Ein hocheffizienter String-Matching-Algorithmus ist die Grundlage einer neuartigen Strategie der Sondenauswahl, die sowohl kodierende als auch nicht-kodierende Bereiche genomischer DNA berücksichtigt. Im Vergleich zu Diagnostika, die ausschließlich auf Virulenz-assoziierten Sonden beruhen, verringert dieses Prinzip das Risiko einer inkorrekten Typisierung. Zusätzliche Sonden erweitern das Anwendungsspektrum auf eine simultane Diagnostik der Antibiotikaresistenz bzw. eine Überwachung der Resistenzausbreitung. Umfangreiche Testhybridisierungen belegen eine überwiegende Zuverlässigkeit der Sonden und vor allem eine robuste Klassifizierung enterobakterieller Stämme entsprechend der Pathogruppen. Die Tests bilden zudem die Grundlage für das Training eines Regressionsmodells zur Klassifizierung der Pathogruppe und zur Vorhersage der Menge hybridisierter DNA. Das Regressionsmodell zeichnet sich durch kontinuierliche Lernfähigkeit und damit durch eine Verbesserung der Vorhersagequalität im Prozess der Anwendung aus. Ein Teil der Sonden repräsentiert intergenische DNA und bestätigt infolgedessen die Relevanz der zugrunde liegenden Strategie. Die Tatsache, dass ein großer Teil der von den Sonden repräsentierten Gene noch nicht annotiert ist, legt die Existenz bisher unentdeckter Faktoren mit Bedeutung für die Ausbildung entsprechender Virulenz-Phänotypen nahe. Ein weiteres Haupteinsatzgebiet von Microarrays ist die Genexpressionsanalyse. Die Größe von Genexpressionsdatenbanken ist in den vergangenen Jahren stark gewachsen. Obwohl sie eine Fülle von Expressionsdaten bieten, sind Ergebnisse aus unterschiedlichen Studien weiterhin schwer in einen übergreifenden Zusammenhang zu bringen. In Kapitel 6 wird die Methodik einer ausschließlich datenbasierten Meta-Analyse für genomweite A. thaliana Genexpressionsdatensätze dargestellt, die neue Erkenntnisse über Funktion und Regulation von Genen verspricht. Die Anwendung von Kernel-basierter Hauptkomponentenanalyse in Kombination mit hierarchischem Clustering identifizierte drei Hauptgruppen von Kontrastexperimenten mit jeweils überlappenden Expressionsmustern. In zwei Gruppen konnten deregulierte Gene wichtigen Funktionen bei Indol-3-Essigsäure (IAA) vermitteltem Pflanzenwachstum und -entwicklung sowie pflanzlicher Pathogenabwehr zugeordnet werden. Bisher funktionell nicht näher charakterisierte Serin-Threonin-Kinasen wurden über die Meta-Analyse mit der Pathogenabwehr assoziiert. Grundsätzlich kann dieser Ansatz versteckte Wechselbeziehungen zwischen Genen aufdecken, die unter verschiedenen Bedingungen reguliert werden. Bei der funktionellen Charakterisierung von Proteinen oder der Vorhersage von Genen in Genomsequenzen werden Hidden-Markov-Modelle (HMMs) eingesetzt. HMMs sind technisch ausgereift und in der computergestützten Biologie vielfach eingesetzt worden. Trotzdem birgt die Methodik das Potential zur Optimierung bezüglich der Modellierung biologischer Daten, die hinsichtlich der Längenverteilung ihrer Sequenzen variieren. Untereinheiten dieser Modelle, die Zustände, repräsentieren über ihre individuelle Verweildauer zugrunde liegende Verteilungen von Sequenzlängen. Kapitel 7 stellt eine Methode zur Anpassung einfacher HMM-Topologien an biologische Daten, die glockenkurvenartige Längenverteilungen zeigen, vor. Die Modellierung solcher Verteilungen wird dabei durch eine serielle Verkettung vervielfältigter Zustände gewährleistet, ohne dass die Klasse herkömmlicher HMMs verlassen wird. Auswertungen der Modellierungsleistung bei unterschiedlich stark optimierten HMM-Topologien unterstreichen die Bedeutung der entwickelten Topologieoptimierung. Zusammenfassend wird hier eine generelle Methodik beschrieben, die die Modelleigenschaften von HMMs über Topologieoptimierungen verbessert. Die Parameter dieser Optimierung werden mit Hilfe von Maximum-Likelihood und einem leicht einzubindenden Momentschätzer bestimmt. In Kapitel 8 wird die Anwendung von HMMs zur Vorhersage von Interaktionsstellen in Proteindomänen beschrieben. Wie bereits gezeigt wurde, sind solche Stellen aufgrund einer variablen Konserviertheit ihrer Position und ihres Typs schwer zu bestimmen. Eine Vorhersage von Interaktionstellen in Proteindomänen wird über die Definition einer neuen HMM-Topologie erreicht, die sowohl Sequenz- als auch Strukturdaten einbindet. Interaktionsstellen werden mit einem Posterior-Decoding-Algorithmus vorhergesagt, der zusätzliche Informationen über die Wahrscheinlichkeit einer Interaktion für alle Sequenzpositionen bereitstellt. Die Implementierung der Interaktionsprofil-HMMs (ipHMMs) basiert auf den etablierten Profil-HMMs und erbt deren Effizienz und Sensitivität. Eine groß angelegte Vorhersage von Interaktionsstellen mit ipHMMs konnte mutationsbedingte Fehlfunktionen in Proteinen erklären, die mit vererbbaren Krankheiten wie unterschiedlichen Tumortypen oder Muskeldystrophie assoziiert sind. Wie Profile-HMMs sind auch ipHMMs für groß angelegte Anwendungen geeignet. Insgesamt verbessert die HMM-gestützte Methode sowohl die Vorhersagequalität für Interaktionsstellen als auch das Verständnis molekularer Hintergründe bei vererbbaren Krankheiten. Im Hinblick auf aktuelle und zukünftige Anforderungen stelle ich in dieser Arbeit Lösungsansätze für eine umfassende Charakterisierung großer Mengen biologischer Daten vor. Alle beschriebenen Methoden zeichnen sich durch gute Übertragbarkeit auf verwandte Probleme aus. Besonderes Augenmerk wurde dabei auf den Wissenstransfer gelegt, der durch einen stetig wachsenden Fundus biologischer Information ermöglicht wird. Die angewandten und entwickelten statistischen Methoden sind lernfähig und profitieren von diesem Wissenszuwachs, Vorhersagequalität und Zuverlässigkeit der Ergebnisse verbessern sich. KW - Genomik KW - Hidden-Markov-Modell KW - Enterobacteriaceae KW - Genexpression KW - Microarray KW - Sequenzanalyse KW - diagnostischer Microarray KW - Sequence Analysis KW - diagnostic Microarray Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-39858 ER - TY - THES A1 - Basile, Rebecca T1 - Thermoregulation and Resource Management in the Honeybee (Apis mellifera) T1 - Thermoregulation und Ressourcenmanagment bei der Honigbiene (Apis mellifera) N2 - Ein grundlegender Faktor, der für das Überleben einer Kolonie sozialer Insekten ausschlaggebend ist, liegt in der Fähigkeit Nahrung durch sogenannte „Trophallaxis“ auszutauschen. Diese Fütterungskontakte sorgen für die gleichmäßige Verteilung der Nahrung innerhalb der Kolonie und werden als einer der Grundpfeiler der Sozialität der Staatenbildenden Insekten erachtet. Im Fall der Honigbienen finden diese Kontakte in vollkommener Dunkelheit statt. Damit es in dieser Situation überhaupt zum Nahrungsaustausch kommen kann, sind die Antennen von großer Wichtigkeit. Ein erster Schritt in den Verhaltensweisen, die der Rezipient eines trophallaktischen Kontaktes zeigt, ist der Kontakt einer Antennenspitze mit den Mundwerkzeugen des Donoren, da sich dort die regurgitierte Nahrung befindet. Diese Berührung hat aufgrund der gustatorischen Sensibilität der Antenne den Zweck, das angebotene Futter zu „erschmecken“. Die rechte Antenne wird vom Rezipienten eines trophallaktischen Kontakts signifikant häufiger eingesetzt als die linke Antenne. Die Präferenz für die rechte Antenne bleibt dabei auch erhalten, wenn ein Teil der Antennengeisel abgetrennt wurde, also die sensorischen Fähigkeiten der rechten Antenne stark beeinträchtigt wurden. Der Grund für die Präferenz der rechten Antenne könnte ihrer erhöhten Sensibilität gegenüber Zuckerwasser zugrunde liegen, da die rechte Antenne im Laborversuch signifikant stärker auf Stimulationen mit Zuckerwasser verschiedener Konzentrationen reagierte als die linke. Trophallaktische Kontakte sichern Individuen innerhalb einer Kolonie den Zugang zur lebenswichtigen Nahrung. Im Beispiel der Honigbienen ist ständige Zugriff auf Nahrung besonders wichtig, da es sich um ein heterothermes Tier handelt, das die Fähigkeit besitzt, aktiv seine Körpertemperatur zu regulieren. Obgleich jedes Individuum in der Lage ist, seine Körpertemperatur den eigenen Bedürfnissen anzupassen, ist diese Fähigkeit streng durch den in der Nahrung aufgenommenen Zucker reguliert. Im Gegensatz zu den Säugetieren oder Vögeln, die für eine Erhöhung des Blutzuckerspiegels auch auf Fett- oder Eiweißressourcen zurückgreifen können, ist die Honigbiene auf die Glucose aus der aufgenommenen Nahrung angewiesen. Die Ergebnisse dieser Untersuchung zeigen, dass der Zuckergehalt der aufgenommenen Nahrung positiv mit der Thoraxtemperatur der Bienen korreliert. Dieser Zusammenhang tritt auf, selbst wenn keine Wärmeerzeugung für die Brutpflege oder für das Erwärmen der Wintertraube notwendig ist und die Tiere außerhalb des Stockes ohne eigentliche Notwendigkeit für die Wärmeerzeugung in einem Käfig gehalten werden. Die Ergebnisse der Untersuchung zeigen, dass die Rezipienten beim Nahrungsaustausch eine signifikant höhere Thoraxtemperatur haben als die Donoren. Außerdem zeigen die Rezipienten nach der Fütterung signifikant häufiger Brutwärmeverhalten als die Donoren. Letztere haben eine signifikant niedrigere Thoraxtemperatur als die Rezipienten und zeigen eine Verhaltenstendenz, häufig zwischen Brutbereich und Honiglager hin- und her zu pendeln. Dabei nehmen sie im Honiglager Honig in ihren Kropf auf und füttern mit dieser Nahrung danach Bienen im Brutbereich. Außerdem zeigen die Ergebnisse, dass es einen wärmegesteuerten Auslösemechanismus gibt, der den Donoren und Rezipienten des trophallaktischen Kontakts dazu verhilft, trotz der Dunkelheit des Stocks praktisch verzögerungsfreie Nahrungsübertragung am Ort des höchsten Energieverbrauchs zu gewährleisten. Das Hervorwürgen von Nahrung angesichts einer Wärmequelle könnte seinen Ursprung in einer Beschwichtigungsgeste haben. Aggressive Tiere zeigen neben sichtbaren aggressiven Verhalten auch durch ihre erhöhte Körpertemperatur, dass sie bereit sind sich auf einen Kampf einzulassen. Die Temperaturerhöhung eines aggressiven Tieres beruht dabei auf der erhöhten Muskelaktivität, die vor allem bei Insekten dazu nötig ist, einen entsprechende Reaktion im Falle eines Kampfes oder der Flucht zeigen zu können. Wird ein Individuum mit Aggression konfrontiert, so bleibt ihm die Wahl sich auf einen Kampf einzulassen, zu flüchten oder durch eine Beschwichtigungsgeste eine Deeskalation der Situation einzuleiten. Besonders häufig wird für diesen Zweck Nahrung regurgitiert und dem dominanteren Tier angeboten, um einem Konflikt aus dem Weg zu gehen. Die Fähigkeit, Arbeiterinnen mit kleinen Portionen konzentrierter Nahrung zu versorgen trägt zu einer ökonomischen Verteilung der Ressourcen bei, die mit den physiologischen Bedürfnissen der Honigbienen konform geht und die ökologischen Erfordernisse des Stockes erfüllt. Das daraus resultierende Managementsystem, welches sparsam mit den Ressourcen haushaltet und auf die individuellen Bedürfnisse jeder einzelnen Biene einzugehen vermag, könnte ein Grund für die Fähigkeit der Honigbienen zur Entwicklung mehrjähriger Kolonien sein, die, anders als Hummeln oder Wespen, auch den Winter in gemäßigten Zonen als Gemeinschaft zu überstehen vermögen. N2 - Like many other social insect societies, honeybees collectively share the resources they gather by feeding each other. These feeding contacts, known as trophallaxis, are regarded as the fundamental basis for social behavior in honeybees and other social insects for assuring the survival of the individual and the welfare of the group. In honeybees, where most of the trophallactic contacts are formed in the total darkness of the hive, the antennae play a decisive role in initiation and maintenance of the feeding contact, because they are sensitive to gustatory stimuli. The sequences of behaviors performed by the receiver bees at the beginning of a feeding contact includes the contact of one antenna with the mouthparts of a donor bee where the regurgitated food is located. The antennal motor action is characterized by behavioral asymmetry, which is novel among communicative motor actions in invertebrates. This preference of right over left antenna is without exception even after removal of the antennal flagellum. This case of laterality in basic social interaction might have its reason in the gustatory asymmetry in the antennae, because the right antenna turns out to be significantly more sensitive to stimulation with sugar water of various concentrations than the left one. Trophallactic contacts which guarantee a constant access to food for every individual in the hive are vitally important to the honeybee society, because honeybees are heterothermic insects which actively regulate their thoracic temperature. Even though the individual can regulate its body temperature, its heating performance is strictly limited by the amount of sugar ingested. The reason for this is that honeybees use mostly the glucose in their hemolymph as the energy substrate for muscular activity, and the heat producing flight muscles are among the metabolically most active tissues known. The fuel for their activity is honey; processed nectar with a sugar content of ~80% stored in the honeycomb. The results show that the sugar content of the ingested food correlates positively with the thoracic temperature of the honeybees even if they are caged and show no actual heating-related behavior as in brood warming or heating in the centre of the winter cluster. Honeybees actively regulate their brood temperature by heating to keep the temperature between 33 °C to 36 °C if ambient temperatures are lower. Heating rapidly depletes the worker’s internal energy; therefore the heating performance is limited by the honey that is ingested before the heating process. This study focused on the behavior and the thoracic temperature of the participants in trophallactic food exchanges on the brood comb. The brood area is the centre of heating activity in the hive, and therefore the region of highest energy demand. The results show that the recipients in a trophallactic food exchange have a higher thoracic temperature during feeding contacts than donors, and after the feeding contact the former engage in brood heating more often. The donor bees have lower thoracic temperature and shuttle constantly between honey stores and the brood comb, where they transfer the stored honey to heating bees. In addition, the results show a heat-triggered mechanism that enables donor and recipient to accomplish trophallactic contacts without delay in the total darkness of the hive in the brood area as the most energy consuming part of the hive. Providing heat-emitting workers with small doses of high performance fuel contributes to an economic distribution of resources consistent with the physiological conditions of the bees and the ecological requirements of the hive, resulting in a highly economical resource management system which might be one of the factors favouring the evolution of perennial bee colonies in temperate regions. The conclusion of these findings suggests a resource management strategy that has evolved from submissive placation behavior as it is seen in honeybees, bumblebees and other hymenopterans. The heat-triggered feedback mechanism behind the resource management of the honeybee´s thermoregulatory behavior reveals a new aspect of the division of labor and a new aspect of communication, and sheds new light on sociality in honeybees. KW - Biene KW - Thermoregulation KW - Ressourcenmanagement KW - Sozialität KW - Hautflügler KW - Honeybee KW - Thermoregulation KW - Resource Managment KW - Sociality KW - Hymenoptera Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-39793 ER - TY - THES A1 - Mannefeld, Mirijam T1 - Role of the human LIN complex in DNA damage induced regulation of gene expression T1 - Die Rolle des humanen LIN Komplex in der Genregulation nach DNA Schädigung N2 - In jeder menschlichen Zelle entstehen täglich ca. 10.000 – 150.000 endogene DNA Schäden. Eine Anhäufung dieser Läsionen kann zu genetischer Instabilität führen und dadurch zur Krebsentwicklung beitragen. Daher ist eine schnelle DNA Schadensantwort nötig, um schwerwiegende Folgen für die Zelle zu vermeiden. Da bekannt ist, dass der Multiproteinkomplex LINC (auch humaner dREAM-Komplex genannt) an der transkriptionellen Regulation mitotischer und G2-spezifischer Gene beteiligt ist, sollte in dieser Arbeit seine Beteiligung an der DNA Schadensantwort genauer untersucht werden. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass in normal wachsenden Zellen B-MYB an den LINC-Kernkomplex bindet, welcher sich aus 5 Proteinen zusammensetzt: LIN-9, LIN-54, LIN-52, LIN-37 und RbAp48. Treten DNA Schäden auf, dissoziiert B-MYB vom LINC Kernkomplex wobei gleichzeitig die Bindung von p130 und E2F4 an LINC induziert wird. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass der Signalweg, der die LINC Umlagerung vermittelt, sowohl p53- als auch p21-abhängig ist. p53 negative Zellen können nach Schädigung der DNA weder einen G1 Block induzieren noch einen G2 Block langfristig aufrechterhalten. Eine Erklärung für diese Schwächung des G2 Arrests liefern Daten dieser Arbeit: Da in DNA geschädigten p53 -/- Zellen keine LINC Umlagerung beobachtet werden kann und zusätzlich B-MYB verstärkt an LINC und die Zielpromotoren bindet, kommt es zu einer erhöhten G2/M Genexpression. Dies resultiert häufig in einem verfrühten Wiedereintritt in den Zellzyklus („checkpoint adaptation“). Eine Daten-Analyse primärer Brustkrebstumore zeigte außerdem, dass erhöhte B-MYB Genexpressionslevel mit einer erhöhte Rückfallgefahr und einer schlechten Prognose korrelieren, was möglicherweise auf die Funktion von B-MYB während der „checkpoint adaptation“ zurückzuführen ist. Schlussendlich lassen die Ergebnisse dieser Arbeit vermuten, dass die Hemmung der B-MYB Funktion in solchen Tumoren, die p53 Mutationen tragen, die Wahrscheinlichkeit eines Behandlungserfolges vergrößern und die Wahrscheinlichkeit eines Rückfalls senken könnte. N2 - Around 10.000 – 150.000 endogenous DNA damage-induced lesions occur in a human body per day and cell. Accumulation of unrepaired lesions can lead to aneuploidy and the loss of genomic integrity which in turn contributes to tumor formation. Therefore, an efficient DNA damage response has to be initiated, in the end leading to cell cycle inhibition and induction of repair. Since it is known that a recently characterized human multiprotein complex named LINC (or human dREAM) together with B-MYB is involved in the regulation of G2/M gene expression (Plk1, cyclin B1, cdc2 etc.), its function in the DNA damage response was analyzed in this study. In growing cells B-MYB is associated to the LIN core complex which consists of 5 different proteins named LIN-9, LIN-54, LIN-52, LIN-37 and RbAp48. After induction of DNA damage B-MYB leaves the complex and binding of E2F4 and p130 to LINC is induced. Importantly, the upstream pathway leading to LINC rearrangement is dependent on the activation of p53 and p21. Interestingly, p53 -/- cells solely have the potential to block in the G2 phase of the cell cycle, thereby making them vulnerable for errors during G2 arrest induction or maintenance. Here I demonstrate that LINC rearrangement is absent in p53 -/- cells and that B-MYB/LINC binding to target gene promoters is increased. This in turn leads to an increased G2/M gene expression after DNA damage induction and triggers premature cell cycle re-entry (checkpoint adaptation). Significantly, B-MYB expression is increased in p53 mutated primary breast cancer tumors and correlates with poor prognosis and reoccurrence probably due to its function in checkpoint adaptation. This study gives evidence that inhibition of B-MYB gene expression or B-MYB function in p53 mutant tumors could be a good choice for adjuvant therapy. KW - Zellzyklus KW - DNS-Schädigung KW - Myb KW - Mitose KW - Genregulation KW - LIN-9 KW - LINC KW - DNA-Schadensantwort KW - Checkpoint recovery KW - Checkpoint adaptation KW - LIN-9 KW - LINC KW - DNA damage response KW - Checkpoint recovery KW - Checkpoint adaptation Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-39261 ER - TY - THES A1 - Kläckta, Christian T1 - Biochemische und –physikalische Charakterisierung von rekombinanten Porinen aus den beiden pathogenen Bakterien Nocardia farcinica und Vibrio cholerae sowie von nativen Porinen aus drei Streptomyces Arten N2 - Die vorliegende Dissertation beschreibt detaillierte biochemische und biophysikalische Untersuchungen von rekombinanten Porinen aus den beiden pathogenen Bakterien Nocardia farcinica und Vibrio cholerae sowie von nativen Porinen aus drei Streptomyces Arten. Für die beiden pathogenen Vertreter sind bereits impermebable Zellwandstrukturen beschrieben worden (Daffe et al., 1993; Rodriguez-Torres et al., 1993). Für Streptomyces Arten ist keine vergeichbare, definierte äußere Zellwandbarriere bekannt. Im Fall von S. griseus konnten dennoch undefinierte, kovalente Lipidverknüpfungen mit der Peptidoglykanschicht nachgewiesen werden (Kim et al., 2001). Daher besteht die Notwendigkeit des Transports von Nährstoffen und anderer Moleküle auch bei Streptomyces Arten durch porenformende Proteine, so genannte Porine. Unter Porinen versteht man wassergefüllte Kanäle, die in zwei Klassen unterteilt werden können: allgemeine Diffusionsporen und substratspezifische Porine. Allgemeine Diffusionsporen filtern entsprechend der molekularen Masse der gelösten Substrate und weisen ein lineares Verhältnis zwischen Translokationsrate und Substratkonzentrationsgradient auf. Dagegen kann der Transport bestimmter Substanzen durch spezifische Porine mit einer Substrat-Bindestelle im Kanal durch die Michaelis-Menten-ähnliche Kinetik beschrieben werden. Diese Kanäle ermöglichen den schnellen Influx bestimmter Klassen von Substraten. N2 - This thesis describes detailed biochemical and biophysical investigations of recombinant porins of both pathogenic bacteria Nocardia farcinica and Vibrio cholerae besides native porins of three Streptomyces strains. For both pathogenic strains used in this work impermeable cell-wall structures have already been described (Daffe et al., 1993; Rodriguez-Torres et al., 1993). However, there is little known about cell-wall composition in Streptomyes strains yet. It was shown that Streptomyces griseus contains lipids that are covalently linked to the peptidoglycan layer (Kim et al., 2001). Therefore it is conceivable that the transport of nutrients and other molecules across the outer membrane of Streptomyces strains is also enabled by pore-forming proteins, so called porins. Porins are water-filled channels which can be subdivided into two different classes, general diffusion pores and substrate-specific porins. General diffusion pores sort mainly according to the molecular mass of the solutes and show a linear relation between translocation rate and solute concentration gradient. Specific porins with a substrate-binding site inside the channel exhibit Michaelis-Menten-like kinetics for the transport of certain solutes and are responsible for the rapid uptake of different classes of solutes. KW - Porine KW - Mycolata KW - Bakterien KW - Porins KW - mycolata KW - bacteria Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-38910 ER - TY - THES A1 - Höhn, Katharina T1 - Genotyp-Phänotyp Korrelation bei Fanconi Anämie T1 - Genotype-Phenotype Correlation of Fanconi Anemia N2 - Die Fanconi Anämie (FA) stellt eine sowohl genetisch als auch phänotypisch äußerst heterogene, autosomal rezessiv und X-chromosomal vererbte Erkrankung dar. Sie ist gekennzeichnet durch chromosomale Instabilität, ein chronisch progredientes Knochenmarkversagen, multiple kongenitale Fehlbildungen und eine Prädisposition zu diversen Neoplasien. Auf zellulärer Ebene ist die FA durch eine erhöhte spontane Chromosomenbrüchigkeit sowie einer Hypersensitivität gegenüber DNA-schädigenden Agenzien charakterisiert. Bislang konnten 13 Komplementations-gruppen (FA-A bis FA-N) und ihre jeweiligen Gene identifiziert werden. Die FA-Proteine spielen eine wichtige Rolle bei der Reparatur von DNA-Doppelstrang-brüchen. Die breite genetische Heterogenität der Fanconi Anämie und die große Anzahl privater Mutationen, aufgrund derer kaum interindividuelle Vergleiche möglich sind, erschweren eine Genotyp-Phänotyp Korrelation ebenso wie der compound-heterozygote Mutationsstatus vieler FA-Patienten. Bisherige Untersuchungen weisen darauf hin, dass die Art der jeweiligen Mutation einen größeren Einfluß auf die phänotypische Ausprägung der Erkrankung hat als die Art des betroffenen Gens. Zusätzlich zeichnet die Fanconi Anämie eine große phänotypische Variabilität aus, die sich in höchst unterschiedlichen Krankheitsausprägungen und –verläufen äußert. Um aussagekräftige Genotyp-Phänotyp Korrelationen etablieren zu können, bedarf es einer ausreichenden Anzahl von FA-Patienten, bei denen sowohl die Komplementationsgruppe als auch die zugrunde liegende Mutation eindeutig definiert wurden. In der vorliegenden Arbeit wurden exemplarisch die Krankheitsverläufe einiger Patienten (4 x FA-A, 1 x FA-B, 3 x FA-C, 1 x FA-D2 und 2 x FA-G) analysiert und mit den jeweiligen molekulargenetischen Befunden korreliert. Im Anschluss daran wurden in der Literatur beschriebene Genotyp-Phänotyp Korrelationen erläutert, verschiedene Mechanismen der phänotypischen Variabilität dargestellt und abschließend prägnante Kasuistiken nochmals hervorgehoben. N2 - Fanconi anemia (FA) is an autosomal recessive disorder that is defined by cellular hypersensitivity to DNA crosslinking agents, and is characterized by the variable presence of congenital malformations, progressive bone-marrow failure, and predisposition to leukemia and solid tumors. There are at least different 13 complementation groups. FA genes are thought to play an important role in the removal of DNA interstrand crosslinks. Genotype-phenotype correlations are further complicated by the obvious heterogeneity of the mutational spectrum within each FA gene, the private character of mutations and the high prevalence of compound heterozygosity. Studies so far indicate that the nature of the underlying mutation is more important than the underlying complementation group. Furthermore there is a wide variation of phenotypes. Clinical course and severity of FA vary strongly between and even within families. Any definite conclusion about genotype-phenotype correlation needs a sufficient number of FA patients whose underlying complementation group and mutation has been identified and whose clinical course has been analysed equally. The present dissertation represents a first step in this direction. KW - Fanconi-Anämie KW - Genetische Variabilität KW - Phänotypische Heterogenität KW - Genotyp-Phänotyp Korrelation KW - Fallbeispiele KW - Fanconi anemia KW - genetic heterogeneity KW - phenotypic heterogeneity KW - genotype-phenotype correlation KW - case reports Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-37542 ER - TY - THES A1 - Herrmann, Petra T1 - Entwicklung und Evaluierung neuer Methoden zur Analyse des Proteoms von Listeria monocytogenes in infizierten Wirtszellen T1 - Development and evaluation of new methods to analyse the proteome of Listeria monocytogenes in infected host cells N2 - In dieser Arbeit wurden neue Methoden zur Analyse des Proteoms von Listeria monocytogenes in infizierten Wirtszellen entwickelt und evaluiert. Proteomische Analysen können im Vergleich zu transkriptomischen Analysen durch Erfassung von Proteinmengen und eventuell auch posttranslationalen Modifikationen, sowie von Abbauprozessen ein genaueres Abbild des Funktionszustands einer Zelle unter unterschiedlichen Umweltbedingungen darstellen. Das Hauptproblem bei proteomischen Untersuchungen an in eukaryontischen Wirtszellen gewachsenen Bakterien, nämlich die Überlagerung des bakteriellen Proteinmusters durch die im Überschuss vorhandenen Wirtszellproteine, musste in dieser Arbeit überwunden werden. Es wurde eine Methode etabliert, intrazellulär gewachsene Bakterien über Bindung an paramagnetische Partikel („Beads“) und anschließende Magnetseparation selektiv von Wirtszellkomponenten abzutrennen. Dabei wurden drei Beads-Varianten mit unterschiedlicher Beschichtung gewählt: Dynabeads anti Listeria (Dynal, Oslo), Kieselgel  Magnetit Beads (MERCK in Entwicklung), Dynabeads M-270 Epoxy – CBD Beads (Beschichtung mit Phagenlysin Ply 118). Hierbei konnte nur für die Kieselgel + Magnetit Beads eine hinreichende Isolierungsrate für die Methode der 2-D-Gelelektrophorese von 6-7* 10**7 Listerien/ Zellkulturflasche erreicht werden. Im 2-D-Proteingel zeigte sich jedoch eine starke Streifenbildung, wodurch sich dieser Ansatz als nicht auswertbar erwies. In einem alternativen Ansatz gelang es, aus Infektionen an J774-Makrophagen, die Listerien mittels konsekutiver Waschschritte von Wirtszellproteinen aufzureinigen. Es konnten aus den Infektionen 30-50 µg listerielles Protein isoliert und zweidimensional aufgetrennt werden, wobei das Proteinpattern qualitativ eindeutig dem von in vitro gewachsenen Listeria monocytogenes entsprach. Auf diese Weise konnten 38 Proteine von Listeria monocytogenes, welche von Listerien während der Infektion in Makrophagen induziert oder reprimiert werden anhand der Deta-2-D Software identifiziert, quantifiziert und statistisch ausgewertet werden. Für einige der hier mittels der neu entwickelten Methode identifizierten Proteine konnte anhand der der vorliegenden Literatur (zu Transkriptom, Sekretom, Virulenz von Listeria) bereits eine Beteiligung am Virulenzgeschehen nachgewiesen werden. Zum jetzigen Zeitpunkt unterliegt die proteomische Analyse einigen Limitierungen, z.B. beim Nachweis von schwach exprimierten, stark alkalischen, stark hydrophoben, hochmolekularen und niedermolekularen Proteinen, so dass die derzeitige Methodik noch nicht das gesamte Proteom abdecken kann. Dass die „klassischen“ Virulenzfaktoren pathogener Listerien, Listeriolysin O (LLO), die Phospholipasen PlcA und PlcB, sowie ActA hier nicht erfasst wurden, ist darin begründet, dass es sich um sekretierte Proteine handelt. Besondere Bedeutung kommt der Beobachtung zu, dass nur in ganz wenigen Fällen (z.B. Pgm, ClpP, Pgi, TrxB, MurC) die nachgewiesenen intrazellulären Veränderungen der Proteinmenge mit den von anderen publizierten Transkriptionsdaten übereinstimmen. Diese Diskrepanzen stellen keine Artefakte dar, sondern sind durch intrazelluläre posttranskriptionelle Mechanismen begründet. Insgesamt zeigte auch diese Proteinanalyse , dass bei Replikation von Listeria monocytogenes im Cytosol eukaryontischer Wirtszellen zahlreiche komplexe Anpassungen von teils zentralen aber auch peripheren Stoffwechselwegen und Biosynthesen der Bakterien an dieses spezielle Milieu ablaufen. N2 - In this thesis new methods to analyse the proteome of Listeria monocytogens in infected host cells have been developed. Proteomic analyses, in comparison to transcriptomic analysis, by their capacity to detect actual protein amounts and possibly post translational modifications as well as degradation processes are able to give a more precise picture of the functional status of a cell under diverse environmental conditions.The main problem of proteomic analyses, with bacteria grown inside eukaryotic host cells, the superimposition of the bacterial protein pattern by the exceedingly present host cell proteins had to be overcome. Methods have been established to selectively isolate intracellularly grown bacteria by binding to paramagnetic beads and subsequent magnetic separation from the host cell components. At this three differently coated types of beads [Dynabeads anti Listeria (Dynal, Oslo), silica gel  magnetite Beads (MERCK under way), Dynabeads M-270 Epoxy – CBD Beads (coated with phagolysine Ply 118)] have been used. At this it was only possible for the “Kieselgel + Magnetit Beads” to reach a sufficient isolation rate for the method of 2-D-electrophoresis of 6-7 * 10**7 Listeria/ cell culture flask. In the 2-D-proteingel there showed up a bad streaking whereby this approach proved not to be evaluable. In an alternative approach at infections of J774-macrophages it succeded to purify the listeria by consecutive washing steps out of the host cells. It was possible to isolate 30-50 µg listerial proteins out of infections in J774-macrophages and to have them two-dimensionally separated whereby the protein pattern qualitatively clearly matched that of in vitro grown Listeria monocytogenes. In such way it was possible to identify 38 proteins of Listeria monocytogenes, which have been induced or suppressed during the infections in macrophages and to have them identified, quantified and statistically evaluated with the Delta-2-D software. There was already evidence for some of the proteins that have been identified by the newly established method, on the basis of the present literature (on transcriptome, secretome, virulence of Listeria), for a participation in the course of infection. Up to now the proteomic analysis is subject to some restrictions for example in the detection of weakly expressed, strong alkaline, strong hydrophobic, high-molecular weight and low-molecular weight proteins so that the current methodology can not cover the whole proteome. That the “classic” virulence factors of pathogenic listeria, listeriolysin O (LLO), the phospholipases PlcA and PlcB, as well as ActA are not captured is caused by the fact that these proteins are secreted. Of particular importance is the observation that in very little cases (e.g. Pgm, ClpP, Pgi, TrxB, MurC) the detected intracellular changes in protein amount are consistent with the published transcription data. These discrepancies constitute no artefacts but are caused by intracellular posttranscriptional mechanisms. Altogether also this protein analysis reveals that during replication of Listeria monocytogenes in the eucaryotic host cell cytosol numerous complex adaptations of partly central but also peripheral metabolic pathways and biosyntheses to that specific milieu take place. KW - Listeria monocytogenes KW - Methode KW - Proteomanalyse KW - Zweidimensionale Elektrophorese KW - Virulenz KW - Infektion KW - Wirtszellen KW - J774-Makrophagen KW - paramagnetische Beads KW - Proteinidentifizierung KW - Quantifizierung KW - statistische Auswertung KW - methods KW - protein analysis KW - infection KW - virulence KW - statistical evaluation Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-37500 ER - TY - THES A1 - Pfrommer, Albrecht T1 - Seed dispersal ecology of Leonia cymosa (Violaceae) in the rain forest of Eastern Ecuador T1 - Ökologie der Ausbreitung der Samen von Leonia cymosa (Violaceae) im Regenwald von Ost-Ekuador N2 - Leonia cymosa (Violaceae) ist ein Baum der unteren Waldschicht im Amazonischen Regenwald. Meine Probenflächen befanden sich in der „Reserva Faunistica Cuyabeno“ im nord-östlichen Ecuador: Meine Untersuchung hatte das Ziel, die Variation von Baummerkmalen zu beschreiben und zu klären, ob und wie die Fruchtentnahme aus den einzelnen Bäumen durch Fruchtfresser mit den Baummerkmalen zusammenhängt. Die mittlere Höhe einer fruchttragenden L. cymosa war 6,6 m (Min. 2 m, Max. 12,6 m). Der Median der Individuendichte lag bei 11,8 Bäumen pro Hektar. Die Bäume wuchsen überwiegend in Gruppen, die aus Bäumen verschiedener Höhe bestanden. L. cymosa blühte zwei Mal im Jahr, sowohl im späten Februar bis März, als auch im Oktober. Die daraus jeweils folgenden Fruchtsaisons erstreckten sich auf die Monate August/September und März bis Mai. Das Fruchtfleisch von L. cymosa enthielt die Zucker Fruktose, Glucose und Saccharose, Proteine, aber keine Lipide. Es gab es signifikante Unterschiede zwischen Bäumen bei allen untersuchten Nährstoffbestandteilen. Die saisonale Produktivität der überwachten Bäume lag im Median bei 45 (1999, n= 57) bzw. bei 36 (2000, n=92) reifen Früchten. Das maximale Fruchtangebot eines Baumes zum Zeitpunkt einer Fruchtzählung lag bei 324 reifen Früchten Schwarzrückentamarine (Saguinus nigricollis, Callitrichidae) und Totenkopfäffchen (Saimiri sciureus, Cebidae), sowie möglicherweise eine unidentifizierte nachtaktive Tierart, konsumierten die Früchte von L. cymosa in meinem Untersuchungsgebiet. Früchte, die von den Bäumen auf den Boden herabgefallen waren, wurden von Grünen Zwergagutis (Myoprocta pratti, Dasyproctidae) gefressen. Schwarzrückentamarine und Totenkopfäffchen unterschieden sich stark in ihrer Effektivität als Samenausbreiter. Schwarzrückentamarine waren zuverlässige Ausbreiter, Totenkopfäffchen nicht. Jede meiner Studienflächen war Teil des Kern-Wohngebietes von jeweils einer Gruppe von Schwarzrückentamarinen, und fiel in das Streifgebiet einer Gruppe von Totenkopfäffchen. In einer Stichprobe von 6 Bäumen vergleichbarer und hoher saisonaler Fruchtproduktion war die Gesamtanzahl an reifen Früchten eines jeweiligen Baums, die durch den zuverlässigen Samenausbreiter S. nigricollis im Verlauf einer Fruchtsaison geerntet wurden, mit keinem der gemessenen Nährstoffbestandteile des Fruchtfleischs signifikant korreliert. Der zuverlässige Samenausbreiter von L. cymosa scheint keinen Selektionsdruck auf den Nährstoffgehalt der Früchte von L. cymosa auszuüben. Die saisonale Fruchtproduktion eines L. cymosa -Baums war die hauptsächliche Vorhersagevariable für alle Aspekte der Fruchtentnahme durch den effektiven Samenausbreiter, Saguinus nigricollis, sowie auch durch den Nicht-Samenausbreiter, Saimiri sciureus. Bäume mit größerer saisonaler Fruchtproduktion hatten eine höhere Wahrscheinlichkeit der Fruchtentnahme durch den Samenausbreiter als Bäume mit kleinerer saisonaler Fruchtproduktion. Von Bäumen mit größerer saisonaler Fruchtproduktion ernteten die Samenausbreiter ebenfalls mehr Früchte. Diese Bäume hatten also einen größeren Ausbreitungserfolg. Der prozentuale Anteil der vom Samenausbreiter entnommenen Früchte an der gesamten saisonalen Fruchtproduktion eines Baums sank jedoch mit wachsender Fruchtproduktion. Im Gegensatz dazu stieg der prozentuale Anteil der vom Nicht-Samenausbreiter abgeernteten Früchte an der gesamten saisonalen Fruchtproduktion mit größer werdender saisonaler Fruchtproduktion. Ebenso stieg die Wahrscheinlichkeit der Fruchtentnahme durch den Nicht-Samenausbreiter und die Anzahl der von ihm geernteten Früchte mit größer werdender saisonaler Fruchtproduktion. Die beobachteten Unterschiede zwischen Samenausbreiter und Nicht-Samenausbreiter sind auf Unterschiede in der jeweiligen Nahrungsaufnahmekapazität, der Gruppengröße und des Fouragierverhaltens zurückzuführen. Tamarine ernteten mit geringerer Wahrscheinlichkeit L. cymosa Bäume, die nicht oder nur wenig von umgebender Vegetation gedeckt waren. Dies reflektiert wahrscheinlich ein Verhalten der Tamarine zur Vermeidung von Angriffen von Wald-Raubvögeln. Bei hoher Dichte von L. cymosa-Früchten in der Nachbarschaft einzelner Bäume verringerte sich der Anteil der Früchte an der saisonalen Fruchtproduktion, die von Tamarinen geerntet wurden. Dies spricht für Konkurrenz von Bäumen um Samenausbreiter. Meine Studie hat Selektionsdrücke der Samenausbreiter auf die saisonale Fruchtproduktion von L. cymosa aufgedeckt. Meine Ergebnisse bestätigen die Vorhersagen der „fruit crop size-Hypothese“. Meine Ergebnisse zeigen ebenfalls, dass es auch Faktoren außerhalb der Kontrolle eine Baumindividuums gibt, die die Fruchtentnahme von L. cymosa Bäumen beeinflussen. Selektion durch Samenausbreiter könnte durch Nachbarschaftsbedingungen begrenzt. N2 - Leonia cymosa (Violaceae) is a small tree from the under story of the Amazonian rain forest. I investigated the seed dispersal ecology of L. cymosa in plots of old growth terra firme forest located within the Cuyabeno Faunistic Reserve in north-eastern Ecuador. This species offered good conditions to examine the variation of traits of individual trees and the way they are linked with fruit removal from each tree. With this study I aimed to address the question whether frugivores exert selection pressures on fruits and the fruiting regime of fleshy fruited plants. The mean height of a fruiting L. cymosa was 6.6 m (range: 2 - 12.6 m). The median tree density was 11.8 trees per hectare. Trees grew in clusters consisting of different numbers of trees of different heights. L. cymosa flowered two times a year, in late February to March and in October. The respective fruiting seasons occurred in August/September and between March and May. The fruit pulp of L. cymosa contained the sugars fructose, glucose, and sucrose, the total soluble sugar being the first important nutritional compound of the fruit pulp. The second important compound was proteins. No lipids were found in the fruit pulp. The variation of nutritional quality of the fruits was high within trees. Nonetheless, significant differences were found among trees in all nutrient constituents studied. The maximum of ripe fruits produced per season by a single tree was 427. Median productivity of the trees was 45 ripe fruits throughout the fruiting season in 1999 (n=57) and 36 ripe fruits in 2000 (n=92). The maximum standing crop of fruits in a tree was 324 fruits (counted in 2000). Black mantle tamarins, Saguinus nigricollis (Callitrichidae), and squirrel monkeys, Saimiri sciureus (Cebidae), and possibly an unknown nocturnal frugivore consumed the fruits of L. cymosa at my study site. Green-rumped acouchis (Myoprocta pratti, Dasyproctidae) consumed fallen fruits and seeds underneath the trees. Black mantle tamarins and squirrel monkeys differed widely in their effectiveness as seed dispersers. Black mantle tamarins swallowed the seeds together with the fruit pulp and defecated intact seeds far away from the mother tree. Squirrel monkeys opened the fruits to suck and gnaw on the fruit pulp, and then dropped seeds to the forest floor below the tree crowns. Each of my study plots fell into the core home range of one group each of S. nigricollis and S. sciureus. Thus, the frugivore assemblage is small and disperser availability is limited for the individual tree of L. cymosa. In a sample of 6 trees of comparable and high fruit crop size, the total of ripe fruits removed from a tree throughout the whole fruiting season by the reliable seed disperser S. nigricollis was neither significantly correlated with the content of any of the nutrients measured in the fruit pulp (fructose, glucose, sucrose, total protein; pulp does not contain lipids), nor with total metabolisable energy, seed to pulp weight ratio, or water content of the fruit pulp. Feeding preferences for single sugars determined by other laboratory studies were not confirmed by this field study. The reliable seed disperser S. nigricollis does not seem to exert selective pressure on the nutrient content of the fruits of L. cymosa. Seasonal fruit crop size was the main predictor of all aspects of fruit removal by the effective disperser of L. cymosa, Saguinus nigricollis, as well as by the non-disperser, Saimiri sciureus. Trees with larger seasonal fruit crop size had a higher probability to have fruits removed by the disperser than those with small seasonal fruit crop sizes. They also had a higher number of fruits removed by the seed disperser. However, the proportion of fruits removed by the disperser decreased with increasing seasonal fruit crop size. In contrast, probability of fruit removal, the number of fruits removed, and the proportion of fruits removed by the non-disperser increased with increasing seasonal fruit crop sizes. The observed differences between disperser and non-disperser are due to differences in feeding capacity, group size and foraging behavior. Tamarins were less likely to harvest Leonia trees that were not or less completely covered by surrounding vegetation. This probably reflects a behavior to avoid predation by forest raptors. At high con-specific fruit abundance in the neighborhood, the proportion of fruits removed by tamarins was reduced. This suggests competition of trees for the disperser. My study revealed selection of the disperser on seasonal fruit crop size of L. cymosa. My results are consistent with the “fruit crop size hypothesis”. FCSH appears to constitute a valid framework also in the monkey-dispersed L. cymosa. My findings also show that factors beyond the tree’s control influenced fruit removal from Leonia trees. Disperser-mediated selection may be constrained (yet not impeded) by neighborhood conditions. KW - Samenverbreitung KW - Ökologie KW - Regenwald KW - Tamarin KW - Totenkopfäffchen KW - Frucht KW - Fruchtgehalt KW - Fruchtansatz KW - Unterholz KW - Fruchtqualität KW - Fruchtentnahme KW - Generalisierte Lineare Modelle KW - Fruchtproduktion KW - Fruchtentnahme KW - fruit removal KW - tamarins KW - squirrel monkeys KW - understorey tree KW - fruit crop size Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-37129 ER - TY - THES A1 - Busch, Sebastian T1 - Morphologie und Organisation individueller oktopaminerger Neurone im Gehirn von Drosophila m. T1 - Morphology and Organization of individual octopaminergic neurons in the Drosophila brain N2 - Das biogene Amin Oktopamin moduliert verschiedene Verhaltensweisen in Invertebraten. In verschiedenen Insektenspezies, wie Heuschrecken, Grillen oder Schaben, ist die Funktion und die Architektur des peripheren oktopaminergen Systems auf Einzelzellebene bekannt. Um die zelluläre Grundlage für die verschiedenen Funktionen von Oktopamin im Zentralnervensystem zu verstehen, ist eine detaillierte Analyse der Architektur des zentralen oktopaminergen Systems notwendig. Innerhalb meiner Doktorarbeit fertigte eine anatomische Karte individueller oktopaminerger Neurone des adulten Hirns von Drosophila an. Ich nutzte die Flp-out Technik, um einzelne oktopaminerge Neurone anzufärben. Anhand ihrer Projektionsmuster konnte ich 28 verschiedene Zelltypen in vier Oktopamin-immunoreaktiven Zellclustern identifizieren. Ihre Morphologie sowie die Verteilung genetischer Marker zeigte, dass die meisten Zelltypen mehrere Neuropile innervieren und dabei eine klare Trennung von Prä- und Postsynaptischen Regionen aufweisen. Die Mehrheit der Zelltypen bildet dendritische Verzweigungen in einer bestimmten Region, der posterioren Slope. Jedoch innerviert jeder Zelltyp stereotyp eine bestimmte Kombination von Zielregionen im Gehirn. Das deutet stark darauf hin, dass oktopaminerge Neurone kombinatorisch organisiert sind: Jedes individuelle Neuron scheint Komponente eines spezifischen neuronalen Schaltkreises zu sein. Dabei könnte jeder Zelltyp eine Art “Modul” darstellen, das selektiv bestimmte Funktionen in den jeweiligen Zielregionen moduliert. Das oktopaminerge Mittelliniencluster des Subösophagealen Ganglions zeigt eine besondere zelluläre Organisation. Es besteht aus gepaarten und ungepaarten Neuronen, die des Zentralgehirn mit extensiven Verzweigungen versorgen. Um die Ordnung hinter dieser komplexen Organisation zu verstehen, wurden die segmentale Organistion der Mittellinienneurone auf Einzelzellebene analysiert und ihre embryonalen Anlagen verglichen. Letzteres ermöglichte die morphologische Analyse von einzelnen oktopaminergen Mittellinienklonen. OA-VPM und OA-VUM Neurone bilden zusammen drei Subcluster im Subösophagealen Ganglion, die wahrscheinlich die drei gnathalen Neuromere repräsentieren. Alle OA-VUM Neurone stammen von der embryonalen Mittellinie ab. In den mandibularen und maxillaren Neuromeren formen sie morphologisch identische Zelltypen, mit stereotypen Innervationsmustern. OA-VPM Neurone gehen nicht aus der embryonalen Mittellinie hervor und sind nicht segmental dupliziert. Diese Arbeit vermittelt nicht nur einen Eindruck über die Architektur individueller oktopaminerger Neurone, sondern auch über die Organisation des oktopaminergen Systems auf Einzelzellebene. N2 - The biogenic amine octopamine modulates divers behaviors in invertebrates. In different insect species, such as locusts, crickets, or cockroaches, the function and organization of the peripheral octopaminergic system is understood at single cell level. To understand the basis for the divers octopamine functions within the central nervous system, a detailed morphological analysis of central octopaminergic neurons is necessary. In my Ph.D. I generated an anatomical map of individual octopaminergic neurons in the Drosophila brain. I utilized the Flp-out technique, to label individual octopaminergic neurons. By their projection pattern I categorized 28 different cell types in four octopamine-immunoreactive cell clusters. Their morphology and the distribution of genetic markers indicates that most of the cell types innervate multiple neuropiles and exhibit a clear separation of dendritic and presynaptic regions: The majority of cell types forms spiny ramifications in one particular brain region, the posterior slope. However, each cell type stereotypically innervates a distinct set of target regions throughout the brain. This suggests that octopaminergic neurons are organized in a combinatorial way. Each individual neuron seems to be a component of a specif neuronal circuitry. This way each cell type could represent a modul, which selectively modulates neuronal processes in its respective target regions. The octopaminergic midline cluster of the suboesophageal ganglion shows a special cellular organization. It consists of paired and unpaired neurons, which supply the central brain with extensive ramifications. To understand the rule behind this complex organization, the segmental organization and developmental origin of midline neurons was analyzed at single cell level. The latter was achieved by analyzing the morphology of individual octopaminergic midline clones. OA-VPM and OA-VUM neurons form three subclusters in the suboesophageal ganglion, which most likely represent the three gnathal neuromeres. All OA-VUM neurons derive from the embryonic midline. In the mandibular and maxillary neuromere they form morphologically identical cell types with stereotypic Innervation patterns. OA-VPM neurons do not derive from the embryonic midline and are not segmentally duplicated. This study not only gives an impression of the architecture of individual octopaminergic neurons, but also about the organization of the octopaminergic system at single cell level. KW - Drosophila KW - Gehirn KW - Octopamin KW - Neuroanatomie KW - Nervennetz KW - Drosophila KW - Brain KW - Octopamine KW - Neuroanatomy Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-36203 ER - TY - THES A1 - Menzel, Florian T1 - Mechanisms and adaptive significance of interspecific associations between tropical ant species T1 - Mechanismen und adaptive Bedeutung interspezifischer Assoziationen zwischen tropischen Ameisenarten N2 - Aggression between ants from different colonies or species is ubiquitous. Exceptions to this rule exist in the form of supercolonies (within a species) and interspecific associations (between species). Probably the most intimate interspecific association is the parabiosis, where two ant species live together in a common nest. They keep their brood separate but jointly use trails and often share food resources. Parabioses are restricted to few species pairings and occur in South American and Southeast Asian rainforests. While the South American parabioses have been studied, albeit poorly, almost nothing is known about their Southeast Asian counterparts. My PhD project focuses on Southeast Asian parabioses between the myrmicine Crematogaster modiglianii Emery 1900 and the considerably larger formicine Camponotus rufifemur Emery 1900. The two species frequently nest together in hollow trees in the tropical lowland rainforest of Borneo. The basic question of my PhD project is why these two species live together. I investigated both proximate and ultimate aspects of this question. For comparative purposes, I included studies on a trail-sharing association in the same habitat. On the proximate level, I investigated which mechanisms facilitate tolerance towards hetero-spe¬ci¬fic nestmates. Ants generally discriminate nestmates from non-nestmates via cuticular hydro¬carbons that function as colony recognition cues. I studied the specificity of nestmate recognition within and between the two parabiotic species. Using gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS), I analyzed the cuticular substances in both ant species to find potential differences to non-parabiotic species, and to estimate the substance overlap among the two species. A high substance overlap would e.g. suggest that interspecific tolerance is caused by chemical mimicry. Finally, bioassays were conducted to evaluate the function of different cuticular compounds. Interspecific tolerance in the two parabiotic species was species-specific but not colony-specific. Ca. rufifemur tolerated all Cr. modiglianii individuals, even those from foreign colonies, but strongly attacked workers of other Crematogaster species. Cr. modiglianii, in turn, tolerated Ca. rufifemur workers of certain foreign colonies but attacked those of others. Chemical analyses revealed two sympatric, chemically distinct Ca. rufifemur varieties (‘red’ and ‘black’) with almost no hydrocarbon overlap. Cr. modiglianii only tolerated foreign Ca. rufifemur workers if they belonged to the same chemical variety as their own Ca. rufifemur partner. It also attacked other, non-parabiotic Camponotus species. Thus, reciprocal interspecific tolerance was restricted to the species Cr. modiglianii and Ca. rufifemur. Ca. rufifemur frequently tolerated conspecific non-nestmates of the same chemical variety. Minor workers were more often tolerated than majors, possibly because they possess two to three times lower hydrocarbon quantities per body surface than majors. In contrast, Cr. modiglianii nearly always attacked conspecific non-nestmates. Both species possessed hydrocarbons with considerably higher chain lengths than congeneric, non-parabiotic ant species. Long-chain hydrocarbons are less volatile than shorter ones and thus harder to perceive. They may thus considerably facilitate interspecific tolerance. Moreover, up to 98% of the cuticular hydrocarbons in Ca. rufifemur were methylbranched alkenes, which are highly unusual among insect cuticular hydrocarbons. Cr. modiglianii and Ca. rufifemur had almost no hydrocarbons in common, refuting chemical mimicry as a possible cause of interspecific tolerance. The only hydrocarbons common to both species were two methylbranched alkenes, which constituted 89% of the ‘red’ Ca. rufifemur hydrocarbon profile and also occurred in those Cr. modiglianii colonies that lived together with this Ca. rufifemur variety. Cr. modiglianii presumably acquired these two compounds from its red Ca. rufifemur partner. Cr. modiglianii was significantly less aggressive towards foreign Cr. modiglianii workers that were associated with the same Ca. rufifemur variety than to those associated with the respective other one. Hence, this species seemed to use recognition cues acquired from its parabiotic partner. Apart from hydrocarbons, both species possessed a set of hitherto unknown substances on their cuticle. The quantitative composition of the unknown compounds varied between parabiotic nests but was similar among the two species of a nest. They are probably produced in the Dufour glanf of Cr. modiglianii and transferred to their Ca. rufifemur partner. Possible transfer mechanisms include interspecific trophallaxis and ‘mounting behaviour’, where Cr. modiglianii climbed onto Ca. rufifemur workers without being displaced. Although the composition of the unknown compounds greatly varied between nests, they did not function as nestmate recognition cues since both species used hydrocarbons for nestmate recognition. However, the unknown compounds significantly reduced aggression in Ca. rufifemur. The ultimate, i.e. ecological and evolutionary aspects of my PhD research deal with potential costs and benefits that Cr. modiglianii and Ca. rufifemur may derive from the parabiotic association, their interactions with other species, and population genetic analyses. Additional studies on a trail-sharing association between three other ant species deal with two possible mechanisms that may cause or facilitate trail-sharing. Whether parabioses are parasitic, commensalistic, or mutualistic, is largely unknown and depends on the costs and benefits each party derives from the association. I therefore investigated food competition (as one of the most probable costs), differentiation of foraging niches (which can reduce competition), and several potential benefits of the parabiotic way of life. Besides, I studied interactions between the ant species and the hemiepiphyte Poikilospermum cordifolium. The foraging niches of the two species differed regarding foraging range, daily activity pattern, and food preferences. None of the two species aggressively displaced its partner species from baits. Thus, interference competition for food seemed to be low or absent. For both ant species, a number of benefits from the parabiotic lifestyle seem possible. They include interspecific trail-following, joint nest defence, provision of nest space by the partner species, food exchange via trophallaxis, and mutual brood care. If an ant species follows another species’ pheromone trails, it can reach food resources found by the other species. As shown by artificial extract trails, Ca. rufifemur workers indeed followed trails of Cr. modiglianii but not vice versa. Thus, Ca. rufifemur benefited from Cr. modiglianii’s knowledge on food sources (informational parasitism). In turn, Cr. modiglianii seemed to profit from nest defence by Ca. rufifemur. Ca. rufifemur majors are substantially larger than Cr. modiglianii workers. Although Cr. modiglianii often effectively defended the nest as well, it seemed likely that this species derived a benefit from its partner’s defensive abilities. In neotropical parabioses (ant-gardens), mutualistic epiphytes play an important role in providing nest space. The neotropical Camponotus benefits its Crematogaster partner by planting epiphyte seeds, for which Crematogaster is too small. Similarly, the Bornean parabioses often were inhabited by the hemiepiphyte Poikilospermum cordifolium (Barg.-Petr.) Merr (Cecropiaceae). P. cordifolium seedlings, saplings and sometimes larger indivi¬duals abundantly grew at the entrances of parabiotic nests. However, P. cordifolium provides no additional nest space and, apart from nutritive elaiosomes, perianths, and extrafloral nectar probably plays a less important role for the ants than the neotropical epiphytes. In conclusion, the parabiosis is probably beneficial to both species. The main benefits seem to be nest defence (for Cr. modiglianii) and interspecific trail-following (for Ca. rufifemur). However, Ca. rufifemur seems to be more dependent on its partner than vice versa. For both parabiotic species, I analyzed mitochondrial DNA of ants from different regions in Borneo. My data suggest that there are four genetically and chemically distinct, but closely related varieties of Camponotus rufifemur. In contrast, Crematogaster modiglianii showed high genetic differentiation between distant populations but was not differentiated into genetic or chemical varieties. This argues against variety-specific cocladogenesis between Cr. modiglianii and Ca. rufifemur, although a less specific coevolution of the two species is highly likely. In Bornean rainforests, trail-sharing associations of Polyrhachis (Polyrhachis) ypsilon Emery 1887 and Camponotus (Colobopsis) saundersi Emery 1889 are common and often include further species such as Dolichoderus cuspidatus Smith 1857. I investigated a trail-sharing association between these three species and studied two mechanisms that may cause or facilitate these associations: interspecific trail-following, i.e. workers following another species’ pheromone trail, and differential inter¬specific aggression. In trail-following assays, D. cuspidatus regularly followed extract trails of the other two species, thus probably parasitizing on their information on food sources. In contrast, only few P. ypsilon and Ca. saundersi workers followed hetero¬speci¬fic extract trails. Hence, the association between P. ypsilon and Ca. saundersi cannot be ex¬plained by foragers following heterospecific trails. In this case, trail-sharing may originate from few scout ants that do follow heterospecific pheromone trails and then lay their own trails. Interspecific aggression among P. ypsilon, Ca. saundersi and D. cuspidatus was strongly asymmetric, Ca. saundersi being submissive to the other two species. All three species discriminated between heterospecific workers from the same and a distant trail-sharing site. Thus, it seems likely that the species of a given trail-sharing site habituate to one another. Differential tolerance by dominant ant species may be mediated by selective habituation towards submissive species, and thereby influence the assembly of trail-sharing associations. N2 - Aggression zwischen Ameisen verschiedener Kolonien oder Arten ist allgegenwärtig. Ausnahmen von dieser Regel bilden Superkolonien (innerhalb einer Art) sowie inter-spezifische Assoziationen (zwischen Arten). Wohl die engste dieser Assoziationen ist die Parabiose, bei der zwei Ameisenarten in einem gemeinsamen Nest leben. Sie halten ihre Brut getrennt, nutzen jedoch gemeinsam Pfade und oftmals auch Nahrungsressourcen. Parabiosen sind auf Assoziationen einiger weniger Artkombinationen beschränkt und kommen nur in südamerikanischen und südostasiatischen Regenwäldern vor. Während jedoch die südamerikanischen Parabiosen bereits untersucht wurden – wenn auch spärlich –, ist fast nichts über ihre südostasiatischen Pendants bekannt. Der Schwerpunkt meiner Doktorarbeit liegt auf südostasiatischen Parabiosen zwischen der myrmicinen Ameise Crematogaster modiglianii Emery 1900 und der deutlich größeren Formicine Camponotus rufifemur Emery 1900. Die beiden Arten nisten häufig gemeinsam in hohlen Bäumen im tropischen Tieflandregenwald Borneos. Die grundlegende Frage meiner Doktorarbeit ist, warum diese beiden Arten zusammenleben. Ich untersuchte sowohl proximate als auch ultimate Aspekte dieser Frage. Zu Vergleichszwecken führte ich Studien über eine trail sharing-Assoziation im selben Lebensraum durch. Auf proximater Ebene untersuchte ich, welche Mechanismen die Toleranz heterospezifischer Nestgenossinnen fördern. Im allgemeinen können Ameisen Nestgenossinnen von fremden Artgenossen mit Hilfe kutikulärer Kohlenwasserstoffen unterscheiden, die als Kolonie-Erkennungssignale dienen. Ich untersuchte Kolonieerkennung innerhalb und zwischen den beiden parabiotischen Arten. Mittels Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) analysierte ich daneben die kutikulären Substanzen beider Ameisenarten, um etwaige Unterschiede zu verwandten, nichtparabiotischen Arten zu finden, und um abzuschätzen, wie stark die Substanzen beider Arten sich überschneiden. Eine starke Überschneidung würde z.B. dafür sprechen, daß inter¬spezifische Toleranz durch chemische Mimikry verursacht wird. Außerdem untersuchte ich anhand von Biotests die Funktion zweier verschiedener kutikulärer Substanzklassen. Die interspezifische Toleranz zwischen den beiden parabiotischen Arten war artspezifisch, aber nicht koloniespezifisch. Ca. rufifemur tolerierte alle Cr. modiglianii-Arbeiterinnen, auch von fremden Kolonien, attackierte aber Arbeiterinnen anderer Crematogaster-Arten. Cr. modiglianii dagegen duldete Ca. rufifemur-Arbeiterinnen von bestimmten fremden Kolonien, attackierte jedoch diejenigen bestimmter anderer Kolonien. Wie chemische Analysen ergaben, kommt Ca. rufifemur in zwei sympatrischen, chemisch verschiedenen Morphen (‚rote’ und ‚schwarze’ Morphe) vor, die praktisch keine Kohlenwasserstoffe gemeinsam haben. Cr. modiglianii duldete nur diejenigen Ca. rufifemur-Arbeiterinnen, die zur gleichen Morphe gehörten wie ihr eigener Partner. Cr. modiglianii attackierte auch weitere, nichtparabiotische Camponotus-Arten. Gegenseitige interspezifische Toleranz war also auf die Arten Cr. modiglianii und Ca. rufifemur beschränkt. Ca. rufifemur duldete häufig koloniefremde Artgenossen derselben Morphe. Die kleineren Arbeiterinnenkasten wurden eher geduldet als große Arbeiterinnen (Soldaten), möglicher¬weise weil sie 2-3-fach kleinere Kohlenwasserstoffmengen pro Körperoberfläche besitzen als letztere. Im Gegensatz dazu attackierte Cr. modiglianii fast stets koloniefremde Artgenossen. Die Kohlenwasserstoffe beider Arten waren deutlich langkettiger als bei nichtparabiotischen Arten der gleichen Gattungen. Langkettige Kohlenwasserstoffe sind aufgrund ihrer geringeren Flüchtigkeit schwerer wahrzunehmen als kürzerkettige und fördern deshalb vermutlich interspezifische Toleranz. Auffällig war weiterhin, daß die kutikulären Kohlenwasserstoffe bei Ca. rufifemur zu bis zu 98% aus Methylalkenen bestanden, die als kutikuläre Substanzen bei Insekten höchst ungewöhnlich sind. Cr. modiglianii und Ca. rufifemur besaßen fast keine gemeinsamen Kohlenwasserstoffe, es lag also keine chemische Mimikry vor. Die einzigen gemeinsamen Kohlenwasserstoffe in größeren Mengen waren zwei Methylalkene, die bei der roten Ca. rufifemur-Morphe ca. 89% des Kohlenwasserstoffprofils ausmachten und auch bei den Cr. modiglianii-Kolonien vorkam, die mit dieser Morphe zusammenlebten. Vermutlich übernahmen diese Cr. modiglianii-Kolonien die beiden Substanzen von ihren roten Ca. rufifemur-Partnern. Cr. modiglianii-Arbeiterinnen waren signifikant weniger aggressiv gegenüber fremden Artgenossinnen, wenn diese mit derselben Ca. rufifemur-Morphe assoziiert waren wie sie selbst. Diese Art schien demnach die Kohlenwasserstoffe, die sie von ihrem Parabiosepartner übernommen hatte, als Erkennungssignale zu nutzen. Neben den Kohlenwasserstoffen kam auf der Kutikula beider Ameisenarten eine Reihe bisher unbekannter Stoffe vor. Die quantita¬tive Zusammen¬setzung dieser Substanzen variierte zwischen parabiotischen Nestern, ähnelte sich aber jeweils zwischen den beiden Arten eines Nests. Sie werden wahrscheinlich in der Dufourdrüse von Cr. modiglianii produziert und auf den Ca. rufifemur-Partner übertragen werden. Als mögliche Übertragungsmechanismen kommen interspezifische Trophallaxis sowie ‚Besteigeverhalten’ in Betracht, bei dem Cr. modiglianii auf Ca. rufifemur-Arbeiterinnen klettert, ohne von diesen vertrieben zu werden. Obwohl die Zusammensetzung der unbekannten Substanzen stark zwischen parabiotischen Nestern variierte, dienten sie – im Gegensatz zu den Kohlenwasserstoffen – nicht der Kolonieerkennung. Sie reduzierten jedoch signifikant die Aggressivität von Ca. rufifemur. Die ultimaten, also ökologischen und evolutionären Aspekte meiner Doktorarbeit beschäftigen sich mit potentiellen Kosten und Nutzen, die Cr. modiglianii und Ca. rufifemur aus ihrer parabiotischen Lebensweise ziehen könnten, mit ihren Interaktionen zu weiteren Arten sowie populationsgenetischen Analysen. Meine Untersuchungen zu einer trail sharing-Assoziation zwischen drei anderen Ameisenarten beschäftigen sich mit zwei Mechanismen, die trail sharing verursachen oder fördern könnten. Ob Parabiosen parasitisch, kommensalistisch oder mutualistisch sind, ist weitgehend unbekannt und hängt von den Kosten und Nutzen ab, die beiden Partnern durch die Parabiose entstehen. Ich untersuchte deshalb Nahrungskonkurrenz (als eine der wahrscheinlichsten Kosten), Nischendifferenzierung in bezug auf die Nahrungssuche (was die Konkurrenz verringern könnte), sowie mehrere etwaige Nutzen aus der parabiotischen Lebensweise. Darüber hinaus untersuchte ich Interaktionen zwischen den Ameisen und dem Hemiepiphyten Poikilospermum cordifolium. Die Nischen der beiden Arten in bezug auf Fouragierdistanz vom Nest, tageszeitliche Aktivitätsspanne und Nahrungspräferenzen. Keine der beiden Arten vertrieb die Partnerart gewaltsam von Ködern, so daß keine direkte Konkurrenz erkennbar war. Für beide Ameisenarten sind eine Reihe von Vorteilen aus der parabiotischen Lebensweise denkbar. Darunter fallen interspezifisches Spurfolgeverhalten, gemeinsame Nestverteidigung, Bereitstellung von Nistraum durch die Partnerart, Nahrungsaustausch mittels Trophallaxis und gegenseitige Brutfürsorge. Wenn eine Ameisenart der Pheromonspur einer anderen Art folgt, erreicht sie Nahrungsressourcen, die die andere Art gefunden hat. Wie durch künstliche Pheromonspuren gezeigt wurde, folgte Ca. rufifemur tatsächlich Spuren von Cr. modiglianii, jedoch nicht umgekehrt. Ca. rufifemur profitierte damit vom Wissen ihrer Partnerart über Nahrungsressourcen (informationaler Parasitismus). Cr. modiglianii wiederum schien von der Nestverteidigung durch Ca. rufifemur zu profitieren. Ca. rufifemur-Soldaten sind deutlich größer als Cr. modiglianii-Arbeiterinnen. Obwohl Cr. modiglianii oft ebenfalls effektiv das Nest verteidigte, erscheint es wahrscheinlich, daß diese Art einen Nutzen aus der Nestverteidigung durch Ca. rufifemur zieht. In neotropische Parabiosen (Ameisengärten) spielen mutualistische Epiphyten durch die Bereitstellung von Nistraum eine große Rolle. Die neotropische Camponotus-Art nützt ihrem Crematogaster-Partner, indem sie Epiphytensamen pflanzt, wozu Crematogaster zu klein ist. Die Parabiosen Borneos waren ebenfall oft von dem Hemiepiphyten Poikilospermum cordifolium (Barg.-Petr.) Merr (Cecropiaceae) besiedelt. Keimlinge und größere Individuen von P. cordifolium wuchsen häufig an parabiotischen Nesteingängen. P. cordifolium bietet jedoch keinen Nistraum und ist daher, abgesehen von der Bereitstellung nahrhafter Elaiosomen, Perianthe und extrafloralem Nektar, für die Ameisen von geringerer Bedeutung als die Epiphyten der Neotropen. Als Fazit erscheint die Parabiose für beide Ameisenarten vorteilhaft. Die wichtigsten Vorteile sind Nestverteidigung (für Cr. modiglianii) und interspezifisches Spurfolgen (für Ca. rufifemur). Allerdings scheint Ca. rufifemur stärker von seinem Partner abzuhängig zu sein als umgekehrt. Von beiden parabiotischen Arten analysierte ich mitochondriale DNA aus verschiedenen Regionen Borneos. Nach meinen Ergebnissen existieren vermutlich vier genetisch und chemisch verschiedene, aber nah miteinander verwandte Camponotus rufifemur-Morphen. Im Gegensatz dazu zeigte Crematogaster modiglianii hohe genetische Differenzierung zwischen entfernten Populationen, aber keine weitere Differenzierung in genetische oder chemische Morphen. Dieses Ergebnis spricht gegen eine morphen-spezifische Cocladogenese zwischen Cr. modiglianii und Ca. rufifemur, obwohl eine weniger spezifische Coevolution der beiden Arten sehr wahrscheinlich ist. In den Regenwäldern Borneos sind trail sharing-Assoziationen zwischen Polyrhachis (Polyrhachis) ypsilon Emery 1887 und Camponotus (Colobopsis) saundersi Emery 1889 weit verbreitet und schließen oft weitere Arten wie Dolichoderus cuspidatus Smith 1857 ein. Ich untersuchte eine trail sharing-Assoziation zwischen diesen drei Arten und erforschte zwei Mechanismen, die eine solche Assoziation eventuell fördern könnten: interspezifisches Spur-folgeverhalten und differentielle interspezifische Aggression. In Spurfolge¬versuchen folgte D. cuspidatus regelmäßig künstlichen Extraktpfaden der anderen beiden Arten. Auf diese Weise parasitierte D. cuspidatus wahrscheinlich auf deren Informationen über Nahrungsressourcen. Im Gegensatz dazu folgten nur wenige Arbeiterinnen von P. ypsilon und Ca. saundersi heterospezifischen Extraktpfaden. Die Assoziation zwischen P. ypsilon und Ca. saundersi kann folglich nicht dadurch erklärt werden, daß fouragierende Arbeiterinnen heterospezifischen Pheromonspuren folgen. In diesem Fall könnte trail sharing möglicherweise darauf beruhen, daß einige wenige scouts heterospezifischen Spuren folgen und anschließend ihre eigene Spur legen. Die interspezifische Aggression zwischen P. ypsilon, Ca. saundersi und D. cuspidatus war stark asymmetrisch, denn Ca. saundersi war gegenüber den anderen beiden Arten stark submissiv. Alle drei Arten unterschieden heterospezifische Arbeiterinnen von ihrem eigenen und einem fremden Standort. Es erscheint daher wahrscheinlich, daß die Arten eines trail sharing-Standorts sich aneinander gewöhnen. Differentielle Toleranz durch dominante Ameisenarten könnte zustande kommen, indem sich diese selektiv an bestimmte submissive Arten gewöhnen, sie dulden und auf diese Weise die Zusammensetzung von trail sharing-Assoziationen beeinflussen. KW - Ameisen KW - Mutualismus KW - Insekten KW - Symbiose KW - Borneo KW - Chemische Kommunikation KW - Interspezifische Assoziation KW - Kohlenwasserstoffe KW - Pheromone KW - Kolonieerkennung KW - Formicidae KW - Parabiose KW - Spurpheromone KW - interspecific association KW - hydrocarbons KW - pheromone KW - nestmate recognition KW - Formicidae KW - parabiosis KW - trail-sharing KW - trail pheromone Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-37251 ER - TY - THES A1 - Stoll, Sascha T1 - Funktionelle Analyse von Blochmannia floridanus, dem primären Endosymbionten der Rossameise Camponotus floridanus T1 - Functional analysis of Blochmannia floridanus, the primary endosymbiont of the carpenter ant Camponotus floridanus N2 - Ameisen der Gattung Camponotus beherbergen bakterielle Symbionten der Gattung Blochmannia in spezialisierten Zellen des Mitteldarms (Blochmann, 1882; Buchner, 1965; Sauer, 2000; Schröder et al., 1996). Die Genomsequenzierung dieser Symbionten zeigte, dass Blochmannia, ähnlich den Symbionten von Blattläusen, hauptsächlich Gene der Aminosäurebiosynthese beibehalten hat (Degnan et al., 2005; Gil et al., 2003). Die Relevanz dieser nahrungsaufwertenden Funktion konnte experimentell bestätigt werden (Feldhaar et al., 2007). Ein Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit war die Aufklärung der dynamischen Interaktion der beiden Partner während des komplexen Lebenszyklus des holometabolen Wirtes. Frühere Studien deuteten darauf hin, dass die Symbiose vor allem während der Larven- und Puppenphasen von Bedeutung sein könnte (Feldhaar et al., 2007; Wolschin et al., 2004; Zientz et al., 2006). Mit fluoreszenter in situ Hybridisierung (FISH) und konfokaler Laserscanning Mikroskopie konnte in der vorliegenden Arbeit die Lokalisierung von B. floridanus während der wichtigsten Entwicklungsstadien aufgeklärt werden. Hierbei konnte gezeigt werden, dass die Symbionten schon im ersten Larvenstadium in spezialisierten Zellen um den Darm angeordnet sind, aber in späteren Stadien nicht, wie bisher angenommen, auf diese Bakteriozyten beschränkt sind, sondern bis zum Schlupf der jungen Arbeiterinnen massiv andere Darmzellen infizieren. Übereinstimmend mit Bestimmungen der Zellzahl in den verschiedenen Wirtsstadien ist die Anzahl der Symbionten gegen Ende der Metamorphose am höchsten. Die Symbiose degeneriert in sehr alten Arbeiterinnen, gut gefüllte Bakteriozyten werden jedoch noch monatelang beibehalten. Mit Macroarray- und qRT- PCR- basierten Transkriptomanalysen wurde die Expression der bakteriellen Gene in charakteristischen Entwicklungsstadien des Wirtes untersucht. Allgemein zeigen vor allem Gene für molekulare Chaperons und bestimmte bakterielle Grundfunktionen eine hohe Expression. Aber auch viele Gene, die möglicherweise wichtige Funktionen in der Symbiose besitzen, wie die Biosynthese essentieller Aminosäuren und das Recycling von Stickstoffverbindungen, zeigen ein hohes absolutes Transkriptlevel. Zudem besteht eine positive Korrelation zwischen dem Expressionsniveau und dem GC- Gehalt der Gene, die in dem höheren Selektionsdruck und damit einer geringeren Mutationsrate der essentiellen Gene begründet liegt (Schaber et al., 2005). Durch Proteinanalysen konnte bestätigt werden, dass die Faktoren mit der höchsten absoluten Transkription die dominanten Proteine der Symbionten darstellen. In den unterschiedlichen Entwicklungsstadien zeigen viele Gene eine deutliche Dynamik, deren Ausmaß aber, verglichen mit freilebenden Bakterien, gering ist. Aus den Expressionsprofilen aufeinanderfolgender Gene lassen sich mögliche Transkriptionseinheiten ableiten, die teilweise auch experimentell bestätigt wurden. Oftmals zeigen auch Gene, die nicht in Transkriptionseinheiten angeordnet sind, aber verwandten Stoffwechselwegen angehören, ähnliche Muster. Dies deutet auf das Vorhandensein grundlegender Genregulations-mechanismen hin, obwohl im Genom von B. floridanus nur noch sehr wenige Transkriptionsfaktoren codiert sind (Gil et al., 2003). Auf übergeordneter Ebene zeigt sich, dass bei Symbionten aus späten Puppenstadien viele symbioserelevante Gene im Vergleich zu Genen des Grundmetabolismus eine erhöhte Expression zeigen. Dies betrifft besonders die Biosynthese aromatischer und verzweigter Aminosäuren, die in diesen Stadien vom Wirt in hoher Menge benötigt werden, während die internen Reserven gleichzeitig zur Neige gehen. Dies äußert sich auch im deutlichen Abfallen der Speicherproteinmenge des Wirts gegen Ende der Puppenphase. Die festgestellte Veränderung der Symbiontenzahl übertrifft das geringe Ausmaß der Genregulation um ein Vielfaches. Die Bakterien liegen in jedem Stadium polyploid mit bis zu 100 Genomkopien vor, dieser Polyploidiegrad bleibt jedoch während der gesamten Wirtsentwicklung weitestgehend konstant. Somit scheint die Kontrolle des Wirts über die bakterielle Vermehrung der entscheidende Faktor dieser Symbiose zu sein. Die verbleibenden regulatorischen Fähigkeiten der Bakterien stellen möglicherweise eine Feinjustierung von optimierten Produktionseinheiten dar, deren Anzahl nach den Bedürfnissen des Wirtes verändert wird. Insgesamt konnten in der vorliegenden Arbeit neue Einblicke in das komplexe Zusammenleben von Blochmannia und Camponotus gewonnen werden, die zu einem besseren Verständnis der biologischen Funktion und der grundlegenden Mechanismen dieser Symbiose führen. Eine der wichtigsten Fragestellungen nach dem Sinn einer nahrungsaufwertenden Symbiose für einen Nahrungsgeneralisten konnte mit starken Hinweisen auf eine stadienabhängige Relevanz der Symbiose beantwortet werden, die den enormen evolutionären Erfolg dieser Ameisengattung erklären könnte.  N2 - Ants of the genus Camponotus harbor bacterial endosymbionts of the genus Blochmannia in specialized cells of their midgut (Blochmann, 1882; Buchner, 1965; Sauer, 2000; Schröder et al., 1996). The complete sequencing of the symbiont’s genome revealed, that Blochmannia, comparable to the symbionts of aphids, mainly retained genes involved in the biosynthesis of essential amino acids (Degnan et al., 2005; Gil et al., 2003). The biological relevance of a nutritional upgrading by Blochmannia could be confirmed experimentally (Feldhaar et al., 2007). One focus of this thesis was the elucidation of the dynamic interactions between the two partners during the complex life cycle of the holometabolic host animal. Previous studies pointed towards a temporal relevance of this symbiosis especially during larval and pupal development (Feldhaar et al., 2007; Wolschin et al., 2004; Zientz et al., 2006). In this thesis the localization of B. floridanus could be documented throughout all life stages of the host by fluorescent in situ hybridization (FISH) and confocal laser scanning microscopy. A layer of densely filled bacteriocytes surrounding the gut could already be identified in first instar larvae. In contrast to previous assumptions, the bacteria are not restricted to these cells in later stages, as until the eclosion of the young adult workers bacteria massively infect other midgut cells. Concordant with previous findings, bacterial load is highest at the end of metamorphosis and symbiont numbers decrease in older workers, yet densely filled bacteriocytes are still visible after several months. The expression of the bacterial genes during characteristic life stages of the C. floridanus was assessed by macroarray and qRT- PCR- based experiments. In general, especially molecular chaperones, central basic metabolism and may putative symbiosis related factors like pathways leading to essential amino acids or nitrogen recycling show highest absolute expression levels. A positive correlation between expression level and GC- content of the genes can be observed, which is caused by a higher selection pressure and lower mutation rate of these essential factors (Schaber et al., 2005). Protein analyses confirmed the correlation between gene expression and translation of the most abundant factors. Many B. floridanus genes exhibit a dynamic expression during the different host stages but the extent of this gene regulation is modest as compared to free living bacteria. Expression profiles of genes located next to each other on the genome allow proposal of local transcription units, which were confirmed experimentally in several cases. Often genes that are not clustered locally but belong to related metabolic functions also exhibit similar expression patterns. This indicates the existence of basic mechanisms of gene regulation despite the low number of transcription factors annotated in the B. floridanus genome (Gil et al., 2003). In late pupal stages symbiosis related genes often show a higher expression compared to basic metabolic functions. This especially includes biosynthetic pathways for aromatic and branched amino acids, which are needed by the host at this stage in increased amounts, while internal storages are depleted. This could be demonstrated by the significant decrease in storage proteins of the host at the end of the pupal phase. The observed change in bacterial numbers per host exceeds the extent of bacterial gene regulation by far. The symbionts are polyploid in each host stage with up to 100 genome copies per cell. The degree of polyploidy is largely constant during host development. Thus the control over bacterial reproduction seems to be the decisive factor in this symbiosis. The residual regulatory capacities of the symbionts might represent a mechanism of fine tuning of a production unit that has been streamlined by evolution and whose numbers are adjusted according to the host’s needs. In conclusion, this thesis delivers new insights into the complex symbiosis of Blochmannia and Camponotus leading to a better understanding of its biological function and the underlying mechanisms. One of the central mysteries concerning the need of a symbiont for nutritional upgrading for an omnivorous host could be explained by a temporal, stage- dependent relevance of this symbiosis, possibly being the reason for the enormous evolutionary success of this ant genus. KW - Intrazelluläre Symbiose KW - Symbiose KW - Ameisen KW - Mikrobiologie KW - Gram-negative Bakterien KW - Bakterien KW - Differentielle Genexpression KW - Genexpression KW - Entwicklung KW - Blochmannia KW - Camponotus KW - symbiosis KW - endosymbiosis KW - ants KW - bacteria KW - gene expression Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-37238 ER - TY - THES A1 - Müller, Nicole T1 - Entwicklung antigenabhängig aktivierbarer TNF-Ligand-Fusionsproteine T1 - Development of antigen-dependent activatable TNF ligand fusion proteins N2 - Von TRAIL, FasL und APRIL, drei Mitgliedern der TNF-Liganden-Familie, ist bekannt, dass Trimerstabilität und Oligomerisierungsstatus maßgeblich das Rezeptoraktivierungspotential dieser Liganden beeinflussen. Für die immunstimulatorischen TNF-Liganden CD27L, CD40L, OX40L, 41BBL und GITRL war hingegen vor der Durchführung dieser Arbeit praktisch nicht bekannt, inwieweit Trimerbildung, Stabilisierung und Oligomerisierung wichtig für deren Aktitvität sind. Dies wurde in dieser Arbeit systematisch untersucht. CD40L besaß bereits als trimeres Molekül eine hohe Aktivität, die durch sekundäre Oligomerisierung nur wenig gesteigert wurde. Die spezifische Aktivität konnte durch Stabilisierung mit Hilfe der Tenascin-C (TNC)-Trimerisierungsdomäne nur geringfügig gesteigert werden. CD27L war als lösliches Flag-markiertes sowie als hexameres Fc-Protein selbst nach Quervernetzen nicht in der Lage, seinen Rezeptor CD27 zu binden und zu aktivieren. Die TNC-stabilisierte trimere Form des CD27L hingegen induzierte nach Oligomerisierung mit einem anti-Flag-Antikörper ein starkes Signal. Trimerer OX40L und trimerer 41BBL konnten nur in oligomerisierter Form ihre Rezeptoren aktivieren, wobei die Aktivität der TNC-stabilisierten Form signifikant stärker ausgeprägt war. GITRL aktivierte seinen Rezeptor bereits als stabilisiertes Trimer und Hexamer, die Aktivität konnte durch Quervernetzen nur gering gesteigert werden. Zusammenfassend kann man sagen, dass CD27L, OX40L und 41BBL zu der Untergruppe der TNF-Ligandenfamilie gehört, für die eine Stabilisierung des trimeren Moleküls und dessen Oligomerisierung nötig sind, um eine starke Rezeptoraktivierung zu ermöglichen. Im Gegensatz dazu zeigten CD40L und GITRL bereits oligomerisierungsunabhängig eine hohe Aktivität. GITRL benötigte allerdings die Stabilisierung des trimeren Moleküls durch die TNC-Domäne, um gute Aktivität zu zeigen. Im Weiteren wurden Antikörperfragment (scFv-)-TNF-Ligand-Fusionsproteine konstruiert und untersucht, die ein Zelloberflächenantigen binden. Eine starke Zelloberflächenantigen-spezifische Aktivierung des jeweiligen Rezeptors konnte für scFv-41BBL und für scFv-OX40L gezeigt werden, wohingegen scFv-CD40L und scFv-GITRL bereits auf antigennegativen Zellen stark aktiv waren. scFv-CD27L war selbst auf antigenpositiven Zellen inaktiv. Verwendet man an Stelle des Antikörperfragments eine extrazelluläre Proteinbindedomäne, z.B. die eines TNF-Rezeptors, erhält man Fusionsproteine, die zum einen eine selektive Aktivierung der TNF-Ligandendomäne und somit die Aktivierung des korrespondierenden Rezeptors auf der Zielzelle ermöglichen, zum anderen aber durch die Bindung an den membranständigen Liganden dessen Aktitvät neutralisieren können. Für CD40-, RANK- und B7-2-FasL konnte der immobilisationabhängige Aktivierungseffekt auf entsprechenden Zelloberflächenmolekül-exprimierenden Zellen gezeigt werden. Anhand von T47D-Zellen, die durch eine autokrine CD40L-CD40-Signalschleife vor Apoptose geschützt sind, konnte gezeigt werden, dass durch die Bindung von CD40-FasL an membranständigen CD40L die CD40L-CD40-Interaktion gestört und gleichzeitig Apoptose verstärkt induziert werden kann. Das Prinzip der antigenabhängigen Aktivierung von TNF-Liganden könnte Anwendung in der Tumortherapie finden, da bei Verwendung entsprechender selektiv exprimierter Marker eine lokale Rezeptoraktivierung erreicht und so Nebenwirkungen minimiert werden können. N2 - Trimer stability and oligomerization status of TRAIL, FasL and APRIL, three members of the TNF ligand family, critically determine their receptor activating potential. However, detailed information for the immunostimmulatory ligands CD27L, CD40L, OX40L, 41BBL and GITRL regarding the importance of trimer formation, stabilization and oligomerization for ligand activity was lacking. These aspects were investigated systematically in this work. CD40L was highly active as a trimeric molecule. Secondary oligomerization and/or stabilization via the tenascin-C (TNC) trimerization domain slightly enhanced its specific activity. As soluble Flag-tagged and as hexameric Fc protein CD27L failed to bind and activate its cognate receptor CD27, even after crosslinking. However, the TNC stabilized form of CD27L induced a strong signal after oligomerization with anti-Flag antibody. Receptor signaling was only activated by oligomerized molecules of trimeric OX40L and 41BBL whereas the respective TNC fusion protein showed significant stronger activity. Stabilized GITRL trimers and hexamers already activated their receptor whereas oligomerization of GITRL just slightly enhanced the specific activity. Taken together, CD27L, OX40L and 41BBL belong to a TNF ligand family subgroup which requires oligomerization and stabilization of the trimeric molecule to ensure strong receptor activation. In contrast, CD40L and GITRL already display high oligomerization-independent activity, though the latter needs stabilization by the TNC domain. Furthermore, antibody fragment (scFv)-ligand fusion proteins targeting specific cell surface antigens were designed and analyzed. Strong cell surface antigen-selective TNF receptor activation was achieved for scFv-41BBL and scFv-OX40L whereas scFv-CD40L and scFv-GITRL already induced signaling in the absence of antigen-positive cells. scFv-CD27L lacked activity even on antigen-positive cells. Using an extracellular protein binding domain for example the ligand binding domain of a TNF receptor instead of an antibody fragment resulted in fusion proteins that on the one hand activate the TNF ligand domain and thus the corresponding receptor on target cells and on the other hand neutralize membrane ligand activity by binding. The effect of cell surface immobilization-mediated activation of these fusion proteins on cells expressing the corresponding target molecule was shown here for CD40-, RANK- and B7-2-FasL. The CD40-FasL fusion protein simultaneously blocked CD40L-CD40 interaction and induced strong apoptosis in T47D cells displaying an antiapoptotic autocrine CD40L-CD40 signaling loop. The principle of antigen-dependent activation of TNF ligands could be of use in tumor treatment due to the fact that tumor specific marker targeting leads to locally restricted receptor activation on antigen positive cells, promising a reduction in potential off target effects. KW - Rekombinantes Protein KW - Oligomerisation KW - Fas-Ligand KW - Antigen CD40 KW - Apoptosis KW - Fibroblast activator protein I KW - Antigen CD19 KW - Tumor-Nekrose-Faktor KW - Trimerisation KW - Stabilisierung KW - CD27L KW - GITRL KW - OX40L KW - 41BBL KW - TRAIL KW - single chain KW - oligomerization KW - fusion protein KW - cross-linking KW - FAP Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-36489 ER - TY - THES A1 - Müller, Stefanie T1 - Funktionale und molekulare Charakterisierung des ArsRS Zweikomponenten-Systems sowie der Response-Regulatoren HP1021 und HP1043 von Helicobacter pylori T1 - Functional and molecular characterization of the ArsRS two-component-system and of the response-regulators HP1021 and HP1043 of Helicobacter pylori N2 - Bakterien sind in der Lage, sich schnell an wechselnde Umweltbedingungen anzupassen. Eine wichtige Rolle bei der Wahrnehmung von verschiedensten Umweltreizen und der zellulären Antwort spielt die Genregulation durch Zweikomponenten-Systeme. Gut charakterisiert ist das ArsRS Zweikomomponenten-System in H. pylori, welches an der Ausbildung der Säureresistenz beteiligt ist und dem Bakterium so die Kolonisierung der Magenschleimhaut ermöglicht. Die Histidin-Kinase ArsS wird in Gegenwart von Säure aktiviert und phosphoryliert den Response-Regulator ArsR, der die Transkription von Target-Genen reguliert. In der periplasmatischen Sensordomäne der Histidin-Kinase ArsS sind sieben Histidinreste vorhanden, die aufgrund ihres pKa-Wertes von 6,0 bei Absenken des pH Wertes von pH 7 auf pH 5, was eine Aktivierung der Histidin-Kinase zur Folge hat, protoniert werden könnten. Es konnte gezeigt werden, dass der Histidinrest H94 der periplasmatischen Sensordomäne einen wesentliche Rolle bei der Säurewahrnehmung durch die Histidin-Kinase ArsS spielt. Die Einführung einer positiv geladenen AS an dieser Position allein reicht jedoch nicht aus, um die Kinase zu aktivieren, weshalb unklar bleibt, ob eine Protonierung des Histidinrestes H94 in vivo die Säurewahrnehmung vermittelt. Weiterhin konnten Indizien darauf erhalten werden, dass neben dem Histidinrest H94 noch weitere Aminosäuren an der Säurewahrnehmung durch die Histidin-Kinase beteiligt sind. Der Aspartatrest D124 leistet unter den negativ geladenen AS vermutlich den größten Beitrag zur Säurewahrnehmung. In den mit H. pylori nahe verwandten Arten Helicobacter hepaticus, Wolinella succinogenes und Campylobacter jejuni sind Orthologe zu dem ArsRS Zweikomponenten-System vorhanden. Um zu untersuchen, ob es sich bei der Säurewahrnehmung durch die Histidin-Kinase ArsS um eine spezifische Anpassung von H. pylori an sein Habitat handelt oder ob Säure einen allgemeinen Stimulus der ArsS-orthologen Kinasen darstellt, wurden Mutanten im genetischen Hintergrund von H. pylori G27 konstruiert, in welchen die Histidin-Kinase ArsS durch die orthologen Kinasen HH1608, CJ1262 und WS1818 substituiert wurde. Durch Transkriptionsstudien konnte gezeigt werden, dass die Kinase WS1818 eine gesteigerte Aktivität bei saurem pH-Wert aufweist. Auch die Kinase HH1607 kann Säure als einen Umweltreiz wahrnehmen, jedoch deutlich weniger effektiv als die Kinasen ArsS und WS1818. Ob die Zweikomponenten-Systeme HH1608/HH1607 und WS1817/WS1818 in vivo in H. hepaticus und W. succinogenes an der Wahrnehmung von Säure und evtl. an der Ausbildung einer Säureresistenz beteiligt sind, ist unklar, da über die Funktion dieser Zweikomponenten-Systeme bisher nichts bekannt ist. Die Kinase CJ1262 ist nicht in der Lage, Säure als einen Umweltreiz wahrzunehmen. Die beiden Response-Regulatoren HP1043 und HP1021 spielen vermutlich eine Rolle bei der Regulation von Genen, deren Produkte eine wichtige Funktion für das vegetative Zellwachstum haben. Die Aktivität der beiden RR wird entgegen dem gängigen Zweikomponenten-System-Paradigma nicht über eine Phosphorylierung moduliert. In der vorliegenden Arbeit wurde analysiert, ob eine strikte Expressionskontrolle für die wachstumsassoziierten Funktion dieser Response-Regulatoren von Bedeutung ist. Zu diesem Zweck wurden verschieden Mutanten konstruiert, in welchen die Transkription der Gene hp1021 und hp1043 unter der Kontrolle von unterschiedlich regulierten Promotoren stattfindet. Es konnte gezeigt werden, dass die Expression des Gens hp1043 sowohl transkriptionell als auch posttranskriptionell und/oder posttranslational strikt reguliert wird. Es kann deshalb postuliert werden, dass die Aktivität des RR HP1043 über die vorhandene Konzentration an Regulator in der Bakterienzelle beeinflusst wird. Die Expression des Gens hp1021 wird nicht strikt reguliert. Auf welche Weise die Aktivität des RR HP1021 moduliert wird, bleibt unklar. N2 - Bacteria are able to adapt rapidly to alternating environmental conditions. Two component systems play a predominant role in sensing environmental stimuli and triggering a proper cellular response. The genome of Helicobacter pylori harbours only a few genes encoding for two component system proteins. The ArsRS two component system of H. pylori which controls the acid response and therefore is required for colonization of the mucus is well characterized. The kinase ArsS is activated under acidic conditions and phosphorylates the response regulator ArsR resulting in activation or repression of transcription of ArsRS-dependent target genes. The acid response of H. pylori is triggered when the pH drops from 7 to 5. Therefore, due to their side chain pKa-value of 6 seven histidine residues in the periplasmic sensor domain of the kinase ArsS were hypothesized to be involved in acid sensing. It was shown that the histidine residiue H94 is involved in the acid sensing by the histidine kinase ArsS. Substitution of H94 by the positively charged amino acid arginine did not result in a constitutively active ArsS protein. Therefore it remains unclear whether H94 contributes to the acid-sensing via protonation. Furthermore it was speculated that apart from histidine H94 other other amino acids contribute to the acid sensing of ArsS. Amongst them the aspartic acid residue D126 seems to play a predominant role. The closely related epsilon-proteobacteria Helicobacter hepaticus, Wolinella succinogenes and Campylobacter jejuni express ArsRS orthologs. Mutants of H. pylori G27 expressing the orthologous hisitine kinases WS1818, HH1607, and CJ1262 instead of the ArsS protein where constructed to investigate whether acidic pH is a common stimulus sensed by ArsS orthologs. Transcriptional analysis of the mutants revealed that the kinase WS1818 is activated under acidic conditions. The histidine kinase HH1607 also responds to acid as an environmental signal though less efficient than ArsS and WS1818. Since nothing is known about the function of the kinases HH1607 and WS1818 it remains unclear whether these proteins contribute to acid sensing and mounte an acid response in vivo in W. succinogenes and H. hepaticus. The kinase CJ1262 is not activated under acidic conditions. The response regulators HP1021 and HP1043 presumably play a role in the regulation of genes whose protein products have a fundamental function in vegetative cell growth. In contrast to the well established two component system paradigm their activity is not modulated via phosphorylation. In this work it was analyzed whether a strict control of their expression is required for the growth associated function of the respective response regulators. For this purpose several mutants were constructed in which the transcription of the genes hp1021 and hp1043 was placed under the control of different promoters. It was demonstrated that the expression of the gene hp1043 is controlled both on the transcriptional and posttranscriptional and/or posttranslational level and that this expression control is important for response regulator function. In contrast, strict expression control is not a prerequisite for the function of response regulator HP1021. KW - Helicobacter pylori KW - Säure KW - Genregulation KW - Zweikomponenten-System KW - ArsRS KW - Response-Regulator KW - HP1021 KW - HP1043 KW - two-cpmponent-system KW - ArsRS KW - response-regulator KW - HP1021 KW - HP1043 Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-36263 ER - TY - THES A1 - Hünerberg, Mirja Maaret T1 - Erstcharakterisierung des Vitamin K-Epoxid-Reduktase Komplex 1-like 1 Proteins T1 - Characterization of the Vitamin K-Epoxide Reductase Komplex 1-like 1 Protein N2 - Im Jahre 2004 wurden in unserem Labor zwei Gene einer neuen Proteinfamilie kloniert, deren Charakterisierung seither im Gange ist. Das eine Protein, VKORC1, konnte durch Mutationsanalysen und biochemische Untersuchungen als eine zentrale Komponente des so genannten Vitamin K-Zyklus identifiziert werden. Vitamin K wird für die γ-Carboxylierung der Vitamin K-abhängigen Proteine wie z.B. der Gerinnungsfaktoren II, VII, IX und X als Cofaktor der γ-Glutamyl-Carboxylase benötigt. Da Vitamin K essentiell ist, wird seine Epoxidform vom Organismus wieder in eine physiologisch aktive Hydrochinon-Form überführt. Für diese Reaktion wird die Vitamin K-Epoxid-Reduktase (VKORC1) benötigt. Mutationen in VKORC1 führen einerseits zu einem erblich bedingten Mangel an Vitamin K-abhängigen Gerinnungsfaktoren vom Typ 2 (VKCFD2) mit starken Blutungen durch eine nicht oder nur unvollständig ablaufende Blutgerinnung. Das VKORC1 ist andererseits auch das Ziel von Medikamenten der Coumaringruppe, der sog. Vitamin K-Antagonisten, die zur Verhinderung einer unzeitigen Gerinnung eingesetzt werden. In höheren Dosen wird diese Substanzklasse als Rattenbekämpfungsmittel eingesetzt. Bei manchen Rattenpopulationen, aber auch bei einigen Patienten, ist die Wirksamkeit der Coumarine durch bestimmte Mutationen im VKORC1-Protein, welche eine Warfarinresistenz hervorrufen, erheblich eingeschränkt. Zu diesem VKORC1 existiert ein paraloges Protein, das Vitamin K-Epoxid-Reduktase Komplex 1-like 1 Protein (VKORC1L1), dessen Funktion bislang unbekannt ist und welches Gegenstand der vorliegenden Arbeit war. Es wurden unterschiedliche Methoden angewandt, um das VKORC1L1-Protein zu charakterisieren und seine mögliche Funktion(en) aufzuklären. Zum einen sollte die Herstellung einer Knockout-Maus dazu dienen, durch den erhaltenen Phänotyp Hinweise auf die mögliche physiologische Aufgabe zu erhalten. Allerdings gelangten die Versuche nur bis zur Generierung der Chimären, so dass dieses Teilprojekt nicht zum Abschluss gebracht werden konnte. Die biochemische Charakterisierung des Proteins zeigte eine Expression des VKORC1L1-Gens in allen untersuchten Geweben, wobei keine starke Expression für ein bestimmtes Gewebe ermittelt werden konnte. Es konnte gezeigt werden, dass das Protein Vitamin K-Epoxid auf gleiche Weise wie das VKORC1 recyceln kann und durch Warfarin gehemmt wird. Einige der in eingeführten VKORC1L1 Mutationen vermitteln darüber hinaus eine Warfarinresistenz. Des Weiteren wurden Enzymkinetiken für die Spezies Maus und Ratte sowie für die Stachelmaus erstellt. Die erhaltenen Werte für die Michaelis-Menten-Konstante und die Maximalgeschwindigkeit sind untereinander sehr ähnlich und sprechen für eine Oxido-Reduktase-Aktivität des VKORC1L1-Proteins. Bioinformatische Analysen konzentrierten sich auf die Aufklärung von konservierten Aminosäureresten im VKORC1L1. Dadurch konnten funktionell wichtige Positionen des Proteins ermittelt werden. Ein evolutiver Stammbaum konnte weiterhin zeigen, dass die paralogen Proteine VKORC1 und VKORC1L1 sehr wahrscheinlich aus einem gemeinsamen Vorläuferprotein bei der Entwicklung der Wirbeltiere aus einer Duplikation entstanden sind und nach der Entstehung der Landwirbeltiere ihre spezifischen Funktionen ausgebildet haben. Ein Homologievergleich zwischen den humanen Chromosomen 7 und 16 und den jeweiligen Chromosomen verschiedener Spezies zeigte, dass sich nach der Duplikation die Gene für das VKORC1 und das VKORC1L1 bei fast allen betrachteten Spezies unabhängig voneinander auf verschiedenen Chromosomen evolutiv entwickelt haben. Dies ist ein weiteres Indiz dafür, dass die Duplikation schon sehr lange zurück liegt. N2 - In 2004 two genes of a new protein family were cloned in our institute. Since then the characterization of this protein family is in progress. Through mutation and biochemical analyses one protein, VKORC1, could be identified as a central component of the so-called vitamin K cycle. Vitamin K is required as a cofactor of the γ-glutamyl carboxylase for the γ-carboxylation of the vitamin K-dependent proteins such as the coagulation factors II, VII, IX and X. As vitamin K is essential, the epoxide form is again transferred by the organism into a physiologically active hydrochinone form. For this reaction vitamin K epoxide reductase (VKORC1) is necessary. On the one hand mutations in VKORC1 lead to a hereditary combined deficiency of vitamin K-dependent clotting factors of type 2 (VKCFD2) with heavy bleedings because of missing or insufficient blood coagulation. On the other hand VKORC1 is also the target of medical treatment with the coumarin derivative group, the so-called vitamin K antagonists, which are used for preventing untimely coagulation. In higher doses this class of substances is used as rodenticides. In some rat populations as well as in case of some human patients the efficiency of the coumarins is considerably reduced through specific mutations in the VKORC1 protein leading to a warfarin resistance. There is a paralogue protein to VKORC1, the vitamin K epoxide reductase complex 1-like 1 protein (VKORC1L1), the function of which is not known so far and which is the subject of this study. Different methods have been applied in order to characterize the VKORC1L1-protein and to explain its potential functions. One the one hand, the creation of a knockout mouse was to give information on potential physiological tasks through its specific phenotype. The experiments, however, were only successful as far as the creation of chimeras was concerned. Thus, this part of the project could not be completed totally. The biochemical characterization showed an expression of the VKORC1L1-gene in all tissues examined. It was, however, not possible to find a strong expression for a specific tissue. We were able to show that the protein can recycle vitamin K epoxide in the same way as VKORC1 and that it is inhibited by warfarin. Some of the mutations within the VKORC1L1 lead to a warfarin resistance. Moreover, enzyme kinetics were applied for the mouse, rat and acomys species. The calculated values of the Michaelis-Menten constant and of the maximal speed Vmax are very similar to each other and support an oxido-reductase activity for the VKORC1L1-protein. Bioinformatic analyses were focused on the explanation of the conserved amino acids within VKORC1L1. So, functionally important positions could be determined. Moreover, an evolutionary life tree showed that the paralogue proteins VKORC1 and VKORC1L1 have probably been arisen from a common precursor protein by duplication when vertebrates developed and formed its specific functions after the tetrapod vertebrates came into being. A homological comparison between the human chromosomes 7 and 16 and the corresponding chromosomes of different species showed that the duplication of the genes for VKORC1 and VKORC1L1 evolved independently of each other on different chromosomes within all species examined. This is a further indication that the duplication took place a long time ago. KW - Vitamin-K-Epoxid-Reduktase KW - VKORC1L1 KW - Vitamin K KW - VKORC1L1 KW - vitamin K Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-36166 ER - TY - THES A1 - Schneider, Hannah T1 - Untersuchung der drei Isoformen des Elongationsfaktors 1A von Xenopus laevis: 42Sp50 versus EF1A-1/EF1A-2 T1 - Analysis of the three isoforms of elongation factor 1A of Xenopus laevis: 42Sp50 versus EF1A-1/EF1A-2 N2 - Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde der monoklonale Antikörper IV´D4 biochemisch charakterisiert und die zelluläre Verteilung des Antigens mittels Immunfluoreszenz-Mikroskopie untersucht. Durch elektronenmikroskopische Lokalisierungsexperimente wurde gezeigt, dass es sich dabei um Nuage handelt. Obwohl der Antikörper eine oozytenspezifische Struktur markierte, färbte er in der Immunfluoreszenz überraschenderweise auch somatische Xenopus Kulturzellen (A6 und XTC) an. Als nächstes wurde das Antigen von IV´D4 und damit eine neue Proteinkomponente der Nuage identifiziert. Durch Immunblots von prävitellogenen Oozyten und Expression rekombinanter Proteine wurde festgestellt, dass der Antikörper das Protein 42Sp50 erkennt. Es war nicht auszuschließen, dass die Nuage lediglich die somatischen EF1A-Isoformen akkumulieren. Tatsächlich werden alle drei EF1A-Isoformen in Oozyten exprimiert, wie RT-PCR-Experimente belegten. Die ubiquitäre Expression und hohe Sequenzverwandtschaft der beiden traditionellen Xenopus EF1A-Isoformen mit denen der Säuger veranlassten uns, die Nomenklatur anzugleichen (Xenopus EF1A-1 für EF1A-S und EF1A-2 für EF1A-O). Durch Mikroinjektion entsprechender mRNAs wurden Fluoreszenz-EF1A Fusionsproteine (gekoppelt an EGFP, monomeres DsRed oder monomeres RFP) in lebenden Oozyten exprimiert und lokalisiert. Neben 42Sp50 wurde auch die zweite Proteinkomponente der 42S Partikel, 42Sp43, in Form von fluoreszierenden Fusionsproteinen in Oozyten exprimiert und lokalisiert. In einem weiteren Teil der Arbeit wurde die Dynamik der Nuage untersucht. Dazu wurden Versuche mit verschiedenen Inhibitoren durchgeführt. Es sollte überprüft werden, ob die Hemmung unterschiedlicher zellulärer Prozesse Einfluss auf die strukturelle Organisation der Nuage hat. Zu Beginn der Arbeit lagen keine Kenntnisse darüber vor, in welchem Zellkompartiment das Assembly der 42S RNPs stattfindet. Zunächst wurden deshalb die beiden Proteine 42Sp50 und 42Sp43 als fluoreszierende Fusionsproteine in prävitellogenen Ooyzten koexprimiert. Ein eindeutiger Nachweis der spezifischen Interaktion zwischen 42Sp43 und 42Sp50 gelang insbesondere durch die transiente Expression der entsprechenden fluoreszenzmarkierten Proteinpaare in somatischen Kulturzellen (Xenopus A6 und Säuger COS-7 Zellen). Die hier beschriebene Koexpression von Proteinpaaren mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen in Säugerzellen stellt eine einfache Methode dar, um in vivo Interaktionen mikroskopisch sichtbar zu machen. Damit sollte es möglich sein, durch gezielte Mutationen und Deletionen von 42Sp50 und 42Sp43 diejenigen Aminosäuren und strukturellen Determinanten zu identifzieren, die bei der spezifischen Interaktion und damit beim Assembly der 42S Partikel eine Rolle spielen. N2 - In the first part of the present work the monoclonal antibody IV´D4 was characterized biochemically and the cellular distribution of the antigen was analyzed using immunofluorescence microscopy. Electron microscopic localization experiments identified them as nuage. Although the antibody marked an oocyte specific structure, immunofluorescence surprisingly showed that it also stained somatic Xenopus culture cells (A6 and XTC). Next, the antigen recognized by IV´D4 was identified as a new protein component of nuage. By immunoblotting of previtellogenic oocytes and by expression of recombinant proteins it was observed that the antibody recognizes the protein 42Sp50. Hence, it was impossible to obtain evidence that nuage really contain 42Sp50 and therefore are sites of 42S RNP formation. It could not be excluded that nuage accumulate only somatic EF1A-isoforms. RT-PCR experiments demonstrated that in fact, all three isoforms are expressed in oocytes. The ubiquitous expression and the high sequence similarity of traditional Xenopus EF1A-isoforms prompted us to adopt the nomenclature (Xenopus EF1A-1 for EF1A-S and EF1A-2 for EF1A-2). Fluorescent EF1A fusion proteins (linked to EGFP, monomeric DsRed and monomeric RFP) were expressed and localized in living oocytes by microinjection of accordant mRNAs. Beside 42Sp50, the second protein component of the 42S particle, 42Sp43, was expressed and localized as fluorescent fusion protein in oocytes. The dynamics of nuage were analyzed in another part of the present work. For that purpose, experiments were carried out with different inhibitors. It was analyzed if the structural organization of nuage was influenced by the inhibition of different cellular processes. At the beginning of the present work it was unknown in which compartment of the cell the assembly of 42S RNPs takes place. Therefore, both proteins of the 42S particle were coexpressed in previtellogenic Xenopus oocytes as fluorescent fusion proteins. Distinct evidence for a specific interaction between 42Sp43 and 42Sp50 was obtained by transient expression of the fluorescence labeled protein pairs in somatic cuture cells (Xenopus A6 and mammalian COS7 cells). The described coexpression of protein pairs with different fluorescent dyes in mammalian cells describes a simple method to visualize in vivo interactions microscopically. By analyzing specific mutations and deletions of 42Sp50 and 42Sp43 it should be possible to identify those amino acids and structural determinants which are responsible for specific interactions important for the assembly of 42S particles. KW - Glatter Krallenfrosch KW - Elongationsfaktor 1A KW - Isoformen KW - Nuage KW - Elongation factor 1A KW - Nuage Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-36124 ER - TY - THES A1 - Braasch, Ingo T1 - Evolution by genome duplication: insights from vertebrate neural crest signaling and pigmentation pathways in teleost fishes T1 - Evolution durch Genomverdoppelung: Erkenntnisse aus Analysen der Signalwege in der Neuralleiste der Vertebraten und in den Pigmentzellen im Fisch N2 - Gene and genome duplications are major mechanisms of eukaryotic genome evolution. Three rounds of genome duplication have occurred in the vertebrate lineage, two rounds (1R, 2R) during early vertebrate evolution and a third round, the fish-specific genome duplication (FSGD), in ray-finned fishes at the base of the teleost lineage. Whole genome duplications (WGDs) are considered to facilitate speciation processes and to provide the genetic raw material for major evolutionary transitions and increases in morphological complexity. In the present study, I have used comparative genomic approaches combining molecular phylogenetic reconstructions, synteny analyses as well as gene function studies (expression analyses and knockdown experiments) to investigate the evolutionary consequences and significance of the three vertebrate WGDs. First, the evolutionary history of the endothelin signaling system consisting of endothelin ligands and receptors was reconstructed. The endothelin system is a key component for the development of a major vertebrate innovation, the neural crest. This analysis shows that the endothelin system emerged in an ancestor of the vertebrate lineage and that its members in extant vertebrate genomes are derived from the vertebrate WGDs. Each round of WGD was followed by co-evolution of the expanding endothelin ligand and receptor repertoires. This supports the importance of genome duplications for the origin and diversification of the neural crest, but also underlines a major role for the co-option of new genes into the neural crest regulatory network. Next, I have studied the impact of the FSGD on the evolution of teleost pigment cell development and differentiation. The investigation of 128 genes showed that pigmentation genes have been preferentially retained in duplicate after the FSGD so that extant teleost genomes contain around 30% more putative pigmentation genes than tetrapods. Large parts of pigment cell regulatory pathways are present in duplicate being potentially involved in teleost pigmentary innovations. There are also important differences in the retention of duplicated pigmentation genes among divergent teleost lineages. Functional studies of pigment synthesis enzymes in zebrafish and medaka, particularly of the tyrosinase family, revealed lineage-specific functional evolution of duplicated pigmentation genes in teleosts, but also pointed to anciently conserved gene functions in vertebrates. These results suggest that the FSGD has facilitated the evolution of the teleost pigmentary system, which is the most complex and diverse among vertebrates. In conclusion, the present study supports a major role of WGDs for phenotypic evolution and biodiversity in vertebrates, particularly in fish. N2 - Gen- und Genomverdopplungen sind wichtige Mechanismen der Genomevolution in Eukaryonten. Im Verlauf der Evolution der Wirbeltiere gab es drei wichtige Genomduplikationen. Zwei Genomverdopplungen (1R, 2R) fanden während der sehr frühen Vertebratenevolution statt. In der Linie der Fische kam es an der Basis der Teleostier zu einer weiteren, fischspezifischen Genomduplikation (FSGD). Man nimmt an, dass Genomduplizierungen Artbildungsprozesse begünstigen und dass sie zusätzliches genetisches Material für wichtige evolutionäre Übergänge und für die Steigerung morphologischer Komplexität erzeugen. In der vorliegenden Arbeit wurden Methoden der vergleichenden und funktionellen Genomik gewählt, um die Auswirkungen und die Bedeutung der drei Genomverdopplungen bei Vertebraten zu untersuchen. Dazu wurden molekularphylogenetische Stammbaumanalysen und Synteniedaten mit Genexpressionsstudien und Knockdown-Experimenten kombiniert. Zunächst wurde die Evolution des Endothelin-Signalsystems rekonstruiert. Dieses besteht aus Endothelin-Liganden und -Rezeptoren und hat eine Schlüsselrolle in die Entwicklung der Neuralleiste. Die Neuralleiste und die von ihr abgeleiteten Zelltypen sind wirbeltierspezifische Innovationen. Die Analyse zeigt, dass das Endothelin-System in einem gemeinsamen Vorfahren der Vertebraten entstanden ist. Die in den Genomen rezenter Vertebraten vorkommenden Komponenten des Endothelin-Systems sind durch die drei Genomverdoppelungen entstanden. Nach jeder der Duplizierungen kam es zur Ko-Evolution der Liganden- und Rezeptorenfamilien. Die Evolution des Endothelin-System unterstreicht daher die Bedeutung der Genomduplizierungen für den Ursprung und die Diversifizierung der Neuralleiste. Sie weist aber auch auf eine wichtige Rolle für die Integrierung neuer Gene in das regulatorische Netzwerk der Neuralleiste hin. Im Weiteren wurde der Einfluss der FSGD auf die Evolution der Pigmentzellentwicklung und differenzierung in Teleostiern untersucht. Die evolutionäre Analyse von 128 Genen zeigte, dass Pigmentierungsgene nach der FSGD bevorzugt in zwei Kopien erhalten geblieben sind. Daher besitzen rezente Teleostier im Vergleich zu Landwirbeltieren zusätzlich ca. 30% mehr Gene mit potentiellen Funktionen für die Pigmentierung. Große Teile der regulatorischen Signalwege in den Pigmentzellen liegen daher als zwei Kopien vor. Diese waren möglicherweise an der Evolution von Innovationen in der Körperfärbung von Teleostiern beteiligt. In der vorliegenden Arbeit wurden auch wichtige Unterschiede zwischen verschiedenen Fischgruppen im Erhalt duplizierter Pigmentierungsgene gefunden. Funktionelle Studien bei Zebrafish und bei Medaka an Enzymen der Pigmentsynthese, insbesondere der Tyrosinase-Familie, gaben Hinweise darauf, dass die funktionelle Evolution duplizierter Pigmentierungsgene in Fischen linienspezifisch verlaufen kann. Die Studien ergaben außerdem, dass bestimmte Funktionen der Pigmentsyntheseenzyme innerhalb der Vertebraten konserviert sind. Die Evolution des Pigmentierungssystems der Fische, welches das vielfältigste und komplexeste innerhalb der Wirbeltiere ist, wurde somit maßgeblich durch die FSGD beeinflusst. Zusammenfassend weisen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit darauf hin, dass die Verdopplung ganzer Genome ein wichtiger Mechanismus der phänotypische Evolution bei Vertebraten ist und damit in besonderem Maße zur ihrer Biodiversität beiträgt. KW - Molekulare Evolution KW - Fische KW - Entwicklungsbiologie KW - Evolutionsbiologie KW - Genanalyse KW - Pigmentierung KW - Melanin KW - Vertebrat KW - Neuralleiste KW - Gen-/Genomverdoppelung KW - gene/genome duplication KW - fish KW - vertebrate KW - neural crest KW - pigmentation Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-35702 ER - TY - THES A1 - Völler, Thomas T1 - Visualisierung und Manipulation neuronaler Aktivitäten im Gehirn von Drosophila melanogaster T1 - Visualization and manipulation of neuronal activity in the brain of Drosophila melanogaster N2 - In dieser Arbeit wurden zwei Techniken zur Analyse der Funktion diverser Neuronen in Drosophila melanogaster angewendet. Im ersten Teil wurde mittels in-vivo Calcium Imaging Technik unter Verwendung des Calciumsensors Cameleon neuronale Aktivität entlang des olfaktorischen Signalweges registriert. Hierbei wurde die neuronale Repräsentation der Duftidentität und der Duftintensität untersucht. In Bezug auf diese Fragestellung wurde die Datenverarbeitung und Datenanalyse weiterentwickelt und standardisiert. Die Experimente führten zu dem Ergebnis, dass duftspezifische Aktivitätsmuster auf der Ebene des Antennallobus sehr gut unterscheidbar sind. Manche Aktivitätsmuster der präsentierten Düfte zeigten interessanterweise einen hohen Ähnlichkeitsgrad, wohingegen andere unähnlich waren. In höheren Gehirnzentren wie den Orten der terminalen Aborisationen der Projektionsneurone oder den Pilzkörper Kenyonzellen liegt eine starke Variabilität der duftevozierten Aktivitätsmuster vor, was generelle Interpretationen unmöglich macht und höchstens Vergleiche innerhalb eines Individuums zulässt. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Calciumsignale in den Rezeptorneuronen sowie prä- und postsynaptisch in den Projektionsneuronen bei Erhöhung der Konzentration der verschiedenen präsentierten Düfte über einen Bereich von mindestens drei Größenordnungen ansteigen. In den Kenyonzellen des Pilzkörper-Calyx und der Pilzkörper-Loben ist diese Konzentrationsabhängigkeit weniger deutlich ausgeprägt und im Falle der Loben nur für bestimmte Düfte detektierbar. Eine Bestätigung des postulierten „sparsed code“ der Duftpräsentation in den Pilzkörpern konnte in dieser Arbeit nicht erbracht werden, was möglicherweise daran liegt, dass eine Einzelzellauflösung mit der verwendeten Technik nicht erreicht werden kann. Im zweiten Teil dieser Arbeit sollte durch die Nutzung des lichtabhängigen Kationenkanals Channelrhodopsin-2 der Frage nachgegangen werden, ob bestimmte modulatorische Neurone die verstärkenden Eigenschaften eines bestrafenden oder belohnenden Stimulus vermitteln. Die lichtinduzierte Aktivierung von Channelrhodopsin-2 exprimierenden dopaminergen Neuronen als Ersatz für einen aversiven Reiz führte bei einer olfaktorischen Konditionierung bei Larven zur Bildung eines aversiven assoziativen Gedächtnisses. Im Gegensatz dazu induzierte die Aktivierung von Channelrhodopsin-2 in oktopaminergen/tyraminergen Neuronen als Ersatz für einen appetitiven Reiz ein appetitives assoziatives Gedächtnis. Diese Ergebnisse zeigen, dass dopaminerge Neurone bei Larven aversives Duftlernen, oktopaminerge/tyraminerge Neurone dagegen appetitives Duftlernen induzieren. N2 - In this work two different techniques were used to determine the functions of various neurons in the brain of Drosophila melanogaster. First, by using in vivo calcium imaging and the calcium indicator cameleon odor-evoked neuronal activity was monitored along the olfactory pathway. How are odor identity and odor intensity represented in the fruit fly brain? To investigate this question we improved and standardized the data processing and data analysis. The experiments reveal that calcium activity patterns elicited by different odors are distinguishable in the antennal lobe. Interestingly, the patterns evoked by some odors show a high degree of similarity whereas those of other odors show less similarity in this analyzed neuropile. In higher brain centers like the region of the terminal aborizations of the projection neurons and the mushroom body Kenyon cells the odor evoked activity patterns are highly variable allowing no general interpretations but only comparison of patterns within fruit flies. Furthermore this work demonstrates an odor concentration dependent activity in the olfactory receptor neurons as well as pre- and postsynaptically in the projection neurons. In the Kenyon cells of the mushroom body calyx this concentration dependency is less clear and in the mushroom body lobes it seems that there is a concentration dependency only for specific odors. So far we have no evidence for the postulated so called “sparsed code” of odor representation in the mushroom body which might be due to limited resolution of the technique used in this work. In the second part of my work we used the light-dependent cation channel channelrhodopsin-2 and asked the question whether specific modulatory neurons mediate the reinforcing properties of a rewarding or punishing stimulus. Light-induced activation of dopaminergic neurons expressing channelrhodopsin-2 caused aversive associative memory formation in an aversiv olfactory conditioning paradigm for Drosophila larvae. Conversely, the artificial activation of octopaminergic/tyraminergic neurons by channelrhodopsin-2 induced appetitive associative memory. The conclusion is that dopaminergic neurons trigger aversive odor learning whereas octopaminergic/tyraminergic neurons trigger appetitive odor learning. KW - Taufliege KW - Calcium KW - Calciumkonzentration KW - Calcium-bindende Proteine KW - Klassische Konditionierung KW - Drosophila KW - in-vivo Calcium-Imaging KW - Cameleon KW - Channelrhodopsin KW - Light-activation Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-35589 ER - TY - THES A1 - Franz, Mirjam T1 - Analyse der Hangover Funktion während der Entwicklung von Ethanol-induziertem Verhalten T1 - Analysis of the Hangover function during the development of ethanol-induced behaviour N2 - Die Entwicklung von Ethanoltoleranz ist ein Indikator für eine mögliche Abhängigkeit von Alkohol. Der genaue molekulare Mechanismus der Ethanoltoleranzentwicklung ist jedoch nicht bekannt. Drosophila ermöglicht die molekulare und phänotypische Untersuchung von verschiedenen Mutanten mit veränderter Toleranz und kann so zu einem besseren Verständnis beitragen. Die hangAE10 Mutante entwickelt eine reduzierte Ethanoltoleranz, wobei dieser Phänotyp auf Defekte in der zellulären Stressantwort zurückzuführen ist. Für ein besseres Verständnis, in welchen molekularen Mechanismen bzw. Signalwegen HANG wirkt, wurde die Funktion des Proteins auf zellulärer Ebene analysiert und mögliche Zielgene charakterisiert. Die auffällige Proteinstruktur von HANG spricht für eine Interaktion mit Nukleinsäuren. Immunhistochemische Analysen von ektopisch exprimiertem Hangover Protein ergaben, dass dieses nicht mit der DNA co-lokalisiert und auch nicht an polytänen Chromosomen nachgewiesen werden kann. Die ektopische Expression von HANG in Speicheldrüsenzellen zeigte eine punktförmige Verteilung des Proteins innerhalb des Zellkerns. Dieses punktförmige Expressionsmuster wird häufig in RNA-bindenden Proteinen gefunden. Deshalb wurden Co-Lokalisationsstudien von HANG mit Markern für RNAmodifizierende Proteine durchgeführt. Dabei wurde keine Interaktion mit verschiedenen Markerproteinen des Spleißapparates gefunden. Mithilfe von in vitro Experimenten konnte aber die Bindung von RNA an bestimmten Hangover Proteinbereichen nachgewiesen werden Diese Ergebnisse legen nahe, dass HANG eine RNA-regulierende Funktion hat. In einem cDNA Microarray Experiment wurde das Gen dunce als mögliches Zielgen von Hangover identifiziert. Das Gen dunce kodiert für eine Phosphodiesterase, welche spezifisch cAMP hydrolysiert. Zur Bestätigung der cDNA Microarray Experimente wurden die dnc Transkriptunterschiede in Wildtyp und hangAE10 Mutante mithilfe von semiquantitativer RT-PCR für jede der vier Gruppen untersucht. Dabei konnte eine Reduktion der dncRMRA-Transkriptgruppe in hangAE10 Mutanten nachgewiesen werden. Aufgrund dieser Ergebnisse wurde die dncRMRA -spezifische dncΔ143 Mutante hergestellt und auf Verhaltensebene analysiert. Die Experimente zeigten, dass sowohl dnc1, als auch die dncΔ143 Mutante eine reduzierte Ethanoltoleranz und Defekte in der zellulären Stressantwort aufweisen. Für die Rettung der reduzierten Toleranz von hangAE10 und dncΔ143 in dncRMRA-spezifischen Neuronen wurde die dncRMRA Promotor- GAL4 Linie hergestellt. Die reduzierte Ethanoltoleranz der dncΔ143 Mutanten konnte über die Expression von UAS-dnc mit der dncRMRA-GAL4 Linie auf Wildtyp Level gerettet werden. Die reduzierte Toleranz der hangAE10 Mutante konnte mithilfe derselben GAL4 Linie verbessert werden. Dies beweist, dass in beiden Mutanten dieselben Zellen für die Entwicklung von Ethanoltoleranz benötigt werden und sie wahrscheinlich in der gleichen Signaltransduktionskaskade eine Funktion haben. Aufgrund der Anfälligkeit der UAS/ GAL4 Systems gegenüber Hitze war es außerdem nicht möglich die Defekte der zellulären Stressantwort von dncΔ143 bzw. hangAE10 Fliegen zu retten. Die Rettung der reduzierten Ethanoltoleranz der dcnΔ143 Mutante führte außerdem zu der Vermutung, dass die cAMP Regulation eine wichtige Funktion bei der Ethanoltoleranzentwicklung hat. Über die Expression von cAMP-regulierenden Proteinen in dncRMRA-spezifischen Neuronen wurde der Einfluss von cAMP bei Ethanol-induziertem Verhalten überprüft. Bei der Überexpression von dunce und rutabaga konnte weder eine Veränderung für die Ethanolsensitivität, noch für die Toleranzentwicklung festgestellt werden. Eine Erklärung hierfür wäre, dass Veränderungen in der cAMP Konzentration über Rückkopplungsmechanismen zwischen Dunce und Rutabaga ausgeglichen werden können. Für eine genauere Aussage müsste jedoch die cAMP Konzentration in diesen Fliegen gemessen werden. Die Überexpression von pka- in dncRMRA spezifischen Zellen führt zu einer erhöhten Ethanolresistenz. Das bedeutet, dass die Modulation der cAMP Konzentration durch dunce und rutabaga in dncRMRA spezifischen Zellen keinen Einfluss auf Ethanol-induziertes Verhalten hat, wohingegen die Stärke der cAMP vermittelten Signalverarbeitung über die cAMP-abhängige PKA zu Veränderungen im Verhalten führt. Für Mutanten des cAMP Signalweges ist außerdem bekannt, dass sie Defekte im olfaktorischen Lernen bzw. Gedächtnis aufweisen. Deshalb wurden die dncΔ143, dnc1 und hangAE10 Mutanten in diesem Paradigma getestet. Sowohl dnc1, als auch dncΔ143 Fliegen zeigten einen reduzierten Performance Index für das zwei und 30 Minuten Gedächtnis. Nach 180 Minuten verhielten sich die dncΔ143 Mutanten nicht mehr unterschiedlich zum Wildtyp, die dnc1 Mutante zeigte jedoch immer noch eine Reduktion des Performance Index im Vergleich zur Kontrolle. Demnach ist in dncΔ143 Mutanten nur das Kurzzeitgedächtnis betroffen, wohingegen hangAE10 Mutanten keine Reduktion des Performance Index für das olfaktorische Kurzzeitgedächtnis aufweisen. Die unterschiedlichen Ergebnisse der beiden Mutanten in der Gedächtnisentwicklung deuten außerdem daraufhin, dass Lernen und Gedächtnis in dncΔ143 und hangAE10 Mutanten von der Toleranzentwicklung unabhängig über unterschiedliche cAMP-abhängige Signaltransduktionskaskaden reguliert werden. N2 - The development of ethanol tolerance is an indicator for a possible alcohol addiction. However the correct molecular mechanism of ethanol tolerance development is not known. The model organism Drosophila allows molecular and phenotypic observations of several mutants with altered ethanol tolerance (Scholz et al., 2000). HangAE10 mutants develop reduced ethanol tolerance because of defects in the cellular stress response (Scholz et al., 2005). For a better understanding of molecular mechanisms or signaling pathways, HANG putative target genes were identified, characterized and the protein function was analyzed on cellular level. The Hangover protein has 16 zinc finger domains, two of them are found in RNA modifying proteins (Scholz et al., 2005; Nelissen et al., 1991). This striking protein structure argues for an interaction of HANG with nucleic acids. In immunohistochemical studies with an ectopically expressed Hangover protein neither colocalization with DNA nor detectable Hangover binding on polytene chromosomes was observed. The ectopic expression of HANG in salivary glands shows a speckled protein distribution in the nucleus, which is similar to the expression pattern in RNA modifying proteins (Spector, 2001). Therefore colocalization studies of HANG with markers for RNA modifying proteins were performed. However no interaction with nucleoli was found. Certain factors of the splicing machinery also show no colocalization with Hangover. Since the studies were done with ectopically expressed protein, the results do not necessarily reflect the wild type behavior of HANG, as the interaction partner is not expressed in a comparable amount. RNA binding to specific parts of the Hangover protein was detected by in vitro experiments. Furthermore wild type expression of Hangover in neuronal cells shows the typical speckled distribution of RNA modifying proteins. These results suggest a RNA regulating function of HANG. In cDNA microarray experiments dunce was identified as a putative target gene of Hangover (Klebes and Scholz, unpublished data). The gene dunce encodes a phosphodiesterase that specifically hydrolyses cAMP (Davis and Kiger, 1981). The 14 dnc transcripts can be divided into four groups based on their length and function (http://flybase.org/; Qiu et al., 1993). To confirm the results of the cDNA microarray experiments, semiquantitative RT-PCRs were performed to analyze the differences in dnc transcript levels between wild type and hangAE10 mutants for each dnc group. A reduced amount of dncRMRA transcripts was observed in hangAE10 mutants. On the basis of these results the dncRMRA transcript specific dncΔ143 mutant was generated (Saratsis, 2006) and tested on behavioral level. Behavioral analysis of dnc1 and dncΔ143 mutants showed reduced ethanol tolerance and defects in the cellular stress response. For rescue experiments of reduced ethanol tolerance in hangAE10 and dncΔ143 mutants in specific dncRMRA neurons, the promotor dncRMRA-GAL4 line was generated (Saratsis, 2006). In-situ hybridization studies suggested that the expression pattern of dncRMRA-GAL4 reflects the endogenous expression of the dncRMRA transcripts. For unambiguous results colocalization studies with a specific DncRMRA antibody has to be done. The dncRMRA-GAL4 line shows a broad expression pattern, with transgene expression in about every 200th cell in the brain. It innervates the antennal lobes, parts of the mushroom body and regions of the central complex. The reduced ethanol tolerance in dncΔ143 mutants was rescued to wild type level by expressing UAS-dnc with the promotor dncRMRA-GAL4 line. Whereas the reduced ethanol tolerance in hangAE10 mutants was advanced by expressing UAS-hang with the same GAL4 line. This demonstrates that both mutants involve the same set of neurons for developing ethanol tolerance and probably act in the same signaling pathway. Expression studies showed that dncRMRA lies downstream of hang. The attempt to rescue the reduced ethanol tolerance in hangAE10 flies by expressing dnc using dncRMRA-GAL4 line did not advance the tolerance in these flies. An obvious explanation is that HANG does not only regulate dunce but also other genes and these regulation defects in hangAE10 mutants cannot be reversed by dnc expression. Due to the sensitivity of the UAS/ GAL4 system towards heat it was impossible to rescue the cellular stress response defects in dncΔ143 and hangAE10 mutants. The rescue of the dncΔ143 tolerance phenotype resulted in the assumption that cAMP regulation has an important function in the development of ethanol tolerance. The effect of cAMP on ethanol induced behavior should be tested by expression of cAMP regulating proteins in dncRMRA specific neurons. There the overexpression of dunce should result in an increase and the overexpression of rutabaga should lead to a decrease in cAMP levels. However, for both experiments there was neither a change in ethanol sensitivity nor in ethanol tolerance. An explanation would be that changes in cAMP concentration could be balanced by feedback loops between Dunce and Rutabaga. For a decisive conclusion the cAMP concentration in these flies has to be measured. Overexpressing pka-c, a gene that encodes the catalytic subunit of PKA in dncRMRA specific cells, leads to a higher resistance towards ethanol. This shows that the modulation of cAMP level by Dunce and Rutabaga has no effect on ethanol induced behavior in dncRMRA specific cells. Whereas the intensity of cAMP mediated signaling processes result in behavioral changes. Several mutants of the cAMP signaling pathway are impaired in olfactory learning and memory. Therefore dnc1, dncΔ143 and hangAE10 mutants were tested in this paradigm. Dnc1 as well as dncΔ143 flies showed reduced performance indices two and 30 minutes memory. After 180 minutes the performance index of dncΔ143 mutants was not significantly different from wild type whereas dnc1 mutants still had a reduction in comparison to wild type. Thus, dncΔ143 mutants have defects in short-term memory whereas short-term memory of hangAE10 mutants is not affected. However it is not known how hangAE10 flies will perform for mid-term and long-term memory formation. Similar to memory formation there exist different phases of tolerance development. To detect, if the long-term or the short-term form of tolerance is affected, the kinetic of tolerance development was investigated for dncΔ143 and hangAE10 mutants. In dncΔ143 mutants the first phase of tolerance development is defective, whereas in hangAE10 mutants the early and the late phase seem to be affected. Thus a part of the reduced tolerance in hangAE10 and the complete reduction in dncΔ143 mutants could be due to defects in the same signaling pathway regulated via cAMP. The variable results for the development of short-term memory in both mutants indicate that memory formation in dncΔ143 and hangAE10 mutants is independent of ethanol tolerance development and is regulated by different cAMP signaling pathways. KW - Taufliege KW - Tachyphylaxie KW - Alkohol KW - Erfahrungsorientiertes Lernen KW - Drosophila KW - Ethanoltolerance KW - dunce KW - hangover Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-35591 ER - TY - THES A1 - Li, Naixin T1 - Dorso-ventral Differentiation and Specification of the Mesencephalon in Early Chick Embryos T1 - Die dorsoventrale Differenzierung und Spezifikation des frühen embryonalen Hühnermittelhirn N2 - The chick midbrain is subdivided into functionally distinct ventral and dorsal domains, tegmentum and optic tectum. In the mature tectum, neurons are organized in layers, while they form discrete nuclei in the tegmentum. An interesting characteristic of the embryonic brain is the development of a large optic tectum, of which the growth becomes obvious at embryonic day 3 (E3). Dorsoventral (DV) specification of the early midbrain should thus play a crucial role for the organization of the neuronal circuitry in optic tectum and tegmentum. In the first part of my thesis, I investigated regional commitment and establishment of cellular differences along the midbrain DV axis. I examined the commitment of gene expression patterns in isolated ventral and dorsal tissue in vivo and in vitro, and studied their cell mixing properties. Explant cultures, and grafting of dorsal midbrain into a ventral environment or vice versa, revealed a gradual increase in the autonomy of region-specific gene regulation between, which was accompanied by a gradual increase in differential adhesive properties from E2 to E3, once the DV axis polarity was fixed. These events happened at a time-point when the majority of midbrain cells are not yet differentiated. Long-term transplantation (6 - 9 days) using quail cells from ventral midbrain as grafts showed the same result. Hence, the results suggest that progressive specification of the midbrain DV axis is accompanied by progressively reduced cell mixing between dorsal and ventral precursors, leading to a partial regionalization of midbrain tissue into autonomous units of precursor cell populations. In the second part I investigated the genes that might be involved in regulating the growth of the tectum. In particular, I focused on the role of Pax7 transcription factor, a paired domain protein. The results suggested that Pax7 was involved in regulating the medial-lateral extension of the tectum. Over expression of Pax7 in dorsal midbrain led to an enlarged tectum accompanied by a raise in cell division, while Pax7 knockdown by shrank caused a reduction in tectum. The overall pattern of neuronal differentiation was not disturbed by an up or down regulation of Pax7. Pax7 also positively regulated Pax3, another pair-ruled gene expressed dorsally. These results suggest that Pax7 very likely together with Pax3 could facilitate or maintain neural cell proliferation in the midbrain at early stages and that a regulation of the size in that region does not influence the neuronal patterning of the developmental field. I further checked the expression and function of a GFPase Rab 23, that was suggested to be involved in the DV patterning in mouse neural tube as a negative regulator of Shh signaling. Overexpression of Rab23 indicated that it facilitated the expression of Pax7 and Pax3 in the neural tube and suppressed ventral genes like Nkx6.1 cell autonomously, however, it did not disturb neuronal patterning. Interestingly, a thorough expression study of Rab 23 during chick early development revealed that Rab23 is already expressed very early and asymmetrically during gastrulation, suggesting a possible role of Rab23 on the left-right determination of Hensen’s node. In combination with the result that Rab23 is expressed in the notochord early in development, I assume that both Rab23 and Shh exist in all neural progenitor cells initially, and when their expression patterns separate gradually the neural cells adopt a ventral or dorsal fate according to their location along the dorsoventral axis. The avian embryo is a classic system used widely to investigate questions of vertebrate development. The easy and cheap accessibility of the embryo for in ovo or ex ovo experiments all around the year make it an ideal animal model to work with. The only recently developed method of over expressing genes in specific cells or regions in the chick embryo by electroporation enabled me to study different ways of gene suppression using this way of gene transfection. Thus, I compared the effect of long-hairpin and short hairpin dsRNA in different vectors and antisense morpholino oligonucleotides. The results revealed that all hairpin dsRNA constructs did reduce gene and protein expression often accompanied by morphological changes. Most efficiently were shRNAi constructs cloned into a siRNA-specific vector – pSilencer 1.0-U6. Gene silencing was already well observed 36 hours after transfection. In comparison antisense morpholino oligonucleotides did not show such big gene reduction as the shRNA in pSilencer. Taken together, this methodical research proposes that the shRNA in the pSilencer vector was a good and effective tool to reduce gene and protein expression locally. N2 - Das Mittelhirn des Huhns wird in funktionel unterschiedliche, ventrale und dorsale Regionen eingeteilt, nämlich das Tegmentum ventral und das optisches Tectum dorsal. Im vollentwickelten Tectum bilden Nervenzellen Schichten, während das Tegmentum aus unterschiedlichen Nuclei besteht. Ein charakteristisches Merkmal des embryonalen Gehirns ist die Entwicklung eines großen optischen Techtums, die am dritten embryonalen Tag (E3) sehr deutlich zu beobachten ist. Diese unterschiedliche funktionelle und morphologische Entwicklung des Mittelhirns deutet daraufhin, das die dorsoventrale Spezifikation des frühen Mittelhirns für der Organisation neuronaler Netzwerke im optischen Tectum und Tegmentum eine kritische Rolle spielt. Im ersten Teil dieser Doktorarbeit wurde die regionale Bestimmung und Bildung zellulärer Unterschiede entlang der DV Achse des Mittelhirns untersucht. Dafür bestimmte ich den Zeitpunkt, an dem spezifische ventrale und dorsale Genexpressionsmuster festgelegt werden in isoliertem ventralen und dorsalen Gewebe in vivo and in vitro. Desweiteren untersuchte ich die Entwicklung unterschiedlicher adhäsiver Eigenschaften von ventralen und dorsalen Zellen in vitro. Explantatkulturen und Transplantationen von dorsalem Mittelhirn in eine ventrale Umgebung oder vice versa liessen eine schrittweise Zunahme der Autonomie der region-spezifischen Genregulation erkennen. Dies wurde von einer schrittweisen Zunahme des differentialen Adhäsionsverhaltens von ventralen und dorsalen Mittelhirnzellen von E2 zu E3 begleitet, der Zeitspanne, in der die Polarität der DV Achse festgelegt wurde. Diese Entwicklungsprozesse fanden u einem Zeitpunkt statt, an dem die meisten Zellen des Mittelhirns noch nicht differenziert hatten. Transplantationen,. von ventralen Mittelhirnzellen der Wachtel ins dorsale Hühnertecctum, die erst nach mehreren Tagen (6 - 9 Tage) untersucht wurden, zeigten das gleiche Ergebnis. Diese Ergebnisse lassen schliessen, dass eine partielle Regionalisierung des Mittelhirns in autonome Einheiten von Vorläuferzellen der dorsoventralen Achse stattfindet. Dies erlaubt den Zellen eine Positionsidentität zu bewahren – unhabhängig von der wachsenden Distanz zu Signalzentren. Im zweiten Teil meiner Arbeit untersuchte ich Gene, die das Wachstum und die spezifische Entwicklung des Tectums regulieren könnten. Die Arbeit konzentrierte sich speziell auf die Rolle von Pax7, ein Mitglied der sogenannten ‚pair-ruled’ Familie von Transkriptionsfaktoren, und auf die Rolle von Rab23, einer GTPase, die den Shh-Signalweg im dorsalen Neuralrohr inhibiert. Dieser Versuch zeigte, dass Pax7 an der Regulation der medio-lateral Ausdehnung des Tectums beteiligt ist. Überexpression von Pax7 im dorsalen Mittelhirn führte zu einer Vergrößerung des Tectums, die von einer Zunahme der Zellteilung begleitet wurde, während Knockdown von Pax7 eine Größereduktion des Tectums verursachte. Das neuronale Differenzierungsmuster im generellen wurde nicht von der Überexpression oder Repression von Pax7 gestört. Pax7 induzierte ausserdem Pax3, ein Mitglied derselben Familie, das ebenfalls dorsal exprimiert wird und unterdrückte ventrale Gene wie Nkx6.1. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass Pax7, sehr wahrscheinlich zusammen mit Pax3, die neural Zellproliferation im Mittelhirn in frühen Entwicklungsstadien fördert oder auf einem konstanten Level hält und dass die Muster der neuronalen Entwicklung nicht durch der Regulation der Größe dieser Region beeinflusst wird. Außerdem förderte Rab 23, das sehr wahrscheinlich ein negativer Regulator von Shh ist, die Expression von Pax7 und Pax3 im ventralen Mittelhirn und unterdrückte ventrale Gene wie Nkx6.1. Die Überexpression von Rab 23 beeinflusste auch nicht das neuronale Differenzierungsmusterung. Interessanterweise zeigte eine genaue Analyse der Expression von Rab 23 während der frühen Entwicklungsstadien des Huhns, dass Rab 23 bereits sehr früh und asymmetrisch während der Gastrulation exprimiert wurde. Dies deutet auf eine mögliche Rolle von Rab 23 für die links-rechts Determination des Hensen´s node an. Betrachtet man diese Ergebnisse zusammen, dann könnte man zu fogender Schlussfolgerung kommen, nämlich, dass sowohl Rab 23 als auch Shh früh in allen neural Progenitorzellen existieren, und dass die neuralen Zellen jeweils nach ihrer Lage entlang der dorsoventral Achse ein ventrales oder dorsales Schicksal annehmen, wenn das sich die Expressionsmuster von Rab 23 und Shh allmänlich trennen. Der Vogelembryo ist ein klassisches und häufig benutztes System, um die Entwicklung der Vertebraten zu untersuchen. Die einfache und preiswerte Zugänglichkeit des Embryos für in ovo oder ex ovo Experiment das ganze Jahr über machen ihn zu einem idealen Tiermodell. Die in den letzten Jahren entwickelte Methode der Elektroporation eines Embryos zum Gentransfer in die Zellen, ermöglichte es mir unterschiedliche Weisen der Genunterdrückung in embryonalem Gewebe zu testen und zu vergleichen.Ich verglich in dieser Untersuchung die Wirkung von langen und kurzen Haarnadel-RNAs (hairpin RNA) in verschieden Vektoren mit der Wirkung von Antisense-morpholino-Oligonucleotiden verglichen. Die Ergebnisse zeigten, dass alle Haarnadel-dsRNA-Konstruktionen die Gen- und Proteinexpression reduzierten, wobei es häufig zu einer morphologischen Veränderung kam. Die kurze shRNAi-Konstruktionen, die in einen siRNA-spezifischen Vektor – pSilencer 1.0-U6 - geklont wurden war, zeigte sich dabei am effizientesten.. Die Herunterregulierung der Gene wurde bereits 36 Stunden nach der Transfektion beobachtet. Im Gegensatz dazu, zeigten die Antisense-Morpholino-Oligonucleotiden keine solche starke Reduktion wie das shRNA in pSilencer. Zusammenfassend zeigt diese methodische Untersuchung, dass die shRNA im pSilencer-Vektor ein gutes und effektives Werkzeug ist, um Gen- und Proteinexpression örtlich zu reduzieren. KW - Differenzierung KW - Embryo KW - Genexpression KW - Mittelhirn KW - Spezifikation KW - Dorso-ventral Patterning KW - Mesencephalon KW - Morpholino KW - Neuronal Proliferation KW - Pax3 KW - Pax7 KW - Rab23 KW - Shh KW - siRNA KW - Transplantation Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-32950 ER -