TY  - THES
A1  - Zimnol, Anna
T1  - Relevance of angiotensin II type 1a receptor and NADPH oxidase for the formation of angiotensin II-mediated DNA damage
T1  - Relevanz des Angiotensin II Typ 1a-Rezeptors und der NADPH-Oxidase für die Entstehung Angiotensin II-vermittelter DNA-Schäden
N2  - Das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System (RAAS) reguliert den Blutdruck sowie den Elektrolyt- und Wasserhaushalt. Das aktive Peptid, Angiotensin II (AngII), führt dabei zur Vasokonstriktion und in höheren Konzentrationen zu Bluthochdruck. Hypertensive Patienten haben ein erhöhtes Risiko an Krebs zu erkranken, vor allem an Nierenkrebs. Wir konnten bereits in vivo zeigen, dass AngII in der Lage ist, den Blutdruck zu steigern und dosisabhängig zu DNA-Schäden über den Angiotensin II Typ 1-Rezeptor (AT1R) führt. Ein stimuliertes RAAS kann ferner über die Aktivierung der NADPH-Oxidase, einer Hauptquelle der Generierung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) in der Zelle, zu oxidativem Stress führen. Zielsetzung dieser Arbeit war es zum einen, mit Hilfe von AT1a-Rezeptor-defizienten Mäusen in vivo zu prüfen, ob die Bildung von ROS, sowie die Bildung von DNA-Schäden in der Niere und im Herzen unabhängig von einem erhöhten Blutdruck auftreten. Zum anderen sollte, ebenfalls in vivo, untersucht werden, ob eine oder beide von zwei untersuchten Isoformen der NADPH-Oxidase (Nox) für die Auslösung oxidativen Stresses in der Niere verantwortlich ist. 
Zunächst wurden für den Versuch zur Überprüfung der Abhängigkeit AngII-induzierter DNA-Schäden vom Blutdruck männliche C57BL/6-Mäuse und AT1a-Knockout (KO)-Mäuse mit osmotischen Minipumpen ausgestattet, die AngII in einer Konzentrationen von 600 ng/kg min über einen Zeitraum von 28 Tagen abgaben. Zusätzlich wurde eine Gruppe von AngII-behandelten Wildtyp (WT)-Mäusen mit dem AT1-Rezeptor-Blocker Candesartan (Cand) behandelt. Während des Versuchszeitraumes fanden regelmäßige, nicht-invasive Blutdruckmessungen an den wachen Mäusen statt. In WT-Mäusen induzierte AngII Bluthochdruck, verursachte erhöhte Albumin-Level im Urin und führte zur Bildung von ROS in Niere und im Herzen. Außerdem traten in dieser Gruppe DNA-Schäden in Form von Einzel- und Doppelstrangbrüchen auf. All diese Reaktionen auf AngII konnten jedoch durch gleichzeitige Behandlung mit Cand verhindert werden. AT1a-KO-Mäuse hatten, verglichen mit WT-Kontrollmäusen, einen signifikant niedrigeren Blutdruck und normale Albumin-Level im Urin. In AT1a-KO-Mäusen, die mit AngII behandelt wurden, konnte kein Anstieg des systolischen Blutdrucks sowie kein Einfluss auf die Nierenfunktion gefunden werden. Jedoch führte AngII in dieser Gruppe zu einer Steigerung von ROS in der Niere und im Herzen. Zusätzlich wurden genomische Schäden, vor allem in Form von Doppelstrangbrüchen signifikant in dieser Gruppe induziert. Auch wenn AT1a-KO-Tiere, unabhängig von einer AngII-Infusion, keine eingeschränkte Nierenfunktion zeigten, so wiesen sie erhebliche histopathologische Schäden im Hinblick auf die Glomeruli und das Tubulussystem auf. Diese Art von Schäden deuten auf eine besondere Bedeutung des AT1aR im Hinblick auf die embryonale Entwicklung der Niere hin. Zusammenfassend beweisen die Ergebnisse dieses Experiments eindeutig, dass eine AngII-induzierte ROS-Produktion und die Induktion von DNA-Schäden unabhängig von einem erhöhten Blutdruck auftreten. Da in der AngII-behandelten AT1a-KO-Gruppe eine signifikant höhere Expression des AT1b-Rezeptors zu finden war und die Blockade von beiden Rezeptorsubtypen mit Cand zu einer Verhinderung der schädlichen Effekte durch AngII führte, scheint der AT1bR im Falle einer AT1aR-Defizienz für die Entstehung der Schäden zuständig zu sein. 
Ziel des zweiten Experimentes war es, den Beitrag der Nox2 und Nox4 zum oxidativen DNA-Schaden in vivo zu untersuchen. Hierfür wurden männliche C57BL/6-Mäuse und Nox2- oder Nox4-defiziente Mäuse mit osmotischen Minipumpen ausgestattet, die AngII in einer Konzentration von 600 ng/kg min über einen Zeitraum von 28 Tagen abgaben. Im WT-Stamm und in beiden Nox-defizienten Stämmen induzierte AngII Bluthochdruck, verursachte erhöhte Albumin-Level im Urin und führte zur Bildung von ROS in der Niere. Außerdem waren in allen AngII-behandelten Gruppen genomische Schäden, vor allem in Form von Doppelstrangbrüchen, erhöht. Auch in Abwesenheit von AngII wiesen Nox2- und Nox4-defiziente Mäuse mehr Doppelstrangbrüche im Vergleich zu WT-Kontrollmäusen auf. Interessanterweise kompensieren allerdings weder Nox2 noch Nox4 das Fehlen der jeweils anderen Isoform auf RNA-Basis. Aufgrund dieser Ergebnisse schließen wir, dass bislang keine Isoform alleine für die Generierung von oxidativen DNA-Schäden in der Niere verantwortlich gemacht werden kann und dass eine Beteiligung einer weiteren Nox-Isoform sehr wahrscheinlich ist. Möglicherweise könnten aber auch andere ROS-generierende Enzyme, wie Xanthinoxidase oder Stickoxidsynthase involviert sein. Da genomische Schäden in Nieren von Nox2- und Nox4-defizienten Mäusen in Abwesenheit von AngII gegenüber den Schäden in WT-Kontrollmäusen erhöht waren, könnten die beiden Isoformen auch eine schützende Funktion im Bereich von Nierenkrankheiten übernehmen. Da dies aber bislang nur für Nox4 beschrieben ist, ist es wahrscheinlicher, dass das Fehlen von einer der beiden Isoformen eher einen Einfluss auf die Embryonalentwicklung hat. Um dies jedoch abschließend zu klären wäre es sinnvoll mit induzierbaren Knockout-Modellen zu arbeiten, bei denen mögliche entwicklungsbedingte Effekte minimiert werden können.
N2  - The renin-angiotensin-aldosterone system (RAAS) regulates blood pressure, electrolyte metabolism and water balance. The reactive peptide, Angiotensin II (AngII), of the RAAS causes vasoconstriction and, in higher concentrations, increased blood pressure. Hypertensive patients have an increased risk to develop cancer, especially kidney cancer. We have shown in vivo, that AngII is capable to cause an elevation of blood pressure, as well as DNA damage dose-dependently via the AngII type 1 receptor (AT1R). A stimulated RAAS can further lead to oxidative stress by activating NADPH oxidases which are major enzymatic sources of reactive oxygen species (ROS) in the cell. On the one hand the aim of this work was to examine in vivo with the help of AT1aR-deficient mice whether the formation of ROS and DNA damage in the kidney and the heart occur independently of an increased blood pressure. On the other hand we wanted to investigate whether one or both of the two examined isoforms of the NADPH oxidase (Nox) is responsible for the triggering of oxidative stress in the kidney. 
For the purpose of the first experiment which examined the dependency of AngII-induced DNA damage on blood pressure, male C57BL/6-mice and AT1a-knockout (KO)-mice were equipped with osmotic minipumps, delivering AngII in a concentration of 600 ng/kg x min during 28 days. Additionally, wild-type (WT) mice were treated with the AT1R antagonist candesartan (cand). Over the whole time period, frequent non-invasive blood pressure measurements were taken. In WT mice, AngII induced hypertension, an elevated urinary albumin level and formation of ROS in kidney and heart. Furthermore, genomic damage, in form of single- and double strand breaks, was augmented in this group. All these responses to AngII could be attenuated by concurrent administration of candesartan. AT1a-deficient mice had lower basal systolic pressures than WT mice and comparable urinary albumin levels. In AT1a-deficient mice treated with AngII, systolic pressure was not increased, and no effect on renal function could be detected. However, AngII led to an increase of ROS in kidney and heart in this group. In addition, genomic damage, especially in form of double strand breaks was significantly induced. Although AT1a-KO-mice, independent of an AngII-infusion, showed no renal impairment they had significant histopathological changes in glomeruli and tubules. This points to a special importance of AT1aR with regard to the embryonic development of the kidney. In summary our results clearly demonstrate that AngII-induced ROS production and DNA damage is independent of blood pressure. Since we found a significantly higher expression of the AT1bR in the AngII-treated AT1aR-KO-group and since blocking of both subtypes with cand resulted in a complete prevention of adverse AngII effects, the receptor responsible for the mediation of these effects seems to be AT1bR. 
The aim of the second experiment was to examine the contribution of Nox2 and Nox4 to oxidative DNA damage in vivo. Therefore male C57BL/6-mice and Nox2- or Nox4-deficient mice were equipped with osmotic minipumps, delivering AngII in a concentration of 600 ng/kg × min during 28 days. In WT and in both strains of Nox-deficient mice, AngII induced hypertension, elevated urinary albumin levels and formation of ROS in the kidney. Furthermore, genomic damage, especially in form of double strand breaks were augmented in all of the AngII-treated groups. Also in the absence of AngII, Nox2- and Nox4-deficient mice exhibited a higher background of double strand breaks. Interestingly neither Nox2 nor Nox4 do not compensate for the deficiency of the other isoform on mRNA level. Due to these results we conclude that there is no isoform so far which is solely responsible for the generation of ROS in the kidney under AngII-treatment. Potentially there might also be a contribution of other enzymes like xanthine oxidase or nitric oxide synthase to the formation of ROS. Since genomic damage in kidneys of Nox2- and Nox4-deficient mice in the absence of AngII was higher as compared to the damages in WT control mice it might be that both isoforms could have a protective role in renal disease. But, since this is so far only described for Nox4 it is likely that the absence of one of the two isoforms rather has an influence on the embryonic development. To finally clarify this hypothesis it would be suggestive to work with inducible knockout mouse models where possible developmental effects can be minimized.
KW  - Angiotensin II
KW  - NADPH-Oxidase
KW  - DNS-Schädigung
KW  - Oxidativer Stress
KW  - Angiotensin II
KW  - NADPH oxidase
KW  - angiotensin II type 1a receptor
KW  - DNA damage
KW  - oxidative stress
KW  - Angiotensin II Typ 1a-Rezeptor
Y1  - 2017
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-137469
ER  - 
TY  - THES
A1  - Schmid, Ursula
T1  - Protection against oxidative DNA damage by antioxidants, hormone-receptor blockers and HMG-CoA-reductase inhibitors
T1  - Schutz vor oxidativen DNA-Schäden durch Antioxidantien, Hormonrezeptorantagonisten und HMG-CoA-Reduktase-Inhibitoren
N2  - In the course of this study, several endogenous compounds and model substances were used to mimic the conditions in patients suffering from hypertension. As endogenous compounds, angiotensin II and aldosterone were chosen. As model substances, 4-nitroquinoline-1-oxide (NQO), hydrogen peroxide and phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) were selected. Benfotiamine as well as α-tocopherol proved in the course of the experiments to be able to prevent angiotensin II-induced formation of oxidative DNA strand breaks and micronuclei. This could be due to a prior inhibition of the release of reactive oxygen species and is in contrast to results which were achieved using thiamine. Furthermore, experiments in which cells were pre-incubated with benfotiamine followed by incubation with NQO showed that benfotiamine was not able to prevent the induction of oxidative stress. The hypothesis that benfotiamine has, like α-tocopherol, direct antioxidative capacity was fortified by measurements in cell free systems. In brief, a new working mechanism for benfotiamine in addition to the ones already known could be provided. In the second part of the study, angiotensin II was shown to be dose-dependently genotoxic. This effect is mediated via the angiotensin II type 1 receptor (AT1R) which. Further experiments were extended from in vitro settings to the isolated perfused kidney. Here it could be shown that angiotensin II caused vasoconstriction and DNA strand breaks. Co-perfusion of kidneys with angiotensin II and candesartan prevented vasoconstriction and formation of strand breaks. DNA strand break formation due to mechanical stress or hypoxia could be ruled out after additional experiments with the thromboxane mimetic U 46619. Detailed investigation of the DNA damage in vitro revealed that angiotensin II induces single strand breaks, double strand breaks and 8-hydroxydeoxyguanosine (8-oxodG)-adducts as well as abasic sites. Investigations of the effects of aldosterone-treatment in kidney cells showed an increase of oxidative stress, DNA strand breaks and micronuclei which could be prevented by the steroidal mineralocorticoid receptor antagonist eplerenone. Additional experiments with the non-steroidal mineralocorticoid receptor antagonist (S)-BR-4628 revealed that this substance was also able to prevent oxidative stress and genomic damage and proved to be more potent than eplerenone. In vivo, hyperaldosteronism was imitated in rats by aid of the deoxycorticosteroneacetate (DOCA) salt model. After this treatment, levels of DNA strand breaks and chromosomal aberrations in the kidney could be observed. Furthermore, an increase in the release of ROS could be measured. Treatment of these animals with spironolactone , BR-4628 and enalaprile revealed that all antagonists were effective BR-4628 was the most potent drug. Finally, rosuvastatin was investigated. In HL-60 cells phorbol 12-myristate 13-acetate caused oxidative stress. Rosuvastatin was able to prevent the release of ROS and subsequent oxidative DNA damage when co-incubated with PMA. Furthermore, not only an inhibition of PMA-induced oxidative stress but also inhibition of the unspecific release of ROS induced by hydrogen peroxide was observable. Addition of farnesyl pyrophosphate (FPP), geranylgeranyl pyrophosphate (GGPP), and mevalonate, intermediates of the cholesterol pathway, caused only a marginal increase of oxidative stress in cells treated simultaneously with PMA and rosuvastatin, thus indicating the effect of rosuvastatin to be HMG-CoA-reductase-independent. Investigation of the gene expression of subunits of NAD(P)H oxidase revealed a down-regulation of p67phox following rosuvastatin-treatment. Furthermore, it could be shown that rosuvastatin treatment alone or in combination with PMA increased total glutathione levels probably due to an induction of the gene expression and enzyme activity of γ-glutamylcysteine synthetase (γ-GCS).
N2  - Im Zuge dieser Studie wurden sowohl endogene Substanzen als auch Modellsubstanzen eingesetzt, um die pathologischen Verhältnisse in Patienten, die an Bluthochdruck leiden, zu imitieren. Als endogene Substanzen wurden Angiotensin II und Aldosteron ausgewählt. Als Modellsubstanzen wurden 4-Nitrochinolin-1-oxid (NQO), Wasserstoffperoxid und Phorbol-12-myristat-13-gewählt. Der erste Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit zwei Vitaminen, nämlich Benfotiamin und α-Tocopherol. Sowohl Benfotiamin als auch α-Tocopherol zeigten im Laufe der Experimente, dass sie in der Lage sind, durch Angiotensin II verursachte DNA-Strangbrüche und chromosomale Aberrationen zu verhindern. Dies ist möglicherweise auf eine ebenfalls beobachtbare vorausgegangene Inhibition der Freisetzung reaktiver Sauerstoffspezies zurückzuführen. Zusammenfassend konnte ein neuer Wirkmechanismus für Benfotiamin vorgestellt werden. Im zweiten Teil dieser Studie konnte nachgewiesen werden, dass Angiotensin II eine dosisabhängige Gentoxizität verursacht. Dieser Effekt wird durch den Angiotensin II-Rezeptor Typ 1 vermittelt. Im weiteren Verlauf der Studie wurden die in vitro Experimente auf das Modell der isolierten perfundierten Mäuseniere ausgeweitet. Hier konnte gezeigt werden, dass Angiotensin II Vasokonstriktion und DNA-Strangbrüche verursacht. Co-Perfusion der Nieren mit Angiotensin II und Candesartan verhinderte hingegen die Vasokonstriktion und die Bildung von DNA-Strangbrüchen. Die Verursachung von Strangbrüchen durch mechanischen Stress oder Hypoxie konnte ausgeschlossen werden. Die Untersuchung der ex vivo beobachteten DNA-Schäden in vitro ließ erkennen, dass Angiotensin II Einzelstrangbrüche, Doppelstrangbrüche, die Bildung des DNA-Addukts 8-OxodG und abasische Stellen induziert. Ein Reparatur-Comet Assay, parallel durchgeführt mit der Messung des phosphorylierten Histons 2AX (γ-H2AX) über 24 h, zeigte eine vollständige Reparatur der Einzelstrangbrüche, wohingegen die Zahl der Doppelstrangbrüche in diesem Zeitraum sogar zunahm. Untersuchungen der Effekte, die eine Aldosteron-Behandlung auf Nierenzellen hat, zeigten einen Anstieg des oxidativen Stress, der DNA Strangbrüche und der Mikrokerne. Diese Effekte konnten durch Eplerenon verhindert werden. Weitere Experimente mit dem nicht-steroidalen Mineralocorticoid Rezeptor-Antagonisten (S)-BR-4628 zeigten, dass auch diese Substanz oxidativen Stress und DNA Schäden verhindern konnte, im Gegensatz hierzu hatte das (R)-Isomer, das keine Aktivität am Mineralocorticoid Rezeptor zeigt, keine präventiven Effekte. In vivo wurde der Hyperaldosteronismus mit Hilfe des Deoxycorticosteronacetat- (DOCA) Salzmodells nachgeahmt. Unter dieser Behandlung konnten Level an DNA-Strangbrüchen und chromosomalen Aberrationen beobachtet werden. Des Weiteren konnten in den DOCA-Tieren erhöhte Level an oxidativem Stress gemessen werden. Wurden die Versuchstiere zusätzlich zur DOCA-Behandlung mit Spironolacton, BR-4628 und dem Enalapril behandelt, konnte gezeigt werden, dass BR-4628 potenter war als Spironolacton Enalapril. Zuletzt wurde mit Rosuvastatin eine Substanz untersucht, die die antioxidative Abwehr der Zellen aktivieren kann. In der humanen Leukämie-Zelllinie HL-60 verursachte Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) oxidativen Stress. Rosuvastatin war in der Lage, die Freisetzung von ROS und daraus resultierende DNA-Strangbrüche bei Co-Inkubation mit PMA zu verhindern. Außerdem konnte gezeigt werden, dass Rosuvastatin nicht nur PMA-induzierten oxidativen Stress, sondern auch die unspezifische Wasserstoffperoxid-induzierte Freisetzung von ROS verhinderte. Die Untersuchung der Genexpression von Untereinheiten der NAD(P)H Oxidase ergab, dass p67phox nach Rosuvastatin-Behandlung herabreguliert wurde. Behandlung mit Rosuvastatin allein oder zusammen mit PMA konnte außerdem die Glutathion-Spiegel erhöhen. Dies ist vermutlich auf die Induktion der Genexpression und der Enzymaktivität der γ-Glutamylcystein-Synthetase (γ-GCS), des Schrittmacherenzyms des Glutathionsystems, zurückzuführen.
KW  - Oxidativer Stress
KW  - Angiotensin II
KW  - Angiotensin-II-Blocker
KW  - Aldosteron
KW  - Aldosteronantagonist
KW  - Renin-Angiotensin-System
KW  - Benfotiamin
KW  - Statin
KW  - Di
KW  - DNA-Schaden
KW  - Mikrokerne
KW  - Comet Assay
KW  - DNA damage
KW  - Micronuclei
KW  - Comet Assay
Y1  - 2008
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-28379
ER  - 
TY  - THES
A1  - Hartmann, Michael
T1  - Charakterisierung inaktivierender posttranslationaler Modifikationen des GC-A-Rezeptors für das atriale natriuretische Peptid (ANP)
T1  - Characterization of inactivating post-translational modifications of the GC-A receptor for the atrial natriuretic peptide (ANP)
N2  - Das atriale natriuretische Peptid (ANP) wird infolge einer Zunahme des atrialen Drucks aus den Myozyten des Atriums sezerniert. Es spielt lokal eine bedeutende, protektive Rolle und wirkt der Entstehung von Herzhypertrophie und Fibrose entgegen. Darüber hinaus kommt ANP vor allem eine wichtige Rolle als endokrines Hormon zu, das den arteriellen Blutdruck und das Blutvolumen regelt. Diese physiologischen Effekte vermittelt das Herzhormon durch seinen Rezeptor, das Transmembranprotein Guanylatzyklase A (GC-A). Durch Bindung von ANP an die extrazelluläre Domäne der GC-A wird intrazellulär, durch die katalytische Domäne des Rezeptors, der sekundäre Botenstoff cGMP gebildet. Patienten mit einer, durch Bluthochdruck verursachten Herzhypertrophie und Herzinsuffizienz weisen erhöhte ANP-Konzentrationen im Plasma auf. Die durch ANP vermittelten, protektiven Effekte sind allerdings vermindert. Zahlreiche Studien haben in vitro gezeigt, dass die chronische Inkubation der GC-A mit ihrem Liganden, sowie die Behandlung von GC-A exprimierenden Zellen mit Hormonen wie Angiotensin II, zur Desensitisierung des Rezeptors führen. Der Verlust der Funktionsfähigkeit geht einher mit der Dephosphorylierung des Rezeptors an spezifischen, intrazellulär lokalisierten Aminosäuren. Durch die Erforschung dieses Mechanismus und Identifizierung möglicher Interaktionspartner in vivo könnte der Grundstein für neue oder verbesserte Therapieformen gelegt werden.
Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde eine kürzlich identifizierte Isoform des GC-A-Rezeptors identifiziert, die durch alternatives Spleißen des Exons 4 entsteht und in einer Vielzahl untersuchter Gewebe der Maus vorkommt. Die Deletion umfasst 51 Basenpaare und resultiert in einem um 17 Aminosäuren verkürzten GC-A-Rezeptor (GC-AΔLys314-Gln330). Molekulare Modellierungen der extrazellulären Domänen des wildtypischen GC-A-Rezeptors und der Isoform zeigten, dass sich die Deletion im membrannahen Bereich der extrazellulären Domäne und damit deutlich entfernt von der ANP-Bindungsdomäne befindet. Oberflächenbiotinylierungs- und Zellfraktionierungsversuche zeigten, dass die Isoform des GC-A-Rezeptors an der Oberfläche von Zellmembranen transient transfizierter HEK 293-Zellen präsentiert wird. Jedoch zeigten die ANP-Stimulationsexperimente unter Anwendung von cGMP-Radioimmunassay (cGMP-RIA) und Förster-Resonanzenergietransfer (FRET)-Messungen, dass die Isoform nicht zur ANP-vermittelten intrazellulären cGMP-Bildung stimuliert werden kann. Im Rahmen von ANP-Bindungsstudien mit 125I-ANP wurde gezeigt, dass GC-AΔLys314-Gln330 die Fähigkeit zur Bindung des Liganden ANP verloren hat. Jedoch zeigten die Koimmunpräzipitationsversuche, dass die Isoform des GC-A-Rezeptors Heterodimere mit dem wildtypischen GC-A-Rezeptor bilden und dadurch die ligandeninduzierte Bildung von cGMP reduzieren kann. In vivo konnte gezeigt werden, dass unter Angiotensin II-induzierter Hypertonie die mRNA-Expression für GC-AΔLys314-Gln330 in der Lunge gesteigert, und gleichzeitig die ANP-vermittelte cGMP-Bildung deutlich reduziert ist. Daher kann davon ausgegangen werden, dass das alternative Spleißen ein regulierender Mechanismus ist, der auf den ANP/GC-A-Signalweg Einfluss nimmt. Angiotensin II-induziertes alternatives Spleißen des GC-A-Gens kann daher einen neuen Mechanismus für die Verringerung der Sensitivität des GC-A-Rezeptors gegenüber ANP darstellen.

Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurden transgene Tiere mit kardiomyozytenspezifischer Überexpression eines Epitop-getaggten GC-A-Rezeptors generiert. Durch dieses Modell sollte es ermöglicht werden, den Rezeptor aus murinem Gewebe anreichern und aufreinigen zu können um danach Analysen zu posttranslationalen Veränderungen und möglichen Interaktionspartnern durchzuführen. Zunächst wurde in eine FLAG-Epitop-getaggte GC-A zusätzlich ein HA-tag, sowie eine Erkennungssequenz für die Protease des tobacco etch virus (TEV) eingefügt. Die Expression und Funktionsfähigkeit des modifizierten Rezeptors wurde durch ANP-Stimulationsexperimente unter Anwendung von cGMP-RIA und FRET-Messungen verifiziert. Die Funktionsfähigkeit der TEV-Erkennungssequenz wurde durch die Elution mittels TEV-Protease nach Immunpräzipitation (IP) nachgewiesen. In vivo wurde an Mäusen die Expression und Lokalisation der GC-A auf Proteinebene, unter Anwendung von Zellfraktionierungsexperimenten und Immunpräzipitationen, überprüft. Die entstandenen transgenen Tiere zeigten eine deutliche, in den Zellmembranen von Kardiomyozyten lokalisierte, Überexpression des Rezeptors. Dieser konnte über das HA-tag angereichert und aufgereinigt werden. Um die Funktionsfähigkeit des modifizierten Rezeptors in vivo nachzuweisen, wurde in zwei Versuchsreihen kardiale Hypertrophie durch chronische Applikation von Angiotensin II induziert. Es wurde postuliert, dass die Überexpression funktionsfähiger GC-A im Herzen die Tiere vor Herzhypertrophie schützt. Die Ergebnisse der Studien zeigen allerdings, dass die generierten transgene Tiere trotz kardiomyozytenspezifischer Überexpression des Rezeptors nicht den erwarteten Schutz vor Herzhypertrophie aufwiesen, sondern ähnlich wie ihre wildtypischen Geschwistertiere reagieren. Jedoch gelang es mit Hilfe des Überexpressionsmodells zusammen mit anderen Mitarbeitern der AG Kuhn eine zuvor in vitro beschriebene Interaktion des GC-A-Rezeptors mit den Kationenkanälen TRPC3 und TRPC6 in vivo nachzuweisen. Somit besteht die Möglichkeit die Epitope und das murine Überexpressionsmodell auch zukünftig zu nutzen, um Interaktionspartner der GC-A zu identifizieren.
N2  - Atrial natriuretic peptide (ANP) is released from cardiac atrialand less ventricular myocytes in response to increased volume or pressure load. It has crucial local functions preventing pathological cardiac hypertrophy and fibrosis. Besides this ANP has a critical endocrine role in the maintenance of arterial blood pressure and blood volume. The physiological actions of this cardiac hormone are mediated through the transmembrane receptor guanylyl cyclase A (GC-A). Upon binding of ANP to the extracellular domain of the receptor the intracellular catalytic domain produces the second messenger cGMP. Patients with hypertensive cardiac hypertrophy and congestive heart failure show markedly increased levels of ANP but the protective, GC-A mediated effects are markedly blunted. Several in vitro studies have shown that chronic treatment of GC-A expressing cells with its ligand or growth hormones, i.e. Angiotensin II, lead to desensitization of the receptor by dephosphorylation of specific intracellular amino acids. Understanding the mechanisms of these posttranslational modifications and possible involved proteins in vivo may help to design new therapeutic approaches restoring GC-A activity in heart failure patients.
In the first part of this study a novel isoform of GC-A (GC-AΔLys314-Gln330) was characterized. This isoform was found ubiquitiously within the murine organism and is the result of differential splicing of exon 4. The resulting deletion of a 51-bp sequence is predicted to delete 17 amino acids in the membrane-distal part of the extracellular domain. Molecular modelling of the extracellular domain auf GC-A wt and the isoform suggested that the deletion does not directly alter the ligand binding domain of the receptor. Cell biotinylation assays and cell fractionation of transiently transfected HEK 293 cells showed, that the isoform is predominantly expressed and localized within the membrane of these cells. However functional studies in transfected HEK 293 cells using FRET and cGMP-RIA to measure intracellular cGMP formation demonstrated that ANP-induced cGMP formation was totally abolished for GC-AΔLys314-Gln330. Binding studies with 125I-ANP revealed that the isoform does not bind ANP. Co-immunoprecipitation experiments showed the ability of the isoform to form heterodimers with the wild type receptor, thereby inhibiting the ANP-induced intracellular cGMP formation. In vivo studies with Angiotensin II resulted in enhanced mRNA expression of GC-AΔLys314-Gln330 in the lungs of Angiotensin II treated mice. Notably the ANP-mediated formation of cGMP by isolated membranes of the lung was significantly reduced. Therefore it can be assumed that alternative splicing of GC-A might be a regulatory mechanism inhibiting the ANP/GC-A signaling pathway. Angiotensin II-induced alternative splicing of the GC-A gene may thus represent a novel mechanism for reducing the sensitivity of GC-A for it‘s ligand.

In the second part of this study transgenic mice with a cardiomyocyte specific overexpression of an epitope tagged GC-A were generated to enable enrichment and purification of the receptor from the heart for biochemical analyses. First a FLAG-tagged GC-A receptor was modified by inserting an additional HA-tag and a restriction site for the protease of tobacco etch virus (TEV). The expression and function of the modified receptor was verified using whole cell stimulation and FRET to determine cGMP formation and IP experiments to test the elution with the protease of TEV. The expression levels and localization of GC-A in cardiomyocytes were analyzed using cell fractionation and immunoprecipitation experiments which showed a clear overexpression within the membranes of cardiomyocytes. It was possible to enrich and purify the GC-A from isolated cardiomyocytes using the HA-tag. Two cardiac hypertrophy studies using chronic administration of Angiotensin II were performed to verify the overexpression of a functional GC-A receptor. Based on the literature it was postulated that transgenic mice are potentially protected from hypertension induced cardiac hypertrophy. Despite verified overexpression of GC-A within the cardiomyocytes of transgenic animals no differences, compared to their littermates, could be found for the relevant hypertrophy parameters. However by using the mice with overexpression of the HA-tagged GC-A we could verify an interaction of GC-A with the cation channels TRPC3 and TRPC6 in vivo. Therefore this model might be a useful tool to identify more interaction partners and posttranslational modifications of the GC-A receptor.
KW  - Guanylatzyklase
KW  - Überexpression
KW  - RNS-Spleißen
KW  - Atriales natriuretisches Hormon
KW  - Atriales natriuretisches Peptid
KW  - guanylyl cylcase A
KW  - ANP
KW  - GC-A
KW  - Angiotensin II
Y1  - 2014
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-97959
ER  -