TY - JOUR A1 - Lambeets, Kevin A1 - Vandegehuchte, Martijn L. A1 - Maelfait, Jean-Pierre A1 - Bonte, Dries T1 - Understanding the impact of flooding on trait-displacements and shifts in assemblage structure of predatory arthropods on river banks N2 - 1. Species assemblages of naturally disturbed habitats are governed by the prevailing disturbance regime. Consequently, stochastic flood events affect river banks and the inhabiting biota. Predatory arthropods occupy predominantly river banks in relation to specific habitat conditions. Therefore, species sorting and stochastic processes as induced by flooding are supposed to play important roles in structuring riparian arthropod assemblages in relation to their habitat preference and dispersal ability. 2. To ascertain whether assemblages of spiders and carabid beetles from disturbed river banks are structured by stochastic or sorting mechanisms, diversity patterns and assemblage-wide trait-displacements were assessed based on pitfall sampling data. We tested if flooding disturbance within a lowland river reach affects diversity patterns and trait distribution in both groups. 3. Whereas the number of riparian spider species decreased considerably with increased flooding, carabid beetle diversity benefited from intermediate degrees of flooding. Moreover, regression analyses revealed trait-displacements, reflecting sorting mechanisms particularly for spiders. Increased flooding disturbance was associated with assemblage-wide increases of niche breadth, shading and hygrophilic preference and ballooning propensity for spider (sub)families. Trait patterns were comparable for Bembidiini carabids, but were less univocal for Pterostichini species. Body size decreased for lycosid spiders and Bembidiini carabids with increased flooding, but increased in linyphiid spiders and Pterostichini carabids. 4. Our results indicate that mainly riparian species are disfavoured by either too high or too low degrees of disturbance, whereas eurytopic species benefit from increased flooding. Anthropogenic alterations of flooding disturbance constrain the distribution of common hygrophilous species and/or species with high dispersal ability, inducing shifts towards less specialized arthropod assemblages. River banks with divergent degrees of flooding impact should be maintained throughout dynamic lowland river reaches in order to preserve typical riparian arthropod assemblages. KW - Flussufer KW - body size KW - dispersal ability KW - niche breadth KW - riparian ecology KW - trait-displacement Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-49580 ER - TY - JOUR A1 - Bonte, Dries A1 - Travis, Justin M. J. A1 - De Clercq, Nele A1 - Zwertvaegher, Ingrid A1 - Lens, Luc T1 - Thermal conditions during juvenile development affect adult dispersal in a spider N2 - Abstract: Understanding the causes and consequences of dispersal is a prerequisite for the effective management of natural populations. Rather than treating dispersal as a fixed trait, it should be considered a plastic process that responds to both genetic and environmental conditions. Here, we consider how the ambient temperature experienced by juvenile Erigone atra, a spider inhabiting crop habitat, influences adult dispersal. This species exhibits 2 distinct forms of dispersal, ballooning (long distance) and rappelling (short distance). Using a half-sib design we raised individuals under 4 different temperature regimes and quantified the spiders' propensity to balloon and to rappel. Additionally, as an indicator of investment in settlement, we determined the size of the webs build by the spiders following dispersal. The optimal temperature regimes for reproduction and overall dispersal investment were 20 °C and 25 °C. Propensity to perform short-distance movements was lowest at 15 °C, whereas for long-distance dispersal it was lowest at 30 °C. Plasticity in dispersal was in the direction predicted on the basis of the risks associated with seasonal changes in habitat availability; long-distance ballooning occurred more frequently under cooler, spring-like conditions and short-distance rappelling under warmer, summer-like conditions. Based on these findings, we conclude that thermal conditions during development provide juvenile spiders with information about the environmental conditions they are likely to encounter as adults and that this information influences the spider's dispersal strategy. Climate change may result in suboptimal adult dispersal behavior, with potentially deleterious population level consequences. KW - Erigone atra KW - emigration KW - dispersal distance KW - immigration KW - behavior KW - plasticity KW - silk KW - body condition KW - seasonality Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48691 ER - TY - JOUR A1 - Gros, Andreas A1 - Hovestadt, Thomas A1 - Poethke, Hans Joachim T1 - Evolution of sex-biased dispersal : the role of sex-specific dispersal costs, demographic stochasticity, and inbreeding N2 - Abstract: Inbreeding avoidance and asymmetric competition over resources have both been identified as factors favoring the evolution of sex-biased dispersal. It has also been recognized that sex-specific costs of dispersal would select for sex-biased dispersal, but there is little quantitative information on this aspect. In this paper we explore (i) the quantitative relationship between cost-asymmetry and a bias in dispersal, (ii) the influence of demographic stochasticity on this effect, and (iii) how inbreeding and cost-asymmetry interact in their effect on sex-specific dispersal. We adjust an existing analytical model to account for sex-specific costs of dispersal. Based on numerical calculations we predict a severe bias in dispersal already for small differences in dispersal costs. We corroborate these predictions in individual-based simulations, but show that demographic stochasticity generally leads to more balanced dispersal. In combination with inbreeding, cost asymmetries will usually determine which of the two sexes becomes the more dispersive. KW - asymmetric dispersal costs KW - kin-selection KW - numerical model KW - individual-based simulations Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48705 ER - TY - JOUR A1 - Bonte, Dries A1 - Maes, Dirk T1 - Trampling affects the distribution of specialised coastal dune arthropods N2 - Abstract: From a conservation point of view, species- tolerances towards disturbance are often generalised and lack reference to spatial scales and underlying processes. In order to investigate how average typical species react to habitat fragmentation and disturbance, we adopted a multi-species approach to address occupancy patterns of five specialised dune arthropods (butterflies Hipparchia semele, Issoria lathonia; grasshopper Oedipoda caerulescens; spiders Alopecosa fabrilis, Xysticus sabulosus) in recently fragmented coastal dune habitats which are subjected to varying levels and modes of local disturbance, i.e. trampling by cattle or people. Occupancy patterns were assessed during two successive years in 133 grey dune fragments of the Flemish coastal dunes (Belgium, France). By treating species as a random factor in our models, emphasis was placed on generalisations rather than documenting species-specific patterns. Our study demonstrates that deteriorating effects of local disturbance on arthropod incidence cannot be interpreted independent of its landscape context, and appear to be more severe when patch area and connectivity decrease. When controlled for patch area and trampling intensity, the probability of species occupancy in poorly connected patches is higher under cattle trampling than under recreation. Incidences additionally decrease with increasing intensity of cattle trampling, but increases with trampling by tourists. This study provides evidence of mode- and landscape-dependent effects of local disturbance on species occupancy patterns. Most importantly, it demonstrates that trampling of sensitive dune fragments will lead to local and metapopulation extinction in landscapes where trampling occurs in a spatially autocorrelated way, but that the outcome (spatial patterns) varies in relation to disturbance mode, indicating that effects of disturbance cannot be generalised. KW - Araneae KW - grazing KW - grey dunes KW - Lepidoptera KW - multispecies metapopulation KW - Orthoptera KW - recreation KW - trampling Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48274 ER - TY - JOUR A1 - Bonte, Dries A1 - Lanckacker, Kjell A1 - Wiersma, Elisabeth A1 - Lens, Luc T1 - Web building flexibility of an orb-web spider in a heterogeneous agricultural landscape N2 - Abstract: Intensification of land-use in agricultural landscapes is responsible for a decline of biodiversity which provide important ecosystem services like pest-control. Changes in landscape composition may also induce behavioural changes of predators in response to variation in the biotic or abiotic environment. By controlling for environmentally confounding factors, we here demonstrate that the orb web spider Araneus diadematus alters its web building behaviour in response to changes in the composition of agricultural landscapes. Thereby, the species increases its foraging efficiency (i.e. investments in silk and web asymmetry) with an increase of agricultural land-use at intermediate spatial scales. This intensification is also related to a decrease in the abundance of larger prey. A negative effect of landscape properties at similar spatial scales on spider fitness was recorded when controlling for relative investments in capture thread length. This study consequently documents the web building flexibility in response to changes in landscape composition, possibly due to changes in prey availability. KW - Araneus diadematus KW - Araneidae KW - behavioural flexibility KW - orb web geometry KW - landscape KW - model selection KW - semi-natural habitats Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48262 ER - TY - JOUR A1 - Bonte, Dries A1 - Hovestadt, Thomas A1 - Poethke, Hans-Joachim T1 - Male-killing endosymbionts: influence of environmental conditions on persistance of host metapopulation N2 - Background: Male killing endosymbionts manipulate their arthropod host reproduction by only allowing female embryos to develop into infected females and killing all male offspring. Because of the reproductive manipulation, we expect them to have an effect on the evolution of host dispersal rates. In addition, male killing endosymbionts are expected to approach fixation when fitness of infected individuals is larger than that of uninfected ones and when transmission from mother to offspring is nearly perfect. They then vanish as the host population crashes. High observed infection rates and among-population variation in natural systems can consequently not be explained if defense mechanisms are absent and when transmission efficiency is perfect. Results: By simulating the host-endosymbiont dynamics in an individual-based metapopulation model we show that male killing endosymbionts increase host dispersal rates. No fitness compensations were built into the model for male killing endosymbionts, but they spread as a group beneficial trait. Host and parasite populations face extinction under panmictic conditions, i.e. conditions that favor the evolution of high dispersal in hosts. On the other hand, deterministic 'curing' (only parasite goes extinct) can occur under conditions of low dispersal, e.g. under low environmental stochasticity and high dispersal mortality. However, high and stable infection rates can be maintained in metapopulations over a considerable spectrum of conditions favoring intermediate levels of dispersal in the host. Conclusion: Male killing endosymbionts without explicit fitness compensation spread as a group selected trait into a metapopulation. Emergent feedbacks through increased evolutionary stable dispersal rates provide an alternative explanation for both, the high male-killing endosymbiont infection rates and the high among-population variation in local infection rates reported for some natural systems. KW - Metapopulation KW - Parasit KW - Wirt KW - Endosymbiont KW - Theoretische Ökologie KW - Host-parasite interactions KW - individual-based model Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-45344 ER - TY - JOUR A1 - Poethke, Hans J. ; A1 - Liebig, Jürgen T1 - Risk-sensitive foraging and the evolution of cooperative breeding and reproductive skew N2 - Abstract: Background Group formation and food sharing in animals may reduce variance in resource supply to breeding individuals. For some species it has thus been interpreted as a mechanism of risk avoidance. However, in many groups reproduction is extremely skewed. In such groups resources are not shared equally among the members and inter-individual variance in resource supply may be extreme. The potential consequences of this aspect of group living have not attained much attention in the context of risk sensitive foraging. Results We develop a model of individually foraging animals that share resources for reproduction. The model allows analyzing how mean foraging success, inter-individual variance of foraging success, and the cost of reproduction and offspring raising influence the benefit of group formation and resource sharing. Our model shows that the effects are diametrically opposed in egalitarian groups versus groups with high reproductive skew. For individuals in egalitarian groups the relative benefit of group formation increases under conditions of increasing variance in foraging success and decreasing cost of reproduction. On the other hand individuals in groups with high skew will profit from group formation under conditions of decreasing variance in individual foraging success and increasing cost of reproduction. Conclusion The model clearly demonstrates that reproductive skew qualitatively changes the influence of food sharing on the reproductive output of groups. It shows that the individual benefits of variance reduction in egalitarian groups and variance enhancement in groups with reproductive skew depend critically on ecological and life-history parameters. Our model of risk-sensitive foraging thus allows comparing animal societies as different as spiders and birds in a single framework. Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48214 ER - TY - THES A1 - Reichert, Nina T1 - The Role of LIN9 in Mouse Development T1 - Die Rolle von LIN9 in der Mausentwicklung N2 - LINC, the human homologue of an evolutionary conserved complex, regulates the transcription of a set of genes essential during the G2/M transition (Osterloh et al., 2007; Schmit et al., 2007). One component of the LINC core module is LIN-9. LIN-9 is essential for the transcriptional activation of LINC target genes and also promotes differentiation in association with pRB (Gagrica et al., 2004). However, nothing is known about its function in vivo. Histological and molecular analysis revealed that Lin9 is ubiquitously expressed throughout embryonic development and in all examined adult organs. Additionally, Lin9 mRNA is expressed in ES cells and blastocysts. Moreover the analogous distribution of the other LINC components suggested that they all function in the same cells and most likely in the same pathway. To deeper investigate the role of LIN9 in cell cycle and differentiation in vivo, a Lin9 gene trap mouse model (GT) was successfully generated and examined. Heterozygouse Lin9GT/+ mice were inconspicuous and develop normally. However, homozygouse knockout embryos were never obtained. The Lin9GT/GT embryos die at peri-implantation, probably due to a defect in the development of the epiblast, which could be shown with in situ hybridization with specific lineage markers. In vitro, the ICM of Lin9-deficient blastocysts did not develop properly. These data suggest that the loss of Lin9 leads to embryonic lethality at peri-implantation, and indicates that LIN9 is required for proper formation of the epiblast. In parallel, the first conditional Lin9 mouse model based on the Cre-loxP technology was generated. The Lin9fl/fl allele can be deleted by Cre-recombinase, in vivo and in vitro. Therefore an inducible system with Lin9fl/fl mice harboring Cre-ERT2 was established. The MEFs generated from these transgenic mice carried a nearly complete knockout upon induction with tamoxifen. Deletion of LIN9 in MEFs had a major impact upon the cell cycle and growth rates. Specifically, they arrested in G2/M phase and stopped to proliferate. Taken together, I was able to generate a lin9 gene trap and a lin9 conditional knockout mouse model. All results obtained so far demonstrate, that Lin9 is an essential gene for embryonic development and cell cycle control. It will be of great interest to further investigate Lin9-deficiency to gain insights into the mechanism of cell cycle control in early embryonic development and cell differentiation. N2 - LINC, das humane Homolog eines evolutionär konservierten Komplexes, reguliert die Transkription von Genen, die essentiell für die G2/M Transition sind (Osterloh et al., 2007; Schmit et al., 2007). Eine Komponente des LINC Komplexes ist LIN-9. LIN-9 ist für die transkriptionelle Aktivierung LINC spezifischer Zielgene essentiell und kann, in Assoziation mit pRB, die Differenzierung humaner Zellen fördern (Gagrica et al., 2004). Bisher ist jedoch nichts über die in vivo Funktion LIN9s bekannt. Histologische und molekulare Analysen der Maus machen deutlich, dass Lin9 während der embryonalen Entwicklung und in allen untersuchten adulten Organen ubiquitär exprimiert wird. Zusätzlich wird Lin9 mRNA in ES Zellen und in Blastocysten exprimiert. Außerdem legt die analoge Verteilung anderer LINC Komponenten nahe, dass sie sehr wahrscheinlich gemeinsam in den gleichen Zellen und Signalwegen agieren. Um die Funktion des LIN9 Proteins im Zellzyklus und der Differenzierung in vivo genauer zu erforschen, wurde ein Lin9 „Gene Trap“ Maus Modell (GT) generiert und untersucht. Heterozygote Lin9GT/+ Mäuse sind unauffällig und entwickeln sich normal. Allerdings wurden keine Lin9 knockout Embryonen erhalten. Lin9GT/GT Embryonen sterben in der peri-Implantationsphase, vermutlich auf Grund eines Entwicklungsdefekts des Epiblasten, was mit in situ Hybridisierung von Abstammungslinien spezifischen Markern gezeigt werden konnte. Die ICM Lin9 defizienter Blastocysten entwickelte sich in vitro nicht richtig. Diese Daten machen deutlich, dass der Verlust von Lin9 zu embryonaler Letalität im Peri-Implantations-stadium führt, und zeigt dass Lin9 für die richtige Ausbildung des Epiblasten benötigt wird. Gleichzeitig wurde das erste konditionelle Lin9 Maus Modell, basierend auf der Cre-loxP Technologie, generiert. Das Lin9fl/fl Allele kann in vivo und in vitro mit der Cre-Recombinase deletiert werden. Deshalb wurde ein induzierbares System mit Lin9fl/fl Mäusen, die zusätzlich Cre-ERT2 tragen, etabliert. Die MEFs dieser transgenen Mäuse trugen nach Induktion mit Tamoxifen einen kompletten Lin9 Knockout. Die Deletion von LIN9 hat dramatische Auswirkung auf den Zellzyklus und die Wachstumsrate der MEFs. Neben der Akkumulation in der G2/M Phase des Zellzyklus kommt es zu einem vollständigen Proliferationsstop. Zusammenfassend war es möglich, ein Lin9 „Gene Trap“ und ein konditionelles Knockout Maus Modell zu generieren. Beide Mausmodelle belegen, dass Lin9 ein essenzielles Gen für die Embryonalentwicklung und die Kontrolle des Zellzyklus ist. Die weitere Erforschung der LIN9 Defizienz wird dazu beitragen, grundlegende Mechanismen der frühen Zellzykluskontrolle und der embryonalen Entwicklung zu verstehen. KW - Zellzyklus KW - Knockout KW - Cell cyle KW - Knockout Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-30889 ER - TY - THES A1 - Kukat, Christian T1 - Fusion, Fission und Nucleoids in Megamitochondrien T1 - Fusion, fission and nucleoids in megamitochondria N2 - In rho0-Zellen, die über keine mitochondriale DNA (mtDNA) mehr verfügen, entstehen während der Kultivierung Megamitochondrien durch endogene Milchsäure-Azidifizierung des Kulturmediums. Diese Riesenorganellen bilden sich dabei durch mitochondriale Fusionsereignisse und/oder eine Hemmung der Fission. In Zellen mit mitochondrialem Genom ist es ebenso möglich Megamitochondrien durch artifizielles Ansäuern des Kulturmediums zu induzieren. Diese Erkenntnisse wurden im Rahmen dieser Arbeit als Werkzeug verwendet, um Einblicke in mitochondriale Fusions- und Fissionsereignisse zu erlangen. Zunächst wurde die Fusion mitochondrialer Matrixkompartimente mithilfe der photoaktivierbaren Variante des grünen fluoreszierenden Proteins (PA-GFP) untersucht. Hiermit konnte gezeigt werden, dass das Vermischen der Matrixkompartimente nach der Fusion ein sehr schneller Prozess ist. Die Analyse der Bildung und Rückbildung der Megamitochondrien erfolgte sowohl konfokal- als auch elektronenmikroskopisch, wobei sich zeigte, dass die Matrix der Riesenorganellen kaum mehr Cristae beinhaltet. Die Rückbildung der Megamitochondrien zum normalen Netzwerk ist ein sehr schneller Prozess, bei dem schon nach 15 min keine vergrößerten Organellen mehr sichtbar sind. Dies indiziert, dass der Rückbildungsprozess wahrscheinlich durch Veränderungen von verfügbaren Proteinen durchgeführt wird, ohne die Induzierung von Proteinneusynthese. Untersuchungen auf ultrastruktureller Ebene zeigten, dass es während der Rückbildung zur Formation von drei unterschiedlichen Mitochondrientypen kam, die sich in ihrer Morphologie stark unterschieden. Weiterhin wurden vergleichende Studien zur Bildung der Megamitochondrien durchgeführt, bei denen der Einfluss von Atmungsketten-Inhibitoren auf die Bildung von Milchsäure-induzierten Riesenorganellen untersucht wurde. Die Resultate deuten für die Megamitochondrieninduktion auf eine Abhängigkeit auf ein intaktes Membranpotential hin. Immunzytochemisch wurde die endogene Lokalisation der mitochondrialen Fusions- und Fissionsproteine Mitofusin 2, hFis1 und Drp1/DNM1L am Modellsystem der Megamitochondrieninduktion aufgeklärt. Es zeigte sich, dass diese Proteine punktförmig an der äußeren Membran der Riesenorganellen lokalisieren Um das Modellsystem an lebenden Zellen zu nutzen, wurden Vektoren konstruiert, die fluoreszenzmarkierte Proteine der mitochondrialen Fusions- und Fissionsmaschinerie exprimierten. Hiermit konnte einerseits die Lokalisation von Mitofusin 1, Mitofusin 2, hFis1 und Drp1/DNM1L in lebenden Zellen nach Induktion der Megamitochondrien analysiert werden und andererseits der Einfluss der Überexpression dieser Proteine auf die Bildung der Riesenorganellen dokumentiert werden. Die Ergebnisse machten deutlich, dass nur die Überepxression von hFis1 die Bildung der Megamitochondrien verhinderte. Ein weiterer Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit lag in der Visualisierung und Dynamik mitochondrialer Nucleoids in lebenden Zellen. Nucleoids sind Protein-DNA-Komplexe, in denen mitochondriale Genome organisiert sind. Mit dem Farbstoff PicoGreen gelang es mtDNA in lebenden Zellen zu färben und Dynamikstudien der punktförmigen Strukturen mikroskopisch festzuhalten. Während sich mtDNA im mitochondrialen Netzwerk nur marginal aufgrund stattfindender Fusions- und Fissionsereignisse bewegte kam es in den Milchsäure-induzierten Megamitochondrien zu einer extensiven und extrem schnellen Bewegung von mitochondrialer DNA. In anschließenden Versuchen wurde der mitochondriale Transkriptions- und Verpackungsfaktor TFAM als fluoreszentes Fusionsprotein in Zellen transfiziert und Kolokalisationsstudien zeigten, dass das Fusionsprotein mit mtDNA kolokalisiert. In den Riesenorganellen präsentierten punktförmige TFAM-gefärbte Nucleoids ein sehr dynamisches Verhalten mit schneller Bewegung. In rho0-Zellen ohne mitochondriale DNA war die TFAM-Fluoreszenz hingegen gleichmäßig verteilt. Ein weiterer Nucleiodbestandteil ist das mitochondriale DNA-Einzelstrangbindeprotein SSBP1, welches in Megamitochondrien ebenso ein sehr dynamisches Verhalten aufwies. Eine mitochondrial-zielgesteuerte und EGFP-markierte Restriktionsendonuklease wies ebenfalls das typische, punktförmige Nucleoidmuster im mitochondrialen Netzwerk auf, was auf eine Interaktion mit der mtDNA schließen lässt. In rho0-Zellen ohne mtDNA kam es jedoch zur gleichmäßigen Verteilung des Konstruktes in den Mitochondrien. Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit sowohl Einblicke in die Biologie der Megamitochondrien gewonnen, als auch Erkenntnisse über die Dynamik mitochondrialer Protein-DNA-Komplexe, wobei der Schwerpunkt hierbei auf einer Analyse mit Hilfe optischer Methoden lag. N2 - During the cultivation of rho0 cells, which are devoid of mitochondrial DNA (mtDNA), excessive endogenous lactic acid production during the fermentation process drives the development of megamitochondria. These giant organelles are formed by mitochondrial fusion events and/or the repression of fission. Megamitochondria formation is inducible in cells containing mtDNA by an artificial acidification of the culture medium by lactic acid. This work exploits these findings in order to investigate mitochondrial fusion and fission events. Fusion of mitochondrial matrix compartments was examined with the aid of the photoactivatable variant of the green fluorescent protein (PA-GFP), showing that the mixing of matrix components after fusion is an extremely fast process. Formation and reversion of megamitochondria was analyzed by confocal and electron microscopy, revealing that the matrix of giant organelles contains only rudiment structures of cristae organization. Reversion of the megamitochondria to a normal network displays fast kinetic characteristics. This indicates that the restoration process most likely is performed by alterations of novel protein expression. Additional assessment on an ultrastructural level displayed the occurrence of three different types of mitochondria during the reversion, which strongly differed in their morphology. To gain insights into the mechanism of megamitochondria formation and reversion comparative studies were performed with various inhibitors of the respiratory chain. The results indicated a dependence on an intact membrane potential for the induction of megamitochondria. Localization of the endogenous mitochondrial fusion and fission proteins mitofusin 1, hFis1 and Drp1/DNM1L were analyzed in megamitochondria by immunocytochemistry, demonstrating that these proteins localize foci-like to the outer membrane of the giant organelles. Fluorescently tagged proteins of the mitochondrial fusion and fission apparatus (mitofusin 1, mitofusin 2, hFis1 and Drp1/DNM1L) were used in localization and overexpression experiments in living cells by transient transfection. The results revealed that only the overexpression of hFis1 inhibited the formation of megamitochondria. Another main focus of this thesis was the visualization and dynamics of mitochondrial nucleoids in living cells. Nucleoids are protein-DNA complexes representing organizational units for the mitochondrial genomes The dye PicoGreen was used to stain mtDNA in living cells and the dynamics of nucleoid movement was analyzed by fluorescent and confocal microscopy. While mitochondrial DNA showed only marginal movements due to ongoing fusion and fission events in a mitochondrial network, an extensive and extremely fast movement in the lactic acid-induced megamitochondria could be observed. In subsequent experiments the mitochondrial transcription and packaging factor TFAM was fluorescently tagged and transfected into cells. Colocalization studies showed that this fusion protein colocalizes with mitochondrial DNA. In the giant organelles foci-like TFAM-stained nucleoids displayed a very dynamic performance with fast movement. However, in rho0 cells without mitochondrial DNA the TFAM-fluorescence was uniformly distributed. An additional nucleoid constituent and marker for mitochondrial DNA is the mitochondrial single-stranded DNA-binding protein SSBP1, and it could be shown that SSBP1 also exhibits very dynamic characteristics in megamitochondria. A mitochondrial-targeted and EGFP-tagged restriction endonuclease also exhibited the typical, punctual nucleoid pattern in the mitochondrial network, suggesting an mtDNA interaction. In rho0 cells, however, the construct was uniformly distributed in the mitochondrial matrix. In summary, in the present thesis optical and mechanistic insights into the biology of megamitochondria were obtained. This approach was further exploited to study the dynamics of mitochondrial protein-DNA complexes with optical methods. KW - Mitochondrium KW - Cytologie KW - Mitochondrien KW - mitochondria Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-30467 ER - TY - THES A1 - Schmitt, Johannes T1 - Proteine der Kernhülle und deren Rolle bei der Umgestaltung des Zellkerns meiotischer und postmeiotischer Zellen von Säugern T1 - Proteins of the nuclear envelope and their role in the rearrangement of the nucleus in meiotic and post-meiotic mammalian cell N2 - Während der Spermatogenese finden erstaunliche Differenzierungsprozessen statt. Reguliert wird die Spermatogenese sowohl hormonell als auch durch Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Zelltypen und der extrazellulärer Matrix. Unterteilt wird die Spermatogenese in drei funktionelle Einheiten. Die Proliferationsphase, die Meiose und die Spermiogenese. Im Laufe der Proliferationsphase gehen aus den Spermatogonien, Spermatocyten hervor, die die Meiose durchlaufen. Während der Prophase I der Meiose kommt es zur Reduktion und Rekombination des genetischen Materials, was mit charakteristischen und höchst dynamischen Bewegungsvorgängen der Telomere einhergeht. Auf die Meiose folgt die Spermiogenese, in der das genetische Material in seine „Transportform“ überführt wird und aus einer stationären, zellverbundenen Einheit ein mobiles autark funktionierendes Vehikel des genetischen Materials wird; das Spermium. Um das Verständnis dieser Vorgänge zu erweitern wurden in dieser Arbeit die Verteilungsmuster einiger Proteine in der Kernhülle von Zellen der Spermatogenese, in Hinblick auf ihre dynamische Umverteilung untersucht. Bei diesen Proteinen handelte es sich um die SUN-Domänen Proteine und das meiosespezifische Lamin C2. Die SUN-Domänen Proteine sind Teil des membrandurchspannenden LINC-Komplexes, der Komponenten des Nukleoplasma mit denen des Cytoplasma verbindet. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die SUN-Domänen Proteine, Sun1 und Sun2 während der Meiose exprimiert werden, und an den Anheftungsplatten meiotischer Chromosomen lokalisieren und deren dynamisches Verteilungsmuster dem Verteilungsmuster der Telomere während der Prophase I der Meiose entsprechen. Dies deutet darauf hin, dass Sun1 und Sun2 eine tragende Rolle, während der koordinierten Bewegungsprozessen der Prophase I der Meiose spielen. In der Spermiogenese sind die SUN-Domänen Proteine, Sun1 und Sun3 vertreten. Dabei weist deren unterschiedliche Lokalisation an entgegengesetzten Zellpolen darauf hin, dass Sun1 und Sun3 möglicherweise unterschiedliche Funktionen bei der Umgestaltung des Spermienkopfes während der Spermiogenese erfüllen. Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit war die Etablierung einer Mauslinie um die Rolle von Lamin C2 in der Meiose untersuchen zu können. Hierzu wurde eine Lamin C2 Knock-out Studie begonnen. In ersten Untersuchungen der knock-out Tiere konnte eine Größenreduktion der Hoden beobachtet werden. Ebenso konnte ein Abbruch der Meiose vermerkt werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit verdeutlichen, dass sowohl die SUN-Domänen Proteine, als auch Lamin C2, wichtige Rollen in dem komplexen Arrangement der Spermatogenese übernehmen. N2 - During spermatogenesis amazing differentiation processes take place. Spermatogenesis is regulated by hormones and crosstalk between several cell types and the extra cellular matrix. It can be divided in three functional processes: The proliferation phase, meiosis and spermiogenesis. In the course of the proliferation phase spermatogonia become spermatocytes, which then pass through meiosis. During prophase I of meiosis the reduction and the recombination of the genetic material take place, involving characteristic and highly dynamic movements of meiotic telomeres. Meiosis is followed by spermiogenesis, where the genetic material is converted to its “transport form”, thereby turning a static, tissue associated cell into a mobile, self-sufficient vehicle of the genetic material; the sperm. To expand the knowledge of these processes, the localisation of some proteins of the nuclear envelope of spermatogenetic cells were examined in this work, in order to discover their dynamic distribution pattern. These proteins are the SUN-domain proteins and the meiosis specific lamin C2. The SUN-domain proteins are part of the transmembrane LINC-complex, which connects nucleoplasmic and cytoplasmic components. This work shows, that the SUN-domain proteins Sun1 and Sun2 are expressed during meiosis, that they are located at the attachment sites of the meiotic telomeres, and that their localisation parallels the dynamic movements of the telomeres, which take place in meiotic prophase I. These results indicate that Sun1 and Sun2 play a major role in the coordinated telomere movements during prophase I of meiosis. This work furthermore shows the specific expression of Sun1 and Sun3 during spermiogenesis. Their localisation at opposite poles of the spermatid head indicates discrete functions during the transformation of the sperm head, which takes place in this phase of spermatogenesis. Another focus of this work was the establishment of a lamin C2 knock out mouse line to analyse the role of lamin C2 in meiosis. Analysis of the knock out animals showed a reduction of testis-size in comparison to wild-type mice. Additionaly meiosis was aborted in lamin C2 deficient mice. In summary these results make evident, that the SUN-domain proteins, as well as the meiosis specific lamin C2 play an important role in the complex arrangements of spermiogenesis. KW - Meiose KW - Spermatogenese KW - Kernproteine KW - meiosis KW - spermatogenesis KW - nucleus Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-31203 ER - TY - THES A1 - Pinkert, Stefan T1 - The human proteome is shaped by evolution and interactions T1 - Das menschliche Proteom ist geformt durch Evolution und Interaktion N2 - Das menschliche Genom ist seit 2001 komplett sequenziert. Ein Großteil der Proteine wurde mittlerweile beschrieben und täglich werden bioinformatische Vorhersagen praktisch bestätigt. Als weiteres Großprojekt wurde kürzlich die Sequenzierung des Genoms von 1000 Menschen gestartet. Trotzdem ist immer noch wenig über die Evolution des gesamten menschlichen Proteoms bekannt. Proteindomänen und ihre Kombinationen sind teilweise sehr detailliert erforscht, aber es wurden noch nicht alle Domänenarchitekturen des Menschen in ihrer Gesamtheit miteinander verglichen. Der verwendete große hochqualitative Datensatz von Protein-Protein-Interaktionen und Komplexen stammt aus dem Jahr 2006 und ermöglicht es erstmals das menschliche Proteom mit einer vorher nicht möglichen Genauigkeit analysieren zu können. Hochentwickelte Cluster Algorithmen und die Verfügbarkeit von großer Rechenkapazität befähigen uns neue Information über Proteinnetzwerke ohne weitere Laborarbeit zu gewinnen. Die vorliegende Arbeit analysiert das menschliche Proteom auf drei verschiedenen Ebenen. Zuerst wurde der Ursprung von Proteinen basierend auf ihrer Domänenarchitektur analysiert, danach wurden Protein-Protein-Interaktionen untersucht und schließlich erfolgte Einteilung der Proteine nach ihren vorhandenen und fehlenden Interaktionen. Die meisten bekannten Proteine enthalten mindestens eine Domäne und die Proteinfunktion ergibt sich aus der Summe der Funktionen der einzelnen enthaltenen Domänen. Proteine, die auf der gleichen Domänenarchitektur basieren, das heißt die die gleichen Domänen in derselben Reihenfolge besitzen, sind homolog und daher aus einem gemeinsamen ursprünglichen Protein entstanden. Die Domänenarchitekturen der ursprünglichen Proteine wurden für 750000 Proteine aus 1313 Spezies bestimmt. Die Gruppierung von Spezies und ihrer Proteine ergibt sich aus taxonomischen Daten von NCBI-Taxonomy, welche mit zusätzlichen Informationen basierend auf molekularen Markern ergänzt wurden. Der resultierende Datensatz, bestehend aus 5817 Domänen und 32868 Domänenarchitekturen, war die Grundlage für die Bestimmung des Ursprungs der Proteine aufgrund ihrer Domänenarchitekturen. Es wurde festgestellt, dass nur ein kleiner Teil der neu evolvierten Domänenarchitekturen eines Taxons gleichzeitig auch im selben Taxon neu entstandene Proteindomänen enthält. Ein weiteres Ergebnis war, dass Domänenarchitekturen im Verlauf der Evolution länger und komplexer werden, und dass so verschiedene Organismen wie der Fadenwurm, die Fruchtfliege und der Mensch die gleiche Menge an unterschiedlichen Proteinen haben, aber deutliche Unterschiede in der Anzahl ihrer Domänenarchitekturen aufweisen. Der zweite Teil beschäftigt sich mit der Frage wie neu entstandene Proteine Bindungen mit dem schon bestehenden Proteinnetzwerk eingehen. In früheren Arbeiten wurde gezeigt, dass das Protein-Interaktions-Netzwerk ein skalenfreies Netz ist. Skalenfreie Netze, wie zum Beispiel das Internet, bestehen aus wenigen Knoten mit vielen Interaktionen, genannt Hubs, und andererseits aus vielen Knoten mit wenigen Interaktionen. Man vermutet, dass zwei Mechanismen zur Entstehung solcher Netzwerke führen. Erstens müssen neue Proteine um auch Teil des Proteinnetzwerkes zu werden mit Proteinen interagieren, die bereits Teil des Netzwerkes sind. Zweitens interagieren die neuen Proteine, gemäß der Theorie der bevorzugten Bindung, mit höherer Wahrscheinlichkeit mit solchen Proteinen im Netzwerk, die schon an zahlreichen weiteren Protein-Interaktionen beteiligt sind. Die Human Protein Reference Database stellt ein auf Informationen aus in-vivo Experimenten beruhendes Proteinnetzwerk für menschliche Proteine zur Verfügung. Basierend auf den in Kapitel I gewonnenen Informationen wurden die Proteine mit dem Ursprungstaxon ihrer Domänenarchitekturen versehen. Dadurch wurde gezeigt, dass ein Protein häufiger mit Proteinen, die im selben Taxon entstanden sind, interagiert, als mit Proteinen, die in anderen Taxa neu aufgetreten sind. Es stellte sich heraus, dass diese Interaktionsraten für alle Taxa deutlich höher waren, als durch das Zufallsmodel vorhergesagt wurden. Alle Taxa enthalten den gleichen Anteil an Proteinen mit vielen Interaktionen. Diese zwei Ergebnisse sprechen dagegen, dass die bevorzugte Bindung der alleinige Mechanismus ist, der zum heutigen Aufbau des menschlichen Proteininteraktion-Netzwerks beigetragen hat. Im dritten Teil wurden Proteine basierend auf dem Vorhandensein und der Abwesenheit von Interaktionen in Gruppen eingeteilt. Proteinnetzwerke können in kleine hoch vernetzte Teile zerlegt werden, die eine spezifische Funktion ausüben. Diese Gruppen können mit hoher statistischer Signifikanz berechnet werden, haben meistens jedoch keine biologische Relevanz. Mit einem neuen Algorithmus, welcher zusätzlich zu Interaktionen auch Nicht-Interaktionen berücksichtigt, wurde ein Datensatz bestehend aus 8,756 Proteinen und 32,331 Interaktionen neu unterteilt. Eine Einteilung in elf Gruppen zeigte hohe auf Gene Ontology basierte Werte und die Gruppen konnten signifikant einzelnen Zellteilen zugeordnet werden. Eine Gruppe besteht aus Proteinen, welche wenige Interaktionen miteinander aber viele Interaktionen zu zwei benachbarten Gruppen besitzen. Diese Gruppe enthält eine signifikant erhöhte Anzahl an Transportproteinen und die zwei benachbarten Gruppen haben eine erhöhte Anzahl an einerseits extrazellulären und andererseits im Zytoplasma und an der Membran lokalisierten Proteinen. Der Algorithmus hat damit unter Beweis gestellt das die Ergebnisse nicht bloß statistisch sondern auch biologisch relevant sind. Wenn wir auch noch weit vom Verständnis des Ursprungs der Spezies entfernt sind, so hat diese Arbeit doch einen Beitrag zum besseren Verständnis der Evolution auf dem Level der Proteine geleistet. Im Speziellen wurden neue Erkenntnisse über die Beziehung von Proteindomänen und Domänenarchitekturen, sowie ihre Präferenzen für Interaktionspartner im Interaktionsnetzwerk gewonnen. N2 - The human genome has been sequenced since 2001. Most proteins have been characterized now and with everyday more bioinformatical predictions are experimentally verified. A project is underway to sequence thousand humans. But still, little is known about the evolution of the human proteome itself. Domains and their combinations are analysed in detail but not all of the human domain architectures at once. Like no one before, we have large datasets of high quality human protein-protein-protein interactions and complexes available which allow us to characterize the human proteome with unmatched accuracy. Advanced clustering algorithms and computing power enable us to gain new information about protein interactions without touching a pipette. In this work, the human proteome is analysed at three different levels. First, the origin of the different types of proteins was analysed based on their domain architectures. The second part focuses on the protein-protein interactions. Finally, in the third part, proteins are clustered based on their interactions and non-interactions. Most proteins are built of domains and their function is the sum of their domain functions. Proteins that share the same domain architecture, the linear order of domains are homologues and should have originated from one common ancestral protein. This ancestor was calculated for roughly 750 000 proteins from 1313 species. The relations between the species are based on the NCBI Taxonomy and additional molecular data. The resulting data set of 5817 domains and 32868 domain architectures was used to estimate the origin of these proteins based on their architectures. It could be observed, that new domain architectures are only in a small fraction composed of domains arisen at the same taxon. It was also found that domain architectures increase in length and complexity in the course of evolution and that different organisms like worm, and human share nearly the same amount of proteins but differ in their number of distinct domain architectures. The second part of this thesis focuses on protein-protein interactions. This chapter addresses the question how new evolved proteins form connections within the existing network. The network built of protein-protein interactions was shown to be scale free. Scale free networks, like the internet, consist of few hubs with many connections and many nodes with few connections. They are thought to arise by two mechanisms. First, newly emerged proteins interact with proteins of the network. Second, according to the theory of preferential attachment, new proteins have a higher chance to interact with already interaction rich proteins. The Human Protein Reference Database provides an on in-vivo interaction data based network for human. With the data obtained from chapter one, proteins were marked with their taxon of origin based on their domain architectures. The interaction ratio of proteins of the same taxa compared to all interactions was calculated and higher values than the random model showed for nearly every taxa. On the other hand, there was no enrichment of proteins originated at the taxon of cellular organisms for the node degree found. The node degree is the number of links for this node. According to the theorie of preferential attachment the oldest nodes should have the most interactions and newly arisen proteins should be preferably attached to them not together. Both could not be shown in this analysis, preferential attachment could therefore not be the only explanation for the forming of the human protein interaction network. Finally in part three, proteins and all their interactions in the network are analysed. Protein networks can be divided into smaller highly interacting parts carrying out specific functions. This can be done with high statistical significance but still, it does not reflect the biological significance. Proteins were clustered based on their interactions and non-interactions with other proteins. A version with eleven clusters showed high gene ontology based ratings and clusters related to specific cell parts. One cluster consists of proteins having very few interactions together but many to proteins of two other clusters. This first cluster is significantly enriched with transport proteins and the two others are enriched with extracellular and cytoplasm/membrane located proteins. The algorithm seems therefore well suited to reflect the biological importance behind functional modules. Although we are still far from understanding the origin of species, this work has significantly contributed to a better understanding of evolution at the protein level and has, in particular, shown the relation of protein domains and protein architectures and their preferences for binding partners within interaction networks. KW - Evolution KW - Protein KW - Domäne KW - Interaktion KW - evolution KW - protein KW - interaction KW - domain Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-35566 ER - TY - THES A1 - Schmit, Fabienne T1 - LINC, a novel protein complex involved in the regulation of G2/M genes T1 - LINC, ein neuer Proteinkomplex, der G2/M Gene reguliert N2 - Regulated progression through the cell cycle is essential for ordered cell proliferation. One of the best characterized tumor suppressors is the retinoblastoma protein pRB, which together with the E2F transcription factors regulates cell cycle progression. In the model organisms Drosophila melanogaster and Caenorhabditis elegans, RB/E2F containing multiprotein complexes have been described as transcriptional regulators of gene expression. This work first describes a homologous complex in human cells named LINC (for LIN complex). It consists of a stable core complex containing LIN-9, LIN-37, LIN-52, LIN-54 and RbAp48. This core complex interacts cell cycle-dependently with different pocket proteins and transcription factors. In quiescent cells, LINC associates with p130 and E2F4. In S-phase cells these interactions are lost and LINC binds to B-MYB and p107. The transient knock-down of LIN-54 in primary fibroblasts, as the depletion of LIN-9, leads to cell cycle defects. The cells are delayed before the entry into mitosis. This effect is due to the fact that the knock-down of LINC components leads to the downregulation of cell cycle genes responsible for the entry into and exit from mitosis as well as for checkpoints during mitosis. These LINC target genes are known E2F G2/M target genes, which are expressed later than the classical G1/S E2F target genes. The transcriptional regulation by LINC is a direct effect as LINC binds to the promoters of its target genes throughout the cell cycle. LINC contains three DNA-binding proteins. E2F4 and B-MYB, which cell cycle-dependently bind to LINC, are known DNA-binding transcription factors. Additionally, it is show here that the LINC core complex member LIN-54 also directly binds to the promoter of a LINC target gene. Although the exact molecular mechanism of LINC function needs to be analyzed further, data in this work provide a model for the delayed activation of G2/M target genes. B-MYB, a G1/S E2F target gene, binds to LINC upon its expression in S-phase. Then only LINC is a transcriptional activator that induces the expression of the G2/M genes. This provides an explanation for the delayed expression of these E2F G2/M target genes. N2 - Die Regulation des Zellzyklus ist unerlässlich für die fehlerfreie Zellteilung. Einer der am Besten charakterisierten Tumorsuppressoren ist das Retinoblastom-Protein pRB, welches zusammen mit den E2F Transkriptionsfaktoren den Zellzyklus reguliert. In den Modellorganismen Drosophila melanogaster und Caenorhabditis elegans wurden Multiproteinkomplexe beschrieben, die pRB und E2F Homologe enthalten und transkriptionell die Expression von Zielgenen regulieren. Diese Arbeit beschreibt erstmals LINC, einen homologen Komplex in humanen Zellen. Der LIN-Kernkomplex besteht aus LIN-9, LIN-37, LIN-52, LIN-54 and RbAp48 und assoziiert zellzyklus-abhängig mit Pocket Proteinen und Transkriptionsfaktoren. In ruhenden Zellen (G0) assoziiert LINC mit p130 und E2F4. In der S-Phase verlassen p130 und E2F4 den Komplex und B-MYB und p107 interagieren mit LINC. Die transiente Depletion von LIN-54, ebenso wie die Depletion von LIN-9, führt zu Defekten im Zellzyklus. Die „knock-down“-Zellen treten verzögert in die Mitose ein. Dies konnte darauf zurückgeführt werden, dass die Depletion von LINC Mitgliedern Gene herunterreguliert, die für den Eintritt in und den Austritt aus der Mitose, sowie für Regulationsprozesse während der Mitose verantwortlich sind. Diese LINC Zielgene wurden bisher als G2/M E2F Zielgene beschrieben, welche verglichen mit klassischen E2F Zielgenen verzögert exprimiert werden. Die transkriptionelle Regulation durch LINC ist ein direkter Effekt, da LINC in G0 und in der S-Phase an die Promotoren seiner Zielgene bindet. LINC enthält drei DNA-bindende Proteine. Die zellzyklus-abhängigen Komponenten von LINC E2F4 und BMYB sind bekannte DNA-bindende Transkriptionsfaktoren. Zusätzlich konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass das LINC Kernprotein LIN-54 direkt an den Promoter eines LINC Zielgens, cdc2, bindet. Obwohl der genaue molekulare Mechanismus für die Funktion von LINC noch genauer untersucht werden muss, liefern Daten in dieser Arbeit ein Modell für die verzögerte Expression von G2/M Genen. B-MYB ist selbst ein E2F Zielgen und bindet an LINC sobald es exprimiert wird. Erst die Assoziation von B-MYB an LINC in der S-Phase macht LINC zu einem transkriptionellen Aktivator G2/M-spezifischer Gene. Dies erklärt die verzögerte Expression dieser E2F G2/M Zielgene. KW - Zellzyklus KW - Transkription KW - LINC KW - LIN-54 KW - G2/M Übergang KW - LINC KW - LIN-54 KW - cell cycle KW - G2/M transition KW - transcription Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-29336 ER - TY - THES A1 - Bertolucci, Franco T1 - Operant and classical learning in Drosophila melanogaster: the ignorant gene (ign) T1 - Operantes und klassisches Lernen in Drosophila melanogaster: das ignorant Gen (ign) N2 - One of the major challenges in neuroscience is to understand the neuronal processes that underlie learning and memory. For example, what biochemical pathways underlie the coincidence detection between stimuli during classical conditioning, or between an action and its consequences during operant conditioning? In which neural substructures is this information stored? How similar are the pathways mediating these two types of associative learning and at which level do they diverge? The fly Drosophila melanogaster is an appropriate model organism to address these questions due to the availability of suitable learning paradigms and neurogenetic tools. It permits an extensive study of the functional role of the gene S6KII which in Drosophila had been found to be differentially involved in classical and operant conditioning (Bertolucci, 2002; Putz et al., 2004). Genomic rescue experiments showed that olfactory conditioning in the Tully machine, a paradigm for Pavlovian olfactory conditioning, depends on the presence of an intact S6KII gene. This rescue was successfully performed on both the null mutant and a partial deletion, suggesting that the removal of the phosphorylating unit of the kinase was the main cause of the functional defect. The GAL4/UAS system was used to achieve temporal and spatial control of S6KII expression. It was shown that expression of the kinase during the adult stage was essential for the rescue. This finding ruled out a developmental origin of the mutant learning phenotype. Furthermore, targeted spatial rescue of S6KII revealed a requirement in the mushroom bodies and excluded other brain structures like the median bundle, the antennal lobes and the central complex. This pattern is very similar to the one previously identified with the rutabaga mutant (Zars et al., 2000). Experiments with the double mutant rut, ign58-1 suggest that both rutabaga and S6KII operate in the same signalling pathway. Previous studies had already shown that deviating results from operant and classical conditioning point to different roles for S6KII in the two types of learning (Bertolucci, 2002; Putz, 2002). This conclusion was further strengthened by the defective performance of the transgenic lines in place learning and their normal behavior in olfactory conditioning. A novel type of learning experiment, called “idle experiment”, was designed. It is based on the conditioning of the walking activity and represents a purely operant task, overcoming some of the limitations of the “standard” heat-box experiment, a place learning paradigm. The novel nature of the idle experiment allowed exploring “learned helplessness” in flies, unveiling astonishing similarities to more complex organisms such as rats, mice and humans. Learned helplessness in Drosophila is found only in females and is sensitive to antidepressants. N2 - Eine der größten Herausforderungen in der Neurobiologie ist es, die neuronalen Prozesse zu verstehen, die Lernen und Gedächtnis zugrundeliegen. Welche biochemischen Pfade liegen z.B. der Koinzidenzdetektion von Reizen (klassische Konditionierung) oder einer Handlung und ihren Konsequenzen (operante Konditionierung) zugrunde? In welchen neuronalen Unterstrukturen werden diese Informationen gespeichert? Wie ähnlich sind die Stoffwechselwege, die diese beiden Arten des assoziativen Lernens vermitteln und auf welchem Niveau divergieren sie? Drosophila melanogaster ist wegen der Verfügbarkeit von Lern-Paradigmen und neurogenetischen Werkzeugen ein geeigneter Modell-Organismus, zum diese Fragen zu adressieren. Er ermöglicht eine umfangreiche Studie der Funktion des Gens S6KII, das in der Taufliege in klassischer und operanter Konditionierung unterschiedlich involviert ist (Bertolucci, 2002; Putz et al., 2004). Rettungsexperimenten zeigen, dass die olfaktorische Konditionierung in der Tully Maschine (ein klassisches, Pawlow’sches Konditionierungsparadigma) von dem Vorhandensein eines intakten S6KII Gens abhängt. Die Rettung war sowohl mit einer vollständigen, als auch einer partiellen Deletion erfolgreich und dies zeigt, dass der Verlust der phosphorylierenden Untereinheit der Kinase die Hauptursache des Funktionsdefektes war. Das GAL4/UAS System wurde benutzt, um die S6KII Expression zeitlich und räumlich zu steuern. Es wurde gezeigt, dass die Expression der Kinase während des adulten Stadiums für die Rettung hinreichend war. Dieser Befund schließt eine Entwicklungsstörung als Ursache für den mutanten Phänotyp aus. Außerdem zeigte die gezielte räumliche Rettung von S6KII die Notwendigkeit der Pilzkörper und schloss Strukturen wie das mediane Bündel, die Antennalloben und den Zentralkomplex aus. Dieses Muster ist dem vorher mit der rutabaga Mutation identifizierten sehr ähnlich (Zars et al., 2000). Experimente mit der Doppelmutante rut, ign58-1 deuten an, dass rutabaga und S6KII im gleichen Signalweg aktiv sind. Vorhergehende Studien hatten bereits gezeigt, dass die unterschiedlichen Ergebnisse bei operanter und klassischer Konditionierung auf verschiedenen Rollen für S6KII in den zwei Arten des Lernens hindeuten (Bertolucci, 2002; Putz, 2002). Diese Schlussfolgerung wurde durch den mutanten Phänotyp der transgenen Linien in der Positionskonditionierung und ihr wildtypisches Verhalten in der klassischen Konditionierung zusätzlich bekräftigt. Eine neue Art von Lern-Experiment, genannt „Idle Experiment“, wurde entworfen. Es basiert auf der Konditionierung der Laufaktivität, stellt eine operante Aufgabenstellung dar und überwindet einige der Limitationen des „Standard“ Heat-Box Experimentes. Die neue Art des Idle Experimentes erlaubt es, „gelernte Hilflosigkeit“ in Fliegen zu erforschen, dabei zeigte sich eine erstaunliche Ähnlichkeit zu den Vorgängen in komplizierteren Organismen wie Ratten, Mäusen oder Menschen. Gelernte Hilflosigkeit in der Taufliege wurde nur in den Weibchen beobachtet und wird von Antidepressiva beeinflusst. KW - Klassische Konditionierung KW - Instrumentelle Konditionierung KW - Konditionierung KW - Operante Konditionierung KW - Lernen KW - Räumliches Gedächtnis KW - Assoziatives Gedächtnis KW - Gedächtnis KW - MAP-Kinase KW - Drosophila KW - Taufliege KW - Gelernte Hilflosigkeit KW - CREB KW - S6KII KW - p90RSK KW - RSK KW - p90 ribosomal S6 kinase KW - ribosomal S6 kinase II KW - operant conditioning KW - classical conditioning KW - associative learning KW - learned helplessness Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-33984 ER - TY - THES A1 - Kunz, Britta K. T1 - Frugivory and Seed Dispersal: Ecological Interactions between Baboons, Plants, and Dung Beetles in the Savanna-Forest Mosaic of West Africa T1 - Frugivorie und Samenausbreitung: Ökologische Interaktionen zwischen Pavianen, Pflanzen und Dungkäfern im Savannen-Wald-Mosaik Westafrikas N2 - Das Guinea-Savanne-Wald-Mosaik Westafrikas weist einen hohen Reichtum an Pflanzenarten auf, deren Samen durch Frugivore ausgebreitet werden. Afrikanische Savannen beherbergen zudem die artenreichste Dungkäferfauna weltweit. Dennoch wurden Interaktionen zwischen Fruchtpflanzen, Primaten und Dungkäfern in Savannenökosysteme bisher kaum erforscht. Meine Untersuchungen am Anubispavian (Papio anubis Lesson 1827, Cercopithecinae) im Comoé Nationalpark (CNP), im NO der Elfenbeinküste, zeigten, dass sich westafrikanische Pavianpopulationen in verschiedener Hinsicht von Populationen in Ostafrika unterscheiden. Paviane werden zumeist vornehmlich als Prädatoren der Samen ihrer Nahrungspflanzen angesehen. Im Savannen-Wald-Mosaik Westafrikas ernähren sie sich jedoch überwiegend frugivor und sind bedeutende Samenausbreiter einer Vielzahl von Gehölzpflanzenarten mit unterschiedlichen Fruchttypen und Samengrößen. Sie breiten intakte Samen von mind. 22% der regionalen Gehölzpflanzenarten aus. Ihr "Ausbreitungspotential" bzgl. Samenzahl und Samengröße ist mit dem der großen Menschenaffen vergleichbar. Der Anteil der Baumarten im Nahrungsspektrum der Paviane ist signifikant höher als es aufgrund des Anteils im regionalen Artenpool der Gehölzpflanzen zu erwarten wäre. Fruchtarten, die von Pavianen gefressen wurden, waren signifikant größer als nicht konsumierte Arten. Von verschiedenen morphologischen Fruchtmerkmalen eignen sich Fruchttyp und Farbe am besten, um vorherzusagen, ob die Früchte einer Art Nahrungsbestandteil der Paviane im CNP sind. Fruchttyp und Samengröße wiederum sind am besten geeignet, um auf die Art der Nutzung (Samenausbreitung bzw. -prädation) zu schließen. Die Samengröße einer Pflanze ist ein wichtiges Fitnessmerkmal, das verschiedene Abschnitte von der Fruchtentwicklung bis zur Etablierung des Keimlings beeinflussen kann. Sie weist bei vielen Pflanzenarten erhebliche intraspezifische Schwankungen auf. Primaten könnten aus unterschiedlichen Gründen Früchte mit bestimmter Samengröße auswählen, zum Beispiel um unverdaulichen Ballast zu reduzieren oder um den Fruchtfleischgewinn pro Frucht zu optimieren. Bei acht von zehn untersuchten Pflanzenarten, die sich in Fruchttyp, Samenzahl und Samengröße unterscheiden, erwiesen sich die Paviane als selektiv in Bezug auf die Samengröße. Für die intraspezifische Fruchtauswahl der Paviane scheint unter anderem das je nach Frucht- und Samenform unterschiedlich variierende Verhältnis von Fruchtfleisch zu Samen eine Rolle zu spielen. Als Habitatgeneralisten (mit einer Präferenz für Waldhabitate), die relativ große Gebiete durchstreifen, scheinen Paviane besonders wichtig für den genetischen Austausch der Pflanzen zwischen entfernten Waldinseln. Da die meisten Gehölzpflanzenarten im Savannen-Wald-Mosaik des CNP mittelgroße bis große Früchte und Samen haben, kommt den Pavianen eine herausragende Rolle bei der Samenausbreitung und natürlichen Regeneration dieses Ökosystems zu. Die Bedeutung der Paviane für die Samenausbreitung von Pflanzenarten mit kleinen Früchten sollte jedoch nicht unterschätzt werden. Meine Untersuchungen an typischen "vogelausgebreiteten" Baumarten, von denen Vögel fast ausschließlich unreife Früchte fraßen, weisen darauf hin, dass eine qualitative und quantitative Beurteilung verschiedener Frugivorengruppen allein aufgrund der Fruchtsyndrome nicht immer zuverlässig ist. Anubispaviane breiten in der Regel mehrere Pflanzensamen in einzelnen Fäzes aus was üblicherweise als ungünstig für die Pflanze angesehen wird. Die Samen aller Pflanzenarten, die in Pavianfäzes im CNP während Zeiten saisonal hoher Dungkäferaktivität zu finden waren, können jedoch potentiell von Dungkäfern ausgebreitet werden. Die Dungkäfer-Aktivität im Untersuchungsgebiet an Pavianfäzes war hoch, es wurden 99 Arten aus 26 Gattungen nachgewiesen. Sowohl die Wahrscheinlichkeit sekundärer Samenausbreitung durch Dungkäfer als auch das sekundäre räumliche Ausbreitungsmuster hängen von der Struktur und Zusammensetzung der Dungkäfergemeinschaft am Ort der primären Ausbreitung ab. Die Dungkäfergemeinschaft wiederum scheint stark von der Vegetation beeinflusst zu sein. Im Savannen-Wald-Mosaik Westafrikas erwartete ich daher deutliche Unterschiede in der sekundären Ausbreitung zwischen Samen, die von Pavianen in die Savanne bzw. in den Wald ausgebreitet werden. Experimente ergaben, dass Samen, die von Pavianen in die Savanne ausgebreitet werden, eine höhere Wahrscheinlichkeit haben (a) überhaupt sekundär durch Dungkäfer ausgebreitet zu werden, (b) horizontal von Telekopriden vom Ort der primären Ausbreitung wegbewegt zu werden, (c) relativ schnell aus den Fäzes entfernt zu werden und (d) über relativ größere Distanzen ausgebreitet zu werden als Samen im Wald. Generell sollten Savannenpflanzen und Habitatgeneralisten unter den Pflanzenarten, deren Samen von Pavianen in die Savanne ausgebreitet werden, am ehesten von sekundärer Ausbreitung durch Dungkäfer profitieren. N2 - The Guinea savanna-forest mosaic of West Africa is particularly rich in animal-dispersed plants. African savannas harbour the richest dung beetle community worldwide. The role of primates and dung beetles in natural plant regeneration and biodiversity maintenance in this ecosystem, however, is still poorly understood. The present study on olive baboons (Papio anubis Lesson 1827, Cercopithecinae) at Comoé National Park (CNP), north-eastern Ivory Coast, revealed that western olive baboon populations differ in several ways from their eastern conspecifics. Baboons are commonly regarded as predators of the seeds of their food plants. In the savanna-forest mosaic of West Africa, however, they are highly frugivorous and are important seed dispersers of a high number of woody plant species that differ in fruit type and seed size. They disperse intact seeds of at least 22% of the woody plant species of the regional plant pool. Their "seed dispersal potential", regarding seed number and seed sizes, is comparable to that of the much larger great apes. Relative to the availability in the regional pool of woody plant species, baboons preferred trees to shrubs and lianas as fruit sources and especially included larger fruit into their diet. Among several morphological fruit traits investigated, fruit type and fruit colour best described whether baboons included a species into their diet, whereas fruit type and seed size best predicted whether baboons predated upon the seeds of a food plant species. Seed size is an important plant fitness trait that can influence several steps between fruiting and the establishment of a plant´s offspring. Seed size can vary considerably within and among individuals of the same species. Primates may select for certain seed sizes within a species for a number of reasons, e.g. to decrease indigestible seed load or to increase pulp intake per fruit. Within eight out of ten plant species investigated, which differed in fruit type, seed number and seed size, olive baboons were selective in fruit choice regarding seed size. Seed size selection by olive baboons seems to be influenced, among other traits, by the amount of pulp rewarded per fruit relative to seed load, which varies with fruit and seed shape. Being a habitat generalist (with a preference for forest habitats) and able to move comparatively long distances, the olive baboon might be especially important for the biodiversity maintenance of distant forest islands. Because most woody plant species at the study site had medium-sized to large fruits and seeds, olive baboons may be crucial for seed dispersal and plant recruitment in this ecosystem. Their importance for seed dispersal of plants with small fruits should not, however, be underrated. Observation of frugivores at a typical "bird-dispersed" tree species showed that classification of seed dispersers on the basis of fruit syndromes alone can be misleading. Olive baboons disperse seeds in their faeces in a clumped manner, which generally is regarded disadvantageous for plants. Yet, seeds from all plant species being naturally present in baboon dung during seasonal peaks of dung beetle activity apparently can be scattered locally by dung beetles. Dung beetle activity at baboon faeces deposited in the two habitats was high, totalling 99 species from 26 genera. The probability and pattern of secondary seed dispersal by dung beetles depend on the structure and composition of the dung beetle community, which, in turn, seems to be strongly determined by vegetation type. I thus expected pronounced differences in secondary seed dispersal by dung beetles between seeds deposited by baboons in the savanna and in the forest. Experiments indicated that compared to seeds dispersed by baboons into the forest, seeds that end up in the savanna generally have a higher probability of (a) being removed by dung beetles, (b) being horizontally scattered by telecoprids, (c) being rapidly removed from the place of primary deposition and (d) being secondarily dispersed over larger distances. In general, savanna plants and plant habitat generalists the seeds of which baboons disperse into the savanna should profit most from secondary seed dispersal by dung beetles. KW - Anubispavian KW - Meerkatzenartige KW - Samenverbreitung KW - Primaten KW - Käfer KW - Afrika KW - Pflanzenökologie KW - Tierökologie KW - Öko-Ethologie KW - Nahrung KW - Frucht KW - Streifgebiet KW - Samenkeimung KW - Blatthornkäfer KW - Savanne KW - Elfenbeinküste KW - Parc National de KW - Gruppengröße KW - sekundäre Samenausbreitung KW - Dungkkäfer KW - Fruchtmerkmale KW - Samenprädation KW - Olive baboons KW - seed dispersal KW - seed predation KW - frugivory KW - dung beetles Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-37519 ER - TY - THES A1 - Glaser, Stefanie T1 - Untersuchung des RNA-Kernexportes im Modellsystem Xenopus laevis T1 - Analysis of the RNA nuclear export in the model system Xenopus laevis N2 - Der eukaryotische Initiationsfaktor 5A (eIF5A) ist evolutionär hoch konserviert und besitzt als einzig bislang bekanntes Protein die Aminosäuremodifikation Hypusin. Obwohl eIF5A ubiquitär exprimiert wird, sind die zellulären Funktionen von eIF5A noch weitgehend unklar. Hypusininhibitoren konnten die Oberflächenexpression von CD83 die CD83 mRNA im Zellkern dendritischer Zellen anreichern und folglich die Oberflächenexpression von CD83 verhindern konnten, wurde eine Beteiligung von eIF5A beim nukleozytoplasmatischen Export der CD83 mRNA vermutet. Weiterhin ist bekannt, dass HuR, ein Protein der ELAV-Familie, an ein cis-aktives RNA-Element mit einer ausgeprägten Sekundärstruktur innerhalb der kodierenden Sequenz der CD83 mRNA bindet. Während die Bindung von HuR an AU-reiche Elemente in der 3UTR bestimmter Transkripte zu deren Stabilisierung führt, wird die Stabilität von CD83-Transkripten durch die Interaktion mit HuR jedoch nicht beeinflusst. In dieser Arbeit wurden Mikroinjektionsstudien in Xenopus laevis-Oozyten zum nukleozytoplasmatischen Export von CD83 mRNA durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass die charakteristische Sekundärstruktur des HuR-Response-Elements essentiell für den Kernexport von CD83-Transkripten ist. HuR wurde zudem als Bindungspartner von eIF5a identifiziert. Inhibitorische Antikörper sowohl gegen HuR als auch eIF5A waren in der Lage, den Export von CD83-Transkripten zu inhibieren. Während die meisten mRNAs durch den TAP/NXT1-vermittelten Exportweg in das Zytoplasma transportiert werden, transloziert CD83 mRNA CRM1-vermittelt, da der Export durch den CRM1-Inhibitor Leptomycin B gehemmt werden konnte. Oozytentypischer TFIIIA, ebenfalls ein Interaktionspartner von eIF5A, ist in jungen Xenopus-Oozyten sowohl bei der RNA-Polymerase III-abhängigen Transkription von 5S rRNA als auch am nukleozytoplasmatischem Export und der Lagerung von 5S rRNA im Zytoplasma beteiligt. Aufgrund der Parallele zwischen dem HIV-1-Rev vermittelten HIV-1-mRNA-Export und dem TFIIIA-vermittelten 5S rRNA-Export, wurde der Export von TFIIIA im Hinblick auf eine Beteiligung von eIF5A als Kofaktor analysiert. In Xenopus-Oozyten wurde TFIIIA an den nukleoplasmatischen Filamenten der Kernporenkomplexe detektiert. Weiterhin konnte durch den Einsatz des spezifischen CRM1-Inhibitors Leptomycin B bestätigt werden, dass TFIIIA, welches ein leucinreiches Kernexportsignal enthält, mittels CRM1 exportiert wird. Im Overlay-Blot-Assay konnte gezeigt werden, dass eIF5A mit TFIIIA interagiert. Außerdem deuten Mikroinjektionsexperimente darauf hin, dass eIF5A, wie beim HIV-1-Rev-vermittelten Export, auch beim TFIIIA-Export als essentieller Kofaktor involviert ist. Ein weiterer bekannter Bindungspartner von eIF5A ist Aktin, das im Zellkern an verschiedenen Exportprozessen sowie der RNA-Polymerase I-, II- und III-abhängigen Transkription beteiligt ist. Im Gegensatz zu Aktin wurde die Existenz des Aktinpartners Myosin im Zellkern erst vor kurzem realisiert. In dieser Arbeit konnten durch bioinformatische Analysen gezeigt werden, dass Kernmyosin IC bei Vertebraten weit verbreitet ist. Es wurde auch bei Xenopus laevis identifiziert. Im Vergleich zu Myosin IC fand sich ein zusätzlicher Aminoterminus aus 16 Aminosäuren, welcher als Kernlokalisationssignal fungiert. In Oozyten von Xenopus laevis konnte Kernmyosin IC, ähnlich wie RNA-Polymerase II, an den lateralen Schleifen der Lampenbürstenchromosomen dargestellt werden. Inhibierende Kernmyosinantikörper führten nach Mikroinjektion in den Zellkern von Xenopus-Oozyten zu einer kompletten Retraktion der meisten lateralen transkriptionsaktiven Schleifen sowie zu einer Verkürzung der Chromosomenachsen. konnte Kernmyosin IC vor allem im Nukleoluskern detektiert werden, wo es partiell mit RNA-Polymerase I und Fibrillarin kolokalisierte. In amplifizierten Nukleolen führte eine Transkriptionsinhibition mit Aktinomycin D zu einer Umverteilung des Kernmyosin IC zusammen mit der RNA-Polymerase I und der rDNA. Nach Injektion inhibierender Kernmyosinantikörper kam es zu einem massiven architektonischen Umbau der Nukleolen. Im Gegensatz zu den Nukleolen von somatischen Xenopus-Zellen war ein BrUTP-Einbau in amplifizierte Nukleolen jedoch noch möglich. Wie für Kernaktin bereits beschrieben, konnte auch Kernmyosin IC an den nukleoplasmatischen Filamenten der Kernporenkomplexe von Xenopus laevis-Ooyzten dargestellt werden. Da Aktin als essentieller Kofaktor an Exportprozessen beteiligt ist, sollte in Mikroinjektionsexperimenten auch eine Beteiligung von Kernmyosin IC beim Kernexport überprüft werden. Antikörper gegen ein Epitop in der Myosinkopfdomäne des Kernmyosin IC (XNMIC #42) waren im Gegensatz zu Antikörpern, die den charakteristischen Aminoterminus aus 16 Aminosäuren erkennen (XNMIC #54), in der Lage, einen CRM1-vermittelten Proteinexport zu inhibieren. N2 - Eucaryotic initiation factor 5A (eIF5A), an evolutionary highly conserved protein, is the only protein known to contain the unique amino acid modification hypusine. Even if eIF5A is ubiquitous expressed, cellular functions of eIF5A remain widely obscure. Hypusine inhibitors are able to enrich CD83 transcripts in the cell nucleus of dendritic cells and subsequently prevent surface expression of CD83. Therefore, a role of eIF5A in nucleocytoplasmic export of CD83 mRNA was supposed. Furthermore, HuR, a member of the ELAV family, binds CD83 transcripts on a specific cis-active RNA element, which forms a characteristic secondary structure. Whereas binding of HuR on AU-rich elements in the 3-UTR of certain transcripts leads to their stability, binding of HuR on CD83 transcripts in the coding region does not. In this thesis, microinjection experiments were performed in Xenopus laevis oocytes to elucidate the nucleocytoplasmic export of CD83 mRNA. The characteristic secondary structure of the HuR response element could be demonstrated as crucial for the nucleocytoplasmic export of CD83 transcripts. Furthermore, HuR could be identified as a binding partner of eIF5A. Inhibitory antibodies against both HuR and eIF5A were able to inhibit nuclear export of CD83 mRNA. While the bulk of cellular mRNAs leaves the nucleus with the aid of TAP/NXT1, CD83 mRNA is exported via the CRM1-mediated pathway, as could be demonstrated by export inhibition using specific CRM1 inhibitor leptomycin B. Oocyte type TFIIIA, another interaction partner of eIF5A, promotes RNA-Polymerase III-dependent transcription, nucleocytoplasmic translocation as well as storage of 5S rRNA in immature Xenopus oocytes. Due to a parallel of HIV-1 Rev mediated HIV-1 mRNA export and TFIIIA mediated 5S rRNA export, nuclear export of TFIIIA was examined with respect to a possible role of eIF5A as a cofactor. In Xenopus oocytes, TFIIIA could be detected on nucleoplasmic filaments of the nuclear pore complexes. Moreover, treatment with specific CRM1 inhibitor Leptomycin B comfirmed nucleocytoplasmic export of leucin-rich nuclear export signal containing TFIIIA via CRM1. Interaction of eIF5A with TFIIIA could be demonstrated using overlay blot assay. In microinjection experiments, eIF5A also seems to be an essential cofactor in TFIIIA export, parallel to HIV-1-Rev mediated export. Actin, a further known binding partner of eIF5A, is involved in diverse nuclear export pathways and RNA-Polymerase I, II and III dependent transcription. In contrast to actin, its partner myosin was only recently discovered undeniable in the cell nucleus. Nuclear myosin IC is a member of the Myosin I family of non filamentous, unconventional myosins. In this thesis, bioinformatical analysis displayed a wide distribution in vertebrates. Nuclear myosin IC is also present in Xenopus laevis. Compared to myosin IC, it contains a specific 16 amino acid aminoterminus, which acts as a nuclear localization signal. In Xenopus laevis oocytes, nuclear myosin IC, as well as RNA-polymerase II, localized on the lateral transcriptional active loops of lampbrush chromosomes. Inhibitory antibodies against nuclear myosin lead to complete retraction of most of the lateral transcriptional active loops and to a shortening of the chromosome axes. After inhibition of transcription in amplified nucleoli, using actinomycin D, nuclear myosin IC was relocated together with RNA-polymerase I and rDNA. Injection of inhibitory antibodies against nuclear myosin resulted in a massive architectural alteration of the amplified nucleoli. In contrast to nucleoli of somatic Xenopus cells, BrUTP-incorporation in amplified nucleoli was still possible. As already published for nuclear actin, nuclear myosin IC could also be detected on nucleoplasmic filaments of nuclear pore complexes in Xenopus laevis oocytes. As actin is an essential cofactor in export pathways, a possible role for nuclear myosin IC in nuclear export was examined by microinjection experiments. Antibodies against an epitop in the nuclear myosin head domain (XNMIC #42) were able to inhibit a CRM1 mediated protein export, whereas antibodies against the specific 16 amino acid terminus (XNMIC #54) failed. KW - RNS KW - Kernhülle KW - Stofftransport KW - Glatter Krallenfrosch KW - eIF5A KW - TFIIIA KW - CD83mRNS KW - Kernmyosin KW - eIF5A KW - TFIIIA KW - CD83mRNA KW - nuclear myosin Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-37474 ER - TY - THES A1 - Barth, Enrico T1 - Study of the properties of channel-forming proteins of the cell walls of different Corynebacteriae T1 - Untersuchung der Eigenschaften kanalbildender Proteine aus den Zellwänden verschiedener Corynebacteriae N2 - Die Gattung Corynebacterium gehört, neben Mycobacterium, Nocardia, Rhodococcus und weiteren nahverwandten Gattungen, dem unverwechselbaren, gattungsübergreifenden Taxon Mycolata an. Viele Spezies aus dieser heterogenen Gruppe Mycolsäure-haltiger Actinomyceten sind entweder aufgrund ihrer medizinischen oder ihrer biotechnologischen Bedeutung bekannt. Beispielsweise zählen Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Corynebacterium diphtheriae und Nocardia farcinica, welche weltweit Verursacher besonders gefährlicher bakterieller Infektionskrankheiten sind, zu dieser ungewöhnlichen Gruppe Gram-positiver Bakterien. Ebenso bedeutsam sind einige apathogene Mycolata-Arten, die industrielle Anwendung finden. Corynebacterium glutamicum und Corynebacterium efficiens sind leistungsfähige Bakterien, die zum Beispiel in der Produktion des Geschmacksverstärkers Glutamat und des Tierfuttermittelzusatzes Lysin eingesetzt werden, während verschiedene Rhodococcus Spezies Anwendung bei der Herstellung von Acrylsäuren finden. Die Zellwand der Mycolata zeigt, verglichen mit der klassischer Gram-positiver Bakterien, eine außergewöhnliche Zusammensetzung und Struktur auf. Abgesehen von einem Arabinogalactan-Peptidoglycan-Komplex enthält die Zellwand der meisten Actinomyceten einen hohen Anteil an Mycolsäuren. Diese langkettigen, verzweigten Fettsäuren formen eine, mit der äußeren Membran Gram-negativer Bakterien vergleichbare, stark undurchlässige, hydrophobe äußere Hülle, welche die Grundlage der außergewöhnlichen Medikamentenresistenz bei den Mycolata bildet. Wie die äußere Membran Gram-negativer Bakterien enthält die Zellwand der Mycolata porenformende Proteine, die den Durchlass hydrophiler Substanzen gestatten. Indem sie eine Verbindung zwischen dem Zellinneren und der Umwelt, in der das Bakterium lebt, schaffen und einen kontrollierten Austausch zwischen beiden ermöglichen, tragen die Kanalproteine entscheidend zur Funktion der bakteriellen Zellhülle bei. Das Ziel dieser Arbeit war das Wissen über Zellwandkanäle in Corynebakterien zu erweitern. Deshalb untersuchten wir PorA und PorH Proteine, die basierend auf früheren Studien Zellwandkanälen in C. glutamicum, C. efficiens und Corynebacterium callunae zugeordnet werden, um ungeklärten Fragen nachzugehen und um Wissen über deren Struktur zu erlangen. Ferner inspizierten wir Zellwände pathogener Corynebakterien, genauer gesagt von Corynebacterium diphtheriae und Corynebacterium jeikeium, um herauszufinden, ob diese Spezies wie ihre harmlosen Verwandten Kanalproteine besitzen. In dieser Arbeit wiesen wir mit C. diphtheriae und C. jeikeium in zwei weiteren Corynebacterium-Arten offene, mit Wasser gefüllte Zellwandkanäle nach. Des Weiteren stellten wir fest, dass sich die Zellwandkanäle von C. glutamicum, C. efficiens und C. diphtheriae aus zwei Proteinen zusammensetzen, einem zugehörig zu der Gruppe der PorH Proteine und einem weiteren aus der Gruppe der PorA Proteine. Diese heteromere Struktur von Zellwandkanälen bei Corynebakterien stellt ein Novum für Zellwandkanäle bei den Mycolata dar. Indessen besteht der Zellwandkanal von C. jeikeium aus nur einem Protein, CjPorA, angeordnet zu einem Oligomer. Obgleich das Molekulargewicht dieses Proteins (4 kDa) mit dem von PorH und PorA Proteinen vergleichbar ist (5-7 kDa), weißt seine Primärsequenz keine eindeutige Homologie zu diesen auf. Dennoch deutet vieles auf eine Verwandtschaft zwischen CjPorA und PorH/PorA Proteinen hin, da das Gen jk0268, welches für CjPorA kodiert, sich in einer Region des C. jeikeium Chromosoms befindet, die der Genomregion entspricht in welcher die porH/porA Gene der anderen Corynebakterien lokalisiert sind. Dies lässt vermuten, dass jk0268 (welches für den homomeren Zellwandkanal in C. jeikeium kodiert) und die porH/porA Gene von C. glutamicum, C. efficiens und C. diphtheriae (die einen heteromeren Zellwandkanal kodieren) wahrscheinlich Nachkommen eines gemeinsamen Vorläufergens sind. Phylogenetische Analysen der Gattung Corynebacterium unterstützen diese Annahme. Desweitern legen sie nahe, dass die hier untersuchten Zellwandkanäle innerhalb dieser Gattung wahrscheinlich weit verbreitet sind. Ein umfassendes Wissen über Zellwandkanäle, denen beim Transport gelöster Stoffe über die äußere Membran in Corynebakterien und anderen Mitgliedern der Mycolata eine entscheidende Rolle zukommt, könnte von großem wirtschaftlichem und medizinischem Nutzen sein. N2 - The genus Corynebacterium belongs, together with Mycobacterium, Nocardia, Rhodococcus and further closely related genera, to the distinctive suprageneric taxon mycolata. Many species within this diverse group of mycolic acid containing actinomycetes are known either because of their medical or biotechnological relevance. For instance, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Corynebacterium diphtheriae and Nocardia farcinica, causer of most dangerous bacterial infectious diseases world-wide, are among this exceptional group of Gram-positive bacteria. Likewise of importance are some harmless mycolata species which find use in industrial settings. Corynebacterium glutamicum and Corynebacterium efficiens are, e.g., potent producers of the flavour enhancer glutamate and the animal feed additive lysine, while several Rhodococcus species are applied in the production of acrylic acids. The cell wall of mycolata species, compared with that of Gram-positive bacteria, exhibits an unusual composition and organization. Besides an arabinogalactan-peptidoglycan complex, the cell walls of most actinomycetes contain large amounts of mycolic acids. Comparable to the outer membrane of Gram-negative bacteria, these long-chained branched fatty acids form a highly impermeable hydrophobic outer layer which provides the basis of the exceptional drug resistance of mycolata species. Like the outer membrane of Gram-negative bacteria, the cell wall of mycolata contains channel-forming proteins that allow the passage of hydrophilic solutes. By permitting and controlling the exchange and communication between the interior of the cell and the environment in which the bacterium lives, the channels play an important role for the function of the bacterial cell envelope. This thesis aimed to extend our knowledge about cell wall channels in corynebacteria. For this purpose, we examined PorA and PorH proteins that have been associated by previous studies with cell wall pores in C. glutamicum, C. efficiens and Corynebacterium callunae in order to resolve unanswered questions and to gain structural knowledge. We also investigated cell walls of pathogenic corynebacteria, in particular of Corynebacterium diphtheriae and Corynebacterium jeikeium, to investigate if these species possessed channels as is the case with their harmless relatives. In this work we provided evidence for the existence of large and water-filled cell wall channels in C. diphtheriae and C. jeikeium. Moreover, we demonstrated that the major cell wall channels of C. glutamicum, C. efficiens and C. diphtheriae consist of two distinctive polypeptides; one of whom belongs to the class of PorH proteins and the other to the class of PorA proteins. This heteromeric structure of channels of corynebacteria represents a novelty for channels of the mycolata. In contrast, the C. jeikeium channel is solely constituted by a single protein, CjPorA, arranged as an oligomer. Although the molecular mass of this protein (4kDa) is comparable to those of PorH and PorA proteins (5-7 kDa), it shares no distinctive homology in its primary sequence with them. However, there is evidence for relationship between CjPorA and PorH/PorA proteins because the gene jk0268, coding for CjPorA, is localized in a chromosomal region of C. jeikeium that corresponds to the genomic region containing the porH/porA genes in the other corynebacteria. This suggests that jk0268 (coding for the homomeric cell wall channel in C. jeikeium) and the porH/porA genes of C. glutamicum, C. efficiens and C. diphtheriae (coding for heteromeric cell wall channels) are presumably descendants of a common ancestor gene. This assumption gets support from data on phylogenetic analysis of the genus Corynebacterium. Moreover, these data suggest that the here investigated cell wall channels are presumably widespread within this genus. A profound knowledge of cell wall channels, building the main passage of solutes through the outer mycolate membrane in corynebacteria and other members of the mycolata, can be of great economical and medical value. KW - Zellwand KW - Corynebacterium KW - Corynebacterium callunae KW - Corynebacterium diphtheriae KW - Corynebacterium efficiens KW - Corynebacterium glutamicum KW - Porin KW - Corynebacterium jeikeium KW - C. jeikeium KW - C. glutamicum KW - C. efficiens KW - C. callunae KW - C. diphtheriae KW - Mykolsäuren KW - Lipid Bilayer Membran KW - Corynebacterium jeikeium KW - C. jeikeium KW - C. glutamicum KW - C. efficiens KW - C. callunae KW - C. diphtheriae KW - Mycolic acid KW - Lipid Bilayer Membrane KW - porin Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-36325 ER - TY - THES A1 - Porps, Patrick T1 - Erhöhte Lebenserwartung und Resistenz gegenüber oxidativem Stress in Maus-Prion-Protein (PrP)-exprimierenden Drosophila melanogaster T1 - Increased lifespan and resistance against oxidative stress in Drosophila melanogaster expressing the murine prion protein (PrP) N2 - Übertragbare spongiforme Enzephalopathien (TSE) wie Scrapie beim Schaf, die bovine spongiforme Enzephalopathie (BSE) beim Rind oder die Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (CJD) beim Menschen sind fortschreitende neurodegenerative Erkrankungen, die nach langer Inkubationszeit zum Tod führen. Die protein only-Hypothese besagt, dass das infektiöse Agens „Prion“ teilweise oder vollständig aus dem zellulären Prion-Protein (PrPC) besteht und nach Infektion des Organismus die Konversion von PrPC in die pathogene Isoform (PrPSc) verursacht. Die der Krankheit zugrunde liegenden neuropathologischen Mechanismen und die physiologische Funktion von PrPC sind bisher unbekannt. Es wurden jedoch eine neuroprotektive Funktion oder eine mögliche Rolle im Zusammenhang mit der oxidativen Stress Homöostase postuliert. In dieser Arbeit wurden transgene Drosophila melanogaster-Linien als Modell zur Untersuchung der Funktion von PrPC etabliert. Unter Verwendung des Expressionssystems UAS/GAL4 exprimierten die Fliegen entweder wildtypisches PrP (wt-PrP) oder eine trunkierte, krankheits-assoziierte Mutante PrPΔ32-134 (tr-PrP), der die potentielle neuroprotektive Octarepeat-Domäne entfernt wurde. Wt-PrP transgene Fliegen zeigten nach Vergleich mit Kontrolllinien eine signifikante, um 20% erhöhte allgemeine Lebenserwartung. Obwohl die Expression von tr-PrP in Drosophila zu keinen nachweisbaren neuropathologischen Veränderungen führte, wurde die Lebensspanne um 8% reduziert. Ko-Expression von wt-PrP und tr-PrP konnte diesen Effekt nicht komplementieren, was eine chronische Toxizität der trunkierten Form nahelegt, die in diesem Zusammenhang der Neuroprotektion übergeordnet ist. Da Lebenserwartung und Stressresistenz eng miteinander korrelieren, wurden die Fliegen den reaktiven Sauerstoffspezies Wasserstoffperoxid, Sauerstoff und Paraquat ausgesetzt, um auf drei unabhängigen Wegen oxidativen Stress zu induzieren. In der Tat vermittelt wt-PrP eine signifikante Stressresistenz, wohingegen tr-PrP-exprimierende Tiere eine normale Anfälligkeit offenbarten, die jedoch teilweise durch Ko-Expression beider PrP-Formen komplementiert werden konnte. Hier erscheint die protektive Funktion von wt-PrP der Toxizität der Deletionsmutante übergeordnet zu sein. Diese Daten belegen eine wichtige Funktion des Prion-Proteins bezüglich der Abwehr von oxidativem Stress. Essentiell ist dabei die Kupfer-bindende Octarepeat-Domäne, durch die möglicherweise Fenton-ähnliche Reaktionen, die bei der Sauerstoff-Radikalsynthese eine wichtige Rolle spielen, inhibiert werden könnten. Konsistent damit ist die Beobachtung des Verlusts der erworbenen Stressresistenz nach Expression der Octarepeat-losen Mutante tr-PrP und die signifikante Reduktion der Lebenserwartung über einen bislang unaufgeklärten Mechanismus. Das Drosophila PrP-Modell bietet die Möglichkeit, die physiologische Funktion von PrP detailliert zu untersuchen. Außerdem ist die Identifizierung unbekannter PrP-Interaktionspartner ermöglicht, um Signaltransduktionswege des PrP und die zugrunde liegenden neurodegenerativen Mechanismen aufzuklären. N2 - Transmissible spongiforme encephalopathies (TSE) such as scrapie in sheep, bovine spongiform encephalopathy (BSE) in cattle or Creutzfeldt-Jakob disease (CJD) in humans are fatal progressive neurodegenerative disorders. The protein only hypothesis proposes that the infectious agent designated prion consists partly or entirely of the host cellular prion protein (PrPC) and, when the prion is introduced into the organism, causes the conversion of PrPC into the pathogenic isoform PrPSc. However, the disease underlying neuropathogenic mechanisms and the physiological function of PrPC still remain unknown, although a neuroprotective function or a role in oxidative stress homeostasis has been postulated previously. In this work transgenic Drosophila melanogaster lines were evaluated as a model for studying the function of PrPC. By using the bipartite expression system UAS/GAL4 either wild-type PrP (wt-PrP) or a truncated disease associated variant PrPΔ32-134 (tr-PrP) lacking the putative neuroprotective octarepeat domain were utilized. Wt-PrP transgenic flies displayed an approximately 20% increase in average lifespan compared to controls. Although expression of tr-PrP in Drosophila did not induce any obvious neuropathology, it significantly reduced the lifespan by 8%. Co-expression of wt-PrP and tr-PrP did not complement this phenotype, indicating a chronic toxicity of the truncated PrP that is overriding the neuroprotection. Since extended lifespan and stress resistance are closely associated, flies were exposed to the reactive oxygen species (ROS) hydrogen peroxide, oxygen and Paraquat as three independent treatments to provoke oxidative stress. Interestingly, wt-PrP confered resistance to ROS-induced stress, whereas tr-PrP transgenic flies showed normal susceptibility, which was partly rescued by co-expression of wt-PrP. In this regard PrP presence in its physiological compartment, the central nervous system, is sufficient to maintain the described beneficial effects. These findings suggest that PrP is involved in oxidative stress homeostasis by a mechanism that requires the copper binding octarepeat domain. This function might be responsible for the inhibition of Fenton-like reactions which are known to play an important role in oxygen radical synthesis. Consistent with this theory is the observation that ectopic expression of the octarepeat deletion mutant tr-PrP reduces both acquired stress resistance and lifespan by an unrelated, yet unknown mechanism. The Drosophila PrP model provides the possibility to investigate the physiological function of PrP in more detail. It is likewise considerable to identify unknown ligands of PrP in order to uncover PrP signal transduction pathways or neuropathogenic mechanisms. KW - Prion KW - Prionprotein KW - Oxidativer Stress KW - Taufliege KW - PrP KW - prion KW - prion protein KW - drosophila melanogster KW - oxidative stress KW - longevity KW - stress resistance Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-36171 ER - TY - THES A1 - Michels, Birgit T1 - Towards localizing the Synapsin-dependent olfactory memory trace in the brain of larval Drosophila T1 - Lokalisierung einer Synapsinabhängigen Duft-Gedächtnisspur im Gehirn von Drosophila Larven N2 - Animals need to adapt and modify their behaviour according to a changing environment. In particular, the ability to learn about rewarding or punishing events is crucial for survival. One key process that underlies such learning are modifications of the synaptic connection between nerve cells. This Thesis is concerned with the genetic determinants of such plasticity, and with the site of these modifications along the sensory-to-motor loops in Drosophila olfactory learning. I contributed to the development and detailed parametric description of an olfactory associative learning paradigm in larval fruit flies (Chapter I.1.). The robustness of this learning assay, together with a set of transgenic Drosophila strains established during this Thesis, enabled me to study the role for Synapsin, a presynaptic phosphoprotein likely involved in synaptic plasticity, in this form of learning (Chapter I.2.), and to investigate the cellular site of the corresponding Synapsin-dependent memory trace (Chapter I.3.). These data provide the first comprehensive account to-date of the neurogenetic bases of learning in larval Drosophila. The role for Synapsin was also analyzed with regard to pain-relief learning in adult fruit flies (Chapter II.1.); that is, if an odour precedes an electric shock during training, flies subsequently avoid that odour (‘punishment learning’), whereas presentation of the odour upon the cessation of shock subsequently leads to approach towards the odour (‘relief larning’). Such pain-relief learning was also the central topic of a study concerning the white gene (Chapter II.2.), which as we report does affect pain-relief as well as punishment learning in adult flies, but leaves larval odour-food learning unaffected. These studies regarding pain-relief learning provide the very first hints, in any experimental system, concerning the genetic determinants of this form of learning. N2 - Tiere müssen sich den wechselnden Umweltbedingungen anpassen und ihr Verhalten dementsprechend ändern. Insbesondere ist die Fähigkeit bestrafende und belohnende Ereignisse zu lernen wesentlich für das Überleben. Ein Schlüssel-Prozess, der solchem Lernen unterliegt, sind Veränderungen in der synaptischen Verbindung zwischen Nervenzellen. Diese Arbeit beschäftigt sich mit den genetischen Bestimmungsgrößen solcher Plastizität und mit dem Ort an, dem diese Veränderungen entlang der sensorisch-motorischen Nervenbahn des olfaktorischen Lernens in Drosophila stattfinden. Ich habe an der Planung und der Festlegung der Parameter eines olfaktorischen assoziativen Lernparadigmas von Drosophila Larven mitgewirkt (Kapitel I.1.). Die Robustheit dieses Lernparadigmas, zusammen mit einer Anzahl an genetisch veränderten Drosophila Stämmen, die ich während dieser Arbeit entwickelt habe, ermöglichte es mir, die Rolle des Synapsins zu untersuchen. Synapsin ist ein präsynaptisches Phosphoprotein und wahrscheinlich an synaptischer Plastizität beteiligt, welche bei dieser Art von Lernen eine Rolle spielt (Kapitel I.2.). Außerdem ermöglichte es mir den zellulären Ort der Synapsinabhängigen Gedächtnisspur zu untersuchen (Kapitel I.3.) Diese Daten liefern den ersten umfassenden Wissensstand über neuro-genetische Grundlagen des larvalen Lernens. Die Rolle des Synapsin wurde auch im „Erleichterungslernen“ in adulten Fliegen analysiert (Kapitel II.1.). Wenn während des Trainings ein Duft einem elektrischem Schock vorausgeht, vermeiden Fliegen danach diesen Duft („Beschtrafungslernen“), wohingegen die Verabreichung des Duftes nach dem Ende des Schocks anschließend zu einer Annäherung in Richtung Duft führt („Erleichterungslernen“). Solches „Erleichterungslernen“ war auch der Schwerpunkt einer Reihe von Experimenten, die sich mit dem „White“-Gen beschäftigten (Kapitel II.2.). Wie gezeigt beeinflusst dieses Gen sowohl das „Erleichterungs“- als auch das „Bestrafungs“- Lernen in adulten Fliegen; jedoch hat es keine Auswirkungen auf das Duft-Futter-Lernen in Larven. Diese Experimente, die sich mit „Erleichterungslernen“ beschäftigen, liefern die neuesten Hinweise in Systemen, die sich mit den genetischen Bestimmungsgrößen dieser Form von Lernen beschäftigen. KW - Taufliege KW - olfaktorisches Lernen KW - Synapsin KW - Larve KW - drosophila larva KW - olfactory learning KW - Synapsin Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-36338 ER - TY - THES A1 - Vollmar, Friederike Lara Veronika T1 - Analyse der Kernhüllenbildung am Modellsystem Xenopus laevis T1 - Studying nuclear envelope assembly in the cell-free system derived from Xenopus laevis eggs N2 - Die Kernhülle ist eine hoch spezialisierte Membran, die den eukaryotischen Zellkern umgibt. Sie besteht aus der äußeren und der inneren Kernmembran, die über die Kernporenkomplexe miteinander verbunden werden. Die Kernhülle reguliert nicht nur den Transport von Makromolekülen zwischen dem Nukleoplasma und dem Zytoplasma, sie dient auch der Verankerung des Chromatins und des Zytoskeletts. Durch diese Interaktionen hilft die Kernhülle, den Zellkern innerhalb der Zelle und die Chromosomen innerhalb des Zellkerns zu positionieren, und reguliert dadurch die Expression bestimmter Gene. In höheren Eukaryoten durchlaufen sowohl die Kernhülle, als auch die Kernporenkomplexe während der Zellteilung strukturelle Veränderungen. Zu Beginn der Mitose werden sie abgebaut, um sich am Ende der Mitose in den Tochterzellen erneut zu bilden. Die molekularen Mechanismen, die zum Wiederaufbau der Kernhülle führen, sind kaum geklärt. Ein geeignetes System, um bestimmte Ereignisse bei der Kernhüllenbildung zu untersuchen, liefert das zellfreie System aus Xenopus Eiern und Spermienchromatin (Lohka 1998). Es konnte bereits früher gezeigt werden, dass es im Eiextrakt von Xenopus laevis mindestens zwei verschiedene Vesikelpopulationen gibt, die zur Bildung der Kernhülle beitragen. Eine der Vesikelpopulationen bindet an Chromatin, fusioniert dort und bildet eine Doppelmembran. Die andere Vesikelpopulation bindet an die bereits vorhandene Doppelmembran und sorgt für die Ausbildung der Kernporenkomplexe. Ziel dieser Arbeit war es, diese beiden Membranfraktionen zu isolieren und zu charakterisieren, wobei das Hauptinteresse in der porenbildenden Membranfraktion lag. Durch Zentrifugation über einen diskontinuierlichen Zuckergradienten konnten die Membranvesikel in zwei verschiedene Vesikelfraktionen aufgetrennt werden. Eine Membranfraktion konnte aus der 40%igen Zuckerfraktion („40% Membranfraktion“) isoliert werden, die andere aus der 30%igen Zuckerfraktion („30% Membranfraktion“). Die verschiedenen Membranfraktionen wurden zu in vitro Kernen gegeben, in denen die Kernporen durch vorausgegangene Bildung von Annulate Lamellae depletiert worden waren. Nach Zugabe der 30% Membranfraktion konnte die Bildung von funktionalen Kernporen beobachtet werden. Im Gegensatz dazu zeigte die 40% Membranfraktion keine porenbildenden Eigenschaften. Unter Verwendung eines vereinfachten Systems, bestehend aus Zytosol, Spermienchromatin und den Membranen, wurde gezeigt, dass die 40% Membranfraktion an Chromatin bindet und ausreichend ist, um eine kontinuierliche Doppelmembran ohne Kernporen zu bilden. Die 30% Membranfraktion besitzt keine Chromatinbindungseigenschaften und wird aktiv entlang von Mikrotubuli zu den porenlosen Kernen transportiert. Dort interagiert sie mit der chromatingebundenen 40% Membranfraktion und induziert die Porenbildung. Nach dem Vergleich der Proteinzusammensetzung der beiden Membranfraktionen, konnte das Major Vault Protein (MVP) nur in der porenbildenden Membranfraktion gefunden werden. MVP ist die Hauptstrukturkomponente der Vault-Komplexe, einem Ribonukleo-proteinpartikel, der in den meisten eukaryotischen Zellen vorhanden ist (Kedersha et al., 1991). Bemerkenswerterweise wird über die Funktion der Vault-Komplexe, trotz ihrer übiquitären Expression und ihrem Vorkommen in fast allen eukaryotischen Zellen, immer noch diskutiert. Um mehr über die Funktion und die Lokalisation der Vaults/MVP zu lernen, wurden die Vaults in Anlehnung an die Methode von Kedersha und Rome (1986) aus Xenopus Eiern isoliert. Zusätzlich wurde rekombinantes Xenopus MVP hergestellt, das unter anderem für die Produktion von Antikörpern in Meerschweinchen verwendet wurde. Um herauszufinden, ob die Anwesenheit von MVP in der 30% Membranfraktion in direktem Zusammenhang mit deren porenbildender Eigenschaft steht, wurden gereinigte Vault-Komplexe oder rekombinantes MVP, das alleine ausreichend ist, um in sich zu den charakteristischen Vault-Strukturen zusammenzulagern, zu porenlosen Kernen gegeben. Sowohl gereinigte Vault-Komplexe, als auch rekombinantes MVP waren in der Lage in den porenlosen Kernen die Bildung von funktionalen Kernporen zu induzieren. Untersuchungen zur Lokalisation von MVP zeigten, dass MVP teilweise an der Kernhülle und den Kernporenkomplexen lokalisiert, während der Großteil an MVP zytoplasmatisch vorliegt. Dies sind die ersten Daten, die Vaults/MVP mit der Kernporenbildung in Verbindung bringen. Deshalb bietet diese Arbeit die Grundlage, um diese unerwartete Rolle der Vaults in Zukunft genauer zu charakterisieren. N2 - The nuclear envelope (NE) is a highly specialized membrane that delineates the eukaryotic cell nucleus. It is composed of the inner and outer nuclear membranes that are connected by the nuclear pore complexes (NPCs). The NE not only regulates the trafficking of macromolecules between nucleoplasm and cytosol but also provides anchoring sites for chromatin and cytoskeleton. Through these interactions, the NE helps position the nucleus within the cell and chromosomes within the nucleus, thereby regulating the expression of certain genes. In higher eukaryotic cells, both NE and NPCs undergo structural changes during cell division as they disassemble at the onset of mitosis and need to reform in the daughter cells at the end of mitosis. The molecular mechanisms governing the reassembly of the NE are only poorly understood. A particular suitable system to analyze specific events involved in NE assembly is provided by the cell-free system based on Xenopus egg extract and sperm chromatin (Lohka 1998). Previously it could be shown that in Xenopus egg extract there exist at least two different vesicle populations that are involved in nuclear envelope assembly. One type of vesicle binds to chromatin where it fuses and forms a bilayered nuclear envelope. The other vesicle population binds to the double nuclear membrane and is required for nuclear pore complex formation. Aim of this study was to isolate and characterize these two membrane fractions with special regard to the pore-forming membrane fraction. By centrifugation on a discontinuous sucrose gradient the membrane vesicles could be separated into two different vesicle fractions. One membrane fraction was recovered from the 40% sucrose fraction (“40% membrane fraction”) and the other one from the 30% sucrose fraction (“30% membrane fraction”). The different membrane fractions were added to in vitro nuclei, where nuclear pores were depleted by formation of annulate lamellae. After addition of the 30% membrane fraction formation of functional nuclear pores could be observed. In contrast the 40% membrane fraction had no pore-forming property. Using a simplified system consisting of cytosol, spermchromatin an membranes it was demonstrated that the 40% membrane fraction binds to chromatin and is sufficient to form a continuous double membrane without NPCs. The 30% membrane fraction lacks chromatin targeting signals and is actively transported along microtubules to the pore-free nuclei. There it interacts with the chromatin-bound 40% membranes and induces formation of NPCs. Comparing the protein composition of both membrane fractions, the major vault protein (MVP) was found to be exclusively in the pore-inducing membrane fraction. MVP is the major structural component of vaults, a ribonucleoprotein particle found in most eukaryotic cells (Kedersha et al., 1991). Remarkably, despite their ubiquitous expression and abundance in nearly all eukaryotic cells, the functional role of vaults is still being debated. To learn more about the functional role and localization of vaults/MVP, vaults were isolated from Xenopus eggs following the procedure of Kedersha and Rome (1986). In addition recombinant Xenopus MVP was prepared and used to generate antibodies in guinea pigs. To find out whether the presence of MVP in the 30% membrane fraction is related to its pore-forming capacity, purified vault complexes or recombinant MVP, which alone is sufficient to selfassemble into the characteristic vault structure, were added to poreless nuclei. Both purified vaults and recombinant MVP induce the formation of functional NPCs in the pore-free nuclei. Studying the localization of MVP it was demonstrated, that MVP localizes in part at the nuclear envelope and the nuclear pore complexes, whereas most MVP is cytoplasmically. These are the first data that link vaults/MVP to NPC assembly. Therefore this work displays fundamental features to study this unexpected role of vaults in more detail. KW - Kernhülle KW - Kernporenkomplex KW - Major Vault Protein KW - Xenopus laevis KW - nuclear envelope assembly KW - nuclear pore complexes KW - major vault protein KW - Xenopus laevis Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-29298 ER - TY - THES A1 - Schlüter, Jan T1 - Molekulare Charakterisierung der Proepikardentwicklung T1 - Molecular Characterization of Proepicardial Development N2 - Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Charakterisierung der molekularen Grundlagen der Proepikardentwicklung im Huhn. Das Proepikard (PE) stellt die Vorläuferpopulation des Koronargefäßsystems dar. Es wurden zwei Schwerpunkte bearbeitet, zum einen die Rolle von einem Mitglied der TGFß-Superfamilie (BMP, bone morphogenetic protein) während der Induktionsphase des PE und zweitens die molekularen Mechanismen, welche der links/rechts Asymmetrie der PE Entwicklung zugrunde liegen. Die Expressionsmuster von TBX18, WT1, CFC weisen diese als proepikardiale Marker aus. BMP4 wird ebenfalls im PE exprimiert, wenngleich wesentlich schwächer als BMP2 im benachbarten Sinusmyokard. Durch in vitro Experimente mit proepikardialen Primärkulturen wurde festgestellt, dass die Zugabe von rekombinatem BMP2 einen Teil der Zellen zu Kardiomyozyten differenzieren lässt. Daher wird angenommen, dass ein Teil der proepikardialen Zellen konzentrationsabhängig auf Wachstumsfaktoren reagieren und in der Lage sind, die epikardiale Linie zu verlassen und ein myokardiales Schicksal anzunehmen. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Rolle des NODAL-PITX2-Signalweges in Bezug auf die Unilateralität des Proepikards im Hühnchen analysiert. Dazu wurden Manipulationen des Hensenschen Knotens im HH Stadium 4 durchgeführt, mit dem Ziel linksseitige Markergene auf der rechten Seite ektopisch zu induzieren. Keine dieser Manipulationen, als auch eine virale Überexpression von PITX2 in sinuatrialen Progenitoren in vivo, liess eine Veränderung der TBX18-Lateralität erkennen, obwohl die PITX2-Expression randomisiert war. Dagegen führte die Inhibition des asymmetrischen Ionenfluxes sowie der Apoptose im Primitivstreifen zu einer völligen Randomisierung der TBX18-Expression, sowie unter anderem der Entwicklung bilateraler Proepikardien. Die Induktion bilateraler TBX18-Expressionsdomänen war ebenfalls durch ektopisches FGF8 auf der linken Seite des Knotens zu beobachten. Der Verlust der rechtsseitigen FGF Signalgebung im Knoten resultierte in einem Verlust der rechtsseitigen TBX18-Expression im Sinus. Daraus kann geschlossen werden, dass proepikardiale Progenitoren nicht nur durch den asymmetrischen Ionenflux sowie Apoptose im Primitivstreifen in ihrer Lateralität festgelegt werden, sondern auch von rechtsseitigen FGF-Signalen im Knoten und unabhängig vom linkseitigen NODAL-PITX2-Signalweg lateralisiert werden. N2 - The proepicardium (PE) is a progenitor population of cells, which gives rise to the coronary blood vessel system of the heart. The aim of this study was to unravel the underlying mechansims of the induction of proepicardial development in the chick. Two main topics were hereby addressed, (1) investigation of the role of BMP (bone morphogenetic protein), a member of the TGFß-superfamily, during the induction of the PE and (2) the molecular mechanisms, which underlie the asymmetrical development of the PE. The analysis of TBX18, CFC and WT1 expression shows that these genes serve as proepicardial markers. BMP4 is also expressed in the PE, but significantly weaker than BMP2 that was known to be expressed in the sinus myocardium. Studies of proepicardial explants revealed, that treatment with recombinant BMP2 leads to differentiation into contractile cardiomyocytes. One can assume that proepicardial cells react after stimulation with growth factors like BMP2 by leaving the epicardial lineage and adopting a myocardial fate. In the second topic, the role of the NODAL-PITX2 pathway in the asymmetrical PE development was analyzed. Manipulations of Hensens node at stage HH 4 were performed to induce leftsided marker gene expression on the right side. However, none of these manipulations as well as a forced overexpression of PITX2 in sinuatrial progenitors had an influence on the expression of TBX18 in the right sinus. In contrast, inhibition of asymmetrical ionflux and prevention of apoptosis in the primitive streak randomized TBX18 expression and lead to the induction of bilateral PE anlagen. The applicaton of FGF8 on the left side of the node also lead to induction of bilateral TBX18 expression domains and the loss of FGF on the right side was followed by a loss of rightsided TBX18 expression. Presumably, the laterality of proepicardial cells is not only determined by an early asymmetrical ionflux and apoptosis in the primitive streak, but also via rightsided FGF signaling in the node which acts independently of the leftsided NODAL-PITX2 pathway. KW - Embryonalentwicklung KW - Hühnerembryo KW - Proepikard KW - links-rechts Asymmetrie KW - BMP KW - FGF KW - chick embryo KW - proepicardium KW - left-right asymmetry KW - BMP KW - FGF Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-30287 ER - TY - THES A1 - Karkazis, Andreas T1 - Vergleich von sozialrechtlichen Gestaltungsmöglichkeiten der medizinischen Versorgung in der Humangenetik an der Universität Würzburg durch das SGB V / 2004 T1 - Comparison of different scopes of design in medical sercice in the field of Human Genetics according to Health Care legislation N2 - „Die berufspolitische Situation für die Humangenetischen Institute hat sich an den Universitäten in den letzten zwei Jahren leider nicht verbessert. Vielen Instituten wurde der Zugang zur Erbringung von Kassenleistungen deutlich erschwert bzw. gänzlich entzogen.“ (Grimm, T.; Zerres, K., 2005, S. 41). Eine Analyse der Rechtsform und Aufbauorganisation sowie der Leistungen des Instituts für Humangenetik an der Universität Würzburg kann als Grundlage dienen, um die Auswirkungen einer entzogenen Kassenzulassung besser verstehen zu können. Zudem ermöglicht eine solche Betrachtung die Ableitung von Erfordernissen, die eine optimale Rechtsform und Aufbauorganisation des Instituts für Humangenetik an der Universität Würzburg erfüllen sollte. Zusammenfassend können dann die aktuellen und zukünftigen Rahmenbedingungen für die humangenetische Leistungserbringung bei bestehender Rechtsform und Aufbauorganisation beschrieben werden. Es wird deutlich, dass aufgrund eines drohenden Entzuges der Kassenzulassung eine Gefährdung der Erbringung humangenetischer Leistungen an der Universität Würzburg besteht. Die Finanzierung der erbrachten Leistungen in der Patientenversorgung wird zu ca. 75% von den gesetzlichen Krankenkassen getragen. Ein Wegbrechen eines solchen Leistungsumfanges hätte kaum kompensierbare Auswirkungen auf Forschung, Lehre, Weiterbildung und die Patientenversorgung an sich. Durch die Reformen des SGB aus dem Jahre 2004 sind verschiedene Alternativen zur bestehenden Rechtsform und Aufbauorganisation möglich geworden. Hierbei handelt es sich um Hochschulambulanzen (gem. §117 SGB V), Integrierte Versorgung (gem. §140 SGB V) und Medizinische Versorgungszentren (gem. §95 SGB V). Zudem gibt es die Möglichkeit einer „Praxis im Institut“-Kooperation. Diese Alternativen werden in der hier vorliegenden Arbeit kurz einzeln charakterisiert, um dann eine Bewertung der möglichen Rechtsformen und Aufbauorganisationen gemäß am Institut bestehender Erfordernisse zu ermöglichen. Die vergleichende Betrachtung wird zeigen, dass ein Medizinisches Versorgungszentrum (MVZ) eine gute Möglichkeit darstellt, die beschriebene Problematik zu lösen und die Erfordernisse des Instituts zu erfüllen. Im Anschluss werden die rechtlichen und organisatorischen Ausgestaltungsmöglichkeiten eines MVZs zur Erbringung humangenetischer Leistungen beleuchtet. Hierbei wird im Besonderen auf die gesetzlichen Gründungsvoraussetzungen eingegangen. Die Anforderungen an Gründer, Rechtsform, Leistungserbringer und ärztliche Leitung werden detailliert beschrieben, und die jeweiligen Gestaltungsmöglichkeiten im Hinblick auf die am Institut bestehenden Erfordernisse gewertet. Im Anschluss kann der Zulassungsprozess des MVZs an sich betrachtet werden. N2 - Comparison of different scopes of design in medical sercice in the field of Human Genetics according to Health Care legislation KW - Humangenetik KW - Humangenetik KW - Medizinisches Versorgungszentrum KW - Organisationsform KW - integrierte Versorgung Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-34679 ER - TY - INPR A1 - Dandekar, Thomas T1 - Why are nature´s constants so fine-tuned? The case for an escalating complex universe N2 - Why is our universe so fine-tuned? In this preprint we discuss that this is not a strange accident but that fine-tuned universes can be considered to be exceedingly large if one counts the number of observable different states (i.e. one aspect of the more general preprint http://www.opus-bayern.de/uni-wuerzburg/volltexte/2009/3353/). Looking at parameter variation for the same set of physical laws simple and complex processes (including life) and worlds in a multiverse are compared in simple examples. Next the anthropocentric principle is extended as many conditions which are generally interpreted anthropocentric only ensure a large space of different system states. In particular, the observed over-tuning beyond the level for our existence is explainable by these system considerations. More formally, the state space for different systems becomes measurable and comparable looking at their output behaviour. We show that highly interacting processes are more complex then Chaitin complexity, the latter denotes processes not compressible by shorter descriptions (Kolomogorov complexity). The complexity considerations help to better study and compare different processes (programs, living cells, environments and worlds) including dynamic behaviour and can be used for model selection in theoretical physics. Moreover, the large size (in terms of different states) of a world allowing complex processes including life can in a model calculation be determined applying discrete histories from quantum spin-loop theory. Nevertheless there remains a lot to be done - hopefully the preprint stimulates further efforts in this area. N2 - Dieses Preprint vertieft einen Aspekt des preprints http://www.opus-bayern.de/uni-wuerzburg/volltexte/2009/3353/, nämlich die Balance zwischen den Konstanten für unsere Naturgesetze. Die Frage nach einer solchen Balance entsteht nur, wenn man sich ein Multiversum mit vielen Alternativen Universen mit anderen Gewichten für die Naturkonstanten vorstellt und dann feststellt, dass diese gerade in unserem Universum optimal für Leben und überhaupt für komplexe, selbst organisierende Strukturen eingestellt sind (sogenanntes fine-tuning). Dies wird häufig mit dem anthropozentrischen Prinzip erklärt. Dies erklärt aber beispielsweise nicht, warum denn dieses fine-tuning noch deutlich feiner und genauer eingestellt ist, als für die Existenz eines Beobachters nötig ist. Wir zeigen dagegen, dass unser Universum besonders komplex ist und einen sehr großen Zustandsraum hat und Bedingungen, die eine hohe Komplexität erlauben, auch einen Beobachter und komplexe Prozesse wie Leben ermöglichen. Allgemein nimmt ein besonders komplexer Zustandsraum den Löwenanteil aller Alternativen ein. Unsere Komplexitätsbetrachtung kann auf verschiedenste Prozesse (Welten, Umwelten, lebende Zellen, Computerprogramme) angewandt werden, hilft bei der Modellauswahl in der theoretischen Physik (Beispiele werden gezeigt) und kann auch direkt ausgerechnet werden, dies wird für eine Modellrechnung zur Quantenschleifentheorie durchgeführt. Dennoch bleibt hier noch viel weitere Arbeit zu leisten, das Preprint kann hier nur einen Anstoß liefern. KW - Natur KW - Naturgesetz KW - Beobachter KW - Kolmogorov-Komplexität KW - Berechnungskomplexität KW - Fundamentalkonstante KW - Nature constants KW - complexity KW - observer KW - fine-tuning KW - multiverse Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-34488 ER - TY - THES A1 - Lechner, Melanie T1 - Charakterisierung des Umweltkeims Bordetella petrii. Untersuchungen zur genomischen Variabilität und zum Bvg Regulon T1 - Characerisation of the environmental bacterium Bordetella petrii. Investigation of genomic variability and the Bvg reguoln. N2 - Die 2001 beschriebene Art B. petrii stellt den ersten Umweltkeim der Gattung Bordetella dar, welcher aus einer anaeroben, dechlorinierenden Anreicherungskultur aus Flusssediment isoliert wurde. Phylogenetisch wird B. petrii an die Basis der Gattung Bordetella eingeordnet und ist in evolutionärer Hinsicht deshalb interessant, weil er sowohl für orthologe Gene bestimmter Virulenzfaktoren der pathogenen Bordetellen kodiert als auch typische Eigenschaften von Umweltkeimen aufweist und somit eine Art Bindeglied darstellt. Da B. petrii ein orthologes BvgAS-System besitzt (der Hauptregulator der Virulenzgenexpression in den pathogenen Bordetellen), wurde dessen Struktur im Rahmen dieser Arbeit mittels in silico Analysen untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass eine Konservierung nur auf Aminosäureebene deutlich zu erkennen ist und der Response Regulator BvgA von B. petrii die stärkste Konservierung aufweist. Desweiteren besitzt B. petrii Gene für zwei Histidinkinasen, BvgS1 und BvgS2, sowie ein separates Gen, welches für eine Hpt-Domäne kodiert. Weitere putative Virulenzfaktoren von B. petrii gehören in die Gruppe der Adhäsionsfaktoren. Diese Faktoren spielen bei den „klassischen“ Bordetellen im Infektionszyklus eine wichtige Rolle für die Anheftung z.B. an die Epithelzellen des Respirationstraktes. Um ein mögliches pathogenes Potential von B. petrii abschätzen zu können, wurden vergleichende Zellkulturstudien mit B. bronchiseptica durchgeführt. Dabei konnte gezeigt werden, dass B. petrii um den Faktor 7,5 weniger in Makrophagen aufgenommen wird. Hinweise auf die Funktionalität des BvgAS-Systems in B. petrii wurden durch Proteomstudien mit einer BvgA-Mutante erhalten, und deuten darauf hin, dass das BvgAS-System in B. petrii möglicherweise eine Funktion in der Respirationskontrolle haben könnte. Im Rahmen der Genomsequenzierung wurden acht genomische Inseln beschrieben, die in dieser Arbeit hinsichtlich ihrer Struktur und ihrem Excisionsverhalten untersucht wurden. Es konnte gezeigt werden, dass die genomischen Inseln, mit Ausnahme der Insel GI0, in verschiedenen Kombinationen, als ringförmige Intermediate aus dem B. petrii Genom ausgeschnitten werden können. Vier der genomischen Inseln (GI1-GI3 und GI6) weisen strukturelle Ähnlichkeiten zu einer Familie syntenischer genomischer Inseln auf, zu denen auch das clc-Element von Pseudomonas sp. Strain B13 zählt. Die größte Ähnlichkeit zum clc-Element weist die Insel GI3 von B. petrii auf. Diese beiden Inseln haben annähernd die gleiche Größe und besitzen Gene zu Abbau von 3-Chlorobenzoat (3-CBA). Die Untersuchung der Stabilität von GI3 ergab, dass nach 125-150 Generationen nur noch 1,5 % der Bakterien die Insel GI3 enthielten. Desweiteren konnte die Übertragung der Insel GI3 von B. petrii auf B. bronchiseptica PS2 gezeigt und der Integrationsbereich bestimmt werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde auch ein neuer Stammbaum der Gattung Bordetella erstellt, in welchen eine Reihe kürzlich neu beschriebener B. petrii Isolate mit aufgenommen wurden wodurch ein zu den pathogenen Bordetellen abgegrenztes Cluster gebildet wird. N2 - The in 2001 described species B. petrii represents the first environmental isolate of the genus Bordetella and was derived from an anaerobic, dechlorinating bioreactor culture enriched from river sediment. Phylogenetically B. petrii is placed at the root of the genus Bordetella. Since it possesses several orthologous genes to virulence factors of the pathogenic Bordetella species but also shows typical features of environmental bacteria, B. petrii might represent some sort of evolutionary missing link. A putative virulence factor in B. petrii is for example the BvgAS-system, which appears to be the master regulator for virulence gene expression in the pathogenic Bordetellae. In this work the structure of this BvgAS ortholog was to be investigated via in silico analyses. We could show that there is a clear conservation on amino acid level and that it is the response regulator BvgA that displays the strongest conservation. Furthermore B. petrii possesses two histidine kinase genes, bvgS1 and bvgS2, as well as a separate gene, coding for an Hpt-domain. Further putative virulence factors of B. petrii are adhesion factors. These play an important role in the infectious cycle of the classical Bordetellae to adhere e.g. to the epithelial cells of the respiratory tract. To assess a possible pathogenic potential of B. petrii, comparative cell culture studies with B. bronchiseptica were performed. They showed that the uptake of B. petrii into macrophages is 7,5 times less than the uptake of B. bronchiseptica. To learn about the function of the BvgAS-system in B. petrii, proteome studies with a BvgA-mutant were performed which indicate that the BvgAS-system in B. petrii might play a role in respiratory control and may react to changing oxygen availabilities. The genome sequencing project determined eight genomic islands which were investigated in this work regarding their structure and excision behaviour. We showed that all genomic islands, except island GI0, were able to excise from the B. petrii genome in different combinations and to form circular intermediates. Four of the genomic islands (GI1-GI3 and GI6) show structural similarity to a family of syntenic genomic islands also comprising the clc-element of Pseudomonas sp. strain B13. The island GI3 exhibits the highest similarity to the clc-element. Both islands are approximately of the same size and contain genes for 3-chlorobenzoate (3-CBA) degradation. Investigation of the GI3 stability revealed a loss of GI3 in 98,5 % of the bacteria after 125-150 generations. We further demonstrated the transfer of GI3 form B. petrii to B. bronchiseptica PS2 and also identified the integration site. In this work also a new phylogenetic tree of the genus Bordetella had to be created by integrating the recently described new B. petrii isolates which showed that the B. petrii isolates derived from different habitats form an independent cluster. KW - Mikrobiologie KW - Bordetella KW - Gentransfer KW - Bordetella petrii KW - genomische Inseln KW - BvgAS KW - Phylogenie KW - Integrase KW - Bordetella petrii KW - genomic island KW - BvgAS KW - phylogeny KW - integrase Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-34391 ER - TY - THES A1 - Steigerwald, Jutta T1 - Der NK-Zellrezeptor NKG2D als Zielstruktur für eine Antikörper-basierte therapeutische Immunmodulation T1 - The NK cell receptor NKG2D as target structure for antibody-based therapeutic immune modulation N2 - Das NKG2D (Natural Killer Group 2 Member D)-Protein, ist ein aktivierender Rezeptor, der es NK- und CD8+ T-Zellen ermöglicht, infizierte oder transformierte körpereigene Zellen zu erkennen und zu eliminieren. Eine Fehlregulation dieses Rezeptors auf Immunzellen scheint jedoch auch zur Ausbildung von Autoimmunerkrankungen wie Typ I Diabetes, Zöliakie und RA zu führen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein humaner Antikörper gegen hNKG2D für einen möglichen therapeutischen Einsatz bei Autoimmunerkrankungen generiert. Basierend auf den Sequenzen von schwerer (VH) und leichter Kette (VL) der murinen monoklonalen Antikörper 6H7 und 6E5A7, welche hNKG2D spezifisch binden und die Interaktion zwischen Ligand und Rezeptor blockieren, wurden scFv-Phagenbibliotheken hergestellt. Diese wurden anschließend zur Selektion im Phagen-Display eingesetzt. Der Humanisierungsprozess erfolgte hierbei mit Hilfe des Guided Selection-Verfahrens. Dazu wurde in einem ersten Phagen-Display-Durchgang die VH-Domäne des parentalen scFv mit einem humanen VL-Repertoire kombiniert. Die beiden daraus resultierenden humanen VL-Ketten wurden im darauf folgenden Schritt mit einem Repertoire an humanen VH-Domänen verknüpft. Da hierbei kein humaner rekombinanter scFv mit hNKG2D-Bindungsaktivität identifiziert werden konnte, musste eine schrittweise Humanisierung der Framework-Regionen (FR) der VH unter Beibehaltung der murinen CDR-Bereiche erfolgen. Diese führte zur Generierung des humanen scFv E1VLV71KVH, welcher neben den murinen CDR-Regionen lediglich noch drei Aminosäuren murinen Ursprungs im FR-Bereich besaß. Dessen biologische Aktivität wurde nach Konvertierung in das IgG1/lambda-Format in verschiedenen in vitro-Systemen analysiert. Anhand der Ergebnisse aus diesen Versuchen konnte ein deutlicher Verlust der Affinität und inhibitorischen Aktivität nach der Humanisierung festgestellt werden. Die dadurch erforderliche Affinitätsmaturierung des E1VLV71KVH Antikörpers mittels sequentieller Randomisierung des CDR3-Bereichs von E1VL und V71KVH resultierte in fünf unterschiedlichen, hoch-affinen Anti-hNKG2D scFv. Zwei dieser generierten Konstrukte, B1VLB6VH und E4VLG10VH, wurden nach ihrer Herstellung als vollständige IgG1/lambda-Antikörper in vitro hinsichtlich ihrer Aktivierungs- und Neutralisierungsaktivität, sowie ihrer Stabilität und Internalisierung durch NK-Zellen untersucht. Beide Antikörper wiesen nach der Affinitätsmaturierung mit einem IC50 von ca. 3,4x 10-2 µg/ml ein wesentlich höheres Inhibitionspotential als der murine Ursprungsantikörper (ca. 3,3 µg/ml) auf und zeigten gegenüber Hitzeeinwirkung und Serumproteasen eine hohe Stabilität. Mit Hilfe fluoreszenzmikroskopischer Untersuchungen konnten Internalisierungsvorgänge der Antikörper in die NK-Zelle beobachtet werden. Für ein besseres Verständnis NKG2D-abhängiger Regulationsvorgänge und die Identifizierung NKG2D-spezifischer Zielgene wurde das Genexpressionsprofil von humanen NK-Zellen nach Interaktion mit dem NKG2D-Liganden ULBP-1Fc mittels Microarray untersucht. Infolge einer anschließenden Validierung der Ergebnisse auf RNA- und Proteinebene konnten mittels RT-qPCR, FACS, ELISA und CBA NKG2D-spezifische Biomarker wie CRTAM, TNFalpha, IFNgamma und GM-CSF etabliert werden. Ergänzend zu 51Cr-Freisetzungs-Experimenten in zwei unterschiedlichen in vitro Zellkultursystemen ermöglichten diese Biomarker eine umfassende Charakterisierung neutralisierender und aktivierender Eigenschaften der beiden Antikörper B1VLB6VH und E4VLG10VH. Anhand dieser Experimente konnte festgestellt werden, dass die humanen Anti-hNKG2D Antikörper eine ambivalente Funktionalität aufweisen. In Lösung sind sie in der Lage, NKG2D-induzierte CRTAM-Expression, Zellyse und Zytokinfreisetzung zu inhibieren. Nach Kreuzvernetzung des NKG2D-Rezeptors über an Platten immobilisierte Anti-hNKG2D Antikörper hingegen lassen sich aktivierende Eigenschaften wie Zellyse und Zytokinsekretion durch NK Zellen beobachten. Aufgrund ihrer ambivalenten Aktivität scheint ein therapeutischer Einsatz der beiden Antikörper bei humanen Autoimmunerkrankungen zum jetzigen Zeitpunkt noch nicht möglich. In der vorliegenden Arbeit wurden somit die Voraussetzungen geschaffen, um einen humanen, hoch affinen hNKG2D neutralisierenden Antikörper in einem letzten Schritt in ein besser geeignetes Antikörper-Format (scFv, Fab oder F(ab)2) zu konvertieren. N2 - The natural killer group 2, member D protein (NKG2D) is an activating receptor on NK- and CD8+ T-cells, which enables them to identify and eliminate infected and transformed somatic cells. However, a dysfunction of this receptor on immune cells may lead to the development of autoimmune diseases like type I diabetes, celiac disease, and rheumatoid arthritis. In this doctoral thesis, a human antibody with anti-hNKG2D specificity was developed which could be of clinical relevance for the treatment of autoimmune diseases. Based on the sequences of heavy (VH) and light chain (VL) of the two murine monoclonal antibodies 6H7 and 6E5A7 which specifically bind to hNKG2D and block the interaction between NKG2D-ligand and receptor, scFv-phage-libraries were prepared. These libraries were used in the following selection process by phage-display and the humanization of the murine scFv was achieved by guided selection-technology. The VH domain of the parental scFv was first combined with a human VL-repertoire and the two resulting human light chains were then joined to a repertoire of human VH-domains. Because no recombinant human scFv with hNKG2D binding activity could be identified by this technique a stepwise humanization process of the VH framework-region (FR) had to be performed while retaining the murine CDR-domains. This procedure resulted in the human scFv E1VLV71KVH which in addition to the murine CDRs merely contained three amino acids of murine origin in the FR. The biological activity of the E1VLV71KVH was analyzed in different in vitro-systems after conversion of the scFv fragment into the completely human IgG1/lambda antibody format. The results of these experiments revealed a noticeable loss of affinity and neutralizing function of the antibody after humanization and thus demonstrated the need for affinity maturation. Therefore, a sequential randomization of the CDR3 domains of E1VL and V71KVH was performed which resulted in five different anti-hNKG2D scFv fragments with high affinity. Two of these human constructs, B1VLB6VH and E4VLG10VH, were produced as fully human IgG1/ antibodies and examined in vitro with regard to their activating and neutralizing activity as well as their stability and internalization effects by NK cells. After affinity maturation, both antibodies exhibited more potent inhibitory activity at IC50 values of 3,4x 10-2 µg/ml compared to the original murine antibody (3,3 µg/ml) and showed a high rigidity to impact of heat and serum proteases. Internalization events of the antibodies by NK cells could be observed by fluorescence microscopic analysis. For a better understanding of NKG2D-dependent regulation processes and the identification of NKG2D-specific target genes, the expression profile of ULBP-1Fc stimulated human NK cells was determined using microarray technology. The microarray data were validated on both RNA- and protein-level using RT-qPCR, FACS, ELISA and CBA, and the following biological NKG2D-specific markers could be established: CRTAM, TNFalpha, IFNgamma and GM-CSF. In addition to the execution of 51Cr-release studies in two different in vitro cell culture systems these markers provided the basis for the characterization of the neutralizing and activating capacity of the human antibodies B1VLB6VH and E4VLG10VH. The findings of all these experiments indicated that the human anti-hNKG2D antibodies exhibit an ambivalent functionality: In solution the antibodies have the ability to inhibit NKG2D-specific CRTAM-Expression, cytolytic activity and cytokine release. However, cross-linking of NKG2D-receptor via plate-bound human anti-hNKG2D antibodies results in the induction of a cytolytic response and cytokine secretion by human NK cells. Due to the bifunctional activity of these two antibodies a therapeutic use in human autoimmune diseases does not seem to be feasible yet. Taken together, this thesis has provided the basis for the conversion of a human hNKG2D neutralizing antibody with high affinity into a more suitable antibody format (scFv, Fab or F(ab)2). KW - Antikörper KW - Autoimmunität KW - Immunmodulation KW - Natürliche Killerzelle KW - NKG2D KW - Phagen-Display KW - Humanisierung KW - NKG2D KW - NK cell KW - human IgG1 KW - phage display KW - autoimmune disease Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-33446 ER - TY - THES A1 - Wüst, Simone T1 - Analyse des Wirkmechanismus von Kortikosteroiden bei der Therapie der Experimentellen Autoimmunen Enzephalomyelitis, einem Tiermodell für Multiple Sklerose T1 - Analysis of the mechanism of action of corticosteroids in the therapy of experimental autoimmune encephalomyelitis, an animal model for multiple sclerosis N2 - In der vorliegenden Arbeit wurden die Mechanismen der Hochdosis-GC-Pulstherapie im Zusammenhang mit akuten Schüben von MS-Patienten anhand des Tiermodells der MS, der Experimentellen Autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE), untersucht. Die EAE wurde in C57Bl/6 Mäusen und diversen GR-defizienten Mäusen durch Immunisierung mit Myelinoligodendrozytenglykoprotein (MOG35-55) induziert. Es konnte gezeigt werden, dass die Gabe von Dexamethason (Dex) den Krankheitsverlauf dosisabhängig verbessert. Die Untersuchung heterozygoter GR Knock-out Mäuse und hämatopoetischer Stammzellchimären verdeutlichte, dass der zytosolische GR (cGR) für die Vermittlung therapeutischer GC-Effekte von sehr großer Bedeutung ist. Der Einsatz zelltyp-spezifischer GR-defizienter Mäuse zeigte auf zellulärer Ebene, dass für die Vermittlung von GC-Wirkungen die Expression des GR vor allem in T-Zellen unabdingbar ist, wohingegen die GR-Expression in myeloiden Zellen in diesem Kontext keine Bedeutung hat. Durch die Analyse des molekularen Mechanismus konnte festgestellt werden, dass diese Effekte durch Apoptoseinduktion und Herunterregulieren von Adhäsionsmolekülen in peripheren, aber nicht ZNS-residenten T-Zellen erzielt wurden. Überdies wurde ersichtlich, dass Dex die T-Zellmigration in das ZNS verhinderte. Diese Beobachtung unterstützt die Hypothese, dass Dex durch Apoptoseinduktion und Immunmodulation hauptsächlich auf periphere T-Zellen wirkt und somit den ständigen Influx neuer Immunzellen in das ZNS verhindert. Ferner konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die therapeutische Gabe hochdosierten Methylprednisolons (MP) in diesem EAE-Modell ebenfalls zu einer dosisabhängigen Verbesserung der EAE führte. Diese beruhte auf einer reduzierten Lymphozyteninfiltration in das ZNS, war allerdings im Vergleich zur Dex-Therapie aufgrund geringerer Wirkpotenz weniger stark ausgeprägt. Im Gegensatz dazu führte die präventive MP-Applikation zu einem verstärkten EAE-Verlauf, der nach der Beeinflussung peripherer, hämatopoetischer Immunzellen auf eine verstärkte Proliferation autoreaktiver T-Zellen zurückzuführen ist. Im weiteren Verlauf der vorliegenden Arbeit wurde als möglicher Ersatz für die Hochdosis-GC-Pulstherapie eine nicht-steroidale, antiinflammatorische Substanz im chronischen EAE-Modell der C57Bl/6 Maus etabliert. Erste tierexperimentelle Untersuchungen mit Compound A (CpdA) offenbarten eine lediglich geringe therapeutische Breite dieser Substanz, wobei innerhalb pharmakologischer Dosierungen dennoch therapeutische Wirkungen vermittelt werden konnten. Anhand von in vitro Experimenten konnte eindeutig nachgewiesen werden, dass CpdA GR-unabhängig Apoptose induzierte, wobei Immunzellen und neuronale Zellen gegenüber CpdA besonders empfindlich reagierten. Der Einsatz T-Zell-spezifischer GR-defizienter Mäuse konnte zeigen, dass CpdA für die Vermittlung therapeutischer Wirkungen den cGR benötigt. Ferner wurde offensichtlich, dass CpdA in Abwesenheit des cGR in T-Zellen eine signifikante Verschlechterung der EAE verursachte. Durch die Anwendung physikochemischer Analysenmethoden, wie der Massenspektrometrie und 1H-NMR-Spektroskopie, konnte festgestellt werden, dass CpdA in vitro in gepufferten Medien in eine zyklische, chemisch sehr reaktive Verbindung (Aziridin) metabolisiert wird. Diese kann sehr wahrscheinlich für die Apoptose-Induktion in Zellen und die in Mäusen beobachteten neurotoxischen Ausfallerscheinungen verantwortlich gemacht werden. Durch chemische Analysen konnte in vitro in wässriger CpdA-Lösung ein weiterer Metabolit, das sympathomimetisch wirksame Synephrin, identifiziert werden. Um die Wirksamkeit adrenerger Substanzen in vivo zu testen, wurde das ß1/2-Sympathomimetikum Isoproterenol appliziert. Dieses verbesserte die EAE-Symptomatik, was sehr wahrscheinlich auf eine reduzierte Antigenpräsentation und einer damit verbundenen verminderten T-Zellinfiltration in das ZNS zurückzuführen ist. N2 - High-dose glucocorticoids (GC) are used to treat acute relapses of multiple sclerosis (MS) patients. In this work the underlying mechanisms of this therapy have been investigated using the animal model of MS, experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). EAE was induced in C57Bl/6 mice and several strains of glucocorticoid receptor (GR) deficient mice by immunization with myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55). It was shown that the application of dexamethasone (Dex) leads to a dose-dependent amelioration of the disease course. Analysis of heterozygous GR-knock out mice and hematopoietic stem cell chimeras revealed, that the cytosolic GR (cGR) is a prerequisite for mediating therapeutic GC effects. Furthermore, the use of cell type-specific GR-deficient mice showed at the cellular level that GR-expression is particularly needed in T cells, while it is dispensible in myeloid cells in this context. Analysis of molecular mechanisms determined that these effects are mainly achieved by apoptosis induction and down regulation of adhesion molecules in peripheral T cells, but not in CNS-residing T cells. In addition, it could be observed that Dex inhibited the T cell migration into the CNS. These findings confirm the hypothesis that Dex mainly acts on peripheral T cells by apoptosis induction and immunomodulation and thus inhibits the influx of new immune cells into the CNS. Furthermore, this work shows that therapeutic application of methylprednisolone (MP) in this EAE-model leads to a dose-dependent amelioration of the disease course as well. This improvement is based on a reduced lymphocyte infiltration into the CNS, but is less pronounced than that after Dex treatment due to reduced potency. In contrast to this, preventive MP-application induces an increased disease course. This aggravation is ascribed to interference with peripheral hematopoietic immune cells and an increased proliferation of autoreactive T cells. In the search of alternatives to high-dose GC therapy a novel antiinflammatory compound was established in the chronic EAE-model of the C57Bl/6 mouse. First in vivo experiments revealed that this non-steroidal substance, compound A (CpdA), has only little therapeutic index, but is able to mediate therapeutic effects within pharmacological dosages. On the basis of in vitro analysis CpdA induces apoptosis in a GR-independent manner, whereas immune cells and neuronal cells are most sensitive. Using T cell-specific GR-deficient mice it could be observed that CpdA requires the cGR for mediating therapeutic effects. Furthermore, the application of CpdA led to an aggravation of the EAE course in absence of the cGR in T cells. Physicochemical analysis such as mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy revealed that CpdA metabolizes in vitro in buffered media into a cyclic, highly reactive compound, aziridine. Presumably, this metabolite may be responsible for apoptosis induction in diverse cells and neurotoxic deficits observed in mice. Using the same methods, an adrenergic substance, synephrine, could be identified in vitro after resolving CpdA in water and PBS. In order to test the efficacy of adrenergic substances in EAE in vivo, the ß1/2-adrenergic drug isoproterenol, was applied. Isoproterenol led to an amelioration of the disease course which may be ascribed to decreased antigen presentation and reduced T cell infiltration into CNS. KW - Multiple Sklerose KW - Tiermodell KW - Glucocorticosteroide KW - Apoptosis KW - Experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis KW - Adhäsionsmoleküle KW - Glukokortikoid-Rezeptor Modulator KW - Experimental autoimmune encephalomyelitis KW - adhesion molecules KW - glucocorticoid-receptor modulator Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-32961 ER - TY - THES A1 - Le, Thu Ha T1 - Protein dynamics in responder and non-responder solid tumor xenografts during oncolytic viral therapy N2 - VACV GLV-1h68 was reported as a diagnostic/therapeutic vector which enters, replicates in, and reveals the locations of tumors in mice. Furthermore, the effect on tumor colonization, on tumor growth, regression and eradication by VACV GLV-1h68 without the need of any known genes with anti-tumoral activities was determined. To investigate differential protein expression between infected tumor cells and corresponding tumors, as well as between infected tumor cells, between infected tumors, proteomics is particularly used, possibly contributing to the understanding oncolytic ability on the protein level of VACV GLV-1h68. The given effects of VACV GLV-1h68 infection on cellular protein expression support tumor cell killing. In this study, differential protein expression was analyzed at different time points with two-dimensional gel electrophoresis (2DE) followed by MALDI-TOF/TOF identification. Comparative analysis of multiple 2-DE gels revealed that the majority of protein expression changes appeared at 48 hours post infection in cell cultivation and at 42 days post infection in tumors. Mass spectrometry identified 68, 75, 159 altered cellular proteins in the GI-101A, HT-29, PC-3 infected cells, respectively, including 30, 23, 49 up-regulated proteins and 38, 52, 110 down-regulated proteins 12 to 48 hours after infection. For xenografts, mass spectrometry identified 270, 101, 91 altered cellular proteins in the infected GI-101A, HT-29, PC-3 tumors, respectively, including 89, 70, 40 up-regulated proteins and 181, 31, 51 down-regulated proteins 7 to 42 days after infection. In general, in the cell lines, the proteins found to be differentially regulated are most often associated with metabolic processes, in particular with primary energy metabolism (glucose catabolism, TCA and lactate production). VAVC GLV 1h68 infection results in hijacking of the host translation apparatus, alteration of cytoskeleton networks, induce ubiqitin proteasome pathway (UPP) disorders. Particularly in tumors, the responses cover a much broader panel of cellular processes, including signalling (e.g., cell death), transport (in particular of iron ions) and migration. A common pathway to be up-regulated in both tumors and cell lines is the "unfolded protein response". Notably, VACV GLV-1h68 affected the anti-apoptosis pathways in GI-101A and PC-3 cancer cells but not in HT-29 xenografts. For example, GI-101A xenografts in mice appear 12 proteins associated with anti-apoptosis function. They were found down-regulated, including tumor protein-translationally-controlled (H-TPT1), rho-GDP-dissociation inhibitor alpha (H-GDIa), ywhaq protein (M-1433T), H-PRDX4, serine/threonine-protein phosphatase-2A-catalytic subunit beta isoform PP2A (M-Ppp2cb), eukaryotic translation initiation factor 2-subunit 1 alpha-35kDa (H-eIF2), H-actinin-α1 (ACTN1 ), Annexin A1 (H-A1), annexin A5 (H-A5), Mouse albumin 1 (M-Alb1), dimethylarginine dimethylaminohydrolase 2 (H-DDAH2). In PC-3 xenografts, anti-apoptosis expression is lesser than those in GI-101A cells, however 3 anti-apoptosis associated proteins were down-regulated such as ARP3 actin-related protein-3-homolog (H-ARP3), Human FLNA protein, Rho GDP dissociation inhibitor (GDI) alpha (H-GDIa). In contrast, in HT-29 xenografts, there are several anti-apoptosis-associated proteins that show even to be up-regulated; they mostly belong to peroxiredoxin proteins. Lesson from HT-29 had been given what various means the HT-29 cells use to escape their apoptosis fate. This suggests that VAVC GLV1h68 infection may induce unbalance of unfolded protein response (UPR) but tending to anti-apoptosis-mediated proteins and promote the destructive elements of UPR, including caspase-12 cleavage and apoptosis. Taken together in this thesis research I have tried to compare protein profiles obtained from responder cell line and from regressing solid tumors colonized by VAVC GLV-1h68 with that of non-responding tumors. I also compared these data with PC-3 prostate cell line and tumor data on intermediate responder which alter mouse protein profiling in tumors similarly to the highly efficacious GI-101A breast tumor cell line. From these comparisons I have deduced exciting protein pattern signature characteristic for a responder or distinctly different from non-responder system. Combining these few crucial genes involved with the transcriptional test data obtained by fellow graduate student at NIH a novel national designed VACV GLV-1h68 strains with enhanced efficacy in many today non-responder cancer cell lines will be available to be tested into ongoing clinical trials. N2 - Es ist bekannt, dass sich VACV GLV-1h68 sowohl als diagnostischer als auch therapeutischer Vektor eignet, der sich in Tumoren ansiedelt, darin repliziert und dass mit dessen Hilfe die Lokalisation von Tumoren bestimmen werden kann. Weiterhin konnte bereits gezeigt werden, dass der Effekt von GLV-1h68 auf die Tumor-Kolonisierung, das Tumorwachstum, die -regression und -vernichtung zustande kommt, ohne dass irgendwelche bekannten Gene mit anti-tumoraler Aktivität dazu notwedig wären. Um die differentielle Proteinexpression vergleichend sowohl zwischen uninfizierten und infizierten Tumorzellen als auch zwischen den korrespondierenden uninfizierten und infizierten Tumoren zu untersuchen, wurden proteomische Methoden angewandt. Ziel dieser Arbeit war es, mehr über die onkolytische Fähigkeit von GLV-1h68 auf Proteinebene zu erfahren. Die dargestellten Effekte der VACV GLV-1h68 Infektion auf die zelluläre Proteinexpression legen eine selektive Vernichtung von Tumorzellen nahe. In dieser Arbeit wurde die differentielle zelluläre Proteinexpression zu verschiedenen Zeitpunkten nach Infektion mit Hilfe der zweidimensionalen Gelelektrophorese (2-DE) gefolgt von MALDI-TOF/TOF-Identifikation der Proteine analysiert. Die vergleichende Analyse mehrerer 2-DE Gele zeigte, dass sich das Proteinexpressionsmuster bei Zellen aus in vitro Kulturen 48 hpi dramatisch verändert. Bei Zellen aus solidem Tumorgewebe erfolgen 42 Tage nach Infektion ebenfalls derartige dramatische Veränderungen. Mittels Massenspektroskopie wurden in GI-101A-Zellen 68, in HT-29-Zellen 75 und in PC-3-Zellen 159 alteriert exprimierte zelluläre Proteine nach VACV-Infektion beobachtet. Davon werden 30, 23 bzw. 49 hochreguliert und 38, 52 bzw. 110 niederreguliert. Diese „up“- bzw. „down“-Regulation erfolgte zwischen 12 und 48 h nach Virusinfektion. In Virus-besiedelten Xenograft-Tumoren wurden mittels Massenspektroskopie in GI-101A-, HAT-29- bzw. PC-3-Tumoren 270, 101 bzw. 91 alteriert exprimierte Proteine festgestellt. Von diesen wurden zwischen 7 und 42 Tagen nach Infektion 89, 70 bzw. 40 „up“-reguliert und 181, 31 bzw. 51 „down“-reguliert. Interessanterweise sind die in den Zelllinien differentiell regulierten Proteine meist mit metabolischen Prozessen, besonders mit dem primären Energiemetabolismus wie Glucose-Katabolismus, Zitronensäurezyklus und der Milchsäure-Produktion assoziiert. Eine VACV GLV-1h68-Infektion generall führt zur Umfunktionierung des Wirts-Translationsapparates zur Synthese von Virusproteinen, zur Umgestaltung des Zytoskeletts und zur Derangierung des Ubiquitin-anhängigen Proteasom-Abauweges. Insbesondere in Virus-infizierten Tumor-Xenograften ist eine weitere Palette von zellulären Prozessen alteriert. Dies umfasst die Signaltransduktion (einschließlich derjenigen, die zum Zelltod führen), Transportprozesse (hier ist vor allem der Eisentransport betroffen) und die Zellmigration. Ein gemeinsamer Signalweg, der sowohl in Zelllinien als auch in den Tumoren hochreguliert ist, ist die „unfolded protein response (UPR)“. Bemerkenswerterweise beeinflusst die VACV GLV-1h68-Infektion die anti-apoptotischen Signalwege in GI-101A und PC-3-Zellen, deren korrespondierende Tumoren nach Virusinfektion eine Regression aufweisen (regressive Tumoren), nicht jedoch in HT-29-Xenograften, die nach Infektion nicht mit Regression reagieren (nicht-regressive Tumoren). So werden z.B. in Virus-infizierten GI-101A-Xenograften 12 Proteine mit Anti-Apoptose-Funktion vermindert exprimiert, darunter tumor protein-translationally-controlled (H-TPT1), rho-GDP-dissociation inhibitor alpha (H-GDIa), ywhaq protein (M-1433T), H-PRDX4, serin/theronin-protein phosphatase-2A-catalytic subunit beta isoform PP2A (M-Ppp2cb), eukaryotic translation initiation factor 2-subunit alpha-35kDA (H-eIF2), H-actinin-α1 (ACTN1), annexn A1 (H-A1), annexin A5 (H-A5), mouse albumin 1 (M-Alb1), dimethylarginine dimethylaminohydrolase 2 (H-DDAH2). In PC-3-Xenograften werden lediglich drei anti-apoptotisch aktive Proteine, ARP3 actin-related protein-3-homolog (H-ARP3), human FLNA protein und rho GDP dissociation inhibitor (GDI) alpha (H-GDIa), niederreguliert. Im Gegensatz dazu werden in den nicht-regressiven HT-29-Tumoren anti-apoptotische Proteine sogar verstärkt exprimiert. Diese gehören vor allem zu den Peroxiredoxin-Proteinen. Diese Erkenntnisse geben Hinweise darauf, mit welchen Mechanismen HT-29-Tumorzellen der Apoptose entgehen. Die Vaccinia-Virus-Infektion scheint vor allem die UPR und Anti-Apoptose-Proteine zu beeinflussen. Weitere Untersuchungen sind in Zukunft nötig, um im Detail herauszufinden, wie die VACV-Infektion die UPR in Tumorzellen induziert und ob einige Elemente der UPR möglicherweise neue Ansätze zu einer verbesserten Tumortherapie darstellen könnten. KW - oncolytic viral therapy KW - proteome analysis Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-32016 ER - TY - THES A1 - Fink, Kristin T1 - Toxins in Renal Disease and Dialysis Therapy : Genotoxic Potential and Mechanisms T1 - Toxine in Nierenerkrankung und Dialyse Therapie : Genotoxisches Potential und Mechanismus N2 - In patients suffering from end-stage renal disease who are treated by hemodialysis genomic damage as well as cancer incidence is elevated. One possible cause for the increased genomic damage could be the accumulation of genotoxic substances in the blood of patients. Two possible sources for those toxins have to be considered. The first possibility is that substances from dialysers, the blood tubing system or even contaminated dialysis solutions may leach into the blood of the patients during dialysis. Secondly, the loss of renal filtration leads to an accumulation of substances which are normally excreted by the kidney. If those substances possess toxic potential, they are called uremic toxins. Several of these uremic toxins are potentially genotoxic. Within this thesis several exemplary uremic toxins have been tested for genotoxic effects (homocysteine, homocysteine-thiolactone,leptine, advanced glycated end-products). Additionally, it was analysed whether substances are leaching from dialysers or blood tubing and whether they cause effects in in vitrotoxicity testing. The focus of chemical analytisis was on bisphenol A (BPA), the main component of plastics used in dialysers and dialyser membranes. N2 - Patienten, die an terminaler Niereninsuffizienz leiden und mittels Hämodialyse behandelt werden, weisen einen erhöhten Genomschaden auf. Dieser könnte ursächlich für die erhöhte Krebsinzidenz dieser Patientengruppe sein. Eine der möglichen Ursachen für den erhöhten Genomschaden stellt die Akkumulation genotoxischer Substanzen im Blut der Patienten dar. Diese Substanzen können prinzipiell aus zwei unterschiedlichen Quellen stammen. Erstens besteht die Möglichkeit, dass während der Dialyse Substanzen aus den Dialysatoren, dem Blutschlauchsystem oder gar aus verunreinigtem Dialysat in das Blut der Patienten übertreten. Zweitens führt der Verlust der Nierenfunktion zu einer stark verminderten Exkretion harnpflichtiger Substanzen. Diese Substanzen akkumulieren im Blut und bilden, sofern sie ein toxisches Potential besitzen, die Gruppe der so genannten urämischen Toxine. Einige dieser urämischen Toxine sind potentiell auch genotoxisch. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurden exemplarische Vertreter der urämischen Toxine auf ihre genotoxische Wirkung hin untersucht (Homocstein, Homocystein-Thiolacton, Leptin, Advanced Glycation End-Products). Außerdem wurde analysiert, ob Substanzen aus Dialysatormembranen oder dem Blutschlauchsystem austreten und in in vitro-Toxizitätstests Effekte zeigen. Der Fokus der Analytik lag hierbei auf dem Nachweis von Bisphenol A, dem Hauptbestandteil verschiedener Kunststoffe die für Dialysatoren und Dialysatormembranen verwendet werden. KW - Bisphenol A KW - Homocystein KW - Extrakorporale Dialyse KW - Genomschaden KW - Urämische Toxine KW - bisphenol a KW - homocysteine KW - dialysis KW - genomic damage KW - uremic toxins Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-31082 ER - TY - THES A1 - Lazariotou, Maria T1 - Gentechnologische Reduktion der Expression des Autoantigens Glutamatdecarboxylase (GAD) in insulinproduzierenden Zellen des endokrinen Pankreas T1 - Suppression of the immunogenic potential of pancreatic beta-cells by genetic reduction of autoantigenic glutamic acid decarboxylase (GAD) expression N2 - Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte geprüft werden ob durch Reduktion der Glutamatdecarboxylase (GAD) Expression eine Reduktion des autoimmunogenen Potenzials in insulinproduzierenden Beta-Zellen des endokrinen Pankreas erreicht werden kann. Aus der Literatur ist bekannt, dass GAD als Autoantigen eine zentrale Stellung bei der Induktion der T-Zell vermittelten Insulitis einnimmt. Der Prozess, welcher zur Beta-Zell-Apoptose des Typ 1 Diabetes führt, ist ein bislang wenig verstandener komplexer Vorgang. Ein besseres Verständnis dieses Prozesses könnte zur Prävention der Beta-Zell-Zerstörung in der frühen Phase des Typ 1 Diabetes beitragen. In den für die Untersuchungen verwendeten INS-1 Zellen werden die beiden Isoformen der GAD exprimiert. Durch einen antisense Ansatz sollte in INS-1 Zellen die GAD Expression beider Isoformen supprimiert werden. In dieser Arbeit wurden zwei Methoden zur gezielten Suppression der Expression des Autoantigens GAD65 etabliert. Es konnte ein antisense Klon identifiziert werden, bei dem die endogene GAD65 mRNA fast nicht mehr detektierbar war. Auf Protein Ebene, im Westernblot konnte dieses Ergebnis jedoch nicht bestätigt werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Funktion der INS-1 Zellen mit supprimierter GAD65 Expression charakterisiert. Dieser Punkt beinhaltet die Analyse der Expression von Genen, welche die Beta-Zell-Funktion definieren, die Glukose-abhängige Insulinsekretion sowie die Regulation der Zytokin-induzierten Apoptose. Dabei zeigte sich aus Daten der RT-PCR, dass die mRNAs von anderen Beta-Zell-spezifischen Genen wie GLUT2, Glukokinase, Proinsulin, IDX1 und Nkx6.1 in unveränderter Menge nachweisbar sind. Also bleibt die Funktion der INS-1 Beta-Zellen erhalten, da selbst durch forcierte Reduktion der Expression des Autoantigens GAD65 die Glukose-induzierte Insulinsekretionskapazität im Wesentlichen nicht beeinträchtigt wird. In vitro Untersuchungen zeigten eine unveränderte Sensitivität der Zytokin-induzierten Apoptose nach GAD65 Suppression in INS-1 Zellen. Die zuvor genannten Resultate und die Tatsache, dass die GAD wohl eines der wichtigsten Autoantigene im Rahmen der Immunpathogenese des Typ 1 Diabetes ist, stellen die Grundlage für die Generierung GAD-supprimierter transplantierbarer Beta-Zellen mit guter Transplantatfunktion dar. Im Hinblick auf eine mögliche therapeutische Anwendung bei der Behandlung dieser humanen Autoimmunerkrankung demonstrieren die vorliegenden Daten, dass im Rahmen einer Inselzelltransplantation die Verwendung von GAD-supprimierten Beta-Zellen bei der Transplantation in das endokrine Pankreas des Menschen zu einer Verminderung von Autoimmunreaktionen führen könnte. N2 - In the present study we investigated genetic engineering approaches for the suppression of autoantigenic GAD expression in insulin producing pancreatic beta-cells. The enzyme glutamic acid decarboxylase (GAD) represents a major autoantigen in the early immunopathogenesis of T-cell-mediated destruction of pancreatic beta-cells in type 1 diabetes mellitus. The mechanisms which trigger the apoptotic destruction of insulin producing pancreatic beta-cells leading to autoimmune diabetes are incompletely understood. The exact mechanisms remain to be clarified. The enzyme glutamic acid decarboxylase (GAD), is expressed in INS-1 pancreatic beta-cells in two distinct isoforms GAD65 and GAD67. Thus, strategies to suppress GAD expression in INS-1 cell lines were tested. Two methods for suppression of autoantigenic GAD65 expression were established. One clone overexpression of GAD65 antisense mRNA yielded an almost complete suppression of endogenous GAD65 mRNA expression. In the second part of this thesis the characterization of INS-1 cells with suppressed autoantigenic GAD65 mRNA expression including beta-cell specific gene expression, glucose-dependent insulin secretion, and cytokine induced-apoptosis was tested. Expression of glucose transporter type 2, glucokinase, preproinsulin, islet/duodenum homeo box 1 transcription factor (IDX), and NK homeodomain transcription factor (Nkx6.1) were characterized by reverse transcription polymerase chain reaction. No differences in the amount of these beta-cell specific genes could be detected between GAD65 suppressed INS-1 cell clones and controls. Moreover, reduced GAD65 expression does not affect insulin secretory capacity in INS-1 cells. Suppression of GAD65 expression in INS-1 cells does not alter sensitivity to cytokine-induced apoptosis. The data presented here suggest that suppression of GAD expression may thus provide a therapeutical approach to prevent recurrence of autoimmune beta-cell destruction in transplanted pancreatic beta-cells in type 1 diabetic patients. KW - Glutamat-Decarboxylase KW - Diabetes mellitus KW - Transplantation KW - Insulin KW - B-Zelle KW - glutamic acid decarboxylase KW - type 1 diabetes mellitus KW - transplantation KW - insulin KW - pancreatic beta-cells Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-30878 ER - TY - THES A1 - Stoll, Regina T1 - Einfluss der Phosphoenolpyruvat-Phosphotransferasesysteme auf die Aktivität des Virulenzgenregulators PrfA von Listeria monocytogenes T1 - Impact of the phosphoenolpyruvate phosphotransferasesystems on the activity of the virulence gene regulator PrfA of Listeria monocytogenes N2 - Die PrfA-Aktivität im L. monocytogenes Stamm EGD sowie dessen prfA Deletionsmutante mit dem prfA- bzw. prfA*-Gen unter Kontrolle des prfA-Promotors auf dem High-Copy Plasmid pERL3 wurde nach Wachstum in BHI, LB (Luria-Bertani Medium) und definiertem MM untersucht. Die Medien waren versetzt mit 50 mM der PTS-Kohlenstoffquellen Glucose, Mannose oder Cellobiose oder mit der Nicht-PTS-Kohlenstoffquelle Glycerin. Mit dem Wildtyp EGD konnte in BHI und LB mit allen genannten Kohlenstoffquellen nur eine geringe PrfA-Aktivität beobachtet werden. In MM dagegen war die PrfA-Aktivität in Anwesenheit von Glycerin stark erhöht und mit Cellobiose als einziger Kohlenstoffquelle stark reprimiert. Mit dem PrfA*-überexprimierenden Stamm wurden unter allen Bedingungen hohe PrfA-Aktivität gefunden. EGDΔprfApPrfA zeigte dagegen trotz gleicher PrfA-Menge wie EGDΔprfApPrfA* nur in BHI eine hohe PrfA-Aktivität. Die Zugabe des Amberlites XAD4 in LB erhöht die reduzierte PrfA-Aktivität in EGDΔprfApPrfA und in MM verstärkt XAD4-Zugabe die PrfA-Aktivität des Wildtyps. Eine ptsH-Mutante ist in LB und MM unabhängig von der Zugabe einer der vier Kohlenstoffquellen nicht in der Lage zu wachsen (Stoll et al., 2008), was darauf hin deutet, dass die Aufnahme der verwendeten Kohlenstoffquelle und auch der Glycerinstoffwechsel von einem intakten PTS-Weg abhängig sind. In BHI stehen dagegen offensichtlich noch PTS-unabhängige Kohlenstoffquellen zur Verfügung, da die ptsH-Mutante in BHI noch wachsen kann. Dies unterstützt auch die Beobachtung, dass die Generationszeiten von L. monocytogenes in LB und vor allem MM im Vergleich zu BHI wesentlich länger sind. Expressionsdaten der PTS-Gene wurden von allen drei Stämmen unter verschiedenen Wachstumsbedingungen erstellt. Die Daten deuten darauf hin, dass die PrfA-Aktivität mit der Expressionsstärke und dem Phosphorylierungsstatus bestimmter PTS-Permeasen zusammenhängt. PTS-Permeasen bestehen immer aus mindestens drei Domänen, der Membran überspannenden Zucker transportierenden Domäne EIIC (und EIID im Falle von Mannose spezifischen PTS) und den zwei im Zytosol löslichen Komponenten EIIA und EIIB. EIIA wird direkt von HPr-His-P phosphoryliert, welches sein Phosphat von dem von PEP phosphorylierten EI empfängt. Das PTS spielt neben der Zuckeraufnahme eine Rolle in vielen regulatorischen Vorgängen in der Bakterienzelle, unter anderem in der Pathogenese (Barabote and Saier, 2005; Deutscher et al., 2006; Postma et al., 1993). Listerien codieren für alle sieben bekannten PTS-Familien, 86 Gene codieren für 29 komplette und einige unvollständige PTS. Trotz der großen Anzahl an PTS-Genen besitzt L. monocytogenes kein vollständiges PtsG, welches homolog zu E. coli oder B. subtilis ist, sondern nur ein EIIAGlc. Um die an der Glucoseaufnahme involvierten PTS-Permeasen zu identifizieren und einen möglichen Zusammenhang zwischen diesen PTS-Permeasen und der PrfA-Aktivität zu untersuchen, wurden in dieser Arbeit systematisch PTS-Permeasen deletiert, welche für putative Beta-Glucosid-PTS (PTSGlc), Mannose-PTS (PTSMan) und Cellobiose-PTS (PTSLac) codieren. Diese Deletionsmutanten wurden bezüglich ihres Wachstumes in Gegenwart der entsprechenden PTS-Zucker und die PrfA-Aktivität untersucht. Deletionen von in L. monocytogenes EGD-e nur schwach exprimierten PTSGlc haben keinen Einfluss auf das Wachstum in MM mit 10 mM Glucose oder Cellobiose. Von den vier exprimierten PTSMan sind zumindest zwei eindeutig in der Lage, Glucose zu transportieren, und die Deletion dieser PTS-Permeasen, codiert von lmo0096-0098 und lmo0781-0784, erhöht sehr deutlich die Expression des im Wildtyp wenig exprimierten Gens für die PTS-Permease PTSGlc(lmo0027). Für den Cellobiose-Transport scheint von den sechs vollständigen PTSLac-Permeasen vor allem PTSLac(lmo2683-2685) und nach Deletion dieses Operons, ebenfalls die PTSGlc(lmo0027)-Permease wichtig zu sein. Obwohl die multiple Deletion dieser für die Glucose/Mannose- bzw. Cellobiose-Aufnahme in L. monocytogenes wichtigen PTS-Permeasen das Wachstum in definiertem MM drastisch reduziert, haben diese Deletionen offensichtlich keine Auswirkung auf das intrazelluläre Wachstum, da die Infektionsrate so effizient ist wie die des Wildtyps. Auf PrfA hat die schrittweise Deletion der Glucose/Mannose-spezifischen PTS-Permeasen nach Wachstum in MM mit Glucose als einziger Kohlenstoffquelle eine aktivierende Wirkung, jedoch keine Auswirkung nach Wachstum in Cellobiose-haltigem MM. Umgekehrt verhält es sich mit den PTSLac-Deletionsmutanten. In vitro Transkriptionsstudien mit (teilweise phosphoryliert) aufgereinigten Lmo0096 (EIIABMan) und Lmo1017 (EIIAGlc) -Proteinen deuten auf eine direkte Interaktion zwischen PrfA und bestimmten EII-Proteinen hin. Dies konnte für Lmo0096 auch in Immunpräzipitationsassays gezeigt werden. Eine Überexpression von Lmo0096 führte zudem zu einer sehr deutlichen Reduktion der PrfA-Aktivität nach Wachstum in MM mit Glucose. N2 - In this study the PrfA activity was assessed in L. monocytogenes strain EGD and its isogenic deletion mutant (EGDΔprfA) with the prfA or prfA* gene under the control of the prfA promoter located on the high copy plasmid pERL3 (strains EGDΔprfApPrfA and EGDΔprfApPrfA*) after growth in BHI, LB (Luria-Bertani broth) and defined minimal medium. Media were supplemented with 50 mM of the PTS carbon sources glucose, mannose or cellobiose or with the non-PTS carbon source glycerol. In the wild type EGD grown in BHI and LB a low PrfA activity was observed with all of the above carbon sources. In MM PrfA activity was strongly increased in the presence of glycerol and strongly decreased with cellobiose as sole carbon source. In the PrfA* overexpressing strain EGDΔprfApPrfA* high PrfA activity was detected under all conditions. EGDΔprfApPrfA exhibited a high activity only in BHI, though PrfA amounts were equally high as in EGDΔprfApPrfA*. Addition of the amberlite XAD4 to LB increases the reduced PrfA activity in EGDΔprfApPrfA and the activity of the wildtype in MM. A ptsH mutant is unable to grow in LB and MM irrespective of the supplementation with the four carbon sources (Stoll et al., 2008), indicating that the uptake of the carbon source used as well as the glycerol metabolism are dependent on an intact PTS pathway. In contrast, BHI obviously possesses PTS independent carbon sources, as the ptsH mutant is still able to grow in BHI. This is also confirmed by the fact that L. monocytogenes generation times are significantly longer in LB and even more in MM as compared to BHI. Expression of the PTS genes was assessed in all three strains upon different growth conditions. The data suggest that PrfA activity is correlated with the expression level and the phosphorylation state of specific PTS permeases. PTS permeases always consist of at least three domains, the membrane crossing sugar transporting domain EIIC (and EIID in mannose specific PTS) and the two cytosolic components EIIA and EIIB. EIIA is directly phosphorylated by HPr-His-P which receives its phosphate group from EI which is phosphorylated by PEP. Aside from sugar transport PT Systems are involved in a variety of regulatory processes in the bacterial cell, e.g. in pathogenesis (Barabote and Saier, 2005; Deutscher et al., 2006; Postma et al., 1993). Listeria code for all of the seven known PTS families with 86 genes coding for 29 complete and several incomplete PTS. Despite the large number of PTS genes L. monocytogenes does not possess a complete PtsG homologue to E. coli or B. subtilis but only an orphan EIIAGlc. To identify the PTS permeases involved in glucose uptake and to investigate a possible role in PrfA regulation, mutants with deletions of beta glucoside PTS (PTSGlc), mannose PTS (PTSMan) and cellobiose PTS (PTSLac) permeases have been analyzed systematically in this study. These deletion mutants were analyzed in respect to their growth upon the respective PTS sugars and to their PrfA activity. Deletion of the five PTSGlc permeases only weakly expressed in L. monocytogenes EGD-e had no impact on growth in MM with 10 mM glucose or cellobiose. At least two out of the four expressed PTSMan permeases are able to transport glucose and the deletion of these PTS (encoded by lmo0096-0098 and lmo0781-0784) causes a significant increase in expression of the PTSGlc(lmo0027) permease, which is expressed at a low level in the wildtype. For transport of cellobiose, only PTSLac(lmo2683-2685) out of the six complete PTSLac permeases and, after deletion of this operon, PTSGlc(lmo0027) seem to be of importance. Although multiple deletions of the PTS important for glucose/mannose and cellobiose uptake have severe consequences on growth in defined MM, obviously intracellular life is not affected, as infection rates resemble those of the wild type. PrfA is activated by the stepwise deletion of the glucose/mannose specific PTS upon growth in MM supplemented with glucose, but no effect is seen upon growth in cellobiose supplemented MM. The behavior of the PTSLac deletion mutants is conversely. In vitro transcription studies with (partially phosphorylated) purified Lmo0096 (EIIABMan) and Lmo1017 (EIIAGlc) proteins suggest a direct interaction between PrfA and specific EII proteins. This could be confirmed for Lmo0096 in immuno precipitation assays. An overexpression of lmo0096 lead to a significant reduction of PrfA activity upon growth in MM supplemented with glucose. KW - Listeria monocytogenes KW - Phosphotransferasesystem KW - Virulenz KW - PrfA KW - PrfA Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-32072 ER - TY - THES A1 - Kotzsch, Alexander T1 - BMP Ligand-Rezeptor-Komplexe: Molekulare Erkennung am Beispiel der Spezifischen Interaktion zwischen GDF-5 und BMPR-IB T1 - BMP ligand receptor complexes: Molecular recognition exemplified by the specific interaction between GDF-5 and BMPR-IB N2 - Knochenwachstumsfaktoren (Bone Morphogenetic Proteins, BMPs) sind ubiquitäre, sekretierte Proteine mit vielfältigen biologischen Funktionen. Die Vielfalt an zellulären Prozessen, die durch BMPs reguliert werden, von der Knochenentwicklung und Organhomöostase bis hin zur Neurogenese, erstaunt – und wirft angesichts von teils redundanten, teils spezifischen Funktionen der BMPs Fragen zu den Mechanismen ihrer Signalübermittlung auf. Die Signaltransduktion von BMPs erfolgt wie bei den strukturell verwandten TGF-βs und Activinen durch die ligandeninduzierte Oligomerisierung von transmembranen Serin/Threonin-Kinaserezeptoren, von denen zwei Typen – Typ I und Typ II – existieren. Einer Vielzahl von mehr als 18 BMP-Liganden stehen nach derzeitigem Erkenntnisstand nur vier Typ I und drei Typ II Rezeptorsubtypen für die Bildung von heteromeren Rezeptorkomplexen zur Verfügung. Ein BMP-Ligand kann hochspezifisch nur einen bestimmten Rezeptorsubtyp oder in einer promisken Art und Weise mehrere Rezeptorsubtypen binden. Trotz dieser Bindungspromiskuität üben BMPs ihre biologische Funktion überwiegend hochspezifisch aus, d.h. abhängig vom Liganden werden spezifische zelluläre Prozesse reguliert. Somit stellt sich die Frage, wie die Bildung von heteromeren Ligand-Rezeptor-Komplexen und die Aktivierung definierter intrazellulärer Signalkaskaden zusammenhängen und wie letztlich ein bestimmtes BMP-Signal durch einen „Flaschenhals“, repräsentiert durch die begrenzte Anzahl an Rezeptorsubtypen, in das Zellinnere übermittelt wird. Die Interaktionen zwischen BMP-2 / GDF-5 und den Typ I Rezeptoren BMPR-IA / BMPR-IB sind ein Paradebeispiel für Bindungspromiskuität und -spezifität. Während BMP-2 beide Rezeptoren BMPR-IA und BMPR-IB mit gleicher Bindungsaffinität bindet („promiske Interaktion“), zeigt GDF-5 eine 15-20fach höhere Bindungsaffinität zu BMPR-IB („spezifische“ Interaktion). Dieser Unterschied ist scheinbar gering, aber physiologisch überaus relevant. Um Einblick in die Mechanismen der molekularen Erkennung zwischen den Bindungspartnern zu gewinnen, wurden binäre und ternäre Komplexe aus den Liganden BMP-2 oder GDF-5, den extrazellulären Domänen der Typ I Rezeptoren BMPR-IA oder BMPR-IB sowie der extrazellulären Domäne des Typ II Rezeptors ActR-IIB untersucht. Die hier vorliegende Arbeit beschreibt die strukturelle und funktionelle Analyse dieser Ligand-Rezeptor-Komplexe. Um den Einfluss struktureller Flexibilität auf die BMP Typ I Rezeptor Erkennung näher zu analysieren, wurde zudem die Struktur von BMPRIA in freiem Zustand mittels NMR-Spektroskopie aufgeklärt. Aus Mutagenesedaten und der Kristallstruktur des GDF-5•BMPR-IB-Komplexes lassen sich im Vergleich zu bekannten Kristallstrukturen Merkmale ableiten, mit denen die Ligand-Rezeptor-Bindung und -Erkennung charakterisiert werden kann: (1) Die Hauptbindungsdeterminanten in Komplexen von BMPR-IA und BMPR-IB mit ihren Liganden sind unterschiedlich. Während in Komplexen mit BMPR-IB ein hydrophobes Motiv die Bindungsaffinität bestimmt, trägt in Komplexen mit BMPR-IA eine polare Interaktion signifikant zur Bindungsenergie bei. Ein Vergleich der Strukturen von freien und gebundenen Liganden und Typ I Rezeptoren zeigt, dass interessanterweise diese Hauptbindemotive erst bei der Ligand-Rezeptor-Interaktion entstehen, sodass ein „induced fit“ vorliegt und die Moleküle entsprechend „aufeinander falten“. (2) Die Bindungsspezifität wird durch periphere Schleifen in den Typ I Rezeptoren bestimmt. Wie Untersuchungen von Punktmutationen in BMPR-IA zeigen, die einer krebsartigen Darmerkrankung (Juvenile Polyposis) zugrunde liegen, führt erst die „richtige“ Kombination aus Flexibilität in den Schleifen und Rigidität des Rezeptorgrundgerüsts zu signalaktiven Typ I Rezeptoren mit einer potentiell den Liganden komplementären Oberfläche. Die mangelnde sterische Komplementarität von Ligand- und Rezeptoroberflächen führt zu der niedrigeren Bindungsaffinität von GDF-5 zu BMPR-IA im Vergleich zu BMPR-IB. Interessanterweise zeigen die hier vorgestellten, hochaufgelösten Strukturdaten, dass die Orientierungen/Positionen der Typ I Rezeptoren BMPR-IA und BMPR-IB in den Bindeepitopen der Liganden BMP-2 und GDF-5 variieren. Unter der Voraussetzung, dass die extrazelluläre Domäne, das Transmembransegment und die intrazelluläre Domäne der Typ I Rezeptoren ein starres Element bilden, sollte sich die unterschiedliche Orientierung der extrazellulären Domänen der Typ I Rezeptoren in der Anordnung der Kinasedomänen widerspiegeln und sich auf die Signaltransduktion auswirken. Möglicherweise ist eine bestimmte Anordnung der Kinasedomänen der Typ I und Typ II Rezeptoren für eine effiziente Phosphorylierung bzw. Signaltransduktion erforderlich. Der Vergleich mehrerer Ligand-Typ I Rezeptor-Komplexe zeigt, dass die unterschiedliche Orientierung dieser Rezeptoren möglicherweise vom Liganden abhängt. Angesichts der Bindungspromiskuität unter BMP-Liganden und -Rezeptoren könnten so spezifische Signale übermittelt und spezifische biologische Funktionen reguliert werden. Die in dieser Arbeit vorgestellten Erkenntnisse tragen wesentlich zur strukturellen Charakterisierung der Ligand-Rezeptor-Erkennung in der BMP-Familie bei. Die Frage, warum trotz strukturell hoch homologer Liganden und Rezeptoren und weitgehend konservierten Bindeepitopen eine teils promiske und teils spezifische Interaktion möglich ist, kann nun für die Liganden BMP-2 und GDF-5 sowie den beiden Typ I Rezeptoren BMPR-IA und BMPR-IB beantwortet werden. N2 - Bone morphogenetic proteins (BMPs) are ubiquitous, secreted cytokines involved in a manifold of biological functions. The diversity of cellular processes regulated by BMPs, from bone development to tissue homeostasis and neuronal processes, is amazing – and raises questions about the mechanisms of signal transduction in the light of redundant functions on the one hand, and specific functions on the other hand. Similar to structurally related activins and TGF-βs, the signal transduction of BMPs is accomplished by ligand-induced oligomerization of transmembrane BMP type I and type II serine/threonine receptor kinases. According to current knowledge, only four type I and three type II receptor subtypes are available for BMP signal transduction, facing a multitude of more than 18 BMP ligands. Binding of BMP ligands to their receptors can be highly specific meaning that only one specific receptor of either subtype is used for signaling. In contrast, many BMP ligands can recruit more than one receptor subtype, which results in binding promiscuity. However, even though receptor subtypes are bound in a promiscuous manner, only certain biological functions are triggered. Dependent on the BMP ligand, specific cellular processes are activated and regulated. This discrepancy between unspecific binding and specific signaling events and the biological response raises the question how the formation of heteromeric ligand-receptor complexes is linked to the activation of defined intracellular signaling cascades, and finally, how a certain BMP signal is transduced into the interior of the cell through a „bottleneck“ represented by the limited number of receptor subtypes. The interaction between BMP-2 / GDF-5 and the BMP type I receptors BMPR-IA / BMPR-IB is a prime example for binding promiscuity and binding specificity. BMP-2 binds BMPR-IA and BMPRIB with almost equal binding affinity („promiscuous interaction“) while GDF-5 exhibits a 15-20fold higher binding affinity to BMPR-IB („specific interaction“). Although this difference is seemingly small, it is however of considerable relevance for the physiological role of these ligands. To gain insight into the mechanisms of molecular recognition between the binding partners, binary and ternary ligand-receptor complexes consisting of BMP-2 or GDF-5, the extracellular domains of the type I receptors BMPR-IA or BMPR-IB, and the extracellular domain of the type II receptor ActRIIB were investigated. The thesis presented here describes the structural and functional analysis of these ligand-receptor complexes. To analyse the effect of structural flexibility on BMP type I receptor recognition in more detail, the structure of free BMPR-IA was determined using NMR spectroscopy. Based on data from a limited mutagenesis and the crystal structure of the GDF-5•BMPR-IB complex several characteristics concerning ligand-receptor binding and recognition can be deduced: (1) The main binding determinants in complexes of BMPR-IA and BMPR-IB with their ligands BMP-2 and GDF-5 differ. A hydrophobic binding motif determines binding affinity in complexes of BMPR-IB, whereas a polar interaction significantly contributes to binding energy in complexes of BMPR-IA. These main binding motifs are only formed during complex formation as demonstrated by a comparison between structures of free and bound ligands as well as type I receptors. Both ligand and receptor fold „onto each other“ which suggests an induced fit mechanism. (2) Binding specificity is encoded on loops at the periphery of the binding epitope of the type I receptors. Only the „appropriate“ combination between structural flexibility in the receptor loops and structural rigidity of the receptor backbone results in signal active type I receptors, as shown by analysis of single polymorphisms in BMPR-IA causing juvenile polyposis syndrome, a cancerous disease of the intestine. A lack of steric surface complementarity between GDF-5 and BMPR-IA, that cannot be overcome by structural flexibility, leads to the lower binding affinity in comparison to BMPR-IB. Interestingly, the high resolution structure of the GDF-5•BMPR-IB complex shows that the orientations/positions of BMPR-IA in the binding epitope of BMP-2 and of BMPR-IB in the binding epitope of GDF-5 vary. Assuming that the extracellular domain, the transmembrane segment, and the intracellular domain of the type I receptors form a rigid element, the different orientations of the extracellular domains should also reflect the assembly of the kinase domains and therefore, affect signal transduction. One can assume that a defined arrangement of the kinase domains of type I and type II receptors is required to allow for efficient phosphorylation and signal transduction, respectively. The comparison of several BMP ligand-type I receptor complexes suggests that the different orientations of these receptors are likely dependent on the ligand. Considering the binding promiscuity among BMP ligands and receptors such a mechanism would represent a possible way for the transmission of specific signals and regulation of specific biological functions. The insights into molecular structure and function of BMP ligands and receptors presented in this thesis contribute significantly to a more detailed understanding of their binding properties. The question why the interaction of BMP ligands and receptors is promiscuous on the one hand and specific on the other hand in spite of structurally highly homologous molecules can now be answered for BMP-2 and GDF-5 as well as BMPR-IA and BMPR-IB. KW - Cytokine KW - Knochen-Morphogenese-Proteine KW - Ligand KW - Proteinfaltung KW - Molekulare Erkennung KW - Rezeptor KW - Transforming Growth Factor beta KW - Wachstumsfaktor KW - Strukturaufklärung KW - Dreidimensionale NMR-Spektroskopie KW - Protein-Serin-Threonin-Ki KW - Proteinkristallographie KW - GDF-5 KW - BMPR-IB KW - Signaltransduktion KW - protein crystallography KW - molecular recognition KW - signal transduction KW - ligand KW - receptor Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-31040 ER - TY - THES A1 - Zube, Christina T1 - Neuronal representation and processing of chemosensory communication signals in the ant brain N2 - Ants heavily rely on olfaction for communication and orientation and ant societies are characterized by caste- and sex-specific division of labor. Olfaction plays a key role in mediating caste-specific behaviours. I investigated whether caste- and sex-specific differences in odor driven behavior are reflected in specific differences and/or adaptations in the ant olfactory system. In particular, I asked the question whether in the carpenter ant, Camponotus floridanus, the olfactory pathway exhibits structural and/or functional adaptations to processing of pheromonal and general odors. To analyze neuroanatomical specializations, the central olfactory pathway in the brain of large (major) workers, small (minor) workers, virgin queens, and males of the carpenter ant C. floridanus was investigated using fluorescent tracing, immunocytochemistry, confocal microscopy and 3D-analyzes. For physiological analyzes of processing of pheromonal and non-pheromonal odors in the first odor processing neuropil , the antennal lobe (AL), calcium imaging of olfactory projection neurons (PNs) was applied. Although different in total glomerular volumes, the numbers of olfactory glomeruli in the ALs were similar across the female worker caste and in virgin queens. Here the AL contains up to ~460 olfactory glomeruli organized in 7 distinct clusters innervated via 7 antennal sensory tracts. The AL is divided into two hemispheres regarding innervations of glomeruli by PNs with axons leaving via a dual output pathway. This pathway consists of the medial (m) and lateral (l) antenno-cerebral tract (ACT) and connects the AL with the higher integration areas in the mushroom bodies (MB) and the lateral horn (LH). M- and l-ACT PNs differ in their target areas in the MB calyx and the LH. Three additional ACTs (mediolateral - ml) project to the lateral protocerebrum only. Males had ~45% fewer glomeruli compared to females and one of the seven sensory tracts was absent. Despite a substantially smaller number of glomeruli, males possess a dual PN output pathway to the MBs. In contrast to females, however, only a small number of glomeruli were innervated by projection neurons of the m-ACT. Whereas all glomeruli in males were densely innervated by serotonergic processes, glomeruli innervated by sensory tract six lacked serotonergic innervations in the female castes. It appears that differences in general glomerular organization are subtle among the female castes, but sex-specific differences in the number, connectivity and neuromodulatory innervations of glomeruli are substantial and likely to promote differences in olfactory behavior. Calcium imaging experiments to monitor pheromonal and non-pheromonal processing in the ant AL revealed that odor responses were reproducible and comparable across individuals. Calcium responses to both odor groups were very sensitive (10-11 dilution), and patterns from both groups were partly overlapping indicating that processing of both odor classes is not spatially segregated within the AL. Intensity response patterns to the pheromone components tested (trail pheromone: nerolic acid; alarm pheromone: n-undecane), in most cases, remained invariant over a wide range of intensities (7-8 log units), whereas patterns in response to general odors (heptanal, octanol) varied across intensities. Durations of calcium responses to stimulation with the trail pheromone component nerolic acid increased with increasing odor concentration indicating that odor quality is maintained by a stable pattern (concentration invariance) and intensity is mainly encoded in the response durations of calcium activities. For n-undecane and both general odors increasing response dynamics were only monitored in very few cases. In summary, this is the first detailed structure-function analyses within the ant’s central olfactory system. The results contribute to a better understanding of important aspects of odor processing and olfactory adaptations in an insect’s central olfactory system. Furthermore, this study serves as an excellent basis for future anatomical and/or physiological experiments. N2 - Für Ameisen spielt die olfaktorische Kommunikation und Orientierung eine zentrale Rolle hinsichtlich der Organisation des Ameisenstaates. Ob sich kasten- und geschlechtsspezifische Verhaltensunterschiede auf neuronaler Ebene und besonders im olfaktorischen System der Ameise widerspiegeln ist die zentrale Frage meiner Arbeit. Im Speziellen stellte ich die Frage, ob sich in der olfaktorischen Bahn der Rossameise Camponotus floridanus strukturelle oder funktionelle Anpassungen an die Verarbeitung von Pheromonen und generellen Düften aufzeigen lassen. Zur Analyse hinsichtlich neuroanatomischer Spezialisierungen wurde die olfaktorische Bahn im Gehirn von großen und kleinen Arbeiterinnen, Jungköniginnen und Männchen der Rossameise C. floridanus mittels Fluoreszenzmassenfärbungen, Immunzytochemie, konfokaler Laserscanningmikroskopie und 3D-Auswertung untersucht. Um die Verarbeitung von Pheromonen und generellen Düften im primären olfaktorischen Neuropil, dem Antennallobus (AL), auf physiologischer Ebene zu charakterisieren wurden olfaktorische Projektionsneurone mittels Calcium Imaging untersucht. Obwohl sich das glomeruläre Gesamtvolumen der ALs zwischen Arbeiterinnenkasten und Jungköniginnen unterscheidet, lag die Gesamtzahl der Glomeruli im AL in einem ähnlichen Bereich. Der AL besteht in allen drei weiblichen Kasten aus bis zu 460 Glomeruli, die in sieben Clustern angeordnet sind und von sieben sensorischen Eingangstrakten innerviert werden. Der AL unterteilt sich in zwei Hemispheren, deren entsprechende Glomeruli von Projektionsneuronen innverviert werden, die vom AL über die Nervenbahn des “dual output pathway” in höhere Hirnregionen projizieren. Diese Nervenbahn besteht aus dem medialen (m) und lateralen (l) Antennocerebraltrakt (ACT) und verbindet den AL mit höheren Integrationszentren wie den Pilzkörpern (MB) und dem lateralen Horn (LH). M- und l-ACT unterscheiden sich in ihren Zielregionen im MB Calyx und dem LH. Drei weitere ACTs (mediolateral – ml) projizieren ausschließlich ins laterale Protocerebrum. Männchen besitzen ca. 45% weniger Glomeruli im Vergleich zur Weibchenkaste. Ihnen fehlt weiterhin einer der sieben sensorischen Eingangstrakte vollständig. Trotz der wesentlich geringeren Anzahl an Glomeruli, besitzen auch Männchen den “dual output pathway”. Im Gegensatz zu den Weibchen ist allerdings nur eine geringe Anzahl an Glomeruli durch m-ACT Projektionsneurone innerviert. Ein weiterer Unterschied im AL von Männchen und Weibchen findet sich in den Glomeruli des sensorische Trakts Nummer sechs, die bei Weibchen keinerlei serotonerge Innervierung aufweisen während beim Männchen der gesamte AL dichte serotonerge Verzweigungen besitzt. Es zeigt sich somit, dass die kastenspezifischen Unterschiede in der allgmeinen glomerulären Organisation des AL innerhalb der Weibchenkaste nur sehr fein sind. Im Gegensatz dazu sind die geschlechtsspezifischen Unterschiede in Anzahl, Konnektivität und neuromodulatorischer Innervierung von Glomeruli zwischen Weibchen- und Männchen wesentlich ausgeprägter was Unterschiede in olfaktorisch geprägten Verhaltensweisen begünstigen könnte. Die Calcium Imaging Experimente zur Untersuchung der Verarbeitung von Pheromonen und generellen Düften im AL der Ameise zeigten, dass Duftantworten reproduzierbar und zwischen Individuen vergleichbar waren. Die Sensitivität des Calcium Signals lag für beide Duftgruppen in einem sehr niedrigen Bereich (Verdünnung 10-11). Die Antortmuster beider Duftgruppen überlappten zum Teil, was die Annahme zuläßt, dass die Verarbeitung von Pheromonen und generellen Düften keiner räumlichen Trennung innerhalb des AL unterliegt. Die Intensität der Antwortmuster auf die Pheromonkomponenten (Spurpheromon: Nerolsäure; Alarmpheromon: n-Undecan) blieben in den meisten Fällen über einen weiten Konzentrationsbereich konstant (7-8 log Einheiten). Die Dauer der Calciumantwort nach Stimulation mit Nerolsäure verlängerte sich mit steigender Duftkonzentration. Dies läßt für das Spurpheromon den Schluß zu, dass die Duftqualität in einem konstanten Duftmuster (Konzentrationsinvarianz) repräsentiert und die Duftintensität über die Dauer des Calciumsignals abgebildet wird. Da die Antwortmuster auf generelle Düfte (Heptanal, Octanol) dagegen sehr viel stärker innerhalb des getesteten Konzentrationsbereichs varrieren ließ sich für n-Undecan und die beiden generellen Düfte eine solche Dynamik nur in einigen wenigen Fällen beobachtet. Zusammenfassend ist diese Studie die erste strukturelle und funktionelle Studie des olfaktorischen Systems der Ameise. Die Ergebnisse tragen zu einem besseren Verständnis der neuronalen Adaptationen und Mechanismen hinsichtlich Duftverarbeitung im zentralen Nervensystem von Insekten bei. Außerdem liefert diese Studie eine wichtige Grundlage für zukünftige neuroanatomische und –physiologische Untersuchungen auf dem Gebiet der Neurobiologie der Insekten. KW - Gehirn KW - Neuroethologie KW - Neuroanatomie KW - Geruchswahrnehmung KW - Neuronale Plastizität KW - Insekten KW - Antennallobus KW - Glomeruli KW - olfaktorische Bahn KW - Camponotus floridanus KW - Dufverarbeitung KW - antennal lobe KW - glomeruli KW - olfactory pathway KW - Campontous floridanus KW - odor processing Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-30383 ER - TY - THES A1 - Gros, Andreas T1 - Interactions in the evolution of dispersal distance and emigration probability T1 - Wechselwirkungen bei der Evolution von Ausbreitungsdistanz und Auswanderwahrscheinlichkeit N2 - Chapter 1 - Evolution of local adaptations in dispersal strategies The optimal probability and distance of dispersal largely depend on the risk to end up in unsuitable habitat. This risk is highest close to the habitat’s edge and consequently, optimal dispersal probability and distance should decline towards the habitat’s border. This selection should lead to the emergence of spatial gradients in dispersal strategies. However, gene flow caused by dispersal itself is counteracting local adaptation. Using an individual based model I investigate the evolution of local adaptations of dispersal probability and distance within a single, circular, habitat patch. I compare evolved dispersal probabilities and distances for six different dispersal kernels (two negative exponential kernels, two skewed kernels, nearest neighbour dispersal and global dispersal) in patches of different size. For all kernels a positive correlation between patch size and dispersal probability emerges. However, a minimum patch size is necessary to allow for local adaptation of dispersal strategies within patches. Beyond this minimum patch area the difference in mean dispersal distance between center and edge increases linearly with patch radius, but the intensity of local adaptation depends on the dispersal kernel. Except for global and nearest neighbour dispersal, the evolved spatial pattern are qualitatively similar for both, mean dispersal probability and distance. I conclude, that inspite of the gene-flow originating from dispersal local adaptation of dispersal strategies is possible if a habitat is of sufficient size. This presumably holds for any realistic type of dispersal kernel. Chapter 2 - How dispersal propensity and distance depend on the capability to assess population density We analyze the simultaneous evolution of emigration probability and dispersal distance for species with different abilities to assess habitat quality (population density) and which suffer from distance dependent dispersal costs. Using an individual-based model I simulate dispersal as a multistep (patch to patch) process in a world consisting of habitat patches surrounded by lethal matrix. Our simulations show that natal dispersal is strongly driven by kin-competition but that consecutive dispersal steps are mostly determined by the chance to immigrate into patches with lower population density. Consequently, individuals following an informed strategy where emigration probability depends on local population density disperse over larger distances than individuals performing density-independent emigration; this especially holds when variation in environmental conditions is spatially correlated. However, already moderate distance-dependent dispersal costs prevent the evolution of long-distance dispersal irrespectively of the chosen dispersal strategy. Chapter 3 - Evolution of sex-biased dispersal: the role of sex-specific dispersal costs, demographic stochasticity, and inbreeding Inbreeding avoidance and asymmetric competition over resources have both been identified as factors favouring the evolution of sex- biased dispersal. It has also been recognized that sex-specific costs of dispersal would promote selection for sexspecific dispersal, but there is little quantitative information on this aspect. In this paper I explore (i) the quantitative relationship between cost-asymmetry and a bias in dispersal, (ii) the influence of demographic stochasticity on this effect, and (iii) how inbreeding and cost-asymmetry interact in their effect on sex-specific dispersal. I adjust an existing analytical model to account for sex-specific costs of dispersal. Based on numerical calculations I predict a severe bias in dispersal already for small differences in dispersal costs. I corroborate these predictions in individualbased simulations, but show that demographic stochasticity generally leads to more balanced dispersal. In combination with inbreeding, cost asymmetries will usually determine which of the two sexes becomes the more dispersive. Chapter 4 - Evolution of sex-biased dispersal: the role of sex-specific dispersal costs, demographic stochasticity, and inbreeding Inbreeding depression, asymmetries in costs or benefits, and the mating system have been identified as potential factors underlying the evolution of sex-biased dispersal. We use individual-based simulations to explore how the mating system and demographic stochasticity influence the evolution of sex-specific dispersal in a metapopulation with females competing over breeding sites, and males over mating opportunities. Comparison of simulation results for random mating with those for a harem system (locally, a single male sires all offspring) reveal that even extreme variance in local male reproductive success (extreme male competition) does not induce a male bias in dispersal. The latter evolves if between-patch variance in reproductive success is larger for males than females. This can emerge due to demographic stochasticity if habitat patches are small. More generally, members of a group of individuals experiencing higher spatio-temporal variance in fitness expectations may evolve to disperse with greater probability than others. N2 - Die optimale Dispersal- oder Ausbreitungsstrategie (eine Kombination aus Auswanderwahrscheinlichkeit und Ausbreitungsdistanz) hängt hauptsächlich von dem Risiko ab, in einem für Reproduktion ungeeigneten Habitat zu enden. Dieses Risiko ist am Rand eines Habitats am höchsten, und daher sollten die evolvierenden Ausbreitungsdistanzen und Auswanderwahrscheinlichkeiten zum Rand des Habitats hin abnehmen. Dieser Selektionsdruck sollte zu räumlichen Gradienten in Ausbreitungsstrategien führen. Der Genfluss, der durch Dispersal verursacht wird, wirkt jedoch lokaler Anpassung der Ausbreitungsstrategie an die jeweilige Umgebung entgegen. Mit einem individuenbasierten Modell untersuchen wir die Evolution lokaler Anpassungen von Ausbreitungsstrategien innerhalb eines einzelnen, kreisförmigen Habitats. Ich vergleiche die evolvierenden Auswanderwahrscheinlichkeiten und -distanzen von sechs verschiedenen Ausbreitungsfunktionen (sog. Kernels, welche die Kombination aus Auswanderwahrscheinlichkeit und Ausbreitungsdistanz abbilden: zwei negativ-exponentielle Kernels, zwei schiefe Kernels, ein Kernel, der Ausbreitung nur in die unmittelbare Nachbarschaft der Mutterpflanze erlaubt (nearest-neighbor dispersal), und ein Kernel, der darin besteht, einen zufälligen Zielort auszuwählen (global dispersal)). Die Evolution der Form der Kernels untersuchen wir in Habitatinseln unterschiedlicher Größe. Ich konnte zeigen, dass eine minimale Habitatgröße nötig ist, um lokale Anpassungen der Ausbreitungsstrategien zu ermöglichen. In Habitatinseln, die diese minimale Größe überschreiten, nimmt die Differenz der Ausbreitungsdistanz zwischen Mitte und Rand des Habitats linear zu, wobei jedoch der Betrag der Differenz vom Kernel abhängt. Mit Ausnahme der Kernels “global dispersal” und “nearest-neighbor dispersal” gleichen sich die evolvierenden räumlichen Muster qualitativ für Auswanderwahrscheinlichkeit und Ausbreitungsdistanz der Kernels. Ich schließe daraus, dass trotz des Genflusses, der mit Ausbreitung einhergeht, lokale Anpassungen der Ausbreitungsstrategien möglich sind, wenn die Habitatinsel groß genug ist. Dies gilt wahrscheinlich für jede realistische Ausbreitungsfunktion. Kapitel 2 - Wie hängen Auswanderwahrscheinlichkeit und Ausbreitungsdistanz von der Fähigkeit ab, Populationsdichten zu bestimmen? Ich untersuche die gleichzeitige Evolution von Auswanderwahrscheinlichkeit und Ausbreitungsdistanz für Arten, die die Populationsdichte in ihren Habitaten unterschiedlich gut wahrnehmen können. In diesem System werden die Überlebenswahrscheinlichkeiten für Nachkommen von steigender Populationsdichte negativ beeinflusst. Mit einem individuenbasierten Modell simuliere ich Dispersal als einen schrittweisen Prozess, in dem Individuen von einem Habitat zum nächsten dispergieren können, wobei sie in jedem dieser Schritte mit einer bestimmten Wahrscheinlichkeit sterben. Meine Ergebnisse zeigen, dass die Emigration aus dem Geburtshabitat stark von Verwandtenselektion beeinflusst wird, wohingegen die Tendenz, weitere Dispersalschritte zu unternehmen, zum größten Teil von der Aussicht bestimmt wird, in ein Habitat einzuwandern, das eine geringere Populationsdichte – und damit bessere Bedingungen für das Überleben der Nachkommen – aufweist, als das Geburtshabitat. Hierbei wird deutlich, dass Individuen, die sich abhängig von der lokalen Populationsdichte dazu “entscheiden”, auszuwandern, im Durchschnitt größere Distanzen zurücklegen, als Individuen die unabhängig von der Populationsdichte auswandern. Dies gilt vor allem dann, wenn die Populationsdichten räumlich korreliert sind und damit dicht und weniger dicht besiedelte Habitate geklumpt vorkommen. Jedoch sorgen schon geringe Wahrscheinlichkeiten, während des Dispersal zu sterben, dafür, dass mit keiner Ausbreitungsstrategie Ausbreitungsdistanzen evolvieren, die im Schnitt mehr als zwei Schritte beinhalten. Kapitel 3 - Evolution von geschlechterspezifischen Ausbreitungsstrategien: die Rolle von geschlechtsspezifischer Wandermortalität, demographischer Mortalität und Inzucht-Depression Inzucht-Vermeidung und asymmetrische Ressourcen-Konkurrenz wurden schon als mögliche Auslöser der Evolution von geschlechterspezifischen Ausbreitungsstrate gien identifiziert. Daneben können jedoch auch unterschiedliche Wandermortalitäten die geschlechterspezifischen Ausbreitungsstrategien beeinflussen, insofern als dasjenige Geschlecht mit der höheren Wandermortalität wahrscheinlich philopatrisch wird, das andere hingegen das Dispersal übernimmt. Leider gibt es dazu wenig quantitative Daten. In diesem Kapitel untersuche ich den quantitativen Zusammenhang zwischen der Differenz in Wandermortalität und dem Ungleichgewicht in der Auswanderwahrscheinlichkeit der Geschlechter. Weiterhin untersuche ich den Einfluss von demographischer Stochastizität und wie Inzucht-Depression in Zusammenspiel mit Unterschieden in der Wandermortalität das Ungleichgewicht der Auswanderwahrscheinlichkeit beeinflusst. Dazu habe ich ein existierendes mathematisches Modell so angepasst, dass geschlechtsspezifische Wandermortalitäten betrachtet werden können. Auf dieser numerischen Basis kann ich Unterschiede in der Auswanderwahrscheinlichkeit von Geschlechtern selbst für sehr kleine Differenzen in der Mortalität vorhersagen. Ich bestätige diese Ergebnisse mit individuenbasierten Simulationen und zeige, dass demographische Stochastizität einen ausgleichenden Einfluss auf die Auswanderwahrscheinlichkeiten der beiden Geschlechter hat. Selbst bei gleichzeitig wirkender Inzucht-Depression bestimmen dieMortalitätsunterschiede welches Geschlecht die höhere Auswanderwahrscheinlichkeit entwickelt. Kapitel 4 - Geschlechtsspezifische räumlich-zeitliche Variabilität des reproduktiven Erfolgs fördert die Evolution von geschlechtsspezifischen Ausbreitungsstrategien Inzucht-Depression, asymmetrische Wandermortalität und unterschiedliche Paarungssysteme wurden als mögliche Auslöser für die Evolution von Ausbreitungsstrategien identifiziert, in denen die Auswanderwahrscheinlichkeit eines Geschlechtes die des anderen überwiegt. Wir verwenden individuenbasierte Simulationen, um den Einfluss des Paarungssystems und demographischer Stochastizität auf die Evolution geschlechtsspezifischen Dispersals zu untersuchen. Wir betrachten dabei Meta-Populationen, in denen Weibchen um Brutplätze und Männchen um Paarungen mit erfolgreichen Weibchen konkurrieren. Der Vergleich der Ergebnisse der Paarungssysteme “random-mating” (alle Weibchen wählen zufällig Männchen als Paarungspartner aus) und “harem” (alle Weibchen eines Habitats paaren sich mit demselben Männchen) zeigt, dass ein Unterschied in der Intensität der Konkurrenz um reproduktionsrelevante Ressourcen alleine nicht genügt, um einen Unterschied in den Auswanderwahrscheinlichkeiten der Geschlechter hervorzurufen. Vielmehr kommt es in solchen Fällen zu besagtem Ungleichgewicht, in denen ein Geschlecht eine größere Variabilität der Nachkommenzahl zwischen Habitaten erfährt. Dann evolviert das Geschlecht mit der höheren Varianz der Nachkommenzahl zwischen Habitaten die höhere Auswanderwahrscheinlichkeit. KW - Theoretische Ökologie KW - Ausbreitung KW - Evolution KW - Evolutionsstabile Strategie KW - Ausbreitungsstrategie KW - Auswanderwahrscheinlichkeit KW - Ausbreitungsdistanz KW - dispersal strategy KW - dispersal propensity KW - dispersal distance Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-29226 ER - TY - THES A1 - Mentzel, Benjamin Tobias T1 - Biochemische und phänotypische Untersuchungen zur Funktion der p21-aktivierten Kinase DPAK3 in Drosophila melanogaster T1 - Biochemical and phenotypic analysis of the p21-activated kinase DPAK3 in Drosophila melanogaster N2 - Gegenstand dieser Arbeit ist das Drosophila melanogaster Protein DPAK3, ein Vertreter der hochkonservierten Familie der p21-aktivierten Kinasen (PAK). DPAK3 und seine Homologen aus anderen Insektenarten und C. elegans können aufgrund eines Vergleichs der Proteinsequenz und struktureller Merkmale in eine eigenen Untergruppe 1* innerhalb der Gruppe 1 der PAK-Proteine eingeordnet werden. Das Genom von Drosophila kodiert noch für zwei weitere PAK-Proteine, das zur Gruppe 1 gehörende DPAK1 und das Gruppe 2 PAK-Protein Mbt. Wie die klassischen Gruppe 1 PAK-Proteine bildet DPAK3 im inaktiven Zustand Dimere. DPAK3 interagiert mit den GTP-gebundenen Formen der RhoGTPasen Rac1, Rac2 und Cdc42. Durch die Bindung dieser Proteine geht DPAK3 aus dem dimeren in den monomeren Zustand über und seine Kinaseaktivität wird durch diese Bindung gesteigert. DPAK3 ist für die Ausbildung der korrekten Morphologie kultivierter Drosophila Zellen erforderlich und beeinflußt die Regulation des Aktinzytoskeletts. Weiterhin konnte CK2beta, die regulatorische Untereinheit der Casein Kinase 2, als neuer Regulator von p21-aktivierten Kinasen identifiziert werden. Das Genom von Drosophila besitzt drei Transkriptionseinheiten, die für CK2beta', CK2betatestes und fünf verschiedene Isoformen von CK2beta kodieren. Eine vergleichende Analyse zeigt, daß alle CK2beta-Proteine mit DPAK1, DPAK3 und in geringerem Maß auch mit Mbt interagieren und in der Lage sind, die Aktivität der PAK-Proteine in vitro zu hemmen. Die Bindung von CK2beta an DPAK3 wird, wie bei allen anderen Serin- / Threoninkinasen, die bisher als Interaktionspartner von CK2beta identifiziert wurden, über die Kinasedomäne von DPAK3 vermittelt. Die Bildung des aus zwei katalytischen CK2a und zwei CK2beta Untereinheiten bestehenden CK2-Holoenzyms hängt von der Fähigkeit von CK2beta ab, Dimere zu bilden. Es konnte gezeigt werden, daß die Bildung eines b-b Dimers für die Interaktion mit und Regulation von DPAK3 nicht erforderlich ist. In vivo wurden die bisher bekannten Dpak3 Allele untersucht, wobei kein gesichertes Nullallel identifiziert werden konnte. Durch enzymatisch katalysierte Rekombination wurde eine neue Deletion hergestellt, die das komplette Leseraster von Dpak3 entfernt. Mit Hilfe von genetischen Mosaiken wurde die Rolle von DPAK3 in der Augenentwicklung untersucht. Durch den Verlust der Genfunktion von Dpak3 wird die Ausbildung der korrekten Struktur der Komplexaugen nur leicht beeinträchtigt. Bei der Analyse einer Dpak1 Mutante wurde dasselbe Ergebnis erzielt. Gleichzeitiger Verlust der Genfunktion von Dpak1 und Dpak3 hingegen führt zu massiven strukturellen Defekten. DPAK1 und DPAK3 erfüllen somit zumindest teilweise redundante Funktionen in der Augenentwicklung. Es wird Gegenstand zukünftiger Studien sein müssen, die gemeinsamen und getrennten Funktionen dieser PAK-Proteine in Drosophila aufzuklären. N2 - Subject of this work is the Drosophila melanogaster protein DPAK3, a member of the highly conserved family of p21-activated kinases. Based on the comparison of the amino acid sequence and structural features, DPAK3 and its homologues from other insect species and C. elegans can be assigned to a distinct subgroup 1* within the group 1 PAK proteins. The genome of Drosophila encodes for two additional PAK proteins, DPAK1 and Mbt, which belong to the group 1 and group 2 p21-activated kinases, respectively. Like the classical group 1 PAK proteins, DPAK3 forms dimers in its inactive conformation. DPAK3 binds to and is activated by the Rho GTPases Rac1, Rac2 and Cdc42. The interaction with these proteins leads to the disruption of the DPAK3 dimer and an increase in the kinase activity of DPAK3. DPAK3 is necessary for the development of the normal morphology of cultured Drosophila cells and influences the regulation of the actin cytoskeleton. CK2b the regulatory subunit of casein kinase 2 was identified as a new regulator of p21 activated kinases. The genome of Drosophila possesses three different transcriptional units that encode the proteins CK2b', CK2btestes and five different isoforms of CK2b. A comparative analysis shows that all CK2b proteins interact with DPAK1, DPAK3 and Mbt and negatively regulate the activity of these kinases in vitro. CK2b binds to the kinase domain of DPAK3 which is consistent with previous results obtained from other serine/threonine kinases interacting with CK2b. The CK2 holoenzyme consists of two catalytically active CK2a subunits and two regulatory CK2b subunits. My results show that the ability of CK2b to form dimers, which is essential for the formation of the CK2 holoenzyme, is not necessary for the regulation of p21 activated kinases. The analysis of the available Dpak3 alleles in vivo revealed the necessity to create a new bona fide loss of function allele. To accomplish this goal, a new deletion which removes the entire Dpak3 open reading frame was created by enzymatically catalysed recombination. Genetic mosaics were used to study the role of DPAK3 in eye development. The morphology of the complex eyes was only slightly impaired by the loss of Dpak3 function. The same result was obtained when analysing Dpak1 mutants, but removal of the gene function of both Dpak1 and Dpak3 leads to massive structural defects. This shows that Dpak1 and Dpak3 have at least partially redundant functions in eye development. Further studies will be necessary to reveal the common and distinct functions of these p21-activated kinases in Drosophila. KW - Taufliege KW - Drosophila melanogaster Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-30290 ER - TY - THES A1 - Engelmann, Julia Cathérine T1 - DNA microarrays: applications and novel approaches for analysis and interpretation T1 - DNA Mikroarrays: Anwendungen und neue Ansätze für die Analyse und Interpretation N2 - In der vorliegenden Dissertation wird die Entwicklung eines phylogenetischen DNA Microarrays, die Analyse von mehreren Microarray-Genexpressionsdatensätzen und neue Ansätze für die Datenanalyse und Interpretation der Ergebnisse vorgestellt. Die Entwicklung und Analyse der Daten eines phylogenetischen DNA Microarrays wird in der ersten Publikation dargestellt. Ich konnte zeigen, dass die Spezies-Detektion mit phylogenetischen Microarrays durch die Datenanalyse mit einem linearen Regressionsansatz signifikant verbessert werden kann. Standard-Methoden haben bislang nur Signalintensitäten betrachtet und eine Spezies als an- oder abwesend bezeichnet, wenn die Signalintensität ihres Messpunktes oberhalb eines willkürlich gesetzten Schwellenwertes lag. Dieses Verfahren ist allerdings aufgrund von Kreuz-Hybridisierungen nicht auf sehr nah verwandte Spezies mit hoher Sequenzidentität anwendbar. Durch die Modellierung des Hybridisierungs und Kreuz-Hybridisierungsverhaltens mit einem linearen Regressionsmodell konnte ich zeigen, dass Spezies mit einer Sequenzähnlichkeit von 97% im Markergen immer noch unterschieden werden können. Ein weiterer Vorteil der Modellierung ist, dass auch Mischungen verschiedener Spezies zuverlässig vorhergesagt werden können. Theoretisch sind auch quantitative Vorhersagen mit diesem Modell möglich. Um die großen Datenmengen, die in öffentlichen Microarray-Datenbanken abgelegt sind besser nutzen zu können, bieten sich Meta-Analysen an. In der zweiten Publikation wird eine explorative Meta-Analyse auf Arabidopsis thaliana-Datensätzen vorgestellt. Mit der Analyse verschiedener Datensätze, die den Einfluss von Pflanzenhormonen, Pathogenen oder verschiedenen Mutationen auf die Genexpression untersucht haben, konnten die Datensätze anhand ihrer Genexpressionsprofile in drei große Gruppen eingeordnet werden: Experimente mit Indol-3-Essigsäure (IAA), mit Pathogenen und andere Experimente. Gene, die charakteristisch für die Gruppe der IAA-Datensätze beziehungsweise für die Gruppe der Pathogen-Datensätze sind, wurden näher betrachtet. Diese Gene hatten Funktionen, die bereits mit Pathogenbefall bzw. dem Einfluss von IAA in Verbindung gebracht wurden. Außerdem wurden Hypothesen über die Funktionen von bislang nicht annotierten Genen aufgestellt. In dieser Arbeit werden auch Primäranalysen von einzelnen Arabidopsis thaliana Genexpressions-Datensätzen vorgestellt. In der dritten Publikation wird ein Experiment beschrieben, das durchgeführt wurde um herauszufinden ob Mikrowellen-Strahlung einen Einfluss auf die Genexpression einer Zellkultur hat. Dazu wurden explorative Analysemethoden angewendet. Es wurden geringe aber signifikante Veränderungen in einer sehr kleinen Anzahl von Genen beobachtet, die experimentell bestätigt werden konnten. Die Funktionen der regulierten Gene und eine Meta-Analyse mit öffentlich zugänglichen Datensätzen einer Datenbank deuten darauf hin, dass die pflanzliche Zellkultur die Strahlung als eine Art Energiequelle ähnlich dem Licht wahrnimmt. Des weiteren wird in der vierten Publikation die funktionelle Analyse eines Arabidopsis thaliana Genexpressionsdatensatzes beschrieben. Die Analyse der Genexpressions eines pflanzlichen Tumores zeigte, dass er seinen Stoffwechsel von aerob und auxotroph auf anaerob und heterotroph umstellt. Gene der Photosynthese werden im Tumorgewebe reprimiert, Gene des Aminosäure- und Fettstoffwechsels, der Zellwand und Transportkanäle werden so reguliert, dass Wachstum und Entwicklung des Tumors gefördert werden. In der fünften Publikation in dieser Arbeit wird GEPAT (Genome Expression Pathway Analysis Tool) beschrieben. Es besteht aus einer Internet- Anwendung und einer Datenbank, die das einfache Hochladen von Datensätzen in die Datenbank und viele Möglichkeiten der Datenanalyse und die Integration anderer Datentypen erlaubt. In den folgenden zwei Publikationen (Publikation 6 und Publikation 7) wird GEPAT auf humane Microarray-Datensätze angewendet um Genexpressionsdaten mit weiteren Datentypen zu verknüpfen. Genexpressionsdaten und Daten aus vergleichender Genom-Hybridisierung (CGH) von primären Tumoren von 71 Mantel-Zell-Lymphom (MCL) Patienten ermöglichte die Ermittlung eines Prädiktors, der die Vorhersage der Überlebensdauer von Patienten gegenüber herkömmlichen Methoden verbessert. Die Analyse der CGH Daten zeigte, dass auch diese für die Vorhersage der Überlebensdauer geeignet sind. Für den Datensatz von Patienten mit großzellig diffusem B-Zell-Lymphom DLBCL konnte aus den Genexpressionsdaten ebenfalls ein neuer Prädiktor vorgeschlagen werden. Mit den zwischen lang und kurz überlebenden Patienten differentiell exprimierten Genen der MCL Patienten und mit den Genen, die zwischen den beiden Untergruppen von DLBCL reguliert sind, wurden Interaktionsnetzwerke gebildet. Diese zeigen, dass bei beiden Krebstypen Gene des Zellzyklus und der Proliferation zwischen Patienten mit kurzer und langer Überlebensdauer unterschiedlich reguliert sind. N2 - In this thesis, the development of a phylogenetic DNA microarray, the analysis of several gene expression microarray datasets and new approaches for improved data analysis and interpretation are described. In the first publication, the development and analysis of a phylogenetic microarray is presented. I could show that species detection with phylogenetic DNA microarrays can be significantly improved when the microarray data is analyzed with a linear regression modeling approach. Standard methods have so far relied on pure signal intensities of the array spots and a simple cutoff criterion was applied to call a species present or absent. This procedure is not applicable to very closely related species with high sequence similarity because cross-hybridization of non-target DNA renders species detection impossible based on signal intensities alone. By modeling hybridization and cross-hybridization with linear regression, as I have presented in this thesis, even species with a sequence similarity of 97% in the marker gene can be detected and distinguished from related species. Another advantage of the modeling approach over existing methods is that the model also performs well on mixtures of different species. In principle, also quantitative predictions can be made. To make better use of the large amounts of microarray data stored in public databases, meta-analysis approaches need to be developed. In the second publication, an explorative meta-analysis exemplified on Arabidopsis thaliana gene expression datasets is presented. Integrating datasets studying effects such as the influence of plant hormones, pathogens and different mutations on gene expression levels, clusters of similarly treated datasets could be found. From the clusters of pathogen-treated and indole-3-acetic acid (IAA) treated datasets, representative genes were selected which pointed to functions which had been associated with pathogen attack or IAA effects previously. Additionally, hypotheses about the functions of so far uncharacterized genes could be set up. Thus, this kind of meta-analysis could be used to propose gene functions and their regulation under different conditions. In this work, also primary data analysis of Arabidopsis thaliana datasets is presented. In the third publication, an experiment which was conducted to find out if microwave irradiation has an effect on the gene expression of a plant cell culture is described. During the first steps, the data analysis was carried out blinded and exploratory analysis methods were applied to find out if the irradiation had an effect on gene expression of plant cells. Small but statistically significant changes in a few genes were found and could be experimentally confirmed. From the functions of the regulated genes and a meta-analysis with publicly available microarray data, it could be suspected that the plant cell culture somehow perceived the irradiation as energy, similar to perceiving light rays. The fourth publication describes the functional analysis of another Arabidopsis thaliana gene expression dataset. The gene expression data of the plant tumor dataset pointed to a switch from a mainly aerobic, auxotrophic to an anaerobic and heterotrophic metabolism in the plant tumor. Genes involved in photosynthesis were found to be repressed in tumors; genes of amino acid and lipid metabolism, cell wall and solute transporters were regulated in a way that sustains tumor growth and development. Furthermore, in the fifth publication, GEPAT (Genome Expression Pathway Analysis Tool), a tool for the analysis and integration of microarray data with other data types, is described. It consists of a web application and database which allows comfortable data upload and data analysis. In later chapters of this thesis (publication 6 and publication 7), GEPAT is used to analyze human microarray datasets and to integrate results from gene expression analysis with other datatypes. Gene expression and comparative genomic hybridization data from 71 Mantle Cell Lymphoma (MCL) patients was analyzed and allowed proposing a seven gene predictor which facilitates survival predictions for patients compared to existing predictors. In this study, it was shown that CGH data can be used for survival predictions. For the dataset of Diffuse Large B-cell lymphoma (DLBCL) patients, an improved survival predictor could be found based on the gene expression data. From the genes differentially expressed between long and short surviving MCL patients as well as for regulated genes of DLBCL patients, interaction networks could be set up. They point to differences in regulation for cell cycle and proliferation genes between patients with good and bad prognosis. KW - Microarray KW - Differentielle Genexpression KW - Genexpression KW - Statistische Analyse KW - Cluster-Analyse KW - Datenanalyse KW - Explorative Datenanalyse KW - Non-Hodgkin-Lymphom KW - B-Zell-Lymphom KW - Metabolom KW - Tumorklassifikation KW - Tumor KW - Krebs KW - Schmalwa KW - phylogenetische Arrays KW - Interaktionsnetzwerke KW - lineare Regression KW - DNA microarray KW - gene expression KW - statistical analysis KW - clustering KW - classification KW - interaction networks Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-29747 ER - TY - THES A1 - Endter, Jörg-Michael T1 - Mechanismen der Elektropermeabilisierung und Elektrofusion eukaryotischer Zellen und Protoplasten T1 - Mechanisms of Electropermeabilization and Electrofusion of eukaryotic cells and protoplasts N2 - In dieser Arbeit konnten grundlegende Erkenntnisse über die Wirkung elektrischer Felder auf Membranen von eukaryotischen Zellen gewonnen werden. Dieses Wissen ermöglichte eine detaillierte Aufklärung der Mechanismen der Elektropermealisierung und der Elektrofusion. Maßgeblich hierfür war die dielektrische Analyse von Pflanzen- bzw. Hefeprotoplasten durch umfassende Messungen auf Basis der Elektrorotationsmethode. Mithilfe dieser Methode wurden die elektrischen Eigenschaften wie die flächenspezifische Membrankapazität und die innere Leitfähigkeit von Pichia pastoris Protoplasten ermittelt. Die Kenntnis dieser Zelleigenschaften verhalf dazu, einerseits das Sammelfeld im Hinblick auf seine Feldstärke und Frequenz einzustellen. Damit wurde ein optimaler Kontakt der Zellmembranen während der Fusion ermöglicht und störende Einflüsse, wie beispielsweise die Multizellrotation, minimiert. Anderseits wurde der Durchbruchpuls bezüglich der Pulslänge und der Feldstärke den Anforderungen für die Elektrofusion der relativ kleinen Protoplasten angepasst. In Folge dessen war es möglich, ein Protokoll zur Herstellung von Riesenzellen aus Pichia pastoris Protoplasten zu erstellen. Diese Erkenntnisse sind besonders interessant, da der Einsatz von Riesenzellen die Erforschung der aktiven elektrischen Eigenschaften von Zellmembranen durch kombinierte Anwendung intrazellulärer Mikroelektroden mit etablierten elektrophysiologischen Techniken ermöglicht. Als Beispiele seien hier „current-„ und „voltage-clamp“, „patch clamp“ sowie die Ladungspulsmethode genannt. Die erhebliche Vergrößerung der Membranoberfläche bei Riesenzellen führt zu einer Erhöhung der Gesamtzahl von Membranproteinen wie beispielsweise Transmembrankanäle. Daher kann erwartet werden, dass kanalvermittelte Signale deutlich stärker ausfallen und ihre Untersuchungen erleichtert werden. Die komplexen Ergebnisse der Elektrorotation von vakuolisierten BY-2 Protoplasten konnten sehr genau mit Hilfe des Dreischalenmodells erklärt werden, welches die Struktur der pflanzlichen Zellen, insbesondere die zwei seriell geschalteten Kapazitäten des Plasmalemmas und des Tonoplasten, berücksichtigt. Die Anwendung dieses Modells erlaubte eine getrennte Berechnung der Potentialprofile über das Plasmalemma (Up) und den Tonoplasten (Ut), welche durch einen kurzen Gleichstrompuls induziert wurden. Anhand dieser Potentialprofile war es möglich, die Abhängigkeit des Ca2+-Einstromes in das Cytoplasma aus der Vakuole oder dem extrazellulären Raum vom applizierten elektrischen Feld und der externen Leitfähigkeit zu erklären. Es konnte außerdem gezeigt werden, dass die Aufladung des Plasmalemmas und des Tonoplasten und daraus folgend der elektrischen Membrandurchbruch der jeweiligen Membran stark von der externen Leitfähigkeit abhängen. Die Tatsache, dass elektrische Pulssequenzen von niedriger Intensität einen erhebliche Anstieg der cytosolischen Ca2+-Konzentration bewirken können und sich durch Modulation ihrer Amplitude reizspezifische Ca2+-Signaturen simulieren lassen, eröffnet eine schonende Möglichkeit zur Untersuchung von Veränderungen des cytosolischen Ca2+-Spiegels unabhängig von persistierenden exogenen Stimuli. Da Ca2+ in Pflanzen ein wichtiger „second messenger“ ist, bieten sich elektrische Felder als neues wirksames Werkzeug zur Kontrolle zellinterne Signalwege für die Grundlagenforschung sowie für Anwendungen in der Biotechnologie, wie beispielsweise Elektrotransfektion und -fusion, an. Als wichtige Konsequenz kann aus den hier gewonnen Erkenntnissen gezogen werden, dass Behandlungen pflanzlicher Zellen mit elektrischen Feldern in niedrig leitende Medien durchgeführt werden, um eine minimale Freisetzung von Ca2+ und anderen Inhaltstoffen aus der Vakuole zu gewährleisten. N2 - In this study fundamental findings could be obtained about the effects of electrical fields on membranes of eukaryotic cells. This knowledge enabled a detailed clarification of the mechanisms of Electropermeabilization and Electrofusion. This was achieved by the dielectric analysis of protoplasts obtained from plants and yeast based on the Electrorotation method. With this method the electrical characteristics of Pichia pastoris protoplasts like the area-specific membrane capacity and the internal conductivity were determined. The knowledge of these cell characteristics on the one hand helped to adjust the collecting field with regard to its field strength and frequency. Thus an optimal contact of the cell membranes was enabled during the fusion and disturbing influences, as for example the multi-cell rotation, were minimized. On the other hand the breakdown pulse was adapted to the requirements for the Electrofusion of the relatively small protoplasts concerning the pulse length and the field strength. In consequence it was possible to elaborate a protocol for the production of giant cells from protoplasts of Pichia pastoris. These findings are particularly interesting, since the use of giant cells allows the study of the active electrical characteristics of cell membranes by combination of intracellular microelectrodes with established electrophysiological techniques like current and voltage clamp, patch clamp as well as the charge-pulse method. The substantial enlargement of the membrane surface of giant cells leads to an increase of the total number of membrane proteins as for example transmembrane channels. So it can be expected that channel-mediated signals occur more strongly and their investigations are facilitated. The complex results of the Electrorotation of vacuolated BY-2 protoplasts could be explained very accurately with the help of the three-shell model. This model regards the structure of the plant cells, in particular the two serially connected capacities of the plasmalemma and the tonoplast. The application of this model permitted a separate calculation of the potential profiles induced by a short direct current pulse over the plasmalemma (Up) and the tonoplast (Ut). Based on these potential profiles it was possible to explain the dependency of the Ca2+ fluxes into the cytoplasma out of the vacuole or the extracellular media on the applied electrical field and the external conductivity. In addition it could be shown that the charging of the plasmalemma and the tonoplast and thereby the electrical breakdown of the respective membranes strongly depend on the external conductivity. Electrical pulse sequences of low intensity resulted in a substantial rise of the cytosolic Ca2+-concentration and the modulation of the pulse amplitude enabled the simulation of stimulus-specific Ca2+-signatures. These observations disclose an effective and gentle method for the investigation of changes of cytosolic Ca2+ which is independent of persisting exogenous stimuli. Since Ca2+ is an important second messenger in plants, electrical fields present themselves as new effective tools to study cellular signal pathways for the basic research as well as for applications in the biotechnology, as for example to Electrotransfection and Electrofusion. In consequence these findings show that treatment of plant cells with electric fields have to be performed in low conductive media in order to ensure a minimum release of Ca2+ and other contents from the vacuole. KW - Elektrofusion KW - Calcium KW - Calciumfreisetzung KW - Tabak KW - Pichia pastoris KW - Elektroporation KW - Electrofusion KW - Electropermeabilization KW - Calcium KW - Tobacco KW - Pichia pastoris Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-29647 ER - TY - THES A1 - Gebhardt, Susanne T1 - Expression, biochemische Charakterisierung und biologische Analyse des CONNECTIVE TISSUE GROWTH FACTOR T1 - Expression, biochemical charakterisation und biological analysis of CONNECTIVE TISSUE GROWTH FACTOR N2 - Der Connective tissue growth factor, CTGF, ist ein mit der EZM assoziiertes Protein, das diverse zelluläre Aktivitäten, einschließlich Adhäsion, Proliferation, Differenzierung und Migration, besitzt. Die umfassenden biologischen Eigenschaften des CTGF in verschiedenen Zelltypen spiegelt seine Fähigkeit, eine Vielfalt an Zelloberflächenmolekülen (HSPGs, Integrine, …) als auch andere bioaktive Moleküle (BMP-4, TGF-β1, ...) zu binden, wieder. Eine veränderte CTGF-Expression ist mit mehreren fibrotischen Erkrankungen assoziiert und CTGF selbst stimuliert die Entstehung und Progression fibrotischer Defekte. Genauere Informationen über den Einfluss des CTGF auf die Genexpression von Zellen waren bisher unbekannt. In dieser Arbeit wurde zunächst humanes CTGF in HEK-Zellen exprimiert und anschließend in mehreren chromatographischen Schritten aufgereinigt. Die biologische Charakterisierung zeigte, dass das rekombinante Protein mit BMP-2 in Oberflächenplasmonresonanzstudien und auf Zellbasis interagiert. Desweiteren konnte auch eine Interaktion mit Balb3T3-Zellen festgestellt werden. Die biologische Aktivität des Proteins wurde durch Proliferationsassays mit einer Endothelzelllinie und primären Fibroblasten des menschlichen Tenon bestätigt. Das reine rekombinante Protein wurde für Genexpressionsanalysen an humanen primären Fibroblasten des Tenon eingesetzt. Ergebnisse dieser Studie der Genexpression von HTF von drei unabhängigen Spendern zeigten, dass CTGF verschiedene biologische und physiologische Prozesse beeinflusst. Bekannte proliferatorische Eigenschaften und der Einfluss auf die EZM konnten bestätigt werden. Neben den bisher bekannten Funktionen der durch CTGF verursachten Effekte bei der Wundheilung, die überwiegend in der zweiten und dritten Phase der Wundheilung im Bereich der Umstrukturierung der EZM zu finden sind, konnten mehrere regulierte Gene nachgewiesen werden, die eine Rolle in der ersten Phase der Wundheilung, der Inflammation, spielen. Die interessantesten bisher im Zusammenhang mit CTGF noch nicht beschriebenen proinflammatorischen Proteine sind die CXC-Chemokine 1, 2, 6 und 8 sowie IL-6, die in den CTGF behandelten Fibroblasten stärker exprimiert waren. CTGF scheint somit eine mannigfaltige koordinierte Rolle in der Wundheilung am Auge, einschließlich Inflammation und EZM-Remodeling sowie möglicherweise auch in der Angiogenese und Hämostase, zu spielen und damit seine Rolle als mulitmodularer Faktor zu bestätigen. N2 - Connective tissue growth factor, CTGF, is an ECM associated protein that has diverse cellular activities including adhesion, proliferation, differentiaton and migration. The widespread biological properties of CTGF reflects its ability to bind many cell surface molecules (HSPGs, Integrins, LDL, …) and other bioactive molecules (BMP-4, TGF-β ...). Expression of CTGF is associated with many fibrotic diseases and CTGF itself stimulates development and progression of fibrotic defects. Detailed information about the effect of CTGF on cellular gene expression is relatively unknown so far. In this study human CTGF was expressed in HEK-cells and subsequently purified in several chromatographic steps. Biological characterization shows an interaction of the protein with BMP-2 in surface plasmon resonance studies and also in cell based assays. Furthermore there was detected an interaction with Balb3T3 cells. Biological activity of the protein was confirmed by proliferation assays with an endothelial cell line and primary fibroblasts of the human tenon. Pure recombinant protein was used for gene expression analysis of human primary fibroblast of the tenon. Results of this gene expression study from three independent donors showed influence of CTGF on different biological and physiological processes. Known proliferative properties and influence on the ECM could be confirmed. Beside up to now known function of CTGF induced effects in wound healing, predominantly found in second and third phase of wound healing in range of ECM remodeling and myofibroblast differentiation, several regulated genes, important in first phase of wound healing, the inflammation, could be detected. As yet unknown CTGF regulated interesting genes are the upregulated chemokines 1, 2, 6 and 8 as well as Interleukin 6, all with proinflammatoric properties. Significant influence of CTGF on the genexpression of tenon fibroblasts indicates the meaningful part of this protein in ocular woundhealing, including inflammation and ECM remodeling, potentially also angiogenesis and haemostasis, and confirms its multimodular function. KW - CTGF KW - rekombinante Expression KW - Expressionsanalyse KW - Fibrose KW - Glaukom KW - CTGF KW - rekombinant expression KW - expression analysis KW - fibrosis KW - glaukoma Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-29565 ER - TY - THES A1 - Mertins, Sonja T1 - Einfluss des Kohlenstoff-Metabolismus auf die Aktivität des Virulenzfaktors PrfA von Listeria monocytogenes T1 - Effect of the carbon metabolism on the PrfA activity in Listeria monocytogenes N2 - Listeria monocytogenes gehört zu den Gram-positiven fakultativ intrazellulären Bakterien, ist aber auch zu einem saprophytischen Leben in freier Natur fähig. Zahlreiche, umfassend charakterisierte Virulenzfaktoren sind für die verschiedenen Schritte im Infektionszyklus von L. monocytogenes erforderlich: InlA und InlB induzieren die Aufnahme von L. monocytogenes in nicht-phagozytische Zellen, LLO und PlcA sind für die Freisetzung aus dem primären Phagosom, ActA für die Zell-zu-Zell-Ausbreitung und LLO zusammen mit PlcA und vor allem PlcB für die Freisetzung der Listerien aus dem sekundären Phagosom erforderlich. Der Hexose-Phosphat-Transporter UhpT ist teilweise für die Vermehrung von L. monocytogenes im Zytosol der infizierten Wirtszelle verantwortlich. Die Gene, die für diese Virulenzfaktoren kodieren, sind größtenteils in dem 9,6 kb-großen Virulenzgencluster LIPI-1 zusammengefasst oder liegen verteilt auf dem Chromosom. Alle diese Virulenzgene werden durch den positiven Regulationsfaktor PrfA (PrfA = positive regulatory factor A) in ihrer Transkription kontrolliert. Das prfA-Gen, kodierend für PrfA, ist benfalls Bestandteil des Virulenzgenclusters (LIPI-1). In bisherigen Studien konnte gezeigt werden, dass die Verwertung der Kohlenstoffquellen Glukose, Mannose und Cellobiose zur Hemmung der PrfA-Aktivität in L. monocytogenes führt. Basierend auf Literaturdaten und eigenen Ergebnissen wurde die Hypothese aufgestellt, dass Komponenten der globalen Kohlenstoff-Katabolitrepression (KKR) oder des PTS (Phosphoenolpyruvat-Phosphotransferase-System)-abhängigen Zuckertransports an der Modulation der PrfA-Aktivität beteiligt sind. Um zu überprüfen, ob über die KKR die Aktivität von PrfA gesteuert wird und dadurch auch die Regulation der PrfA-abhängigen Virulenzgenexpression, wurden in dieser Arbeit pLSV101-Insertionsmutanten für die Gene ccpA (kodierend für CcpA = catabolite control protein A), hprK (kodierend für die HPr-Kinase/Phosphorylase, die HPr am Ser46 phophoryliert) und ptsH (kodierend für das hitzestabile HPr) charakterisiert. Die Insertionsmutanten ::ccpA und ::hprK zeigten sowohl in BHI (undefiniertes nährstoffreiches Medium) als auch in definiertem Minimalmedium (MM) mit 50 mM Glukose ein verlangsamtes Wachstum und eine verringerte [14C]-Glukose-Aufnahme im Vergleich zum Wildtyp (WT). Die ::ptsH-Insertionsmutante war nur zu einem Wachstum in BHI fähig und zeigte erwartungsgemäß (fehlendes HPr) kein Wachstum in definiertem MM mit Glukose als einziger Kohlenstoffquelle. Die ::hprK- und (unter bestimmten Wachstumsbedingungen) auch die ::ptsH–Mutante wiesen sowohl auf Transkriptions- als auch auf Translationsebene eine gesteigerte Expression PrfA-abhängiger Virulenzgene auf. Cellobiose-Verwertung führte auch in der ::hprK-Insertionsmutante zu einer Hemmung der PrfA-Aktivität. Dagegen wurde in der ::ccpA-Insertionsmutante eine geringere Expression aller PrfA-abhängigen Virulenzgene im Vergleich zum WT festgestellt. Die Revertanten RccpA, RhprK und RptsH wiesen im Wachstumsverhalten und in der PrfA-abhängigen Virulenzgenexpression wieder einen wildtypischen Phänotyp auf. Trotz der etwas gesteigerten Virulenzgenexpression zeigte die ::ptsH-Mutante eine deutlich verringerte Replikationsrate in J744 Makrophagen gegenüber dem WT. Die Transkriptomprofile der ::ccpA- und ::hprK-Insertionsmutanten zeigten im Vergleich zum WT viele hochregulierte Gene. Diese umfassen Gene, die v.a. für den PTS-abhängigen Zuckertransport, ABC-Transporter und Enzyme des C- und N-Metabolismus kodieren und im WT wahrscheinlich unter den gegebenen Wachstumsbedingungen unter KKR-Kontrolle stehen. Die erhöhte PrfA-abhängige Virulenzgenexpression in der ::hprK-Mutante korreliert mit der Herunterregulation einiger Gene, die in ihrer Transkription durch einen aktiven PTSvermittelten Glukose-Transport kontrolliert werden. Die gesteigerte PrfA-Aktivität und die Abwesenheit von HPr-Ser46~P (neben CcpA eine wichtige Komponente der KKR) in den ::hprK- und ::ptsH-Insertionsmutanten führten zu der Annahme, dass eine Korrelation zwischen der Menge an HPr-Ser46~P und der PrfA-Aktivität bestehen könnte. Die Untersuchung der PrfA-Aktivität und parallel dazu die Mengenbestimmung von HPr-Ser46~P in MM mit Glukose, Cellobiose und Glyzerin zeigte jedoch, dass weder HPr-Ser46~P noch HPr-His15~P direkte Modulatoren der PrfA-Aktivität sind. Eine direkte Interaktion zwischen HPr-Ser46~P und PrfA konnte mittels Biacor-Analyse ebenfalls nicht nachgewiesen werden. Auch in vitro Transkriptions-Studien zeigten keinen inhibitorischen Effekt von HPr-Ser46~P auf die Initiation der Transkription bei PrfA-abhängigen Promotoren (S. Müller-Altrock, persönliche Mitteilung). Interessanterweise war bei einem aktiven Glukose-Transport, bei Bedingungen also, wo die EIIA-Komponenten aller aktiven Glukose-spezifischen PTS im unphosphoryliertem Zustand vorliegen (EIIA-Komponenten übertragen über EIIB das aktive Phosphat auf die über EIIC in die Bakterienzelle transportierte Glukose), die PrfA-Aktivität gering. Erst in der spätlogarithmischen bis stationären Wachstumsphasen, wenn Glukose nur noch in geringem Umfang von der Bakterienzelle aufgenommen wird und die Glukose-spezifischen EIIA-Komponenten in phosphorylierter Form vorliegen, steigt die PrfA-Aktivität. Die Verwertung der PTS-unabhängigen Kohlenstoffquelle Glyzerin zeigte gegenüber den PTS Zuckern Glukose und Cellobiose schon in der frühen Wachstumsphase eine erhöhte PrfA-Aktivität. Demnach scheint sich die Expression spezifischer PTS und der Phosphorylierungszustand von EIIA dieser PTS regulatorisch auf die PrfA-Aktivität auszuwirken. Die Glukose-Aufnahme in L. monocytogenes ist noch nicht vollständig aufgeklärt (R. Stoll, unveröffentlichte Ergebnisse). Doch kann aufgrund des Wachstumsverlustes der ::ptsH-Insertionsmutante in Glukose-haltigem MM davon ausgegangen werden, dass die Glukose-Aufnahme in L. monocytogenes ausschließlich PTS-abhängig erfolgt. Ein Glukose-spezifisches PtsG, das in B. subtilis und anderen Bakterien als wichtiger Glukose-Transporter beschrieben wurde, existiert in L. monocytogenes nicht. Hier konnte nur eine PtsG-spezifische EIIA-Komponente (kodiert von lmo1017) identifiziert werden. Wachstumsuntersuchungen in definiertem MM mit den Kohlenstoffquellen Glukose, Mannose, Cellobiose und Glyzerin ergaben keinen Wachstumsunterschied zwischen der in dieser Komponente defekten ΔeIIAGlc-Mutante und dem WT. Die PrfA-Aktivität dieser Mutante war leicht erhöht, was sich in einer etwas gesteigerten ActA- bzw. PrfA-Expression und einer höheren LLO-Aktivität gegenüber dem WT ausprägte. Es konnte jedoch keine eindeutige Interaktion zwischen dieser gereinigten EIIAGlc-Komponente und dem PrfA-Protein mittels Biacor-Analyse nachgewiesen werden (S. Müller-Altrock und G. Seidel, persönliche Mitteilung). Welche EIIA-Komponenten spezifischer PTS an der Modulation der PrfA-Aktivität beteiligt sind, konnte in dieser Arbeit damit nicht abschließend geklärt werden. Der Transport von phosphorylierten Zuckern, wie Glukose-1-, Glukose-6- oder Mannose-6- Phosphat, erfolgt in L. monocytogenes über den Hexose-Phosphat-Transporter UhpT, der von dem strikt PrfA-abhängig uhpT-Gen kodiert wird. Durch die Zugabe von Amberlite XAD-4 zu LB-Medium oder durch vorherigen Anzucht in Glyzerin-haltigem MM, Bedingungen, die sich stimulierend auf die PrfA-Aktivität auswirken, konnte ein effizientes Wachstum von L. monocytogenes in Glukose-6-Phosphat-haltigem Medium erreicht werden. Obwohl die Kohlenstoff-Verbindungen (Glukose, Cellobiose und Glukose-6-Phosphat) in die Glykolyse eingeschleust werden, führte die Verwertung von Glukose-6-Phosphat zur Aufhebung der KKR. Dies konnte durch vergleichende Gesamtgenom-Transkriptom-Analysen und an der Bestimmung der HPr-Ser46~P Meng gezeigt werden. Die PTS-unabhängige Glukose-6-Phosphat-Aufnahme führt, ähnlich wie die von Glyzerin, zu einer erhöhten Aktivität von PrfA. Neben Glyzerin können auch Dihydroxyaceton (Dha) und Pyruvat (letztere allerdings mit niedriger Wachstumseffizienz), nicht aber Glyzerin-3-Phosphat in vitro als C3-Quellen dienen. Da die ::ptsH-Insertionsmutante kein Wachstum in Glyzerin- oder Dha-haltigem Medium zeigte, lässt sich vermuten, dass die listeriellen Glyzerin-Kinase(n) (GlpK), ähnlich wie die von B. subtilis, durch HPr-His15~P aktiviert werden muss und die Dha-Kinase(n) (DhaK) von L. monocytogenes ebenfalls HPr-His15~P als Kofaktor für die Phosphorylierung von Dha verwendet. Der Glyzerin-Metabolismus in L. monocytogenes wurde vor allem über Gesamtgenom-Transkriptom-Analysen und Real-time RT-PCR Untersuchungen näher charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass L. monocytogenes mehrere Gene besitzt, die in Glyzerin-haltigem Medium verstärkt exprimiert werden und vermutlich am Glyzerin- bzw. Dha-Metabolismus beteiligt sind. L. monocytogenes besitzt zwei Dha-Kinasen (kodiert von lmo0347-48 und lmo2695-96), die beide eine hohe Homologie zur DhaK aus E. coli besitzen. Eine Deletion beider Dha-Kinasen (ΔdhaK = Δlmo0347-48/lmo2695-96) führte zu einer starken Wachstumshemmung in Glyzerin-haltigem MM und zur weitgehenden Inaktivierung von PrfA. Die ΔdhaK- und die ΔglpD/dhaK-Mutante wiesen in J744 Makrophagen eine verringerte Replikationsrate im Vergleich zum WT auf, was für eine Verwertung von Glyzerin und/oder Dha durch L. monocytogenes im Zytoplasma von Wirtszellen spricht. Da diese Mutanten aber noch –wenn auch mit verringerter Effizienz – in diesem Zellkompartiment der Makrophagen wachsen können, muss L. monocytogenes wohl auch in der Lage sein, weitere Kohlenstoffquellen dieser Wirtszelle verwerten zu können. N2 - Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular bacterium of mammals naturally inhabiting decayed plant matter in the soil. Several well-characterised virulence factors are necessary for the different steps in the infection cycle of L. monocytogenes: InlA and InlB for active internalization of L. monocytogenes into nonprofessional phagocytic cells, LLO and PlcA for the release of the primary phagosome, ActA for cell-to-cell spreading, LLO together with PlcA and mainly PlcB are responsible for the escape from the secondary phagosome. The hexose-phosphate-transpoter (UhpT) is partially involved in intracellular replication in the cytosol of the host. The genes that encode these virulence factors are clustered mainly in a single 9,6 kb region of the chromosome (LIPI-1) or dispersed elsewhere on the listerial chromosome. The transcriptions of these genes are regulated by the positive regulatory factor A ( PrfA), encoded by prfA, which is itself a member of the same gene cluster (LIPI-1). Previous studies have indicated that the utilization fermentable sugars like glucose, mannose, and cellobiose repressed the PrfA-controlled virulence gene expression in L. monocytogenens. Based on the published results and the results obtained in this study, it is tempting to hypothesise that components of the carbon catabolite repression (CCR) or of the PTS- (Phosphoenolpyruvate Phosphotransferase System) dependent sugar transport are involved in modulation of PrfA activity. To show that components of CCR could be involved in modulation of PrfA activity and therfore in regulation of PrfA-dependent virulence gene expression in L. monocytogenes, insertion mutants of ccpA (coding for CcpA = catabolite control protein A), hprK (coding for HPr kinase/phosphatase which phosphorylates HPr at Ser46) and ptsH (coding for HPr) were characterised. The ::ccpA and ::hprK mutants showed reduced growth in BHI (undefined nutrient rich medium) as well as in defined minimal medium (MM) with 50 mM glucose and decreased [14C]-glucose uptake compared to wild-type. The ::ptsH mutant could only grow in a rich culture medium and as expected was unable to grow in MM with glucose as sole carbon source because of its inability to produce HPr. ::hprK and ::ptsH mutant (under certain growth conditions) too showed increased expression of PrfA-controlled genes both at the transcriptional and translational level. Cellobiose utilisation in the ::hprK mutant led to inhibition of PrfA activity. In contrast, the ::ccpA mutant showed decreased expression of the PrfA-dependent virulence genes in comparison to wild-type. Revertants, RccpA RhprK and RptsH again showed a wild type phenotype with respect to growth and expression of the PrfA regulated genes. In spite of slight increased virulence gene expression, the ::ptsH mutant showed reduced replication in J744 macrophages compared to wild-type. The transcript profiles of the::ccpA and ::hprK mutants revealed in comparison to the wildtype several upregulated genes. Amongst others, genes coding for PTS-dependent sugar transport, ABC-transporter and enzyms of the C- and N-metabolism were upregulated, suggesting that they were repressed in wild-type under those growth conditions. Upregulation of the PrfA-dependent virulence genes in the ::hprK mutant correlates with the down-regulation of genes which are controlled by the efficiency of PTS-mediated glucose transport. The increased PrfA activity and the absence of the HPr-Ser46~P (beside CcpA a main key player of CCR) in ::hprK and ::ptsH mutants led to assumption that there is an inverse correlation between the level of HPr-Ser46~P and PrfA activity. However, the determination of the PrfA activity and quantification of the amount of HPr-Ser46~P in the medium with glucose cellobiose and glycerol respectively showed that neither HPr-Ser46~P nor HPr-His15~P could act as direct negative modulators of PrfA activity. Recent studies aimed at demonstrating direct binding of purified HPr-Ser46~P and PrfA using Biacore assays also failed. In addition in vitro transcription showed no inhibition effect by HPr-Ser46~P to initiated transcription from several PrfA-dependent promoters (S. Müller-Altrock, personal communication). Interestingly, during active glucose transport, conditions where EIIA components of active glucose-specific PTS are unphosphorylated (EIIA components transfer the phosphate via EIIB to the glucose being tranported by EIIC into the bacterial cell) the PrfA activity is low. In the late log phase and the early stationary phase where less glucose is taken up by the bacteria and glucose-specific EIIA components are phosphorylated, the PrfA activity increased. L. monocytogenes grown in the presence of the non-PTS carbon source glycerol showed already in the early growth phase a higher PrfA activity in comparison to growth with PTS-dependent sugars like glucose or cellobiose. Based on these results, the expression of specific PTS and the phosphorylation state of EIIA componentes of these PTS seams to affect the regulation of PrfA activity. The exact mechanism of glucose uptake in L. monocytogenes is still unclear (R. Stoll; unpublished data). Due to the growth deficiency of the ::ptsH mutant in glucose-containing MM glucose uptake must be PTS-dependent. The glucose-specific PtsG described for B. subtilis and other bacteria as important glucose transporter is not present in L. monocytogenes. Only a PtsG-specific EIIA component (encoded by lmo1017) has been identified. Growth analysis in defined MM supplemented with glucose, mannose, cellobiose and glycerol respectively showed no differences in growth between eIIAGlc mutant and wildtype. The PrfA activity in that mutant was slightly increased, shown in a slight increased expression of ActA and PrfA and a higher LLO activity compared to wild-type. However, studies aimed at demonstrating direct binding of purified EIIAGlc and PrfA with in Biacore assays failed (S. Müller-Altrock and G. Seidel, personal communication). Which of the EIIA components of specific PTS are involved in modulation of PrfA activity needs further clarification. Transport of phosphate sugars like glucose-1-, glucose-6- or mannose-6-phosphate is mediated by the hexose-phosphate-transporter UhpT encoded by the strictly PrfA-dependent gene uhpT. Addition of Amberlite XAD-4 to LB-Medium or preincubation in glycerolcontaining MM conditions which induce PrfA activity led to efficient growth of L. monocytogenes in glucose-6-phosphate containing medium. Even though, glucose, cellobiose and glucose-6-phosphate are catabolised via glycolyis, glucose-6-phosphate utilisation led to deregulation of the CCR. This deregulation was shown on the basis of wholegenome-transcriptom analysis and quantification of the amount of HPr-Ser46~P. The non-PTS-dependent transport of glucose-6-phosphate resulted similar to that of glycerol to a higher activation of PrfA. Besides glycerol, dihydroxyacetone (dha) and pyruvate (with lower growth efficiencies) but not glycerol-3-phosphate seem to be suitable C3 sources for L. monocytogenes. The ::ptsH mutant was unable to grow in glycerol- or dha-containing medium which suggests that the listerial glycerol kinase(s) (GlpK) similar to that of B. subtilis is activated by HPr-His15~P and that the dha kinase(s) (DhaK) also use HPr-His15~P as a cofactor for dha phosphorylation. The glycerol metabolism of L. monocytogenes was mainly characteriezed by wholegenome transcriptome analysis and Real-time RT-PCR. It was shown that L. monocytogenes exhibits many genes highly upregulated in glycerol-containing MM indicating an involvement in glycerol and dha metabolism, respectively. L. monocytogenes possesses two dha kinases (encoded by lmo0347-48 and lmo2695-96) with high sequence homology to the dha kinase of E. coli. Deletion of both dha kinases (ΔdhaK = Δlmo0347-48/lmo2695-96) led to high growth inhibition and to almost complete PrfA inactivation. The dhaK and glpD/dhaK mutants exhibited a reduction in intracellular replication in J744 macrophages compared to wild-type, suggesting an utilisation of glycerol and/or dha in the host cytosol by L. monocytogenes. The fact that these mutants could still grow in this cell compartment of macrophages (however with lower efficiencies) indicates that L. monocytogenes must be able to utilise additional carbon sources in the host cell. KW - Listeria monocytogenes KW - PrfA KW - PEP:PTS KW - Kohlenstoffkatabolitrepression KW - Listeria monocytogenes KW - PrfA KW - PEP:PTS KW - Kohlenstoffkatabolitrepression KW - Listeria monocytogenes KW - PrfA KW - PEP:PTS KW - carbon catabolite repression Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-29556 ER - TY - THES A1 - Kroner-Milsch, Antje T1 - Role of immune cells in hereditary myelinopathies T1 - Rolle von Immunzellen in hereditären Myelinopathien N2 - Myelin mutations in the central and peripheral nervous system lead to severely disabling, currently untreatable diseases. In this study, we used transgenic PLP overexpressing mice (PLPtg) as a model for central inherited myelinopathies, such as leukodystrophies, and heterozygously P0 deficient (P0+/-) mice as models for peripheral hereditary polyneuropathies. Both models are characterized by low grade nervous tissue inflammation. Macrophages and CD8+ T- lymphocytes contribute to the myelin pathology as shown by crossbreeding experiments with immunodeficient mice. Having shown the relevance of CD8+ T- lymphocytes in PLPtg mice, we investigated the influence of one major cytotoxic molecule (granzyme B) on neural damage. By generation of granzyme B deficient PLPtg bone marrow chimeras, we could demonstrate a reduction of myelin pathology and oligodendrocyte death. Taken together, granzyme B is at least partly responsible for the cytotoxicity induced neural damage in PLPtg mice. To further explore the role of immune modulation, we focussed on the influence of the coinhibitory molecule PD-1, a CD28-related receptor expressed on activated T- and B-lymphocytes. By investigating myelin mutants of the CNS and PNS (PLPtg and P0+/-) with an additional PD-1 deficiency, induced by crossbreeding or bone marrow chimerization, we found a significant increase of CD8+ T- lymphocytes and massive increase of the myelin pathology in both the CNS and PNS model. In PLPtg mice, absence of PD-1 increased oligodendrocyte apoptosis, clonal expansions and a higher propensity of CNS but not peripheral CD8+ T- cells to secrete proinflammatory cytokines. In P0+/- mice, absence of PD-1 lead to moderate motor and sensory disturbances, confirming the important role of PD-1 in immune homeostasis. Taken together, we identified granzyme B as an important effector agent of cytotoxic T-lymphocytes in PLPtg mice and PD-1 as a crucial player in regulating the effector cells in our models of central and peripheral myelinopathy. Alterations of this regulatory pathway lead to overt neuroinflammation of high pathogenetic impact. These results might help to understand mechanisms responsible for high clinical variability of polygenic or even monogenic disorders of the nervous system. N2 - Myelinmutationen des zentralen und peripheren Nervensystems verursachen erheblich behindernde und bislang nicht heilbare Erkrankungen. In dieser Arbeit verwendeten wir transgene PLP überexprimierende Mäuse (PLPtg) als Modell für zentrale Myelinopathien und heterozygot P0 defiziente (P0+/-) Mäuse als Modell für hereditäre Neuropathien des peripheren Nervensystems. Beide Modelle zeigen eine niedriggradige Inflammation des Nervengewebes. Durch Verpaarung mit immundefizienten Mausstämmen konnten wir die Relevanz von Makrophagen und T- Lymphozyten in der Entstehung der Myelinpathologie zeigen. Nachdem wir beweisen konnten, dass CD8+ T- Lymphozyten maßgeblich zur Pathologie in PLPtg Mäusen beitragen untersuchten wir den Einfluss eines wichtigen zytotoxischen Moleküls, Granzym B, auf den neuralen Schaden. Durch Generierung von Granzym B defizienten PLPtg Knochenmarkschimären konnten wir eine deutliche Reduktion des glialen Schadens und der Oligodendrozytenapoptose nachweisen. Granzym B ist also zumindest teilweise verantwortlich für die Schädigung, die durch T- Lymphozyten hervorgerufen wird. Um die zusätzliche Informationen über die Rolle der Immunmodulation in unseren Modellen zu gewinnen, untersuchten wir das koinhibitorische Molekül PD-1, einen CD-28 verwandten Rezeptor, der auf B- und T- Lymphozyten exprimiert wird. Bei der Untersuchung von Myelinmutanten des ZNS und PNS (PLPtg und P0+/-), die zusätzlich PD-1 defizient waren, konnten wir einen signifikanten Anstieg von CD8+ T- Lymphozyten und eine deutliche Verschlechterung des glialen Schadens beobachten. In PLPtg Mäusen induzierte die Abwesenheit von PD-1 verstärkte Oligodendrozytenapoptose und klonale Expansion. Außerdem neigen ZNS- Lymphozyten aber nicht periphere CD8+ T- Zellen zur verstärkten Sekretion von proinflammatorischen Zytokinen. In P0+/- Mäusen führt Abwesenheit von PD-1 zu moderaten motorischen und sensorischen Störungen, was die wichtige Rolle von PD-1 in immunologischen Regulationsmechanismen unterstreicht. Zusammenfassend kann man festhalten, daß Granzym B ein wichtiges Effektormolekül zytotoxischer T- Zellen in PLPtg Mäusen ist. PD-1 spielt eine wichtige Rolle in der Regulation von Effektorzellen in unseren Modellen für zentrale und periphere Myelinopathien. Veränderungen dieser Regulation können deutliche Neuroinflammation mit starker Myelinpathologie hervorrufen. Diese Ergebnisse können dazu beitragen, die starke klinische Variabilität von polygenen und sogar monogenen neurologischen Erkrankungen zu erklären. KW - Myelinopathie KW - T- Lymphozyt KW - Multiple Sklerose KW - Neuropathie KW - PD-1 KW - Myelinopathy KW - neuropathy KW - T-lymphocyte KW - multiple sclerosis Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-28976 ER - TY - THES A1 - Geissler, Oliver T1 - Der Informationsfluss bei der Futtersuche von Ameisen : Spezielle Kommunikationsstrategien von Blattschneiderameisen und nektarsammelnden Ameisen T1 - The flow of information during foraging in ants: special communication strategies in leaf-cutting ants and nectar feeding ants N2 - Die komplexen Aktivitätsmuster während der Futtersuche bei Ameisen sind kein Resultat einer einfachen Selbstorganisation mit starren Regeln sind, sondern diese Regeln werden vielmehr permanent durch den Informationsaustausch zwischen den Arbeiterinnen modifiziert. Die Furagierökologie hat vor allem einen Einfluss auf die Rekrutierungsstrategie der Tiere. Blattschneiderameisen furagieren an großen und stabilen Nahrungsressourcen auf diese sie nach dem Auffinden sofort stark rekrutieren. Camponotus rufipes besucht hingegen Futterquellen, die in ihrer Ergiebigkeit schlecht vorhersagbar sind. Daher steigern die Tiere ihre Rekrutierungsintensität erst nachdem sie sich durch mehrmaliges Aufsuchen der Futterquelle von deren Beständigkeit überzeugt haben. N2 - The complex foraging activity patterns performed by ant colonies during foraging are not the result of numerous simple stimulus-response behaviours based on fixed decision rules. On the contrary, the decision rules are modified continuously by the information flow between workers. The foraging ecology has a strong impact on the recruitment strategies used by the ants. Leaf-cutting ants forage at long-term ad libitum food sources. Therefore, when food patches once found, the scouts show immediately intense recruiting behaviour. In contrast Camponotus rufipes visit small food patches, which are unpredictable in their profitability. Therefore the animals increase the recruitment activity not until the reliability of the site was tested by being able to perform several successful foraging bouts. KW - Nahrungserwerb KW - Ameisen KW - Organisation KW - Rückkopplung KW - ants KW - foraging KW - organisation KW - feedback Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-28878 ER - TY - THES A1 - Kroiß, Matthias T1 - Reinigung und funktionelle Charakterisierung des SMN-Komplexes von Drosophila melanogaster T1 - Purification and functional characterization of the SMN-complex in Drosophila melanogaster N2 - Die Zusammenlageurng spleißosomaler UsnRNPs erfolgt beim Menschen und anderen Vertebraten durch den makromolekularen SMN-Komplex. Dieser besteht aus insgesamt neun Proteinen, genannt SMN und Gemin2-8. In dieser Arbeit wurde die Evolution dieser molekularen Maschine untersucht. Dazu wurden die Genome mehrerer Modellorganismen bioinformatisch nach Orthologen von SMN und seinen Komplexpartnern durchsucht. Es zeigte sich, dass SMN und Gemin2 die Kernkomponenten des Komplexes darstellen. Von diesen ausgehend kamen weitere Komponenten im Laufe der Evolution hinzu und zwar blockweise, wie es ihrer physischen Assoziation im humanen Komplex entspricht. Um diese Befunde einer biochemischen Überprüfung zu unterziehen, wurde ein neues Affinitätsepitop, das TagIt-Epitop, entwickelt. Nach stabiler Transfektion von Drosophila Schneider2-Zellen konnte das Fusionsprotein effizient exprimiert und der Drosophila-SMN-Komplex nativ aufgereinigt werden. Die massenspektrometrische Untersuchung des Komplexes zeigte, dass SMN und Gemin2 seine einzigen stöchiometrischen Komponenten sind. Dies ist in eindrucksvoller Übereinstimmung mit den bioinformatischen Daten. Der aufgereinigte Komplex lagert in vitro Sm-Proteine mit der entsprechenden UsnRNA zum UsnRNP-core-Komplex zusammen. Diese Ergebnisse ließen sich nach rekombinanter Rekonstitution des SMN/Gemin2-Dimers rekapitulieren. Dabei zeigte sich, dass der SMN-Komplex die unkoordinierte Bindung der Sm-Proteine an „falsche“ RNAs verhindert. Folglich genügen SMN und Gemin2 zur Zusammenlagerung des Sm-core-Komplexes, während die übrigen Gemine weitere Funktionen im Kontext der UsnRNP-Biogenese spielen könnten. Aus evolutionsbiologischer Sichtweise ist der SMN-Komplex aus Drosophila ein eindrückliches Beispiel, wie die Vereinfachung eines biochemischen Prozesses zur Kompaktierung des Genoms beitragen kann. N2 - In vertebrates, assembly of spliceosomal UsnRNPs is mediated by the SMN-complex, a macromolecular entity composed of the proteins SMN and Gemins 2-8. In this study, the evolution of this machinery has been investigated using complete genome assemblies of multiple model organisms. The SMN-complex has gained complexity in evolution by a block-wise addition of Gemins onto an ancestral core complex composed of SMN and Gemin2. In contrast to this overall evolutionary trend to higher complexity in metazoans, orthologs of most Gemins are missing in dipterans. In order to challenge these findings by biochemical means, I have developed a novel affinity epitope suitable for use in transfected Drosophila Schneider2-cells. Using protein mass spectrometry, the composition of the Drosophila SMN-complex has been determined. In accordance with the bioinformatic data, it consists of the core components SMN and Gemin2 only. Purified complex mediates assembly of UsnRNP core complexes in a manner very similar to its vertebrate counterpart. These results were recapitulated after recombinant reconstitution of the dSMN/dGemin2-dimer, demonstrating that the Drosophila complex also prevents mis-assembly of Smproteins onto non-target RNAs. Hence, only a minority of Gemins is required for the assembly reaction per se, whereas others may serve additional functions in the context of UsnRNP biogenesis. From a more general point of view, the evolution of the SMN-complex is an interesting example of how the simplification of a biochemical process contributes to genome compaction. KW - Taufliege KW - Epitop KW - Antikörper KW - Biochemische Evolution KW - SMN-Komplex KW - Spinale Muskelatrophie KW - Affinitätsreinigung KW - Epitop-Tag KW - SMN-complex KW - spinal muscular atrophy KW - affinity purification KW - epitope tagging Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-28840 ER - TY - THES A1 - Haneke, Torsten T1 - Die Tumorgenese in Mlh1 defizienten Mäusen und der Einfluss des Immunsystems auf die Abwehr von Tumoren in Mismatch Reparatur-(MMR-) defizienten Mäusen T1 - The tumorigenesis in Mlh1 deficient mice and the influence of the immune system for the rejection of tumors in mismatch repair- (MMR-) deficient mice N2 - Das DNA-Mismatch-Reparatur-(MMR-) System ist das einzig bekannte postreplikativ arbeitende DNA-Reparatur-System. Es wurde gezeigt, dass die MMR-Aktivität für den Erhalt der genomischen Stabilität in Prokaryoten und Eukaryoten notwendig ist. Defekte in Genen des MMR-Systems (wie beispielsweise MLH1 oder MSH2) wurden als Ursache für die Entstehung des hereditären nicht-polypösen kolorektalen Karzinoms (HNPCC) und anderen Tumorarten beschrieben. In der vorliegenden Arbeit wurde die Tumorgenese in Mlh1 defizienten Mäusen (Mlh1-/-) untersucht und eine umfassende Charakterisierung der hier auftretenen Lymphome vorgenommen und die Bedeutung des Immunsystems für die Tumorgenese in Mlh1 defizienten Mäusen durch Einkreuzen zusätzlicher Immundefizienzen erruiert. Die auf einen reinen genetischen Hintergrund zurückgekreuzten Mlh1-/--Mäuse zeigten eine in zwei Wellen ablaufende Tumorgenese: Eine frühe Phase, in der Mäuse lymphoide Tumoren entwickelten und eine spätere Phase, in der die Mlh1-/--Tiere vorwiegend an Gastrointestinaltumoren erkrankten. Wir konnten zeigen, dass die Mlh1 defizienten Mäuse ein breiteres Lymphomspektrum, als beispielsweise Msh2 defiziente Tiere aufweisen. Eine Vielzahl der untersuchten Lymphome Mlh1 defizienter Mäuse war mikrosatelliteninstabil (MSI). Die Tatsache, dass mikrosatellitenstabile (MSS) Lymphome in den Mlh1-/--Tieren vorkamen, impliziert aber auch, das MMR-Defizienz nicht zwingend durch Mikrosatelliteninstabilität gekennzeichnet sein muss. Es ist möglich, dass sich eine Mikrosatelliteninstabilität erst zu einem späteren Zeitpunkt der Tumorentwicklung in MMR-defizienten Zellen manifestiert. Darauf deuten auch die MSI-Analysen der in den Rag-/-/Mlh1-/--Mäusen frühzeitiger als in Mlh1-/--Mäusen auftretenden Gastrointestinaltumoren hin. Einige dieser untersuchten Gastrointestinaltumoren in den Rag-/-/Mlh1-/--Mäusen waren mikrosatellitenstabil, wohingegen sämtliche Gastrointestinaltumoren der Mlh1 defizienten Mauspopulation Mikrosatelliteninstabilität aufwiesen. In einigen der untersuchten Lymphome fehlte die MHC Klasse I-Molekülexpression, was auf deutet den Einfluss des Immunsystems auf die Erkennung und Eliminierung von (durch MMR-Defizienz entstandenen) Tumoren hindeutet. Um die Art der Immunantwort und die verantwortlichen Komponenten des Immunsystems für die Abwehr MMR-defizienter Tumoren einzugrenzen, wurden verschiedene immunkompromitierte oder immundefiziente Mauslinien in Mlh1 defiziente Mäuse eingekreuzt. Dieses waren Mauslinien mit beta2Mikroglobulin- (b2m-/--), Perforin- (pfp-/--), beta2Mikroglobulin/Perforin- (b2m-/-/pfp-/--) und Recombination activation gene- (Rag-/--) Defizienz. Häufig wurde in diesen Tieren eine Verschiebung im Tumorspektrum und ein beschleunigtes zeitliches Auftreten der Tumoren beobachtet. Anhand dieser Modelle konnten wir demonstrieren, dass insbesondere die Regulierung der MHC Klasse I-Molekülexpression ein bedeutsamer Schritt für die Ausprägung verschiedener Lymphomarten ist, welcher das „Überleben“ der Tumorzellen gewährleistet. Auch die Notwendigkeit einer balancierten Expression von NK-Zell-stimulatorischen und –inhibitorischen Liganden auf der Tumorzelloberfläche, welche die Erkennung und Eliminierung von Tumorzellen durch Nicht-MHC Klasse I-abhängige Immunzellen (wie z.B. den Natürliche Killerzellen) reguliert, liess sich mit Hilfe der beta2Mikroglobulin- und Perforin-Mausmodelle aufzeigen. Offensichtlich sind für die in Mlh1 defizienten Mäusen vorkommenden verschiedenen Tumorarten unterschiedliche zelluläre Komponenten und Abwehrmechanismen des Immunsystems für die Erkennung und Eliminierung verantwortlich. So beeinflussen insbesondere cytotoxische T-Zellen (CTLs) die Entstehung von Gastrointestinaltumoren in Mlh1 defizienten Mäusen. Für die lymphoiden Tumoren ergab sich ein divergentes Bild. Hier beschränkte sich der Einfluss der CTLs bei der Lymphomabwehr auf die Erkennung und Eliminierung disseminierter T- und B-Zell-Lymphome. Die in den Mlh1-/--Mäusen nachgewiesenen thymischen T-Zell Lymphome dagegen unterlagen der perforin-vermittelten Zellabwehr durch Nicht-MHC Klasse I-beschränkte Immunzellen (z.B. Natürlichen Killerzellen). Die Relevanz der vorliegenden Mausmodelle wird deutlich, wenn man sich die Situation von immunsupprimierten Posttransplantationspatienten und immundefizienten HIV-Patienten vor Augen führt. Häufig beobachtet man in diesen Patientengruppen das Auftreten lymphoider Tumoren. Diese sind oftmals Mikrosatelliteninstabil, was auf eine vorliegende MMR-Defizienz hindeutet. Zudem zeigen diese Lymphome ähnliche Merkmale, wie die durch Mlh1-Defizienz entstandenen lymphoiden Tumoren. Insbesondere für Studien solcher Lymphome stellt die Mlh1-defiziente Maus mit den verschiedenen eingekreuzten Immundefizienzen ein geeignetes in vivo Model dar. N2 - The DNA-Mismatch-(MMR-) Repair System is the only postreplicative working DNA repair system known so far. It was shown, that MMR activity is necessary for maintaining the genomic stability in prokaryotes and eukaryotes. Defects in MMR genes such as MLH1 or MSH2 were described in the hereditary non-polyposis colorectal carcinoma (HNPCC) and other tumors. The aim of this thesis was the analysis of the tumorigenesis and a detailed characterization of the lymphoid tumors of Mlh1 deficient mice. Additionally, by crossing the Mlh1-/--mice with different immune compromised animals, the impact of the immune system on the tumorigenesis in Mlh1 deficient mice was studied. The tumorigenesis in the Mlh1-/--mice (crossed on a pure genetic background) occurred in two waves: one early phase with predominant development of lymphoid tumors and a later phase characterized by mainly gastrointestinal tumors. The majority of lymphomas were histologically defined as lymphomas of a lymphoblastic T- and B-cell type. The lymphoma types grouped by immunophenotyping were different, depending on their expression of surface molecules (MHC class I, Rae-1) and genes that are relevant for the development of lymphoid cells (like TdT, Rag, Pax5, E2a). Based on these findings, and subgrouping the lymphomas according to their location (thymus-located and disseminated lymphomas) we found a broad spectrum of lymphoid tumors. In comparison to Msh2 deficient mice which exclusively developed thymic T cell lymphomas (and gastrointestinal tumors) we observed an additional appearance of disseminated T cell and B cell lymphomas in the Mlh1 deficient mouse population. The analysis of microsatellite instability (MSI) as a hallmark of the human hereditary colorectal carcinoma (HNPCC) has been shown to represent an appropriate method for other tumor entities, as the majority of lymphomas in Mlh1 deficient mice were microsatellite instable. On the other hand, the finding of microsatellite stable (MSS) lymphomas implies that Mismatch Repair- (MMR-) deficiency is not necessarily characterized by microsatellite instability. One possible explanation might be that MSI in MMR deficient cells are manifested at a later timepoint of tumorigenesis. This notion is supported by the occurence of microsatellite stabile (MSS) gastrointestinal tumors found in Rag-/-/Mlh1-/--animals. All of the gastrointestinal tumors analyzed in Mlh1-/--mice were microsatellite instable (MSI) and arised later. Frequently, lymphomas in Mlh1-/--mice were lacking the expression of MHC class I molecules. This finding suggests a possible influence of immune recognition and elimination of the MMR deficient tumors by the immune system. To narrow down the kind of immune response and the responsible components of the immune system involved in the recognition of MMR deficient tumors, we crossed immunocompromised or immunodeficient mouse strains into Mlh1 deficient mice. This were the beta2microglobulin-(b2m-/--), perforin-(pfp-/--), beta2micro-globulin/perforin-(b2m-/-/pfp-/--), and recombination activation gene-(Rag-/--) deficient strains. The additional immunodeficiencies, frequently led to a shifted spectra and onset of the tumors in the Mlh1-/--mice. The crucial importance of MHC class I molecule expression for the development of different lymphoma entities was shown by using these additional models. A regulation of MHC class I molecules is important for the tumor cells survival. Consequently, crossing immunodeficiencies (b2m-/-- and/or pfp-/-) into the Mlh1-/--mice revealed the importance of a balanced expression of natural killer-(NK-) cell stimulatory and inhibitory ligands on the surface of tumor cells. Obviously the different tumor entities observed in Mlh1 deficient mice are controlled by different cellular components and mechanisms exerted through the immune system. The cytotoxic T cells (CTLs) had a strong impact on the gastrointestinal tumorigenesis in Mlh1 deficient mice. A divergent situation was observed in the group of lymphoid tumors: the recognition and elimination by CTLs seemed to be restricted to the subgroups of disseminated T and B cell lymphomas, whereas the thymic T-cell lymphomas were eliminated by the Non-MHC class I-restriced immune cells (e.g. NK cells) via the perforin-mediated (granzyme) pathway. The relevance of these mouse models becomes evident by a comparison of human lymphomas that are frequently found in immune-suppressed postransplantation patients and in HIV-patients. These lymphomas are mostly microsatellite instable, indicating an MMR deficiency. Thus, these tumors are displaying similar features compared to the lymphoid tumors of Mlh1-/--mice, with the additional immunodeficiencies crossed in as described here representing an appropriate in vivo model for further studies. KW - Lymphom KW - Gastrointestinaler Tumor KW - Immunsystem KW - Tumorimmunologie KW - Knockout KW - Mismatch Reparatur System KW - Lymphomagenese KW - Mikrosatelliten Instabilität KW - Immundefizienz KW - Mlh1 KW - mismatch repair system KW - lymphomagenesis KW - microsatellite instability KW - immune deficiency KW - Mlh1 Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-28737 ER - TY - THES A1 - Yarali, Ayse T1 - Aspects of predictive learning in the fruit fly T1 - Aspekte des assoziatives Lernens bei Taufliegen N2 - Past experience contributes to behavioural organization mainly via learning: Animals learn otherwise ordinary cues as predictors for biologically significant events. This thesis studies such predictive, associative learning, using the fruit fly Drosophila melanogaster. I ask two main questions, which complement each other: One deals with the processing of those cues that are to be learned as predictors for an important event; the other one deals with the processing of the important event itself, which is to be predicted. Do fruit flies learn about combinations of olfactory and visual cues? I probe larval as well as adult fruit flies for the learning about combinations of olfactory and visual cues, using a so called ‘biconditional discrimination’ task: During training, one odour is paired with reinforcement only in light, but not in darkness; the other odour in turn is reinforced only in darkness, but not in light. Thus, neither the odours nor the visual conditions alone predict reinforcement, only combinations of both do. I find no evidence that either larval or adult fruit flies were to solve such task, speaking against a cross-talk between olfactory and visual modalities. Previous studies however suggest such cross-talk. To reconcile these results, I suggest classifying different kinds of interaction between sensory modalities, according to their site along the sensory-motor continuum: I consider an interaction ‘truly’ cross-modal, if it is between the specific features of the stimuli. I consider an interaction ’amodal’ if it instead engages the behavioural tendencies or ‘values’ elicited by each stimulus. Such reasoning brings me to conclude that different behavioural tasks require different kinds of interaction between sensory modalities; whether a given kind of interaction will be found depends on the neuronal infrastructure, which is a function of the species and the developmental stage. Predictive learning of pain-relief in fruit flies Fruit flies build two opposing kinds of memory, based on an experience with electric shock: Those odours that precede shock during training are learned as predictors for punishment and are subsequently avoided; those odours that follow shock during training on the other hand are learned as signals for relief and are subsequently approached. I focus on such relief learning. I start with a detailed parametric analysis of relief learning, testing for reproducibility as well as effects of gender, repetition of training, odour identity, odour concentration and shock intensity. I also characterize how relief memories, once formed, decay. In addition, concerning the psychological mechanisms of relief learning, first, I show that relief learning establishes genuinely associative conditioned approach behaviour and second, I report that it is most likely not mediated by context associations. These results enable the following neurobiological analysis of relief learning; further, they will form in the future the basis for a mathematical model; finally, they will guide the researchers aiming at uncovering relief learning in other experimental systems. Next, I embark upon neurogenetic analysis of relief learning. First, I report that fruit flies mutant for the so called white gene build overall more ‘negative’ memories about an experience with electric shock. That is, in the white mutants, learning about the painful onset of shock is enhanced, whereas learning about the relieving offset of shock is diminished. As they are coherently affected, these two kinds of learning should be in a balance. The molecular mechanism of the effect of white on this balance remains unresolved. Finally, as a first step towards a neuronal circuit analysis of relief learning, I compare it to reward learning and punishment learning. I find that relief learning is distinct from both in terms of the requirement for biogenic amine signaling: Reward and punishment are respectively signalled by octopamine and dopamine, for relief learning, either of these seem dispensible. Further, I find no evidence for roles for two other biogenic amines, tyramine and serotonin in relief learning. Based on these findings I give directions for further research. N2 - Vergangene Ereignisse beeinflussen die Organisation des Verhaltens hauptsächlich durch das Lernen: Tiere lernen natürlich vorkommende neutrale Reize als Signal für biologisch relevante Ereignisse zu nutzen. Diese Dissertation befasst sich mit derartigen assoziativen Lernvorgängen bei der Taufliege Drosophila melanogaster. Ich stelle zwei, sich ergänzende, grundlegende Fragen: Die eine Frage beschäftigt sich mit der Verarbeitung von Reizen, die als Signal für ein wichtiges Ereignis erlernt werden. Die andere Frage behandelt die Verarbeitung des Ereignisses selbst. Lernen Taufliegen etwas über Kombinationen von olfaktorischen und visuellen Reizen? Sowohl bei larvalen, als auch bei adulten Taufliegen wird das Lernen von Kombinationen aus olfaktorischen und visuellen Stimuli untersucht. Ich verwende einen sogenannten „bikonditionalen Diskriminierungs-Versuchsaufbau“: Während des Trainings wird ein Duft nur im Licht und nicht im Dunkeln mit Reinforcement kombiniert, während ein anderer Duft nur im Dunkeln und nicht im Licht mit Reinforcement kombiniert wird. Somit signalisieren weder die Düfte, noch die visuellen Bedingungen allein das Reinforcement, sondern nur eine Kombination aus Beiden. Ich finde keine Beweise dafür, dass larvale oder adulte Taufliegen eine solche Aufgabe lösen können. Dies spricht gegen eine Interaktion zwischen olfaktorischen und visuellen Modalitäten. Allerdings weisen frühere Studien auf derartige Interaktionen hin. Um meine Ergebnisse mit den bekannten Studien in Einklang zu bringen, ordne ich die unterschiedlichen Interaktionen zwischen den sensorischen Modalitäten nach ihrer Lage entlang des sensorisch-motorischen Kontinuums: Ich bezeichnen eine Interaktion für „echt“ cross-modal, wenn sie zwischen den spezifischen Eigenschaften der beiden Reize stattfindet. Ich halte eine Interaktion für „amodal“, wenn sie zwischen den von den Reizen induzierten Verhaltenstendenzen und „Werten“ stattfindet. Aufgrund dieser Argumentation komme ich zu der Schlussfolgerung, dass unterschiedliche Verhaltensaufgaben unterschiedliche Interaktionen zwischen den sensorischen Modalitäten erfordern. Ob eine Art von Interaktion gefunden wird oder nicht hängt von der neuronalen Vernetzung ab, welche charakteristisch für Art und Entwicklungsstadium ist. Assoziatives Lernen von Schmerz-Erleichterung bei Taufliegen Taufliegen entwickeln zwei unterschiedliche Arten von Gedächtnissen basierend auf Erfahrung mit Elektro-Schock: Düfte, die während des Trainings dem Schock vorausgehen, werden als Bestrafungssignale gelernt und deshalb vermieden. Düfte, die während des Trainings auf den Schock folgen, werden als Erleichterungssignale gelernt und deshalb bevorzugt. Ich beschäftige mich mit der zweiten Art dieses assoziativen Lernens, das ich als „Erleichterungslernen“ bezeichne. Ich beginne mit einer detaillierten parametrischen Analyse des Erleichterungslernens. Die Reproduzierbarkeit, sowie die Einflüsse des Geschlechts, der Anzahl an Trainingswiederholungen, der Duftintensität, der Duftkonzentration und der Schockintensität werden geprüft. Ich teste, wie das Erleichterungsgedächtnis, nachdem es gebildet wurde, wieder gelöscht wird. Des Weiteren gehe ich zwei wichtigen Fragen zu den psychologischen Mechanismen des Erleichterungslernen nach: Zum einen zeige ich, dass das Erleichterungslernen echtes assoziativ konditioniertes Annäherungsverhalten etabliert. Zum anderen zeige ich, dass vorausgegangenes Kontext-Schock Training das folgende Erleichterungslernen nicht beeinflusst. Das Erleichterungslernen wird also nicht durch Kontextassoziation vermittelt. Diese Ergebnisse erlauben die folgende neurobiologische Analyse des Erleichterungslernens. Außerdem werden sie in Zukunft als Grundlage für ein mathematisches Modell des Erleichterungslernens dienen. Schließlich werden die Forscher/innen, die das Erleichterungslernen in anderen experimentellen Systemen untersuchen, von diesen parametrischen Erkenntnissen profitieren. In einer neurobiologischen Analyse des Erleichterungslernens zeige ich, dass der Verlust der Funktion des sogenannten white Gens die beiden unterschiedlichen Arten von Schock-Induziertem Lernen zusammenhängend beeinflusst: Das Bestrafungslernen wird verstärkt und das Erleichterungslernen wird abgeschwächt. Auf Grund dieses Ergebnisses schlagen ich vor, dass sich diese zwei Arten von Lernen in einem Gleichgewicht befinden sollen, welches vom white Gen beeinflusst wird. Die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen eines solchen Gleichgewichts sind noch nicht bekannt. Schließlich vergleiche ich das Erleichterungslernen mit dem Belohnungslernen und dem Bestrafungslernen. Ich zeige, dass das Erleichterungslernen anders ist als beide: Bestrafung und Belohnung werden entsprechend von Dopamin und Octopamin vermittelt. Für das Erleichterungslernen sind beide diese biogenen Aminen unnötig. Ebenso finde ich beim Erleichterungslernen keinen Beleg für die Rolle von zwei weiteren Aminen: Tyramin und Serotonin. Aufgrund dieser Ergebnisse schlage ich vor weitere Forschungsrichtungen. KW - Lernen KW - Drosophila KW - Neurogenetik KW - Lernverhalten KW - olfaktorik KW - sehen KW - erleichterungslernen KW - associative learning KW - drosophila KW - neurogenetic analyses KW - behavioural analyses KW - relief Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-28741 ER - TY - THES A1 - Löwe, Tobias T1 - Untersuchung von gene-drive-Strategien als neue Interventionsstrategien zur Eindämmung der Malaria T1 - A refined genome engineering strategy against parasites and vectors: an application for malaria control N2 - In der vorliegenden Arbeit haben wir unter Nutzung bioinformatischer Methoden eine innovative Strategie zur Eindämmung der Malaria entwickelt. Die genetische Modifikationsstrategie beinhaltet sowohl Manipulationen aufseiten des gefährlichsten Erregers, Plasmodium falciparum, als auch des Hauptvektors, Anopheles gambiae. In den Genomen beider Spezies wurden eine Reihe neuer konkreter targets identifiziert. Auch bereits beschriebene targets und Ansätze wurden in die Strategie einbezogen bzw. weiter ausgestaltet. Bezüglich der Vektormoskitos wird die Verbreitung eines gegenüber Plasmodien resistenten Genotyps angestrebt. Es werden einerseits effiziente natürliche und künstliche Resistenzgene diskutiert und andererseits eine bekannte Strategie zur Fixierung natürlicher Resistenzallele in natürlichen Populationen verbessert. Auf der Seite der Plasmodien erweiterten wir einen bereits von A. Burt (2003) beschriebenen Eradikationsansatz um weitere targets. Aus ethischen und evolutionsbiologischen Erwägungen bevorzugen wir jedoch eine alternative Strategie, welche die Etablierung von in ihrer Virulenz gemilderten Parasiten zum Ziel hat. Der attenuierte Genotyp wird unter anderem durch komplexe Pathway-Remodellierungen beschrieben (Löwe, Sauerborn, Schirmer, Dandekar, A refined genome engineering strategy against parasites and vectors, Manuskript beim Journal „Genome Biology“ eingereicht). Da sich Mutanten in der Natur gegen Wildtyp-Organismen kaum durchsetzen können, werden zwei drive-Systeme beschrieben, welche für die Implementierung der genetischen Manipulationsstrategie entwickelt wurden. Beide Konstrukte wurden zur Patentierung angemeldet (Patentanmeldung U30010 DPMA bzw. Aktenzeichen 102006029354.1). Zusätzlich zur deutschen wurde für eines der beiden Konstrukte eine PCT-Anmeldung eingereicht, welche in Zukunft einen internationalen Patentschutz ermöglichen soll. Es werden Kalkulationen vorgelegt, welche die Verbreitungstendenzen der Konstrukte in natürlichen Populationen vorhersagen. Die Beschreibung der entwickelten Konstrukte beschränkt sich nicht auf das primäre Anwendungsgebiet der Arbeit (Malaria), sondern beinhaltet auch andere Anwendungsgebiete, vor allem im Bereich der Medizin und Molekularbiologie. N2 - Background: Gene drive strategies are an important alternative to control tropical diseases such as malaria. Results: Here we introduce a new gene drive strategy based on gene conversion constructs. We identify a gene drive strategy both for plasmodia and for anopheles including design of an inducible modification vector. Our constructs are based on group II introns or homing endonuclease genes. They include besides the intron to modify vector or parasite genome sites inducible promoters for gene activation. We thus separate gene modification from activation of the modified gene. Moreover, we provide a detailed list of suitable targets in vector and plasmodia for the modification strategy. Finally, we discuss the control effect of an eradication strategy versus a mild strategy of the gene construct for vector and parasite populations. Conclusions: A new eukaryotic vector and parasite control strategy using gene drive systems is presented and discussed. KW - Malaria tropica KW - Malaria KW - Gentechnologie KW - Malariamücke KW - Anopheles gambiae KW - Plasmodium KW - Plasmodium falciparum KW - Containment KW - malaria KW - disease control KW - population engineering KW - siRNA KW - evolution Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-28750 ER - TY - THES A1 - Shishkova, Yoana T1 - Investigations of Measles virus regulation on activation and function of antigen presenting cells T1 - Untersuchungen zur Regulation der Aktivierung und Funktion antigen-präsentiernder Zellen durch Masernvirus N2 - Interaction with dendritic cells (DCs) is considered as central to immunosuppression induced by viruses, including measles virus (MV). Commonly, viral infection of DCs abrogates their ability to promote T cell expansion, yet underlying mechanisms at a cellular level are undefined. It appears that MV-WTF infection modulate DCs morphology and dynamic adhesion on extra cellular matrix proteins such as FN or ICAM-1. By morphological criteria, WTF-DCs resembled LPS-DCs, associated with their mature phenotype also adhered less efficiently to the FN or ICAM-1 support. Reduced adhesion could not be explained by a lack of 1-integrin expression or activation. Similarly, MV-DCs strongly resembled LPS-DCs in that levels of focal adhesion kinase phosphorylated at Y397 were high and not further enhanced upon FN ligation. Fascin, a downstream effector of integrin signaling was highly upregulated in LPS-DCs and moderately in WTF-DCs, and differences in its subcellular distribution were not observed between both cell cultures. Apparently, however, fascin associated less efficiently with PKC in WTF-DCs then in LPS-DCs. In line with findings for murine DCs, high motility of mature human DCs was found to require expression of Rac-GTPases. Human LPS-DCs and more so, DC transfected to express constitutively active Rac1 were the most motile DC-species analysed, confirming that migration of human DC also involved Rac activity. The velocity of WTF-DCs on FN is below that of LPS-DCs, indicating that maturation induced by WTF may be insufficient to completely promote integrin signaling which leads to Rac activation. The organisation of MV-DC/T cell interfaces was consistent with that of functional immune synapses with regard to CD3 clustering, MHC class II surface recruitment and MTOC location. These analyses are based in the selection of stable conjugates. Subsequently, however, neither contacts nor calcium flux can be stabilised and sustained in the majority of MV-DC/T cell conjugates and only promoted abortive T cell activation. Formation of spatially organised IS in T cells requites, prolonged contact durations. Therefore, aberrant distribution patterns of CD3 in these structures, if occurring, are not likely to contribute to the type of contacts predominating for WTF-DC/T cell interactions. It is also likely that transient interactions of less than 2 minutes may if at all, not efficiently support viral transmission to T cells. Transient interactions are typically observed with immature DCs in the absence of antigen, but this is not likely to be relevant in our allogenic system, which includes SA-loaded WTF-DCs. Thus, MV-infected DCs retain activities required for initiating, but not sustaining T cell conjugation and activation. This is partially rescued if surface expression of the MV glycoproteins on DCs is abolished by infection with a recombinant MV encoding VSV G protein instead, indicating that these contribute directly to synapse destabilisation and thereby act as effectors of T cell inhibition. N2 - Die Interaktion mit Dentritischen Zellen (DCs) wird für die Immunsuppression, welche durch Viren einschließlich des Masernvirus (MV) hervorgerufen wird, als ein zentraler Mechanismus angesehen. Für gewöhnlich unterdrücken virale Infektionen von DCs deren Fähigkeit, die T-Zell Expansion zu vermitteln. Dies geschieht durch einen Mechanismus, welcher bisher nicht auf zellulärer Ebene definiert ist. Es scheint, dass eine MV-WTF Infektion die Morphologie der DCs und deren dynamische Adhäsion an extrazellulären Matrixproteinen wie FN oder ICAM-1 moduliert. Unter morphologischen Gesichtspunkten ähneln WTF-DCs den LPS-DCs. Entsprechend ihrem reifen Phänotyp adherieren erstgenannte ebenfalls weniger effektiv unter Einwirkung von FN und ICAM-1. Die reduzierte Adhäsion konnte nicht durch das Fehlen von ß1-Integrin Expression oder Aktivierung erklärt werden. Analog glichen MV-DCs den LPS-DCs in der Hinsicht sehr, dass deren Expressionslevel von Y397 phosphorylierter Fokaler-Adhäsions-Kinase hoch war und durch FN Ligation nicht weiter anstieg. Fascin, ein downstream Effektor des Integrin- Signalwegs, wurde in LPS-DCs stark und in WTF-DCs moderat hochreguliert. Differenzen in der subzellulären Verteilung des Fascin wurden zwischen den beiden Zellkulturen nicht beobachtet. Allerdings assoziierte Fascin in WTF-DCs weniger effizient mit PKCα, als in LPS-DCs. In Übereinstimmung mit Befunden bei murinen DCs wurde herausgefunden, dass eine hohe Motilität reifer humaner DCs die Expression von Rac-GTPasen voraussetzt. Humane LPS-DCs und mehr noch transfizierte DCs, welche konsitutiv aktive Rac1-GTPase exprimieren, waren die mobilsten unter den analysierten DC Typen. Dies bestätigt, dass die Migration humaner DCs unter Anderem von der Rac-Aktivität abhängt. Die Geschwindigkeit von WTF-DCs auf FN ist niedriger, als die von LPS-DCs, was darauf hinweist, dass die durch WTF induzierte Reifung unzureichend sein könnte, um die Integrin-Signalgebung auszulösen, welche zur Rac Aktivierung führt. Die Ausbildung der MV-DC / T-Zell-Verbindungen stimmte mit der einer funktionalen immunologischen Synapse in Hinsicht auf die Formung von CD3 Clustern, die Oberflächenrekrutierung von MHC-II-Molekülen und der MTOC-Lokalisierung überein. Diese Befunde fußen allerdings auf der Selektion stabiler Konjugate. Dagegen konnten bei der Mehrzahl der MV-DC / T-Zell-Konjugate weder Kontakte noch Calcium-Influx stabilisiert und aufrechterhalten und nur eine unvollständige T-Zell-Aktivierung hervorrufen werden. Die Ausbildung räumlich organisierter Synapsen in T-Zellen setzt länger anhaltende Kontakte voraus. Das abweichende Verteilungsmuster von CD3 in diesen Strukturen steuert deshalb, soweit vorhanden, wohl nicht zu der Art von Kontakten bei, welche die WTF-DC / T-Zell-Interaktion dominieren. Es ist außerdem wahrscheinlich, dass transiente Interaktionen von weniger als zwei Minuten die virale Transmission zu T-Zellen, wenn überhaupt, nicht effizient unterstützen. Transiente Interaktionen werden typischer Weise bei unreifen DCs in der Abwesenheit von Antigen beobachtet, doch dies ist wahrscheinlich nicht relevant in dem hier verwendeten allogenen System, welches SA-geladene WTF-DCs verwendet. MV-infizierte DCs besitzen folglich die Eigenschaften, welche für die Initialisierung, aber nicht solche die für die Aufrechterhaltung der T-Zellkonjugation und Aktivierung der T-Zellen nötig sind. Dieses Unvermögen wird teilweise kompensiert, wenn die Oberflächenexpression von MV Glykoproteinen auf DCs durch die Infektion mit rekombinatem MV, welches das VSV G Protein kodiert, verhindert wird. Aus diesem Befund kann man schließen, dass die MV Glykoproteine direkt zur Destabilisierung der Synapse beitragen und deshalb als Effektoren der T-Zell Inhibition agieren. KW - Masern KW - Dendritische Zelle KW - Priming KW - Zellkonjugation KW - Interaction KW - dendritic cells Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-28283 ER - TY - THES A1 - Schmid, Ursula T1 - Protection against oxidative DNA damage by antioxidants, hormone-receptor blockers and HMG-CoA-reductase inhibitors T1 - Schutz vor oxidativen DNA-Schäden durch Antioxidantien, Hormonrezeptorantagonisten und HMG-CoA-Reduktase-Inhibitoren N2 - In the course of this study, several endogenous compounds and model substances were used to mimic the conditions in patients suffering from hypertension. As endogenous compounds, angiotensin II and aldosterone were chosen. As model substances, 4-nitroquinoline-1-oxide (NQO), hydrogen peroxide and phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) were selected. Benfotiamine as well as α-tocopherol proved in the course of the experiments to be able to prevent angiotensin II-induced formation of oxidative DNA strand breaks and micronuclei. This could be due to a prior inhibition of the release of reactive oxygen species and is in contrast to results which were achieved using thiamine. Furthermore, experiments in which cells were pre-incubated with benfotiamine followed by incubation with NQO showed that benfotiamine was not able to prevent the induction of oxidative stress. The hypothesis that benfotiamine has, like α-tocopherol, direct antioxidative capacity was fortified by measurements in cell free systems. In brief, a new working mechanism for benfotiamine in addition to the ones already known could be provided. In the second part of the study, angiotensin II was shown to be dose-dependently genotoxic. This effect is mediated via the angiotensin II type 1 receptor (AT1R) which. Further experiments were extended from in vitro settings to the isolated perfused kidney. Here it could be shown that angiotensin II caused vasoconstriction and DNA strand breaks. Co-perfusion of kidneys with angiotensin II and candesartan prevented vasoconstriction and formation of strand breaks. DNA strand break formation due to mechanical stress or hypoxia could be ruled out after additional experiments with the thromboxane mimetic U 46619. Detailed investigation of the DNA damage in vitro revealed that angiotensin II induces single strand breaks, double strand breaks and 8-hydroxydeoxyguanosine (8-oxodG)-adducts as well as abasic sites. Investigations of the effects of aldosterone-treatment in kidney cells showed an increase of oxidative stress, DNA strand breaks and micronuclei which could be prevented by the steroidal mineralocorticoid receptor antagonist eplerenone. Additional experiments with the non-steroidal mineralocorticoid receptor antagonist (S)-BR-4628 revealed that this substance was also able to prevent oxidative stress and genomic damage and proved to be more potent than eplerenone. In vivo, hyperaldosteronism was imitated in rats by aid of the deoxycorticosteroneacetate (DOCA) salt model. After this treatment, levels of DNA strand breaks and chromosomal aberrations in the kidney could be observed. Furthermore, an increase in the release of ROS could be measured. Treatment of these animals with spironolactone , BR-4628 and enalaprile revealed that all antagonists were effective BR-4628 was the most potent drug. Finally, rosuvastatin was investigated. In HL-60 cells phorbol 12-myristate 13-acetate caused oxidative stress. Rosuvastatin was able to prevent the release of ROS and subsequent oxidative DNA damage when co-incubated with PMA. Furthermore, not only an inhibition of PMA-induced oxidative stress but also inhibition of the unspecific release of ROS induced by hydrogen peroxide was observable. Addition of farnesyl pyrophosphate (FPP), geranylgeranyl pyrophosphate (GGPP), and mevalonate, intermediates of the cholesterol pathway, caused only a marginal increase of oxidative stress in cells treated simultaneously with PMA and rosuvastatin, thus indicating the effect of rosuvastatin to be HMG-CoA-reductase-independent. Investigation of the gene expression of subunits of NAD(P)H oxidase revealed a down-regulation of p67phox following rosuvastatin-treatment. Furthermore, it could be shown that rosuvastatin treatment alone or in combination with PMA increased total glutathione levels probably due to an induction of the gene expression and enzyme activity of γ-glutamylcysteine synthetase (γ-GCS). N2 - Im Zuge dieser Studie wurden sowohl endogene Substanzen als auch Modellsubstanzen eingesetzt, um die pathologischen Verhältnisse in Patienten, die an Bluthochdruck leiden, zu imitieren. Als endogene Substanzen wurden Angiotensin II und Aldosteron ausgewählt. Als Modellsubstanzen wurden 4-Nitrochinolin-1-oxid (NQO), Wasserstoffperoxid und Phorbol-12-myristat-13-gewählt. Der erste Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit zwei Vitaminen, nämlich Benfotiamin und α-Tocopherol. Sowohl Benfotiamin als auch α-Tocopherol zeigten im Laufe der Experimente, dass sie in der Lage sind, durch Angiotensin II verursachte DNA-Strangbrüche und chromosomale Aberrationen zu verhindern. Dies ist möglicherweise auf eine ebenfalls beobachtbare vorausgegangene Inhibition der Freisetzung reaktiver Sauerstoffspezies zurückzuführen. Zusammenfassend konnte ein neuer Wirkmechanismus für Benfotiamin vorgestellt werden. Im zweiten Teil dieser Studie konnte nachgewiesen werden, dass Angiotensin II eine dosisabhängige Gentoxizität verursacht. Dieser Effekt wird durch den Angiotensin II-Rezeptor Typ 1 vermittelt. Im weiteren Verlauf der Studie wurden die in vitro Experimente auf das Modell der isolierten perfundierten Mäuseniere ausgeweitet. Hier konnte gezeigt werden, dass Angiotensin II Vasokonstriktion und DNA-Strangbrüche verursacht. Co-Perfusion der Nieren mit Angiotensin II und Candesartan verhinderte hingegen die Vasokonstriktion und die Bildung von DNA-Strangbrüchen. Die Verursachung von Strangbrüchen durch mechanischen Stress oder Hypoxie konnte ausgeschlossen werden. Die Untersuchung der ex vivo beobachteten DNA-Schäden in vitro ließ erkennen, dass Angiotensin II Einzelstrangbrüche, Doppelstrangbrüche, die Bildung des DNA-Addukts 8-OxodG und abasische Stellen induziert. Ein Reparatur-Comet Assay, parallel durchgeführt mit der Messung des phosphorylierten Histons 2AX (γ-H2AX) über 24 h, zeigte eine vollständige Reparatur der Einzelstrangbrüche, wohingegen die Zahl der Doppelstrangbrüche in diesem Zeitraum sogar zunahm. Untersuchungen der Effekte, die eine Aldosteron-Behandlung auf Nierenzellen hat, zeigten einen Anstieg des oxidativen Stress, der DNA Strangbrüche und der Mikrokerne. Diese Effekte konnten durch Eplerenon verhindert werden. Weitere Experimente mit dem nicht-steroidalen Mineralocorticoid Rezeptor-Antagonisten (S)-BR-4628 zeigten, dass auch diese Substanz oxidativen Stress und DNA Schäden verhindern konnte, im Gegensatz hierzu hatte das (R)-Isomer, das keine Aktivität am Mineralocorticoid Rezeptor zeigt, keine präventiven Effekte. In vivo wurde der Hyperaldosteronismus mit Hilfe des Deoxycorticosteronacetat- (DOCA) Salzmodells nachgeahmt. Unter dieser Behandlung konnten Level an DNA-Strangbrüchen und chromosomalen Aberrationen beobachtet werden. Des Weiteren konnten in den DOCA-Tieren erhöhte Level an oxidativem Stress gemessen werden. Wurden die Versuchstiere zusätzlich zur DOCA-Behandlung mit Spironolacton, BR-4628 und dem Enalapril behandelt, konnte gezeigt werden, dass BR-4628 potenter war als Spironolacton Enalapril. Zuletzt wurde mit Rosuvastatin eine Substanz untersucht, die die antioxidative Abwehr der Zellen aktivieren kann. In der humanen Leukämie-Zelllinie HL-60 verursachte Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) oxidativen Stress. Rosuvastatin war in der Lage, die Freisetzung von ROS und daraus resultierende DNA-Strangbrüche bei Co-Inkubation mit PMA zu verhindern. Außerdem konnte gezeigt werden, dass Rosuvastatin nicht nur PMA-induzierten oxidativen Stress, sondern auch die unspezifische Wasserstoffperoxid-induzierte Freisetzung von ROS verhinderte. Die Untersuchung der Genexpression von Untereinheiten der NAD(P)H Oxidase ergab, dass p67phox nach Rosuvastatin-Behandlung herabreguliert wurde. Behandlung mit Rosuvastatin allein oder zusammen mit PMA konnte außerdem die Glutathion-Spiegel erhöhen. Dies ist vermutlich auf die Induktion der Genexpression und der Enzymaktivität der γ-Glutamylcystein-Synthetase (γ-GCS), des Schrittmacherenzyms des Glutathionsystems, zurückzuführen. KW - Oxidativer Stress KW - Angiotensin II KW - Angiotensin-II-Blocker KW - Aldosteron KW - Aldosteronantagonist KW - Renin-Angiotensin-System KW - Benfotiamin KW - Statin KW - Di KW - DNA-Schaden KW - Mikrokerne KW - Comet Assay KW - DNA damage KW - Micronuclei KW - Comet Assay Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-28379 ER - TY - THES A1 - Teutschbein, Janka T1 - Identifizierung und Charakterisierung von Genen und Proteinen in der Xmrk-induzierten Entwicklung von Melanomen T1 - Identification and characterization of genes and proteins in Xmrk-induced melanomagenesis N2 - Melanome stellen die gefährlichste Form von Hautkrebs mit der höchsten Mortalitätsrate dar. Der Transformation normaler Melanozyten zu malignen Melanomen liegen komplexe molekulare und biochemische Veränderungen zu Grunde. Im Xiphophorus-Melanom-Modell ist die onkogene Rezeptortyrosinkinase "Xiphophorus melanoma receptor kinase" (Xmrk) der alleinige Auslöser der Melanominitiation und -progression. Die Aufklärung der Xmrk-vermittelten Signaltransduktion kann zum besseren Verständnis von Ereignissen, die auch bei der humanen Melanomentwicklung eine Rolle spielen, beitragen. In der vorliegenden Arbeit wurde mit Hilfe der Microarray-Technologie die Regulation der Genexpression durch Xmrk analysiert. Zu den nach Rezeptoraktivierung am stärksten herabregulierten Genen gehörten "son of sevenless homolog 1" (Sos1) und "ubiquitin-conjugating enzyme E2I" (Ube2i); stark hochreguliert waren "early growth response 1" (Egr1), "cysteine-rich protein 61" (Cyr61), "dual-specificity phosphatase 4" (Dusp4), "fos-like antigen 1" (Fosl1), "epithelial membrane protein" (Emp1), Osteopontin (Opn), "insulin-like growth factor binding protein 3" (Igfbp3) und "tumor-associated antigen L6" (Taal6). Die für die Regulation dieser Gene verantwortlichen Signalwege wurden durch die Anwendung von niedermolekularen Inhibitoren und siRNA identifiziert, wobei für die SRC-Kinase FYN eine zentrale Bedeutung bei der Xmrk-abhängigen Regulation der Genexpression festgestellt wurde. Darüber hinaus wurde die Expression der Gene in humanen Melanomzelllinien im Vergleich zu normalen humanen Melanozyten untersucht. Als besonders vielversprechende Kandidaten stellten sich dabei DUSP4 und TAAL6 heraus, deren Rolle in der humanen Melanominduktion und -progression Gegenstand zukünftiger Studien sein wird. In einem anderen Ansatz zur Aufklärung des Signalnetzwerkes sollten Zielproteine von Xmrk durch Protein-Protein-Interaktionsstudien mit Hilfe des Split-Ubiquitin-Systems ermittelt werden. Aufgrund ungünstiger Expressions- oder Faltungseigenschaften von Xmrk in diesem System war es aber nicht möglich, den Rezeptor als Köderprotein einzusetzen. Das für die Xmrk-vermittelte Melanomentstehung zentrale Protein FYN konnte jedoch als Köder etabliert und seine Wechselwirkung mit der Tyrosinkinase FAK analysiert werden. Es wurde gezeigt, dass der phosphorylierte Tyrosinrest an Position 397 von FAK für die Interaktion einer N-terminal trunkierten FAK-Variante mit FYN notwendig ist und dass diese Phosphorylierung in Hefe gewährleistet zu sein scheint. Die Suche nach neuen Interaktionspartnern von FYN mittels der Split-Ubiquitin-Technologie könnte Einblicke in weitere FYN-abhängige Ereignisse bieten, die zur Aufklärung seiner zentralen Rolle bei der Tumorentstehung dienen könnte. N2 - Melanoma is the most aggressive type of skin cancer with the highest mortality rate. The transformation of melanocytes to malignant melanoma is based on complex molecular and biochemical alterations. In the Xiphophorus melanoma model, the oncogenic receptor tyrosine kinase Xiphophorus melanoma receptor kinase (Xmrk) is the sole trigger of melanoma initiation and progression. Elucidating Xmrk-dependent signaling pathways may contribute to a better understanding of processes that play a role in human melanomagenesis, too. Here, the regulation of gene expression by Xmrk was analyzed using a microarray approach. The genes with the strongest down-regulation in response to receptor activation included son of sevenless homolog 1 (Sos1) and ubiquitin-conjugating enzyme E2I (Ube2i), whereas early growth response 1 (Egr1), cysteine-rich protein 61 (Cyr61), dual-specificity phosphatase 4 (Dusp4), fos-like antigen 1 (Fosl1), epithelial membrane protein (Emp1), Osteopontin (Opn), insulin-like growth factor binding protein 3 (Igfbp3), and tumor-associated antigen L6 (Taal6) were strongly up-regulated. The pathways regulating expression of these genes were identified by applying small molecule inhibitors and siRNA. Interestingly, the SRC-family kinase FYN was found to be a key-player in Xmrk-dependent gene regulation. Furthermore, expression of the genes in human melanoma cell lines compared to normal human melanocytes was investigated. The most promising candidates, which might be important for melanoma induction and progression, were DUSP4 and TAAL6. Their potential suitability as diagnostic and prognostic melanoma markers will be addressed in future studies. In addition to gene expression analysis, protein-protein interactions were to be assayed by the split-ubiquitin-system in order to identify novel Xmrk targets. Unfortunately, inappropriate expression or folding of the receptor in this system precluded it from working as bait. However, the FYN protein, which has a central role in Xmrk-mediated signaling, was established as bait and its association with FAK was analyzed in more detail. A phosphorylated tyrosine residue at position 397 of FAK was demonstrated to be necessary for the interaction of an N-terminally truncated FAK variant with FYN, and this phosphorylation event seems to be feasible in yeast. In future, a split-ubiquitin based screen for novel interaction partners of FYN might provide insights into FYN-dependent processes and help to understand its central role in tumor development. KW - Melanom KW - Schwertkärpfling KW - Microarray KW - Onkogen KW - Epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor KW - Yeast-Two-Hybrid-System KW - Xiphophorus KW - Rezeptortyrosinkinase KW - Xmrk KW - Protein-Protein-Interaktion KW - Split-Ubiquitin-System KW - Microarray KW - EGFR KW - oncogene KW - melanoma KW - protein-protein interaction Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27516 ER - TY - THES A1 - Pfenning, Brenda T1 - Seasonal life-history adaptation in the water strider GERRIS LACUSTRIS T1 - Anpassung der Lebenslaufstrategie an saisonalen Umwelten beim Gemeinen Wasserläufer Gerris lacustris N2 - Insects living in temperate latitudes need to adjust their life-history to a seasonally variable environment. Reproduction, growth, and development have to be completed within the limited period where environmental conditions are favourable while climatically adverse conditions have to be spent in a state of diapause. Consequently, questions how individuals adapt their life-history to seasonality and which mechanisms underlie the responses to seasonal cues, like photoperiod, are important issues in the study of life-history strategies. This thesis focuses on the life-history adaptation to seasonality in the wing-dimorphic common pond skater Gerris lacustris L. (Heteroptera: Gerridae). Using a combination of field and laboratory studies as well as mathematical modelling, it is adressed how variation in the availability of thermal energy impacts on various aspects of larval development such as accumulated thermal energy (i.e. physiological development time), developmental pathway (direct reproduction vs. diapause) and wing dimorphism. N2 - Insekten in temperierten Breiten müssen ihre Lebenslaufstrategie an eine saisonale Umwelt anpassen. Reproduktion, Wachstum und Entwicklung können nur innerhalb der begrenzten Phase geeigneter Umweltbedingungen stattfinden, während klimatisch ungünstige Bedingungen in einem Stadium der Diapause überdauert werden müssen. Die Fragen, wie Individuen ihre Lebenslaufstrategie an Saisonalität anpassen und welche Mechanismen der Reaktion auf saisonale Umweltreize (insbesondere der Photoperiode) zugrunde liegen, sind daher zentrale Aspekte in der Erforschung von Lebenslaufstrategien. Diese Arbeit beschäftigt sich mit Anpassungen der Lebenslaufstrategie des flügeldimorphen Gemeinen Wasserläufers Gerris lacustris L. (Heteroptera: Gerridae) an Saisonaliät. Mit einer Kombination aus Feld- und Laborstudien sowie mathematischer Modellierung wird untersucht, wie Variationen in der Verfügbarkeit thermaler Energie auf verschiedene Aspekte der Larvalentwicklung - wie die akkumulierte thermale Energie (physiologische Entwicklungszeit), den Entwicklungsweg (direkte Reproduktion vs. Diapause) und den Flügeldimorphimus – Einfluss nehmen. KW - Wanzen KW - Temperatur KW - Habitat KW - Entwicklung KW - Gerridae KW - Lebenslaufstrategie KW - Voltinismus KW - Flügeldimorphismus KW - thermale Energie KW - Gerridae KW - life history strategy KW - voltinism KW - wing dimorphism KW - thermal energy Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27900 ER - TY - THES A1 - Nieratschker, Vanessa T1 - Charakterisierung der Serin-/Threonin-Proteinkinase SRPK3 in Drosophila melanogaster und Phosphorylierungsstudien an Synapsin T1 - Characterization of the serine-/threonine protein kinase SRPK3 in Drosophila melanogaster and phosphorylation studies on synapsin N2 - In einer vorangegangenen Arbeit konnte eine hypomorphe Mutation innerhalb des Genlokus einer putativen Serin-/Threonin-Kinase als Auslöser der Aggregatbildung des Aktive-Zone- Proteins Bruchpilot in larvalen Motoneuronaxonen identifiziert werden (Nieratschker, 2004). Aufgrund der Homologien dieser Kinase zu SR-Proteinkinasen wurde der Name Serin- /Threonin-Proteinkinase 3 (SRPK3) vorgeschlagen. Laut ursprünglicher Annotation der „Flybase“ (http://flybase.bio.indiana.edu) codiert der Genlokus der Srpk3, der auf dem linken Arm des dritten Chromosoms innerhalb der Region 79D4 lokalisiert ist und sich über ca. 10,3 kb erstreckt, für zwei Transkripte (Srpk3-RC und Srpk3-RB). Diese beiden Transkripte haben unterschiedliche Transkriptions- und Translationsstartpunkte und unterscheiden sich in ihrem ersten kodierenden Exon, ab dem vierten Exon sind sie allerdings identisch. Das Srpk3-RCTranskript umfasst ca. 4,2 kb, das Srpk3-RB-Transkript ca. 3,8 kb. Die von diesen Transkripten kodierten Proteine bestehen aus 816 (Srpk3-RC) bzw. 749 (Srpk3-RB) Aminosäuren. Diese beiden ursprünglich annotierten Transkripte konnten durch RT-PCR-Experimente bestätigt werden. Dabei wurde auch ein zusätzliches, alternativ gespleißtes Exon von 159 bp entdeckt, das beiden Transkripten zugeordnet werden kann. Somit codiert der Srpk3-Genlokus für mindestens vier Transkripte, die Transkripte der RC/RF-Transkriptgruppe mit (Srpk3-RF) und ohne (Srpk3-RC) das alternativ gespleißte Exon und die Transkripte der RB/RETranskriptgruppe mit (Srpk3-RE) und ohne (Srpk3-RB) das alternativ gespleißte Exon. Die Existenz eines weiteren Transkriptes Srpk3-RD, die in der aktuellen Version der „Flybase“ annotiert ist, konnte durch RT-PCR-Experimente nicht nachgewiesen werden. Zu Beginn dieser Arbeit lag eine hypomorphe Mutante für die SRPK3 schon vor (Srpk3P1; Eberle, 1995). Diese Linie trägt eine P-Elementinsertion innerhalb des ersten Exons der RC/RF-Transkriptgruppe, die das Leseraster dieser Transkriptgruppe zerstört, so dass in dieser Linie nur die RB/RE-Transkriptgruppe gebildet werden kann. Wie bereits erwähnt, konnte diese Mutation in vorangegangenen Arbeiten bereits als der Auslöser der Aggregatbildung des Bruchpilot-Proteins in larvalen Motoneuronaxone, sowie einiger Verhaltensdefekte identifiziert werden (Nieratschker, 2004; Bock 2006). Diese Verhaltensdefekte ähneln stark denen, die durch einen knock-down der Bruchpilot-Expression mittels RNAi ausgelöst werden (Wagh et al., 2006; Bock, 2006), was auf eine Interaktion beider Proteine schließen lässt. Um nun den Beweis führen zu können, dass tatsächlich diese Mutation die beobachteten Phänotypen verursacht, wurden Rettungsversuche durchgeführt. Die Srpk3-RF-cDNA war dabei in der Lage die durch die hypomorphe Mutation der SRPK3 verursachten Phänotypen vollständig, oder zumindest teilweise zu retten (vgl. auch Bock, 2006; Bloch, 2007). Damit konnte belegt werden, dass die hypomorphe Mutation der SRPK3 tatsächlich die in der Mutante Srpk3P1 beobachteten Phänotypen verursacht. Um die durch in situ Hybridisierung erhaltenen Daten zur Lokalisation der SRPK3 im larvalen Gehirn (Nieratschker, 2004) bestätigen, sowie weitere Daten erhalten zu können, wurden Isoform-spezifische Antisera gegen die SRPK3 generiert. Diese Antiseren sind in der Lage überexprimiertes Protein zu detektieren (Bloch, 2007), allerdings ist es mit diesen Antiseren nicht möglich die SRPK3 in wildtypischen Präparaten nachzuweisen. Weitere Daten zur Lokalisation der SRPK3, die durch die Verwendung eines SRPK3-eGFPFusionsproteins erhalten wurden, zeigten, dass eine der ektopisch überexprimierten SRPK3- Isoformen mit Bruchpilot an der Aktiven Zone kolokalisiert. Dieses Ergebnis, in Verbindung mit den durch die Mutation der SRPK3 verursachten Bruchpilot-Aggregaten in larvalen Motoneuronaxonen und den Verhaltensdefekten, gibt Hinweise auf eine mögliche direkte Interaktion beider Proteine…. N2 - In a previous study, a hypomorphic mutation in the gene locus of a putative serine-/threonine kinase was found to cause aggregates of the active zone protein Bruchpilot in larval motoneuron axons (Nieratschker, 2004). Because of its high homology to SR-protein kinases this gene was named serine-/threonine protein kinase 3 (Srpk3). The 10,3 kb large Srpk3 gene locus is located on the left arm of the third chromosome in the chromosomal region 79D4. According to an earlier annotation in “flybase” (http://flybase.bio.indiana.edu) the Srpk3 gene codes for two transcripts of 4,2 (Srpk3-RC) and 3,8 kb (Srpk3-RB). These two transcripts use different transcription and translation start sites, but from the fourth exon on they are identical. The Srpk3-RC and Srpk3-RB transcripts code for proteins of 816 and 749 amino acids respectively. The existence of these two originally annotated transcripts could be verified by RT-PCR. In addition, an alternatively spliced exon of 159 bp was identified, which is part of both groups of transcripts (Srpk3-RF and Srpk3-RE). Therefore the Srpk3 gene locus codes for at least four transcripts. Srpk3-RB and Srpk3-RC do not contain the newly identified, alternatively spliced exon, whereas Srpk3-RF and Srpk3-RE do. The existence of another transcript (Srpk3- RD) annotated in the current version of “flybase” could not be confirmed by RT-PCR experiments. The hypomorphic BRPK mutant Srpk3P1, which has a P-element insertion in the first exon of the RC/RF group of transcripts that destroys the open reading frame of those isoforms, already existed (Eberle, 1995). Therefore in that line only the RB/RE isoforms are expressed. That hypomorphic mutation was found to cause Bruchpilot aggregates in larval motoneuron axons (Nieratschker, 2004) and in addition several behavioral deficits (Bock, 2006). The behavioral deficits are similar to those caused by a genetic knock-down of the Bruchpilot expression using RNAi (Wagh et al., 2006; Bock, 2006). This observation points towards an exclusive interaction of both proteins. To prove that in fact the mutation of the SRPK3 causes the observed phenotypes, rescue experiments were performed. We were able to revert the mutant phenotypes by expressing the Srpk3-RF cDNA in the nervous system (see also Bock, 2006; Bloch, 2007). Therefore mutation of the SRPK3 indeed causes the observed phenotypes in the hypomorphic BRPK mutant (Srpk3P1). To confirm the data obtained by in situ hybridization on larval brains (Nieratschker, 2004) and to gain more knowledge regarding the localization of the SRPK3, isoform specific antisera have been generated. These antisera recognize over-expressed protein (Bloch, 2007), but they are not able to recognize SRPK3 in wild type animals. Further data about localization of SRPK3 could be provided by using ectopically overexpressed GFP-tagged SRPK3 isoforms. SRPK3-GFP colocalizes with Bruchpilot at the presynaptic active zone. This result along with the Bruchpilot aggregates in larval motoneuron axons and the behavioral deficits of SRPK3 mutants provide further evidence for a possible interaction of both proteins. To investigate, if a complete loss of SRPK3 expression alters the phenotypes observed in the hypomorphic SRPK3 mutant, a SRPK3 null mutant was generated by jump-out mutagenesis. The phenotypic analyses performed with the hypomorphic line Srpk3P1were repeated with the SRPK3 null mutant. It became obvious that the phenotypes were not enhanced by complete loss of SRPK3 expression (also see Bloch, 2007). Regarding the Bruchpilot aggregates in larval motoneuron axons, no significant differences between hypomorphic mutant and null mutant were observed, however behavioral deficits seem to be more severe in the hypomorph (Bloch, 2007)….. KW - Drosophila melanogaster KW - SRPK KW - Bruchpilot KW - Synapsin KW - Neurobiologie KW - Drosophila melanogaster KW - SRPK KW - Bruchpilot KW - Synapsin KW - Neurobiologie KW - Drosophila melanogaster KW - SRPK KW - Bruchpilot KW - Synapsin KW - Neurobiology Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27806 ER - TY - THES A1 - Bucher, Daniel T1 - An Electrophysiological Analysis of Synaptic Transmission at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction T1 - Eine elektrophysiologische Untersuchung synaptische Transmission an der neuromuskulären Endplatte von Drosophila-Larven N2 - In this thesis, synaptic transmission was studied electrophysiologically at an invertebrate model synapse, the neuromuscular junction of the Drosophila 3rd instar wandering larvae. In the first part, synaptic function is characterized at the neuromuscular junction in fly lines which are null mutants for the synaptic proteins “the synapse associated protein of 47 kDa” (Sap-47156), Synapsin (Syn97), the corresponding double mutant (Sap-47156, Syn97), a null mutant for an as yet uncharacterized Drosophila SR protein kinase, the Serine-Arginine protein kinase 3 (SRPK3), and the Löchrig (Loe) mutant which shows a strong neurodegenerative phenotype. Intracellular voltage recordings from larval body wall muscles 6 and 7 were performed to measure amplitude and frequency of spontaneous single vesicle fusion events (miniature excitatory junction potentials or mEJPs). Evoked excitatory junction potentials (eEJPs) at different frequencies and calcium concentrations were also measured to see if synaptic transmission was altered in mutants which lacked these synaptic proteins. In addition, structure and morphology of presynaptic boutons at the larval neuromuscular junction were examined immunohistochemically using monoclonal antibodies against different synaptic vesicle proteins (SAP-47, CSP, and Synapsin) as well as the active zone protein Bruchpilot. Synaptic physiology and morphology was found to be similar in all null mutant lines. However, Löchrig mutants displayed an elongated bouton morphology, a significant shift towards larger events in mEJP amplitude frequency histograms, and increased synaptic facilitation during a 10 Hz tetanus. These deficits suggest that Loe mutants may have a defect in some aspect of synaptic vesicle recycling. The second part of this thesis involved the electrophysiological characterization of heterologously expressed light activated proteins at the Drosophila neuromuscular junction. Channelrhodopsin-2 (ChR2), a light gated ion channel, and a photoactivated adenylate cyclase (PAC) were expressed in larval motor neurons using the UAS-Gal4 system. Single EJPs could be recorded from muscles 15, 16, and 17 when larva expressing ChR2 were illuminated with short (100 ms) light pulses, whereas long light pulses (10 seconds) resulted in trains of EJPs with a frequency of around 25 Hz. Larva expressing PAC in preparations where motor neurons were cut from the ventral ganglion displayed a significant increase in mEJP frequency after a 1 minute exposure to blue light. Evoked responses in low (.2 mM) calcium were also significantly increased when PAC was stimulated with blue light. When motor nerves were left intact, PAC stimulation resulted in light evoked EJPs in muscles 6 and 7 in a manner consistent with RP3 motor neuron activity. ChR2 and PAC are therefore useful and reliable tools for manipulating neuronal activity in vivo. N2 - Thema dieser Arbeit war die elektrophysiologische Untersuchung synaptischer Transmission, untersucht an einer Modellsynapse in Invertebraten, der neuromuskulären Synapse von Drosophila- Larven des dritten Larvalstadiums. Im ersten Teil dieser Arbeit, wurde die synaptische Funktion an der neuromuskulären Synapse von Nullmutanten für verschiedene synaptische Proteine charakterisiert (das synapse associated protein of 47 kDa (Sap-47156), Synapsin (Syn97), eine bis dahin uncharakterisierte Drosophila SR-Proteinkinase (SRPK3), und eine Mutante mit einem starken neurodegenerativen Phänotyp (Loe)). Intrazelluläre Ableitungen wurden von Muskel 6 und 7 des Hautmuskelschlauches durchgeführt, um die Amplitude und Frequenz der spontanen Freisetzung von Neurotransmitter aus einzelnen synaptischen Vesikeln (miniature excitatory junction potentials oder mEJPs) zu messen. Außerdem wurden Evoked excitatory junction potentials (eEJPs) bei verschiedenen Frequenzen und verschiedenen Kalziumkonzentrationen gemessen, um zu erforschen, ob die synaptische Transmission in den genannten Mutanten verändert ist. Zusätzlich wurde die Struktur und die Morphology der präsynaptischen Boutons immunhistochemisch untersucht. Dabei wurden monoklonal Antikörper gegen verschiedene Proteine der synaptischen Vesikel (SAP-47, CSP und Synapsin) und gegen das Aktive Zone Protein Bruchpilot benutzt. Die synaptische Physiologie war in den genannten Nullmutanten für synaptische Proteine nicht verändert, im Vergleich zu den wildtypischen Kontrollen, während Löchrig-Mutanten Defekte der synaptischen Übertragung zeigten, die im Einklang standen mit einem Defekt des Recyclings synaptischer Vesikel. Der zweite Teil dieser Arbeit beinhaltet die elektrophysiologische Charakterisierung von heterolog exprimierten Licht-aktivierbaren Proteinen an der neuromuskulären Synapse von Drosophila. Channelrhodopsin-2 (ChR2), ein Licht gesteuerter Ionenkanal und eine Licht-aktivierbare Adenylatcyclase (PAC) wurden mit Hilfe des UAS-Gal4-Systems an der larvalen, neuromuskulären Synapse exprimiert. Wenn ChR2-exprimierende Larven mit kurzen (100ms) Lichtpulsen beleuchtet wurden, konnten einzelne EJPs von den Muskeln 15, 16 und 17 abgeleitet werden. Längere Lichtpulse (10 Sekunden) führten zu einer Serie von EJPs mit einer Frequenz von ca. 25 Hz. Larven, die PAC exprimierten zeigten, in Präparationen in denen die Motoneurone vom Ventralganglion gelöst wurden, nach einminütiger Belichtung mit Blaulicht einen signifikanten Anstieg der mEJP-Frequenz. Auch die EJPs waren in einer Umgebung mit geringer Kalziumkonzentration (0,2 mM) signifikant erhöht, wenn PAC durch Blaulicht stimuliert wurde. Wurden die Motoneurone intakt gelassen, führte die Stimulation der PAC durch Blaulicht zu EJPs in den Muskeln 6 und 7, die im Einklang standen mit RP3 Motoneuronaktivität. Beide Proteine (ChR2 und PAC) erwiesen sich daher als nützliche, zuverlässige Werkzeuge, um die neurale Aktivität in vivo zu manipulieren. KW - Drosophila KW - synapse KW - elektrophysiologie KW - Drosophila KW - synapse KW - electrophysiology Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27784 ER - TY - THES A1 - Geier, Katja T1 - Durchflusszytometrische Diagnostik bei Verdacht auf Nijmegen Breakage Syndrom T1 - Diagnostic in suspicion of Nijmegen breakage syndrome by flow cytometry N2 - Das Nijmegen Breakage Syndrom ist eine seltene autosomal- rezessive Erkrankung, die durch ein typisches Erscheinungsbild mit Mikrozephalie, Wachstumsretardierung, Immundefizienz sowie durch eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber ionisierender Strahlung und eine erhöhte Prädisposition gegenüber malignen Tumoren charakterisiert wird. Die Erkrankung wird durch Mutationen im NBS1-Gen verursacht, welches auf Chromosom 8q21 lokalisiert werden konnte. Das NBS1-Gen Produkt, Nibrin, ist Teil des MRE11-RAD50-Nibrin Proteinkomplexes, welcher eine zentrale Rolle bei der Erkennung und der Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen spielt. Das Fehlen von Nibrin führt zu einer fehlerhaften DNA-Reparatur und erklärt die verschiedenen klinischen und zellulären Symptome bei NBS-Patienten. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Daten von 40 Patienten ausgewertet, die im Rahmen der Verdachtsdiagnose eines Nijmegen Breakage Syndroms mit der Durchflusszytometrie untersucht wurden. Für die Unterscheidung zwischen NBS-positiven und NBS-negativen Fällen sind folgende Parameter von diagnostischer Relevanz: 1) der Anteil nichtproliferierender Zellen (G0/G1-Phase-Zelle), welcher bei NBS-Patienten meist deutlich höher sind als bei gesunden Kontrollen. Sie spiegeln bei erhöhten Werten die herabgesetzte Mitogenantwort wider. 2) die G2/GF-Ratio als Maß für Strahlensensitivität, welche bei NBS-Patienten charakteristischerweise erhöht ist. Die Auswertung der Daten erlaubte es in 22 Fällen die Verdachtsdiagnose NBS auszuschließen, da diese für beide Parameter Werte im Normalbereich zeigten. In 16 Fällen ergab sich ein positives Ergebnis mit erhöhtem Anteil nichtproliferierender Zellen und erhöhter Strahlensensitivität. Unter den positiven Fällen konnte bei 9 Patienten die Diagnose des Nijmegen Breakage Syndroms mittels Mutationsanalyse bestätigt werden. Bei 7 Patienten konnte jedoch trotz erhöhter Strahlensensitivität keine Mutation im NBS1-Gen nachgewiesen werden. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass die Durchflusszytometrie das Vorliegen einer erhöhten Strahlensensitivität eindeutig nachweisen kann. Eine erhöhte Strahlensensitivität ist wiederum ein charakteristisches Merkmal des Nijmegen Breakage Syndroms, da es in direkten Zusammenhang mit dem verursachenden Gendefekt steht. Die Durchflusszytometrie kann daher als ein sinnvolles diagnostisches Verfahren von hoher Sensitivität bei Patienten mit der Verdachtsdiagnose NBS angesehen und erfolgreich eingesetzt werden. Allerdings ist die Spezifität des Verfahrens sehr viel geringer. Die Methode der Wahl für die Primärdiagnostik des Nijmegen Breakage Syndroms wird in Zukunft daher die Mutationsanalyse sein. N2 - Nijmegen breakage syndrome is a rare autosomal recessive chromosomal instability disorder with hypersensitivity to ionizing radiation and an increased cancer risk. The clinical phenotype is characterized by congenital microcephaly, dysmorphic facial appearance, growth retardation and immunodeficiency. At the cellular level NBS is characterized with increased spontaneous and induced chromosomal breaks and cell cycle aberrations. NBS1, the gene defective in Nijmegen breakage syndrome, is located on chromosome 8q21 and has been cloned. The NBS1 gene codes for the protein nibrin which is a member of the MRE11-RAD50-NBS1 complex, a central player associated with double–strand breaks repair. Most NBS patients are Slavic origin and homozygous for the founder mutation 657del5, which leads to a frameshift and protein truncation. We have studied 40 patients with the clinical suspicion of NBS using a cell cycle based screening assay. Peripheral blood mononuclear cells were exposed to ionizing radiation and incubated for 72 h in the presence of phytohemagglutinin. To decide between NBS-positive and NBS-negative group the following cell cycle parameters were ascertained: 1. proportion of non-proliferation (G0/G1) cells as a measure of the mitogen response. 2. Proportion of first cycle G2-phase cells relative to the growth fraction as a measure of radiosensitivity. 22 cases could assign to the NBS-negative group and 16 cases could assign to the NBS-positive group. 9 cases of the NBS-positive group were confirmed by NBS mutation analysis. In the other 7 cases no NBS-mutation could be found. We conclude that cell cycle testing by flow cytometry is a very sensitive screening procedure for radiosensitivity and can be successfully applied to the diagnostic of Nijmegen breakage syndrome. But the primary diagnostic of NBS is mutation analysis. KW - Durchflusscytometrie KW - Nijmegen Breakage Syndrom KW - Nibrin KW - Chromosomeninstabilitätssyndrome KW - Strahlensensitivität KW - Nijmegen breakage syndrome KW - chromosomal instability disorder KW - nibrin KW - radiosensitivity KW - flow cytometry Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27695 ER - TY - THES A1 - Kraich, Michael T1 - Strukturelle und funktionelle Untersuchungen der Interaktion zwischen Ligand und Rezeptor im Interleukin-4- und Interleukin-13-System T1 - Structural and functional studies of the interaction between ligand and receptor in the interleukin-4 and interleukin-13 system N2 - Interleukin-4 (IL-4) und Interleukin-13 (IL-13) sind bedeutende Regulatorproteine des Immunsystems. Sie spielen eine entscheidende Rolle bei der Entstehung und dem Verlauf von allergischen Erkrankungen, wie z.B. Asthma. Um ihre Signale in die Zielzelle zu transduzieren, kann von beiden Zytokinen der gleiche Zelloberflächenrezeptor verwendet werden, wodurch sich die überlappenden, biologischen Funktionen erklären lassen. Dieser gemeinsam genutzte Rezeptor ist aus den beiden Untereinheiten IL-4Ralpha; und IL-13Ralpha1 aufgebaut. Da IL-4 und IL-13 auf Aminosäureebene nur etwa 25% Sequenzidentität besitzen und stark unterschiedliche Affinitäten zu den beiden Rezeptorketten besitzen, stellt sich die Frage, durch welchen molekularen Erkennungsmechanismus, die Affinität und die Spezifität der Ligand-Rezeptor-Interaktion unabhängig voneinander reguliert werden kann. In dieser Arbeit gelang es, rekombinante Expressions- und Aufreinigungsstrategien für IL-13 und die extrazellulären Domänen der Rezeptorketten IL-13Ralpha1 und IL-13Ralpha2 zu entwickeln. Dadurch war es mögliche, eine breite Mutations-/Interaktionsanalyse der IL-13Ralpha1-Kette durchzuführen.Es konnte gezeigt werden, dass die N-terminale FnIII-ähnliche Domäne von IL-13Ralpha1 sowohl an der Bindung von IL-13 als auch an der Interaktion mit IL-4 beteiligt ist. Im funktionellen Bindeepitop der IL-13Ralpha1-Kette wurden die Aminosäurereste Arg84, Phe253 und Tyr321 als Hauptbindungsdeterminanten für die Interaktion mit IL-13 identifiziert. Durch die Interaktionsstudien der IL-13Ralpha1-Varianten mit IL-4 wurde gezeigt, dass diese Hauptbindungsdeterminanten auch für die niederaffine Bindung von IL-4 von größter Bedeutung sind. Die funktionellen Bindeepitope für IL-4 und IL-13 auf der IL-13Ralpha1-Kette sind nahezu identisch und überlappen in einem großen Bereich. Aufgrund der Ergebnisse aus der Mutagenesestudie war es möglich, ein Strukturmodell der extrazellulären Domäne der IL-13Ralpha1-Kette zu erstellen. Darin wird eine neuartige Orientierung der N-terminalen FnIII-Domäne und deren Beteiligung an der Ligandeninteraktion dargestellt. Mit Hilfe des Strukturmodells gelang es, neue Aminosäurerest auf der Oberfläche von IL-13 zu identifizieren, die an der Bindung zu IL-13Ralpha1 beteiligt sind, was die Relevanz des Strukturmodells weiter unterstreicht. In einem weiteren Teil dieser Arbeit wurde versucht, den molekularen Mechanismus aufzuklären, durch den es den superagonistischen IL-4-Varianten T13D und F82D gelingt, mit dreifach höherer Affinität an die IL-4Ralpha-Kette zu binden, als wildtypischer Ligand. Durch strukturelle und funktionelle Untersuchungen wurde gezeigt, dass der Affinitätssteigerung ein indirekter Mechanismus zugrunde liegt, bei dem eine Konformationsänderung und die Fixierung der Arg85-Seitenkette von IL-4 zur Ausbildung von zusätzlichen Ligand-Rezeptor-Interaktionen führt. Das Bindeepitop zwischen IL-4 und der IL-4Ralpha-Kette besitzt eine modulare Architektur aus drei unabhängig voneinander agierenden Interaktionsclustern. Bei der Interaktion von wildtypischem IL-4 mit IL-4Ralpha tragen nur zwei dieser Cluster in signifikanter Weise zur freien Bindeenergie bei. Im Falle der superagonistischen IL-4-Varianten ist jedoch auch das dritte Cluster an der Generierung von zusätzlicher, freier Bindeenergie beteiligt, wodurch die Affinität zwischen Ligand und Rezeptor erhöht wird. Damit stellt der modulare Aufbau der Interaktionsfläche zwischen IL-4 und der IL-4Ralpha-Kette möglicherweise einen Mechanismus dar, über den Proteine die Affinität von Wechselwirkungen über einen großen Bereicht variieren können, ohne dabei Spezifität einzubüssen. Da IL-4 und IL-13 als interessante Zielmoleküle für die Therapie von allergischen und asthmatischen Erkrankungen erkannt worden sind, können die in der vorliegenden Arbeit gewonnenen Informationen über den Bindemechanismus und die Einblicke in den molekularen Charakter der Interaktion zwischen den beiden Zytokinen und ihren spezifischen Rezeptorketten dabei helfen, neuartige und hoch spezifische, inhibitorische Moleküle zu entwickeln. N2 - Interleukin-4 (IL-4) and Interleukin-13 (IL-13) are important regulatory proteins of the immune system. They play a key role in the development and the progression of allergic diseases like asthma. For signal transduction into the target cell, both cytokines can use an identical cell surface receptor, which is an explanation for many overlapping biological functions of IL-4 and IL-13. This common receptor consists of the two subunits IL-4Ralpha and IL-13Ralpha1. Because IL-4 and IL-13 share only 25% sequence identity on the amino acid sequence level and because they show very different affinities to the two receptor chains, the question has to be raised, by which molecular recognition mechanism it is possible to regulate affinity and specificity of the ligand-receptor-interaction independently. In the course of this work recombinant expression and purification strategies for IL-13 and the extracellular domains of IL-13Ralpha1 and IL-13Ralpha2 were established. Therefore it was possible to perform a broad mutagenesis and interaction analysis of the IL-13Ralpha1 chain. It was shown, that the N-terminal FnIII-like domain of IL-13Ralpha1 participates in the binding of IL-13 as well as in the interaction with IL-4. As part of the functional epitope the amino acid residues Arg84, Phe253 and Tyr321 were identified to be main binding determinants for the interaction with IL-13. By carrying out interaction studies with IL-4 it could be demonstrated, that the same residues are also from great importance for the low affinity binding of IL-4. The functional epitopes for the binding of IL-4 and IL-13 are almost identical and are overlapping in a large area. Due to the results of the mutagenesis study it was possible to generate a structural model of the extracellular domain of the IL-13Ralpha1 chain. A key feature of this model is the novel orientation of the N-terminal FnIII-like domain and its involvement in ligand binding. According to the modelled structure new residues in IL-13 could be identified, that participate in the interaction with the IL-13Ralpha1. This further underlines the relevance of the shown structural model of the extracellulardomain of the IL-13Ralpha1 chain. In a different part of this work it was tried to elucidate the molecular mechanism, which enables the super-agonistic IL-4 variants T13D and F82D bind IL-4Ralpha with three times higher affinity than wildtype IL-4. With the help of structural und functional analysis it could be shown, that an indirect mechanism leads to the gain of affinity. A conformational change in and the fixation of the Arg85 side chain in IL-4 result in the formation of additional interactions between ligand and receptor. The binding interface between IL-4 and IL-4Ralpha exhibits a modular architecture consisting of three independently acting interaction clusters. For the binding of wild-type IL-4 to the IL-4Ralpha chain only two of the three clusters contribute a significant amount to the overall free binding energy. In the case of the super-agonistic IL-4 variants all three interaction clusters are used to generate additional free binding energy and to increase the affinity between ligand and receptor. Therefore the modular design of the IL-4/IL-4Ralpha interaction interface probably represents a mechanism, which enables proteins to alter the affinity of interactions over a broad range without loosing specificity. Because IL-4 and IL-13 were discovered as promising targets for the therapy of allergic and asthmatic diseases, the acquired information about the binding mechanism and the molecular characteristics of the interaction between the cytokines IL-4 and IL-13 and their specific receptor chains may help to design novel and highly specific inhibitory molecules. KW - Renaturierung KW - Ligand KW - Biochemie KW - Interleukin 4 KW - Interleukin 13 KW - Interaktion KW - Rezeptor KW - Immunologie KW - Allergie KW - Allerg KW - Proteinbiochemie KW - BIAcore KW - Oberflächenplasmonresonanz (SPR) KW - Strukturbiologie KW - interleukin-4 KW - interleukin-13 KW - protein interaction KW - BIAcore KW - structural biology Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27655 ER - TY - THES A1 - Schwarz, Roland T1 - Modellierung von Metabolismus, Transkriptom und Zellentwicklung bei Arabidopsis, Listerien und anderen Organismen T1 - Modeling of metabolism, transcriptome and cell development in Arabidopsis, Listeria and other organisms N2 - Im gleichen Maße wie informatisches Wissen mehr und mehr in den wissenschaftlichen Alltag aller Lebenswissenschaften Einzug gehalten hat, hat sich der Schwerpunkt bioinformatischer Forschung in stärker mathematisch und informatisch-orientierte Themengebiete verschoben. Bioinformatik heute ist mehr als die computergestützte Verarbeitung großer Mengen an biologischen Daten, sondern hat einen entscheidenden Fokus auf der Modellierung komplexer biologischer Systeme. Zur Anwendung kommen hierbei insbesondere Theorien aus dem Bereich der Stochastik und Statistik, des maschinellen Lernens und der theoretischen Informatik. In der vorliegenden Dissertation beschreibe ich in Fallstudien die systematische Modellierung biologischer Systeme aus einem informatisch - mathematischen Standpunkt unter Anwendung von Verfahren aus den genannten Teilbereichen und auf unterschiedlichen Ebenen biologischer Abstraktion. Ausgehend von der Sequenzinformation über Transkriptom, Metabolom und deren regulatorischer Interaktion hin zur Modellierung von Populationseffekten werden hierbei aktuelle biologische Fragestellungen mit mathematisch - informatischen Modellen und einer Vielzahl experimenteller Daten kombiniert. Ein besonderer Augenmerk liegt dabei auf dem Vorgang der Modellierung und des Modellbegriffs als solchem im Rahmen moderner bioinformatischer Forschung. Im Detail umfassen die Projekte (mehrere Publikationen) die Entwicklung eines neuen Ansatzes zur Einbettung und Visualisierung von Multiplen Sequenz- und Sequenz-Strukturalignments, illustriert am Beispiel eines Hemagglutininalignments unterschiedlicher H5N1 Varianten, sowie die Modellierung des Transkriptoms von A. thaliana, bei welchem mit Hilfe einer kernelisierten nicht-parametrischen Metaanalyse neue, an der Infektionsabwehr beteiligten, Gene ausfindig gemacht werden konnten. Desweiteren ist uns mit Hilfe unserer Software YANAsquare eine detaillierte Untersuchung des Metabolismus von L. monocytogenes unter Aktivierung des Transkriptionsfaktors prfA gelungen, dessen Vorhersagen durch experimentelle 13C Isotopologstudien belegt werden konnten. In einem Anschlußprojekt war der Zusammenhang zwischen Regulation des Metabolismus durch Regulation der Genexpression und der Fluxverteilung des metabolischen Steady- State-Netzwerks das Ziel. Die Modellierung eines komplexen organismischen Phänotyps, der Zellgrößenentwicklung der Diatomee Pseudo-nitzschia delicatissima, schließt die Untersuchungen ab. N2 - In the same way that informatical knowledge has made its way into almost all areas of research in the Life Sciences, the focus of bioinformatical research has shifted towards topics originating more in the fields of mathematics and theoretical computer science. Bioinformatics today is more than the computer-driven processing of huge amounts of biological data, but it has a special focus on the emphmodelling of complex biological systems. Of special importance hereby are theories from stochastics and statistics, from the field of machine learning and theoretical computer science. In the following dissertation, I describe the systematic modelling of biological systems from an informatical-mathematical point of view in a case studies approach, applying methods from the aforementioned areas of research and on different levels of biological abstraction. Beginning with the sequence information itself, followed by the transcriptome, metabolome and the interaction of both and finally population effects I show how current biological questions can be tackled with mathematical models and combined with a variety of different experimental datasets. A special focus lies hereby on the procedure of modelling and the concept and notion of a model as such in the framework of bioinformatical research. In more detail, the projects contained the development of a new approach for embedding and visualizing Multiple Sequence and Structure Alignments, which was illustrated using a hemagglutinin alignment from different H5N1 variants as an example. Furthermore we investigated the A. thaliana transcriptome by means of a kernelized non-parametric meta-analysis, thus being able to annotate several new genes as pathogen-defense related. Another major part of this work was the modelling of the metabolic network of L. monocytogenes under activation of the transcription factor prfA, establishing predictions which were later verified by experimental 13C isotopologue studies. Following this project we investigated the relationship between the regulation of metabolism by changes in the cellular genexpression patterns and the flux distributions of the metabolic steady-state network. Modelling of a complex organismal property, the cell size development of the planktonic diatom Pseudo-nitzschia delicatissima concludes this work. KW - Bioinformatik KW - Würzburg / Universität / Lehrstuhl für Bioinformatik KW - Modellierung KW - Metabolismus KW - Stoffwechsel KW - Transkriptom KW - Transkriptomanalyse KW - bioinformatics KW - metabolome KW - transcriptome KW - modeling KW - steady-state Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27622 ER - TY - THES A1 - Bollazzi Sosa, Leonardo Martin T1 - Building behaviour and the control of nest climate in Acromyrmex leaf-cutting ants T1 - Bauverhalten und die Kontrolle des Nestklimas in der Blattschneiderameisen Acromyrmex N2 - This work was aimed at experimentally studying whether climatic variables act as environmental cues for workers’ building behaviour in leaf-cutting ants of the genus Acromyrmex, and to what extent building responses account for the maintenance of nest climate in a proper range for the inhabiting colony. Specifically, this work presents independent analysis in different Acromyrmex species with disparate ecology and nesting habits, aimed at understanding to what extent: i) temperature and humidity act as cues for workers’ building behaviour, ii) inter- and intraspecific differences in the nesting habits observed in South American Acromyrmex are based on distinct building behaviours and on the variation in regional climate across continent, iii) differences in nest architecture account for the maintenance of nest climate in a proper range for colony members and, iv) climatic variables trigger building responses aimed at controlling short-term changes in nest climate. It is first experimentally shown that soil temperature acts as a cue for workers’ digging behaviour. Acromyrmex lundi workers were observed to respond to both soil temperature as well as its changes, and to decide accordingly where to start or whether to stop digging. The soil temperature range preferred by workers to dig, between 20°C and maximally 30.6°C, matches the range at which colony growth is expected to be maximized. Temperature-sensitive digging might therefore lead to the establishment of the fungus chambers in soil layers with a proper range of temperatures for colony growth. Based on that, it was hypothesized that nest depth in Acromyrmex largely depends on the depth at which this temperature range is located across the soil profile, i.e., the higher the temperature in the superficial soil layers, the deeper the nest location, since soil temperature decreases with increasing depth. A bibliographic survey on nesting habits of 21 South American Acromyrmex species confirmed that the warmer the soil temperature at 50 cm depth throughout the South American continent, the higher the number of species presenting subterranean nests, compared with those inhabiting superficial nests. Temperature-sensitive digging in Acromyrmex would therefore explain the geographical distribution of nesting habits observed for this genus in the South American continent, i.e., subterranean in the northern tropical regions, and superficial in the southern temperate ones. In addition, results showed that Acromyrmex colonies from temperate regions indeed achieve thermoregulatory benefits through the determination of nest depth based on thermoregulatory needs. In sympatrically-occurring colonies of the grass-cutting ant A. heyeri, temperature inside superficial thatched nests was higher, and more suitable for colony growth, than that inside subterranean nests. This temperature surplus was even higher in spring, at the time of production of sexual brood, than in winter or summer. It was demonstrated that such temperature surplus was brought about by the low thermal diffusivity of the nest thatch, which prevents diurnal nest overheating by the incoming solar radiation, and avoids losses of the accumulated daily heat into the cold air during night, thus leading to high average nest temperatures. Although highly advantageous for colonies in terms of nest temperature, the determination of nest depth based on thermoregulatory needs may differentially affect nest ventilation and humidity depending on how nest exposition influences the exchange of nest air with the outside air. For instance, colonies with a superficial nesting habit might benefit from improved nest ventilation, but be at risk of desiccation due to their exposition and the consequent humidity losses into the dry outside air. Results demonstrated that in two Acromyrmex species, short-term regulatory building responses triggered and spatially organized by climatic variables occur, and may counteract undesired changes in internal nest humidity. Workers of the thatching grass-cutting ant A. heyeri, for instance, closed a number of nest-thatch openings as a response to desiccation of the outside air, even at a nest temperature that otherwise triggered the response of opening them so as to reduce nest temperature. In the leaf-cutting ant A. ambiguus, the direction of the airflow inside nest tunnels was shown to act as a cue for spatially guiding the building behaviour of plugging nest entrances. However, workers only responded if the humidity content of the circulating air was low, trading therefore nest ventilation for humidity maintenance. N2 - Die vorliegende Arbeit untersucht, inwiefern das Bauverhalten von Blattschneiderameisen der Gattung Acromyrmex durch klimatische Variablen beeinflusst wird und dem Erhalt für die Ameisen geeigneter klimatischer Bedingungen dient. Betrachtet werden verschiedene Acromyrmex-Arten, die sich in ihrer Ökologie und ihren Nistgewohnheiten unterscheiden. Ziel ist es zu verstehen, in wie fern: i) Temperatur und Feuchtigkeit als Reize das Bauverhalten der Arbeiterinnen beeinflussen, ii) Unterschiede im Bauverhalten und die regionale Variation des Klimas über den südamerikanischen Kontinent die beobachteten, inter- und intraspezifischen Unterschiede zwischen den Nesttypen südamerikanischer Acromyrmex-Arten erklären, iii) unterschiedliche Nestarchitekturen für die Aufrechterhaltung für die Ameisen geeigneter klimatischer Bedingungen im Nest sorgen, iv) klimatische Variablen Verhaltensweisen auslösen, die der Kontrolle kurzfristiger Änderungen des Nestklimas dienen. Zunächst wird experimentell gezeigt, dass die Bodentemperatur ein Reiz ist, der das Bauverhalten von Ameisen beeinflusst. Es wurde beobachtet, dass Acromyrmex lundi-Arbeiterinnen sowohl auf Temperaturen als auch auf Temperaturänderungen reagieren, und, abhängig von diesen Variablen, über die Aufnahme oder den Abbruch des Grabeverhaltens entscheiden. Der Temperaturbereich im Boden, in dem die Arbeiterinnen zu Graben bevorzugen, also zwischen 20°C und maximal 30.6°C, entspricht dem Temperaturbereich, bei dem ein maximales Koloniewachstum erwartet werden sollte. Zudem legen die Ergebnisse nahe, dass die Orientierung des kollektiven Grabenverhaltens an der Bodentemperatur den Ameisen ermöglicht, Nestkammern in Bodenschichten zu etablieren die geeignete Temperaturbedingungen bieten. Es wird angenommen, dass die Nesttiefe bei Acromyrmex stark davon abhängt, wie tief im Boden geeignete Temperaturbedingungen anzutreffen sind. Je höher die Temperatur in den obersten Bodenschichten, desto tiefer das Nest, denn die Bodentemperatur sinkt mit zunehmender Tiefe. Literaturdaten zu den Nistgewohnheiten von 21 südamerikanischen Acromyrmex-Arten wurden verglichen. Hierbei bestätigte sich, dass über den südamerikanischen Kontinent mit zunehmender, mittlerer Bodentemperatur in einer Tiefe von 50 cm auch der Anteil der Arten zunimmt, die ausschließlich unterirdische Nester bauen im Verhältnis zu den Arten mit Oberflächennestern zunimmt. Temperaturabhängiges Graben würde die geographische Verteilung der Nistgewohnheiten von Acromyrmex in Südamerika erklären: Unterirdische Nester überwiegen in den nördlichen, tropischen Regionen und Oberflächennester in den gemäßigten Regionen im Süden. Zudem konnte gezeigt werden, dass Acromyrmex-Kolonien der gemäßigten Regionen tatsächlich ihre Nesttemperatur durch Anpassung der Nesttiefe an klimatische Bedingungen regulieren. Bei der Grassschneiderameise A. heyeri, bei der Kolonien mit unterirdischen Nestern und solche mit oberflächlichen Hügelnestern sympatrisch vorkommen, war die Temperatur in den Oberflächennestern höher, und für das Koloniewachstum günstiger, als in unterirdischen Nestern. Dieser Temperaturvorteil war im Frühling, der Zeit, in der die Geschlechtstierbrut herangezogen wird, größer als in Winter oder Sommer. Es wurde gezeigt, dass dieser Vorteil durch die niedrige Wärmeleitfähigkeit der Nesthügels bedingt ist. Tagsüber verhindert der Nesthügel zunächst die Überhitzung durch Sonneneinstrahlung, und minimiert dann während der Nacht den Wärmeverlust an die kalte Umgebungsluft. Dies führt zu hohen Durchschnittstemperaturen innerhalb solcher Nester. Neben dem Vorteil, den eine geringe Nesttiefe in diesem Fall für die Temperatur in der Nestkammer bietet, spielen auch weitere Aspekte eine Rolle. Kolonien mit oberflächlichen Nestern profitieren zwar von der vergleichsweise guten Nestventilation, setzen sich dabei aber einem Erhöhten Risiko aus, durch den Verlust von Feuchtigkeit an die Außenluft auszutrocknen. Bei zwei Acromyrmex-Arten zeigen die Ergebnisse das Auftreten regulatorischer Bauaktivität, die, ausgelöst und räumlich organisiert durch klimatische Variablen, einem unerwünschten Feuchtigkeitsverlust innerhalb des Nestes entgegenwirkt. Arbeiterinnen der hügelbauenden Grassschneiderameise A. heyeri verschlossen Öffnungen im Nesthügel als Antwort auf die Austrocknung der Aussenluft, und das selbst bei einer Nesttemperatur, auf die unter anderen Umständen mit der Öffnung derselben zur Reduzierung der Nesttemperatur reagiert worden wäre. Bei der Blattschneiderameise A. ambiguus, die unter bestimmten Bedingungen ihre Tunnel mit Pflanzenmaterial verschließt, wurde gezeigt, dass die Richtung der Luftbewegung in den Nestgängen das Verschließen der Eingänge räumlich beeinflusst. Dennoch reagierten Arbeiteinnen nur, wenn der Feuchtigkeitsgehalt der zirkulierenden Luft niedrig war, sie beschränkten somit die Nestventilation um die Feuchtigkeit aufrecht zu erhalten. KW - Verhaltensökologie KW - Bauverhalten KW - Nestklimas KW - Acromyrmex KW - Blattschneiderameisen KW - Building behaviour KW - nest climate KW - Acromyrmex KW - leaf-cutting ants Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27610 ER - TY - THES A1 - Berg, Daniela T1 - Entwicklung von TRAIL-Fusionsproteinen und ihre Wirkung auf Myelomzellen N2 - 1. Zusammenfassung Lösliche humane TRAIL-Varianten (hTRAIL), die nur die “TNF homology domain” (THD) beinhalten, binden sowohl den TRAILR1 aus auch den TRAILR2, stimulieren jedoch nur den TRAILR1. Nach sekundärem Quervernetzen des Liganden wird dann aber auch der TRAILR2 effektiv aktiviert. Entsprechende murine TRAIL-Varianten (mTRAIL) dagegen zeigen nur eine schwache Rezeptorbindung und sind selbst nach sekundärem Quervernetzen nur wenig aktiv. Interessanterweise kann ein Fusionsprotein aus der THD von mTRAIL und der Trimerisierungsdomäne von Tenascin-C (TNC), das wie mTRAIL selbst auch als Trimer vorligt, effizient an TRAIL-Rezeptoren binden und nach sekundärem Quervernetzen den TRAILR2 gut stimulieren. Weiterhin kann eine mTRAIL-Variante, die neben der THD auch die Stammregion des Moleküls enthält, die die THD von der Transmembrandomäne trennt, nach sekundärem Quervernetzen Apoptose induzieren, jedoch nicht so effektiv wie das TNC-mTRAILFusionsprotein. Die spezifische Bioaktivität der humanen TRAIL-Varianten wird gleichfalls, wenn auch weniger stark, durch Fusion mit der Tenascin-C-Trimerisierungsdomäne gesteigert. Die Fixierung des N-Terminus der THD, die hier durch die TNCDomäne sonst jedoch durch die Stamm- oder Transmembrandomäne gewährleistet wird, könnte demnach für mTRAIL für eine gute Rezeptorbindung und effektive Apoptoseinduktion nötig sein. Dies deutet auf eine bisher nicht erkannte Rolle der Stammregion für die Aktivität dieser Liganden hin und bietet die Möglichkeit, rekombinante lösliche Liganden der TNF-Familie mit erhöhter Aktivität zu generieren. Die TRAIL-induzierte Apoptose kann für die Behandlung von Tumorzellen nützlich sein. Es wurde jedoch kürzlich gezeigt, dass TRAIL neben Apoptose auch proinflammatorische, d. h. potentiell tumorfördernde Signalwege, insbesondere in apoptoseresistenten Zellen induzieren kann. Im Folgenden sollte untersucht werden, inwiefern TRAIL solche Signalwege in Myelomzellen stimuliert. Oligomerisiertes TRAIL kann bei allen analysierten Zelllinien Caspasen aktivieren und Apoptose induzieren. Werden die Zelllinien mit dem pan-Caspaseinhibitor ZVAD behandelt, kann die Caspase- Aktivierung bei allen Zellen blockiert werden, die Apoptoseinduktion jedoch nur bei zwei Zelllinien. Im Gegensatz dazu schützt ZVAD drei andere Myelomzelllinien nur partiell vor der TRAIL-induzierten Apoptose. Dies zeigt, dass TRAIL in Myelomzellen auch caspaseunabhängigen Zelltod induzieren kann. TRAIL induziert in den Myelomzellen auch proinflammatorische Signalwege wie den NFкB-, den JNK-, den p38- und den p42/44-Signalweg. Die Stimulation des JNK- und des p38-Signalwegs erwies sich hierbei in zelltypspezifischer Weise caspaseabhängig, die Aktivierung des NFкB- und p42/44-Signalwegs immer als caspaseunabhängig. Zusammenfassend geht aus diesen Ergebnissen hervor, dass zur Behandlung des multiplen Myeloms, TRAIL in Kombination mit anti-inflammatorisch wirkenden Mitteln eingesetzt werden sollte, insbesondere um mögliche proinflammatorische Nebenwirkungen durch TRAIL zu minimieren. N2 - 2. Summary Variants of soluble human TRAIL (hTRAIL), encompassing solely the TNF-homology domain (THD), interact with TRAILR1 and TRAILR2, but they only stimulate TRAILR1 robustly. After crosslinking however, these ligands are also able to activate TRAILR2. Contrarily, the corresponding murine TRAIL variants poorly bind and activate their receptors even after crosslinking. Interestingly, a fusion protein consisting of the THD of mTRAIL and the trimerization domain of Tenascin-C (TNC) shows an effictive receptor binding and TRAILR2 activation after crosslinking. A variant of mTRAIL that not only contains the THD, but also the the stalk region, which seperates the transmembranedomain from the THD, does also induce apoptosis after crosslinking, but not as effective as the TNC-mTRAIL fusionprotein. The activity of soluble human TRAIL variants is also enhanced after fusion with TNC. It seems that especially for mTRAIL the spatial fixation of the THD by TNC is necessary for proper receptor binding and activation. This spatial fixiation is otherwise ensured by the stalk region or the transmembrane-domain. So the stalk region has unanticipated functions for the activity of the TNF ligands. Moreover, there is now an option to generate soluble ligands of the TNF-family with improved activity. TRAIL-induced apoptosis could be applied in the treatment of tumor cells. However, it was shown that TRAIL cannot only induce apoptosis, but also activates proinflammatory potentially tumor promoting pathways, especially in apoptosis resistant cells. Therefore, the ability of TRAIL to activate such pathways in myeloma cells was analyzed. Oligomerized TRAIL induces apoptosis and caspase activation in all analyzed myeloma cells. In experiments with the pan-caspase inhibitor ZVAD caspase acitvation could be blocked in all cell lines, but apoptosis could be blocked only in two cell lines. Three other myeloma cell lines were only marginally rescued from apoptosis. Therefore, TRAIL can also induce caspase independent cell death in myeloma cells. Beside apoptosis TRAIL also stimulates proinflammatory pathways like the NFкB-, the JNK, the p38- and the p42/44- pathway. Thereby, the activation of the NFкB- and p42/44-pathways is always caspase-dependent, but the induction of the p38- and JNKpathways is cell type specifically caspase-dependent. Thus, taken together for myeloma therapy TRAIL should be used in combination with anti-proinflammatory drugs to avoid potential side effects related to the proinflammatory properties of TRAIL. KW - TRAIL KW - Myelom KW - Apoptose KW - TRAIL KW - multiple myeloma KW - apoptosis Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27430 ER - TY - THES A1 - Froese, Alexander T1 - The Popeye domain containing gene 2 (Popdc2): Generation and functional characterization of a null mutant in mice and promoter analysis T1 - Das Popeye domain containing 2 (Popdc2) Gen : Herstellung und funktionelle Charakterisierung einer Nullmutante in Mäusen und die Analyse des Promoters N2 - In the present study a knockout mouse model of the Popeye domain containing gene 2 (Popdc2) was generated and functionally characterized. The Popdc2 null mutants were viable with an apparent normal life span. ß-galactosidase staining to visualize the expression of the Popdc2-LacZ transgene revealed the presence of the Popdc2 in heart, bladder, smooth and skeletal muscles. In the heart LacZ was found to be present in cardiac myocytes with elevated levels in the myocytes of the cardiac conduction system. Holter ECGs records of the heart function of the 8 months (but not in 3 and 6 months) old mutant and WT littermates revealed a pronounced sinus bradycardia in the mutant mice in response to three different stress regimens: isoproterenol infusion, mental stress and a physical exercise. Histological examination of the Popdc2 null mutants SAN revealed structural alterations as was detected by HCN4 staining. Moreover, volume measurements using 3-D reconstructions of serial sections stained with HCN4 antibody revealed a volume reduction of about 30% in the mutant SAN. Taken together data presented in this study suggest that the Popdc2 KO mouse line may serve as an animal model of human sick sinus syndrome. In the second part of this thesis the Popdc2 gene promoter was analyzed. Three transcription factors binding sites were predicted in the promoter region and characterized. N2 - Im Vordergrund dieser Arbeit stand die Generierung und Analyse der Popdc2 Knockout Maus. Die Expression des Popdc2-LacZ Konstruktes war vorwiegend im Herz, der Blase, sowie in der glatten und Skelett Muskulatur detektierbar/sichtbar. Der Herzrhythmus 8 Monate alter Popdc2 Mutanten und WT Nachkommen wurde anhand von Elektrokardiogrammen (EKGs) untersucht. Bei dieser Analyse wurden die Mäuse verschiedenen Stresssituationen ausgesetzt, d.h. Injektion von Isoproterenol, mentaler bzw. physikal. Stress. Die Aufzeichnung der EKG-Kurve erfolgte direkt nach der Stressinduktion über eine Zeitspanne von 6 Minuten. Es konnte gezeigt werden, dass die Mäuse eine ausgeprägte Sinus Bradykardie entwickelten. Anhand histologischer Schnitte 8 Monate alter Popdc2 KO SAN Mäuse konnten strukturelle Veränderungen im Vergleich zum WT aufgedeckt werden. Auf der Grundlage serieller Schnitte, gefärbt mit HCN4 Antikörper, wurden 3D-Rekonstruktionen erzeugt. Dabei stellte sich heraus, dass das Volumen des SAN in Popdc2 Mutante um 30% gegenüber dem Wildtyp verringert ist. Auf Grund der hier vorgestellten Daten scheint die Popdc2 KO Maus ein nützliches Tiermodell im Hinblick auf menschl. Sinus-Erkrankungen zu sein. Der zweite Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der Popdc2 Promotor Analyse. In Promotorregion konnten drei Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren charakterisiert werden. Um weitere Faktoren, die eine Rolle bei der Popdc2 Genregulation spielen könnten, zu identifizieren sind weiterführende Studien unerlässlich. KW - Herz KW - Herzrhythmusstörung KW - Transgene Tiere KW - Popdc2 KW - KO Mäuse KW - Bradikardia KW - Popdc2 KW - KO mice KW - Heart KW - Bradycardia Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-26473 ER - TY - THES A1 - Drechsler, Patrick Hans T1 - Mechanics of adhesion and friction in stick insects and tree frogs T1 - Mechanik der Adhäsion und Reibung von Stabheuschrecken und Baumfröschen N2 - Many arthropods and vertebrates can cling to surfaces using adhesive pads on their legs. These pads are either smooth and characterised by a specialised, soft cuticle or they are hairy, i.e. densely covered with flexible adhesive setae. Animals climbing with adhesive organs are able to control attachment and detachment dynamically while running. The detailed mechanisms of how tarsal pads generate adhesive and frictional forces and how forces are controlled during locomotion are still largely unclear. The aim of this study was to clarify the attachment mechanism of smooth adhesive pads as present in many insects and tree frogs. To understand the function of these fluid-based adhesive systems, I characterized their performance under standardized conditions. To this end, experiments were conducted by simultaneously measuring adhesion, friction, and contact area in single adhesive pads. The first result of this study showed that friction in stick insect attachment pads is anisotropic: Attachment pads regularly detached when slid away from the body. Further analyses of "immobilized" arolia revealed that this anisotropy is not caused by an increased shear stress in the proximal direction, but by the instability of the tarsus when pushed distally. In the second part of this study, I analysed the role of the pad secretion present in insects and tree frogs. In stick insects, shear stress was largely independent of normal force and increased with velocity, seemingly consistent with the viscosity effect of a continuous fluid film. However, measurements of the remaining force two minutes after a sliding movement showed that adhesive pads could sustain considerable static friction in insects and tree frogs. Repeated sliding movements and multiple consecutive pull-offs of stick insect single legs to deplete adhesive secretion showed that on a smooth surface, friction and adhesion strongly increased with decreasing amount of fluid in insects. In contrast, stick insect pull-off forces significantly decreased on a rough substrate. Thus, the secretion does not generally increase attachment but does so only on rough substrates, where it helps to maximize contact area. When slides with stick insect arolia were repeated at one position so that secretion could accumulate, sliding shear stress decreased but static friction remained clearly present. This suggests that static friction in stick insects, which is biologically important to prevent sliding, is based on non-Newtonian properties of the adhesive emulsion rather than on a direct contact between the cuticle and the substrate. % Analogous measurements in toe pads of tree frogs showed that they are also able to generate static friction, even though their pads are wetted by mucus. In contrast to the mechanism proposed for insects, static friction in tree frogs apparently results from the very close contact of toe pads to the substrate and boundary lubrication. In the last section of this study, I investigated adhesive forces and the mode of detachment by performing pull-off measurements at different velocities and preloads. These experiments showed that preload has only an increasing effect on adhesion for faster pull-offs. This can be explained by the viscoelastic material properties of the stick insect arolium, which introduce a strong rate-dependence of detachment. During fast pull-offs, forces can spread over the complete area of contact, leading to forces scaling with area. In contrast, the pad material has sufficient time to withdraw elastically and peel during slow detachments. Under these conditions the adhesive force will concentrate on the circumference of the contact area, therefore scaling with a length, supporting models such as the peeling theory. The scaling of single-pad forces supported these conclusions, but large variation between pads of different stick insects did not allow statistically significant conclusions. In contrast, when detachment forces were quantified for whole insects using a centrifuge, forces scaled with pad contact area and not with length. N2 - Viele Arthropoden und Vertebraten können sich mit Hilfe tarsaler Haftorgane an Oberflächen festhalten. Diese Organe sind entweder glatt, mit einer spezialisierten, weichen Cuticula oder haarig, d.h. dicht besetzt mit mikroskopisch kleinen, biegsamen Hafthaaren. Mit Haftorganen kletternde Tiere können während des Laufens Haftkräfte dynamisch kontrollieren. Die genaueren Mechanismen, mit denen Adhäsions- und Reibungskräfte erzeugt werden und mit denen die Kräfte während des Laufens schnell kontrolliert werden können, sind allerdings noch immer weitgehend unklar. Das Ziel dieser Arbeit war es, den Haftmechanismus von glatten Haftorganen bei Insekten und Baumfröschen näher aufzuklären. Um die Funktion dieser flüssigkeitsbasierten Haftsysteme zu verstehen, charakterisierte ich ihr Adhäsions- und Reibungsverhalten unter standardisierten Bedingungen. Dazu führte ich Experimente an einzelnen Haftorganen durch, bei denen ich gleichzeitig Adhäsion, Reibung, und Kontaktfläche erfasste. Das erste Ergebnis dieser Arbeit war, dass die Reibung von Insektenhaftorganen von der Bewegungsrichtung abhängt. Ein Haftorgan, das vom Körper weg bewegt wird (distale Richtung), löst sich meist von der Oberfläche ab. Weitere Untersuchungen an Haftorganen bei fixiertem Tarsus zeigten, dass die Richtungsabhängigkeit nicht durch eine erhöhte Scherspannung in der proximalen Richtung hervorgerufen wird, sondern durch die Instabilität des Tarsus, wenn der Fuß vom Körper weg bewegt wird. Im zweiten Teil der Arbeit untersuchte ich die Rolle des Haftsekrets bei Stabheuschrecken und Baumfröschen. Bei Stabheuschrecken war die Scherspannung unabhängig von der Normalkraft und nahm mit der Bewegungsgeschwindigkeit zu, scheinbar in Einklang mit der viskosen Reibung eines durchgehenden Flüssigkeitsfilms. Jedoch ergaben Scherspannungsmessungen bei Stabheuschrecken und Fröschen selbst zwei Minuten nach einer Gleitbewegung ein beträchtliches Maß an statischer "Rest"-Reibung. Um den Einfluss geringer werdender Haftflüssigkeit zu untersuchen, wurden wiederholte Gleitversuche sowie aufeinanderfolgende Ablöseversuche auf glatten Oberflächen durchgeführt. Diese Experimente zeigten, dass sowohl die Reibungs- als auch die Adhäsionskraft mit abnehmender Flüssigkeitsmenge anstieg. Im Gegensatz hierzu nahm die Adhäsionskraft auf rauen Oberflächen mit abnehmender Haftflüssigkeitsmenge ab. Demzufolge führte die Haftflüssigkeit nur auf rauen Oberflächen zu einer Vergrößerung der Kontaktfläche und zu einer Erhöhung der Adhäsionskraft. Reibungskräfte auf glatten Oberflächen wurden bei Stabheuschrecken umso geringer, je häufiger Reibungsversuche an ein und der selben Stelle durchgeführt wurden (um die Menge an Haftflüssigkeit zu erhöhen). Dennoch blieb immer eine statische Reibung vorhanden. Das Vorhandensein von statischer Reibung ist biologisch wichtig um das unfreiwillige Ausrutschen zu verhindern. Meine Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Haftreibung bei Insekten nicht auf direkte Kontakte zwischen Cuticula und Untergrund zurückzuführen ist, sondern auf die (scherverdünnende) nicht-Newtonschen Eigenschaften des zweiphasigen Haftsekrets. Analoge Messungen an Haftzehen von Baumfröschen zeigten, dass auch diese statische Reibungskräfte erzeugen können, obwohl sie von einem flüssigen Schleim benetzt sind. Im Gegensatz zu dem bei Insekten gefundenen Mechanismus, entsteht bei Fröschen die statische Reibung wahrscheinlich durch Trockenreibung und den sehr nahen Kontakt zur Oberfläche. Im letzten Teil dieser Arbeit untersuchte ich Adhäsionskräfte und den Ablösevorgang durch Haftkraftmessungen bei verschiedenen Geschwindigkeiten und Normalkräften. Diese Experimente zeigten, dass die Normalkraft nur bei schnellem Ablösen zu höheren Adhäsionskräften führt. Dies ist durch die viskoelastischen Materialeigenschaften der Stabheuschrecken-Arolien erklärbar, die zu einer starken Geschwindigkeitsabhängigkeit des Ablösevorgangs führen. Bei schnellem Ablösen breiten sich die Kräfte über die gesamte Kontaktzone aus, was zu einer Flächenskalierung der Adhäsion führt. Im Gegensatz dazu hat das Haftorgan bei einem langsamen Ablöseprozess genügend Zeit, sich elastisch zurückzuziehen und abzuschälen. Unter diesen Bedingungen konzentriert sich die Kraft am Rand der Kontaktzone, wodurch die Adhäsionskräfte mit einer Länge skalieren, wie z.B. von der "peeling" Theorie vorhergesagt. Die Skalierung von Einzelbein-Haftkräften bestätigte diese Schlußfolgerungen, aber die starke Variation zwischen verschiedenen Stabheuschrecken erlaubte es nicht, diese statistisch abzusichern. Im Gegensatz dazu zeigten die Haftkräfte ganzer Insekten, welche mit Hilfe einer Zentrifuge gemessen wurden, eine deutliche Flächenskalierung. KW - Biomechanik KW - Adhäsion KW - Flüssigkeitsreibung KW - Reibung KW - Frosch KW - Insekten KW - Carausius morosus KW - Haftung KW - Schubspannung KW - Emulsion KW - Schälen KW - Haftmechanismen KW - Haftorgane KW - Haftflüssigkeit KW - Litoria caerulea KW - Scherspannung KW - Wet adhesion model KW - biomechanics KW - adhesion KW - friction KW - attachment structure KW - adhesive fluid KW - wet adhesion KW - shear stress KW - emulsion KW - attachment devices KW - peeling Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-26836 ER - TY - THES A1 - Kleinhenz, Marco T1 - Wärmeübertragung im Brutbereich der Honigbiene (Apis mellifera) T1 - Heat transfer in the brood area of honeybees (Apis mellifera) N2 - In dieser Arbeit untersuche ich das Verhalten von Arbeiterbienen beim Brutwärmen, die Wärmeübertragung von den Bienen auf die gedeckelte Brut, die thermophysikalischen Eigenschaften des Brutnests und spezielle Aspekte des Brutnestaufbaus, die für dieses Thema relevant sind und bisher nicht untersucht wurden. Meine Arbeit umfasst Verhaltensbeobachtungen und thermografische Messungen an individuellen Bienen, die Simulation des Heizverhaltens von Arbeiterinnen und das Messen der Temperaturänderungen in der Wabe, die Messung der thermophysikalischen Eigenschaften der Brutwabe und der Zellwände (Wärmeleitfähigkeit und Durchlässigkeit für Wärmestrahlung), die Auswertung von Brutzelltemperaturen als Ergebnis des Verhaltens von Arbeiterbienen, die Analyse der Anzahl und der räumlichen Verteilung von Brutlücken (Auswertung in 2-D und 3-D bezüglich beider Wabenseiten) und die Entwicklung spezifischer Computersoftware, die zur Erarbeitung dieser Ergebnisse unverzichtbar ist. Ein wichtiges Ergebnis dieser Arbeit ist die Entdeckung und Beschreibung eines bemerkenswerten, bislang unbekannten Verhaltens der Honigbiene: Die Aufrechterhaltung hoher Thoraxtemperaturen (TTh) bei Langzeitbesuchen in offenen Zellen („Lücken“) die verstreut in der gedeckelten Brutfläche vorkommen. Hier zeige ich, dass die Aufrechterhaltung der hohen TTh nicht auf den Zellinhalt (z. B. offene Brut) bezogen ist - in den meisten Fällen waren die besuchten Zellen ohnehin leer - sondern auf die direkt benachbarte gedeckelte Brut, mit der diese Zellen über gemeinsame Zellwände in Kontakt stehen. Dieses Verhalten liefert eine Erklärung für Langzeitzellbesuche von sehr langer Dauer ohne erkennbare Aktivität, die in früheren Arbeiten beschrieben aber nicht völlig verstanden wurden, und es rehabilitiert die scheinbar „faulen“ Bienen im Zellinnern. Diesem Verhalten kommt eine große Bedeutung für das Brutwärmen zu, da sich der aufgeheizte Thorax tief in der Wabe (fast an der Mittelwand) befindet wo der Wärmeverlust an die Luft minimiert ist und von wo bis zu 6 umliegende Puppenzellen gleichzeitig gewärmt werden können. Im Vergleich zum Brutwärmeverhalten an der Wabenoberfläche (Andrücken des Thorax an die Brutdeckel), wo nur 1 oder Teile von 3 Brutdeckeln mit dem Thorax in Berührung stehen, ist das Wärmen im Zellinnern mit derselben TTh bis zu 2,6-fach effizienter. Die Messung der thermophysikalischen Eigenschaften der Brutwabe und die Simulation des Brutwärmeverhaltens unter kontrollierten Bedingungen zeigen, dass sich die Wabe langsam aufwärmt und eher ein lokal begrenztes Wärmen als eine rasche Wärmeausbreitung über eine große Fläche begünstigt. Der Einflussbereich eines einzelnen Zellbesuchers hängt von seiner TTh und der Dauer des Zellbesuchs ab. Anstiege der Bruttemperatur in bis zu 3 Zellen Abstand zum Zellbesucher sind nachweisbar. Das hier beschriebene Brutwärmeverhalten im Innern von Lücken (offenen Zellen) bietet nicht nur neue Einsichten in das Bienenverhalten. Es ermöglicht auch eine Neubewertung der Lücken und ihrer Nützlichkeit für die Bienen. Eine von mir entwickelte Computersoftware („CombUse 2.0“) ermöglicht es, das Vorkommen und die räumliche Verteilung von Lücken mit hoher Genauigkeit auf der Ebene einzelner Zellen zu erfassen und auszuwerten. Die räumliche Verteilung der Lücken in der gedeckelten Brutfläche zeigt, dass schon bei geringen Lückenhäufigkeiten von ca. 4 bis 10 %, die in gesunden Kolonien normal sind, eine überraschend große Zahl gedeckelter Brutzellen (88 % bis 99 %, wenn die dreidimensionale Verteilung berücksichtigt wird) im Einflussbereich von Brut wärmenden Zellbesuchern sind. Obwohl das Brutwärmeverhalten im Zellinnern schwer zu entdecken und zu beobachten ist, führen die in dieser Arbeit präsentierten Daten zu dem Schluss, dass es sich dabei um einen wichtigen Bestandteil der Nestklimatisierung bei Honigbienen handelt. N2 - In this thesis I investigate the behaviour of worker bees while incubating brood, heat transfer from bees to the sealed brood, the thermophysical properties of the brood nest and special aspects of brood nest architecture that are relevant for this topic but have not been investigated so far. My work comprises behavioural observations and thermographic measurements of individual bees, simulation of worker bees’ heating behaviour and measurement of temperature changes within the brood comb, the measurement of thermophysical properties of the brood comb and cell walls (thermal conductivity and transmission of thermal radiation), the analysis of brood cell temperatures as a result of the behaviour of worker bees, the analysis of the number and spatial distribution of brood gaps (analysis in 2-D and 3-D with regard to both sides of a comb) and the engineering of specific computer software which was indispensable to achieve these results. One major result of this work is the discovery and description of a very remarkable, hitherto unknown behaviour of the honeybee: the maintenance of high thorax temperatures (TTh) during long-time visits to open cells (“gaps”) which are scattered at low rates among the sealed brood. Here I show that the maintenance of high TTh is not related to the contents of the visited cells (anyway, they were empty in most cases) but to the presence of sealed brood which is directly adjacent to and sharing common cell walls with the visited cell. The discovery of this behaviour casts a positive light on apparently “lazy” bees and provides an explanation for long-time cell-visits with durations of several ten minutes which were described but not fully understood in earlier works by other authors. Moreover, this behaviour is of high relevance for brood incubation itself because the heated thorax is deep in the comb (almost down to the middle wall) where heat loss to the air is minimized and where up to 6 surrounding pupa cells can be warmed simultaneously. In comparison to specific brood incubation behaviour on the comb surface (pressing the thorax onto the brood caps), where only one or parts of three brood caps may be in touch with a heated thorax, heating inside cells with the same TTh is up to 2,6 times more efficient. The measurement of thermophysical properties of the brood comb and the simulation of worker heating under controlled conditions show that the comb warms up slowly and supports local heating rather than a rapid spread of heat all over the area. The radius-of-influence of a single cell visitor depends on its TTh and on the duration of the cell visit. Increases of brood temperature as far as three cells away from the cell visitor may be detected. The brood incubation behaviour via gaps (i.e. open cells) which I describe in this work does not only give new insights into bee behaviour. It also allows a reconsideration of the gaps them¬selves and their usefulness to the bees. A specific computer software (“CombUse 2.0”) which I developed for this work allowed me to register and analyze the spatial distribution of gaps with high precision on the level of cells, in contrast to rough estimations of brood areas and gap numbers which are commonly used in bee-breeding and population assessments. The analysis of the spatial distribution of gaps in the sealed brood area shows that even at small proportions of gaps (ca. 4 to 10 %, common to healthy colonies), a surprisingly large number (88 % to 99 %, if the three-dimensional distribution of gaps is considered) of sealed brood cells is within the reach of brood incubating worker bees visiting these gaps. Although brood incubation behaviour inside cells is very difficult to detect and observe, the data presented in this work strongly suggest that heating inside cells is an important part of nest climate control and other aspects of social life in honeybee colonies. KW - Biene KW - Bienenzelle KW - Carnica-Biene KW - Biene KW - Bienenbrut KW - Thermoregulation KW - Wabe KW - Verhalten KW - honeybee KW - behaviour KW - thermoregulation KW - brood KW - comb Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-26866 ER - TY - THES A1 - Rister, Jens T1 - Genetic dissection of peripheral pathways in the visual system of Drosophila T1 - Genetische Zerlegung peripherer Pfade im visuellen System von Drosophila N2 - Die visuellen Systeme von Vertebraten und Invertebraten weisen Ähnlichkeiten in den ersten Schritten visueller Informationsverarbeitung auf. Im menschlichen Gehirn werden zum Beispiel die Modalitäten Farbe, Form und Bewegung separat in parallelen neuronalen Pfaden verarbeitet. Dieses grundlegende Merkmal findet sich auch bei der Fliege Drosophila melanogaster, welche eine ähnliche Trennung in farbsensitive und (farbenblinde) bewegungssensitive Pfade aufweist, die durch zwei verschiedene Gruppen von Photorezeptoren (dem R1-6 und dem R7/8 System) determiniert werden. Fliegen haben ein hoch organisiertes visuelles System, welches durch die repetitive, retinotope Organisation von vier Neuropilen charakterisiert ist: Dies sind die Lamina, die Medulla, die Lobula und die Lobulaplatte. Jedes einzelne besteht aus Kolumnen, die denselben Satz von Nervenzellen enthalten. In der Lamina formen Axonbündel von sechs Photorezeptoren R1-6, die auf denselben Bildpunkt blicken, Säulen, die als Cartridges bezeichnet werden. Diese sind die funktionellen visuellen „sampling units“ und sind mit vier Typen von Interneuronen erster Ordnung assoziiert, die von R1-6 den gleichen Input erhalten: L1, L2, L3 und die Amakrinzellen (amc, mit ihrem postsynaptischen Partner T1). Diese stellen parallele Pfade dar, die auf anatomischer Ebene im Detail untersucht wurden; jedoch ist wenig über ihre funktionelle Rolle bei der Verarbeitung für das Verhalten relevanter Information bekannt, z.B. hinsichtlich der Blickstabilisierung, der visuellen Kurskontrolle oder der Fixation von Objekten. Die Verfügbarkeit einer Vielfalt von neurogenetischen Werkzeugen für die Struktur-Funktionsanalyse bei Drosophila ermöglicht es, erste Schritte in Richtung einer genetischen Zerlegung des visuellen Netzwerks zu unternehmen, das Bewegungs- und Positionssehen vermittelt. In diesem Zusammenhang erwies sich die Wahl des Effektors als entscheidend. Überraschenderweise wurde festgestellt, dass das clostridiale Tetanus-Neurotoxin die Photorezeptorsynapsen adulter Drosophila Fliegen nicht blockiert, hingegen irreversible Schäden bei Expression während deren Entwicklung verursacht. Aus diesem Grund wurde das dominant-negative shibire Allel shits1, welches sich als geeigneter erwies, zur Blockierung der Lamina Interneurone verwendet, um die Notwendigkeit der jeweiligen Pfade zu analysieren. Um festzustellen, ob letztere auch hinreichend für das gleiche Verhalten waren, wurde für die umgekehrte Strategie die Tatsache ausgenutzt, daß die Lamina Interneurone Histaminrezeptoren exprimieren, die vom ort Gen kodiert werden. Die spezifische Rettung der ort Funktion in definierten Pfaden im mutanten Hintergrund ermöglichte festzustellen, ob sie für eine bestimmte Funktion hinreichend waren. Diese neurogenetischen Methoden wurden mit der optomotorischen Reaktion und dem objektinduzierten Orientierungsverhalten als Verhaltensmaß kombiniert, um folgende Fragen innerhalb dieser Doktorarbeit zu beantworten: (a) Welche Pfade stellen einen Eingang in elementare Bewegungsdetektoren dar und sind notwendig und/oder hinreichend für die Detektion gerichteter Bewegung? (b) Gibt es Pfade, die spezifisch Reaktionen auf unidirektionale Bewegung vermitteln? (c) Welche Pfade sind notwendig und/oder hinreichend für das objektinduzierte Orientierungsverhalten? Einige grundlegende Eigenschaften des visuellen Netzwerks konnten dabei aufgedeckt werden: Die zwei zentralen Cartridge Pfade, die von den großen Monopolarzellen L1 und L2 repräsentiert werden, haben eine Schlüsselfunktion bei der Bewegungsdetektion. Über ein breites Spektrum von Reizbedingungen hinweg sind die beiden Subsysteme redundant und können Bewegung unabhängig voneinander verarbeiten. Um eine Beeinträchtigung des Systems festzustellen, wenn nur einer der beiden Pfade intakt ist, muß dieses an die Grenzen seiner Leistungsfähigkeit gebracht werden. Bei niedrigem Signal/Rauschverhältnis, d.h. bei geringem Musterkontrast oder geringer Hintergrundbeleuchtung, hat der L2 Pfad eine höhere Sensitivität. Bei mittlerem Musterkontrast sind beide Pfade auf die Verarbeitung unidirektionaler Bewegung in entgegengesetzten Reizrichtungen spezialisiert. Im Gegensatz dazu sind weder der L3, noch der amc/T1 Pfad notwendig oder hinreichend für die Detektion von Bewegungen. Während der erstere Positionsinformation für Orientierungsverhalten zu verarbeiten scheint, nimmt der letztere eine modulatorische Rolle bei mittlerem Kontrast ein. Es stellte sich heraus, daß das Orientierungsverhalten noch robuster als das Bewegungssehen ist und möglicherweise auf einem weniger komplizierten Mechanismus beruht, da dieser keinen nichtlinearen Vergleich der Signale benachbarter visueller „sampling units“ benötigt. Die Fixation von Objekten setzt nicht grundsätzlich das Bewegungssehen voraus, allerdings verbessert die Detektion von Bewegung die Fixation von Landmarken, im besonderen, wenn diese schmal sind oder einen geringen Kontrast aufweisen. N2 - Vertebrate and invertebrate visual systems exhibit similarities in early stages of visual processing. For instance, in the human brain, the modalities of color, form and motion are separately processed in parallel neuronal pathways. This basic property is also found in the fly Drosophila melanogaster which has a similar division in color- sensitive and (color blind) motion-sensitive pathways that are determined by two distinct subsets of photoreceptors (the R1-6 and the R7/8 system, respectively). Flies have a highly organized visual system that is characterized by its repetitive, retinotopic organization of four neuropils: the lamina, the medulla, the lobula and the lobula plate. Each of these consists of columns which contain the same set of neurons. In the lamina, axon bundles of six photoreceptors R1-6 that are directed towards the same point in space form columnar structures called cartridges. These are the visual sampling units and are associated with four types of first-order interneuron that receive common input from R1-6: L1, L2, L3 and the amacrine cells (amc, together with their postsynaptic partner T1). They constitute parallel pathways that have been studied in detail at the anatomical level. Little is known, however, about their functional role in processing behaviorally relevant information, e.g. for gaze stabilization, visual course control or the fixation of objects. The availability of a variety of neurogenetic tools for structure-function analysis in Drosophila allowed first steps into the genetic dissection of the neuronal circuitry mediating motion and position detection. In this respect, the choice of the effector turned out to be crucial. Surprisingly, it was found that the clostridial tetanus neurotoxin failed to block mature Drosophila photoreceptor synapses, but caused irreversible damage when expressed during their development. Therefore, the dominant-negative shibire allele shits1 which turned out to be better suited was used for blocking lamina interneurons and thereby analyzing the necessity of the respective pathways. To determine whether the latter were also sufficient for the same behavioral task, the inverse strategy was developed, based on the fact that lamina interneurons express histamine receptors encoded by the ort gene. The specific rescue of ort function in defined channels in an otherwise mutant background allowed studying their sufficiency in a given task. Combining these neurogenetic methods with the optomotor response and object induced orientation behavior as behavioral measures, the aim of the present thesis was to answer the following questions: (a) Which pathways feed into elementary motion detectors and which ones are necessary and/or sufficient for the detection of directional motion? (b) Do pathways exist which specifically mediate responses to unidirectional motion? (c) Which pathways are necessary and/or sufficient for object induced orientation behavior? Some basic properties of the visual circuitry were revealed: The two central cartridge pathways, represented by the large monopolar cells L1 and L2, are key players in motion detection. Under a broad range of stimulatory conditions, the two subsystems are redundant and are able to process motion independently of each other. To detect an impairment when only one of the pathways is intact, one has to drive the system to its operational limits. At low signal to noise ratios, i.e. at low pattern contrast or low background illumination, the L2 pathway has a higher sensitivity. At intermediate pattern contrast, both pathways are specialized in mediating responses to unidirectional motion of opposite stimulus direction. In contrast, neither the L3, nor the amc/T1 pathway is necessary or sufficient for motion detection. While the former may provide position information for orientation, the latter has a modulatory role at intermediate pattern contrast. Orientation behavior turned out to be even more robust than motion vision and may utilize a less sophisticated mechanism, as it does not require a nonlinear comparison of signals from neighboring visual sampling units. The position of objects is processed in several redundant pathways, involving both receptor subsystems. The fixation of objects does not generally require motion vision. However, motion detection improves the fixation of landmarks, especially when these are narrow or have a reduced contrast. KW - Genetik KW - Neurogenetik KW - Visuelles System KW - Bewegungssehen KW - Taufliege KW - Lamina KW - visual system KW - peripheral pathways KW - motion vision KW - elementary motion detector KW - optomotor response Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-25980 ER -