TY - THES A1 - Contar Adolfi, Mateus T1 - Sex determination and meiosis in medaka: The role of retinoic acid T1 - Geschlechtsbestimmung und Meiose in Medaka: Die Rolle der Retinsäure N2 - Sex determination (SD) is a complex and diverse developmental process that leads to the decision whether the bipotential gonad anlage will become a testis or an ovary. This mechanism is regulated by gene cascades, networks and/or chromosomal systems, and can be influenced by fluctuations of extrinsic factors like temperature, exposure to hormones and pollution. Within vertebrates, the group of fish show the widest variety of sex determination mechanism. This whole diversity of processes and mechanisms converges to the formation of two different gametes, the eggs and the sperm, the first bigger and static, and the second smaller and motile. Meiosis is crucial for the formation of both types of gametes, and the timing of meiosis entry is one of the first recognizable differences between male and female in vertebrates. The germ cells go into meiosis first in female than in male, and in mammals, this event has been shown to be regulated by retinoic acid (RA). This small polar molecule induces in the germ cells the expression of the pre-meiotic marker Stra8 (stimulated by retinoic acid gene 8), which is necessary for meiosis initiation. Interestingly, genome analyzes have shown that the majority of fish (including medaka) lack the stra8 gene, adding a question mark to the role of RA in meiosis induction in this group. Since a role of RA in entry of meiosis and sexual development of fish is still far from being understood, I investigated in medaka (Oryzias latipes) a possible signaling function of RA during the SD period in embryos and in reproductively active gonads of adults. I generated a transgenic medaka line that reports responsiveness to RA in vivo. With this tool, I compared RA responsiveness with the expression of the main gene involved in the synthesis of RA. My results show that there is a de-correlation between the action of RA with its source. In adults, expression of the RA metabolizing enzymes show sexually dimorphic RA levels, with aldh1a2 levels being higher in testis, and cyp26a1 stronger in female gonad. In ovary, the responsiveness is restricted to the early meiotic oocytes. In testis, RA is acting directly in the pre-meiotic cells, but also in Sertoli and Leydig cells. Treatment experiments on testis organ culture showed that RA pathway activation leads to a decrease in meiosis markers expression levels. During the development, RA responsiveness in the germ cells was observed in both sexes much earlier than the first female meiosis entry. Treatments with RA-synthesis inhibitor show a decrease in meiosis markers expression levels only after the sex differentiation period in female. Expression analyzes of embryos treated with exogenous RA showed induction of dmrt1a at the gonad levels and an increase of amh levels. Both genes are not only involved in male formation, but also in the regulation of germ cell proliferation and differentiation. RA is important in meiosis induction and gametogenesis in adult medaka. However, there is no evidence for a similar role of RA in initiating the first meiosis in female germ cells at the SD stage. Moreover, contrary to common expectation, RA seems to induce sex related genes that are involved indirectly in meiosis inhibition. In this thesis, I showed for the first time that RA can be involved in both induction and inhibition of meiosis entry, depending on the sex and the developmental stage in a stra8-independent model organism. N2 - Geschlechtsbestimmung ist ein komplexer und vielfältiger Entwicklungsprozess, der zu der Entscheidung führt, ob sich aus der bipotenten Gonadenanlage Hoden oder Ovarien entwickeln. Dieser Mechanismus ist durch Genkaskaden, Netzwerke und/oder chromosomale Systeme reguliert, kann aber auch durch Fluktuation äußerer Faktoren wie beispielsweise Temperatur, durch Hormonexposition oder durch Umweltverschmutzung beeinflusst werden. Innerhalb der Wirbeltiere zeigen Fische die größte Vielfalt in Bezug auf die Mechanismen der Geschlechtsbestimmung. Die unterschiedlichen Mechanismen der Geschlechtsbestimmung konvergieren in der Entstehung von der beiden unterschiedlichen Geschlechtszellen, der Eizelle und des Spermiums. Die Eizelle ist groß und statisch, das Spermium hingegen ist kleiner und beweglich. Die entscheidende Rolle für die Entstehung der Geschlechtzellen spielt die Meiose. Der Zeitpunkt, an dem zum ersten Mal in der Entwicklung die Meiose einsetzt, ist der erste erkennbare Unterschied in der Gonadenentwicklung zwischen männlichen und weiblichen Wirbeltieren. Die Meiose der Keimzellen beginnt bei Weibchen früher als bei Männchen. Bei Säugetieren reguliert Retinsäure (RA) diesen Prozess. Dieses kleine polare Molekül induziert die Expression des Prä-Meiose-Markers Stra8 (stimulated by retinoic acid gene 8) in den Keimzellen, welcher für den Eintritt in die Meiose essentiell ist. Interessanterweise haben Genomanalyzen gezeigt, dass das stra8 Gen in Medaka sowie in den meisten anderen Fischarten nicht vorhanden ist. Dies stellt eine vergleichbare Rolle von RA für die Induktion der Meiose wie bei Säugetieren in diesen Fischen in Frage. Da die Rolle von RA für den Eintritt in die Meiose sowie für die Geschlechtsentwicklung in Fischen bisher nur unzureichend untersucht und verstanden ist, habe ich bei Medaka (Oryzias latipes) eine mögliche Funktion von RA für die Geschlechtsdetermination in Embryonen sowie in Gonaden geschlechtsreifer Tiere untersucht. Ich habe im Rahmen dieser Arbet eine transgene Medakalinie generiert, die in vivo eine RA induzierte Genexpression durch ein GFP Reportergen anzeigt. Mit Hilfe dieser Linie wurde die transkriptionsreulierende Aktivität von RAmit der Expression der wichtigsten Gene, die in die RA Synthese involviert sind, verglichen. Meine Ergebnisse zeigen eine Diskrepanz zwischen dem Wirkungs- und Syntheseort von RA. Die RA metabolisierenden Enzyme zeigten eine geschlechtsdimorphe Expression in adulten Medakas, mit einer höheren aldh1a2 Expression im Hoden sowie einer stärkeren cyp26a1 Expression in weiblichen Gonaden. Im Ovar sind lediglich frühe meiotische Eizellen RA-sensitiv. Im Hoden wirkt RA direkt in prä-meiotische Zellen, aber auch in Sertoli und Leydig Zellen. Stimulations-Experimente an Hoden Organkulturen ergaben, dass eine Aktivierung des RA Signalwegs zu einer Abnahme des Expressionslevels von Meiose-Markern führt. Während der Embryonalentwicklung konnte in den Keimzellen beider Geschlechter eine transkriptions-induziernende Aktivität von RA bereits zu einem Zeitpunkt beobachtet werden, der deutlich vor dem ersten Meiose Eintritt in Weibchen liegt. Behandlungen mit einem RA-Synthese Inhibitor zeigten lediglich nach der Geschlechtsdifferenzierung in Weibchen eine verminderte Expression der Meiose-Marker. Expressionsanalysen von Embryonen, die mit exogener RA behandelt wurden, ergaben eine Induktion von dmrt1a in den Gonaden und ein Anstieg von amh. Beide Gene sind sowohl in die männliche Geschlechtsentwicklung involviert, als auch in die Regulation der Keimzellproliferation und –differenzierung. Zusammen ergaben meine Untersuchungen, dass RA für die Induktion der Meiose und der Gametogenese in adulten Medakas wichtig ist. Allerdings gibt es keinen Hinweis für eine ähnliche Rolle 11 von RA bei der Initiierung der ersten Meiose in weiblichen Keimzellen während der Geschlechtsdetermination. Im Gegensatz zur bisher beschriebenen Situation, scheint darüber hinaus RA die Expression geschlechtsspezifischer Gene zu induzieren, die indirekt in die Inhibition der Meiose involviert sind. In der vorliegenden Arbeit konnte in einem stra8-unabhängigen Modelorganismus das erste Mal gezeigt werden, dass RA – abhängig vom Geschlecht und vom Stadium der Entwicklung - sowohl in die Induktion als auch in die Inhibition des Meiose-Eintritts involviert ist. KW - Japankärpfling KW - Meiose KW - Sex determination KW - Meiosis KW - Retinoic acid KW - Medaka KW - Geschlechtsdifferenzierung KW - Retinoesäure KW - Geschlechtsbestimmung Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-136335 ER - TY - THES A1 - Danner, Nadja T1 - Honey bee foraging in agricultural landscapes T1 - Sammelverhalten von Honigbienen in der Agrarlandschaft N2 - 1. Today honey bee colonies face a wide range of challenges in modern agricultural landscapes which entails the need for a comprehensive investigation of honey bees in a landscape context and the assessment of environmental risks. Within this dissertation the pollen foraging of honey bee colonies is studied in different agricultural landscapes to gain insight into the use of pollen resources and the influence of landscape structure across the season. General suggestions for landscape management to support honey bees and other pollinators are derived. 2. Decoding of waggle dances and a subsequent spatial foraging analysis are used as methods in Chapters 4 and 5 to study honey bee colonies in agricultural landscapes. The recently developed metabarcoding of mixed pollen samples was applied for the first time in honey bee foraging ecology and allowed for a detailed analysis of pollen, that was trapped from honey bees in front hive entrances (Chapter 6). 3. Pollen identification through molecular sequencing and DNA barcoding has been proposed as an alternative approach to light microscopy, which still is a tedious and error-prone task. In this study we assessed mixed pollen probes through next-generation sequencing and developed a bioinformatic workflow to analyse these high-throughput data with a newly created reference database. To evaluate the feasibility, we compared results from classical identification based on light microscopy from the same samples with our sequencing results. Abundance estimations from sequencing data were significantly correlated with counted abundances through light microscopy. Next-generation sequencing thus presents a useful and efficient workflow to identify pollen at the genus and species level without requiring specialized palynological expert knowledge. 4. During maize flowering, four observation hives were placed in and rotated between 11 landscapes covering a gradient in maize acreage. A higher foraging frequency on maize fields compared to other landuse types showed that maize is an intensively used pollen resource for honey bee colonies. Mean foraging distances were significantly shorter for maize pollen than for other pollen origins, indicating that effort is put into collecting a diverse pollen diet. The percentage of maize pollen foragers did not increase with maize acreage in the landscape and was not reduced by grassland area as an alternative pollen resource. Our findings allow estimating the distance-related exposure risk of honey bee colonies to pollen from surrounding maize fields treated with systemic insecticides. 5. It is unknown how an increasing area of mass-flowering crops like oilseed rape (OSR) or a decrease of semi-natural habitats (SNH) change the temporal and spatial availability of pollen resources for honey bee colonies, and thus foraging distances and frequency in different habitat types. Sixteen observation hives were placed in and rotated between 16 agricultural landscapes with independent gradients of OSR and SNH area within 2 km to analyze foraging distances and frequencies. SNH and OSR reduced foraging distance at different spatial scales and depending on season, with possible benefits for the performance of honey bee colonies. Frequency of pollen foragers per habitat type was equally high for SNH, grassland and OSR fields, but lower for other crops and forest. In landscapes with a small proportion of SNH a significantly higher density of pollen foragers on SNH was observed, indicating the limitation of pollen resources in simple agricultural landscapes and the importance of SNH. 6. Quantity and diversity of collected pollen can influence the growth and health of honey bee colonies, but little is known about the influence of landscape structure on pollen diet. In a field experiment we rotated 16 honey bee colonies across 16 agricultural landscapes (see also Chapter 5), used traps to get samples of collected pollen and observed the intra-colonial dance communication to gain information about foraging distances. Neither the amount of collected pollen nor pollen diversity were related to landscape diversity. The revealed increase of foraging distances with decreasing landscape diversity suggests that honey bees compensate for a lower landscape diversity by increasing their pollen foraging range in order to maintain pollen amount and diversity. 7. Our results show the importance of diverse pollen resources for honey bee colonies in agricultural landscapes. Beside the risk of exposure to pesticides honey bees face the risk of nutritional deficiency with implications for their health. By modifying landscape composition and therefore availability of resources we are able to contribute to the wellbeing of honey bees. Agri-environmental schemes aiming to support pollinators should focus on possible spatial and temporal gaps in pollen availability and diversity in agricultural landscapes. N2 - 1. Honigbienen stehen heutzutage vor einer Vielzahl von Herausforderungen in der modernen Agrarlandschaft, was umfassende Untersuchungen von Honigbienen im Landschafskontext erforderlich macht. Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Pollensammeln von Honigbienenvölkern in verschiedenen Agrarlandschaften studiert, um Einblick in die Nutzung von Pollenressourcen und auf den Einfluss der Landschaftsstruktur zu gewinnen. 2. Die Dekodierung von Schwänzeltänzen und eine anschließende räumliche Analyse des Sammelverhaltens werden als Methoden in den Kapiteln 4 und 5 eingesetzt, um Bienenvölker in Agrarlandschaften zu untersuchen. Das kürzlich entwickelte Metabarcoding von gemischten Pollenproben wurde zum ersten Mal in der Honigbienenökologie angewandt und ermöglichte eine detaillierte Analyse von Pollenproben, die per Pollenfallen vor den Stockeingängen gesammelt wurden (Kapitel 6). 3. Pollenbestimmung durch molekulare Sequenzierung und DNA Barcoding wurde als Alternative zur Lichtmikroskopie vorgeschlagen, die immer noch sehr mühsam und fehlerbehaftet ist. In dieser Studie bestimmten wir gemischte Pollenproben durch Next-Generation-Sequenzierung und entwickelten einen bioinformatischen Arbeitsablauf um diese Hochdurchsatz-Daten mit einer neu kreierten Referenzdatanbank zu analysieren. Um die Durchführbarkeit zu evaluieren verglichen wir Ergebnisse aus der klassischen Identifizierung via Lichtmikroskopie derselben Proben mit unseren Sequenzier-Ergebnissen. Häufigkeitsschätzungen auf Basis der Sequenzierdaten waren signifikant mit den gezählten Häufigkeiten via Lichtmikroskopie korreliert. Next-Generation-Sequenzierung stellt daher einen nützlichen und effizienten Arbeitsablauf dar, um Pollen auf dem Gattungs- und Artniveau zu bestimmen ohne spezielles palynologisches Expertenwissen zu benötigen. 4. Während der Maisblüte wurden vier Beobachtungsstöcke in 11 Landschaften mit einem Maisflächengradienten platziert und zwischen diesen rotiert. Maisfelder wurden intensiver genutzt als Flächen anderer Landnutzungstypen. Die mittleren Sammeldistanzen waren signifikant niedriger für Maispollen als Pollen anderer Herkunft, was darauf hinweist, dass Aufwand in das Sammeln einer diversen Pollendiät gesetzt wird. Der Anteil an Maispollensammlerinnen stieg nicht mit der Maisanbaufläche in der Landschaft und wurde nicht durch Grünlandfläche als alternative Pollenressource reduziert. Unsere Ergebnisse ermöglichen die Schätzung des entfernungsbezogenen Expositionsrisikos von Honigbienenvölker auf Pollen aus den umliegenden Maisfeldern, die mit systemischen Insektiziden behandelt werden. 5. Es ist nicht bekannt, wie eine Zunahme von Massentrachten wie Raps (OSR) oder eine Abnahme von halbnatürlichen Habitaten (SNH) die zeitliche und räumliche Verfügbarkeit von Pollenressourcen für die Honigbienen, und damit Sammeldistanzen und -frequenzen in verschiedenen Lebensraumtypen verändert. Sechzehn Beobachtungsstöcke wurden in 16 Agrarlandschaften mit unabhängigen Gradienten an OSR- und SNH-Fläche innerhalb von 2 km platziert und regelmäßig rotiert, um Sammeldistanzen und -frequenzen zu analysieren. SNH und OSR reduzierten die Sammeldistanzen auf verschiedenen räumlichen Skalen und je nach Saison, mit möglichen Vorteilen für die Leistungsfähigkeit von Bienenvölkern. Die Häufigkeit der Pollensammler pro Habitattyp war gleich hoch für SNH, Grünland und OSR, aber niedriger für andere Kulturen und Wald. In Landschaften mit einem kleinen Anteil von SNH wurde eine deutlich höhere Dichte von Pollensammlerinnen auf SNH beobachtet, was auf die Begrenzung der Pollenressourcen in einfachen Agrarlandschaften und die Bedeutung von SNH hinweist. 6. Menge und Diversität des gesammelten Pollens können das Wachstum und die Gesundheit von Honigbienenvölkern beeinflussen, aber es ist wenig über den Einfluss der Landschaftsstruktur auf die Pollendiät bekannt. In einem Feldexperiment rotierten wir 16 Honigbienenkolonien über 16 Agrarlandschaften (siehe auch Kapitel 5), nutzten Pollenfallen um Proben des gesammelten Pollens zu nehmen und beobachteten die intrakoloniale Tanzkommunikation, um Informationen über die Sammeldistanzen zu erhalten. Weder Pollenmenge noch -diversität waren von der Landschaftsdiversität abhängig. Der offenbarte Anstieg von Sammeldistanzen mit abnehmender Landschaftsdiversität legt nahe, dass Honigbienen durch die Erweiterung des Pollensammelbereichs eine niedrigere Landschaftsdiversität kompensieren, um Pollenmenge und -diversität zu erhalten. 7. Unsere Ergebnisse zeigen die Bedeutung eines diversen Pollenangebots für Bienenvölker in der Agrarlandschaft. Neben dem Risiko einer Exposition gegenüber Pestiziden, stehen Bienenvölker vor der Gefahr von Mangelernährung mit Auswirkungen auf ihre Gesundheit. Durch eine Änderung der Landschaftzusammensetzung und damit der Verfügbarkeit von Ressourcen können wir zum Wohlergehen der Honigbienen beitragen. Agrarumweltmaßnahmen mit dem Ziel Bestäuber zu unterstützen, sollten sich auf mögliche räumliche und zeitliche Lücken in der Pollenverfügbarkeit und Vielfalt in der Agrarlandschaft konzentrieren. KW - Apis mellifera KW - Zea mays KW - Resource Use KW - Exposure Risk KW - Oilseed Rape KW - foraging distances KW - Sammeldistanzen KW - semi-natural habitat KW - halbnatürliche Habitate KW - next-generation sequencing KW - pollen KW - Pollen KW - Next-Generation Sequenzierung KW - Landschaftsstruktur KW - landscape structure Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-139322 ER - TY - THES A1 - Zimnol, Anna T1 - Relevance of angiotensin II type 1a receptor and NADPH oxidase for the formation of angiotensin II-mediated DNA damage T1 - Relevanz des Angiotensin II Typ 1a-Rezeptors und der NADPH-Oxidase für die Entstehung Angiotensin II-vermittelter DNA-Schäden N2 - Das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System (RAAS) reguliert den Blutdruck sowie den Elektrolyt- und Wasserhaushalt. Das aktive Peptid, Angiotensin II (AngII), führt dabei zur Vasokonstriktion und in höheren Konzentrationen zu Bluthochdruck. Hypertensive Patienten haben ein erhöhtes Risiko an Krebs zu erkranken, vor allem an Nierenkrebs. Wir konnten bereits in vivo zeigen, dass AngII in der Lage ist, den Blutdruck zu steigern und dosisabhängig zu DNA-Schäden über den Angiotensin II Typ 1-Rezeptor (AT1R) führt. Ein stimuliertes RAAS kann ferner über die Aktivierung der NADPH-Oxidase, einer Hauptquelle der Generierung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) in der Zelle, zu oxidativem Stress führen. Zielsetzung dieser Arbeit war es zum einen, mit Hilfe von AT1a-Rezeptor-defizienten Mäusen in vivo zu prüfen, ob die Bildung von ROS, sowie die Bildung von DNA-Schäden in der Niere und im Herzen unabhängig von einem erhöhten Blutdruck auftreten. Zum anderen sollte, ebenfalls in vivo, untersucht werden, ob eine oder beide von zwei untersuchten Isoformen der NADPH-Oxidase (Nox) für die Auslösung oxidativen Stresses in der Niere verantwortlich ist. Zunächst wurden für den Versuch zur Überprüfung der Abhängigkeit AngII-induzierter DNA-Schäden vom Blutdruck männliche C57BL/6-Mäuse und AT1a-Knockout (KO)-Mäuse mit osmotischen Minipumpen ausgestattet, die AngII in einer Konzentrationen von 600 ng/kg min über einen Zeitraum von 28 Tagen abgaben. Zusätzlich wurde eine Gruppe von AngII-behandelten Wildtyp (WT)-Mäusen mit dem AT1-Rezeptor-Blocker Candesartan (Cand) behandelt. Während des Versuchszeitraumes fanden regelmäßige, nicht-invasive Blutdruckmessungen an den wachen Mäusen statt. In WT-Mäusen induzierte AngII Bluthochdruck, verursachte erhöhte Albumin-Level im Urin und führte zur Bildung von ROS in Niere und im Herzen. Außerdem traten in dieser Gruppe DNA-Schäden in Form von Einzel- und Doppelstrangbrüchen auf. All diese Reaktionen auf AngII konnten jedoch durch gleichzeitige Behandlung mit Cand verhindert werden. AT1a-KO-Mäuse hatten, verglichen mit WT-Kontrollmäusen, einen signifikant niedrigeren Blutdruck und normale Albumin-Level im Urin. In AT1a-KO-Mäusen, die mit AngII behandelt wurden, konnte kein Anstieg des systolischen Blutdrucks sowie kein Einfluss auf die Nierenfunktion gefunden werden. Jedoch führte AngII in dieser Gruppe zu einer Steigerung von ROS in der Niere und im Herzen. Zusätzlich wurden genomische Schäden, vor allem in Form von Doppelstrangbrüchen signifikant in dieser Gruppe induziert. Auch wenn AT1a-KO-Tiere, unabhängig von einer AngII-Infusion, keine eingeschränkte Nierenfunktion zeigten, so wiesen sie erhebliche histopathologische Schäden im Hinblick auf die Glomeruli und das Tubulussystem auf. Diese Art von Schäden deuten auf eine besondere Bedeutung des AT1aR im Hinblick auf die embryonale Entwicklung der Niere hin. Zusammenfassend beweisen die Ergebnisse dieses Experiments eindeutig, dass eine AngII-induzierte ROS-Produktion und die Induktion von DNA-Schäden unabhängig von einem erhöhten Blutdruck auftreten. Da in der AngII-behandelten AT1a-KO-Gruppe eine signifikant höhere Expression des AT1b-Rezeptors zu finden war und die Blockade von beiden Rezeptorsubtypen mit Cand zu einer Verhinderung der schädlichen Effekte durch AngII führte, scheint der AT1bR im Falle einer AT1aR-Defizienz für die Entstehung der Schäden zuständig zu sein. Ziel des zweiten Experimentes war es, den Beitrag der Nox2 und Nox4 zum oxidativen DNA-Schaden in vivo zu untersuchen. Hierfür wurden männliche C57BL/6-Mäuse und Nox2- oder Nox4-defiziente Mäuse mit osmotischen Minipumpen ausgestattet, die AngII in einer Konzentration von 600 ng/kg min über einen Zeitraum von 28 Tagen abgaben. Im WT-Stamm und in beiden Nox-defizienten Stämmen induzierte AngII Bluthochdruck, verursachte erhöhte Albumin-Level im Urin und führte zur Bildung von ROS in der Niere. Außerdem waren in allen AngII-behandelten Gruppen genomische Schäden, vor allem in Form von Doppelstrangbrüchen, erhöht. Auch in Abwesenheit von AngII wiesen Nox2- und Nox4-defiziente Mäuse mehr Doppelstrangbrüche im Vergleich zu WT-Kontrollmäusen auf. Interessanterweise kompensieren allerdings weder Nox2 noch Nox4 das Fehlen der jeweils anderen Isoform auf RNA-Basis. Aufgrund dieser Ergebnisse schließen wir, dass bislang keine Isoform alleine für die Generierung von oxidativen DNA-Schäden in der Niere verantwortlich gemacht werden kann und dass eine Beteiligung einer weiteren Nox-Isoform sehr wahrscheinlich ist. Möglicherweise könnten aber auch andere ROS-generierende Enzyme, wie Xanthinoxidase oder Stickoxidsynthase involviert sein. Da genomische Schäden in Nieren von Nox2- und Nox4-defizienten Mäusen in Abwesenheit von AngII gegenüber den Schäden in WT-Kontrollmäusen erhöht waren, könnten die beiden Isoformen auch eine schützende Funktion im Bereich von Nierenkrankheiten übernehmen. Da dies aber bislang nur für Nox4 beschrieben ist, ist es wahrscheinlicher, dass das Fehlen von einer der beiden Isoformen eher einen Einfluss auf die Embryonalentwicklung hat. Um dies jedoch abschließend zu klären wäre es sinnvoll mit induzierbaren Knockout-Modellen zu arbeiten, bei denen mögliche entwicklungsbedingte Effekte minimiert werden können. N2 - The renin-angiotensin-aldosterone system (RAAS) regulates blood pressure, electrolyte metabolism and water balance. The reactive peptide, Angiotensin II (AngII), of the RAAS causes vasoconstriction and, in higher concentrations, increased blood pressure. Hypertensive patients have an increased risk to develop cancer, especially kidney cancer. We have shown in vivo, that AngII is capable to cause an elevation of blood pressure, as well as DNA damage dose-dependently via the AngII type 1 receptor (AT1R). A stimulated RAAS can further lead to oxidative stress by activating NADPH oxidases which are major enzymatic sources of reactive oxygen species (ROS) in the cell. On the one hand the aim of this work was to examine in vivo with the help of AT1aR-deficient mice whether the formation of ROS and DNA damage in the kidney and the heart occur independently of an increased blood pressure. On the other hand we wanted to investigate whether one or both of the two examined isoforms of the NADPH oxidase (Nox) is responsible for the triggering of oxidative stress in the kidney. For the purpose of the first experiment which examined the dependency of AngII-induced DNA damage on blood pressure, male C57BL/6-mice and AT1a-knockout (KO)-mice were equipped with osmotic minipumps, delivering AngII in a concentration of 600 ng/kg x min during 28 days. Additionally, wild-type (WT) mice were treated with the AT1R antagonist candesartan (cand). Over the whole time period, frequent non-invasive blood pressure measurements were taken. In WT mice, AngII induced hypertension, an elevated urinary albumin level and formation of ROS in kidney and heart. Furthermore, genomic damage, in form of single- and double strand breaks, was augmented in this group. All these responses to AngII could be attenuated by concurrent administration of candesartan. AT1a-deficient mice had lower basal systolic pressures than WT mice and comparable urinary albumin levels. In AT1a-deficient mice treated with AngII, systolic pressure was not increased, and no effect on renal function could be detected. However, AngII led to an increase of ROS in kidney and heart in this group. In addition, genomic damage, especially in form of double strand breaks was significantly induced. Although AT1a-KO-mice, independent of an AngII-infusion, showed no renal impairment they had significant histopathological changes in glomeruli and tubules. This points to a special importance of AT1aR with regard to the embryonic development of the kidney. In summary our results clearly demonstrate that AngII-induced ROS production and DNA damage is independent of blood pressure. Since we found a significantly higher expression of the AT1bR in the AngII-treated AT1aR-KO-group and since blocking of both subtypes with cand resulted in a complete prevention of adverse AngII effects, the receptor responsible for the mediation of these effects seems to be AT1bR. The aim of the second experiment was to examine the contribution of Nox2 and Nox4 to oxidative DNA damage in vivo. Therefore male C57BL/6-mice and Nox2- or Nox4-deficient mice were equipped with osmotic minipumps, delivering AngII in a concentration of 600 ng/kg × min during 28 days. In WT and in both strains of Nox-deficient mice, AngII induced hypertension, elevated urinary albumin levels and formation of ROS in the kidney. Furthermore, genomic damage, especially in form of double strand breaks were augmented in all of the AngII-treated groups. Also in the absence of AngII, Nox2- and Nox4-deficient mice exhibited a higher background of double strand breaks. Interestingly neither Nox2 nor Nox4 do not compensate for the deficiency of the other isoform on mRNA level. Due to these results we conclude that there is no isoform so far which is solely responsible for the generation of ROS in the kidney under AngII-treatment. Potentially there might also be a contribution of other enzymes like xanthine oxidase or nitric oxide synthase to the formation of ROS. Since genomic damage in kidneys of Nox2- and Nox4-deficient mice in the absence of AngII was higher as compared to the damages in WT control mice it might be that both isoforms could have a protective role in renal disease. But, since this is so far only described for Nox4 it is likely that the absence of one of the two isoforms rather has an influence on the embryonic development. To finally clarify this hypothesis it would be suggestive to work with inducible knockout mouse models where possible developmental effects can be minimized. KW - Angiotensin II KW - NADPH-Oxidase KW - DNS-Schädigung KW - Oxidativer Stress KW - Angiotensin II KW - NADPH oxidase KW - angiotensin II type 1a receptor KW - DNA damage KW - oxidative stress KW - Angiotensin II Typ 1a-Rezeptor Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-137469 ER - TY - THES A1 - Kunz, Meik T1 - Systembiologische Analysen von Interaktionen: Zytokinine (Pflanzenpathogene), 3D-Zellkulturen (Krebstherapie) und Drugtargets T1 - Systems biology analysis of interactions: Cytokinins (plant pathogens), 3D cell cultures (cancer therapy) and drug targets N2 - Der Einsatz von computergestützten Analysen hat sich zu einem festen Bestandteil der biowissenschaftlichen Forschung etabliert. Im Rahmen dieser vorliegenden Arbeit wurden systembiologische Untersuchungen auf verschiedene biologische Themengebiete und Organismen angewendet. In diesem Zusammenhang liefert die Arbeit einen innovativen und interdisziplinären methodischen Ansatz. Die grundlegende Frage lautet: Wie verstehe und beschreibe ich Signalwege und wie kann ich sie beeinflussen? Der Ansatz verknüpft verschiedene biologische Datensätze und Datenebenen miteinander, beginnend vom Genom und Interaktionskontext über semiquantitative Simulationen hin zu neuen Interventionen und Experimenten, welche therapeutisch und biotechnologisch genutzt werden können. Die Analysen können auf diese Weise - zu einem besseren Verständnis experimenteller Daten und biologischer Fragestellungen beitragen und ermöglichen ein systematisches Verständnis der zugrunde liegenden Signalwege und Netzwerkeffekte (z.B. in Pflanzen). - Darüber hinaus ermöglichen sie die Identifizierung wichtiger funktioneller Hubproteine und die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien für weitere experimentelle Testungen (z.B. Tumormodelle), - stellen zudem einen hilfreichen Schritt auf dem Weg zur personalisierten Medizin (z.B. lncRNAs und Tumormodelle) und Medikamentenentwicklung (z.B. Datenbank DrumPID) dar. (i) Als Grundlage wurde hierzu eine integrierte systembiologische Methode entwickelt, welche experimentelle Daten (z.B. Transkriptomdaten) hinsichtlich ihrer biologischen Funktionen untersucht und die Identifizierung relevanter funktioneller Cluster und Hubproteine ermöglicht. In einem ersten Teil wurden Analysen zum pflanzlichen Immunsystem durchgeführt. Mithilfe der entwickelten Methode wurden Genexpressionsdatensätze von A. thaliana, die mit dem Pathogen Pst DC3000 infiziert wurden, untersucht, um den Einfluss verschiedener Virulenzfaktoren auf das Interaktom der Wirtspflanze zu untersuchen und neue Modulatoren einer CK-vermittelten Immunabwehr zu finden. In diesem Zusammenhang konnte gezeigt werden, dass die von Pst DC3000 sekretierten Abwehrstoffe wichtige pflanzliche Hormonsignalwege für die Immunabwehr in A. thaliana beeinflussen. Die Ergebnisse zeigen zudem, dass sich der Einfluss auf das Netzwerkverhalten der Effektorproteine und COR-Phytotoxine von dem der PAMPs unterscheidet, sich jedoch auch eine Regulierung gemeinsamer Signalwege und eine Überlappung der beiden Phasen der Immunantwort (PTI und ETI) in A. thaliana finden lassen. Die komplexe Immunantwort auf eine Infektion spiegelt sich zudem in einer höheren Anzahl an funktionellen Clustern und Hubproteinen in Pst DC3000 gegenüber den beiden untersuchten Mutanten wider, wobei sich für Pst DC3000 insbesondere ein stark vernetztes immunrelevantes Cluster um den JA-Signalweg zeigt. Weiterhin wurden anhand der entwickelten Methode wichtige Hubproteine für die Immunabwehr identifiziert. Als bedeutende Vertreter sind AHK2 und AAR14 zu nennen, welche Teil des Zweikomponentensystems der Signalübertragung von CK sind und hierbei wichtige Modulatoren für eine CK-vermittelte Immunabwehr darstellen. (ii) Im zweiten Teil der Arbeit schließen sich Untersuchungen an einem in vitro-Experiment einer 2D- und 3D-Zellkultur einer HSP90-Behandlung in einem Lungentumormodell an. In diesem Zusammenhang wurden mithilfe der entwickelten Methode Unterschiede zwischen den beiden Zellkultursystemen gefunden, die das unterschiedliche Behandlungsansprechen erklären, und für die beiden KRAS-mutierten Zelllinien A549 und H441 des 3D-Testsystems neue prognostische und therapeutische Kandidaten identifiziert. Hierbei haben die durchgeführten Analysen zwei funktionelle Cluster von Protein-Interaktionen um p53 und die STAT-Familie gefunden, welche eine Verbindung zu HSP90 haben und die entsprechenden Behandlungsunterschiede nach einer HSP90-Inhibierung zwischen den beiden Zellkultursystemen erklären können. Unter Berücksichtigung des zelllinien-spezifischen Mutationshintergrunds wurde eine prognostische Markersignatur und daraus abgeleitet HIF1A für die H441-Zelllinie und AMPK für die A549-Zelllinie als neue therapeutische Targets gefunden, wobei die anschließend durchgeführten in silico-Simulationen einen potentiellen therapeutischen Effekt aufzeigen konnten. Weiterhin wurden wichtige experimentelle Readout-Parameter in ein in silico-Lungentumormodell integriert, wobei unter Einbeziehung des Mutationshintergrunds für die verwendeten Zelllinien die HSP90-Behandlung des 3D-Testsystems computergestützt abgebildet werden konnte. Im weiteren Verlauf wurden im in silico-Lungentumormodell Resistenzmechanismen nach einer Gefitinib-Behandlung mit bekanntem Mutationsstatus für die Zelllinien HCC827 und A549 untersucht und daraus folgend neue Therapieansätze abgeleitet, die von potentieller klinischer Bedeutung sein können. Die durchgeführten in silico-Simulationen für HCC827 konnten hierbei zeigen, dass eine EGFR- und c-MET-Koaktivierung zu einer Gefitinib-Resistenz führen kann, wohingegen bei den A549 eine Komutation von KRAS und IGF-1R zu einem geringen Behandlungsansprechen beiträgt. Die Simulationen lassen zudem erkennen, dass eine direkte Inhibierung der an der Resistenzentwicklung beteiligten Rezeptoren c-MET und IGF-1R in beiden Fällen nicht die bestmögliche Therapiestrategie darstellt. In beiden Zelllinien konnte gezeigt werden, dass eine kombinierte Inhibierung von PI3K und MEK den bestmöglichen therapeutischen Effekt liefert, was demnach einen vielversprechenden Therapieansatz bei Gefitinib-resistenten Lungentumorpatienten darstellt. In einem weiteren Schritt wurde das therapeutische Potential der miRNA-21 im in silico-Modell für die HCC827-Zelllinie untersucht. Die durchgeführten Simulationen zeigen, dass eine miRNA-21-Überexpression zu einer Resistenzentwickung nach Gefitinib-Behandlung beitragen kann, wobei eine Inhibierung der miRNA-21 diesen Effekt umkehren kann. Die Ergebnisse lassen zudem erkennen, dass eine PTEN-Aktivierung als potentieller Marker einer erfolgreichen therapeutischen Inhibierung der miRNA-21 fungieren kann, wohingegen eine reduzierte miRNA-21-Expression als möglicher Marker für eine erfolgreiche Gefitinib-Behandlung dienen kann. (iii) Im dritten Teil der Arbeit wurden systematisch RNA- und Protein-Interaktionen untersucht. Hierzu wurden integrierte systembiologische Analysen an neu identifizierten und funktionell bislang unbekannten lncRNAs durchgeführt. Die Analysen für die infolge einer Herzhypertrophie hochregulierte lncRNA Chast haben umfassend gezeigt, dass diese Proteine und Transkriptionsfaktoren regulieren und binden kann, welche die Signalübertragung und Genexpression regulieren, aber auch eine Verbindung zum kardiovaskulären System und stressinduzierter Herzhypertrophie besitzt. Anhand der Ergebnisse lässt sich schlussfolgern, dass Chast direkt und indirekt (a) Proteine binden und die Translation beeinflussen kann, zudem eine Chromatin-modifizierende Funktion besitzt und so die Transkription, z.B. für herz- und stress-assoziierte Gene, reguliert, und/oder (b) in einem negativen Feedbackloop seine eigene Transkription reguliert. Obwohl lncRNAs meist eine geringe Konservierung aufweisen, konnten die durchgeführten Analysen für Chast eine Sequenz-Struktur-Konservierung in Säugetieren aufzeigen. Weiterhin haben die Untersuchungen an zwei hypoxie-induzierten lncRNAs in Endothelzellen gezeigt, dass die lncRNA MIR503HG eine hohe Sequenz-Struktur-Konservierung in Säugetieren besitzt, wohingegen die LINC00323-003 eine geringe Konservierung aufzeigt. Dies untermauert die Tatsache, dass lncRNAs häufig eine geringe Konservierung aufweisen, was Untersuchungen in Modellorganismen hinsichtlich einer therapeutischen Nutzung schwierig machen. Da sich zahlreiche Untersuchungen auf Interaktionen und Signalwege konzentriert haben, wurde abschließend eine Datenbank entwickelt, welche Analysen von Protein-Interaktionen und Signalwegen nachhaltig voranbringt. Die entwickelte DrumPID-Datenbank stellt insbesondere die Interaktion zwischen einem Medikament und seinem Target in den Fokus und ermöglicht Analysen einzelner Interaktionen und beteiligter Signalwege, bietet zusätzlich aber auch verschiedene Links zu anderen Datenbanken für individuelle weiterführende Analysen. DrumPID ermöglicht ein geeignetes Medikament u. a. für ein vorgegebenes Zielprotein zu finden und dessen Wirkmechanismus und Interaktionskontext zu untersuchen, was zu einem besseren experimentellen Verständnis beitragen kann. Zudem erlaubt DrumPID eine potentielle chemische Leitstruktur für ein Zielprotein zu entwickeln, was z.B. spezifisch ein parasitisches Protein inhibiert, ohne dabei einen toxischen Effekt im Menschen zu haben. Zahlreiche weitere Pharmakabeispiele belegen, dass DrumPID für den täglichen wissenschaftlichen Gebrauch auf dem Gebiet der Analyse von Protein-Pharmaka-Interaktionen und der Medikamentenentwicklung geeignet ist. Die beschriebenen Ergebnisse der Promotionsarbeit wurden in fünf Originalarbeiten, zwei Übersichtsartikeln und einem Buchteil, u. a. in Science Translational Medicine, veröffentlicht, sechs dieser Publikationen erfolgten im Rahmen von Erstautorschaften. N2 - The use of computer-based analysis has become an integral part of life science research. Within this thesis, systems biology investigations have been applied to various biological topics and organisms which provides an innovative and interdisciplinary methodological approach. The basic question was: How do I understand and describe signaling pathways and how can I influence them? The approach combines various biological data sets and data levels starting from the genome and interaction context over semiquantitative simulations towards new interventions and experiments which can be used therapeutically and biotechnologically. The analysis can contribute to - a better understanding of experimental data and biological questions and enables a systematic understanding of the signaling pathways and network effects (e.g. in plants). - They enable the identification of important functional hub nodes as well as the development of new therapeutic strategies for further experimental testing (e.g. tumor models), - also representing a helpful step on the path to personalized medicine (e.g. lncRNAs and tumor models) and drug development (e.g. database DrumPID). (i) As a basis, an integrated systems biology methodology was developed which examines experimental data sets (e.g. transcriptome data) with respect to their biological functions and enables the identification of relevant functional clusters and hub nodes. In the first part of the thesis, analyzes regarding the plant immune system were accomplished. Using the developed methodology, gene expression datasets of A. thaliana infected with the pathogen Pst DC3000 were analyzed in order to investigate the influence of different virulence factors on the host interactome, and to find new modulators of CK-mediated immune defense. In this context, the analysis could show that the secreted defense compounds of Pst DC3000 influence important plant hormone signaling pathways for the immune defense in A. thaliana. Moreover, the results show that the impact on the network behavior of the effector proteins and COR phytotoxins differ from the PAMPs, but there also exists an overlap in common regulated signal pathways as well as an overlap between the two phases of immune response (PTI and ETI) in A. thaliana. In addition, the complex immune response to an infection is also reflected by a higher number of functional clusters and hub nodes in Pst DC3000 compared to the two studied mutants, whereby for Pst DC3000 a highly connected immune-relevant cluster around the JA pathway has been found. Furthermore, using the developed methodology several important hub nodes for the immune defense have been identified. As most important candidates, AHK2 and AAR14 have to be highlighted which are part of the two-component-system of signal transduction of CK and represent in this context important modulators for a CK mediated immune defense. (ii) In the second part of the thesis, analyzes of a HSP90 treatment in lung cancer in an in vitro experiment in 2D and 3D cell cultures were accomplished. In this context using the developed methodology, differences between the two cell cultures explaining the differences in treatment responses were found, and for the two KRAS mutated cell lines A549 and H441 of the 3D test system new prognostic marker and therapeutic drug candidates were identified. However, the analyzes found two functional clusters of protein interactions around p53 and the STAT family which have a connection to HSP90 and might explain the observed treatment differences for the HSP90 inhibition between the two cell culture systems. Considering the mutational background of the cell lines, a prognostic marker signature were found and derived from it HIF1A for the H441 cell line and AMPK for the A549 cell line as new therapeutic drug targets. Moreover, the subsequently performed in silico simulations could show a potential therapeutic effect of the identified drug targets. Furthermore, important experimental read-out parameters were integrated into the in silico lung tumor model, and by considering the mutation background of the used cell lines the HSP90 treatment of the 3D test system could be in silico simulated. In the further course of the thesis, resistance mechanisms after gefitinib treatment with known mutation status for the HCC827 and A549 cell lines were investigated in the in silico lung tumor model and consequently new therapeutic approaches were derived which may be of potential clinical relevance. Here, the in silico simulations for HCC827 cells show that a co-activation of EGFR and c-MET can lead to a gefitinib resistance, whereas in the A549 a co-mutation of KRAS and IGF-1R can contribute to the reduced treatment response. In addition, the simulations reveal that a direct inhibition of the resistance contributing receptors c-MET and IGF-1R reflect not the best treatment strategy in both cases. However, in both cell lines a combined inhibition of PI3K and MEK provides the best therapeutic effect, thus representing a promising new therapeutic approach in gefitinib resistant lung cancer patients. In a further step, the therapeutic potential of the miRNA-21 was examined in the in silico model for the HCC827 cells. The simulations show that an overexpression of the miRNA-21 can contribute to a resistance development after gefitinib treatment, in which an inhibition of the miRNA-21 reverses this effect. Moreover, the results show that a PTEN activation can function as a potential marker of therapeutic success of miRNA-21 inhibition whereas a reduced miRNA-21 expression may serve as a potential marker for a successful gefitinib treatment. (iii) In the third part of the thesis, systematic RNA and protein interactions were investigated. For this, integrated systems biology analyzes were carried out on new identified and previously functional unknown lncRNAs. The analyzes of the cardiac hypertrophy caused upregulated lncRNA Chast have extensive demonstrated that Chast can regulate and bind proteins and transcription factors which regulate signal transduction and gene expression, but it has also a connection to the cardiovascular system and stress-induced cardiac hypertrophy. Based on the results, it can be concluded that Chast can directly and indirectly (a) bind proteins and influence the translation but also possess a chromatin-modifying function and regulate transcription e.g. for cardiac and stress-associated genes, and/or (b) regulate its own transcription in a negative feedback loop. Although lncRNAs often have a low conservation the analysis could show a sequence-structure-conservation for Chast in mammalians. Furthermore, the investigations for two hypoxia induced endothelial lncRNAs have shown that the lncRNA MIR503HG represents a high sequence-structure-conservation in mammalians, whereas the LINC00323-003 shows a low conservation. This underscores the fact that lncRNAs often have a low conservation thereby making studies regarding the therapeutic potential in model organisms difficult. Finally, as numerous analyzes in this thesis have focused on interactions and signaling pathways, a database was developed which brings a sustainable progress in analysis of protein interactions and signaling pathways. The developed DrumPID database puts especially the interaction between a drug and its target into its focus and allows analysis of individual interactions and involved signaling pathways but, additionally, provides various crosslinks to other databases for individual further analysis. DrumPID enables to find a suitable drug, e.g. for a given target protein, and to analyze its mechanism of action as well as interaction context which can contribute to a better understanding of experimental data. Moreover, DrumPID allows to develop a potential chemical lead structure for a target protein which e.g. specifically inhibits a parasitic protein but has no toxic effect in humans. Numerous additional pharmaceutical examples verify that DrumPID is suitable for the daily scientific usage in the field of analysis of protein-drug-interactions and drug development. The described results of the doctoral thesis were published in five research papers, two review articles and a book chapter, e.g. in Science Translational Medicine, including six first authorships. KW - Systembiologie KW - Interaktionen KW - Zytokinine (Pflanzenpathogene) KW - 3D-Zellkulturen (Krebstherapie) KW - Drugtargets KW - Systembiologische Analysen Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-134911 ER - TY - THES A1 - Kuen, Janina T1 - Influence of 3D tumor cell/fibroblast co-culture on monocyte differentiation and tumor progression in pancreatic cancer T1 - Einfluss von 3D Tumorzell/Fibroblasten Ko-kulturen auf die Monozyten Differenzierung und das Tumorwachstum bei Bauchspeicheldrüsenkrebs N2 - Pancreatic cancer (PC) remains one of the most challenging solid tumors to treat with a high unmet medical need as patients poorly respond to standard-of-care-therapies. Prominent desmoplastic reaction involving cancer-associated fibroblasts (CAFs) and the immune cells in the tumor microenvironment (TME) and their cross-talk play a significant role in tumor immune escape and progression. To identify the key cellular mechanisms induce an immunosuppressive tumor microenvironment, we established 3D co-culture model with pancreatic cancer cells, CAFs, monocyte as well as T cells. Using this model, we analysed the influence of tumor cells and fibroblasts on monocytes and their immune suppressive phenotype. Phenotypic characterization of the monocytes after 3D co-culture with tumor/fibroblast spheroids was performed by analysing the expression of defined cell surface markers and soluble factors. Functionality of these monocytes and their ability to influence T cell phenotype and proliferation was investigated. 3D co-culture of monocytes with pancreatic cancer cells and fibroblasts induced the production of immunosuppressive cytokines which are known to promote polarization of M2 like macrophages and myeloid derived suppressive cells (MDSCs). These co-culture spheroid polarized monocyte derived macrophages (MDMs) were poorly differentiated and had an M2 phenotype. The immunosuppressive function of these co-culture spheroids polarized MDMs was demonstrated by their ability to inhibit autologous CD4+ and CD8+ T cell activation and proliferation in vitro, which we could partially reverse by 3D co-culture spheroid treatment with therapeutic molecules that are able to re-activate spheroid polarized MDMs or block immune suppressive factors such as Arginase-I. In conclusion, we generated a physiologically relevant 3D co-culture model, which can be used as a promising tool to study complex cell-cell interactions between different cell types within the tumor microenvironment and to support drug screening and development. In future, research focused on better understanding of resistance mechanisms to existing cancer immunotherapies will help to develop new therapeutic strategies in order to combat cancer. N2 - Bei Bauchspeicheldrüsenkrebs handelt es sich um eine maligne Tumorerkrankung, deren Behandlung Ärzte noch immer vor große Herausforderungen stellen und die zur dritthäufigsten krebsbedingten Todesursache der westlichen Welt zählt. Desmoplastische Reaktionen im Tumorgewebe sind hierbei ein besonderes Merkmal dieser Erkrankung. Dabei spielen tumor-assoziierte Fibroblasten sowie unterschiedliche Zellen des Immunsystems und deren Interaktionen eine essentielle Rolle hinsichtlich Tumorwachstum und der Herunterregulation des Immunsystems. Um zelluläre Mechanismen, die ein immunsuppressives Tumormilieu induzieren, zu identifizieren, entwickelten wir ein 3D Ko-Kultur Modell mit Bauchspeicheldrüsenkrebszellen, tumor-assoziierten Fibroblasten sowie Monozyten und T-Zellen. Mit Hilfe dieses Modells konnten wir den Einfluss von Tumorzellen und Fibroblasten auf den Phänotyp und das Verhalten von Monozyten untersuchen. Dazu wurden Monozyten in einer 3D Tumorzell/Fibroblasten Ko-Kultur kultiviert und differenziert, um anschließend die Expression definierter Zelloberflächenmarker und löslicher Faktoren zu analysieren. Des Weiteren wurde das Verhalten dieser 3D Ko-Kultur differenzierten myeloiden Zellpopulation sowie ihre Fähigkeit den Phänotyp von T Zellen und deren Proliferation zu beeinflussen untersucht. Die 3D Ko-Kultur der Monozyten zusammen mit den Tumorzellen und den Fibroblasten führten zur Produktion immunsuppressiver Zytokine und Chemokine, wodurch die Differenzierung der Monozyten in M2-ähnliche Makrophagen induziert wurde. Diese durch die 3D Tumorzell/Fibroblasten Sphäroide polarisierten aus Monozyten herangereiften M2-ähnlichen Makrophagen besaßen außerdem immunsuppressive funktionelle Eigenschaften, indem sie in der Lage waren, die Aktivierung und Proliferation von autologen CD4+ und CD8+ T Zellen in vitro zu inhibieren. Die Suppression sowohl der CD4+ als auch der CD8+ T Zellen konnte durch die Behandlung therapeutischer Moleküle, die die Re-Aktivierung der immunsuppressiven 3D Sphäroid polarisierten Makrophagen stimulierten oder suppressive Faktoren wie Arginase-I blockierten, wieder aufgehoben und die T Zell Proliferation teilweise wiederhergestellt werden. Unser etabliertes 3D Ko-Kultur System repräsentiert ein vielversprechendes physiologisch relevantes Modell, welches genutzt werden kann, um Zell-Zell Interaktion und Kommunikation im Tumormilieu zu untersuchen und dadurch die Wirkung von Medikamenten zu verbessern. Ein gezieltes besseres Verständnis von Tumorresistenz Mechanismen gegen bereits bestehende Immun Therapien fördert die Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze zur Bekämpfung von Krebs. KW - monocyte KW - pancreatic cancer KW - 3D cell culture KW - monocyte differentiation KW - Bauchspeicheldrüsenkrebs KW - fibroblasts KW - TAMs KW - 3D Ko-kulture KW - Monozytendifferenzierung KW - Fibroblasten Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-156226 ER - TY - THES A1 - Iltzsche, Fabian T1 - The Role of DREAM/MMB-mediated mitotic gene expression downstream of mutated K-Ras in lung cancer T1 - Die Rolle DREAM/MMB-vermittelter mitotischer Genexpression unterhalb von mutiertem K-Ras in Lungenkrebs N2 - The evolutionary conserved Myb-MuvB (MMB) multiprotein complex has an essential role in transcriptional activation of mitotic genes. MMB target genes as well as the MMB associated transcription factor B-Myb and FoxM1 are highly expressed in a range of different cancer types. The elevated expression of these genes correlates with an advanced tumor state and a poor prognosis. This suggests that MMB could contribute to tumorigenesis by mediating overexpression of mitotic genes. Although MMB has been extensively characterized biochemically, the requirement for MMB to tumorigenesis in vivo remains largely unknown and has not been tested directly so far. In this study, conditional knockout of the MMB core member Lin9 inhibits tumor formation in vivo in a mouse model of lung cancer driven by oncogenic K-Ras and loss of p53. The incomplete recombination observed within tumors points towards an enormous selection pressure against the complete loss of Lin9. RNA interference (RNAi)-mediated depletion of Lin9 or the MMB associated subunit B-Myb provides evidence that MMB is required for the expression of mitotic genes in lung cancer cells. Moreover, it was demonstrated that proliferation of lung cancer cells strongly depends on MMB. Furthermore, in this study, the relationship of MMB to the p53 tumor suppressor was investigated in a primary lung cancer cell line with restorable p53 function. Expression analysis revealed that mitotic genes are downregulated after p53 re-expression. Moreover, activation of p53 induces formation of the repressive DREAM complex and results in enrichment of DREAM at mitotic gene promoters. Conversely, MMB is displaced at these promoters. Based on these findings the following model is proposed: In p53-negative cells, mitogenic stimuli foster the switch from DREAM to MMB. Thus, mitotic genes are overexpressed and may promote chromosomal instability and tumorigenesis. This study provides evidence that MMB contributes to the upregulation of G2/M phase-specific genes in p53-negative cells and suggests that inhibition of MMB (or its target genes) might be a strategy for treatment of lung cancer. N2 - Der evolutionär konservierte Myb-MuvB (MMB) Multiproteinkomplex hat eine wesentliche Rolle in der transkriptionellen Aktivierung mitotischer Gene. Zielgene des MMB sowie die MMB assoziierten Transkriptionsfaktoren B-Myb und FoxM1 sind hoch exprimiert in einer Bandbreite verschiedener Krebsarten. Die erhöhte Expression dieser Gene korreliert mit einem fortgeschrittenen Tumorstadium und einer geringen Prognose. Das weißt auf darauf hin, dass MMB an der Tumorentstehung beteiligt sein könnte indem es die Überexpression mitotischer Gene fördert. Obwohl MMB biochemisch eingehend untersucht wurde, ist die Erfordernis von MMB zur Tumorentstehung in vivo weitestgehend unbekannt und wurde bisher nicht direkt getestet. In dieser Studie hemmt der konditionale Knockout der MMB Kerneinheit Lin9 die Tumorbildung in vivo in einem Lungenkrebs-Mausmodell angetrieben durch onkogenes K-Ras und den Verlust von p53. Die unvollständige Rekombination welche in Tumoren beobachtet wurde deutet auf einen starken Selektionsdruck gegen den kompletten Verlust von Lin9 hin. Die Verminderung von Lin9 und der MMB- assoziierten Untereinheit B-Myb durch RNAi-Interferenz (RNAi) liefert Beweise dafür, dass MMB für die Expression mitotischer Gene in Lungenkrebszellen notwendig ist. Zudem wurde gezeigt, dass das Zellwachstum von Lungenkrebszellen stark von MMB abhängig ist. Weiterhin wurde der Zusammenhang zwischen MMB und dem p53-Tumorsuppressor in einer primären Lungenkrebszelllinie mit wiederherstellbarer p53-Funktion untersucht. Expressionsanalysen zeigen, dass mitotische Gene nach Re-expression von p53 runterreguliert werden. Außerdem induziert die Aktivierung von p53 die Bildung des repressiven DREAM-Komplexes und führt zu einer Anreicherung von DREAM an Promotoren mitotischer Gene. Im Gegenzug wird MMB an den Promotoren verdrängt. Basierend auf den Ergebnissen wird das folgende Model vorgeschlagen: In p53- negativen Zellen begünstigen mitogene Reize den Wechsel von DREAM zu MMB. Dadurch werden mitotische Gene überexprimiert und können so chromosomale Instabilität und Tumorentstehung fördern Diese Studie liefert Hinweise, dass MMB an der Hochregulation G2/M- Phasenspezifischer Gene in p53-negativen Zellen beteiligt ist und dass die Hemmung von MMB (oder seiner Zielgene) eine Strategie zur Behandlung von Lungenkrebs sein könnte. KW - Nicht-kleinzelliges Bronchialkarzinom (NSCLC) KW - Lungenkrebs KW - lung cancer KW - DREAM complex KW - MMB KW - K-Ras KW - mitotic gene expression KW - Mitose Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-154108 ER - TY - THES A1 - Faist, Hanna T1 - Bedeutung und Charakterisierung der bakteriellen Flora in Vitis vinifera mit und ohne Wurzelhalsgallen T1 - Significance and characterization of the bacterial community in Vitis vinifera with and without crown galls N2 - Am Rebstock werden in der Natur von Agrobacterium vitis, dem Auslöser Wurzelhalsgallenerkrankung, charakteristische Wurzelhalsgallentumore induziert. Virulente Vertreter der Gattung der Agrobacteria schleusen bakterielle DNA in das pflanzliche Genom ein, wodurch die Pflanze Tumore produziert. Die Wurzelhalsgallenerkrankung wird seit einem Jahrhundert als ein Beispiel der Pflanzen-Pathogen-Interaktion untersucht. Die Rolle der bakteriellen Flora im Zusammenhang mit der Wurzelhalsgallenerkrankung beim Rebstock wurde bisher kaum betrachtet. Um dieser Frage nachzugehen, habe ich die endophytische mikrobielle Zusammensetzung von Rebstöcken mit und ohne Wurzelhalsgalle analysiert. Es werden Proben von drei Zeitpunkten einer Wachstumsperiode (Frühling, Sommer und Herbst) und von den Organen der Rebstöcke (Wurzeln, Pfropfstelle und einjährige Triebe) sowie dem Boden in einer Weinanlage bei Himmelstadt in Unterfranken genommen. Die Bakterienflora dieser Umweltproben wird mit kultivierungsabhängigen (Isolierung von Bakterien) und kultivierungsunabhängigen (Hochdurchsatzsequenzierungen) Methoden untersucht. Zudem werden i) die Virulenz der verschiedenen Agrobacterium-Isolate in Tumorassays bestimmt, ii) synthetische Bakteriengemeinschaften von in vitro kultivierten Weinpflänzchen mit Wurzelhalsgallen analysiert, iii) die Genome von einem virulenten und einem nicht-virulenten Agrobacteria-Isolat aus der Wurzelhalsgalle verglichen, iv) erste Interaktionsstudien auf festen Nährmedien durchgeführt und v) virulente Agrobacteria mittels bildgebender Fluoreszenz-Lebenszeit-Mikroskopie (FLIM) in Wurzelhalsgallen lokalisiert. Die Rebstöcke dieser Studie haben eine organspezifische Bakterienflora, die innerhalb einer Wachstumsperiode variiert. Nur die Bakterienflora der Pfropfstelle (mit oder ohne Wurzelhalsgalle) aber nicht die des Bodens, der Wurzeln, und der einjährigen Triebe unterscheidet sich strukturell zwischen gesunden und erkrankten Rebstöcken. Mikroskopisch konnten virulente Agrobacteria punktuell in Interzellularen, sklerenchymatischen Geweben und assoziiert mit Leitgefäßen nachgewiesen werden. Dadurch ist ausreichend Lebensraum vorhanden, der zusätzlich von tumorspezifischen Bakterien besiedelt werden kann. Im Gegensatz zur gesunden Pfropfstelle ist in der Wurzelhalsgalle eine saisonal stabile Kernmikroflora, bestehend aus Vertreter von A. vitis, Pseudomonas, Enterobacteriaceae, Agrobacterium tumefaciens, Gammaproteobacteria und Burkholderiales, vorhanden. Diese Bakterien werden überwiegend aus dem Boden rekrutiert und profitieren von der Nährstoffsituation in der Wurzelhalsgalle. Wurzelhalsgallen enthalten Opine, die nur von der transformierten Pflanzenzelle produziert werden. Interessanterweise hat in dieser Arbeit ein Agrobacterium-Isolat Gene, die zum Opinkatabolismus beitragen und ein Pseudomonas-Isolat kann Opine als einzige Kohlenstoffquelle nutzen. Trotzdem sind beide Isolate weder virulent noch verdrängen sie die virulenten A. vitis, die ebenso Opine nutzen, aus der Wurzelhalsgalle. In synthetischen Bakteriengemeinschaften an in vitro kultivierten Weinpflänzchen konnte gezeigt werden, dass diese und weitere tumorspezifischen Bakterien, neben A. vitis, nicht essentiell zur Entstehung der Wurzelhalsgalle nötig sind aber unterschiedliche Funktionen in der Wurzelhalsgalle übernehmen. Ein Serratia-Isolat hemmt das Wachstum von A. vitis auf festen Nährmedium, andere fördern oder hemmen das Wachstum der Wurzelhalsgalle. Nach Studien in der Literatur erhöhen weitere Bakterien die Resistenz des Rebstocks gegenüber biotischem und abiotischem Stress. Zusammengefasst identifizierten und isolierte ich in dieser Studie unter 150 unterschiedlichen Bakterien in der Wurzelhalsgalle jene Bakterien, die neben A. vitis von der neuen ökologischen Nische profitieren und somit wahrscheinlich Opportunisten mit unterschiedlichen Funktionen sind. In Folge von multiplen Interaktionen in der Wurzelhalsgalle entsteht ein ökologisches Gleichgewicht zwischen den opportunistischen Bakterien, der Wurzelhalsgalle und dem Rebstock, das den Fortbestand des Rebstocks mit Wurzelhalsgalle ermöglicht. N2 - In nature, Agrobacterium vitis is known for the ability to introduce bacterial DNA into the grapevine genome, thereby causing crown gall disease. This plant disease has been studied for a century as a model for plant-pathogen interaction, while the role of the plant microbiota in disease development is not well understood. My study contributes to the understanding of the microbial ecology in crown galls of grapevine, combining culture-dependent with culture-independent high-throughput sequencing techniques. I analysed the structure of the endophytic microbiota by collecting different samples (soil, roots, graft unions and canes) of diseased and non-diseased grapevines from one vine-yard in Franconia, Bavaria, Germany during one growing season (spring, summer, autumn). The characterization of the grapevine-associated bacterial microbiota was completed by (i) detecting the virulence of diverse agrobacterial isolates using a tumour growth assay with in vitro cultivated grapevine plantlets, (ii) microbial analysis of synthetic communities of in vitro cultivated grapevine plantlets with crown galls, (iii) genome sequencing of a virulent and a non-virulent agrobacterial isolate, (iv) in vitro interaction studies on solid medium with bacterial isolates and (v) localisation of virulent A. vitis using Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) in tumour tissues. Grapevine plants of this study have an organ-specific bacterial community that varies during one growing season. Healthy and diseased grapevine plants differed in the struc-ture of the bacterial community only in the graft union (with or without a crown gall), but not in the soil, root and one-year old cane. Microscopy revealed that virulent Agrobacteria mainly accumulate in defined spots of sclerenchymatous tissue, intercellular space and tissues associated with vessels. Therefore, there is unoccupied living space in a crown gall, which can be additionally colonized by tumour-specific bacteria. A season-independent stable core bacteria exists in grapevine crown galls in contrast to healthy graft unions, consisting of OTUs assigned to A. vitis, Pseudomonas, Enterobacteriaceae, Agrobacterium tumefaciens, Gammaproteobacteria and Burkholderiales. These bacteria are predominantly recruited from the soil and most likely profit from special nutrients in the crown gall. The crown gall contains opines, exclusively produced by transformed plant cells. Curiously individual isolates of Agrobacteria and Pseudo-monas of this study that are non-virulent do not outcompete virulent A. vitis in the crown gall but harbour, like A. vitis, genes involved in octopin-catabolism or use opines in liquid cultures as a sole nutrient source. Although synthetic bacterial communities revealed that the tumour-specific bacteria are not required for crown gall induction us-ing in vitro grown grapevine plantlets, they may have different functions in crown gall persistence. A Serratia-isolate inhibits the growth of A. vitis on solid medium, others reduce or support crown gall development, while some, according to literature, increase resistance of the grapevine plant against biotic and abiotic stresses. Taken together, among the 150 bacteria found in the crown galls, I identified and isolated bacteria in addition to A. vitis that profit from the new ecological niche suggesting an opportunistic lifestyle with different ecological functions. An ecological equilibrium in a bacterial community that balances crown gall growth will support the existence of grapevine plants with a crown gall in vineyards. KW - Wurzelhalsgalle KW - DNA Barcoding KW - Agrobacterium vitis KW - Weinrebe KW - Angewandte Mikrobiologie KW - bakterielle Flora KW - Holobiont KW - Mikrobiota Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-154359 ER -