TY - THES A1 - Schubert, Jonathan T1 - Bildgebende Zweifarben-Einzelmolekül-PET-Fluoreszenzspektroskopie am molekularen Chaperon Hsp90 T1 - Two-color single-molecule PET fluorescence imaging spectroscopy on the molecular chaperone Hsp90 N2 - Im Forschungsfeld der Proteindynamik häufen sich in den letzten Jahren Untersuchungen an einzelnen Molekülen. Damit können molekulare Ereignisse, die in konventioneller Spektroskopie durch stochastische Prozesse unentdeckt bleiben, durch direkte Beobachtung identifiziert und analysiert werden, was zu tieferem mechanistischem Verständnis des untersuchten Systems beitragen kann. Die Implikation des molekularen Chaperons Hsp90 in die korrekte Faltung und Aktivierung einer Vielzahl davon abhängiger Klientenproteine machen es zu einem zentralen Knotenpunkt der zellulären Proteinhomöostase, allerdings ist der Mechanismus seiner breiten Klientenerkennung und -prozessierung bisher nur lückenhaft untersucht. Mit der Erkenntnis, dass Hsp90 ATP abhängig große, ratenlimitierende Umstrukturierungen erfährt, wurden Reportersysteme entwickelt, die auf dem Förster-Resonanzenergietransfer mit einer räumlichen Auflösung von ca. 2-10 nm basieren. Diese dokumentieren einen Klammerschluss des Chaperons und prognostizieren einen intermediatbbasierten Konformations-Zyklus. Details über den Mechanismus der Umstrukturierungen wurden mit der Entwicklung von Reportersystemen ermittelt, die auf dem photoinduzierten Elektronentransfer zwischen der Aminosäure Tryptophan und einem organischen Farbstoff basieren. Die Technik beruht auf kontaktinduzierter Fluoreszenzlöschung und damit verbundenen digitalen Intensitätsübergängen, dabei ermöglicht die räumliche Sensitivität von < 1 nm die Beobachtung von lokalen Umstrukturierungen. In Hsp90 wurden damit mittels konventioneller Spektroskopie drei kritische lokale Umlagerungen untersucht und daraus ein Modell mit heterogenen apo-Konformationen sowie ein kooperativer Konformationszyklus abgeleitet, der dem intermediatbasierten Modell gegenübersteht. Im Rahmen dieser Dissertation wurde anhand des Hsp90-Chaperons eine Methode entwickelt, die eine bildgebende PET Fluoreszenzspektroskopie von mehreren Umstrukturierungen gleichzeitig an einzelnen Molekülen erlaubt. Ein umfangreiches Farbstoffscreening führte zur Identifizierung eines Farbstoffpaars, das die PET-basierte simultane Aufzeichnung zweier Konformations-Koordinaten ermöglicht. Über verschiedene Modifikationen des Chaperons konnten einzelmolekültaugliche Oberflächen hergestellt werden, auf denen zweifach markierte Hsp90-Proteine immobilisiert sind. Fluoreszenzintensitätszeitspuren einzelner Chaperone und entsprechende Kontrollkonstrukte bestätigen qualitativ den Erfolg der Methode, für die quantitative Analyse wurde eine Routine in der Programmiersprache Python entwickelt, mit welcher kinetische Informationen ermittelt werden konnten. Diese legen eine enge wechselseitige Abhängigkeit der drei lokalen Elemente nahe, wobei der Großteil der Konformationsübergänge zweier simultan aufgezeichneter Umstrukturierungen Synchronität innerhalb von zwei Sekunden zeigt. Im Vergleich zur Hydrolyse von einem ATP in mehreren Minuten deutet das auf eine enge Kopplung hin. Weiter konnte eine Beschleunigung der Dynamiken durch aromatische Modifikation des N-Terminus von Hsp90 beobachtet werden, zudem erlaubt der Einzelmolekülansatz die Verwendung des nativen Nukleotids ATP, wodurch auch die lokalen Öffnungsdynamiken zugänglich werden. Die zur Bestimmung der Zeitkonstanten durchgeführte Analyse unterstützt die Ansicht heterogener apo-Zustände und einer einheitlich geschlossenen Konformation. Die bildgebende Zweifarben-Einzelmolekül-PET-Spektroskopie konnte insgesamt zu einem Komplement der Einzelmolekül-FRET-Spektroskopie entwickelt werden, um damit lokale Konformationsdynamiken zu untersuchen. Der bildgebende Ansatz erlaubt eine einfache Implementierung in einen experimentellen Einzelmolekül-FRET Aufbau bei gleichzeitiger Erweiterung der beobachteten Koordinaten und wird so zu einem breit anwendbaren Werkzeug multidimensionaler Dynamikuntersuchungen einzelner Proteine. N2 - Over the past years, the number of investigations of single molecules has risen in the field of protein dynamics studies. Direct observation of molecular events that are obscured by stochastic processes in bulk measurements can provide a deeper mechanistic understanding of the systems under study. The molecular chaperone Hsp90, as being involved in the correct folding and activation of client proteins, thereby acting at late-stage folding, is a central node of cellular protein homeostasis. The mechanistic understanding of its broad client recognition and processing capability still remains elusive. The discovery of large conformational changes that drive the chaperone through a rate limiting conformational cycle as a reaction of ATP binding led to the development of reporter systems that probe the global rearrangement. As the reporters are based on Förster resonance energy transfer, they are active on a spatial scale of 2-10 nm and report on the molecular clamp closure. The predicted conformational cycle implicates several intermediate states. Details of the underlying rearrangements were obtained by the development of reporter systems based on photoinduced electron transfer between the amino acid tryptophan and an organic dye. As the technique relies on contact-induced quenching of fluorescence, which is accompanied by digital intensity transitions, the resulting spatial resolution of < 1 nm enables probing of local conformational rearrangements. In bulk experiments, three critical local dynamics were probed in Hsp90, leading to the assumption of heterogeneous apo conformations and an associated cooperative cycle which faces the intermediate-based model. Within the scope of this doctoral thesis, two color single-molecule PET fluorescence imaging spectroscopy was developed using the Hsp90 chaperone to study multiple conformational rearrangements simultaneously on individual proteins. Extensive dye screening identified a dye pair suitable for the PET-based investigation of two different conformational coordinates simultaneously. Modifications on the chaperone protein enabled the immobilization of double-labeled Hsp90 molecules on glass surfaces that are suited for single-molecule studies. Fluorescence intensity time traces of single chaperones and related control constructs validated qualitatively the success of the method. For quantitative analysis, a routine was developed in the programming language Python to obtain kinetic information. Derived kinetics pointed to a close interdependence between the three local elements. Furthermore, the majority of state transitions of rearrangements studied at the same time occurred simultaneously within a two-second window, thereby suggesting synchronicity. Compared to the hydrolysis of one ATP molecule taking minutes, this suggests a tight coupling of motions. Further, an aromatic modification of the Hsp90 N-Terminus resulted in accelerated local dynamics. Besides investigating the dynamics accompanying clamp closure, clamp opening kinetics also became accessible through the use of native nucleotide ATP. The analysis performed as part of the determination of time constants supports the view of a heterogeneous apo and a uniformly closed conformation. Two-color single-molecule PET fluorescence imaging spectroscopy was developed into a technique complement to single-molecule FRET spectroscopy that enables the probing of local conformational dynamics in immobilized proteins. The imaging approach allows for easy implementation in a single-molecule FRET setup while expanding the observed coordinates, making the PET-based technique a widely applicable tool for multidimensional dynamics studies of single proteins. KW - Fluoreszenzspektroskopie KW - Einzelmolekülspektroskopie KW - Hitzeschock-Proteine KW - Proteinsynthese KW - Photoinduzierter Elektronentransfer KW - photoinduced electron transfer KW - Hsp90 Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-244938 ER - TY - THES A1 - Sisario, Dmitri Jonas T1 - Bildbasierte Analyse von Säugetierzellen unter dem Einfluss von osmotischem Stress, überkritischen elektrischen Feldern und ionisierender Strahlung T1 - Image-based analysis of mammalian cells subjected to osmotic stress, supracritical electric fields and ionizing radiation N2 - Im ersten Teil dieser Doktorarbeit wurde die kurz nach Elektroporation eintretende hämolytische Zellbewegung von humanen Erythrozyten erstmals quantitativ untersucht, um den zu Grunde liegenden Mechanismus aufzuklären. Die Ergebnisse legen nahe, dass die Bewegung aus dem Ausstoß von unter Druck stehendem Zytosol resultierte. Durch weitere Experimente wurde die Beteiligung des Nicht-Muskel-Myosins NMIIA am Aufbau des zytosolischen Überdrucks nachgewiesen. Ausgehend von diesen Ergebnissen wurde ein molekular-mechanischer bisher unbekannter NMII-basierter Mechanismus der rapiden Ghostbildung beschrieben. Diese Erkenntnis könnte biomedizinische Relevanz besitzen, da der Abbau von Erythrozyten in der Milz die Transformation zu Hb-armen Ghosts voraussetzt. Der zweite Teil dieser Arbeit befasste sich mit dem Hirntumor Glioblastoma multiforme (GBM), dessen Rezidiv hauptsächlich auf Strahlenresistenz und Zellinvasion zurückzuführen ist. Deshalb wurde mittels hochauflösender Fluoreszenzmikroskopie (dSTORM) die Nanostruktur des DSB-Markers Histon γH2AX und des DNA-Reparaturfaktors DNA-PKcs in bestrahlten GBM-Zellen analysiert. Anhand von dSTORM-Rekonstruktionen wurde erstmals gezeigt, dass die beiden Proteine kaum Kolokalisation im Nanometerbereich aufweisen. Zunehmend wird die anomale Expression von Membrantransportern aus der SLC-Familie mit der Migration von Krebszellen in Verbindung gebracht. Der finale Abschnitt befasste sich daher mit der subzellulären Lokalisierung der Transporterproteine SLC5A1 und SLC5A3 in GBM-Zellen, um ihre Beteiligung an der Zellmigration nachzuweisen. Dabei wurde erstmals gezeigt, dass der Leitsaum der untersuchten GBM-Zellen deutliches SLC5A1- und SLC5A3-Signal aufwies. Basierend auf diesen Befunden wurden den Transportern unterschiedliche Aufgaben bei der zellmigrativen lokalen Volumenregulation zugeschrieben. Somit ergänzen SLC5A1 und SLC5A3 das migrationsassoziierte Krebszell-Transportom. N2 - The unique properties of the highly specialized, enucleated mammalian erythrocytes allows them to withstand enormous mechanical stress. However, because their membrane area is limited, they display high osmotic fragility towards hypotonic shocks. In contrast, the much more complex tumor cells are not only capable of tolerating a wide range of osmotic stresses, but they frequently display considerable chemo- and even radioresistance. Because of these intriguing properties, both cell types have been the subject of intensive biophysical and biomedical research for decades. However, despite the long history of erythrocyte research, the apparently self-propelled motion of red blood cells that occurs in the course of hemolysis is a largely unknown phenomenon. In the first part of this doctoral thesis, the electroporation-triggered hemolytic cell motion of human erythrocytes was examined quantitatively for the first time in order to elucidate the underlying mechanism of this phenomenon. Using fluorescence and videomicroscopic analyses, the two main phases of electrohemolysis were identified. The first, prehemolytic phase was characterized by an efflux of low-molecular cytosolic solutes via electropores, accompanied by transient, osmotic cell shrinkage. Once the influx of extracellular solutes predominated, swelling to the critical cell volume started, apparent from the loss of discoid morphology. The second, hemolytic phase was characterized by a sudden cell acceleration to a peak velocity of ~35 µm/s, ~1 second of rapid and linear movement, gradual volume reduction and transformation to a hemoglobin-depleted, transparent ghost. The results of this work suggest that this rapid linear motion results from a cell contraction-driven expulsion of the pressurized hemoglobin (Hb)-rich cytosol through a single hemolytic hole. ... KW - Erythrozyt KW - Glioblastom KW - Zellmigration KW - DNS-Doppelstrangbruch KW - Hb-Jet Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-246772 ER - TY - THES A1 - Heidinger, Ina M. M. T1 - Beyond metapopulation theory: Determinants of the dispersal capacity of bush crickets and grasshoppers T1 - Bestimmende Faktoren der Ausbreitungsfähigkeit von Heuschrecken N2 - Habitat fragmentation and destruction due to anthropogenic land use are the major causes of the increasing extinction risk of many species and have a detrimental impact on animal populations in numerous ways. The long-term survival and stability of spatially structured populations in fragmented landscapes largely depends on the colonisation of habitat patches and the exchange of individuals and genes between patches. The degree of inter-patch dispersal, in turn, depends on the dispersal ability of a species (i.e. the combination of physiological and morphological factors that facilitate dispersal) and the landscape structure (i.e. the nature of the landscape matrix or the spatial configuration of habitat patches). As fragmentation of landscapes is increasing and the number of species is continuously declining, a thorough understanding of the causes and consequences of dispersal is essential for managing natural populations and developing effective conservation strategies. In the context of animal dispersal, movement behaviour is intensively investigated with capture-mark-recapture studies. For the analysis of such experiments, the influence of marking technique, handling and translocation of marked animals on movement pattern is of crucial importance since it may mask the effects of the main research question. Chapter 2 of this thesis presents a capture-mark-recapture study investigating the effect of translocation on the movement behaviour of the blue-winged grasshopper Oedipoda caerulescens. Transferring individuals of this grasshopper species to suitable but unfamilliar sites has a significant influence on their movement behaviour. Translocated individuals moved longer distances, showed smaller daily turning angles, and thus their movements were more directed than those of resident individuals. The effect of translocation was most pronounced on the first day of the experiment, but may persist for longer. On average, daily moved distances of translocated individuals were about 50 % longer than that of resident individuals because they have been transferred to an unfamiliar habitat patch. Depending on experiment duration, this leads to considerable differences in net displacement between translocated and resident individuals. In summary, the results presented in chapter 2 clearly point out that translocation effects should not be disregarded in future studies on arthropod movement, respectively dispersal. Studies not controlling for possible translocation effects may result in false predictions of dispersal behaviour, habitat detection capability or habitat preferences. Beside direct field observations via capture-mark-recapture methods, genetic markers can be used to investigate animal dispersal. Chapter 3 presents data on the genetic structure of populations of Metrioptera bicolor, a wing-dimorphic bush cricket, in a spatially structured landscape with patches of suitable habitat distributed within a diverse matrix of different habitat types. Using microsatellite markers, the effects of geographic distance and different matrix types on the genetic differentiation among 24 local populations was assessed. The results of this study clearly indicate that for M. bicolor the isolation of local populations severely depends on the type of surrounding matrix. The presence of forest and a river running through the study area was positively correlated with the extent of genetic differentiation between populations. This indicates that both matrix types severely impede gene flow and the exchange of individuals between local populations of this bush cricket. In addition, for a subsample of populations which were separated only by arable land or settlements, a significant positive correlation between pairwise genetic and geographic distances exists. For the complete data set, this correlation could not be found. This is most probably due to the adverse effect of forest and river on gene flow which dominates the effect of geographic distance in the limited set of patches investigated in this study. The analyses in chapter 3 clearly emphasize the differential resistance of different habitat types on dispersal and the importance of a more detailed view on matrix ‘quality’ in metapopulation studies. Studies that focus on the specific dispersal resistance of different matrix types may provide much more detailed information on the dispersal capacity of species than a mere analysis of isolation by distance. Such information is needed to improve landscape oriented models for species conservation. In addition to direct effects on realised dispersal (see chapter 3), landscape structure on its own is known to act as an evolutionary selection agent because it determines the costs and benefits of dispersal. Both morphological and behavioural traits of individuals and the degree to which a certain genotype responds to environmental variation have heritable components, and are therefore expected to be able to respond to selection pressures. Chapter 4 analyses the influence of patch size, patch connectivity (isolation of populations) and sand dynamics (stability of habitat) on thorax- and wing length as proxies for dispersal ability of O. caerulescens in coastal grey dunes. This study revealed clear and sex-specific effects of landscape dynamics and patch configuration on dispersal-related morphology. Males of this grasshopper species were smaller and had shorter wings if patches were larger and less connected. In addition, both sexes were larger in habitat patches with high sand dynamics compared to those in patches with lower dynamics. The investments in wing length were only larger in connected populations when sand dynamics were low, indicating that both landscape and patch-related environmental factors are of importance. These results are congruent with theoretical predictions on the evolution of dispersal in metapopulations. They add to the evidence that dispersal-related morphology varies and is selected upon in recently structured populations even at small spatial scales. Dispersal involves different individual fitness costs like increased predation risk, energy expenditure, costs of developing dispersal-related traits, failure to find new suitable habitat as well as reproductive costs. Therefore, the decision to disperse should not be random but depend on the developmental stage or the physiological condition of an individual just as on actual environmental conditions (context-dependent dispersal, e.g. sex- and wing morph-biased dispersal). Biased dispersal is often investigated by comparing the morphology, physiology and behaviour of females and males or sedentary and dispersive individuals. Studies of biased dispersal in terms of capture-mark-recapture experiments, investigating real dispersal and not routine movements, and genetic proofs of biased dispersal are still rare for certain taxa, especially for orthopterans. However, information on biased dispersal is of great importance as for example, undetected biased dispersal may lead to false conclusions from genetic data. In chapter 5 of this thesis, a combined approach of morphological and genetic analyses was used to investigate biased dispersal of M. bicolor. The presented results not only show that macropterous individuals are predestined for dispersal due to their morphology, the genetic data also indicate that macropters are more dispersive than micropters. Furthermore, even within the group of macropterous individuals, males are supposed to be more dispersive than females. To get an idea of the flight ability of M. bicolor, the morphological data were compared with that of Locusta migratoria and Schistocerca gregaria, which are proved to be very good flyers. Based on the morphological data presented here, one can assume a good flight ability for macropters of M. bicolor, although flying individuals of this species are seldom observed in natural populations. N2 - Zahlreiche Tierarten sind mehr und mehr vom Aussterben bedroht. Hauptursachen dafür sind die Zerstörung und Fragmentierung von Lebensraum durch den Menschen. Mit der anthropogenen Landnutzung sind vielfältige, negative Auswirkungen auf die betroffenen Tierpopulationen verbunden. Das langfristige Überleben und die Stabilität von räumlich strukturierten Populationen in fragmentierten Landschaften hängen dabei wesentlich von der Besiedlung von Habitatflächen, sowie dem Individuenaustausch und dem damit verbundenen genetischen Austausch zwischen einzelnen Populationen ab. Das Ausmaß der Ausbreitung von Individuen zwischen einzelnen Habitatflächen wird dabei (i) durch die Ausbreitungsfähigkeit der betreffenden Tierart, als die Kombination physiologischer und morphologischer Faktoren, welche die Ausbreitung eines Individuums begünstigen, und (ii) von der Struktur der Landschaft, wie z.B. dem Matrix-Typ oder die räumliche Anordnung von Habitatflächen, bestimmt. Da die Fragmentierung von Lebensräumen und die Anzahl bedrohter Tierarten stetig zunehmen, ist ein umfassendes Verständnis der Ursachen und Konsequenzen der Ausbreitung essenziel für das Management natürlicher Populationen sowie für die Entwicklung effektiver Schutzmaßnahmen. Eine gängige und sehr häufig angewandte Methode, Ausbreitung zu untersuchen, sind Fang-Wiederfang-Studien zum Laufverhalten einzelner Individuen. Dabei wird grundsätzlich davon ausgegangen, dass das Markieren und das Versetzen der Tiere keinerlei Einfluss auf deren Verhalten haben. Für die Analyse und Interpretation solcher Experimente ist es entscheidend, diesen Einfluss ausschließen zu können, da er die Effekte, die eigentlich untersucht werden sollen, überlagern kann. Kapitel 2 der vorliegenden Arbeit ist eine Fang-Wiederfang-Studie, die diese Annahme und damit den Einfluss des Versetzens auf das Laufverhalten der Blauflügelige Ödlandschrecke (Oedipoda caerulescens) untersucht. Wie sich zeigte, hat das Versetzen von Individuen auf eine geeignete, jedoch fremde Habitatfläche einen signifikanten Einfluss auf das Laufverhalten der versetzten Tiere. Versetzte Individuen legten größere Strecken zurück und zeigten ein geradlinigeres Bewegungsmuster als die Tiere, die genau an ihrem Fundort im „Heimathabitat“ wieder freigelassen wurden. Dieser Effekt war am ersten Tag nach der Freilassung der Versuchstiere am deutlichsten ausgeprägt, kann jedoch auch noch darüber hinaus anhalten. Die zurückgelegten Tagesstrecken der versetzten Individuen, die in eine ihnen unbekannte Habitatfläche verbracht wurden, waren im Durchschnitt 50 % länger, als die der nichtversetzten Tiere. In Abhängigkeit von der Dauer eines Experiments führt dies zu erheblichen Unterschieden hinsichtlich der Nettostrecken, die insgesamt von versetzten und nicht versetzten Tieren zurückgelegt werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die in Kapitel 2 präsentierten Ergebnisse deutlich zeigen, dass in zukünftigen Untersuchungen des Laufverhaltens von Arthropoden bzw. deren Ausbreitung, der Effekt des Versetzens berücksichtigt werden muss. Studien, die diesen Einfluss ignorieren, können zu falschen Vorhersagen bezüglich des Ausbreitungsverhaltens, der Fähigkeit geeignetes Habitat zu detektieren oder der Habitatpräferenzen einer Art führen. Neben direkter Beobachtung mittels Fang-Wiederfang-Methoden kommen auch genetische Methoden zur Anwendung, um das Ausbreitungsverhalten von Tieren zu untersuchen. Kapitel 3 beinhaltet Daten zur genetischen Struktur von Populationen der Zweifarbigen Beißschrecke (Metrioptera bicolor), einer Heuschreckenart mit ausgeprägtem Flügeldimorphismus. Die Untersuchung fand in einer räumlich strukturierten Landschaft statt, in der geeignete Habitatflächen verteilt in einer diversen Matrix von unterschiedlichen nicht-geeigneten Habitattypen vorliegen. Mit Hilfe von Mikrosatellitenmarkern wurde der Einfluss der geographischen Distanz und unterschiedlicher Matrixtypen auf die genetische Differenzierung von 24 lokalen Populationen von M. bicolor untersucht. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen deutlich, dass der Isolationsgrad lokaler Populationen dieser Heuschreckenart wesentlich von der umgebenden Matrix abhängt. Wie sich zeigte, werden der Individuenaustausch und der damit verbundenen Genfluss zwischen den untersuchten Populationen wesentlich durch Wald und einen Fluss eingeschränkt, da das Vorhandensein dieser beiden Matrixtypen positiv mit dem Grad der genetischen Differenzierung zwischen den Populationen korrelierte. Zudem zeigte sich für eine Teilauswahl von Populationen, welche nur durch landwirtschaftlich genutzte Flächen und Siedlungen voneinander getrennt sind, eine signifikant positive Korrelation zwischen der paarweise berechneten genetischen und der geographischen Distanz zwischen zwei Populationen. Dies bedeutet eine größere Differenzierung der Populationen je weiter sie voneinander entfernt sind. Für den vollständigen Datensatz mit allen untersuchten Populationen, konnte dieser Zusammenhang nicht nachgewiesen werden. Am wahrscheinlichsten ist dies darauf zurück zu führen, dass der nachteilige Effekt von Wald und Fluss auf den Genfluss den Effekt der geographischen Distanz überlagert. Die Analysen in Kapitel 3 machen deutlich, dass sich verschiedene Matrixtypen unterschiedlich auf die Ausbreitung einer Art auswirken, und unterstreichen wie wichtig eine eingehende Betrachtung der Matrixqualität für Metapopulationsstudien ist. Studien mit Fokus auf den unterschiedlichen Einfluss verschiedener Matrixtypen können wesentlich genauere Informationen zur Ausbreitungsfähigkeit einer Art liefern, als eine alleinige Analyse des isolierenden Effekts der räumlichen Trennung von Populationen. Gerade solche Informationen sind essentiell und nötig, um landschaftsorientierte Modelle für den Artenschutz verbessern zu können. Zusätzlich zu dem unmittelbaren Einfluss der Struktur der Landschaft auf die realisierte Ausbreitung von Individuen (siehe Kapitel 3), kann Landschaft auch als evolutionärer Selektionsfaktor agieren, da sie Kosten und Nutzen der Ausbreitung bestimmt. Ein entsprechender Selektionsdruck sollte sich sowohl auf morphologische Merkmale und Verhaltensmerkmale eines Individuums als auch auf das Ausmaß, mit dem ein bestimmter Genotyp auf Variationen der Umwelt reagiert, auswirken. Kapitel 4 untersucht den Einfluss der Größe und der Isolation einer Habitatfläche, sowie der Habitatstabilität (in Form der Sanddynamik) auf die Thorax- und Flügellänge, als Maße für die Ausbreitungsfähigkeit, der Blauflügeligen Ödlandschrecke in einem Küstengebiet. Die vorliegende Studie zeigte deutliche, geschlechtsspezifische Effekte der Sanddynamik und der räumlichen Anordnung der Habitatflächen zueinander auf die untersuchten morphologischen Merkmalen. Mit zunehmender Flächengröße und abnehmender Habitatkonnektivität, waren die Männchen von O. caerulescens kleiner und hatten zudem kürzere Flügel. Männchen und Weibchen von instabilen Habitatflächen (gekennzeichnet durch eine hohe Sanddynamik) waren größer als die Individuen von stabileren Habitatflächen (geringerer Sanddynamik). Insgesamt machen die vorliegenden Ergebnisse deutlich, dass sowohl landschaftsbezogene als auch habitatflächenbezogene Umweltfaktoren für die individuelle Investition in ausreitungsrelevante, morphologische Merkmale von Bedeutung sind. Diese Ergebnisse stimmen mit den Vorhersagen theoretischer Modelle zur Evolution der Ausbreitung in Metapopulationen überein und liefern einen weiteren Nachweis dafür, dass ausbreitungsrelevante, morphologische Merkmale variieren und in kürzlich strukturierten Populationen einer Selektion unterliegen. Die Ausbreitung eines Individuums ist mit unterschiedlichen Fitnesskosten verbunden. Dazu zählen zum Beispiel: Ein erhöhtes Predationsrisiko, energetische Kosten, das Risiko kein geeignetes Habitat zu finden, Kosten die mit der Ausbildung von ausbreitungsrelevanten Merkmalen verbunden sind, sowie Reproduktionskosten. Die Entscheidung, ob sich ein Individuum ausbreitet, sollte daher nicht zufällig erfolgen, sondern von dessen Entwicklungsstadium oder dessen physiologischer Konstitution, sowie von aktuellen Umweltbedingungen abhängen. Man spricht von einer kontextbezogene Ausbreitung, die zum Beispiel vom Geschlecht oder der Flügelmorphe eines Individuums abhängt. Ein Ungleichgewicht in der Ausbreitung verschiedener Geschlechter oder Morphen wird als biased dispersal bezeichnet. Für die Untersuchung von biased dispersal werden häufig Weibchen und Männchen oder sesshafte und sich ausbreitende Individuen einer Art morphologisch, physiologisch oder hinsichtlich ihres Verhaltens miteinander verglichen. Für einige Taxa, insbesondere Heuschrecken, liegen bislang nur wenige Studien zum biased dispersal in Form von Fang-Wiederfang-Experimenten (die auch wirklich Ausbreitung und keine Routinebewegungen einzelner Individuen untersuchen) oder genetischen Analysen vor. Allerdings sind gerade Informationen hierzu von großer Bedeutung, da zum Beispiel ein unentdecktes biased dispersal dazu führen kann, dass falsche Schlüsse aus den Ergebnissen genetischer Untersuchungen gezogen werden. Kapitel 5 der vorliegenden Dissertation untersucht das Auftreten von biased dispersal der Zweifarbigen Beißschrecke unter Verwendung eines kombinierten Ansatzes morphologischer und genetischer Analysen. Die hier präsentierten Ergebnisse zeigen nicht nur, dass makroptere Individuen aufgrund ihrer Morphologie prädestiniert für die Ausbreitung sind. Auch die genetischen Daten deuten an, dass sich makroptere Tiere stärker ausbreiten als mikroptere Tiere. Darüber hinaus besitzen innerhalb der Gruppe der makropteren Individuen Männchen eine bessere Ausbreitungsfähigkeit als Weibchen. Um die Flugfähigkeit von M. bicolor beurteilen zu können, wurden die morphologischen Daten der vorliegenden Untersuchung mit den Ergebnissen von Studien über Locusta migratoria and Schistocerca gregaria verglichen. Beide Arten sind für ihr sehr gutes Flugvermögen bekannt. Darauf basierend ist für maktoptere Individuen von M. bicolor eine gute Flugfähigkeit anzunehmen, wenn auch in natürlichen Populationen fliegende Tiere dieser Art nur selten beobachtet werden. KW - Heuschrecken <Überfamilie> KW - capture-mark-recapture KW - patch connectivity KW - sand dynamics KW - populations genetics KW - biased dispersal KW - Populationsgenetik KW - Demökologie KW - Habitat KW - Ausbreitung KW - dispersal KW - orthoptera Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-135068 ER - TY - THES A1 - Hacker, Christian T1 - Beteiligung des Major Vault Proteins an der Kernporenkomplexbildung T1 - Involvement of the Major Vault Protein in nuclear pore complex formation N2 - In die Kernmembran von Eukaryoten sind Kernporenkomplexe eingelagert. Diese stellen die einzige Verbindung zwischen dem Nukleo- und Zytoplasma dar und vermitteln den gerichteten Transport von Proteinen und Ribonukleoproteinpartikeln über die Kernhülle. Durch vorangehende Versuche unserer Arbeitsgruppe konnte gezeigt werden, dass es experimentell möglich ist, die Bildung einer kontinuierlichen Doppelmembran von der Insertion der Kernporenkomplexe zu trennen (Ewald et al., 1997). Dabei spielen verschiedene im Extrakt enthaltene Membranfraktionen eine Rolle. Erst kürzlich wurden in unserer Arbeitsgruppe zwei unterschiedliche Membranfraktionen aus Xenopus Extrakt isoliert, die aufgrund ihrer Dichte als 40% und 30% Membranfraktion benannt wurden. Massenspektrometrische Untersuchungen zeigten, dass sich in der 30% Membranfraktion, welche für die Kernporenkomplexbildung verantwortlich zu sein scheint, das Major Vault Protein (MVP) befindet. MVP ist Hauptbestandteil der Vault-Komplexe, großer tonnenförmiger Ribonukleoproteinpartikel, denen bislang eine Vielzahl von zellulären Funktionen zugeordnet wurden, die meisten davon jedoch noch stark debattiert. Vaults könnten womöglich eine Rolle als Transporter über die Kernporenkomplexe spielen und wurden schon mehrfach mit dem Aufbau einer multiplen Arzneimittelresistenz in Verbindung gebracht. Die Beteiligung von MVP bei der Bildung der Kernporenkomplexe ist eine neue zelluläre Funktion und sollte deshalb in dieser Arbeit näher untersucht werden. In dieser Arbeit wurden zunächst die 40% und 30% Membranfraktionen auf ihr unterschiedliches Verhalten bei der Bildung der Kernhülle separat und in Kombination genauer untersucht. Dabei zeigte sich, dass die 40% Membranfraktion an Chromatin bindet und eine kontinuierliche Doppelmembran aufbaut. Die 30% Membranfraktion konnte alleine nicht an Chromatin binden, induzierte aber in der durch die 40% Membranfraktion gebildeten Doppelmembran den Aufbau von Kernporenkomplexen. Durch Immunfluoreszenzaufnahmen und ultrastrukturelle Untersuchungen wurde belegt, dass das an der 30% Membranfraktion assoziierte MVP für die Bildung von Kernporenkomplexen verantwortlich war. Ferner konnten wir zeigen, dass sowohl MVP als auch Vault-Partikel die de novo Insertion von Kernporenkomplexen in kontinuierliche Doppelmembranen induzieren konnten. Die molekularen Mechanismen der Kernporenkomplexbildung durch MVP wurden mit Hilfe von artifiziellen Lipidmembranen analysiert. Anhand von unilamellaren Liposomen und elektronenmikroskopischen Aufnahmen konnte gezeigt werden, dass MVP die Lipidstruktur beeinflussen und perforieren kann. Zudem löste MVP die Bildung von Poren in schwarzen Lipidmembranen aus und führte zur Messung von Strömen durch Einzelkanalmessungen über die entstandenen Poren. Um die bei dem Prozess der Kernporenkomplexbildung beteiligten Bindungspartner von MVP zu identifizieren, wurden mehrere Protein-Protein-Bindungsstudien durchgeführt. Unter den ermittelten MVP-Bindungspartnern ließen sich keine Nukleoporine mit dem Sequenzmotiv FXFG identifizieren, es ist jedoch nicht auszuschließen, dass MVP bei der Bildung der Kernporenkomplexe mit anderen Nukleoporinen interagiert. Da eine frühere Arbeit die Bedeutung von Mikrotubuli bei der Bildung der Kernporenkomplexe aufzeigte (Ewald et al., 2001), wurden in dieser Arbeit die Interaktionen der isolierten 40% und 30% Membranfraktionen und von MVP mit dem Mikrotubulinetzwerk näher analysiert. Dabei zeigte sich, dass nur die 30% Membranfraktion mit Mikrotubuli interagierte und eine Inhibition der Mikrotubulipolymerisation durch Colchizin den Einbau von Kernporenkomplexen verhinderte. Im Gegensatz dazu interagierten die 40% Membranvesikel nicht mit Mikrotubuli und daher hat eine Colchizin-induzierte Inhibition der Mikrotubulipolymerisation keinen Effekt auf den Aufbau einer kontinuierlichen Doppelmembran. Durch immunfluoreszenzmikroskopische Untersuchungen konnte zudem gezeigt werden, dass die Lokalisation von MVP an der Kernhülle ebenfalls Abhängig von Mikrotubuli ist. Um zu demonstrieren, dass die MVP-induzierte Kernporenkomplexbildung im zellfreien System abhängig vom Transport von MVP zur Kernhülle ist, wurde die Zugabe von MVP zu porenlosen Kernen nach einer Colchizin-Behandlung analysiert. Hierbei konnte belegt werden, dass MVP Mikrotubuli auch benötigt, um die Bildung von Kernporenkomplexen in der Kernmembran zu initiieren. Da Mikrotubulifilamente im zellfreien System mit ihren Plus-Enden gegen die Chromatinoberfläche gerichtet sind, sollten für den gerichteten Transport zum Chromatin Motorproteine der Kinesin-Familie eine Rolle spielen. Durch die Inhibition von Mklp2, einem mitotischen Kinesin, konnte der Aufbau der Kernporenkomplexe durch MVP in porenlosen Kernen blockiert werden. N2 - In eukaryotes, the nuclear envelope is normally interspersed with numerous nuclear pore complexes, which act as the only gateway between the nucleo- and cytoplasm. Nuclear pore complexes mediate the directed transport of proteins and ribonucleoproteinparticles through the nuclear envelope. Little is known about the assembly of these structures out of various subcomplexes. Interestingly, our group recently linked the Major Vault Protein (MVP) with the assembly of nuclear pore complexes. MVP is the main part of Vault-complexes, huge barrel-shaped ribonucleoproteinparticles with many cellular functions attached, many of them still in debate. Vaults possibly play a role as nuclear transporters and several works exist that connect them with the origin of multiple drug resistance. The involvement in the assembly of nuclear pore complexes depicts a novel cellular function of MVP and should therefore be analyzed in this project. Preceding work with the cell-free system based on Xenopus laevis egg extract showed that the building of a continuous double membrane could be separated from the insertion of nuclear pore complexes and could be assigned to different membrane fractions of the egg extract. (Ewald et al., 1997). Two different membrane fractions were isolated out of Xenopus egg extract and named 40% and 30% membrane fraction according to their density. Mass spectrometric analysis showed that the pore-inducing 30% membrane fraction contained MVP (Dissertation Friederike Vollmar). The first step in this project was the particularly examination of the different behaviour of the 40% and 30% membrane fraction during the formation of the nuclear envelope. Thereby, it could be demonstrated that the 40% membrane fraction binds to chromatin where it builds up a continuous double membrane. The 30% membrane fraction was not able to independently bind to chromatin, but induced the formation of nuclear pore complexes when added to the pore-free nuclei. Immunofluorescent and ultrastructural studies proved that the MVP-associated 30% membrane fraction is responsible in this process. MVP, as well as Vault-particles have the ability to induce the de novo insertion of nuclear pore complexes in continuous double membranes. Artificial lipid membranes were used to study the molecular mechanisms involving MVP during the process of nuclear pore complex assembly. By using unilamellar liposomes and electron microscopy it could be demonstrated that MVP affects and perforates the lipid structure. Furthermore, MVP induced the formation of pores in black lipid membranes and lead to the detection currents by single channel measurement. To identify MVP-binding partners that are involved in the process of nuclear pore complex formation, several protein-protein-interaction studies were performed. The studies showed that no nucleoporins with the sequence motive FXFG could be detected among the MVP-binding partners, but it cannot be ruled out that MVP interacts with other nucleoporins during the formation of nuclear pore complexes. As a previous study showed the importance of microtubules during the assembly of nuclear pore complexes (Ewald et al., 2001), this work analyzed the interactions of the isolated 40% and 30% membrane fraction and of MVP concerning the microtubule network. Thereby, it could be shown that only the 30% membrane fraction was able to interact with microtubules and the colchicines-induced inhibition of microtubule polymerisation prevented the insertion of nuclear pore complexes. In contrast, the 40% membrane vesicles did not interact with microtubules and the colchicine-induced inhibition of microtubule assembly had no effect on the constitution of a continuous double membrane. In the next step, immunofluorescence studies demonstrated that the nuclear localisation of MVP is also dependent on microtubules. To demonstrate that the MVP-induced formation of nuclear pore complexes also depends on the microtubule-driven transport of MVP towards the nuclear membrane, the addition of MVP to pore-free nuclei was monitored after colchicine treatment. Hereby, it could be shown that MVP also needed microtubules to initiate the assembly of nuclear pore complexes. As the plus-ends of microtubules are directed towards the chromatin surface in the cell-free system, the directed transport in the direction of chromatin should be mediated by motor proteins of the Kinesin family. The inhibition of Mklp2, a mitotic Kinesin, prevented the assembly of nuclear pore complexes in Xenopus egg extract. The MVP-mediated de novo assembly of nuclear pore complex therefore is accomplished by the microtubule-transport of MVP via Mklp2. KW - Ribonucleoproteine KW - Kernhülle KW - Kernpore KW - Kernporenkomplex KW - Major Vault Protein KW - Vault KW - Kernhüllenbildung KW - Xenopus laevis KW - Nuclear pore complex KW - Major Vault Protein KW - Vault KW - Nuclear envelope assembly KW - Xenopus laevis Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-51279 ER - TY - THES A1 - Gabel, Martin Sebastian T1 - Behavioural resistance to \(Varroa\) \(destructor\) in the Western honeybee \(Apis\) \(mellifera\) - Mechanisms leading to decreased mite reproduction T1 - Resistenzverhalten der Westlichen Honigbiene \(Apis\) \(mellifera\) gegen \(Varroa\) \(destructor\) - Zu verringerter Milbenreproduktion führende Mechanismen N2 - The Western Honeybee (Apis mellifera) is among the most versatile species in the world. Its adaptability is rooted in thousands of the differently specialized individuals acting jointly together. Thus, bees that are able to handle a certain task or condition well can back up other individuals less capable to do so on the colony level. Vice versa, the latter individuals might perform better in other situations. This evolutionary recipe for success ensures the survival of colonies despite challenging habitat conditions. In this context, the ectoparasitic mite Varroa destructor reflects the most pronounced biotic challenge to honeybees worldwide. Without proper treatment, infested colonies rapidly dwindle and ultimately die. Nevertheless, resistance behaviours against this parasite have evolved in some populations through natural selection, enabling colonies to survive untreated. In this, different behaviours appear to be adapted to the respective habitat conditions and may complement each other. Yet, the why and how of this behavioural response to the mite remains largely unknown. My thesis focuses on the biological background of Varroa-resistance traits in honeybees and presents important findings for the comprehension of this complex host-parasite interaction. Based on this, I draw implications for both, applied bee breeding and scientific investigations in the field of Varroa-resistance. Specifically, I focus on two traits commonly found in resistant and, to a lower degree, also mite-susceptible colonies: decreased mite reproduction and the uncapping and subsequent recapping of sealed brood cells. Examining failures in the reproductive success of mites as a primary mechanism of Varroa-resistance, I was able to link them to specific bee behaviours and external factors. Since mite reproduction and the brood rearing of bees are inevitably connected, I first investigated the effects of brood interruption on the reproductive success of mites. Brood interruption decreased the reproductive success of mites both immediately and in the long term. By examining the causes of reproductive failure, I could show that this was mainly due to an increased share of infertile mites. Furthermore, I proved that interruption in brood rearing significantly increased the expression of recapping behaviour. These findings consequently showed a dynamic modulation of mite reproduction and recapping, as well as a direct effect of brood interruption on both traits. To further elucidate the plasticity in the expression of both traits, I studied mite reproduction, recapping behaviour and infestation levels over the course of three years. The resulting extensive dataset unveiled a significant seasonal variation in mite reproduction and recapping. In addition, I show that recapping decreases the reproductive success of mites by increasing delayed developing female offspring and cells lacking male offspring. By establishing a novel picture-based brood investigation method, I could furthermore show that both the removal of brood cells and recapping activity specifically target brood ages in which mite offspring would be expected. Recapping, however, did not cause infertility of mites. Considering the findings of my first study, this points towards complementary mechanisms. This underlines the importance of increased recapping behaviour and decreased mite reproduction as resistance traits, while at the same time emphasising the challenges of reliable data acquisition. To pave the way for a practical application of these findings in breeding, we then investigated the heritability (i.e., the share of genotypic variation on the observed phenotypic variation) of the accounted traits. By elaborating comparable test protocols and compiling data from over 4,000 colonies, we could, for the first time, demonstrate that recapping of infested cells and decreased reproductive success of mites are heritable (and thus selectable) traits in managed honeybee populations. My thesis proves the importance of recapping and decreased mite reproduction as resistance traits and therefore valuable goals for breeding efforts. In this regard, I shed light on the underlying mechanisms of both traits, and present clear evidence for their interaction and heritability. N2 - Die Westliche Honigbiene (Apis mellifera) zählt zu den anpassungsfähigsten Arten der Welt. Diese Anpassungsfähigkeit liegt in der Zusammenarbeit tausender unterschiedlich spezialisierter Individuen begründet. Auf Volksebene können Bienen, die mit einer bestimmten Aufgabe oder Situation gut umgehen können, andere Individuen, die dies weniger gut können, absichern. Andererseits können Letztere womöglich mit anderen Situationen besser umgehen. Dieses evolutionäre Erfolgskonzept sichert das Überleben der Völker selbst unter herausfordernden Habitatbedingungen. Die ektoparasitäre Milbe Varroa destructor stellt in diesem Zusammenhang weltweit die größte biotische Herausforderung dar. Ohne entsprechende Behandlung siechen die Völker rasch dahin und sterben schlussendlich. In einigen Populationen haben sich jedoch Resistenzmechanismen durch natürliche Selektion herausgebildet, die es den Völkern ermöglichen, ohne Behandlung zu überleben. Die verschiedenen Verhaltensweisen scheinen dabei an die jeweiligen Habitatbedingungen angepasst zu sein und sich gegenseitig zu ergänzen. Was diese Reaktion auf die Milben auslöst und wie sie funktioniert ist allerdings noch weitestgehend unbekannt. Meine Dissertation fokussiert den biologischen Hintergrund von Varroa-resistenzmechanismen bei Honigbienen und stellt dabei wichtige Erkenntnisse zum Verständnis dieser komplexen Parasit-Wirt-Beziehung vor. Darauf aufbauend leite ich Implikationen für die angewandte Bienenzucht und wissenschaftliche Untersuchungen auf dem Gebiet der Varroa-resistenz ab. Hierbei konzentriere ich mich insbesondere auf zwei Merkmale, die häufig in resistenten Völkern zu finden sind: die reduzierte Milbenreproduktion und das Entdeckeln und Wiederverdeckeln bereits verschlossener Brutzellen. Beide Merkmale treten in geringerem Umfang auch in milbenanfälligen Populationen auf und sind daher von besonderem Interesse für jedwede Zuchtbemühung mit dem Ziel der Varroa-resistenz. Durch die Untersuchung von Fehlern in der Reproduktion der Milben, konnte ich diesen Hauptmechanismus der Varroa-resistenz mit Verhaltensweisen der Bienen, sowie äußeren Faktoren in Verbindung setzen. Da die Milbenvermehrung untrennbar mit der Brutaufzucht der Bienen verbunden ist, habe ich zunächst die Einflüsse von Brutunterbrechungen auf den Vermehrungserfolg der Milben untersucht. Diese Untersuchung zeigte auf, dass Brutunterbrechungen den Vermehrungserfolg der Milben sowohl kurzfristig, als auch langfristig herabsetzen. Durch die Untersuchung der jeweils zugrundeliegenden Ursachen gescheiterter Milbenreproduktion konnte ich zeigen, dass dies vor Allem auf einen gesteigerten Anteil infertiler Milben zurückzuführen war. Des Weiteren konnte ich beweisen, dass die Unterbrechung der Brutaufzucht die Ausprägung des Wiederverdeckelns signifikant verstärkte. Folglich zeigten diese Ergebnisse eine dynamische Anpassung der Milbenreproduktion und des Wiederverdeckelns, sowie einen direkten Einfluss der Brutunterbrechungen auf beide Eigenschaften. Um die Plastizität der Ausprägung beider Merkmale genauer zu erklären, untersuchte ich daraufhin drei Jahre lang die Milbenvermehrung, das Verhalten des Wiederverdeckelns, sowie die Befallsentwicklung. Daraus resultierte ein umfangreicher Datensatz, der eine signifikante saisonale Variation der Milbenvermehrung und des Wiederverdeckelns belegte. Ich konnte außerdem eindeutig beweisen, dass das Wiederverdeckeln den Reproduktionserfolg der Milben herabsetzt, indem es die Anteile von verzögert heranwachsenden weiblichen Nachkommen und fehlenden Männchen steigert. Durch Anwendung einer neuartigen Bild-basierten Methode der Brutuntersuchung, konnte ich darüber hinaus zeigen, dass sich sowohl das Ausräumen, als auch das Wiederverdeckeln von Brutzellen auf Brutalter konzentriert, in denen Milbennachwuchs erwartet werden würde. Das Wiederverdeckeln trug jedoch nicht zur Infertilität der Milben bei, was zusammen mit den Ergebnissen meiner ersten Untersuchung auf komplementäre Mechanismen hinweist. Dies unterstreicht die Bedeutung des Wiederverdeckelns und der verminderten Milbenreproduktion als Resistenzmechanismen, hebt aber gleichzeitig auch die Herausforderungen einer verlässlichen Datenerhebung hervor. Um den Weg für die praktische Anwendung dieser Erkenntnisse in der Zuchtarbeit zu ebnen, untersuchten wir daraufhin die Erblichkeit (den Anteil der genotypischen Variation an der beobachteten phänotypischen Variation) der betrachteten Merkmale. Durch das Erarbeiten vergleichbarer Prüfprotokolle und Zusammenführen von Daten aus über 4000 Völkern, konnten wir erstmalig zeigen, dass das Wiederverdeckeln befallener Zellen und der verminderte Vermehrungserfolg der Milben erbliche und damit selektierbare Merkmale in bewirtschafteten Honigbienenpopulationen sind. Meine Dissertation beweist die Relevanz des Wiederverdeckelns und der verminderten Milbenreproduktion als Resistenzmerkmale und damit lohnende Ziele für Zuchtbemühungen. In diesem Zusammenhang beleuchtete ich verschiedene Mechanismen, die der Ausprägung beider Merkmale zugrunde liegen und lieferte eindeutige Beweise für deren Interaktion und Erblichkeit. KW - Varroa destructor KW - Resistenz KW - Biene KW - mite non-reproduction KW - recapping KW - Varroa resistance KW - biotechnical Varroa control KW - heritability KW - selection KW - honeybees KW - Varroa mites KW - Züchtung KW - Apis mellifera KW - Breeding Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-360536 ER - TY - THES A1 - Hokema, Anna T1 - Beeinflussung der Genexpression verschiedener Gene durch Xmrk in Pigmentzelltumoren bei Oryzias latipes T1 - The effect of Xmrk on the gene expression of various genes in pigment cell tumors in oryzias latipes N2 - Ziel dieser Arbeit ist es ein besseres Verständinis der molekularen Prozesse der Melanomentstehung und Tumorprogression zu gewinnen. Hierfür wurde ein Tiermodell transgener Medakas (Oryzias latipes) verwendet, welche als stabiles Transgen das Konstrukt mitf::xmrk besitzen. Diese Fische entwickelten Pigmentzelltumore, welche für eine Microarrayanalyse herangezogen wurden. Aus diesem Microarraydatensatz wurden 11 Gene ausgewählt, welche in dieser Arbeit näher untersucht wurden. Beobachtungen haben ergeben, dass sich bei transgenen Medakas, welche Xmrk exprimieren, verschiedene pigmentierte Hauttumore entwickeln. Diese Tumore wurden je nach ihrem verschiedenen Histiotyp klassifiziert und untersucht. Um einen Eindruck zu gewinnen, wie Xmrk die Transkription verschiedener Gene, welche in der Krebsentstehung und –progression eine wichtige Rolle spielen, beeinflusst, wurden pigmentierte Hauttumore transgener Medakas, so wie zu Vergleichszwecken hyperpigmentierte Haut transgener Medakas und Lymphome und gesunde Organe von Wildtyp-Medakas, untersucht. Mit Hilfe von Real-time-PCR’s wurden die folgenden Gene untersucht: G6PC, GAMT, GM2A, MAPK3, NID1, SLC24A5, SPP1, PDIA4, RASL11B, TACC2 und ZFAND5. Dabei konnte festgestellt werden, dass die Expression der Gene GM2A, MAPK3, NID1, PDIA4, RASL11B, SLC24A5 und ZFAND5 von Xmrk beeinflusst wird, während dies für die Gene G6PC, GAMT, SPP1 und TACC2 nicht zutrifft. Im Vergleich zu gesunder Haut werden GM2A, MAPK3, PDIA4, RASL11B, SLC24A5 und ZFAND5 in Tumoren höher exprimiert. Die Gene G6PC, GAMT, NID1, SPP1 und TACC2 werden dagegen verglichen mit gesunder Haut unverändert oder niedriger exprimiert. Die Bedeutung der erhöhten Genexpression lässt sich in vielen Fällen zurzeit nur theoretisch erfassen. Eine höhere Expression von SLC24A5 beispielsweise lässt vermuten, dass ein Zusammenhang zwischen der Melaninproduktion und der Zellproliferation besteht. Die Überexpression von GM2A weist dagegen auf eine Rolle von GM2A als Tumormarker hin. Dahingegen scheint die erniedrigte Expression von GAMT und G6PC Auskunft über den veränderten Stoffwechsel in Tumoren zu geben. Um diese Ergebnisse zu bestätigen und zu entschlüsseln wie genau Xmrk die Expression der getesteten Gene beeinflusst, sind allerdings noch weitere funktionelle Studien nötig. Generell kommt man zu dem Schluss, dass die Genexpression sich in jedem Tumor unterscheidet. Daher scheint jeder Tumor seinen eigenen Evolutionsweg zu beschreiten. N2 - Target of this work is to get a better understanding in melanomagenesis and tumorprogression. Therefore a model of transgenic medakas (Oryzias latipes) was used, wich had the construct mitf::Xmrk as a stable, integrated transgen. Those fishes developed pigmentcelltumors that, wich where used in a microarrayanalysis. Of the results of this microarray 11 genes where chosen and analysed in this study. Those transgenic medakas which got xmrk injected, but without a tumorsuppresorgen, developed various pigmented kinds of skin cancer. Those tumors were analysed equally to their histiotyps. To get an idea, how Xmrk effects the transcription of several genes, which play an important role in tumor development and progression, pigmented skin cancer of transgenic medakas and for comparison, hyper pigmented skin of transgenic medakas and also lymphoma and healthy organs where tested. The following genes where tested by real-time-PCR: G6PC, GAMT, GM2A, MAPK3, NID1, SLC24A5, SPP1, PDIA4, RASL11B, TACC2 and ZFAND5. It was noticed that the expression of the genes GM2A, MAPK3, NID1, PDIA4, RASL11B, SLC24A5 und ZFAND5 gets modified by Xmrk. In contrast the genes G6PC, GAMT, SPP1 and TACC2 didn't. In comparison to healthy skin GM2A, MAPK3, PDIA4, RASL11B, SLC24A5 and ZFAND5 got higher expressed in tumors. Indeed the expression level of the genes G6PC, GAMT, NID1, SPP1 and TACC2 is the same or even lower than in healthy skin. The meaning of the higher gen expression can currently just be theoretically conceived. The higher expression of SLC24A5 for example leads to guess that there is a link between the production of melanin and cell proliferation. The overexpression of GM2A shows that GM2A plays maybe a role as an tumor marker. However the lower expression of G6PC and GAMT gets references about the metabolism in cancer. To fix this results and get an better understanding how Xmrk affects the expression of this genes, additional funktional studies are necessary. The result is that gene expression differs in each tumor. A common conclusion is not possible. It appears that each tumor goes its own evolutionary way. KW - Japankärpfling KW - Melanom KW - Hauttumor KW - Genexpression KW - Real time quantitative PCR KW - Onkogen KW - Xmrk KW - Xmrk Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-75616 ER - TY - THES A1 - Seitz, Nicola T1 - Bee demise and bee rise: From honey bee colony losses to finding measures for advancing entire bee communities T1 - Bienenschwund und Bienenaufschwung: Von Honigbienen-Kolonieverlusten zur Förderung von gesamten Bienengemeinschaften N2 - My dissertation comprises three studies: (1) an assessment of honey bee colony losses in the USA between 2014 and 2015, (2) an exploration of the potential of reclaimed sand mines as bee habitat, and (3) an evaluation of native and non-native pollinator friendly plants in regard to their attraction to bees. While the first study focuses on honey bees, the latter two studies primarily take wild bees or entire bee communities in focus. The study on honey bee colony losses was conducted within the framework of the Bee Informed Partnership (BIP, beeinformed.org) and aligns with the annual colony loss surveys which have been conducted in the USA since the winter of 2006/2007. It was the fourth year for which summer and annual losses were calculated in addition to winter losses. Among participants, backyard beekeepers were the largest group (n = 5690), although sideline (n = 169) and commercial (n = 78) beekeepers managed the majority (91.7 %) of the 414 267 surveyed colonies. Overall, 15.1 % of the estimated 2.74 million managed colonies in the USA were included in the study. Total honey bee colony losses (based on the entirety of included colonies) were higher in summer (25.3 %) than in winter (22.3 %) and amounted to 40.6 % for the entire 2014/2015 beekeeping year. Average colony losses per beekeeper or operation were higher in winter (43.7 %) than in summer (14.7 %) and amounted to 49 % for the entire 2014/2015 beekeeping year. Due to the dominance of backyard beekeepers among participants, average losses per operation (or unweighted loss) stronger reflected this smaller type of beekeeper. Backyard beekeepers mainly named colony management issues (e.g., starvation, weak colony in the fall) as causes for mortality, while sideline and commercial beekeepers stronger emphasized parasites or factors outside their control (e.g., varroa, nosema, queen failure). The second study took place at reclaimed sand mines. Sand mines represent anthropogenically impacted habitats found worldwide, which bear potential for bee conservation. Although floral resources can be limited at these habitats, vegetation free patches of open sandy soils and embankments may offer good nesting possibilities for sand restricted and other bees. We compared bee communities as found in three reclaimed sand mines and at adjacent roadside meadows in Maryland, USA, over two years. Both sand mines and roadsides hosted diverse bee communities with 111 and 88 bee species, respectively. Bee abundances as well as richness and Shannon diversity of bee species were higher in sand mines than at roadsides and negatively correlated with the percentage of vegetational ground cover. Species composition also differed significantly between habitats. Sand mines hosted a higher proportion of ground nesters, more uncommon and more ‘sand loving’ bees similar to natural sandy areas of Maryland. Despite the destruction of the original pre-mining habitat, sand mines thus appear to represent a unique habitat for wild bees, particularly when natural vegetation and open sand spots are encouraged. Considering habitat loss, the lack of natural disturbance regimes, and ongoing declines of wild bees, sand mines could add promising opportunities for bee conservation which has hitherto mainly focused on agricultural and urban habitats. The third study was an experimental field study on pollinator friendly plants. Bees rely on the pollen and nectar of plants as their food source. Therefore, pollinator friendly plantings are often used for habitat enhancements in bee conservation. Non-native pollinator friendly plants may aid in bee conservation efforts, but have not been tested and compared with native pollinator friendly plants in a common garden experiment. In this study, we seeded mixes of 20 native and 20 non-native pollinator friendly plants in two separate plots at three sites in Maryland, USA. For two years, we recorded flower visitors to the plants throughout the blooming period and additionally sampled bees with pan traps. A total of 3744 bees (120 species) were sampled in the study. Of these, 1708 bees (72 species) were hand netted directly from flowers for comparisons between native and non-native plants. Depending on the season, bee abundance and species richness was either similar or lower (early season and for richness also late season) at native plots compared to non-native plots. Additionally, the overall bee community composition differed significantly between native and non-native plots. Furthermore, native plants were associated with more specialized plant-bee visitation networks compared to non-native plants. In general, visitation networks were more specialized in the early season than the later seasons. Four species (Bombus impatiens, Halictus poeyi/ligatus, Lasioglossum pilosum, and Xylocopa virginica) out of the five most abundant bee species (also including Apis mellifera) foraged more specialized on native than non-native plants. Our study showed that non-native plants were well accepted by a diverse bee community and had a similar to higher attraction for bees compared to native plants. However, we also demonstrated alterations in foraging behavior, bee community assemblage, and visitation networks. As long as used with caution, non-native plants can be a useful addition to native pollinator friendly plantings. This study gives a first example of a direct comparison between native and non-native pollinator friendly plants. N2 - Meine Dissertation umfasst drei Studien: (1) eine Erfassung von Honigbienen-Kolonieverlusten in den USA zwischen 2014 und 2015, (2) die Erforschung des Potenzials renaturierter Sandminen als Habitat für Bienen und (3) eine Evaluierung nativer sowie standortfremder bestäuberfreundlicher Pflanzen hinsichtlich ihrer Attraktivität für Bienen. Während die erste Studie Honigbienen im Fokus hat, verschiebt sich der Fokus der zwei weiteren Studien hin zu Wildbienen bzw. gesamten Bienengemeinschaften. Die Studie zu Honigbienenkolonieverlusten wurde im Rahmen des Bee Informed Partnerships (BIP, beeinformed.org) durchgeführt und reiht sich ein in die seit dem Winter 2006/2007 jährlich durchgeführten Untersuchungen in den USA. Es ist das vierte Jahr in dem Sommer- und Jahresverluste zusätzlich zu den Winterverlusten kalkuliert wurden. Unter den Teilnehmern bildete die Gruppe der Hobby-Imker den größten Anteil (n = 5690), obwohl nebenberufliche (n = 169) und kommerzielle (n = 78) Imker den Großteil (91,7 %) der 414 267 begutachteten Bienenvölkern bzw. Kolonien hielten. Insgesamt enthielt die Studie 15,1 % der auf 2,74 Mio. geschätzten Gesamtzahl an gehaltenen Bienenvölkern in den USA. Die Gesamtverluste an Honigbienenvölkern (basierend auf der Gesamtheit der erfassten Völker) waren im Sommer mit 25,3 % höher als im Winter mit 22,3 % und bezifferten sich auf 40,6 % für das gesamte Imkerjahr in 2014/2015. Durchschnittliche Kolonieverluste pro Imkerbetrieb waren höher im Winter (43,7 %) als im Sommer (14,7 %) und betrugen 49 % für das gesamte Imkerjahr in 2014/2015. Aufgrund der hohen Anzahl an Hobby-Imkern unter den Teilnehmern reflektieren die durchschnittlichen Kolonieverluste pro Imkerbetrieb (oder ungewichtete Verluste) v.a. die Situation dieser kleineren Imkerbetriebe. Hobby-Imker nannten als Gründe für die Honigbienenmortalität hauptsächlich Probleme des Koloniemanagements (z.B. Verhungerung, schwache Völker im Herbst), während nebenberufliche und kommerzielle Imker stärker Faktoren betonten, die außerhalb ihrer Kontrolle lagen (z.B. Varroamilben, Nosemasporen, Versagen der Königin). Die zweite Studie fand in renaturierten Sandminen statt. Sandminen sind weltweit zu findende anthropogen veränderte Landschaften, die ein Potenzial für Bienenschutz haben. Obwohl florale Ressourcen in diesen Habitaten limitiert sein können, könnten die vegetationsfreien Flecken auf offenen Sandböden und Böschungen gute Nistplätze für auf Sand spezialisierte und andere Bienen bieten. Wir haben Bienengemeinschaften aus drei renaturierten Sandminen sowie jeweils nahe gelegenen bepflanzten Straßenrändern in Maryland, USA verglichen. Sowohl die Sandminen als auch die Straßenränder enthielten vielfältige Bienengemeinschaften mit 111 (Sandminen) und 88 (Straßenränder) Bienenarten. Bienenabundanz, Artenreichtum und Shannon Diversität waren höher in den Sandminen als an den Straßenrändern und korrelierten negativ mit dem Anteil an vorhandener Bodenvegetation. Darüber hinaus unterschied sich die Artzusammensetzung signifikant zwischen den beiden Habitattypen. Sandminen enthielten einen größeren Anteil an Bodennistern, mehr seltene Arten und mehr sandliebende Arten, ähnlich natürlicher sandiger Gebiete in Maryland. Trotz der Zerstörung des ursprünglichen prä-Minen Habitats, scheinen Sandminen daher ein einzigartiges Bienenhabitat für Wildbienen darzustellen, besonders wenn die natürliche Besiedlung von Vegetation und offene Sandflächen gefördert werden. Im Hinblick auf Habitatverluste, auf das Fehlen von natürlichen Landschaftsstörungen und auf den weiterschreitenden Rückgang an Wildbienen, könnten Sandminen eine vielversprechende Möglichkeit für Bienenschutz darstellen, der sich bisher stark auf landwirtschaftliche und urbane Habitate konzentrierte. Bei der dritten Studie handelt es sich um eine experimentelle Feldstudie zu bestäuberfreundlichen Pflanzen. Bienen sind auf Pollen und Nektar von Pflanzen als Nahrungsquelle angewiesen. Aus diesem Grund werden bestäuberfreundliche Pflanzen oft für Habitatverbesserungen im Rahmen von Bienenschutzmaßnahmen gepflanzt. Standortfremde bestäuberfreundliche Pflanzen können dabei die Bienenschutzmaßnahmen unterstützen, wurden aber bisher nicht in einem Common Garden Experiment zusammen mit nativen bestäuberfreundlichen Pflanzen getestet bzw. verglichen. In dieser Studie haben wir Saatgutmischungen mit jeweils 20 nativen und 20 standortfremden Pflanzen in zwei separaten Plots in drei Gebieten in Maryland, USA ausgesät. Zwei Jahre lang protokollierten wir über die gesamten Blühzeiträume hinweg Pflanzenbesucher und sammelten Bienen mit Farbschalen. Insgesamt erfassten wir 3744 Bienen (120 Arten), von denen 1708 Individuen (72 Arten) per Hand direkt von den Blüten gesammelt wurden für die Vergleiche zwischen nativen und standortfremden Pflanzen. Abhängig von der Saison waren Bienenabundanz und Artenreichtum entweder ähnlich oder niedriger (frühe Saison und für Artenreichtum auch späte Saison) in nativen Plots verglichen mit den standortfremden Plots. Zusätzlich unterschied sich die Zusammensetzung der Bienengemeinschaft signifikant zwischen nativen und standortfremnden Pflanzen. Darüber hinaus waren die Bienen-Pflanzen-Besuchs-Netzwerke nativer Pflanzen spezialisierter als die Besuchs-Netzwerke standortfremder Pflanzen. Im Allgemeinen waren die Besuchs-Netzwerke in der frühen Saison spezialisierter als in der späten Saison. Vier Arten (Bombus impatiens, Halictus poeyi/ligatus, Lasioglossum pilosum, und Xylocopa virginica) der fünf am häufigsten vorkommenden Arten (zusätzlich auch Apis mellifera) fouragierten spezialisierter auf nativen Pflanzen als auf standortfremden Pflanzen. Unsere Studie zeigte, dass standortfremde Pflanzen weitläufig von einer artenreichen Bienengemeinschaft angenommen wurden und eine ähnliche bis höhere Attraktivität für Bienen aufwiesen verglichen mit nativen Pflanzen. Allerdings demonstrierten wir auch Änderungen im Fouragierverhalten, in der Zusammensetzung der Bienengemeinschaft und in den Besuchs-Netzwerken. Insgesamt kann ein vorsichtiger Einsatz standortfremder Pflanzen eine sinnvolle Ergänzung zu nativen bestäuberfreundlichen Anpflanzungen sein. Diese Studie stellt ein erstes Beispiel eines direkten Vergleichs von nativen und standortfremden bestäuberfreundlichen Anpflanzungen dar. KW - Biene KW - Wildbienen KW - Renaturierung <Ökologie> KW - Naturschutz KW - Honigbienen KW - exotische Pflanzen KW - Sandminen KW - Pflanzen-Bienen-Netzwerke KW - bestäuberfreundliche Pflanzen KW - wild bees KW - honey bees KW - sand mine KW - pollinator friendly plants KW - plant-bee visitation networks Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-184180 ER - TY - THES A1 - Faist, Hanna T1 - Bedeutung und Charakterisierung der bakteriellen Flora in Vitis vinifera mit und ohne Wurzelhalsgallen T1 - Significance and characterization of the bacterial community in Vitis vinifera with and without crown galls N2 - Am Rebstock werden in der Natur von Agrobacterium vitis, dem Auslöser Wurzelhalsgallenerkrankung, charakteristische Wurzelhalsgallentumore induziert. Virulente Vertreter der Gattung der Agrobacteria schleusen bakterielle DNA in das pflanzliche Genom ein, wodurch die Pflanze Tumore produziert. Die Wurzelhalsgallenerkrankung wird seit einem Jahrhundert als ein Beispiel der Pflanzen-Pathogen-Interaktion untersucht. Die Rolle der bakteriellen Flora im Zusammenhang mit der Wurzelhalsgallenerkrankung beim Rebstock wurde bisher kaum betrachtet. Um dieser Frage nachzugehen, habe ich die endophytische mikrobielle Zusammensetzung von Rebstöcken mit und ohne Wurzelhalsgalle analysiert. Es werden Proben von drei Zeitpunkten einer Wachstumsperiode (Frühling, Sommer und Herbst) und von den Organen der Rebstöcke (Wurzeln, Pfropfstelle und einjährige Triebe) sowie dem Boden in einer Weinanlage bei Himmelstadt in Unterfranken genommen. Die Bakterienflora dieser Umweltproben wird mit kultivierungsabhängigen (Isolierung von Bakterien) und kultivierungsunabhängigen (Hochdurchsatzsequenzierungen) Methoden untersucht. Zudem werden i) die Virulenz der verschiedenen Agrobacterium-Isolate in Tumorassays bestimmt, ii) synthetische Bakteriengemeinschaften von in vitro kultivierten Weinpflänzchen mit Wurzelhalsgallen analysiert, iii) die Genome von einem virulenten und einem nicht-virulenten Agrobacteria-Isolat aus der Wurzelhalsgalle verglichen, iv) erste Interaktionsstudien auf festen Nährmedien durchgeführt und v) virulente Agrobacteria mittels bildgebender Fluoreszenz-Lebenszeit-Mikroskopie (FLIM) in Wurzelhalsgallen lokalisiert. Die Rebstöcke dieser Studie haben eine organspezifische Bakterienflora, die innerhalb einer Wachstumsperiode variiert. Nur die Bakterienflora der Pfropfstelle (mit oder ohne Wurzelhalsgalle) aber nicht die des Bodens, der Wurzeln, und der einjährigen Triebe unterscheidet sich strukturell zwischen gesunden und erkrankten Rebstöcken. Mikroskopisch konnten virulente Agrobacteria punktuell in Interzellularen, sklerenchymatischen Geweben und assoziiert mit Leitgefäßen nachgewiesen werden. Dadurch ist ausreichend Lebensraum vorhanden, der zusätzlich von tumorspezifischen Bakterien besiedelt werden kann. Im Gegensatz zur gesunden Pfropfstelle ist in der Wurzelhalsgalle eine saisonal stabile Kernmikroflora, bestehend aus Vertreter von A. vitis, Pseudomonas, Enterobacteriaceae, Agrobacterium tumefaciens, Gammaproteobacteria und Burkholderiales, vorhanden. Diese Bakterien werden überwiegend aus dem Boden rekrutiert und profitieren von der Nährstoffsituation in der Wurzelhalsgalle. Wurzelhalsgallen enthalten Opine, die nur von der transformierten Pflanzenzelle produziert werden. Interessanterweise hat in dieser Arbeit ein Agrobacterium-Isolat Gene, die zum Opinkatabolismus beitragen und ein Pseudomonas-Isolat kann Opine als einzige Kohlenstoffquelle nutzen. Trotzdem sind beide Isolate weder virulent noch verdrängen sie die virulenten A. vitis, die ebenso Opine nutzen, aus der Wurzelhalsgalle. In synthetischen Bakteriengemeinschaften an in vitro kultivierten Weinpflänzchen konnte gezeigt werden, dass diese und weitere tumorspezifischen Bakterien, neben A. vitis, nicht essentiell zur Entstehung der Wurzelhalsgalle nötig sind aber unterschiedliche Funktionen in der Wurzelhalsgalle übernehmen. Ein Serratia-Isolat hemmt das Wachstum von A. vitis auf festen Nährmedium, andere fördern oder hemmen das Wachstum der Wurzelhalsgalle. Nach Studien in der Literatur erhöhen weitere Bakterien die Resistenz des Rebstocks gegenüber biotischem und abiotischem Stress. Zusammengefasst identifizierten und isolierte ich in dieser Studie unter 150 unterschiedlichen Bakterien in der Wurzelhalsgalle jene Bakterien, die neben A. vitis von der neuen ökologischen Nische profitieren und somit wahrscheinlich Opportunisten mit unterschiedlichen Funktionen sind. In Folge von multiplen Interaktionen in der Wurzelhalsgalle entsteht ein ökologisches Gleichgewicht zwischen den opportunistischen Bakterien, der Wurzelhalsgalle und dem Rebstock, das den Fortbestand des Rebstocks mit Wurzelhalsgalle ermöglicht. N2 - In nature, Agrobacterium vitis is known for the ability to introduce bacterial DNA into the grapevine genome, thereby causing crown gall disease. This plant disease has been studied for a century as a model for plant-pathogen interaction, while the role of the plant microbiota in disease development is not well understood. My study contributes to the understanding of the microbial ecology in crown galls of grapevine, combining culture-dependent with culture-independent high-throughput sequencing techniques. I analysed the structure of the endophytic microbiota by collecting different samples (soil, roots, graft unions and canes) of diseased and non-diseased grapevines from one vine-yard in Franconia, Bavaria, Germany during one growing season (spring, summer, autumn). The characterization of the grapevine-associated bacterial microbiota was completed by (i) detecting the virulence of diverse agrobacterial isolates using a tumour growth assay with in vitro cultivated grapevine plantlets, (ii) microbial analysis of synthetic communities of in vitro cultivated grapevine plantlets with crown galls, (iii) genome sequencing of a virulent and a non-virulent agrobacterial isolate, (iv) in vitro interaction studies on solid medium with bacterial isolates and (v) localisation of virulent A. vitis using Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) in tumour tissues. Grapevine plants of this study have an organ-specific bacterial community that varies during one growing season. Healthy and diseased grapevine plants differed in the struc-ture of the bacterial community only in the graft union (with or without a crown gall), but not in the soil, root and one-year old cane. Microscopy revealed that virulent Agrobacteria mainly accumulate in defined spots of sclerenchymatous tissue, intercellular space and tissues associated with vessels. Therefore, there is unoccupied living space in a crown gall, which can be additionally colonized by tumour-specific bacteria. A season-independent stable core bacteria exists in grapevine crown galls in contrast to healthy graft unions, consisting of OTUs assigned to A. vitis, Pseudomonas, Enterobacteriaceae, Agrobacterium tumefaciens, Gammaproteobacteria and Burkholderiales. These bacteria are predominantly recruited from the soil and most likely profit from special nutrients in the crown gall. The crown gall contains opines, exclusively produced by transformed plant cells. Curiously individual isolates of Agrobacteria and Pseudo-monas of this study that are non-virulent do not outcompete virulent A. vitis in the crown gall but harbour, like A. vitis, genes involved in octopin-catabolism or use opines in liquid cultures as a sole nutrient source. Although synthetic bacterial communities revealed that the tumour-specific bacteria are not required for crown gall induction us-ing in vitro grown grapevine plantlets, they may have different functions in crown gall persistence. A Serratia-isolate inhibits the growth of A. vitis on solid medium, others reduce or support crown gall development, while some, according to literature, increase resistance of the grapevine plant against biotic and abiotic stresses. Taken together, among the 150 bacteria found in the crown galls, I identified and isolated bacteria in addition to A. vitis that profit from the new ecological niche suggesting an opportunistic lifestyle with different ecological functions. An ecological equilibrium in a bacterial community that balances crown gall growth will support the existence of grapevine plants with a crown gall in vineyards. KW - Wurzelhalsgalle KW - DNA Barcoding KW - Agrobacterium vitis KW - Weinrebe KW - Angewandte Mikrobiologie KW - bakterielle Flora KW - Holobiont KW - Mikrobiota Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-154359 ER - TY - THES A1 - Bettaga, Noomen T1 - Bedeutung der NO-sensitiven Guanylyl Cyclase bei der Angiogenese und der Arteriogenese in der Maus T1 - Role of NO-sensitive guanylyl cyclase in angiogenesis and arteriogenesis in mice N2 - Stickstoffmonoxid (NO) spielt eine wichtige Rolle bei Gefäßremodelling-Prozessen wie Angiogenese und Arteriogenese. Die NO-Synthese im Gefäßsystem wird hauptsächlich durch die endotheliale NO-Synthase (eNOS) gewährleistet. Sie kann durch verschiedene Faktoren wie Scherkräfte und Zytokine wie der vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor (VEGF) reguliert werden. VEGF ist ein wichtiger Stimulator der Angiogenese und wird während dieses Prozesses hochreguliert. Die meisten physiologischen Effekte von NO werden durch die NO-sensitive Guanylyl-Cyclase (NO-GC) vermittelt. Als Hauptrezeptor für NO produziert die NO-GC den sekundären Botenstoff cyklisches Guanosinmonophosphat (cGMP) und führt dadurch zur Stimulation der verschiedenen Effektoren wie z.B. der PKG. Ob die Wirkung von NO in Angiogenese und Arteriogenese ebenfalls durch NO-GC vermittelt wird, war bis zum Beginn dieser Arbeit noch unklar. Die NO-GC besteht aus zwei Untereinheiten (α und ß). Die Deletion der ß1-Untereinheit in Mäusen resultiert in einer vollständigen Knockout Maus (GCKO). Mithilfe des Cre-LoxP-Systems wurden zusätzlich zellspezifische Knockout-Mäuse für glatte Muskelzellen (SMC-GCKO) und Endothelzellen (EC-GCKO) generiert. Um die Rolle der NO-GC in der Angiogenese und Arteriogenese zu untersuchen, wurden drei gut etablierte Methoden benutzt. Im ersten Teil des Projekts sollte die Expression der NO-GC in Endothelzellen untersucht werden. Zu diesem Zweck wurde die reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) benutzt. Die Ergebnisse zeigen, dass die NO-GC in Endothelzellen der Lunge nur äußerst gering wenig exprimiert ist. Durch den Aortenring-Assay wurde eine Rolle der NO-GC bei der VEGF-vermittelten Angiogenese festgestellt. Dabei zeigte sich eine stärkere Angiogeneserate bei globaler Abwesenheit der NO-GC. Bei Fehlen der NO-GC ausschließlich in Endothelzellen zeigte sich kein Unterschied in den aussprossenden Aorten im Vergleich zu den Kontroll-Tieren. Dies zeigt, dass die NO-GC in Endothelzellen sehr wahrscheinlich keine Rolle bei der VEGF-vermittelten Angiogenese spielt. Im zweiten Teil wurde die Rolle der NO-GC bei der Angiogenese in einem in vivo-Modell untersucht. In dem Modell der Sauerstoff-induzierten-Retinopathie zeigten die GCKO-Mäuse eine verringerte Vaso-Obliteration, eine verlangsamte Angiogenese und eine erhöhte Tuft-Bildung. Ähnliche Ergebnisse wurden bei den SMC-GCKO-Tieren beobachtet. EC-GCKO-Mäuse zeigten eine gegenüber den Kontroll-Tieren unveränderte Vaso-Obliteration, Angiogeneserate und Tuft-Bildung. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass die NO-GC in Endothelzellen keine Rolle spielt. Immunfluoreszenz-Aufnahmen zeigten die Expression von NO-GC in Perizyten der Gefäßkapillaren der Mausretina. Daher könnte die NO-GC in diesem Zelltyp letztendlich für die Effekte bei den GCKO- und SMC-GCKO-Tieren verantwortlich sein. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde eine Versuchsreihe unter Anwendung des Hinterlauf-Ischämie-Modells durchgeführt. Hierbei entwickelten die Pfoten aller GCKO- und teilweise der SMC-GCKO-Tiere nach der Ligation der Femoralarterie eine Nekrose. Die Regeneration der Hinterläufe der EC-GCKO-Tiere nach der Operation verlief normal. Diese Ergebnisse schließen eine bedeutende Rolle der NO-GC in Endothelzellen aus, zeigen allerdings, dass die NO-GC in den glatten Muskelzellen essentiell für den Arteriogenese-Prozess ist. Zusammengefasst führt die Deletion der NO-GC in glatten Muskelzellen und wahrscheinlich auch in Perizyten zur einer verlangsamten Angiogenese und Inhibierung der Arteriogenese. N2 - Nitric oxide (NO) plays an important role in vascular remodelling processes such as angiogenesis and arteriogenesis. The synthesis of NO in the vascular system is ensured mainly by endothelial NO synthase (eNOS). It can be regulated by a number of factors, such as shear stress and cytokines like the vascular endothelial growth factor (VEGF). VEGF is an important stimulator of angiogenesis and is upregulated during this process. Most of the physiological effects of NO are mediated by the NO-sensitive guanylyl cyclase (NO-GC). As the main receptor for NO, NO-GC produces the second messenger cyclic guanosine monophosphate (cGMP) and thereby leads to a variety of physiological effects. However, whether the effects of NO in angiogenesis and arteriogenesis are also mediated by NO-GC is still unclear. NO-GC consists of two subunits (α and ß). The deletion of the ß1 subunit in mice results in a global knockout mouse (GCKO). Using the Cre-LoxP system we also generated smooth muscle cell-specific (SMC GCKO) and endothelial cell-specific knockout mice (EC GCKO). To investigate the role of NO-GC in angiogenesis and arteriogenesis, three well-established methods have been used. In the first part of the project, the expression of the NO-GC in endothelial cells should be investigated. By using the reverse transcription polymerase chain reaction method (RT-PCR), the results show a very weak expression of the NO-GC in endothelial cells of the lung. A role for NO-GC in the VEGF-mediated angiogenesis was ascertained by the aortic ring assay. The results show an increased angiogenesis in the global absence of NO-GC. However, the EC-GCKO shows no difference compared to control mice. This indicates that NO-GC in endothelial cells is unlikely to play a major role in VEGF-mediated angiogenesis. In the second part of the project, the role of NO-GC in angiogenesis was investigated in an in vivo model. In the oxygen induced-retinopathy model (OIR), GCKO mice showed reduced vaso-obliteration, slowed angiogenesis and increased tuft formation. Similar results were observed in the SMC-GCKO animals. In contrast, EC-GCKO mice showed vaso-obliteration as well as angiogenesis rate and tuft formation similar to those seen in control animals. The results of this experiment suggest that NO-GC in endothelial cells is not involved in vaso-obliteration, physiological angiogenesis and tuft formation. Immunhistochemical analyses showed the expression of NO-GC in pericytes of the vascular capillaries of the mouse retina. Therefore, NO-GC in this cell type could be responsible for the effects in GCKO- and SMC-GCKO animals. In the last part of this thesis, hindlimb-ischemia experiments were performed. For this purpose, the paws of all GCKO- and some SMC-GCKO animals showed necrosis after ligation of the femoral artery. The regeneration of legs from EC-GCKO animals after the operation was normal. These results exclude a major role of NO-GC in endothelial cells, but show that NO-GC in smooth muscle cells is essential in the arteriogenesis process. In summary, the deletion of NO-GC in smooth muscle cells and probably also in pericytes leads to a slowed angiogenesis and inhibits arteriogenesis. KW - Guanylylcyclase KW - cGMP KW - Stickstoffmonoxid KW - Angiogenese KW - Arteriogenese KW - Maus Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-111284 ER - TY - THES A1 - Schulze, Katja T1 - Automatisierte Klassifizierung und Viabilitätsanalyse von Phytoplankton T1 - Automated classification and viability analysis for phytoplankton N2 - Zentrales Ziel dieser Arbeit war es, Methoden der Mikroskopie, Bildverarbeitung und Bilderkennung für die Charakterisierungen verschiedener Phyotplankter zu nutzen, um deren Analyse zu verbessern und zu vereinfachen. Der erste Schwerpunkt der Arbeit lag auf der Analyse von Phytoplanktongemeinschaften, die im Rahmen der Überprüfung der Süßwasserqualität als Marker dienen. Die konventionelle Analyse ist dabei sehr aufwendig, da diese noch immer vollständig von Hand durchgeführt wird und hierfür speziell ausgebildetes Personal eingesetzt werden muss. Ziel war es, ein System zur automatischen Erkennung aufzubauen, um die Analyse vereinfachen zu können. Mit Hilfe von automatischer Mikroskopie war es möglich Plankter unterschiedlicher Ausdehnung durch die Integration mehrerer Schärfeebenen besser in einem Bild aufzunehmen. Weiterhin wurden verschiedene Fluoreszenzeigenschaften in die Analyse integriert. Mit einem für ImageJ erstellten Plugin können Organismen vom Hintergrund der Aufnahmen abgetrennt und eine Vielzahl von Merkmalen berechnet werden. Über das Training von neuralen Netzen wird die Unterscheidung von verschieden Gruppen von Planktontaxa möglich. Zudem können weitere Taxa einfach in die Analyse integriert und die Erkennung erweitert werden. Die erste Analyse von Mischproben, bestehend aus 10 verschiedenen Taxa, zeigte dabei eine durchschnittliche Erkennungsrate von 94.7% und eine durchschnittliche Falsch-Positiv Rate von 5.5%. Im Vergleich mit bestehenden Systemen konnte die Erkennungsrate verbessert und die Falsch Positiv Rate deutlich gesenkt werde. Bei einer Erweiterung des Datensatzes auf 22 Taxa wurde darauf geachtet, Arten zu verwenden, die verschiedene Stadien in ihrem Wachstum durchlaufen oder höhere Ähnlichkeiten zu den bereits vorhandenen Arten aufweisen, um evtl. Schwachstellen des Systemes erkennen zu können. Hier ergab sich eine gute Erkennungsrate (86.8%), bei der der Ausschluss von nicht-planktonischen Partikeln (11.9%) weiterhin verbessert war. Der Vergleich mit weiteren Klassifikationsverfahren zeigte, dass neuronale Netze anderen Verfahren bei dieser Problemstellung überlegen sind. Ähnlich gute Klassifikationsraten konnten durch Support Vektor Maschinen erzielt werden. Allerdings waren diese bei der Unterscheidung von unbekannten Partikeln dem neuralen Netz deutlich unterlegen. Der zweite Abschnitt stellt die Entwicklung einer einfachen Methode zur Viabilitätsanalyse von Cyanobakterien, bei der keine weitere Behandlung der Proben notwendig ist, dar. Dabei wird die rote Chlorophyll - Autofluoreszenz als Marker für lebende Zellen und eine grüne unspezifische Fluoreszenz als Marker für tote Zellen genutzt. Der Assay wurde mit dem Modellorganismus Synechocystis sp. PCC 6803 etabliert und validiert. Die Auswahl eines geeigeneten Filtersets ermöglicht es beide Signale gleichzeitig anzuregen und zu beobachten und somit direkt zwischen lebendenden und toten Zellen zu unterscheiden. Die Ergebnisse zur Etablierung des Assays konnten durch Ausplattieren, Chlorophyllbestimmung und Bestimmung des Absorbtionsspektrums bestätigt werden. Durch den Einsatz von automatisierter Mikroskopie und einem neu erstellten ImageJ Plugin wurde eine sehr genaue und schnelle Analyse der Proben möglich. Der Einsatz beim Monitoring einer mutagenisierten Kultur zur Erhöhung der Temperaturtoleranz ermöglichte genaue und zeitnahe Einblicke in den Zustand der Kultur. Weitere Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Kombination mit Absorptionsspektren es ermöglichen können bessere Einblicke in die Vitalität der Kultur zu erhalten. N2 - Central goal of this work was to improve and simplify the characterization of different phytoplankter by the use of automated microscopy, image processing and image analysis. The first part of the work dealt with the analysis of pytoplankton communities, which are used as a marker for the determination of fresh water quality. The current routine analysis, is very time consuming and expensive, as it is carried out manually by trained personnel. Thus the goal of this work was to develop a system for automating the analysis. With the use of automated microscopy different focal planes could be integrated into one image, which made it possible to image plankter of different focus levels simultaneously. Additionally it allowed the integration of different fluorescence characteristics into the analysis. An image processing routine, developed in ImageJ, allows the segmentation of organisms from the image background and the calculation of a large range of features. Neural networks are then used for the classification of previously defined groups of plankton taxa. The program allows easy integration of additional taxa and expansion of the recognition targets. The analysis of samples containing 10 different taxa showed an average recognition rate of 94.7% and an average error rate of 5.5%. The obtained recognition rate was better than those of existing systems and the exclusion of non-plankton particles could be greatly improved. After extending the data set to 22 different classes of (more demanding) taxa a still good recognition (86.9 %) and still improved error rate (11.9 %) were obtained. This extended set was specifically selected in order to target potential weaknesses of the system. It contained mainly taxa that showed strong similarities to each other or taxa that go through various different morphological stages during their growth. The obtained recognition rates were comparable or better than those of existing systems and the exclusion of non-plankton particles could be greatly improved. A comparison of different classification methods showed, that neural networks are superior to all other investigated methods when used for this specific task. While similar recognition rates could be achieved with the use of support vector machines they were vastly inferior for the differentiation of unknown particles. The second part focused on the development of a simple live - dead assay for unicellular cyanobacteria without the need of sample preparation. The assay uses red chlorophyll fluorescence, corresponding to viable cells, and an unspecific green autofluorescence, that can only be observed in non viable cells. The assay was established and validated for the model organism Synechocystis sp. PCC 6803. With the selection of a suitable filter-set both signals could be excited and observed simultaneously, allowing a direct classification of viable and non-viable cells. The results were confirmed by plating/colony count, absorption spectra and chlorophyll measurements. The use of an automated fluorescence microscope and an ImageJ based image analysis plugin allows a very precise and fast analysis. The monitoring of a random mutagenized culture undergoing selection for improved temperature tolerance allowed an accurate and prompt insight into the condition of the culture. Further results indicate that a combination of the new assay with absorption spectra or chlorophyll concentration measurements allows the estimation of the vitality of cells. KW - Bilderkennnung KW - Bioinformatik KW - Phytoplankton KW - Bilderkennung KW - Phytoplankton KW - Viabilität KW - Mikroskopie KW - Bioinformatik Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-107174 ER - TY - THES A1 - Memmel, Simon T1 - Automatisierte Algorithmen zur Analyse der Migration und der strahleninduzierten DNA-Schäden humaner Glioblastomzellen nach kombinierter PI3K/mTOR/Hsp90-Inhibierung T1 - Automated algorithms for the analysis of cell migration and radiation induced DNA-damage in human glioblastoma cells after combined PI3K/mTOR/Hsp90 inhibition N2 - Das hohe invasive Potential und die starke Resistenz gegen Radio-/Chemotherapie von Glioblastoma multiforme (GBM) Zellen machen sie zu dem tödlichsten Tumor ihrer Art. Es ist deshalb von großem Interesse die Grundlagen, welche der Migrationsfähigkeit und DNA Reparatur zu Grunde liegen, besser zu verstehen. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden zwei Algorithmen zur automatischen Analyse der Migration in der Einzelzellverfolgung und im Wundheilungsassay modifiziert. Die Auswertung der Daten konnte automatisch und somit schnell, effektiv und mit geringerem Arbeitsaufwand durchgeführt werden. Mit Hilfe dieser automatischen Algorithmen wurde die Migrationsfähigkeit von zwei GBM-Zelllinien (DK-MG und SNB19) untersucht. Zusätzlich wurde die konfokale Laserscanning- sowie die hochauflösende dSTORM-Fluoreszenzmikroskopie verwendet um die, der Zellbewegung zu Grunde liegende, Struktur des F Aktin und der fokalen Adhäsionskinase (FAK) aufzulösen und darzustellen. Unter Anwendung dieser genannten Methoden sind die Effekte des dualen PI3K/mTOR Inhibitors PI-103 alleine und in Kombination mit dem Hsp90 Inhibitor NVP AUY922 mit und ohne Bestrahlung auf die Bewegung untersucht worden. Es konnte festgestellt werden, dass sich beide Zelllinien deutlich in ihrem migratorischem Potential in vitro unterscheiden und zudem auch markante Unterschiede in ihrer Morphologie aufweisen. Die weniger invasiven DK MG-Zellen besitzen eine polarisierte Zellstruktur, wohingegen SNB19-Zellen sich durch multipolare ungerichtete Bewegung auszeichneten. Zudem wurde die Migration, durch PI3K/mTOR Inhibition mit PI-103 bei den DK-MG-Zellen (p53 wt, PTEN wt), sehr effektiv unterdrückt. Wohingegen sich die SNB19-Zellen (p53 mut, PTEN mut) resistent gegen diesen Inhibitor zeigten. Hsp90 Inhibition offenbarte in beiden Zelllinien einen starken inhibitorischen Effekt auf die Migration der Zellen sowie die Reorganisierung des F Aktinskelettes. In der zweiten Hälfte dieser Arbeit wurde ein Augenmerk auf die DNA-DSB-Reparatur der GBM Zellen nach ionisierender Strahlung gelegt. Zunächst wurde eine automatische Analysesoftware „FocAn-3D“ entwickelt, mit dessen Hilfe die DNA Doppelstrangbruchreparaturkinetik untersucht werden sollte. Diese Software ermöglicht es die gesamten Zellkerne mit ihren γH2AX-Foci in 3D-cLSM-Aufnahmen zu untersuchen. Es konnte somit eine Verbesserung der Genauigkeit in der Auszählung der γH2AX-Foci erreicht werden, welche 2D beschränkter Software verwehrt bleibt. Mit FocAn-3D konnte der gesamte Verlauf der Induktions- und Abbauphase der γH2AX-Foci in DK MG- und SNB19-Zellen mit einem mathematischen Modell ausgewertet und dargestellt werden. Des Weiteren wurde die Nanometerstruktur von γH2AX- und pDNA-PKcs-Foci mittels hochauflösender dSTORM-Mikroskopie untersucht. Konventionelle Mikroskopiemethoden, begrenzt durch das Beugungslimit und einer Auflösung von ~200 nm, konnten die Nanometerstruktur (<100 nm) der Reparaturfoci bisher nicht darstellen. Mit Hilfe der beugungsunbegrenzten dSTORM-Mikroskopie war es möglich in DK MG- und SNB19-Zellen die Nanometerstruktur genannten Reparaturproteine in den Foci mit einer Auflösung von bis zu ~20 nm darzustellen. γH2AX-Foci zeigten sich als eine Verteilung aus einzelnen Untereinheiten („Nanofoci“) mit einem Durchmesser von ~45 nm. Dies lässt die Vermutung zu, dass es sich hier um die elementare Substruktur der Foci und somit der γH2AX enthaltenen Nukleosome handelt. DNA-PK-Foci wiesen hingegen eine diffusere Verteilung auf. Die in dieser Arbeit ermittelten Unterschiede im Migrationsverhalten der Zellen rechtfertigen eine weitere präklinische Untersuchung der verwendeten Inhibitoren als potentielle Zelltherapeutika für die Behandlung von GBM. Zudem konnte sich dSTORM als machtvolles Hilfsmittel, sowohl zur Analyse der Migration zugrundeliegenden Zytoskelettstruktur und der Effekte der Hsp90 Inhibierung, als auch, der Nanostruktur der DNA-DSB-Reparaturfoci herausstellen. Es ist anzunehmen, dass beugungsunbegrenzte Mikroskopiemethoden sich als bedeutende Werkzeuge in der medizinischen und biologischen Erforschung der DNA-Reparaturmechanismen herausstellen werden. Das in dieser Arbeit entwickelte ImageJ Plugin „FocAn-3D“ bewies sich ebenfalls als ein vielversprechendes Werkzeug für die Analyse der Reparaturkinetik. Mit Hilfe von „FocAn-3D“ sollte es somit möglich sein u.a. den Einfluss gezielter Inhibition auf den zeitlichen Verlauf der Induktion und des Abbaus der DNA-Reparaturmaschinerie genauer zu studieren. N2 - The high invasive Potential and increased resistance to radio- and chemotherapy of glioblastoma multiforme (GBM) tumor cells make it the most lethal of all primary brain tumors. It is therefore of great interest to gain a better understanding of the mechanisms facilitating the migration and DNA repair. In the first part of this study, two algorithms for single cell tracking and wound healing assays were modified to increase effectiveness and speed of the automatic data analysis. The migratory capacity of the two GBM cell lines, DK MG and SNB19, were analyzed using these automatic algorithms. In addition, employing confocal microscopy and high resolution dSTORM imaging, the underlying F actin/FAK structure was resolved and studied. Together, these automatic algorithms enabled me to elucidate the effects of the dual PI3K/mTOR inhibitor PI 103 alone and in combination with the Hsp90 inhibitor NVP-AUY922 and/or irradiation on the migration, focal adhesions and F-actin cytoskeleton of DK-MG and SNB19 cells. Both cell lines differ markedly in their migratory capacity in vitro and display distinctive differences in their morphology. The less invasive DK-MG cells retained their polarized structure, while SNB19 cells demonstrate multipolar morphology with random migration. The PI3K/mTOR Inhibition using PI-103 suppressed migration of the PTEN wt and p53 wt DK-MG cells but not of the PTEN mut and p53 mut SNB19 cells. In contrast, Hsp90 inhibition using NVP-AUY922 exerted a strong inhibitory effect on the migration in both cell lines as well as massive morphological changes and reorganization of the F-actin cytoskeleton. The second part of this study was designed to gain further insights in the DNA double strand break (DSB) repair of both GBM cell lines. The DNA DSB repair kinetics were analyzed using the novel software “FocAn-3D”. The software enables the 3D analysis of foci in entire nuclei using cLSM-imaging. This in turn results in increased accuracy of the foci counts, compared to approaches restricted to 2D. Using the new software approach, I was able to determine the whole γH2AX-foci induction and decay process and apply a well described mathematical model for the γH2AX-foci repair kinetics. Additionally, diffraction unlimited microscopy (dSTORM) was applied to resolve the nanometer scale of the foci forming repair proteins γH2AX and DNA-PK. Although conventional microscopy is able to reveal the repair foci as diffuse spots, the underlying protein distribution is well beyond the diffraction limit of ~200 nm. In this study, using the diffraction unlimited dSTORM microscopy with a lateral resolution of ~20 nm, it was possible to resolve the nanometer scale of both γH2AX and DNA-PK. γH2AX foci appeared not as diffuse spots, but rather as a distribution of distinct subunits (“nanofoci”). In contrast DNA-PK mostly showed a more diffuse distribution. The nanofoci diameter was about ~45 nm and it can be concluded that these clusters represent the elementary structural subunits of repair foci, the γH2AX-containing nucleosomes. Using the newly developed or modified algorithms for the analysis of cell migration, I was able to show a cell line specific response of the PI3K/mTOR inhibition on the cell migration. This warrants further preclinical trials for its potential as an anti-migratory agent in the treatment of GBM. In addition, dSTORM emerged as a powerful tool for the analysis of the cytoskeletal structure, underlying the cells migration capacity and the effects of Hsp90 inhibition. Also, dSTORM was able to unravel the elementary nanostructure of the DSB repair foci. This means diffraction unlimited single-molecule localization nanoscopy methods will likely emerge as powerful tools for the analysis of targeted inhibition on the DSB repair mechanisms. In addition, the newly developed software “FocAn-3D” showed promising results in the analysis of Foci kinetics. Consequently, it should enable the future study of targeted inhibition and its effects on foci induction and decay processes of the DNA repair. KW - Glioblastom KW - Zellmigration KW - DNS-Schädigung KW - Algorithmus KW - Automatisierung KW - PI3K/mTOR inhibierung KW - yH2AX-Foci KW - Dnaschaden KW - DNS-Doppelstrangbruch Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-185710 ER - TY - THES A1 - Streit, Sebastian T1 - Automatische Identifizierung bei sozialen Insekten : Design und Praxistest T1 - Automatic insect identification: Design and test N2 - Design und Implementierung eines RFID basierten Systems für soziale Insekten (Hummeln, Bienen) N2 - Design and implementation of a rfid based system for identifying social insects (honeybees, bumblebees) KW - Soziale Insekten KW - Individuum KW - Identifikation KW - Methode KW - rfid KW - Identifizierung KW - Honigbiene KW - rfid KW - insect identification KW - honeybee Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-8962 ER - TY - THES A1 - Grimm, Johannes T1 - Autocrine and paracrine effects of BRAF inhibitor induced senescence in melanoma T1 - Autokrine und parakrine Effekte BRAF-Inhibitor-induzierter Seneszenz im Melanom N2 - The FDA approval of targeted therapy with BRAFV600E inhibitors like vemurafenib and dabrafenib in 2011 has been the first major breakthrough in the treatment of metastatic melanoma since almost three decades. Despite increased progression free survival and elevated overall survival rates, complete responses are scarce due to resistance development approximately six months after the initial drug treatment. It was previously shown in our group that melanoma cells under vemurafenib pressure in vitro and in vivo exhibit features of drug-induced senescence. It is known that some cell types, which undergo this cell cycle arrest, develop a so-called senescence associated secretome and it has been reported that melanoma cell lines also upregulate the expression of different factors after senescence induction. This work describes the effect of the vemurafenib-induced secretome on cells. Conditioned supernatants of vemurafenib-treated cells increased the viability of naive fibroblast and melanoma cell lines. RNA analysis of donor melanoma cells revealed elevated transcriptional levels of FGF1, MMP2 and CCL2 in the majority of tested cell lines under vemurafenib pressure, and I could confirm the secretion of functional proteins. Similar observations were also done after MEK inhibition as well as in a combined BRAF and MEK inhibitor treatment situation. Interestingly, the transcription of other FGF ligands (FGF7, FGF17) was also elevated after MEK/ERK1/2 inhibition. As FGF receptors are therapeutically relevant, I focused on the analysis of FGFR-dependent processes in response to BRAF inhibition. Recombinant FGF1 increased the survival rate of melanoma cells under vemurafenib pressure, while inhibition of the FGFR pathway diminished the viability of melanoma cells in combination with vemurafenib and blocked the stimulatory effect of vemurafenib conditioned medium. The BRAF inhibitor induced secretome is regulated by active PI3K/AKT signaling, and the joint inhibition of mTor and BRAFV600E led to decreased senescence induction and to a diminished induction of the secretome-associated genes. In parallel, combined inhibition of MEK and PI3K also drastically decreased mRNA levels of the relevant secretome components back to basal levels. In summary, I could demonstrate that BRAF inhibitor treated melanoma cell lines acquire a specific PI3K/AKT dependent secretome, which is characterized by FGF1, CCL2 and MMP2. This secretome is able to stimulate other cells such as naive melanoma cells and fibroblasts and contributes to a better survival under drug pressure. These data are therapeutically highly relevant, as they imply the usage of novel drug combinations, especially specific FGFR inhibitors, with BRAF inhibitors in the clinic. N2 - Die Zulassung der spezifischen BRAFV600E Inhibitoren Vemurafenib und Dabrafenib im Jahr 2011 war der erste wirksame Schritt nach Jahrzehnten der Stagnation in der Behandlung des metastasierenden Melanoms. Allerdings zeigte sich, dass trotz erhöhter Gesamtüberlebensrate und gestiegenem progressionsfreien Überleben komplette Remissionen selten waren. Wir konnten in vorangegangenen Versuchen zeigen, dass eine Behandlung BRAFV600E-mutierter Melanom Zelllinien mit Vemurafenib mit der Induktion von Seneszenz-assoziierten Merkmalen einhergeht. Da bekannt ist, dass seneszente Zellen, darunter auch Melanom Zellen, ein sogenanntes Sekretom ausbilden können, welches andere Zellen beeinflussen kann, war die Identifizierung und Charakterisierung von Vemurafenib-induzierten sezernierten Faktoren das Ziel meiner Arbeit. Initiale Versuche zeigten, dass konditionierter Überstand von Vemurafenib behandelten Zellen das Wachstum naiver Zelllinien erhöhen kann. Ich konnte in weiteren Versuchen zeigen, dass sich die Transkription und Expression des Cytokins CCL2, der Matrixmetalloprotease MMP2 und des Wachstumsfaktors FGF1 nach Vemurafenib Behandlung erhöht. Darüber hinaus konnte ich interessanterweise auch eine gesteigerte Transkription anderer FGF Liganden (FGF7, FGF17) feststellen, was meinen Fokus auf die Analyse von FGFR abhängigen Prozessen als Antwort auf die BRAF Inhibition gelenkt hat. Es zeigte sich, dass sich Melanomzellen mittels Zugabe von FGF1 besser gegen die Vemurafenib-induzierte MEK/ERK1/2 Hemmung behaupten können. Darüber hinaus konnte durch den Einsatz eines spezifischen FGFR Inhibitors die Viabilität von Melanomzellen unter Vemurafenib Behandlung vermindert werden. Auch der stimulierende Effekt des Vemurafenib konditionierten Überstandes konnte dadurch teilweise aufgehoben werden. Die Induktion des BRAF Inhibitor assoziierten Sekretoms ist auf einen aktiven PI3K/AKT Signalweg angewiesen. So führt eine gleichzeitige Hemmung des MEK/ERK1/2 und PI3K/AKT Signalwegs zu einer verminderten Seneszenzinduktion und einer niedrigeren Transkription der Seneszenz-assoziierten Gene. Zudem konnte ich feststellen, dass auch eine gemeinsame Hemmung von BRAF und MEK Seneszenz und das damit einhergehende Sekretom unter Beteiligung von CCL2, MMP2 und den FGFs induziert. Zusammenfassend zeigen meine Daten, dass BRAFV600E-mutierte Melanomzellen nach Vemurafenib Behandlung ein Sekretom ausbilden, welches potentiell wachstumsfördernde und matrix-modellierende Faktoren beinhaltet. Dies ist abhängig vom PI3K/AKT Signalweg und charakterisiert durch die Sekretion von FGF1, CCL2 und MMP2. Klinische Relevanz erlangen diese Erkenntnisse durch die Möglichkeit, diese Faktoren im Rahmen einer Kombinationstherapie, z.B. mit einem spezifischen FGFR Inhibitor, zu inaktivieren. KW - Melanoma KW - Inhibitor KW - Melanom Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-181161 ER - TY - THES A1 - Röschert, Isabelle T1 - Aurora-A prevents transcription-replication conflicts in MYCN-amplified neuroblastoma T1 - Aurora-A verhindert Transkriptions-Replikationskonflikte in MYCN-amplifizierten Neuroblastomen N2 - Neuroblastoma is the most abundant, solid, extracranial tumor in early childhood and the leading cause of cancer-related childhood deaths worldwide. Patients with high-risk neuroblastoma often show MYCN-amplification and elevated levels of Aurora-A. They have a low overall survival and despite multimodal therapy options a poor therapeutic prognosis. MYCN-amplified neuroblastoma cells depend on Aurora-A functionality. Aurora-A stabilizes MYCN and prevents it from proteasomal degradation by competing with the E3 ligase SCFFBXW7. Interaction between Aurora-A and MYCN can be observed only in S phase of the cell cycle and activation of Aurora-A can be induced by MYCN in vitro. These findings suggest the existence of a profound interconnection between Aurora-A and MYCN in S phase. Nevertheless, the details remain elusive and were investigated in this study. Fractionation experiments show that Aurora-A is recruited to chromatin in S phase in a MYCN-dependent manner. Albeit being unphosphorylated on the activating T288 residue, Aurora-A kinase activity was still present in S phase and several putative, novel targets were identified by phosphoproteomic analysis. Particularly, eight phosphosites dependent on MYCN-activated Aurora-A were identified. Additionally, phosphorylation of serine 10 on histone 3 was verified as a target of this complex in S phase. ChIP-sequencing experiments reveal that Aurora-A regulates transcription elongation as well as histone H3.3 variant incorporation in S phase. 4sU-sequencing as well as immunoblotting demonstrated that Aurora-A activity impacts splicing. PLA measurements between the transcription and replication machinery revealed that Aurora-A prevents the formation of transcription-replication conflicts, which activate of kinase ATR. Aurora-A inhibitors are already used to treat neuroblastoma but display dose-limiting toxicity. To further improve Aurora-A based therapies, we investigated whether low doses of Aurora-A inhibitor combined with ATR inhibitor could increase the efficacy of the treatment albeit reducing toxicity. The study shows that the combination of both drugs leads to a reduction in cell growth as well as an increase in apoptosis in MYCN-amplified neuroblastoma cells, which is not observable in MYCN non-amplified neuroblastoma cells. This new approach was also tested by a collaboration partner in vivo resulting in a decrease in tumor burden, an increase in overall survival and a cure of 25% of TH-MYCN mice. These findings indicate indeed a therapeutic window for targeting MYCN-amplified neuroblastoma. N2 - Das Neuroblastom ist der häufigste, solide, extrakranielle Tumor der frühesten Kindheit und die häufigste mit Krebs verbundene Todesursache von Kleinkindern weltweit. Patienten mit geringerer Überlebenswahrscheinlichkeit und schlechterer Therapieprognose zeigen oft eine MYCN-Amplifikation und erhöhte Mengen von Aurora-A. Aurora-A ist eine Serin/Threonin-Protein Kinase, die wichtige mitotische Prozesse reguliert. Aurora-A stabilisiert MYCN und verhindert dadurch den proteasomalen Abbau von MYCN. Die Interaktion zwischen Aurora-A und MYCN ist S Phasen-spezifisch und MYCN ist in vitro in der Lage, durch seine Bindung Aurora-A zu aktivieren. Die Funktionen und Prozesse, die von Aurora-A in der S Phase reguliert werden, sind noch nicht hinreichend untersucht und daher Gegenstand dieser Dissertation. Zell-Fraktionierungen zeigen, dass Aurora-A in der S Phase in einer MYCN-abhängigen Weise an das Chromatin gebunden ist. Phosphoproteom-Analysen mittels Massenspektrometrie identifizierten zahlreiche neue Substrate von Aurora-A, sowie acht Substrate von MYCN-aktiviertem Aurora-A. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass Histon 3 Serin 10 von Aurora-A in Abhängigkeit von MYCN in S Phase phosphoryliert wird. ChIP-Sequenzierungen zeigen, dass Aurora-A die Elongation der Transkription und den Einbau der Histone Variante H3.3 in S Phase beeinflusst. 4sU-Sequenzierung sowie Immunoblots zeigen einen Zusammenhang zwischen der Aktivität von Aurora-A und dem Spleißosom in der S Phase. Zusätzlich konnte mittels PLA nachgewiesen werden, dass Aurora-A die Entstehung von Transkriptions-Replikationskonflikten verhindert, die andernfalls die Kinase ATR aktivieren würden. Aurora-A Inhibitoren wurden unter anderem zur Therapie von Neuroblastomen eingesetzt, allerdings ist die Dosis des Aurora-A Inhibitors durch die hohe Toxizität limitiert, was die Effizienz der Therapie stark beeinträchtigt. Daher wurde untersucht, ob die gleichzeitige Gabe von geringeren Mengen Aurora-A Inhibitor in Kombination mit einem ATR Inhibitor zur Therapie geeignet ist. In vitro konnte gezeigt werden, dass die Kombination beider Inhibitoren das Zellwachstum reduziert und das MYCN-amplifizierte Zellen im Vergleich zu MYCN nicht-amplifizierten Zellen verstärkt durch Apoptose sterben. Durch einen Kollaborationspartner konnte die Kombination der beiden Inhibitoren an Mäusen getestet werden. Die mit der Kombination behandelten Mäuse, zeigen ein deutlich reduziertes Tumorwachstum, sowie längeres Überleben. Somit stellt diese Kombination ein therapeutisches Fenster dar und könnte zur Behandlung von Neuroblastompatienten genutzt werden. KW - Neuroblastom KW - Aurora-A KW - MYCN KW - neuroblastoma Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-243037 ER - TY - THES A1 - Weber, Dionys A. T1 - Aufklärung der Struktur und Charakterisierung des ternären Komplexes aus BMP-2, BMPR-IA und ActR-IIB T1 - Structure determination and characterisation of the ternary complex of BMP-2, BMPR-IA and ActR-IIB N2 - „Bone Morphogenetic Proteins“ (BMPs) kontrollieren eine Vielzahl unterschiedlichster Prozesse bei der Embryonalentwicklung und der postnatalen Gewebehomöostase. Wie TGF­-betas, Activine und andere Mitglieder der TGF-beta Superfamilie vermitteln BMPs ihr Signal durch die Bildung eines aus dem Liganden und zwei Rezeptorsubtypen bestehenden Signalkomplexes. Für die Rezeptoraktivierung ist ein Zwei-Schritt Mechanismus allgemein akzeptiert. Bisher wurde nur der erste Schritt, die Bindung des Liganden an seinen hochaffinen Rezeptor, strukturell untersucht. Der molekulare Mechanismus der anschließenden Rekrutierung des niederaffinen Rezeptortyps war bisher nicht bekannt. Die vorliegende Arbeit beschreibt die Präparation, Kristallisation und Strukturaufklärung des ternären Komplexes aus BMP-2 und den extrazellulären Domänen von BMPR-IA und ActR-IIB. Mit der Kristallstruktur dieses ternären Komplexes kann erstmals der Mechanismus der BMP Rezeptoraktivierung von der Bindung des Liganden bis hin zur Transaktivierung untersucht werden. Der Ligand BMP-2 präsentiert sich hier, im Gegensatz zu anderen Mitgliedern der TGF-beta Superfamilie, als nahezu starre Komponente, um welche die beiden Rezeptortypen symmetrisch angelagert werden. Zwischen den extrazellulären Domänen der Rezeptoren können keine direkten Kontakte beobachtet werden. Die in Zellen beobachtete Kooperativität bei der Rekrutierung des niederaffinen Rezeptors im BMP-2 System ist folglich weder durch allosterische Effekte, noch durch direkte Rezeptor-Rezeptor-Kontakte erklärbar. Vielmehr repräsentiert die Bindung des niederaffinen Rezeptors von BMP-2 einen Minimalmechanismus, bei dem Kooperativität über die Verringerung der Freiheitsgrade durch Lokalisation des Liganden in der Zellmembran erzeugt wird. Die durchgeführten Mutations-/Interaktionsanalysen erlauben vertiefende Einblicke wie Affinität und Spezifität im BMP/Activin-System generiert werden. Es zeigt sich, dass sowohl bei der niederaffinen Interaktion von ActR-IIBecd mit BMP-2 bzw. BMP-7 als auch bei der hochaffinen Bindung von ActA mit ActR-IIBecd ein Großteil der freien Bindungsenergie von denselben hydrophoben Interaktionen getragen wird. Während polare Interaktionen bei der niederaffinen Bindung der BMPs an ActR-IIBecd kaum eine Rolle spielen, stellt die zentrale Wasserstoffbrücke zwischen ActA Ser90(OG) und ActR-IIB Leu61(N) bei der Bildung des Komplexes ActA/ActR-IIBecd eine entscheidende Determinante der hochaffinen Bindung dar. BMP-2 bindet an die Typ II Rezeptoren BMPR-II, ActR-II und ActR-IIB mit nahezu identischer Affinität, daher wird eine promiske Verwendung dieser Rezeptoren angenommen. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die spezifische Erkennung und Bindung der Typ II Rezeptoren durch den Austausch einzelner Aminosäuren modulierbar ist. Mit den hier gewonnenen Kenntnissen über den molekularen Mechanismus der Typ II Rezeptorerkennung ist nun eine Generierung von BMPs mit definierter Typ II Rezeptorspezifität möglich. Diese BMP-2 Varianten können als Werkzeuge zur Aufklärung von Typ II Rezeptor-spezifischen Signalwegen verwendet werden. Ebenso wäre es denkbar, BMP-2 Varianten mit ausgeprägter Typ II Rezeptor Spezifität in vivo zur Modulation TypII Rezeptor spezifischer Signalwege zu benutzen. Beispielsweise könnte ein auf BMP-2 basierendes ActR-IIB-spezifisches Protein als Myostatin-Antagonist zur Behandlung von Muskeldystrophie eingesetzt werden. N2 - Bone morphogenetic proteins are key regulators of embryonic development and postnatal homeostasis of tissues and organs. Like TGF-betas, Activins, GDFs and other members of the TGF-beta superfamily, BMPs transmit their signals by assembling two types of serine-/threonine-kinase receptors. A two-step mechanism for receptor activation is generally accepted. To date, only the molecular basis of the first step, binding of the ligand to a high affinity receptor has been analyzed by structure determination. The molecular mechanism of the subsequent low affinity receptor recruitment remained elusive. This study describes the preparation, crystallization and structure determination of the ternary ligand-receptor complex consisting of BMP-2 and the extracellular domains of BMPR-IA and ActR-IIB. The structure of this ternary complex allowed us to study BMP-2 receptor activation from ligand recruitment to transactivation. In contrast to other ligands of the TGF-beta superfamily, BMP-2 acts as a nearly rigid scaffold binding to the extracellular domains of both receptor subtypes. There are no direct contacts observed between the extracellular domains of the receptors. Therefore the cooperativity observed for BMP-2 low affinity receptor recruitment on whole cells could not be explained by allosteric effects nor by direct receptor-receptor contacts. The BMP receptor assembly possibly presents a basic mode for generating cooperativity employing the reduction of dimensionality in the membrane to faciliate low affinity receptor recuitment Mutagenesis/interaction studies enabled us to understand how affinity and specificity in the BMP/ Activin system are generated. A majority of the free binding energy in low and high affinity interaction of ActR-IIBecd with BMP-2/-7 or ActR-IIBecd with ActA, respectively, is dominated by the same subset of hydrophobic residues. Polar interactions play only a minor role in low-affinity binding of BMPs to ActR-IIBecd. However in the complex ActA/ActR-IIBecd, the central hydrogen bond between ActA Ser90(OG) and ActR-IIBecd Leu61(N) is the key determinant for switch from low to high affinity binding. Type II receptor binding is termed promiscous since BMP-2 binds to its type II receptors BMPR-II, ActR-II and ActR-IIB with almost similar affinity. This study clearly shows that binding and recruitment of a particular type II receptor could be modulated just by the exchange of single amino acid residues. These insights into the molecular mechanism of type II receptor recognition allow the generation of highly type II receptor specific BMPs. These BMP-2 variants could serve as valuable tools for the determination or the modulation of type II receptor specific signaling pathways. A BMP-2 based mutant protein which is highly specific for ActR-IIB binding could be used for example as a myostatin antagonist for the treatment of muscle dystrophy. KW - Knochen-Morphogenese-Proteine KW - Ternärkomplex KW - Ternärer Komplex KW - Kristallstruktur KW - BMP-2 KW - ActR-IIB KW - BMPR-IA KW - ternary complex KW - crystal structure KW - BMP-2 KW - BMPR-IA KW - ActR-IIB Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-20735 ER - TY - THES A1 - Imes, Dennis T1 - Aufklärung der molekularen Struktur und Funktion des R-Typ Anionenkanals QUAC1 in Schließzellen T1 - Molecular structure and function analyses of the R-type anion channel QUAC1 in guard cells N2 - Zum Gasaustausch mit Ihrer Umgebung besitzen höhere Pflanzen stomatäre Komplexe. Die Turgor-getrieben Atmungsöffnungen in der Epidermis der Blätter werden von zwei Schließzellen umsäumt. Um bei Trockenheit einen exzessiven Verlust von Wasser zu verhindern, synthetisieren/importieren Schließzellen das Stresshormon ABA (Abszisinsäure), das über eine schnelle ABA-Signalkaskade plasmamembrangebundene Ionenkanäle steuert. Dabei wird der Stomaschluss durch die Aktivität von R-(rapid) und S-(slow)Typ Anionenkanälen initiiert. Obwohl die R- und S-Typ Anionenströme in Schließzellen seit Jahrzehnten bekannt waren, konnte erst kürzlich das Gen identifiziert werden, das für den S-Typ Anionenkanal (SLAC1, Slow activating Anion Channel 1) kodiert. Daraufhin wurde schnell der Zusammenhang zwischen dem Stresshormon ABA, der ABA-Signalkette und der Aktivität des SLAC1 Anionenkanals im heterologen Expressionssystem der X. laevis Oozyten als auch in Schließzellprotoplasten aufgeklärt. Es konnte gezeigt werden, dass ABA durch einen zytosolischen Rezeptor/Phosphatasekomplex (RCAR1/ABI1) erkannt wird und die Aktivität von kalziumabhängigen Kinasen (CPK-Familie) sowie kalziumunabhängigen Kinasen der SnRK2-Familie (OST1) steuert. In Anwesenheit von ABA phosphorylieren diese Kinasen SLAC1 und sorgen so für die Aktivierung von Anionenströmen und damit für die Initiierung des Stomaschlusses. Die genetische Herkunft der ABA-induzierten R-Typ Ströme in Schließzellen war zu Beginn der vorliegenden Arbeit noch nicht bekannt. R-Typ Ströme zeichnen sich durch eine strikte Spannungsabhängigkeit und sehr schnellen Aktivierungs- sowie Deaktivierungskinetiken aus. Die Charakterisierung von Verlustmutanten des Schließzell-exprimierten Gens ALMT12 (Aluminium-aktivierter Malattransporter 12) konnte in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe Martinoia (Zürich) erste Hinweise auf die Beteiligung dieses Gens an der Stomabewegung demonstrieren. Anschließende Patch-Clamp Untersuchungen an Schließzellprotoplasten aus Wildtyppflanzen und ALMT12-Verlustmutanten zeigten, dass ALMT12 für die Malat-aktivierte R-Typ Anionenstromkomponente verantwortlich ist. Deshalb wurde der Anionenkanal QUAC1 (Quickly activating Anion Channel 1) benannt - in Anlehnung an die Benennung des Anionenkanals SLAC1. Mit der Identifizierung von QUAC1 in planta war es nun meine Aufgabe, die elektrischen Eigenschaften von ALMT12/QUAC1 und dessen Aktivitätskontrolle durch die ABA-Signalkaskade im heterologen Expressionssystem der Xenopus Oozyten zu untersuchen. Protein-Protein Interaktionsstudien mit der Hilfe der Bimolekularen Fluoreszenz-Technik, sowie die Beobachtung von markant erhöhten QUAC1 Anionenströmen in Anwesenheit der SnRK2 Kinase OST1 und den Calcium-abhängigen Kinasen CPK2 und CPK20, ließen den Schluss zu, dass QUAC1, ebenso wie SLAC1, unter der Kontrolle des schnellen ABA-Signalwegs steht. Eine zusätzliche Expression des negativen Regulators ABI1 unterdrückte die aktivierenden Eigenschaften der QUAC1-aktivierenden Kinasen, was die Hypothese der Koregulation von S- und R-Typ Anionenkanälen durch die gleiche ABA-Signalkaskade weiter unterstützt. Zur weiteren Aufklärung der elektrischen Eigenschaften von QUAC1 wurden tiefgreifende elektrophysiologische Untersuchungen mit der Zwei-Elektroden-Spannungsklemmen Technik durchgeführt. Durch die Wahl von geschickten Spannungsprotokollen konnte sowohl die schnelle Aktivierungskinetik als auch die schnelle Deaktivierungskinetik von QUAC1 bestimmt und quantifiziert werden. Diese Stromantworten waren sehr ähnlich zu den R-Typ Strömen, die man von Patch-Clamp Untersuchungen an Schließzellprotoplasten kannte, was ein weiteres Indiz dafür war, dass es sich bei QUAC1 tatsächlich um eine Komponente des R-Typ Kanals aus Schließzellen handelt. Weiterführende Untersuchungen bezüglich der Spannungsabhängigkeit und der Selektivität von QUAC1 charakterisierten das Protein als einen Depolarisations-aktivierten Anionenkanal mit einer starken Präferenz für Dicarbonsäuren wie Malat und Fumarat. Zudem konnte auch eine Leitfähigkeit für Sulfat und Chlorid nachgewiesen werden. Interessanterweise erwies sich Malat nicht nur als ein permeierendes Ion, sondern auch als ein regulierendes Ion, welches das spannungsabhängige Schalten von QUAC1 maßgeblich beeinflusst. Extrazelluläres Malat verschob die Offenwahrscheinlichkeit von QUAC1 sehr stark zu negativeren Membranspannungen, so dass der Anionenkanal bereits bei typischen Ruhespannungen von Schließzellen (ca. -150 mV) aktiviert werden konnte. Eine Beladung von QUAC1-exprimierender Oozyten mit Malat bewirkte zum einen höhere Anioneneffluxströme, aber auch eine Verschiebung der spannungsabhängigen Offenwahrscheinlichkeit zu negativeren Membranpotentialen. Struktur-Funktionsanalysen sollten die umstrittene Topologie von ALMT-ähnlichen Proteinen beleuchten und die molekulare Herkunft der Phosphorylierungsaktivierung aufzeigen, sowie die Malatabhängigkeit und die starke Spannungsabhängigkeit von QUAC1 aufklären. Es zeigte sich jedoch schnell, dass Punktmutationen und Deletionen im C-Terminus von QUAC1 sehr häufig zu nicht-funktionellen Mutanten führten. Diese Tatsache weist darauf hin, dass es sich um einen hoch-strukturierten und funktionell sehr wichtigen Bereich des Anionenkanals handelt. Auch die Topologie des Anionenkanalproteins wird in der Literatur kontrovers diskutiert. Sowohl die Lage des N- und C-Terminus (extrazellulär oder intrazellulär), als auch die Anzahl der membrandurchspannenden Domänen war nicht abschließend geklärt. Deshalb wurde in einem Fluoreszenz-basiertem Ansatz die Lage der Termini bestimmt. Im Rahmen meiner Arbeit konnte somit eindeutig gezeigt werden, dass sich beide Termini im Zytosol der Zelle befinden. Auf Grundlage von Modellen aus der Literatur und meiner Topologiebestimmungen konnte schließlich ein erweitertes Modell zur Struktur von QUAC1 entwickelt werden. Dieses Modell kann in Zukunft als Ausgangspunkt für weiterführende Struktur-Funktionsanalysen dienen. Diese Arbeit hat somit gezeigt, dass das Gen QUAC1 tatsächlich eine Komponente der R-Typ Ströme in Schließzellen kodiert. Ebenso wie SLAC1 steht der Malat-induzierte Anionenkanal QUAC1 unter der Kontrolle der schnellen ABA-Signalkaskade. In Zukunft bleibt zu klären, welche weiteren Gene für die R-Typ Kanalproteine in Schließzellen kodieren und welche strukturelle Grundlage für die besonderen Eigenschaften von QUAC1 hinsichtlich seiner schnellen Kinetiken, seiner Selektivität und Aktivierbarkeit durch Malat. N2 - Higher plants are able to exchange gases with their environment. This gas exchange is accomplished by the stomatal complex, which consist of two tugor-driven guard cells (GC) that surround a pore in the epidermis. Under drought conditions, guard cells produce and import the plant stress hormone abscisic acid (ABA). ABA is able to activate plasma membrane localized ion channels via the fast ABA-signal cascade, which leads to a closure of the stoma and thus minimizes the loss of water. The stomatal closure is initialized by the R-(rapid) and S-(slow) type anion channels. Although R- and S-type anion channels in guard cells have been known for over a decade, the gene which decodes the S-type anion channel SLAC1 (Slow activating Anion Channel 1) has only recently been identified. Consequently, the relationship between the plant hormone ABA, the ABA-signal-transduction-chain, and the activity of SLAC1 could be clarified in rapid succession in the heterologous expression system of X. laevis oocytes as well as in GC-protoplasts. It could be shown that ABA is recognized by a cytosolic receptor/phosphatase complex (RCAR/ABI1). This complex in turn regulates the activity of calcium dependent kinases of the CPK-family as well as the calcium independent kinases of the SnRK2-family (OST1). In the presence of ABA, these kinases activate SLAC1 by phosphorylation, and by this activate anion currents across the plasma membrane, ultimately leading to closure of the stomates. The genetic origin of the ABA induced R-type currents in guard cells was unknown at the beginning of this thesis. R-type currents are characterized by strong voltage-dependent behavior and fast activation- and deactivation-kinetics. In cooperation with the workgroup of Martinoia (Zürich), knock-out plants missing the guard cell gen ALMT12 (Aluminum activated Malate Transporter 12) were characterized. This work delivered the first hints that ALMT12 is involved in the stomatal movement. Subsequent patch-clamp studies on GC-protoplasts from WT and ALMT12 knock-out mutants revealed that ALMT12 is responsible for the malate-activated component of the R-type anion currents. Therefore, the anion-channel was named QUAC1 (Quick activating Anion Channel) in dependence on the naming of SLAC1. With the identification of QUAC1 in planta it was my duty to research the electrical properties of ALMT12/QUAC1 as well as the activation by the ABA-signal-transduction-chain in the heterologous expression system of X. laevis oocytes. Protein-protein interaction studies via bimolecular fluorescence complementation (BIFC) as well as significantly higher QUAC1 anion currents in the presence of the SnRK2 kinase OST1 and the calcium-dependent-kinases CPK2 and CPK20 led to the conclusion that QUAC1 is under the control of the fast ABA signaling pathway, as it was shown before for SLAC1. Furthermore expression of the negative regulator ABI1 inhibited the activating properties of the QUAC1-activating kinases. These findings support further the hypotheses of the simultaneous regulation of S- and R-type anion channels by the ABA-signaling pathway. To further elucidate the electrical properties of QUAC1, electrophysiological investigations were performed with the two-electrode-voltage-clamp technique (TEVC). In this way, the fast activation and deactivation of QUAC1 could be identified and quantified by carefully chosen voltage-clamp protocols. These current responses of QUAC1 closely resembled the R-type currents known from former patch-clamp studies from GC-protoplasts. This further supported the conclusion that QUAC1 is indeed a component of the R-type channels of guard cells. Additional investigations of the voltage-dependence and selectivity of QUAC1 characterized the protein as a depolarization-activated anion channel with strong preference for bicarbonate acids like malate and fumarate. Furthermore, a conductance for sulfate and chloride could also be shown. Interestingly, malate was not only able to permeate the channel, it was also able to alter the voltage-dependence of QUAC1. External malate strongly shifted the open probability of QUAC1 to negative membrane voltages. By this shift the anion channel could be activated at typical guard cell membrane potentials (approx. 150 mV). Loading of QUAC1 expressing oocytes with malate produced enhanced anion efflux currents and shift the voltage-dependent open probability to negative membrane potentials. Structure function analysis were performed to clarify the controversial topology of ALMT like proteins and the molecular origin of the phosphorylation activation. Furthermore, this should elucidate the origin of the malate dependence and the strong voltage dependence of QUAC1. It soon became evident that point mutations and deletions in the C-terminus of QUAC1 very often lead to nonfunctional mutants. This points toward a highly structured and functionally important region of the anion channel. In addition, the topology of the anion-channel-protein is controversially debated in literature. Neither the position of the C- and N-terminus (intra- or extracellular) nor the number of transmembrane domains has been conclusively established. Due to this, the position of the C- and N-termini were localized by a fluorescence based experiment. As part of this work, it could be shown explicitly that both termini reside in the cytosol of the cell. Based on models from the literature and my own topology studies, an enhanced structure model for QUAC1 could be generated. This model will serve as a starting point for future structure function analysis. This work has thus shown that the gene QUAC1 indeed encodes a component of the R-type currents in guard cells. Like SLAC1, the malate-induced anion channel QUAC1 is under the control of the fast ABA-signal-cascade. Future works must establish which further genes encode R-type channel proteins and which structural attributes are responsible for the special traits of QUAC1: its fast kinetics, its selectivity and its activation by malate. KW - Ackerschmalwand KW - Schließzelle KW - Anionentranslokator KW - Abscisinsäure KW - Struktur KW - Funktion KW - R-Typ KW - Anionenkanal KW - QUAC1 KW - TEVC Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-136860 ER - TY - THES A1 - Heidbreder, Meike T1 - Association and Activation of TNF-Receptor I Investigated with Single-Molecule Tracking and Super-Resolution Microscopy in Live Cells T1 - Assoziierung und Aktivierung des TNF-Rezeptor I untersucht mit Einzelmolekül-Tracking und hochauflösender Mikroskopie in lebenden Zellen N2 - Cellular responses to outer stimuli are the basis for all biological processes. Signal integration is achieved by protein cascades, recognizing and processing molecules from the environment. Factors released by pathogens or inflammation usually induce an inflammatory response, a signal often transduced by Tumour Necrosis Factor alpha (TNF). TNFα receptors TNF-R1 and TNF-R2 can in turn lead to apoptosis or proliferation via NF-B. These processes are closely regulated by membrane compartimentalization, protein interactions and trafficking. Fluorescence microscopy offers a reliable and non-invasive method to probe these cellular events. However, some processes on a native membrane are not resolvable, as they are well below the diffraction limit of microscopy. The recent development of super-resolution fluorescence microscopy methods enables the observation of these cellular players well below this limit: by localizing, tracking and counting molecules with high spatial and temporal resolution, these new fluorescence microscopy methods offer a previously unknown insight into protein interactions at the near-molecular level. Direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) utilizes the reversible, stochastic blinking events of small commercially available fluorescent dyes, while photoactivated localization microscopy (PALM) utilizes phototransformation of genetically encoded fluorescent proteins. By photoactivating only a small fraction of the present fluorophores in each observation interval, single emitters can be localized with high precision and a super-resolved image can be reconstructed. Quantum Dot Triexciton imaging (QDTI) utilizes the three-photon absorption (triexcitonic) properties of quantum dots (QD) and to achieve a twofold resolution increase using conventional confocal microscopes. In this thesis, experimental approaches were implemented to achieve super-resolution microscopy in fixed and live-cells to study the spatial and temporal dynamics of TNF and other cellular signaling events. We introduce QDTI to study the three-dimensional cellular distribution of biological targets, offering an easy method to achieve resolution enhancement in combination with optical sectioning, allowing the preliminary quantification of labeled proteins. As QDs are electron dense, QDTI can be used for correlative fluorescence and transmission electron microscopy, proving the versatility of QD probes. Utilizing the phototransformation properties of fluorescent proteins, single-receptor tracking on live cells was achieved, applying the concept of single particle tracking PALM (sptPALM) to track the dynamics of a TNF-R1-tdEos chimera on the membrane. Lateral receptor dynamics can be tracked with high precision and the influences of ligand addition or lipid disruption on TNF-R1 mobility was observed. The results reveal complex receptor dynamics, implying internalization processes in response to TNFα stimulation and a role for membrane domains with reduced fluidity, so-called lipid raft domains, in TNF-R1 compartimentalization prior or post ligand induction. Comparisons with previously published FCS data show a good accordance, but stressing the increased data depth available in sptPALM experiments. Additionally, the active transport of NF-κB-tdEos fusions was observed in live neurons under chemical stimulation and/or inhibition. Contrary to phototransformable proteins that need no special buffers to exhibit photoconversion or photoactivation, dSTORM has previously been unsuitable for in vivo applications, as organic dyes relied on introducing the probes via immunostaining in concert with a reductive, oxygen-free medium for proper photoswitching behaviour. ATTO655 had been previously shown to be suitable for live-cell applications, as its switching behavior can be catalyzed by the reductive environment of the cytoplasm. By introducing the cell-permeant organic dye via a chemical tag system, a high specificity and low background was achieved. Here, the labeled histone H2B complex and thus single nucleosome movements in a live cell can be observed over long time periods and with ~20 nm resolution. Implementing these new approaches for imaging biological processes with high temporal and spatial resolution provides new insights into the dynamics and spatial heterogeneities of proteins, further elucidating their function in the organism and revealing properties that are usually only detectable in vitro.   N2 - Zelluläre Antworten auf externe Stimuli sind die Basis aller biologischer Prozesse. Die Integration dieser Signale wird dabei von Proteinkaskaden ausgeführt, welche Moleküle aus der Umgebung wahrnehmen und verarbeiten. Faktoren, welche von Pathogenen oder während einer Entzündung freigesetzt werden, induzieren für gewöhnlich eine Entzündungsantwort, eine Reaktion, die oft vom Tumornekrosefaktor alpha (TNFα) vermittelt wird. Die TNFα Rezeptoren TNF-R1 und TNF-R2 vermitteln nach Ligandenbinding Apoptose oder Zellproliferation durch NF-kB. Diese Prozesse sind engmaschig durch Membrankompartimentierung, Proteininteraktionen und -transport reguliert. Fluoreszenzmikroskopie bietet eine zuverlässige, nicht-invasive Methode um diese zellulären Prozesse zu untersuchen. Allerdings sind einige Prozesse innerhalb einer nativen Membran nicht auflösbar, da sie weit unterhalb der Beugungsgrenze der Lichtmikroskopie stattfinden. Die jüngste Entwicklung der hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopiemethoden erlaubt die Beobachtung dieser zellulären Abläufe auf molekularer Ebene: durch das Lokalisieren, Verfolgen und Zählen von Molekülen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung bieten diese neuen Fluoreszenzmethoden bisher unbekannte Einblicke in Proteininteraktionen. Direkte stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (dSTORM) nutzt die reversiblen, stochastischen Ereignisse von kleinen blinkenden, kommerziell erhältlichen Fluoreszenzfarbstoffen, während die photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (PALM) die Phototransformation fluoreszierenden Proteinen nutzt. Durch das Photoaktivieren lediglich eines kleinen Bruchteils der Fluorophore innerhalb eines Zeitintervalls können einzelne Emitter mit hoher Genauigkeit lokalisiert und ein hochaufgelöstes Bild daraus rekonstruiert werden. Quantum Dot Triexciton Imaging (QDTI) nutzt die Drei-Photonen-Absorption von Quantenpunkten um eine zweifache Auflösungserhöhung mittels eines Konfokalmikroskopes zu erreichen. In dieser Arbeit wurden experimentelle Ansätze zur hochauflösenden Mikroskopie an fixierten und lebenden Zellen implementiert, um die räumliche und zeitliche Dynamik von TNF und anderen zellulären Signalwegen zu untersuchen. Zur Analyse der dreidimensionalen, zellulären Verteilung von biologischen Zielen stellen wir QDTI vor, welches eine einfache Methode zur Verbesserung der Auflösung an Konfokalmikroskopen in Kombination mit optischen Schnitten darstellt. Dies ermöglicht die vorläufige Quantifizierung von markierten Proteinen. Da QDs eine hohe Elektronendichte besitzen kann QDTI auch für korrelative Fluoreszenz- und Transmissionselektronenmikroskopie genutzt werden, was die Vielseitigkeit der QD-Sonden verdeutlicht. Mit Hilfe des single-particle tracking PALM (sptPALM) Konzepts konnten einzelne Rezeptormoleküle verfolgt werden, um die Dynamiken einer TNF-R1-tdEos Chimäre auf der Membran zu beobachten. Die laterale Rezeptordynamik kann hier mit hoher Präzision gemessen, und die Einflüsse auf die TNF-R1-Mobilität konnte nach Ligandenzugabe oder die Störung der Membranzusammensetzung analysiert werden. Die Ergebnisse zeigen eine komplexe Rezeptordynamik und lassen sowohl auf Internalisierungsprozesse in Reaktion auf TNFα-Stimulation, als auch auf eine wichtige Rolle von Membrandomänen mit eingeschränkter Fluidität in der TNF-R1 Kompartimentierung während der Ligandenbindung schließen. Zusätzlich wurde der aktive Transport von NF-kB-tdEos Fusionsproteinen in lebenden Neuronen unter chemischer Stimulierung bzw. Inhibierung untersucht. Im Gegensatz zu phototransformierbaren Proteinen, die keine speziellen Puffer zur Photokonversion oder Photoaktivierung benötigen, war dSTORM bisher für in vivo Anwendungen ungeeignet, da organische Farbstoffe auf die Einführung über Immunfärbung in Kombination mit einem reduktiven, Sauerstoff-freiem Medium für korrektes Photoschalten angewiesen waren. ATTO655 wurde zuvor als geeignet für die Anwendung in lebenden Zellen eingestuft, da das Schaltverhalten durch die reduktive Umgebung des Zytoplasmas katalysiert werden kann. Durch die Einführung von membranpermeablen organischen Farbstoffen über ein chemisches Markierungssystem konnte eine hohe Spezifität und ein geringer Hintergrund erreicht werden. Hier konnte durch die Markierung des Histon H2B Komplexes die Bewegung einzelner Nukleosome in lebenden Zellen über lange Zeiträume mit einer Auflösung von ~20 nm beobachtet werden. Die Umsetzung dieser neuen Ansätze für die Darstellung biologischer Prozesse mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung liefert neue Einblicke in die Dynamiken und die räumliche Heterogenität von Proteinen und enthüllt Funktionen im Organismus und beleuchtet Eigenschaften, die sonst nur in vitro nachweisbar wären. KW - Fluoreszenzmikrosopie KW - Tumor-Nekrose-Faktor KW - Hochauflösendes Verfahren KW - sptPALM KW - dSTORM KW - PALM KW - QDTI KW - TNF-R1 KW - TNF-R2 Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73191 ER - TY - THES A1 - Hauff, Cornelia T1 - Aspects of the mode of action of bispecific T cell engager (BiTE) antibodies T1 - Wirkmechanismus eines bispezifischen T cell engager Antikörpers N2 - Bispecific T cell engager (BiTE) display a novel design among the class of bispecific antibodies and hold great promise to fight diverse cancers. BiTE molecules consist of two different binding entities derived from two human IgG antibodies connected by a short peptide linker. Their binding arms are directed against the CD3e chain of the T cell receptor on T cells and against an antigen that is specific for (e.g., CD19 for lymphoma in MT103) or over-expressed on (e.g., EpCAM for epithelial cancer in MT110) tumor cells. Without requirement for pre- or co-stimulation, BiTE molecules efficiently redirect CD3+ T cells towards tumor cells expressing the relevant target antigen. Only a BiTE molecule simultaneously bound to both tumor cell and T cell activates the T cell to exert its cytolytic function resulting in tumor cell death. In T cells stimulated with both BiTE and target cells, elevated levels of caspase activation and increased expression of cytotoxic and signaling proteins are observed. These include cytolytic proteins granzyme B and perforin, activation markers CD69 and CD25 and adhesion molecules CD2 and LFA-1. Activated T cells secrete the usual mix of cytokines, among them pro-inflammatory cytokines IFN-g and TNF-a. The membrane of tumor cells expressing the relevant target antigen is perforated during the attack of BiTE-stimulated effector cells as can be concluded from adenylate kinase release from the cytosol of tumor cells. Ca2+-chelator EGTA completely blocked BiTE-mediated activation of caspases and tumor cell lysis. As perforin is strictly Ca2+-dependent, a major role for this pore-forming protein is assumed for the elimination of tumor cells via BiTE-stimulated T cells. Granzyme B and caspases are main players in BiTE-mediated elimination of tumor cells. Inhibitors of granzyme B or caspases reduce or block, respectively the activation of caspases. However, other signals of apoptosis (cleavage of PARP and fragmentation of DNA) were only reduced by granzyme B inhibitor or caspase inhibitor. Most interestingly, the lytic capacity of BiTE molecules was not impaired by granzyme B inhibitor or caspase inhibitor. It seems that there is no requirement for granzyme B and caspases to be present simultaneously. Instead the data presented provide evidence that they can be replaced one at a time by related proteins. Pre-incubation of effector cells with the glucocorticoids dexamethasone or methylprednisolone resulted in markedly decreased secretion of cytokines by T cells yet only a small reduction in the expression of activation markers and adhesion molecules on T cells and specific lysis of tumor cells upon BiTE stimulation. Soluble factors secreted in an undirected manner by BiTE-stimulated T cells do not mediate tumor cell death by themselves. Bystander cells negative for the antigen that is recognized by the BiTE molecule will not be compromised by BiTE activity. The cytokine TGF-b reduced proliferation as well as granzyme B and perforin expression of BiTE-stimulated T cells. Redirected lysis by BiTE-activated T cells was also decreased under the influence of TGF-b, however lysis was still performed at a reasonable rate (72 % of target cells). TGF-b does not exert a deleterious effect on lytic potential of BiTE-stimulated T cells. The minimal anticipated biological effect level for the BiTE MT110 was determined for the entry of MT110 into phase I clinical studies. Experiments analyzing redirected lysis of tumor cells, expression of activation marker CD25 and cytokine release by T cells revealed a MABEL value of 50 pg/ml for MT110. N2 - Bispecific T cell engager stellen mit ihrem neuartigen Design eine eigene Gruppe unter den bispezifischen Antikörpern dar und zeigen sich vielversprechend im Kampf gegen unter-schiedliche Krebsarten. BiTE Moleküle bestehen aus zwei unterschiedlichen Bindungsstellen, die von zwei humanen IgG Antikörpern abgeleitet sind und durch einen kurzen Peptidlinker verbunden sind. Die Bindungsstellen sind gerichtet gegen die CD3e Kette des T-Zell-Rezeptors auf T-Zellen und gegen ein Antigen, das auf den Tumorzellen ausschließlich (CD19 bei Lymphomen in MT103) oder in erhöhtem Maße (EpCAM bei epithelialem Krebs in MT110) exprimiert wird. BiTE Moleküle richten CD3+ T-Zellen gegen Tumorzellen, die das relevante Zielantigen präsentieren. Dabei sind sie nicht auf Vor- oder Kostimulation angewiesen. Nur wenn das BiTE Molekül gleichzeitig an Tumorzelle und T-Zelle gebunden ist, aktiviert es die T-Zelle zytolytisch zu wirken und die Tumorzelle zu töten. T-Zellen, die mit BiTE und zugleich Targetzellen stimuliert wurden, zeigen erhöhte Raten von Caspaseaktivierung und vermehrte Expression von zytotoxischen und Signalproteinen. Diese beinhalten die zytolytischen Proteine Granzyme B und Perforin, die Aktivierungs-marker CD69 und CD25 und die Adhäsionsmoleküle CD2 und LFA-1. Aktivierte T-Zellen sezernieren die übliche Mischung an Zytokinen, darunter die pro-inflammatorischen Zytokine IFN-g und TNF-a. Die Freisetzung von Adenylatkinase aus dem Zytosol von Tumorzellen lässt darauf schließen, dass die Membran von Tumorzellen, die das relevante Zielantigen exprimieren, während dem Angriff von BiTE-stimulierten Effektorzellen durchlöchert wird. Der Ca2+ Chelator EGTA verhinderte die BiTE-vermittelte Aktivierung von Caspasen und Lyse von Tumorzellen vollständig. Da Perforin in Abhängigkeit von Ca2+ wirkt, wird für dieses porenbildende Protein eine entscheidende Rolle in der Beseitigung von Tumorzellen mittels BiTE-stimulierter T-Zellen angenommen. Granzyme B und Caspasen sind die Hauptakteure in der BiTE-vermittelten Beseitigung von Tumorzellen. Inhibitoren von Granzyme B oder den Caspasen vermindern bzw. hemmen die Aktivierung von Caspasen. Andere Apoptosesignale (PARP-Spaltung und DNA-Fragmentierung) werden von Granzyme B- oder Caspase-Inhibitoren jedoch lediglich reduziert. Bemerkenswerterweise wurde die lytische Kapazität von BiTE Molekülen durch einen Granzyme B- oder Caspase-Inhibitor nicht beeinträchtigt. Es scheint, dass keine Notwendigkeit für die gleichzeitige Anwesenheit von Granzyme B und Caspasen besteht. Stattdessen erbringen die vorgestellten Ergebnisse einen Hinweis dafür, dass diese Proteine jeweils einzeln durch verwandte Proteine ersetzt werden können. Präinkubation von Effektorzellen mit den Glucocorticoiden Dexamethason oder Methylpred-nisolon bewirkte eine deutlich verminderte Zytokinsekretion von T-Zellen, jedoch nur eine geringe Abnahme der Expression von Aktivierungsmarkern und Adhäsionsmolekülen auf T-Zellen und der spezifischen Lyse von Tumorzellen in Folge von BiTE-Stimulierung. Lösliche Faktoren, die von BiTE-stimulierten T-Zellen nicht zielgerichtet abgegeben werden, vermitteln keine Lyse von Tumorzellen. Zellen, die sich in der Nachbarschaft des Tumors befinden, aber das Antigen nicht exprimieren, das vom BiTE Moleküle erkannt wird, werden daher durch BiTE Aktivität nicht in Mitleidenschaft gezogen. Das Zytokin TGF-b verminderte die Proliferation von BiTE-stimulierten T-Zellen sowie deren Expression von Granzyme B und Perforin. Die gerichtete Lyse von BiTE-aktivierten T-Zellen war unter dem Einflusss von TGF-b ebenfalls vermindert. Trotzdem erreichten die Lysisraten Werte von 72 %. TGF-b übt keinen schädlichen Effekt auf das lytische Potential von BiTE-stimulierten T-Zellen aus. Die MT110-Konzentration, bei der der geringste biologische Effekt erwartet wird, wurde für den Eintritt von MT110 in klinische Studien der Phase I bestimmt. Auf Grundlage von Experimenten zur gerichteten Lyse von Tumorzellen, zur Expression des Aktivierungsmarker CD25 auf T-Zellen und zu Freisetzung von Zytokinen aus T-Zellen, ergab sich ein MABEL-Wert von 50 pg/ml für MT110. KW - Antikörper KW - Krebs KW - Therapie KW - T-Lymphozyt KW - bispezifische Antikörper KW - Krebstherapie KW - T cell KW - bispecific antibody KW - cancer therapy Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48369 ER - TY - THES A1 - Yarali, Ayse T1 - Aspects of predictive learning in the fruit fly T1 - Aspekte des assoziatives Lernens bei Taufliegen N2 - Past experience contributes to behavioural organization mainly via learning: Animals learn otherwise ordinary cues as predictors for biologically significant events. This thesis studies such predictive, associative learning, using the fruit fly Drosophila melanogaster. I ask two main questions, which complement each other: One deals with the processing of those cues that are to be learned as predictors for an important event; the other one deals with the processing of the important event itself, which is to be predicted. Do fruit flies learn about combinations of olfactory and visual cues? I probe larval as well as adult fruit flies for the learning about combinations of olfactory and visual cues, using a so called ‘biconditional discrimination’ task: During training, one odour is paired with reinforcement only in light, but not in darkness; the other odour in turn is reinforced only in darkness, but not in light. Thus, neither the odours nor the visual conditions alone predict reinforcement, only combinations of both do. I find no evidence that either larval or adult fruit flies were to solve such task, speaking against a cross-talk between olfactory and visual modalities. Previous studies however suggest such cross-talk. To reconcile these results, I suggest classifying different kinds of interaction between sensory modalities, according to their site along the sensory-motor continuum: I consider an interaction ‘truly’ cross-modal, if it is between the specific features of the stimuli. I consider an interaction ’amodal’ if it instead engages the behavioural tendencies or ‘values’ elicited by each stimulus. Such reasoning brings me to conclude that different behavioural tasks require different kinds of interaction between sensory modalities; whether a given kind of interaction will be found depends on the neuronal infrastructure, which is a function of the species and the developmental stage. Predictive learning of pain-relief in fruit flies Fruit flies build two opposing kinds of memory, based on an experience with electric shock: Those odours that precede shock during training are learned as predictors for punishment and are subsequently avoided; those odours that follow shock during training on the other hand are learned as signals for relief and are subsequently approached. I focus on such relief learning. I start with a detailed parametric analysis of relief learning, testing for reproducibility as well as effects of gender, repetition of training, odour identity, odour concentration and shock intensity. I also characterize how relief memories, once formed, decay. In addition, concerning the psychological mechanisms of relief learning, first, I show that relief learning establishes genuinely associative conditioned approach behaviour and second, I report that it is most likely not mediated by context associations. These results enable the following neurobiological analysis of relief learning; further, they will form in the future the basis for a mathematical model; finally, they will guide the researchers aiming at uncovering relief learning in other experimental systems. Next, I embark upon neurogenetic analysis of relief learning. First, I report that fruit flies mutant for the so called white gene build overall more ‘negative’ memories about an experience with electric shock. That is, in the white mutants, learning about the painful onset of shock is enhanced, whereas learning about the relieving offset of shock is diminished. As they are coherently affected, these two kinds of learning should be in a balance. The molecular mechanism of the effect of white on this balance remains unresolved. Finally, as a first step towards a neuronal circuit analysis of relief learning, I compare it to reward learning and punishment learning. I find that relief learning is distinct from both in terms of the requirement for biogenic amine signaling: Reward and punishment are respectively signalled by octopamine and dopamine, for relief learning, either of these seem dispensible. Further, I find no evidence for roles for two other biogenic amines, tyramine and serotonin in relief learning. Based on these findings I give directions for further research. N2 - Vergangene Ereignisse beeinflussen die Organisation des Verhaltens hauptsächlich durch das Lernen: Tiere lernen natürlich vorkommende neutrale Reize als Signal für biologisch relevante Ereignisse zu nutzen. Diese Dissertation befasst sich mit derartigen assoziativen Lernvorgängen bei der Taufliege Drosophila melanogaster. Ich stelle zwei, sich ergänzende, grundlegende Fragen: Die eine Frage beschäftigt sich mit der Verarbeitung von Reizen, die als Signal für ein wichtiges Ereignis erlernt werden. Die andere Frage behandelt die Verarbeitung des Ereignisses selbst. Lernen Taufliegen etwas über Kombinationen von olfaktorischen und visuellen Reizen? Sowohl bei larvalen, als auch bei adulten Taufliegen wird das Lernen von Kombinationen aus olfaktorischen und visuellen Stimuli untersucht. Ich verwende einen sogenannten „bikonditionalen Diskriminierungs-Versuchsaufbau“: Während des Trainings wird ein Duft nur im Licht und nicht im Dunkeln mit Reinforcement kombiniert, während ein anderer Duft nur im Dunkeln und nicht im Licht mit Reinforcement kombiniert wird. Somit signalisieren weder die Düfte, noch die visuellen Bedingungen allein das Reinforcement, sondern nur eine Kombination aus Beiden. Ich finde keine Beweise dafür, dass larvale oder adulte Taufliegen eine solche Aufgabe lösen können. Dies spricht gegen eine Interaktion zwischen olfaktorischen und visuellen Modalitäten. Allerdings weisen frühere Studien auf derartige Interaktionen hin. Um meine Ergebnisse mit den bekannten Studien in Einklang zu bringen, ordne ich die unterschiedlichen Interaktionen zwischen den sensorischen Modalitäten nach ihrer Lage entlang des sensorisch-motorischen Kontinuums: Ich bezeichnen eine Interaktion für „echt“ cross-modal, wenn sie zwischen den spezifischen Eigenschaften der beiden Reize stattfindet. Ich halte eine Interaktion für „amodal“, wenn sie zwischen den von den Reizen induzierten Verhaltenstendenzen und „Werten“ stattfindet. Aufgrund dieser Argumentation komme ich zu der Schlussfolgerung, dass unterschiedliche Verhaltensaufgaben unterschiedliche Interaktionen zwischen den sensorischen Modalitäten erfordern. Ob eine Art von Interaktion gefunden wird oder nicht hängt von der neuronalen Vernetzung ab, welche charakteristisch für Art und Entwicklungsstadium ist. Assoziatives Lernen von Schmerz-Erleichterung bei Taufliegen Taufliegen entwickeln zwei unterschiedliche Arten von Gedächtnissen basierend auf Erfahrung mit Elektro-Schock: Düfte, die während des Trainings dem Schock vorausgehen, werden als Bestrafungssignale gelernt und deshalb vermieden. Düfte, die während des Trainings auf den Schock folgen, werden als Erleichterungssignale gelernt und deshalb bevorzugt. Ich beschäftige mich mit der zweiten Art dieses assoziativen Lernens, das ich als „Erleichterungslernen“ bezeichne. Ich beginne mit einer detaillierten parametrischen Analyse des Erleichterungslernens. Die Reproduzierbarkeit, sowie die Einflüsse des Geschlechts, der Anzahl an Trainingswiederholungen, der Duftintensität, der Duftkonzentration und der Schockintensität werden geprüft. Ich teste, wie das Erleichterungsgedächtnis, nachdem es gebildet wurde, wieder gelöscht wird. Des Weiteren gehe ich zwei wichtigen Fragen zu den psychologischen Mechanismen des Erleichterungslernen nach: Zum einen zeige ich, dass das Erleichterungslernen echtes assoziativ konditioniertes Annäherungsverhalten etabliert. Zum anderen zeige ich, dass vorausgegangenes Kontext-Schock Training das folgende Erleichterungslernen nicht beeinflusst. Das Erleichterungslernen wird also nicht durch Kontextassoziation vermittelt. Diese Ergebnisse erlauben die folgende neurobiologische Analyse des Erleichterungslernens. Außerdem werden sie in Zukunft als Grundlage für ein mathematisches Modell des Erleichterungslernens dienen. Schließlich werden die Forscher/innen, die das Erleichterungslernen in anderen experimentellen Systemen untersuchen, von diesen parametrischen Erkenntnissen profitieren. In einer neurobiologischen Analyse des Erleichterungslernens zeige ich, dass der Verlust der Funktion des sogenannten white Gens die beiden unterschiedlichen Arten von Schock-Induziertem Lernen zusammenhängend beeinflusst: Das Bestrafungslernen wird verstärkt und das Erleichterungslernen wird abgeschwächt. Auf Grund dieses Ergebnisses schlagen ich vor, dass sich diese zwei Arten von Lernen in einem Gleichgewicht befinden sollen, welches vom white Gen beeinflusst wird. Die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen eines solchen Gleichgewichts sind noch nicht bekannt. Schließlich vergleiche ich das Erleichterungslernen mit dem Belohnungslernen und dem Bestrafungslernen. Ich zeige, dass das Erleichterungslernen anders ist als beide: Bestrafung und Belohnung werden entsprechend von Dopamin und Octopamin vermittelt. Für das Erleichterungslernen sind beide diese biogenen Aminen unnötig. Ebenso finde ich beim Erleichterungslernen keinen Beleg für die Rolle von zwei weiteren Aminen: Tyramin und Serotonin. Aufgrund dieser Ergebnisse schlage ich vor weitere Forschungsrichtungen. KW - Lernen KW - Drosophila KW - Neurogenetik KW - Lernverhalten KW - olfaktorik KW - sehen KW - erleichterungslernen KW - associative learning KW - drosophila KW - neurogenetic analyses KW - behavioural analyses KW - relief Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-28741 ER - TY - THES A1 - Münz, Thomas Sebastian T1 - Aspects of neuronal plasticity in the mushroom body calyx during adult maturation in the honeybee Apis mellifera T1 - Aspekte neuronaler Plastizität im Pilzkörper kalyx während der Adultreifung der Honigbiene Apis mellifera N2 - Division of labor represents a major advantage of social insect communities that accounts for their enormous ecological success. In colonies of the honeybee, Apis mellifera, division of labor comprises different tasks of fertile queens and drones (males) and, in general, sterile female workers. Division of labor also occurs among workers in form of an age-related polyethism. This helps them to deal with the great variety of tasks within the colony. After adult eclosion, workers spend around three weeks with various duties inside the hive such as tending the brood or cleaning and building cells. After this period workers switch to outdoor tasks and become foragers collecting nectar, pollen and water. With this behavioral transition, workers face tremendous changes in their sensory environment. In particular, visual sensory stimuli become important, but also the olfactory world changes. Foragers have to perform a completely new behavioral repertoire ranging from long distance navigation based on landmark orientation and polarized-skylight information to learning and memory tasks associated with finding profitable food sources. However, behavioral maturation is not a purely age-related internal program associated with a change, for example, in juvenile hormone titers. External factors such as primer pheromones like the brood pheromone or queen mandibular pheromone can modulate the timing of this transition. In this way colonies are able to flexibly adjust their work force distribution between indoor and outdoor tasks depending on the actual needs of the colony. Besides certain physiological changes, mainly affecting glandular tissue, the transition from indoor to outdoor tasks requires significant adaptations in sensory and higher-order integration centers of the brain. The mushroom bodies integrate olfactory, visual, gustatory and mechanosensory information. Furthermore, they play important roles in learning and memory processes. It is therefore not surprising that the mushroom bodies, in particular their main input region, the calyx, undergo volumetric neuronal plasticity. Similar to behavioral maturation, plastic changes of the mushroom bodies are associated with age, but are also to be affected by modulating factors such as task and experience. In my thesis, I analyzed in detail the neuronal processes underlying volumetric plasticity in the mushroom body. Immunohistochemical labeling of synaptic proteins combined with quantitative 3D confocal imaging revealed that the volume increase of the mushroom body calyx is largely caused by the growth of the Kenyon cell dendritic network. This outgrowth is accompanied by changes in the synaptic architecture of the mushroom body calyx, which is organized in a distinct pattern of synaptic complexes, so called microglomeruli. During the first week of natural adult maturation microglomeruli remain constant in total number. With subsequent behavioral transition from indoor duties to foraging, microglomeruli are pruned while the Kenyon cell dendritic network is still growing. As a result of these processes, the mushroom body calyx neuropil volume enlarges while the total number of microgloumeruli becomes reduced in foragers compared to indoor workers. In the visual subcompartments (calyx collar) this process is induced by visual sensory stimuli as the beginning of pruning correlates with the time window when workers start their first orientation flights. The high level of analysis of cellular and subcellular process underlying structural plasticity of the mushroom body calyx during natural maturation will serve as a framework for future investigations of behavioral plasticity in the honeybee. The transition to foraging is not purely age-dependent, but gets modulated, for example, by the presence of foragers. Ethyl oleate, a primer pheromone that is present only in foragers, was shown to delay the onset of foraging in nurse bees. Using artificial application of additional ethyl oleate in triple cohort colonies, I tested whether it directly affects adult neuronal plasticity in the visual input region of the mushroom body calyx. As the pheromonal treatment failed to induce a clear behavioral phenotype (delayed onset of foraging) it was not possible to show a direct link between the exposure to additional ethyl oleate and neuronal plasticity in mushroom body calyx. However, the general results on synaptic maturation confirmed my data of natural maturation processes in the mushroom body calyx. Given the result that dendritic plasticity is a major contributor to neuronal plasticity in the mushroom body calyx associated with division of labor, the question arose which proteins could be involved in mediating these effects. Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII) especially in mammals, but also in insects (Drosophila, Cockroach), was shown to be involved in facilitating learning and memory processes like long-term synaptic potentiation. In addition to presynaptic effects, the protein was also revealed to directly interact with cytoskeleton elements in the postsynapse. It therefore is a likely candidate to mediate structural synaptic plasticity. As part of my thesis, the presence and distribution of CaMKII was analyzed, and the results showed that the protein is highly concentrated in a distinct subpopulation of the mushroom body intrinsic neurons, the noncompact Kenyon cells. The dendritic network of this population arborizes in two calyx subregions: one receiving mainly olfactory input – the lip – and the collar receiving visual input. This distribution pattern did not change with age or task. The high concentration of CaMKII in dendritic spines and its overlap with f-actin indicates that CaMKII could be a key player inducing structural neuronal plasticity associated with learning and memory formation and/or behavioral transitions related to division of labor. Interestingly CaMKII immunoreactivity was absent in the basal ring, another subregion of the mushroom body calyx formed almost exclusively by the inner compact Kenyon cells and known to receive combined visual and olfactory input. This indicates differences of this mushroom body subregion regarding the molecular mechanisms controlling plastic changes in corresponding Kenyon cells. How is timing of behavioral and neuronal plasticity regulated? The primer pheromone ethyl oleate was found in high concentrations on foragers and was shown to influence behavioral maturation by delaying the onset of foraging when artificially applied in elevated concentrations. But how is ethyl oleate transferred and how does it shift the work force distribution between indoor and outdoor tasks? Previous work showed that ethyl oleate concentrations are highest in the honeycrop of foragers and suggested that it is transferred and communicated inside the colony via trophallaxis. The results of this thesis however clearly show, that ethyl oleate was not present inside the honey crop or the regurgitate, but rather in the surrounding tissue of the honey crop. As additionally the second highest concentration of ethyl oleate was measured on the surface of the cuticle of forgers, trophallaxis was ruled out as a mode of transmission. Neurophysiological measurements at the level of the antennae (electroantennogram recordings) and the first olfactory neuropil (calcium imaging of activity in the antennal lobe) revealed that the primer pheromone ethyl oleate is received and processed as an olfactory stimulus. Appetitive olfactory conditioning using the proboscis extension response as a behavioral paradigm showed that ethyl oleate can be associated with a sugar reward. This indicates that workers are able to perceive, learn and memorize the presence of this pheromone. As ethyl oleate had to be presented by a heated stimulation device at close range, it can be concluded that this primer pheromone acts via close range/contact chemoreception through the olfactory system. This is also supported by previous behavioral observations. Taken together, the findings presented in this thesis revealed structural changes in the synaptic architecture of the mushroom body calyx associated with division of labor. For the primer pheromone ethyl oleate, which modulates the transition from nursing to foraging, the results clearly showed that it is received via the olfactory system and presumably acts via this pathway. However, manipulation experiments did not indicate a direct effect of ethyl oleate on synaptic plasticity. At the molecular level, CaMKII is a prime candidate to mediate structural synaptic plasticity in the mushroom body calyx. Future combined structural and functional experiments are needed to finally link the activity of primer pheromones like ethyl oleate to the molecular pathways mediating behavioral and synaptic plasticity associated with division of labor in Apis mellifera. The here identified underlying processes will serve as excellent models for a general understanding of fundamental mechanisms promoting behavioral plasticity. N2 - Arbeitsteilung stellt einen der wesentlichen Faktoren dar, der für den ökologischen Erfolg von sozialen Insektengemeinschaften verantwortlich ist. In Staaten der Honigbiene, Apis mellifera, umfasst die Arbeitsteilung verschiedene Aufgaben für die fertilen Königinnen und Drohnen (Männchen) beziehungsweise die gewöhnlicherweise sterilen Arbeiterinnen. Arbeitsteilung findet aber auch in Form eines altersabhängigen Polyethismus zwischen den Arbeiterinnen selber statt. Dies hilft ihnen die Vielzahl verschiedener Aufgaben im Stock zu bewältigen. Nach dem Schlupf verbringen die Arbeiterinnen etwa drei Wochen mit verschiedenen Aufgaben im Stock, wie beispielsweise Brutpflege oder Reinigen und Bauen neuer Wabenzellen. Nach dieser Zeit wechseln die Arbeiterinnen zu Aufgaben außerhalb des Stocks und werden Nektar-, Pollen- oder Wassersammlerinnen. Durch diesen Verhaltensübergang sind die Arbeiterinnen mit einem massiven Wandel ihrer sensorischen Umwelt konfrontiert. Im speziellen werden nun visuelle Reize wichtig, aber auch die olfaktorische Welt der Arbeiterinnen ändert sich. Sammlerinnen zeigen ein komplett neues Verhaltensrepertoire das von Langstreckennavigation, basierend Landmarken und dem Polarisationsmuster des Himmels, bishin zu Lern- und Gedächtnisaufgaben im Zusammenhang mit dem Auffinden profitabler Futterquellen reicht. Allerdings ist Verhaltensreifung kein rein altersbedingtes internes Programm beispielsweise basierend auf einer Veränderung des Juvenilhormon-Titers. Externe Faktoren wie beispielsweise die Primer Pheromone Brutpheromone oder Königinnenpheromon können den Zeitpunkt des Übergangs modulieren. Hierdurch sind Staaten in der Lage ihre Arbeiterkräfte flexibel zwischen Innen- und Außendienst Aufgaben zu verschieben. Neben bestimmten physiologischen Veränderungen, die vor allem Drüsengewebe betreffen, benötigt der Übergang vom Innendienst zum Außendienst deutliche Anpassungen sensorischer und höherer Integrationszentren im Gehirn. Die Pilzkörper integrieren olfaktorische, visuelle und mechanosensorische Informationen. Sie spielen weiterhin eine wichtige Rolle für Lern- und Gedächtnisvorgänge. Es ist daher nicht überraschend, dass die Pilzkörper, im Speziellen deren Haupteingangsregion, der Kalyx, eine neuronale Volumensplastizität durchlaufen. Ähnlich wie die Verhaltensreifung, sind plastische Veränderungen im Pilzkörper mit dem Alter verbunden, werden aber auch durch modulierende Faktoren wie Aufgabe und Erfahrungen beeinflusst. In meiner Dissertation habe ich detailliert die neuronalen Prozesse analysiert, die der Volumensplastizität des Pilzkörpers zugrunde liegen. Immunhistologische Färbungen synaptischer Proteine kombiniert mit quantitativer 3D Konfokalmikroskopie zeigten, dass die Volumenszunahme des Pilzkörpers hauptsächlich durch dendritisches Wachstum des Kenyon-Zellen-Netzwerks bedingt ist. Dieses Auswachsen wurde begleitet durch Veränderungen der synaptischen Architektur des Kalyx des Pilzkörpers, welcher in Form synaptischer Komplexe, sogenannter Mikroglomeruli organisiert ist. Während der ersten Woche der Adultreifung blieb die Gesamtzahl der Mikroglomeruli konstant. Im folgenden Verhaltensübergang von Innendienstaufgaben zum Sammeln, wurden die Mikroglomeruli zurückgetrimmt, während das dendritische Kenyon-Zell-Netzwerk weiterhin wuchs. Als Ergebnis dieser Prozesse vergrößerte sich das Volumen des Kalyx des Pilzkörpers während die Gesamtzahl der Mikroglomeruli bei Sammlerinnen im Vergleich zu Inndienst Arbeiterinnen reduziert war. In der visuellen Unterregion (Kragen des Kalyx) wurde dieser Prozess induziert durch sensorische Stimuli, da der Beginn des Zurücktrimmens mit dem Zeitfenster zusammenfiel, in dem die Arbeiterinnen ihre ersten Orientierungsflüge starteten. Der hohe Analysegrad der zellulären und subzellulären Prozesse, die der strukturellen Plastizität des Kalyx des Pilzkörpers während der natürlichen Reifung zugrunde liegen, wird zukünftigen Untersuchungen der Verhaltensplastizität bei Honigbienen als Referenz dienen. Der Übergang zur Sammlerin ist nicht rein altersabhängig, sondern wird beispielsweise durch die Gegenwart von anderen Sammlerinnen moduliert. Ethyloleat, ein Primer Pheromone das nur auf Sammlerinnen auftritt, verzögert das Einsetzen des Sammelns von Ammenbienen. Durch das Einbringen zusätzlichen Ethyloleats in Dreifach Kohorten, testete ich, ob es einen direkten Einfluss auf die neuronale Plastizität der visuellen Eingangsregion des Pilzkörper Kalyx hat. Da durch die Pheromon Behandlung kein eindeutiger Verhaltensphänotyp (verzögerter Sammelbeginn) induziert werden konnte, war es nicht möglich einen direkten Zusammenhang zwischen der verstärkten Ethyloleat-Exposition und der neuronalen Plastizität des Kalyx des Pilzkörpers herzustellen. Dennoch bestätigten die Beobachtungen der synaptischen Reifung meine generellen Daten zu den natürlichen Reifungsprozessen im Kalyx des Pilzkörper. Basierend auf dem Ergebnis, dass dendritische Plastizität einen wesentlichen Anteil an der arbeitsteilungsbezogenen neuronalen Plastizität des Kalyx des Pilzkörper hat, stellte sich die Frage, welche Proteine daran beteiligt sein könnten diese Effekte zu vermitteln. Von der Calcium/Calmodulin abhängigen Kinase II (CaMKII) ist bekannt, dass sie speziell bei Säugetieren - aber bei Insekten (Drosophila, Schabe) - daran beteiligt ist, Lern- und Gedächtnisvorgänge, wie die Langzeitpotenzierung, zu ermöglichen. Neben präsynaptischen Effekten, wurde gezeigt, dass dieses Protein direkt mit Elementen des postsynaptischen Cytoskeletts interagieren kann. Als Teil meiner Dissertation habe ich das Vorkommen und die Verteilung der CaMKII analysiert. Ich konnte es hochkonzentriert in einer definierten Subpopulation der intrinsischen Pilzkörper-Neurone, den „nicht kompakten“ Kenyon Zellen, nachweisen. Das dendritische Netzwerk dieser Population verzweigt sich in zwei Kalyx Subregionen: eine olfaktorisch innervierte – die Lippe – und den Kragen, welcher optischen Eingang erfährt. Dieses Verteilungsmuster ändert sich nicht mit dem Alter oder der Aufgabe der Biene. Die hohe Konzentration von CaMKII in den dendritsichen Dornenfortsätzen und die gleichzeitige räumliche Überlappung mit f-Aktin, weisen darauf hin, dass CaMKII eine Schüsselrolle bei der Induzierung struktureller neuronaler Plastizität im Zusammenhang mit Lernen und Gedächtnisbildung und/oder Arbeitsteilung bezogener Verhaltensübergänge, zukommen könnte. Interessanterweise wies der Basalring, eine weitere Subregion des Kalyx des Pilzkörpers die dafür bekannt ist kombinierten visuellen und olfaktorischen Eingang zu erhalten und fast ausschließlich durch die „inneren kompakten“ Kenyon Zellen gebildet wird, keine Immunreaktivität auf. Dies deutet auf Unterschiede in den molekularen Mechanismen die plastische Veränderungen in den entsprechenden Kenyon zellen kontrollieren. Wie wird die zeitliche Abstimmung der Verhaltensplastizität und neuronalen Plastizität reguliert? Für das in hohen Konzentration auf Sammlerinnen vorkommende Primer Pheromon Ethyloelat konnte durch dessen Anwendung in erhöhten Konzentrationen gezeigt werden, dass es die Verhaltensreifung durch Verzögerung des Sammelbeginns beeinflussen kann. Wie aber wird Ethyloleat transferiert und wie verschiebt es die Arbeitskräfteverteilung zwischen Innen- und Außendienst Aufgaben? Frühere Arbeiten zeigten die höchste Konzentration von Ethyloleat im Sozialmagen der Sammlerinnen und schlugen vor, dass es innerhalb der Kolonie über Trophollaxis transferiert und kommuniziert wird. Die Ergebnisse meiner Arbeit zeigten aber eindeutig, dass Ethyloleat nicht im Inhalt des Sozialmagen und auch nicht im Regurgitat, sondern nur im Gewebe des Sozialmagens vorhanden ist. Da zusätzlich die zweithöchste Konzentration von Ethyloleat auf der Oberfläche der Kutikula von Sammlerinnen gemessen wurde, wurde Trophollaxis als Übertragungsmodus ausgeschlossen. Neurophysiologische Messungen an der Antenne (Elektroantennografie), dem ersten olfaktorischen Neuropil (Calcium Imaging der Aktivität des Antennallobus), zeigten, dass Ethyloleat als olfaktorischer Reiz wahrgenommen und prozessiert wird. Appetitive olfaktorische Konditionierung mit Hilfe des Rüsselstreckreflexes wurde als Verhaltensparadigma verwendet um zu zeigen, dass Ethyloleat mit einer Zuckerbelohnung assoziiert werden kann. Dies deutet darauf hin, dass Arbeiterinnen in der Lage sind, die Anwesenheit dieses Pheromons zu perzipieren, zu erlernen und sich auch daran zu erinnern. Da Ethyloleat nur durch Erwärmung als Stimulus präsentiert werden konnte, lässt sich schlussfolgern, dass es über Nahbereichs/Kontakt-Chemorezeption durch das olfaktorische System wahrgenommen wird. Dies wird auch durch frühere Verhaltensbeobachtungen unterstützt. Zusammengenommen, zeigen die in dieser Dissertation präsentierten Ergebnisse strukturelle Veränderungen in der synaptischen Architektur des Kalyx des Pilzkörpers in Zusammenhang mit Arbeitsteilung. Für das Primer Pheromone Ethyloleat, welches den Übergang von Ammendiensten zum Sammeln moduliert, zeigten die Ergebnisse eindeutig, dass es über das olfaktorische System wahrgenommen wird und vermutlich auch über diesen Weg seine Wirkung vermittelt. Dennoch konnten Manipulationsexperimente keine direkte Verbindung zwischen Ethyloleat und der synaptischen Reifung herstellen. Auf molekularer Ebene stellt CaMKII einen Topkandidaten dar, der strukturelle synaptische Plastizität im Kalyx des Pilzkörpers vermitteln kann. Eine Kombination struktureller und funktioneller Experimente ist der nächste logische Schritt um schlussendlich die Verbindung zwischen der Aktivität von Primer Pheromonen (wie Ethyloleat) und molekularen Signalwegen, die Verhaltensplastizität und synaptische Plastizität im Zusammenhang mit der Arbeitsteilung von Apis mellifera vermitteln, herzustellen. Die hierbei identifizierten zugrundeliegenden Prozesse werden als exzellente Modelle für ein generelles Verständnis der fundamentalen Mechanismen welche Verhaltensplastizität vermitteln, dienen. KW - Biene KW - Neuronale Plastizität KW - Pheromon KW - Neuronal plasticity KW - Honeybee KW - Pheromon communication KW - CaMKII KW - Division of labor KW - Neuronale Plastizität KW - Honigbiene KW - Pheromon Kommunikation KW - Arbeitsteilung Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-111611 ER - TY - THES A1 - Kuklovsky [former Finke], Valerie T1 - Are some bees smarter than others? An examination of consistent individual differences in the cognitive abilities of honey bees T1 - Sind manche Bienen schlauer als andere? Eine Untersuchung von konsistenten individuellen Unterschieden in den kognitiven Fähigkeiten von Honigbienen N2 - Cognition refers to the ability to of animals to acquire, process, store and use vital information from the environment. Cognitive processes are necessary to predict the future and reduce the uncertainty of the ever-changing environment. Classically, research on animal cognition focuses on decisive cognitive tests to determine the capacity of a species by the testing the ability of a few individuals. This approach views variability between these tested key individuals as unwanted noise and is thus often neglected. However, inter-individual variability provides important insights to behavioral plasticity, cognitive specialization and brain modularity. Honey bees Apis mellifera are a robust and traditional model for the study of learning, memory and cognition due to their impressive capabilities and rich behavioral repertoire. In this thesis I have applied a novel view on the learning abilities of honey bees by looking explicitly at individual differences in a variety of learning tasks. Are some individual bees consistently smarter than some of her sisters? If so, will a smart individual always perform good independent of the time, the context and the cognitive requirements or do bees show distinct isolated ‘cognitive modules’? My thesis presents the first comprehensive investigation of consistent individual differences in the cognitive abilities of honey bees. To speak of an individual as behaving consistently, a crucial step is to test the individual multiple times to examine the repeatability of a behavior. I show that free-flying bees remain consistent in a visual discrimination task for three consecutive days. Successively, I explored individual consistency in cognitive proficiency across tasks involving different sensory modalities, contexts and cognitive requirements. I found that free-flying bees show a cognitive specialization between visual and olfactory learning but remained consistent across a simple discrimination task and a complex concept learning task. I wished to further explore individual consistency with respect to tasks of different cognitive complexity, a question that has never been tackled before in an insect. I thus performed a series of four experiments using either visual or olfactory stimuli and a different training context (free-flying and restrained) and tested bees in a discrimination task, reversal learning and negative patterning. Intriguingly, across all these experiments I evidenced the same results: The bees’ performances were consistent across the discrimination task and reversal learning and negative patterning respectively. No association was evidenced between reversal learning and negative patterning. After establishing the existence of consistent individual differences in the cognitive proficiency of honey bees I wished to determine factors which could underlie these differences. Since genetic components are known to underlie inter-individual variability in learning abilities, I studied the effects of genetics on consistency in cognitive proficiency by contrasting bees originating from either from a hive with a single patriline (low genetic diversity) or with multiple patrilines (high genetic diversity). These two groups of bees showed differences in the patterns of individually correlated performances, indicating a genetic component accounts for consistent cognitive individuality. Another major factor underlying variability in learning performances is the individual responsiveness to sucrose solution and to visual stimuli, as evidenced by many studies on restrained bees showing a positive correlation between responsiveness to task relevant stimuli and learning performances. I thus tested whether these relationships between sucrose/visual responsiveness and learning performances are applicable for free-flying bees. Free-flying bees were again subjected to reversal learning and negative patterning and subsequently tested in the laboratory for their responsiveness to sucrose and to light. There was no evidence of a positive relationship between sucrose/visual responsiveness and neither performances of free-flying bees in an elemental discrimination, reversal learning and negative patterning. These findings indicate that relationships established between responsiveness to task relevant stimuli and learning proficiency established in the laboratory with restrained bees might not hold true for a completely different behavioral context i.e. for free-flying bees in their natural environment. These results show that the honey bee is an excellent insect model to study consistency in cognitive proficiency and to identify the underlying factors. I mainly discuss the results with respect to the question of brain modularity in insects and the adaptive significance of individuality in cognitive abilities for honey bee colonies. I also provide a proposition of research questions which tie in this theme of consistent cognitive proficiency and could provide fruitful areas for future research. N2 - Unter Kognition versteht man die Fähigkeit von Tieren, essenzielle Informationen aus der Umwelt zu erfassen, zu verarbeiten, zu speichern und zu nutzen. Kognitive Prozesse sind notwendig, um die Zukunft vorherzusagen und die Unvorhersehbarkeit der sich ständig verändernden Umwelt zu verringern. Die Forschung der Kognition von Tieren konzentriert sich klassischerweise auf entscheidende kognitive Tests, um die Fähigkeit einer Spezies anhand der Leistungen einiger weniger Individuen zu bestimmen. Bei diesem Ansatz wird die Variabilität zwischen Individuen als unerwünschtes Rauschen betrachtet und daher vernachlässigt. Die interindividuelle Variabilität liefert jedoch wichtige Erkenntnisse über die Plastizität des Verhaltens, die kognitive Spezialisierung und die Modularität des Gehirns. Die Honigbiene Apis mellifera ist aufgrund ihrer eindrucksvollen Fähigkeiten und ihres reichen Verhaltensrepertoires ein robuster und traditioneller Modellorganismus für die Untersuchung von Lernen, Gedächtnis und Kognition. In dieser Arbeit habe ich das Lernverhalten von Honigbienen in einem neuen Blickwinkel betrachtet, indem ich explizit die individuellen Unterschiede bei diversen Lernaufgaben untersucht habe. Zeigen manche Bienen durchweg eine erhöhte Lernleistung im Vergleich zu ihren Schwestern? Wenn ja, erbringt ein Individuum unabhängig von der Zeit, dem Kontext und den kognitiven Anforderungen der Lernaufgaben immer gute Leistungen, oder zeigen Bienen ausgeprägte unabhängige "kognitive Module"? Die vorliegende Doktorarbeit stellt die erste umfassende Untersuchung konsistenter individueller Unterschiede in den kognitiven Fähigkeiten von Honigbienen dar. Um von einem konsistenten Verhalten sprechen zu können, ist es entscheidend das Individuum mehrfach zu testen, um die Wiederholbarkeit eines Verhaltens zu untersuchen. Ich konnte zeigen, dass frei fliegende Bienen bei einer visuellen Unterscheidungsaufgabe an drei aufeinanderfolgenden Tagen eine konsistente Lernleistung zeigen. Im Anschluss untersuchte ich die individuelle Konsistenz der kognitiven Fähigkeiten bei Lernaufgaben mit unterschiedlichen sensorischen Modalitäten, Kontexten und kognitiven Anforderungen. Frei fliegende Bienen zeigten eine kognitive Spezialisierung zwischen visuellem und olfaktorischem Lernen, während sie bei einer einfachen Unterscheidungsaufgabe und einer komplexen Konzeptlernaufgabe konsistent im Lernverhalten blieben. Anschließend wollte ich die individuelle Konsistenz im Lernverhalten bei Aufgaben unterschiedlicher kognitiver Komplexität weiter erforschen, eine Frage, die bisher noch nie bei einem Insekt behandelt wurde. Ich führte dazu eine Reihe von vier Experimenten durch, bei denen entweder visuelle oder olfaktorische Stimuli und ein unterschiedlicher Trainingskontext (frei fliegend oder eingespannt) verwendet wurden. Die Bienen wurden in einer Unterscheidungsaufgabe, einer Umlernaufgabe und in Negative Patterning getestet. Erstaunlicherweise wurden bei diesen Experimenten die gleichen Ergebnisse festgestellt: Die Lernleitung der Bienen in der Unterscheidungsaufgabe zeigte eine positive Korrelation mit der Lernleistung im Umlernen und Negative Patterning. Zwischen dem Umkehrlernen und Negative Patterning konnte jedoch kein Zusammenhang festgestellt werden. Nachdem ich festgestellt hatte, dass es konsistente individuelle Unterschiede in den kognitiven Fähigkeiten von Bienen gibt, wollte ich die Faktoren ermitteln, die diesen Unterschieden zugrunde liegen könnten. Es war bereits bekannt, dass genetische Komponenten der interindividuellen Variabilität im Lernverhalten zugrunde liegen. Deshalb untersuchte ich den Einfluss von genetischer Vielfalt auf die Beständigkeit von kognitiven Fähigkeiten, indem ich Bienen gegenüberstellte, die entweder aus einem Bienenstock mit einer einzigen Patriline (geringe genetische Vielfalt) oder mit mehreren Patrilinen (hohe genetische Vielfalt) stammten. Diese beiden Gruppen von Bienen wiesen Unterschiede in den Mustern der individuellen korrelierten Lernleistungen auf, was darauf hindeutet, dass eine genetische Komponente für kognitive Individualität verantwortlich ist. Ein weiterer wichtiger Faktor, welcher der Variabilität im Lernverhalten zugrunde liegt, ist die individuelle Reaktionsfähigkeit auf Saccharose Lösungen und auf visuelle Stimuli. Dies wurde durch viele Studien an eingespannten Bienen gezeigt, die eine positive Korrelation zwischen der Reaktionsfähigkeit auf aufgabenrelevante Reize und den Lernfähigkeiten feststellten. Ich habe daher untersucht, ob diese Beziehungen zwischen der Reaktionsfähigkeit auf Saccharose und visuellen Stimuli und den Lernleistungen auch für frei fliegende Bienen zutreffen. Die individuellen Lernleistungen im Umlernen und Negative patterning von frei fliegenden Bienen wurden erneut ermittelt und anschließend wurde im Labor die Reaktionsfähigkeit auf Saccharose und Licht getestet. Es gab keine Hinweise auf eine positive Korrelation zwischen der Reaktionsfähigkeit auf Saccharose und Licht und den Lernleistungen von frei fliegenden Bienen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Beziehungen zwischen der Reaktionsfähigkeit auf aufgabenrelevante Stimuli und der Lernleistung, die im Labor mit eingespannten Bienen festgestellt wurden, möglicherweise nicht für einen anderen Verhaltenskontext gelten, d. h. für frei fliegende Bienen in ihrer natürlichen Umgebung. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Honigbiene ein hervorragendes Insektenmodell ist, um die Konsistenz kognitiver Fähigkeiten zu untersuchen und die zugrunde liegenden Faktoren zu ermitteln. Ich diskutiere die Ergebnisse vor allem im Hinblick auf die Frage der Modularität des Gehirns bei Insekten und die adaptive Bedeutung von individuellen konsistenten kognitiven Fähigkeiten für Honigbienenvölker. Ich schlage auch Forschungsfragen vor, die mit individuellen konsistenten kognitiven Fähigkeiten zusammenhängen und wertvolle Bereiche für künftige Forschungen darstellen könnten. KW - Lernen KW - Biene KW - Kognition KW - Individual differences KW - Cognitive consistency KW - Cognitive profile KW - Learning KW - Honeybee KW - Cognition Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-323012 ER - TY - THES A1 - Baier, Andrea T1 - Architektur meiotischer Chromosomen : Eigenschaften und Evolution des Synaptonemalkomplexproteins SYCP3 T1 - Molecular Architecture of Meiotic Chromosome:Properties and Evolution of Synaptonemal Complex Protein SYCP3 N2 - Die Meiose ist eine besondere Art der Zellteilung, die während der Keimzellreifung stattfindet. Sie umfasst zwei aufeinander folgende Zellteilungen mit nur einer DNA-Repli-kationsrunde, wodurch aus einer diploiden Ausgangszelle vier haploide Gameten entstehen. In der ersten meiotischen Teilung werden die homologen Chromosomen miteinander rekombiniert und voneinander getrennt, in der Meiose II findet die Trennung der Schwesterchromatiden statt. Für den korrekten Ablauf dieser Prozesse musste sich eine spezielle molekulare Architektur des meiotischen Chromosoms entwickeln welche die Synapse der homologen Chromosomen durch den Synaptonemalkomplex (SC) beinhaltet. SCs sind evolutionär hochkonservierte, meiosespezifische Proteinkomplexe, die eine zentrale Bedeutung für Synapse, Rekombination und Segregation der homologen Chromosomen haben. Ein SC besteht aus zwei lateralen Elementen (LEs), die den Achsen der homologen Chromosomen aufgelagert sind, einer zentralen Region (CR) und einem zentralen Element (CE). Eine Hauptstrukturkomponente der LEs in Vertebraten ist das Synaptonemalkomplexprotein, SYCP3. Um die molekulare Architektur des SC besser zu verstehen und die Bedeutung von SYCP3 für die Zusammenlagerung der LE aufzudecken, wurden die Polymerisationseigenschaften von SYCP3, exprimiert in somatischen Zellen, erforscht. In diesem experimentellen Ansatz polymerisierte SYCP3 autonom zu stabilen, höher geordneten, filamentösen Strukturen. Die „Coiled-Coil“-Domäne und die flankierenden, evolutionär konservierten Motive sind dabei notwenig, und nach Deletion des weniger konservierten N-terminalen Bereichs auch ausreichend für die Bildung der höher geordneten Strukturen. Der N-Terminus hingegen spielt eine Rolle in der Stabilität der Polymärstrukturen, welche durch Phosphorylierung zweier Serinreste im N-terminalen Bereich beeinflusst werden könnte. Obwohl die Struktur des SC in der Evolution hochkonserviert ist, sind die Protein-komponenten auf Aminosäuresequenzebene sehr unterschiedlich und weisen wenn überhaupt eine strukturelle Homologie in ihrer Domänenorganisation auf. Um den SC-Aufbau und dessen Funktion besser verstehen zu können, wurden die orthologen SC-Proteine zwischen taxonomisch entfernten Spezies Ratte und Medaka verglichen. Es konnte gezeigt werden, dass trotz der Unterschiede in den Aminosäuresequenzen die sich in den letzen 450 Millionen Jahren zwischen Fisch- und Säugern-SYCP3 akkumuliert haben, die Eigenschaften der Proteine vergleichbar sind, und das sie unter experimentellen Bedingungen miteinander interagieren und zu höher geordneten Strukturen kopolymerisieren können. N2 - Meiosis is a germ line specific, special type of cell division which creates haploid daughter cells from a diploid cell in a manner that ensures each daughter cell a complete haploid genome. A meiotic cell undergoes two cell divisions without an intervening DNA replication step. In the first meiotic division the homologous chromosomes get separated and recombination takes place, while the sister chromatids remain associated until the second meiotic division. To align the homologue chromosomes in meiotic prophase I, a specialized structure has evolved the so called synaptonemal complex (SC). SCs are meiosis-specific nuclear structures that are critically involved in synapsis, recombination and segregation of homologous chromosomes. SYCP3 is a major determinant of axial/lateral element assembly of the mammalian SC. To investigate the contribution of SYCP3 in the assembly of axial/lateral elements, I studied SYCP3 polymerization in a heterologous system where SC proteins are not expressed normally. Under these experimental conditions SYCP3 on its own can form higher order structures that, like SCs, are largely resistant to harsh cell fractionation procedures. I also obtained compelling evidence that the SYCP3 coiled-coil domain together with two flanking, evolutionary conserved motifs (CM) are necessary and also sufficient for higher order structure assembly. Notably, most of the SYCP3 N-terminus appears to be dispensable for polymerization, but plays a key role in the stability of polymer structure. I show that two N-terminal serine residues at positions 32 and 35 are crucial. Their mutation to glutamate residues, whereby phosphate charges are mimicked, leads to the formation of altered higher order structures showing a significantly reduced binding strength. The results are compatible with the notion that SYCP3 provides mechanical stability to SC axial/lateral elements that can be regulated by phosphorylation events. Although the SC structure is conserved in evolution this is not the case for its protein components. To provide information on SC proteins which would be important for our understanding of the conserved SC structure and function, here I compared ortholog SYCP3 proteins of two evolutionary distant vertebrate species, namely rat and medaka fish. To this end I have investigated the polymerization properties of both proteins by immunocytochemistry, electron microscopy and cell fractionation. I found that despite of the sequence differences that have accumulated over the last 450 million years mammalian and fish SYCP3 have similar properties that allow them to co-assemble higher order structures under experimental conditions. KW - Meiose KW - Chromosomen KW - Synaptonemalkomplex KW - Vertebraten KW - Evolution KW - Meiosis KW - Chromosomes KW - Synaptonemal complex KW - Vertebrates KW - Evolution Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-25995 ER - TY - THES A1 - Vainshtein, Yevhen T1 - Applying microarray‐based techniques to study gene expression patterns: a bio‐computational approach T1 - Anwendung von Mikroarrayanalysen um Genexpressionsmuster zu untersuchen: Ein bioinformatischer Ansatz N2 - The regulation and maintenance of iron homeostasis is critical to human health. As a constituent of hemoglobin, iron is essential for oxygen transport and significant iron deficiency leads to anemia. Eukaryotic cells require iron for survival and proliferation. Iron is part of hemoproteins, iron-sulfur (Fe-S) proteins, and other proteins with functional groups that require iron as a cofactor. At the cellular level, iron uptake, utilization, storage, and export are regulated at different molecular levels (transcriptional, mRNA stability, translational, and posttranslational). Iron regulatory proteins (IRPs) 1 and 2 post-transcriptionally control mammalian iron homeostasis by binding to iron-responsive elements (IREs), conserved RNA stem-loop structures located in the 5’- or 3‘- untranslated regions of genes involved in iron metabolism (e.g. FTH1, FTL, and TFRC). To identify novel IRE-containing mRNAs, we integrated biochemical, biocomputational, and microarray-based experimental approaches. Gene expression studies greatly contribute to our understanding of complex relationships in gene regulatory networks. However, the complexity of array design, production and manipulations are limiting factors, affecting data quality. The use of customized DNA microarrays improves overall data quality in many situations, however, only if for these specifically designed microarrays analysis tools are available. Methods In this project response to the iron treatment was examined under different conditions using bioinformatical methods. This would improve our understanding of an iron regulatory network. For these purposes we used microarray gene expression data. To identify novel IRE-containing mRNAs biochemical, biocomputational, and microarray-based experimental approaches were integrated. IRP/IRE messenger ribonucleoproteins were immunoselected and their mRNA composition was analysed using an IronChip microarray enriched for genes predicted computationally to contain IRE-like motifs. Analysis of IronChip microarray data requires specialized tool which can use all advantages of a customized microarray platform. Novel decision-tree based algorithm was implemented using Perl in IronChip Evaluation Package (ICEP). Results IRE-like motifs were identified from genomic nucleic acid databases by an algorithm combining primary nucleic acid sequence and RNA structural criteria. Depending on the choice of constraining criteria, such computational screens tend to generate a large number of false positives. To refine the search and reduce the number of false positive hits, additional constraints were introduced. The refined screen yielded 15 IRE-like motifs. A second approach made use of a reported list of 230 IRE-like sequences obtained from screening UTR databases. We selected 6 out of these 230 entries based on the ability of the lower IRE stem to form at least 6 out of 7 bp. Corresponding ESTs were spotted onto the human or mouse versions of the IronChip and the results were analysed using ICEP. Our data show that the immunoselection/microarray strategy is a feasible approach for screening bioinformatically predicted IRE genes and the detection of novel IRE-containing mRNAs. In addition, we identified a novel IRE-containing gene CDC14A (Sanchez M, et al. 2006). The IronChip Evaluation Package (ICEP) is a collection of Perl utilities and an easy to use data evaluation pipeline for the analysis of microarray data with a focus on data quality of custom-designed microarrays. The package has been developed for the statistical and bioinformatical analysis of the custom cDNA microarray IronChip, but can be easily adapted for other cDNA or oligonucleotide-based designed microarray platforms. ICEP uses decision tree-based algorithms to assign quality flags and performs robust analysis based on chip design properties regarding multiple repetitions, ratio cut-off, background and negative controls (Vainshtein Y, et al., 2010). N2 - Die Regulierung und Aufrechterhaltung der Eisen-Homeostase ist bedeutend für die menschliche Gesundheit. Als Bestandteil des Hämoglobins ist es wichtig für den Transport von Sauerstoff, ein Mangel führt zu Blutarmut. Eukaryotische Zellen benötigen Eisen zum Überleben und zum Proliferieren. Eisen ist am Aufbau von Hämo- und Eisenschwefelproteinen (Fe-S) beteiligt und kann als Kofaktor dienen. Die Aufnahme, Nutzung, Speicherung und der Export von Eisen ist zellulär auf verschiedenen molekularen Ebenen reguliert (Transkription, mRNA-Level, Translation, Protein-Level). Die iron regulatory proteins (IRPs) 1 und 2 kontrollieren die Eisen-Homeostase in Säugetieren posttranslational durch die Bindung an Iron-responsive elements (IREs). IREs sind konservierte RNA stem-loop Strukturen in den 5' oder 3' untranslatierten Bereichen von Genen, die im Eisenmetabolismus involviert sind (z.B. FTH1, FTL und TFRC). In dieser Arbeit wurden biochemische und bioinformatische Methoden mit Microarray-Experimenten kombiniert, um neue mRNAs mit IREs zu identifizieren. Genexpressionsstudien verbessern unser Verständnis über die komplexen Zusammenhänge in genregulatorischen Netzwerken. Das komplexe Design von Microarrays, deren Produktion und Manipulation sind dabei die limitierenden Faktoren bezüglich der Datenqualität. Die Verwendung von angepassten DNA Microarrays verbessert häufig die Datenqualität, falls entsprechende Analysemöglichkeiten für diese Arrays existieren. Methoden Um unser Verständnis von eisenregulierten Netzwerken zu verbessern, wurde im Rahmen dieses Projektes die Auswirkung einer Behandlung mit Eisen bzw. von Knockout Mutation unter verschiedenen Bedingungen mittels bioinformatischer Methoden untersucht. Hierfür nutzen wir Expressionsdaten aus Microarray-Experimenten. Durch die Verknüpfung von biochemischen, bioinformatischen und Microarray Ansätzen können neue Proteine mit IREs identifiziert werden. IRP/IRE messenger Ribonucleoproteine wurden immunpräzipitiert. Die Zusammensetzung der enthaltenen mRNAs wurde mittels einem IronChip Microarray analysiert: Für diesen Chip wurden bioinformatisch Gene vorhergesagt, die IRE-like Motive aufweisen. Der Chip wurde mit solchen Oligonucleotiden beschichtet und durch Hybridisierung überprüft, ob die präzipitierten mRNA sich hieran binden. Die Analyse der erhaltenen Daten erfordert ein spezialisiertes Werkzeug um von allen Vorteilen der angepassten Microarrays zu profitieren. Ein neuer Entscheidungsbaum-basierter Algorithmus wurde in Perl im IronChip Evaluation Package (ICEP) implementiert. Ergebnisse Aus großen Sequenz-Datenbanken wurden IRE-like Motive identifiziert. Dazu kombiniert der Algorithmus, insbesondere RNA-Primärsequenz und RNA-Strukturdaten. Solche Datenbankanalysen tendieren dazu, eine große Anzahl falsch positiver Treffer zu generieren. Daher wurden zusätzliche Bedingungen formuliert, um die Suche zu verfeinern und die Anzahl an falsch positiven Treffer zu reduzieren. Die angepassten Suchkriterien ergaben 15 IRE-like Motive. In einem weiteren Ansatz verwendeten wir eine Liste von 230 IRE-like Sequenzen aus UTR-Datenbanken. Daraus wurden 6 Sequenzen ausgewählt, die auch im unteren Teil stabil sind (untere Helix über 6 bp stabil). Die korrespondierenden Expressed Sequence Tags (ESTs) wurden auf die humane oder murine Version des IronChips aufgetragen. Die Microarray Ergebnisse wurden mit dem ICEP Programm ausgewertet. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Immunpräzipitation mit anschließender Microarrayanalyse ein nützlicher Ansatz ist, um bioinformatisch vorhergesagte IRE-Gene zu identifizieren. Darüber hinaus ermöglicht uns dieser Ansatz die Detektion neuer mRNAs, die IREs enthalten, wie das von uns gefundene Gen CDC14A (Sanchez et al., 2006). ICEP ist ein optimiertes Programmpaket aus Perl Programmen (Vainshtein et al., BMC Bioinformatics, 2010). Es ermöglicht die einfache Auswertung von Microarray Daten mit dem Fokus auf selbst entwickelten Microarray Designs. ICEP diente für die statistische und bioinformatische Analyse von selbst entwickelten IronChips, kann aber auch leicht an die Analyse von oligonucleotidbasierten oder cDNA Microarrays adaptiert werden. ICEP nutzt einen Entscheidungsbaum-basierten Algorithmus um die Qualität zu bewerten und führt eine robuste Analyse basierend auf Chipeigenschaften, wie mehrfachen Wiederholungen, Signal/Rausch Verhältnis, Hintergrund und Negativkontrollen durch. KW - Microarray KW - Genexpression KW - Bioinformatik KW - geneexpression KW - microarrays KW - IronChip KW - ICEP Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-51967 ER - TY - THES A1 - Jovcic, Alexander T1 - Applications of aerobic and anaerobic bacteria in the fields of biological degradation of contaminants and biological wastewater treatment T1 - Applikation von aeroben und anaeroben Bakterien in den Bereichen biologischer Schadstoffabbau und biologische Abwasserreinigung N2 - In the work here presented four distinctly different problems were investigated. The first problem was an investigation into the degradation of Dichloroethylene (DCE) and 1,1-bis (p-Chlorophenyl)-2-dichloroethylene (DDE) utilising pure bacterial cultures. The second investigation dealt with the degradation of DDE and polychlorinated Biphenyl’s (PCB’s) utilising anaerobic sediments and soils from New Zealand. The third investigation worked on the Granulation of anaerobic River-sediments in Upflow Anaerobic Sludge Blanket (UASB) Reactors. The last investigation describes the commissioning of an industrial aerobic Wastewater Treatment Plant and the Implementation of biological Nitrogen- and Phosphate removal in this Wastewater Treatment Plant. Since the chemical Structure of DCE and DDE have certain similarities, Bacteria that were capable of degrading DCE, were tested here, whether they would also be able to degrade DDE utilising a co-metabolic pathway. In the experiments the aerobic bacteria Methylosinus trichosporium and Mycobacterium vaccae and the anaerobic bacteria Acetobacterium woodii and Clostridium butyricum were used. Approximately 60% of the added DCE was degraded by M. vaccae, while M. trichosporium degraded approximately 50%. A. woodii and C. butyricum degraded 40% and 30% respectively of the added DCE. Further experiments with these cultures and DDE lead to a microbial degradation of DDE to an extent of 34.6% for M. vaccae, 14.1% for C. butyricum, 2.2% for A. woodii and 10.5% for M. trichosporium. Additional experiments, utilising [14C]-DDE, showed that the DDE had not been degraded but were attached to the bacterial cells. The second investigation utilised anaerobic soils and sediments from New Zealand to study the anaerobic co-metabolic degradation of DDE and PCB’s. The soils and sediments originated from the River Waikato, from Wastewater Ponds in Kinleith, Marine-Sediments from Mapua, and a variety of soils comtaminated with Pentachlorophenyl (PCP). The cultures from these soils and sediments were raised on a variety of Carbon- and Energy-sources. Beside DDE, Aroclor 1260, and a mix of four pure PCB-Congeneres (one Tetra-, one Hexa, one Hepta- and one Deca-Chlorobiphenyl) were used to test for the reductive dechlorination. The cultivation process of the baceria lasted six months. Samples of the cultures were taken after zero, three and six months. These samples were tested for the increase of cell-protein, the degradation of carbon- and energy-sources, and the removal of the added polychlorinated chemicals. The organochlorines were analysed using reversed phase HPLC and FID-GC. When a change in the Chromatogram was detected the respective cultures were further analysed using ECD-GC and GC-MS. The results showed that the culutres grew under these conditions, but no degradation of DDE and the PCB-Mix could be detected, and only small changes in the composition/chromatograms of Aroclor 1260 were found. The third investigation worked on the Granulation of River-Sediments in UASB-Reactors. Sediments from the River Waikato in New Zealand and the River Saale in Germany were used. In both cases the Granulation process was successful, which was demonstrated by microscopic comparisons of the Sediments and the resulting Granules. The two main bacterial cultures detected were Methanosarcina- and Methanothrix-like cultures. The main carbon- and energy-source was Lactic Acid, which was used at a concentration of 21,8 g COD/L. The Granulation-Process was a combination of using high a COD-Concentration combined with a low Volumetric Loading-Rate. Comparisons of the specific degradation-rates of a variety of carbon- and energy-sources between the Sediments and the Granules, showed no increased degradation rates in regard to the same cell-mass, but the increased bio-mass in the Granules allowed for higher degradation-rates within the UASB-reactors. The fourth investigation describes the commissioning of an industrial Wastewater Treatment Plant for a Dairy-Site in Edendale, Southland, New Zealand. This Plant consists of a DAF-Unit (Dissolved Air Flotation), two Extended Aeration Lagoons with Activated Sludge and two Clarifiers, one for the Activated Sludge and the second for the dosing of Aluminium-Sulphate and the removal of Phosphat-Sulphate. Biological processes for the removal of carbon- and energy-sources were optimised and biological processes for the reduction of Nitrogen- and Phosphate-Concentrations within the wastewater were implemented and optimised. Bilogical removal rates for COD of 95% and above, for Nitrogen of 85-92% and Phosphate of 64-83% were achieved. N2 - In der hier vorgelegten Arbeit wurden vier distinkt verschiedene Probleme untersucht. Das erste Problem war die Untersuchung in den Abbau von Dichloroethylene (DCE) und 1,1-bis (p-chlorophenyl)-2-dichloroethylene (DDE) mithilfe von reinen bakteriellen Kulturen. Die zweite Untersuchung beschaeftigte sich mit dem Abbau von DDE und polychlorinierten Biphenylen (PCB’s) mithilfe von anaeroben Sedimenten und Erden aus New Zealand. Die dritte Untersuchung behandelt die Granulation von anaeroben Fluss-sedimenten in Upflow Anaerobic Sludge Blanket (UASB) Reaktoren. Die letzte Untersuchung behandelt das Anfahren einer industriellen aeroben Abwasser-anlage und die Implementierung von biologischem Stickstoff- und Phosphat-abbau in dieser Abwasser-anlage. Da die chemische Struktur von DCE und DDE gewisse Aehnlichkeiten besitzt, wurden hier wurden Bakterien untersucht, die in der Lage sind DCE abzubauen, ob diese DDE in einer cometabolischen Reaktion abbauen koennen. In den Experimenten wurden die aeroben Bakterien Methylosinus trichosporium und Mycobacterium vaccae und die anaeroben Bakterien Acetobacterium woodii und Clostridium butyricum benutzt. Ungefaehr 60% des hinzugefuegten DCE’s wurde von M. vaccae abgebaut, whaerend M. trichosporium ca 50% abbaute. A. woodii und C. butyricum bauten jeweils 40% und 30% des zugefuegten DCE’s ab. Weiterfuehrenden Experimente mit den obigen Kulturen und zugefuegtem DDE fuehrte zu einem mikrobiologischen Abbau von DDE in den Kulturen von 34.6% fuer M. vaccae, 14.1% fuer C. butyricum, 12.2% fuer A. woodii und 10.5% fuer M. trichosporium. Weitere Experimente, bei denen [14C]-DDE benutzt wurde, ergaben, dass das DDE nicht abgebaut worden war, sondern es stellte sich heraus, dass das DDE an die Bakterienzellen angelagert worden war. Die zweite Untersuchung benutzte anaerobe Erden und Sedimente aus New Zealand um den anaeroben cometabolischen Abbau von DDE und PCB’s zu studieren. Die Erden und Sedimente stammten von dem Fluss Waikato, aus Abwasser-Teichen in Kinleith, Meeresboden-Sedimenten aus Mapua, und verschiedene Erden die mit Pentachlorophenyl (PCP) kontaminiert waren. Die Kulturen aus diesen Erden und Sedimenten wurde mit verschiedenen Kohlenstoff- und Energie-Quellen aufgezogen. Neben DDE wurden Aroclor 1260 und ein Mix aus vier reinen PCB-Congeneren (ein Tetra-, ein Hexa, ein Hepta- und ein Deca-Chlorobiphenyl) fuer die reduktive Dechlorinierung benutzt. Die Aufzucht der Bakteria dauert sechs Monate, Proben wurden am Start der Kultivierung, nach drei und nach sechs Monaten genommen. Diese Proben wurden fuer die Veraenderung des Zellproteins, den Abbau der Kohlenstoof- und Energie-Quellen, und das Verschwinden der zugefuegten polychlorinierten Chemikalien ananlysiert. Die Organochlorine wurden mithilfe von reversed HPLC und dann FID-GC untersucht. Wenn eine Veraenderung in den Chromatogrammen auftrat wurden die entsprechenden Kulturen mithilfe von ECD-GC und GC-MS weitergehend untersucht. Die Resultate zeigten ein wachsen der Kulturen an, aber keinen Abbau von DDE und dem PCB-Mix, und nur geringe Veraenderungen der Komposition von Aroclor 1260. Die dritte Untersuchung befasste sich mit der Granulierung von anaeroben Fluss-sedimenten in UASB Reaktoren. Dafuer wurden Sedimente von dem Waikato in New Zealand und der Saale in Deutschland benutzt. In beiden Faellen war die Granulation erfolgreich, was durch mikroskopische Vergleiche von den Sedimenten und den Granules festgestellt werden konnte. Die zwei hauptsaechlichen Bakterien Kulturen waren Methanosarcina und Methanothrix aehnliche Kulturen. Die Haupt-Kohlenstoff- und Energie-Quelle war Lactic Acid und wurde mit einer Konzentration von 21,8 g COD/L verwendet. Der Granulations-Prozess war eine Kombination von einer hohen COD-Konzentration verbunden mit einer niedrigen volumetrischen Ladungs-Rate. Vergleiche der spezifischen Abbauraten von verschiedenen Kohlenstoff- und Energie-Quellen zwischen den Sedimenten und den Granules, ergab keine erhoehten Abbauraten in Bezug auf die gleiche Zellmasse, aber die erhoehte Biomasse in den Granules sorgt fuer groessere Abbauraten in den UASB Reaktoren. Die vierte Untersuchung befasste sich mit dem Anfahren einer industriellen Abwasser-Anlage fuer eine Molkerei in Edendale, Southland, New Zealand. Diese Anlage besteht aus einer DAF-Unit (Dissolved Air Flotation), zwei Abwasser-Teichen mit aktiver Schlammbehandlung und zwei Klaerbecken, eines fuer die Aktiv-Schlamm-Beseitigung und das zweite fuer die Dosierung von Aluminiumsulphat und die Entfernung von Phosphat-Sulphat. Biologische Verfahren zum Abbau von Kohlenstoff-Verbindugen wurden optimiert und biologische Verfahren zur Verringerung von Stickstoff- und Phospaht-Konzentrationen im Abwasser wurden implementiert und optimiert. Biologische Abbau-Raten fuer COD von ueber 95%, fuer Stickstoff 85-92% und Phosphat 64-83% wurden erreicht. KW - Biologische Abwasserreinigung KW - Bakterien Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-6702 ER - TY - THES A1 - Borst, Andreas T1 - Apoptosis & senescence: cell fate determination in inhibitor-treated melanoma cells T1 - Apoptose & Seneszenz: Bestimmung der Zell-spezifischen Reaktion von Melanomzellen auf Inhibitoren N2 - Neoplasms of the skin represent the most frequent tumors worldwide; fortunately, most of them are benign or semi-malignant and well treatable. However, the two most aggressive and deadly forms of malignant skin-neoplasms are melanoma and Merkel cell carcinoma (MCC), being responsible for more than 90% of skin-cancer related deaths. The last decade has yielded enormous progress in melanoma therapy with the advent of targeted therapies, like BRAF or MEK inhibitors, and immune-stimulating therapies, using checkpoint antibodies targeting CTLA- 4, PD-1 or PD-L1. Very recent studies suggest that also MCC patients benefit from a treatment with checkpoint antibodies. Nevertheless, in an advanced metastatic stage, a cure for both of these aggressive malignancies is still hard to achieve: while only a subset of patients experience durable benefit from the immune-based therapies, the widely applicable targeted therapies struggle with development of resistances that inevitably occur in most patients, and finally lead to their death. The four articles included in this thesis addressed current questions concerning therapy and carcinogenesis of melanoma and MCC. Moreover, they are discussed in the light of the up-to-date research regarding targeted and immune-based therapies. In article I we demonstrated that besides apoptosis, MAPK pathway inhibition in BRAF-mutated melanoma cells also induces senescence, a permanent cell cycle arrest. These cells may provide a source for relapse, as even permanently arrested cancer cells can contribute to a pro-tumorigenic milieu. To identify molecular factors determining the differential response, we established M14 melanoma cell line derived single cell clones that either undergo cell death or arrest when treated with BRAF/MEK inhibitors. Using these single cell clones, we demonstrated in article IV that downregulation of the pro-apoptotic BH3-only protein BIK via epigenetic silencing is involved in apoptosis deficiency, which can be overcome by HDAC inhibitors. These observations provide a possible explanation for the lack of a complete and durable response to MAPK inhibitor treatment in melanoma patients, and suggest the application of HDAC inhibitors as a complimentary therapy to MAPK pathway inhibition. Concerning MCC, we scrutinized the interactions between the Merkel cell polyomavirus’ (MCV) T antigens (TA) and the tumor suppressors p53 and Rb in article II and III, respectively. In article III, we demonstrated that the cell cycle master regulator Rb is the crucial target of MCV large T (LT), while it - in contrast to other polyomavirus LTs - exhibits much lower affinity to the related proteins p107 and p130. Knockdown of MCV LT led to proliferation arrest in MCC cells, which can be rescued by knockdown of Rb, but not by knockdown of p107 and p130. Contrary to Rb, restriction of p53 in MCC seems to be independent of the MCV TAs, as we demonstrated in article II. In conclusion, the presented thesis has revealed new molecular details, regarding the response of melanoma cells towards an important treatment modality and the mechanisms of viral carcinogenesis in MCC. N2 - Die häufigsten Tumore weltweit sind Neoplasien der Haut; glücklicherweise sind die meisten dieser benigne oder semi-maligne und gut behandelbar. Die beiden aggressivsten und tödlichsten Formen bösartiger Hauttumoren sind das Melanom und das Merkelzell-Karzinom (MCC), welche verantwortlich für über 90% aller durch Hauttumore verursachten Todesfälle sind. Im letzten Jahrzehnt gab es jedoch erstaunliche Fortschritte in der Therapie des malignen Melanoms, was vor allem durch das Aufkommen der zielgerichteten Therapien wie den BRAF oder MEK Inhibitoren und den immunstimulierenden Therapien, welche Checkpoint-Antikörper gegen CTLA-4, PD-1 oder PD-L1 verwenden, bedingt ist. Neueste Studien legen nahe, dass auch MCC Patienten von diesen Checkpoint-Antikörpern profitieren können. In fortgeschrittenen, metastasierten Stadien ist jedoch für beide Malignitäten eine Heilung immer noch sehr schwer erreichbar: nur eine kleine Gruppe der Patienten erreichen einen dauerhaften Nutzen durch die Immuntherapien, während die breit anwendbaren zielgerichteten Therapien mit der Entwicklung von Resistenzen zu kämpfen haben, welche unausweichlich in den meisten Patienten entstehen und letztendlich zu deren Tod führen. Die vier dieser Dissertation beigefügten Publikationen adressierten aktuelle Fragestellungen bezüglich Therapie und Karzinogenese des Melanoms und des MCCs. Des Weiteren werden diese im Licht des heutigen Forschungsstandes diskutiert, im Besonderen mit Blick auf die zielgerichteten und immunbasierten Therapien. In Publikation I zeigten wir, dass Inhibition des MAPK Signalwegs in BRAF-mutierten Melanom-Zellen neben Apoptose auch zu Seneszenz, einem permanenten Zellzyklusarrest, führen kann. Diese Zellen können der Ursprung der Resistenzbildung sein, da auch permanent arretierte Krebszellen zu einem Tumor-fördernden Milieu beitragen können. Um molekulare Faktoren zu identifizieren, die für diese unterschiedliche Behandlungsreaktion ursächlich sind, haben wir Einzelzellklone aus der M14 Melanom-Zelllinie etabliert, welche entweder mit Zelltod oder Arrest auf die BRAF/MEK Inhibitor Behandlung reagieren. Mit Hilfe dieser Klone zeigten wir in Publikation IV, dass die Herunterregulierung des pro-apoptotischen BH3-only Proteins BIK durch einen epigenetischen Mechanismus zur Apoptose-Resistenz dieser Zellen führt, was durch den Einsatz von HDAC-Inhibitoren umgangen werden kann. Diese Beobachtungen bieten eine mögliche Erklärung für das Ausbleiben eines vollständigen und dauerhaften Ansprechens auf die MAPK-Inhibitor Behandlung der Melanom-Patienten, und legen den Einsatz von HDAC-Inhibitoren als komplementäre Therapieoption nahe. Beim MCC haben wir jeweils die Interaktion zwischen den Merkelzell-Polyomavirus (MCV) T Antigenen (TA) und den Tumor-Suppressoren p53 und Rb in Publikation II und III näher betrachtet. In Publikation III haben wir gezeigt, dass das zentrale, Zellzyklus-regulierende Protein Rb das vorrangige Ziel des MCV large T Antigens (LT) ist, während es - im Gegensatz zu anderen Polyomavirus-LTs - viel weniger Affinität zu den verwandten Proteinen p107 und p 130 aufweist. Der Knockdown des MCV LT führte zu Proliferationsarrest in MCC Zellen, welcher durch Knockdown von Rb aufgehoben werden konnte, nicht jedoch durch Knockdown von p107 und p130. Die Restriktion von p53 scheint im Gegensatz zu Rb im MCC unabhängig von den MCV TAs zu sein, wie wir in Publikation II gezeigt haben. Zusammenfassend gibt diese Dissertation Aufschluss über neue molekulare Zusammenhänge bezüglich der Reaktion von Melanom-Zellen gegenüber einer wichtigen Behandlungsmöglichkeit und den Mechanismen der viralen Karzinogenese des MCC. KW - Melanom KW - Apoptosis KW - MAP-Kinase KW - Senescence KW - BRAF inhibition Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-155085 ER - TY - THES A1 - Ernst, Raffael T1 - Anuran communities on the cutting edge : Analysing patterns and processes in anthropogenically altered tropical forests - Studies from the Guiana Shield and West Africa T1 - Anurengemeinschaften auf Messers Schneide: Muster und Prozesse in anthropogen veränderten tropischen Wäldern - Studien vom Guiana Schild und Westafrika N2 - Summary Timber harvesting is currently the most common commercial utilisation activity in tropical forests. Assessing the effects of logging on different aspects of biodiversity and general ecosystem properties is hence of prime importance if the few remaining areas of intact tropical forest are to be protected effectively and efficiently. Tropical amphibian communities are an appropriate model system for studies on the impacts of human-induced environmental changes on the dynamics of complex biological systems. This thesis elaborates on patterns of diversity changes in tropical forest amphibian communities facing habitat alterations associated with selective logging in two globally important eco-regions (Côte d’Ivoire, Upper Guinea, West Africa and Guyana, the Guiana Shield, northern South America). The thesis is organised along two main themes. After a general introduction, a section on general methodology and an introduction to the model systems studied, the first theme moves from general patterns to underlying processes. A second theme running through both chapters carries from undisturbed systems to disturbed systems. A final section integrates findings and addresses implications for conservation management of anthropogenically altered tropical forests. Several case studies at the species- population and community level are being presented and data on the direct and indirect impacts of anthropogenic habitat alteration on respective organizational levels are provided. A key statement that is stressed on throughout the studies is the fact that common measures of diversity, such as species richness and species-diversity only inadequately reflect processes of diversity change following anthropogenic disturbance. They also fail to describe actual impacts on the dynamics of complex biological systems. It is argued that commonly used measures produce an incoherent and insufficient picture of diversity patterns and the underlying processes that shape these patterns. Thus, an understanding of higher levels of diversity, such as β-diversity and functional diversity (and hence compositional patterns) appears to be the key to effectively mitigating the impacts of human-induced disturbance on amphibian communities. It is shown that the predictability of amphibian community composition depends on the respective level of anthropogenic disturbance imposed on a particular habitat. Hence, human activities that lead to changes in the structure of a forest, such as logging, not only alter simple system descriptors, such as the number of species in a given community, but rather alter the dynamics of the entire system. In this context, functional diversity is shown to be an important aspect underlying the actual mechanism that leads to the observed change of predictability patterns. Functional differences between species, rather than number of species per se appear to be the decisive factor in sustaining desirable ecosystem states and thus in maintaining important ecosystem services. Because biological diversity appears to play a substantial role in ecosystem resilience required to safeguard essential ecosystem functions in the face of environmental change, the thesis calls for a critical revision of common diversity assessments approaches. The studies advocate the reconsideration of the uncritical use of widespread measures and descriptors of biodiversity on grounds of inconsistent patterns found throughout numerous studies, including those presented herein. N2 - Zusammenfassung Forst- und Holzwirtschaft gehört derzeit zu einer der wichtigsten kommerziellen Nutzungsformen tropischer Wälder. Der Analyse und Untersuchung von direkten und indirekten Auswirkungen von Holzeinschlag auf verschiedene Aspekte biologischer Vielfalt und genereller Ökosystemeigenschaften muß daher eine zentrale Bedeutung eingeräumt werden. Dies trifft im besonderen Maße zu, wenn die verbleibenden noch intakten Regenwaldflächen effizient und auch langfristig effektiv geschützt werden sollen. Tropische Amphibiengemeinschaften haben sich bei der Untersuchung von Auswirkungen anthropogen induzierter Habitatveränderungen auf die Dynamik komplexer biologischer Systeme als geeignetes Modellsystem erwiesen. Die hier vorliegende Arbeit befasst sich mit den Mustern der Diversität und deren Änderung in tropischen Waldamphibiengemeinschaften unter dem Einfluss anthropogener Habitatveränderungen (selektiver Holzeinschlag) in zwei geographisch distinkten Ökoregionen von globaler Bedeutung (Côte d’Ivoire, Oberguinea, West Afrika und Guyana, Guiana Schild, nördliches Südamerika). Die thematische Gliederung der Arbeit folgt zwei unterschiedlichen Organisationssträngen. Der erste Strang leitet, nach einer allgemeinen Einführung und einem Abschnitt zur Methodik und Einführung in die untersuchten Modellsysteme, über, von den generellen Mustern zu den zugrunde liegenden Prozessen. Ein zweiter führt von ungestörten Systemen zu Systemen unter Störungseinfluss. Ein abschließender Abschnitt befasst sich mit den Implikationen für Naturschutzmanagement von anthropogen veränderten tropischen Wäldern. In einer Reihe von Fallstudien auf Art-, Populations- und Gemeinschaftsniveau werden die direkten und indirekten Einflüsse anthropogener Habitatänderungen auf die jeweilige Organisationsebene erörtert. Grundtenor aller vorgestellten Untersuchungen ist die Tatsache, dass herkömmliche Diversitätsmaße, wie etwa Artenreichtum und Artendiversität die in Zusammenhang mit anthropogenen Störungen auftretenden Veränderungen von Diversitätsmustern nur unzureichend erklären. Diese Maße erscheinen ebenfalls ungeeignet für die Beschreibung des Einflusses auf die Dynamik komplexer biologischer Systeme. Herkömmlich verwendete Diversitätsindizes generieren ein inkohärentes und unzureichendes Bild tatsächlicher Diversitätsmuster und der zugrunde liegenden Prozesse, die diese Muster formen. Das Verständnis höherer Ebenen der Diversität, wie etwa β-Diversität oder funktionale Diversität (und somit Muster der Artzusammensetzung) erscheint essentiell für die Minimierung des Einflusses von anthropogen induzierten Störungen auf Amphibiengemeinschaften und könnte somit zu einer effektiven Schadensbegrenzung beitragen. In den vorgestellten Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass die Vorhersagbarkeit der Zusammensetzung einer gegebenen Amphibiengemeinschaft unmittelbar vom Störungsgrad des jeweiligen Systems abhängt. Menschliche Aktivitäten, die zu strukturellen Änderungen von Waldssystemen führen, wie etwa kommerzieller Holzeinschlag, führen nicht nur zu Änderungen einfacher Systemdeskriptoren, wie der Anzahl der Arten innerhalb einer Gemeinschaft, vielmehr beeinflussen sie die Dynamik des Gesamtsystems. In diesem Zusammenhang erwiesen sich funktionale Diversitätskomponenten als äußerst wichtige determinierende Faktoren für die beobachteten Vorhersagbarkeitsmuster und deren Veränderung. Funktionale Unterschiede und nicht Artenzahl per se scheinen demnach für den Erhalt zu bevorzugender Ökossystemzustände ausschlaggebend zu sein. Der Erhalt dieser funktionalen Merkmalsdiversität trägt unmittelbar zum Erhalt wichtiger ökosystemarer Leistungen bei. Da anzunehmen ist, dass biologischer Diversität eine maßgebliche Rolle in Bezug auf die Belastbarkeit und Elastizität von Ökosystemen zukommt (essentielle Eigenschaften, die das langfristige Funktionieren von Ökosystemen unter Störungseinfluss gewährleisten), unterstreichen die Ergebnisse der hier vorliegenden Arbeit die Notwendigkeit einer kritischen Revision traditioneller Ansätze der Diversitätserfassung. KW - Tropischer Regenwald KW - Westafrika KW - Lurche KW - Ökologie KW - anthropogene Störungen KW - Amphibiengemeinschaften KW - Vorhersagbarkeitsmuster KW - Naturschutz KW - Afro- Neotropen KW - anthropogenic disturbance KW - amphibian communities KW - predictabilitiy patterns KW - conservation KW - Afro- Neotropics Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-18373 ER - TY - THES A1 - Zimmermann, Henriette T1 - Antigenic variation and stumpy development in \(Trypanosoma\) \(brucei\) T1 - Antigene Variation und Stumpy Entwicklung in \(Trypanosoma\) \(brucei\) N2 - The eukaryotic parasite Trypanosoma brucei has evolved sophisticated strategies to persist within its mammalian host. Trypanosomes evade the hosts' immune system by antigenic variation of their surface coat, consisting of variant surface glycoproteins (VSGs). Out of a repertoire of thousands of VSG genes, only one is expressed at any given time from one of the 15 telomeric expression sites (ES). The VSG is stochastically exchanged either by a transcriptional switch of the active ES (in situ switch) or by a recombinational exchange of the VSG within the active ES. However, for infections to persist, the parasite burden has to be limited. The slender (sl) bloodstream form secretes the stumpy induction factor (SIF), which accumulates with rising parasitemia. SIF induces the irreversible developmental transition from the proliferative sl to the cell cycle-arrested but fly-infective stumpy (st) stage once a concentration threshold is reached. Thus, antigenic variation and st development ensure persistent infections and transmissibility. A previous study in monomorphic cells indicated that the attenuation of the active ES could be relevant for the development of trypanosomes. The present thesis investigated this hypothesis using the inducible overexpression of an ectopic VSG in pleomorphic trypanosomes, which possess full developmental competence. These studies revealed a surprising phenotypic plasticity: while the endogenous VSG was always down-regulated upon induction, the ESactivity determined whether the VSG overexpressors arrested in growth or kept proliferating. Full ES-attenuation induced the differentiation of bona fide st parasites independent of the cell density and thus represents the sole natural SIF-independent differentiation trigger to date. A milder decrease of the ES-activity did not induce phenotypic changes, but appeared to prime the parasites for SIF-induced differentiation. These results demonstrate that antigenic variation and development are linked and indicated that the ES and the VSG are independently regulated. Therefore, I investigated in the second part of my thesis how ES-attenuation and VSG-silencing can be mediated. Integration of reporters with a functional or defective VSG 3'UTR into different genomic loci showed that the maintenance of the active state of the ES depends on a conserved motif within the VSG 3'UTR. In situ switching was only triggered when the telomere-proximal motif was partially deleted, suggesting that it serves as a DNA-binding motif for a telomere-associated protein. The VSG levels seem to be additionally regulated in trans based on the VSG 3'UTR independent of the genomic context, which was reinforced by the regulation of a constitutively expressed reporter with VSG 3' UTR upon ectopic VSG overexpression. N2 - Der eukaryotische Parasit Trypanosoma brucei hat komplexe Strategien entwickelt, um in seinem Säugetierwirt zu überleben. Die Grundlage der Immunevasion ist die antigene Variation des Oberflächenmantels, der aus dem variablen Oberflächenglykoprotein (VSG) besteht. Von mehreren tausend VSG-Genen wird zu jedem Zeitpunkt nur ein einziges aus einer der 15 telomerischen Expressionsstellen (ES) exprimiert. Das VSG kann entweder durch einen transkriptionellen Wechsel der aktiven ES (in situ Wechsel) oder durch einen rekombinatorischen Wechsel des VSG-Gens innerhalb der aktiven ES stochastisch ausgetauscht werden. Damit jedoch eine langanhaltende Infektion des Wirts möglich wird, muss gleichzeitig der Parasitenbefall begrenzt werden. Mit ansteigender Parasitämie akkumuliert der 'stumpy induction factor' (SIF), welcher von der 'slender' (sl) Blutstromform sekretiert wird. Sobald ein Schwellenwert in der SIF-Konzentration erreicht ist, wird die irreversible Differenzierung der proliferativen sl in die zellzyklusarretierte 'stumpy'(st) Form eingeleitet, welche infektiös für den Fliegenvektor ist. Somit stellen antigene Variation und st- Differenzierung das Persistieren der Infektion und die Übertragung des Parasiten sicher. Eine frühere Arbeit mit monomorphen Zellen deutete darauf hin, dass die Attenuierung der aktiven ES eine Rolle für die Differenzierung der Trypanosomen spielen könnte. Diese Hypothese wurde in der vorliegenden Dissertation untersucht, indem in pleomorphen Zellen mit vollständiger Entwicklungskompetenz ein ektopisches VSG induzierbar überexprimiert wurde. Diese Studien offenbarten eine erstaunliche phänotypische Plastizität: während das endogene VSG nach Induktion runter reguliert wurde, arretierten die VSG-Überexpressoren in Abhängigkeit von der ES-Aktivität entweder im Wachstum oder teilten sich weiter. Die vollständige ES-Attenuierung löste die Differenzierung zu echten st Zellen unabhängig von der Zelldichte aus und ist somit der bisher einzige natürliche SIF-unabhängige Differenzierungsauslöser. Eine mildere Abnahme der ES-Aktivität verursachte keinen Phänotyp, scheint aber die Zellen auf die SIF-induzierte Differenzierung vorzubereiten. Diese Ergebnisse zeigen, dass antigene Variation und Differenzierung verbunden sind und deuteten an, dass die ES und das VSG unabhängig voneinander reguliert werden. Daher habe ich im zweiten Teil meiner Dissertation untersucht, wie ES-Attenuierung und VSG-Stilllegung vermittelt werden können. Die Integration eines Reporters mit funktioneller oder defekter VSG 3'UTR an verschiedenen Orten im Genom zeigte, dass die Aufrechterhaltung der ES-Aktivität von einem konservierten Motiv in der VSG 3'UTR abhängig ist. Ein in situ Wechsel wurde nur ausgelöst, wenn Teile des Telomer-proximalen Motiv deletiert wurden, was nahelegt, dass das Motiv auf DNA-Ebene von einem Telomerbindeprotein erkannt wird. Die VSG-Level scheinen unabhängig vom genomischen Kontext zusätzlich in trans basierend auf der VSG 3'UTR reguliert zu werden, was durch die Regulation eines konstitutiv exprimierten Reporters mit VSG 3'UTR nach VSG-Überexpression bekräftigt wurde. KW - Trypanosoma brucei KW - Genexpression KW - Entwicklung KW - Parasit KW - VSG KW - antigenic variation KW - monoallelic expression KW - stumpy development KW - differentiation Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-146902 ER - TY - THES A1 - Bruder, Jessica T1 - Antigenerkennung bei autoaggressiven Lymphozyten T1 - Antigen recognition of autoaggressive lymphocytes N2 - Millionen Menschen weltweit leiden an den verschiedensten Autoimmunerkrankungen. Diese Krankheiten entstehen, wenn das Immunsystem gesundes körpereigenes Gewebe angreift und zerstört. An der Pathogenese sind sowohl Komponenten des angeborenen Immunsystems als auch Bestandteile des adaptiven Immunsystems, wie Lymphozyten und Antikörper, beteiligt. Da die Ursachen und molekularen Mechanismen der Pathogenese dieser Erkrankungen bis heute weitgehend unbekannt sind, wurden in dieser Arbeit autoaggressive Lymphozyten bei den humanen Autoimmunerkrankungen Polymyositis und Multiple Sklerose näher untersucht. Die Polymyositis ist eine chronisch entzündliche Erkrankung der Skelettmuskulatur. Die Muskelfasern werden dabei von zytotoxischen CD8+ gd-T-Lymphozyten infiltriert, attackiert und schließlich zerstört. In einem seltenen Fall der Polymyositis wurden die Muskelzellen hingegen in ähnlicher Weise von CD8- gd-T-Lymphozyten angegriffen. Die gd-T-Lymphozyten waren monoklonal expandiert und ihr Rezeptor, im Folgenden als M88 bezeichnet, wurde als Vg1.3+Vd2+ identifiziert. Frühere Untersuchungen der Antigenspezifität dieser Zellen zeigten, dass M88 mehrere funktionell und strukturell verschiedene Proteine aus unterschiedlichen Spezies erkennt. Die Bindung erfolgt spezifisch durch die Antigenerkennungsregionen beider Rezeptorketten von M88. In dieser Arbeit wurden verschiedene bakterielle und humane Proteine des Translationsapparates als Antigene von M88 identifiziert. Weitere ausführliche Untersuchungen eines paradigmatischen bakteriellen Antigens, dem Translationsinitiationsfaktor EcIF1, zeigten, dass M88 an Oberflächen-exponierte Konformationsepitope von Proteinen bindet. Interessanterweise erkennt M88 mehrere humane Aminoacyl-tRNA-Synthetasen, Antigene, die in anderen Formen der Myositis von Autoantikörpern angegriffen werden. Diese Beobachtung ergibt eine bemerkenswerte Verbindung zwischen T-Zell- und Antikörper-vermittelten B-Zell-Antworten bei der autoimmunen Myositis. Bei der Multiplen Sklerose ist das zentrale Nervensystem betroffen. Autoaggressive Lymphozyten greifen die Myelinschicht der Nervenzellen im Gehirn und Rückenmark an und zerstören sie. Im Liquor cerebrospinalis von Patienten lassen sich klonal expandierte und affinitätsgereifte B-Zellen sowie „oligoklonale Banden“ (OKB) Antikörper nachweisen. Obwohl diese Merkmale auf eine Antigen-induzierte Immunantwort hindeuten, sind die zugrundeliegenden Antigene und die Rolle der OKB bei der Pathogenese bis heute unbekannt. In dieser Arbeit wurde die Antigenspezifität von fünf IgG OKB-Antikörpern aus drei Patienten untersucht. Durch verschiedene proteinbiochemische Methoden konnten intrazelluläre Kandidatenantigene identifiziert werden. Interessanterweise sind darunter mehrere nukleäre Proteine, die an der Transkriptionsregulation oder der RNA-Prozessierung beteiligt sind. Reaktivitäten gegen intrazelluläre Antigene treten auch bei anderen Autoimmunerkrankungen, wie beispielsweise dem systemischen Lupus erythematodes, auf. Diese Ergebnisse könnten auf einen allgemeinen Mechanismus der Entstehung und Funktion von Autoantikörpern bei diesen humanen Autoimmunerkrankungen hindeuten. N2 - Millions of people worldwide suffer from various autoimmune diseases. These disorders occur if the immune system reacts to and destroys healthy body tissue. Pathogenesis is mediated by components of the innate immune system as well as by constituents of the adaptive immune system, like lymphocytes and antibodies. However, the origin and molecular mechanisms of these diseases remain still largely unknown. Therefore we investigated the role of autoaggressive lymphocytes in the human autoimmune diseases polymyositis and multiple sclerosis. Polymyositis is a chronically inflammatory disease of the skeletal muscles. Cytotoxic CD8+ gd-T lymphocytes invade, attack and finally destroy muscle fibers. However, in a rare variant of polymyositis, muscle fibers are similarly attacked by CD8- gd-T lymphocytes. These gd-T lymphocytes were monoclonally expanded and their receptor, termed M88, was identified as Vg1.3+Vd2+. Previous investigations of the antigen specificity of these cells revealed that M88 recognizes several structurally and functionally different proteins from various species. This recognition is specifically mediated by the antigen recognition sites of both receptor chains of M88. In this work we have identified different bacterial and human proteins of the translation apparatus as antigens of M88. Further detailed investigations of one paradigmatic bacterial antigen, the translation initiation factor EcIF1, have shown that M88 binds to surface-exposed conformational protein epitopes. Interestingly, M88 recognizes several human aminoacyl-tRNA-synthetases. These antigens have been described to be also targeted by autoantibodies in other forms of myositis. This observation reveals a remarkable link between T cell and antibody-mediated B cell responses in autoimmune myositis. In multiple sclerosis the central nervous system is affected. Autoaggressive lymphocytes attack and destroy the myelin sheet of nerve cells of the brain and spinal cord. In the cerebrospinal fluid of these patients clonally expanded and affinity-maturated B cells as well as „oligoclonal band“ (OCB) antibodies can be detected. Although these features indicate an antigen-induced immune response, the underlying antigens and the role of the OCB antibodies in the pathogenesis are still unknown. In this work we describe the antigen specificity of five IgG OCB antibodies from three patients. Through various biochemical methods we have identified intracellular candidate antigens. Interestingly, these include several nuclear proteins involved in transcription regulation and RNA processing. Reactivity against intracellular antigens also occurs in other autoimmune diseases such as systemic lupus erythematosus. These findings suggest a general mechanism for the generation and function of autoantibodies in these human autoimmune diseases. KW - Multiple Sklerose KW - gamma-delta T-Lymphozyten KW - Polymyositis KW - B-Lymphozyten KW - Antikörper KW - Multiple Sklerose KW - gamma-delta T-lymphocytes KW - polymyositis KW - B-lymphocytes KW - antibodies KW - Multiple Sclerosis KW - Polymyositis KW - Lymphozyt KW - Antikörper Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73342 ER - TY - THES A1 - Azzami, Klara T1 - Antibakterielle und antivirale Abwehrreaktionen in unterschiedlichen Entwicklungsstadien der Honigbiene (Apis mellifera) T1 - Antibacterial and antiviral defence reactions in different developmental stages of the honey bee (Apis mellifera) N2 - Das angeborene Immunsystem von Insekten besteht aus einer humoralen Komponente, einer zellulären Komponente und dem Prophenoloxidase-aktivierenden System. Fast alle Erkenntnisse über das angeborene Immunsystem stammen von Arbeiten mit Modellorganismen wie z.B. Drosophila oder Anopheles gambiae. Wie genau das Immunsystem der Honigbiene (Apis mellifera) funktioniert, ist jedoch noch relativ unbekannt. In der vorliegenden Arbeit wurden die unterschiedlichen Immunreaktionen aller drei Entwicklungsstadien der Honigbiene nach artifizieller Infektion mit Gram-negativen und Gram-positiven Bakterien (Escherichia coli und Micrococcus flavus) und dem Akuten Bienen Paralyse Virus (ABPV) untersucht und verglichen. Eine E. coli-Injektion zeigt bei Larven und adulten Arbeiterinnen nur wenig Auswirkung auf das äußere Erscheinungsbild und die Überlebensrate. In beiden Entwicklungsstadien wird die humorale Immunantwort stark induziert, erkennbar an der Expression der antimikrobiellen Peptide (AMPs) Hymenoptaecin, Defensin1 und Abaecin. Zusätzlich werden allein in Jungbienen nach bakterieller Infektion vier weitere immunspezifische Proteine exprimiert. Unter anderem eine Carboxylesterase (CE1) und das Immune-Responsive Protein 30 (IRp30). Die Expression von CE1 und IRp30 zeigt dabei den gleichen zeitlichen Verlauf wie die der AMPs. In Jungbienen kommt es zudem nach E. coli-Injektion zu einer raschen Abnahme an lebenden Bakterien in der Hämolymphe, was auf eine Aktivierung der zellulären Immunantwort schließen lässt. Ältere Bienen und Winterbienen zeigen eine stärkere Immunkompetenz als Jungbienen. Selbst nicht-infizierte Winterbienen exprimieren geringe Mengen der immunspezifischen Proteine IRp30 und CE1. Die Expression von IRp30 kann dabei durch Verwundung oder Injektion von E. coli noch gesteigert werden. Eine weitere Besonderheit ist die im Vergleich zu Jungbienen raschere Abnahme an lebenden Bakterien in der Hämolymphe bis hin zur vollständigen Eliminierung. Die Reaktion von Puppen auf eine bakterielle Infektion war völlig unerwartet. Nach Injektion von E. coli-Zellen kommt es innerhalb von 24 h p.i. zu einem tödlichen Kollaps, der sich in einer Graufärbung des gesamten Puppenkörpers äußert. Da keine Expression von AMPs nachzuweisen war, wird die humorale Immunantwort offensichtlich nicht induziert. Auch die zelluläre Immunantwort scheint nicht aktiviert zu werden, denn es konnte keine Abnahme an lebenden E. coli-Zellen beobachtet werden. Aufgrund dieser fehlenden Immunreaktionen vermehrt sich E. coli im Hämocoel infizierter Puppen und scheint damit deren Tod herbeizuführen. Nach viraler Infektion wurden in allen drei Entwicklungsstadien der Honigbiene gänzlich andere Reaktionen beobachtet als nach bakterieller Infektion. Bei dem verwendeten Akuten Bienen Paralyse Virus (ABPV) handelt es sich um ein Picorna-ähnliches Virus, dessen Vermehrung in der Hämolymphe über die massive Synthese der Capsidproteine verfolgt werden kann. Eine Injektion von sehr wenigen ABPV-Partikeln ins Hämocoel hat dramatische Auswirkungen auf Larven. Nach Virusinjektion kommt es innerhalb weniger Stunden zu einer raschen Virusvermehrung und schon 24 h p.i. zum Tod, häufig begleitet von einer Schwarzfärbung der gesamten Larve. Kurz vor dem Ableben kommt es neben dem Abbau hochmolekularer Speicherproteine zur Expression zahlreicher Proteine, die u.a. an der Translation oder dem Schutz vor oxidativem Stress beteiligt sind. Auf Jungbienen hat eine ABPV-Infektion keine so dramatischen Auswirkungen wie auf Larven. Sie zeigen lediglich Zeichen von Paralyse, zudem überleben sie länger bei höheren injizierten Partikelzahlen, die Virusvermehrung ist langsamer und es kommt zu keiner starken Veränderung des Hämolymph-Proteinmusters. Es konnte gezeigt werden, dass es in ABPV-infizierten Larven oder adulten Bienen zu keiner erkennbaren Aktivierung des humoralen Immunsystems in Form von exprimierten AMPs kommt. Zudem scheint die humorale Immunantwort auch nicht unterdrückt zu werden, denn nach gleichzeitiger Injektion von E. coli und ABPV kommt es neben der Expression viraler Capsidproteine auch zur Expression von AMPs. Zusätzlich konnte in Jungbienen nach Infektion mit ABPV eine zelluläre Immunantwort in Form von Nodulation ausgeschlossen werden. Ältere Bienen scheinen nicht nur mit bakteriellen Infektionen, sondern auch mit einer ABPV-Infektion besser zurechtzukommen. Bei einer Menge an ABPV-Partikeln, die in Jungbienen spätestens 72 h p.i. zum Tod führt, ist in Winterbienen eine Virusvermehrung erst ab 96 h p.i. erkennbar und diese beeinträchtigt die Überlebensrate kaum. Puppen sind einer Virusinfektion genauso schutzlos ausgeliefert wie einer Bakterieninfektion. Es kommt zwar zu keiner starken Änderung des äußeren Erscheinungsbildes, jedoch bleiben Puppen in ihrer Entwicklung komplett stehen. Das Virus muss sich daher stark vermehren, allerdings nicht überwiegend - wie bei Larven und adulten Bienen - in der Hämolymphe. N2 - The innate immune system of insects comprises of a humoral component, a cellular component and the prophenoloxidase-activating system. Almost all knowledge about the innate immune system derives from model organisms like Drosophila or Anopheles gambiae. The exact mechanisms of the innate immune system of the honey bee (Apis mellifera) have yet to be discovered. This work investigates and compares the immune reactions of all three developmental stages of the honey bee after artificial infection with Gram-negative (Escherichia coli) and the Acute bee paralysis virus (ABPV). After injection of E. coli neither a change in the outer appearance nor a significant reduction of the survival rate of larvae or adult worker bees can be observed. In both developmental stages, a strong induction of the humoral immune response visible by the expression of the antimicrobial peptides (AMPs) hymenoptaecin, defensin1 and abaecin occurs. However, bacterial challenge of young adult worker bees leads to the expression of additional immune-specific proteins: a carboxylesterase (CE1) and the immune-responsive protein (IRp30). The expressions of CE1 and IRp30 show the same time course as the expression of AMPs. Furthermore, after injection of E. coli-cells into the haemocoel of young adult worker bees a fast decrease of living bacteria in the haemolymph could be observed. Older bees show a stronger immune competence in many ways. In winter bees even non-infected individuals express constitutively low amounts of the immune-responsive proteins IRp30 and CE1. The expression of IRp30 can still be enhanced by wounding or injection of E. coli. Moreover, older bees display a drastic reduction of living bacteria in the haemolymph as compared to young adult worker bees resulting in an almost complete elimination. Pupae in contrast react surprisingly different to a bacterial challenge. Injection of living E. coli-cells leads to a deadly collapse within 24 h p.i. accompanied by a colour change of the whole pupal body from white to grey. Since no visible expression of AMPs could be detected, the humoral immune response obviously was not induced. The same appears to be true for the cellular immune response, as no decrease in living E. coli-cells was observed upon infection. Because of this lack of humoral and cellular immune reactions, E. coli can proliferate in the haemocoel of infected pupae and potentially cause their death. All three developmental stages of the honey bee show completely different reactions to a viral infection than to a bacterial challenge. The Acute bee paralysis virus (ABPV) used in this study is a picorna-like virus with a positive, single-stranded RNA-genome and a non-enveloped protein capsid. Its proliferation in the haemocoel can be monitored by a massive synthesis of capsid proteins in the haemolymph. In contrast to a bacterial challenge, injection of only a few ABPV-particles into the haemocoel has tremendous effects on larvae. Injection of viral particles leads to a strong viral multiplication within hours and to death 24 h p.i. often accompanied by a colour change of the whole larva from pale-white to black. In addition to a visible degradation of high-molecular storage proteins shortly before the larvae die, the expression of proteins involved in translation or protection against oxidative stress can be observed. Young adult worker bees do not show such a tremendous reaction as larvae to a viral infection. They just display signs of paralysis. In contrast to larvae, young adult worker bees show better survival rates for higher numbers of injected virus-particles, the viral multiplication proceeds slower and there is no strong visible change of the haemolymph protein pattern. It could be demonstrated that no expression of AMPs and therefore no detectable activation of the humoral immune system by the virus occurs. But the humoral immune reponse also does not seem to be suppressed, since a simultaneous injection of E. coli and ABPV leads to the expression of viral capsid proteins in concert with the expression of AMPs. Additionally, nodulation, a prominent cellular immune response of young adult worker bees to bacterial infection, is likewise not initiated by ABPV-infection. Older bees apparently are not only capable of better fighting a bacterial infection, but also in surviving an ABPV-infection. Injection of an amount of viral particles leading to death of young adult worker bees within 72 h p.i., only leads to just detectable amounts of virus in winter bees 96 h p.i.. At the same time, the survival rate is not more impaired than after E. coli-injection. Pupae are as susceptible to a viral infection as to bacterial challenge. Although there is no strong visible change in the outer appearance, the pupaes’ development ceases within 3 d p.i.. This is possibly due to a strong multiplication of the virus, but obviously not mainly in the haemolymph, as it can be observed in larvae and adult bees as well. KW - Biene KW - Akute Paralyse KW - Immunsystem KW - Akutes Bienen Paralyse Virus KW - angeborenes Immunsystem KW - honey bee KW - Acute bee paralysis virus KW - innate immune system Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-66452 ER - TY - THES A1 - Dinev, Dragomir T1 - Analysis of the role of extracellular signal regulated kinase (ERK5) in the differentiation of muscle cells T1 - Analyse der Rolle der extrazellulären signalregulierten Kinase (ERK5) in der Differenzierung von Muskelzellen N2 - The MEK5/ ERK5 kinase module is a relatively new discovered mitogen-activated protein kinase (MAPK) signalling pathway with a poorly defined physiological function. Since ERK5 and its upstream activator MEK5 are abundant in skeletal muscle a function of the cascade during muscle differentiation was examined. ERK5 becomes activated upon induction of differentiation in mouse myoblasts. The selective activation of the pathway results in promoter activation of differentiation-specific genes, such as the cdk-inhibitor p21 gene, the myosin light chain (MLC1A) gene, or an E-box containing promoter element, where myogenic basic-helix-loop-helix proteins such as MyoD or myogenin bind. Moreover, myogenic differentiation is completely blocked, when ERK5 expression is inhibited by antisense RNA. The effect can be detected also on the expression level of myogenic determination and differentiation markers such as p21, MyoD and myogenin. Another new finding is that stable expression of ERK5 in C2C12 leads to differentiation like phenotype and to increased p21 expression levels under growth conditions. These results provide first evidence that the MEK5/ERK5 MAP kinase cascade is critical for early steps of muscle cell differentiation. N2 - MEK5/ ERK5 ist ein erst kürzlich entdeckter MAPK- Signalweg, dessen physiologische Funktion noch wenig verstanden ist. Da ERK5 und der in der Kaskade oberhalb liegende Aktivator MEK5 in Skelettmuskeln hoch expremiert werden, wurde eine Funktion der Kaskade während des Muskel-Differenzierung untersucht. ERK5 wird nach einer Induktion der Differenzierung in Maus-Myoblasten aktiviert. Die gezielte Aktivierung dieses Signalwegs führt zur Induzierung von Promotoren differenzierungs-spezifischer Gene, wie z.B. des cdk-Inhibitors p21, der MLC1A, oder eines Promotors, der E-Boxen enthält, woran myogene Basische-Helix- loop- Helix Proteine, wie MyoD oder Myogenin binden können. Darüber hinaus ist die Muskeldifferenzierung völlig blockiert, wenn die Expression von ERK5 mittels antisense-RNA inhibiert wird. Diesen Effekt kann man auch an hand der Menge von exprimierten muskelspezifischen Differenzierungsproteinen, wie p21, MyoD und Myogenin nachweisen. Eine weitere neue Entdeckung ist, daß stabile Expression von ERK5 in C2C12 Zellen zu einem differenzierungsähnlichen Phänotyp und gesteigerter p21 Expression unter Wachstum-bedingungen führt. Diese Ergebnisse geben erste Anhaltspunkte, daß der MEK5/ ERK5 MAP Kinase Signalweg entscheidend für frühe Stadien der Muskeldifferenzierung ist. KW - Muskelzelle KW - Zelldifferenzierung KW - Signaltransduktion KW - Proteinkinasen KW - ERK5 KW - MEK5 KW - MEF2C KW - MyoD KW - Muskeldifferenzierung KW - Kinase KW - ERK5 KW - MEK5 KW - MEF2C KW - MyoD KW - muscle differentiation KW - kinase Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1180481 ER - TY - THES A1 - Fernández-Mora, Eugenia T1 - Analysis of the maturation of Rhodococcus equi-containing vacuoles in macrophages T1 - Analyse der Reifung von Rhodococcus equi-enthaltenden Phagosomen in Makrophagen N2 - Rhodococcus equi is a Gram-positive intracellular pathogen which can cause severe bronchopneumonia in foals. In recent years, the role of this bacterium as human pathogen has been noted, as R.equi infections in humans have increase in frequency. This increase is associated with the rise in immunosupressed individuals, specially AIDS patients, where infection leads to symptoms and pathology similar to those seen in foals with a high mortality rate. Due to its capability to survive and multiply in murine and equine macrophages, R.equi has been classified as a facultative intracellular bacterium. R.equi is found frequently in macrophages in alveolar infiltrate from infected animals. The pathogenicity of R.equi depends on its ability to exist and multiply inside macrophages and has been associated with the presence of virulence plasmids. It has been observed that, inside foal alveolar macrophages, R.equi-containing vacuoles (RCVs) do not mature into phagolysosomes. However, most of the intracellular events during R.equi infection have not been investigated in detail. The aim of this study was to elucidate the intracellular compartmentation of R.equi and the mechanism by which the bacteria avoid destruction in host macrophages. The importance of the virulence-associated plasmids of R.equi for the establishment of RCVs was also evaluated. Furthermore, the intracellular fate of viable and non-viable R.equi was compared in order to study whether viability of R.equi influeciantes the establishment of RCVs. In this study, the RCV was characterized by using a variety of endocytic markers to follow the path of the bacteria trhough murine macropages. Transmission electron microscopy-base analysis showed that R.equi was found equally frequently in phagosomes with loosely or thightly apposed membranes, and RCV often contains numerous membranous vesicles. Laser scanning microscopy of infected macrophages showed that the majority of phagosomes containing R.equi acquired transiently the early endosomal markers Rab5, Ptlns3P, and EEA-1, suggesting initially undisturbed phagosome maturation. Although the RCV acquired some late endosomal markers, such as Rab7, LAMP-1, and Lamp-2, they did not acquired vATPase, did not interact with pre-labeled lysosomes, and failed to acidify. These data clearly suggest that the RCV is a compartment which has left vacuoles that resemble multivesicular body compartments (MVB), which are transport intermediates between early and late endosomes and display internal vesicles very similar to the ones observed within RCVs. Analyisis of several R.equi strains containing either VapA- or VapB-expressing plasmids or neither demonstrated that the possession of the virulence-associated plasmids does not affect phagosome trafficking over a two hour period of infection. The finding that non-viable R.equi was still able to inhibit phagosome maturation (although not to the same extent as viable R.equi did) suggests that heat-insensitive factors, such as cell periphery lipids, may play a major role in inhibition of phagosome maturation, although heat-sensitive factors may also be involved. N2 - Rhodococcus equi ist ein Gram-positives, fakultativ intrazelulläres Bakterium, das unter anderem die Ursache von Bronchopneumonien bei Fohlen ist. Menschen und andere Säugetiere können ebenfalls von Infektionen mit R. equi betroffen sein. In den letzten Jahren ist die Häufigkeit klinischer Infektionen mit R. equi bei Menschen gestiegen. Die wachsende Anzahl an mmunosupprimierten Patienten (hauptsächlich AIDS-Patienten) liegt dieser Zunahme an Infektionen zugrunde. Die Symptomatologie und Pathologie der Infektion mit R. equi ist bei AIDS-Patienten und Fohlen ähnlich. Die Sterblichkeitsrate ist in beiden Fällen hoch. Die Fähigkeit der Rhodokokken, innerhalb von Makrophagen zu überleben und sich zu vermehren, ist mit dem Vorhandensein von Virulenzplasmiden (virulence-associated plasmids) verbunden. Innerhalb des Makrophagen befinden sich die Rhodokokken in einem Phagosom, das nicht mit Lysosomen fusioniert. Die genaue Kompartimentierung der Rhodococcus equi-enthaltenden Phagosomen in Makrophagen war bisher unbekannt und wurde deshalb in der vorliegenden Promotionsarbeit untersucht. Mit Hilfe mehrerer endozytischer Marker wurde das R. equi-enthaltende Kompartiment charakterisiert. Mögliche Unterschiede zwischen der Kompartimentierung von R. equi(+)- und R. equi(-)-enthaltenden Phagosomen ist ebenfalls Thema dieser Promotionsarbeit. Weiterhin wurde die Etablierung des phagosomalen Kompartiments für jeweils lebende und tote Rhodokokken verglichen. Transmissionselektronenmikroskopische Analysen haben gezeigt, dass die Phagosomenmembran Rhodococcus equi-enthaltender Phagosomen sowohl locker als auch eng anliegend sein kann (50%). Darüber hinaus wurden häufig zahlreiche, membranöse Vesikel in R. equi-enthaltenden Phagosomen gefunden. Diese Phagosomen zeigen somit Ähnlichkeiten zu Multivesicular Bodies. Multivesicular Bodies sind intermediäre Kompartimente zwischen frühen und späten Endosomen und zeigen ebenfalls eine Vielzahl von internen Vesikeln. Untersuchungen am konfokalen Lasermikroskop ergaben, dass die Mehrheit der R. equi-enthaltenden Phagosomen die früh endosomalen Marker Rab5, PtIns3P und EEA-1 transient akquirieren. Dieser Befund deutet auf eine ungestörte phagosomale Reifung im frühen Stadium hin. Trotz der beobachteten Akquisition der spät endosomalen Marker Rab7, LAMP-1 und LAMP-2 konnte keine Akquisition der vATPase, keine Interaktion mit vormarkierten Lysosomen und keine Ansäuerung von R.equi-enthaltenden Phagosomen nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass R. equi-enthaltende Phagosomen das früh endosomale Stadium abschließen, aber einen typisch spät endosomale Zustand nicht erreichen. Die Analyse unterschiedlicher R. equi-Stämme, die entweder vapA- oder vapB-exprimierende Virulenzplasmide enthalten, hat gezeigt, dass die Anwesenheit von Virulenzplasmiden die phagosomale Reifung über eine Infektionsperiode von zwei Stunden nicht beeinflusst. Getötete Rhodokokken waren in der Lage, die phagosomale Reifung zu inhibieren, aber in geringerem Ausmaß als lebende Rhodokokken. Das weist darauf hin, dass hitze-insensitive Faktoren (wie zum Beispiel Lipide der Zellwand) zur Inhibierung der phagosomalen Reifung entscheidend sind, obwohl dazu auch hitze-sensitive Faktoren (wie Proteine) relevant sein können. KW - Rhodococcus equi KW - Makrophage KW - Vakuole KW - Endosome KW - Phagosome KW - Rhodococcus KW - Mycobacterium KW - Reifung KW - endosome KW - phagosome KW - Rhodococcus KW - Mycobacterium KW - maturation Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-14049 ER - TY - THES A1 - Schuster, Sarah T1 - Analysis of \(Trypanosoma\) \(brucei\) motility and the infection process in the tsetse fly vector T1 - Analyse der Motilität von \(Trypanosoma\) \(brucei\) und dem Infektionsprozess in der Tsetsefliege N2 - African trypanosomes are protist pathogens that are infective for a wide spectrum of mammalian hosts. Motility has been shown to be essential for their survival and represents an important virulence factor. Trypanosoma brucei is transmitted by the bite of the bloodsucking tsetse fly, the only vector for these parasites. The voyage through the fly is complex and requires several migration, proliferation and differentiation steps, which take place in a defined order and in specific fly tissues. The first part of this doctoral thesis deals with the establishment of the trypanosome tsetse system as a new model for microswimmer analysis. There is an increasing interdisciplinary interest in microbial motility, but a lack of accessible model systems. Therefore, this work introduces the first enclosed in vivo host parasite system that is suitable for analysis of diverse microswimmer types in specific microenvironments. Several methods were used and adapted to gain unprecedented insights into trypanosome motion, the fly´s interior architecture and the physical interaction between host and parasite. This work provides a detailed overview on trypanosome motile behavior as a function of development in diverse host surroundings. In additional, the potential use of artificial environments is shown. This can be used to partly abstract the complex fly architecture and analyze trypanosome motion in defined nature inspired geometries. In the second part of the thesis, the infection of the tsetse fly is under investigation. Two different trypanosome forms exist in the blood: proliferative slender cells and cell cycle arrested stumpy cells. Previous literature states that stumpy cells are pre adapted to survive inside the fly, whereas slender cells die shortly after ingestion. However, infection experiments in our laboratory showed that slender cells were also potentially infective. During this work, infections were set up so as to minimize the possibility of stumpy cells being ingested, corroborating the observation that slender cells are able to infect flies. Using live cell microscopy and fluorescent reporter cell lines, a comparative analysis of the early development following infection with either slender or stumpy cells was performed. The experiments showed, for the first time, the survival of slender trypanosomes and their direct differentiation to the procyclic midgut stage, contradicting the current view in the field of research. Therefore, we can shift perspectives in trypanosome biology by proposing a revised life cycle model of T. brucei, where both bloodstream stages are infective for the vector. N2 - Afrikanische Trypanosomen sind pathogene Protisten, die ein breites Spektrum von Säugetierwirten infizieren. Es wurde gezeigt, dass die Zellmotilität für das Überleben der Parasiten essenziell ist und einen wichtigen Virulenzfaktor darstellt. Trypanosoma brucei wird durch den Biss der blutsaugenden Tsetsefliege übertragen, dem einzigen Vektor für diese Parasiten. Der Entwicklungszyklus in der Fliege ist komplex und beinhaltet mehrere Migrations-, Proliferations- und Differenzierungsschritte, die in einer definierten Reihenfolge und in spezifischen Fliegenorganen stattfinden. Der erste Teil dieser Doktorarbeit beschäftigt sich mit der Etablierung des Trypanosomen Tsetse Systems als ein neues Modell für Motilitätsanalysen. Es besteht ein wachsendes interdisziplinäres Interesse an mikrobieller Motilität, aber es fehlen zugängliche Mikroschwimmersysteme. Deswegen stellt diese Arbeit das erste abgeschlossene in vivo Wirt Parasit System vor, das für Analysen von verschiedenen Mikroschwimmertypen in spezifischen Umgebungen geeignet ist. Verschiedene Methoden wurden benutzt und adaptiert, um sowohl Einblicke in die Trypanosomenbewegung, die innere Fliegenarchitektur als auch die physikalischen Wechselwirkungen zwischen Wirt und Parasit zu erhalten. Diese Arbeit bietet einen detaillierten Überblick über das motile Verhalten von Trypanosomen als Funktion der Entwicklung in diversen Wirtsumgebungen. Zusätzlich ist die potenzielle Nutzung von artifiziellen Umgebungen gezeigt. Diese können benutzt werden, um die komplexe Architektur der Fliege teilweise zu abstrahieren und die Trypanosomenbewegung in definierten und von der Nature inspirierten Geometrien zu analysieren. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Infektion der Fliege genauer betrachtet. Im Blut existieren zwei verschiedene Trypanosomenformen: proliferierende ‘slender’ und Zellzyklus arretierte ‘stumpy’ Zellen. Bisherige Literatur besagt, dass stumpy Zellen präadaptiert sind, um in der Fliege zu überleben, wohingegen slender Zellen kurz nach der Aufnahme sterben. Dennoch konnten Infektionsexperimente in unserem Labor zeigen, dass auch slender Zellen potenziell infektiös sind. Während dieser Arbeit wurden weitere Infektionen so durchgeführt, dass die Möglichkeit für die Aufnahme von stumpy Zellen minimiert wurde und die Infektionskapazität der slender Zellen bestätigt werden konnte. Durch Lebendzell Mikroskopie mit fluoreszenten Reporterzelllinien wurde eine vergleichende Analyse für die frühe Entwicklung von slender und stumpy Parasiten nach der Infektion durchgeführt. Die Experimente zeigten zum ersten Mal das Überleben von slender Trypanosomen in der Tsetsefliege und ihre direkte Differenzierung in das prozyklische Mitteldarmstadium. Sie widersprechen demnach der aktuellen Auffassung im Forschungsbereich. Demzufolge können wir von einem Perspektivwechsel in der Trypanosomenbiologie sprechen und schlagen einen revidierten Lebenszyklus für T. brucei vor, in dem beide Blutstromformen für den Vektor infektiös sind. KW - Motilität KW - Trypanosomen KW - Tsetsefliege KW - Parasit KW - tsetse fly KW - motility KW - trypanosome KW - vector-parasite interaction KW - microswimming Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-192691 ER - TY - THES A1 - Wawrowsky, Kolja Alexander T1 - Analysis and Visualization in Multidimensional Microscopy T1 - Analyse und Visualisierung in der multidimensionalen Mikroskopie N2 - The live sciences currently undergo a paradigm shift to computer aided discoveries. Discoveries in the live sciences were historically made by either direct observation or as a result of chemical assays. Today we see a growing shift toward computer aided analysis and visualization. This gradual process happens in microscopy. Multidimensional laser scanning microscopy can acquire very complex multichannel data from fixed or live specimen. New probes such as visible fluorescent proteins let us observe the expression of genes and track protein localization. Ion sensitive dyes change intensity with the concentration of ions in the cell. The laser scanning confocal allows us to record these processes in three dimensions over time. This work demonstrates the application of software analysis to multidimensional microscopy data. We introduce methods for volume investigation, ion flux analysis and molecular modeling. The visualization methods are based on a multidimensional data model to accommodate complex datasets. The software uses vector processing and multiple processors to accelerate volume rendering and achieve interactive rendering. The algorithms are based on human visual perception and allow the observer a wide range of mixed render modes. The software was used to reconstruct the pituitary development in zebrafish and observe the degeneration of neurons after injury in a mouse model. Calicum indicator dyes have long been used to study calcium fluxes. We optimized the imaging method to minimize impact on the cell. Live cells were imaged continuously for 45 minutes and subjected to increasing does of a drug. We correlated the amplitude of calcium oscillations to increasing doses of a drug and obtain single cell dose response curves. Because this method is very sensitive and measures single cell responses it has potential in drug discovery and characterization. Microtubules form a dynamic cytoskeleton, which is responsible for cell shape, intracellular transport and has an integral role in mitosis. A hallmark of microtubule organization is lateral interactions. Microtubules are bundles by proteins into dense structures. To estimate the contribution of this bundling process, we created a fractal model of microtubule organization. This model demonstrates that morphology of complex microtubule arrays can be explained by bundling alone. In summary we showed that advances in software for visualization, data analysis and modeling lead to new discoveries. N2 - Die biologische Forschung befindet sich in einem Paradigmenwandel, in dem Endeckungen immer mehr von Computeranalyse ermöglicht werden. Entdeckungen in der biologischen Forschung wurden historisch gesehen durch direkte Beobachtung and mit Hilfe chemischer Analysemethoden gemacht. Heute sehen wir einen wachsenden Trend zur computerunterstützten Analyse und Visualisierung. Dieser graduelle Umschwung spielt sich auch in der Mikroskopie ab. Multidimensionale Laser Scanning Mikroskopie kann sehr komplexe Multikanalbilder von fixierten oder lebenden Präparaten aufnehmen. Neue Methoden (wie z.B. fluoreszierende Proteine) erlauben es, Genexpression und Proteinlokalisierung direkt sichtbar zu machen. Ionensensitive Farbstoffe ändern ihre Helligkeit mit der Konzentration der Ionen in der Zelle. Die konfokale Mikroskopie erlaubt es, diese Änderungen dreidimensional über die Zeit aufzunehmen. Die hier vorgestellte Arbeit demonstriert die Anwendung speziell entwickelter Software für die Analyse multidimensionaler Daten. Die hierbei entwickelten Methoden wurden für Volumendarstellung, Ionenfluxanalyse und zur molekularen Modellierung eingesetzt. Die Visualisierungsmethoden basieren auf einem multidimensionalen Datenmodel, um auch komplexe Daten verarbeiten zu können. Die Software benutzt Vektorverarbeitung und Multiprozessorunterstützung um Volumendarstellung schneller und interaktiv zu machen. Die Algorithmen beruhen auf Erkenntnissen der Wahrnehmungsforschung und erlauben es dem Anwender, eine Reihe von verschiedenen Darstellungsmodi zu kombinieren. Die Software wurde erstmals verwendet, um einerseits die Entwicklung der Hypophyse im Zebrafisch zu rekonstruieren, und andererseits die Degenerierung von Neuronen im Mausmodell bildlich zu verfolgen. Kalziumfarbstoffe wurden schon länger zum Studium von Kalziumoszillationen in Zellen eingesetzt. Wir optimierten die Bildaufnahmemethode um Schädigungen der Zelle zu minimieren. Zellen wurden kontinuierlich in 45 Minuten Zeitintervallen aufgenommen und dabei wachsenden Dosen der zu untersuchenden Substanz ausgesetzt. Durch Korrelation von Dosis und Oszillationsamplitude konnten pharmakologische Wirkungskurven für jede einzelne Zelle ermittelt werden. Diese Methode hat wegen der hohen Sensitivität und Auflösung bis zur einzelnen Zelle Potential für pharmakologische Untersuchungen. Mikrotubuli formen ein dynamisches Zytoskelett, das für Zellform und intrazellularen Transport zuständig ist und eine integrale Rolle bei der Mitose spielt. Eine besondere Eigenschaft der Mikrotubuli ist die laterale Interaktion. Mikrotubuli werden von Motorproteinen zu dichten Strukturen gebündelt. Um den möglichen Einfluß dieses Vorgangs auf die Organisation der Mikotubuli zu testen, wurde ein fraktales Model erstellt. Dieses Modell demonstriert, daß die komplexe Organisation der Mikrotubuli in einigen Fällen allein mit dem Bündelungsprozess erklärt werden kann. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit demonstriert werden, daß der Einsatz speziell entwickelter Software für Visualisierung, Datenanalyse und Modellierung zu neuen wissenschaftlichen Erkenntnissen führen kann. KW - Konfokale Mikroskopie KW - Laser-Rastermikroskopie KW - Leica-Mikroskopie und -Systeme GmbH KW - Mikroskopie KW - Visualisierung KW - Bildverarbeitung KW - Mikrotubuli KW - Visualization KW - Image Processing KW - Microtubules Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-23867 ER - TY - THES A1 - Kaltdorf, Martin Ernst T1 - Analyse von regulatorischen Netzwerken bei Zelldifferenzierung und in der Infektionsbiologie T1 - Analysis of Regulatory Networks during Cell Differentiation and in Infection Biology N2 - Das zentrale Paradigma der Systembiologie zielt auf ein möglichst umfassendes Ver-ständnis der komplexen Zusammenhänge biologischer Systeme. Die in dieser Arbeit angewandten Methoden folgen diesem Grundsatz. Am Beispiel von drei auf Basis von Datenbanken und aktueller Literatur rekonstruier-ten Netzwerkmodellen konnte in der hier vorliegenden Arbeit die Gültigkeit analyti-scher und prädiktiver Algorithmen nachgewiesen werden, die in Form der Analy-sesoftware Jimena angewandt wurden. Die daraus resultierenden Ergebnisse sowohl für die Berechnung von stabilen Systemzuständen, der dynamischen Simulation, als auch der Identifikation zentraler Kontrollknoten konnten experimentell validiert wer-den. Die Ergebnisse wurden in einem iterativen Prozess verwendet werden um das entsprechende Netzwerkmodell zu optimieren. Beim Vergleich des Verhaltens des semiquantitativ ausgewerteten regulatorischen Netzwerks zur Kontrolle der Differenzierung humaner mesenchymaler Stammzellen in Chondrozyten (Knorpelbildung), Osteoblasten (Knochenbildung) und Adipozyten (Fett-zellbildung) konnten 12 wichtige Faktoren (darunter: RUNX2, OSX/SP7, SOX9, TP53) mit Hilfe der Berechnung der Bedeutung (Kontrollzentralität der Netzwerkknoten identifi-ziert werden). Der Abgleich des simulierten Verhaltens dieses Netzwerkes ergab eine Übereinstimmung mit experimentellen Daten von 47,2%, bei einem widersprüchlichen Verhalten von ca. 25%, dass unter anderem durch die temporäre Natur experimentel-ler Messungen im Vergleich zu den terminalen Bedingungen des Berechnung der stabilen Systemzustände erklärt werden kann. Bei der Analyse des Netzwerkmodells der menschlichen Immunantwort auf eine Infek-tion durch A. fumigatus konnten vier Hauptregulatoren identifiziert werden (A. fumi-gatus, Blutplättchen, hier Platelets genannt, und TNF), die im Zusammenspiel mit wei-teren Faktoren mit hohen Zentralitätswerten (CCL5, IL1, IL6, Dectin-1, TLR2 und TLR4) fähig sind das gesamte Netzwerkverhalten zu beeinflussen. Es konnte gezeigt werden, dass sich das Aktivitätsverhalten von IL6 in Reaktion auf A. fumigatus und die regulato-rische Wirkung von Blutplättchen mit den entsprechenden experimentellen Resultaten deckt. Die Simulation, sowie die Berechnung der stabilen Systemzustände der Immunantwort von A. thaliana auf eine Infektion durch Pseudomonas syringae konnte zeigen, dass die in silico Ergebnisse mit den experimentellen Ergebnissen übereinstimmen. Zusätzlich konnten mit Hilfe der Analyse der Zentralitätswerte des Netzwerkmodells fünf Master-regulatoren identifiziert werden: TGA Transkriptionsfaktor, Jasmonsäure, Ent-Kaurenoate-Oxidase, Ent-kaurene-Synthase und Aspartat-Semialdehyd-Dehydrogenase. Während die ersteren beiden bereits lange als wichtige Regulatoren für die Gib-berellin-Synthese bekannt sind, ist die immunregulatorische Funktion von Aspartat-Semialdehyd-Dehydrogenase bisher weitgehend unbekannt. N2 - The central paradigm of systems biology aims at a comprehensive understanding in complex relationships of biological systems. The methods used in this work support this aim. By the example of three network models reconstructed on the basis of databases and current literature, the validity of analytical and predictive algorithms could be demon-strated in this work. As simulation software the framework Jimena was applied. The results for the calculation of stable system states, the dynamic simulation as well as the identification of central control nodes could be validated experimentally. The re-sults were used in an iterative process to further optimize the corresponding network model. Comparing the behavior of the semi-quantitatively evaluated regulatory network to control the differentiation of human mesenchymal stem cells into chondrocytes (carti-lage formation), osteoblasts (bone formation) and adipocytes (fatty cell formation), 12 important factors (including: RUNX2, OSX/SP7, SOX9, TP53) could be identified by the calculation of the control centralities of the network nodes. The comparison of the simulated behavior of these nodes showed an agreement with experimental data of 47.2%. We found a contradictory behavior of approximately 25%. Differing results can be explained due to the temporary nature of experimental measurements compared to the terminal conditions of the calculation the stable system states. Analyzing the network model of the human immune response to A. fumigatus infec-tion, four major regulators could be identified (A. fumigatus, platelets, and TNF), which interact with other factors with high control centrality values (CCL5, IL1, IL6, Dectin1). TLR2 and TLR4) are capable of affecting the overall network behavior. It could be shown that the activity behavior of IL6 in response to the modular activity of the plate-lets as well as A. fumigatus coincides with the corresponding experimental results. The simulation, as well as the calculation of the stable system states of the immune response of A. thaliana to an infection by Pseudomonas syringae, showed that in silico results are in agreement with the experimental results. By analyzing the control cen-trality values of the network model, five main regulators could be: TGA transcription factor, jasmonic acid, ent-kaurene-Oxidase, ent-kaurene synthase and aspartate semi-aldehyde. While the former two have long been recognized as important regulators of gibberel-lin synthesis, the immunoregulatory function of aspartate semialdehyde dehydrogen-ase has been largely unknown. KW - Netzwerksimulation KW - Immunbiologie KW - Zelldifferenzierung KW - Systembiologie KW - Signaltransduktion KW - Mesenchymale Stammzelldifferenzierung KW - Netzwerkrekonstruktion KW - network simulation KW - network reconstruction KW - immunology KW - mesenchymal stem cell differentiation KW - signal transduction Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-198526 ER - TY - THES A1 - Wüst, Simone T1 - Analyse des Wirkmechanismus von Kortikosteroiden bei der Therapie der Experimentellen Autoimmunen Enzephalomyelitis, einem Tiermodell für Multiple Sklerose T1 - Analysis of the mechanism of action of corticosteroids in the therapy of experimental autoimmune encephalomyelitis, an animal model for multiple sclerosis N2 - In der vorliegenden Arbeit wurden die Mechanismen der Hochdosis-GC-Pulstherapie im Zusammenhang mit akuten Schüben von MS-Patienten anhand des Tiermodells der MS, der Experimentellen Autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE), untersucht. Die EAE wurde in C57Bl/6 Mäusen und diversen GR-defizienten Mäusen durch Immunisierung mit Myelinoligodendrozytenglykoprotein (MOG35-55) induziert. Es konnte gezeigt werden, dass die Gabe von Dexamethason (Dex) den Krankheitsverlauf dosisabhängig verbessert. Die Untersuchung heterozygoter GR Knock-out Mäuse und hämatopoetischer Stammzellchimären verdeutlichte, dass der zytosolische GR (cGR) für die Vermittlung therapeutischer GC-Effekte von sehr großer Bedeutung ist. Der Einsatz zelltyp-spezifischer GR-defizienter Mäuse zeigte auf zellulärer Ebene, dass für die Vermittlung von GC-Wirkungen die Expression des GR vor allem in T-Zellen unabdingbar ist, wohingegen die GR-Expression in myeloiden Zellen in diesem Kontext keine Bedeutung hat. Durch die Analyse des molekularen Mechanismus konnte festgestellt werden, dass diese Effekte durch Apoptoseinduktion und Herunterregulieren von Adhäsionsmolekülen in peripheren, aber nicht ZNS-residenten T-Zellen erzielt wurden. Überdies wurde ersichtlich, dass Dex die T-Zellmigration in das ZNS verhinderte. Diese Beobachtung unterstützt die Hypothese, dass Dex durch Apoptoseinduktion und Immunmodulation hauptsächlich auf periphere T-Zellen wirkt und somit den ständigen Influx neuer Immunzellen in das ZNS verhindert. Ferner konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die therapeutische Gabe hochdosierten Methylprednisolons (MP) in diesem EAE-Modell ebenfalls zu einer dosisabhängigen Verbesserung der EAE führte. Diese beruhte auf einer reduzierten Lymphozyteninfiltration in das ZNS, war allerdings im Vergleich zur Dex-Therapie aufgrund geringerer Wirkpotenz weniger stark ausgeprägt. Im Gegensatz dazu führte die präventive MP-Applikation zu einem verstärkten EAE-Verlauf, der nach der Beeinflussung peripherer, hämatopoetischer Immunzellen auf eine verstärkte Proliferation autoreaktiver T-Zellen zurückzuführen ist. Im weiteren Verlauf der vorliegenden Arbeit wurde als möglicher Ersatz für die Hochdosis-GC-Pulstherapie eine nicht-steroidale, antiinflammatorische Substanz im chronischen EAE-Modell der C57Bl/6 Maus etabliert. Erste tierexperimentelle Untersuchungen mit Compound A (CpdA) offenbarten eine lediglich geringe therapeutische Breite dieser Substanz, wobei innerhalb pharmakologischer Dosierungen dennoch therapeutische Wirkungen vermittelt werden konnten. Anhand von in vitro Experimenten konnte eindeutig nachgewiesen werden, dass CpdA GR-unabhängig Apoptose induzierte, wobei Immunzellen und neuronale Zellen gegenüber CpdA besonders empfindlich reagierten. Der Einsatz T-Zell-spezifischer GR-defizienter Mäuse konnte zeigen, dass CpdA für die Vermittlung therapeutischer Wirkungen den cGR benötigt. Ferner wurde offensichtlich, dass CpdA in Abwesenheit des cGR in T-Zellen eine signifikante Verschlechterung der EAE verursachte. Durch die Anwendung physikochemischer Analysenmethoden, wie der Massenspektrometrie und 1H-NMR-Spektroskopie, konnte festgestellt werden, dass CpdA in vitro in gepufferten Medien in eine zyklische, chemisch sehr reaktive Verbindung (Aziridin) metabolisiert wird. Diese kann sehr wahrscheinlich für die Apoptose-Induktion in Zellen und die in Mäusen beobachteten neurotoxischen Ausfallerscheinungen verantwortlich gemacht werden. Durch chemische Analysen konnte in vitro in wässriger CpdA-Lösung ein weiterer Metabolit, das sympathomimetisch wirksame Synephrin, identifiziert werden. Um die Wirksamkeit adrenerger Substanzen in vivo zu testen, wurde das ß1/2-Sympathomimetikum Isoproterenol appliziert. Dieses verbesserte die EAE-Symptomatik, was sehr wahrscheinlich auf eine reduzierte Antigenpräsentation und einer damit verbundenen verminderten T-Zellinfiltration in das ZNS zurückzuführen ist. N2 - High-dose glucocorticoids (GC) are used to treat acute relapses of multiple sclerosis (MS) patients. In this work the underlying mechanisms of this therapy have been investigated using the animal model of MS, experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). EAE was induced in C57Bl/6 mice and several strains of glucocorticoid receptor (GR) deficient mice by immunization with myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55). It was shown that the application of dexamethasone (Dex) leads to a dose-dependent amelioration of the disease course. Analysis of heterozygous GR-knock out mice and hematopoietic stem cell chimeras revealed, that the cytosolic GR (cGR) is a prerequisite for mediating therapeutic GC effects. Furthermore, the use of cell type-specific GR-deficient mice showed at the cellular level that GR-expression is particularly needed in T cells, while it is dispensible in myeloid cells in this context. Analysis of molecular mechanisms determined that these effects are mainly achieved by apoptosis induction and down regulation of adhesion molecules in peripheral T cells, but not in CNS-residing T cells. In addition, it could be observed that Dex inhibited the T cell migration into the CNS. These findings confirm the hypothesis that Dex mainly acts on peripheral T cells by apoptosis induction and immunomodulation and thus inhibits the influx of new immune cells into the CNS. Furthermore, this work shows that therapeutic application of methylprednisolone (MP) in this EAE-model leads to a dose-dependent amelioration of the disease course as well. This improvement is based on a reduced lymphocyte infiltration into the CNS, but is less pronounced than that after Dex treatment due to reduced potency. In contrast to this, preventive MP-application induces an increased disease course. This aggravation is ascribed to interference with peripheral hematopoietic immune cells and an increased proliferation of autoreactive T cells. In the search of alternatives to high-dose GC therapy a novel antiinflammatory compound was established in the chronic EAE-model of the C57Bl/6 mouse. First in vivo experiments revealed that this non-steroidal substance, compound A (CpdA), has only little therapeutic index, but is able to mediate therapeutic effects within pharmacological dosages. On the basis of in vitro analysis CpdA induces apoptosis in a GR-independent manner, whereas immune cells and neuronal cells are most sensitive. Using T cell-specific GR-deficient mice it could be observed that CpdA requires the cGR for mediating therapeutic effects. Furthermore, the application of CpdA led to an aggravation of the EAE course in absence of the cGR in T cells. Physicochemical analysis such as mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy revealed that CpdA metabolizes in vitro in buffered media into a cyclic, highly reactive compound, aziridine. Presumably, this metabolite may be responsible for apoptosis induction in diverse cells and neurotoxic deficits observed in mice. Using the same methods, an adrenergic substance, synephrine, could be identified in vitro after resolving CpdA in water and PBS. In order to test the efficacy of adrenergic substances in EAE in vivo, the ß1/2-adrenergic drug isoproterenol, was applied. Isoproterenol led to an amelioration of the disease course which may be ascribed to decreased antigen presentation and reduced T cell infiltration into CNS. KW - Multiple Sklerose KW - Tiermodell KW - Glucocorticosteroide KW - Apoptosis KW - Experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis KW - Adhäsionsmoleküle KW - Glukokortikoid-Rezeptor Modulator KW - Experimental autoimmune encephalomyelitis KW - adhesion molecules KW - glucocorticoid-receptor modulator Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-32961 ER - TY - THES A1 - Lührmann, Anja T1 - Analyse der Reifung von Afipien- und Rhodokokken-enthaltenden Phagosomen in Makrophagen T1 - Analysis of the maturation of Afipia- and Rhodococcus-containing phagosomes in macrophages N2 - Die Isolierung von Phagosomen ermöglicht die biochemische Analyse der Phagosomen-Zusammensetzung sowie der an der Phagosomenreifung beteiligten Moleküle. Deshalb wurde im Rahmen dieser Promotionsarbeit eine Methode entwickelt, die es ermöglicht, Bakterien-enthaltende Phagosomen zu isolieren. Diese Methode erzielt im Vergleich zu anderen in der Literatur beschriebenen Methoden eine gute Ausbeute (fast 40 Prozent) und vor allem eine höhere Reinheit an Bakterien-enthaltenden Phagosomen. So besteht keine Kontamination mit Teilen des Golgi-Apparates und nur eine sehr geringe Kontamination mit endosomalen und lysosomalen Proteinen sowie Plasmamembranbestandteilen. Allerdings wurde eine Kontamination mit Mitochondrien und ER detektiert. Letzteres muss nicht unbedingt eine Kontamination darstellen, sondern könnte ein wichtiger Bestandteil von Phagosomen sein. Afipia felis ist ein Gram-negatives Bakterium, das für einige Fälle der Katzen-Kratz Krankheit verantwortlich ist. Es kann innerhalb von Makrophagen überleben und sich vermehren. Die genaue Kompartimentierung der Afipia felis-enthaltenden Phagosomen in Makrophagen war allerdings unbekannt und sollte deshalb in der vorliegenden Promotionsarbeit analysiert werden. Ovalbumin Texas Red, mit dem Lysosomen vor der Infektion markiert wurden, gelangt nicht in die Afipien-enthaltenden Phagosomen, und die Afipien-enthaltenden Phagosomen sind auch nicht zugänglich für Ovalbumin Texas Red, mit dem das gesamte endozytische System nach der etablierten Infektion markiert wurde. Außerdem sind etablierte, isolierte Afipia felis-enthaltende Phagosomen nur in geringem Umfang positiv für spät endosomale/lysosomale Markerproteine und negativ für früh endosomale Markerproteine. Die Afipien, die ein nicht endozytisches Kompartiment etablieren, werden vom Makrophagen in ein EEA1-negatives Kompartiment aufgenommen, das auch zu späteren Zeitpunkten negativ für LAMP-1 ist. Nur die circa 30 Prozent der Afipien, die sich in einem Kompartiment befinden, das zum endozytischen System gehört, gelangen nach der Aufnahme durch den Makrophagen in ein EEA1-positives Kompartiment, das zu einem späteren Zeitpunkt positiv für LAMP-1 wird. Tötung der Afipien oder Opsonisierung mit Antikörpern vor der Infektion normalisiert die Reifung der Afipia felis-enthaltenden Phagosomen in den J774E-Makrophagen. Somit konnte nachgewiesen werden, dass die Mehrzahl der Phagosomen (70 Prozent), die Afipia felis enthalten, nicht zum endozytischen System gehören. Diese ungewöhnliche Kompartimentierung besteht bereits bei der Aufnahme und kann nur von lebenden Afipien etabliert werden. Rhodococcus equi ist ein Gram-positives Bakterium, das unter anderem Bronchopneumonien beim Fohlen verursacht. Aber auch Menschen und andere Säugetiere sind von Infektionen mit R. equi betroffen. Die Fähigkeit der Rhodokokken, innerhalb der Makrophagen zu überleben und sich zu vermehren, ist mit dem Vorhandensein eines 85 kbp Plasmids assoziiert. Da über die genaue Kompartimentierung von R. equi im Mausmakrophagen wenig bekannt war, und der Frage, ob es einen Unterschied zwischen der Kompartimentierung von R. equi(+)- und R. equi(-)-enthaltenden Phagosomen gibt, noch nicht nachgegangen wurde, war beides Thema dieser Promotionsarbeit. Dabei zeigt sich, dass R. equi(-)-enthaltende Phagosomen wesentlich stärker mit den spät endosomalen/lysosomalen Markerproteinen vATPase und LAMP-1 assoziiert sind sowie eine höhere ß-Galaktosidase-Aktivität aufweisen als die R. equi(+)-enthaltenden Phagosomen. Da sowohl die isolierten R. equi(-)- als auch die R. equi(+)-enthaltenden Phagosomen mit dem früh endosomalen Markerprotein rab5 assoziiert sind, ist anzunehmen, dass Rhodokokken unabhängig vom Vorhandensein des 85 kbp Plasmids in der Lage sind, die Phagosomenreifung zu verzögern. Aber R. equi(-) kann die Reifung zwar verzögern, aber letztendlich nicht verhindern. Wahrscheinlich reifen die Phagosomen, die R. equi(-) enthalten, zu einem späteren Zeitpunkt zu Phagolysosomen, wohingegen R. equi(+) ein ungewöhnliches Kompartiment etabliert und dadurch die Phagosomenreifung endgültig zu verhindern scheint. Somit ist anzunehmen, dass mindestens ein vom 85 kbp Plasmid kodiertes Molekül für die Etablierung dieses ungewöhnlichen, R. equi(+)-enthaltenden Kompartimentes, verantwortlich ist. Da eine Infektion mit Rhodococcus equi zytotoxisch für die infizierte Zelle sein kann, wurde die von den Rhodokokken vermittelte Zytotoxizität näher analysiert. Die in dieser vorliegenden Promotionsarbeit dargestellten Ergebnisse zeigen deutlich, dass nur die Plasmid-enthaltenden Rhodokokken zur Nekrose, aber nicht zur Apoptose ihrer Wirtszellen führen, während R. equi(-) keinen Einfluss auf die Vitalität ihrer Wirtszellen haben. Dieses Phänomen ist allerdings abhängig vom Wirtszelltyp. So sind R. equi(-) als auch R. equi(+) für humane Monozyten nur geringfügig zytotoxisch. N2 - The isolation of phagosomes from phagocytes enables their fine biochemical analysis as well as the determination of the role of various molecules in phagosome biogenesis. Therefore, a method to purify bacteria-containing phagosomes from infected macrophages has been established in this study. In comparison with previously described methods a good yield (40 per cent) and a higher level of purity of bacteria-containing phagosomes were obtained using this phagosome isolation method. No Golgi-derived contamination and only very little endosomal or lysosomal and plasma membrane-derived contaminations was found. Furthermore, some mitochondrial and ER contaminations were detectable. Afipia felis is a Gram-negative bacterium that causes some cases of human Cat Scratch Disease. It can survive and multiply in macrophages, but the precise intracellular compartimentalization of Afipia felis-containing phagosomes is unknown. In this study we show evidence, that 70 per cent of Afpia felis-containing phagosomes do not belong to the endocytic pathway. This is supported by the facts that neither did ovalbumin preloaded into lysosomes enter most Afipia felis-containing phagosomes, nor did ovalbumin loaded into the endocytic system after infection. Furthermore the percentage of isolated Afipia felis-containing phagosomes positive for late endosomal/lysosomal markerproteins were very low and early endosomal marker proteins were rarely detectable. Those bacteria that were to be found in a nonendosomal compartment entered the macrophage via an EEA1-negative compartment, which remained negative for LAMP-1. The small population of Afipia felis whose phagosomes were part of the endocytic system entered into an EEA1-positive compartment which also subsequently acquired LAMP-1. Killing of Afipia felis or opsonization with antibodies before infection lead to a strong increase in the percentage of Afipia felis-containing phagosomes that interact with the endocytic system. We conclude that most phagosomes containing Afipia felis are disconnected from the endocytic system. This unusual compartalization is decided at uptake and can only be established by viable Afipia felis. Rhodococcus equi is a Gram-positive bacterium that causes granulomatous pneumonia in foals. It is also a pathogen for other animals and human beings. The pathogenicity of Rhodococcus equi is depending on its ability to exist and multiply inside macrophages and this correlates with the presence of a 85 kbp plasmid. The aim of this study was to elucidate the intracellular compartmentation of Rhodococcus equi and the mechanism by which the bacteria might avoid the destruction in host macrophages. The importance of the virulence-associated plasmid was also evaluated. In this study it is shown that R. equi(-)-containing phagosomes contained much more of the late endosomal/lysosomal marker proteins vATPase or LAMP-1 and also a larger amount of the lysosomal enzyme ß-galactosidase than R. equi(+)-containing phagosomes. Both R. equi(+)- and R. equi(-)-containing phagosomes associated with the early endosomal marker protein rab5. Based on these results it can be speculated that Rhodococcus equi is able to slow down or arrest the maturation of its phagosome independently of the 85 kbp virulence-associated plasmid. Whereas R. equi(-) is able to slow down but not to arrest its phagosomes, R. equi(+) establishes an unusual compartment, which possibly represents a recycling-endosome. Therefore, for the long term establishment of the unusual R. equi(+)-containing phagosomes at least one of the molecules encoded by the 85 kbp plasmid is necessary. Since Rhodococcus equi infection ultimately proves toxic for macrophages, the R. equi mediated cytotoxicity was analyzed. In this study it is shown that Rhodococcus equi induce necrosis in their host cells and which is dependent on the presence of the virulence-associated 85 kbp plasmid. But the Rhodococcus induced necrosis can only be observed in mouse macrophages and not in human monocytes. KW - Afipia KW - Rhodococcus KW - Phagosom KW - Makrophage KW - Makrophage KW - J774 KW - Phagosom KW - Endosom KW - Lysosom KW - Phagozytose KW - Zytotoxizität KW - Afipia felis KW - Rhodococcus equi KW - Macrophage KW - J774 KW - phagosome KW - endosome KW - lysosome KW - phagocytosis KW - cytotoxicity KW - Afipia felis KW - Rhodococcus equi Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1619 ER - TY - THES A1 - Vollmar, Friederike Lara Veronika T1 - Analyse der Kernhüllenbildung am Modellsystem Xenopus laevis T1 - Studying nuclear envelope assembly in the cell-free system derived from Xenopus laevis eggs N2 - Die Kernhülle ist eine hoch spezialisierte Membran, die den eukaryotischen Zellkern umgibt. Sie besteht aus der äußeren und der inneren Kernmembran, die über die Kernporenkomplexe miteinander verbunden werden. Die Kernhülle reguliert nicht nur den Transport von Makromolekülen zwischen dem Nukleoplasma und dem Zytoplasma, sie dient auch der Verankerung des Chromatins und des Zytoskeletts. Durch diese Interaktionen hilft die Kernhülle, den Zellkern innerhalb der Zelle und die Chromosomen innerhalb des Zellkerns zu positionieren, und reguliert dadurch die Expression bestimmter Gene. In höheren Eukaryoten durchlaufen sowohl die Kernhülle, als auch die Kernporenkomplexe während der Zellteilung strukturelle Veränderungen. Zu Beginn der Mitose werden sie abgebaut, um sich am Ende der Mitose in den Tochterzellen erneut zu bilden. Die molekularen Mechanismen, die zum Wiederaufbau der Kernhülle führen, sind kaum geklärt. Ein geeignetes System, um bestimmte Ereignisse bei der Kernhüllenbildung zu untersuchen, liefert das zellfreie System aus Xenopus Eiern und Spermienchromatin (Lohka 1998). Es konnte bereits früher gezeigt werden, dass es im Eiextrakt von Xenopus laevis mindestens zwei verschiedene Vesikelpopulationen gibt, die zur Bildung der Kernhülle beitragen. Eine der Vesikelpopulationen bindet an Chromatin, fusioniert dort und bildet eine Doppelmembran. Die andere Vesikelpopulation bindet an die bereits vorhandene Doppelmembran und sorgt für die Ausbildung der Kernporenkomplexe. Ziel dieser Arbeit war es, diese beiden Membranfraktionen zu isolieren und zu charakterisieren, wobei das Hauptinteresse in der porenbildenden Membranfraktion lag. Durch Zentrifugation über einen diskontinuierlichen Zuckergradienten konnten die Membranvesikel in zwei verschiedene Vesikelfraktionen aufgetrennt werden. Eine Membranfraktion konnte aus der 40%igen Zuckerfraktion („40% Membranfraktion“) isoliert werden, die andere aus der 30%igen Zuckerfraktion („30% Membranfraktion“). Die verschiedenen Membranfraktionen wurden zu in vitro Kernen gegeben, in denen die Kernporen durch vorausgegangene Bildung von Annulate Lamellae depletiert worden waren. Nach Zugabe der 30% Membranfraktion konnte die Bildung von funktionalen Kernporen beobachtet werden. Im Gegensatz dazu zeigte die 40% Membranfraktion keine porenbildenden Eigenschaften. Unter Verwendung eines vereinfachten Systems, bestehend aus Zytosol, Spermienchromatin und den Membranen, wurde gezeigt, dass die 40% Membranfraktion an Chromatin bindet und ausreichend ist, um eine kontinuierliche Doppelmembran ohne Kernporen zu bilden. Die 30% Membranfraktion besitzt keine Chromatinbindungseigenschaften und wird aktiv entlang von Mikrotubuli zu den porenlosen Kernen transportiert. Dort interagiert sie mit der chromatingebundenen 40% Membranfraktion und induziert die Porenbildung. Nach dem Vergleich der Proteinzusammensetzung der beiden Membranfraktionen, konnte das Major Vault Protein (MVP) nur in der porenbildenden Membranfraktion gefunden werden. MVP ist die Hauptstrukturkomponente der Vault-Komplexe, einem Ribonukleo-proteinpartikel, der in den meisten eukaryotischen Zellen vorhanden ist (Kedersha et al., 1991). Bemerkenswerterweise wird über die Funktion der Vault-Komplexe, trotz ihrer übiquitären Expression und ihrem Vorkommen in fast allen eukaryotischen Zellen, immer noch diskutiert. Um mehr über die Funktion und die Lokalisation der Vaults/MVP zu lernen, wurden die Vaults in Anlehnung an die Methode von Kedersha und Rome (1986) aus Xenopus Eiern isoliert. Zusätzlich wurde rekombinantes Xenopus MVP hergestellt, das unter anderem für die Produktion von Antikörpern in Meerschweinchen verwendet wurde. Um herauszufinden, ob die Anwesenheit von MVP in der 30% Membranfraktion in direktem Zusammenhang mit deren porenbildender Eigenschaft steht, wurden gereinigte Vault-Komplexe oder rekombinantes MVP, das alleine ausreichend ist, um in sich zu den charakteristischen Vault-Strukturen zusammenzulagern, zu porenlosen Kernen gegeben. Sowohl gereinigte Vault-Komplexe, als auch rekombinantes MVP waren in der Lage in den porenlosen Kernen die Bildung von funktionalen Kernporen zu induzieren. Untersuchungen zur Lokalisation von MVP zeigten, dass MVP teilweise an der Kernhülle und den Kernporenkomplexen lokalisiert, während der Großteil an MVP zytoplasmatisch vorliegt. Dies sind die ersten Daten, die Vaults/MVP mit der Kernporenbildung in Verbindung bringen. Deshalb bietet diese Arbeit die Grundlage, um diese unerwartete Rolle der Vaults in Zukunft genauer zu charakterisieren. N2 - The nuclear envelope (NE) is a highly specialized membrane that delineates the eukaryotic cell nucleus. It is composed of the inner and outer nuclear membranes that are connected by the nuclear pore complexes (NPCs). The NE not only regulates the trafficking of macromolecules between nucleoplasm and cytosol but also provides anchoring sites for chromatin and cytoskeleton. Through these interactions, the NE helps position the nucleus within the cell and chromosomes within the nucleus, thereby regulating the expression of certain genes. In higher eukaryotic cells, both NE and NPCs undergo structural changes during cell division as they disassemble at the onset of mitosis and need to reform in the daughter cells at the end of mitosis. The molecular mechanisms governing the reassembly of the NE are only poorly understood. A particular suitable system to analyze specific events involved in NE assembly is provided by the cell-free system based on Xenopus egg extract and sperm chromatin (Lohka 1998). Previously it could be shown that in Xenopus egg extract there exist at least two different vesicle populations that are involved in nuclear envelope assembly. One type of vesicle binds to chromatin where it fuses and forms a bilayered nuclear envelope. The other vesicle population binds to the double nuclear membrane and is required for nuclear pore complex formation. Aim of this study was to isolate and characterize these two membrane fractions with special regard to the pore-forming membrane fraction. By centrifugation on a discontinuous sucrose gradient the membrane vesicles could be separated into two different vesicle fractions. One membrane fraction was recovered from the 40% sucrose fraction (“40% membrane fraction”) and the other one from the 30% sucrose fraction (“30% membrane fraction”). The different membrane fractions were added to in vitro nuclei, where nuclear pores were depleted by formation of annulate lamellae. After addition of the 30% membrane fraction formation of functional nuclear pores could be observed. In contrast the 40% membrane fraction had no pore-forming property. Using a simplified system consisting of cytosol, spermchromatin an membranes it was demonstrated that the 40% membrane fraction binds to chromatin and is sufficient to form a continuous double membrane without NPCs. The 30% membrane fraction lacks chromatin targeting signals and is actively transported along microtubules to the pore-free nuclei. There it interacts with the chromatin-bound 40% membranes and induces formation of NPCs. Comparing the protein composition of both membrane fractions, the major vault protein (MVP) was found to be exclusively in the pore-inducing membrane fraction. MVP is the major structural component of vaults, a ribonucleoprotein particle found in most eukaryotic cells (Kedersha et al., 1991). Remarkably, despite their ubiquitous expression and abundance in nearly all eukaryotic cells, the functional role of vaults is still being debated. To learn more about the functional role and localization of vaults/MVP, vaults were isolated from Xenopus eggs following the procedure of Kedersha and Rome (1986). In addition recombinant Xenopus MVP was prepared and used to generate antibodies in guinea pigs. To find out whether the presence of MVP in the 30% membrane fraction is related to its pore-forming capacity, purified vault complexes or recombinant MVP, which alone is sufficient to selfassemble into the characteristic vault structure, were added to poreless nuclei. Both purified vaults and recombinant MVP induce the formation of functional NPCs in the pore-free nuclei. Studying the localization of MVP it was demonstrated, that MVP localizes in part at the nuclear envelope and the nuclear pore complexes, whereas most MVP is cytoplasmically. These are the first data that link vaults/MVP to NPC assembly. Therefore this work displays fundamental features to study this unexpected role of vaults in more detail. KW - Kernhülle KW - Kernporenkomplex KW - Major Vault Protein KW - Xenopus laevis KW - nuclear envelope assembly KW - nuclear pore complexes KW - major vault protein KW - Xenopus laevis Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-29298 ER - TY - THES A1 - Franz, Mirjam T1 - Analyse der Hangover Funktion während der Entwicklung von Ethanol-induziertem Verhalten T1 - Analysis of the Hangover function during the development of ethanol-induced behaviour N2 - Die Entwicklung von Ethanoltoleranz ist ein Indikator für eine mögliche Abhängigkeit von Alkohol. Der genaue molekulare Mechanismus der Ethanoltoleranzentwicklung ist jedoch nicht bekannt. Drosophila ermöglicht die molekulare und phänotypische Untersuchung von verschiedenen Mutanten mit veränderter Toleranz und kann so zu einem besseren Verständnis beitragen. Die hangAE10 Mutante entwickelt eine reduzierte Ethanoltoleranz, wobei dieser Phänotyp auf Defekte in der zellulären Stressantwort zurückzuführen ist. Für ein besseres Verständnis, in welchen molekularen Mechanismen bzw. Signalwegen HANG wirkt, wurde die Funktion des Proteins auf zellulärer Ebene analysiert und mögliche Zielgene charakterisiert. Die auffällige Proteinstruktur von HANG spricht für eine Interaktion mit Nukleinsäuren. Immunhistochemische Analysen von ektopisch exprimiertem Hangover Protein ergaben, dass dieses nicht mit der DNA co-lokalisiert und auch nicht an polytänen Chromosomen nachgewiesen werden kann. Die ektopische Expression von HANG in Speicheldrüsenzellen zeigte eine punktförmige Verteilung des Proteins innerhalb des Zellkerns. Dieses punktförmige Expressionsmuster wird häufig in RNA-bindenden Proteinen gefunden. Deshalb wurden Co-Lokalisationsstudien von HANG mit Markern für RNAmodifizierende Proteine durchgeführt. Dabei wurde keine Interaktion mit verschiedenen Markerproteinen des Spleißapparates gefunden. Mithilfe von in vitro Experimenten konnte aber die Bindung von RNA an bestimmten Hangover Proteinbereichen nachgewiesen werden Diese Ergebnisse legen nahe, dass HANG eine RNA-regulierende Funktion hat. In einem cDNA Microarray Experiment wurde das Gen dunce als mögliches Zielgen von Hangover identifiziert. Das Gen dunce kodiert für eine Phosphodiesterase, welche spezifisch cAMP hydrolysiert. Zur Bestätigung der cDNA Microarray Experimente wurden die dnc Transkriptunterschiede in Wildtyp und hangAE10 Mutante mithilfe von semiquantitativer RT-PCR für jede der vier Gruppen untersucht. Dabei konnte eine Reduktion der dncRMRA-Transkriptgruppe in hangAE10 Mutanten nachgewiesen werden. Aufgrund dieser Ergebnisse wurde die dncRMRA -spezifische dncΔ143 Mutante hergestellt und auf Verhaltensebene analysiert. Die Experimente zeigten, dass sowohl dnc1, als auch die dncΔ143 Mutante eine reduzierte Ethanoltoleranz und Defekte in der zellulären Stressantwort aufweisen. Für die Rettung der reduzierten Toleranz von hangAE10 und dncΔ143 in dncRMRA-spezifischen Neuronen wurde die dncRMRA Promotor- GAL4 Linie hergestellt. Die reduzierte Ethanoltoleranz der dncΔ143 Mutanten konnte über die Expression von UAS-dnc mit der dncRMRA-GAL4 Linie auf Wildtyp Level gerettet werden. Die reduzierte Toleranz der hangAE10 Mutante konnte mithilfe derselben GAL4 Linie verbessert werden. Dies beweist, dass in beiden Mutanten dieselben Zellen für die Entwicklung von Ethanoltoleranz benötigt werden und sie wahrscheinlich in der gleichen Signaltransduktionskaskade eine Funktion haben. Aufgrund der Anfälligkeit der UAS/ GAL4 Systems gegenüber Hitze war es außerdem nicht möglich die Defekte der zellulären Stressantwort von dncΔ143 bzw. hangAE10 Fliegen zu retten. Die Rettung der reduzierten Ethanoltoleranz der dcnΔ143 Mutante führte außerdem zu der Vermutung, dass die cAMP Regulation eine wichtige Funktion bei der Ethanoltoleranzentwicklung hat. Über die Expression von cAMP-regulierenden Proteinen in dncRMRA-spezifischen Neuronen wurde der Einfluss von cAMP bei Ethanol-induziertem Verhalten überprüft. Bei der Überexpression von dunce und rutabaga konnte weder eine Veränderung für die Ethanolsensitivität, noch für die Toleranzentwicklung festgestellt werden. Eine Erklärung hierfür wäre, dass Veränderungen in der cAMP Konzentration über Rückkopplungsmechanismen zwischen Dunce und Rutabaga ausgeglichen werden können. Für eine genauere Aussage müsste jedoch die cAMP Konzentration in diesen Fliegen gemessen werden. Die Überexpression von pka- in dncRMRA spezifischen Zellen führt zu einer erhöhten Ethanolresistenz. Das bedeutet, dass die Modulation der cAMP Konzentration durch dunce und rutabaga in dncRMRA spezifischen Zellen keinen Einfluss auf Ethanol-induziertes Verhalten hat, wohingegen die Stärke der cAMP vermittelten Signalverarbeitung über die cAMP-abhängige PKA zu Veränderungen im Verhalten führt. Für Mutanten des cAMP Signalweges ist außerdem bekannt, dass sie Defekte im olfaktorischen Lernen bzw. Gedächtnis aufweisen. Deshalb wurden die dncΔ143, dnc1 und hangAE10 Mutanten in diesem Paradigma getestet. Sowohl dnc1, als auch dncΔ143 Fliegen zeigten einen reduzierten Performance Index für das zwei und 30 Minuten Gedächtnis. Nach 180 Minuten verhielten sich die dncΔ143 Mutanten nicht mehr unterschiedlich zum Wildtyp, die dnc1 Mutante zeigte jedoch immer noch eine Reduktion des Performance Index im Vergleich zur Kontrolle. Demnach ist in dncΔ143 Mutanten nur das Kurzzeitgedächtnis betroffen, wohingegen hangAE10 Mutanten keine Reduktion des Performance Index für das olfaktorische Kurzzeitgedächtnis aufweisen. Die unterschiedlichen Ergebnisse der beiden Mutanten in der Gedächtnisentwicklung deuten außerdem daraufhin, dass Lernen und Gedächtnis in dncΔ143 und hangAE10 Mutanten von der Toleranzentwicklung unabhängig über unterschiedliche cAMP-abhängige Signaltransduktionskaskaden reguliert werden. N2 - The development of ethanol tolerance is an indicator for a possible alcohol addiction. However the correct molecular mechanism of ethanol tolerance development is not known. The model organism Drosophila allows molecular and phenotypic observations of several mutants with altered ethanol tolerance (Scholz et al., 2000). HangAE10 mutants develop reduced ethanol tolerance because of defects in the cellular stress response (Scholz et al., 2005). For a better understanding of molecular mechanisms or signaling pathways, HANG putative target genes were identified, characterized and the protein function was analyzed on cellular level. The Hangover protein has 16 zinc finger domains, two of them are found in RNA modifying proteins (Scholz et al., 2005; Nelissen et al., 1991). This striking protein structure argues for an interaction of HANG with nucleic acids. In immunohistochemical studies with an ectopically expressed Hangover protein neither colocalization with DNA nor detectable Hangover binding on polytene chromosomes was observed. The ectopic expression of HANG in salivary glands shows a speckled protein distribution in the nucleus, which is similar to the expression pattern in RNA modifying proteins (Spector, 2001). Therefore colocalization studies of HANG with markers for RNA modifying proteins were performed. However no interaction with nucleoli was found. Certain factors of the splicing machinery also show no colocalization with Hangover. Since the studies were done with ectopically expressed protein, the results do not necessarily reflect the wild type behavior of HANG, as the interaction partner is not expressed in a comparable amount. RNA binding to specific parts of the Hangover protein was detected by in vitro experiments. Furthermore wild type expression of Hangover in neuronal cells shows the typical speckled distribution of RNA modifying proteins. These results suggest a RNA regulating function of HANG. In cDNA microarray experiments dunce was identified as a putative target gene of Hangover (Klebes and Scholz, unpublished data). The gene dunce encodes a phosphodiesterase that specifically hydrolyses cAMP (Davis and Kiger, 1981). The 14 dnc transcripts can be divided into four groups based on their length and function (http://flybase.org/; Qiu et al., 1993). To confirm the results of the cDNA microarray experiments, semiquantitative RT-PCRs were performed to analyze the differences in dnc transcript levels between wild type and hangAE10 mutants for each dnc group. A reduced amount of dncRMRA transcripts was observed in hangAE10 mutants. On the basis of these results the dncRMRA transcript specific dncΔ143 mutant was generated (Saratsis, 2006) and tested on behavioral level. Behavioral analysis of dnc1 and dncΔ143 mutants showed reduced ethanol tolerance and defects in the cellular stress response. For rescue experiments of reduced ethanol tolerance in hangAE10 and dncΔ143 mutants in specific dncRMRA neurons, the promotor dncRMRA-GAL4 line was generated (Saratsis, 2006). In-situ hybridization studies suggested that the expression pattern of dncRMRA-GAL4 reflects the endogenous expression of the dncRMRA transcripts. For unambiguous results colocalization studies with a specific DncRMRA antibody has to be done. The dncRMRA-GAL4 line shows a broad expression pattern, with transgene expression in about every 200th cell in the brain. It innervates the antennal lobes, parts of the mushroom body and regions of the central complex. The reduced ethanol tolerance in dncΔ143 mutants was rescued to wild type level by expressing UAS-dnc with the promotor dncRMRA-GAL4 line. Whereas the reduced ethanol tolerance in hangAE10 mutants was advanced by expressing UAS-hang with the same GAL4 line. This demonstrates that both mutants involve the same set of neurons for developing ethanol tolerance and probably act in the same signaling pathway. Expression studies showed that dncRMRA lies downstream of hang. The attempt to rescue the reduced ethanol tolerance in hangAE10 flies by expressing dnc using dncRMRA-GAL4 line did not advance the tolerance in these flies. An obvious explanation is that HANG does not only regulate dunce but also other genes and these regulation defects in hangAE10 mutants cannot be reversed by dnc expression. Due to the sensitivity of the UAS/ GAL4 system towards heat it was impossible to rescue the cellular stress response defects in dncΔ143 and hangAE10 mutants. The rescue of the dncΔ143 tolerance phenotype resulted in the assumption that cAMP regulation has an important function in the development of ethanol tolerance. The effect of cAMP on ethanol induced behavior should be tested by expression of cAMP regulating proteins in dncRMRA specific neurons. There the overexpression of dunce should result in an increase and the overexpression of rutabaga should lead to a decrease in cAMP levels. However, for both experiments there was neither a change in ethanol sensitivity nor in ethanol tolerance. An explanation would be that changes in cAMP concentration could be balanced by feedback loops between Dunce and Rutabaga. For a decisive conclusion the cAMP concentration in these flies has to be measured. Overexpressing pka-c, a gene that encodes the catalytic subunit of PKA in dncRMRA specific cells, leads to a higher resistance towards ethanol. This shows that the modulation of cAMP level by Dunce and Rutabaga has no effect on ethanol induced behavior in dncRMRA specific cells. Whereas the intensity of cAMP mediated signaling processes result in behavioral changes. Several mutants of the cAMP signaling pathway are impaired in olfactory learning and memory. Therefore dnc1, dncΔ143 and hangAE10 mutants were tested in this paradigm. Dnc1 as well as dncΔ143 flies showed reduced performance indices two and 30 minutes memory. After 180 minutes the performance index of dncΔ143 mutants was not significantly different from wild type whereas dnc1 mutants still had a reduction in comparison to wild type. Thus, dncΔ143 mutants have defects in short-term memory whereas short-term memory of hangAE10 mutants is not affected. However it is not known how hangAE10 flies will perform for mid-term and long-term memory formation. Similar to memory formation there exist different phases of tolerance development. To detect, if the long-term or the short-term form of tolerance is affected, the kinetic of tolerance development was investigated for dncΔ143 and hangAE10 mutants. In dncΔ143 mutants the first phase of tolerance development is defective, whereas in hangAE10 mutants the early and the late phase seem to be affected. Thus a part of the reduced tolerance in hangAE10 and the complete reduction in dncΔ143 mutants could be due to defects in the same signaling pathway regulated via cAMP. The variable results for the development of short-term memory in both mutants indicate that memory formation in dncΔ143 and hangAE10 mutants is independent of ethanol tolerance development and is regulated by different cAMP signaling pathways. KW - Taufliege KW - Tachyphylaxie KW - Alkohol KW - Erfahrungsorientiertes Lernen KW - Drosophila KW - Ethanoltolerance KW - dunce KW - hangover Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-35591 ER - TY - THES A1 - Nilla, Jaya Santosh Chakravarthy T1 - An Integrated Knowledgebase and Network Analysis Applied on Platelets and Other Cell Types T1 - Integrierte Datenbank und Netzwerkanalysen zur Untersuchung von Blutplättchen und anderen Zelltypen N2 - Systems biology looks for emergent system effects from large scale assemblies of molecules and data, for instance in the human platelets. However, the computational efforts in all steps before such insights are possible can hardly be under estimated. In practice this involves numerous programming tasks, the establishment of new database systems but as well their maintenance, curation and data validation. Furthermore, network insights are only possible if strong algorithms decipher the interactions, decoding the hidden system effects. This thesis and my work are all about these challenges. To answer this requirement, an integrated platelet network, PlateletWeb, was assembled from different sources and further analyzed for signaling in a systems biological manner including multilevel data integration and visualization. PlateletWeb is an integrated network database and was established by combining the data from recent platelet proteome and transcriptome (SAGE) studies. The information on protein-protein interactions and kinase-substrate relationships extracted from bioinformatical databases as well as published literature were added to this resource. Moreover, the mass spectrometry-based platelet phosphoproteome was combined with site-specific phosphorylation/ dephosphorylation information and then enhanced with data from Phosphosite and complemented by bioinformatical sequence analysis for site-specific kinase predictions. The number of catalogued platelet proteins was increased by over 80% as compared to the previous version. The integration of annotations on kinases, protein domains, transmembrane regions, Gene Ontology, disease associations and drug targets provides ample functional tools for platelet signaling analysis. The PlateletWeb resource provides a novel systems biological workbench for the analysis of platelet signaling in the functional context of protein networks. By comprehensive exploration, over 15000 phosphorylation sites were found, out of which 2500 have the corresponding kinase associations. The network motifs were also investigated in this anucleate cell and characterize signaling modules based on integrated information on phosphorylation and protein-protein interactions. Furthermore, many algorithmic approaches have been introduced, including an exact approach (heinz) based on integer linear programming. At the same time, the concept of semantic similarities between two genes using Gene Ontology (GO) annotations has become an important basis for many analytical approaches in bioinformatics. Assuming that a higher number of semantically similar gene functional annotations reflect biologically more relevant interactions, an edge score was devised for functional network analysis. Bringing these two approaches together, the edge score, based on the GO similarity, and the node score, based on the expression of the proteins in the analyzed cell type (e.g. data from proteomic studies), the functional module as a maximum-scoring sub network in large protein-protein interaction networks was identified. This method was applied to various proteome datasets (different types of blood cells, embryonic stem cells) to identify protein modules that functionally characterize the respective cell type. This scalable method allows a smooth integration of data from various sources and retrieves biologically relevant signaling modules. N2 - Systembiologie sucht nach Systemeffekten in großflächigen Anordnungen von Molekülen und Daten, beispielsweise in menschlichen Blutplättchen. Allerdings kann der Rechenaufwand in den Schritten, die für solche Einsichten nötig sind, kaum unterschätzt werden. In der Praxis umfasst dies zahlreiche Programmieraufgaben, die Einrichtung neuer Datenbanksysteme, sowie deren Wartung, aber auch die Pflege und Validierung der vorgehaltenen Daten. Zudem sind Netzwerkeinsichten nur möglich, wenn effiziente und gute Algorithmen für versteckte Systemeffekte oder auch codierende Wechselwirkungen entschlüsseln. Diese Dissertation und meine Arbeit sind auf diese Herausforderungen konzentriert. Um diese Anforderung zu erfüllen, wurde ein integriertes Thrombozytennetzwerk, PlateletWeb, aus verschiedenen Quellen zusammengestellt und weiterhin auf Signalverarbeitung und –weitergabe einschließlich mehrstufiger Datenintegration und Visualisierung systembiologisch analysiert. PlateletWeb ist eine integrierte Netzwerkdatenbank, die durch die Kombination von Daten aus den neuesten Thrombozyten Proteom und Transkriptom (SAGE) Studien etabliert wurde. Information über Protein-Protein-Wechselwirkungen und Kinase-Substrat-Paaren wurde aus bioinformatischen Datenbanken hinzugefügt, extrahierte Daten aus der veröffentlichten Literatur ergänzten dies weiter. Darüber hinaus wurde das Blutplättchen-Phosphoproteom aufgrund von Daten aus der Massenspektroskopie mit ortsspezifischen Phosphorylierungs-/ Dephosphorylierungsdaten kombiniert. Ergänzt wurde dies um Daten aus der Datenbank Phosphosite und durch bioinformatische Sequenzanalyse unter Nutzung ortsspezifischer Kinasevorhersagen. Die Zahl der katalogisierten Thrombozytenproteine wurde im Vergleich mit der Vorversion von 2008 um mehr als 80% erhöht (beinahe Verdoppelung der Daten, insbesondere aber neue, zusätzliche Datenkategorien, z.B. über Pharmaka, Phosphorylierung, Gen-Ontologie, daneben auch weitere Validierung und Pflege der vorhandenen Daten). Die neue Integration von Annotationen für Kinasen, Proteindomänen, Transmembranregionen, Gene Ontology, Krankheitsbezüge und Azneimittelziele bietet neue, mächtige Werkzeuge für die funktionelle und systembiologische Analyse von Thrombozytensignalwegen. Die PlateletWeb Datenbank liefert eine neuartige systembiologische Werkbank zur Analyse von medizinisch relevanten Blutplättchensignalen (z.B. Plättchenaktivierung bei Thrombose, Hämostase etc.) im funktionellen Zusammenhang von Proteinnetzwerken. Durch umfassende Untersuchungen wurden über 15000 Phosphorylierungsstellen identifiziert, von denen 2500 einer Kinase zugeordnet werden konnten. Netzwerkmotive wurden auch in diesen Zellen ohne Zellkern untersucht und neue und interessante Signalmodule charakterisiert. Dies war nur durch die integrierte Information über Phosphorylierung und Protein-Protein-Wechselwirkungen möglich. Darüber hinaus wurden zahlreiche algorithmische Ansätze verwand, darunter ein exakter Ansatz zur Bayesschen Analyse von Interaktionsnetzwerken (Heinz) basierend auf linearer Integer-Programmierung. Gleichzeitig hat sich unser Konzept der semantischen Ähnlichkeiten zwischen zwei Genen basiert auf Gene Ontology (GO) Annotationen etabliert und ist eine wichtige Grundlage für viele analytische Ansätze in der Bioinformatik geworden. Unter der Annahme, dass eine höhere Anzahl von semantisch ähnlichen funktionellen Genannotationen biologisch relevantere Interaktionen reflektieren, wurde eine Bewertung der Kanten für funktionelle Netzwerkanalyse entwickelt. Die Kombination beider Ansäte, die Kantenbewertung, basierend auf der GO-Ähnlichkeit und die Netzknotenbewertung bezogen auf die Expression der Proteine ermöglichte in den analysierten Zelltypen (unter Nutzung von Daten z.B. aus Proteomstudien) die Identifizierung funktioneller Module als maximal bewertete Subnetzwerke in großen Proteinnetzwerken. Dieses Verfahren wurde an verschiedenen Proteomdatensätzen getestet (verschiedene Arten von Blutzellen, embryonale Stammzellen), um Proteinmodule zu identifizieren, die funktionell den jeweiligen Zelltyp charakterisieren. Weitere Ansätze der Methode erfassen die Analyse von quantitativen Phosphoproteom-Daten zur Identifizierung des Signalflusses in einem Kinase-Substrat Netzwerk. Diese skalierbaren Ansätze ermöglichen eine reibungslose Integration von Daten aus verschiedenen Quellen und liefern biologisch relevante Signalmodule. KW - Systembiologie KW - Netzwerkanalyse KW - Thrombozyt KW - Integrated Knowledgebase KW - Network Analysis KW - Platelets KW - Integrierte Datenbank KW - Blutplättchen Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85730 ER - TY - THES A1 - Bucher, Daniel T1 - An Electrophysiological Analysis of Synaptic Transmission at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction T1 - Eine elektrophysiologische Untersuchung synaptische Transmission an der neuromuskulären Endplatte von Drosophila-Larven N2 - In this thesis, synaptic transmission was studied electrophysiologically at an invertebrate model synapse, the neuromuscular junction of the Drosophila 3rd instar wandering larvae. In the first part, synaptic function is characterized at the neuromuscular junction in fly lines which are null mutants for the synaptic proteins “the synapse associated protein of 47 kDa” (Sap-47156), Synapsin (Syn97), the corresponding double mutant (Sap-47156, Syn97), a null mutant for an as yet uncharacterized Drosophila SR protein kinase, the Serine-Arginine protein kinase 3 (SRPK3), and the Löchrig (Loe) mutant which shows a strong neurodegenerative phenotype. Intracellular voltage recordings from larval body wall muscles 6 and 7 were performed to measure amplitude and frequency of spontaneous single vesicle fusion events (miniature excitatory junction potentials or mEJPs). Evoked excitatory junction potentials (eEJPs) at different frequencies and calcium concentrations were also measured to see if synaptic transmission was altered in mutants which lacked these synaptic proteins. In addition, structure and morphology of presynaptic boutons at the larval neuromuscular junction were examined immunohistochemically using monoclonal antibodies against different synaptic vesicle proteins (SAP-47, CSP, and Synapsin) as well as the active zone protein Bruchpilot. Synaptic physiology and morphology was found to be similar in all null mutant lines. However, Löchrig mutants displayed an elongated bouton morphology, a significant shift towards larger events in mEJP amplitude frequency histograms, and increased synaptic facilitation during a 10 Hz tetanus. These deficits suggest that Loe mutants may have a defect in some aspect of synaptic vesicle recycling. The second part of this thesis involved the electrophysiological characterization of heterologously expressed light activated proteins at the Drosophila neuromuscular junction. Channelrhodopsin-2 (ChR2), a light gated ion channel, and a photoactivated adenylate cyclase (PAC) were expressed in larval motor neurons using the UAS-Gal4 system. Single EJPs could be recorded from muscles 15, 16, and 17 when larva expressing ChR2 were illuminated with short (100 ms) light pulses, whereas long light pulses (10 seconds) resulted in trains of EJPs with a frequency of around 25 Hz. Larva expressing PAC in preparations where motor neurons were cut from the ventral ganglion displayed a significant increase in mEJP frequency after a 1 minute exposure to blue light. Evoked responses in low (.2 mM) calcium were also significantly increased when PAC was stimulated with blue light. When motor nerves were left intact, PAC stimulation resulted in light evoked EJPs in muscles 6 and 7 in a manner consistent with RP3 motor neuron activity. ChR2 and PAC are therefore useful and reliable tools for manipulating neuronal activity in vivo. N2 - Thema dieser Arbeit war die elektrophysiologische Untersuchung synaptischer Transmission, untersucht an einer Modellsynapse in Invertebraten, der neuromuskulären Synapse von Drosophila- Larven des dritten Larvalstadiums. Im ersten Teil dieser Arbeit, wurde die synaptische Funktion an der neuromuskulären Synapse von Nullmutanten für verschiedene synaptische Proteine charakterisiert (das synapse associated protein of 47 kDa (Sap-47156), Synapsin (Syn97), eine bis dahin uncharakterisierte Drosophila SR-Proteinkinase (SRPK3), und eine Mutante mit einem starken neurodegenerativen Phänotyp (Loe)). Intrazelluläre Ableitungen wurden von Muskel 6 und 7 des Hautmuskelschlauches durchgeführt, um die Amplitude und Frequenz der spontanen Freisetzung von Neurotransmitter aus einzelnen synaptischen Vesikeln (miniature excitatory junction potentials oder mEJPs) zu messen. Außerdem wurden Evoked excitatory junction potentials (eEJPs) bei verschiedenen Frequenzen und verschiedenen Kalziumkonzentrationen gemessen, um zu erforschen, ob die synaptische Transmission in den genannten Mutanten verändert ist. Zusätzlich wurde die Struktur und die Morphology der präsynaptischen Boutons immunhistochemisch untersucht. Dabei wurden monoklonal Antikörper gegen verschiedene Proteine der synaptischen Vesikel (SAP-47, CSP und Synapsin) und gegen das Aktive Zone Protein Bruchpilot benutzt. Die synaptische Physiologie war in den genannten Nullmutanten für synaptische Proteine nicht verändert, im Vergleich zu den wildtypischen Kontrollen, während Löchrig-Mutanten Defekte der synaptischen Übertragung zeigten, die im Einklang standen mit einem Defekt des Recyclings synaptischer Vesikel. Der zweite Teil dieser Arbeit beinhaltet die elektrophysiologische Charakterisierung von heterolog exprimierten Licht-aktivierbaren Proteinen an der neuromuskulären Synapse von Drosophila. Channelrhodopsin-2 (ChR2), ein Licht gesteuerter Ionenkanal und eine Licht-aktivierbare Adenylatcyclase (PAC) wurden mit Hilfe des UAS-Gal4-Systems an der larvalen, neuromuskulären Synapse exprimiert. Wenn ChR2-exprimierende Larven mit kurzen (100ms) Lichtpulsen beleuchtet wurden, konnten einzelne EJPs von den Muskeln 15, 16 und 17 abgeleitet werden. Längere Lichtpulse (10 Sekunden) führten zu einer Serie von EJPs mit einer Frequenz von ca. 25 Hz. Larven, die PAC exprimierten zeigten, in Präparationen in denen die Motoneurone vom Ventralganglion gelöst wurden, nach einminütiger Belichtung mit Blaulicht einen signifikanten Anstieg der mEJP-Frequenz. Auch die EJPs waren in einer Umgebung mit geringer Kalziumkonzentration (0,2 mM) signifikant erhöht, wenn PAC durch Blaulicht stimuliert wurde. Wurden die Motoneurone intakt gelassen, führte die Stimulation der PAC durch Blaulicht zu EJPs in den Muskeln 6 und 7, die im Einklang standen mit RP3 Motoneuronaktivität. Beide Proteine (ChR2 und PAC) erwiesen sich daher als nützliche, zuverlässige Werkzeuge, um die neurale Aktivität in vivo zu manipulieren. KW - Drosophila KW - synapse KW - elektrophysiologie KW - Drosophila KW - synapse KW - electrophysiology Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27784 ER - TY - THES A1 - Brembs, Björn T1 - An Analysis of Associative Learning in Drosophila at the Flight Simulator T1 - Eine Ananlyse des assoziativen Lernens von Drosophila im Flugsimulator N2 - Most natural learning situations are of a complex nature and consist of a tight conjunction of the animal's behavior (B) with the perceived stimuli. According to the behavior of the animal in response to these stimuli, they are classified as being either biologically neutral (conditioned stimuli, CS) or important (unconditioned stimuli, US or reinforcer). A typical learning situation is thus identified by a three term contingency of B, CS and US. A functional characterization of the single associations during conditioning in such a three term contingency has so far hardly been possible. Therefore, the operational distinction between classical conditioning as a behavior-independent learning process (CS-US associations) and operant conditioning as essentially behavior-dependent learning (B-US associations) has proven very valuable. However, most learning experiments described so far have not been successful in fully separating operant from classical conditioning into single-association tasks. The Drosophila flight simulator in which the relevant behavior is a single motor variable (yaw torque), allows for the first time to completely separate the operant (B-US, B-CS) and the classical (CS-US) components of a complex learning situation and to examine their interactions. In this thesis the contributions of the single associations (CS-US, B-US and B-CS) to memory formation are studied. Moreover, for the first time a particularly prominent single association (CS-US) is characterized extensively in a three term contingency. A yoked control shows that classical (CS-US) pattern learning requires more training than operant pattern learning. Additionally, it can be demonstrated that an operantly trained stimulus can be successfully transferred from the behavior used during training to a new behavior in a subsequent test phase. This result shows unambiguously that during operant conditioning classical (CS-US) associations can be formed. In an extension to this insight, it emerges that such a classical association blocks the formation of an operant association, which would have been formed without the operant control of the learned stimuli. Instead the operant component seems to develop less markedly and is probably merged into a complex three-way association. This three-way association could either be implemented as a sequential B-CS-US or as a hierarchical (B-CS)-US association. The comparison of a simple classical (CS-US) with a composite operant (B, CS and US) learning situation and of a simple operant (B-US) with another composite operant (B, CS and US) learning situation, suggests a hierarchy of predictors of reinforcement. Operant behavior occurring during composite operant conditioning is hardly conditioned at all. The associability of classical stimuli that bear no relation to the behavior of the animal is of an intermediate value, as is operant behavior alone. Stimuli that are controlled by operant behavior accrue associative strength most easily. If several stimuli are available as potential predictors, again the question arises which CS-US associations are formed? A number of different studies in vertebrates yielded amazingly congruent results. These results inspired to examine and compare the properties of the CS-US association in a complex learning situation at the flight simulator with these vertebrate results. It is shown for the first time that Drosophila can learn compound stimuli and recall the individual components independently and in similar proportions. The attempt to obtain second-order conditioning with these stimuli, yielded a relatively small effect. In comparison with vertebrate data, blocking and sensory preconditioning experiments produced conforming as well as dissenting results. While no blocking could be found, a sound sensory preconditioning effect was obtained. Possible reasons for the failure to find blocking are discussed and further experiments are suggested. The sensory preconditioning effect found in this study is revealed using simultaneous stimulus presentation and depends on the amount of preconditioning. It is argued that this effect is a case of 'incidental learning', where two stimuli are associated without the need of reinforcement. Finally, the implications of the results obtained in this study for the general understanding of memory formation in complex learning situations are discussed. N2 - Die meisten Lernsituationen sind von komplexer Natur und bestehen aus einer engen Verknüpfung des Verhaltens eines Tieres (B) mit den wahrgenommenen Stimuli. Entsprechend der Reaktion des Tieres auf diese Stimuli werden diese als entweder biologisch neutral (konditionierte Stimuli, CS) oder signifikant (unkonditionierte Stimuli, US oder Verstärker) klassifiziert. Eine typische Lernsituation ist also durch eine Dreiwegebeziehung zwischen B, CS und US gekennzeichnet. Eine funktionelle Charakterisierung der Einzelassoziationen während des Lernens in einer solchen Dreiwegebeziehung war experimentell bisher kaum zugänglich. Operationell wird daher zwischen klassischer Konditionierung als verhaltensunabhängigem Lernvorgang (CS-US Assoziationen) und operanter Konditionierung als essentiell verhaltensabhängigem Lernen (B-US Assoziationen) unterschieden. In den meisten bisher beschriebenen Lernexperimenten ist noch nicht einmal diese Trennung in Einzelassoziationen vollständig durchzuführen gewesen. Im Drosophila Flugsimulator, in dem das relevante Verhalten eine einzelne Bewegungsvariable (das Gierungsdrehmoment) ist, können zum ersten Mal die operanten (B-US, B-CS) und die klassischen (CS-US) Bestandteile einer komplexen Lernsituation völlig getrennt und auf ihre Interaktionen hin untersucht werden. In der vorliegenden Arbeit wurden sowohl die Beiträge der Einzelassoziationen (CS-US, B-US und B-CS) bei der Akquisition der Gedächtnismatrize in komplexen Lernsituationen untersucht, als auch die Eigenschaften einer besonders prominenten Einzelassoziation (CS-US) während einer komplexen Lernsituation zum ersten Mal weitgehend charakterisiert. Mit einer gejochten (yoked) Kontrolle kann gezeigt werden, dass das klassische (CS-US) Musterlernen umfangreicheres Training als das operante Musterlernen erfordert. Außerdem kann die Fliege einen operant gelernter Stimulus von dem Verhalten mit dem er gelernt wurde, auf ein anderes Verhalten im Test übertragen. Dieses Resultat zeigt eindeutig, dass während der operanten Konditionierung klassische (CS-US) Assoziationen gebildet werden können. In einer Erweiterung dieses Ergebnisses zeigt sich, dass solch eine klassische Assoziation, wenn sie gebildet wird, die Bildung einer operanten Assoziation blockiert, die ohne operante Kontrolle der klassisch assoziierten Stimuli gebildet würde. Stattdessen scheint sich der operante Bestandteil weniger ausgeprägt zu entwickeln und ist eventuell in einer komplexen Dreiwege-Assoziation eingebunden. Die Dreiwege-Assoziation könnte entweder als sequentielle B-CS-US oder als hierarchische (B-CS)-US Assoziation implementiert sein. Der Vergleich einer einfachen klassischen (CS-US) mit einer komplexen operanten (B, CS und US) Lernsituation und einer einfachen operanten (B-US) mit einer anderen komplexen operanten (B, CS und US) Lernsituation, ermöglicht das Postulat einer Hierarchie der Prädiktoren für Verstärker. Operantes Verhalten während einer komplexen operanten Lernsituation wird wenig oder überhaupt nicht konditioniert. Die Assoziierbarkeit der klassischen Stimuli ohne Relation zum Verhalten des Tieres (CS-US) sind - wie operantes Verhalten alleine (B-US) auch - von mittlerer Assoziierbarkeit. Stimuli die von operantem Verhalten kon-trolliert werden, erhöhen am schnellsten ihre assoziative Stärke. Sind mehrere Stimuli während des Lernvorgangs zugänglich, stellt sich erneut die Frage, welche von den CS-US Assoziationen gebildet werden. Eine Vielzahl verschiedenster Studien in Vertebraten wiesen erstaunlich übereinstimmende Ergebnisse auf. Diese Ergebnisse inspirierten dazu, die Eigenschaften der CS-US Assoziationen in der komplexen Lernsituation am Flugsimulator zu untersuchen und mit Ergebnissen in Vertebraten zu vergleichen. Es wird erstmals gezeigt, dass Drosophila zusammengesetzte Stimuli lernen und die Einzelkomponenten unabhängig voneinander und in etwa ähnlichen Proportionen wiedererkennen kann. Der Versuch "Lernen zweiter Ordnung" mit diesen Stimuli zu erzielen, liefert einen relativ kleinen Effekt. Die Gegenüberstellung mit Daten aus Vertebraten liefert sowohl Abweichungen als auch Übereinstimmungen hinsichtlich der Lernregeln, die beim klassischen Konditionieren von Vertebraten gefunden wurden. Während es ein deutliches "sensorisches Präkonditionieren" gibt, konnte kein "Blocken" gefunden werden. Das sensorische Präkonditionieren in dieser Studie zeigt sich bei gleichzeitiger Stimuluspräsentation und ist vom Mass der Präkonditionierung abhängig. Es wird argumentiert, dass dieser Effekt ein Fall "beiläufigen Lernens" ist, bei dem zwei Stimuli ohne die Notwendigkeit der Verstärkung assoziiert werden. Für das nicht gefundene Blocken werden mögliche Gründe diskutiert und weiterführende Experimente vor-geschlagen. Abschließend wird über die Implikationen der Resultate dieser Arbeit für das allgemeine Verständnis der Gedächtnisbildung in komplexen Lernsituationen nachgedacht. KW - Taufliege KW - Lernen KW - Flugsimulator KW - Drosophila KW - Lernen KW - Gedächtnis KW - Assoziation KW - assoziativ KW - Flugsimulator KW - Lernregeln KW - operantes Konditionieren KW - klassisches Konditionieren KW - Drosophila KW - learning KW - memory KW - association KW - associative KW - flight simulator KW - learning rules KW - operant conditioning KW - classical conditioning Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1039 ER - TY - THES A1 - Glos, Julian T1 - Amphibian communities of the dry forest of Western Madagascar : taxonomy, ecology and conservation T1 - Amphibiengemeinschaften im westmadagassischen Trockenwald: Taxonomie, Ökologie und Naturschutz N2 - In meiner Arbeit habe ich taxonomische, gemeinschaftsökologische und autökologische Aspekte im westmadagassischen Trockenwald untersucht. Ziel dieser Arbeit war es Antworten auf die Fragen zu geben wie die einzelnen Arten die Habitate in Raum und Zeit nutzen, welchen Einfluss abiotische Parameter, Austrocknungsrisiko der Laichgewässer und Mikrohabitat haben und wie Prädatoren die Gemeinschaft und das Verhalten einzelner Arten beeinflussen. Somit trägt diese Arbeit dazu bei die grundlegenden Mechanismen zu verstehen, die die Zusammensetzung einer Lebensgemeinschaft bestimmen. Im Einzelnen untersuchte ich hierzu folgende Fragestellungen: Aus welchen Arten bestehen die Anurengemeinschaften des westmadagassischen Trockenwaldes, und wie lassen sich diese Arten morphologisch voneinander abgrenzen? Welche Unterschiede finden sich zwischen den Arten bezüglich ihres Paarungssystems, ihrer life-history und ihrer Habitatwahl bzw. den Anpassungen an ihr Habitat? Gibt es spezifische Kaulquappengemeinschaften, die sich anhand biotischer und abiotischer Umweltvariablen vorhersagen lassen? Unterscheiden sich die Muster der Vorhersagbarkeit von Gemeinschaften zwischen unterschiedlichen Habitattypen innerhalb eines lokalen räumlichen Skalenniveaus? Wie beeinflusst das Vorkommen von Raubfeinden die Verteilung von Kaulquappen und deren Verhalten auf der räumlichen Skalenebene einzelner Laichgewässer? Anhand welcher Umweltvariablen lässt sich die Laichplatzwahl von Anuren in diesem Habitat vorhersagen? Wie lassen sich die Ergebnisse nutzen, um Empfehlungen zum Schutz bedrohter Arten auszusprechen? In dieser Arbeit beschreibe ich eine Froschart wissenschaftlich neu. Diese Art, Scaphiophryne menabensis, ist die seltenste Froschart in ihrem Verbreitungsgebiet, und aus meiner Arbeit resultiert die dringende Empfehlung, sie in ein bestehendes Schutzkonzept für den Kirindy-Wald und seine Umgebung mit einzubeziehen. Weiterhin beschreibe ich wissenschaftlich erstmalig in dieser Arbeit fünf Kaulquappenarten und präsentiere Daten zu Ökologie, life-history und Verhalten dieser Arten. Die wissenschaftliche Beschreibung weiterer Frosch- und Kaulquappenarten ist Gegenstand noch andauernder Studien (Scaphiophryne sp., Heterixalus carbonei und H. tricolor; Revision der Kaulquappen von Scaphiophryne). Die Ergebnisse dieser Arbeit stellen damit die Basis für alle weiteren ökologischen Studien an Fröschen und Kaulquappen dieses Ökosystems dar. FAZIT Die Amphibienfauna Madagaskars ist einzigartig, und sie stellt ein aufregendes Feld für ökologische Fragestellungen dar, sowohl als eigenständiges System betrachtet als auch als Modell für andere Systeme. Umso mehr verwundert es, dass bislang kaum detaillierte ökologische Studien an diesem System durchgeführt wurden. Die vorliegende Arbeit schafft zunächst mit der taxonomischen Beschreibung der vorkommenden Arten die Basis für ökologische Fragestellungen und zeigt dann auf den Ebenen sowohl der Gemeinschaft als auch einzelner Arten, wie verschiedene Umweltfaktoren die Verteilung von Anuren in Raum und Zeit beeinflussen. Es zeigt sich, dass sowohl statische Eigenschaften der Gewässer als auch dynamische Faktoren wie Raubfeinde oder das Vorhandensein anderer Kaulquappen die Verteilung der Arten auf verschiedenen räumlichen Skalenebenen sowie deren Verhalten beeinflussen. Somit tragen die Ergebnisse dieser Arbeit dazu bei, die grundlegenden Mechanismen zu verstehen, die die Zusammensetzung der Lebensgemeinschaften in diesem Ökosystem bestimmen. Nicht zuletzt ermöglichen diese Erkenntnisse, geeignete, artenorientierte Schutzkonzepte für diese in ihrer Existenz stark bedrohte Anurengemeinschaft zu entwickeln und die Effekte von Habitatzerstörung auf diese Gemeinschaft aufzuzeigen. N2 - The amphibian fauna of the Kirindy dry forest in western Madagascar Abstracts of chapter 5 and 6 Living apart together – patterns of tadpole communities in a western Madagascan dry forest Whether communities are established in a deterministic or in a stochastic manner depends to a large degree on the spatial scale considered. In this study we use a tadpole community in the dry forest of western Madagascar to show that when within-site habitat diversity is considered, communities may also differ in two community parameters (species composition and species richness) within one geographic scale. Forest ponds and riverbed ponds are two types of breeding habitat that are both used by anurans but that differ generally in their temporal availability, predation pressure, and environmental characteristics. In forest ponds, tadpole communities were very predictable by the physical properties of the ponds and by their vegetation characteristics. In contrast, the riverbed communities were not predictable. We offer two hypotheses to explain this phenomenon. This study clearly demonstrates differing patterns in community organization in two natural habitats within one site, and therefore, highlights the importance of considering local conditions and within-site habitat diversity in community studies. Modeling the habitat use of an endangered dry-forest frog from Western Madagascar A crucial factor for the successful reproduction and thus conservation of an amphibian species is the availability of suitable waters as breeding sites. In this chapter, we examine the use of breeding sites of an endangered, local endemic frog of Western Madagascar, Aglyptodactylus laticeps, over a three year period. Logistic regression was used to model the relationship between the species’ breeding habitat use and environmental variables. This model was aimed to be predictive, rather than explanatory, and only environmental variables were included that are assessable in a time and cost effective manner, and that can therefore be used as an easy-to-use management tool in applied conservation. On the local scale of the Kirindy concession, A. laticeps is restricted to forest with a relatively low degree of disturbance and closed canopy cover. The model identified three environmental variables that suffice to satisfactorily predict the use of respective breeding sites, namely leaf litter, vegetation coverage and surface water plants. Based on these results, we present recommendations for the conservation management of this frog. Furthermore, the presence or absence of this species within its natural range indicates the relative degree of environmental integrity of its habitat, and we therefore consider this species as a suitable indicator species of temporary aquatic habitats within the dry forest that are characterized by a low water permanency and high leaf litter coverage. This study demonstrates that models constructed from basic ecological knowledge of relevant species may serve as valuable management tools in applied conservation. KW - Lurche KW - Tiergesellschaft KW - Ökologie KW - Madagaskar KW - Kaulquappen KW - Gemeinschaftsökologie KW - Räuber-Beute Interaktionen KW - Habitatmodel KW - tadpoles KW - community ecology KW - predator-prey interactions KW - habitat model Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-18146 ER - TY - THES A1 - Mattern, Felix T1 - Alterungsbedingte Effekte auf DNA-Methylierungsprofile entwicklungsrelevanter Gene in Eizellen und Embryonen am Modellorganismus Bos taurus T1 - Aging-induced effects on DNA methylation profiles of developmental genes in oocytes and embryos on the model organism Bos taurus N2 - Die postovulatorische Alterung sowie die ovarielle Alterung konnten bei der Anwendung assistierter Reproduktionstechniken (ARTs) als entscheidende Faktoren identifiziert werden, die den Reproduktionserfolg nachhaltig beeinträchtigen. Die postovulatorische Alterung tritt ein, sobald die reife Eizelle nicht mehr innerhalb ihres physiologischen Zeitfensters befruchtet wird. Die ovarielle Alterung beschreibt hingegen die Abnahme des Follikel-Vorrats mit zunehmendem Alter des weiblichen Individuums bzw. des Ovars. Sowohl die postovulatorische Alterung als auch die ovarielle Alterung führen u.a. zu einer reduzierten Oozytenqualität und einer geringeren Blastozystenrate. Die Zielsetzung dieser Arbeit bestand darin, den Einfluss der postovulatorischen Alterung und der ovariellen Alterung im Holstein-Rind (Bos taurus) auf die DNA-Methylierung entwicklungsrelevanter Gene in Eizellen und Embryonen zu untersuchen. Aus Schlachthof-Ovarien wurden Antralfollikeln unterschiedlicher Größe (<2 mm, 3-5 mm und >6 mm) isoliert. Eizellen aus Follikeln der Größe 3-5 mm wurden für 24h (physiologisch) und 48h (gealtert) in vitro gereift (IVM). Die gereiften Oozyten wurden anschließend in vitro fertilisiert und Embryonen im 4-6 Zellstadium generiert. Sowohl in den unreifen Eizellen aus Antralfollikeln unterschiedlicher Größe als auch in den gereiften Oozyten und den Embryonen wurde die Promotormethylierung der Gene bH19, bSNRPN, bZAR1, bDNMT3A, bOCT4, bDNMT3Lo und bDNMT3Ls analysiert. Zur Untersuchung der ovariellen Alterung wurden mittelgroßen Antralfollikel aus Ovarien lebender Rinder (in vivo) unterschiedlichen Alters (9-12 Monate, 3-7 Jahre und 8-11 Jahre) gewonnen. In den daraus isolierten unreifen Eizellen wurde die DNA-Methylierung der Promotorregionen der Gene bTERF2, bREC8, bBCL-XL, bPISD, bBUB1, bDNMT3Lo, bH19 und bSNRPN bestimmt. Als Methode zur Analyse der Promotormethylierung wurde die Limiting Dilution Bisulfit-Sequenzierung angewendet. In unreifen Eizellen aus Antralfollikeln unterschiedlicher Größe (<2 mm, 3-5 mm und >6 mm) konnte ein erhöhtes Auftreten abnormal methylierter Allele in den geprägten Genen bH19 und bSNRPN von Eizellen kleiner Follikel (<2 mm) identifiziert werden. Dieses Ergebnis könnte eine mögliche Ursache einer bereits bekannten und mehrfach beschriebenen geringeren Entwicklungskompetenz von Eizellen kleiner Follikel (<2 mm) auf epigenetischer Ebene darstellen. Die verlängerte Reifungsdauer der IVM-Eizellen hatte eine signifikante Hypermethylierung in der Promotorregion des Gens DNMT3Lo von 48h-gereiften Eizellen zur Folge. Beim Übergang von 48h-gereiften Eizellen zum Embryo konnte eine signifikante Hypomethylierung von CpG7 des stammzellspezifischen Transkripts DNMT3Ls beobachtet werden. Diese CpG-Stelle wies ebenfalls einen signifikanten Anstieg von CpGs mit nicht-eindeutigem Methylierungszustand in unreifen Eizellen mit steigender Follikelgröße auf. Da sich die CpG-Position innerhalb eines Sequenz-Motivs einer Bindungsstelle des Transkriptionsfaktors CREB befindet, könnten die Methylierungsdaten auf eine Interaktion zwischen dem Transkriptionsfaktor CREB und der DNA-Methylierung während der Entwicklung und Reifung der Eizelle sowie der Transition von der Eizelle zum Embryo hindeuten. Die DNA-Methylierungsprofile der untersuchten Gene in unreifen Eizellen aus Kühen unterschiedlichen Alters (9-12 Monate, 3-7 Jahre und 8-11 Jahre) wiesen keine signifikanten Unterschiede zwischen den Altersgruppen auf. Die ovarielle Alterung bei Rindern zwischen 9 Monaten und 11 Jahren zeigte damit keinen Effekt auf die DNA-Methylierung der untersuchten Promotorregionen der Gene bTERF2, bREC8, bBCL-XL, bPISD, bBUB1, bDNMT3Lo, bH19 und bSNRPN. Nach einer simulierten postovulatorischen Alterung durch eine in vitro Reifung für 48h konnte eine Veränderung der DNA-Methylierung der Oozyten-spezifischen (DNMT3Lo) und Stammzell-spezifischen (DNMT3Ls) Promotoren des katalytisch inaktiven Cofaktors von DNMT3A, DNMT3L, beobachtet werden. Die veränderte DNA-Methylierung von DNMT3Ls tritt dabei erst im frühen Embryo in Erscheinung und interagiert vermutlich mit dem Transkriptionsfaktor CREB. Die Veränderungen von DNMT3Lo in Eizellen und DNMT3Ls in den daraus generierten Embryonen lässt vermuten, dass es sich hierbei um eine dynamische Anpassung des Embryos auf äußere Umweltbedingungen der Eizelle über die Methylierung der DNA handelt. N2 - Postovulatory aging and ovarian aging have been identified as key factors in assisted reproductive techniques (ARTs) and have a lasting effect on reproductive success. Postovulatory aging occurs if the mature egg is not fertilized within its physiological time window. On the other hand, ovarian aging describes the decrease in the follicular reserve with increasing age of the female or the ovary, respectively. Both post-ovulatory aging and ovarian aging result in reduced oocyte quality and lower blastocyst rate. The aim of this thesis was to explore the effects of postovulatory aging and ovarian aging in Holstein cattle (Bos taurus) on the DNA methylation of developmentally important genes in oocytes and embryos. Antral follicles of different sizes (<2 mm, 3-5 mm and> 6 mm) were isolated from slaughterhouse ovaries. Female germ cells from middle-sized follicles (3-5 mm) were matured for 24h (physiological conditions) and 48h (aged conditions) in vitro (IVM). The IVM- oocytes were subsequently fertilized in vitro and embryos at the 4-6 cell stage were generated. Promoter methylation of the genes bH19, bSNRPN, bZAR1, bDNMT3A, bOCT4, bDNMT3Lo and bDNMT3Ls was analysed in immature oocytes from antral follicles of different sizes as well as in matured oocytes and the respective embryos. For studying ovarian aging, middle-sized antral follicles were obtained in vivo from animals of different age groups (9-12 months, 3-7 years and 8-11 years). In the extracted immature gametes, the DNA methylation of the promoter regions of bTERF2, bREC8, bBCL-XL, bPISD, bBUB1, bDNMT3Lo, bH19 and bSNRPN was examined. The limiting dilution bisulfite (pyro)sequencing method was applied to determine the promoter methylation of the candidate genes at the single allele level. In immature oocytes from antral follicles of different diameters (<2 mm, 3-5 mm and> 6 mm) an increased occurrence of abnormally methylated alleles of the imprinted genes bH19 and bSNRPN was identified in small follicles (<2 mm). This failure to establish imprinting could be a possible cause of a well-known reduced developmental potential of small follicles (<2 mm) at the epigenetic level. The extended maturation time of the IVM-oocytes resulted in a significant hypermethylation in the promoter region of DNMT3Lo in 48h matured oocytes. After transition from 48h matured oocytes to embryos, a significant hypomethylation of CpG7 of the stem cell specific transcript DNMT3Ls was detected. The same CpG site showed a significant increase of CpGs with unclear methylation state in immature female germ cells with increasing follicular size. This CpG position is located within a potential binding site of the transcription factor CREB. Thus, the methylation data indicates an interaction between the transcription factor CREB and the DNA methylation during development and maturation of oocytes as well as during transition from the oocyte to the embryo. The DNA methylation profiles of the analysed genes in immature oocytes from cows of different age (9-12 months, 3-7 years and 8-11 years) showed no significant differences between age groups. Hence, the ovarian aging in cattle between 9 months and 11 years caused no effect on the DNA methylation of bTERF2, bREC8, bBCL-XL, bPISD, bBUB1, bDNMT3Lo, bH19 and bSNRPN. After a simulated postovulatory aging by in vitro maturation for 48h, a change in the DNA methylation of the oocyte-specific (DNMT3Lo) and stem cell-specific (DNMT3Ls) promoters of the catalytically inactive DNA-methyltransferase DNMT3L was observed. The altered DNA methylation of DNMT3Ls occurs in the early embryo and probably interacts with the transcription factor CREB. The changes of DNMT3Lo in oocytes and DNMT3Ls in the resulting embryos might represent a dynamic adaptation to external environmental conditions. KW - Oozyte KW - Epigenetik KW - Altern KW - DNS-Methyltransferase KW - Ovarielle Alterung KW - Postovulatorische Alterung KW - Antralfollikel KW - Holstein Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-144562 ER - TY - THES A1 - Maierhofer, Anna T1 - Altersassoziierte und strahleninduzierte Veränderungen des genomweiten DNA-Methylierungs-Profils T1 - Age-associated and radiation-induced changes in genome-wide DNA methylation N2 - Der Prozess des Alterns ist ein komplexer multifaktorieller Vorgang, der durch eine sukzessive Verschlechterung der physiologischen Funktionen charakterisiert ist. Ein hohes Alter ist der Hauptrisikofaktor für die meisten Krankheiten, einschließlich Krebs und Herz-Kreislauf-Erkrankungen. Das Verständnis der epigenetischen Mechanismen, die in den Prozess des Alterns involviert sind, könnte zur Entwicklung pharmakologischer Interventionen beitragen, die nicht nur die Lebenserwartung erhöhen, sondern auch den Beginn des altersassoziierten funktionellen Abbaus verzögern könnten. Durch die Langzeit-Kultivierung primärer humaner Fibroblasten wurde ein in vitro Modell für das Altern etabliert, das die Identifizierung altersassoziierter DNA-Methylierungs-Veränderungen ermöglichte. Die in vitro Alterung konnte mit einer globalen Hypomethylierung und einer erhöhten DNA-Methylierung der ribosomalen DNA assoziiert werden. Darüber hinaus konnten DNA-Methylierungs-Veränderungen in Genen und Signalwegen, die für das Altern relevant sind, und ein erhöhtes epigenetisches Alter nachgewiesen werden. Das in vitro Modell für das Altern wurde verwendet, um neben den direkten Effekten ionisierender Strahlung auf die DNA-Methylierung auch deren Langzeit-Effekte zu untersuchen. Die Strahlentherapie ist ein entscheidendes Element der Krebstherapie, hat aber auch negative Auswirkungen und kann unter anderem das Risiko für die Entwicklung eines Zweittumors erhöhen. Bei externer Bestrahlung wird neben dem Tumor auch gesundes Gewebe ionisierender Strahlung ausgesetzt. Daher ist es wichtig zu untersuchen, wie Zellen mit intakten DNA-Reparatur-Mechanismen und funktionierenden Zellzyklus-Checkpoints durch diese beeinflusst werden. In der frühen Phase der DNA-Schadensantwort auf Bestrahlung wurden in normalen Zellen keine wesentlichen DNA-Methylierungs-Veränderungen beobachtet. Mehrere Populations-Verdoppelungen nach Strahlenexposition konnten dagegen eine globale Hypomethylierung, eine erhöhte DNA-Methylierung der ribosomalen DNA und ein erhöhtes epigenetisches Alter detektiert werden. Des Weiteren zeigten Gene und Signalwege, die mit Krebs in Verbindung gebracht wurden, Veränderungen in der DNA-Methylierung. Als Langzeit-Effekte ionisierender Strahlung traten somit die mit der in vitro Alterung assoziierten DNA-Methylierungs-Veränderungen verstärkt auf und ein epigenetisches Muster, das stark an das DNA-Methylierungs-Profil von Tumorzellen erinnert, entstand. Man geht davon aus, dass Veränderungen der DNA-Methylierung eine aktive Rolle in der Entwicklung eines Tumors spielen. Die durch ionisierende Strahlung induzierten DNA-Methylierungs-Veränderungen in normalen Zellen könnten demnach in die Krebsentstehung nach Strahlenexposition involviert sein und zu dem sekundären Krebsrisiko nach Strahlentherapie beitragen. Es ist bekannt, dass Patienten unterschiedlich auf therapeutische Bestrahlung reagieren. Die Ergebnisse dieser Arbeit weisen darauf hin, dass die individuelle Sensitivität gegenüber ionisierender Strahlung auch auf epigenetischer Ebene beobachtet werden kann. In einem zweiten Projekt wurden Gesamtblutproben von Patienten mit Werner-Syndrom, einer segmental progeroiden Erkrankung, und gesunden Kontrollen analysiert, um mit dem vorzeitigen Altern in Verbindung stehende DNA-Methylierungs-Veränderungen zu identifizieren. Werner-Syndrom konnte nicht mit einer globalen Hypomethylierung, jedoch mit einer erhöhten DNA-Methylierung der ribosomalen DNA und einem erhöhten epigenetischen Alter assoziiert werden. Das vorzeitige Altern geht demzufolge mit spezifischen epigenetischen Veränderungen einher, die eine Beschleunigung der mit dem normalen Altern auftretenden DNA-Methylierungs-Veränderungen darstellen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte die Bedeutung epigenetischer Mechanismen im Prozess des Alterns hervorgehoben werden und gezeigt werden, dass sowohl exogene Faktoren, wie ionisierende Strahlung, als auch endogene Faktoren, wie das in Werner-Syndrom-Patienten mutiert vorliegende WRN-Gen, altersassoziierte DNA-Methylierungs-Veränderungen beeinflussen können. N2 - Aging is a complex, multifactorial process that is characterized by the successive deterioration of normal physiological functions. Age is the main risk factor for most diseases, including cancer. Understanding the epigenetic mechanisms that are involved in the aging process could contribute to the development of pharmacological interventions not only increasing lifespan but also delaying the onset of age-dependent functional decline. An in vitro model for aging was established by long-term culturing of primary human fibroblasts and used to identify age-associated changes in DNA methylation. In vitro aging could be linked to global hypomethylation, elevated DNA methylation of ribosomal DNA, a higher epigenetic age and alterations in DNA methylation of genes and pathways being relevant for aging. The in vitro model for aging allowed to analyse the long-term effects of ionizing radiation on DNA methylation in addition to their direct effects. Radiotherapy is an important element of cancer treatment but can also have negative effects and increase the risk of second cancers. Although radiotherapy is targeted to the tumour, it also affects the surrounding healthy tissue. Therefore, it is important to analyse the impacts of ionizing radiation on normal cells with intact DNA repair and cell cycle checkpoints. The early phase of DNA damage response to radiation does not seem to include great changes in DNA methylation in normal cells. In contrast, several population doublings after radiation exposure, global hypomethylation and DNA methylation changes of genes and pathways being linked to tumorigenesis were detected. Furthermore, DNA methylation of ribosomal DNA and the epigenetic age were increased. Thus, as long-term effects of ionizing radiation the age-associated changes in DNA methylation were enhanced and an epigenetic pattern strongly resembling the DNA methylation profile of tumour cells was observed. It is assumed that alterations in DNA methylation are not only side effects of carcinogenesis but rather play an active role during this process. Radiation-induced changes in DNA methylation could thus be involved in tumour development and contribute to the secondary cancer risk after radiotherapy. It is well known that patients react differently to therapeutic radiation. The results of this study suggest that individual radiation sensitivity is also reflected on epigenetic level. In a second project whole blood samples from patients with Werner syndrome, a segmental progeroid syndrome, and healthy controls were analysed to identify changes in DNA methylation associated with premature aging. Werner syndrome could not be linked to global hypomethylation, but to an increased epigenetic age and elevated methylation levels of ribosomal DNA. Hence, premature aging seems to be accompanied by specific alterations in DNA methylation representing an acceleration of the DNA methylation changes associated with normal aging. This work outlines the importance of epigenetic mechanisms in the aging process and shows that not only exogenous factors like ionizing radiation but also endogenous factors like Werner syndrome causing mutations in the WRN gene can influence age-associated changes in DNA methylation. KW - Methylierung KW - Ionisierende Strahlung KW - Altern KW - Progeria adultorum KW - Epigenetik KW - Epigenetische Uhr Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-174134 ER - TY - THES A1 - Lampert, Kathrin P. T1 - Alternative life history strategies in the West African reed frog, Hyperolius nitidulus T1 - Alternative Lebenslauf-Strategien beim westafrikanischen Kreideriedfrosch Hyperolius nitidulus N2 - Distinct juvenile behaviour differences, changes in adult sizes and reproductive capacity and a long reproductive period triggered the working hypothesis of two alternative life-cycle strategies favouring aestivation or immediate reproduction. The hypothesis for the life-cycles of Hyperolius nitidulus that differed from the commonly assumed reproductive strategy for this species was confirmed by the results of this study. Aestivated juveniles start to mature at the beginning of the rainy season and reproduce subsequently. Their tadpoles grow until metamorphosis and either reproduce in this same season, in which case their offspring aestivates (one year - two generations), or they delay reproduction to the following year and aestivate themselves (one year - one generation). Juveniles trying to reproduce as fast as possible will invest in growth and differentiation and show no costly adaptations to aestivation, while juveniles delaying reproduction to the following rainy season will be well adapted to dry season conditions. Indirect evidence for the existence of a second generation was found in all three investigation years: adult size decreased abruptly towards the end of the rainy season, mainly due to the arrival of very small individuals, and clutch size decreased abruptly. Also at the end of the rainy season juveniles had two behavioural types: one hiding on the ground and clearly avoiding direct sunlight and another sitting freely above ground showing higher tolerance towards dry season conditions (high air temperatures and low humidity). Skin morphology differed between the types showing many more purine crystals in a higher order in the dry-season adapted juveniles. The final proof for the existence of a second generation came with the recapture of individuals marked as juveniles when they left the pond. The 45 recaptured frogs definitely came back to the pond to reproduce during the same season in 1999. Second generation frogs (males and females) were significantly smaller than the rest of all adults and egg diameter was reduced. Clutch size did not differ significantly. It was found that females did not discriminate against second generation males when coming to the ponds to reproduce. Second generation males had a similar chance to be found in amplexus as first generation males. Indirect and direct evidence for a second generation matched very well. The sudden size decrease in adults occurred just at the time when the first marked frogs returned. The observation that freshly metamorphosed froglets were able to sit in the sun directly after leaving the water led to the assumption that the decision whether to aestivate or to reproduce already happens during the frogs' larval period. Water chemistry and the influence of light was investigated to look for the factors triggering the decision, but only contaminated water increased the number of juveniles ready for aestivation. Whether the life history polymorphism observed in Hyperolius nitidulus is due to phenotypic plasticity or genetic polymorphism is still not known. Despite this uncertainty, there is no doubt that the optimal combination of different life histories is profitable and may be a reason for the wide range and high local abundance of Hyperolius nitidulus. N2 - Deutliche Verhaltensunterschiede bei Juvenilen, Veränderungen in der Größe von Adultfröschen, reduzierte Gelegegrößen und eine lange Reproduktionsphase führten zu der Arbeitshypothese von möglicherweise zwei verschiedenen life-history Strategien für Hyperolius nitidulus: Ästivation oder unmittelbare Reproduktion. Die Hypothese der alternativen life-cycles wich vom allgemein angenommenen Lebensverlauf der Frösche ab, wurde aber in dieser Arbeit bestätigt. Ästivierte Jungfrösche entwickeln sich zu Beginn der Regenzeit zu Adulten und reproduzieren sich dann (= erste Generation). Ihre Kaulquappen wachsen entweder bis zur Metamorphose und reproduzieren sich dann in dieser Saison (Sommergeneration), in welchem Fall erst ihre Nachkommen wieder ästivieren (ein Jahr - zwei Generationen) oder sie verschieben ihre Reproduktion auf das nächste Jahr und ästivieren selbst (ein Jahr - eine Generation). Jungfrösche, die sofort versuchen, sich zu reproduzieren, sollten in schnelles Wachstum und Differenzierung investieren und keine teuren Anpassungen an die Ästivation aufweisen, während Jungtiere, die die Reproduktion auf das nächste Jahr verschieben, gut an Trockenzeitbedingungen angepasst sein sollten. Indirekte Hinweise auf eine kurzlebige Sommergeneration (= zweite Generation) gab es in allen Untersuchungsjahren: Die mittlere Adultgröße nahm gegen Ende der Regenzeit abrupt ab, hauptsächlich aufgrund der Ankunft extrem kleiner Tiere, und auch die Gelegegröße ging rapide zurück. Gegen Ende der Regenzeit gab es bei den Jungfröschen außerdem zwei verschiedene Verhaltenstypen: einen, der sich am Boden versteckte und deutlich direkte Sonnenbestrahlung mied und ein anderer, der frei an Grashalmen über dem Boden saß und höhere Toleranz gegenüber Trockenzeitbedingungen (hohe Temperaturen und niedrige Luftfeuchtigkeit) aufwies. Die Hautmorphologie dieser Verhaltenstypen war ebenfalls unterschiedlich. Die trockenadaptierten Tiere hatten mehr Purinkristalle, die außerdem stärker geordnet waren. Der Wiederfang von Tieren, die sich in derselben Regenzeit in der sie als Jungfrösche markiert worden waren, fortpflanzten, war der direkte Beweis für die Existenz Sommergeneration. 45 Frösche kamen 1999 in derselben Saison zurück, um sich zu reproduzieren. Frösche aus der Sommergeneration (=Fortpflanzung in der selben Saison) waren signifikant kleiner als der Rest der Frösche am Tümpel, und der Eidurchmesser von Gelegen von Zweitgenerationsweibchen war reduziert. Gelegegrößen zwischen erster und zweiter Generation waren nicht unterschiedlich. Reproduktionsbereite Weibchen unterschieden nicht zwischen Männchen der ersten und zweiten Generation. Männchen der zweiten Generation hatten daher dieselben Amplexuschancen. Direkte und indirekte Hinweise auf eine zweite Generation passten zeitlich sehr gut zusammen. Die plötzliche Größenreduktion in den Adulten trat genau zu dem Zeitpunkt auf, zu dem die ersten markierten Frösche zurückkamen, um sich zu reproduzieren. Die Beobachtung, dass frischmetamorphosierte Jungtiere in der Lage waren, direkt nach dem Verlassen des Wassers in der Sonne zu sitzen, führten zu der Annahme, dass die Entscheidung für Reproduktion oder Ästivation bereits während der larvalen Phase gefällt werden muss. Wasserchemie und der Einfluss von Licht wurden untersucht, allerdings erhöhte nur stark verschmutztes Wasser die Anzahl ästivationsbereiter Juveniler. Ob der in Hyperolius nitidulus gefundenen life-history Polymorphismus genetisch ist, oder ob es sich um phänotypische Plastizität handelt, ist noch nicht bekannt. Trotz dieser Unsicherheit gibt es keinen Zweifel, dass die optimale Kombination von verschiedenen life-history Strategien vorteilhaft ist und ein Grund für die weite Verbreitung und hohe lokale Abundanz von Hyperolius nitidulus sein könnte. KW - Westafrika KW - Parc National de la Como´e KW - Kreideriedfrosch KW - Fortpflanzung KW - Lebensdauer KW - Ontogenie KW - Fortpflanzung KW - Ökologie KW - Lebenslauf-Strategien KW - Kreideriedfrosch KW - Hyperolius KW - Reproduktion KW - Partnerwahl KW - Kaulquappenentwicklung KW - westafrikanische Savanne KW - life history strategies KW - reed frog KW - Hyperolius KW - reproduction KW - mate choice KW - tadpole development KW - West African savanna Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1677 ER - TY - THES A1 - Schäfer, Rolf T1 - Aktivierung von Caspasen in AKR-2B Mausfibroblasten T1 - Activation of caspases in AKR-2B mouse fibroblasts N2 - In der vorliegenden Arbeit konnte die essentielle Beteiligung von Caspasen im Zelltodmodell der AKR 2B-Mausfibroblasten nachgewiesen und ihre Aktivitäten charakterisiert werden. AKR 2B-Mausfibroblasten stellen eine subklonierte und gut charakterisierte Zellinie dar, in der durch Entzug des Serums der Zelltod induziert wird. Während des Zelltods sterben innerhalb von 6h etwa 50 Prozent einer dichtearretierten Kultur. Die überlebenden Zellen bleiben von diesem Mangelzustand für mindestens weitere 48h unbeeinflußt, benötigen aber zum Überleben eine Proteinneusynthese. Der Zelltod zeigt für eine Apoptose typische morphologische Veränderungen der Zelle, obwohl apoptotische Charakteristika, wie die oligonukleosomale Fragmentierung der DNA oder die Aufnahme der zerfallenen Zelle durch benachbarte Zellen, ausbleiben. Mittels unterschiedlicher Methoden konnte die Expression von mRNA aller für den apoptotischen Prozeß bekannten relevanten Caspasen in den AKR 2B-Mausfibroblasten nachgewiesen werden. Die Caspasen-1, -2, -3, -6 und -9 liegen in ihrer zymogenen Form konstitutiv in den Zellen vor. Mit Ausnahme der Caspase-9 konnte die durch Serumentzug induzierte Spaltung dieser Caspasen in Untereinheiten und somit ihre Aktivierung nicht detektiert werden. Die wesentliche Beteiligung dieser Cystein-Proteasen wurde jedoch durch den protektiven Effekt spezifischer Inhibitoren und den Nachweis ihrer spezifischen Aktivität bestimmt. Die Charakterisierung dieser enzymatischen Aktivitäten lieferte Hinweise zur Identität der aktivierten Caspasen. Neben einer konstitutiven VEIDase- und IETDase-Aktivität wird 3h nach Entzug des Serums eine DEVDase maximal aktiviert. Das Gemisch an Caspase-Aktivitäten wird durch eine DEVDase dominiert. Diese Aktivität wird zum größten Teil durch nur ein Enzym gestellt, wie durch eine Affinitätsmarkierung und 2D-Gelelektrophorese gezeigt wurde. KM- und Ki-Wert-Bestimmungen der DEVDase deuten darauf hin, daß dieses Enzym typische Effektoreigenschaften, wie die der Caspase-3, besitzt. Daneben werden Lamine während des Zelltods in AKR 2B-Mausfibroblasten abgebaut, was auf eine aktivierte Caspase-6 hinweist. Die enzymatischen Charakteristika dieser Protease weichen aber von den in AKR 2B-Mausfibroblasten festgestellten Werten deutlich ab, so daß man ihr nur eine untergeordnete Rolle im Caspasen-Gemisch zuordnen kann. Eine mehrfach chromatographische Reinigung der Aktivität bietet die beste Grundlage für eine anschließende Sequenzierung der Caspase mit dem Ziel ihrer Identifizierung. Durch die Expression des viralen Caspase-Inhibitors CrmA konnte eine tragende Rolle der Caspase-8 und damit des Rezeptor-vermittelten Weges in der Initiierung des apoptotischen Programms in AKR 2B-Mausfibroblasten ausgeschlossen werden. Gleiches gilt für den mitochondrial-vermittelten Weg, für dessen Beteiligung, bis auf die Spaltung der Caspase-9, keine Hinweise vorliegen. Der Weg, der zur Aktivierung der DEVDase führt, ist Ziel gegenwärtiger Untersuchungen. Substanzen, die Signalwege aktivieren PDGF-BB, TPA, Forskolin und 8Br-cAMP) oder auch Substanzen, deren Verbindung zu Signalwegen noch weitgehend offen ist, schützen die Zellen vor dem Zelltod. Der protektive Effekt dieser Signalwege konzentriert sich in einem Konvergenzpunkt, der auf noch unbekannte Weise die Aktivierung der Effektor-Caspasen blockiert. Die Identität dieses Konvergenzpunktes und von ihm ausgehenden protektiven Weges ist Ziel weiterer Untersuchungen. So ist es möglicherweise dieser Weg, der zum Überleben von 50 Prozent der AKR 2B-Mausfibroblasten während des Serumentzugs wesentlich beiträgt. N2 - In the work presented here, the essential involvement of caspases in the cell death of AKR 2B-fibroblasts could be proved as well as their activities could be characterized. Confluent AKR 2B-fibroblasts, a good characterized and subcloned cell line, rapidly disintegrate after serum deprivation. Dying of the cells ceases after 6 hours with a survival of 50 per cent. These surviving cells remain uneffected for additional 48 hours which is dependent on neo-protein biosynthesis. During cell death AKR 2B-fibroblasts show morphological changes characteristically for apoptosis, even though typical features like oligonucleosomal DNA fragmentation is absent. Using different approaches the expression of mRNA of all known caspases, which are believed to be involved in apoptosis essentially, was successfully detected in AKR 2B-fibroblasts. Caspases-1, -2, -3, -6 and -9 were constitutively expressed as zymogens. With the exception of Caspase-9, the processing into their active subunits induced by serum removal could not be detected. At least their considerable importance during cell death of AKR cells could be proved by using specific caspase inhibitors and by determination of their specific activity. The characterization of that activity gave some hints for the identity of activated caspases. Beside constutive VEIDase and IETDase activities, a DEVDase reaches its maximum 3 hours after the onset of apoptosis. The present mixture of caspase activity is dominated by this DEVDase, which seems to be represented by just one enzyme, as shown by affinity labeling and 2D-SDS-PAGE. Determinations of KM- and Ki-values lead to the conclusion, that this enzyms has typical effector caspase characteristics, like caspase-3. Cleavage of lamins during cell death of the fibroblasts indicate that a caspase-6 became active. However, the known characteristics of caspase-6 are different of that found in AKR 2B cells, so that it may play just a minor role in the caspase mixture. Established repeated purification steps by chromatography, offers best conditions for protein sequencing and identification of the active caspase. The involvement of the receptor mediated pathway could be excluded by an overexpression of CrmA , a cowpox virus derived Caspase inhibitor; also there are no hints for an involvement of the mitochondria mediated pathway, except of caspase-9 cleavage. Pathways which lead to DEVDase activation are of major interests in present and future. Stimulation of signal pathways by PDGF-BB, TPA, Forskolin and 8Br-cAMP and others agents protect the fibroblasts from death. The stimulated pathways converge in one point up stream of effector-caspase activation. The identification of this point and its regulatory properties is a future goal, which will maybe lead to an understanding of processes responsible for surviving of 50 per cent of AKR 2B-Mausfibroblasten during serum removal. KW - Maus KW - Fibroblast KW - Apoptosis KW - Proteasen KW - AKR-2B Fibroblasten KW - Apoptose KW - Anisomycin KW - Caspase KW - Serumentzug KW - DEVDase KW - AKR-2B fibroblasts KW - apoptosis KW - anisomycin KW - caspase KW - serum deprivation KW - DEVDase Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1950 ER - TY - THES A1 - Krimmer, Elena T1 - Agri-environment schemes and ecosystem services: The influence of different sown flower field characteristics on pollination, natural pest control and crop yield T1 - Agrarumweltmaßnahmen und Ökosystemdienstleistungen: der Einfluss unterschiedlicher Blühflächen Merkmale auf Bestäubung, natürliche Schädlingskontrolle und Erträge N2 - Insects are responsible for the major part of the ecosystem services pollination and natural pest control. If insects decline, these ecosystem services can not longer be reliably delivered. Agricultural intensification and the subsequent loss and fragmentation of habitats has among others been identified to cause insect decline. Ecological intensification aims to promote alternative and sustainable management practices in agricultural farming, for example to decrease the use of external inputs such as pesticides. Agri-environment schemes make amends for farmers if they integrate ecologically beneficial measures into their farming regime and can therefore promote ecological intensification. There is a wide variety of agri-environment schemes, but the implementation of sown flower fields on crop fields is often included. Flower fields offer foraging resources as well as nesting sites for many different insect species and should be able to support insect populations as well as to increase ecosystem services to adjacent fields. However, the potential of flower fields to exhibit these effects is depending on many factors. Among others, the age and size of the flower field can influence if and how different insects profit from the measure. Additionally, the complexity of the surrounding landscape and therefore the existing biodiversity is influencing the potential of flower fields to increase ecosystem services locally. The goal of this study is to disentangle to which degree these factors influence the ecosystem services pollination and natural pest control and if these factors interact with each other. Furthermore, it will be examined if and how flower fields and ecosystem services influence crop yield. Additional factors examined in this study are distance decay and pesticide use. The abundance of beneficial insects can decrease strongly with increasing distance to suitable habitats. Pesticide use in turn could abrogate positive effects of flower fields on beneficial insects. To examine these different aspects and to be able to make recommendations for flower field implementation, field experiments were conducted on differently composed sown flower fields and adjacent oilseed rape fields. Flower fields differed in their age and continuity as well as in their size. Additionally, flower and oilseed rape fields were chosen in landscapes with different amounts of semi-natural habitat. Oilseed rape fields adjacent to calcareous grasslands and conventional crop fields served as controls. Pollinator observations and pollen beetle and parasitism surveys were conducted in the oilseed rape fields. Additionally, different yield parameters of the oilseed rape plants were recorded. Observations were conducted and samples taken in increasing distance to the flower fields to examine distance decay functions. Spray windows were established to inspect the influence of pesticides on ecosystem services and crop yields. Linear mixed models were used for statistical analysis. The results show, that newly established flower fields with high amounts of flower cover are very attractive for pollinators. If the flower fields reached a certain size (> 1.5ha), the pollinators tended to stay in these fields and did not distribute into the surroundings. High amounts of semi-natural habitat in the surrounding landscape increased the value of small flower fields as starting points for pollinators and their subsequent spillover into crop fields. Additionally, high amounts of semi-natural habitat decreased the decay of pollinators with increasing distance to the flower fields. Based on these results, it can be recommended to establish many small flower fields in landscapes with high amounts of semi-natural habitat and large flower fields in landscapes with low amounts of semi-natural habitat. However, it is mentionable that flower fields are no substitute for perennial semi-natural habitats. These still must be actively conserved to increase pollination to crop fields. Furthermore, the lowest amount of pollen beetle infestation was found on oilseed rape fields adjacent to continuous flower fields aged older than 6 years. Flower fields and calcareous grasslands in general increased pollen beetle parasitism in adjacent oilseed rape fields compared to conventional crop fields. The threshold for effective natural pest control could only be reached in the pesticide free areas in the oilseed rape fields adjacent to continuous flower fields and calcareous grasslands. Parasitism and superparasitism declined with increasing distance to the adjacent fields in pesticide treated areas of the oilseed rape fields. However, they remained on a similar level in spray windows without pesticides. Large flower fields increased parasitism and superparasitism more than small flower fields. Flower fields generally have the potential to increase pollen beetle parasitism rates, but pesticides can abrogate these positive effects of flower fields on natural pest control. Last but not least, effects of flower fields and ecosystem services on oilseed rape yield were examined. No positive effects of pollination on oilseed rape yield could be found. Old and continuous flower fields increased natural pest control in oilseed rape fields, which in turn increased seed set and total seed weight of oilseed rape plants. The pesticide treatment had negative effects on natural pest control, but positive effects on crop yield. Pollination and natural pest control decreased with increasing distance to the field edge, but fruit set slightly increased. The quality of the field in terms of soil and climatic conditions did not influence the yield parameters examined in this study. Yield formation in oilseed rape plants is a complex process with many factors involved, and it is difficult to disentangle indirect effects of flower fields on yield. However, perennial flower fields can promote ecological intensification by increasing crop yield via natural pest control. This study contributes to a better understanding of the effects of differently composed flower fields on pollination, natural pest control and oilseed rape yield. N2 - Insekten sind für einen Großteil der Ökosystemdienstleistungen Bestäubung und natürliche Schädlingskontrolle zuständig. Schwinden die Insekten, so können diese Dienstleistungen nicht mehr zuverlässig gewährleistet werden. Als Ursachen für den Rückgang an Insekten wurde unter anderem die Intensivierung der Landwirtschaft und damit einhergehend der Verlust und die Fragmentierung von Lebensraum identifiziert. Ökologische Intensivierung hat das Ziel, alternative und nachhaltige Bewirtschaftungsmethoden in der Landwirtschaft zu fördern und beispielsweise den Einsatz von Spritzmitteln zu verringern. Agrarumweltmaßnahmen entschädigen Landwirte, wenn sie ökologisch wertvolle Maßnahmen in ihren Betrieb integrieren und können dadurch ökologische Intensivierung unterstützen. Die Bandbreite an Agrarumweltmaßnahmen ist groß, beinhaltet aber häufig das Anlegen von Blühflächen auf Ackerflächen. Blühflächen liefern Nahrungsressourcen und Lebensraum für eine Vielzahl von Insekten und sollten daher in der Lage sein Insektenpopulationen zu unterstützen und Ökosystemdienstleistungen auf angrenzenden Feldern zu verstärken. Jedoch ist das ökologische Potential von Blühflächen von einer Vielzahl von Faktoren abhängig. Unter anderem können das Alter und die Größe der Blühfläche entscheidend beeinflussen, inwiefern unterschiedliche Insektengruppen profitieren. Zusätzlich hat die Landschaftskomplexität der direkten Umgebung, und damit die potentiell vorhandene Biodiversität, großen Einfluss auf die Fähigkeit von Blühflächen Ökosystemdienstleistungen lokal zu erhöhen. In dieser Studie geht es darum zu entschlüsseln, wie sich diese verschiedenen Faktoren sich auf die beiden Ökosystemdienstleistungen Bestäubung und natürliche Schädlingskontrolle auswirken und ob sie sich gegenseitig beeinflussen. Zusätzlich soll untersucht werden, inwiefern Blühflächen und Ökosystemdienstleistungen Erträge beeinflussen können. Weitere in dieser Studie untersuchte Einflussfaktoren sind die Distanz zur Blühfläche und der Einsatz von Pestiziden. Die Abundanz von Nützlingen kann mit der Distanz zu geeigneten Habitaten stark abnehmen. Der Einsatz von Spritzmitteln wiederum könnte die positiven Einflüsse der Blühflächen auf Nützlinge aufheben. Um diese verschiedenen Aspekte zu untersuchen und letztendlich Empfehlung für die Etablierung von Blühflächen geben zu können, wurden Feldversuche auf Blühflächen mit unterschiedlicher Beschaffenheit und auf angrenzenden Rapsflächen durchgeführt. Die Blühflächen unterschieden sich hierbei in ihrem Alter und ihrer Kontinuität. Zusätzlich wurden Blühflächen mit unterschiedlicher Größe getestet. Außerdem wurden die Blühflächen und ihre benachbarten Rapsfelder so ausgewählt, dass sie sich in Landschaften mit unterschiedlichem Anteil an halbnatürlichen Habitaten befinden. Rapsflächen neben Kalkmagerrasen und Äckern mit konventionellen Feldfrüchten dienten als Kontrollflächen. Auf den Rapsflächen wurden Bestäuberbeobachtungen sowie Aufnahmen von Rapsglanzkäferbefall und deren Parasitierung durchgeführt. Zusätzlich wurden verschiedene Ertragsparameter von Raps aufgenommen. Die Untersuchungen fanden jeweils in unterschiedlichen Distanzen zur Blühfläche innerhalb des Rapsfeldes statt, um Distanz-Abnahme Funktionen zu untersuchen. Spritzfenster wurden etabliert, um den Einfluss von Pestiziden auf Ökosystemdienstleistungen und Erträge zu untersuchen. Für die statistische Auswertung wurden lineare gemischte Modelle verwendet. Die Ergebnisse haben zum einen gezeigt, dass frisch angelegte Blühflächen mit hoher Blütendeckung sehr attraktiv für Bestäuber sind. Jedoch blieben die Bestäuber in den Blühflächen, wenn diese eine gewisse Größe hatten (> 1.5ha) und verteilten sich nicht auf die umgebenden Flächen. Ein hoher Anteil an halbnatürlichen Habitaten in der umgebenden Landschaft erhöhte den Wert von kleinen Blühflächen als Ausgangspunkt für Bestäuber und ihren anschließenden Übergang auf Ackerflächen. Hohe Mengen an halbnatürlichen Habitaten verringerten außerdem den Rückgang der Bestäuber mit steigender Entfernung zur Blühfläche. Auf Grundlage dieser Ergenisse wäre es zu empfehlen, kleine Blühflächen in Landschaften mit viel halbnatürlichem Habitat und große Blühflächen in Landschaften mit wenig halbnatürlichem Habitat anzulegen. Außerdem ist anzumerken, dass Blühflächen keinen adequaten Ersatz für dauerhafte halbantürliche Habitate darstellen. Diese müssen weiterhin aktiv geschützt und erhalten werden, um Bestäubung auf Ackerflächen zu fördern. Des Weiteren wurde auf Rapsflächen neben kontinuierlichen Blühflächen mit einem Alter über 6 Jahre der niedrigste Befall mit Rapsglanzkäferlarven festgestellt. Blühflächen und Kalkmagerrasen erhöhten die Parasitierung von Rapsglanzkäfern in benachbarten Rapsflächen im Vergleich zu Rapsflächen die neben Ackerflächen liegen. Der Schwellenwert für eine effektive natürliche Schädlingskontrolle wurde nur in den pestizidfreien Bereichen in Rapsflächen neben kontinuierlichen Blühflächen und Kalkmagerasen erreicht. In mit Pestiziden behandelten Bereichen nahmen Parasitismus und Superparasitismus mit zunehmender Entfernung zum benachbarten Feld ab. In den Spritzfenstern ohne Pestizide blieben sie jedoch auf dem gleichen Niveau. Große Blühflächen erhöhten Parasitismus und Superparasitismus mehr als kleine. Insgesamt können Blühflächen die Parasitierungsraten von Rapsglanzkäfern auf Rapsflächen erhöhen, jedoch können Pestizide diese positiven Effekte aufheben. Zuletzt wurden die Effekte von Blühflächen und Ökosystemdienstleistungen auf den Rapsertrag untersucht. Hier stellte sich heraus, dass Bestäubung keine positiven Effekte auf den Rapsertrag hatte. Alte und kontinuierliche Blühflächen erhöhten die natürliche Schädlingskontrolle in den Rapsfeldern, welche wiederrum den Samenansatz und das absolute Samengewicht erhöhten. Die Behandlung mit Pestiziden hatte negative Asuwirkungen auf natürliche Schädlingskontrolle, aber positive Auswirkungen auf den Ertrag. Bestäubung und natürliche Schädlingskontrolle nahmen mit der zunehmenden Entfernung zum Feldrand ab, aber der Fruchtansatz nahm leicht zu. Die Feldqualität hatte keine Auswirkungen auf die im Modell untersuchten Rapsertrag Messwerte. Ertragsbildung bei Rapspflanzen ist ein komplexer Vorgang an dem viele Faktoren beteiligt sind. Mehrjährige Blühflächen können ökologische Intensivierung fördern indem sie den Ertrag durch natürliche Schädlingskontrolle erhöhen. Diese Studie leistet einen wertvollen Beitrag zum besseren Verständnis der Auswirkungen von unterschiedlich beschaffenen Blühflächen auf Bestäubung, natürliche Schädlingskontrolle und Rapsertrag. KW - Ökologie KW - Agrarumweltmaßnahmen KW - Ökosystemdienstleistung Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-206577 ER - TY - THES A1 - Schardt, Simon T1 - Agent-based modeling of cell differentiation in mouse ICM organoids T1 - Agentenbasierte Modellierung von Maus ICM Organoiden N2 - Mammalian embryonic development is subject to complex biological relationships that need to be understood. However, before the whole structure of development can be put together, the individual building blocks must first be understood in more detail. One of these building blocks is the second cell fate decision and describes the differentiation of cells of the inner cell mass of the embryo into epiblast and primitive endoderm cells. These cells then spatially segregate and form the subsequent bases for the embryo and yolk sac, respectively. In organoids of the inner cell mass, these two types of progenitor cells are also observed to form, and to some extent to spatially separate. This work has been devoted to these phenomena over the past three years. Plenty of studies already provide some insights into the basic mechanics of this cell differentiation, such that the first signs of epiblast and primitive endoderm differentiation, are the expression levels of transcription factors NANOG and GATA6. Here, cells with low expression of GATA6 and high expression of NANOG adopt the epiblast fate. If the expressions are reversed, a primitive endoderm cell is formed. Regarding the spatial segregation of the two cell types, it is not yet clear what mechanism leads to this. A common hypothesis suggests the differential adhesion of cell as the cause for the spatial rearrangement of cells. In this thesis however, the possibility of a global cell-cell communication is investigated. The approach chosen to study these phenomena follows the motto "mathematics is biology's next microscope". Mathematical modeling is used to transform the central gene regulatory network at the heart of this work into a system of equations that allows us to describe the temporal evolution of NANOG and GATA6 under the influence of an external signal. Special attention is paid to the derivation of new models using methods of statistical mechanics, as well as the comparison with existing models. After a detailed stability analysis the advantages of the derived model become clear by the fact that an exact relationship of the model parameters and the formation of heterogeneous mixtures of two cell types was found. Thus, the model can be easily controlled and the proportions of the resulting cell types can be estimated in advance. This mathematical model is also combined with a mechanism for global cell-cell communication, as well as a model for the growth of an organoid. It is shown that the global cell-cell communication is able to unify the formation of checkerboard patterns as well as engulfing patterns based on differently propagating signals. In addition, the influence of cell division and thus organoid growth on pattern formation is studied in detail. It is shown that this is able to contribute to the formation of clusters and, as a consequence, to breathe some randomness into otherwise perfectly sorted patterns. N2 - Die embryonale Entwicklung von Säugetieren unterliegt komplexen biologischen Zusammenhängen, die es zu verstehen gilt. Bevor jedoch das gesamte Gebilde der Entwicklung zusammengesetzt werden kann, müssen zunächst die einzelnen Bausteine genauer verstanden werden. Einer dieser Bausteine ist die zweite Zellschicksalsentscheidung und beschreibt die Differenzierung von Zellen der inneren Zellmasse des Embryos hin zu Epiblast- und primitiven Endodermzellen. Diese Zellen teilen sich daraufhin räumlich auf und bilden die anschließend die Grundlagen für den Embryo und den Dottersack. In Organoiden der inneren Zellmasse wird ebenfalls beobachtet, wie sich diese zwei Typen von Vorläuferzellen bilden, und sich in gewissem Maße räumlich voneinander trennen. Diesem Phänomenen widmete sich diese Arbeit im Verlaufe der letzten drei Jahre. Über diese Zelldifferenzierung ist bereits bekannt, dass die ersten Anzeichen für Epiblast- und primitive Endodermdifferenzierung jeweils die Expressionslevel der Transkriptionsfaktoren NANOG und GATA6 sind. Dabei nehmen Zellen mit niedriger Expression an GATA6 und hoher Expression an NANOG das Epiblastschicksal an. Sind die Expressionen umgekehrt, so entsteht eine primitive Endodermzelle. Bei der räumlichen Aufteilung der beiden Zelltypen ist noch nicht eindeutig geklärt, welcher Mechanismus dazu führt. Eine gängige Hypothese besagt, dass die Ursache für die räumliche Umlagerung der Zellen in der unterschiedlichen Adhäsion der Zellen liegt. In dieser Arbeit wird jedoch die Möglichkeit einer globalen Zell-Zell-Kommunikation untersucht. Die gewählte Vorgehensweise bei der Untersuchung dieser Phänomene folgt dem Motto "Die Mathematik ist das nächste Mikroskop der Biologie". Mit Hilfe mathematischer Modellierung wird das zentrale genregulierende Netzwerk im Mittelpunkt dieser Arbeit in ein Gleichungssystem umgewandelt, welches es ermöglicht, die zeitliche Entwicklung von NANOG und GATA6 unter Einfluss eines externen Signals zu beschreiben. Ein besonderes Augenmerk liegt dabei auf der Herleitung neuer Modelle mit Hilfe von Methoden der statistischen Mechanik, sowie dem Vergleich mit bestehenden Modellen. Nach einer ausführlichen Stabilitätsanalyse werden die Vorteile des hergeleiteten Modells dadurch deutlich, dass ein exakter Zusammenhang der Modellparameter und der Formierung von heterogenen Mischungen zweier Zelltypen gefunden wurde. Dadurch lässt sich das Modell einfach kontrollieren und die Proportionen der resultierenden Zelltypen bereits im Voraus abschätzen. Dieses mathematische Modell wird außerdem kombiniert mit einem Mechanismus zur globalen Zell-Zell Kommunikation, sowie einem Modell zum Wachstum eines Organoiden. Dabei wird gezeigt dass die globale Zell-Zell Kommunikation dazu in der Lage ist die Bildung von Schachbrettmustern, sowie auch umrandenden Muster anhand unterschiedlich ausbreitender Signale zu vereinen. Zusätzlich wird der Einfluss der Zellteilung und somit des Organoidwachstums auf die Musterbildung genauestens untersucht. Es wird gezeigt, dass dies zur Bildung von Clustern beiträgt und infolgedessen eine gewisse Zufälligkeit in ansonsten perfekt sortierte Muster einbringt. KW - Mathematische Modellierung KW - Embryonalentwicklung KW - Organoid KW - Differentialgleichung KW - Agentenbasierte Modellierung KW - Transkriptionelle Regulierung Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-301940 ER - TY - THES A1 - Franke, Christian T1 - Advancing Single-Molecule Localization Microscopy: Quantitative Analyses and Photometric Three-Dimensional Imaging T1 - Weiterentwicklung von Einzel-Molekül Lokalisations-Mikroskopie: Quantitative Analysen und photometrische drei-dimensionale Bildgebung N2 - Since its first experimental implementation in 2005, single-molecule localization microscopy (SMLM) emerged as a versatile and powerful imaging tool for biological structures with nanometer resolution. By now, SMLM has compiled an extensive track-record of novel insights in sub- and inter- cellular organization.\\ Moreover, since all SMLM techniques rely on the analysis of emission patterns from isolated fluorophores, they inherently allocate molecular information $per$ $definitionem$.\\ Consequently, SMLM transitioned from its origin as pure high-resolution imaging instrument towards quantitative microscopy, where the key information medium is no longer the highly resolved image itself, but the raw localization data set.\\ The work presented in this thesis is part of the ongoing effort to translate those $per$ $se$ molecular information gained by SMLM imaging to insights into the structural organization of the targeted protein or even beyond. Although largely consistent in their objectives, the general distinction between global or segmentation clustering approaches on one side and particle averaging or meta-analyses techniques on the other is usually made.\\ During the course of my thesis, I designed, implemented and employed numerous quantitative approaches with varying degrees of complexity and fields of application.\\ \\ In my first major project, I analyzed the localization distribution of the integral protein gp210 of the nuclear pore complex (NPC) with an iterative \textit{k}-means algorithm. Relating the distinct localization statistics of separated gp210 domains to isolated fluorescent signals led, among others, to the conclusion that the anchoring ring of the NPC consists of 8 homo-dimers of gp210.\\ This is of particular significance, both because it answered a decades long standing question about the nature of the gp210 ring and it showcased the possibility to gain structural information well beyond the resolution capabilities of SMLM by crafty quantification approaches.\\ \\ The second major project reported comprises an extensive study of the synaptonemal complex (SNC) and linked cohesin complexes. Here, I employed a multi-level meta-analysis of the localization sets of various SNC proteins to facilitate the compilation of a novel model of the molecular organization of the major SNC components with so far unmatched extend and detail with isotropic three-dimensional resolution.\\ In a second venture, the two murine cohesin components SMC3 and STAG3 connected to the SNC were analyzed. Applying an adapted algorithm, considering the disperse nature of cohesins, led to the realization that there is an apparent polarization of those cohesin complexes in the SNC, as well as a possible sub-structure of STAG3 beyond the resolution capabilities of SMLM.\\ \\ Other minor projects connected to localization quantification included the study of plasma membrane glycans regarding their overall localization distribution and particular homogeneity as well as the investigation of two flotillin proteins in the membrane of bacteria, forming clusters of distinct shapes and sizes.\\ \\ Finally, a novel approach to three-dimensional SMLM is presented, employing the precise quantification of single molecule emitter intensities. This method, named TRABI, relies on the principles of aperture photometry which were improved for SMLM.\\ With TRABI it was shown, that widely used Gaussian fitting based localization software underestimates photon counts significantly. This mismatch was utilized as a $z$-dependent parameter, enabling the conversion of 2D SMLM data to a virtual 3D space. Furthermore it was demonstrated, that TRABI can be combined beneficially with a multi-plane detection scheme, resulting in superior performance regarding axial localization precision and resolution.\\ Additionally, TRABI has been subsequently employed to photometrically characterize a novel dye for SMLM, revealing superior photo-physical properties at the single-molecule level.\\ Following the conclusion of this thesis, the TRABI method and its applications remains subject of diverse ongoing research. N2 - Seit ihrer ersten experimentellen Umsetzung in 2005 hat sich die Einzel-Molekül Lokalisations-Mikroskopie (\textit{engl.} single-molecule localization microscopy (SMLM)) als vielseitig einsetzbares Verfahren in der biologischen Bildgebung etabliert, vor allem aufgrund ihres hohen Auflösungsvermögens im Nanometer Bereich. Bis heute wurde eine Reihe neuer Erkenntnisse bezüglich der sub- und inter- zellulären Organisation durch den Einsatz der SMLM erlangt.\\ Aufgrund der Tatsache, dass alle SMLM Techniken auf dem Prinzip basieren, isolierte Fluorophore zu detektieren und zu analysieren, beinhalten SMLM Daten $per$ $definitionem$ molekulare Informationen.\\ Folgerichtig entwickelte sich das Feld der SMLM vom reinen Bildgebungsinstrument mit Nanometer-Auflösung hin zu quantitativer Mikroskopie, bei welcher der Fokus nicht länger vornehmlich auf dem hochaufgelöstem Bild, sondern vielmehr auf den Lokalisationsdaten liegt.\\ Die vorliegende Arbeit ist als Teil der anhaltenden Bestrebungen zu sehen, aus den $per$ $se$ molekularen Informationen der SMLM weiterführende Erkenntnisse über die strukturelle Organisation der markierten Proteine zu gewinnen. Obwohl mit der gleichen prinzipiellen Zielsetzung versehen, unterscheiden sich hierbei globale oder Segmentierungs- Clusteranalysen von Lokalisations-Meta-Analysen oder so genannten \textit{particle averaging} Ansätzen.\\ Während meiner Doktorarbeit habe ich verschiedene Quantifizierungs Ansätze entworfen, implementiert und angewendet, mit unterschiedlichen Graden an Komplexität und Breite des Anwendungsgebietes.\\ \\ In meinem ersten wesentlichem Projekt analysierte ich mit einem iterativen \textit{k}-means Algorithmus die Lokalisationsverteilung des integralen Proteins gp210, welches Teil des Kernporenkomplexes ist (\textit{engl.} nuclear pore complex (NPC)). Durch den Vergleich der charakteristischen Lokalisations-Statistik von separierten gp210 Domänen mit isolierten Fluoreszenzmarkern konnte unter anderem festgestellt werden, dass der Verankerungsring des NPC aus acht gp210 Homodimeren bestehen muss.\\ Diese Erkenntnis beantwortet zum einen eine jahrzehntealte Frage nach der Zusammensetzung des gp210 Rings und zum anderen liefert sie ein Beispiel dafür, dass durch eine geschickte Analyse der Lokalisationsstatistik strukturelle Informationen erlangt werden können, die jenseits des räumlichen Auflösungsvermögens von SMLM liegen.\\ \\ Das zweite hier vorgestellte wesentliche Projekt beinhaltet eine umfassende Studie des Synaptonemalen Komplexes (\textit{engl.} synaptonemal complex (SNC)) und damit verbundenen Cohesin Komplexen. Um die molekulare Organisation des SNC zu untersuchen, implementierte ich eine multi-level Meta-Analyse der Lokalisationsdaten mehrerer SNC Komponenten. Aus dessen Ergebnissen konnte ein neues drei dimensionales molekulares Modell des SNC erstellt werden.\\ Nachfolgend wurden die beiden murinen Cohesine SMC3 und STAG3 mit adaptierter Methodik untersucht. Hierbei musste die starke intrinsische Dispersion der Cohesin-Signale berücksichtigt werden. Die Analyse ergab deutliche Hinweise auf eine Polarisation der Cohesine innerhalb des SNC. Zudem zeigte sich eine mögliche Substruktur in der Organisation von STAG3, die unterhalb der Auflösungsgrenze von SMLM liegt.\\ \\ Weitere Nebenprojekte im Zusammenhang mit quantitativer Lokalisationsanalyse umfassten die Untersuchung der Lokalisationsverteilung von Plasma-Membran Glykanen, sowie zweier Flotillin Proteine in den Membranen von Bakterien, welche Cluster unterschiedlicher Form und Größe aufzeigten.\\ \\ Schließlich wird ein neuartiger Ansatz für dreidimensionale SMLM vorge-stellt, die auf der genauen Bestimmung von Einzel-Molekül Intensitäten basiert. Diese Methode, genannt TRABI, stützt sich auf die Prinzipien der Apertur Photometrie, welche für die SMLM angepasst und verbessert wurden.\\ Mit TRABI konnte gezeigt werden, dass weit verbreitete Lokalisations-Software, die auf $Gaussian-Fitting$ basiert, die Photonenzahl von Emittern oftmals stark unterschätzt. Diese Diskrepanz kann als $z$-abhängiger Parameter verwendet werden um z.B. einen 2D SMLM Datenatz in einen virtuellen 3D Raum zu überführen. Außerdem wird gezeigt, dass TRABI vorteilhaft mit einem multi-plane Detektionsschema kombiniert werden kann und dabei höhere axiale Lokalisationsgenauigkeiten und Auflösungen er-reicht.\\ Zudem wurde TRABI eingesetzt, um einen neuen Fluoreszenzfarbstoff für SMLM zu charakterisieren und dessen verbesserte photo-physikalische Eigenschaften auf Einzel-Molekül Basis zu demonstrieren.\\ Auch nach Abschluss dieser Arbeit ist die TRABI Methode und deren Anwendung weiterhin Gegenstand diverser Forschungen. KW - Einzelmolekülmikroskopie KW - Quantitative Mikroskopie KW - dSTORM Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-156355 ER - TY - THES A1 - Cseh, Richard T1 - Adsorption of phloretin to lipid layers T1 - Adsorption von Phloretin an Lipidschichten N2 - The mode of action of phloretin and its analogs on the permeability of natural membranes for neutral and charged molecules, such as urea, glucose and chloride has been characterized 25 years ago. In contrast to signal molecules with primary effects on transport systems of natural membranes, phloretin also affects model membranes, i.e., artificial membranes, which do not contain proteins. Since the dipole potential reducing effect of phloretin on mono- and bilayers has been found, it became clear that its primary effect must be a biophysical one: phloretin adsorbs to lipid layers and changes biophysical parameters of these layers. The aim of this work was the characterization of the interaction between the surface-active molecule phloretin and artificial lipid layers. We were able to describe structural and functional parameters of the model systems mono- and bilayer as functions of one or few variables. One of these parameters, the dipole potential, measured as a function of the aqueous phloretin concentration, allowed a critical examination of the Langmuir adsorption model that has been postulated for the interaction between phloretin and lipid layers. Surface pressure versus area per lipid molecule isotherms and surface (dipole) potential change versus area per lipid molecule isotherms, measured at lipid monolayers, allowed a structural description of the phloretin-lipid interaction: phloretin integrates into monolayers dependent on the surface pressure and the phase state of the lipid. Calorimetric measurements confirmed the integration of phloretin into membranes because of the strong decrease of the phase transition temperature, but they also showed that the cooperativity of phase transition is hardly affected, even at very high amounts of phloretin in the membrane. Obviously the interaction between phloretin and lipids is restricted to the head groups, an integration into the hydrocarbon layer is unlikely. 2H NMR measurements with spherical unilamellar vesicles of headgroup-deuterated lipid showed changed quadrupolar splittings indicating the interaction between phloretin and headgroups of the lipids. N2 - Die Wirkung von Phloretin und seinen Analogen auf die Permeabilität von natürlichen Membranen für bestimmte ungeladene und geladene Moleküle wie z.B. Harnstoff, Glukose und Chlorid ist bereits vor 25 Jahren beschrieben worden. Im Gegensatz zu Signalmolekülen mit Primärwirkungen auf Transportsysteme natürlicher Membranen wirkt Phloretin auch auf Modellmembranen, d.h., künstliche, reine Lipidmembranen, die keine Proteine enthalten. Nach der Entdeckung des dipolpotential-reduzierenden Effekts von Phloretin auf Monolayer und Bilayer war klar, daß dessen primäre Wirkung biophysikalischer Natur sein mußte: Phloretin adsorbiert an Lipidschichten und verändert biophysikalische Parameter dieser Schichten. Ziel dieser Arbeit war es, die Wechselwirkungen des oberflächenaktiven Moleküls Phloretin mit künstlichen Lipidschichten näher zu charakterisieren. Strukturelle und funktionelle Parameter der Modellsysteme Mono- und Bilayer konnten in Abhängigkeit einer oder weniger Variablen verfolgt und beschrieben werden. Einer dieser Parameter, das Dipolpotential, gemessen als Funktion der Phloretinkonzentration in der wässrigen Phase, erlaubte eine kritische Betrachtung des in der Literatur postulierten Langmuirschen Adsorptionsverhaltens von Phloretin. Oberflächendruck-molekulare Fläche Isothermen sowie Oberflächenpotential (Dipolpotential)-molekulare Fläche Isothermen, ermittelt an Lipidmonoschichten, erlaubten eine strukturelle Beschreibung der Phloretin-Lipid Wechselwirkung: Phloretin integriert in Monoschichten, wobei dieser Effekt stark abhängig ist vom Filmdruck und vom Phasenzustand des Lipids. Kalorimetrische Messungen bestätigten die Integration von Phloretin in Membranen durch eine starke Abnahme der Phasenübergangstemperatur, sie zeigten aber auch, daß die Kooperativität der Lipidmoleküle nur wenig beeinträchtigt wird, selbst bei sehr großen Mengen von Phloretin in der Membran. Die Wechselwirkung von Phloretin mit Lipiden ist offensichtlich beschränkt auf die Kopfgruppen, eine Integration in die hydrophobe Kohlenwasserstoffphase findet wahrscheinlich nicht statt. 2H NMR Messungen an sphärischen, unilamellaren Vesikeln aus kopfgruppen-deuteriertem Lipid zeigten unter dem Einfluß von Phloretin eine veränderte Quadrupol-Aufspaltung, was die Wechselwirkung von Phloretin mit den Kopfgruppen der Lipide belegt. KW - Phloretin KW - Lipide KW - Grenzflächenpotenzial KW - Phloretin KW - Oberflächendruck KW - Oberflächenpotential KW - Dipolpotential KW - Dipol-Dipol Wechselwirkung KW - Langmuir Adsorptionsisotherme KW - Phloretin KW - Surface pressure KW - Surface potential KW - Dipole potential KW - Dipole-dipole interaction KW - Langmuir adsorption isotherm Y1 - 1999 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1069 ER - TY - THES A1 - Rapp, Ulrike T1 - Achieving protective immunitity against intracellular bacterial pathogens : a study on the efficiency of Gp96 as a vaccine carrier T1 - Immunisierung gegen intrazelluläre Bakterien mit Hilfe von HSP-Fusionsproteinen N2 - Protective vaccination against intracellular pathogens using HSP fusion proteins in the listeria model. N2 - Impfschutz gegen intrazelluläre Pathogene durch Immunisierung mit HSP-Fusionsproteinen im listerien Modell. KW - Listeria monocytogenes KW - Immunisierung KW - Hitzeschock-Proteine KW - Hitzeschockproteine KW - Immunsierung KW - Intrazelluläre Pathogene KW - Heat Shock Proteins KW - Immunization KW - Intracellular Pathogens Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-9096 ER - TY - THES A1 - Dehmer, Markus T1 - A novel USP11-TCEAL1-mediated mechanism protects transcriptional elongation by RNA Polymerase II T1 - Ein neuer USP11-TCEAL1 vermittelter Mechanismus schützt die transkriptionelle Elongation der RNA Polymerase II N2 - Deregulated expression of MYC oncoproteins is a driving event in many human cancers. Therefore, understanding and targeting MYC protein-driven mechanisms in tumor biology remain a major challenge. Oncogenic transcription in MYCN-amplified neuroblastoma leads to the formation of the MYCN-BRCA1-USP11 complex that terminates transcription by evicting stalling RNAPII from chromatin. This reduces cellular stress and allows reinitiation of new rounds of transcription. Basically, tumors with amplified MYC genes have a high demand on well orchestration of transcriptional processes-dependent and independent from MYC proteins functions in gene regulation. To date, the cooperation between promoter-proximal termination and transcriptional elongation in cancer cells remains still incomplete in its understanding. In this study the putative role of the dubiquitinase Ubiquitin Specific Protease 11 (USP11) in transcription regulation was further investigated. First, several USP11 interaction partners involved in transcriptional regulation in neuroblastoma cancer cells were identified. In particular, the transcription elongation factor A like 1 (TCEAL1) protein, which assists USP11 to engage protein-protein interactions in a MYCN-dependent manner, was characterized. The data clearly show that TCEAL1 acts as a pro-transcriptional factor for RNA polymerase II (RNAPII)-medi- ated transcription. In detail, TCEAL1 controls the transcription factor S-II (TFIIS), a factor that assists RNAPII to escape from paused sites. The findings claim that TCEAL1 outcompetes the transcription elongation factor TFIIS in a non-catalytic manner on chromatin of highly expressed genes. This is reasoned by the need regulating TFIIS function in transcription. TCEAL1 equili- brates excessive backtracking and premature termination of transcription caused by TFIIS. Collectively, the work shed light on the stoichiometric control of TFIIS demand in transcriptional regulation via the USP11-TCEAL1-USP7 complex. This complex protects RNAPII from TFIIS-mediated termination helping to regulate productive transcription of highly active genes in neuroblastoma. N2 - Die deregulierte Expression von MYC Onkoproteinen ist ein zentrales Event in vielen huma-nen Krebsarten. Aus diesem Grund sind das Verständnis und die gezielte Bekämpfung MYC-getriebener Mechanismen in der Tumorbiologie nach wie vor eine große Herausforderung. In MYCN-amplifizierten Neuroblastomen führt eine übermäßig hohe Transkriptionsrate zur stress-bedingten Rekrutierung des MYCN-BRCA1-USP11-Komplexes. Dieser Komplex be-endet vorzeitig die Transkription, indem er RNAPII Moleküle vom Chromatin wirft. Durch diesen Mechanismus wird zellulärer Stress reduziert und ermöglicht dadurch einen erneuten Start der Transkription. Grundsätzlich stellen Tumoren mit einer Amplifikation von einem der MYC Proteine hohe Anforderungen an eine feine Abstimmung der einzelnen Schritte in der Transkription. Dies ist sowohl abhängig als auch unabhängig von den bereits beschriebe-nen Funktionen der MYC-Proteine in der Genregulation. Bis heute ist das Zusammenspiel zwischen promoter-proximaler Termination und transkriptioneller Elongation noch nicht vollständig aufgeklärt. In dieser Studie wurde eine potenzielle Rolle von USP11 in der Regulation der Transkription weitergehend untersucht. Zunächst wurden mehrere Interaktionspartner von USP11, die an der Regulation der Transkription in Neuroblastom Krebszellen beteiligt sind, identifiziert. Es wurde insbesondere das Transcription Elongation Factor A Like 1 (TCEAL1) Protein charak-terisiert. Dieses Protein unterstützt USP11 dabei, Protein-Protein-Interaktionen MYCN-vermittelt einzugehen. Die Daten zeigen, dass TCEAL1 als pro-transkriptioneller Faktor für die RNA-Polymerase II (RNAPII) -vermittelte Transkription fungiert. Genauer, TCEAL1 kontrolliert den Transkriptionsfaktor S-II (TFIIS), einen Faktor, der der RNAPII dabei hilft, die Transkription nach einem kurzen Pausieren („pausing“) fortzusetzen. Die Ergebnisse zei-gen, dass TCEAL1 den Elongationsfaktor TFIIS auf nicht-katalytische Weise von dem Chromatin von hochexprimierten Genen verdrängt. Dies ist darin begründet, dass die Funkti-on von TFIIS bei der Transkription reguliert werden muss. TCEAL1 gleicht übermäßiges Zurückwandern der RNAPII und die vorzeitige Beendigung der Transkription, das durch TFIIS vermittelt wird, aus. Diese Arbeit gibt Aufschluss über die stöchiometrische Kontrolle des TFIIS-Bedarfs bei der Transkriptionsregulation durch den USP11-TCEAL1-USP7-Komplex. Dieser Komplex schützt die RNAPII vor der TFIIS-vermittelter Termination der Transkription und trägt zur Regulierung einer produktiven Transkription hochaktiver Gene im Neuroblastom bei. KW - Transkription KW - N-Myc KW - Transcription Regulation KW - Pause Release KW - Ubiquitin Specific Protease 11 KW - transcription elongation factor A (SII)-like 1 (TCEAL1) KW - RNA Polymerase II (RNAPII) KW - Transcriptional Stress Response Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-360544 ER - TY - THES A1 - Breitenbach, Tim T1 - A mathematical optimal control based approach to pharmacological modulation with regulatory networks and external stimuli T1 - Ein auf mathematischer Optimalkontrolle basierender Ansatz für pharmakologische Modulation mit regulatorischen Netzwerken und externen Stimuli N2 - In this work models for molecular networks consisting of ordinary differential equations are extended by terms that include the interaction of the corresponding molecular network with the environment that the molecular network is embedded in. These terms model the effects of the external stimuli on the molecular network. The usability of this extension is demonstrated with a model of a circadian clock that is extended with certain terms and reproduces data from several experiments at the same time. Once the model including external stimuli is set up, a framework is developed in order to calculate external stimuli that have a predefined desired effect on the molecular network. For this purpose the task of finding appropriate external stimuli is formulated as a mathematical optimal control problem for which in order to solve it a lot of mathematical methods are available. Several methods are discussed and worked out in order to calculate a solution for the corresponding optimal control problem. The application of the framework to find pharmacological intervention points or effective drug combinations is pointed out and discussed. Furthermore the framework is related to existing network analysis tools and their combination for network analysis in order to find dedicated external stimuli is discussed. The total framework is verified with biological examples by comparing the calculated results with data from literature. For this purpose platelet aggregation is investigated based on a corresponding gene regulatory network and associated receptors are detected. Furthermore a transition from one to another type of T-helper cell is analyzed in a tumor setting where missing agents are calculated to induce the corresponding switch in vitro. Next a gene regulatory network of a myocardiocyte is investigated where it is shown how the presented framework can be used to compare different treatment strategies with respect to their beneficial effects and side effects quantitatively. Moreover a constitutively activated signaling pathway, which thus causes maleficent effects, is modeled and intervention points with corresponding treatment strategies are determined that steer the gene regulatory network from a pathological expression pattern to physiological one again. N2 - In dieser Arbeit werden Modelle für molekulare Netzwerke bestehend aus gewöhnlichen Differentialgleichungen durch Terme erweitert, die die Wechselwirkung zwischen dem entsprechenden molekularen Netzwerk und der Umgebung berücksichtigen, in die das molekulare Netzwerk eingebettet ist. Diese Terme modellieren die Effekte von externen Stimuli auf das molekulare Netzwerk. Die Nutzbarkeit dieser Erweiterung wird mit einem Modell der circadianen Uhr demonstriert, das mit gewissen Termen erweitert wird und Daten von mehreren verschiedenen Experimenten zugleich reproduziert. Sobald das Modell einschließlich der externen Stimuli aufgestellt ist, wird eine Grundstruktur entwickelt um externe Stimuli zu berechnen, die einen gewünschten vordefinierte Effekt auf das molekulare Netzwerk haben. Zu diesem Zweck wird die Aufgabe, geeignete externe Stimuli zu finden, als ein mathematisches optimales Steuerungsproblem formuliert, für welches, um es zu lösen, viele mathematische Methoden zur Verfügung stehen. Verschiedene Methoden werden diskutiert und ausgearbeitet um eine Lösung für das entsprechende optimale Steuerungsproblem zu berechnen. Auf die Anwendung dieser Grundstruktur pharmakologische Interventionspunkte oder effektive Wirkstoffkombinationen zu finden, wird hingewiesen und diese diskutiert. Weiterhin wird diese Grundstruktur in Bezug zu existierenden Netzwerkanalysewerkzeugen gesetzt und ihre Kombination für die Netzwerkanalyse diskutiert um zweckbestimmte externe Stimuli zu finden. Die gesamte Grundstruktur wird mit biologischen Beispielen verifiziert, indem man die berechneten Ergebnisse mit Daten aus der Literatur vergleicht. Zu diesem Zweck wird die Blutplättchenaggregation untersucht basierend auf einem entsprechenden genregulatorischen Netzwerk und damit assoziierte Rezeptoren werden detektiert. Weiterhin wird ein Wechsel von einem T-Helfer Zelltyp in einen anderen in einer Tumorumgebung analysiert, wobei fehlende Agenzien berechnet werden um den entsprechenden Wechsel in vitro zu induzieren. Als nächstes wird ein genregulatorisches Netzwerk eines Myokardiozyten untersucht, wobei gezeigt wird wie die präsentierte Grundstruktur genutzt werden kann um verschiedene Behandlungsstrategien in Bezug auf ihre nutzbringenden Wirkungen und Nebenwirkungen quantitativ zu vergleichen. Darüber hinaus wird ein konstitutiv aktivierter Signalweg, der deshalb unerwünschte Effekte verursacht, modelliert und Interventionspunkte mit entsprechenden Behandlungsstrategien werden bestimmt, die das genregulatorische Netzwerk wieder von einem pathologischen Expressionsmuster zu einem physiologischen steuern. KW - Bioinformatik KW - systematic drug targeting KW - optimal drug combination KW - disease modelling KW - external stimuli KW - intervention point analyzing KW - Molekülsystem KW - Reiz Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-174368 ER - TY - THES A1 - Xu, Jiajia T1 - A high-complexity lentiviral shRNA screen identifies synthetic lethal interactions with deregulated N-Myc in neuroblastoma cells T1 - Ein hoch-Komplexität Genom-weit RNAi Screen für synthetisch letale Interaktion mit dereguliertem N-Myc in Neuroblastomzellen N2 - In contrast to c-Myc, a deregulated expression of the MYCN gene is restricted to human neuroendocrine tumours. In most cases, the excessive activity of N-Myc results from a MYCN amplification. In neuroblastoma, amplification of MYCN is a predictor of poor prognosis and resistance to therapy. The inability to target the N-Myc protein directly necessitates the search for alternative targets. This project aimed at identifying genes specifically required for growth and survival of cells that express high levels of N-Myc using high-throughput shRNA screening combined with next generation sequencing. The identification and analysis of these genes will shed light on functional interaction partners of N-Myc. We screened a shRNA library containing 18,327 shRNAs and identified 148 shRNAs, which were selectively depleted in the presence of active N-Myc. In addition, shRNAs targeting genes that are involved in p53 and ARF turnover and apoptosis were depleted in the cell population during the screen. These processes are known to affect N-Myc-mediated apoptosis. Consequently, these results biologically validated the screen. The 148 shRNAs that showed a significant synthetic lethal interaction with high levels of N-Myc expression were further analysed using the bioinformatics program DAVID. We found an enrichment of shRNAs that target genes involved in specific biological processes. For example, we validated synthetic lethal interactions for genes such as, THOC1, NUP153 and LARP7, which play an important role in the process of RNA polymerase II-mediated transcription elongation. We also validated genes that are involved in the neddylation pathway. In the screen we identified Cullin 3, which is a component of the BTB-CUL3-Rbx1 ubiquitin ligase that is involved in the turnover of Cyclin E. Depletion of cullin 3 and activation of N-Myc was found to synergistically increase Cyclin E expression to supraphysiological levels, inducing S-phase arrest and a strong DNA damage response. Together with results from a proteomics analysis of N-Myc associated proteins, our results lead us to the following hypothesis: In a neuroblastoma cell, the high levels of N-Myc result in a conflict between RNA polymerase II and the replication machinery during S-phase. The newly identified interaction partners of N- Myc are required to solve this conflict. Consequently, loss of the interaction leads to a massive DNA damage and the induction of apoptosis. In addition, inhibition or depletion of the essential components of the neddylation pathway also results in an unresolvable problem during S-phase. N2 - 6.2 Zusammenfassung Im Gegensatz zu c-Myc findet man eine Deregulation von N-Myc nur in einer begrenzten Anzahl maligner Tumore die neuroektodermalen Ursprungs sind. Die übermäßige Aktivität ist dabei fast immer durch eine genomische Amplifikation von N-Myc begründet. Im Neuroblastom korreliert eine MYCN-Amplifikation mit einer schlechten Prognose. Da es auf Grund einer fehlenden katalytischen Domäne nicht möglich ist N-Myc direkt zu inhibieren, ist die Suche nach alternativen Targets notwendig. Das Ziel dieser Arbeit war es neue Gene zu identifizieren, die notwendig für das Wachstum und Überleben von MYCN amplifizierten Zellen sind. Dies wurde durch eine Kombination von Hochdurchsatz-RNAi-Screens und Next-Generation-Sequenzierung erreicht. Durch das Screenen einer shRNA-Bibliothek, die insgesamt 18327 shRNAs beinhaltet, konnten 148 shRNAs identifiziert werden, die selektiv nachteilig für das Überleben N-Myc überexpremierender Zellen sind. Die statistische Auswertung der Ergebnisse des Screens zeigte zusätzlich eine Anreichung von shRNAs gegen Gene, die p53-und ARF-abhängig Apoptose vermitteln. Da es bekannt ist, dass diese Gene in der N-Myc-vermittelten Apoptose involviert sind, konnte dadurch der Screen validiert werden. Die weitere Auswertung mit dem bioinformatischen Programm DAVID ergab, dass unter den 148 als synthetisch letal identifizierten shRNAs solche angereichert waren, die gegen Gene spezifischer biologischer Prozesse gerichtet sind. Zum einen wurden Gene wie THOC1, NUP153 und LARP7 validiert, die eine Rolle im Prozeß der Elongation der RNA Polymerase II spielen. Zum anderen konnten Gene validiert werden die einen Beitrag bei der Neddylierung von Proteinen leisten. Durch die Depletion von Cullin 3, ein Bestandteil des BTB-CUL3-Rbx1 Ubiquitin-Ligase-Komplexes, der am Abbau von Cyclin E beteiligt ist, konnte gezeigt werden, dass zusammen mit der Aktivierung von N-Myc eine supraphysiologische Erhöhung von Cyclin E induziert wird. Dies führt zu einem S-Phase Arrest in der Zelle, der die DNA-Schadens-Signalkaskade auslöst. Zusammen mit den Ergebnissen einer Proteomanalyse, bei der neue N-Myc-assoziierte Proteine identifiziert wurden, konnte folgende Hypothese aufgestellt werden: In einer Neuroblastomzelle helfen diese neuen Interaktionspartner den durch die N-Myc Überexpression in der S-phase entstehenden Konflikt zwischen RNA-Polymerase II und Replikationsmaschinerie zu lösen. Der Verlust dieser Interaktion führt zu einer massiven Schädigung der DNA, worauf in der Zelle Apoptose ausgelöst wird. Des Weiteren führen auch die Inhibition oder Ausschaltung wesentlicher Komponenten des Neddylierungs-Signalwegs zu unlösbaren Problemen in der S-Phase des Zellzyklus. KW - Neuroblastom KW - synthetic lethality KW - apoptosis KW - cul3 ring ligase KW - replicative stress KW - N-Myc KW - Deregulierung KW - RNS-Interferenz KW - synthetische Letalität Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-103157 ER - TY - THES A1 - El-Masri, Harun T1 - A genetic analysis of somitogenesis in the Medaka (Oryzias latipes) T1 - Genetische Analyse der Somitogenese in Medaka (Oryzias latipes) N2 - Somites are repeated epithelial segments that are generated in a rhythmic manner from the presomitic mesoderm (PSM) in the embryonic tailbud. Later, they differentiate into skeletal muscle, cartilage and dermis. Somitogenesis is regulated by a complex interplay of different pathways. Notch/Delta signaling is one of the pathways well characterized in zebrafish through mutants affected in its different components. Previous work in mouse, chicken and zebrafish has shown that also additional components are required during somitogenesis, most importantly through an FGF and Retinoic acid (RA) gradient, as well as Wnt signaling. However, no zebrafish mutants with defects in these pathways showing specific somite malformations are described. This was explained by functional redundancies among related genes that have resulted from a whole genome duplication which occurred in a teleost fish ancestor 350 million years ago. As distinct duplicates exist in different teleost species, a large scale mutagenesis screen in the medaka (Oryzias latipes) has been performed successfully in Kyoto, Japan. I analyzed nine of the isolated medaka mutants that show variable aspects of somitic phenotypes. This includes a complete or partial loss of somite boundaries (e.g. bms and sne), somites with irregular sizes and shapes (e.g. krz and fsl) or partially fused and enlarged somites (e.g. dpk). Although some of these medaka mutants share characteristics with previously described zebrafish somite mutants, most of the mutants represent unique phenotypes, not obtained in the zebrafish screens. In-situ hybridization analyses with marker genes implicated in the segmentation clock (e.g. her7), establishment of anterior-posterior (A-P) polarity (e.g. mesp) and differentiation of somites (e.g. myf5, lfng) revealed that the medaka mutants can be separated into two classes. Class I shows defects in tailbud formation and PSM prepatterning, and lateron somite boundary formation was impaired in these mutants. A unique member of this class with a novel phenotype is the doppelkorn (dpk) mutant that has single fused or enlarged somites. This phenotype has not been reported till now in zebrafish somite mutants. In-situ analyses on dpk showed that stabilization of the cyclically expressed somitogenesis clock genes must be affected in this mutant. This is accompanied by a disrupted regulation of A-P polarity genes like mesp. This suggests that dpk is a mutant deficient in the wave front, which is necessary for the down-regulation of oscillating genes in the anterior PSM. Furthermore, as the initiation of oscillation of all three cyclic her genes was unaffected in dpk embryos, I could exclude that this mutant in affected in the Notch/Delta pathway. Another mutant that belongs to this class is the samidare (sam) mutant. Morphologically, sam mutants are similar to zebrafish after eight (aei). In both cases, the first 7-9 somites are formed properly, but after this somite formation ceases. Different to the situation in aei, sam mutant embryos presented an additional defect in the mid-hindbrain boundary (MHB) region. Similar MHB defects were described in the zebrafish fgf8 mutant acerebellar (ace). In ace zebrafish mutant, somites were only slightly defective, although FGF signaling has been shown to be important for somite formation in chicken, mouse and zebrafish. This was explained by functional redundancy between fgf8 and fgf24 ligands in the tailbud of zebrafish. Thus, it is interesting to suggest that the sam mutant, based on the parallel defects in somites and MHB, is a potential member of the FGF signaling pathway muatnts. It was shown that FGF plays a crucial role during MHB formation in medaka. In addition, I showed that fgf8 acts non-redundantly during tailbud formation and somitogenesis in medaka. Furthermore, I showed that FGF signaling regulates somite size also in medaka and that fgfr1 is the only FGF receptor expressed in the tailbud and somites. In class II medaka somite mutants, PSM prepatterning appears normal, whereas A-P polarity, boundary formation, epithelialization or the later differentiation of somites appears to be affected. Such mutants have not been isolated so far in zebrafish, mice or chicken. Therefore, medaka class II somite mutants seem to be a novel group of mutants that opens new perspectives to analyze A-P polarity regulation, determination and boundary formation in the presence of a normally functioning clock in the PSM. Identifying the encoding genes for all analyzed medaka somite mutants will contribute to the understanding of the molecular interactions of different signaling pathways involved during somitogenesis, and is expected to result in the identification of new components. N2 - Die Somitogenese stellt einen entscheidenden Prozess bei der Entwicklung von Wirbeltierembryonen dar. Somiten sind transiente Strukturen, die sich im Verlauf der Embryonalentwicklung zu Skelettmuskulatur, Dermis und Wirbelkörper differenzieren. Somiten entstehen in einem sich regelmäßig wiederholenden Zyklus aus Stammzellen des präsomitischen Mesoderms (PSM), einer Wachstumszone am caudalen Ende des Embryos. Ein wichtiger Bestandteil der Somitogenese ist ein molekularer Oszillator, das so genannte „Segmentierungs-Uhrwerk“. Die periodische Segmentierung des präsomitischen Mesoderms wird reguliert durch eine Reihe komplexer Interaktionen von unterschiedlichen Signale wegen. Der Notch/Delta Signalweg spielt dabei eine zentrale Bedeutung, da hierbei Komponenten entdeckt wurden, die während der Somitogenese zyklisch im PSM exprimiert werden. Außer dem Notch/Delta Signalweg spielen auch ein FGF und Retinolsäure Gradient, sowie Wnt Signale eine wichtige Rolle bei der Somitogenese. Trotz mehrerer Mutagenese Screens im Zebrafisch wurden bislang keine Mutanten im FGF oder Wnt Signalweg entdeckt, die einen spezifischen Somiten Defekt besitzen. Die wurde durch eine funktionelle Redundanz unterschiedlicher Gene erklärt, die durch eine Duplikation im Genom von Teleostieren vor 350 Millionen Jahren enstanden ist. Da unterschiedliche Duplikate in verschiedenen Fischspezies existieren, wurde in den letzten Jahren ein grosser Mutagenese Screen bei Medaka (Oryzias latipes) in Kyoto, Japan durchgeführt. In meiner Arbeit habe ich neue Somitogenese Mutanten aus dieser Screen isoliert und Phänotypisch charakterisiert. Die neun isolierten Mutanten zeigten unterschiedliche Somiten Phänotypen. Einige Mutanten hatten wenige oder gar keine Somitengrenzen (z.B bms oder sne), andere hatten unregelmäßige Somiten Formen (z.B. krz oder fsl) oder unterschiedlich große Somiten (z.B dpk). Manche dieser Medaka wiesen Änlichkeiten Mutanten zu im Zebrafisch beschriebenen Somiten Mutanten auf. Die Mehrzahl der Mutanten zeigten jedoch Phänotypen, die bis jetzt noch nicht in Zebrafisch Screens gefunden worden. In-Situ Analysen mit Hilfe unterschiedlicher, neu isolierter Somitenmarker, wie z.B. her7 einem Bestandteil des molekularen Oszillators, mesp einem anterior-posterioren Gen oder den Somitendifferenzierungsgenen lfng oder myf5 erlaubten, die Medaka Mutanten in zwei unterschiedliche Gruppen zuzuordnen. Gruppe I zeigt Defekte in der Bildung der Schwanzknospe und der Musterbildung im PSM. Ein besonderes Beispiel dieser Gruppe ist die Mutante doppelkorn (dpk), die einen bislang nicht beschriebenen Somitenphänotyp besitzt. In-situ Analysen von dpk zeigten, dass zyklische Gene im anterioren PSM dieser Mutante nicht stabilisiert werden und auch A-P Polaritätsgene fehlerhaft reguliert werden. Das deutet darauf hin, dass in der dpk Mutante ein Faktor der sogenannten „Wavefront“ betroffen sein könnte, der wichtig ist für die Regulation von oszillierenden Genen im anterioren PSM ist. Ich konnte zeigen, daß der wichtige Notch/Delta Signalweg in dieser Mutante nicht betroffen ist, weil alle unterschiedlichen zyklischen Gene, her1, her5 und her7, eine normale dynamische initiation ihrer Expression zeigten. Gruppe II Mutanten zeigen Defekte bei der Bildung der Somitengrenzen und Epithelialisierung der Somiten trotz normales, Musterbildung im PSM. Solche Mutanten wurden bislang weder in Zebrafisch, noch in Maus oder Hühnchen gefunden. Deshalb sollten nach der molekularen Identifiezierung der mutierten Gene neue Faktoren erhalten werden, die vor allem für die Regulation später Somitogenese-phasen wichtig sind. KW - Japankärpfling KW - Somit KW - Genanalyse KW - Somiten KW - Präsomitisches Mesoderm KW - Medaka KW - FGF Signalweg KW - Notch/Delta Signalweg KW - Somites KW - Presomitic meoderm KW - Medaka KW - FGF pathway KW - Notch/Delta pathway Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-14515 ER - TY - THES A1 - Hackl, Thomas T1 - A draft genome for the Venus flytrap, Dionaea muscipula : Evaluation of assembly strategies for a complex Genome – Development of novel approaches and bioinformatics solutions T1 - Ein Genom für die Venus Fliegenfalle, Dionaea muscipula N2 - The Venus flytrap, \textit{Dionaea muscipula}, with its carnivorous life-style and its highly specialized snap-traps has fascinated biologist since the days of Charles Darwin. The goal of the \textit{D. muscipula} genome project is to gain comprehensive insights into the genomic landscape of this remarkable plant. The genome of the diploid Venus flytrap with an estimated size between 2.6 Gbp to 3.0 Gbp is comparatively large and comprises more than 70 % of repetitive regions. Sequencing and assembly of genomes of this scale are even with state-of-the-art technology and software challenging. Initial sequencing and assembly of the genome was performed by the BGI (Beijing Genomics Institute) in 2011 resulting in a 3.7 Gbp draft assembly. I started my work with thorough assessment of the delivered assembly and data. My analysis showed that the BGI assembly is highly fragmented and at the same time artificially inflated due to overassembly of repetitive sequences. Furthermore, it only comprises about on third of the expected genes in full-length, rendering it inadequate for downstream analysis. In the following I sought to optimize the sequencing and assembly strategy to obtain an assembly of higher completeness and contiguity by improving data quality and assembly procedure and by developing tailored bioinformatics tools. Issues with technical biases and high levels of heterogeneity in the original data set were solved by sequencing additional short read libraries from high quality non-polymorphic DNA samples. To address contiguity and heterozygosity I examined numerous alternative assembly software packages and strategies and eventually identified ALLPATHS-LG as the most suited program for assembling the data at hand. Moreover, by utilizing digital normalization to reduce repetitive reads, I was able to substantially reduce computational demands while at the same time significantly increasing contiguity of the assembly. To improve repeat resolution and scaffolding, I started to explore the novel PacBio long read sequencing technology. Raw PacBio reads exhibit high error rates of 15 % impeding their use for assembly. To overcome this issue, I developed the PacBio hybrid correction pipeline proovread (Hackl et al., 2014). proovread uses high coverage Illumina read data in an iterative mapping-based consensus procedure to identify and remove errors present in raw PacBio reads. In terms of sensitivity and accuracy, proovread outperforms existing software. In contrast to other correction programs, which are incapable of handling data sets of the size of D. muscipula project, proovread’s flexible design allows for the efficient distribution of work load on high-performance computing clusters, thus enabling the correction of the Venus flytrap PacBio data set. Next to the assembly process itself, also the assessment of the large de novo draft assemblies, particularly with respect to coverage by available sequencing data, is difficult. While typical evaluation procedures rely on computationally extensive mapping approaches, I developed and implemented a set of tools that utilize k-mer coverage and derived values to efficiently compute coverage landscapes of large-scale assemblies and in addition allow for automated visualization of the of the obtained information in comprehensive plots. Using the developed tools to analyze preliminary assemblies and by combining my findings regarding optimizations of the assembly process, I was ultimately able to generate a high quality draft assembly for D. muscipula. I further refined the assembly by removal of redundant contigs resulting from separate assembly of heterozygous regions and additional scaffolding and gapclosing using corrected PacBio data. The final draft assembly comprises 86 × 10 3 scaffolds and has a total size of 1.45 Gbp. The difference to the estimated genomes size is well explained by collapsed repeats. At the same time, the assembly exhibits high fractions full-length gene models, corroborating the interpretation that the obtained draft assembly provides a complete and comprehensive reference for further exploration of the fascinating biology of the Venus flytrap. N2 - Die Venus Fliegenfalle, D. muscipula fasziniert aufgrund ihres karnivoren Lebensstil und ihrer hochspezialisierten Fallen Biologen schon seit der Zeit von Charles Darwins. Das Ziel des D. muscipula Genomprojekts ist es, neue Einblicke in den genomischen Grundlagen dieser besonderen Pflanze zu gewinnen. Die diploide Venus Fliegenfalle verfügt mit eine geschätzten Größe von 2.6 bp bis 3Gbp über ein vergleichsweise großes Genom, das zudem zu über 70% aus repetitiven Regionen besteht. Sequenzierung und Assembly von Genomen dieser Größenordnung stellen selbst mit neusten technischen und informatischen Methoden eine große Herausforderung dar. Zum ersten mal sequenziert und assembliert wurde das Genom 2011 durch das BGI (Beijing Genomics Institute). Meine Arbeit am Genom der Fliegenfalle begann mit der Analyse des 3.7Gbp großen Assemblies, welches wir vom BGI erhalten haben. Mit meinen Untersuchungen könnte ich zeigen, dass das Assembly stark fragmentiert und gleichzeitig durch überrepräsentierte repetitive Sequenzen stark aufgebläht ist. Darüberhinaus beinhaltet es gerade ein mal eine drittel der erwarteten Gene in Volllänge, wodurch es für die weiter Analyse ungeeignet ist. In meiner weiteren Arbeit habe ich mich daher darauf konzentriert, unsere Sequenzierungsund Assemblierungsstrategie zu verfeinern um ein stärker zusammenhängendes und vollständigeres Assembly zu erhalten. Dafür war es notwendig die Qualität der Sequenzierdaten so wie den Assemblierungsprozess selbst zu optimieren, und Programme zu entwickeln, die eine Verbesserung der Daten und eine Analyse der Zwischenergebnisse ermöglichen. So wurden etwa zur neue Bibliotheken von nicht-polymorphen DNA-Proben sequenziert um die Heterogenität im Datensatz zu verringern. Um die Kontinuität der Assemblies zu verbessern und Probleme mit der Heterozygosität der Daten zu lösen habe ich eine Reihe verschiedener Assemblierungsprogramme getestet. Dabei zeigte sich, dass das Programm ALLPATHS-LG am besten geeignet ist für die Assemblierung von D. muscipula Daten. Durch den Einsatz von digitaler Normalisierung konnte ich den Bedarf an Computerressourcen für einzelne Assemblierungen deutlich reduzieren und gleichzeitig die Kontinuität der Assemblies deutlich erhöhen. Zur besseren Auflösung repetitiver Strukturen im Genom, habe ich auf eine neu entwickelte Sequenziertechnologie von PacBio zurückgegriffen, die deutlich länger Sequenzen erzeugt. Um die neuen Daten trotz ihrer hohen Fehlerrate von 15% für Assemblierungen nutzen zu können, entwickelte ich das Korrekturprogramm proovread (Hackl et al., 2014). proovread nutzt kurze Illumina Sequenzen mit hoher Sequenziertiefe um innerhalb eines iterativen Prozess Fehler in PacBio Daten ausfindig zu machen und zu korrigieren. Das Programm erreicht dabei eine bessere Genauigkeit und eine höhere Sensitivität als vergleichbare Software. Darüber hinaus erlaubt sein flexibles Design auch Datensätze in der Größenordung des Fliegenfallengenoms effizient auf großen Rechenclustern zu bearbeiten. Neben dem Assemblierungsprozess an sich, stellt auch die Analyse von Assemblies großer Genome eine Herausforderung dar. Klassische Methoden basieren oft auf der rechenintensiven Berechnung von Alignments zwischen Sequenzierdaten und Assembly. Um vergleichbare Analysen deutlich schneller generieren zu können, habe ich Programme entwickelt die auf der Auswertung von k-mer Häufigkeiten beruhen, und die gewonnenen Ergebnisse in übersichtlichen Graphiken darstellen. Durch Kombination der so gewonnenen Einblicke und der verschiedenen Erkenntnisse bezüglich der Optimierung es Assemblierungsprozesses, war es mir am Ende möglich, ein Assembly von hoher Qualität für das Genom der Venus Fliegenfalle zu rekonstruieren. Dieses habe ich weiter verfeinert, unter anderem durch das Entfernen heterozygoter Sequenzen und durch das Flicken von Lücken mit Hilfe von PacBio Daten. Das so erstelle Assembly besteht aus 86 × 103 Sequenzen und hat eine Gesamtgröße von 1.45Gbp. Der Unterschied zur erwarteten Genomgröße lässt sich dabei gut durch kollabierte repetitive Regionen erklären. Gleichzeitig untermauert ein hoher Anteil an Volllängengenen im Assembly die Interpretation, dass das vorliegende Assembly eine vollständiges und umfassendes Abbild der D. muscipula Genom zeigt, und dass es sich damit als gute Grundlage für weitere Untersuchungen zur Biologie dieser faszinierenden Pflanze eignet. KW - Venusfliegenfalle KW - genome assembly KW - repeats KW - heterozygosity KW - pacbio correction KW - Genom Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-133149 ER - TY - THES A1 - Beer, Katharina T1 - A Comparison of the circadian clock of highly social bees (\(Apis\) \(mellifera\)) and solitary bees (\(Osmia\) \(spec.\)): Circadian clock development, behavioral rhythms and neuroanatomical characterization of two central clock components (PER and PDF) T1 - Ein Vergleich der Inneren Uhr von sozialen Bienen (\(Apis\) \(mellifera\)) und solitären Bienen (\(Osmia\) \(spec.\)): Entwicklung der circadianen Uhr, Verhaltensrhythmen und neuroanatomische Beschreibung von zwei zentralen Uhr Komponenten (PER und PDF) N2 - Summary Bees, like many other organisms, evolved an endogenous circadian clock, which enables them to foresee daily environmental changes and exactly time foraging flights to periods of floral resource availability. The social lifestyle of a honey bee colony has been shown to influence circadian behavior in nurse bees, which do not exhibit rhythmic behavior when they are nursing. On the other hand, forager bees display strong circadian rhythms. Solitary bees, like the mason bee, do not nurse their offspring and do not live in hive communities, but face the same daily environmental changes as honey bees. Besides their lifestyle mason and honey bees differ in their development and life history, because mason bees overwinter after eclosion as adults in their cocoons until they emerge in spring. Honey bees do not undergo diapause and have a relatively short development of a few weeks until they emerge. In my thesis, I present a comparison of the circadian clock of social honey bees (Apis mellifera) and solitary mason bees (Osmia bicornis and Osmia cornuta) on the neuroanatomical level and behavioral output level. I firstly characterized in detail the localization of the circadian clock in the bee brain via the expression pattern of two clock components, namely the clock protein PERIOD (PER) and the neuropeptide Pigment Dispersing Factor (PDF), in the brain of honey bee and mason bee. PER is localized in lateral neuron clusters (which we called lateral neurons 1 and 2: LN1 and LN2) and dorsal neuron clusters (we called dorsal lateral neurons and dorsal neurons: DLN, DN), many glia cells and photoreceptor cells. This expression pattern is similar to the one in other insect species and indicates a common ground plan of clock cells among insects. In the LN2 neuron cluster with cell bodies located in the lateral brain, PER is co-expressed with PDF. These cells build a complex arborization network throughout the brain and provide the perfect structure to convey time information to brain centers, where complex behavior, e.g. sun-compass orientation and time memory, is controlled. The PDF arborizations centralize in a dense network (we named it anterio-lobular PDF hub: ALO) which is located in front of the lobula. In other insects, this fiber center is associated with the medulla (accessory medulla: AME). Few PDF cells build the ALO already in very early larval development and the cell number and complexity of the network grows throughout honey bee development. Thereby, dorsal regions are innervated first by PDF fibers and, in late larval development, the fibers grow laterally to the optic lobe and central brain. The overall expression pattern of PER and PDF are similar in adult social and solitary bees, but I found a few differences in the PDF network density in the posterior protocerebrum and the lamina, which may be associated with evolution of sociality in bees. Secondly, I monitored activity rhythms, for which I developed and established a device to monitor locomotor activity rhythms of individual honey bees with contact to a mini colony in the laboratory. This revealed new aspects of social synchronization and survival of young bees with indirect social contact to the mini colony (no trophalaxis was possible). For mason bees, I established a method to monitor emergence and locomotor activity rhythms and I could show that circadian emergence rhythms are entrainable by daily temperature cycles. Furthermore, I present the first locomotor activity rhythms of solitary bees, which show strong circadian rhythms in their behavior right after emergence. Honey bees needed several days to develop circadian locomotor rhythms in my experiments. I hypothesized that honey bees do not emerge with a fully matured circadian system in the hive, while solitary bees, without the protection of a colony, would need a fully matured circadian clock right away after emergence. Several indices in published work and preliminary studies support my hypothesis and future studies on PDF expression in different developmental stages in solitary bees may provide hard evidence. N2 - Zusammenfassung Bienen, sowie viele andere Organismen, evolvierten eine innere circadiane Uhr, die es ihnen ermöglicht, tägliche Umweltveränderungen voraus zu sehen und ihre Foragierflüge zu Tageszeiten durchzuführen, wenn sie möglichst viele Blüten besuchen können. Es zeigte sich, dass der soziale Lebensstil der Honigbiene Einfluss auf das rhythmische Verhalten der Ammenbienen hat, die während der Brutpflege keinen täglichen Rhythmus im Verhalten aufweisen. Sammlerbienen auf der anderen Seite zeigen ein stark rhythmisches Verhalten. Solitäre Bienen, wie die Mauerbiene, betreiben keine Brutpflege und leben nicht in einer Staatengemeinschaft, aber sind den gleichen Umweltveränderungen ausgesetzt. Nicht nur Lebensstil, sondern auch Entwicklung und Lebenszyklus unterscheiden sich zwischen Honig- und Mauerbienen. Mauerbienen überwintern als adulte Insekten in einem Kokon bis sie im Frühjahr schlüpfen. Honigbienen durchleben keine Diapause und schlüpfen nach wenigen Wochen der Entwicklung im Bienenstock. In meiner Dissertation vergleiche ich die circadiane Uhr von sozialen Honigbienen (Apis mellifera) und solitären Mauerbienen (Osmia bicornis und Osmia cornuta) auf Ebene der Neuroanatomie und das durch die innere Uhr verursachte rhythmische Verhalten. Erstens charakterisierte ich detailliert die Lage der circadianen Uhr im Gehirn von Honig- und Mauerbiene anhand des Expressionsmusters von zwei Uhrkomponenten. Diese sind das Uhrprotein PERIOD (PER) und das Neuropeptid Pigment Dispersing Factor (PDF). PER wird exprimiert in lateralen Neuronen-Gruppen (die wir laterale Neurone 1 und 2 nannten: LN1 und LN2) und dorsalen Neuronen-Gruppen (benannt dorsal laterale Neurone und dorsale Neurone: DLN und DN), sowie in vielen Gliazellen und Fotorezeptorzellen. Dieses Expressionsmuster liegt ähnlich in anderen Insektengruppen vor und deutet auf einen Grundbauplan der Inneren Uhr im Gehirn von Insekten hin. In der LN2 Neuronen-Gruppe, deren Zellkörper im lateralen Gehirn liegen, sind PER und PDF in den gleichen Zellen co-lokalisiert. Diese Zellen bilden ein komplexes Netzwerk aus Verzweigungen durch das gesamte Gehirn und liefern damit die perfekte Infrastruktur, um Zeitinformation an Gehirnregionen weiterzuleiten, die komplexe Verhaltensweisen, wie Sonnenkompass-Orientierung und Zeitgedächtnis, steuern. Alle PDF Neuriten laufen in einer anterior zur Lobula liegenden Region zusammen (sie wurde ALO, anterio-lobular PDF Knotenpunkt, genannt). Dieser Knotenpunkt ist in anderen Insekten mit der Medulla assoziiert und wird akzessorische Medulla (AME) genannt. Wenige PDF Zellen bilden bereits im frühen Larvalstadium diesen ALO und die Zellzahl sowie die Komplexität des Netzwerks wächst die gesamte Entwicklung der Honigbiene hindurch. Dabei werden zuerst die dorsalen Gehirnregionen von PDF Neuronen innerviert und in der späteren Larvalentwicklung wachsen die Neurite lateral in Richtung der optischen Loben und des Zentralgehirns. Das generelle Expressionsmuster von PER und PDF in adulten sozialen und solitären Bienen ähnelt sich stark, aber ich identifizierte kleine Unterschiede in der PDF Netzwerkdichte im posterioren Protocerebrum und in der Lamina. Diese könnten mit der Evolution von sozialen Bienen assoziiert sein. Zweitens entwickelte und etablierte ich eine Methode, Lokomotionsrhythmen von individuellen Bienen im Labor aufzunehmen, die in Kontakt mit einem Miniaturvolk standen. Diese Methode enthüllte neue Aspekte der sozialen Synchronisation unter Honigbienen und des Überlebens von jungen Bienen, die indirekten sozialen Kontakt zu dem Miniaturvolk hatten (Trophalaxis war nicht möglich). Für Mauerbienen etablierte ich eine Methode Schlupf- und lokomotorische Aktivitätsrhythmik aufzuzeichnen und konnte damit zeigen, dass tägliche Rhythmen im Schlupf durch Synchronisation der circadianen Uhr in Mauerbienen durch Tagestemperatur-Zyklen erzielt werden kann. Des Weiteren präsentiere ich die ersten lokomotorischen Aktivitätsrhythmen von solitären Bienen, die sofort nach ihrem Schlupf einen starken circadianen Rhythmus im Verhalten aufwiesen. Honigbienen brauchten in meinen Experimenten mehrere Tage, um circadiane Rhythmen in Lokomotion zu entwickeln. Ich erstellte die Hypothese, dass Honigbienen zum Zeitpunkt des Schlupfes im Bienenvolk ein noch nicht vollständig ausgereiftes circadianes System besitzen, während solitäre Bienen, die ohne den Schutz eines Volkes sind, direkt nach dem Schlupf eine vollständig ausgereifte Uhr brauchen. Mehrere Hinweise in Publikationen und Vorversuchen unterstützen meine Hypothese. Zukünftige Studien der Entwicklung des PDF Neuronen-Netzwerkes in solitären Bienen unterschiedlicher Entwicklungsstufen könnten dies nachweisen. KW - Chronobiologie KW - circadian rhythms KW - honeybee KW - Mauerbiene KW - Neuroanatomie Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-159765 ER - TY - THES A1 - Wagh, Dhananjay Anil T1 - "Bruchpilot" -molecular and functional characterization of a novel active zone protein at the Drosophila synapse T1 - "Bruchpilot" - Molekulare und funktionelle Charakterisierung eines neuen Proteins der aktiven Zone der Drosophila-Synapse N2 - Chemical neurotransmission is a complex process of central importance for nervous system function. It is thought to be mediated by the orchestration of hundreds of proteins for its successful execution. Several synaptic proteins have been shown to be relevant for neurotransmission and many of them are highly conserved during evolution- suggesting a universal mechanism for neurotransmission. This process has checkpoints at various places like, neurotransmitter uptake into the vesicles, relocation of the vesicles to the vicinity of calcium channels in order to facilitate Ca2+ induced release thereby modulating the fusion probability, formation of a fusion pore to release the neurotransmitter and finally reuptake of the vesicles by endocytosis. Each of these checkpoints has now become a special area of study and maintains its own importance for the understanding of the overall process. Ca2+ induced release occurs at specialized membrane structures at the synapse known as the active zones. These are highly ordered electron dense grids and are composed of several proteins which assist the synaptic vesicles in relocating in the vicinity of Ca2+ channels thereby increasing their fusion probability and then bringing about the vesicular fusion itself. All the protein modules needed for these processes are thought to be held in tight arrays at the active zones, and the functions of a few have been characterized so far at the vertebrate active zones. Our group is primarily interested in characterizing the molecular architecture of the Drosophila synapse. Due to its powerful genetics and well-established behavioural assays Drosophila is an excellent system to investigate neuronal functioning. Monoclonal antibodies (MABs) from a hybridoma library against Drosophila brain are routinely used to detect novel proteins in the brain in a reverse genetic approach. Upon identification of the protein its encoding genetic locus is characterized and a detailed investigation of its function is initiated. This approach has been particularly useful to detect synaptic proteins, which may go undetected in a forward genetic approach due to lack of an observable phenotype. Proteins like CSP, Synapsin and Sap47 have been identified and characterized using this approach so far. MAB nc82 has been one of the shortlisted antibodies from the same library and is widely used as a general neuropil marker due to the relative transparency of immunohistochemical whole mount staining obtained with this antibody. A careful observation of double stainings at the larval neuromuscular junctions with MAB nc82 and other pre and post-synaptic markers strongly suggested an active zone localization of the nc82 antigen. Synaptic architecture is well characterized in Drosophila at the ultrastructural level. However, molecular details for many synaptic components and especially for the active zone are almost entirely unknown. A possible localization at the active zone for the nc82 antigen served as the motivation to initiate its biochemical characterization and the identification of the encoding gene. In the present thesis it is shown by 2-D gel analysis and mass spectrometry that the nc82 antigen is a novel active zone protein encoded by a complex genetic locus on chromosome 2R. By RT-PCR exons from three open reading frames previously annotated as separate genes are demonstrated to give rise to a transcript of at least 5.5 kb. Northern blots produce a prominent signal of 11 kb and a weak signal of 2 kb. The protein encoded by the 5.5 kb transcript is highly conserved amongst insects and has at its N-terminus significant homology to the previously described vertebrate active zone protein ELKS/ERC/CAST. Bioinformatic analysis predicts coiled-coil domains spread all over the sequence and strongly suggest a function involved in organizing or maintaining the structure of the active zone. The large C-terminal region is highly conserved amongst the insects but has no clear homologues in veretebrates. For a functional analysis of this protein transgenic flies expressing RNAi constructs under the control of the Gal4 regulated enhancer UAS were kindly provided by the collaborating group of S.Sigrist (Gِttingen). A strong pan-neuronal knockdown of the nc82 antigen by transgenic RNAi expression leads to embryonic lethality. A relatively weaker RNAi expression results in behavioural deficits in adult flies including unstable flight and impaired walking behavior. Due to this peculiar phenotype as observed in the first knockdown studies the gene was named “bruchpilot” (brp) encoding the protein “Bruchpilot (BRP)” (German for crash pilot). A pan-neuronal as well as retina specific downregulation of this protein results in loss of ON and OFF transients in ERG recordings indicating dysfunctional synapses. Retina specific downregulation also shows severely impaired optomotor behaviour. Finally, at an ultrastructural level BRP downregulation seems to impair the formation of the characteristic T-shaped synaptic ribbons at the active zones without significantly altering the overall synaptic architecture (in collaboration with E.Asan). Vertebrate active zone protein Bassoon is known to be involved in attaching the synaptic ribbons to the active zones as an adapter between active zone proteins RIBEYE and ERC/CAST. A mutation in Bassoon results in a floating synaptic ribbon phenotype. No protein homologous to Bassoon has been observed in Drosophila. BRP downregulation also results in absence of attached synaptic ribbons at the active zones. This invites the speculation of an adapter like function for BRP in Drosophila. However, while Bassoon mutant mice are viable, BRP deficit in addition to the structural phenotype also results in severe behavioural and physiological anomalies and even stronger downregulation causes embryonic lethality. This therefore suggests an additional and even more important role for BRP in development and normal functioning of synapses in Drosophila and also in other insects. However, how BRP regulates synaptic transmission and which other proteins are involved in this BRP dependant pathway remains to be investigated. Such studies certainly will attract prominent attention in the future. N2 - Die chemische Signalübertragung an Synapsen ist ein komplexer Prozess mit zentraler Bedeutung für die Funktion von Nervensystemen. Man nimmt an, dass er auf einem Zusammenspiel hunderter verschiedener Proteine beruht. Diverse Synopsenproteine haben sich für die Neurotransmission als relevant erwiesen und viele davon sind in der Evolution hoch konserviert, was einen universalen Mechanismus der Neurotransmission wahrscheinlich macht. Dieser Prozess ist in zahlreiche aufeinander folgende Schritte unterteilt, wie die Neurotransmitteraufnahme in Vesikel, den Transport von Vesikeln in die Nنhe von Calciumkanنlen, die Ausbildung einer Fusionspore zur Transmitterausschüttung und schlieكlich die Wiederaufnahme von Vesikeln durch Endozytose. Jeder dieser Teilschritte wird momentan gezielt erforscht und spielt für sich genommen eine zentrale Rolle für das Verstنndnis des gesamten Prozesses. Die Calcium-induzierte Transmitterausschüttung findet an spezialisierten Membranstrukturen der Synapsen statt, den aktiven Zonen. Diese sind hoch organisierte, elektronendichte Gitterstrukturen und bestehen aus verschiedenen Proteinen, die den synaptischen Vesikeln bei der Verlagerung in die Nنhe von Calciumkanنlen behilflich sind. Alle Proteinmodule, die für diese Prozesse nِtig sind, scheinen eng aneinandergereiht an den aktiven Zonen vorzuliegen. Nur von wenigen konnte bisher bei Vertebraten die Funktion an der aktiven Zone charakterisiert werden. Ein Fokus der Arbeitsgruppe, an der diese Doktorarbeit durchgeführt wurde, besteht in der Charakterisierung des molekularen Aufbaus der Synapse von Drosophila. Die Taufliege ist aufgrund eines reichen Angebots hِchsteffektiver genetischer Methoden und vielfنltiger Verhaltensparadigmen ein exzellentes Modellsystem, um die neuronale Signalübertragung zu untersuchen. Monoklonale Antikِrper (MAKs) aus einer Hybridomabank gegen das Drosophila Gehirn werden standardmنكig verwendet, um neue Gehirnproteine mittels der „reverse genetics“- Methode zu identifizieren. Dazu wird der entsprechende genetische Lokus charakterisiert und eine detaillierte Untersuchung der Proteinfunktion initiiert. Diese Vorgehensweise war besonders hilfreich bei der Identifizierung von Synapsenproteinen, die bei der „forward genetics“-Methode aufgrund des Fehlens eines beobachtbaren Phنnotyps übersehen würden. Proteine wie CSP, Synapsin und Sap47 wurden so gefunden und charakterisiert. I MAK nc82 stammt aus dieser Hybridomabank und wird in vielen Labors als allgemeiner Neuropilmarker aufgrund seiner hervorragenden Fنrbungseigenschaften in Gehirnprنparaten verwendet. Doppelfنrbungen der larvalen neuromuskulنren Synapse mit dem Antikِrper nc82 in Kombination mit anderen prن- und postsynaptischen Markern deuteten stark auf eine Lokalisierung des Antigens an der aktiven Zone hin. Die Synapsenarchitektur von Drosophila ist auf der ultrastrukturellen Ebene gut verstanden. Jedoch sind die molekularen Details vieler Synapsenkomponenten, besonders die der aktiven Zone, nicht bekannt. Die vermutete Lokalisierung des nc82 Antigens an der aktiven Zone war daher der Ansatzpunkt, eine biochemische Charakterisierung zu initiieren und das entsprechende Gen zu identifizieren. In der vorliegenden Arbeit wird durch 2-D Gelelektrophorese und Massenspektrometrie gezeigt, das das nc82 Antigen ein neues Protein der aktiven Zone ist, welches von einem komplexen Genlokus auf Chromosom 2R kodiert wird. Durch RT-PCR wurde gezeigt, dass die Exons von drei offenen Leserastern, die bisher als getrennte Gene annotiert wurden, ein Transkript von mindestens 5,5 kb Lنnge kodieren. Northern Blots ergaben ein deutliches Signal bei 11 kb und ein schwنcheres bei 2 kb. Das von dem 5,5 kb Transkript resultierende Protein ist hoch konserviert in der Gruppe der Insekten und weist an seiner N-terminalen Domنne eine signifikante Homologie zu den bisher beschriebenen Vertebratenproteinen der aktiven Zone ELKS/ERC/CAST auf. Bioinformatische Analysen sagen „coiled-coil“ Domنnen vorher, die über die gesamte Sequenz verteilt sind. Dies deutet stark auf eine Funktion bei der Organisation oder der Aufrechterhaltung der prنsynaptischen Struktur hin. Die groكe C-terminale Region ist zwar bei Insekten hoch konserviert, zeigt aber keine eindeutige Homologie zu Proteinen von Vertebraten. Für die Funktionsanalyse dieses Proteins wurden transgene Fliegen, die UAS-RNAi Konstrukte in ihrem Genom tragen und durch entsprechende GAL4-Linien getrieben werden kِnnen, freundlicherweise von der kollaborierenden Arbeitsgruppe von S. Sigrist (Gِttingen) zur Verfügung gestellt. Der pan-neuronale „knock-down“ des nc82 Antigens durch transgene RNAi-Expression führt zu embryonaler Letalitنt. Eine schwنchere RNAi-Expression führt bei adulten Fliegen zu Verhaltensdefekten, wie instabilem Flug und beeintrنchtigtem Laufverhalten. Aufgrund dieser Phنnotypen, die in den ersten „knock-down“ Studien beobachtet wurden, wurde das Gen „bruchpilot“ (brp) und das zugehِrige Protein „Bruchpilot“ (BRP) genannt. Die pan-neuronale, sowie die retinaspezifische Reduktion des Proteins führt zu einem Verlust der ON und OFF Transienten des Elektroretinogramms, was auf nichtfunktionelle Synapsen hindeutet. Die retinaspezifische Reduktion des Proteins hat eine Beeintrنchtigung der optomotorischen Reaktion zur Folge. Auكerdem scheint auf der ultrastrukturellen Ebene die Bildung der charakteristischen T-fِrmigen „ribbons“ der aktiven Zonen beeintrنchtigt zu sein, jedoch ohne signifikante Verنnderungen der Gesamtarchitektur der Synapse (in Kollaboration mit E. Asan). Von Basson, einem Protein der aktiven Zone bei Vertebraten, ist bekannt, dass es an der Anheftung der synaptischen „ribbons“ an den aktiven Zonen beteiligt ist. Es fungiert als Adapter zwischen RIBEYE und ELKS/ERC/CAST, zwei weiteren Proteinen der aktiven Zone. Die Mutation von Bassoon hat zur Folge, dass die synaptischen „ribbons“ frei im Zytoplasma treiben. Für Bassoon ist kein homologes Drosophila-Protein bekannt. Die Reduktion von BRP bedingt ebenfalls ein Fehlen befestigter „ribbons“ an der aktiven Zone. Dies kِnnte auf eine Art Adapterfunktion von BRP hindeuten. Jedoch hat das Fehlen von BRP zusنtzlich zum strukturellen Phنnotyp auch deutliche Verhaltensabnormalitنten und starke physiologische Beeintrنchtigungen zur Folge. Eine noch stنrkere Reduktion bedingt auكerdem embryonale Lethalitنt, wohingegen Mausmutanten ohne Bassoon lebensfنhig sind. Daraus ergibt sich, dass BRP eine weitere, wichtige Rolle wنhrend der Entwicklung und für die Funktion von Synapsen bei Drosophila und mِglicherweise auch bei anderen Insekten einnimmt. Es muss aber noch geklنrt werden, auf welche Weise BRP die synaptische Signalübertragung reguliert und welche anderen Proteine in diesem BRP-abhنngigen Pfad involviert sind. Derartige Studien werden mit Sicherheit in der Zukunft eine bedeutende Rolle spielen. KW - Taufliege KW - Synapse KW - Proteine KW - Molekulargenetik KW - Bruchpilot KW - Drosophila-Synapse KW - Bruchpilot KW - Drosophila synapse Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-14989 ER -