TY  - THES
A1  - Zachary, Marie
T1  - Functional characterization of small non-coding RNAs of \(Neisseria\) \(gonorrhoeae\)
T1  - Funktionelle Charakterisierung kleiner nicht-kodierender RNAs in \(Neisseria\) \(gonorrhoeae\)
N2  - During infection, bacteria need to adapt to a changing environment and have to endure various stress conditions. Small non-coding RNAs are considered as important regulators of bacterial gene expression and so allow quick adaptations by altering expression of specific target genes. Regulation of gene expression in the human-restricted pathogen Neisseria gonorrhoeae, the causative agent of the sexually transmitted disease gonorrhoea, is only poorly understood. The present study aims a better understanding of gene regulation in N. gonorrhoeae by studying small non-coding RNAs.
The discovery of antisense RNAs for all opa genes led to the hypothesis of asRNA-mediated degradation of out-of-frame opa transcripts. Analysis of asRNA expression revealed a very low abundance of the transcripts and inclusion of another phase-variable gene in the study indicates that the asRNAs are not involved in degradation of out-of-frame transcripts.
This doctoral thesis focuses on the analysis of trans-acting sRNAs. The sibling sRNAs NgncR_162 and NgncR_163 were discovered as post-transcriptional regulators altering expression of genes involved in metabolic processes, amino acid uptake and transcriptional regulation. A more detailed analysis by in silico and transcriptomic approaches showed that the sRNAs regulate a broad variety of genes coding for proteins of central metabolism, amino acid biosynthesis and degradation and several transport processes. Expression levels of the sibling sRNAs depend on the growth phase of the bacteria and on the growth medium. This indicates that NgncR_162 and NgncR_163 are involved in the adaptation of the gonococcal metabolism to specific growth conditions.
This work further initiates characterisation of the sRNA NgncR_237. An in silico analysis showed details on sequence conservation and a possible secondary structure. A combination of in silico target prediction and differential RNA sequencing resulted in the identification of several target genes involved in type IV pilus biogenesis and DNA recombination. However, it was not successful to find induction conditions for sRNA expression. Interestingly, a possible sibling sRNA could be identified that shares the target interaction sequence with NgncR_237 and could therefore target the same mRNAs.
In conclusion, this thesis provides further insights in gene regulation by non-coding RNAs in N. gonorrhoeae by analysing two pairs of sibling sRNAs modulating bacterial metabolism or possibly type IV pilus biogenesis.
N2  - Bakterien müssen sich während des Infektionsprozesses an eine sich veränderte Umgebung anpassen und sind dabei zahlreichen Stressfaktoren ausgesetzt. Kleine, nicht-kodierende RNAs gelten als wichtige Regulatoren der bakteriellen Genexpression und ermöglichen daher eine schnelle Anpassung durch eine Veränderung der Expression spezifischer Ziel-Gene. Die Regulation der Genexpression des Humanpathogens Neisseria gonorrhoeae, Auslöser der Geschlechtskrankheit Gonorrhö, ist bis jetzt kaum verstanden. Die vorliegende Studie soll durch die Analyse kleiner, nicht-kodierender RNAs zum besseren Verständnis der Genregulation in Gonokokken beitragen.
Durch die Entdeckung von antisense-RNAs für alle opa Gene wurde die Hypothese entwickelt, dass diese für den Abbau von opa Transkripten außerhalb des Leserahmens verantwortlich sind. Eine Analyse der asRNA Expression zeigte jedoch, dass diese sehr wenig exprimiert werden und auch die Untersuchung eines anderen phasenvariablen Gens weist darauf hin, dass die asRNAs keine Bedeutung für den Abbau von Transkripten außerhalb des Leserahmens haben.
Der Schwerpunkt der Doktorarbeit liegt auf der Untersuchung trans-codierter sRNAs. Die Zwillings-sRNAs NgncR_162 und NgncR_163 agieren als post-transkriptionelle Regulatoren, die die Expression von Genen verändern, die bei Stoffwechselprozessen, Aminosäureaufnahme und transkriptioneller Regulation eine Rolle spielen. Eine detailliertere Analyse durch in silico- und Transkriptom-Studien zeigte, dass die sRNAs ein großes Spektrum an Genen regulieren, die für Proteine des Zentralstoffwechsels, der Aminosäurebiosynthese und des –abbaus, sowie zahlreicher Transportprozesse kodieren. Die Expressionslevel der Zwillings-sRNAs hängen von der Wachstumsphase der Bakterien und dem Wachstumsmedium ab. Das weist darauf hin, dass NgncR_162 und NgncR_163 eine Rolle bei der Adaptation des Stoffwechsels von Gonokokken zu bestimmten Wachstumsbedingungen spielen.
In dieser Arbeit wird zudem die Charakterisierung der sRNA NgncR_237 initiiert. Im Rahmen von in silico Analysen wurde die Sequenzkonservierung und mögliche Sekundärstruktur untersucht. Eine Kombination aus in silico Zielgen-Vorhersage und differentieller RNA Sequenzierung führte zur Identifizierung zahlreicher Zielgene, die in der Biogenese von Typ IV Pili und DNA Rekombination eine Rolle spielen. Allerdings konnten keine Induktionsbedingungen für die sRNA Expression gefunden werden. Interessanterweise konnte eine mögliche Zwillings-sRNA identifiziert werden, die dieselbe Targetinteraktionsdomäne wie NgncR_237 hat und somit dieselben Zielgene regulieren könnte.
Zusammenfassend ermöglicht diese Arbeit neue Einblicke in die Genregulation durch nicht-kodierende RNAs in Gonokokken, indem zwei Paare Zwillings-sRNAs analysiert wurden, die den bakteriellen Stoffwechsel anpassen oder möglicherweise eine Rolle in der Typ IV Pilus Biogenese spielen.
KW  - Neisseria gonorrhoeae
KW  - Non-coding RNA
KW  - Genregulation
KW  - regulation of gene expression
Y1  - 2021
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-245826
ER  - 
TY  - THES
A1  - Horn, Jessica
T1  - Molecular and functional characterization of the long non-coding RNA SSR42 in \(Staphylococcus\) \(aureus\)
T1  - Molekulare und funktionelle Charakterisierung der langen nicht-kodierenden RNA SSR42 in \(Staphylococcus\) \(aureus\)
N2  - Staphylococcus aureus asymptomatically colonizes the skin and anterior nares of 20-30% of the healthy human population. As an opportunistic human pathogen it elicits a variety of infections ranging from skin and soft tissue infections to highly severe manifestations such as pneumonia, endocarditis and osteomyelitis. Due to the emergence of multi resistant strains, treatment of staphylococcal infections becomes more and more challenging and the WHO therefore classified S. aureus as a “superbug”. The variety of diseases triggered by S. aureus is the result of a versatile expression of a large set of virulence factors. The most prominent virulence factor is the cytotoxic and haemolytic pore-forming α-toxin whose expression is mediated by a complex regulatory network involving two-component systems such as the agr quorum-sensing system, accessory transcriptional regulators and alternative sigma-factors. However, the intricate regulatory network is not yet understood in its entirety. Recently, a transposon mutation screen identified the AraC-family transcriptional regulator ‘Repressor of surface proteins’ (Rsp) to regulate haemolysis, cytotoxicity and the expression of various virulence associated factors. Deletion of rsp was accompanied by a complete loss of transcription of a 1232 nt long non-coding RNA, SSR42. 
This doctoral thesis focuses on the molecular and functional characterization of SSR42. By analysing the transcriptome and proteome of mutants in either SSR42 or both SSR42 and rsp, as well as by complementation of SSR42 in trans, the ncRNA was identified as the main effector of Rsp-mediated virulence. Mutants in SSR42 exhibited strong effects on transcriptional and translational level when compared to wild-type bacteria. These changes resulted in phenotypic alterations such as strongly reduced haemolytic activity and cytotoxicity towards epithelial cells as well as reduced virulence in a murine infection model. Deletion of SSR42 further promoted the formation of small colony variants (SCV) during long term infection of endothelial cells and demonstrated the importance of this molecule for intracellular bacteria. The impact of this ncRNA on staphylococcal haemolysis was revealed to be executed by modulation of sae mRNA stability and by applying mutational studies functional domains within SSR42 were identified. 
Moreover, various stressors modulated the transcription of SSR42 and antibiotic challenge resulted in SSR42-dependently increased haemolysis and cytotoxicity. Transcription of SSR42 itself was found under control of various important global regulators including AgrA, SaeS, CodY and σB, thereby illustrating a central position in S. aureus virulence gene regulation. 
The present study thus demonstrates SSR42 as a global virulence regulatory RNA which is important for haemolysis, disease progression and adaption of S. aureus to intracellular conditions via formation of SCVs.
N2  - Staphylococcus aureus kolonisiert asymptomatisch als Kommensal die Haut und Nasenschleimhäute von circa 20-30% der gesunden Weltbevölkerung. Als opportunistisches Humanpathogen löst S. aureus dagegen eine Reihe von Krankheiten aus, die von leichten Hautinfektionen und Abszessen bis hin zu schwerwiegenden und lebensbedrohlichen Krankheitsformen wie Pneumonie, Endokarditis und Osteomyelitis reichen können. Die Behandlung von Staphylokokken-Infektionen stellt aufgrund der Entstehung multi-resistenter Stämme vermehrt eine Herausforderung dar, weshalb S. aureus von der WHO als „superbug“ klassifiziert wurde. Die Vielzahl an möglichen Krankheitsformen sind das Ergebnis der anpassungsfähigen und koordinierten Expression einer Vielzahl von Virulenzfaktoren. Der dabei wohl bedeutendste und am besten charakterisierte Virulenzfaktor ist das porenbildende α-toxin, dessen zytotoxische und hämolytische Aktivität für eine Reihe diverser Krankheiten verantwortlich ist. Die Expression dieses Toxins wird durch ein komplexes, bis jetzt noch nicht komplett verstandenes, regulatorisches Netzwerk gesteuert, das sowohl Zwei-Komponentensysteme wie das agr Quorum-sensing System, diverse akzessorische transkriptionelle Regulatoren sowie alternative Sigmafaktoren beinhaltet. Kürzlich wurde in einem Transposon-Mutanten-Screen der AraC-Familie transkriptionelle Regulator „Repressor of surface proteins” (Rsp) identifiziert, der die Expression diverser Virulenz-assoziierter Faktoren beeinflusste. Eine Deletion von rsp ging, neben reduzierter Hämolyse und Zytotoxizität, auch mit dem kompletten Verlust der Transkription einer 1232 nt langen nicht-kodierenden RNA, SSR42, einher. 
Diese Doktorarbeit befasst sich mit der molekularen und funktionellen Charakterisierung dieser nicht-kodierenden RNA. Mittels Transkriptom- und Proteomanalysen wurden eine SSR42 Deletionsmutante sowie eine Doppelmutante in SSR42 und rsp charakterisiert und SSR42 als Hauptfaktor der Rsp-vermittelten Virulenzregulation identifiziert. Neben weitreichenden Veränderungen auf trans-kriptioneller und translationaler Ebene wiesen Mutanten in SSR42 eine stark reduzierte hämolytische und zytotoxische Aktivität sowie verringerte Virulenz in einem murinen Infektionsmodell auf. Eine Deletion von SSR42 begünstigte weiterhin die Bildung von sog. „small colony variants“ während Langzeit-Infektionen von Endothelzellen und demonstrierte die Bedeutung dieser nicht-codierenden RNA für intrazelluläre Staphylokokken. Die regulatorische Wirkung von SSR42 auf die hämolytische Aktivität von S. aureus wurde in dieser Arbeit aufgeklärt. Dabei konnte ein stabilisierender Einfluss der nicht-kodierenden RNA auf sae mRNA nachgewiesen werden. Weiterhin wurde SSR42 durch Mutagenese-Studien auf molekularer Ebene charakterisiert, wobei funktionelle und stabilisierende Domänen identifiziert wurden.
Ebenso wurden in dieser Arbeit diverse Stressoren und Antibiotika erfasst, die eine modulatorische Wirkung auf die Transkription von SSR42 ausüben. Neben einer Erhöhung der Transkription von SSR42 resultierte eine Behandlung von S. aureus mit sub-inhibitorischen Konzentrationen von Antibiotika in einer drastischen, SSR42-abhängigen, Steigerung der hämolytischen und zytotoxischen Aktivität. Mithilfe von Promotoraktivitätsstudien wurde der Einfluss diverser Regulatoren wie AgrA, SaeS, CodY und σB auf die transkriptionellen Regulation von SSR42 identifiziert und SSR42 somit eine zentrale Rolle in der Regulation von Virulenzgenen verliehen. 
SSR42 wurde demnach als ein neuartiger globaler Regulator identifiziert, der eine wichtige Rolle für Hämolyse, den Krankheitsverlauf sowie bei der Anpassung an intrazelluläre Bedingungen, über die Bildung von „small colony variants“, spielt.
KW  - Staphylococcus aureus
KW  - Non-coding RNA
KW  - SSR42
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-175778
ER  -