TY - THES A1 - Lambour, Benjamin T1 - Regulation of sphingolipid long-chain bases during cell death reactions and abiotic stress in \(Arabidopsis\) \(thaliana\) T1 - Regulation von Sphingobasen während der Zelltodreaktion und abiotischem Stress in \(Arabidopsis\) \(thaliana\) N2 - Sphingobasen (LCBs) sind die Bausteine der Biosynthese von Sphingolipiden. Sie werden als Strukturelemente der pflanzlichen Zellmembran definiert und spielen eine wichtige Rolle für das Schicksal der Zellen. Komplexe Ceramide machen einen wesentlichen Teil der gesamten Sphingolipide aus, die einen großen Teil der eukaryotischen Membranen bilden. Gleichzeitig sind LCBs bekannte Signalmoleküle für zelluläre Prozesse in Eukaryonten und sind an Signalübertragungswegen in Pflanzen beteiligt. Es hat sich gezeigt, dass hohe LCB-Konzentrationen mit der Induktion des programmierten Zelltods sowie mit dem durch Pathogene ausgelösten Zelltod in Verbindung stehen. Mehrere Studien haben die regulierende Funktion der Sphingobasen beim programmierten Zelltod (PCD) in Pflanzen bestätigt: (i) Spontaner PCD und veränderte Zelltodreaktionen, die durch mutierte verwandte Gene des Sphingobasen-Stoffwechsels verursacht werden. (ii) Zelltodbedingungen erhöhen den Gehalt an LCBs. (iii) PCD aufgrund eines gestörten Sphingolipid-Stoffwechsels, der durch von nekrotrophen Krankheitserregern produzierte Toxine wie Fumonisin B1 (FB1) hervorgerufen wird. Um den Zelltod zu verhindern und die Zelltodreaktion zu kontrollieren, kann daher die Regulierung des Gehalts an freien LCBs entscheidend sein. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie stellten das Verständnis der Sphingobasen und Sphingolipidspiegel während der PCD in Frage. Wir lieferten eine detaillierte Analyse der Sphingolipidspiegel, die Zusammenhänge zwischen bestimmten Sphingolipidarten und dem Zelltod aufzeigte. Darüber hinaus ermöglichte uns die Untersuchung der Sphingolipid-Biosynthese ein Verständnis des Fluxes nach Akkumulation hoher LCB-Konzentrationen. Weitere Analysen von Abbauprodukten oder Sphingolipid-Mutantenlinien wären jedoch erforderlich, um vollständig zu verstehen, wie die Pflanze mit hohen Mengen an Sphingobasen umgeht. N2 - Sphingolipid long-chain bases (LCBs) are the building blocks of the biosynthesis of sphingolipids. They are defined as structural elements of the plant cell membrane and play an important role determining the fate of the cells. Complex ceramides represent a substantial fraction of total sphingolipids which form a major part of eukaryotic membranes. At the same time, LCBs are well known signaling molecules of cellular processes in eukaryotes and are involved in signal transduction pathways in plants. High levels of LCBS have been shown to be associated with the induction of programmed cell death as well as pathogen-derived toxin-induced cell death. Indeed, several studies confirmed the regulatory function of sphingobases in plant programmed cell death (PCD): (i) Spontaneous PCD and altered cell death reaction caused by mutated related genes of sphingobase metabolism. (ii) Cell death conditions increases levels of LCBs. (iii) PCD due to interfered sphingolipid metabolism provoked by toxins produced from necrotrophic pathogens, such as Fumonisin B1 (FB1). Therefore, to prevent cell death and control cell death reaction, the regulation of levels of free LCBs can be crucial. The results of the present study challenged the comprehension of sphingobases and sphingolipid levels during PCD. We provided detailed analysis of sphingolipids levels that revealed correlations of certain sphingolipid species with cell death. Moreover, the investigation of sphingolipid biosynthesis allowed us to understand the flux after the accumulation of high LCB levels. However, further analysis of degradation products or sphingolipid mutant lines, would be required to fully understand how high levels of sphingobases are being treated by the plant. KW - PCD KW - Sphingolipids KW - LCB KW - Ackerschmalwand KW - programmed cell death KW - arabidopsis thaliana KW - abiotic stress Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-325916 ER - TY - THES A1 - Anwar, Ammarah T1 - Natural variation of gene regulatory networks in \(Arabidopsis\) \(thaliana\) T1 - Natürliche Variation genregulatorischer Netzwerke in \(Arabidopsis\) \(thaliana\) N2 - Understanding the causal relationship between genotype and phenotype is a major objective in biology. The main interest is in understanding trait architecture and identifying loci contributing to the respective traits. Genome-wide association mapping (GWAS) is one tool to elucidate these relationships and has been successfully used in many different species. However, most studies concentrate on marginal marker effects and ignore epistatic and gene-environment interactions. These interactions are problematic to account for, but are likely to make major contributions to many phenotypes that are not regulated by independent genetic effects, but by more sophisticated gene-regulatory networks. Further complication arises from the fact that these networks vary in different natural accessions. However, understanding the differences of gene regulatory networks and gene-gene interactions is crucial to conceive trait architecture and predict phenotypes. The basic subject of this study – using data from the Arabidopsis 1001 Genomes Project – is the analysis of pre-mature stop codons. These have been incurred in nearly one-third of the ~ 30k genes. A gene-gene interaction network of the co-occurrence of stop codons has been built and the over and under representation of different pairs has been statistically analyzed. To further classify the significant over and under- represented gene-gene interactions in terms of molecular function of the encoded proteins, gene ontology terms (GO-SLIM) have been applied. Furthermore, co- expression analysis specifies gene clusters that co-occur over different genetic and phenotypic backgrounds. To link these patterns to evolutionary constrains, spatial location of the respective alleles have been analyzed as well. The latter shows clear patterns for certain gene pairs that indicate differential selection. N2 - Das Verständnis des kausalen Zusammenhangs zwischen Genotyp und Phänotyp ist ein wichtiges Ziel in der Biologie. Das Hauptinteresse liegt darin, die Merkmalsarchitektur zu verstehen und Loci zu identifizieren, die zu den jeweiligen Merkmalen beitragen. Genome-wide association mapping (GWAS) ist ein Werkzeug, um diese Zusammenhänge aufzuklären und wurde erfolgreich in vielen verschiedenen Arten eingesetzt. Die meisten Studien konzentrieren sich jedoch auf marginale Markereffekte und ignorieren epistatische und Gen-Umwelt-Interaktionen. Diese Wechselwirkungen sind problematisch zu erklären, werden aber wahrscheinlich einen wichtigen Beitrag zu vielen Phänotypen leisten, die nicht durch unabhängige genetische Effekte, sondern durch ausgefeiltere genregulatorische Netzwerke reguliert werden. Eine weitere Komplikation ergibt sich aus der Tatsache, dass sich diese Netzwerke in verschiedenen natürlichen Akzessionen unterscheiden. Das Verständnis der Unterschiede zwischen genregulatorischen Netzwerken und Gen-Gen- Interaktionen ist jedoch entscheidend, um die Merkmalsarchitektur zu konzipieren und Phänotypen vorherzusagen. Das grundlegende Thema dieser Studie – unter Verwendung von Daten aus dem Arabidopsis 1001 Genomes Project – ist die Analyse von vorzeitigen Stop-Codons. Diese sind in fast einem Drittel der ~ 30k-Gene aufgetreten. Ein Gen-Gen- Interaktionsnetzwerk des gleichzeitigen Auftretens von Stop-Codons wurde aufgebaut und die Über- und Unterrepräsentation verschiedener Paare wurde statistisch analysiert. Um die signifikante über- und unterrepräsentierte Gen-Gen-Interaktion in Bezug auf den biologischen Prozess der kodierten Proteine weiter zu klassifizieren, wurden genonkologische Begriffe (GO-SLIM) verwendet. Darüber hinaus spezifiziert die Koexpressionsanalyse Gencluster, die über verschiedene genetische und phänotypische Hintergründe hinweg gleichzeitig auftreten. Um diese Muster mit evolutionären Einschränkungen in Verbindung zu bringen, wurde auch die räumliche Lage der jeweiligen Allele analysiert. Letzteres zeigt klare Muster für bestimmte Genepaare, die auf eine differentielle Selektion hinweisen. KW - Arabidopsis thaliana KW - Co-occurrence matrix KW - co-expression coefficient KW - gene expression networks KW - non-sense mutations KW - phenotype KW - local adaptation KW - variations in genome KW - Ackerschmalwand Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-291549 ER - TY - THES A1 - Dindas, Julian T1 - Cytosolic Ca\(^2\)\(^+\), a master regulator of vacuolar ion conductance and fast auxin signaling in \(Arabidopsis\) \(thaliana\) T1 - Zytosolisches Ca\(^2\)\(^+\), ein zentraler Regulator der vakuolären Ionenleitfähigkeit und der schnellen Auxin-Signaltransduktion in \(Arabidopsis\) \(thaliana\) N2 - Das Phytohormon Auxin erfüllt wichtige Funktionen bei der Initiierung von pflanzlichen Geweben und Organen, wie auch in der Steuerung des Wurzelwachstums im Zusammenspiel mit äußeren Reizen wie Schwerkraft, Wasser- und Nähstoffverfügbarkeit. Diese Funktionen basieren dabei vor allem auf der Auxin-abhängigen Regulation von Zellteilung und -streckung. Wichtig für letzteres ist dabei die Kontrolle des Zellturgors durch die Vakuole. Als Speicher für Nährstoffe, Metabolite und Toxine sind Vakuolen von essentieller Bedeutung. Vakuolär gespeicherte Metabolite und Ionen werden sowohl über aktive Transportprozesse, als auch passiv durch Ionenkanäle, über die vakuoläre Membran mit dem Zytoplasma ausgetauscht. In ihrer Funktion als second messenger sind Kalziumionen wichtige Regulatoren, aber auch Gegenstand vakuolärer Transportprozesse. Änderungen der zytosolischen Kalziumkonzentration wirken nicht nur lokal, sie werden auch mit einer Signalweiterleitung über längere Distanzen in Verbindung gebracht. Im Rahmen dieser Arbeit wurden elektrophysiologische Methoden mit bildgebenden Methoden kombiniert um Einblicke in das Zusammenspiel zwischen zytosolischen Kalziumsignalen, vakuolärer Transportprozesse und der Auxin-Physiologie im intakten pflanzlichen Organismus zu gewinnen. Kalziumsignale sind an der Regulierung vakuolärer Ionenkanäle und Transporter beteiligt. Um dies im intakten Organismus zu untersuchen wurden im Modellsystem junger Wurzelhaare von Arabidopsis thaliana Messungen mit intrazellulären Mikroelektroden durchgeführt. Mittels der Zwei-Elektroden-Spannungsklemm-Technik konnte bestätigt werden, dass die vakuoläre Membran der limitierende elektrische Wiederstand während intravakuolärer Messungen ist und so gemessene Ionenströme in der Tat nur die Ströme über die vakuoläre Membran repräsentieren. Die bereits bekannte zeitabhängige Abnahme der vakuolären Leitfähigkeit in Einstichexperimenten konnte weiterhin mit einer einstichbedingten, transienten Erhöhung der zytosolischen Kalziumkonzentration korreliert werden. Durch intravakuoläre Spannungsklemmexperimente in Wurzelhaarzellen von Kalziumreporterpflanzen konnte dieser Zusammenhang zwischen vakuolärer Leitfähigkeit und der zytosolischen Kalziumkonzentration bestätigt werden. Die Vakuole ist jedoch nicht nur ein Empfänger zytosolischer Kalziumsignale. Da die Vakuole den größten intrazellulären Kalziumspeicher darstellt, wird seit Langem diskutiert, ob sie auch an der Erzeugung solcher Signale beteiligt ist. Dies konnte in intakten Wurzelhaarzellen bestätigt werden. Änderungen des vakuolären Membranpotentials wirkten sich auf die zytosolische Kalziumkonzentration in diesen Zellen aus. Während depolarisierende Potentiale zu einer Erhöhung der zytosolischen Kalziumkonzentration führten, bewirkte eine Hyperpolarisierung der vakuolären Membran das Gegenteil. Thermodynamische Überlegungen zum passiven und aktiven Kalziumtransport über die vakuoläre Membran legten dabei den Schluss nahe, dass die hierin beschriebenen Ergebnisse das Verhalten von vakuolären H+/Ca2+ Austauschern wiederspiegeln, deren Aktivität durch die protonenmotorische Kraft bestimmt wird. Im Rahmen dieser Arbeit stellte sich weiterhin heraus, dass zytosolisches Kalzium ebenso ein zentraler Regulator eines schnellen Auxin-induzierten Signalweges ist, über den der polare Transport des Hormons reguliert wird. Im gleichen Modellsystem junger Wurzelhaare konnte gezeigt werden, dass die externe Applikation von Auxin eine sehr schnelle, Auxinkonzentrations- und pH-abhängige Depolarisation des Plasmamembranpotentials zur Folge hat. Synchron zur Depolarisation des Plasmamembranpotentials wurden im Zytosol transiente Kalziumsignale registriert. Diese wurden durch einen von Auxin aktivierten Einstrom von Kalziumionen durch den Ionenkanal CNGC14 hervorgerufen. Experimente an Verlustmutanten als auch pharmakologische Experimente zeigten, dass zur Auxin-induzierten Aktivierung des Kalziumkanals die Auxin-Perzeption durch die F-box Proteine der TIR1/AFB Familie erforderlich ist. Durch Untersuchungen der Auxin-abhängigen Depolarisation wie auch des Auxin-induzierten Einstroms von Protonen in epidermale Wurzelzellen von Verlustmutanten konnte gezeigt werden, dass die sekundär aktive Aufnahme von Auxin durch das hochaffine Transportprotein AUX1 für die schnelle Depolarisation verantwortlich ist. Nicht nur die zytosolischen Kalziumsignale korrelierten mit der CNGC14 Funktion, sondern ebenso die AUX1-vermittelte Depolarisation von Wurzelhaaren. Eine unveränderte Expression von AUX1 in der cngc14 Verlustmutante legte dabei den Schluss nahe, dass die Aktivität von AUX1 posttranslational reguliert werden muss. Diese Hypothese erfuhr Unterstützung durch Experimente, in denen die Behandlung mit dem Kalziumkanalblocker Lanthan zu einer Inaktivierung von AUX1 im Wildtyp führte. Die zytosolische Beladung einzelner epidermaler Wurzelzellen mit Auxin hatte die Ausbreitung lateraler und acropetaler Kalziumwellen zur Folge. Diese korrelierten mit einer Verschiebung des Auxin-Gradienten an der Wurzelspitze und unterstützten somit eine hypothetische Kalziumabhängige Regulation des polaren Auxin Transports. Ein Model für einen schnellen, Auxin induzierten und kalziumabhängigen Signalweg wird präsentiert und dessen Bedeutung für das gravitrope Wurzelwachstum diskutiert. Da die AUX1-vermittelte Depolarisation in Abhängigkeit von der externen Phosphatkonzentration variierte, wird die Bedeutung dieses schnellen Signalwegs ebenso für die Anpassung des Wurzelhaarwachstums an eine nicht ausreichende Verfügbarkeit von Phosphat diskutiert. N2 - The phytohormone auxin performs important functions in the initiation of plant tissues and organs, as well as in the control of root growth in conjunction with external stimuli such as gravity, water and nutrient availability. These functions are based primarily on the auxin-dependent regulation of cell division and elongation. Important for the latter is the control of the cell turgor by the vacuole. As storage for nutrients, metabolites and toxins, vacuoles are of vital importance. Vacuolar stored metabolites and ions are exchanged across the vacuolar membrane with the cytoplasm via active transport processes as well as passively through ion channels. In their function as second messenger, calcium ions are important regulators but also subject to vacuolar transport processes. Changes in the cytosolic calcium concentration not only act locally, but are also associated with signal transduction over longer distances. In this work, electrophysiological methods were combined with imaging techniques to gain insights into the interaction between cytosolic calcium signals, vacuolar transport processes and auxin physiology in the intact plant organism. Calcium signals are involved in the regulation of vacuolar ion channels and transporters. In order to investigate this in the intact organism, intracellular microelectrode measurements were performed in the model system of bulging Arabidopsis thaliana root hairs. By means of the two-electrode voltage-clamp technique, it could be confirmed that the vacuolar membrane is the limiting electrical resistance during intravacuolar measurements and thus measured ion currents actually represent only the currents across the vacuolar membrane. The already known time-dependent decrease of vacuolar conductivity during intravacuolar experiments could be further correlated with an impalement-related, transient increase of the cytosolic calcium concentration. Intravacuolar voltage-clamp experiments in root hair cells of calcium reporter plants confirmed this relationship between vacuolar conductivity and the cytosolic calcium concentration. However, the vacuole is not just a recipient of cytosolic calcium signals. Since the vacuole represents the largest intracellular calcium reservoir, it has long been argued that it is also involved in the generation of such signals. This could be confirmed in intact root hair cells. Changes in the vacuolar membrane potential affected the cytosolic calcium concentration in these cells. While depolarizing potentials led to an increase of the cytosolic calcium concentration, hyperpolarization of the vacuolar membrane caused the opposite. Thermodynamic considerations of passive and active calcium transport across the vacuolar membrane suggested that the results described herein reflect the behaviour of vacuolar H+/Ca2+ exchangers whose activity is determined by the proton motive force. In addition, cytosolic calcium has been shown to be a key regulator of a rapid auxin-induced signaling pathway that regulates polar transport of the hormone. In the same model system of bulging root hairs it could be shown that the external application of auxin results in a very fast, auxin concentration- and pH-dependent depolarization of the plasma membrane potential. Synchronous with the depolarization of the plasma membrane potential, transient calcium signals were recorded in the cytosol. These were caused by an auxin-activated influx of calcium ions through the ion channel CNGC14. Experiments on loss-of-function mutants as well as pharmacological experiments showed that the auxin-induced activation of the calcium channel requires auxin-perception by the F-box proteins of the TIR1/AFB family. Investigations of auxin-dependent depolarization as well as the auxin-induced influx of protons into epidermal root cells of loss-of-function mutants showed that the secondary active uptake of auxin by the high-affinity transport protein AUX1 is responsible for the rapid depolarization Not only the cytosolic calcium signals correlated with CNGC14 function, but also the AUX1-mediated depolarization of root hairs. An unchanged expression of AUX1 in the cngc14 loss-of-function mutant suggested that the activity of AUX1 must be post-translationally regulated. This hypothesis was supported by experiments in which treatment with the calcium channel blocker lanthanum led to inactivation of AUX1 in the wild type. The cytosolic loading of individual epidermal root cells with auxin resulted in the spread of lateral and acropetal calcium waves. These correlated with a shift of the auxin gradient at the root apex and thus supported a hypothetical calcium-dependent regulation of polar auxin transport. A model for a rapid, auxin-induced and calcium-dependent signaling pathway is presented and its importance for gravitropic root growth is discussed. Since AUX1-mediated depolarization varied with external phosphate concentration, the importance of this rapid signaling pathway is also discussed for the adaptation of root hair growth to an inadequate availability of phosphate. KW - Ackerschmalwand KW - Auxine KW - Vakuole KW - Calcium KW - Elektrophysiologie KW - Pflanzenhormone KW - Hormontransport KW - Ionenleitfähigkeit KW - Signaltransduktion KW - Arabidopsis thaliana Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-158638 ER - TY - THES A1 - Pedrotti, Lorenzo T1 - The SnRK1-C/S1-bZIPs network: a signaling hub in Arabidopsis energy metabolism regulation T1 - Das SnRK1-C/S1-bZIP-Netzwerk: ein Signalknoten in der Regulation des Arabidopsis Energie-Metabolismus N2 - The control of energy homeostasis is of pivotal importance for all living organisms. In the last years emerged the idea that many stress responses that are apparently unrelated, are actually united by a common increase of the cellular energy demand. Therefore, the so called energy signaling is activated by many kind of stresses and is responsible for the activation of the general stress response. In Arabidopsis thaliana the protein family SnF1- related protein kinases (SnRK1) is involved in the regulation of many physiological processes but is more known for its involvement in the regulation of the energy homeostasis in response to various stresses. To the SnRK1 protein family belong SnRK1.1 (also known as KIN10), SnRK1.2 (KIN11), and SnRK1.3 (KIN12). SnRK1 exerts its function regulating directly the activity of metabolic enzymes or those of key transcription factors (TFs). The only TFs regulated by SnRK1 identified so far is the basic leucine zipper (bZIP) 63. bZIP63 belongs to the C group of bZIPs (C-bZIPs) protein family together with bZIP9, bZIP10, and bZIP25. SnRK1.1 phosphorylates bZIP63 on three amino acids residues, serine (S) 29, S294, and S300. The phosphorylation of tbZIP63 is strongly related to the energy status of the plant, shifting from almost absent during the normal growth to strongly phosphorylated when the plant is exposed to extended dark. bZIPs normally bind the DNA as dimer in order to regulate the expression of their target genes. C-bZIPs preferentially form dimers with S1-bZIPs, constituting the so called C/S1- bZIPs network. The SnRk1 dependent phosphorylation of bZIP63 regulates its activation potential and its dimerization properties. In particular bZIP63 shift its dimerization preferences according to its phosphorylation status. The non-phosphorylated form of bZIP63 dimerize bZIP1, the phosphorylates ones, instead, forms dimer with bZIP1, bZIP11, and bZIP63 its self. Together with bZIP63, S1-bZIPs are important mediator of part of the huge transcriptional reprogramming induced by SnRK1 in response to extended dark. S1-bZIPs regulate, indeed, the expression of 4'000 of the 10'000 SnRK1-regulated genes in response to energy deprivation. In particular S1-bZIPs are very important for the regulation of many genes encoding for enzymes involved in the amino acid metabolism and for their use as alternative energy source. After the exposition for some hours to extended dark, indeed, the plant make use of every energy substrate and amino acids are considered an important energy source together with lipids and proteins. Interestingly, S1- bZIPs regulate the expression of ETFQO. ETFQO is a unique protein that convoglia the electrons provenienti from the branch chain amino acids catabolism into the mitochondrial electron transport chain. The dimer formed between bZIP63 and bZIP2 recruits SnRK1.1 directly on the chromatin of ETFQO promoter. The recruitment of SnRK1 on ETFQO promoter is associated with its acetylation on the lysine 14 of the histone protein 3 (K14H3). This chromatin modification is normally asociated with an euchromatic status of the DNA and therefore with its transcriptional activation. Beside the particular case of the regulation of ETFQO gene, S1-bZIPs are involved in the regulation of many other genes activated in response of different stresses. bZIP1 is for example an important mediator of the salt stress response. In particular bZIP1 regulates the primary C- and N-metabolism. The expression of bZIP1, in response of both salt ans energy stress seems to be regulated by SnRK1, as it is the expression of bZIP53 and bZIP63. Beside its involvement in the regulation of the energy stress response and salt response, SnRK1 is the primary activators of the lipids metabolism during see germination. SnRK1, indeed, controls the expression of CALEOSINs and OLEOSINs. Those proteins are very important for lipids remobilization from oil droplets. Without their expression seed germination and subsequent establishment do not take place because of the absence of fuel to sustain these highly energy costly processes, which entirely depend on the catabolism of seed storages. N2 - Die Kontrolle der Energiehomöostase ist für alle lebenden Organismen von großer Bedeutung. In den letzten Jahren kam die Idee auf, dass viele Stressantworten, die scheinbar unabhängig voneinander sind, durch den Energiebedarf doch miteinander verbunden sind. Das sogenannte Energie-Signaling wird von vielen verschiedenen Stress- Arten aktiviert und ist verantwortlich für die Aktivierung der allgemeinen Stressantwort. In Arabidopsis thaliana ist die Proteinfamilie der SnF1-verwandten Proteinkinasen (SnRK1) an der Regulation vieler physiologischer Prozesse beteiligt. Auch bei der Regulation der Energiehomöostase als Folge von Stress spielen SnRK1-Kinasen eine wichtige Rolle. Proteine aus der SnRK1-Familie sind SnRK1.1, auch als KIN10 bezeichnet, SnRK1.2 (KIN11) und SnRK1.3 (KIN12). SnRK1-Proteine können die Aktivität von metabolischen Enzyme oder bestimmten Transkriptionsfaktoren (TF) direkt regulieren. Bislang wurde nur für den basischen Leucin-Zipper (bZIP) TF bZIP63 die Regulation durch SnRK1 gezeigt. bZIP63 gehört zur Gruppe C der bZIP Proteinfamilie (C-bZIP). Ebenfalls zu Gruppe C werden bZIP9, bZIP10 und bZIP25 zugeordnet. SnRK1.1 phosphoryliert das bZIP63- Protein an Serin (S) 29, S294 und S300. Der Grad der Phosphorylierung von bZIP63 steht in direktem Zusammenhang mit dem Energiehaushalt der Pflanze. Unter normalen Bedingungen wird bZIP63 kaum phosphoryliert, während bei verlängerter Nacht bZIP63 stark phosphoryliert wird. bZIP TF bilden untereinander Dimere aus und binden so an die DNA um die Expression ihrer Zielgene zu regulieren. C-bZIP TF bilden bevorzugt Dimere mit bZIP TF der Gruppe S1, bekannt als das C/S1-bZIP-Netzwerk. Die SnRK1-abhängige Phosphorylierung von bZIP63 steuert das Aktivierungspotential und die Dimerisierungseigenschaften. Besonders bei bZIP63 ändern sich die Dimerisierungspartner in Abhängigkeit des Phosphorylierungsgrads. Nicht-phosphoryliert dimerisiert bZIP61 mit bZIP1, im phosphorylierten Zustand dagegen bildet bZIP63 Dimere neben bZIP1 auch mit bZIP11 und bZIP63. S1-bZIP TF sowie bZIP63 sind wichtige Regulatoren der transkriptionellen Reprogrammierung, die durch SnRK1 bei verlängerter Dunkelheit induziert wird. S1-bZIP TF regulieren die Expression von 4'000 der 10'000 durch SnRK1 regulierten Gene in der Energieverarmungsantwort. Besonders S1-bZIP TF sind sehr wichtig für die Regulation vieler Gene, die für Enzyme aus dem Aminosäuremetabolismus codieren und als alternative Energiequelle der Pflanze bekannt sind. Wird die Nacht für einige Stunden verlängert, greift die Pflanze auf jede mögliche Energiequelle zurück. Als Energiequelle werden besonders Aminosäuren, aber auch Lipiden und Proteinen herangezogen. Interessanterweise regulieren S1-bZIP TF die Expression von ETFQO. ETFQO ist ein besonderes Protein, das die Elektronen aus dem Metabolismus verzweigter Aminosäuren in die mitochondriale Elektronentransportkette steuert. Das Dimer aus bZIP63 und bZIP2 rekrutiert SnRK1.1 direkt an das Chromatin des ETFQO-Promotors. Dieser Rekrutierung folgt die Acetylierung des Histonproteins 3 (K14H3) am Lysin 14. Diese Modifikation des Chromatins führt normalerweise zu einem euchromatischen Status der DNA und der nachfolgenden transkriptionellen Aktivierung. Neben der Regulation des ETFQO-Gens sind S1-bZIP TF auch an der Regulation von vielen anderen Genen in Folge von verschiedenen Stressen beteiligt. bZIP1 ist beispielsweise ein wichtiger Regulator der Antwort auf Salz-Stress. Auch der primäre Kohlenstoff- und Stickstoffmetabolismus werden von bZIP1 reguliert. Es wird angenommen, dass die Expression von bZIP1 wie auch von bZIP53 und bZIP63 in der Antwort auf Salzstress und Energieverarmung durch SnRK1 gesteuert wird. Abgesehen von der Regulation der Antwort auf Energieverarmung und Salzstress spielen SnRK1-Proteine auch bei der Aktivierung des Lipidmetabolismus während der Keimung eine Rolle. SnRK1 kontrolliert die Expression von CALEOSINs und OLEOSINs. Diese beiden Proteine sind sehr wichtig für die Mobilisierung von Lipiden aus Öltröpfchen. In Abwesenheit von SnRK1 finden aufgrund von Energiemangel weder die Keimung noch die nachfolgende Entwicklung statt. KW - Ackerschmalwand KW - Homöostase KW - Proteinkinasen KW - Stress-Syndrom KW - SnRK1 KW - bZIPs KW - mitochondria KW - energy metabolism Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-116080 ER - TY - THES A1 - Müller, Stephanie T1 - Plant thermotolerance: The role of heat stress-induced triacylglycerols in \(Arabidopsis\) \(thaliana\) T1 - Thermotoleranz in Pflanzen: Die Rolle von Hitzestress induzierten Triacylglycerolen in \(Arabidopsis\) \(thaliana\) N2 - Plants are exposed to high temperature, especially during hot summer days. Temperatures are typically lowest in the morning and reach a maximum in the afternoon. Plants can tolerate and survive short-term heat stress even on hot summer days. A. thaliana seedlings have been reported to tolerate higher temperatures for different time periods, a phenomenon that has been termed basal thermotolerance. In addition, plants have the inherent capacity to acclimate to otherwise lethal temperatures. Arabidopsis thaliana seedlings acclimate at moderately elevated temperatures between 32–38° C. During heat acclimation, a genetically programmed heat shock response (HSR) is triggered that is characterized by a rapid activation of heat shock transcription factors (HSFs), which trigger a massive accumulation of heat shock proteins that are chiefly involved in protein folding and protection. Although the HSF-triggered heat-shock response is well characterized, little is known about the metabolic adjustments during heat stress. The aim of this work was to get more insight into heat-responsive metabolism and its importance for thermotolerance. In order to identify the response of metabolites to elevated temperatures, global metabolite profiles of heat-acclimated and control seedlings were compared. Untargeted metabolite analyses revealed that levels of polyunsaturated triacylglycerols (TG) rapidly increase during heat acclimation. TG accumulation was found to be temperature-dependent in a temperature range from 32–50° C (optimum at 42° C). Heat-induced TG accumulation was localized in extra-chloroplastic compartments by chloroplast isolation as well as by fluorescence microscopy of A. thaliana cell cultures. Analysis of mutants deficient in all four HSFA1 master regulator genes or the HSFA2 gene revealed that TG accumulation occurred independently to HSF. Moreover, the TG response was not limited to heat stress since drought and salt stress (but not short-term osmotic, cold and high light stress) also triggered an accumulation of TGs. In order to reveal the origin of TG synthesis, lipid analysis was carried out. Heat-induced accumulation of TGs does not derive from massive de novo fatty acid (FA) synthesis. On the other hand, lipidomic analyses of A. thaliana seedlings indicated that polyunsaturated FA from thylakoid galactolipids are incorporated into cytosolic TGs during heat stress. This was verified by lipidomic analyses of A. thaliana fad7/8 transgenic seedlings, which displayed altered FA compositions of plastidic lipids. In addition, wild type A. thaliana seedlings displayed a rapid conversion of plastidic monogalactosyldiacylglycerols (MGDGs) into oligogalactolipids, acylated MGDGs and diacylglycerols (DGs). For TG synthesis, DG requires a FA from the acyl CoA pool or phosphatidylcholine (PC). Seedlings deficient in phospholipid:diacylglycerol acyltransferase1 (PDAT1) were unable to accumulate TGs following heat stress; thus PC appears to be the major FA donor for TGs during heat treatment. These results suggest that TG and oligogalactolipid accumulation during heat stress is driven by post-translationally regulated plastid lipid metabolism. TG accumulation following heat stress was found to increase basal thermotolerance. Pdat1 mutant seedlings were more sensitive to severe heat stress without prior acclimatization, as revealed by a more dramatic decline of the maximum efficiency of PSII and lower survival rate compared to wild type seedlings. In contrast, tgd1 mutants over-accumulating TGs and oligogalactolipids displayed a higher basal thermotolerance compared to wild type seedlings. These results therefore suggest that accumulation of TGs increases thermotolerance in addition to the genetically encoded heat shock response. N2 - Pflanzen sind besonders während der Sommerzeit hohen Temperaturschwankungen ausgesetzt. Temperaturen sind am Morgen meist niedrig und erreichen ihr Maximum während des Nachmittags. Pflanzen können Hitzestress im Sommer jedoch für eine kurze Zeit tolerieren. Arabidopsis thaliana Keimlinge können höhere Temperaturen für verschiedene Zeitspannen tolerieren, was als Basale Thermotoleranz beschrieben wird. Zusätzlich können Pflanzen durch Akklimatisierung eine Toleranz zu andernfalls letalen Temperaturen erwerben. A. thaliana Keimlinge beginnen sich bereits bei moderat erhöhten Temperaturen zwischen 32–38° C zu akklimatisieren. Während der Hitzeakklimatisierung wird eine genetisch programmierte Hitzeschockantwort (HSR) ausgelöst, welche durch eine rasche Aktivierung von Hitzeschock-Transkriptionsfaktoren (HSF) eingeleitet wird. Dies führt wiederum zu einem enormen Anstieg von einer Reihe von Hitzeschockproteinen (HSP), welche an der Faltung und dem Schutz der Proteine beteiligt sind. Obwohl die HSF-induzierte Hitzeschockantwort bereits gut charakterisiert ist, ist über die metabolomische Anpassung während des Hitzestress nur wenig bekannt. Das Ziel dieser Arbeit war es mehr Kenntnisse von hitze-respondierenden Metaboliten zu erhalten sowie deren Bedeutung für die Thermotoleranz. Zur Identifizierung von thermosensitiven Metaboliten, wurden die Metabolitprofile von Hitze akklimatisierten und Kontrollkeimlingen miteinander verglichen. Mittels ungerichteter Metabolit Analyse wurde ein rascher Anstieg von vielfach ungesättigten Triacylglycerolen (TG) während der Hitzeakklimatisierung nachgewiesen. Der TG Anstieg ist temperaturabhängig in einem Bereich von 32–50° C (Optimum bei 42° C). Der hitzeinduzierte TG Anstieg konnte mittels Chloroplastenisolierung sowie der separaten Analyse von Wurzel und Spross in den extrachloroplastidären Kompartimenten lokalisiert werden. Dies konnte durch Fluoreszenz Mikroskopie in Zellkulturen von A. thaliana bestätigt werden. Die Analyse von Mutanten, die einen Defekt in allen vier HSFA1 Masterregulatoren oder in dem HSFA2 Gen besitzen, zeigte, dass der Anstieg der TGs keine Abhängigkeit von den HSFs aufweist. Zudem ist der TG Anstieg nicht nur auf die Hitzestressantwort begrenzt, sondern auch durch Trockenheit und Salzstress induzierbar, jedoch nicht durch kurzzeitigen osmotischen-, Kälte- und Hochlichtstress. Zur Aufklärung des Ursprungs der TG Synthese wurde eine Lipidanalyse durchgeführt. Die hitzeinduzierte TG Akkumulation durch eine massive De Novo Fettsäuresynthese konnte ausgeschlossen werden. Die Untersuchung des Lipidoms von A. thaliana Keimlingen nach Hitze bot jedoch Hinweise auf einen Einbau von vielfach ungesättigten Fettsäuren aus thylakoiden Galaktolipiden in zytosolische TGs. Dies konnte durch die Untersuchung des Lipidoms von fad7/8 transgenen A. thaliana Keimlingen mit veränderter Fettsäure Komposition der plastidären Lipide bestätigt werden. Der Wildtyp von A. thaliana wies zudem eine rasche Umwandlung von plastidärem Monogalactosyldiacylglycerolen (MGDGs) zu Oligogalaktolipiden, acylierten MGDGs und Diacylglycerolen (DGs) auf. Für die TG Biosynthese wird eine Fettsäure aus dem Acyl-CoA Pool oder von Phosphatidylcholin (PC) auf ein DG übertragen. Keimlinge, die einen Defekt in der Phosolipid:Diacylglycerol Acyltransferase (PDAT1) aufweisen, waren nicht in der Lage TGs nach Hitzestress zu akkumulieren, auf PC als der wesentliche Fettsäure-Donor für TGs nach Hitzestress hinweist. Die Ergebnisse deuten auf einen TG und Oligogalaktolipid Anstieg durch einen posttranskriptionell regulierten Lipidumbau während des Hitzestress hin. Es konnte gezeigt werden, dass der TG Anstieg nach Hitzestress zu einer erhöhten Thermotoleranz führt. Keimlinge der pdat1 Mutanten waren ohne Akklimatisierung empfindlicher gegenüber massiven Hitzestress, da sowohl ein dramatischer Abfall der maximalen Effizienz des Photosystems II und eine niedrigere Überlebensrate im Vergleich zu Keimlingen des Wildtyps nachgewiesen wurden. Im Gegensatz dazu zeigten tgd1 Mutanten, welche eine Überakkumulation von TGs und Oligogalaktolipiden aufweisen, eine höhere Thermotoleranz auf als Keimlinge des Wildtyps. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die TG Akkumulation die Thermotoleranz zusätzlich zu der genetisch kodierten Hitzeschockantwort erhöht. KW - Triglyceride KW - Ackerschmalwand KW - Hitzestress KW - thermotolerance KW - Thermotoleranz KW - lipid remodeling KW - Lipidumbau Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-152829 ER - TY - THES A1 - Horn, Hannes T1 - Analysis and interpretation of (meta-)genomic data from host-associated microorganisms T1 - Analyse und Interpretation von (meta-)genomischen Daten aus Wirt-assoziierten Mikroorganismen N2 - Host–microbe interactions are the key to understand why and how microbes inhabit specific environments. With the scientific fields of microbial genomics and metagenomics, evolving on an unprecedented scale, one is able to gain insights in these interactions on a molecular and ecological level. The goal of this PhD thesis was to make (meta–)genomic data accessible, integrate it in a comparative manner and to gain comprehensive taxonomic and functional insights into bacterial strains and communities derived from two different environments: the phyllosphere of Arabidopsis thaliana and the mesohyl interior of marine sponges. This thesis focused first on the de novo assembly of bacterial genomes. A 5–step protocol was developed, each step including a quality control. The examination of different assembly software in a comparative way identified SPAdes as most suitable. The protocol enables the user to chose the best tailored assembly. Contamination issues were solved by an initial filtering of the data and methods normally used for the binning of metagenomic datasets. This step is missed in many published assembly pipelines. The described protocol offers assemblies of high quality ready for downstream analysis. Subsequently, assemblies generated with the developed protocol were annotated and explored in terms of their function. In a first study, the genome of a phyllosphere bacterium, Williamsia sp. ARP1, was analyzed, offering many adaptions to the leaf habitat: it can deal with temperature shifts, react to oxygen species, produces mycosporins as protection against UV–light, and is able to uptake photosynthates. Further, its taxonomic position within the Actinomycetales was infered from 16S rRNA and comparative genomics showing the close relation between the genera Williamsia and Gordonia. In a second study, six sponge–derived actinomycete genomes were investigated for secondary metabolism. By use of state–of–the–art software, these strains exhibited numerous gene clusters, mostly linked to polykethide synthases, non–ribosomal peptide synthesis, terpenes, fatty acids and saccharides. Subsequent predictions on these clusters offered a great variety of possible produced compounds with antibiotic, antifungal or anti–cancer activity. These analysis highlight the potential for the synthesis of natural products and the use of genomic data as screening toolkit. In a last study, three sponge–derived and one seawater metagenomes were functionally compared. Different signatures regarding the microbial composition and GC–distribution were observed between the two environments. With a focus on bacerial defense systems, the data indicates a pronounced repertoire of sponge associated bacteria for bacterial defense systems, in particular, Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, restriction modification system, DNA phosphorothioation and phage growth limitation. In addition, characterizing genes for secondary metabolite cluster differed between sponge and seawater microbiomes. Moreover, a variety of Type I polyketide synthases were only found within the sponge microbiomes. With that, metagenomics are shown to be a useful tool for the screening of secondary metabolite genes. Furthermore, enriched defense systems are highlighted as feature of sponge-associated microbes and marks them as a selective trait. N2 - Mikroben–Wirt Interaktionen sind der Schlüssel, um zu verstehen “Wie?” und “Warum?” Mikroben in bestimmten Umgebungen vorkommen. Mithilfe von Genomik und Metagenomik lassen sich Einblicke auf dem molekularen sowie ökolgischen Level gewinnen. Ziel dieser Arbeit war es, diese Daten zugänglich zu machen und zu vergleichen, um Erkenntnisse auf taxonomischer und funktionaler Ebene in bakterielle Isolate und bakterielle Konsortien zu erhalten. Dabei wurden Daten aus zwei verschiedenen Umgebungen erhoben: der Phyllosphäre von Arabidopsis thaliana und aus der Mesohyl–Matrix mariner Schwämme. Das Ziel war zunächst, bakterieller Genome denovo zu assemblieren. Dazu wurde ein Protokoll, bestehend aus 5 Schritten, entwickelt. Durch Verwendung verschiedener Soft- ware zum Assemblieren konnte SPAdes als am besten geeignet für die gegebenen Daten herausgearbeitet werden. Durch anfängliches Filtern der Daten konnte erste Kontamina- tion entfernt werden. Durch das Anwenden weiterer Methoden, welche ursprünglich für metagenomische Datensätze entwickelt wurden, konnten weitere Kontaminationen erkannt und von den “echten” Daten getrennt werden. Ein Schritt, welcher in den meisten pub- lizierten Assembly–Pipelines fehlt. Das Protokoll ermöglicht das Erstellen hochqualitativer Assemblies, welche zur weiteren Analyse nicht weiter aufbereitet werden müssen. Nachfolgend wurden die generierten Assemblies annotiert. Das Genom von William- sia sp. ARP1 wurde untersucht und durch dessen Interpretation konnten viele Anpassungen an die Existenz in der Phyllosphäre gezeigt werden: Anpassung an Termperaturveränderun- gen, Produktion von Mycosporinen als Schutz vor UV–Strahlung und die Möglichkeit, von der Pflanze durch Photosynthese hergestellte Substanzen aufzunehmen. Seine taxonomische Position wurde aufgrund von 16S rRNA sowie vergleichende Genomik bestimmt. Dadurch konnte eine nahe Verwandtschaft zwischen den Gattungen Williamsia und Gordonia gezeigt werden. In einer weiteren Studie wurden sechs Actinomyceten–Genome, isoliert aus Schwämmen, hinsichtlich ihres Sekundärmetabolismus untersucht. Mihilfe moderner Software konnten in zahlreiche Gen–Cluster identifiziert werden. Zumeist zeigten diese eine Zugehörigkeit zu Polyketidsynthasen, Nichtribosomalen Peptidsynthasen, Terpenen, Fettsäuren oder Sac- chariden. Durch eine tiefere Analyse konnten die Cluster mit chemischen Verbindungen assoziiert werden, welche antibakterielle oder fungizide Eigenschaften besitzen. In der letzten Untersuchung wurden Metagenome von drei Schwämmen sowie Meerwasser auf funktioneller Ebene verglichen. Beobachtet wurden Unterschiede in deren mikrobiellen Konsortien und GC–Gehalt. Schwamm–assoziierte Bakterien zeigten ein ausgeprägtes Inventar an Verteidigungsmechanismen gegenüber deren Vertretern aus dem Meerwasser. Dies beinhaltete vor allem: Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, das Restriktions-Modifikationssystem, DNA Phosphorothioation, oder Gene, welche das Wachstum von Phagen hemmen können. Gene für Sekundärmetabolite waren zwischen Schwamm– und Meerwasser–Metagenomen unterschiedlich stark ausgeprägt. So konnten Typ I Polyketidsynthasen ausschließlich in den Schwamm–Metagenomen gefunden werden. Dies zeigt, dass metagenomische Daten ebenso wie genomische Daten zur Untersuchung des Sekundärmetabolismus genutzt werden können. Des Weiteren zeigt die Anhäufung an Verteidigungsmechanismen eine Anpassung von Schwamm–assoziierten Mikroben an ihre Umgebung und ist ein Hinweis auf deren mögliche selektive Eigenschaft. KW - Bakterien KW - Meeresschwämme KW - Metagenom KW - Phyllosphäre KW - Ackerschmalwand KW - Metagenomics KW - Genomics KW - Phyllosphere KW - Sponges KW - Bacteria KW - Deep sequencing KW - Arabidopsis thaliana KW - Bioinformatics Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-152035 ER - TY - THES A1 - Klinkenberg, Jörn T1 - Physiological Role of Fatty Acid Desaturation in Agrobacterium-induced Arabidopsis Crown Galls T1 - Physiologische Rolle der Fettsäure-Desaturierung in der durch Agrobacterium ausgelösten Wurzelhalsgalle von Arabidopsis N2 - Crown gall development is accompanied by hypoxia, drought and oxidative stress. These abiotic stress factors are known to have an impact on fatty acid (FA) desaturation. Thus, an alteration in the lipid profile of plant tumors was expected. A comprehensive lipid analysis of Arabidopsis thaliana crown galls induced by Agrobacterium tumefaciens showed an increase in the degree of FA desaturation. The poly unsaturated fatty acid (PUFA) linolenic acid (18:3) of endoplasmic reticulum (ER) derived phospholipids was especially affected. The increased levels of desaturated FAs were reflected by a strong induction of two genes encoding desaturases, FAD3 and SAD6. In contrast to FAD3, which encodes the ER membrane bound fatty acid desaturase enzyme that synthesizes 18:3 PUFAs in the ER, the function of SAD6 is unknown. The ability of SAD6 to complement the extreme dwarf growth phenotype of the ssi2-2 mutant allele suggests that SAD6 is a functional stearoyl-acyl-carrier-protein delta-9 desaturase (SAD) which catalyzes the first step in FA desaturation and forms stearic acid (18:1). Overexpression of the SAD6 gene in Arabidopsis (SAD6-OE) to a similar degree as in tumors resulted in a light-dependent chlorosis phenotype and caused a similar shift in the lipid profile towards unsaturated phospholipids. Posttranscriptional down-regulation of SAD6 overexpression by RNA reverted the chlorosis phenotype and the changes in the lipid profile, showing that SAD6 overexpression forms the unsaturated FA profile and the phenotype in SAD6-OE. The subcellular localization of the SAD6 protein in chloroplasts, which is obligatory for SAD function was demonstrated. SSI2, which encodes the major contributor to the 18:1 FA levels in Arabidopsis is down-regulated in crown galls pointing to a replacement of SSI2 function by SAD6 in the tumor. SAD6 transcripts were almost undetectable in Arabidopsis under normal growth condition, whereas under hypoxia the gene was strongly activated. In the tumor hypoxia most likely caused the very high transcription of SAD6. Hypoxia is known to limit FA desaturation and it is associated with an elevated reactive oxygen species (ROS) production which is detrimental for unsaturated FAs. Thus, up-regulation of SAD6 in the crown gall, most likely serves as an adaptive mechanism to activate desaturation under low oxygen concentrations and to maintain the levels of unsaturated FA under oxidative stress. The ER localized FAD3 most likely is responsible for the rise in 18:3 of the phospholipid class to cope with drought stress in crown galls. This hypothesis was supported by the loss of function mutant, fad3-2, which developed significantly smaller tumors as the wild type under low relative humidity.Taken together, this study suggests that the induction of SAD6 and FAD3 shapes the tumor lipid profile by increasing the levels of unsaturated FAs. Unsaturated fatty acids prepare the crown gall to cope with ongoing hypoxia, drought and oxidative stress during growth and development. N2 - Die Physiologie der durch Agrobacterium tumefaciens hervorgerufenen Wurzelhalsgallen ist geprägt von Sauerstoffmangel, Trocken- und oxidativen Stress. Diese Stressfaktoren beeinflussen die Umwandlung gesättigter zu ungesättigten Fettsäuren (Desaturierung). Somit sind Änderungen im Lipidmuster des durch Agrobacterium tumefaciens ausgelösten Pflanzentumors wahrscheinlich. Eine umfassende Analyse des Wurzelhalsgallenlipidmusters ergab, dass der Anteil an ungesättigten Fettsäuren erhöht war. Am auffälligsten war vor allem die Erhöhung der mehrfach ungesättigten Fettsäure Linolensäure (18:3) in den mit dem endoplasmatischen Retikulum (ER) assoziierten Phospholipiden. Dieser Anstieg ging einher mit der stark erhöhten transkriptionellen Aktivität des FAD3-Gens, das eine membrangebundene Fettsäure-Desaturase kodiert, die Linolensäure (18:3) im ER synthetisiert. Darüber hinaus war ein weiteres funktionell unbekanntes Desaturase-Gen, SAD6, stark aktiviert. Das SAD6 Protein war in Chloroplasten lokalisiert und in der Lage den extremen Zwergwuchs-Phänotyp der ssi2-2 Mutante zum Wildtyp zu komplementieren. Damit wurde nahegelegt, dass SAD6, wie SSI2, eine funktionelle „delta-9 Stearoyl-Acyl-Carrier-Protein-Desaturase“ (SAD) ist. Die Überexpression des SAD6-Gens in Arabidopsis (SAD6-OE), vergleichbar der in Wurzelhalsgallen, führte zu einem Anstieg ungesättigter Phospholipide und einem lichtabhängigen chlorotischen Phänotyp. Eine posttranskriptionelle Reduzierung der SAD6 Überexpression durch RNAi revertierte den Chlorosephänotyp und die Veränderungen im Lipidprofil zum Phänotyp des Wildtyps. Da SSI2, welches das SAD-Enzym für die Ölsäure (18:1)-Produktion in Arabidopsis kodiert, in Wurzelhalsgallen stark herunterreguliert ist, übernimmt hier sehr wahrscheinlich SAD6 die Funktion von SSI2. Insbesondere deshalb, weil der im Tumor vorherrschende Sauerstoffmangel zu einer starken Aktivierung des SAD6-Gens führt. Die Produktion ungesättigter Fettsäuren wird unter hypoxischen Bedingungen limitiert, weshalb eine erhöhte Expression von SAD6 die reduzierte Synthese ungesättigter Fettsäuren kompensieren könnte. Hypoxie und vor allem die posthypoxische Phase führen zur Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), die ungesättigte Fettsäuren peroxidieren, so dass das Hypoxie-sensitive SAD6-Gen darüber hinaus das Niveau ungesättigter Fettsäuren unter oxidativem Stress zu erhalten scheint. Die ER lokalisierte Desaturase FAD3 ist ursächlich für die spezifische Erhöhung von Linolensäure (18:3) in den ER assoziierten Phospholipiden und führt somit zu einer Anpassung an den Trockenstress im Tumor. Dies wird dadurch unterstützt, dass an fad3-2 Mutanten unter erhöhtem Trockenstress deutlich kleinere Tumore wachsen. Diese Studie hat gezeigt, dass die Induktion von SAD6 und FAD3 in der Wurzelhalsgalle mit einer erhöhten Produktion ungesättigter Fettsäuren einhergeht und somit die Entwicklung und das Wachstum von Wurzelhalsgallen unter Sauerstoffmangel, oxidativem Stress und Wasserverlust ermöglicht wird. KW - Agrobacterium tumefaciens KW - Wurzelhalsgalle KW - Lipidstoffwechsel KW - Ungesättigte Fettsäuren KW - Ackerschmalwand KW - Hypoxie KW - Agrobacterium tumefaciens KW - Crown Gall KW - Lipid Metabolism KW - unsaturated Fatty Acids KW - Arabidopsis thaliana KW - Hypoxia Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-75262 ER - TY - THES A1 - Nazeer, Ahmed T1 - Physiological and molecular basis of Azospirillum-Arabidopsis Interaction T1 - Physiological and molecular basis of Azospirillum-Arabidopsis Interaction N2 - The present study was aimed at revealing the early signalling events during the interaction of the diazotrophic soil bacterium Azospirillum brasilense with its host plant Arabidopsis thaliana. Furthermore, taking advantage of the micro array technique, a comprehensive overview of Arabidopsis genes has been undertaken which are affected upon association with A. brasilense The characterization of the early responses of Arabidopsis plants upon inoculation with Azospirillum brasilense strain Sp7 clearly indicated parallels with the initial events in plant pathogen interaction. For instance, not only bacterial preprations (lysates) form Azospirillum elicited an apoplastic alkalinization of the culture medium, but also the live bacteria, which were even more effective. Besides, in a luminol based assay, the bacterial lysates triggered production of the reactive oxygen species (ROS) in the Arabidopsis leaf discs. Interestingly, the elongation factor receptor mutants (efr) were completely insensitive to Azospirillum, suggesting elongation factor Tu (EF-TU) recognition as elicitor by Arabidopsis. This hypothesis was further validated with a bioinformatic approach. The N terminus initial 26 amino acids from Azospirillum EF-TU gene (elf26) showed more similarity to the elf26 sequences of bacteria like Agrobacterium tumefaciens which elicit responses in the plants through EF-TU rather than Pseudomonas syringae where the potent elicitor is flagellin 22. Universal transcriptome profiling of Arabidopsis thaliana seedlings upon inoculation with Azospirillum brasilense over a time course of six, twenty four and ninty six hours revealed very little genetic responses in the early time points. However, a bulk of genes was differentially regulated in 96 hours post inoculation (96hpi). The nature of these genes indicated that the bacterial treatment, among others, greatly affect the processes like cell wall modification, hormone metabolism, stress and secondary metabolism. Additionally expression levels of a numer of transcription factors (TFs) related to basic helix loop helix (BHLH) and MYB domain containing TF families were altered with Azospirillum inoculation. Particularly the BHLH TFs were among the most highly regulated genes. The array results from Azospirillum treated plants were further compared with the already available data emnating from treatment with flagellin 22 (flg22), oligogalacturonides (OGs) and Agrobacterium tumefaciens. Noteworthy, very different set of genes were affected upon inoculation with Azospirillum in relation to other treatments. Secondly a cluster of proteins involved in the biosynthesis of aliphatic glucosinolates (GSL) were uniquely induced upon Sp7 exposure. Genes operating in flavonoid biosynthesis also showed a distinct regulation trend in the comparative analysis. Taken together, the study in question provides insights into the early signalling events in the context of Azospirillum-Arabidopsis association and the bacterial signals recognized by the plants. The array data, at the same time, elucidates the genetic factors of Arabidopsis triggered upon association with Azospirillum brasilense. N2 - Die vorliegende Arbeit befasst sich mit den physiologischen und genetischen Reaktionen im Zuge der Interaktion von Arabidopsis thaliana mit dem freilebenden, Stickstoff-fixierenden Bodenbakterium Azospirillum brasilense. Qualitativ konnten gemeinsame Mechanismen der frühen physiologischen Antworten von Arabidopsis auf Lysate von mutualistischen (Azospirillum brasilense) oder pathogenen (Pseudomonas syringae und Agrobacterium tumefaciens) Mikroorganismen festgestellt werden. So reagierten Arabidopsis (Col-0 ) Pflanzen auf Lysate dieser Bakterien mit einem Anstieg der cytosolischen Calcium-Konzentration sowie des extrazellulären pH Werts, mit der Bildung reaktiver Sauerstoffspezies und einer Depolarisierung des Membranpotentials. Diese Antworten untschieden sich jedoch zum Teil erheblich in ihrer Amplitude. Weitere Untersuchungen konnten zeigen, dass Flagellenproteine von Azospirillum nicht durch Arabidopsis erkannt werden. Somit unterscheidet sich der Erkennungsmechanismus der Azospirillen von dem der Pseudomonaden, welche aufgrund ihrer Flagellenproteine durch den FLAGELLINSENSING-2 (FLS2) Rezeptor in Arabidopsis perzipiert werden. Die Arabidopsis Mutante ELONGATIONFACTOR RECEPTOR (efr) war insensitiv gegenüber Azospirillumlysaten. Dies legte nahe, dass die Erkennung von Azosprillum über eine Erkennung des bakteriellen Elongationsfaktors (EF-Tu) durch den EFR Rezeptor verläuft. Die anschließende Klonierung des Azospirillum EF-Tu Gens zeigte positionspezifische Unterschiede in der abgeleiteten Aminosäuresequenz gegenüber Referenzsequenzen aus Escherichia coli oder Agrobacterium tumefaciens und erklärt somit die „imperfekte“ Erkennung durch den EFR Rezeptor. Der zeitliche Verlauf der genetischen Antwort von Arabidopsis im Zuge der Interaktion mit Azospirillum wurde mit Hilfe „Micro-Array“ basierter Transkriptionansanalysen 6, 24 und 96 Stunden nach Inokulation (hpi) der Pflanzen untersucht. Dabei wurden nach 6 und 24 hpi lediglich 30 bzw. 60 differenziell regulierte Transkripte gefunden. Diese Beobachtung steht im Gegensatz zu Studien pathogener Elizitoren wie Flagellinen, in welchen bereits nach wenigen Stunden mehr als eintausend differenziell regulierte Transkripte in Arabidopsis gefunden wurden. Dieser Effekt konnte in den Interaktionsstudien mit Azospirillum erst nach 96 hpi beobachtet werden. Die Analyse der genetischen Antwort ergab, dass 96 hpi insbesondere Gene in ihrer Expression verändert waren, deren Produkte im Zusammenhang mit Zellwandmodifikationen, dem Hormonmetabolismus, der Stressanpassung sowie der sekundären Metabolismus stehen. Darüber hinaus konnten Gene aus der Familie der sog. „basic-helix-loop-helix“ und „MYB“ Transkriptionsfaktoren identifiziert werden, die einer spezifischen Regulation durch Azospirillum unterlagen. Die vergleichende Analyse der Araydaten mit Datensätzen, die im Zuge von Pathogen-Arabidopsis Interaktionen gewonnen wurden zeigte, dass insbesondere die Biosynthese von aliphatischen Glykosiden und Flavonolen eine typische Antwort der Pflanze auf die mutualistischen Azospirillum Bakterien darstellt. Die vorgestellte Arbeit liefert somit erste Erkenntnisse zur physiologischen und genetischen Antwort von Arabidopsis auf Azospirillum und ermöglicht die vergleichende Betrachtung dieser Antworten im Kontext der Interaktion von Pflanzen mit pathogenen Mikroorganismen. Die im Rahmen dieser Arbeit identifizierten, differenziell regulierten Gene bieten neue Ansatzpunkte zum vertieften Studium der Wechselwirkung von mutualistischen, wachstumsfördernden Bakterien mit höheren Pflanzen. KW - Azospirillum brasilense KW - Ackerschmalwand KW - Wechselwirkung KW - Molekularbiologie KW - Azospirillum brasilense KW - PAMPS KW - ROS KW - EF-TU KW - aliphatic glucosinolates KW - Azospirillum brasilense KW - PAMPS KW - ROS KW - EF-TU KW - aliphatic glucosinolates Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-51673 ER - TY - THES A1 - Demir, Fatih T1 - Lipid rafts in Arabidopsis thaliana leaves T1 - Lipid Rafts in Arabidopsis thaliana Blättern N2 - Arabidopsis thaliana (A.th.) mesophyll cells play a pivotal role in the regulation of the drought stress response. The signaling & transport components involved in drought stress regulation within lipid rafts of the plasma membrane were investigated by DRM isolation from highly purified plasma membranes. Detergent treatment with Brij-98 and Triton X-100 resulted in a total of 246 DRM proteins which were identified by nano HPLC-MS/MS. The majority of these proteins could be isolated by Triton X-100 treatment (78.5 %) which remains the ”golden” standard for the isolation of DRMs. Comparing in-gel and in-solution digestion approaches disclosed additional protein identifications for each method but the in-gel approach clearly delivered the majority of the identified proteins (81.8 %). Functionally, a clear bias on signaling proteins was visible – almost 1/3 of the detected DRM proteins belonged to the group of kinases, phosphatases and other signaling proteins. Especially leucine-rich repeat receptor-like protein kinases and calcium-dependent protein kinases were present in Brij-98 & Triton X-100 DRMs, for instance the calcium-dependent protein kinase CPK21. Another prominent member of DRMs was the protein phosphatase 2C 56, ABI1, which is a key regulator of the ABA-mediated drought stress response in A.th. The lipid raft localization of the identified DRM proteins was confirmed by sterol-depletion with the chemical drug MCD. Proteins which depend upon a sterol-rich environment are depleted from DRMs by MCD application. Especially signaling proteins exhibited a strong sterol-dependency. They represented the vast majority (41.5 %) among the Triton X-100 DRM proteins which were no longer detected following MCD treatment. AtRem 1.2 & 1.3 could be shown to be sterol-dependent in mesophyll cells as well as two CPKs (CPK10 & CPK21) and the protein phosphatase ABI1. AtRem 1.2 & 1.3 could be proven to represent ideal plant lipid raft marker proteins due to their strong presence in Triton X-100 DRMs and dependency upon a sterol-rich environment. When fluorescence labeled AtRem 1.2 & 1.3 were transiently expressed in A.th. leaves, they localized to small, patchy structures at the plasma membrane. CPK21 was an intrinsic member of Triton X-100 DRMs and displayed extreme susceptibility to sterol-depletion by MCD in immunological and proteomic assays. Calcium-dependent protein kinases (CPKs) have already been studied to be involved in drought stress regulation, for instance at the regulation of S-type anion channels in guard cells. Hence, further transient expression studies with the anion channel SLAH3, protein kinase CPK21 and its counterpart, protein phosphatase ABI1 were performed in Nicotiana benthamiana. Transient co-expression of CPK21 and the anion channel SLAH3, a highly mesophyll- specific homologue of the guard cell anion channel SLAC1, resulted in a combined, sterol-dependent localization of both proteins in DRMs. Supplementary co-expression of the counterpart protein phosphatase ABI1 induced dislocation of SLAH3 from DRMs, probably by inactivation of the protein kinase CPK21. CPK21 is known to regulate the anion channel SLAH3 by phosphorylation. ABI1 dephosphorylates CPK21 thus leading to deactivation and dislocation of SLAH3 from DRMs. All this regulative events are taking place in DRMs of A.th. mesophyll cells. This study presents the first evidence for a lipid raft-resident protein complex combining signaling and transport functions in A.th. Future perspectives for lipid raft research might target investigations on the lipid raft localization of candidate DRM proteins under presence of abiotic and biotic stress factors. For instance, which alterations in the DRM protein composition are detectable upon exogenous application of the plant hormone ABA? Quantitative proteomics approaches will surely increase our knowledge of the post-transcriptional regulation of gene activity under drought stress conditions. N2 - Mesophyllzellen spielen eine sehr wichtige Rolle bei der Regulierung der Trockenstress-Antwort in der Pflanze Arabidopsis thaliana (A.th.). Um die an der Trockenstress-Antwort beteiligten Signaltransduktions- und Transportproteine zu identifizieren, die sich in Lipid Rafts der pflanzlichen Plasmamembran befinden, wurden Detergent-Resistant Membranes (DRMs) aus hochreinen Arabidopsis Plasmamembran-Präparationen isoliert. Behandlung dieser hochreinen Plasmamembran mit den Detergentien Brij-98 und Triton X-100 führte zur Identifikation von 246 DRM Proteinen, die mittels der nano HPLC-MS/MS Technologie detektiert wurden. Hierbei war festzustellen, dass das Detergens Triton X-100 eindeutig den Standard für die Isolierung von DRMs darstellt. Die große Mehrheit (78,5 %) der identifizierten DRM Proteine konnte nämlich mit Triton X-100 aufgereinigt werden. Vergleichende Anwendung verschiedener Verdaumethoden (In-Gel & In-Lösung Verdau) zeigte auf, dass jede Methode einen unterschiedlichen Pool an Proteinen identifiziert. Das Gros der analysierten Proteine (81,8 %) konnte jedoch auch alleine durch In-Gel Verdau ermittelt werden. Unter den identifizierten DRM Proteinen stellten Proteine, die an der Signaltransduktion beteiligt sind, fast 1/3 dar. Diese Proteingruppe wurde hauptsächlich durch Kinasen und Phosphatasen vertreten. Insbesondere Leucin-reiche rezeptor-artige and Calcium-abhängige Proteinkinasen waren in Brij-98 & Triton X-100 DRMs zu beobachten, z.B. die Calcium-abhängige Proteinkinase CPK21. Ebenso in Triton X-100 DRMs wurde die Proteinphosphatase 2C 56 (ABI1) lokalisiert, die eine zentrale Rolle bei der ABA-vermittelten Antwort auf Trockenstress in A.th. inne hat. Zur Bestätigung der Lipid Raft Lokalisation der identifizierten DRM Proteine wurden Sterole aus der Plasmamembran mittels der Chemikalie Methyl-ß-D-cyclodextrin entfernt. Besonders Proteine, die an der Signalweiterleitung beteiligt sind, zeigten eine starke Abhängigkeit von der Präsenz der Sterole. Sie waren besonders betroffen: 41,5 % der Proteine, die nach MCD Behandlung nicht mehr in DRMs identifiziert wurden, gehörten zur Gruppe der Signaltransduktionsproteine. Beispiele waren sowohl die Calcium-abhängigen Proteinkinasen CPK10 & CPK21, als auch die Proteinphosphatase ABI1. Die A.th. Remorine AtRem 1.2 & 1.3 stellen ideale Kandidaten für pflanzliche Lipid Raft Markerproteine dar, da beide sowohl ziemlich stark in Triton X-100 DRMs vertreten, als auch im besonderen Maße auf die Präsenz von Sterolen in DRMs angewiesen sind. Fluoreszenzmarkierte AtRem 1.2 & 1.3 Fusionskonstrukte lokalisierten bei transienter Expression in A.th. Blättern in kleinen, punktförmigen Strukturen an der Plasmamembran. Diese Strukturen zeigten frappierende Ähnlichkeit zu bereits bekannten Mustern von Lipid Raft Proteinen in Hefen und Säugetieren. CPK21 stellte ein besonderes Mitglied der Triton X-100 DRMs dar, welches ebenfalls stark auf die Präsenz von Sterolen in DRMs angewiesen war. Dies konnte durch immunologische and massenspektrometrische Experimente nachgewiesen werden. Calcium-abhängige Proteinkinasen (CPKs) sind an der Regulierung der Trockenstress-Antwort in Pflanzen beteiligt, z.B. bei der Aktivierung von S-typ Anionenkanälen in Schließzellen von A.th. Aufgrund dieser Beteiligung an der Trockenstress-Antwort, wurden transiente Co-Expressionsstudien des Anionenkanals SLAH3, der Proteinkinase CPK21 und ihrem Gegenspieler, der Proteinphosphatase ABI1 in Nicotiana benthamiana Blättern durchgeführt. Transiente Co-Expression von CPK21 und SLAH3, einem zum schließzell-spezifischen Anionenkanal SLAC1 homologen Protein in Mesophyllzellen, resultierte in einer sterol-abhängigen Co-Lokalisation beider Proteine in DRMs. Zusätzliche Gabe vom Gegenspieler ABI1 führte zum Verschwinden von SLAH3 aus DRMs, was möglicherweise auf die Inaktivierung der Proteinkinase CPK21 durch ABI1 zurückzuführen ist. Für CPK21 konnte schon aufgezeigt werden, dass es den Anionenkanal SLAH3 durch Phosphorylierung aktiviert. ABI1 hingegen dephosphoryliert die Proteinkinase CPK21 und führt zur Deaktivierung vom Anionenkanal SLAH3, welcher dann auch nicht mehr in DRMs lokalisierbar ist. Diese streng regulierten Prozesse im Rahmen der Trockenstress-Antwort spielen sich in DRMs von A.th. Mesophyllzellen ab. Die vorliegende Arbeit ist der erste Bericht eines Lipid Raft-lokalisierten Proteinkomplexes, der Signalweiterleitung und Transportprozesse in Arabidopsis Lipid Rafts vereint. Zukünftige Lipid Raft Studien könnten sich mit der Lokalisation von putativen DRM Proteinen nach Anwendung von abiotischen und biotischen Stressfaktoren befassen. So könnte man sich die Frage stellen, inwiefern sich die Proteinzusammensetzung in DRMs von der Zugabe des pflanzlichen Hormons Abscisinsäure (ABA) beeinflussen läßt. Insbesondere quantitative Proteomstudien werden in Zukunft mit Sicherheit unser Wissen über die posttranskriptionelle Regulation der Genaktivität bei Trockenstress erweitern. KW - Ackerschmalwand KW - Abscisinsäure KW - Plasmamembran KW - Stressreaktion KW - Mesophyll KW - ABA KW - DRMs KW - Membrandomänen KW - Trockenstress KW - Anionenkanal KW - Biomembran KW - Blatt KW - Membran KW - ABA KW - DRMs KW - Membrane domains KW - Drought stress KW - Anion channel Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-53223 ER - TY - THES A1 - Griebel, Thomas T1 - Local and systemic resistance in Arabidopsis thaliana in response to Pseudomonas syringae: impact of light and phytosterols T1 - Lokale und systemische Resistenzausbildung in Arabidopsis thaliana gegen Pseudomonas syringae: Der Einfluss von Licht und pflanzlichen Sterolen N2 - Inoculation with plant pathogens induces a diverse range of plant responses which potentially contribute to disease resistance or susceptibility. Plant responses occuring in consequence of pathogen infection include activation of classical defence pathways and changes in metabolic activity. The main defence route against hemibiotrophic bacterial pathogens such as Pseudomonas syringae is based on the phytohormone salicylic acid (SA). SA-mediated responses are strictly regulated and have also been shown to depend on external factors, e.g. the presence of light. A major goal of this work was to provide a better understanding of the light dependency of plant defence responses mediated through SA. The second part of the project focussed on the influence of plant sterols on plant resistance. I analyzed leaf lipid composition and found that accumulation of the phytosterol stigmasterol in leaves and in isolated (plasma) membranes is a significant plant metabolic process occurring upon pathogen infection. N2 - Eine Infektion mit Pathogenen veranlasst Pflanzen zur Aktivierung zahlreicher Abwehrreaktionen, welche entscheidend dazu beitragen können, ob die Pflanze anfällig ist und erkrankt oder eine erfolgreiche Resistenz ausbilden kann. Die Abwehr gegen hemibiotrophe bakterielle Pathogene basiert vor allem auf der verstärkten Bildung des Pflanzenhormons Salicylsäure (SA) und der Aktivierung SA-vermittelter Abwehrreaktionen. Beides ist nicht nur intern genau reguliert, sondern auch von externen Faktoren beeinflusst. So trägt zum Beispiel die Verfügbarkeit von Licht wesentlich zum Ausmaß und zum Erfolg dieser Abwehrreaktionen bei. Ein Ziel dieser Arbeit ist es, zu einem besseren Verständnis des Einflusses von Licht auf die Pathogenabwehr beizutragen. Das zweite Projekt dieser Arbeit stellt die Lipidzusammensetzung pathogen-infizierter Blätter in den Mittelpunkt. Bei der Analyse pflanzlicher Sterole zeigte sich unter anderem, dass das C22-ungesättigte Sterol Stigmasterol in Blättern und in daraus isolierten Plasmamembranen nach Pathogenbehandlungen akkumuliert. KW - Ackerschmalwand KW - Pseudomonas syringae KW - Resistenz KW - Licht KW - Phytosterine KW - Phytopathologie KW - Schmalwand KW - Pseudomonas syringae KW - pflanzliche Sterole Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48370 ER - TY - THES A1 - Attaran, Elham T1 - Regulation of pathogen-inducible volatile compounds in Arabidopsis and their role in plant defense N2 - Plants are constantly attacked by pathogenic microbes. As a result, they have evolved a plethora of constitutive and inducible defense responses to defend against attempted pathogen infection. Although volatile organic compounds have been implicated in plant defense, direct evidence of their function in plant resistance is still lacking. I have examined the role of VOCs in Arabidopsis defense against the hemibiotrophic bacterial pathogen Pseudomonas syringae pv. maculicola. The obtained results show that the vegetative parts of Arabidopsis produces and emits the volatile phenylpropanoid MeSA and three kinds of terpenoids, (E,E)-4,8,12-trimethyltrideca-1,3,7,11-tetraene (TMTT), alpha-ionon and beta-farnesen, upon avirulent and virulent P. syringae inoculation. Whereas the most abundant volatiles, MeSA and TMTT, are already produced at early stages of infection in the compatible and incompatible interaction, enhanced emission of alpha-ionon and beta-farnesen can only be detected in later stages of the compatible interaction. It was revealed that pathogen-induced synthesis of TMTT in Arabidopsis requires the JA signaling pathway but occurs independently of SA defense signaling. Similarly, the production of MeSA is dependent on JA signaling but not on the SA defense signaling pathway. Furthermore, production of MeSA is dependent on the function of ISOCHORISMATE SYNTHASE1, which produces its precursor SA. Upon inoculation with avirulent P. syringae, endogenously produced JA activates the JA signalling pathway to mediate MeSA and TMTT synthesis. By contrast, in the compatible Arabidopsis-Psm interaction, production of MeSA predominantly depends on the P. syringea the virulence factor coronatine, which activates JA downstream signaling. To learn more about the role of inducible VOCs in plant defense responses, I have identified an Arabidopsis T-DNA insertions line with a defect in the TERPENE SYNTHASE4 (TPS4) gene. Emission profiles from this mutant revealed that the induced production of TMTT but not of alpha-ionone, beta-farnesene or MeSA are abolished, demonstrating that TPS4 specifically regulates the P. syringae-induced synthesis of TMTT in Arabidopsis. The lack of TMTT in tps4 mutants, however, does not affect plant defense responses and resistance induction against P. syringae. This excludes a role of the terpenoid as an effective phytoalexin in Arabidopsis leaves against the bacterial pathogen. Moreover, tps4 mutant plants are still able to mount a SAR response, excluding a signaling function of TMTT during SAR. An important aim of our studies was to address the defensive role of MeSA, the major VOC emitted from P. syringae-inoculated Arabidopsis leaves. MeSA has been recently proposed as a critical long distance signal in the development of SAR. I found that two independent T-DNA insertions lines with defects in expression of the pathogen-inducible SA methyl transferase gene BSMT1 are completely devoid of pathogen-induced production of MeSA. However, bsmt1 mutant plants are capable to increase the level of SA in systemic, non-infected leaves of Arabodopsis and develop SAR like wild-type plants upon local P. syringae-inoculation. Thus, MeSA does not function as a critical SAR signal in Arabidopsis. Further experiments showed that SA accumulation in distant leaves occurs due to de novo synthesis through isochorismate synthase. In addition, we also ruled out a critical defensive role of MeSA at inoculation sites, because bsmt1 mutants are able to build up SA-dependent defense responses and local resistance in a wild-type-like manner. The conversion of SA to MeSA and subsequently emission of MeSA from the plant might help the plant to detoxify an excess of SA. This process is regulated by the JA pathway and might be one means to mediate negative crosstalk between JA and SA signaling. Moreover, the COR-triggered conversion of SA to MeSA and emission of the volatile methyl ester could be a way by which virulent P. syringae is able to attenuate the SA-defense pathway. N2 - Pflanzen sind einer ständigen Bedrohung durch phytopathogene Mikroorganismen ausgesetzt und haben deshalb eine Vielzahl von konstitutiven und induzierbaren Abwehrstrategien entwickelt. Die Phytohormone Salicylsäure (SA), Jasmonsäure (JA) und Ethylen sind zum Beispiel entscheidende Regulatoren von induzierten Abwehrmechanismen. Eine Antwort der Pflanze auf mikrobielle Angriffe beinhaltet auch die Emission volatiler organischer Verbindungen (volatile organic compounds - VOCs). Antimikrobielle Wirkungen von VOCs wurden bisher jedoch nur in in-vitro-Assay beobachtet. Ein direkter Beweis für eine mögliche Rolle der VOCs in der Pflanzenabwehr wurde bisher nicht erbracht. Die Rolle pflanzlicher VOCs und deren Bedeutung für die Pathogenabwehr im Modellsystems Arabidopsis thaliana – Pseudomonas syringae ist das zentrale Element dieser Arbeit. Zunächst wurden Terpenoide, die die größte Gruppe der VOCs bilden, untersucht. Vegetative Teile von Arabidopsis emittieren nach Inokulation mit virulenten und avirulenten Stämmen von P. syringae pv. maculicola (Psm) vor allem drei Terpene: das Homoterpen (E,E)-4,8,12-Trimethyl-1,3,7,11-tridecatetraen (TMTT), alpha-Ionon und beta-Farnesen, welches zur Gruppe der Sesquiterpene gehört. Als Hauptkomponente des pathogen-induzierten VOC-Profils wurde das Phenylpropansäurederivat Methylsalicylsäure (MeSA) identifiziert. Um einen besseren Einblick in die Rolle der VOCs in der Pflanzenabwehr zu erhalten, wurden Arabidopsis T-DNA-Insertionslinien des Terpensynthase-gens TPS4 isoliert. Die Emissionsmuster zeigten, dass die induzierbare Freisetzung von TMTT, aber nicht von alpha-Ionon und beta-Farnesen oder MeSA reduziert war. Dies zeigt, dass TPS4 spezifisch die Psm-induzierte TMTT-Synthese in A. thaliana reguliert. Die verringerte Menge TMTT in den tps4-Mutanten hat jedoch keinen Einfluss auf die pflanzlichen Abwehrreaktionen und die Resistenzinduktion gegen P. syringae, was eine Rolle von TMTT als effektives Phytoalexin in A. thaliana gegen bakterielle Pathogene ausschließt. Ebenso hat TMTT keine Signalfunktion bei der Ausbildung der Systemisch erworbenen Resistenz (SAR), da tps4-Mutanten weiterhin in der Lage sind eine SAR-Antwort zu induzieren (Attaran et al. 2008). Als weiteres Teilprojekt wurde die Regulation von pathogen-induzierten VOCs in A. thaliana untersucht. Viele induzierte Abwehrmechanismen beinhalten Signaltransduktionsnetzwerke an denen Salicyl- oder Jasmonsäure beteiligt sind. Mit A. thaliana-Mutanten, die in der SA- oder JA- Synthese oder den jeweiligen Signalwegen beeinträchtigt sind, konnte gezeigt werden, dass die pathogen-induzierte TMTT-Produktion in A. thaliana über den JA-Signalweg, aber unabhängig von Salicylsäure verläuft. Auch die MeSA-Produktion ist JA-abhängig. Für die Biosynthese von SA, genauso wie für deren Derivat MeSA, wird ISOCHORISMAT SYNTHASE1 benötigt, die den MeSA-Vorläufer SA bildet. Im Rahmen einer inkompatiblen Interaktion wird die Bildung von MeSA in Abhängigkeit von der JA-Biosynthese gesteuert. Im Gegensatz dazu ist in der kompatiblen Interaktion die MeSA-Produktion vom bakteriellen Virulenzfaktor Coronatin abhängig. Coronatin-defiziente Stämme von P. syringae sind nicht fähig, eine MeSA-Emission zu induzieren (Attaran et al., 2009). Desweiteren wurde in der vorliegenden Arbeit die Rolle von MeSA in der Pflanzenabwehr untersucht. MeSA ist das VOC, welches von P. syringae-inokulierten A. thaliana-Blättern vorwiegend abgegeben wird. Kürzlich wurde für MeSA eine Signaleigenschaft als Langstreckensignal in der Etablierung der SAR postuliert (Park et al., 2007). Wir konnten zeigen, dass T-DNA Insertionslinien, bei denen keine Expression der pathogeninduzierten SA-Methyltransferase BSMT1 nachgewiesen werden konnte und die somit keine pathogen-induzierte MeSA-Produktion aufwiesen, auch in systemischen, nicht infizierten Blättern nach P. syringae-Inokulation einen erhöhten SA-Spiegel, eine verstärte Expression von Abwehrgenen und eine erhöhte Pathogenresistenz aufwiesen. Diese Mutantenlinien können also die SAR genauso und in demselben Maß wie Wildtyp-Pflanzen entwickeln. Damit konnte gezeigt werden, dass MeSA nicht als zentrales Signal für die Ausbildung der SAR in Arabidopsis wirken kann. Weitere Experimente machten deutlich, dass die SA-Akkumulation in distalen Blättern auf eine de-novo-Synthese durch die Isochorismat-Synthase zurückzuführen ist. Schließlich konnte auch eine wichtige Rolle von MeSA in der Pflanzenabwehr an den Infektionsstellen ausgeschlossen werden, da bsmt1-Mutanten SA-abhängige Abwehrreaktionen und lokale Resistenzantworten in gleicher Weise wie Wildtyp-Pflanzen zeigen (Attaran et al., 2009). Produktion und anschließende Emission von MeSA könnte daher in der Pflanze dazu beitragen, einen toxischen Überschuss an SA abzubauen. Reguliert wird dieser Prozess durch den JA-Signalweg, der dadurch einen negativen Einfluss auf den SAHaushalt der Pflanze innehat. Die Auslösung der MeSA-Produktion von dem bakteriellen Virulenzfaktor COR in der kompatiblen Wechselwirkung könnte eine Strategie von P. syringae sein, die Effizienz der SA-basierenden Abwehr zu verzögern. KW - Ackerschmalwand KW - Pathogener Mikroorganismus KW - Abwehrreaktion KW - VOC <Ökologische Chemie> KW - Volatiler oraganischer Verbindungen KW - Abwehrmechanismen KW - Systemisch erworbenen Resistenz KW - Volatiole Compounds KW - disease resistance KW - Systemic acquired resistance Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-46715 ER - TY - THES A1 - Mishina, Tatiana E. T1 - Mechanisms of local and systemic defences in Arabidopsis thaliana in response to host and non-host strains of Pseudomonas syringae N2 - Stickstoffmonooxid (NO) wird als wichtige Signalkomponente bei der Entwicklung der Hypersensitiven Reaktion beschrieben. Außerdem wird NO eine Rolle als Signalmolekül bei der Expression von Abwehrgenen wie PR-1, PAL1 oder Chalkonsynthase (CHS) und bei der Akkumulation von Salicylsäure zugeordnet (Durner et al., 1998). In der vorliegenden Arbeit wurden transgene Pflanzen mit veränderten endogenen NO-Spiegeln verwendet, um die Rolle von NO in Pflanze-Pathogen-Interaktionen zu untersuchen. Arabidopsis-Pflanzen, die aufgrund der Expression einer NO Dioxygenase erniedrigte NO-Gehalte aufweisen, zeigen nach einem Angriff avirulenter Pathogene einen abgeschwächten oxidative burst und eine reduzierte Expression von Genen des Phenylpropanbiosyntheseweges. Weitere Experimente mit transgenen Pflanzen, die eine bakterielle NO-Synthase exprimieren, legen nahe, dass eine konstitutive Erhöhung der NO-Spiegel nicht zu einer konstitutiv verstärkten Pathogenabwehr führt. Möglicherweise ist eine graduelle Steigerung der NO-Gehalte nach Pathogenkontakt für die Induktion pflanzlicher Abwehrreaktionen erforderlich. Im Gegenteil, die NOS-exprimierenden Pflanzen waren anfälliger gegen bakterielle Pathogene als Wildtyp-Pflanzen und zeigten eine abgeschwächte SAR-Reaktion. Die Ergebnisse deuten auch darauf hin, dass NO eine wichtige Rolle bei der Regulation des Redoxstatus in der Pflanzenzelle spielt. Diese Funktion von NO ist wichtig beim Seneszenzvorgang. Entsprechend der Ergebnisse dieser Arbeit kann NO als negativer Regulator der Blattseneszenz angesehen werden. Die Wirkungsweise von NO auf molekularer Ebene und die Signalkaskaden, in die NO involviert ist, sind immer noch nicht ausreichend verstanden. In zukünftigen Experimenten wird es notwendig sein, die selektive Quantifizierung von NO in intaktem Pflanzengewebe zu gewährleisten, die Proteintargets von NO zu identifizieren und die Struktur und Funktion NO-modifizierter Biomoleküle zu entschlüsseln, um die Rolle von NO in Pflanze-Pathogen-Wechselwirkungen besser verstehen zu lernen. Die Nichtwirtsresistenz beruht auf mehreren Verteidigungsebenen, welche konstitutive und induzierte Komponenten beinhalten. Die Bedeutung induzierter Abwehrreaktionen für die Nichtwirtsresistenz gegen bakterielle Pathogene ist nicht vollständig klar. Die Daten der vorliegenden Arbeit legen nahe, dass das Wachstum von Nichtwirtsbakterien in Arabidopsis-Blättern durch vorgebildete toxische Substanzen und durch induzierte Zellwandverstärkungen gehemmt wird. Nichtwirtsbakterien verursachen eine schnelle Induktion der Expression der Ligninbiosynthesegene PAL1 und BCB, die unabhängig vom Typ III-Sekretionssystem ist und möglicherweise zur Papillenbildung beiträgt. Darüber hinaus ist die Überlebensrate der Nichtwirtsbakterien in den extrazellulären Räumen der Arabidopsis pal1-Mutante höher als in Wildtyp-Pflanzen, was die funktionelle Bedeutung der PAL1-Expression bei der Nichtwirtsresistenz verdeutlicht. Außerdem zeigen die Experimente, dass Nichtwirtsbakterien in ähnlicher Weise wie Wirtsbakterien die Akkumulation von Salicylsäure und die Expression von PR-Genen induzieren. Die Induktion dieser Abwehrkomponenten ist abhängig von einem intakten Typ III-Sekretionssystem. Die Signalwege, auf denen nach Kontakt mit Nichtwirtsbakterien und Wirtsbakterien Abwehrreaktionen induziert werden, sind ähnlich. Es wurden jedoch zwischen zwei verschiedenen Nichtwirtsstämmen auch unterschiedliche Signalwege aktiviert, was möglicherweise auf ein unterschiedliches Repertoire von TypIII-Effektoren der beiden Stämme zurückgeführt werden kann. Trotz der Aktivierung dieser induzierten Abwehr zeigen Experimente mit klassischen Abwehrmutanten, dass SA- und JA-abhängige Abwehrreaktionen nicht direkt zur Nichtwirtsresistenz gegen P. syringae beitragen. Weiterhin zeigt diese Arbeit, dass die Nichtwirtsresistenz des Arabidopsis-Ökotyps Col-0 effektiver ist als die des Ler-0-Ökotyps, obwohl bei letzterem die Resistenz gegen virulente Bakterien höher ist. Diese Unterschiede scheinen nicht mit der unterschiedlichen Glucosinolatzusammensetzung der beiden Ökotypen im Zusammenhang zu stehen. Um das Verständnis der Nichtwirtsresistenz von Arabidopsis gegenüber P. syringae zu verbessern, können in zukünftigen Experimenten Doppel- und Triplemutanten hergestellt werden, die gleichzeitig Defekte in der zellwandabhängigen Abwehr (Lignin- und Callosebiosynthese) und in klassischen, SA-abhängigen Abwehrreaktionen aufweisen. Auch können Analysen des Genom-Polymorphismus und der Zusammensetzung von Sekundärmetaboliten in den Ökotypen Ler-0 und Col-0 zu einem besseren Verständnis der Nichtwirtsresistenz führen. Die Resultate dieser Arbeit zeigen, dass ein lokaler, symptomfreier Kontakt von Arabidopsis-Blättern mit Nichtwirtsbakterien, TTSS-defiziente Bakterien und allgemeine bakterielle Elicitoren (PAMPs) wie Flagellin und Lipopolysaccharide die systemisch erworbene Resistenz innerhalb der Gesamtpflanze hervorrufen. Die symptomlose systemische Resistenzreaktion findet in SAR-defizienten Mutanten nicht statt, wird jedoch in der Jasmonat-insensitiven jar1-Mutante, die keine ISR-Reaktion ausbilden kann, beobachtet. Durch Behandlung von Arabidopsis-Blättern mit unterschiedlichen Inokuli von virulenten oder avirulenten P. syringae-Stämmen wurde auch eine deutliche Korrelation des Ausmaßes der SAR-Induktion mit der Höhe der SA-Akkumulation oder der PR-Genexpression, aber nicht mit der Nekrosenbildung oder der JA-Produktion, am Infektionsort festgestellt. Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass nicht die Hypersensitive Reaktion oder Gewebenekrosen, sondern möglicherweise die Stärke bestimmter Abwehrreaktionen am Ort der Inokulation zur Auslösung der SAR beitragen. Die Befunde, dass die systemische Resistenz auch durch PAMPs und durch TTSS-defekte P. syringae-Stämme erhöht wird, verdeutlicht die wichtige Rolle von allgemeinen Elicitoren bei der SAR-Induktion. In künftige Experimenten kann untersucht werden, ob verschiedene PAMPs die SAR in synergistischer Weise induzieren und ob allgemeine Elicitoren pilzlicher Herkunft SAR auslösen können. Weiterhin können die molekulare Prozesse spezifiziert werden, die stromabwärts von PAMP-Erkennungsprozessen für die SAR-Ausbildung notwendig sind. In weiteren Experimenten könnte die Hypothese überprüft werden, ob einzelner PAMPs als mobile SAR-Langstreckensignale fungieren können. Durch phytopathologische Charakterisierung von T-DNA-Knockout-Linien, die Defekte in Genen aufweisen, welche in Arabidopsis nach einer P. syringae-Infektion aufreguliert werden, konnte das FLAVIN-DEPENDENT MONOOXYGENASE1 (FMO1)-Gen als notwendige Komponente der SAR in Arabidopsis identifiziert werden. So bleiben die im Wildtyp induzierten systemischen Abwehrreaktionen und die Erhöhung der systemischen Resistenz nach lokaler Inokulation mit P. syringae in fmo1-Knockout-Pflanzen vollständig aus. Weiterhin korreliert die systemische Expression des FMO1-Gens eng mit der SAR-Induktion. So gibt es bei allen Abwehrmutanten, die keine SAR nach Kontakt mit P. syringae ausbilden können, keine FMO1-Expression in distalen Blättern inokulierter Pflanzen. Umgekehrt verhält es sich mit Arabidopsis-Linien, die die SAR ausbilden. Die erhaltenen Ergebnisse deuten darauf hin, dass FMO1 eine wichtige Komponente eines Signalverstärkungszyklus darstellt, der in nichtinfizierten, systemischen Teilen der Pflanze wirkt, um die SAR zu ermöglichen. In künftigen Experimenten soll der postulierte Amplifizierungsmechanismus experimentell verifiziert werden. Die Konstruktion von transgenen Linien, die ein FMO1:GFP-Fusionsprodukt exprimieren, kann Informationen über die zelluäre Lokalisation des FMO1-Proteins liefern. Weiterhin können vergleichende Analysen der chemischen Zusammensetzung von Blattextrakten der fmo1 Knockout-Linien, von FMO1-Überexprimierern und von Wildtyp-Pflanzen zur Aufklärung der biochemischen Reaktion beitragen, die die FMO1-Monooxygenase katalysiert. In Anlehnung an die Funktion von yFMO, die die einzige Flavin-abhängige Monooxygenase der Hefe darstellt, kann überprüft werden, ob FMO1 die korrekte Faltung von Proteinen am endoplasmatischen Retikulum vermittelt. Schließlich kann durch die Identifizierung weitere SAR-Gene nach der beschriebenen Strategie und durch funktionelle Charakterisierung der zugehörigen Proteine das Verständnis der SAR-Reaktion auf molekularer Ebene weiter verbessert werden. N2 - NO has been described as an important component involved in the development of the hypersensitive reaction (Delledonne et.al., 1998). Furthermore, NO induces expression of a set of defence gene, such as PR-1, PAL1 and chalcone synthase (CHS), and accumulation of SA (Durner et al., 1998). In this study, transgenic plants with altered NO levels were used to study the role of NO in plant defence. Arabidopsis plants which, due to expression of a bacterial NO dioxygenase, exhibit lower levels of NO than wild-type plants, show several weakened defence response, including the oxidative burst and expression of phenylpropanoid pathway genes. By contrast, constitutive expression of a bacterial NO synthase in Arabisopsis results in increased levels of endogenous NO. However, these plants do not show constitutively activated defence responses, but suffer from increased susceptibility to various strains of P. syringae. This might indicate that a gradient in NO production rather than constitutive elevation of NO is necessary to trigger plant defence responses. Nevertheless, NO seems to be important for regulation of the oxidative state in plant cells. This function of NO is important during leaf senescence. The data of the present work indicate that NO acts as senescence-delaying factor during plant development. The molecular action of NO in plants and signalling cascades in which NO is involved as second messenger are still poorly understood. Experiments addressing the selective quantification of NO in intact plant tissue, the identification of NO-target proteins as well as the function of NO-modified biomolecules might help to understand the role of NO in plants. Non-host resistance consists of several layers of defence that include preformed compounds existing in plants before pathogen infection and induced defences which the plant activates after recognition of a pathogen. The role of inducible defences in preventing multiplication of non-adapted bacteria is not clear. Our experiments suggest that to restrict non-adapted bacterial growth, pre-formed antimicrobial compounds and an early inducible cell wall-based defence might play an important role in Arabidopsis leaves. Upon inoculation with non-adapted bacteria, we have observed early, TTSS-independent up-regulation of PAL1 and BCB, two lignin biosynthesis genes which might be involved in papilla formation or other kinds of cell wall fortification. Moreover, Arabidopsis pal1 knockout lines permit significantly higher survival of non-adapted bacteria in leaves than wild-type plants, suggesting a functional importance of PAL1 up-regulation. Although non-host bacteria, like host bacteria, induce accumulation of SA and PR gene expression in a TTSS-dependent manner, SA-dependent or JA/ET-dependent defences do not directly contribute to non-host resistance. Moreover, non-adapted bacteria activate similar defence signalling pathways as do host bacteria. However, because of varieties in effector protein composition between different non-adapted bacterial strains, the activated signalling pathways might also include different compounds. The Arabidopsis ecotype Ler 0 is more susceptible to a non-adapted strain of P. syringae than ecotype Col-0. Although differences in glucosinolate content and composition between those ecotypes exist, they are probably not a major reason for the observed difference in non-host resistance. To further understand the mechanisms underlying non-host resistance, the generation of double or triple mutants with deficits in both cell wall-based defences and SA-dependent signal cascades is necessary. Moreover, the study of genome polymorphism and composition of secondary metabolites between Ler-0 and Col-0 can shed new light into the mechanisms of non-host resistance against bacterial pathogens. Additionally, experiments addressing papilla formation and callose biosynthesis in Ler-0 and Col-0 could help to further elucidate bacterial non-host resistance. Our data indicate that localized contact of Arabidopsis leaves with non-adapted bacteria, type III secretion-defective P. syringae strains and bacterial pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) induce systemic acquired resistance (SAR) at the whole plant level. This finding contrasts the general belief that an HR or other leaf necroses are required for SAR induction. The observed symptomless systemic response was abolished in all SAR-deficient mutants tested in this study, but was intact in the jar1 mutant, which is compromised in induction of ISR, indicating that non-host bacteria and PAMPs induce SAR in a mechanistically similar way than host bacteria. In addition, our data show that the extent of SA accumulation or PR gene expression induced at sites of virulent or avirulent P. syringae inoculation rather than the amount of tissue necroses or jasmonate accumulation determine the magnitude of SAR. The fact that systemic responses were also triggered after local treatment with type III secretion-defective P. syringae strains and bacterial PAMPs indicate that induction of SAR is TTSS-independent. Instead, recognition of general elicitors like flagellin and LPS play an important role in activation of the SAR process. To broaden the concept of PAMP-based SAR initiation, further general elicitors from bacteria and fungal pathogens should be tested for their capability to induce SAR. Screens for mutants with deficiency in SAR activation by individual PAMPs can help to identify new components involved in the SAR signalling cascade. Possible functions of PAMPs as mobile systemic signals should be tested in future experiments. By selection of candidate genes whose expression is up-regulated in Arabidopsis leaves infected with avirulent and virulent P. syringae and pathophysiological analyses of corresponding T-DNA knockout lines, FLAVIN-DEPENDENT MONOOXYGENASE1 (FMO1) was identified as a key SAR regulator. SAR triggered by P. syringae is completely abolished in fmo1 mutant plants, and pathogen-induced expression of FMO1 in systemic leaves is closely correlated with the capability of different Arabidopsis lines to develop SAR. According to our findings, we have proposed that the FMO1 acts in signal amplification in non-inoculated, systemic leaves to trigger SAR. Experimental verification of the postulated potential amplification cycle underlying SAR should be tested in future experiments. The generation of transgenic lines expressing FMO1::GFP will provide useful information about the cellular localization of the FMO1 protein. Moreover, a comparative metabolomic analysis using SAR-induced wild-type, fmo1 knockout and FMO1 overexpressing lines can be used to identify substrates and reaction products of the FMO1 monooxygenase. As the single yeast FMO (yFMO) provides oxidizing equivalents at the ER for correct protein folding, expression of FMO1 in yfmo mutant yeast combined with protein activity assays might indicate whether FMO1 exhibits functional similarities with yeast FMO, e.g. in assuring proper folding of ER-targeted proteins essential for SAR establishment. Identification of further genes involved in activation of systemic resistance and biochemical characterization of the corresponding proteins can help to understand the SAR process in more detail. KW - Ackerschmalwand KW - Pseudomonas syringae KW - Induzierte Resistenz KW - Stickstoffmonoxid KW - Arabidopsis thaliana KW - Pseudomonas syringae KW - systemisch erworbene Resistenz KW - Stickstoffmonoxid KW - Nichtwirtsresistenz KW - Arabidopsis thaliana KW - Pseudomonas syringae KW - systemic acquired resistance KW - nitric oxide KW - non-host resistance Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-23160 ER -