TY - THES A1 - Yang, Tao T1 - Functional insights into the role of a bacterial virulence factor and a host factor in Neisseria gonorrhoeae infection T1 - Funktionelle Einblicke in die Rolle eines bakteriellen Virulenzfaktors und eines Wirtsfaktors bei der Infektion mit Neisseria gonorrhoeae N2 - Neisseria gonorrhoeae (GC) is a human specific pathogenic bacterium. Currently, N. gonorrhoeae developed resistance to virtually all the available antibiotics used for treatment. N. gonorrhoeae starts infection by colonizing the cell surface, followed by invasion of the host cell, intracellular persistence, transcytosis and exit into the subepithelial space. Subepithelial bacteria can reach the bloodstream and disseminate to other tissues causing systemic infections, which leads to serious conditions such as arthritis and pneumonia. A number of studies have well established the host-pathogen interactions during the initial adherence and invasion steps. However, the mechanism of intracellular survival and traversal is poorly understood so far. Hence, identification of novel bacterial virulence factors and host factors involved in the host-pathogen interaction is a crucial step in understanding disease development and uncovering novel therapeutic approaches. Besides, most of the previous studies about N. gonorrhoeae were performed in the conventional cell culture. Although they have provided insights into host-pathogen interactions, much information about the native infection microenvironment, such as cell polarization and barrier function, is still missing. This work focused on determining the function of novel bacterial virulence factor NGFG_01605 and host factor (FLCN) in gonococcal infection. NGFG_01605 was identified by Tn5 transposon library screening. It is a putative U32 protease. Unlike other proteins in this family, it is not secreted and has no ex vivo protease activity. NGFG_01605 knockout decreases gonococcal survival in the epithelial cell. 3D models based on T84 cell was developed for the bacterial transmigration assay. NGFG_01605 knockout does not affect gonococcal transmigration. The novel host factor FLCN was identified by shRNA library screening in search for factors that affected gonococcal adherence and/or internalization. We discovered that FLCN did not affect N. gonorrhoeae adherence and invasion but was essential for bacterial survival. Since programmed cell death is a host defence mechanism against intracellular pathogens, we further explored apoptosis and autophagy upon gonococcal infection and determined that FLCN did not affect apoptosis but inhibited autophagy. Moreover, we found that FLCN inhibited the expression of E-cadherin. Knockdown of E- cadherin decreased the autophagy flux and supported N. gonorrhoeae survival. Both non-polarized and polarized cells are present in the cervix, and additionally, E-cadherin represents different polarization properties on these different cells. Therefore, we established 3-D models to better understand the functions of FLCN. We discovered that FLCN was critical for N. gonorrhoeae survival in the 3-D environment as well, but not through inhibiting autophagy. Furthermore, FLCN inhibits the E-cadherin expression and disturbs its polarization in the 3-D models. Since N. gonorrhoeae can cross the epithelial cell barriers through both cell-cell junctions and transcellular migration, we further explored the roles FLCN and E-cadherin played in transmigration. FLCN delayed N. gonorrhoeae transmigration, whereas the knockdown of E-cadherin increased N. gonorrhoeae transmigration. In summary, we revealed roles of the NGFG_01605 and FLCN-E-cadherin axis play in N. gonorrhoeae infection, particularly in relation to intracellular survival and transmigration. This is also the first study that connects FLCN and human-specific pathogen infection. N2 - Neisseria gonorrhoeae (GC) ist ein humanpathogenes Bakterium. Gegen jedes kommerziell erhältliche Antibiotikum konnten bereits Resistenzen entdeckt werden. Die Infektion von Neisserien startet mit der Kolonisierung der Zelloberfläche, gefolgt von der Invasion in die Zelle, intrazellulärer Persistenz, Transzytose und Verlassen des subepithelen Raums. Subepithele Bakterien können den Blutfluss erreichen und sich somit auf andere Gewebe verbreiten und dadurch schwerwiegende Erkrankungen wie Arthritis und Lungenentzündungen verursachen. Zahlreiche Studien haben die Interaktion zwischen Wirtszelle und Pathogen zwischen Adhärenz und Invasion gut charakterisiert. Allerdings ist der Mechanismus des intrazellulären Überlebens und der Transmigration weitestgehend unbekannt. Um neue therapeutische Ansätze zu definieren ist es deshalb wichtig weitere bakterielle und zelluläre Faktoren verantwortlich für Interaktionen zwischen Wirt und Pathogen zu identifizieren. Außerdem wurden Studien über N. gonorrhoeae bisher in konventioneller Zellkultur durchgeführt. Auch wenn diese weitere Einsichten in Wirt-Pathogen Interaktionen geben, ist viel Information in der nativen Infektionsumgebung, wie Zellpolarisierung oder Barrierefunktionen, bisher nicht bekannt. Diese Arbeit fokussiert sich auf die Bestimmung eines neuen bakteriellen Virulenzfaktors, NGFG_01605, und Wirtsfaktoren (FLCN) in der Infektion von Gonokokken. NGFG_01605 wurde über Screening einer Transposonsammlung identifiziert und ist eine vermeintliche U32 Protease. Im Gegensatz zu anderen Proteinen dieser Familie, wird diese Protease nicht sekretiert und hat keine ex vivo Proteaseaktivität. Der Knockout von NGFG_01605 vermindert die Überlebensrate von Gonokokken in Epithelzellen. 3D-Modelle basierend auf T84-Zellen wurden für die Analyse der bakteriellen Transmigration entwickelt. Der Knockout von NGFG_01605 hat keinen Einfluss auf die Transmigration. Bei der Suche neuer Wirtsfaktoren, die für die Adhärenz und/oder Internalisierung wichtig sind, wurde FLCN durch ein Screening einer shRNA Sammlung entdeckt. Wir konnten zeigen, dass dieser Faktor zwar nicht für die Adhärenz oder Invasion von N. gonorrhoeae, aber für das Überleben der Bakterien in der Wirtszelle essenziell ist. Da der programmierte Zelltod ein typischer Abwehrmechanismus gegen intrazelluläre Bakterien ist, haben wir Apoptose und Autophagie weiter untersucht und konnten zeigen, dass FLCN zwar keinen Effekt auf Apoptose hat, aber Autophagie inhibiert. Außerdem konnten wir zeigen, dass FLCN die Expression von E-cadherin inhibiert. Auch der Knockdown von E-cadherin verringerte Autophagie und erhöhte das Überleben von N. gonorrhoeae. Im Gebärmutterhals sind sowohl polarisierte als auch nicht-polarisierte Zellen präsent. E-cadherin hat zudem unterschiedliche Einflüsse auf diese unterschiedlichen Zellen. Aus diesem Grund haben wir ein 3D-Modell entwickelt, um die Funktionen von FLCN besser zu verstehen. Wir entdeckten, dass FLCN zwar auch im 3D Modell wichtig für das Überleben ist, aber nicht durch Inhibition von Autophagie. Außerdem inhibiert FLCN die Expression und Verteilung von E-cadherin in 3D-Modellen. Da N. gonorrhoeae die Epithelzellbarierre durch sowohl Zell-Zell-Kontakte als auch transzelluläre Migration überwinden kann, untersuchten wir daraufhin die Rollen von FLCN und E-cadherin in der transzellulären Migration. Diese wird durch FLCN verspätet und durch Knockdown von E-cadherin erhöht. Zusammengefasst, haben wir die Rolle von NGFG_01605 und den Zusammenhang von FLCN und E-cadherin während der Infektion von N. gonorrhoeae untersucht. Unser Fokus war hierbei das intrazelluläre Überleben sowie zelluläre Transmigration. Diese Arbeit ist die Erste, die FLCN und humanpathogenspezifische Infektion miteinander in Verbindung bringt. KW - Folliculin KW - autophagy KW - polarized epithelium KW - protease KW - Gonococcal invasion KW - autophagocytose Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-208959 ER - TY - THES A1 - Klein, Thomas T1 - Establishing an in vitro disease model for Fabry Disease using patient specific induced pluripotent stem cell-derived sensory neurons T1 - Etablierung eines in vitro Krankheitsmodells für M. Fabry mittels patienteneigener sensibler Neurone, generiert über induzierte pluripotente Stammzellen N2 - Fabry disease (FD) is an X-linked lysosomal storage disorder caused by deficiency of the α-galactosidase A (GLA), leading to intracellular accumulations of globotriaosylceramide (Gb3). Acral burning pain, which can be triggered by heat, fever or physical activity is an early hallmark of FD and greatly reduces patients’ quality of life. The pathophysiology of FD pain is unknown and research is hindered by the limited in vivo availability of suitable human biomaterial. To overcome this obstacle, we generated induced pluripotent stem cells (iPSC) from one female and two male patients with a differing pain phenotype, and developed a refined differentiation protocol for sensory neurons to increase reliability and survival of these neurons, serving as an in vitro disease model. Neurons were characterized for the correct neuronal subtype using immunocytochemistry, gene expression analysis, and for their functionality using electrophysiological measurements. iPSC and sensory neurons from the male patients showed Gb3 accumulations mimicking the disease phenotype, whereas no Gb3 depositions were detected in sensory neurons derived from the female cell line, likely caused by a skewed X-chromosomal inactivation in favor of healthy GLA. Using super-resolution imaging techniques we showed that Gb3 is localized in neuronal lysosomes of male patients and in a first experiment using dSTORM microscopy we were able to visualize the neuronal membrane in great detail. To test our disease model, we treated the neurons with enzyme replacement therapy (ERT) and analyzed its effect on the cellular Gb3 load, which was reduced in the male FD-lines, compared to non-treated cells. We also identified time-dependent differences of Gb3 accumulations, of which some seemed to be resistant to ERT. We also used confocal Ca2+ imaging to investigate spontaneous neuronal network activity, but analysis of the dataset proofed to be difficult, nonetheless showing a high potential for further investigations. We revealed that neurons from a patient with pain pain are more easily excitable, compared to cells from a patient without pain and a healthy control. We provide evidence for the potential of patient-specific iPSC to generate a neuronal in vitro disease model, showing the typical molecular FD phenotype, responding to treatment, and pointing towards underlying electrophysiological mechanisms causing different pain phenotypes. Our sensory neurons are suitable for state-of-the-art microscopy techniques, opening new possibilities for an in-depth analysis of cellular changes, caused by pathological Gb3 accumulations. Taken together, our system can easily be used to investigate the effect of the different mutations of GLA on a functional and a molecular level in affected neurons. N2 - Morbus Fabry (M. Fabry) ist eine X-chromosomal vererbte lysosomale Speichererkrankung, die durch die Defizienz von α-Galaktosidase A (GLA) verursacht wird. Diese führt zu pathologischen Ablagerungen von Globotriaosylceramid (Gb3) in Zellen. Akraler, brennender Schmerz, der durch Hitze, Fieber oder Sport ausgelöst werden kann, ist ein frühes Krankheitsmerkmal und reduziert die Lebensqualität der Patienten deutlich. Die Pathophysiologie von M. Fabry ist unklar und die Forschung ist durch die limitierte Verfügbarkeit von humanem Biomaterial nur eingeschränkt möglich. Um dieses Problem zu bewältigen haben wir induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC) von einer weiblichen Patientin und zwei männlichen Patienten mit unterschiedlichen Schmerzphänotypen generiert. Mit diesen Zellen konnten wir ein verbessertes Protokoll zur Herstellung sensibler Neurone etablieren um diese als in vitro Krankheitsmodell zu nutzen. Die Neurone wurden mittels Immunozytochemie, Genexpressionsanalyse und elektrophysiologischer Messungen auf die korrekte Zellidentität und deren Funktionalität getestet. Gb3 Ablagerungen konnten als Krankheitsmerkmal in iPSC und sensiblen Neuronen der männlichen Patienten, nicht aber in Zellen der weiblichen Patientin und der Kontrollperson nachgewiesen werden. Das Fehlen von pathologischen Ablagerungen in Zellen der weiblichen Betroffenen ist vermutlich auf eine verschobene X-Inaktivierung zu Gunsten des gesunden GLA zurückzuführen. Nichtsdestotrotz ist es uns durch die Nutzung hochauflösender Mikroskopietechniken gelungen, bei männlichen Patienten Gb3 in neuronalen Lysosomen nachzuweisen und die Membran in großem Detail abzubilden. Die Behandlung der Neurone mit der Enzymersatztherapie (ERT) als Nachweis für die Funktionalität des Krankheitsmodells führte zu einer Reduktion der Gb3 Ablagerungen bei männlichen Zellen, im Vergleich zu unbehandelten Zellen. Zudem konnten wir unterschiedliche Arten von Gb3 Akkumulationen identifizieren, von denen einige scheinbar behandlungsresistent sind. Erste Versuche mit Ca2+ Imaging zeigten spontane, neuronale Netzwerkaktivität, die noch weitergehend analysiert werden müssen. Mittels Patch-Clamp Analysen konnten wir zeigen, dass Neurone des Patienten mit Schmerzen leichter erregbar sind als Zellen des Patienten ohne Schmerzen, was einen Hinweis auf die mögliche Beteiligung gestörter Ionenkanäle gibt. Wir konnten zeigen, dass patientenspezifische iPSC geeignet sind um ein neuronales in vitro Krankheitsmodell zu erstellen. Dieses Modell zeigt den typischen molekularen Phänotypen des M. Fabry, spricht auf ERT an und liefert erste Hinweise auf pathologische elektrophysiologische Krankheitsursachen, die zu unterschiedlichen Schmerzphänotypen führen können. Zelluläre Veränderungen durch Gb3 Ablagerungen können nun mittels neuester Mikroskopietechniken anhand der von uns generierten Neurone untersucht werden um ein besseres Verständnis der zugrundeliegenden Pathophysiologie zu bekommen. Zusammenfassend bietet unser System eine neue Möglichkeit den neuronalen Einfluss verschiedener GLA Mutationen auf einer funktionellen und molekularen Ebene zu untersuchen und die Diversität von M. Fabry aufzuschlüsseln. KW - Induzierte pluripotente Stammzelle KW - iPSC KW - disease model KW - fabry disease KW - pain Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-199705 ER - TY - THES A1 - Vollmuth, Nadine T1 - Role of the proto-oncogene c-Myc in the development of Chlamydia trachomatis T1 - Die Rolle des proto-onkogenes c-Myc in der Entwicklung von Chlamydia trachomatis N2 - Chlamydia trachomatis, an obligate intracellular human pathogen, is the world’s leading cause of infection related blindness and the most common, bacterial sexually transmitted disease. In order to establish an optimal replicative niche, the pathogen extensively interferes with the physiology of the host cell. Chlamydia switches in its complex developmental cycle between the infectious non-replicative elementary bodies (EBs) and the non-infectious replicative reticulate bodies (RBs). The transformation to RBs, shortly after entering a host cell, is a crucial process in infection to start chlamydial replication. Currently it is unknown how the transition from EBs to RBs is initiated. In this thesis, we could show that, in an axenic media approach, L glutamine uptake by the pathogen is crucial to initiate the EB to RB transition. L-glutamine is converted to amino acids which are used by the bacteria to synthesize peptidoglycan. Peptidoglycan inturn is believed to function in separating dividing Chlamydia. The glutamine metabolism is reprogrammed in infected cells in a c-Myc-dependent manner, in order to accomplish the increased requirement for L-glutamine. Upon a chlamydial infection, the proto-oncogene c-Myc gets upregulated to promote host cell glutaminolysis via glutaminase GLS1 and the L-glutamine transporter SLC1A5/ASCT2. Interference with this metabolic reprogramming leads to limited growth of C. trachomatis. Besides the active infection, Chlamydia can persist over a long period of time within the host cell whereby chronic and recurrent infections establish. C. trachomatis acquire a persistent state during an immune attack in response to elevated interferon-γ (IFN-γ) levels. It has been shown that IFN-γ activates the catabolic depletion of L-tryptophan via indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO), resulting in the formation of non-infectious atypical chlamydial forms. In this thesis, we could show that IFN-γ depletes the key metabolic regulator c-Myc, which has been demonstrated to be a prerequisite for chlamydial development and growth, in a STAT1-dependent manner. Moreover, metabolic analyses revealed that the pathogen de routs the host cell TCA cycle to enrich pyrimidine biosynthesis. Supplementing pyrimidines or a-ketoglutarate helps the bacteria to partially overcome the persistent state. Together, the results indicate a central role of c-Myc induced host glutamine metabolism reprogramming and L-glutamine for the development of C. trachomatis, which may provide a basis for anti-infectious strategies. Furthermore, they challenge the longstanding hypothesis of L-tryptophan shortage as the sole reason for IFN-γ induced persistence and suggest a pivotal role of c-Myc in the control of the C. trachomatis dormancy. N2 - Chlamydia trachomatis, ein obligat intrazellul¨ares humanes Pathogen, ist weltweit fu¨hrende Ursache fu¨r infektionsbedingte Erblindung und die h¨aufigste, bakterielle sexuell u¨bertragbare Krankheit. Um eine optimale Replikationsnische zu etablieren, interagiert das Pathogen in tensiv mit der Physiologie der Wirtszelle. Chlamydien wechseln in ihrem komplexen Entwick lungszyklus zwischen den infekti¨osen nicht replizierenden Elementark¨orperchen (EBs) und den nicht infekti¨osen replizierenden Retikulark¨orperchen (RBs), und diese Umwandlung in RBs kurz nach dem Eintritt in die Wirtszelle ist ein entscheidender Prozess in der Infektion, um die Replikation des Bakteriums einzuleiten. Derzeit ist noch nicht bekannt, wodurch diese Transformation von EBs zu RBs eingeleitet wird. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass bei einer zellfreien Kultivierung des Pathogens die Aufnahme von Glutamin durch den Erreger entscheidend ist, um den ¨Ubergang von EB zu RB zu initiieren. Vor kurzem wurde Peptidoglykan in den Septen von sich replizierenden Chlamydien nachgewiesen. Fu¨r die Syn these des Peptidoglykans nutzen die Bakterien das aufgenommene Glutamin. Der Glutamin metabolismus wird in infizierten Zellen c-Myc abh¨angig umprogrammiert, um den erh¨ohten Bedarf an Glutamin zu bew¨altigen. Bei einer Chlamydieninfektion wird das Proto-Onkogen c-Myc zur F¨orderung der Glutaminolyse der Wirtszelle u¨ber die Glutaminase GLS1 und den Glutamin Transporter SLC1A5/ASCT2 hochreguliert. Ein Eingreifen in diese metabolische Neuprogrammierung fu¨hrt zu einem reduzierten Wachstum von C. trachomatis. Neben der aktiven Infektion k¨onnen Chlamydien u¨ber einen sehr langen Zeitraum in der Wirtszelle persistieren, wodurch es zur Etablierung von chronischen und wiederkehrenden Infektionen kommt. C. trachomatis verf¨allt bei einem Immunangriff in Persistenz, wenn sie auf das freigesetzte Interferon-γ treffen. Es ist bekannt, dass Interferon-γ den Katabolismus von Tryptophan mittels indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) aktiviert, was zur Bildung von nicht infekti¨osen atypischen Chlamydienformen fu¨hrt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Interferon-γ den zentralen Stoffwechselregulator c-Myc, der sich fu¨r die Entwicklung und das Wachstum von Chlamydien als essentiell erwiesen hat, in Abh¨angigkeit von STAT1 herunter reguliert. Daru¨ber hinaus zeigte die Analyse des Metabolismus, dass das Pathogen den TCA Zyklus der Wirtszelle umleitet, um die Pyrimidinbiosynthese zu unterstu¨tzen. Die Zugabe von Pyrimidinen oder α-Ketoglutarat hilft den Bakterien den Status der Persistenz teilweise zu u¨berwinden. Zusammengenommen deuten die Ergebnisse auf eine zentrale Rolle der c-Myc induzierten Umprogrammierung des Glutaminmetabolismus und des Glutamins selbst fu¨r die Entwicklung von C. trachomatis hin. Diese Befunde k¨onnten eine Basis fu¨r Strategien gegen eine Infektion darstellen. Weiterhin stellen sie die seit langem bestehende Hypothese des Trypotphanmangels als alleiniger Grund fu¨r die von Interferon-γ induzierte Persistenz in Frage und legen eine zentrale Rolle von c-Myc bei der Kontrolle der C. trachomatis Dormanz nahe. KW - Chlamydia trachomatis KW - Persistence KW - trachomatis KW - chlamydia Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-203655 ER - TY - THES A1 - Mayer, Alexander E. T1 - Protein kinase D3 signaling in the regulation of liver metabolism T1 - Proteinkinase D3 Signalwirkung in der Regulation des Leberstoffwechsels N2 - The liver plays a pivotal role in maintaining energy homeostasis. Hepatic carbohydrate and lipid metabolism are tightly regulated in order to adapt quickly to changes in nutrient availability. Postprandially, the liver lowers the blood glucose levels and stores nutrients in form of glycogen and triglycerides (TG). In contrast, upon fasting, the liver provides glucose, TG, and ketone bodies. However, obesity resulting from a discrepancy in food intake and energy expenditure leads to abnormal fat accumulation in the liver, which is associated with the development of hepatic insulin resistance, non-alcoholic fatty liver disease, and diabetes. In this context, hepatic insulin resistance is directly linked to the accumulation of diacylglycerol (DAG) in the liver. Besides being an intermediate product of TG synthesis, DAG serves as second messenger in response to G-protein coupled receptor signaling. Protein kinase D (PKD) family members are DAG effectors that integrate multiple metabolic inputs. However, the impact of PKD signaling on liver physiology has not been studied so far. In this thesis, PKD3 was identified as the predominantly expressed isoform in liver. Stimulation of primary hepatocytes with DAG as well as high-fat diet (HFD) feeding of mice led to an activation of PKD3, indicating its relevance during obesity. HFD-fed mice lacking PKD3 specifically in hepatocytes displayed significantly improved glucose tolerance and insulin sensitivity. However, at the same time, hepatic deletion of PKD3 in mice resulted in elevated liver weight as a consequence of increased hepatic lipid accumulation. Lack of PKD3 in hepatocytes promoted sterol regulatory element-binding protein (SREBP)-mediated de novo lipogenesis in vitro and in vivo, and thus increased hepatic triglyceride and cholesterol content. Furthermore, PKD3 suppressed the activation of SREBP by impairing the activity of the insulin effectors protein kinase B (AKT) and mechanistic target of rapamycin complexes (mTORC) 1 and 2. In contrast, liver-specific overexpression of constitutive active PKD3 promoted glucose intolerance and insulin resistance. Taken together, lack of PKD3 improves hepatic insulin sensitivity but promotes hepatic lipid accumulation. For this reason, manipulating PKD3 signaling might be a valid strategy to improve hepatic lipid content or insulin sensitivity. However, the exact molecular mechanism by which PKD3 regulates hepatocytes metabolism remains unclear. Unbiased proteomic approaches were performed in order to identify PKD3 phosphorylation targets. In this process, numerous potential targets of PKD3 were detected, which are implicated in different aspects of cellular metabolism. Among other hits, phenylalanine hydroxylase (PAH) was identified as a target of PKD3 in hepatocytes. PAH is the enzyme that is responsible for the conversion of phenylalanine to tyrosine. In fact, manipulation of PKD3 activity using genetic tools confirmed that PKD3 promotes PAH-dependent conversion of phenylalanine to tyrosine. Therefore, the data in this thesis suggests that PKD3 coordinates lipid and amino acid metabolism in the liver and contributes to the development of hepatic dysfunction. N2 - Die Leber spielt eine zentrale Rolle bei der Aufrechterhaltung der Energiehomöostase. Der hepatische Kohlenhydrat- und Fettstoffwechsel ist stark reguliert, um sich schnell an Veränderungen in der Nährstoffverfügbarkeit anzupassen. Die Leber senkt postprandial den Blutzuckerspiegel und speichert Nährstoffe in Form von Glykogen und Triglyzeriden (TG). Im Gegensatz dazu stellt die Leber beim Fasten Glukose, TG und Ketonkörper bereit. Fettleibigkeit, welche aus einer Diskrepanz zwischen Nahrungsaufnahme und Energieaufwand resultiert, führt allerdings zu einer abnormalen Fettansammlung in der Leber, die mit der Entwicklung von Leberinsulinresistenz, nicht-alkoholischen Fettlebererkrankungen und Diabetes einhergeht. Hepatische Insulinresistenz steht dabei in direktem Zusammenhang mit der Akkumulation von Diacylglycerol (DAG) in der Leber. DAG ist nicht nur ein Zwischenprodukt der TG-Synthese, sondern dient auch als sekundärer Messenger im G-Protein-gekoppelten Rezeptor-Signalweg. Die Mitglieder der Proteinkinase D (PKD)-Familie sind DAG-Effektoren, die vielfache metabolische Inputs integrieren. Jedoch wurden die Auswirkungen der PKD-Signalwirkung auf die Leberphysiologie bisher nicht untersucht. Im Rahmen dieser Thesis wurde PKD3 als die in der Leber überwiegend exprimierte Isoform identifiziert. Die Stimulation von primären Hepatozyten mit DAG sowie die Fütterung von Mäusen mit fettreicher Nahrung (HFD) führte zu einer Aktivierung von PKD3, was auf eine Relevanz von PKD3 bei Fettleibigkeit hinweist. Mäusen, welchen PKD3 spezifisch in Hepatozyten fehlte und mit HFD gefüttert wurden, zeigten eine deutlich verbesserte Glukosetoleranz und Insulinsensitivität. Gleichzeitig führte jedoch die hepatische Deletion von PKD3 bei Mäusen zu einem erhöhten Lebergewicht in Folge einer erhöhten Lipidakkumulation in der Leber. Das Fehlen von PKD3 in Hepatozyten förderte die Sterol Regulatory Element-Binding Protein (SREBP)-vermittelte de novo Lipogenese in vitro und in vivo und erhöhte damit den Gehalt an Triglyceriden und Cholesterol in der Leber. Darüber hinaus supprimierte PKD3 die Aktivierung von SREBP, indem es die Aktivität der Insulin-Effektoren Proteinkinase B (AKT) und mechanistisches Ziel von Rapamycin- Komplexen (mTORC) 1 und 2 verminderte. Im Gegensatz dazu förderte die leberspezifische Überexpression von konstitutiv aktiver PKD3 die Glukoseintoleranz und Insulinresistenz. Zusammenfassend verbessert der Mangel an PKD3 die hepatische Insulinempfindlichkeit, aber fördert gleichzeitig die Akkumulation von Lipiden in der Leber. Aus diesem Grund könnte das Eingreifen in den PKD3-Signalweg eine gute Strategie zur Verbesserung des hepatischen Lipidgehalts oder der Insulinempfindlichkeit sein. Allerdings bleibt der genaue molekulare Mechanismus, mit dem PKD3 den Stoffwechsel von Hepatozyten reguliert, unklar. Es wurden unvoreingenommene proteomische Ansätze durchgeführt, um PKD3- Phosphorylierungsziele zu identifizieren. In diesem Prozess wurden zahlreiche potenzielle Ziele von PKD3 entdeckt, welche in den verschiedensten Aspekten des Zellstoffwechsels involviert sind. Unter anderem wurde Phenylalaninhydroxylase (PAH) als Ziel von PKD3 in Hepatozyten identifiziert. PAH ist das Enzym, welches für die Umwandlung von Phenylalanin in Tyrosin verantwortlich ist. Tatsächlich bestätigte die Manipulation der PKD3-Aktivität mit Hilfe von genetischen Werkzeugen, dass PKD3 die PAH-abhängige Umwandlung von Phenylalanin in Tyrosin fördert. Deswegen legen die Daten in dieser Arbeit nahe, dass PKD3 den Lipid- und Aminosäurestoffwechsel in der Leber koordiniert und zur Entwicklung von Leber- Dysfunktion beiträgt. KW - Metabolismus KW - Proteinkinase D KW - Leber-Metabolismus Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-207978 ER - TY - THES A1 - Herz, Michaela T1 - Genome wide expression profiling of Echinococcus multilocularis T1 - Genomweite Expressionsanalysen von Echinococcus multilocularis N2 - Alveolar echinococcosis, which is caused by the metacestode stage of the small fox tapeworm Echinococcus multilocularis, is a severe zoonotic disease with limited treatment options. For a better understanding of cestode biology the genome of E. multilocularis, together with other cestode genomes, was sequenced previously. While a few studies were undertaken to explore the E. multilocularis transcriptome, a comprehensive exploration of global transcription profiles throughout life cycle stages is lacking. This work represents the so far most comprehensive analysis of the E. multilocularis transcriptome. Using RNA-Seq information from different life cycle stages and experimental conditions in three biological replicates, transcriptional differences were qualitatively and quantitatively explored. The analyzed datasets are based on samples of metacestodes cultivated under aerobic and anaerobic conditions as well as metacestodes obtained directly from infected jirds. Other samples are stem cell cultures at three different time points of development as well as non-activated and activated protoscoleces, the larval stage that can develop into adult worms. In addition, two datasets of metacestodes under experimental conditions suitable for the detection of genes that are expressed in stem cells, the so-called germinative cells, and one dataset from a siRNA experiment were analyzed. Analysis of these datasets led to expression profiles for all annotated genes, including genes that are expressed in the tegument of metacestodes and play a role in host-parasite interactions and modulation of the host's immune response. Gene expression profiles provide also further information about genes that might be responsible for the infiltrative growth of the parasite in the liver. Furthermore, germinative cell-specific genes were identified. Germinative cells are the only proliferating cells in E. multilocularis and therefore of utmost importance for the development and growth of the parasite. Using a combination of germinative cell depletion and enrichment methods, genes with specific expression in germinative cells were identified. As expected, many of these genes are involved in translation, cell cycle regulation or DNA replication and repair. Also identified were transcription factors, many of which are involved in cell fate commitment. As an example, the gene encoding the telomerase reverse transcriptase (TERT) was studied further. Expression of E. multilocularis tert in germinative cells was confirmed experimentally. Cell culture experiments indicate that TERT is required for proliferation and development of the parasite, which makes TERT a potentially interesting drug target for chemotherapy of alveolar echinococcosis. Germinative cell specific genes in E. multilocularis also include genes of densoviral origin. More than 20 individual densovirus loci with information for non-structural and structural densovirus proteins were identified in the E. multilocularis genome. Densoviral elements were also detected in many other cestode genomes. Genomic integration of these elements suggests that densovirus-based vectors might be suitable tools for genetic manipulation of tapeworms. Interestingly, only three of more than 20 densovirus loci in the E. multilocularis genome are expressed. Since the canonical piRNA pathway is lacking in cestodes, this raises the question about potential silencing mechanisms. Exploration of RNA-Seq information indicated natural antisense transcripts as a potential gene regulation mechanism in E. multilocularis. Preliminary experiments further suggest DNA-methylation, which was previously shown to occur in platyhelminthes, as an interesting avenue to explore in future. The transcriptome datasets also contain information about genes that are expressed in differentiated cells, for example the serotonin transporter gene that is expressed in nerve cells. Cell culture experiments indicate that serotonin and serotonin transport play an important role in E. multilocularis proliferation, development and survival. Overall, this work provides a comprehensive transcription data atlas throughout the E. multilocularis life cycle. Identification of germinative cell-specific genes and genes important for host-parasite interactions will greatly facilitate future research. A global overview of gene expression profiles will also aide in the detection of suitable drug targets and the development of new chemotherapeutics against alveolar echinococcosis. N2 - Alveoläre Echinokokkose wird durch das Metazestodenstadium des kleinen Fuchsbandwurms Echinococcus multilocularis verursacht und medizinisch als eine schwere Zoonose mit begrenzten Behandlungsmöglichkeiten betrachtet. Um ein besseres Verständnis für die Biologie der Zestoden zu erlangen, wurde das Genom von E. multilocularis, zusammen mit denen anderer Zestoden, bereits sequenziert. Bisher wurden nur wenige Studien zum Transkriptom von E. multilocularis durchgeführt und eine umfassende Analyse der Transkriptionsprofile über verschiedene Stadien des Lebenszyklus hinweg fehlt bislang. Diese Arbeit stellt die bisher umfassendste Untersuchung des Transkriptoms von E. multilocularis dar. Unterschiede in der Genexpression in verschiedenen Stadien des Lebenszyklus und unter experimentellen Bedingungen wurden qualitativ und quantitativ untersucht. Dazu wurden Daten aus RNA-Sequenzierungen in drei biologischen Replikaten verwendet. Die untersuchten Datensätze beruhen auf Proben von Metazestoden, die unter aeroben und anaeroben Bedingungen kultiviert, sowie von Metazestoden, die direkt aus Gerbilen isoliert wurden. Weitere Proben umfassen Stammzellkulturen zu drei verschiedenen Entwicklungszeitpunkten sowie nicht-aktivierte und aktivierte Protoskolizes, das Larvenstadium das sich zu Adulten entwickeln kann. Zusätzlich wurden zwei Datensätze von Metazestoden unter experimentellen Bedingungen, die zur Identifizierung stammzellspezifischer (keimzellspezifischer) Gene geeignet sind, sowie ein Datensatz von einem siRNA-Experiment untersucht. Die Analyse dieser Datensätze führte zu Genexpressionsprofilen für alle annotierten Gene, unter anderem für Gene, die im Tegument des Metazestoden exprimiert werden und eine Rolle spielen bei Wirt-Parasit-Interaktionen und der Modulierung der Immunantwort des Wirts. Genexpressionsprofile liefern zudem Informationen über Gene, die für das infiltrative Wachstum des Parasiten in der Leber verantwortlich sein könnten. Des Weiteren wurden keimzellspezifische Gene identifiziert. Keimzellen sind die einzigen proliferierenden Zellen in E. multilocularis und daher von essentieller Bedeutung für die Entwicklung und das Wachstum des Parasiten. Durch eine Kombination von Keimzelldepletierungs- und Keimzellanreicherungsverfahren wurden Gene mit keimzellspezifischer Expression identifiziert. Wie erwartet, sind viele dieser Gene in der Translation, der Zellzyklusregulation oder DNA-Replikation und –Reparatur involviert. Darüber hinaus wurden keimzellspezifisch exprimierte Transkriptionsfaktoren detektiert, von denen viele in der Festlegung des Zellschicksals eine Rolle spielen. Als Beispiel eines keimzellspezifischen Genes wurde das Gen, das für die reverse Transkriptase (TERT) kodiert, genauer untersucht. Die Expression von E. multilocularis tert in Keimzellen wurde experimentell bestätigt. Zellkulturexperimente weisen darauf hin, dass TERT für die Proliferation und die Entwicklung essentiell ist. TERT ist daher ein potentiell interessantes Wirkstofftarget für die chemotherapeutische Behandlung der alveolären Echinokokkose. Zu den keimzellspezifischen Genen in E. multilocularis gehören auch Gene densoviralen Ursprungs. Es wurden mehr als 20 Densovirusloci mit Informationen für nicht-strukturelle und strukturelle Densovirusproteine im E. multilocularis-Genom identifiziert. Densovirale Elemente wurden auch in vielen anderen Zestodengenomen detektiert. Die genomische Integration dieser Elemente deutet darauf hin, dass densovirus-basierte Vektoren zur genetischen Manipulation von Zestoden geeignet sein könnten. Interessanterweise sind nur drei von mehr als 20 Densovirusloci im E. multilocularis-Genom exprimiert. Da es in Zestoden keinen kanonischen piRNA-Signalweg gibt, stellt sich die Frage nach möglichen Genabschaltungsmechanismen. Die Analyse der RNA-Sequenzierdaten ergab Hinweise auf natürliche Antisense-Transkripte als einen möglichen Genregulationsmechanismus in E. multilocularis. Vorläufige Experimente und bisherige Studien deuten weiterhin darauf hin, dass DNA-Methylierung ein Mechanismus der Genregulation und -abschaltung in Zestoden sein könnte. Die Transkriptionsdaten enthalten auch Informationen zu Genen, die in differenzierten Zellen exprimiert werden, wie zum Beispiel das Serotonintransportergen, das in Nervenzellen exprimiert wird. Zellkulturversuche weisen darauf hin, dass Serotonin und Serotonintransport eine wichtige Rolle bei der Proliferation, der Entwicklung und dem überleben von E. multilocularis spielen. Insgesamt bietet diese Arbeit einen umfassenden Transkriptionsdatenatlas über die Stadien des Lebenszyklus von E. multilocularis. Die Identifizierung von keimzellspezifischen Genen und Genen, die für die Interaktion zwischen Wirt und Parasit wichtig sind, wird die zukünftige Forschung erheblich erleichtern. Ein globaler Überblick über die Genexpressionsprofile wird zudem hilfreich sein bei der Entdeckung geeigneter Wirkstofftargets und bei der Entwicklung neuer Chemotherapeutika gegen die alveoläre Echinokokkose. KW - Fuchsbandwurm KW - Serotonin KW - Telomerase KW - Stammzelle KW - Transkriptomanalyse KW - foxtapeworm KW - transcriptome data analysis KW - germinative cell Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-203802 ER - TY - THES A1 - Liess [née Eller], Anna Katharina Luise T1 - Understanding the regulation of the ubiquitin-conjugating enzyme UBE2S T1 - Die Regulation des Ubiquitin-konjugierenden Enzyms UBE2S N2 - The ubiquitination of proteins serves as molecular signal to control an enormous number of physiological processes and its dysregulation is connected to human diseases like cancer. The versatility of this signal stems from the diverse ways by which ubiquitin can be attached to its targets. Thus, specificity and tight regulation of the ubiquitination are pivotal requirements of ubiquitin signaling. Ubiquitin-conjugating enzymes (E2s) act at the heart of the ubiquitination cascade, transferring ubiquitin from a ubiquitin-activating enzyme (E1) to a ubiquitin ligase (E3) or substrate. When cooperating with a RING-type E3, ubiquitin-conjugating enzymes can determine linkage specificity in ubiquitin chain formation. Our understanding of the regulation of E2 activities is still limited at a structural level. The work described here identifies two regulation mechanisms in UBE2S, a cognate E2 of the human RING-type E3 anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C). UBE2S elongates ubiquitin chains on APC/C substrates in a Lys11 linkage-specific manner, thereby targeting these substrates for degradation and driving mitotic progression. In addition, UBE2S was found to have a role in DNA repair by enhancing non-homologous end-joining (NHEJ) and causing transcriptional arrest at DNA damage sites in homologous recombination (HR). Furthermore, UBE2S overexpression is a characteristic feature of many cancer types and is connected to poor prognosis and diminished response to therapy. The first regulatory mechanism uncovered in this thesis involves the intramolecular auto-ubiquitination of a particular lysine residue (Lys+5) close to the active site cysteine, presumably through conformational flexibility of the active site region. The Lys+5-linked ubiquitin molecule adopts a donor-like, ‘closed’ orientation towards UBE2S, thereby conferring auto-inhibition. Notably, Lys+5 is a major physiological ubiquitination site in ~25% of the human E2 enzymes, thus providing regulatory opportunities beyond UBE2S. Besides the active, monomeric state and the auto-inhibited state caused by auto-ubiquitination, I discovered that UBE2S can adopt a dimeric state. The latter also provides an auto-inhibited state, in which ubiquitin transfer is blocked via the obstruction of donor binding. UBE2S dimerization is promoted by its unique C-terminal extension, suppresses auto-ubiquitination and thereby the proteasomal degradation of UBE2S. Taken together, the data provided in this thesis illustrate the intricate ways by which UBE2S activity is fine-tuned and the notion that structurally diverse mechanisms have evolved to restrict the first step in the catalytic cycle of E2 enzymes. N2 - Die Ubiquitinierung von Proteinen fungiert als molekulares Signal zur Kontrolle einer Vielzahl physiologischer Prozesse, wobei eine gestörte Regulation der Ubiquitinierung eng mit zahlreichen Erkrankungen, wie beispielsweise Krebs, verbunden ist. Aufgrund der verschiedenen Verknüpfungsmöglichkeiten von Ubiquitin, die das zelluläre Schicksal des Zielproteins bestimmen, sind Spezifität und stringente Regulation unabkömmliche Voraussetzungen im Ubiquitinierungsprozess. Ubiquitin-konjugierende Enzyme (E2s) fungieren in der Mitte der Ubiquitinierungskaskade. Sie übernehmen ein Ubiquitinmolekül vom Ubiquitin-aktivierenden Enzym (E1) und übertragen es auf eine Ubiquitin-Ligase (E3) oder direkt auf das Zielprotein. Arbeiten Ubiquitin-konjugierende Enzyme mit E3s des RING-Typus zusammen, so bestimmen E2s die Art der Verknüpfung. Die Regulation der Aktivität Ubiquitin-konjugierender Enzyme auf struktureller Ebene ist jedoch bisher nur bedingt verstanden. Die hier dargelegte Arbeit umfasst die Identifizierung zweier Regulationsmechanismen des Ubiquitin-konjugierenden Enzyms UBE2S. UBE2S arbeitet mit einem humanen E3 des RING-Typus‚ dem ‚Anaphase Promoting Complex/Cyclosome‘ (APC/C) zusammen und bildet Lys11-spezifische Ubiquitinketten auf Substraten des APC/Cs. Hierdurch werden die Substrate für den Abbau durch das Proteasom markiert, was das Fortschreiten der Mitose bedingt. Zusätzlich wird UBE2S eine Rolle in der DNS-Reparatur zugeschrieben. Hierbei verstärkt UBE2S die nicht-homologe Rekombination (NHEJ) und verhindert außerdem die Transkription an DNS-Bruchstellen, die durch Homologe Rekombination (HR) repariert werden. Die Überexpression von UBE2S ist ein Charakteristikum verschiedenster Krebsarten, vermindert den Erfolg herkömmlicher Krebstherapien, und führt somit zu schlechten Prognosen für betroffenen Patienten. Der erste hier beschriebene Regulationsmechanismus beinhaltet die intramolekulare Ubiquitinierung eines Lysins (Lys+5) nahe des katalytischen Cysteins, mutmaßlich durch strukturelle Flexibilität der Region des aktiven Zentrums. Das Lys+5-verknüpfte Ubiquitin nimmt eine Donorubiquitin-ähnliche Position auf UBE2S ein, wodurch UBE2S gehemmt wird. Da ein Lysin an der Position +5 in ~25% der humanen E2-Enzyme vorhanden und eine physiologische Ubiquitinierungsstelle ist, birgt dieser Mechanismus Regulationsmöglichkeiten über UBE2S hinaus. Zusätzlich zum aktiven monomeren Zustand und dem durch Autoubiquitinierung ausgelösten inhibierten Zustand, kann UBE2S auch als Dimer vorliegen. In diesem Zustand ist es ebenfalls inaktiv, da die Donorubiquitin-Bindestelle auf UBE2S durch ein zweites Molekül des E2s blockiert wird. Begünstigt wird die Dimerisierung durch die C-terminale Verlängerung von UBE2S und verhindert so deren Autoubiquitinierung, und folglich den proteasomalen Abbau von UBE2S. Es handelt sich hierbei somit um einen zweiten Regulationsmechanismus von UBE2S. Zusammenfassend veranschaulichen die in dieser Arbeit dargelegten Daten die komplexen Möglichkeiten, durch die die Aktivität von UBE2S reguliert werden kann, sowie die Erkenntnis, dass strukturell unterschiedliche Mechanismen existieren, um den ersten Schritt der von Ubiquitin-konjugierenden Enzymen katalysierten Reaktion zu hemmen. KW - E2 KW - Regulation KW - Ubiquitin KW - Mechanismus KW - UBE2S KW - structural mechanism KW - Ubiquitin-conjugating enzyme KW - regulation Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-204190 ER - TY - THES A1 - Dannhäuser, Sven T1 - Function of the Drosophila adhesion-GPCR Latrophilin/CIRL in nociception and neuropathy T1 - Funktionelle Rolle des Drosophila aGPCR Latrophilin/CIRL in Nozizeption und Neuropathie N2 - Touch sensation is the ability to perceive mechanical cues which is required for essential behaviors. These encompass the avoidance of tissue damage, environmental perception, and social interaction but also proprioception and hearing. Therefore research on receptors that convert mechanical stimuli into electrical signals in sensory neurons remains a topical research focus. However, the underlying molecular mechanisms for mechano-metabotropic signal transduction are largely unknown, despite the vital role of mechanosensation in all corners of physiology. Being a large family with over 30 mammalian members, adhesion-type G protein-coupled receptors (aGPCRs) operate in a vast range of physiological processes. Correspondingly, diverse human diseases, such as developmental disorders, defects of the nervous system, allergies and cancer are associated with these receptor family. Several aGPCRs have recently been linked to mechanosensitive functions suggesting, that processing of mechanical stimuli may be a common feature of this receptor family – not only in classical mechanosensory structures. This project employed Drosophila melanogaster as the candidate to analyze the aGPCR Latrophilin/dCIRL function in mechanical nociception in vivo. To this end, we focused on larval sensory neurons and investigated molecular mechanisms of dCIRL activity using noxious mechanical stimuli in combination with optogenetic tools to manipulate second messenger pathways. In addition, we made use of a neuropathy model to test for an involvement of aGPCR signaling in the malfunctioning peripheral nervous system. To do so, this study investigated and characterized nocifensive behavior in dCirl null mutants (dCirlKO) and employed genetically targeted RNA-interference (RNAi) to cell-specifically manipulate nociceptive function. The results revealed that dCirl is transcribed in type II class IV peripheral sensory neurons – a cell type that is structurally similar to mammalian nociceptors and detects different nociceptive sensory modalities. Furthermore, dCirlKO larvae showed increased nocifensive behavior which can be rescued in cell specific reexpression experiments. Expression of bPAC (bacterial photoactivatable adenylate cyclase) in these nociceptive neurons enabled us to investigate an intracellular signaling cascade of dCIRL function provoked by light-induced elevation of cAMP. Here, the findings demonstrated that dCIRL operates as a down-regulator of nocifensive behavior by modulating nociceptive neurons. Given the clinical relevance of this results, dCirl function was tested in a chemically induced neuropathy model where it was shown that cell specific overexpression of dCirl rescued nocifensive behavior but not nociceptor morphology. N2 - Der Tastsinn ist die Fähigkeit, mechanische Reize wahrzunehmen, die für essentielle Verhaltensweisen notwendig sind. Dazu gehören die Vermeidung von Gewebsschädigungen, die Wahrnehmung der Umwelt und soziale Interaktion, aber auch die Propriozeption und das Hören. Daher bleibt die Forschung an Rezeptoren, die mechanische Reize in sensorischen Neuronen in elektrische Signale umwandeln, ein aktueller Forschungsschwerpunk. Die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen für die mechanometabotrope Signalübertragung sind trotz der wesentlichen Rolle des Tastsinns in allen Bereichen der Physiologie weitgehend unbekannt. Adhäsions G-Protein gekoppelte Rezeptoren (aGPCRs), eine große Molekülfamilie mit über 30 Vertretern im Menschen, sind an einer Vielzahl von physiologischen Prozessen beteiligt. Demzufolge wird ein Zusammenhang zwischen diesen Rezeptoren und verschiedenen Erkrankungen des Menschen, wie z. B. Entwicklungsstörungen, Defekte des Nervensystems, Allergien und Krebs, angenommen. Mehrere aGPCRs wurden kürzlich mit mechanosensitiven Funktionen in Verbindung gebracht, was darauf hindeutet, dass die Verarbeitung mechanischer Reize ein gemeinsames Merkmal dieser Rezeptorfamilie ist – nicht nur in klassischen mechanosensorischen Strukturen. In diesem Projekt wurde Drosophila melanogaster verwendet, um die Funktion des aGPCR-Latrophilin/dCIRL in der mechanischen Nozizeption in vivo zu analysieren. Zu diesem Zweck konzentriert sich diese Arbeit auf mechano-sensorische Neurone (Typ II Klasse IV) der Fruchtfliegenlarve, um die molekularen Mechanismen der dCIRL-Aktivität zu untersuchen. Hierzu wurden noxische mechanische Reize in Kombination mit optogenetischen Werkzeugen, zur Manipulation der Second-Messenger-Signalübertragung, herangezogen. Zusätzlich wurde ein Neuropathie-Modell etabliert, um eine Beteiligung des aGPCRs dCIRL am beeinträchtigten peripheren Nervensystem zu testen. Zu diesem Zweck untersucht und charakterisiert diese Studie das nozizeptive Verhalten in dCirl-Nullmutanten (dCirlKO) und die RNA-Interferenz (RNAi) Methode, um zellspezifische Manipulationen auszuführen. Die Ergebnisse zeigen, dass dCirl in spezifischen peripheren sensorischen Neuronen (C4da) transkribiert wird - ein Zelltyp, der Nozizeptoren in Säugern strukturell ähnlich ist und verschiedene nozizeptive sensorische Modalitäten vermittelt. Darüber hinaus zeigen dCirlKO-Larven ein erhöhtes nozizeptives Verhalten, welches mittels zellspezifischer Reexpression gerettet werden kann. Die Expression von bPAC (bakterielle photoaktivierbare Adenylatcyclase) in diesen nozizeptiven Neuronen ermöglichte es, intrazelluläre Signalkaskaden von CIRL zu untersuchen, welche durch lichtinduzierte Erhöhung von cAMP angeregt werden. Dieser Versuch zeigt, dass dCIRL durch die Modulation nozizeptiver Neuronen eine Herabregulation des nozizeptiven Verhaltens bewirkt. Angesichts der klinischen Relevanz dieses Ergebnisses wurde die dCirl-Funktion in einem chemisch induzierten Neuropathie-Modell getestet. Dabei stellte sich heraus, dass zellspezifische Überexpression von dCirl eine ausgeprägte Hyperalgesie reduziert, morphologische Schädigungen hingegen nicht gerettet werden konnten. KW - Drosophila KW - Fluoreszenzmikroskopie KW - Nozizeption KW - Neuropathie KW - nociception KW - neuropathy KW - adhesion-GPCR KW - aGPCR KW - dCIRL KW - Latrophilin Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-201580 ER - TY - THES A1 - Gründl, Marco T1 - Biochemical characterization of the MMB-Hippo crosstalk and its physiological relevance for heart development T1 - Biochemische Charakterisierung des MMB-Hippo Signalweges und dessen physiologische Rolle in der Herzentwicklung N2 - The Myb-MuvB (MMB) complex plays an essential role in the time-dependent transcriptional activation of mitotic genes. Recently, our laboratory identified a novel crosstalk between the MMB-complex and YAP, the transcriptional coactivator of the Hippo pathway, to coregulate a subset of mitotic genes (Pattschull et al., 2019). Several genetic studies have shown that the Hippo-YAP pathway is essential to drive cardiomyocyte proliferation during cardiac development (von Gise et al., 2012; Heallen et al., 2011; Xin et al., 2011). However, the exact mechanisms of how YAP activates proliferation of cardiomyocytes is not known. This doctoral thesis addresses the physiological role of the MMB-Hippo crosstalk within the heart and characterizes the YAP-B-MYB interaction with the overall aim to identify a potent inhibitor of YAP. The results reported in this thesis indicate that complete loss of the MMB scaffold protein LIN9 in heart progenitor cells results in thinning of ventricular walls, reduced cardiomyocyte proliferation and early embryonic lethality. Moreover, genetic experiments using mice deficient in SAV1, a core component of the Hippo pathway, and LIN9-deficient mice revealed that the correct function of the MMB complex is critical for proliferation of cardiomyocytes due to Hippo-deficiency. Whole genome transcriptome profiling as well as genome wide binding studies identified a subset of Hippo-regulated cell cycle genes as direct targets of MMB. By proximity ligation assay (PLA), YAP and B-MYB were discovered to interact in embryonal cardiomyocytes. Biochemical approaches, such as co-immunoprecipitation assays, GST-pulldown assays, and µSPOT-based peptide arrays were employed to characterize the YAP-B-MYB interaction. Here, a PY motif within the N-terminus of B-MYB was found to directly interact with the YAP WW-domains. Consequently, the YAP WW-domains were important for the ability of YAP to drive proliferation in cardiomyocytes and to activate MMB target genes in differentiated C2C12 cells. The biochemical information obtained from the interaction studies was utilized to develop a novel competitive inhibitor of YAP called MY-COMP (Myb-YAP competition). In MY-COMP, the protein fragment of B-MYB containing the YAP binding domain is fused to a nuclear localization signal. Co-immunoprecipitation studies as well as PLA revealed that the YAP-B-MYB interaction is robustly blocked by expression of MY-COMP. Adenoviral overexpression of MY-COMP in embryonal cardiomyocytes suppressed entry into mitosis and blocked the pro-proliferative function of YAP. Strikingly, characterization of the cellular phenotype showed that ectopic expression of MY-COMP led to growth defects, nuclear abnormalities and polyploidization in HeLa cells. Taken together, the results of this thesis reveal the mechanism of the crosstalk between the Hippo signaling pathway and the MMB complex in the heart and form the basis for interference with the oncogenic activity of the Hippo coactivator YAP. N2 - Der Myb-MuvB Komplex spielt eine essenzielle Rolle in der transkriptionellen Aktivierung von Zellzyklusgenen. Unser Labor hat kürzlich einen bis dahin unbekannten Mechanismus zwischen dem MMB-Komplex und Hippo-YAP Signalweg, der zur Aktivierung von Mitosegenen beiträgt, identifiziert. Der Hippo-YAP Signalweg ist beteiligt an der Gewebehomöostase und am Wachstum von Organen. So reguliert der Hippo-YAP Signalweg zum Beispiel während der Herzentwicklung die Proliferation von Herzmuskelzellen. Der exakte Mechanismus wie YAP die Zellteilung von Kardiomyozyten aktiviert, ist jedoch bisher nicht bekannt. In der vorliegenden Doktorarbeit wird das Zusammenspiel zwischen dem Hippo-Signalweg und dem MMB-Komplex im Herzen untersucht. Außerdem wird die Interaktion zwischen YAP und B-MYB biochemisch charakterisiert, um einen Inhibitor zu entwickeln, der die Aktivität von YAP vermindert. Die Ergebnisse dieser Doktorarbeit zeigen, dass der Verlust der zentralen Untereinheit des MMB-Komplexes, LIN9, in Vorläuferzellen der Kardiomyozyten zu einer Reduktion der Herzwand sowie zu einer niedrigeren Proliferationsrate von Herzmuskelzellen und einer erhöhten Embryonalsterblichkeit führt. Außerdem wurde in genetischen Experimenten mit Hippo- und LIN9-defizienten Mäusen gezeigt, dass der MMB-Komplex wichtig für die Aktivierung der Proliferation in Hippo-defizienten Kardiomyozyten ist. Eine globale Analyse der Transkription und Chromatinbindung von YAP und LIN9 im Herzen zeigte, dass eine Untergruppe von Zellzyklusgenen, die nach Inaktivierung des Hippo-Signalwegs vermehrt exprimiert werden, gleichzeitig den MMB-Komplex am Promoter gebunden haben. Durch Interaktionsstudien konnte gezeigt werden, dass YAP und B-MYB in embryonalen Kardiomyozyten miteinander interagieren. Die Bindung der beiden Transkriptionsfaktoren wurde durch Co-Immunpräzipitation, GST-Pulldown-Analysen und Peptid-Arrays biochemisch untersucht. Dabei wurde gezeigt, dass ein PY-Motiv im N-terminus von B-MYB direkt an die WW-Domänen von YAP bindet. Im Umkehrschluss wurde festgestellt, dass die WW-Domänen von YAP essenziell sind, um sowohl die Proliferation in Herzmuskelzellen als auch die Expression von Mitosegenen in differenzierten C2C12 Zellen zu aktivieren. Letztendlich wurden die Ergebnisse der Interaktionsstudie genutzt, um einen neuartigen kompetitiven Inhibitor von YAP zu entwickeln. Für MY-COMP (Myb-YAP Competition) wurde der Proteinabschnitt von B-MYB, der die YAP Bindedomäne enthält, mit einer Kernlokalisierungssequenz fusioniert. Bindestudien zeigten, dass MY-COMP die Interaktion zwischen YAP und B-MYB effektiv blockiert. Eine durch Adenoviren vermittelte Überexpression von MY-COMP in embryonalen Herzmuskelzellen resultierte in einer verminderten Anzahl von mitotischen Zellen. Somit wird durch Expression von MY-COMP, die proliferative Fähigkeit von YAP vermindert. Interessanterweise wurden in HeLa Zellen, die mit MY-COMP behandelt wurden, vermehrt Abnormalitäten der Zellkerne, polyploide Zellen sowie ein Wachstumsdefizit beobachtet. Zusammengefasst verdeutlichen die Ergebnisse dieser Doktorarbeit die Bedeutung des Zusammenspiels zwischen dem MMB-Komplex und dem Hippo-YAP-Signalweg für die Herzentwicklung und bilden die Grundlage, für die effektive Inhibierung der onkogenen Eigenschaften des Hippo-Coaktivators YAP. KW - Zellzyklus KW - Heart development KW - Hippo pathway KW - Myb-MuvB complex KW - Cardiomyocyte Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-213328 ER - TY - THES A1 - Becker, Isabelle Carlotta T1 - The role of megakaryocytes and platelets in vascular and osteogenic development T1 - Die Rolle von Megakaryozyten und Thrombozyten in vaskulärer und osteogener Entwicklung N2 - Platelets, small anucleate cell fragments in the blood stream, derive from large precursor cells, so-called megakaryocytes (MK) residing in the bone marrow (BM). In addition to their role in wound healing, platelets have been shown to play a significant role during inflammatory bleeding. Above all, the immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM) receptors GPVI as well as CLEC-2 have been identified as main regulators of vascular integrity. In addition to ITAM-bearing receptors, our group identified GPV as another potent regulator of hemostasis and thrombosis. Surprisingly, concomitant lack of GPV and CLEC-2 deteriorated blood-lymphatic misconnections observed in Clec2-/- mice resulting in severe edema formation and intestinal inflammation. Analysis of lymphatic and vascular development in embryonic mesenteries revealed severely defective blood-lymph-vessel separation, which translated into thrombocytopenia and increased vascular permeability due to reduced tight junction density in mesenteric blood vessels and consequent leakage of blood into the peritoneal cavity. Recently, platelet granule release has been proposed to ameliorate the progression of retinopathy of prematurity (ROP), a fatal disease in newborns leading to retinal degradation. The mechanisms governing platelet activation in this process remained elusive nonetheless, which prompted us to investigate a possible role of ITAM signaling. In the second part of this thesis, granule release during ROP was shown to be GPVI- and partly CLEC-2-triggered since blockade or loss of these receptors markedly deteriorated ROP progression. Proplatelet formation from MKs is highly dependent on a functional microtubule and actin cytoskeleton, the latter of which is regulated by several actin-monomer binding proteins including Cofilin1 and Twinfilin1 that have been associated with actin-severing at pointed ends. In the present study, a redundancy between both proteins especially important for the guided release of proplatelets into the bloodstream was identified, since deficiency in both proteins markedly impaired MK functionality mainly due to altered actin-microtubule crosstalk. Besides ITAM-triggered activation, platelets and MKs are dependent on inhibitory receptors, which prevent overshooting activation. We here identified macrothrombocytopenic mice with a mutation within Mpig6b encoding the ITIM-bearing receptor G6b-B. G6b-B-mutant mice developed a severe myelofibrosis associated with sex-specific bone remodeling defects resulting in osteosclerosis and -porosis in female mice. Moreover, G6b-B was shown to be indispensable for MK maturation as verified by a significant reduction in MK-specific gene expression in G6b-B-mutant MKs due to reduced GATA-1 activity. N2 - Blutplättchen, die kleinsten Zellen des hämatopoetischen Systems, werden von großen Vorläuferzellen, den Megakaryozyten (MKs), im Knochenmark gebildet. Neben ihrer Rolle bei der Blutstillung und Wundheilung sind Thrombozyten außerdem maßgeblich daran beteiligt, Blutungen in Entzündungsprozessen zu verhindern. Insbesondere den immuno- receptor tyrosine-based activation motif (ITAM) Rezeptoren GPVI und CLEC-2 wird eine tragende Rolle in der Aufrechterhaltung der vaskulären Integrität zugeschrieben. Neben den ITAM-Rezeptoren konnten wir auch für den Thrombozytenrezeptor GPV eine Funktion in Hämostase und Thrombose identifizieren. Erstaunlicherweise führte ein gleichzeitiger Verlust von GPV und CLEC-2 zu einer dramatischen Verstärkung der Blut- Lymphgefäß-Fehlbildungen, die bereits in CLEC-2-defizienten Mäusen beschrieben wurde, sodass die Tiere eine starke Ödembildung in den Extremitäten sowie Entzündungen des Dünndarms aufwiesen. Eine vertiefte Analyse der vaskulären Strukturen in Mesenterien während der Embryonalentwicklung offenbarte zusätzliche Defekte in der Blut- und Lymphgefäßtrennung in CLEC-2/GPV-defizienten Mäusen. Diese Deformationen führten zu Thrombozytopenie, Anämie und einer erhöhten vaskulären Permeabilität in adulten Mäusen, was sich auf eine reduzierte tight-junction-Dichte in Mesenterien und Darmgewebe zurückführen ließ, die zu einem Austritt von Blut in die Peritonealhöhle führte. In einer kürzlich veröffentlichten Publikation wurde Plättchengranula eine Rolle in der Auflösung retinopathischer Gefäßmissbildungen zugeschrieben. Retinopathia praema- turorum (ROP) ist eine Krankheit in Frühgeborenen, die aufgrund von Sauerstoffunter- schieden vor und nach Geburt zu Netzhautablösung und Blindheit führen kann. Die exakten Mechanismen, die hierbei zu Thrombozytenaktivierung und nachfolgender Degranulierung beitragen, sind bisher allerdings nicht bekannt. Da eine tragende Rolle von ITAM Rezeptoren in der Aufrechterhaltung vaskulärer Integrität insbesondere in krankhaftem Gewebe zuvor bereits aufgezeigt wurde, untersuchten wir die Entwicklung von Vaso-obliteration und Neovaskularisierung in CLEC-2 und GPVI-depletierten oder defizienten Mäusen und konnten einen Beitrag beider Rezeptoren zur Progression von ROP nachweisen. Die Produktion von Thrombozyten aus MKs ist stark von einem funktionalen Mikrotubuli- und Aktin-Zytoskelett abhängig. Aktinpolymerisation wird substanziell von unterschiedlichen Aktin-bindenden Proteinen reguliert, von denen Cofilin1 und Twinflin1 ein Abtrennen der Filamente induzieren. Wir konnten nun eine funktionale Redundanz beider Proteine in murinen MKs aufzeigen, die insbesondere für ein geregeltes Abschnüren von Thrombozyten in die Blutbahn essentiell ist und von einem Crosstalk zwischen Aktin- und Mikrotubuli- Zytoskeletts abhängig ist, der durch Twinfilin1 und Cofilin1 aufrechterhalten wird. Neben ITAM-induzierter Thrombozytenaktivierung spielt auch die Inhibition derselbigen durch immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif (ITIM)-Rezeptoren eine große Rolle in MKs und Plättchen, da diese eine überschießende Aktivierung verhindern. Wir konnten in der vorliegenden Arbeit eine Spontanmutation in Mpig6b, das für den ITIM-Rezeptor G6b-B codiert, in stark makrothrombozytopenen, wildtypischen Mäusen identifizieren. Außer in der stark reduzierten Thrombozytenzahl manifestierte sich die Mutation des Weiteren in einer massiven Myelofibrose, die mit einer geschlechtsspezifischen Osteosklerose und -porose in weiblichen Mäusen einherging. Überraschenderweise konnten wir zudem einen dramatischen Reifungsblock in G6b-B-mutierten MKs feststellen, der insbesondere in einer reduzierten Expression des Transkriptionsfaktors GATA-1 begründet lag. KW - Megakaryozyt KW - Thrombozyt KW - Megakaryocyte KW - platelets KW - bone marrow KW - hematopoiesis Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-210241 ER - TY - THES A1 - Weigand, Isabel T1 - Consequences of Protein Kinase A mutations in adrenocortical cells and tumours T1 - Auswirkungen von Proteinkinase A Mutationen in Zellen und Tumoren der Nebenniere N2 - Adrenal Cushing’s Syndrome (CS) is a rare but life-threatening disease and therefore it is of great importance to understand the pathogenesis leading to adrenal CS. It is well accepted that Protein Kinase A (PKA) signalling mediates steroid secretion in adrenocortical cells. PKA is an inactive heterotetramer, consisting of two catalytic and two regulatory subunits. Upon cAMP binding to the regulatory subunits, the catalytic subunits are released and are able to phosphorylate their target proteins. Recently, activating somatic mutations affecting the catalytic subunit a of PKA have been identified in a sub-population of cortisol-producing adenomas (CPAs) associated with overt CS. Interestingly, the PKA regulatory subunit IIb has long been known to have significantly lower protein levels in a sub-group of CPAs compared to other adrenocortical tumours. Yet, it is unknown, why these CPAs lack the regulatory subunit IIb, neither are any functional consequences nor are the underlying regulation mechanisms leading to reduced RIIb levels known. The results obtained in this thesis show a clear connection between Ca mutations and reduced RIIb protein levels in CPAs but not in other adrenocortical tumours. Furthermore, a specific pattern of PKA subunit expression in the different zones of the normal adrenal gland is demonstrated. In addition, a Ca L206R mutation-mediated degradation of RIIb was observed in adrenocortical cells in vitro. RIIb degradation was found to be mediated by caspases and by performing mutagenesis experiments of the regulatory subunits IIb and Ia, S114 phosphorylation of RIIb was identified to make RIIb susceptible for degradation. LC-MS/MS revealed RIIb interaction partners to differ in the presence of either Ca WT and Ca L206R. These newly identified interaction partners are possibly involved in targeting RIIb to subcellular compartments or bringing it into spatial proximity of degrading enzymes. Furthermore, reducing RIIb protein levels in an in vitro system were shown to correlate with increased cortisol secretion also in the absence of PRKACA mutations. The inhibiting role of RIIb in cortisol secretion demonstrates a new function of this regulatory PKA subunit, improving the understanding of the complex regulation of PKA as key regulator in many cells. N2 - Das adrenale Cushing Syndrom, ausgelöst durch ein Kortisol-sekretierendes Nebennierenadenom (CPA), ist eine potentiell letale Erkrankung mit einer geringen Inzidenz. Schon lange ist bekannt, dass der Proteinkinase A (PKA)-Signalweg maßgeblich die Sekretion von Steroidhormonen in der Nebenniere reguliert. In ihrer inaktiven Form ist die PKA ein Heterotetramer aus zwei katalytischen und zwei regulatorischen Untereinheiten, welches über die Bindung des second messengers cAMP und die daraus resultierende Konformationsänderung aktiviert wird. Kürzlich wurden in etwa 40 % der CPAs, somatische Mutationen in der katalytischen Untereinheit a (Ca) der PKA identifiziert. Diese Mutation verhindert die Bindung der regulatorischen Untereinheiten, was zu einer konstitutiven Aktivierung des PKA-Signalwegs führt. Unabhängig davon war bereits einige Jahre zuvor erkannt worden, dass in einem Teil der CPAs die regulatorische Untereinheit IIb (RIIb) der PKA in geringerem Maße exprimiert wird. Ein Zusammenhang zwischen dieser verringerten Proteinmenge an RIIb und den Mutationen in Ca war bisher nicht bekannt. In dieser Dissertation konnte gezeigt werden, dass zwischen den Mutationen in Ca und der verringerten Proteinmenge von RIIb in CPAs, jedoch nicht in anderen Tumorentitäten der Nebenniere, ein klarer Zusammenhang besteht. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass auch die Zonen der normalen Nebenniere ein spezifisches Muster der Proteinkinase A Untereinheiten exprimieren. Zusätzlich konnten in in vitro Versuchen Caspasen identifiziert werden, die maßgeblich am Abbau von RIIb beteiligt sind. Durch Mutagenese-Experimente und den Austausch der Inhibitory-Sequenzen der regulatorischen Untereinheiten RIa und RIIb, konnte die Phosphorylierung von Ser114 an RIIb als essentiell für den Abbau identifiziert werden. Darüber hinaus wurden mittels LC-MS/MS neue RIIb Interaktionspartner in Zellen der Nebennierenrinde identifiziert, die sich in der An-oder Abwesenheit der Ca L206R Mutante unterscheiden. Ferner konnte für RIIb eine inhibierende Rolle, speziell in der Kortisol-Sekretion von Nebennierenrindenzellen, gezeigt werden. Dies stellt eine bislang unbekannte Funktion von RIIb dar, die das Verständnis der komplexen Regulierung von PKA als Schlüsselregulator in vielen Zellen verbessert. KW - Cushing-Syndrom KW - protein kinase a KW - cushing's syndrome KW - tumour KW - signalling KW - adrenal gland Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-160646 ER - TY - THES A1 - Thomas, Sarah Katharina T1 - Design of novel IL-4 antagonists employing site-specific chemical and biosynthetic glycosylation T1 - Herstellung neuer IL-4 basierter Antagonisten durch zielgerichtete chemische und biosynthetische Glykosylierung N2 - The cytokines interleukin 4 (IL-4) and IL-13 are important mediators in the humoral immune response and play a crucial role in the pathogenesis of chronic inflammatory diseases, such as asthma, allergies, and atopic dermatitis. Hence, IL-4 and IL-13 are key targets for treatment of such atopic diseases. For cell signalling IL-4 can use two transmembrane receptor assemblies, the type I receptor consisting of receptors IL-4R and γc, and type II receptor consisting of receptors IL-4R and IL-13R1. The type II receptor is also the functional receptor of IL-13, receptor sharing being the molecular basis for the partially overlapping effects of IL-4 and IL-13. Since both cytokines require the IL-4R receptor for signal transduction, this allows the dual inhibition of both IL-4 and IL-13 by specifically blocking the receptor IL-4R. This study describes the design and synthesis of novel antagonistic variants of human IL-4. Chemical modification was used to target positions localized in IL-4 binding sites for γc and IL-13R1 but outside of the binding epitope for IL-4R. In contrast to existing studies, which used synthetic chemical compounds like polyethylene glycol for modification of IL-4, we employed glycan molecules as a natural alternative. Since glycosylation can improve important pharmacological parameters of protein therapeutics, such as immunogenicity and serum half-life, the introduced glycan molecules thus would not only confer a steric hindrance based inhibitory effect but simultaneously might improve the pharmacokinetic profile of the IL-4 antagonist. For chemical conjugation of glycan molecules, IL-4 variants containing additional cysteine residues were produced employing prokaryotic, as well as eukaryotic expression systems. The thiol-groups of the engineered cysteines thereby allow highly specific modification. Different strategies were developed enabling site-directed coupling of amine- or thiol- functionalized monosaccharides to introduced cysteine residues in IL-4. A linker-based coupling procedure and an approach requiring phenylselenyl bromide activation of IL-4 thiol-groups were hampered by several drawbacks, limiting their feasibility. Surprisingly, a third strategy, which involved refolding of IL-4 cysteine variants in the presence of thiol- glycans, readily allowed synthesis of IL-4 glycoconjugates in form of mixed disulphides in milligram amount. This approach, therefore, has the potential for large-scale synthesis of IL-4 antagonists with highly defined glycosylation. Obtaining a homogenous glycoconjugate with exactly defined glycan pattern would allow using the attached glycan structures for fine-tuning of pharmacokinetic properties of the IL-4 antagonist, such as absorption and metabolic stability. The IL-4 glycoconjugates generated in this work proved to be highly effective antagonists inhibiting IL-4 and/or IL-13 dependent responses in cell-based experiments and in in vitro binding studies. Glycoengineered IL-4 antagonists thus present valuable alternatives to IL-4 inhibitors used for treatment of atopic diseases such as the neutralizing anti-IL-4R antibody Dupilumab. N2 - Die Zytokine Interleukin-4 (IL-4) und IL-13 sind zentrale Mediatoren in der humoralen Immunantwort und sind wesentlich an der Entstehung chronisch inflammatorischer Erkrankungen, wie Asthma, Allergien und atopischer Dermatitis beteiligt. Daher werden IL- 4 und IL-13 als wichtige therapeutische Angriffspunkte für die Behandlung atopischer Erkrankungen betrachtet. Zur Signaltransduktion aktiviert IL-4 zwei heterodimere Rezeptorkomplexe, den Typ I Rezeptor bestehend aus den Untereinheiten IL-4R und γc und den Typ II Rezeptor, der sich aus IL-4R und IL-13R1 zusammensetzt. Der Typ II Rezeptor wird auch von IL-13 zur Signalweiterleitung genutzt, wodurch sich die teilweise überschneidenden Funktionen der beiden Zytokine erklären lassen. Die überlappende Rezeptornutzung erlaubt es durch eine gezielte Blockade des IL-4R-Rezeptors sowohl IL-4, als auch IL-13 gleichzeitig zu inhibieren. Ziel dieser Arbeit war die Herstellung neuartiger IL-4 basierter Antagonisten. Dazu wurden ausgewählte Positionen innerhalb der IL-4 Bindestelle für γc and IL-13R1, jedoch außerhalb des Bindeepitops für IL-4R gezielt chemisch modifiziert. Im Gegensatz zu bereits existierenden Studien, die synthetische Gruppen wie Polyethylenglykol (PEG) zur chemischen Modifizierung von IL-4 nutzten, wurden in dieser Arbeit Glykane als natürliche Alternative zu PEG an IL-4 gekoppelt. Da sich Glykosylierung auf wichtige pharmakologische Eigenschaften proteinbasierter Therapeutika, wie Immunogenität oder Serum Halbwertszeit, positiv auswirken kann, würde der Zucker in dieser Strategie nicht nur den auf sterischer Hinderung basierenden inhibitorischen Effekt vermitteln, sondern könnte gleichzeitig zu einer Optimierung der pharmakologischen Eigenschaften des IL-4 Inhibitors beitragen. Zur chemischen Zucker-Kopplung wurden zusätzliche Cystein-Reste in IL-4 eingebracht, deren freie Thiol-gruppen eine hochspezifische Modifizierung der IL-4 Mutanten erlauben. Die IL-4 Cystein-Mutanten wurden rekombinant in prokaryotischen und eukaryotischen Expressionssystemen hergestellt. Anschließend wurden verschiedene Strategien entwickelt, die eine ortsspezifische Kopplung Amin- und Thiol-haltiger Zucker an die eingebrachten Cystein-Reste in IL-4 ermöglichen. Eine Linker-basierte Reaktion, sowie ein Kopplungsansatz, der eine Aktivierung der Thiol-Gruppe mittels Bromselenobenzol erforderte, wiesen einige Nachteile auf, die eine erhebliche Einschränkung ihrer technischen Durchführbarkeit zur Folge hatte. Eine dritte Strategie hingegen, die eine Rückfaltung derIL-4 Cystein-Mutanten in Anwesenheit von Thiol-Glykanen involvierte, erlaubte eine effiziente Herstellung von IL-4 Glykokonjugaten in Form gemischter Disulfide im Milligrammbereich. Dieser Ansatz könnte somit zur Produktion homogen glykosylierter IL-4 Antagonisten im Großmaßstab eingesetzt werden. Die Herstellung homogener Glykokonjugate mit klar definierten Glykosylierungsmuster würde es erlauben über die gekoppelten Glykanstrukturen die pharmakologischen Eigenschaften von IL-4, wie Absorption und metabolische Stabilität, gezielt zu modulieren. Die hergestellten IL-4 Glykokonjugate erwiesen sich als hochwirksame Antagonisten, die die Aktivität von IL-4 und IL-13 in zellbasierten Experimenten inhibieren konnten. Glykosylierte IL-4 Antagonisten stellen somit eine vergleichbare Alternative zu gängigen IL-4 Inhibitoren dar, die zur Behandlung von atopischen Erkrankungen eingesetzt werden, wie beispielweise der neutralisierende anti-IL-4R Antikörper Dupilumab. KW - Glykosylierung KW - Modifizierung KW - Interleukin KW - Inhibitor KW - Entzündung KW - Glykomodifizierung KW - Interleukin-4 Antagonist KW - TH2 Immunantwort KW - Proteinmodifizierung KW - Rezeptorblocker Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-175172 ER - TY - THES A1 - Rüdenauer, Fabian T1 - Nutrition facts of pollen: nutritional quality and how it affects reception and perception in bees T1 - Nährwertinformationen von Pollen: Nährstoffzusammensetzung und wie diese sich auf Rezeption und Perzeption von Bienen auswirkt N2 - Nutrients belong to the key elements enabling life and influencing an organism’s fitness. The intake of nutrients in the right amounts and ratios can increase fitness; strong deviations from the optimal intake target can decrease fitness. Hence, the ability to assess the nutritional profile of food would benefit animals. To achieve this, they need the according nutrient receptors, the ability to interpret the receptor information via perceptive mechanisms, and the ability to adjust their foraging behavior accordingly. Additionally, eventually existing correlations between the nutrient groups and single nutrient compounds in food could help them to achieve this adjustment. A prominent interaction between food and consumer is the interaction between flowering plants (angiosperms) and animal pollinators. Usually both of the interacting partners benefit from this mutualistic interaction. Plants are pollinated while pollinators get a (most of the times) nutritional reward in form of nectar and/or pollen. As similar interactions between plants and animals seem to have existed even before the emergence of angiosperms, these interactions between insects and angiosperms very likely have co-evolved right from their evolutionary origin. Therefore, insect pollinators with the ability to assess the nutritional profile may have shaped the nutritional profile of plant species depending on them for their reproduction via selection pressure. In Chapter I of this thesis the pollen nutritional profile of many plant species was analyzed in the context of their phylogeny and their dependence on insect pollinators. In addition, correlations between the nutrients were investigated. While the impact of phylogeny on the pollen protein content was little, the mutual outcome of both of the studies included in this chapter is that protein content of pollen is mostly influenced by the plant’s dependence on insect pollinators. Several correlations found between nutrients within and between the nutrient groups could additionally help the pollinators to assess the nutrient profile of pollen. An important prerequisite for this assessment would be that the pollinators are able to differentiate between pollen of different plant species. Therefore, in Chapter II it was investigated whether bees have this ability. Specifically, it was investigated whether honeybees are able to differentiate between pollen of two different, but closely related plant species and whether bumblebees prefer one out of three pollen mixes, when they were fed with only one of them as larvae. Honeybees indeed were able to differentiate between the pollen species and bumblebees preferred one of the pollen mixes to the pollen mix they were fed as larvae, possibly due to its nutritional content. Therefore, the basis for pollen nutrient assessment is given in bees. However, there also was a slight preference for the pollen fed as larvae compared to another non-preferred pollen mix, at least hinting at the retention of larval memory in adult bumblebees. Chapter III looks into nutrient perception of bumblebees more in detail. Here it was shown that they are principally able to perceive amino acids and differentiate between them as well as different concentrations of the same amino acid. However, they do not seem to be able to assess the amino acid content in pollen or do not focus on it, but instead seem to focus on fatty acids, for which they could not only perceive concentration differences, but also were able to differentiate between. These findings were supported by feeding experiments in which the bumblebees did not prefer any of the pollen diets containing less or more amino acids but preferred pollen with less fatty acids. In no choice feeding experiments, bumblebees receiving a diet with high fatty acid content accepted undereating other nutrients instead of overeating fat, leading to increased mortality and the inability to reproduce. Hence, the importance of fat in pollen needs to be looked into further. In conclusion, this thesis shows that the co-evolution of flowering plants and pollinating insects could be even more pronounced than thought before. Insects do not only pressure the plants to produce high quality nectar, but also pressure those plants depending on insect pollination to produce high quality pollen. The reason could be the insects’ ability to receive and perceive certain nutrients, which enables them to forage selectively leading to a higher reproductive success of plants with a pollinator-suitable nutritional pollen profile. N2 - Nährstoffe gehören zu den zentralen Elementen, die das Leben an sich ermöglichen und die Fitness eines Organismus beeinflussen können. Nährstoffaufnahme in den richtigen Mengen und Verhältnissen kann die Fitness verbessern, starke Abweichungen von der optimalen Aufnahme können sie verschlechtern. Deshalb könnten Tiere von der Fähigkeit profitieren das Nährstoffprofil von Nahrung bewerten zu können. Dafür benötigten sie jedoch die passenden Nährstoffrezeptoren, die Fähigkeit die Rezeptorinformationen durch perzeptive Mechanismen zu interpretieren und ihr Sammelverhalten daran anzupassen. Eine zusätzliche Hilfe dabei könnten Korrelationen zwischen sowohl den Nährstoffgruppen als auch einzelnen Nährstoffen bieten. Eine bekannte Interaktion zwischen Nahrung und Konsument ist die zwischen Blühpflanzen (Angiospermen) und tierischen Bestäubern. Normalerweise profitieren beide Interaktionspartner von dieser mutualistischen Interaktion. Pflanzen werden bestäubt, während die Bestäuber eine (zumeist) nahrhafte Belohnung in Form von Nektar und/oder Pollen erhalten. Da ähnliche Interaktionen zwischen Pflanzen und Tieren vermutlich schon vor dem Auftreten der Angiospermen existierten, könnte sich diese Interaktion, im Speziellen mit Insekten, direkt vom evolutiven Startpunkt der Angiospermen aus koevolviert haben. Deshalb ist es möglich, dass Bestäuber mit der Fähigkeit das Nährstoffprofil von Pollen bewerten zu können, dieses bei von ihnen abhängigen Pflanzen durch Selektionsdruck formen konnten. Im Kapitel I dieser Thesis wurde das Nährstoffprofil von Pollen vieler Pflanzenarten im Kontext ihrer Phylogenie und ihrer Abhängigkeit von Insekten als Bestäubern analysiert. Außerdem wurden Korrelationen zwischen den Nährstoffen untersucht. Während die Phylogenie nur einen geringen Einfluss auf den Proteingehalt von Pollen haben könnte, ist der gemeinsame Nenner der beiden Studien in diesem Kapitel, dass der Proteingehalt des Pollens hauptsächlich von der Abhängigkeit der Pflanzen von Bestäubern bestimmt wird. Es wurden zudem einige Korrelationen sowohl in als auch zwischen den Nährstoffgruppen gefunden, die den Bestäubern helfen könnten das Nährstoffprofil von Pollen bewerten zu können. Eine wichtige Grundvoraussetzung für diese Bewertung wäre, dass die Bestäuber überhaupt dazu in der Lage sind zwischen Pollen von unterschiedlichen Pflanzenarten zu unterscheiden. Dies wird in Kapitel II behandelt, in dem untersucht wurde ob Honigbienen in der Lage sind zwischen Pollen zweier nah verwandter Pflanzenarten zu unterscheiden und ob Hummeln eine von drei Pollenmischungen bevorzugen, wenn sie nur mit einer davon als Larve in Kontakt kamen. Honigbienen war es tatsächlich möglich zwischen den Pollenarten zu unterscheiden und Hummeln bevorzugten eine bestimmte Pollenmischung gegenüber der, die sie als Larve erhalten hatten, möglicherweise aufgrund eines vorteilhaften Nährstoffprofils. Die Grundlage zur Nährstoffbewertung scheint bei Bienen also gegeben zu sein. Allerdings hatten die Hummeln auch eine leichte Präferenz für die Pollenmischung, die sie als Larve erhalten hatten gegenüber der dritten, nicht bevorzugten Pollenmischung, was zumindest darauf hindeuten könnte, dass Larvenerinnerungen bei erwachsenen Hummeln erhalten bleiben könnten. Kapitel III beschäftigt sich tiefergehend mit der Nährstoffwahrnehmung von Hummeln. Es wurde gezeigt, dass diese prinzipiell befähigt sind Aminosäuren wahrzunehmen als auch zwischen ihnen und verschiedenen Konzentrationen der gleichen Aminosäure zu unterscheiden. Allerdings scheinen sie entweder nicht in der Lage zu sein oder sich zumindest nicht darauf zu fokussieren den Aminosäuregehalt von Pollen zu bewerten, sondern sich eher auf Fettsäuren zu konzentrieren. Von diesen konnten sie nicht nur Konzentrationsunterschiede feststellen, sondern auch zwischen verschiedenen Fettsäuren im Pollen unterscheiden. Diese Ergebnisse wurden von denen in Fütterungsexperimenten gestützt, in denen die Hummeln gleiche Mengen von Pollen mit mehr oder weniger Aminosäuren aufnahmen, aber Pollen mit weniger Fettsäuren bevorzugten. In Experimenten, in denen die Hummeln keine Wahl hatten, nahmen die Hummeln mit einer Diät, die eine hohe Fettsäurekonzentration hatte, lieber in Kauf, dass sie zu wenig von den anderen Nährstoffen aufnahmen, als zu viel Fett, was zu einer erhöhten Mortalitätsrate und der Unfähigkeit sich zu reproduzieren führte. Deshalb sollten zukünftige Studien sich eingehender mit dem Fettsäuregehalt von Pollen beschäftigen. Zusammenfassend zeigt diese Thesis, dass die Koevolution von Pflanzen und bestäubenden Insekten ausgeprägter sein könnte, als bisher angenommen. Insekten setzen die Pflanzen nicht nur unter Druck qualitativ hochwertigen Nektar zu produzieren, sondern setzen vor allem auch die Pflanzen unter Druck, die von ihrer Bestäubung abhängig sind, qualitativ hochwertigen Pollen zu produzieren. Der Grund dafür könnte die Fähigkeit der Insekten sein, bestimmte Nährstoffe zu rezipieren und perzipieren und dann ihr Sammelverhalten so anzupassen, dass Pflanzen mit einem passenden Nährstoffprofil einen höheren Reproduktionserfolg haben. KW - Pollen KW - bumblebee*s KW - nutrients KW - nutrition KW - pollen KW - reception KW - perception KW - proboscis extension response KW - honeybee*s Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-212548 ER - TY - THES A1 - Rüdt von Collenberg, Cora Freifrau T1 - The role of Ciliary Neurotrophic Factor in hippocampal synaptic plasticity and learning T1 - Die Rolle von Ciliary Neurotrophic Factor bei hippocampaler synaptischer Plastizität und Lernen N2 - Ciliary neurotrophic factor (Cntf) acts as a differentiation and survival factor for different types of neurons and glial cells. It is expressed by peripheral Schwann cells and astrocytes in the central nervous system and mediates its effects via a receptor complex involving CntfRα, LifRß and gp130, leading to downstream activation of Stat3. Recent studies by our group have shown that Cntf modulates neuronal microtubule dynamics via Stat3/stathmin interaction. In a mouse model for motor neuron disease, i.e. pmn, Cntf is able to rescue axonal degeneration through Stat3/stathmin signaling. While these findings suggest a role of Cntf in controlling axonal functions in the neuromuscular system, additional data indicate that Cntf might also play a role in synaptic plasticity in the hippocampus. Electrophysiological recordings in hippocampal organotypic cultures and acute slices revealed a deficit in long-term potentiation (LTP) in Cntf -/- mice. This deficit was rescued by 24 h stimulation with Cntf, combined with an acute application of Cntf during LTP-measurements indicating that Cntf is both necessary and sufficient for hippocampal LTP, and possibly synaptic plasticity. Therefore, Cntf knockout mice were investigated to elucidate this possible role of Cntf in hippocampal LTP and synaptic plasticity. First, we validated the presence of Cntf in the target tissue: in the hippocampus, Cntf was localized in Gfap-positive astrocytes surrounding small blood vessels in the fissure and in meningeal areas close to the dentate gyrus. Laser micro-dissection and qPCR analysis showed a similar distribution of Cntf-coding mRNA validating the obtained immunofluorescent results. Despite the strong LTP deficit in organotypic cultures, in vivo behavior of Cntf -/- mice regarding hippocampus-dependent learning and anxiety-related paradigms was largely inconspicuous. However, western blot analysis of hippocampal organotypic cultures revealed a significant reduction of pStat3 levels in Cntf -/- cultures under baseline conditions, which in turn were elevated upon Cntf stimulation. In order to resolve and examine synaptic structures we turned to in vitro analysis of cultured hippocampal neurons which indicated that pStat3 is predominantly located in the presynapse. In line with these findings, presynapses of Cntf -/- cultures were reduced in size and when in contact to astrocytes, contained less pStat3 immunoreactivity compared to presynapses in wildtype cultures. In conclusion, our findings hypothesize that despite of a largely inconspicuous behavioral phenotype of Cntf -/- mice, Cntf appears to have an influence on pStat3 levels at hippocampal synapses. In a next step these two key questions need to be addressed experimentally: 1) is there a compensatory mechanism by members of the Cntf family, possibly downstream of pStat3, which explains the in vivo behavioral results of Cntf -/- mice and can likewise account for the largely inconspicuous phenotype in CNTF-deficient humans? 2) How exactly does Cntf influence LTP through Stat3 signaling? To unravel the underlying mechanism further experiments should therefore investigate whether microtubule dynamics downstream of Stat3 and stathmin signaling are involved in the Cntf-induced modulation of hippocampal synaptic plasticity, similar to as it was shown in motoneurons. N2 - Ciliary neurotrophic factor (Cntf) wirkt als Differenzierungs- und Überlebensfaktor für verschiedene Arten von Neuronen und Gliazellen. Es wird von peripheren Schwann´schen Zellen und Astrozyten des zentralen Nervensystems exprimiert und vermittelt seine Effekte über einen Rezeptorenkomplex, der aus CntfRα, LifRß und gp130 besteht, und zu einer nachfolgenden Aktivierung von Stat3 führt. Jüngste Studien unserer Arbeitsgruppe haben gezeigt, dass Cntf neuronale Mikrotubulidynamik über Stat3/stathmin Interaktion modulieren kann. In pmn Mäusen, einem Mausmodell für Motoneuronenerkrankungen, ist Cntf in der Lage, durch Stat3/Stathmin Signaltransduktion die zugrundeliegende axonale Degeneration wieder aufzuheben. Während diese Ergebnisse eine Rolle von Cntf bei der Kontrolle axonaler Funktionen im neuromuskulären System postulieren, deuten zusätzliche Daten darauf hin, dass Cntf ebenfalls eine Funktion bei synaptischer Plastizität im Hippocampus ausübt. Elektrophysiologische Messungen in hippocampalen organotypischen Kulturen und akuten Schnitten zeigen ein Defizit in der Langzeitpotenzierung (LTP) bei Cntf -/- Mäusen. Dieses Defizit konnte durch eine 24 stündige Stimulation mit Cntf, in Kombination mit akuter Zugabe von Cntf während der LTP Messungen, kompensiert werden. Dies weist darauf hin, dass Cntf sowohl notwendig als auch ausreichend für hippocampale LTP und möglicherweise synaptische Plasizität ist. Deshalb wurden Cntf knockout Mäuse untersucht, um diese putative Rolle von Cntf bei hippocampaler LTP und synaptischer Plastizität zu untersuchen. Zunächst haben wir die Lokalisation von Cntf in unserem Zielgewebe bestätigt: im Hippocampus war Cntf sowohl in Gfap-positiven Astrocyten lokalisiert, die kleine Blutgefäße in der Fissur umschließen, als auch in Gfap-positiven Astrocyten nahe des Gyrus dentatus. Lasermikrodissektion und qPCR-Analysen zeigten eine ähnliche Verteilung von Cntf kodierender mRNA, und bestätigten somit die durch Immunoflureszenz-Färbung erworbenen Ergebnisse. Trotz des starken LTP Defizits in organotypischen Kulturen zeigten jedoch Cntf -/- Mäuse in Hippocampus-abhängigen lern- und angstbedingten Verhaltensparadigmen keinen offensichtlichen Phänotyp. Allerdings zeigten Western Blot Analysen hippocampaler Kulturen eine signifikante Reduktion der pStat3 Level in Cntf -/- Kulturen unter Kontrollbedingungen, die nach Cntf Zugabe wieder erhöht werden konnten. Um synaptische Strukturen besser darstellen und evaluieren zu können, wurden hippocampale Neurone in vitro kultiviert, in denen Stat3 überwiegend in Präsynapsen lokalisiert war. In Übereinstimmung mit diesen Beobachtungen zeigten Cntf -/- Präsynapsen eine geringere Größe und enthielten, verglichen zu Präsynapsen in Wildtypkulturen, weniger pStat3 Immunreaktivität, gerade dann, wenn sie sich in Kontakt mit Astrozyten befanden. Zusammenfassend weisen unsere Befunde darauf hin, dass Cntf – trotz eines weitgehend unaufälligen Verhaltensphänotyps bei Cntf -/- Mäusen – einen Einfluss auf den Level von pStat3 an hippokampalen Synapsen zu haben scheint. In einem nächsten Schritt sollten die folgenden zwei Schlüsselfragen experimentell geklärt werden: 1) gibt es einen kompensierenden Mechanismus, über welchen Mitglieder der Cntf Familie wirken könnten – möglicherweise nachfolgend von pStat3 – und welcher das Verhalten der Cntf -/- Mäuse, sowie den größtenteils unauffälligen Phänotyp bei CNTF defizienten Menschen erklären könnte? 2) Wie genau wirkt sich Cntf induziertes pStat3 auf LTP aus? Um diesen zugrundeliegenden Mechanismus aufzuklären, sollten weitere Experimente untersuchen, ob pStat3 und Stathmin abhängige Mikrotubulidynamik in der durch Cntf induzierten Modulation hippocampaler Plastizität eine Rolle spielt – ähnlich, wie es in Motoneuronen bereits gezeigt wurde. KW - Hippocampus KW - Ciliary neurotrophic factor KW - hippocampus KW - synaptic plasticity KW - learning KW - Hippocampus KW - synaptische Plastizität KW - Lernen Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-206646 ER - TY - THES A1 - Bergmann Bueno, Amauri T1 - Ecophysiological adaptations of cuticular water permeability of plants to hot arid biomes T1 - Ökophysiologische Anpassungen der kutikulären Wasserpermeabilität von Pflanzen an heiße aride Biome N2 - Arid environments cover almost one-third of the land over the world. Plant life in hot arid regions is prone to the water shortage and associated high temperatures. Drought-stressed plants close the stomata to reduce water loss. Under such conditions, the remaining water loss exclusively happens across the plant cuticle. The cuticular water permeability equals the minimum and inevitable water loss from the epidermal cells to the atmosphere under maximally stomatal closure. Thus, low cuticular water permeability is primordial for plant survival and viability under limited water source. The assumption that non-succulent xerophytes retard water loss due to the secretion of a heavier cuticle is often found in the literature. Intuitively, this seems to be plausible, but few studies have been conducted to evaluate the cuticular permeability of xerophilous plants. In chapter one, we investigated whether the cuticular permeability of Quercus coccifera L. grown in the aridest Mediterranean-subtype climate is indeed lower than that of individuals grown under temperate climate conditions. Also, the cuticular wax chemical compositions of plants grown in both habitats were qualitatively and quantitatively analysed by gas-chromatography. In few words, our findings showed that although the cuticular wax deposition increased in plants under Mediterranean climate, the cuticular permeability remained unaltered, regardless of habitat. The associated high temperatures in arid regions can drastically increase the cuticular water permeability. Thereby, the thermal stability of the cuticular transpirational barrier is decisive for safeguarding non-succulent xerophytes against desiccation. The successful adaptation of plants to hot deserts might be based on finding different solutions to cope with water and heat stresses. Water-saver plants close the stomata before the leaf water potential drastically changes in order to prevent damage, whereas water-spender plants reduce the leaf water potential by opening the stomata, which allow them to extract water from the deep soil to compensate the high water loss by stomatal transpiration. In chapter two, we compare the thermal stability of the cuticular transpiration barrier of the desert water-saver Phoenix dactylifera L. and the water-spender Citrullus colocynthis (L.) Schrad. In short, the temperature-dependent increase of the cuticular permeability of P. dactylifera was linear over the whole temperature range (25-50°C), while that of C. colocynthis was biphasic with a steep increase at temperatures ≥ 40°C. This drastic increase of cuticular permeability indicates a thermally induced breakdown of the C. colocynthis cuticular transpiration barrier, which does not occur in P. dactylifera. We further discussed how the specific chemical composition of the cutin and cuticular waxes might contribute to the pronounced thermal resistance of the P. dactylifera cuticular transpiration barrier. A multitude of morpho and physiological modifications, including photosynthetic thermal tolerance and traits related to water balance, led to the successful plant colonisation of hot arid regions over the globe. High evaporative demand and elevated temperatures very often go along together, thereby constraining the plant life in arid environments. In chapter 3, we surveyed cuticular permeability, leaf thermal tolerance, and cuticular wax chemical composition of 14 non-succulent plant species native from some of the hottest and driest biomes in South-America, Europe, and Asia. Our findings showed that xerophilous flowering plants present high variability for cuticular permeability and leaf thermal tolerance, but both physiological features could not be associated with the species original habitat. We also provide substantial evidence that non-succulent xerophytes with more efficient cuticular transpirational barrier have higher leaf thermal tolerance, which might indicate a potential coevolution of these features in hot arid biomes. We further discussed the efficiency of the cuticular transpiration barrier in function to the cuticular wax chemical composition in the general discussion section. N2 - Trockene Trockene Lebensräume bedecken fast ein Drittel der Landoberfläche der Erde. Das Pflanzenleben in Trockengebieten ist durch Wasserknappheit und hohe Temperaturen gekennzeichnet. Durch Trockenheit beanspruchte Pflanzen schließen die Stomata, um den Wasserverlust zu reduzieren. Unter diesen Bedingungen erfolgt der verbleibende Wasserverlust ausschließlich über die pflanzliche Kutikula. Die kutikuläre Wasserpermeabilität entspricht dem minimalen und unvermeidbaren Wasserverlust aus den Epidermiszellen an die Atmosphäre. Daher ist eine niedrige kutikuläre Wasserpermeabilität für die Lebensfähigkeit der Pflanzen unter begrenzter Wasserverfügbarkeit entscheidend. Die Annahme, dass xerophile Pflanzen den Wasserverlust aufgrund der Ausbildung einer speziellen Kutikula verringern, findet sich häufig in der Literatur. Intuitiv erscheint dies plausibel, jedoch wurden nur wenige Studien durchgeführt, um die kutikuläre Wasserpermeabilität von xerophilen Pflanzen zu untersuchen. Im ersten Kapitel wurde getestet, ob die kutikuläre Wasserpermeabilität von Quercus coccifera L., angezogen im ariden Klima des mediterranen Subtyps, tatsächlich geringer ist als die von Pflanzen derselben Art, die unter gemäßigten Klimabedingungen kultiviert wurden. Außerdem wurde die chemische Zusammensetzung der kutikulären Wachse von Pflanzen, die in beiden Habitaten angezogen wurden, quantitativ und qualitativ durch Gaschromatographie mit Flammenionisationsdetektion- beziehungsweise Massenspektrometrie-Kopplung analysiert. Die Ergebnisse zeigen, dass die kutikuläre Wasserpermeabilität unter beiden Anzuchtbedingungen vergleichbar war, obwohl die Pflanzen, die unter dem mediterranen Klima wuchsen, eine höhere Menge an kutikulären Wachsen aufwiesen. Die hohen Temperaturen in trockenen Regionen können die Wasserdurchlässigkeit der pflanzlichen Kutikula drastisch erhöhen. Dabei ist die thermische Stabilität der kutikulären Transpirationsbarriere entscheidend für den Austrocknungsschutz xerophiler Pflanzen. Die erfolgreiche Anpassung von Wüstenpflanzen kann auf verschiedenen Strategien zur Bewältigung von Wassermangel und Hitze beruhen. Wassersparende Pflanzen (water-save plants) schließen die Stomata, bevor sich das Wasserpotenzial drastisch ändert, um Schädigungen zu verhindern. Wasserverschwendende Pflanzen (water-spender plants) reduzieren das Wasserpotenzial durch das Öffnen der Stomata. Dadurch können diese Pflanzen Wasser aus tiefen Bodenschichte nachziehen, um den hohen stomatären Wasserverlust zu kompensieren. Im zweiten Kapitel wurde die thermische Stabilität der kutikulären Transpirationsbarriere der beiden Wüstenpflanzen Phoenix dactylifera L. (saver) und Citrullus colocynthis (L.) Schrad. (spender) verglichen. Der temperaturabhängige Anstieg der kutikulären Wasserpermeabilität von P. dactylifera verlief linear über einen Temperaturbereich von 25°C bis 50°C. Dagegen war der temperaturabhängige Anstieg der kutikulären Wasserpermeabilität von C. colocynthis zweiphasig. Der steile Anstieg der kutikulären Permeabilität bei Temperaturen ≥ 35°C weist auf eine thermisch induzierte Schädigung der kutikulären Transpirationsbarriere hin. Die spezielle chemische Zusammensetzung der Kutinmatrix und der kutikulären Wachse trägt zur ausgeprägten thermischen Resistenz der kutikulären Transpirationsbarriere von P. dactylifera bei. Die erfolgreiche Besiedlung von heißen und trockenen Regionen der Erde beruht auf einer Vielzahl von morphologischen und physiologischen Anpassungen wie der fotosynthetischen Hitzetoleranz. Eine hohe Verdunstungskapazität und hohe Temperaturen treten oft zusammen auf, wodurch das Pflanzenleben in ariden Klimazonen eingeschränkt wird. In Kapitel 3 wurde die kutikuläre Wasserpermeabilität, die kutikuläre Wachszusammensetzung sowie die fotosynthetische Hitzetoleranz von 14 nicht-sukkulenten Pflanzenarten aus einigen der heißesten und trockensten Biome Südamerikas, Europas und Asiens untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass die ausgewählten xerophilen Pflanzen eine hohe Variabilität in der kutikulären Wasserpermeabilität und der fotosynthetischen Hitzetoleranz aufwiesen. Beide physiologischen Merkmale konnten jedoch nicht mit dem ursprünglichen Standort der Arten assoziiert werden. Dennoch weisen xerophile Pflanzen mit einer effizienteren kutikulären Transpirationsbarriere eine höhere Hitzetoleranz auf, was auf eine mögliche Koevolution dieser Merkmale in trockenen Biomen hinweisen könnte. Darüber hinaus wurde die Effizienz der kutikulären Transpirationsbarriere in Zusammenhang mit der chemischen Zusammensetzung der kutikulären Wachse diskutiert KW - Plant cuticle KW - Arid biomes KW - Cuticular transpiration KW - Cuticular waxes KW - Water stress KW - Heat stress Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-167832 ER - TY - THES A1 - Schönwetter, Elisabeth Sofie T1 - Towards an understanding of the intricate interaction network of TFIIH T1 - Auf dem Weg zum Verständnis des komplexen TFIIH Interaktionsnetzwerkes N2 - The integrity of its DNA is fundamental for every living cell. However, DNA is constantly threatened by exogenous and endogenous damaging agents that can cause a variety of different DNA lesions. The severe consequences of an accumulation of DNA lesions are reflected in cancerogenesis and aging. Several DNA repair mechanisms ensure the repair of DNA lesions and thus maintain DNA integrity. One of these DNA repair mechanisms is nucleotide excision repair (NER), which is famous for its ability to address a large variety of structurally unrelated DNA lesions. A key component of eukaryotic NER is the transcription factor II H (TFIIH) complex, which is not only essential for DNA repair but also for transcription. The TFIIH complex is composed of ten subunits. How these subunits work together during NER to unwind the DNA around the lesion is, however, not yet fully understood. High-resolution structural data and biochemical insights into the function of every subunit are thus indispensable to understand the functional networks within TFIIH. The importance of an intact TFIIH complex is reflected in the severe consequences of patient mutations in the TFIIH subunits XPB, XPD or p8 leading to the hallmark diseases xeroderma pigmentosum, Cockayne syndrome and trichothiodystrophy. Defects in the NER pathway are further associated with several types of cancer including skin cancer. The herein described work focused on five TFIIH subunits derived from the thermophilic fungus Chaetomium thermophilum, the p34/p44 pair and the ternary XPB/p52/p8 complex. The interaction between p34 and p44 was characterized based on a high-resolution structure of the p34_vWA/p44_RING minimal complex. Biochemical studies of the p34/p44 interaction led to the disclosure of an additional interaction between the p34 and p44 subunits, which had not been characterized so far. The p34/p44 interaction was shown to be central to TFIIH, which justifies the presence of several redundant interfaces to safeguard the interaction between the two proteins and might explain why so far, no patient mutations in these subunits have been identified. The p52 subunit of TFIIH was known to be crucial to stimulate the ATPase activity of XPB, which is required during NER. This work presents the first entire atomic resolution structural characterization of p52, which was derived of several crystal structures of p52 variants and a p52/p8 variant thereby demonstrating the interaction between p52 and p8. The precise structural model of p52 offered the possibility to investigate interactions with other TFIIH subunits in more detail. The middle domain 2 of p52 and the N-terminal domain of XPB were shown to mediate the main interaction between the two subunits. An analysis of the p52 crystal structures within recently published cryo-electron microscopy structures of TFIIH provides a model of how p52 and p8 stimulate the ATPase activity of XPB, which is essential for NER and transcription. The structural and biochemical findings of this work provide an additional building block towards the uncovering of the architecture and function of this essential transcription factor. N2 - Die Unversehrtheit ihrer DNA ist für jede lebende Zelle elementar. Die DNA ist jedoch fortwährend exogenen und endogenen Toxinen ausgeliefert, die eine Vielfalt unterschiedlicher DNA-Schäden verursachen. Die sehr ernsthaften Konsequenzen einer Anhäufung von DNA-Schäden spiegeln sich in der Entstehung von Tumorerkrankungen und Alterung wider. Verschiedene DNA-Reparaturmechanismen sorgen für die Reparatur von DNA-Schäden und erhalten so die Unversehrtheit der DNA. Einer dieser DNA-Reparaturmechanismen ist die Nukleotid-Exzisions-Reparatur (NER), die bekannt dafür ist, eine Vielfalt an strukturell unterschiedlichen DNA-Schäden zu adressieren. Eine Schlüsselkomponente der eukaryotischen NER ist der Transkriptionsfaktor II H (TFIIH), welcher nicht nur für die DNA-Reparatur, sondern auch für die Transkription essentiell ist. Der TFIIH Komplex besteht aus zehn Untereinheiten. Wie diese Untereinheiten zusammenarbeiten, um die DNA um den Schaden herum zu entwinden, ist jedoch noch nicht hinreichend bekannt. Hochaufgelöste Strukturdaten und biochemische Einblicke in die Funktion jeder Untereinheit sind daher unabkömmlich, um das funktionelle Netzwerk innerhalb dieses Transkriptionsfaktors zu verstehen. Die Bedeutung eines intakten TFIIH Komplexes spiegelt sich in den verheerenden Folgen von Patientenmutationen in den TFIIH Untereinheiten XPB, XPD oder p8 wider, die zu den kennzeichnenden Krankheitsbildern von Xeroderma Pigmentosum, Cockayne Syndrom und Trichothiodystrophie führen. Ein fehlerhafter NER Reparaturweg ist ferner mit einigen Krebsarten wie Hautkrebs assoziiert. Die hier beschriebene Arbeit hat sich auf fünf TFIIH Untereinheiten konzentriert, die aus dem thermophilen Pilz Chaetomium thermophilum stammen, das p34/p44 Heterodimer und der ternäre XPB/p52/p8 Komplex. Die Interaktion zwischen p34 und p44 wurde basierend auf einer hochaufgelösten Kristallstruktur des p34_vWA/p44_RING Minimalkomplexes charakterisiert. Biochemische Studien der p34/p44 Interaktion haben zur Aufdeckung einer weiteren Interaktion zwischen p34 und p44 geführt, die bisher noch nicht charakterisiert wurde. Die p34/p44 Interaktion ist von zentraler Bedeutung für TFIIH, was die Gegenwart mehrerer redundanter Schnittstellen zwischen p34 und p44, um die p34/p44 Interaktion abzusichern, rechtfertigt und erklären könnte, warum bislang keine Patientenmutationen in diesen Untereinheiten identifiziert wurden. Die p52 Untereinheit von TFIIH ist bekannt dafür, die ATPase-Aktivität von XPB zu stimulieren, die während der NER benötigt wird. Diese Arbeit zeigt die erste vollständige atomare strukturelle Charakterisierung von p52, die aus verschiedenen Kristallstrukturen von p52 Varianten und einer p52/p8 Variante, welche die Interaktion zwischen p52 und p8 darstellt, stammt. Das Strukturmodel von p52 bietet die Möglichkeit Interaktionen mit anderen TFIIH Untereinheiten zu analysieren. Es wurde gezeigt, dass die mittlere Domäne 2 von p52 und die N-terminale Domäne von XPB die hauptsächliche Interaktion zwischen den beiden Untereinheiten vermitteln. Eine Analyse der p52 Kristallstrukturen in neuesten publizierten cryo-Elektronenmikroskopie TFIIH-Strukturen ermöglichte die Erstellung eines Models, das zeigt, wie p52 und p8 die ATPase-Aktivität von XPB stimulieren, welche essentiell für die NER und die Transkription ist. Die strukturellen und biochemischen Erkenntnisse dieser Arbeit bieten einen wichtigen Beitrag zur Enthüllung der Architektur und Funktion von TFIIH, einem essentiellen zellulären Komplex. KW - DNS-Reparatur KW - Röntgenkristallographie KW - Strukturbiologie KW - DNA repair KW - TFIIH KW - Nucleotide excision repair KW - Nukleotid-Exzisions-Reparatur Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-168926 ER - TY - THES A1 - Tylek, Tina T1 - Establishment of a Co-culture System of human Macrophages and hMSCs to Evaluate the Immunomodulatory Properties of Biomaterials T1 - Etablierung eines Co-Kultur-Systems von humanen Makrophagen und hMSCs zur Bewertung der Immunmodulatorischen Eigenschaften von Biomaterialien N2 - The outcome of the innate immune response to biomaterials mainly determines whether the material will be incorporated in the body to fulfill its desired function or, when it gets encapsulated, will be rejected in the worst case. Macrophages are key players in this process, and their polarization state with either pro- (M1), anti-inflammatory (M2), or intermediate characteristics is crucial for deciding on the biomaterial’s fate. While a transient initial pro-inflammatory state is helpful, a prolonged inflammation deteriorates the proper healing and subsequent regeneration. Therefore, biomaterial-based polarization may aid in driving macrophages in the desired direction. However, the in vivo process is highly complex, and a mono-culture of macrophages in vitro displays only one part of the cellular system, but, to this date, there is a lack of established co-cultures to assess the immune response to biomaterials. Thus, this thesis aimed to establish a functional co-culture system of human macrophages and human mesenchymal stromal cells (hMSCs) to improve the assessment of the immune response to biomaterials in vitro. Together with macrophages, hMSCs are involved in tissue regeneration and inflammatory reactions and can modulate the immune response. In particular, endogenously derived hMSCs considerably contribute to the successful engrafting of biomaterials. This thesis focused on poly(ε-caprolactone) (PCL) fiber-based scaffolds produced by the technique of melt electrowriting (MEW) as biomaterial constructs. Via this fabrication technique, uniform, precisely ordered scaffolds varying in geometry and pore size have been created in-house. To determine the impact of scaffold geometries and pore sizes on macrophages, mono-cultures incubated on scaffolds were conducted. As a pre-requisite to achieve a functional co-culture system on scaffolds, setups for direct and indirect systems in 2D have initially been established. These setups were analyzed for the capability of cell-cell communication. In parallel, a co-culture medium suitable for both cell types was defined, prior to the establishment of a step-by-step procedure for the co-cultivation of human macrophages and hMSCs on fiber-based scaffolds. Regarding the scaffold morphologies tested within this thesis to improve M2-like polarization, box-shaped scaffolds outperformed triangular-, round- or disordered-shaped ones. Upon further investigation of scaffolds with box-shaped pores and precise inter-fiber spacing from 100 µm down to only 40 µm, decreasing pore sizes facilitated primary human macrophage elongation accompanied by their differentiation towards the M2 type, which was most pronounced for the smallest pore size of 40 µm. To the best of my knowledge, this was the first time that the elongation of human macrophages in a 3D environment has been correlated to their M2-like polarization. Thus, these results may set the stage for the design, the assessment, and the selection of new biomaterials, which can positively affect the tissue regeneration. The cell communication of both cell types, detected via mitochondria exchange in direct and indirect co-cultures systems, took place in both directions, i.e., from hMSCs to macrophages and vice versa. Thereby, in direct co-culture, tunneling nanotubes enabled the transfer from one cell type to the respective other, while in indirect co-culture, a non-directional transfer through extracellular vesicles (EVs) released into the medium seemed likely. Moreover, the phagocytic activity of macrophages after 2D co-cultivation and hence immunomodulation by hMSCs increased with the highest phagocytic rate after 48 h being most pronounced in direct co-cultivation. As the commonly used serum supplements for macrophages and hMSCs, i.e., human serum (hS) and fetal calf serum (FCS), respectively, failed to support the respective other cell type during prolonged cultivation, these sera were replaced by human platelet lysate (hPL), which has been proven to be the optimal supplement for the co-cultivation of human macrophages with hMSCs within this thesis. Thereby, the phenotype of both cell types, the distribution of both cell populations, the phagocytic activity of macrophages, and the gene expression profiles were maintained and comparable to the respective standard mono-culture conditions. This was even true when hPL was applied without the anticoagulant heparin in all cultures with macrophages, and therefore, heparin was omitted for further experiments comprising hPL and macrophages. Accordingly, a step-by-step operating procedure for the co-cultivation on fiber-based scaffolds has been established comprising the setup for 3D cultivation as well as the description of methods for the analysis of phenotypical and molecular changes upon contact with the biomaterial. The evaluation of the macrophage response depending on the cultivation with or without hMSCs and either on scaffolds or on plastic surfaces has been successfully achieved and confirmed the functionality of the suggested procedures. In conclusion, the functional co-culture system of human macrophages and hMSCs established here can now be employed to assess biomaterials in terms of the immune response in a more in vivo-related way. Moreover, specifically designed scaffolds used within the present thesis showed auspicious design criteria positively influencing the macrophage polarization towards the anti-inflammatory, pro-healing type and might be adaptable to other biomaterials in future approaches. Hence, follow-up experiments should focus on the evaluation of the co-culture outcome on promising scaffolds, and the suggested operating procedures should be adjusted to further kinds of biomaterials, such as cements or hydrogels. N2 - Der Verlauf der angeborene Immunantwort auf Biomaterialien bestimmt maßgebend, ob das Material vom Körper angenommen wird, um so seine gewünschte Funktion zu erfüllen, oder ob es zur Einkapselung und im schlimmsten Fall zur Abstoßung kommt. Makrophagen spielen in diesem Prozess eine Schlüsselrolle, und ihr Polarisationszustand, entweder pro (M1), antiinflammatorisch (M2) oder ein dazwischenliegender Subtyp, ist dabei von entscheidender Bedeutung. Während ein vorübergehender proinflammatorischer Anfangszustand hilfreich ist, verschlechtert eine anhaltende Entzündung eine zeitnahe Heilung und die anschließende Regeneration. Daher könnte eine durch Biomaterialien beeinflusste Polarisation hilfreich sein, um die Makrophagen in die gewünschte Richtung zu lenken. Die in vivo Reaktion ist jedoch äußerst komplex und die Kultivierung von Makrophagen in vitro stellt nur einen Teil des Prozesses dar. An etablierten Co-Kultursystem zur Untersuchung der immunmodulierenden Eigenschaften von Biomaterialien mangelt es jedoch. Daher war es Ziel dieser Arbeit ein funktionelles Co-Kultursystem von humanen Makrophagen und humanen mesenchymalen Stromazellen (hMSCs) zu etablieren um die in vitro Bewertung der Immunantwort nach Kontakt mit Biomaterialien zu verbessern. Von Interesse sind hMSCs hierbei, da sie zusammen mit Makrophagen an der Geweberegeneration und an Entzündungsreaktionen beteiligt sind. Zudem weisen MSCs immunmodulierende Eigenschaften in Hinblick auf Makrophagen auf und sind aktiv am Verlauf der Fremdkörperreaktion nach der Transplantation von Biomaterial beteiligt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Poly(ε-caprolactone) (PCL)-Scaffolds auf Faserbasis als Biomaterialkonstrukte verwendet, welche mit der Technik des Melt Electrowriting (MEW) hergestellt wurden. Mit dieser Technik kann sowohl die Form der Scaffolds als auch die Porengröße variiert werden. Um Unterschiede der Scaffoldgeometrien und Porengrößen in Hinblick auf die Makrophagenreaktion zu untersuchen, wurden zunächst Versuche mit Makrophagen-Monokulturen durchgeführt. Zur Etablierung eines funktionellen Co-Kultursystem, wurde zu Beginn ein Aufbau für ein direktes und indirektes System in 2D erstellt. Dieser Aufbau wurde anschließend auf die Möglichkeit der Zell-Zell-Kommunikation darin analysiert. Weiterhin wurde ein, für beide Zelltypen, geeignetes Kulturmedium definiert, gefolgt von der Etablierung eines Protokoll für die Co-Kultivierung beider Zelltypen auf faserbasierten Scaffolds. Im Bezug zu dieser Arbeit wurden Scaffolds mit unterschiedlicher Geometrie mittels der Technik des Melt Electrowriting hergestellt um die Veränderung der Makrophagenpolarisation zu untersuchen. Dabei zeigte sich eine verstärkte M2-Polarisation auf Scaffolds mit einer kastenförmigen Morphologie, verglichen mit dreieckigen, runden oder ungeordnet-strukturierten Scaffolds. Die weitere Untersuchung von Scaffolds mit kastenförmigen Poren und präzisen Faserabständen von 100 µm bis zu 40 µm zeigte das kleinere Porengrößen die Elongation primärer menschlicher Makrophagen förderten. Begleitet wurde die verstärkte Elongation mit einer gesteigerten Polarisation in Richtung des M2 Typs. Dieser Effekt war nach Kultivierung von Makrophagen auf Scaffolds mit 40 µm Poren am stärksten ausgeprägt. Im Rahmen dieser Arbeit konnte damit erstmals eine länglichen Morphologie humaner Makrophagen mit einer Polarisierung in den M2 Typ korreliert werden. Diese Ergebnisse könnten daher für das Design neuer Biomaterialien, welche sich positiv auf die Geweberegeneration auswirken sollen, von Bedeutung sein. Die Zellkommunikation beider Zelltypen, welche über Mitochondrienaustausch im direkten und indirekten Co-Kultur-System nachgewiesen wurde, fand sowohl ausgehend von Makrophagen als auch von hMSCs statt. Dabei ermöglichten „Tunneling Nanotubes“ in der direkten Co-Kultur den Transfer von Mitochondrien von einem Zelltyp zum jeweils anderen, während in der indirekter Co-Kultur ein ungerichteter Transfer durch in das Medium freigesetzte extrazelluläre Vesikel (EVs) stattfand. Darüber hinaus wurde die phagozytotische Aktivität von Makrophagen nach Co-Kultivierung untersucht, um die immunmodulatorischen Eigenschaften von hMSCs nachzuweisen, wobei die höchste phagozytotische Aktivität nach 48 stündiger Co-Kultivierung festgestellt wurde. Da die üblicherweise verwendeten Serumzusätze für Makrophagen (humanes Serum (hS)) und hMSCs (fötales Kälberserum (FCS)) bei längerer Kultivierung den jeweils anderen Zelltyp nicht unterstützen konnten, wurden diese Seren durch humanes Thrombozytenlysat (hPL) ersetzt. Dieses erwies sich im Rahmen dieser Arbeit als optimale Ergänzung für die gemeinsame Kultivierung beider Zelltypen in der Co-Kultur. Dabei wurden der Phänotyp und die Populationsverteilung beider Zelltypen, sowie die phagozytotische Aktivität und die Veränderung des Genexpressionsprofils von Makrophagen untersucht und mit den jeweiligen Standard-Monokulturbedingungen verglichen. Des Weiteren konnte gezeigt werde, dass eine Zugabe von Heparin in Zellkulturen mit Makrophagen und hPL nicht nötig ist. Daher wurde auf den Zusatz von Heparin für alle weitere Experimente, die hPL und Makrophagen umfassten, verzichtet. Im letzten Teil der Arbeit wurde ein Protokoll für die Co-Kultivierung auf MEW Scaffolds erstellt. Neben der Etablierung eines Setups für die 3D-Kultivierung wurden sowohl Protokolle zur Bewertung phänotypischer als auch molekularer Veränderungen entwickelt. Durch Feststellung von Unterschieden in der Makrophagenreaktion in Abhängigkeit zu der Kultivierung mit / ohne hMSCs und entweder auf Scaffolds oder Plastik-Kulturschalen konnte die Funktionalität der Protokolle nachgewiesen werden. Mit dem in dieser Arbeit etabliertem funktionellen Co-Kultursystem von humanen Makrophagen und hMSCs können zukünftig Biomaterialien mit einem stärkeren in vivo -Bezug in Hinblick auf die Immunantwort bewertet werden. Darüber hinaus deuten Ergebnisse auf speziell konstruierte MEW-Scaffolds ein vielversprechendes Designkriterium für neu entwickelte Biomaterialien an, wobei die Polarisation der Makrophagen in Richtung des entzündungshemmenden, heilungsfördernden Typens durch eine gesteuerte Morphologieänderung beeinflusst werden kann. An diese Arbeit anschließende Experimente sollten sich auf die Untersuchung vielversprechender Scaffolds mittels Co-Kultivierung sowie auf die Anpassung der etablierten Protokolle an andere Biomaterialgruppen, wie beispielsweiße für Zemente oder Hydrogele, konzentrieren. KW - Makrophage KW - Biomaterial KW - Co-culture system KW - Mesenchymal stromal cells KW - Macrophages Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-203570 ER - TY - THES A1 - Joshi, Hemant Kumar T1 - Function of IRAK2 in macrophages and HECTD1 in B cells T1 - Funktion von IRAK2 in makrophagen und HECTD1 in B zellen N2 - The Immune system exerts its response against invading pathogens via a cumulative, sequential cooperation of immune cells coordinated by their secreted products. Immune cells, such as macrophages and dendritic cells (DCs), express toll-like receptors (TLRs) to sense the presence of pathogens through pathogen-associated molecular patterns (PAMPs). The interaction of PAMPs with TLRs elicits a cytosolic signaling cascade that enhances the expression of genes to stimulate inflammation. Interleukin 1 receptor-associated kinase 2 (IRAK2) is a component of the TLR signaling pathway. IRAK2 transduces the TLR signal via a direct interaction with TNF receptor-associated factor 6 (TRAF6) and subsequent enhancement of its ubiquitination. During my PhD thesis, I determined that a 55-amino acid long stretch at the C-terminal end of IRAK2 is important for TLR signaling. Overexpression of C-terminal truncated IRAK2 (IRAK2Δ55) in the murine macrophage cell line RAW 264.7 led to impaired CD40 expression after TLR4 stimulation by Lipopolysaccharide (LPS). I observed attenuated competency of IRAK2Δ55 in restoring a full TLR signaling response i.e. IL-6 secretion, NO production and CD40 expression in IRAK2-deficient RAW cells generated via CRISPR-Cas9 approach. Additionally, diminished TLR4 induced activation of nuclear factor κB (NF-κB) and extracellular signal related kinase (ERK) was observed with IRAK2Δ55 reconstituted RAW cells as compared to cell reconstituted with wildtype IRAK2. IRAK2Δ55 reconstituted RAW cells also exhibited reduced TLR4-induced cell death and phosphorylation of receptor interacting protein kinase 3 (RIP3). Co-immunoprecipitation experiments in HEK 293T cells showed that IRAK2Δ55 was still able to bind to TRAF6 alike IRAK2 but failed to induce ubiquitination of TRAF6. In conclusion, the results suggest that the IRAK2 TRAF6 interaction is not sufficient to sustain full TLR signaling. An C-terminus-dependent unknown molecular mechanism is also involved. Through my PhD work, I also analyzed a B cell lineage-specific HECTD1 knock-out mice. HECTD1 is an E3 ubiquitin ligase for various substrate proteins, such as heat shock protein 90 (HSP90), adenomatous polyposis coli and phosphatidylinositol phosphate kinase type 1 γ. Hsp90 regulates a variety of signaling molecules in NF-κB activation pathways which are essential for an optimal B cell response. HECTD1-deficient pro-B cells developed normally into mature B cells. However, TLR4 stimulated HECTD1-deficient B cells displayed reduced immunoglobulin (Ig) production in in vitro cultures. In addition, mice with HECTD1-deficient B cells showed a diminished Ig response after nitrophenylacetyl-keyhole limpet hemocyanin immunization. Thus, HECTD1 is necessary for efficient Ig secretion. N2 - Auf das Eindringen von Pathogenen in den Körper antwortet das Immunsystem mit einer kumulativen, sequenziellen und wechselseitigen Zusammenarbeit zwischen Immunzellen, ihren Oberflächenrezeptoren sowie den von ihnen sezernierten Mediatoren. Immunzellen, wie Makrophagen und dendritische Zellen (DZ), sind dabei in der Lage mittels Toll-like Rezeptoren (TLRs) das Vorhandensein von Pathogenen über Pathogen-assoziierte molekulare Muster (pathogen-associated molecular patterns, PAMPs) zu detektieren. Die Bindung von PAMPs an TLRs führt über intrazelluläre Signalkaskaden zu einer verstärkten Expression pro-inflammatorischer Gene und damit zur Initiierung einer Immunreaktion. Die Interleukin 1 Rezeptor-assoziierte Kinase 2 (IRAK2) ist einer Komponente der TLR Signalkaskade. IRAK2 bindet direkt an den TNF-Rezeptor-assozierten Faktor 6 (TRAF6), welcher daraufhin verstärkt ubiquitiniert wird. In meiner Promotionsarbeit habe ich einen 55 Aminosäure langen Abschnitt im C-Terminus von IRAK2 identifiziert, der für die Signalleitung von TLRs essentiell ist. Die Überexpression von mutierten IRAK2, dem dieser C-terminale Bereich fehlt (IRAK2∆55), in der murinen Macrophagen Zelllinie RAW 264.7 führte zu einer verminderten Expression von CD40 nach Stimulation des TLR4 durch Lipopolysaccharid (LPS). Wurden IRAK2-defiziente RAW Zellen mit dem mutierten IRAK2∆55 Gen rekonstituiert, zeigten diese Zellen verglichen mit Zellen, die mit dem wildtypischen Gen rekonstituiert wurden, eine verminderte Aktivierung des nuclear factor κB (NF-κB) und der extracellular signal related kinase (ERK) nach Stimulation des TLR4. Ebenso waren die Expression von CD40, die Sekretion von IL-6 und NO gestört. In IRAK2-defizienten und IRAK2∆55 RAW Zellen war eine Reduktion des durch TLR4 induzierten Zelltodes sowie der TLR4-induzierten Phosphorylierung der Rezeptor-interagierenden Proteinkinase 3 (RIP3) zu beobachten. Ko-Immunpräzipitationsexperimente mit HEK 293T Zellen zeigten, dass IRAK2∆55 genauso wie intaktes IRAK2 zwar in der Lage ist, TRAF6 zu binden, aber nicht dessen Ubiquitinylierung zu induzieren. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die Interaktion von IRAK2 mit TRAF6 für ein optimales TLR-Signal nicht ausreichend ist und deshalb ein bisher unbekannter Mechanismus an der Signalweiterleitung beteiligt sein muss. Dieser Mechanismus ist vom C-terminalen Ende von IRAK2 abhängig. In einem zweiten Teil meiner Doktorarbeit analysierte ich B-Zellen von Mäusen, in denen HECTD1-spezifisch in der B-Zellentwicklungslinie deletiert wurde. HECTD1 ist eine E3 Ubiquitin-Ligase für zahlreiche Substratproteine, wie bspw. dem Hitzeschock-Protein (heat-shock-protein, HSP90), dem adenomatösen Polyposis coli Protein oder der Phosphatidylinositol Phosphatkinase Typ 1 γ. HSP90 reguliert eine Vielzahl an Signalmolekülen im NF-κB Signalweg, die für eine optimale B-Zell-Antwort wesentlich sind. HECTD1-defiziente pro-B-Zellen entwickelten sich normal zu reifen B-Zellen. Die Stimulation des TLR4 auf HECTD1-defizienten B-Zellen führte in vitro zu einer im Vergleich zu wildtypischen B-Zellen reduzierten Immunglobulin-Sekretion. Eine reduzierte Immunglobulin-Antwort konnte auch in B-Zell-spezifischen hectd1-/- Mäusen beobachtet werden, wenn diese zuvor mit Schlitzschnecken-Hämocyanin (Keyhole Limpet Hemocyanin, NP-KLH) immunisiert wurden. Die reduzierte Produktion von Antikörpern durch HECTD1-defiziente B-Zellen zeigt, dass dieses Protein für diese zentrale Aufgabe von B-Zellen notwendig ist. KW - Toll-like-Rezeptoren KW - IRAK2 KW - HECTD1 KW - Signaltransduktion KW - TLR signaling Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-150846 ER - TY - THES A1 - Scheide-Nöth, Jan-Philipp T1 - Activation of the Interleukin-5 receptor and its inhibition by cyclic peptides T1 - Aktivierung des IL-5 Rezeptors und dessen Inhibierung durch zyklische Peptide N2 - The cytokine interleukin-5 (IL-5) is part of the TH2-mediated immune response. As a key regulator of eosinophilic granulocytes (eosinophils), IL-5 controls multiple aspects of eosinophil life. Eosinophils play a pathogenic role in the onset and progression of atopic diseases as well as hypereosinophilic syndrome (HES). Here, cytotoxic proteins and pro-inflammatory mediators stored in intracellular vesicles termed granula are released upon activation thereby causing local inflammation to fight the pathogen. However, if such inflammation persists, tissue damage and organ failure can occur. Due to the close relationship between eosinophils and IL-5 this cytokine has become a major pharmaceutical target for the treatment of atopic diseases or HES. As observed with other cytokines, IL-5 signals by assembling a heterodimeric receptor complex at the cell surface in a stepwise mechanism. In the first step IL-5 binds to its receptor IL-5Rα (CD125). This membrane-located complex then recruits the so-called common beta chain βc (CD131) into a ternary ligand receptor complex, which leads to activation of intracellular signaling cascades. Based on this mechanism various strategies targeting either IL-5 or IL-5Rα have been developed allowing to specifically abrogate IL-5 signaling. In addition to the classical approach of employing neutralizing antibodies against IL 5/IL-5Rα or antagonistic IL-5 variants, two groups comprising small 18 to 30mer peptides have been discovered, that bind to and block IL-5Rα from binding its activating ligand IL-5. Structure-function studies have provided detailed insights into the architecture and interaction of IL-5IL-5Rα and βc. However, structural information for the ternary IL-5 complex as well as IL-5 inhibiting peptides is still lacking. In this thesis three areas were investigated. Firstly, to obtain insights into the second receptor activation step, i.e. formation of the ternary ligand-receptor complex IL-5•IL-5Rα•βc, a high-yield production for the extracellular domain of βc was established to facilitate structure determination of the ternary ligand receptor assembly by either X-ray crystallography or cryo-electron microscopy. In a second project structure analysis of the ectodomain of IL-5Rα in its unbound conformation was attempted. Data on IL-5Rα in its ligand-free state would provide important information as to whether the wrench-like shaped ectodomain of IL-5Rα adopts a fixed preformed conformation or whether it is flexible to adapt to its ligand binding partner upon interaction. While crystallization of free IL-5Rα failed, as the crystals obtained did not diffract X rays to high resolution, functional analysis strongly points towards a selection fit binding mechanism for IL-5Rα instead of a rigid and fixed IL-5Rα structure. Hence IL-5 possibly binds to a partially open architecture, which then closes to the known wrench-like architecture. The latter is then stabilized by interactions within the D1-D2 interface resulting in the tight binding of IL-5. In a third project X-ray structure analysis of a complex of the IL-5 inhibitory peptide AF17121 bound to the ectodomain of IL-5Rα was performed. This novel structure shows how the small cyclic 18mer peptide tightly binds into the wrench-like cleft formed by domains D1 and D2 of IL-5Rα. Due to the partial overlap of its binding site at IL-5Rα with the epitope for IL-5 binding, the peptide blocks IL-5 from access to key residues for binding explaining how the small peptide can effectively compete with the rather large ligand IL-5. While AF17121 and IL-5 seemingly bind to the same site at IL-5Rα, functional studies however showed that recognition and binding of both ligands differ. With the structure for the peptide-receptor complex at hand, peptide design and engineering could be performed to generate AF17121 analogies with enhanced receptor affinity. Several promising positions in the peptide AF17121 could be identified, which could improve inhibition capacity and might serve as a starting point for AF17121-based peptidomimetics that can yield either superior peptide based IL-5 antagonists or small-molecule-based pharmacophores for future therapies of atopic diseases or the hypereosinophilic syndrome. N2 - Das Zytokin Interleukin-5 (IL-5) nimmt eine zentrale Rolle im Zellzyklus von eosinophlien Granulozyten (Eosinophile) ein, indem es beispielsweise die Differenzierung, Aktivierung und Apoptose dieser Zellen steuert. Als Immunantwort auf Pathogene kommt es zur Aktivierung von Eosinophilen. Dieses führt zur Freisetzung von in intrazellulären Vesikeln (Granula) gespeicherten zytotoxischen Proteinen und proinflammatorischen Mediatoren, wodurch lokale Entzündungen verursacht werden, um den Erreger zu bekämpfen. Fehlregulationen (übermäßige Produktion) von eosinophilen Granulozyten können zu Gewebeschäden und Organversagen führen, wenn diese über einen längeren Zeitraum bestehen, und sind insbesondere mit dem Ausbruch und Fortschreiten von atopischen Erkrankungen sowie dem Hypereosinophilen Syndrom (HES) assoziiert. IL-5 muss, um die Eosinophilen aktivieren zu können, an einen heterodimeren Transmembranrezeptor binden. Im ersten Schritt bindet IL-5 an seinen zytokin-spezifischen Rezeptor IL-5Rα (CD125). Dieser membrangebundene Komplex rekrutiert dann die sogenannte gemeinsame („common“) beta-Kette βc (CD131) in einen ternären Liganden Rezeptorkomplex, was zur Aktivierung von intrazellulären Signalkaskaden führt. Aufgrund dieser engen Beziehung zwischen Eosinophilen und IL-5 ist dieses Zytokin in den Fokus der pharmazeutischen Industrie für die Behandlung atopischer Erkrankungen oder HES gerückt. Bisherige Therapien basieren auf der Unterdrückung der Immunreaktion durch Corticosteroide, neutralisierende gegen IL 5/IL-5Rα gerichtete Antikörper oder antagonistische IL-5 Varianten. Eine alternative Therapiemöglichkeit stellen IL-5 inhibierende Peptide dar, welche an IL 5Rα binden und hierbei die Bindung des aktivierenden Liganden (IL-5) hemmen. Derzeit stehen Strukturen vom binären IL-5IL-5Rα Komplex und von βc im ungebundenen Zustand zur Verfügung. Zudem konnten wichtige Wechselwirkungen im binären Komplex identifiziert werden. Allerdings sind vom ternären IL-5 Komplex und den IL-5 inhibierenden Peptiden keinerlei Strukturdaten bekannt. Um im Rahmen dieser Arbeit Einblicke in den zweiten Rezeptoraktivierungsschritt, d.h. die Bildung des ternären Ligand-Rezeptor Komplexes IL-5•IL-5Rα•βc, zu erhalten, wurde ein Herstellungsverfahren für die extrazelluläre Domäne von βc etabliert. Zusammen mit den optimierten Reinigungsverfahren für IL-5 und IL 5Rα konnte hiermit eine gute Grundlage für zukünftige Strukturanalysen des ternären IL-5 Komplexes geschaffen werden. In einem zweiten Projekt wurde versucht, die Struktur der Ektodomäne von IL 5Rα in ihrem freien Zustand aufzuklären. Diese Strukturdaten würden wichtige Informationen darüber liefern, ob die bisher bekannte „Schraubenschlüssel“-Architektur der IL-5Rα Ektodomäne in einer rigiden, vorgebildeten Konformation vorliegt, oder ob die Architektur der Ektodomäne bei Bindung flexibel an ihren Liganden angepasst wird. Während die Kristallisation von IL-5Rα ohne einen Bindepartner fehlschlug, deuten neue Funktionsanalysen auf einen „selection fit binding mechanism“ für IL-5Rα hin. Der relativ große Ligand IL-5 bindet daher sehr wahrscheinlich an eine teilweise „offene“ Rezeptorkonformation, die erst nach Bindung die bekannte „Schraubenschlüssel“-Architektur annimmt. In einem dritten Projekt wurde eine Strukturanalyse des Komplexes des IL-5 inhibierenden AF17121 Peptids gebunden an die Ektodomäne von IL-5Rα durchgeführt. Anhand dieser neuen Struktur lässt sich erklären, wie das kleine zyklische 18mer Peptid effektiv mit dem wesentlich größeren Liganden IL-5 um die Bindung am Rezeptor konkurrieren kann. Aufgrund der Überlappung der Bindestellen von AF17121 und IL-5 am Rezeptor IL 5Rα blockiert das Peptid den Zugang von IL-5 an seinen Rezeptor. Obwohl AF17121 und IL-5 in einem ähnlich Strukturbereich in IL-5Rα binden, zeigen funktionelle Studien, dass sich Erkennung und Bindung beider Liganden unterscheiden. Mit der vorliegenden Struktur vom Peptid Rezeptor Komplex konnte ein strukturbasiertes Peptid-Design durchgeführt und so AF17121 Varianten mit verbesserter Rezeptorbindung erzeugt werden. Dabei wurden mehrere Positionen im Peptid AF17121 identifiziert, die dessen Inhibierungseigenschaften möglicherweise verbessern. Somit konnte ein weiterer Grundstein für die Entwicklung von effektiveren Peptid-basierten IL 5 Antagonisten oder sogar nicht-peptidischen Inhibitoren für zukünftige Therapieansätze gegen atopische Erkrankungen oder HES gelegt werden. KW - Interleukin 5 KW - Eosinophiler Granulozyt KW - atopic diseases KW - eosinophil KW - interleukin-5 signaling KW - peptide-based interleukin-5 inhibitor KW - peptide engineering KW - receptor KW - functional studies KW - structure analysis Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-182504 ER - TY - THES A1 - Pernitzsch, Sandy Ramona T1 - Functional Characterization of the abundant and conserved small regulatory RNA RepG in Helicobacter pylori T1 - Funktionelle Charakterisierung der abundanten und konservierten kleinen regulatorischen RNA RepG in Helicobacter pylori N2 - Bacterial small non-coding RNAs (sRNAs) play fundamental roles in controlling and finetuning gene expression in a wide variety of cellular processes, including stress responses, environmental signaling and virulence in pathogens. Despite the identification of hundreds of sRNA candidates in diverse bacteria by genomics approaches, the mechanisms and regulatory capabilities of these posttranscriptional regulators have most intensively been studied in Gram-negative Gammaproteobacteria such as Escherichia coli and Salmonella. So far, almost nothing is known about sRNA-mediated regulation (riboregulation) in Epsilonproteobacteria, including the major human pathogen Helicobacter pylori. H. pylori was even thought to be deficient for riboregulation as none of the sRNAs known from enterobacteria are conserved in Helicobacter and since it lacks the major RNA chaperone Hfq, which is crucial for sRNA function as well as stability in many bacteria. Nonetheless, more than 60 cis- and trans-acting sRNA candidates were recently identified in H. pylori by a global RNA sequencing approach, indicating that this pathogen, in principle, has the capability to use riboregulation for its gene expression control. However, the functions and underlying mechanisms of H. pylori sRNAs remained unclear. This thesis focused on the first functional characterization and target gene identification of a trans-acting sRNA, RepG (Regulator of polymeric G-repeats), in H. pylori. Using in-vitro and in-vivo approaches, RepG was shown to directly base-pair with its C/Urich terminator loop to a variable homopolymeric G-repeat in the 5’ untranslated region (UTR) of the tlpB mRNA, thereby regulating expression of the chemotaxis receptor TlpB. While the RepG sRNA is highly conserved, the length of the G-repeat in the tlpB mRNA leader varies among different H. pylori isolates, resulting in a strain-specific tlpB regulation. The modification of the number of guanines within the G-stretch in H. pylori strain 26695 demonstrated that the length of the homopolymeric G-repeat determines the outcome of posttranscriptional control (repression or activation) of tlpB by RepG. This lengthdependent targeting of a simple sequence repeat by a trans-acting sRNA represents a new twist in sRNA-mediated regulation and a novel mechanism of gene expression control, since it uniquely links phase variation by simple sequence repeats to posttranscriptional regulation. In almost all sequenced H. pylori strains, tlpB is encoded in a two gene operon upstream of HP0102, a gene of previously unknown function. This study provided evidence that HP0102 encodes a glycosyltransferase involved in LPS O-chain and Lewis x antigen production. Accordingly, this glycosyltransferase was shown to be essential for mice colonization by H. pylori. The coordinated posttranscriptional regulation of the tlpB-HP0102 operon by antisense base-pairing of RepG to the phase-variable G-repeat in the 5’ UTR of the tlpB mRNA allows for a gradual, rather than ON/OFF, control of HP0102 expression, thereby affecting LPS biosynthesis in H. pylori. This fine-tuning of O-chain and Lewis x antigen expression modulates H. pylori antibiotics sensitivity and thus, might be advantageous for Helicobacter colonization and persistence. Whole transcriptome analysis based on microarray and RNA sequencing was used to identify additional RepG target mRNAs and uncover the physiological role of this riboregulator in H. pylori. Altogether, repG deletion affected expression of more than 40 target gene candidates involved various cellular processes, including membrane transport and adhesion, LPS modification, amino acid metabolism, oxidative and nitrosative stress, and nucleic acid modification. The presence of homopolymeric G-repeats/G-rich sequences in almost all target mRNA candidates indicated that RepG hijacks a conserved motif to recognize and regulate multiple target mRNAs in H. pylori. Overall, this study demonstrates that H. pylori employs riboregulation in stress response and virulence control. In addition, this thesis has successfully established Helicobacter as a new model organism for investigating general concepts of gene expression control by Hfq-independent sRNAs and sRNAs in bacterial pathogens. N2 - Bakterielle kleine, nicht-kodierende RNAs (sRNAs, engl. für small RNAs) spielen eine fundamentale Rolle in der Kontrolle und Feinabstimmung der Genexpression in Bakterien. Sie sind an einer Vielzahl von zellulären Prozessen, einschließlich der Adaption an unterschiedliche Stress- sowie Umweltbedingungen und der Virulenz von bakteriellen Pathogenen, beteiligt. Trotz der Identifizierung von Hunderten von sRNA-Kandidaten in diversen Bakterien durch genomweite Untersuchungsmethoden, wurden die regulatorischen Eigenschaften und Mechanismen dieser posttranskriptionellen Regulatoren bisher hauptsächlich in Gram-negativen Gammaproteobakterien wie Escherichia coli und Salmonella untersucht. Bislang ist nur wenig über sRNA-basierte Regulation (Riboregulation) in Epsilonproteobakterien, einschließlich dem weitverbreiteten Humanpathogen Helicobacter pylori, bekannt. Es wurde sogar angenommen, dass H. pylori über keine Art der Riboregulation verfügt, da keine der enterobakteriellen sRNAs in Helicobacter konserviert sind. Zudem konnte in diesem Erreger kein Homolog für das RNAChaperon Hfq, welches in vielen Bakterien essentiell für die Funktion und Stabilität von sRNAs ist, identifiziert werden. Nichtsdestotrotz wurden mit Hilfe einer globalen RNASequenzierungsstudie,die auf der Sequenzierung primärer Transkripte in einem Hochdurchsatzverfahren basiert, kürzlich mehr als 60 in cis- und in trans-agierende sRNAKandidaten in H. pylori identifiziert. Diese Transkriptomanalyse deutet darauf hin, dass H. pylori prinzipiell die Fähigkeit hat Riboregulation zur Kontrolle seiner Genexression zu nutzen. Die Funktionen und Mechanismen von sRNAs in H. pylori sind jedoch immer noch unklar. In der vorgelegten Arbeit wurde erstmals eine in trans-agierende sRNA, RepG (Regulator of polymeric G-repeats), in Helicobacter charakterisiert sowie dessen zelluläre Zielgene identifiziert. Mit Hilfe diverser in-vitro und in-vivo Analysen konnte gezeigt werden, dass der C/U-reiche Transkriptionsterminatorloop von RepG direkt an eine variable, repetitive G-Sequenz in der 5‘ untranslatierten Region (UTR) der tlpB mRNA bindet. Durch diese direkte sRNA-mRNA Interaktion wird die Expression des Chemotaxis Rezeptors TlpB reguliert. Im Gegensatz zu einer hohen Konservierung der Sequenz der RepG sRNA, variiert die Länge des G-Stretches im 5‘ UTR der tlpB mRNA zwischen unterschiedlichen H. pylori Isolaten. Diese Längenvariation resultiert in einer Stamm-spezifischen Regulation der TlpB Expression. Die Modifikation der Anzahl der Guanin-Basen im G-Stretch des H. pylori Stammes 26695 demonstrierte, dass die Länge der repetitiven G-Sequenz das Ergebnis der posttranskriptionellen Regulation (Repression oder Aktivierung) von tlpB durch RepG beeinflusst. Die hier beschriebene Längen-abhängige Interaktion zwischen einer in transagierenden sRNA und einer einfachen, repetitiven Sequenz repräsentiert nicht nur ein neues Konzept für die Genregulation durch sRNAs, sondern stellt auch einen neuen Mechanismus der Genexpressionskontrolle dar. Darüber hinaus, veranschaulicht die hier beschriebene sRNA-mRNA Interaktion eine bislang einzigartige Verknüpfung von Phasenvariation durch hochvariabel, repetitive Sequenzen mit Genregulation durch sRNAs. In nahezu allen sequenzierten H. pylori Stämmen ist das tlpB Gen in einem Operon zusammen mit einem Gen mit bisher unbekannter Funktion, HP0102, kodiert. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass HP0102 für eine Glykosyltransferase kodiert, die an der Synthese der O-Seitenketten des LPS und des Lewis x Antigens in H. pylori beteiligt ist. Darüber hinaus konnte demonstriert werden, dass diese Glykosyltransferase für die Kolonisierung des murinen Magens durch H. pylori essentiell ist. Die koordinierte, posttranskriptionelle Regulation des tlpB-HP0102 Operons, welche durch antisense Basenpaarung zwischen RepG und der phasen-variablen, repetitiven G-Sequenz im 5‘ UTR der tlpB mRNA vermittelt wird, ermöglicht eine graduelle Kontrolle der Genexpression von HP0102, und somit Einflussnahme auf die LPS Biosynthese in H. pylori. Diese Feinabstimmung der LPS O-Seitenketten und Lewis x Antigen Expression beeinflusst die Resistenz von H. pylori gegen diverse Antibiotika und könnte somit sowohl für die Kolonisierung als auch für die persistente Infektion des Wirts durch H. pylori vorteilhaft sein. Um Einblicke in die physiologische Funktion von RepG zu gewinnen, wurden in einer genom-weiten Transkriptomanalyse mittels Microarray und RNA-Sequenzierung weitere Zielgene von RepG bestimmt. Insgesamt beeinflusste die Deletion von repG die Expression von mehr als 40 potentiellen Zielgenen, welche an diversen zellulären Prozessen beteiligt sind, wie z.B. Membrantransport und Adhäsion, Aminosäure- und Nukleinsäure-Metabolismus, oxidative und nitrosative Stressantwort sowie LPS Modifizierung. Die Identifizierung von homopolymeren G-Stretchen bzw. G-reichen Sequenzen in allen ZielmRNAs deutet darauf hin, dass RepG ein konserviertes Motiv bindet, um mehrere Zielgene in H. pylori zu erkennen und zu regulieren. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass H. pylori Riboregulation basierend auf sRNAs nutzt, um seine Genexpression in unterschiedlichen Stress- und Virulenzbedingungen zu regulieren. Darüber hinaus hat diese Studie Helicobacter als neuen Modelorganismus für die Untersuchung genereller Wirkungsweisen Hfq-unabhängiger sRNAs und sRNAs in bakteriellen Pathogenen etabliert. KW - Small RNA KW - Helicobacter pylori KW - Genregulation KW - Riboregulation KW - Chemotaxis KW - LPS Biosynthese KW - Sequenzwiederholung KW - Phasenvariation Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-122686 ER - TY - THES A1 - Adenugba, Akinbami Raphael T1 - Functional analysis of the gene organization of the pneumoviral attachment protein G T1 - Funktionelle Analyse der Genorganisation des pneumoviralen Attachment-Protein G N2 - The putative attachment protein G of pneumonia virus of mice (PVM), a member of the Pneumoviruses, is an important virulence factor with so far ambiguous function in a virus-cell as well as in virus-host context. The sequence of the corresponding G gene is characterized by significant heterogeneity between and even within strains, affecting the gene and possibly the protein structure. This accounts in particular for the PVM strain J3666 for which two differing G gene organizations have been described: a polymorphism in nucleotide 65 of the G gene results in the presence of an upstream open reading frame (uORF) that precedes the main ORF in frame (GJ366665A) or extension of the major G ORF for 18 codons (GJ366665U). Therefore, this study was designed to analyse the impact of the sequence variations in the respective G genes of PVM strains J3666 and the reference strain 15 on protein expression, replication and virulence. First, the controversy regarding the consensus sequence of PVM J3666 was resolved. The analysis of 45 distinct cloned fragments showed that the strain separated into two distinct virus populations defined by the sequence and structure of the G gene. This division was further supported by nucleotide polymorphisms in the neighbouring M and SH genes. Sequential passage of this mixed strain in the cell line standardly used for propagation of virus stocks resulted in selection for the GJ366665A-containing population in one of two experiments pointing towards a moderate replicative advantage. The replacement of the G gene of the recombinant PVM 15 with GJ366665A or GJ366665U, respectively, using a reverse genetic approach indicated that the presence of uORF within the GJ366665A significantly reduced the expression of the main G ORF on translational level while the potential extension of the ORF in GJ366665U increased G protein expression. In comparison, the effect of the G gene-structure on virus replication was inconsistent and dependent on cell line and type. While the presence of uORF correlated with a replication advantage in the standardly used BHK-21 cells and primary murine embryonic fibroblasts, replication in the murine macrophage cell line RAW 264.7 did not. In comparison, the GJ366665U variant was not associated with any effect on replication in cultured cells at all. Nonetheless, in-vivo analysis of the recombinant viruses associated the GJ366665U gene variant, and hence an increased G expression, with higher virulence whereas the GJ366665A gene, and therefore an impaired G expression, conferred an attenuated phenotype to the virus. To extend the study to other G gene organizations, a recombinant PVM expressing a G protein without the cytoplasmic domain and for comparison a G-deletion mutant, both known to be attenuated in vivo, were studied. Not noticed before, this structure of the G gene was associated with a 75% reduction in G protein expression and a significant attenuation of replication in macrophage-like cells. This attenuation was even more prominent for the virus lacking G. Taking into consideration the higher reduction in G protein levels compared to the GJ366665A variant indicates that a threshold amount of G is required for efficient replication in these cells. In conclusion, the results gathered indicated that the expression levels of the G protein were modulated by the sequence of the 5’ untranslated region of the gene. At the same time the G protein levels modulated the virulence of PVM. N2 - Das mutmaßliche „attachment“ Protein G des Pneumonievirus der Maus (PVM), einem Mitglied des Genus Pneumovirus, ist ein bedeutender Virulenzfaktor, mit allerdings noch nicht vollständig verstandener Funktion. Dabei zeichnet sich die Sequenz des G-Gens durch Nukleotid-Polymorphismen und damit verbundenen Variationen in der Genorganisation und möglicherweise der Proteinstruktur sowohl zwischen als auch innerhalb von PVM-Stämmen aus. Insbesondere für den PVM-Stamm J3666 wurden zwei verschiedene Organisationen des G-Gens beschrieben: ein Polymorphismus des Nukleotids 65 des G-Genes erzeugt einen neuen „upstream Open reading frame“ (uORF), der dem eigentlichen G-ORF vorausgeht (GJ366665A), oder führt zu einer Verlängerung des eigentlichen G-ORF von G um 18 Kodons (GJ366665U). Ziel dieser Studie war es deshalb, die Auswirkung dieser Sequenzvariabilitäten der für PVM J3666 beschriebenen G-Gene im Vergleich zu dem des Referenzstamms PVM 15 bezüglich Proteinexpression, der Virusreplikation und der Virulenz zu untersuchen. Als erstes wurden die beschriebenen Sequenzunterschiede bezüglich des PVM-Stamms J3666 untersucht. Die Analyse von 45 verschiedenen klonierten Fragmenten von PVM J3666 zeigte, dass es sich bei diesem Stamm eigentlich um zwei separate Viruspopulationen handelt, die sich durch die Sequenz und Struktur des G-Genes definieren lassen. Diese Unterscheidung wird durch weitere Nukleotid-Polymorphismen in den benachbarten Genen, M und SH, gestärkt. Sequenzielle Passagierung dieses gemischten Stammes in der standardmäßig zur Virusanzucht verwendeten BHK-21-Zelllinie resultierte in einem von zwei Experimenten in der Selektion der GJ366665A-Population, das ein Hinweis auf einen moderaten Replikationsvorteil darstellt. Der Austausch des G-Gens des Referenzstamms PVM 15 durch GJ366665A oder GJ366665U mithilfe der Reversen Genetik, zeigte, dass der uORF innerhalb von GJ366665A zu einer deutlich reduzierten Expression des eigentlichen G-ORF führt. Andererseits führte die potenzielle Verlängerung des ORF in GJ366665U zu einer im gleichen Maße erhöhten Expression des G-Proteins. Dagegen war der Einfluss der G-Genorganisation auf die Virusvermehrung in Zellkultur in Abhängigkeit von Zelllinie und Zelltyp inkonsistent. Während ein uORF mit einem Replikationsvorteil in BHK-21-Zellen und primären murinen embryonen Fibroblasten korrelierte, war dies in der murinen Makrophagen-Zelllinie RAW 264.7 nicht zu beobachten. Im Vergleich dazu konnte die GJ366665U-Variante nicht mit einem Einfluss auf die Virusvermehrung in Verbindung gebracht werden. Nichtsdestotrotz, konnte die GJ366665U-Variante, und damit eine erhöhte Expression von G, mit einer gesteigerten Virulenz assoziiert werden, während die GJ366665A-Variante, d. h. eine verringerte G-Expression zur Attenuierung des Virus führte. Die Untersuchungen wurden auf weitere G-Genstrukturen, d.h. ein rekombinantes PVM, rPVM-Gt, das ein N-terminal verkürztes G-Protein exprimiert, ausgeweitet. Zum Vergleich wurde eine Deletionsmutante des kompletten G-Gens, rPVM-ΔG, mit einbezogen. Von beiden Viren war bereits bekannt, dass sie in vivo attenuiert sind. Die Organisation des Gt-Gens war mit einer um 75 % verringerten Expression des entsprechenden Proteins assoziiert, was zuvor nicht beobachtet worden war. Zugleich zeigte rPVM-Gt eine deutliche Attenuierung der Replikation in RAW 264.7-Zellen und primären Mausmakrophagen, die von der G-Deletionsmutante noch übertroffen wurde. Die im Vergleich zu der GJ366665A-Variante deutlich höhere Reduktion der G-Expression dieser beiden G-Mutanten in Betracht ziehend, scheint dies darauf hinzuweisen, dass eine bestimmte Mindestexpression von G für eine effiziente Virusvermehrung in diesen Zellen benötigt wird. Zusammenfassend deuten die erhaltenen Ergebnisse darauf hin, dass die Expression des G-Proteins durch die jeweiligen 5’ nicht-translatierte Region des Gens moduliert wird, was einen neuen Mechanismus für Negativstrang-RNA-Viren darstellt. Zugleich moduliert die Expressionsrate von G die Virulenz von PVM. KW - G glycoprotein KW - protein regulation and expression KW - Pneumoviruses KW - regulation KW - expression KW - replication KW - virulence KW - 5`-UTR KW - PVM KW - RSV Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-128146 ER - TY - THES A1 - Eißler, Christoph Marcel T1 - Assessment of the left ventricular systolic and diastolic function in rats using electrocardiogram-gated cardiac positron emission tomography T1 - Bestimmung der linksventrikulären systolischen und diastolischen Funktion in Ratten durch Elektrokardiogramm-getriggerte kardiale Positronen-Emissions-Tomographie N2 - DD is a cardiac disturbance, which has gained increasing importance in recent years due to its important role in different cardiac disease and cardiomyopathies including ischemic cardiomyopathy, arterial hypertension and diabetic cardiomyopathy. ECG-gated 18F-FDG PET is an imaging technique, that can distinguish between districts of myocardial viability and myocardial scars and further provides information of great interest on the efficacy of experimental approaches designed to improve the cardiac function and/or myocardial metabolism in experimental small animal models. However, ECG-gated 18F-FDG PET is a technique whose feasibility in the assessment of the LV diastolic function in small animals has not been a subject of study. In this thesis, the ability of the ECG-gated 18F-FDG PET for the assessment of both the systolic and diastolic function in eight control rats and in seven ZDF rats, which are an experimental animal model mimicking T2DM conditions and diabetic related complications in humans including DCM, has been investigated The ECG-gated 18F-FDG PET imaging was performed under hyperinsulinemic-euglycemic clamping and the data were stored in list mode files and retrospectively reconstructed. The systolic and diastolic parameters were achieved from the time/volume and the time/filling curve calculated from the software HFV. Additionally, the influence of the number of gates per cardiac cycle on the LV volumes and function parameters has been studied. Hyperinsulinemic-euglycemic clamp procedure and blood glucose measurement did confirm the development of a manifest diabetes in the ZDF rats at the timepoint of the experiments. Regarding the systolic parameters, no significant difference could be detected between the ZDF and ZL rats. The values for the CO were similar in both groups, which demonstrates a similar LV systolic function in the ZDF and the ZL rats at the age of 13 weeks. Values for the systolic parameters are in good line with previous PET, MRI and cardiac catheterization-based studies in diabetic rats. The main finding of this study was that by using in vivo ECG-gated 18F-FDG PET and the software HFV, reliable diastolic parameters could be calculated. Moreover, it was possible to detect the presence of a mild impaired diastolic filling in the ZDF rats in absence of any systolic alteration. This impaired diastolic function in an early stage of diabetes could also be detected by other investigators, who used echocardiography or cardiac catheterization. Therefore, this is the first study showing, that the assessment of the diastolic function in rats can be carried out by ECG-gated 18F-FDG PET imaging. In conclusion, additionally to calculating LV volumes and LV EF, ECG-gated 18F-FDG PET can evaluate the diastolic function of healthy and diabetic rats and is able to detect a DD in ZDF rats. N2 - Die DD ist eine Störung der Herzdynamik, welche, aufgrund ihrer Beteiligung in verschiedenen Herzerkrankungen und Kardiomyopathien wie der ischämischen Kardiomyopathie, der arteriellen Hypertonie und der diabetischen Kardiomyopathie, in den letzten Jahren zunehmend in das Interessenzentrum der Herzforschung gerückt ist. Die EKG-getriggerte 18F-FDG PET ist eine Bildgebungsmethode, welche die Unterscheidung von vitalem Myokard und Narben ermöglicht und zusätzlich noch in der Lage ist, wichtige Informationen zu erheben, welche von Bedeutung für die Beurteilung von experimentelle Behandlungen zur Verbesserung der Herzfunktion und/oder des kardialen Stoffwechsels in präklinischen Tiermodellen sind. Trotz dieser Möglichkeiten wurde bisher noch nicht die Fähigkeit der EKG-getriggerten 18F-FDG PET zur Bestimmung der LV diastoischen Funktion in Kleintiermodellen untersucht. Deshalb wurde in dieser Arbeit das Potential der EKG-getriggerten 18F-FDG PET in Bezug auf die Bestimmung der LV systolischen und diastolischen Funktion in acht Kontrollratten (ZL) und sieben ZDF-Ratten, welche eine experimentelles Tiermodell für T2DM und die damit verbundenen Komplikationen einschließlich der diabetischen Kardiomyopathie sind, untersucht. Die EKG-getriggerte 18F-FDG PET wurde unter der hyperinsulinämischen euglykämischen Klemm Methode durchgeführt, die Daten in „list-mode“ Dateien gespeichert und retrospektiv rekonstruiert. Die Berechnung der LV systolischen und diastolischen Parameter erfolge aus der Zeit-Volumen-Kurve und der Zeit-Füllungs-Kurve durch das Programm HFV. Zudem wurde der Einfluss der pro Rekonstruktion verwendeten „frames“ pro kardialen Zyklus auf die LV Volumina und die linksventrikulären Funktionsparameter untersucht. Durch die hyperinsulinämische euglykämische Klemm Methode und durch Blutglukose Messungen konnte die Entwicklung eines manifesten Diabetes zum Zeitpunkt der Experimente in den ZDF Ratten nachgewiesen werden. Es konnte kein signifikanter Unterschied zwischen den systolischen Parametern der ZDF und der ZL Ratten gefunden werden. Der kardiale Auswurf war nahezu identisch in den beiden Gruppen zum Zeitpunkt der Experimente, was eine vergleichbare systolische Funktion in beiden Gruppen demonstriert. Die erhobenen Werte für die systolischen Parameter befinden sich in guter Übereinstimmung mit den Werten der Literatur von vorherigen PET, MRT und Katheter-gestützten Experimenten in diabetischen Rattenmodellen. Ein wichtiges Ergebnis dieser Arbeit ist die Erhebung von verlässlichen diastolischen Parametern durch den kombinierten Einsatz von EKG-getriggerter 18F-FDG PET und HFV. Zudem war es möglich, eine gestörte diastolische Füllung des LV in den ZDF Ratten nachzuweisen, in Abwesenheit von systolischen Funktionseinschränkungen. Eine Beeinträchtigung der diastolischen Funktion in der frühen Phase des Diabetes wurde bereits in anderen Rattenstudien mittels Echokardiografie und Katheter basierten Untersuchungen gezeigt. Dennoch ist dies hier die erste Studie, welche demonstriert, dass die Bestimmung der diastolischen Funktion auch mit Hilfe der EKG-getriggerten 18F-FDG PET durchgeführt werden kann. In Zusammenfassung lässt sich festhalten, das zusätzlich zu der Bestimmung der LV-Volumina und der LVEF durch EKG-getriggerten 18F-FDG PET auch die Bestimmung der diastolischen Funktion in gesunden und diabetischen Ratten möglich ist und dass durch EKG-getriggerten 18F-FDG PET die Identifikation einer DD in ZDF Ratten möglich ist. KW - Positronen-Emissions-Tomografie KW - preclinical PET KW - ECG-gated PET KW - diastolic dysfunction KW - diabetic cardiomyopathy KW - HFpEF Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-219765 ER - TY - THES A1 - Aurbach, Katja T1 - Studies on the role of the cytoskeleton in platelet production T1 - Studien über die Rolle des Zytoskeletts in der Produktion von Thrombozyten N2 - Platelets are small anucleated cell fragments that originate from megakaryocytes (MKs), which are large cells located in the bone marrow (BM). MKs extend long cytoplasmic protrusions, a process which is called proplatelet formation, into the lumen of the sinusoidal vessels where platelets are sized by the bloodstream. During the process of platelet biogenesis, segments of the MK penetrate the endothelium and, through cytoskeletal remodeling inside the MK, proplatelet fragments are released. Rho GTPases, such as RhoA and RhoB, are critically involved in cytoskeletal rearrangements of both the actin and the tubulin cytoskeleton. The first part of this thesis concentrated on the protein RhoB and its involvement in cytoskeletal organization in MKs and platelets. Single knockout (KO) mice lacking RhoB had a minor microthrombocytopenia, which means a smaller platelet size and reduced platelet number, accompanied by defects in the microtubule cytoskeleton in both MKs and platelets. In particular, tubulin organization and stability, which is regulated by posttranslational modifications of α-tubulin, were disturbed in RhoB-/- platelets. In contrast, RhoB-/- MKs produced abnormally shaped proplatelets but had unaltered posttranslational modifications of α-tubulin. The second part focused on the influence of RhoA and RhoB on MK localization and platelet biogenesis in murine BM. Many intact RhoA-/- MKs are able to transmigrate through the endothelial layer and stay attached to the vessel wall, whereas only 1% of wildtype (wt) MKs are detectable in the intrasinusoidal space. Concomitant deficiency of RhoA and RhoB reverts this transmigration and results in macrothrombocytopenia, MK clusters around the vessel in the BM and defective MK development. The underlying mechanism that governs MKs to distinct localizations in the BM is poorly understood, thus this thesis suggests that this process may be dependent on RhoB protein levels, as RhoA deficiency is coincided with increased RhoB levels in MKs and platelets. The third part of this thesis targeted the protein PDK1, a downstream effector of Rho GTPases, in regard to MK maturation and polarization throughout thrombopoiesis. MK- and platelet-specific KO in mice led to a significant macrothrombocytopenia, impaired actin cytoskeletal reorganization during MK spreading and proplatelet formation, with defective MK maturation. This was associated with decreased PAK activity and, subsequently, phosphorylation of its substrates LIMK and Cofilin. Together, the observations of this thesis highlight the importance of Rho GTPases and their downstream effectors on the regulation of the MK and platelet cytoskeleton. N2 - Thrombozyten sind kleine Zellfragmente ohne Zellkern, die von Megakaryozyten (MKs) produziert werden. MKs sind riesige Zellen im Knochenmark, welche lange zytoplasmatische Ausläufer in die sinusoidalen Blutgefäße strecken, woraus durch den Blutstrom Thrombozyten abgeschnürt werden. Während der Thrombozyten-Biogenese penetrieren Teile des MKs das Endothel und durch zytoskeletales Umorganisieren innerhalb des MKs werden Proplättchen-Fragmente gebildet. Rho GTPasen wie die Proteine RhoA und RhoB sind maßgebliche Regulatoren des Zytoskeletts, sowohl des Aktins als auch des Tubulin Zytoskeletts. Der erste Teil dieser Thesis konzentrierte sich auf das Protein RhoB und dessen Einfluss auf die Organisation des Zytoskeletts. Mäuse mit einer Defizienz für das Protein RhoB zeigen eine Microthrombozytopenie und eine Reduktion der Thrombozytenzahl und -größe. Dies ist begleitet von Defekten des Mikrotubuli Zytoskeletts sowohl in MKs als auch in Blutplättchen. In Thrombozyten waren insbesondere Tubulin Organisation und Stabilisation betroffen, welche durch posttranslationale Modifizierungen von α-Tubulin bestimmt wurde. RhoB-negative MKs hingegen produzierten abnormal geformte Proplättchen, hatten jedoch unveränderte posttranslationale Modifizierungen von α-Tubulin. Der zweite Teil dieser Thesis fokussierte sich auf den Einfluss von RhoA und RhoB auf die Lokalisation von MKs im Knochenmarkt von Mäusen. Eine große Anzahl von RhoA-negativen MKs können durch das Endothel in die Blutgefäße wandern und bleiben dort adhärent, während nur etwa 1% wildtypischer MKs am Blutgefäß detektierbar sind. Gleichzeitige Defizienz von RhoA und RhoB revertiert die Translokation von RhoA-negativen MKs und führt in Mäusen zu Makrothrombozytopenie, die Formierung von MK Clustern um die Gefäßwand im Knochenmarkt und eine fehlerhafte MK Entwicklung. Der Mechanismus, der MKs zu bestimmten Positionen im Knochenmarkt führt, ist bisher kaum verstanden. In dieser Thesis konnte gezeigt werden, dass dieser Prozess von dem Level an RhoB Protein abhängig sein könnte, da eine Defizienz von RhoA zu einer Hochregulierung von RhoB in MKs und Thrombozyten führte. Der dritte Teil dieser Thesis zielte auf ein Signalprotein der Rho GTPasen ab, dem Protein PDK1. Es wurde die Rolle von PDK1 in der Regulation von MK Reifung und Polarisation während der Bildung von Thrombozyten untersucht. Ein MK und Thrombozyten spezifischer KO von PDK1 führte zu einer signifikanten Makrothrombozytopenie, einem gestörten Aktin Zytoskelett, während des MK Spreadings und der Proplättchen Bildung, begleitet von einer fehlerhaften MK Reifung. Dies war mit einer Reduktion in der Aktivität von PAK und folglich dem Phosphorylierungsstatus seiner Substrate LIMK und Cofilin assoziiert. Die Beobachtungen dieser Doktorarbeit arbeiteten die Relevanz von Rho GTPasen und ihren Signalproteinen für die Regulation des MK und Thrombozyten Zytoskelettes im Maus-Modell hervor. KW - Megakaryozyt KW - Thrombozyt KW - Zellskelett KW - Thrombopoiesis KW - Cytoskeleton Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-234669 ER - TY - THES A1 - Baluapuri, Apoorva T1 - Molecular Mechanisms of MYC’s impact on Transcription Elongation T1 - Molekulare Mechanismen des Einflusses von MYC auf die Transkriptionselongation N2 - Expression of the MYC oncoprotein, which binds the DNA at promoters of most transcribed genes, is controlled by growth factors in non-tumor cells, thus stimulating cell growth and proliferation. Here in this thesis, it is shown that MYC interacts with SPT5, a subunit of the RNA polymerase II (Pol II) elongation factor DSIF. MYC recruits SPT5 to promoters of genes and is required for its association with Pol II. The transfer of SPT5 is mediated by CDK7 activity on TFIIE, which evicts it from Pol II and allows SPT5 to bind Pol II. MYC is required for fast and processive transcription elongation, consistent with known functions of SPT5 in yeast. In addition, MYC increases the directionality of promoters by stimulating sense transcription and by suppressing the synthesis of antisense transcripts. The results presented in this thesis suggest that MYC globally controls the productive assembly of Pol II with general elongation factors to form processive elongation complexes in response to growth-factor stimulation of non-tumour cells. However, MYC is found to be overexpressed in many tumours, and is required for their development and progression. In this thesis it was found that, unexpectedly, such overexpression of MYC does not further enhance transcription but rather brings about squelching of SPT5. This reduces the processivity of Pol II on selected set of genes that are known to be repressed by MYC, leading to a decrease in growth-suppressive gene transcription and uncontrolled tumour growth N2 - Die Expression des MYC-Onkoproteins, das die Promotoren der meisten exprimierten Gene bindet, wird in gesunden, nicht transformierten Zellen durch Wachstumsfaktoren reguliert und fördert das Zellwachstum und die Zellteilung. In dieser Arbeit wurde die Interaktion zwischen MYC und SPT5, einer Untereinheit des RNA-Polymerase (Pol II) Elongationsfaktors DSIF gezeigt. MYC ist für die Rekrutierung von SPT5 an Promotoren und die Assoziation mit Pol II notwendig. Der Transfer von SPT5 auf Pol II setzt die Aktivität der Proteinkinase CDK7 voraus, die TFIIE aus dem Pol II Komplex entfernt und es so SPT5 ermöglicht, an Pol II zu binden. MYC wird für eine schnelle und prozessive Transkriptionselongation benötigt, was mit bekannten Funktionen von SPT5 in Hefe übereinstimmt. Zusätzlich erhöht MYC die Direktionalität von Promotoren, indem es die Sense-Transkription stimuliert und die Synthese der Antisense-Transkripte unterdrückt. Die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse legen nahe, dass MYC in normalen, nicht-transformierten Zellen die produktive Assemblierung von Pol II mit allgemeinen Elongationsfaktoren global steigert, um prozessive Elongationskomplexe als Reaktion auf die Wachstumsfaktorstimulation zu bilden. Die meisten humanen Tumore exprimieren jedoch deutlich erhöhte Mengen des MYC Proteins, das für Tumorentstehung und Progression benötigt wird. In dieser Arbeit wurde festgestellt, dass eine solche Überexpression von MYC unerwarteterweise keine weitere Steigerung der Expression mit sich bringt, sondern zur Sequestrierung von SPT5 führt. Dies reduziert die Prozessivität von Pol II an ausgewählten Genen, welche durch MYC bekannterweise supprimiert werden, was zu einer Abnahme der wachstumsunterdrückenden Gentranskription und zu einem unkontrollierten Wachstum führt. KW - Transcription KW - MYC Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-243806 ER - TY - THES A1 - Jonas, Franziska T1 - CNS1-dependency of \(in\) \(vivo\) peptide-induced CD4\(^+\)Foxp3\(^+\) regulatory T cells T1 - CNS1-Abhängigkeit von \(in\) \(vivo\) Peptid-induzierten CD4\(^+\)Foxp3\(^+\) regulatorischen T-Zellen N2 - CD4+Foxp3+ Tregs can be induced in vitro by TGF-b stimulation. Here, CNS1 deficient CD4+ T cells were found to show compromised Foxp3 upregulation in vitro compared to CNS1 WT CD4+ T cells. Moreover, we could demonstrate that antigen-specific CD4+Foxp3+ Tregs can be induced in vivo by tolerogenic antigen stimulation. Parenteral application of agonist BDC2.5 mimetope induced Foxp3 expression in CD4+ BDC2.5 tg cells. We could show that induction of Foxp3 expression by tolerogenic peptide stimulation is impaired in CNS1 deficient CD4+ BDC2.5 tg cells compared to CNS1 WT CD4+ BDC2.5 tg controls. These results indeed indicate that in vivo induced Tregs share mechanistic characteristics with naturally occurring pTregs. Additional in vivo experiments with blocking monoclonal anti-TGF-b demonstrated that high dosage TGF-b blockade abrogated peptide-induced Foxp3 expression in CNS1 WT BDC2.5 tg CD4+ cells, akin to what is seen for impaired Foxp3 upregulation in peptide-stimulated CNS1 KO BDC2.5 tg CD4+ cells without anti-TGF-b-treatment. Adoptive transfer of CD4+CD25- T cells in T cell deficient recipients dramatically increased CD4+Foxp3+ Treg frequencies in both CNS1 WT CD4+ and CNS1 KO CD4+ donor cells. Despite an initially lower increase in Foxp3 expression in CNS1 KO donor cells compared to CNS1 WT donor cells early after transfer, in this setting impaired Treg induction in CNS1 deficient cells was not preserved over time. Consequently, diabetes onset and progression were indistinguishable between mice that received CNS1 WT or CNS1 KO donor cells. Additional Foxp3 induction by peptide stimulation of immunodeficient recipients after transfer of CNS1 WT BDC2.5. tg or CNS1 KO BDC2.5 tg donor cells was not detectable. N2 - CD4+Foxp3+ Tregs können in vitro mittels TGF-b-Stimulation induziert werden. Im Rahmen dieses Projekts konnte bestätigt werden, dass CNS1-defiziente CD4+ T-Zellen im Vergleich zu CD4+ CNS1 WT-Zellen in vitro eine eingeschränkte Foxp3-Hochregulation zeigen. Des Weiteren konnten wir Antigen-spezifische CD4+Foxp3+ Tregs mittels tolerogener Antigenstimulation in vivo induzieren. Parenteral appliziertes BDC2.5-Mimetop induzierte die Foxp3 Expression in CD4+ BDC2.5 transgenen T-Zellen. Hierbei zeigten CNS1 KO BDC2.5 transgene CD4+ T-Zellen im Vergleich zu CNS1 WT BDC2.5 transgenen CD4+ T-Zell-Kontrollen eine eingeschränkte Hochregulation der Foxp3 Expression nach Mimetop-Stimulation. Peptid-induzierte CD4+Foxp3+ Tregs verhalten sich somit ähnlich wie natürlich vorkommende pTregs. Unter Verwendung höherer Dosen von anti-TGF-b zeigte sich bei Mimetop-Stimulation im in vivo Experiment eine eingeschränkte Foxp3-Hochregulation der CNS1 WT CD4+ BDC2.5 transgenen T-Zellen, ähnlich wie es bei CNS1 KO CD4+ BDC2.5 transgenen T-Zellen ohne anti-TGF-b-Behandlung zu beobachten war. ... KW - Treg KW - Regulatorischer T-Lymphozyt KW - Diabetes mellitus Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-243887 ER - TY - THES A1 - Ramani Mohan, Ramkumar T1 - Effect of Mechanical Stress On Stem Cells to Improve Better Bone Regeneration T1 - Die Auswirkung von mechanischer Belastung auf Stammzellen zur Verbesserung der Knochenregeneration N2 - Critical size bone defects and nonunion fractures remain difficult to treat. Although cell‐loaded bone substitutes have improved bone ingrowth and formation, the lack of methods for achieving viability and the uniform distribution of cells in the scaffold limits their use as bone grafts. In addition, the predominant mechanical stimulus that drives early osteogenic cell maturation has not been clearly identified. Further, it is challenging to evaluate mechanical stimuli (i.e., deformation and fluid–flow-induced shear stress) because they are interdependent. This thesis compares different mechanical stimuli applied to cell-seeded scaffolds to develop bone grafts efficiently for the treatment of critical size bone defects. It also seeks to understand how deformation strain and interstitial fluid–flow-induced shear stress promote osteogenic lineage commitment. In this thesis, different scaffolds were seeded with primary human bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSCs) from different donors and subjected to static and dynamic culture conditions. In contrast with the static culture conditions, homogenous cell distributions were accomplished under dynamic culture conditions. Additionally, the induction of osteogenic lineage commitment without the addition of soluble factors was observed in the bioreactor system after one week of cell culture. To determine the role of mechanical stimuli, a bioreactor was developed to apply mechanical deformation force to a mesenchymal stem sell (MSC) line (telomerase reverse transcriptase (TERT)) expressing a strain-responsive AP-1 luciferase reporter construct on porous scaffolds. Increased luciferase expression was observed in the deformation strain compared with the shear stress strain. Furthermore, the expression of osteogenic lineage commitment markers such as osteonectin, osteocalcin (OC), osteopontin, runt-related transcription factor 2 (RUNX2), alkaline phosphate (AP), and collagen type 1 was significantly downregulated in the shear stress strain compared with the deformation strain. These findings establish that the deformation strain was the predominant stimulus causing skeletal precursors to undergo osteogenesis in earlier stages of osteogenic cell maturation. Finally, these findings were used to develop a bioreactor in vitro test system in which the effect of medication on osteoporosis could be tested. Primary human BM-MSCs from osteoporotic donors were subjected to strontium ranelate (an osteoporotic drug marketed as Protelos®). Increased expression of collagen type 1 and calcification was seen in the drugtreated osteoporotic stem cells compared with the nondrug-treated osteoporotic stem cells. Thus, this bioreactor technology can easily be adapted into an in vitro osteoporotic drug testing system. N2 - Knochendefekte kritischer Größe und Frakturen mit Pseudoarthrose bleiben schwierig zu behandeln. Obwohl zellbeladene Knochenersatzprodukte das Einwachsen und die Bildung von Knochen verbessert haben, schränken fehlende Methoden zur Erreichung der Lebensfähigkeit und der gleichmäßigen Verteilung der Zellen im Gerüst die Verwendung von Knochenersatzprodukten als Knochentransplantate ein. Ebenfalls konnte der vorherrschende mechanische Reiz, der die frühe osteogene Zellreifung antreibt nicht eindeutig identifiziert werden. Ferner ist es schwierig, mechanische Reize (d. H. Verformung und durch Flüssigkeitsströmung induzierte Scherbeanspruchung) zu bewerten, da diese Größen sie voneinander abhängig sind. Diese Arbeit vergleicht die Auswirkung verschiedener mechanischer Reize auf mit Zellen besiedelte Gerüste, um herauszufinden, ob Knochentransplantate effizient entwickelt werden können damit sie für die Behandlung von Knochendefekten einsetzbar sind. Des Weiteren wird versucht zu verstehen, wie Verformungsdehnung und durch interstitielle Flüssigkeitsströmung induzierte Scherbeanspruchung die Bindung osteogener Linien fördern. In dieser Arbeit wurden verschiedene Gerüste mit primären mesenchymalen Knochenmarkstammzellen (BM-MSCs) von verschiedenen Spendern ausgesät und statischen und dynamischen Kulturbedingungen ausgesetzt. Im Gegensatz zu den statischen Kulturbedingungen wurde unter dynamischen Kulturbedingungen eine homogene Zellverteilungen erreicht. Zusätzlich wurde im Bioreaktorsystem nach einer Woche Zellkultur eine Formung einer osteogenen Linienbindung auch ohne Zusätze von löslichen Faktoren beobachtet. Um die Rolle mechanischer Stimuli zu bestimmen, wurde ein Bioreaktor entwickelt, um auf porösen Scaffolds eine mechanische Verformungskraft auf eine mesenchymale Stammzelllinie (MSC) (Telomerase Reverse Transkriptase (TERT)) auszuüben. Diese exprimiert ein auf Dehnung ansprechendes AP-1-Luciferase-Reporterkonstrukt. Eine erhöhte LuciferaseExpression wurde in der Verformungsdehnung im Vergleich zur Scherspannungsdehnung beobachtet. Darüber hinaus war die Expression von osteogenen Linien Marker wie Osteonektin, Osteocalcin (OC), Osteopontin, Runt-verwandtem Transkriptionsfaktor 2 (RUNX2), alkalischem Phosphat (AP) und Kollagen Typ 1 in der Scherbeanspruchungsbelastung im Vergleich zur Verformungsdehnung signifikant herabreguliert. Diese Befunde belegen, dass die Verformungsdehnung der vorherrschende Stimulus war, der dazu führte, dass Skelettvorläufer in früheren Stadien der osteogenen Zellreifung eine Osteogenese durchliefen. Schließlich wurden diese Ergebnisse verwendet, um ein Bioreaktor-In-vitro-Testsystem zu entwickeln, in dem die Wirkung von Medikamenten auf Osteoporose getestet werden konnte. Primäre humane BM-MSCs von osteoporotischen Spendern wurden Strontiumranelat (einem als Protelos® vertriebenen Arzneimittel zur Therapie der Osteoporose) ausgesetzt. Eine erhöhte Expression von Kollagen Typ 1 und Verkalkung wurde in den mit Arzneimitteln behandelten osteoporotischen Stammzellen im Vergleich zu den nicht mit Arzneimitteln behandelten osteoporotischen Stammzellen beobachtet. Somit kann diese Bioreaktortechnologie leicht in ein in vitro Arzneimitteltestsystem angepasst werden. KW - Bioreactor KW - Mechanical deformation KW - Scaffold bone implant Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-240134 ER - TY - THES A1 - Popp, Christina T1 - Evolution of antifungal drug resistance of the human-pathogenic fungus \(Candida\) \(albicans\) T1 - Evolution der Antimykotikaresistenz im humanpathogenen Pilz \(Candida\) \(albicans\) N2 - Infections with the opportunistic yeast Candida albicans are frequently treated with the first-line drug fluconazole, which inhibits ergosterol biosynthesis. An alarming problem in clinics is the development of resistances against this azole, especially during long-term treatment of patients. Well-known resistance mechanisms include mutations in the zinc cluster transcription factors (ZnTFs) Mrr1 and Tac1, which cause an overexpression of efflux pump genes, and Upc2, which results in an overexpression of the drug target. C. albicans strains with such gain-of-function mutations (GOF) have an increased drug resistance conferring a selective advantage in the presence of the drug. It was previously shown that this advantage comes with a fitness defect in the absence of the drug. This was observed in different conditions and is presumably caused by a deregulated gene expression. One aim of the present study was to examine whether C. albicans can overcome the costs of drug resistance by further evolution. Therefore, the relative fitness of clinical isolates with one or a combination of different resistance mutations in Mrr1, Tac1 and/or Upc2 was analyzed in competition with the matched fluconazole-susceptible partner. Most fluconazole-resistant isolates had a decreased fitness in competition with their susceptible partner in vitro in rich medium. In contrast, three fluconazole-resistant strains with Mrr1 resistance mutations did not show a fitness defect in competition with their susceptible partner. In addition, the fitness of four selected clinical isolate pairs was examined in vivo in mouse models of gastrointestinal colonization (GI) and disseminated infection (IV). In the GI model all four fluconazole-resistant strains were outcompeted by their respective susceptible partner. In contrast, in the IV model only one out of four fluconazole-resistant isolates did show a slight fitness defect in competition with its susceptible partner during infection of the kidneys. It can be stated, that in the present work the in vitro fitness did not reflect the in vivo fitness and that the overall fitness was dependent on the tested conditions. In conclusion, C. albicans cannot easily overcome the costs of drug resistance caused by a deregulated gene expression. In addition to GOFs in Mrr1, Tac1 and Upc2, resistance mutations in the drug target Erg11 are a further key fluconazole resistance mechanism of C. albicans. Clinical isolates often harbor several resistance mechanisms, as the fluconazole resistance level is further increased in strains with a combination of different resistance mutations. In this regard, the question arises of how strains with multiple resistance mechanisms evolve. One possibility is that strains acquire mutations successively. In the present study it was examined whether highly drug-resistant C. albicans strains with multiple resistance mechanisms can evolve by parasexual recombination as another possibility. In a clonal population, cells with individually acquired resistance mutations could combine these advantageous traits by mating. Thereupon selection could act on the mating progeny resulting in even better adapted derivatives. Therefore, strains heterozygous for a resistance mutation and the mating type locus (MTL) were grown in the presence of fluconazole. Derivatives were isolated, which had become homozygous for the resistance mutation and at the same time for the MTL. This loss of heterozygosity was accompanied by increased drug resistance. In general, strains which are homozygous for one of both MTL configurations (MTLa and MTLα) can switch to the opaque phenotype, which is the mating-competent form of the yeast, and mate with cells of the opposite MTL. In the following, MTLa and MTLα homozygous strains in the opaque phenotype were mated in all possible combinations. The resulting mating products with combined genetic material from both parents did not show an increased drug resistance. Selected products of each mating cross were passaged with stepwise increasing concentrations of fluconazole. The isolated progeny showed high levels of drug resistance and loss of wild-type alleles of resistance-associated genes. In conclusion, selective pressure caused by fluconazole exposure selects for resistance mutations and at the same time induces genomic rearrangements, resulting in mating competence. Therefore, in a clonal population, cells with individually acquired resistance mutations can mate with each other and generate mating products with combined genetic backgrounds. Selection can act on these mating products and highly drug-resistant und thus highly adapted derivatives can evolve as a result. In summary, the present study contributes to the current understanding of the evolution of antifungal drug resistance by elucidating the effect of resistance mutations on the fitness of the strains in the absence of the drug selection pressure and investigates how highly drug-resistant strains could evolve within a mammalian host. N2 - Infektionen mit dem opportunistischen Hefepilz Candida albicans werden häufig mit dem First-Line-Medikament Fluconazol behandelt, welches die Ergosterol-Biosynthese hemmt. Ein besorgniserregendes Problem in der Klinik, insbesondere bei der Langzeitbehandlung von Patienten, ist die Entwicklung von Resistenzen gegen dieses Azol. Zu den bekannten Resistenzmechanismen gehören Resistenzmutationen in den Zink-Cluster-Transkriptionsfaktoren (ZnTFs) Mrr1 und Tac1, die eine Überexpression von Effluxpumpen-Genen bewirken und Resistenzmutationen in Upc2, die zu einer Überexpression des Wirkstofftargets führen. C. albicans Stämme mit solchen Gain-of-Function-Mutationen (GOF) weisen eine erhöhte Medikamentenresistenz auf, was einen selektiven Vorteil in Gegenwart des Medikaments bedeutet. Es wurde zuvor gezeigt, dass dieser Vorteil mit einem Fitnessdefekt in Abwesenheit des Medikaments einhergeht. Dies wurde in verschiedenen Bedingungen nachgewiesen und wird vermutlich durch eine deregulierte Genexpression verursacht. Ein Ziel der vorliegenden Studie war es zu untersuchen, ob C. albicans die Kosten der Medikamentenresistenz durch Evolution kompensieren kann. Daher wurde die relative Fitness von klinischen Isolaten mit einer oder einer Kombination verschiedener Resistenzmutationen in Mrr1, Tac1 und/oder Upc2 im Wettbewerb mit dem zugehörigen Fluconazol-sensitiven Partner analysiert. Die meisten Fluconazol-resistenten Isolate hatten eine verminderte Fitness im Wettbewerb mit ihrem sensitiven Partner in vitro in vollwertigem Medium. Dennoch zeigten drei Fluconazol-resistente Stämme mit Mrr1-Resistenzmutationen keinen Fitnessdefekt im Wettbewerb mit ihrem jeweiligen Partner. Zusätzlich wurde die Fitness von vier ausgewählten klinischen Isolat-Paaren in vivo in Mausmodellen für gastrointestinale Kolonisation (GI) und disseminierte Infektion (IV) untersucht. Im GI-Modell wurden alle vier Fluconazol-resistenten Stämme von ihren sensitiven Partnern überwachsen. Im Gegensatz dazu zeigte im IV-Modell nur einer der vier Fluconazol-resistenten Isolate einen leichten Fitnessdefekt im Wettbewerb mit dem jeweiligen Fluconazol-sensitiven Partner während der Infektion der Nieren. Es kann festgestellt werden, dass in der vorliegenden Arbeit die in vitro-Fitness nicht die in vivo-Fitness widerspiegelt und dass die Gesamtfitness von den getesteten Bedingungen abhängig ist. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass C. albicans die Kosten der Medikamentenresistenz, die durch eine deregulierte Genexpression verursacht werden, nur schwer überwinden kann. Neben GOFs in Mrr1, Tac1 und Upc2 sind Resistenzmutationen im Wirkstofftarget Erg11 ein wichtiger Resistenzmechanismus von C. albicans. Klinische Isolate weißen oft mehrere Resistenzmechanismen auf, da die Kombination verschiedener Resistenzmutationen die Fluconazol-Resistenz potenziert. In diesem Zusammenhang stellt sich die Frage, wie sich Stämme mit mehreren Resistenzmechanismen entwickeln. Eine Möglichkeit ist, dass Stämme Mutationen sequenziell erwerben. In der vorliegenden Studie wurde untersucht, ob als weitere Möglichkeit hochresistente C. albicans Stämme mit multiplen Resistenzmechanismen durch parasexuelle Rekombination evolvieren können. In einer klonalen Population könnten Zellen mit individuell erworbenen Resistenzmutationen diese vorteilhaften Eigenschaften durch Paarung kombinieren. Daraufhin könnte Selektionsdruck auf die Matingprodukte wirken und so die Entstehung von besser angepassten Derivaten begünstigen. Daher wurden Resistenzmutation und Mating Type Locus (MTL) heterozygote Stämme in Gegenwart von Fluconazol kultiviert. So konnten Derivate isoliert werden, die homozygot für die Resistenzmutation und gleichzeitig für den MTL geworden waren. Dieser Verlust der Heterozygotie ging mit einer erhöhten Medikamentenresistenz einher. Generell können Stämme, die homozygot für eine der beiden MTL-Konfigurationen (MTLa und MTLα) sind, in den opaque Phänotyp wechseln, der die paarungskompetente Form der Hefe darstellt, und sich mit Zellen des gegensätzlichen MTL paaren. Im Folgenden wurden MTLa und MTLα homozygote Stämme im opaque Phänotyp in allen möglichen Kombinationen verpaart. Die resultierenden Matingprodukte mit kombiniertem genetischem Material beider Elternteile wiesen keine erhöhte Medikamentenresistenz auf. Ausgewählte Paarungsprodukte jeder Kreuzung wurden mit stufenweise ansteigenden Konzentrationen von Fluconazol passagiert. Die isolierten Nachkommen zeigten ein hohes Maß an Medikamentenresistenz und den Verlust von Wildtyp-Allelen der resistenzassoziierten Gene. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der selektive Druck, der durch die Fluconazol-Exposition verursacht wird, für Resistenzmutationen selektiert und gleichzeitig genomische Umlagerungen induziert, die eine Paarung ermöglichen. Daher können sich in einer klonalen Population Zellen mit individuell erworbenen Resistenzmutationen miteinander paaren und Matingprodukte mit kombiniertem genetischem Hintergrund generieren. Auf diese Matingprodukte kann die Selektion wirken, woraufhin sich hochresistente und damit stark an ihre Umwelt angepasste Derivate entwickeln können. Zusammenfassend trägt die vorliegende Studie zum aktuellen Verständnis der Evolution der Antimykotika-Resistenz bei, indem sie den Effekt von Resistenzmutationen auf die Fitness der Stämme in Abwesenheit des Medikamenten-Selektionsdrucks untersucht und aufklärt, wie sich hochgradig resistente Stämme in einem Säugetierwirt entwickeln könnten. KW - Evolution KW - Resistenz KW - Fitness KW - Candida albicans KW - Fluconazol KW - Resistance KW - Fluconazole KW - Drug resistance KW - Human-pathogenic KW - Yeast Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-243515 ER - TY - THES A1 - Röschert, Isabelle T1 - Aurora-A prevents transcription-replication conflicts in MYCN-amplified neuroblastoma T1 - Aurora-A verhindert Transkriptions-Replikationskonflikte in MYCN-amplifizierten Neuroblastomen N2 - Neuroblastoma is the most abundant, solid, extracranial tumor in early childhood and the leading cause of cancer-related childhood deaths worldwide. Patients with high-risk neuroblastoma often show MYCN-amplification and elevated levels of Aurora-A. They have a low overall survival and despite multimodal therapy options a poor therapeutic prognosis. MYCN-amplified neuroblastoma cells depend on Aurora-A functionality. Aurora-A stabilizes MYCN and prevents it from proteasomal degradation by competing with the E3 ligase SCFFBXW7. Interaction between Aurora-A and MYCN can be observed only in S phase of the cell cycle and activation of Aurora-A can be induced by MYCN in vitro. These findings suggest the existence of a profound interconnection between Aurora-A and MYCN in S phase. Nevertheless, the details remain elusive and were investigated in this study. Fractionation experiments show that Aurora-A is recruited to chromatin in S phase in a MYCN-dependent manner. Albeit being unphosphorylated on the activating T288 residue, Aurora-A kinase activity was still present in S phase and several putative, novel targets were identified by phosphoproteomic analysis. Particularly, eight phosphosites dependent on MYCN-activated Aurora-A were identified. Additionally, phosphorylation of serine 10 on histone 3 was verified as a target of this complex in S phase. ChIP-sequencing experiments reveal that Aurora-A regulates transcription elongation as well as histone H3.3 variant incorporation in S phase. 4sU-sequencing as well as immunoblotting demonstrated that Aurora-A activity impacts splicing. PLA measurements between the transcription and replication machinery revealed that Aurora-A prevents the formation of transcription-replication conflicts, which activate of kinase ATR. Aurora-A inhibitors are already used to treat neuroblastoma but display dose-limiting toxicity. To further improve Aurora-A based therapies, we investigated whether low doses of Aurora-A inhibitor combined with ATR inhibitor could increase the efficacy of the treatment albeit reducing toxicity. The study shows that the combination of both drugs leads to a reduction in cell growth as well as an increase in apoptosis in MYCN-amplified neuroblastoma cells, which is not observable in MYCN non-amplified neuroblastoma cells. This new approach was also tested by a collaboration partner in vivo resulting in a decrease in tumor burden, an increase in overall survival and a cure of 25% of TH-MYCN mice. These findings indicate indeed a therapeutic window for targeting MYCN-amplified neuroblastoma. N2 - Das Neuroblastom ist der häufigste, solide, extrakranielle Tumor der frühesten Kindheit und die häufigste mit Krebs verbundene Todesursache von Kleinkindern weltweit. Patienten mit geringerer Überlebenswahrscheinlichkeit und schlechterer Therapieprognose zeigen oft eine MYCN-Amplifikation und erhöhte Mengen von Aurora-A. Aurora-A ist eine Serin/Threonin-Protein Kinase, die wichtige mitotische Prozesse reguliert. Aurora-A stabilisiert MYCN und verhindert dadurch den proteasomalen Abbau von MYCN. Die Interaktion zwischen Aurora-A und MYCN ist S Phasen-spezifisch und MYCN ist in vitro in der Lage, durch seine Bindung Aurora-A zu aktivieren. Die Funktionen und Prozesse, die von Aurora-A in der S Phase reguliert werden, sind noch nicht hinreichend untersucht und daher Gegenstand dieser Dissertation. Zell-Fraktionierungen zeigen, dass Aurora-A in der S Phase in einer MYCN-abhängigen Weise an das Chromatin gebunden ist. Phosphoproteom-Analysen mittels Massenspektrometrie identifizierten zahlreiche neue Substrate von Aurora-A, sowie acht Substrate von MYCN-aktiviertem Aurora-A. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass Histon 3 Serin 10 von Aurora-A in Abhängigkeit von MYCN in S Phase phosphoryliert wird. ChIP-Sequenzierungen zeigen, dass Aurora-A die Elongation der Transkription und den Einbau der Histone Variante H3.3 in S Phase beeinflusst. 4sU-Sequenzierung sowie Immunoblots zeigen einen Zusammenhang zwischen der Aktivität von Aurora-A und dem Spleißosom in der S Phase. Zusätzlich konnte mittels PLA nachgewiesen werden, dass Aurora-A die Entstehung von Transkriptions-Replikationskonflikten verhindert, die andernfalls die Kinase ATR aktivieren würden. Aurora-A Inhibitoren wurden unter anderem zur Therapie von Neuroblastomen eingesetzt, allerdings ist die Dosis des Aurora-A Inhibitors durch die hohe Toxizität limitiert, was die Effizienz der Therapie stark beeinträchtigt. Daher wurde untersucht, ob die gleichzeitige Gabe von geringeren Mengen Aurora-A Inhibitor in Kombination mit einem ATR Inhibitor zur Therapie geeignet ist. In vitro konnte gezeigt werden, dass die Kombination beider Inhibitoren das Zellwachstum reduziert und das MYCN-amplifizierte Zellen im Vergleich zu MYCN nicht-amplifizierten Zellen verstärkt durch Apoptose sterben. Durch einen Kollaborationspartner konnte die Kombination der beiden Inhibitoren an Mäusen getestet werden. Die mit der Kombination behandelten Mäuse, zeigen ein deutlich reduziertes Tumorwachstum, sowie längeres Überleben. Somit stellt diese Kombination ein therapeutisches Fenster dar und könnte zur Behandlung von Neuroblastompatienten genutzt werden. KW - Neuroblastom KW - Aurora-A KW - MYCN KW - neuroblastoma Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-243037 ER - TY - THES A1 - Busch, Albert Franz Jakob T1 - Modification of angiogenesis to abrogate abdominal aortic aneurysm growth T1 - Modifikation von Angiogenese um das Wachstum abdominaler Aortenaneurysmen zu beeinflussen N2 - Introduction: Abdominal aortic aneurysm (AAA) is a pathological saccular enlargement most often of the infrarenal aorta. Eventual rupture is fatal, making preemptive surgical therapy upon a diameter threshold of >50mm the treatment of choice. The pathophysiology, especially the initial trigger aortic remodeling is still largely unknown. However, some characteristic features involved in aneurysm growth have been established, such as medial angiogenesis, low-grade inflammation, vascular smooth muscle cell (VSMC) phenotype switch, extracellular remodeling, altered hemodynamics and an eventual humoral immune answer. Currently, no medical treatment options are available. RNA therapeutics and drug repurposing offer new possibilities to overcome this shortage. Using such to target angiogenesis in the aneurysm wall and investigate their potential mechanisms is the aim of this thesis. Material and Methods: We test our hypothesis by targeting the long non-coding RNA H19 and re-use the anti-cancer drug Lenvatinib in two murine inducible AAA models and one preclinical large animal model in the LDLR-/- pig. Furthermore, a H19-/- mouse is included to verify the results. AAA and control samples from a human biobank along with a primary human cell culture are used to verify results ex vivo by qPCR, WesternBlot, live cell imaging, histo- and immunohistochemistry along with gene array analysis, RNA knockdown, pull-down- and promotor assays. Results: H19 is significantly upregulated in AAA mice models and its knockdown limited aneurysm growth. It is well known that H19 interacts with several transcription factors. We found that cytoplasmic interaction between H19 and hypoxia-inducible factor 1-alpha (HIF1α) increased apoptosis in cultured SMCs associated with sequential p53 stabilization. In contrast, the knockdown of H19 was associated with markedly decreased apoptotic cell rates. Our data underline that HIF1α was essential in mediating the pro-apoptotic effects of H19. Secondly, Lenvatinib was applied both systemically and locally by endovascular means in mice with an established AAA. The drug significantly halted aneurysm growth and array analysis revealed myosin heavy chain 11 (MYH11) as the most differentially regulated target. This was shown to be up regulated after Lenvatinib treatment of primary AAA smooth muscle cells suggesting a salvage mechanism to obtain a contractile phenotype based on gene expression and immunohistochemistry. The same results were shown upon a local endovascular Lenvatinib-coated balloon angioplasty in the established aneurysmatic lesion of a novel atherosclerotic LDLR-/- Yucatan minipig model. Decreased phosphorylation of extracellular-signal regulated kinases 1-2 (ERK1-2) is the downstream effect of Lenvatinib-specific blockage of the vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR2). Conclusion: Taking into account the heterogeneity of the disease, inhibition of VSMC phenotype switch, extracellular remodeling and angiogenesis seem promising targets in some if not all AAA patients. Together with surveillance and surgical therapy, these new non-invasive treatment strategies would allow for a more personalized approach to treat this disease. N2 - Einleitung: Das abdominale Aortenaneurysma (AAA) ist eine Erweiterung der infrarenalen Aorta. Die größte Gefahr ist eine Ruptur, sodass eine präemptive chirurgische Ausschaltung ab 50mm Durchmesser empfohlen wird. Insbesondere die initialen Triggermechanismen zur AAA Entstehung sind weiterhin unklar. Einige charakteristische Eigenschaften des Aneurysmawachstums sind z.B. Angiogenese in der Media, low-grade Entzündung, die vascular smooth muscle cell (VSMC) Phänotyp-Änderung, Remodelling der extrazellulären Matrix, eine veränderte Hämodynamik und eine humorale Immunantwort. Gegenwärtig sind neben den chirurgischen, keine medikamentösen Therapiealternativen vorhanden. RNA-Therapien und drug repurposing könnten dies ändern. Ziel dieser Arbeit ist die Beeinflussung der Angiogenese, um das Wachstum von AAAs zu verändern. Material und Methoden: Um diese Hypothese zu überprüfen wurden zwei verschiedene Ansätze verfolgt: Inhibition der long non-coding RNA H19 und die Verwendung von Lenvatinib in zwei Mausmodellen mit induzierbarem AAA und einem präklinischen Großtiermodell im LDLR-/- Schwein. Zusätzlich wurden Versuche in einer H19-/- Maus durchgeführt. AAA und Kontrollen aus einer humanen Biobank in Kombination mit der Verwendung einer primären Zellkultur aus AAA Patientenproben, wurden mittels qPCR, WesternBlot, live cell imaging, Histo- und Immunhistochemie sowie Microarray Analysen und RNA knockdown untersucht. Ergebnisse: Wir zeigen, dass experimenteller knockdown von H19, mittels antisense Oligonukleotiden (LNA-GapmeRs) in vivo das AAA Wachstum signifikant einschränkt. In vitro reduziert dieser knockdown deutlich die Apoptoserate von menschlichen aortalen VSMCs. Mittels array Analyse wurde hypoxia-inducible factor 1-alpha (HIF1α) als Zielgen identifiziert. Zytoplasmatische Interaktion zwischen H19 und HIF1α führt zu einer Stabilisierung von p53. Dieser Mechanismus konnte auch in H19-/- Mäusen bestätigt werden, die nach AAA Induktion kein Aneurysma entwickelten. Zweitens konnte Lenvatinib sowohl bei systemischer, wie auch bei lokaler Applikation in Mäusen mit etabliertem AAA deren Wachstum signifikant einschränken. In einer Microarray Analyse wurde hier myosin heavy chain 11 (MYH11) als am deutlichsten verändertes Gen identifiziert. In primären humanen AAA Zellen war dies nach Lenvatinib Behandlung deutlich hochreguliert und deutet damit einen Erhalt des kontraktilen VSMC Phänotyps an. Der gleiche Effekt konnte im Großtiermodell nach lokaler endovaskulärer Behandlung mit einem Lenvatinib-coated balloon in einem neuen LDLR-/- Yucatan minipig Modell gezeigt werden. Reduzierte Phophorylierung von ERK1-2 ist das Ergebnis der Lenvatinib-spezifischen Blockade von vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR2). Schlussfolgerung: Zieht man die Heterogenität der Erkrankung AAA in Betracht, ist die Inhibition von VSMC Phänotyp Änderung, Remodelling der Matrix und Angiogenese möglicherweise ein guter Mechanismus um die Aneurysmen einiger Patienten zu behandeln. Diese neuen Ansätze werden möglicherweise in Kombination mit Überwachung und chirurgischer Therapie einen personalisierten Ansatz in der Therapie erlauben. KW - Aortenaneurysma KW - drug repurposing Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-241356 ER - TY - THES A1 - von Wardenburg, Niels Oliver T1 - Investigations into the Pathogenic Antibody-Antigen-Interference of Glycine Receptor Autoantibodies T1 - Untersuchungen zur pathogenen Antikörper-Antigen-Interferenz von Autoantikörpern gegen den Glycinrezeptor N2 - Anti-glycine receptor (GlyR) autoantibodies belong to the novel group of autoantibodies that target neuronal cell-surface antigens (NCS), which are accompanied with various neurologic and neuropsychiatric conditions. The inhibitory ionotropic GlyR is one of the major inhibitory neurotransmitter receptors and therefore involved in maintaining homeostasis of neuronal excitation levels at brain stem and spinal cord. Anti-GlyR autoantibodies are associated with progressive encephalomyelitis with rigidity and myoclonus or stiff person syndrome. These neuromotor disorders are characterized by exaggerated startle, muscle stiffness, and painful spasms, leading to immobility and fatal outcome in some cases. It was hypothesized that imbalance of motoneuronal inhibition by functional impairment of GlyR and receptor internalization are direct consequences of antibody-antigen interference. Here, serum samples of four patients were tested for anti-GlyR autoantibodies and were used for the analysis of the functional impact on the electrophysiological properties of recombinant GlyRs, transiently expressed in HEK293 cells. Furthermore, the recognition pattern of anti- GlyR autoantibodies to human, zebrafish and chimeric GlyRα1 located the epitope to the far N-terminal region. The pathogenicity of anti-GlyR autoantibodies and thereby the autoimmunologic etiology of the disease was confirmed by passive transfer of patient serum to zebrafish (Danio rerio) larvae, that yielded an abnormal escape response – a brain stem reflex that corresponds to the exaggerated startle of afflicted patients. The phenotype was accompanied by profound reduction of GlyR clusters in spinal cord cryosections of treated zebrafish larvae. Together, these novel insights into the pathogenicity of GlyR autoantibodies confirm the concept of a novel neurologic autoimmune disease and might contribute to the development of innovative therapeutic strategies. N2 - GlyR Autoantikörper sind mit dem Stiff-Person-Syndrom assoziiert, insbesondere mit der schwerverlaufenden Variante der Progressiven Enzephalopathie mit Rigidität und Myoklonus. Diese Studie hat sich als Ziel gesetzt, die Pathogenität der Autoantikörper sowie deren pathogenen Eigenschaften mit Hilfe der Patch-Clamp-Methode sowie eines passiven Transfers der Erkrankung auf Zebrafischlarven zu erklären. ... KW - stiff person syndrome KW - glycine receptor autoantibodies Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-247217 ER - TY - THES A1 - Sarma, Bhavishya T1 - Merkel Cell Carcinoma: Investigations on its carcinogenesis and new therapeutic approaches T1 - Merkelzellkarzinom: Untersuchungen zur Karzinogenese und neue Therapieansätze N2 - Merkel cell carcinoma (MCC) is a rare and aggressive skin cancer with an increasing incidence. The majority of MCC cases (approximately 80%) are associated with the Merkel cell polyomavirus (MCPyV). This virus encodes for the MCPyV T antigens (small T (sT) and large T (LT)), which are oncoproteins that drive MCC carcinogenesis. However, the precise cells of the skin that are transformed by the T antigens are not known i.e., the cells of origin of MCC are yet to be discovered. Therefore, the first part of this study involved the generation and evaluation of a vector system that could be used to study MCC oncogenesis. To this end, a set of lentiviral vectors was cloned that allows independent, inducible expression of potential key factors in MCC oncogenesis. In addition, a CRISPR/Cas9 knock in was established that allows the coding sequence for a fluorescent protein to be placed under the control of the promoter of KRT20, one of the most crucial markers of MCC. The functionality of this KRT20 reporter was proven in the MCPyV-positive MCC cell line, WaGa. The different inducible vector systems (doxycycline-inducible MCPyV T antigens or MCPyV sT, RheoSwitch-inducible ATOH1 and IPTG-inducible dnMAML1 and GLI1) were found to have different efficacies in various cellular systems and in particular, a considerable reduction in efficiency was observed at times upon the interaction of several vectors in one cell. In the second and more important part of this study, the role of the well-established anti-malarial drug, artesunate, which possesses additional anti-tumor and anti-viral activity, in the treatment of MCPyV-positive MCC was analyzed. In our study, artesunate was found to be cytotoxic towards MCPyV-positive MCC cell lines in vitro and repressed tumor growth in vivo in a mouse model. Artesunate was also found to downregulate T antigen expression, which is critical for the proliferation of MCPyV-positive MCC cells. The repression of T antigen expression, however, was not the sole mechanism of artesunate’s cytotoxic action; instead, the MCPyV-positive MCC cell line, WaGa, was found to be even less sensitive to artesunate after shRNA knockdown of the T antigens. Since loss of membrane integrity occurred more rapidly than degradation/loss of genomic DNA under the influence of artesunate in four of five MCPyV-positive MCC cell lines examined, apoptosis, although widely described as a modus operandi for artesunate, did not appear to be a determinant of the cytotoxicity of artesunate against MCPyV-positive MCC cells. Instead, we were able to demonstrate that artesunate induced the recently described iron-dependent and lipid peroxide-associated form of cell death known as "ferroptosis". This was achieved primarily through the use of inhibitors that can suppress specific individual steps of the ferroptotic process. Thus, artesunate-induced cell death of MCPyV-positive MCC cells could be suppressed by iron chelators and by the inhibition of lipid peroxidation and lysosomal transport. Surprising results were obtained from the analysis of two proteins associated with the ferroptotic process, namely, ferroptosis suppressor protein 1 (FSP1) and tumor suppressor protein p53. Here, we showed that ectopically- 2 expressed FSP1 cannot suppress artesunate-induced ferroptosis in MCPyV-positive MCC cells and that p53 does not play a pro-ferroptotic role in artesunate-induced cell death of MCPyV-positive MCCs. Since artesunate did not suppress the interferon-γ-induced expression of immune-related molecules such as HLA and PD-L1 on the surface of MCPyV-positive MCCs, our study also provided the first positive evidence for its use in combinatorial immunotherapy. Overall, this study showed that artesunate appears to be an effective drug for the treatment of MCPyV-positive MCC and might also be considered for its use in combinatorial MCC immunotherapy in the future. N2 - Das Merkelzellkarzinom (MCC) ist ein seltener und aggressiver Hautkrebs mit einer steigenden Inzidenz. Die Mehrzahl der MCC-Fälle (ca. 80%) sind mit dem Merkelzell-Polyomavirus (MCPyV) assoziiert. Dieses Virus kodiert für die MCPyV T Antigene (small T (sT) und Large T (LT)), die als Onkoproteine die MCC Karzinogenese vorantreiben. Unbekannt ist jedoch welche Zellen der Haut durch die T Antigene transformiert werden, was also die Ursprungszellen des MCC sind. Der erste Teil dieser Arbeit befasste sich daher mit der Generierung und Evaluierung eines Vektorsystems, das zur Untersuchung der MCC-Onkogenese genutzt werden könnte. Dazu wurde ein Set von lentiviralen Vektoren kloniert, das die voneinander unabhängige, induzierbare Expression von potentiellen Schlüsselfaktoren der MCC-Onkogenese erlaubt. Außerdem wurde ein CRISPR/Cas9 knock in etabliert, der es erlaubt die kodierende Sequenz für ein fluoreszierendes Protein unter die Kontrolle des Promoters von KRT20, dessen Expression eines der wichtigsten MCC Marker ist, zu bringen. Die Funktionalität dieses KRT20 Reporters konnte in einer MCPyV-positive MCC Linie, WaGa, nachgewiesen werden. Die verschiedenen induzierbaren Vektorsysteme (Doxycyclin-induzierbare MCPyV T Antigene bzw. MCPyV sT, RheoSwitch-induzierbare ATOH1, IPTG-induzierbares dnMAML1 und GLI1) zeigten sich unterschiedlich effektiv in unterschiedlichen Zellsystemen und insbesondere im Zusammenspiel mehrerer Vektoren in einer Zelle war die Induzierbarkeit teilweise erheblich reduziert. Im zweiten, und wichtigeren Teil dieser Arbeit, habe ich mich mit der Frage auseinandergesetzt, ob ein etabliertes Anti-Malaria-Medikament, dem zusätzlich anti-tumorale und anti-virale Aktivität zugeschrieben werden, sich für die Behandlung des MCPyV-positiven MCC anbieten könnte. In unserer Studie wurde festgestellt, dass Artesunat in vitro zytotoxisch auf MCPyV-positive MCC Zelllinien wirkt und in vivo im Mausmodell das Tumorwachstum verlangsamen kann. Es wurde zudem beobachtet, dass Artesunat die T Antigen Expression unterdrückt, das für die Proliferation von MCPyV-positiven MCC-Zellen entscheidend ist. Allerdings spielt die Repression der T Antigen Expression keine Rolle für den zytotoxischen Effekt von Artesunat, sondern es zeigte sich, dass die MCC-Zelllinie WaGa nach shRNA knockdown der T Antigene sogar weniger sensitiv gegenüber Artesunat war. Da unter dem Einfluss von Artesunat in vier von fünf untersuchten MCC Zelllinien der Verlust der Membranintegrität schneller eintrat als eine Degradation/Verlust der genomischen DNA scheint Apoptose, obwohl vielfach als Modus Operandi für Artesunat beschrieben, nicht bestimmend für die Zytotoxität von Artesunat gegenüber MCPyV-positiven MCC Zellen zu sein. Stattdessen konnten wir die kürzlich beschriebene eisenabhängige und Lipidperoxid-assoziierte Form des Zelltods, die sogenannte "Ferroptose", nachweisen. Dies gelang vor allem durch den Einsatz von Inhibitoren, die spezifische Einzelschritte des ferroptotischen Prozesses unterdrücken können. So ließ sich der durch Artesunat induzierte Zelltod von MCPyV-positiven Zellen durch Eisenchelatbildner und Inhibition der Lipidperoxidation und des lysosomalen Transports unterdrücken. Überraschende Ergebnisse lieferte die Analyze von zwei Proteinen, die mit dem ferroptotischen Prozess in Verbindung gebracht werden, nämlich dem Ferroptose-Suppressor-Protein 1 (FSP1) und dem Tumorsuppressor-Protein p53. Hier zeigte sich, dass ektopisch-exprimiertes FSP1 die Artesunat-induzierte Ferroptose in MCC Zellen nicht unterdrücken kann und dass p53 keine pro-ferroptotische Rolle beim Artesunat-induzierten Zelltod von MCPyV-positiven MCCs spielt. Da Artesunat die Interferon-γ induzierte Expression von immunrelevanten Molekülen wie HLA und PD-L1 auf der Oberfläche von MCPyV-positiven MCCs nicht unterdrückte, ergaben sich auch erste positive Hinweise auf seinen Einsatz in der kombinatorischen Immuntherapie. Insgesamt zeigte diese Studie, dass Artesunat ein wirksames Medikament für die Behandlung von MCPyV-positivem MCC zu sein scheint und in Zukunft auch für den Einsatz in der kombinatorischen MCC-Immuntherapie in Frage kommen könnte. KW - Merkel cell carcinoma KW - Merkel cell polyomavirus KW - Ferroptosis KW - Artesunate Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-247402 ER - TY - THES A1 - Schlegel, Jan T1 - Super-Resolution Microscopy of Sphingolipids and Protein Nanodomains T1 - Hochaufgelöste Mikroskopie von Sphingolipiden und Protein Nanodomänen N2 - The development of cellular life on earth is coupled to the formation of lipid-based biological membranes. Although many tools to analyze their biophysical properties already exist, their variety and number is still relatively small compared to the field of protein studies. One reason for this, is their small size and complex assembly into an asymmetric tightly packed lipid bilayer showing characteristics of a two-dimensional heterogenous fluid. Since membranes are capable to form dynamic, nanoscopic domains, enriched in sphingolipids and cholesterol, their detailed investigation is limited to techniques which access information below the diffraction limit of light. In this work, I aimed to extend, optimize and compare three different labeling approaches for sphingolipids and their subsequent analysis by the single-molecule localization microscopy (SMLM) technique direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM). First, I applied classical immunofluorescence by immunoglobulin G (IgG) antibody labeling to detect and quantify sphingolipid nanodomains in the plasma membrane of eukaryotic cells. I was able to identify and characterize ceramide-rich platforms (CRPs) with a size of ~ 75nm on the basal and apical membrane of different cell lines. Next, I used click-chemistry to characterize sphingolipid analogs in living and fixed cells. By using a combination of fluorescence microscopy and anisotropy experiments, I analyzed their accessibility and configuration in the plasma membrane, respectively. Azide-modified, short fatty acid side chains, were accessible to membrane impermeable dyes and localized outside the hydrophobic membrane core. In contrast, azide moieties at the end of longer fatty acid side chains were less accessible and conjugated dyes localized deeper within the plasma membrane. By introducing photo-crosslinkable diazirine groups or chemically addressable amine groups, I developed methods to improve their immobilization required for dSTORM. Finally, I harnessed the specific binding characteristics of non-toxic shiga toxin B subunits (STxBs) and cholera toxin B subunits (CTxBs) to label and quantify glycosphingolipid nanodomains in the context of Neisseria meningitidis infection. Under pyhsiological conditions, these glycosphingolipids were distributed homogenously in the plasma membrane but upon bacterial infection CTxB detectable gangliosides accumulated around invasive Neisseria meningitidis. I was able to highlight the importance of cell cycle dependent glycosphingolipid expression for the invasion process. Blocking membrane accessible sugar headgroups by pretreatment with CTxB significantly reduced the number of invasive bacteria which confirmed the importance of gangliosides for bacterial uptake into cells. Based on my results, it can be concluded that labeling of sphingolipids should be carefully optimized depending on the research question and applied microscopy technique. In particular, I was able to develop new tools and protocols which enable the characterization of sphingolipid nanodomains by dSTORM for all three labeling approaches. N2 - Die Entwicklung von zellulären Lebensformen auf der Erde basiert auf der Entstehung biologischer Lipid-Membranen. Obwohl viele Techniken zur Verfügung stehen, welche es erlauben deren biophysikalische Eigenschaften zu untersuchen, sind die Möglichkeiten, verglichen mit der Analyse von Proteinen, eher eingeschränkt. Ein Grund hierfür, ist die geringe Größe von Lipiden und deren komplexe Zusammenlagerung in eine asymmetrische dicht gepackte Lipiddoppelschicht, welche sich wie eine heterogene zweidimensionale Flüssigkeit verhält. Durch die lokale Anreicherung von Sphingolipiden und Cholesterol sind Membranen in der Lage dynamische, nanoskopische Domänen auszubilden, welche lediglich mit Techniken, welche die optische Auflösungsgrenze umgehen, detailliert untersucht werden können. Ein wesentliches Ziel meiner Arbeit war es, drei Färbeverfahren für Sphingolipide zu vergleichen, erweitern und optimieren, um eine anschliessende Untersuchung mit Hilfe der einzelmolekülsensitiven Technik dSTORM (direct stochastic optical reconstruction microscopy) zu ermöglichen. Zunächst verwendete ich das klassische Färbeverfahren der Immunfluoreszenz, um Sphingolipid-Nanodomänen auf eukaryotischen Zellen mit Hilfe von Farbstoff-gekoppelten Antikörpern zu detektieren und quantifizieren. Dieses Vorgehen ermöglichte es mir, Ceramid-angereicherte Plattformen mit einer Größe von ~ 75nm auf der basalen und apikalen Membran verschiedener Zell-Linien zu identifizieren und charakterisieren. Als nächstes Verfahren verwendete ich die Klick-Chemie, um Sphingolipid-Analoge in lebenden und fixierten Zellen zu untersuchen. Eine Kombination aus Fluoreszenz-Mikroskopie und Anisotropie-Messungen erlaubte es mir Rückschlüsse über deren Zugänglichkeit und Konfiguration innerhalb der Plasmamembran zu ziehen. Hierbei lokalisierten Azid-Gruppen am Ende kurzkettiger Fettsäurereste außerhalb des hydrophoben Membrankerns, wodurch sie mittels membran-undurchlässige Farbstoffe angeklickt werden konnten. Im Gegensatz dazu, waren Azide an längeren Fettsäureresten weniger zugänglich und konjugierte Farbstoffe tauchten tiefer in die Plasmamembran ein. Durch die Einführung photoreaktiver Diazirin-Gruppen oder chemisch modifzierbarer Amin-Gruppen wurden Wege geschaffen, welche eine Immobilisierung und anschließende Analyse mit Hilfe von dSTORM ermöglichen. Schließlich nutzte ich das spezifische Bindeverhalten der nicht toxischen B Untereinheiten von Shiga- (STxB) und Cholera-Toxin (CTxB) aus, um Glycosphingolipid Nanodomänen im Kontext einer Neisseria meningitidis Infektion zu untersuchen. Unter physiologischen Bedingungen waren diese homogen in der Plasmamembran verteilt, jedoch reicherten sich CTxB-detektierbare Ganglioside um eindringende Bakterien an. Darüber hinaus konnte ich einen Zusammenhang zwischen der zellzyklusabhängigen Expression von Glycosphingolipiden und dem Eindringen der Bakterien herstellen. Eine Absättigung der Zucker an der äußeren Membran durch CTxB-Vorbehandlung reduzierte die Anzahl von invasiven Bakterien signifikant und bestätigte die Schlüsselrolle von Gangliosiden bei der Aufnahme von Bakterien. Meine Ergebnisse legen Nahe, dass das Färbeverfahren für Sphingolipide an die jeweilige Fragestellung und Mikroskopietechnik angepasst werden sollte. Im Rahmen dieser Arbeit konnten neue Werkzeuge und Protokolle geschaffen werden, die die Charakterisierung von Sphingolipid-Nanodomänen mittels dSTORM für alle drei Färbeverfahren ermöglichen. KW - Sphingolipide KW - Lipide KW - Einzelmolekülmikroskopie KW - Click-Chemie KW - Lipid Raft KW - super-resolution microscopy KW - sphingolipids KW - labeling techniques KW - dSTORM KW - lipid rafts Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-229596 ER - TY - THES A1 - Jessen, Christina T1 - NRF2 links antioxidant and immune-relevant features in melanoma T1 - NRF2 verknüpft antioxidative und immunrelevante Eigenschaften im Melanom N2 - The transcription factor NRF2 is considered as the master regulator of cytoprotective and ROS-detoxifying gene expression. Due to their vulnerability to accumulating reactive oxygen species, melanomas are dependent on an efficient oxidative stress response, but to what extent melanomas rely on NRF2 is only scarcely investigated so far. In tumor entities harboring activating mutations of NRF2, such as lung adenocarcinoma, NRF2 activation is closely connected to therapy resistance. In melanoma, activating mutations are rare and triggers and effectors of NRF2 are less well characterized. This work revealed that NRF2 is activated by oncogenic signaling, cytokines and pro-oxidant triggers, released cell-autonomously or by the tumor microenvironment. Moreover, silencing of NRF2 significantly reduced melanoma cell proliferation and repressed well-known NRF2 target genes, indicating basal transcriptional activity of NRF2 in melanoma. Transcriptomic analysis showed a large set of deregulated gene sets, besides the well-known antioxidant effectors. NRF2 suppressed the activity of MITF, a marker for the melanocyte lineage, and induced expression of epidermal growth factor receptor (EGFR), thereby stabilizing the dedifferentiated melanoma phenotype and limiting pigmentation markers and melanoma-associated antigens. In general, the dedifferentiated melanoma phenotype is associated with a reduced tumor immunogenicity. Furthermore, stress-inducible cyclooxygenase 2 (COX2) expression, a crucial immune-modulating gene, was regulated by NRF2 in an ATF4-dependent manner. Only in presence of both transcription factors was COX2 robustly induced by H2O2 or TNFα. COX2 catalyzes the first step of the prostaglandin E2 (PGE2) synthesis, which was described to be associated with tumor immune evasion and reduction of the innate immune response. In accordance with these potentially immune-suppressive features, immunocompetent mice injected with NRF2 knockout melanoma cells had a strikingly longer tumor-free survival compared to NRF2-proficient cells. In line with the in vitro data, NRF2-deficient tumors showed suppression of COX2 and induction of MITF. Furthermore, transcriptomic analyses of available tumors revealed a strong induction of genes belonging to the innate immune response, such as RSAD2 and IFIH1. The expression of these genes strongly correlated with immune evasion parameters in human melanoma datasets and NRF2 activation or PGE2 supplementation limited the innate immune response in vitro. In summary, the stress dependent NRF2 activation stabilizes the dedifferentiated melanoma phenotype and facilitates the synthesis of PGE2. As a result, NRF2 reduces gene expression of the innate immune response and promotes the generation of an immune-cold tumor microenvironment. Therefore, NRF2 not only elevated the ROS resilience, but also strongly contributed to tumor growth, maintenance, and immune control in cutaneous melanoma. N2 - Der Transkriptionsfaktor NRF2 gilt als Masterregulator der antioxidativen Zellantwort. Im Melanom ist die Rolle von NRF2 bisher nur wenig untersucht worden, obwohl das Melanom anfällig für oxidativen Stress ist und somit eine besondere Abhängigkeit von antioxidativen Prozessen besteht. In Tumorentitäten mit NRF2 aktivierende Mutationen, wie z.B. dem Lungenadenokarzinom, ist die NRF2 Aktivierung mit einer Therapieresistenz verbunden. Allerdings sind diese aktivierenden Mutationen im Melanom selten und Mechanismen, die zu einer NRF2 Aktivierung führen, sind kaum bekannt. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass NRF2 hier vor allem durch onkogene Signalwege, Zytokine und pro-oxidative Trigger aktiviert wird. Zudem verringerte die NRF2 Inhibierung die Zellproliferation und reduzierte die Expression von bekannten NRF2 Zielgenen. Dies weist darauf hin, dass die basale Transkriptionsaktivität von NRF2 im Melanom wichtig ist. Neben den bekannten Zielgenen waren außerdem eine Vielzahl von ROS-unabhängigen Gen-Sets dereguliert. Zum einen reduzierte NRF2 die Aktivität von MITF, dem melanozytären Lineage Marker und induzierte die Expression des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors, EGFR. Dadurch stabilisiert NRF2 den undifferenzierten Melanom-Phänotyp, welcher allgemein mit einer verminderten Expression von Pigmentierungsmarkern und Melanom-assoziierten Antigenen verbunden ist. Zum anderen regulierte NRF2 die Expression von Cyclooxygenase 2 (COX2), in Abhängigkeit von dem Transkriptionsfaktor ATF4. COX2 wurde basal und nach H2O2 oder TNFα Stimulation nur in Anwesenheit beider Transkriptionsfaktoren exprimiert. COX2 katalysiert die Prostaglandin E2 (PGE2) Synthese und es wurde beschrieben, dass hohe Konzentrationen an PGE2, sowohl die Immunevasion von Tumoren erleichtert als auch die angeborenen Immunantwort reduziert. In Übereinstimmung mit diesen potenziell immun-evasiven Eigenschaften zeigten immunkompetente Mäuse, denen NRF2-knockout Melanomzellen injiziert wurden, im Vergleich zu Kontrollzellen, ein deutlich längeres tumorfreies Überleben. Die NRF2-abhängige COX2 Erhöhung und MITF Hemmung, wurde zudem in den Maustumoren bestätigt. Darüber hinaus zeigten die NRF2-defizienten Tumore eine starke Induktion von Genen des angeborenen Immunsystems, wie z.B. RSAD2 und IFIH1. Die Expression dieser Gene korrelierte mit Immunevasionsparametern in Datensätzen des humanen Melanoms und eine NRF2 Aktivierung oder PGE2 Zugabe unterdrückte die Genexpression der angeborene Immunantwort bereits in vitro. Somit stabilisiert stress-induziertes NRF2 den undifferenzierten Melanom-Phänotyp und fördert die immunmodulierende PGE2 Produktion. Infolgedessen reduziert NRF2 die angeborene Immunantwort und unterstützt die Entstehung einer immun-suppressiven Tumormikroumgebung, welche das Tumorwachstum erleichtert. Die endogene NRF2 Aktivierung im Melanom fördert somit nicht nur die ROS-Resilienz, sondern auch die Tumoraufrechterhaltung und das Tumorwachstum im immunkompetenten Organismus. KW - Melanom KW - Oxidativer Stress KW - Genexpression KW - Krebsforschung KW - NRF2 KW - Antioxidantien KW - melanoma dedifferentiation Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-233495 ER - TY - THES A1 - Rücker, Viktoria T1 - Time trends and determinants of stroke mortality in Germany T1 - Zeitliche Trends und Einflussfaktoren auf die Schlaganfall-Sterblichkeit in Deutschland N2 - In several countries, a decline in mortality, case-fatality and recurrence rates of stroke was observed. However, studies investigating sex-specific and subtype-specific (pathological and etiological) time trends in stroke mortality, case-fatality and recurrence rates are scarce, especially in Germany. The decline in ischemic stroke mortality and case-fatality might be associated with the high quality of acute care of ischemic stroke, but the exact determinants of early outcome remains unknown for Germany. Therefore, as first step of this thesis, we investigated the time trends of subtype- and sex-specific age- standardized stroke mortality rates in Germany from 1998 to 2015, by applying joinpoint regression on official causes of death statistics, provided by the Federal Statistical Office. Furthermore, a regional comparison of the time trends in stroke mortality between East and West was conducted. In the second step, time trends in case-fatality and stroke recurrence rates were analyzed using data from a population- based stroke register in Germany between 1996 and 2015. The analysis was stratified by sex and etiological subtype of ischemic stroke. In the third step, quality of stroke care and the association between adherence to measures of quality of acute ischemic stroke care and in-hospital mortality was estimated based on data from nine regional hospital-based stroke registers in Germany from the years 2015 and 2016. We showed that in Germany, age-standardized stroke mortality declined by over 50% from 1998 to 2015 both, in women and men. Stratified by the pathological subtypes of stroke, the decrease in mortality was larger in ischemic stroke compared to hemorrhagic stroke. Different patterns in the time trends of stroke were observed for stroke subtypes, regions in Germany (former Eastern part of Germany (EG), former Western part of Germany (WG)) and sex, but in all strata a decline was found. By applying joinpoint regression, the number of changes in time trend differed between the regions and up to three changes in the trend in ischemic stroke mortality were detected. Trends in hemorrhagic stroke were in parallel between the regions with up to one change (in women) in joinpoint regression. Comparing the regions, stroke mortality was higher in EG compared to WG throughout the whole observed time period, however the differences between the regions started to diminish from 2007 onwards. Further it was found that, based on the population-based Erlangen Stroke Project (ESPro), case-fatality and recurrence rates in ischemic stroke patients are still high in Germany. 46% died and 20% got a recurrent stroke within the first five years after stroke. Case-fatality rates declined statistically significant from 1996 to 2015 across all ischemic stroke patients and all etiological subtypes of ischemic stroke. Based on Cox regression no statistically significant decrease in stroke recurrence was observed. Based on the pooled data of nine regional hospital-based stroke registers from the years 2015 and 2016 covering about 80% of all hospitalized stroke patients in Germany, a high quality of care of acute ischemic stroke patients, measured via 11 evidence-based quality indicators (QI) of process of care, was observed. Across all registers, most QI reached the predefined target values for good quality of stroke care. 9 out of 11 QI showed a significant association with 7-day in-hospital mortality. An inverse linear association between overall adherence to QI and 7-day in-hospital mortality was observed. In conclusion, stroke mortality and case-fatality showed a favorable development over time in Germany, which might partly be due to improvements in acute treatment. This is supported by the association between overall adherence to quality of care and in-hospital mortality. However, there might be room for improvements in long-term secondary prevention, as no clear reduction in recurrence rates was observed. N2 - Ein Rückgang der Mortalität-, Letalität- und Rezidivraten nach einem Schlaganfall konnte in einigen Ländern in den letzten Jahren beobachtet werden. Es gibt, insbesondere für Deutschland, jedoch nur wenige Daten, die diese zeitlichen Trends stratifiziert nach Geschlecht und Schlaganfallsubtyp (pathologischer und ätiologischer Subtyp) ausgewertet haben. Der Rückgang der Mortalität und Letalität nach ischämischem Schlaganfall könnte mit der beobachteten hohen Qualität der Versorgung des akuten ischämischen Schlaganfalls zusammenhängen, jedoch sind für Deutschland die genauen Determinanten der frühen Sterblichkeit nach Schlaganfall noch unbekannt. Aus diesem Grunde wurden in der vorliegenden Dissertation, im ersten Schritt zeitliche Trends von 1998 bis 2015 der altersstandardisierten und nach Subtyp und Geschlecht stratifizierten Mortalitätsraten untersucht. Dazu wurden die vom Statistischen Bundesamtes bereitgestellten Daten zur Todesursachenstatistik mittels Joinpoint Regression ausgewertet. Zusätzlich wurde ein regionaler Vergleich der zeitlichen Trends in der Schlaganfallmortalität zwischen der östlichen und westlichen Region von Deutschland durchgeführt. Im zweiten Schritt, wurde basierend auf einem deutschem bevölkerungsbasierten Schlaganfallregister mittels Cox Regression die zeitlichen Trends der Letalitätsraten und Rezidivraten des ischämischen Schlaganfalls zwischen 1996 und 2015 geschätzt. Die Analyse wurde stratifiziert nach Geschlecht und ätiologischem Subtyp des ischämischen Schlaganfalls. Im dritten Schritt wurde, basierend auf Daten von neun regionalen krankenhausbasierten Schlaganfallregistern der Jahre 2015 und 2016, die Qualität der Behandlung des akuten ischämischen gemessen und ein möglicher Zusammenhang zwischen dem Grad der Erfüllung von evidenzbasierten Qualitätsindikatoren und der Krankenhaussterblichkeit untersucht. Wir konnten zeigen, dass von 1998 bis 2015 die altersstandardisierten Schlaganfall Mortalitätsraten über 50%, sowohl bei Männern als auch bei Frauen, abgenommen haben. Stratifiziert nach pathologischem Schlaganfallsubtyp zeigte sich ein stärkerer Rückgang in den Mortalitätsraten nach ischämischem Schlaganfall als in der Mortalitätsrate nach hämorrhagischem Schlaganfall. In allen Strata sind die Mortalitätsraten gesunken, jedoch unterschieden sich die zeitlichen Verläufe zwischen den Strata (Geschlecht, Region). Die mittels Joinpoint Regression geschätzten Anzahlen an Änderungen im zeitlichen Trend der ischämischen Schlaganfall Mortalitätsraten variierten zwischen 0 und maximal 3 Änderungen, zwischen den Regionen und Geschlechtern. Die zeitlichen Trends der Mortalitätsraten nach hämorrhagischem Schlaganfall der beiden Regionen verliefen hingegen parallel zueinander und es zeigte sich nur bei Frauen eine Änderung in der Mortalitätsrate nach der Joinpoint Regression. Die Schlaganfall Mortalitätsraten im östlichen Teil von Deutschland waren über die gesamte Zeit hinweg höher als im westlichen Teil von Deutschland, jedoch glichen sich die Raten ab 2007 immer mehr einander an und es zeigte sich nur noch ein geringer Unterschied in 2015. Die altersadjustierten Letalitätsraten und Rezidivraten nach ischämischem Schlaganfall waren in Deutschland, basierend auf Daten des bevölkerungsbasierten Erlanger Schlaganfall Registers, relativ hoch. Innerhalb der ersten fünf Jahre nach einem ischämischen Schlaganfall sterben 46% und 20% aller Patienten bekommen einen erneuten Schlaganfall. Von 1996 bis 2015 haben die Letalitätsraten nach Schlaganfall signifikant abgenommen, dies zeigte sich in allen Subtypen des ischämischen Schlaganfalls. Die Rezidivraten zeigten keinen signifikanten Rückgang. Basierend auf gepoolten Daten aus den Jahren 2015/2016 von neun krankenhausbasierten Schlaganfall Registern in Deutschland, die ca. 80% aller hospitalisierten Schlaganfälle in Deutschland abdecken, ist die, mittels 11 evidenzbasierter Prozessindikatoren gemessene Qualität der Behandlung des ischämischen Schlaganfalls, hoch. In allen Registern lagen die meisten Qualitätsindikatoren über dem vorabdefinierten Referenzwert für eine gute Qualität an Schlaganfallversorgung. Ein Zusammenhang zwischen 7-Tage Krankenhaussterblichkeit und Erfüllung von einzelnen Qualitätsindikatoren, konnte bei 9 von 11 Qualitätsindikatoren gezeigt werden. Zusätzlich zeigte sich ein inverser Zusammenhang zwischen der Gesamteinhaltung von Qualitätsindikatoren und 7-Tage Krankenhaussterblichkeit. Schlaganfall Mortalitätsrate und Letalitätsraten zeigten eine positive Entwicklung in allen Subtypen des Schlaganfalls über die letzten 20 Jahre. Dies könnte mit Verbesserungen in der Behandlung des akuten ischämischen Schlaganfalls im Krankenhaus zusammenhängen, da ein Zusammenhang zwischen der Erfüllung von Qualitätsindikatoren und der Krankenhaussterblichkeit besteht. Jedoch besteht möglicherweise noch Verbesserungspotenzial in der langfristigen Sekundärprävention, da in den Rezidivraten kein klarer Rückgang erkennbar war. KW - Schlaganfall KW - Sterblichkeit KW - Rezidiv KW - Letalität KW - Trend KW - Qualitätsindikator Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-233116 ER - TY - THES A1 - Klitsch, Alexander T1 - Corneal and cutaneous factors contributing to small fiber pathology in fibromyalgia syndrome T1 - Untersuchung cornealer und kutaner Faktoren im Rahmen der Kleinfaserpathologie beim Fibromyalgie-Syndrom N2 - We examined 143 patients suffering from FMS, a syndrome characterized by chronic widespread pain, sleep disturbances, and fatigue. Etiology and pathophysiology of FMS are scarcely understood. In recent years abnormalities of small Aδ- and C-nerve fibers have been found in subgroups of FMS patients. It is yet unclear how such SFP is caused in FMS patients and how it contributes to FMS symptoms. We used CCM to analyze corneal small nerve fibers and associated LC, comparing FMS patients’ results to those from 65 healthy controls and 41 disease controls suffering from SFN. We, further, assessed expression levels of mRNA and miRNA in keratinocytes taken from skin punch biopsies of FMS patients and healthy controls kept as monocellular cell cultures. A screening was performed using NGS in a small cohort of 12 FMS patients and 5 healthy controls. Results were validated in larger cohorts by qRT-PCR. As in previous studies IENFD and CNFD were reduced in a subgroup of FMS patients. We found identical LC densities in FMS patients, healthy controls, and SFN patients. The subpopulation of dLCfiber contact in FMS and SFN patients was lower than in healthy controls. Our RNA expression analysis revealed one mRNA that was expressed higher in FMS patients than in controls: PRSS21. We conclude that reduced neurotrophic signaling of LC may contribute to SFP in the cornea. Epidermal PRSS21 expression and dLCfiber contact density are promising biomarker candidates for FMS diagnosis. N2 - Wir untersuchten 143 PatientInnen mit FMS, einem chronischen Schmerzsyndrom mit bislang kaum verstandener Ätiologie und Pathophysiologie. In den letzten Jahren wurden bei Subgruppen von FMS-PatientInnen Pathologien der sogenannten small fibers nachgewiesen. Wie diese entstehen oder zu den Symptomen des FMS beitragen ist noch unklar. Wir untersuchten corneale Nerven und assoziierte LC mittels CCM und verglichen die Ergebnisse der FMS PatientInnen mit denen von 65 gesunden Kontrollen und 41 SFN Patientinnen. Weiterhin untersuchten wir die mRNA und miRNA Expression in Keratinozyten aus Hautstanzbiopsien von FMS PatientInnen und gesunden Kontrollen, die isoliert in Zellkultur genommen wurden. Mittels NGS wurde ein mRNA/miRNA-Screening in einer kleinen Kohorte von 12 PatientInnen und 5 Kontrollen durchgeführt. Die Ergebnisse wurden mittels qRT-PCR in einer größeren Gruppe validiert. Wie in vorausgegangenen Studien waren IENFD und CNFD bei FMS PatientInnen-Subgruppen reduziert. Die Dichte an LC war bei FMS und SFN PatientInnen sowie gesunden Kontrollen identisch. Die Subpopulation der dLCfiber contact war bei FMS und SFN PatientInnen niedriger als bei gesunden Kontrollen. Eine mRNA, PRSS21, wurde bei FMS PatientInnen stärker als bei Kontrollen exprimiert. Wir schlussfolgern, dass eine Reduktion neurotropher Signale durch LC zur Kleinfaserpathologie bei FMS beitragen könnte. Epidermale PRSS21-Expression und dLCfiber contact Dichte stellen vielversprechende Kandidaten für Biomarker zur FMS-Diagnose dar. KW - Fibromyalgie KW - Hornhaut KW - small fiber pathology KW - fibromyalgia sydrome KW - corneal confocal microscopy KW - Langerhans cells Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-224398 ER - TY - THES A1 - Jansch, Charline T1 - Effects of SLC2A3 copy number variants on neurodevelopment and glucose metabolism in ADHD patient-specific neurons T1 - Effekte der SLC2A3 Kopienzahlvarianten auf Neuroentwicklung und Glukosemetabolismus in ADHS Patienten-spezifischen Neuronen N2 - Neuropsychiatric disorders, such as attention-deficit/hyperactivity disorder (ADHD), represent a burden which deeply impair the patient’s life. Neurobiological research has therefore increasingly focused on the examination of brain neurotransmitter systems, such as the serotonin (5-HT) system, since a dysfunction has been repeatedly implicated in the pathology of these diseases. However, investigation of functional human neurons in vitro has been restricted by technical limitations for a long time until the discovery of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) revolutionized the field of experimental disease models. Since the pathogenesis of neuropsychiatric disorders involves a complex genetic component, genome-wide association studies (GWAS) revealed numerous risk genes that are associated with an increased risk for ADHD. For instance, the novel ADHD candidate gene SLC2A3 which encodes the glucose transporter-3 (GLUT3), facilitates the transport of glucose across plasma membranes and is essential for the high energy demand of several cell types, such as stem cells and neurons. Specifically, copy number variants (CNVs) of SLC2A3 might therefore impact cerebral glucose metabolism as well as the assembly of synaptic proteins in human neurons which might contribute to the pathogenesis of ADHD. We hypothesized that an altered SLC2A3 gene dosage in human neurons can exert diverse protective or detrimental effects on neurodevelopmental processes as well as the coping of glucometabolic stress events, such as hypo- and hyperglycaemic conditions. The generation of specific iPSC lines from ADHD patients and healthy probands served as basis to efficiently differentiate stem cells into 5-HT specific neurons. Using this neuronal culture, we were able to examine effects of SLC2A3 CNVs on the basal expression of SCL2A3 and GLUT3 in human neurons. Furthermore, the focus was on potentially altered coping of the cells with glucose deprivation and the treatment with specific high- and low glycaemic media. High-resolution fluorescence imaging in combination with electrophysiological and molecular biological techniques showed that: 1) The generated human iPSCs are fully reprogrammed human stem cells showing typical characteristics of embryonic stem cell-like morphology, growth behaviour, the ability to differentiate into different cell types of the human body and the expression of pluripotency-specific markers. 2) The neuronal subtype derived from our stem cells display typical characteristics of 5-HT specific median and dorsal neurons and forms synapses reflected by the expression of pre- and postsynaptic proteins. 3) Even if SLC2A3 CNVs influence SLC2A3 and GLUT3 basal expression, no significant alterations in gene and protein expression caused by hyper- and hypoglycaemic conditions, nor in the assembly of proteins associated with synapse formation could be observed in human iPSC-derived neurons. N2 - Neuropsychiatrische Erkrankungen, wie das Aufmerksamkeits-Defizit/Hyperaktivitäts-Syndrom (ADHS), stellen eine Belastung dar, die das Leben des Patienten schwerwiegend beeinträchtigen. Die neurobiologische Forschung hat sich deshalb zunehmend auf die Untersuchung der Neurotransmittersysteme des Gehirns, wie das serotonerge (5-HT) System fokussiert, da eine Dysfunktion wiederholt in Zusammenhang mit der Pathogenese solcher Erkrankungen gebracht wurde. Die in vitro-Untersuchung funktioneller humaner Neurone war jedoch lange Zeit durch technische Limitierungen eingeschränkt, bis die Entdeckung humaner induzierter pluripotenter Stammzellen (iPSCs) das Feld der experimentellen Krankheitsmodelle revolutionierte. Da die Pathogenese neuropsychiatrischer Erkrankungen eine komplexe genetische Komponente einschließt, haben genomweite Assoziationsstudien zahlreiche Risikogene aufgedeckt, die mit einem erhöhten Risiko für ADHS assoziiert werden. Das Kandidatengen SLC2A3, das den Glukosetransporter-3 (GLUT3) codiert, ermöglicht beispielsweise den Transport von Glukose über Plasmamembranen und ist somit essenziell für die hohe Energieanforderung verschiedenster Zelltypen, wie etwa Stammzellen und Neurone. Im Besonderen könnten die Kopienzahlvarianten (CNVs) des Gens SLC2A3 daher den cerebralen Glukosemetabolismus, sowie die Ansammlung synaptischer Proteine beeinflussen und so zur Pathogenese des ADHS beitragen. Wir nahmen an, dass eine veränderte SLC2A3-Gendosis in humanen Neuronen diverse protektive oder schädliche Effekte auf Neuroentwicklungsprozesse, sowie den Umgang mit glukometabolischen Stress-Ereignissen, wie etwa hypo- und hyperglykämische Bedingungen haben könnte. Die Generierung spezieller iPSC-Linien von ADHS-Patienten und gesunden Probanden diente als Basis, um Stammzellen effizient in 5-HT spezifische Neurone zu differenzieren. Diese neuronale Kultur ermöglichte uns die Untersuchung der Effekte der SLC2A3 CNVs auf die Basalexpression von SLC2A3 und GLUT3 in humanen Neuronen. Des Weiteren war der Focus auf einen potenziell veränderten Umgang der Zellen mit Glukoseentzug und der Behandlung mit speziellen hoch- und niederglykämischen Medien. Hochauflösende Fluoreszenzaufnahmen in Kombination mit elektrophysiologischen und molekularbiologischen Techniken zeigten, dass: 1) Die generierten human iPSCs vollständig reprogrammierte humane Stammzellen sind, die die typischen Merkmale der embryonalen Stammzell-Morphologie, des Wachstumsverhaltes, der Fähigkeit in verschiedenste Zelltypen des menschlichen Körpers zu differenzieren und der Expression Pluripotenz-assoziierter Marker aufweisen. 2) Der neuronale Subtyp, der aus unseren Stammzellen generiert wurde, die typischen Charakteristiken medianer und dorsaler 5-HT Neurone aufweist und Synapsen formt, verdeutlicht durch die Expression prä- und postsynaptischer Proteine. 3) Selbst wenn die SLC2A3 CNVs einen Einfluss auf die basale Gen- und Proteinexpression haben, zeigte sich jedoch in humanen iPSC-erzeugten Neuronen keine signifikante Veränderung der Gen- und Proteinexpression aufgrund hyper- und hypoglykämischer Konditionen, noch der Ansammlung der Proteine, die mit der Formation der Synapsen assoziiert sind. KW - Stammzelle KW - Induzierte pluripotente Stammzelle KW - Aufmerksamkeitsdefizit-Syndrom KW - Kopienzahlvariation KW - Duplikation KW - SLC2A3 KW - Deletion Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-216201 ER - TY - THES A1 - Ciba, Manuel T1 - Synchrony Measurement and Connectivity Estimation of Parallel Spike Trains from in vitro Neuronal Networks T1 - Messung der Synchronität und Abschätzung der Konnektivität von in-vitro Spike-Trains N2 - The goal of this doctoral thesis is to identify appropriate methods for the estimation of connectivity and for measuring synchrony between spike trains from in vitro neuronal networks. Special focus is set on the parameter optimization, the suitability for massively parallel spike trains, and the consideration of the characteristics of real recordings. Two new methods were developed in the course of the optimization which outperformed other methods from the literature. The first method “Total spiking probability edges” (TSPE) estimates the effective connectivity of two spike trains, based on the cross-correlation and a subsequent analysis of the cross-correlogram. In addition to the estimation of the synaptic weight, a distinction between excitatory and inhibitory connections is possible. Compared to other methods, simulated neuronal networks could be estimated with higher accuracy, while being suitable for the analysis of massively parallel spike trains. The second method “Spike-contrast” measures the synchrony of parallel spike trains with the advantage of automatically optimizing its time scale to the data. In contrast to other methods, which also adapt to the characteristics of the data, Spike-contrast is more robust to erroneous spike trains and significantly faster for large amounts of parallel spike trains. Moreover, a synchrony curve as a function of the time scale is generated by Spike-contrast. This optimization curve is a novel feature for the analysis of parallel spike trains. N2 - Ziel dieser Dissertation ist die Identifizierung geeigneter Methoden zur Schätzung der Konnektivität und zur Messung der Synchronität von in-vitro Spike-Trains. Besonderes Augenmerk wird dabei auf die Parameteroptimierung, die Eignung für große Mengen paralleler Spike-Trains und die Berücksichtigung der Charakteristik von realen Aufnahmen gelegt. Im Zuge der Optimierung wurden zwei neue Methoden entwickelt, die anderen Methoden aus der Literatur überlegen waren. Die erste Methode “Total spiking probability edges” (TSPE) schätzt die effektive Konnektivität zwischen zwei Spike-Trains basierend auf der Berechnung einer Kreuzkorrelation und einer anschließenden Analyse des Kreuzkorrelograms. Neben der Schätzung der synaptischen Ge- wichtung ist eine Unterscheidung zwischen exzitatorischen und inhibitorischen Verbindungen möglich. Im Vergleich zu anderen Methoden, konnten simulierte neuronale Netzwerke mit einer höheren Genauigkeit geschätzt werden. Zudem ist TSPE aufgrund der hohen Rechengeschwindigkeit für große Datenmengen geeignet. Die zweite Methode “Spike-contrast” misst die Synchronität paralleler Spike-Trains mit dem Vorteil, dass die Zeitskala automatisch an die Daten angepasst wird. Im Gegensatz zu anderen Methoden, welche sich ebenfalls an die Daten anpassen, ist Spike-contrast robuster gegenüber fehlerhaften Spike-Trains und schneller für große Datenmengen. Darüber hinaus berechnet Spike-Contrast eine Synchronitätskurve als Funktion der Zeitskala. Diese Kurve ist ein neuartiges Feature zur Analyse paralleler Spike-Trains. KW - Synchronitätsmessung KW - Konnektivitätsschätzung KW - microelectrode array KW - bicuculline KW - similarity KW - distance KW - correlation Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-223646 ER - TY - THES A1 - Kunz, Tobias C. T1 - Expansion Microscopy (ExM) as a tool to study organelles and intracellular pathogens T1 - Expansionsmikroskopie (ExM) als Tool zur Untersuchung von Organellen und intrazellulären Pathogenen N2 - The resolution of fluorescence light microscopy was long believed to be limited by the diffraction limit of light of around 200-250 nm described in 1873 by Ernst Abbe. Within the last decade, several approaches, such as structured illumination microscopy (SIM), stimulated emission depletion STED and (direct) stochastic optical reconstruction microscopy (d)STORM have been established to bypass the diffraction limit. However, such super-resolution techniques enabling a resolution <100 nm require specialized and expensive setups as well as expert knowledge in order to avoid artifacts. They are therefore limited to specialized laboratories. Recently, Boyden and colleagues introduced an alternate approach, termed expansion microscopy (ExM). The latter offers the possibility to perform superresolution microscopy on conventional confocal microscopes by embedding the sample into a swellable hydrogel that is isotropically expanded. Since its introduction in 2015, expansion microscopy has developed rapidly offering protocols for 4x, 10x and 20x expansion of proteins and RNA in cells, tissues and human clinical specimens. Mitochondria are double membrane-bound organelles and crucial to the cell by performing numerous tasks, from ATP production through oxidative phosphorylation, production of many important metabolites, cell signaling to the regulation of apoptosis. The inner mitochondrial membrane is strongly folded forming so-called cristae. Besides being the location of the oxidative phosphorylation and therefore energy conversion and ATP production, cristae have been of great interest because changes in morphology have been linked to a plethora of diseases from cancer, diabetes, neurodegenerative diseases, to aging and infection. However, cristae imaging remains challenging as the distance between two individual cristae is often below 100 nm. Within this work, we demonstrate that the mitochondrial creatine kinase MtCK linked to fluorescent protein GFP (MtCK-GFP) can be used as a cristae marker. Upon fourfold expansion, we illustrate that our novel marker enables visualization of cristae morphology and localization of mitochondrial proteins relative to cristae without the need for specialized setups. Furthermore, we show the applicability of expansion microscopy for several bacterial pathogens, such as Chlamydia trachomatis, Simkania negevensis, Neisseria gonorrhoeae and Staphylococcus aureus. Due to differences in bacterial cell walls, we reveal important aspects for the digestion of pathogens for isotropic expansion. We further show that expansion of the intracellular pathogens C. trachomatis and S. negevensis, enables the differentiation between the two distinct developmental forms, catabolic active reticulate bodies (RB) and infectious elementary bodies (EB), on a conventional confocal microscope. We demonstrate the possibility to precisely locate chlamydial effector proteins, such as CPAF or Cdu1, within and outside the chlamydial inclusion. Moreover, we show that expansion microscopy enables the investigation of bacteria, herein S. aureus, within LAMP1 and LC3-II vesicles. With the introduction of the unnatural α-NH2-ω-N3-C6-ceramide, we further present the first approach for the expansion of lipids that may also be suitable for far inaccessible molecule classes like carbohydrates. The efficient accumulation and high labeling density of our functionalized α-NH2-ω-N3-C6-ceramide in both cells and bacteria enables in combination with tenfold expansion nanoscale resolution (10-20 nm) of the interaction of proteins with the plasma membrane, membrane of organelles and bacteria. Ceramide is the central molecule of the sphingolipid metabolism, an important constituent of cellular membranes and regulates many important cellular processes such as differentiation, proliferation and apoptosis. Many studies report about the importance of sphingolipids during infection of various pathogens. While the transport of ceramide to Chlamydia has been reported earlier, one of the unanswered questions remaining was if ceramide forms parts of the outer or inner bacterial membrane. Expansion of α-NH2-ω-N3-C6-ceramide enabled the visualization of ceramide in the inner and outer membrane of C. trachomatis and their distance was determined to be 27.6 ± 7.7 nm. N2 - Aufgrund der Beugungseigenschaften des Lichtes wurde bereits 1873 durch Ernst Abbe für die Lichtmikroskopie eine theoretische Auflösungsgrenze von 200-250 nm definiert. Durch die Einführung verschiedener hochauflösender Mikroskopiemethoden, wie beispielsweise SIM-Mikroskopie (structured illumination microscopy), STED-Mikroskopie (stimulated emission depletion) und (d)STORM-Mikroskopie ((direct) stochastic optical reconstruction microscopy), konnte im letzten Jahrzehnt jedoch die Auflösung auf unter 100 nm verbessert werden. Allerdings benötigen solche Hochauflösungstechniken sowohl spezialisierte und kostenintensive Geräte als auch Expertenwissen zur Vermeidung von Artefakten, sodass diese nur in wenigen Laboren angewendet werden können. Ein alternativer Ansatz, die sogenannte Expansionsmikroskopie, wurde kürzlich von der Arbeitsgruppe um Ed Boyden etabliert. Hierbei wird eine Probe mit einem quellfähigen Gel vernetzt, welches daraufhin isotrop expandiert wird, sodass auch an konventionellen konfokalen Mikroskopen Hochauflösung ermöglicht wird. Seit ihrer Einführung im Jahre 2015 hat sich die Expansionsmikroskopie schnell entwickelt und bietet Protokolle für 4-fache, 10-fache oder sogar 20-fache Expansion von Proteinen als auch RNA in Zellen oder sogar komplexen Geweben. Mitochondrien besitzen zwei Membranen und sind für die Zelle von großer Bedeutung, da sie eine Vielzahl wichtiger Aufgaben übernehmen - von der ATP-Produktion durch die oxidative Phosphorylierung über die Produktion vieler wichtiger Metabolite bis hin zur Regulation zellulärer Signalwege. Die innere Mitochondrienmembran ist stark gefaltet und bildet Einstülpungen, die sogenannten Cristae, in welchen die oxidative Phosphorylierung und somit die Energieumwandlung und ATP-Synthese stattfindet. Morphologische Veränderungen der Cristae können sowohl beim Altern von Zellen, als auch bei verschiedenen Infektionen beobachtet werden und können darüber hinaus auch im Rahmen diverser Erkrankungen, wie beispielsweise Krebs, Diabetes oder neurodegenerativen Erkrankungen auftreten. Die Visualisierung der Cristae durch Fluoreszenzmikroskopie ist herausfordernd, da der Abstand zwischen einzelnen Cristae oftmals unter 100 nm beträgt. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass die Expression der mitochondrialen Kreatinkinase gekoppelt an das Fluoreszenzprotein GFP (MtCK-GFP) als Cristaemarker genutzt werden kann. In Kombination mit vierfacher Expansion ermöglicht unser Marker die Untersuchung morphologischer Veränderungen von Cristae, sowie die Lokalisierung mitochondrialer Proteine relativ zu den Cristae. Darüber hinaus wird im Rahmen dieser Arbeit die Anwendbarkeit der Expansionsmikroskopie für mehrere bakterielle Pathogene, und zwar Chlamydia trachomatis, Simkania negevensis, Neisseria gonorrhoeae und Staphylococcus aureus, gezeigt. Hierbei verdeutlichen wir wichtige Aspekte für den vollständigen Verdau unterschiedlicher bakterieller Zellwände und somit isotropen Expansion. Die Expansion der intrazellulären Pathogene C. trachomatis und S. negevensis ermöglichte es uns an konventionellen konfokalen Mikroskopen zwischen den zwei verschiedenen Entwicklungsstadien, der katabolisch aktiven Retikulärkörperchen (RBs) und der infektiösen Elementarkörperchen (EBs), zu unterscheiden. Außerdem konnte die Möglichkeit der präzisen Lokalisierung chlamydialer Proteine wie CPAF und Cdu1 innerhalb und außerhalb der chlamydialen Inklusion gezeigt werden und Bakterien, in diesem Fall S. aureus, in LAMP1 und LC3-II Vesikeln visualisiert werden. Mit der Einführung des unnatürlichen α-NH2-ω-N3-C6-Ceramides, präsentieren wir zudem ein erstes Konzept für die Expansion von Lipiden, welches möglicherweise auch für deutlich unzugänglichere Molekülklassen wie beispielsweise Kohlehydrate geeignet ist. Die effiziente Akkumulierung unseres funktionalisierten α-NH2-ω-N3-C6-Ceramides in Zellen sowie Bakterien ermöglicht in Kombination mit zehnfacher Expansion die Untersuchung der Interaktion von Proteinen mit der Zellmembran, Membranen von Organellen und Bakterien mit einer räumlichen Auflösung von 10-20 nm. Ceramid ist das zentrale Molekül des Sphingolipidstoffwechsels, ein wichtiger Baustein zellulärer Membrane und reguliert viele essentielle Prozesse wie die Zelldifferenzierung, die Proliferation als auch die Apoptose. Viele Studien berichten von der Bedeutung der Sphingolipide während der Infektion verschiedener Pathogene. So wurde beispielsweise zuvor berichtet, dass Ceramide aktiv zu Chlamydien transportiert und in deren Membranen eingebaut werden. Hierbei verblieb allerdings die Frage, ob Ceramide in der äußeren oder inneren bakteriellen Membran lokalisiert sind. Die Expansion unseres α-NH2-ω-N3-C6-Ceramides ermöglichte es uns Ceramide in der inneren und äußeren Membran von C. trachomatis zu visualisieren und den Abstand zwischen beiden Membranen auf 27.6 ± 7.7 nm zu bestimmen. KW - Fluoreszenzmikroskopie KW - Mitochondrium KW - Chlamydia trachomatis KW - Ceramide KW - Superresolution microscopy KW - Expansion microscopy KW - Mitochondria KW - Intracellular bacteria KW - Hochauflösungsmikroskopie KW - Expansionsmikroskopie KW - Mitochondrien KW - Intrazelluläre Bakterien Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-223330 ER - TY - THES A1 - Orth, Barbara T1 - Identification of an atypical peptide binding mode of the BTB domain of the transcription factor MIZ1 with a HUWE1-derived peptide T1 - Identifikation eines neuen Bindungsmodus zwischen der BTB-Domäne des Transkriptionsfaktors MIZ1 und eines Peptids aus der HECT-E3-Ligase HUWE1 N2 - Ubiquitination is a posttranslational modification with immense impact on a wide range of cellular processes, including proteasomal degradation, membrane dynamics, transcription, translation, cell cycle, apoptosis, DNA repair and immunity. These diverse functions stem from the various ubiquitin chain types, topologies, and attachment sites on substrate proteins. Substrate recruitment and modification on lysine, serine or threonine residues is catalyzed by ubiquitin ligases (E3s). An important E3 that decides about the fate of numerous substrates is the HECT-type ubiquitin ligase HUWE1. Depending on the substrate, HUWE1 is involved in different processes, such as cell proliferation and differentiation, DNA repair, and transcription. One of the transcription factors that is ubiquitinated by HUWE1 is the MYC interacting zinc finger protein 1 (MIZ1). MIZ1 is a BTB/POZ (Bric-à-brac, Tramtrack and Broad-Complex/Pox virus and zinc finger) zinc finger (ZF) protein that binds to DNA through its 13 C2H2-type zinc fingers and either activates or represses the transcription of target genes, including genes involved in cell cycle arrest, such as P21CIP1 (CDKN1A). The precise functions of MIZ1 depend on its interactions with the MYC-MAX heterodimer, but also its heterodimerization with other BTB-ZF proteins, such as BCL6 or NAC1. How MIZ1 interacts with HUWE1 has not been studied and, as a consequence, it has not been possible to rationally develop tools to manipulate this interaction with specificity in order to better understand the effects of the interaction on the transcriptional function of MIZ1 on target genes or processes downstream. One aspect of my research, therefore, aimed at characterizing the MIZ1-HUWE1 interaction at a structural level. I determined a crystal structure of the MIZ1-BTB-domain in complex with a peptide, referred to as ASC, derived from a C terminal region of HUWE1, previously named ‘activation segment’. The binding mode observed in this crystal structure could be validated by binding and activity assays in vitro and by cell-based co-IP experiments in the context of N-terminally truncated HUWE1 constructs. I was not able to provide unambiguous evidence for the identified binding mode in the context of full-length HUWE1, indicating that MIZ1 recognition by HUWE1 requires yet unknown regions in the cell. While the structural details of the MIZ1-HUWE1 interaction remains to be elucidated in the context of the full-length proteins, the binding mode between MIZ1BTB and ASC revealed an interesting, atypical structural feature of the BTB domain of MIZ1 that, to my knowledge, has not been described for other BTB-ZF proteins: The B3 region in MIZ1BTB is conformationally malleable, which allows for a HUWE1-ASC-peptide-mediated β-sheet extension of the upper B1/B2-strands, resulting in a mixed, 3 stranded β-sheet. Such β-sheet extension does not appear to occur in other homo- or heterodimeric BTB-ZF proteins, including MIZ1-heterodimers, since these proteins typically possess a pre-formed B3-strand in at least one subunit. Instead, BCL6 co repressor-derived peptides (SMRT and BCOR) were found to extend the lower β-sheet in BCL6BTB by binding to an adjacent ‘lateral groove’. This interaction follows a 1:1 stoichiometry, whereas the MIZ1BTB-ASC-complex shows a 2:1 stoichiometry. The crystal structure of the MIZ1BTB-ASC-complex I determined, along with comparative binding studies of ASC with monomeric, homodimeric, and heterodimeric MIZ1BTB variants, respectively, suggests that ASC selects for MIZ1BTB homodimers. The structural data I generated may serve as an entry point for the prediction of additional interaction partners of MIZ1 that also have the ability to extend the upper β-sheet of MIZ1BTB. If successful, such interaction partners and structures thereof might aid the design of peptidomimetics or small-molecule inhibitors of MIZ1 signaling. Proof-of-principle for such a structure-guided approach targeting BTB domains has been provided by small-molecule inhibitors of BCL6BTB co-repressors interactions. If a similar approach led to molecules that interfere with specific interactions of MIZ1, they would provide intriguing probes to study MIZ1 biology and may eventually allow for the development of MIZ1-directed cancer therapeutics. N2 - Ubiquitinierung ist eine posttranslationale Modifikation mit weitreichendem Einfluss auf eine Vielzahl von zellulären Prozessen, wie proteasomale Degradation, Membrandynamik, Transkription, Translation, Zellzyklus, Apoptose, DNA-Reparatur und Immunität. Grundlage für diese Diversität ist die Möglichkeit, dass Substrate an unterschiedlichen Stellen mit verschiedenen Ubiquitin-Kettentypen modifiziert werden können. Die Substratrekrutierung und -modifikation an Lysin-, Serin oder Threonin Resten wird durch Ubiquitin-Ligasen (E3s) katalysiert. Eine wichtige Ubiquitin-Ligase, die zahlreiche Substrate reguliert, ist die HECT-Ligase HUWE1. Abhängig vom Substrat ist HUWE1 an verschiedenen Prozessen, wie der Zellproliferation und -differenzierung, DNA-Reparatur, aber auch Transkription beteiligt. Ein Transkriptionsfaktor, der von HUWE1 ubiquitiniert wird, ist MIZ1 (MYC interacting zinc finger protein 1). MIZ1 ist ein BTB/POZ (Bric-à-brac, Tramtrack and Broad-Complex/Pox Virus and Zinc finger) Zinkfinger(ZF)-Protein, das über seine 13 C2H2 Zinkfinger an DNA bindet und so die Transkription von verschiedenen Zielgenen aktivieren oder reprimieren kann. MIZ1-Zielgene sind unter anderem am Zellzyklusarrest beteiligt, wie z.B. das Gen P21CIP1 (CDKN1A). Die biologischen Funktionen von MIZ1 werden unter anderem durch seine Interaktion mit dem MYC MAX-Heterodimer, aber auch durch Heterodimerisierung mit anderen BTB ZF Proteinen, wie BCL6 oder NAC1, reguliert. Wie MIZ1 mit der HUWE1-Ligase interagiert, wurde bislang strukturell noch nicht untersucht, weshalb noch nicht gezielt kleine Moleküle zur Manipulation der Interaktion entwickelt werden konnten, um Einfluss auf die transkriptionellen Funktionen von MIZ1 oder seiner Zielgene zu nehmen. Meine Untersuchungen zielten daher unter anderem darauf ab, die MIZ1-HUWE1-Interaktion auf struktureller Ebene zu charakterisieren. Ich konnte eine Kristallstruktur der MIZ1-BTB-Domäne in Komplex mit dem HUWE1-Peptid ASC lösen, dessen Sequenz in der C-terminalen Region von HUWE1 zu finden ist und zuvor als „activation segment“ definiert wurde. Der in dieser Kristallstruktur beobachtete Bindungsmodus konnte durch Bindungs- und Aktivitätsassays in vitro und durch co-IP-Experimente in zellbasierten Assays validiert werden, jedoch nur im Zusammenhang mit N-terminal verkürzten HUWE1 Konstrukten. Es war mir nicht möglich, diesen Bindungsmodus im Kontext des HUWE1-Proteins voller Länge nachzuweisen, was darauf hindeutet, dass bei der MIZ1-Erkennung durch HUWE1 in der Zelle andere Regionen beteiligt sein könnten. Während die strukturellen Details der MIZ1-HUWE1-Interaktion im Kontext der Proteine voller Länge noch aufgeklärt werden müssen, zeigte der Bindungsmodus zwischen MIZ1BTB und ASC ein atpyisches Strukturmerkmal der BTB-Domäne von MIZ1, das meines Wissens bislang in keinem anderen BTB-ZF-Protein beschrieben wurde: Die B3-Region in MIZ1BTB zeigt eine untypische konformationelle Flexibilität, die es erlaubt, dass das HUWE1-ASC-Peptid die B1/B2-Stränge im oberen Segment von MIZ1BTB zu einem 3-strängigen β-Faltblatt erweitert. Eine solche β-Faltblatt-Erweiterung scheint in anderen homo- oder heterodimeren BTB-ZF-Proteinen, einschließlich MIZ1-Heterodimeren, nicht aufzutreten, da diese Proteine typischerweise bereits einen B3-Strang in mindestens einer Untereinheit aufweisen. Stattdessen konnte beobachtet werden, dass Peptidliganden, wie sie von den BCL6 Co-Repressoren SMRT und BCOR abgeleitet wurden, ein β-Faltblatt im unteren Segment von BCL6BTB erweitern, indem sie in der sogenannten „lateral groove“ binden, die in unmittelbarer Nähe des betreffenden β-Faltblattes lokalisiert ist. Während die Interaktion von BCL6BTB mit Co-Repressor-Peptiden eine 1:1 Stöchiometrie zeigt, beobachtete ich für den MIZ1BTB-ASC-Komplex eine 2:1 Stöchiometrie. Die Kristallstruktur des MIZ1BTB-ASC-Komplexes, zusammen mit Bindungsassays, die die Interaktion zwischen ASC und monomerem, homodimerem bzw. heterodimerem MIZ1BTB untersuchten, deuten darauf hin, dass ASC spezifisch mit MIZ1BTB-Homodimeren interagiert. Daher könnten die von mir gewonnenen Strukturinformationen dazu dienen, weitere MIZ1-Bindungspartner vorherzusagen. Falls erfolgreich, könnten die neu identifizierten Interaktionspartner und zugehörige Strukturen dazu genutzt werden, Peptidomimetika und niedermolekulare Inhibitoren zu entwickeln, die spezifische Interaktionen von MIZ1 und die zugehörigen zellulären Prozesse stören und somit als Werkzeuge zum besseren Verständnis der MIZ1 Biologie dienen könnten. Vorbild dabei können zahlreiche niedermolekulare Verbindungen sein, die zur Störung der Co-Repressor-Peptid-Bindung an BCL6BTB entwickelt wurden. Wenn es auf ähnliche Weise gelänge, spezifischen Einfluss auf die transkriptionelle Funktion von MIZ1 zu nehmen, so könnte dies von hohem therapeutischen Nutzen in der Bekämpfung verschiedener Krebsarten sein. KW - Ubiquitin KW - Ubiquitin-Protein-Ligase KW - Ubiquitinierung KW - Transkriptionsfaktor KW - Zink-Finger-Proteine KW - HUWE1 KW - MIZ1 KW - BTB domain KW - binding mode KW - peptide Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-250447 ER - TY - THES A1 - Kraus, Amelie Johanna T1 - H2A.Z – a molecular guardian of RNA polymerase II transcription in African trypanosomes T1 - H2A.Z – eine molekulare Wächterin der RNA Polymerase II Transkription in Afrikanischen Trypanosomen N2 - In eukaryotes, the enormously long DNA molecules need to be packaged together with histone proteins into nucleosomes and further into compact chromatin structures to fit it into the nucleus. This nuclear organisation interferes with all phases of transcription that require the polymerase to bind to DNA. During transcription – the process in which the hereditary information stored in DNA is transferred to many transportable RNA molecules - nucleosomes form a physical obstacle for polymerase progression. Thus, transcription is usually accompanied by processes mediating nucleosome destabilisation, including post-translational histone modifications (PTMs) or exchange of canonical histones by their variant forms. To the best of our knowledge, acetylation of histones has the highest capability to induce chromatin opening. The lysine modification can destabilise histone-DNA interactions within a nucleosome and can serve as a binding site for various chromatin remodelers that can modify the nucleosome composition. For example, H4 acetylation can impede chromatin folding and can stimulate the exchange of canonical H2A histone by its variant form H2A.Z at transcription start sites (TSSs) in many eukaryotes, including humans. As histone H4, H2A.Z can be post-translationally acetylated and as acetylated H4, acetylated H2A.Z is enriched at TSSs suggested to be critical for transcription. However, thus far, it has been difficult to study the cause and consequence of H2A.Z acetylation. Even though, genome-wide chromatin profiling studies such as ChIP-seq have already revealed the genomic localisation of many histone PTMs and variant proteins, they can only be used to study individual chromatin marks and not to identify all factors important for establishing a distinct chromatin structure. This would require a comprehensive understanding of all marks associated to a specific genomic locus. However, thus far, such analyses of locus-specific chromatin have only been successful for repetitive regions, such as telomeres. In my doctoral thesis, I used the unicellular parasite Trypanosoma brucei as a model system for chromatin biology and took advantage of its chromatin landscape with TSSs comprising already 7% of the total T. brucei genome (humans: 0.00000156%). Atypical for a eukaryote, the protein-coding genes are arranged in long polycistronic transcription units (PTUs). Each PTU is controlled by its own ~10 kb-wide TSS, that lies upstream of the PTU. As observed in other eukaryotes, TSSs are enriched with nucleosomes containing acetylated histones and the histone variant H2A.Z. This is why I used T. brucei to particularly investigate the TSS-specific chromatin structures and to identify factors involved in H2A.Z deposition and transcription regulation in eukaryotes. To this end, I established an approach for locus-specific chromatin isolation that would allow me to identify the TSSs- and non-TSS-specific chromatin marks. Later, combining the approach with a method for quantifying lysine-specific histone acetylation levels, I found H2A.Z and H4 acetylation enriched in TSSs-nucleosomes and mediated by the histone acetyltransferases HAT1 and HAT2. Depletion of HAT2 reduced the levels of TSS-specific H4 acetylation, affected targeted H2A.Z deposition and shifted the sites of transcription initiation. Whereas HAT1 depletion had only a minor effect on H2A.Z deposition, it had a strong effect on H2A.Z acetylation and transcription levels. My findings demonstrate a clear link between histone acetylation, H2A.Z deposition and transcription initiation in the early diverged unicellular parasite T. brucei, which was thus far not possible to determine in other eukaryotes. Overall, my study highlights the usefulness of T. brucei as a model system for studying chromatin biology. My findings allow the conclusion that H2A.Z regardless of its modification state defines sites of transcription initiation, whereas H2A.Z acetylation is essential co-factor for transcription initiation. Altogether, my data suggest that TSS-specific chromatin establishment is one of the earliest developed mechanisms to control transcription initiation in eukaryotes. N2 - In Eukaryoten muss die genomische DNA zusammen mit Histonproteinen zu Nukleosomen und weiter zu kompakten Chromatinstrukturen verpackt werden, damit sie in den Zellkern passt. Diese Organisation behindert die Transkription bei jedem Schritt, bei dem die Polymerase an der DNA bindet. Während der Transkription – dem Prozess bei dem die in der DNA gespeicherte Erbinformation in viele transportable RNA Molekülen umgewandelt wird – stellen Nukleosomen ein physikalisches Hindernis für das Vorankommen der Polymerase dar. Aus diesem Grund wird die Transkription üblicherweise von Prozessen begleitet, die für die Destabilisierung der Nukleosomen sorgen, wie zum Beispiel post-translationale Modifizierung (PTM) der Histone oder der Austausch von kanonischen Histonproteinen durch eine ihrer Varianten. Soweit bisher bekannt ist Histonacetylierung am besten dafür geeignet, eine offene Chromatinstruktur bereit zu stellen. Die Lysinmodifizierung kann Interaktionen zwischen der DNA und den Histonen innerhalb eines Nukleosomes destabilisieren und als Andockstelle für einige Proteinkomplexe sogenannte Chromatin-Modellierer fungieren, die die Zusammensetzung eines Nukleosomes verändern können. Zum Beispiel, kann Acetylierung am Histon H4 das „Zusammenfalten“ des Chromatins erschweren und den Austausch von kanonischem H2A mit ihrer Variante H2A.Z an den Transkriptiosinitiationsstellen (TSSen) in vielen eukaryotischen Organismen, Menschen eingeschlossen, stimulieren. Wie Histon H4, kann auch H2A.Z post-translationell acetyliert werden und wie acetyliertes H4, findet man auch acetyliertes H2A.Z vor allem an TSSen. Deswegen geht man davon aus, dass es sehr wichtig für die Transkriptioninitiierung ist. Allerdings war es bisher nicht möglich, die Ursache und Wirkung von H2A.Z Acetylierung genauer zu untersuchen. Genom-weite Chromatinprofilstudien wie z.B. ChIP-Seq ermöglichen es die genomische Lokalisierung von vielen Histon-Modifizierungen und -Varianten zu bestimmen. Dennoch reichen sie nicht dafür aus alle Faktoren, die für die Bildung einer bestimmten Chromatinstruktur notwendig sind, gleichzeitig herauszufinden. Das würde voraussetzen, dass man alle Merkmale der genomischen Stelle kennt. Bisher waren Analysen von spezifischen Chromatinstellen nur erfolgreich, wenn das Chromatin von einer repetitiven Region, wie z.B. Telomeren, stammt. In meiner Doktorarbeit verwendete ich den einzelligen Parasiten Trypanosoma brucei als Modelsystem für Chromatinbiologie. Dabei machte ich mir dessen Chromatinorganisation zunutze, die eher untypisch für einen eukaryotische Organismus ist. TSSen machen hier ungefähr 7% des gesamten Genoms aus (Mensch: 0.00000156%). Protein-kodierende Gene sind in langen polycistronischen Transkriptionseinheiten (PTE) angeordnet. Jede dieser Einheiten besitzt eine eigene TSS, die vor der PTE liegt, und bis zu 10 kb lang sein kann. Jedoch, wie in anderen Eukaryoten, sind an den TSSen Nukleosomen angereichert, die sich durch acetylierte Histone und den Einbau der Histonvariante H2A.Z auszeichnen. Aus diesen Gründen verwendete ich T. brucei, um während meiner Doktorarbeit die Chromatinstrukturen, die TSSen auszeichnen, genauer zu untersuchen und die Faktoren, die bei der H2A.Z Positionierung und dadurch bei der Transkriptionsregulation in Eukaryoten eine Rolle spielen, herauszufinden. Dafür etablierte ich zuerst eine Methode, mit der man Chromatin von einer bestimmten genomischen Stelle isolieren kann und die es mir ermöglichen würde, die Merkmale von TSS-spezifischen und -unspezifischen Chromatin zu identifizieren. Später konnte ich das entwickelte Protokoll mit einer Methode zur Quantifizierung von Lysin-spezifischen Histonacetylierung kombinieren. Dadurch konnte ich herausfinden, dass Nukleosomen an trypanosomischen TSSen stark acetyliertes H2A.Z und H4 enthalten und dass für diese Modifizierungen die Histonacetyltransferasen HAT1 und HAT2 verantwortlich sind. Eine Reduzierung der HAT2-Levels führte zu einer Reduzierung von H4 Acetylierung, verschlechterte die gezielte H2A.Z Positionierung und führte dazu, dass die Transkriptioninitiierung sich verlagerte. Wohingegen eine Reduzierung von HAT1, die zwar nur einen kleinen Einfluss auf die H2A.Z Positionierung hatte, eine sehr starke Verringerung von acetyliertem H2A.Z und der Transkriptionsrate zur Folge hatte. Durch meine Ergebnisse konnte ich zeigen, dass in T. brucei, einem evolutionär divergenten eukaryotischem Organismus, die Prozesse der Histonacetylierung, H2A.Z Positionierung und Transkriptionsinitiierung sehr stark miteinander verbunden sind. Meine Arbeit ist des weiteren ein Beweis dafür, dass T. brucei ein sehr wichtiger Modellorganismus für die Forschung an Chromatin ist. Insgesamt erlauben meine Ergebnisse die Schlussfolgerung, dass H2A.Z, egal ob modifiziert oder nicht, ein Herausstellungsmerkmal für TSSen ist, während acetyliertes H2A.Z essentiell für die Transkriptionsinitiierung darstellt. Zusammengefasst, weisen die Daten meiner Doktorarbeit darauf hin, dass die Etablierung von bestimmten Chromatinstrukturen an TSSen eines der frühesten entwickelten Mechanismen zur Kontrolle der Transkriptionsinitiierung in Eukaryoten ist. KW - Chromatin KW - Histone KW - Histonacetyltransferase KW - Transcription KW - Acetylation KW - H2A.Z KW - Trypanosoma Brucei KW - Histone Acetylation KW - Transcription KW - Chromatin KW - Histone KW - Histone modification KW - Histone variant Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-250568 ER - TY - THES A1 - Kumari, Khushbu T1 - The role of lipid transfer proteins (LTPs) during the fertilization process in Arabidopsis thaliana T1 - Untersuchungen zur Rolle von Lipidtransferproteinen (LTPs) während des Befruchtungsprozesses in Arabidopsis thaliana N2 - Double fertilization is a defining characteristic of flowering plants (angiosperms). As the sperm cells of higher plants are non-motile, they need to be transported to the female gametophyte via the growing pollen tube. The pollen-tube journey through the female tissues represents a highly complex process. To provide for successful reproduction it demands intricate communication between the cells of the two haploid gametophytes - the polar growing pollen tube (carrying the two non-motile sperm cells) and the ovule (hosting the egg cell/synergid cells). The polar growth of the pollen tube towards the female gamete is guided by different signaling molecules, including sugars, amino acids and peptides. Some of these belong to the family of lipid transfer proteins (LTPs), which are secreted cysteine-rich peptides. Depending on the plant species several lines of evidence have also suggested potential roles for LTPs during pollen germination or pollen-tube guidance. Although Arabidopsis thaliana has 49 annotated genes for LTPs, several of which are involved in plant immunity and cell-to-cell communication, the role of most members of this family during fertilization is unknown. The aim of this project was therefore to systematically identify LTPs which play a role in the fertilization process in A. thaliana, particularly during pollen tube guidance. To identify candidate proteins, the expression profile of LTPs in reproductive tissue was investigated. This was accomplished by in-silico bioinformatic analysis using different expression databases. Following confirmion of these results by qRT-PCR analysis, seven Type-I nsLTPs (LTP1, LTP2, LTP3, LTP4, LTP5, LTP6 and LTP12) were found to be exclusively expressed in pistils. Except for LTP12, all other pistil expressed LTPs were transcriptionally induced upon pollination. Using reporter-based transcriptional and translational fusions the temporal and spatial expression patterns together with protein localizations for LTP2, 3, 4, 5, 6, and 12 were determined in planta. Stable transgenic plants carrying PromLTP::GUS constructs of the six different LTP candidates showed that most of LTPs were expressed in the stigma/stylar region and were induced upon pollination. With respect to protein localization on the cellular level, they split into two categories: LTP2, LTP5 and LTP6 were localized in the cell wall, while LTP3, LTP4 and LTP12 were specifically targeted to the plasma membrane. For the functional characterization of the candidate LTPs, several T-DNA insertion mutant plant lines were investigated for phenotypes affecting the fertilization process. Pollen development and quality as well as their in-vitro germination rate did not differ between the different single ltp mutant lines and wildtype plants. Moreover, in-vivo cross pollination experiments revealed that tube growth and fertilization rate of the mutant plants were similar to wildtype plants. Altogether, no discernible phenotype was evident in other floral and vegetative parts between different single ltp mutant lines and wildtype plants. As there was no distinguishable phenotype observed for single ltp-ko plants, double knock out plants of the two highly homologous genes LTP2 (expressed in the female stigma, style and transmitting tract) and LTP5 (expressed in the stigma, style, pollen pollen-tube and transmitting tract) were generated using the EPCCRISPR-Cas9 genome editing technique. Two ltp2ltp5 mutant transgenic-lines (#P31-P2 and #P31-P3) with frameshift mutations in both the genes could be established. Further experiments showed, that the CRISPR/Cas9-mediated knock-out of LTP2/LTP5 resulted in significantly reduced fertilization success. Cell biological analyses revealed that the ltp2ltp5 double mutant was impaired in pollen tube guidance towards the ovules and that this phenotype correlated with aberrant callose depositions in the micropylar region during ovule development. Detailed analysis of in-vivo pollen-tube growth and reciprocal cross pollination assay suggested that, the severely compromised fertility was not caused by any defect in development of the pollen grains, but was due to the abnormal callose deposition in the embryo sac primarily concentrated at the synergid cell near the micropylar end. Aberrant callose deposition in ltp2ltp5 ovules pose a complete blockage for the growing pollen tube to change its polarity to enter the funiculus indicating funicular and micropylar defects in pollen tube guidance causing fertilization failure. Our finding suggests that female gametophyte expressed LTP2 and LTP5 play a crucial role in mediating pollen tube guidance process and ultimately having an effect on the fertilization success. In line with the existence of a N-terminal signal peptide, secreted LTPs might represent a well-suited mobile signal carrier in the plant’s extracellular matrix. Previous reports suggested that, LTPs could act as chemoattractant peptide, imparting competence to the growing pollen tube, but the molecular mechanism is still obscure. The results obtained in this thesis further provide strong evidence, that LTP2/5 together regulate callose homeostasis and testable models are discussed. Future work is now required to elucidate the detailed molecular link between these LTPs and their potential interacting partners or receptors expressed in pollen and synergid cells, which should provide deeper insight into their functional role as regulatory molecules in the pollen tube guidance mechanism. N2 - Die ‚doppelte Befruchtung‘ ist ein charakteristisches Merkmal von Blütenpflanzen (Angiospermen). Da im Gegensatz zu vielen anderen Organismen die Spermien höherer Pflanzen nicht beweglich sind, müssen sie über den wachsenden Pollenschlauch zum weiblichen Gametophyten transportiert werden. Die je nach Pflanze durchaus lange Reise des Pollenschlauchs durch das weibliche Gewebe ist ein sehr komplexer Vorgang. Um eine erfolgreiche Reproduktion zu gewährleisten, ist eine fein abgestimmte Kommunikation zwischen den Zellen der beiden haploiden Gametophyten erforderlich - dem polar wachsenden Pollenschlauch (welcher die beiden nicht beweglichen Spermien trägt) und der Samenanlage (in der sich die Eizellen und Synergiden befinden). Das polare Wachstum des Pollenschlauchs in Richtung des weiblichen Gameten wird von verschiedenen Signalmolekülen gesteuert, darunter Zucker, Aminosäuren und Cystein-reiche Peptide (CRPs). Einige dieser Signalmoleküle gehören zur Familie der Lipidtransferproteine (LTPs), welche ebenfalls zur Klasse der CRPs gehören. Abhängig von der Pflanzenart deuten mehrere Hinweise auf eine mögliche Rolle von LTPs während der Pollenkeimung oder der Pollenschlauch-Navigation hin. Obwohl das Genom von Arabidopsis thaliana für mehr als 49 annotierte LTP-Gene kodiert, von denen einige an der ‚angeborenen Immunitätsreaktion‘ von Pflanzen sowie der Kommunikation von Zelle zu Zelle beteiligt sind, ist die physiologische Rolle der meisten Mitglieder dieser Familie während des Befruchtungsvorgangs bisher unbekannt. Ziel dieses Projekts war es daher, systematisch solche LTPs zu identifizieren, die eine Rolle bei der Befruchtung von A. thaliana spielen, insbesondere bei der Navigation des Pollenschlauchs zur Eizelle. Um diese LTP Proteine zu identifizieren, wurde zunächst das Expressionsprofil von LTPs in reproduktiven Gewebe untersucht. Dies wurde durch bioinformatische ‚in-silico‘ Analyse unter Verwendung verschiedener Expressionsdatenbanken erreicht. Nach Bestätigung dieser Ergebnisse durch qRT-PCR- Analyse wurde festgestellt, dass sieben Typ-I-LTPs (LTP1, LTP2, LTP3, LTP4, LTP5, LTP6 und LTP12) präferentiell im Stempel exprimiert werden. Mit Ausnahme von LTP12 wurden darüber hinaus alle anderen Stempel-exprimierten LTPs nach Bestäubung auf transkriptioneller Ebene induziert. Unter Verwendung von Reporter-basierten Transkriptions- und Translationsfusionen wurden die zeitlichen und räumlichen Expressionsmuster zusammen mit Proteinlokalisationen für LTP2, 3, 4, 5, 6 und 12 ‚in planta‘ bestimmt. Stabile transgene Pflanzen, die PromLTP::GUS-Konstrukte der sechs verschiedenen LTP- Kandidaten exprimierten, zeigten, dass die meisten LTPs in der Stigma/Stylar-Region abundant waren und tatsächlich bei der Bestäubung induziert wurden. Die anschließende Proteinlokalisierung auf zellulärer Ebene klassifizierte diese LTPs in zwei Kategorien: LTP2, LTP5 und LTP6 wurden in der Zellwand lokalisiert, während LTP3, LTP4 und LTP12 spezifisch an der Plasmamembran lokalisierten. Zur funktionellen Charakterisierung der Kandidaten-LTPs wurden mehrere T-DNA- Insertionsmutanten auf Phänotypen hinsichtlich des Befruchtungsprozesses untersucht. Die Pollenentwicklung sowie die ‚in-vitro‘ Keimrate des Pollens unterschieden sich dabei nicht zwischen den verschiedenen LTP-Mutantenlinien und Wildtyp-Pflanzen. Darüber hinaus ergaben ‚in-vivo‘ Kreuzbestäubungsexperimente, dass das Pollenschlauchwachstum und die Befruchtungsrate der mutierten Pflanzen im Vergleich zu Wildtyp-Pflanzen ähnlich waren. Insgesamt war kein erkennbarer Phänotyp in der Blütenentwickung oder der vegetativen Entwicklung zwischen verschiedenen LTP-Einzel-Mutanten und Wildtyp-Pflanzen erkennbar. Aufgrund möglicher funktioneller Redundanz, und der Tatsache, dass für einzelne LTP ‚knock- out‘ Pflanzen kein unterscheidbarer Phänotyp beobachtet wurde, wurden Verlustmutanten der beiden hoch homologen und ko-exprimierten Gene LTP2 und LTP5 unter Verwendung der EPC-CRISPR-Cas9-Genomeditiertechnik erzeugt. Zwei ltp2ltp5-mutierte transgene Linien (# P31-P2 und # P31-P3) mit In-Frame-Mutationen in beiden Genen konnten dabei etabliert werden. Weitere Experimente zeigten, dass das CRISPR/Cas9-vermittelte Ausschalten von LTP2 und LTP5 zu einem signifikant verringerten Befruchtungserfolg in diesen Linien führte. Zellbiologische Analysen ergaben, dass die ltp2ltp5 Doppelmutante in der Pollenschlauch- Navigation zu den Ovulen hin beeinträchtigt war und dass dieser Phänotyp mit Kalloseablagerungen in der Region der Mikropyle während der Ovulen-Entwicklung in diesen Linien korrelierte. Eine detaillierte Analyse des ‚in-vivo‘ Wachstums der Pollenschläuche sowie eines wechselseitigen Bestäubungstests ergab, dass die stark beeinträchtigte Befruchtung nicht durch einen Entwicklungsdefekt im männlichen Gametophyten, dem Pollen, verursacht wurde. Stattdessen konnte die beeinträchtigte Befruchtung auf die abnormale Kalloseabscheidung im weiblichen Gametophyten, dem Embryosack, zurückgeführt werden. Interessanterweise, konzentrierte sich die Kalloseabscheidung in der ltp2ltp5 Doppelmutante hauptsächlich im Bereich der Synergiden, am mikropylaren Ende des Embryosacks. Für den wachsenden Pollenschlauch stellen diese im Vergleich zum Wildtyp untypischen Kalloseablagerungen in ltp2ltp5-Mutanten in der Nähe der Eizellen möglicherweise eine Blockade für die Perzeption von Ovulen-Signalen dar. Dies behindert die erforderliche Richtungsänderung des polar gerichteten Wachstums und somit die Fähigkeit des Pollenschlauchs, entlang des Funikulus zu wachsen und in die Mikropyle eindringen zu können. Diese Beobachtung zeigt, dass funikuläre und mikropylare Defekte in der Pollenschlauch-Navigation den Befruchtungserfolg vermindern. Die Ergebnisse dieser Dissertation legen nahe, dass der weibliche Gametophyt, in welchem LTP2 und LTP5 exprimiert werden, eine entscheidende Rolle bei der Regulation der Pollenschlauch-Navigation spielt und letztendlich auch einen messbaren Einfluss auf den Befruchtungserfolg hat. Aufgrund der Existenz eines N-terminalen Signalpeptids und der damit verbundenen Sekretion in den Apoplasten könnten LTPs als Signalmoleküle in der extrazellulären Matrix der Pflanze fungieren. Frühere Arbeiten deuteten bereits an, dass LTPs als chemoattraktive Peptide wirken könnten und dem wachsenden Pollenschlauch die Kompetenz verleihen könnten, die Signale der Eizellen wahrzunehmen. Der zugrundeliegende molekulare Mechanismus ist jedoch noch immer unbekannt. Die in dieser Dissertation erzielten Ergebnisse liefern jedoch starke Hinweise darauf, dass LTP2/5 zusammen die Homöostase der Kallosebildung regulieren. Mögliche Modelle zur Aktivität von LTPs im Kontext der Regulation der Kallose-Homöostase werden vorgestellt und diskutiert. Zukünftige Arbeiten sind nun erforderlich, um die detaillierte molekulare Verbindung zwischen diesen LTPs und ihren potenziellen Interaktionspartnern oder Rezeptoren, die in Pollen- und Synergidzellen exprimiert werden, aufzuklären. Diese sollten einen tieferen Einblick in die funktionelle Rolle von LTP2 und LTP5 als regulatorische Moleküle für die Pollenschlauch- Navigation geben. KW - Fertilization in angiosperm KW - Lipid Transfer Protein Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-199613 ER - TY - THES A1 - Seufert, Pascal T1 - Chemical and physical structure of the barrier against water transpiration of leaves: Contribution of different wax compounds T1 - Chemischer und physikalischer Aufbau der Wassertranspirationsbarriere von Blättern: Beitrag verschiedener Wachskomponenten N2 - The cuticle is constituted of the biopolymer cutin and intra- and epicuticular waxes. In some cases, it has epicuticular wax crystals, protruding from the epicuticular wax film. One of the most important tasks is protection against desiccation. Many investigations were conducted to find the transport limiting component of the cuticle. It is evidentially confirmed that the waxes form this barrier. These waxes are multifactorial blends made of very-long-chain aliphatic (VLCA) compounds and triterpenoids (TRP). The VLCAs were proposed to constitute the transpiration barrier to water. However, experimental confirmation was lacking so far. The present study focuses on the development of a method to selectively extract TRPs from the cuticle and the impact of the removal on the transpiration barrier. The plants deployed in this study exhibited several features. They had no epicuticular crystals on their surfaces, were astomatous, had a rather durable and possibly isolatable cuticle. A broad range of wax compositions was covered from plants with no TRP content and low wax load like Hedera helix and Zamioculcas zamiifolia to plants with high TRP content and high wax load like Nerium oleander. The selective extraction was conducted using a sequence of solvents. TRPs were extracted almost exhaustively from CMs with the first MeOH extract. Only a minor amount of shorter chained VLCAs was obtained. The remaining waxes, consisting mostly of VLCAs and some remnant TRPs, were removed with the following TCM extract. After the extractions, the water permeance of native cuticular membranes (CM), MeOH extracted (M) and dewaxed cuticular discs (MX) was investigated gravimetrically. Compared to the water permeance of CMs, Ms showed no or only a small increase in water conductance. MXs, however, always showed strongly increased values. The knowledge about the wax compounds constituting the transport-limiting properties is vital for different projects. For various issues, it would be favourable to have a standardized wax mixture as an initial point of research. It could be used to develop screening procedures to investigate the impact of adjuvants on cuticular waxes or the influence of wax constituents on the properties of cuticular waxes. This work concentrated on the development of an artificial wax mixture, which mimics the physical properties of a plant leaf wax sufficiently. As target wax, the leaf wax of Schefflera elegantissima was chosen. The wax of this plant species consisted almost exclusively of VLCAs, had a rather simple composition regarding compound classes and chain length distribution and CMs could be isolated. Artificial binary, ternary and quaternary waxes corresponding to the conditions within the plant wax were investigated using differential scanning calorimetry (DSC), X-ray diffraction (XRD) techniques and Fourier-transform infrared (FTIR) spectroscopy. Phase diagrams were mapped out for a series of binary, ternary and quaternary wax mixtures. FTIR experiments were conducted using, ternary and a quaternary artificial wax blends. The blends were chosen to represent the conditions within the wax of the adaxial CM plant wax. The FTIR experiments exhibited an increasing resemblance of the artificial wax to the plant wax (adaxial CM wax) with an increasing number of compounds in the artificial wax. The same trend was found for DSC thermograms. Thermograms of ternary and quaternary blends exhibited more overlapping peaks and occurred in a temperature range more similar to the range of the whole leaf plant wax. The XRD spectrum at room temperature showed good conformity with the quaternary blend. The current work illustrates a method for selective extraction of TRPs from isolated CMs. It gives direct experimental proof of the association of the water permeance barrier with the VLCA rather than to the TRPs. Furthermore, the possibility to mimic cuticular waxes using commercially available wax compounds is investigated. The results show promising feasibility for its viability, enabling it to perform as a standardized initial point for further research (e.g. to examine the influence of different constituents on waxes), revealing valuable knowledge about the structure and the chemistry-function relationship of cuticular waxes. N2 - Die Kutikula ist eine der vielen Anpassungen, die Pflanzen entwickelten um nach der Besiedelung des Landes mit den Herausforderungen ihrer neuen Umgebung fertig zu werden. Sie überzieht überirdische Pflanzenorgane, wie Blüten oder Blätter und erfüllt verschiedene Aufgaben. Hierzu besteht sie aus dem biopolymer Kutin und intra- sowie epikutikulären Wachs. Studien, die sich mit der Lokalisierung der transporteinschänkenden Barriere beschäftigten, zeigten, dass die Wachse sie bilden. Diese sind vielschichtige Mischungen aus langkettigen aliphatischen Verbindungen (VLCA) und pentazyklischen Verbindung wie Triterpenen (TRP). Es wird davon ausgegangen, dass VLCAs die Barriere aufbauen, ein direkter experimenteller Nachweis dafür wurde jedoch noch nicht erbracht. In dieser Arbeit wurde daher ein Verfahren zur selektiven Extraktion von TRPs aus isolierten kutikulären Membranen (CM) entwickelt und deren Auswirkung auf die Transpirationsbarriere untersucht. Die untersuchten Pflanzen wiesen keine epikutikuläre Kristalle auf, hatten keine Stomata auf der Kutikula der Blattoberseite und es war möglich ihre Kutikula zu isolieren. Die Zusammensetzung der Wachse variierte von wenig Wachs ohne TRPs (z. B. Hedera helix, Zamioculcas zamiifolia) hin zu pflanzen mit großer Wachsmenge und hohem TRP- Anteil (Nerium oleander). Die selektive Extraktion wurde durch die sequenzielle Nutzung zweier Lösemittel erreicht. TRPs wurden fast vollständig mit Methanol (MeOH) entfernt, während VLCAs überwiegend nur mit Chloroform (TCM) extrahiert werden konnten. Die gravimetrische Bestimmung der Wassertranspiration von unbehandelten, mit Methanol extrahierten (M) und entwachsten Membranen (MX) in Transpirationskammern zeigte bei allen untersuchten Pflanzenarten einen einheitlichen Trend auf. Im Vergleich zu CMs erhöhte sich die Transpirationsrate bei Ms nicht oder nur geringfügig, während bei MXs ein starker Anstieg festgestellt werden konnte. Diese Ergebnisse stellen den ersten direkten experimentellen Nachweis der Verbindung von VLCAs zur Transpirationsbarriere kutikulärer Wachse dar. Mit dem Wissen, sich bei der Untersuchung der Permeation durch die Kutikula sich nur auf die VLCA Fraktion beschränken zu müssen können weitere Projekte effizient angegangen werden. Ein leicht erhältliches Standartwachsgemisch könnte Ausgangspunkt für die Untersuchung des Einflusses verschiedener Pflanzenwachskomponenten auf deren physikalische Eigenschaften dienen. Als Zielwachs diente das Blattwachs von Schefflera elegantissima. Es bestand fast ausschließlich aus VLCAs, hatte eine recht einfache Zusammensetzung bezüglich der Stoffklassen und Kettenlängenverteilung und die Kutikula war isolierbar. Mit Hilfe von dynamische Differentialkalorimetrie (DSC), Röntgenbeugung (XRD) und Fouriertransformierter Infrarot (FTIR) Spektroskopie wurden binäre, ternäre und quaternäre Gemische, die Verhältnisse im Pflanzenwachs wiederspiegelten, untersucht und Phasendiagramme erstellt. Phasendiagramme wurden von einer Reihe der binären Gemische, bestehend aus Alkanen oder Alkoholen, ternären Gemischen aus zwei Alkanen und einem Alkohol und quaternären Gemischen aus zwei Alkanen und zwei Alkoholen erstellt. FTIR-spektroskopische Versuche zeigten mit zunehmender Komponentenzahl eine erhöhte Ähnlichkeit der artifiziellen Wachse zum Pflanzenwachs (adaxiale isolierte Kutikula). Ein ähnlicher Trend wurde für die Ähnlichkeit der Thermogramme der artifiziellen Gemische zum Pflanzenwachs (aus dem Extrakt ganzer Blätter) ersichtlich. Das Diffraktogramm des quaternären Waches stimmte auf Raumtemperatur gut mit dem des Pflanzenwachses (adaxiale isolierte Kutikula) ein. Diese Arbeit beschreibt eine Methode zur selektiven Extraktion von TRPs aus isolierten kutikulären Membranen. Sie zeigt einen direkten experimentellen Nachweis für die Assoziation der Transpirationsbarriere zu den VLCAs und nicht zu den TRPs. Zusätzlich wird die Möglichkeit kutikulare Wachse mit Hilfe von kommerziell erhältlichen Wachskomponenten nachzustellen untersucht, was vielversprechende Ergebnisse liefert. Dieses Wachs könnte daher als standardisierter Ausgangspunkt für weitere Experimente (z. B. zur Untersuchung des Einflusses verschiedener Wachskomponenten auf dessen physikalische Eigenschaften) dienen. Dies könnte wertvolle Informationen über die Struktur und die Beziehung zwischen chemischer Zusammensetzung und der Funktion kutikulärer Wachse liefern. KW - Kutikula KW - Transpiration KW - Kutikularwachs KW - FT-IR-Spektroskopie KW - Differential scanning calorimetry KW - Very-long-chain aliphatic KW - X-ray diffraction KW - Selective extraction Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-208963 ER - TY - THES A1 - Gromer, Daniel T1 - Mechanisms Underlying Virtual Reality Exposure Therapy for Specific Phobias T1 - Wirkmechanismen der Expositionstherapie in virtueller Realität bei spezifischen Phobien N2 - Virtual reality exposure therapy (VRET) is an effective cognitive-behavioral treatment for anxiety disorders that comprises systematic confrontations to virtual representations of feared stimuli and situations. However, not all patients respond to VRET, and some patients relapse after successful treatment. One explanation for this limitation of VRET is that its underlying mechanisms are not yet fully understood, leaving room for further improvement. On these grounds, the present thesis aimed to investigate two major research questions: first, it explored how virtual stimuli induce fear responses in height-fearful participants, and second, it tested if VRET outcome could be improved by incorporating techniques derived from two different theories of exposure therapy. To this end, five studies in virtual reality (VR) were conducted. Study 1 (N = 99) established a virtual environment for height exposure using a Computer Automatic Virtual Environment (CAVE) and investigated the effects of tactile wind simulation in VR. Height-fearful and non-fearful participants climbed a virtual outlook, and half of the participants received wind simulation. Results revealed that height-fearful participants showed stronger fear responses, on both a subjective and behavioral level, and that wind simulation increased subjective fear. However, adding tactile wind simulation in VR did not affect presence, the user's sense of 'being there' in the virtual environment. Replicating previous studies, fear and presence in VR were correlated, and the correlation was higher in height-fearful compared to non-fearful participants. Study 2 (N = 43) sought to corroborate the findings of the first study, using a different VR system for exposure (a head-mounted display) and measuring physiological fear responses. In addition, the effects of a visual cognitive distractor on fear in VR were investigated. Participants' fear responses were evident on both a subjective and physiological level---although much more pronounced on skin conductance than on heart rate---but the virtual distractor did not affect the strength of fear responses. In Study 3 (N = 50), the effects of trait height-fearfulness and height level on fear responses were investigated in more detail. Self-rated level of acrophobia and five different height levels in VR (1 m--20 m) were used as linear predictors of subjective and physiological indices of fear. Results showed that subjective fear and skin conductance responses were a function of both trait height-fearfulness and height level, whereas no clear effects were visible for heart rate. Study 4 (N = 64 + N = 49) aimed to advance the understanding of the relationship between presence and fear in VR. Previous research indicates a positive correlation between both measures, but possible causal mechanisms have not yet been identified. The study was the first to experimentally manipulate both presence (via the visual and auditive realism of the virtual environment) and fear (by presenting both height and control situations). Results indicated a causal effect of fear on presence, i.e., experiencing fear in a virtual environment led to a stronger sense of `being there' in the virtual environment. However, conversely, presence increased by higher scene realism did not affect fear responses. Nonetheless, presence seemed to have some effects on fear responding via another pathway, as participants whose presence levels were highest in the first safe context were also those who had the strongest fear responses in a later height situation. This finding indicated the importance of immersive user characteristics in the emergence of presence and fear in VR. The findings of the first four studies were integrated into a model of fear in VR, extending previous models and highlighting factors that lead to the emergence of both fear and presence in VR. Results of the studies showed that fear responses towards virtual heights were affected by trait height-fearfulness, phobic elements in the virtual environment, and, at least to some degree, on presence. Presence, on the other hand, was affected by experiencing fear in VR, immersion---the characteristics of the VR system---and immersive user characteristics. Of note, the manipulations of immersion used in the present thesis, visual and auditory realism of the virtual environment and tactile wind simulation, were not particularly effective in manipulating presence. Finally, Study 5 (N = 34) compared two different implementations of VRET for acrophobia to investigate mechanisms underlying its efficacy. The first implementation followed the Emotional Processing Theory, assuming that fear reduction during exposure is crucial for positive treatment outcome. In this condition, patients were asked to focus on their fear responses and on the decline of fear (habituation) during exposures. The second implementation was based on the inhibitory learning model, assuming that expectancy violation is the primary mechanism underlying exposure therapy efficacy. In this condition, patients were asked to focus on the non-occurrence of feared outcomes (e.g., 'I could fall off') during exposure. Based on predictions of the inhibitory learning model, the hypothesis for the study was that expectancy-violation-based exposure would outperform habituation-based exposure. After two treatment sessions in VR, both treatment conditions effectively reduced the patients' fear of heights, but the two conditions did not differ in their efficacy. The study replicated previous studies by showing that VRET is an effective treatment for acrophobia; however, contrary to the assumption, explicitly targeting the violation of threat expectancies did not improve outcome. This finding adds to other studies failing to provide clear evidence for expectancy violation as the primary mechanism underlying exposure therapy. Possible explanations for this finding and clinical implications are discussed, along with suggestions for further research. N2 - Die Expositionstherapie in virtueller Realität (VRET) ist ein wirksames kognitiv-verhaltenstherapeutisches Verfahren zur Behandlung von Angststörungen. Bei einer VRET werden Patienten nach psychoedukativer Vorbereitung mit virtuellen Repräsentationen der von ihnen gefürchteten Objekte oder Situationen konfrontiert. Die VRET zeigt allerdings nicht bei allen Patienten die gewünschte Wirksamkeit, und einige Patienten erleben selbst nach erfolgreicher Therapie eine Rückkehr der Angst. Da die zugrunde liegenden Wirkfaktoren der VRET noch nicht ausreichend aufgeklärt sind, lässt sich ihre Effektivtät möglicherweise noch weiter verbessern. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher zwei Fragen zu untersuchen. Zum einen, wie genau virtuelle Reize Furchtreaktionen bei höhenängstlichen Personen auslösen, und zum anderen, ob sich VRET durch den Einsatz spezifischer Techniken, welche aus Theorien zur Expositionstherapie abgeleitet wurden, verbessern lässt. Um die Fragen zu beantworten, wurden im Rahmen der Dissertation fünf Studien durchgeführt. In Studie 1 (N = 99) wurde eine virtuelle Umgebung für Höhenexposition etabliert und Effekte von taktiler Windsimulation in virtueller Realität (VR) untersucht. In der Studie hatten höhenängstliche und nicht-ängstliche Probanden die Aufgabe einen virtuellen Turm zu besteigen, wobei die Hälfte der Probanden währenddessen eine Windsimulation dargeboten bekam. Die Ergebnisse zeigten, dass höhenängstliche Probanden stärkere Furchtreaktionen zeigten, was sich sowohl im Bericht als auch im Verhalten äußerte. Zusätzlich erhöhte die Windsimulation die subjektiv Furcht der Probanden. Die Windsimulation hatte allerdings keinen Einfluss auf das Präsenzerleben, d. h. wie sehr sich Probanden so gefühlt hatten als seien sie tatsächlich in der virtuellen Umgebung gewesen. In der Studie konnten darüber hinaus zwei Befunde vorheriger Studien zum Präsenzerleben repliziert werden. Furcht und Präsenz korrelierten positiv, und dieser Zusammenhang war bei höhenängstlichen Probanden stärker als bei nicht-ängstlichen Probanden. Die Studie konnte zeigen, dass sich VR eignet um Furcht auf verschiedenen Reaktionsebenen zu untersuchen und es darüber hinaus möglich ist, Furcht in VR experimentell zu manipulieren. In Studie 2 (N = 43) sollten die Ergebnisse der ersten Studie bestätigt werden. Hierfür wurden ein anderes VR-System für die Exposition eingesetzt sowie die Erfassung von Furchtreaktionen um physiologische Maße ergänzt. Zusätzlich wurde der Einfluss einer visuell-kognitiven Distraktionsaufgabe in VR auf Furchtreaktionen untersucht. Die Furchtreaktionen der Probanden zeigten sich sowohl auf subjektiver als auch physiologischer Ebene, wobei Reaktionen der Hautleitfähigkeit stärker ausgeprägt waren als Veränderungen der Herzrate. Ein Einfluss der ablenkenden visuell-kognitiven Aufgabe auf Furchtreaktionen konnte nicht gezeigt werden. Die Studie konnte insgesamt verdeutlichen, dass die Eigenschaft von VR, Furcht zu erzeugen, nicht an einen bestimmten Versuchsaufbau gebunden ist und sich Furcht in VR auf allen Reaktionsebenen zeigt. Studie 3 (N = 50) hatte das Ziel, den Einfluss von Höhenängstlichkeit und Höhe auf Furchreaktionen genauer zu untersuchen. Hierfür wurde per Fragebogen erfasste Höhenängstlichkeit sowie fünf verschiedene Höhen (1 m--20 m) als lineare Prädiktoren für subjektive und physiologische Furchtindizes verwendet. Die Ergebnisse zeigten, dass subjektive Furcht und Hautleitfähigkeitsreaktionen in Abhängigkeit von sowohl Höhenängstlichkeit als auch Höhe zunahmen. Für die Herzrate zeigten sich hingegen keine eindeutigen Effekte. Die Studie konnte zusammenfassend zeigen, dass sich die Furchtreaktionen in VR spezifisch auf Höhe zeigten. In Studie 4 (N = 64 + N = 49) sollte der Zusammenhang zwischen Furcht und Präsenzerleben in VR genauer untersucht werden. Vorangegangene Studien zeigten eine positive Korrelation zwischen beiden Maßen, konnten jedoch keine Aussagen über einen möglichen Kausalzusammenhang machen. Die vorliegende Studie war daher die erste, welche sowohl Präsenz als auch Furcht experimentell manipulierte. Präsenz wurde über die Darbietung unterschiedlich realistischer virtueller Umgebungen, Furcht über die Darbietung von Höhen und Kontrollumgebungen manipuliert. Die Ergebnisse der Studie zeigten, dass es einen kausalen Effekt von Furcht auf Präsenzerleben gab, d. h. das Erleben von Furcht in einer Höhensituation in VR führte zu erhöhtem Präsenzerleben. Umgekehrt gab es jedoch keinen Effekt von experimentell manipuliertem Präsenzerleben auf die Stärke der Furchtreaktion. Es zeigte sich allerdings, dass Personen, welche in der ersten sicheren Situation das stärkste Präsenzerleben berichteten, später auch die stärksten Furchtreaktionen zeigten, was darauf schließen lässt, dass es möglicherwiese dennoch Effekte von Präsenzerleben auf Furcht gibt. Dieses Ergebnis weist auf die Bedeutung von möglichen Persönlichkeitsunterschieden hin, welche für das Erleben von Präsenz und Furcht in VR von Bedeutung sind. Die Studie verdeutlichte damit zum einen die Komplexität des Zusammenhangs zwischen Furcht und Präsenzerleben und erlaubte zum anderen erstmals Kausalschlüsse zwischen beiden Maßen. Die Ergebnisse der ersten vier Studien wurden in einem Modell zur Furcht in VR zusammengefasst. Basierend auf bestehenden Modellen zeigt das neue Modell Faktoren auf, welche für die Entstehung von Furcht und Präsenz bedeutsam sind. So konnten die Studien zeigen, dass Furchtreaktionen in Abhängigkeit von habitueller Höhenangst, der furchtbezogenen Relevanz der virtuellen Umgebung (z. B. Höhe), sowie zum Teil vom Präsenzerleben, auftreten. Bezüglich des Präsenzerlebens betont das Modell die Relevanz von aktuellem Furchterleben, Immersion (den Charakteristika des VR-Systems) und immersiven Nutzercharakteristika (z. B. Absorption). Zu erwähnen ist, dass die in der vorliegenden Dissertation untersuchten Manipulationen von Immersion (visueller und auditiver Realismus der virtuellen Umgebung und taktile Windsimulation) jedoch keine sonderlich starken Effekte auf Präsenz hatten. In Studie 5 (N = 34) wurden abschließend im Rahmen einer Therapiestudie zwei verschiedene VRET-Ansätze miteinander verglichen. Die erste Gruppe von Patienten erhielt hierbei eine Therapie auf Basis der Emotional Processing Theory. In dieser Bedingung wurden die Patienten während der Exposition gebeten, sich auf ihr Furchterleben und dessen Rückgang über die Zeit (Habituation) zu konzentrieren. Die zweite Gruppe von Patienten erhielt eine Therapie auf Basis des Inhibitory Learning Models. In dieser Bedingung wurden die Patienten gebeten, gezielt ihre Befürchtungen (z. B. "Ich könnte herunterfallen") zu überprüfen und zu widerlegen. Es wurde auf Basis der Vorhersage des Inhibitory Learning Models, dass Erwartungswiderlegung der zentrale Wirkfaktor der Expositionstherapie ist, angenommen, dass eine Therapie auf Basis der Widerlegung von Befürchtungen effektiver ist als eine Therapie auf Basis von Habituation. Nach zwei Therapiesitzungen berichteten die Patienten in beiden Gruppen einen signifikaten Rückgang ihrer Höhenangst, es zeigten sich jedoch keine Wirksamkeitsunterschiede zwischen den Gruppen. Die Studie konnte damit zwar vorherige Befunde replizieren, die zeigten, dass VRET eine effektive Behandlung für Höhenangst ist, die spezifische Fokussierung auf Erwartungswiderlegung zeigte jedoch keinen Vorteil. Dieser Befund reiht sich damit in eine Reihe von Studien ein, die Erwartungswiderlegung als zentralen Wirkfaktor der Expositionstherapie nicht nachweisen konnten. Mögliche Gründe für diesen Befund sowie daraus folgende klinische Implikationen und Vorschläge für weitere Forschung werden diskutiert. KW - Virtuelle Realität KW - Höhenangst KW - Expositionstherapie Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-207334 ER - TY - THES A1 - Beer, Katharina T1 - A Comparison of the circadian clock of highly social bees (\(Apis\) \(mellifera\)) and solitary bees (\(Osmia\) \(spec.\)): Circadian clock development, behavioral rhythms and neuroanatomical characterization of two central clock components (PER and PDF) T1 - Ein Vergleich der Inneren Uhr von sozialen Bienen (\(Apis\) \(mellifera\)) und solitären Bienen (\(Osmia\) \(spec.\)): Entwicklung der circadianen Uhr, Verhaltensrhythmen und neuroanatomische Beschreibung von zwei zentralen Uhr Komponenten (PER und PDF) N2 - Summary Bees, like many other organisms, evolved an endogenous circadian clock, which enables them to foresee daily environmental changes and exactly time foraging flights to periods of floral resource availability. The social lifestyle of a honey bee colony has been shown to influence circadian behavior in nurse bees, which do not exhibit rhythmic behavior when they are nursing. On the other hand, forager bees display strong circadian rhythms. Solitary bees, like the mason bee, do not nurse their offspring and do not live in hive communities, but face the same daily environmental changes as honey bees. Besides their lifestyle mason and honey bees differ in their development and life history, because mason bees overwinter after eclosion as adults in their cocoons until they emerge in spring. Honey bees do not undergo diapause and have a relatively short development of a few weeks until they emerge. In my thesis, I present a comparison of the circadian clock of social honey bees (Apis mellifera) and solitary mason bees (Osmia bicornis and Osmia cornuta) on the neuroanatomical level and behavioral output level. I firstly characterized in detail the localization of the circadian clock in the bee brain via the expression pattern of two clock components, namely the clock protein PERIOD (PER) and the neuropeptide Pigment Dispersing Factor (PDF), in the brain of honey bee and mason bee. PER is localized in lateral neuron clusters (which we called lateral neurons 1 and 2: LN1 and LN2) and dorsal neuron clusters (we called dorsal lateral neurons and dorsal neurons: DLN, DN), many glia cells and photoreceptor cells. This expression pattern is similar to the one in other insect species and indicates a common ground plan of clock cells among insects. In the LN2 neuron cluster with cell bodies located in the lateral brain, PER is co-expressed with PDF. These cells build a complex arborization network throughout the brain and provide the perfect structure to convey time information to brain centers, where complex behavior, e.g. sun-compass orientation and time memory, is controlled. The PDF arborizations centralize in a dense network (we named it anterio-lobular PDF hub: ALO) which is located in front of the lobula. In other insects, this fiber center is associated with the medulla (accessory medulla: AME). Few PDF cells build the ALO already in very early larval development and the cell number and complexity of the network grows throughout honey bee development. Thereby, dorsal regions are innervated first by PDF fibers and, in late larval development, the fibers grow laterally to the optic lobe and central brain. The overall expression pattern of PER and PDF are similar in adult social and solitary bees, but I found a few differences in the PDF network density in the posterior protocerebrum and the lamina, which may be associated with evolution of sociality in bees. Secondly, I monitored activity rhythms, for which I developed and established a device to monitor locomotor activity rhythms of individual honey bees with contact to a mini colony in the laboratory. This revealed new aspects of social synchronization and survival of young bees with indirect social contact to the mini colony (no trophalaxis was possible). For mason bees, I established a method to monitor emergence and locomotor activity rhythms and I could show that circadian emergence rhythms are entrainable by daily temperature cycles. Furthermore, I present the first locomotor activity rhythms of solitary bees, which show strong circadian rhythms in their behavior right after emergence. Honey bees needed several days to develop circadian locomotor rhythms in my experiments. I hypothesized that honey bees do not emerge with a fully matured circadian system in the hive, while solitary bees, without the protection of a colony, would need a fully matured circadian clock right away after emergence. Several indices in published work and preliminary studies support my hypothesis and future studies on PDF expression in different developmental stages in solitary bees may provide hard evidence. N2 - Zusammenfassung Bienen, sowie viele andere Organismen, evolvierten eine innere circadiane Uhr, die es ihnen ermöglicht, tägliche Umweltveränderungen voraus zu sehen und ihre Foragierflüge zu Tageszeiten durchzuführen, wenn sie möglichst viele Blüten besuchen können. Es zeigte sich, dass der soziale Lebensstil der Honigbiene Einfluss auf das rhythmische Verhalten der Ammenbienen hat, die während der Brutpflege keinen täglichen Rhythmus im Verhalten aufweisen. Sammlerbienen auf der anderen Seite zeigen ein stark rhythmisches Verhalten. Solitäre Bienen, wie die Mauerbiene, betreiben keine Brutpflege und leben nicht in einer Staatengemeinschaft, aber sind den gleichen Umweltveränderungen ausgesetzt. Nicht nur Lebensstil, sondern auch Entwicklung und Lebenszyklus unterscheiden sich zwischen Honig- und Mauerbienen. Mauerbienen überwintern als adulte Insekten in einem Kokon bis sie im Frühjahr schlüpfen. Honigbienen durchleben keine Diapause und schlüpfen nach wenigen Wochen der Entwicklung im Bienenstock. In meiner Dissertation vergleiche ich die circadiane Uhr von sozialen Honigbienen (Apis mellifera) und solitären Mauerbienen (Osmia bicornis und Osmia cornuta) auf Ebene der Neuroanatomie und das durch die innere Uhr verursachte rhythmische Verhalten. Erstens charakterisierte ich detailliert die Lage der circadianen Uhr im Gehirn von Honig- und Mauerbiene anhand des Expressionsmusters von zwei Uhrkomponenten. Diese sind das Uhrprotein PERIOD (PER) und das Neuropeptid Pigment Dispersing Factor (PDF). PER wird exprimiert in lateralen Neuronen-Gruppen (die wir laterale Neurone 1 und 2 nannten: LN1 und LN2) und dorsalen Neuronen-Gruppen (benannt dorsal laterale Neurone und dorsale Neurone: DLN und DN), sowie in vielen Gliazellen und Fotorezeptorzellen. Dieses Expressionsmuster liegt ähnlich in anderen Insektengruppen vor und deutet auf einen Grundbauplan der Inneren Uhr im Gehirn von Insekten hin. In der LN2 Neuronen-Gruppe, deren Zellkörper im lateralen Gehirn liegen, sind PER und PDF in den gleichen Zellen co-lokalisiert. Diese Zellen bilden ein komplexes Netzwerk aus Verzweigungen durch das gesamte Gehirn und liefern damit die perfekte Infrastruktur, um Zeitinformation an Gehirnregionen weiterzuleiten, die komplexe Verhaltensweisen, wie Sonnenkompass-Orientierung und Zeitgedächtnis, steuern. Alle PDF Neuriten laufen in einer anterior zur Lobula liegenden Region zusammen (sie wurde ALO, anterio-lobular PDF Knotenpunkt, genannt). Dieser Knotenpunkt ist in anderen Insekten mit der Medulla assoziiert und wird akzessorische Medulla (AME) genannt. Wenige PDF Zellen bilden bereits im frühen Larvalstadium diesen ALO und die Zellzahl sowie die Komplexität des Netzwerks wächst die gesamte Entwicklung der Honigbiene hindurch. Dabei werden zuerst die dorsalen Gehirnregionen von PDF Neuronen innerviert und in der späteren Larvalentwicklung wachsen die Neurite lateral in Richtung der optischen Loben und des Zentralgehirns. Das generelle Expressionsmuster von PER und PDF in adulten sozialen und solitären Bienen ähnelt sich stark, aber ich identifizierte kleine Unterschiede in der PDF Netzwerkdichte im posterioren Protocerebrum und in der Lamina. Diese könnten mit der Evolution von sozialen Bienen assoziiert sein. Zweitens entwickelte und etablierte ich eine Methode, Lokomotionsrhythmen von individuellen Bienen im Labor aufzunehmen, die in Kontakt mit einem Miniaturvolk standen. Diese Methode enthüllte neue Aspekte der sozialen Synchronisation unter Honigbienen und des Überlebens von jungen Bienen, die indirekten sozialen Kontakt zu dem Miniaturvolk hatten (Trophalaxis war nicht möglich). Für Mauerbienen etablierte ich eine Methode Schlupf- und lokomotorische Aktivitätsrhythmik aufzuzeichnen und konnte damit zeigen, dass tägliche Rhythmen im Schlupf durch Synchronisation der circadianen Uhr in Mauerbienen durch Tagestemperatur-Zyklen erzielt werden kann. Des Weiteren präsentiere ich die ersten lokomotorischen Aktivitätsrhythmen von solitären Bienen, die sofort nach ihrem Schlupf einen starken circadianen Rhythmus im Verhalten aufwiesen. Honigbienen brauchten in meinen Experimenten mehrere Tage, um circadiane Rhythmen in Lokomotion zu entwickeln. Ich erstellte die Hypothese, dass Honigbienen zum Zeitpunkt des Schlupfes im Bienenvolk ein noch nicht vollständig ausgereiftes circadianes System besitzen, während solitäre Bienen, die ohne den Schutz eines Volkes sind, direkt nach dem Schlupf eine vollständig ausgereifte Uhr brauchen. Mehrere Hinweise in Publikationen und Vorversuchen unterstützen meine Hypothese. Zukünftige Studien der Entwicklung des PDF Neuronen-Netzwerkes in solitären Bienen unterschiedlicher Entwicklungsstufen könnten dies nachweisen. KW - Chronobiologie KW - circadian rhythms KW - honeybee KW - Mauerbiene KW - Neuroanatomie Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-159765 ER - TY - THES A1 - Schmidt, Stefanie T1 - Cartilage Tissue Engineering – Comparison of Articular Cartilage Progenitor Cells and Mesenchymal Stromal Cells in Agarose and Hyaluronic Acid-Based Hydrogels T1 - Tissue Engineering von Knorpel – Vergleich von Gelenkknorpel-Vorläuferzellen und mesenchymalen Stromazellen in Agarose- und Hyaluronsäure-basierten Hydrogelen N2 - Articular cartilage damage caused by sports accidents, trauma or gradual wear and tear can lead to degeneration and the development of osteoarthritis because cartilage tissue has only limited capacity for intrinsic healing. Osteoarthritis causes reduction of mobility and chronic pain and is one of the leading causes of disability in the elderly population. Current clinical treatment options can reduce pain and restore mobility for some time, but the formed repair tissue has mostly inferior functionality compared to healthy articular cartilage and does not last long-term. Articular cartilage tissue engineering is a promising approach for the improvement of the quality of cartilage repair tissue and regeneration. In this thesis, a promising new cell type for articular cartilage tissue engineering, the so-called articular cartilage progenitor cell (ACPC), was investigated for the first time in the two different hydrogels agarose and HA-SH/P(AGE-co-G) in comparison to mesenchymal stromal cells (MSCs). In agarose, ACPCs´ and MSCs´ chondrogenic capacity was investigated under normoxic (21 % oxygen) and hypoxic (2 % oxygen) conditions in monoculture constructs and in zonally layered co-culture constructs with ACPCs in the upper layer and MSCs in the lower layer. In the newly developed hyaluronic acid (HA)-based hydrogel HA-SH/P(AGE-co-G), chondrogenesis of ACPCs and MSCs was also evaluated in monoculture constructs and in zonally layered co-culture constructs like in agarose hydrogel. Additionally, the contribution of the bioactive molecule hyaluronic acid to chondrogenic gene expression of MSCs was investigated in 2D monolayer, 3D pellet and HA-SH hydrogel culture. It was shown that both ACPCs and MSCs could chondrogenically differentiate in agarose and HA-SH/P(AGE-co-G) hydrogels. In agarose hydrogel, ACPCs produced a more articular cartilage-like tissue than MSCs that contained more glycosaminoglycan (GAG), less type I collagen and only little alkaline phosphatase (ALP) activity. Hypoxic conditions did not increase extracellular matrix (ECM) production of ACPCs and MSCs significantly but improved the quality of the neo-cartilage tissue produced by MSCs. The creation of zonal agarose constructs with ACPCs in the upper layer and MSCs in the lower layer led to an ECM production in zonal hydrogels that lay in general in between the ECM production of non-zonal ACPC and MSC hydrogels. Even though zonal co-culture of ACPCs and MSCs did not increase ECM production, the two cell types influenced each other and, for example, modulated the staining intensities of type II and type I collagen in comparison to non-zonal constructs under normoxic and hypoxic conditions. In HA-SH/P(AGE-co-G) hydrogel, MSCs produced more ECM than ACPCs, but the ECM was limited to the pericellular region for both cell types. Zonal HASH/P(AGE-co-G) hydrogels resulted in a native-like zonal distribution of ECM as MSCs in the lower zone produced more ECM than ACPCs in the upper zone. It appeared that chondrogenesis of ACPCs was supported by hydrogels without biological attachment sites such as agarose, and that chondrogenesis of MSCs benefited from hydrogels with biological cues like HA. As HA is an attractive material for cartilage tissue engineering, and the HA-based hydrogel HA-SH/P(AGE-co-G) appeared to be beneficial for MSC chondrogenic differentiation, the contribution of HA to chondrogenic gene expression of MSCs was investigated. An upregulation of chondrogenic gene expression was found in 2D monolayer and 3D pellet culture of MSCs in response to HA supplementation, while gene expression of osteogenic and adipogenic transcription factors was not upregulated. MSCs, encapsulated in a HA-based hydrogel, showed upregulation of gene expression for chondrogenic, osteogenic and adipogenic differentiation markers as well as for stemness markers. In a 3D bioprinting process, using the HA-based hydrogel, gene expression levels of MSCs mostly did not change. Nevertheless, expression of three tested genes (COL2A1, SOX2, CD168) was downregulated in printed in comparison to cast constructs, underscoring the importance of closely monitoring cellular behaviour during and after the printing process. In summary, it was confirmed that ACPCs are a promising cell source for articular cartilage engineering with advantages over MSCs when they were cultured in a suitable hydrogel like agarose. The performance of the cells was strongly dependent on the hydrogel environment they were cultured in. The different chondrogenic performance of ACPCs and MSCs in agarose and HA-SH/P(AGE-co-G) hydrogels highlighted the importance of choosing suitable hydrogels for the different cell types used in articular cartilage tissue engineering. Hydrogels with high polymer content, such as the investigated HA-SH/P(AGE-co-G) hydrogels, can limit ECM distribution to the pericellular area and should be developed further towards less polymer content, leading to more homogenous ECM distribution of the cultured cells. The influence of HA on chondrogenic gene expression and on the balance between differentiation and maintenance of stemness in MSCs was demonstrated. More studies should be performed in the future to further elucidate the signalling functions of HA and the effects of 3D bioprinting in HA-based hydrogels. Taken together, the results of this thesis expand the knowledge in the area of articular cartilage engineering with regard to the rational combination of cell types and hydrogel materials and open up new possible approaches to the regeneration of articular cartilage tissue. N2 - Gelenkknorpeldefekte, die durch Sportverletzungen, Unfälle oder graduelle Abnutzung ent-stehen, können zu Degeneration des Gewebes und zur Entstehung von Arthrose führen, da Knorpelgewebe nur über eine eingeschränkte Fähigkeit zur Selbstheilung verfügt. Arthrose reduziert die Beweglichkeit und verursacht chronische Schmerzen. Sie ist vor allem bei älte-ren Menschen einer der häufigsten Gründe für körperliche Behinderung. Die zurzeit verfüg-baren operativen Behandlungsmöglichkeiten können die Symptome meist für einige Zeit lindern, aber das dabei gebildete Ersatzgewebe zeigt meistens nur eingeschränkte Funktiona-lität im Vergleich zu natürlichem gesunden Knorpelgewebe und bleibt nur für eine begrenzte Zeit stabil. Tissue Engineering von Gelenkknorpelgewebe ist ein vielversprechender Ansatz, um die Qualität des Ersatzgewebes und der Knorpelregeneration zu verbessern. Diese Arbeit untersuchte einen neuen vielversprechenden Zelltyp für das Tissue Engineering von Knorpelgewebe, sogenannte Gelenkknorpel-Vorläuferzellen (ACPCs). Diese Zellen wurden erstmals in zwei verschiedenen Hydrogelen, Agarose und HA-SH/P(AGE-co-G), mit mesenchymalen Stromazellen (MSCs) verglichen. Die chondrogene Kapazität von ACPCs und MSCs in Agarose wurde unter normoxischen (21 % Sauerstoff) und hypoxischen (2 % Sauerstoff) Bedingungen in Monokultur und zonal geschichteter Kokultur untersucht. In den zonalen Kokulturen befanden sich ACPCs in einer oberen Schicht und MSCs in einer unte-ren Schicht. In dem neu entwickelten Hyaluronsäure (HA)-basierten Hydrogel HA-SH/P(AGE-co-G) wurde die chondrogene Differenzierung von ACPCs und MSCs ebenfalls in Monokultur und in zonal geschichteter Kokultur, wie im Agarose-Hydrogel, analysiert. Außerdem wurde der Beitrag des biologisch aktiven Moleküls Hyaluronsäure zur chondro-genen Genexpression von MSCs in 2D-, 3D-Pellet- und HA-SH-Hydrogel-Kulturen unter-sucht. Diese Arbeit zeigte, dass sowohl ACPCs als auch MSCs in Agarose- und HA-SH/P(AGE-co-G)-Hydrogelen chondrogen differenzieren konnten. ACPCs produzierten im Agarose-Hydrogel ein Gewebe, das dem Gelenkknorpel ähnlicher war als das von MSCs produzierte Gewebe, da es mehr Glykosaminoglykane (GAG), weniger Typ I Kollagen und nur geringe Aktivität der Alkalinen Phosphatase (ALP) aufwies. Hypoxische Bedingungen konnten die Produktion von extrazellulärer Matrix (ECM) durch ACPCs und MSCs nicht erhöhen, aber sie verbesserten die Qualität des von MSCs produzierten Gewebes. Die Herstellung von zon-alen Agarose-Konstrukten mit ACPCs in der oberen Schicht und MSCs in der unteren Schicht führte zu einer ECM-Produktion in zonalen Hydrogelen, die im Allgemeinen zwi-schen der ECM-Produktion der ACPC-Monokultur und der MSC-Monokultur lag. Zonale Kokultur von ACPCs und MSCs führte zwar nicht zu einer erhöhten ECM-Produktion, al-lerdings beeinflussten die beiden Zelltypen sich gegenseitig und modulierten zum Beispiel die Intensitäten der Typ II und Typ I Kollagen Färbungen im Vergleich zu Monokulturen unter normoxischen und hypoxischen Bedingungen. Im HA-SH/P(AGE-co-G)-Hydrogel produzierten die MSCs mehr ECM als die ACPCs, allerdings war die Verteilung der gebilde-ten ECM bei beiden Zelltypen auf den perizellulären Bereich beschränkt. Zonale HA-SH/P(AGE-co-G)-Hydrogele führten zu einer zonalen Verteilung von ECM, die der natürli-chen Struktur von Gelenkknorpel ähnlich war, da die MSCs in der unteren Schicht mehr ECM produzierten als die ACPCs in der oberen Schicht. Anscheinend wurde die chondroge-ne Differenzierung von ACPCs von Hydrogelen unterstützt, die, so wie Agarose, keine bio-logischen Bindestellen aufwiesen, und die Chondrogenese von MSCs profitierte von Hydro-gelen mit biologischen Signalen wie HA. Da HA ein attraktives Material für Tissue Engineering von Knorpel darstellt und das HA-basierte Hydrogel HA-SH/P(AGE-co-G) anscheinend die chondrogene Differenzierung von MSCs begünstigte, wurde der Beitrag von HA zur chondrogenen Genexpression in MSCs untersucht. Eine Hochregulation der chondrogenen Genexpression ließ sich in 2D- und 3D-Pellet-Kulturen von MSCs als Reaktion auf HA beobachten, während die Genexpression von osteogenen oder adipogenen Transkriptionsfaktoren nicht hochreguliert wurde. Der Ein-schluss von MSCs in einem HA-basierten Hydrogel führte zu einer Erhöhung der Genex-pression von chondrogenen, osteogenen, adipogenen und Stemness-Markern. Ein 3D-Druck-Prozess mit dem HA-basierten Hydrogel veränderte die Genexpression von MSCs in den meisten Fällen nicht. Dennoch wurde die Expression von drei getesteten Genen (COL2A1, SOX2, CD168) in gedruckten im Vergleich zu gegossenen Konstrukten herunterreguliert. Dies unterstrich die Wichtigkeit einer genauen Kontrolle des Verhaltens der Zellen während und nach dem Druck-Prozess. Zusammenfassend ließen sich ACPCs als vielversprechender neuer Zelltyp für das Tissue Engineering von Gelenkknorpelgewebe bestätigen. ACPCs haben Vorteile gegenüber MSCs, vor allem, wenn sie in einem passenden Hydrogel wie Agarose kultiviert werden. Die Leis-tung der Zellen war stark von den verschiedenen Hydrogelen und der Umgebung beeinflusst, die diese den Zellen darboten. Die unterschiedliche chondrogene Leistung von ACPCs und MSCs in Agarose- und HA-SH/P(AGE-co-G)-Hydrogelen zeigte deutlich die übergeordnete Relevanz der Auswahl von passenden Hydrogelen für die verschiedenen Zelltypen, die im Tissue Engineering von Gelenkknorpel Verwendung finden. Hydrogele mit einem hohen Polymergehalt, wie das eingesetzte HA-SH/P(AGE-co-G)-Hydrogel, können die Verteilung der gebildeten ECM auf den perizellulären Bereich beschränken und sollten weiterentwickelt werden, um einen niedrigeren Polymergehalt und damit eine homogenere ECM-Verteilung durch die kultivierten Zellen zu erreichen. Der Einfluss von HA auf die chondrogene Gen-expression und auf die Balance zwischen Differenzierung und Erhaltung der Stemness in MSCs ließ sich aufzeigen. In Zukunft sollten weitere Studien die Signalfunktionen von HA und den Einfluss des 3D-Drucks in HA-basierten Hydrogelen genauer zu untersuchen. Zusammengenommen erweitern die Ergebnisse dieser Arbeit das Wissen im Bereich des Tissue Engineerings von Gelenkknorpelgewebe, vor allem in Bezug auf eine rationale Kom-bination von Zelltypen und Hydrogel-Materialien, und eröffnen neue Ansätze zur Knorpel-regeneration. KW - Hyaliner Knorpel KW - Tissue Engineering KW - Hydrogel KW - Hypoxie KW - Mesenchymzelle KW - articular cartilage progenitor cells KW - Cartilage KW - Mesenchymal stem cell KW - Hyaluronsäure KW - Agarose KW - zonal Hydrogels KW - Bioprinting KW - Cartilage Tissue Engineering KW - Oxygen partial pressure KW - chondrogene Differenzierung Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-251719 ER - TY - THES A1 - Beykan, Seval T1 - Implementation and Optimization of Dosimetry for Theranostics in Radiopeptide Therapies T1 - Implementierung und Optimierung der Dosimetrie für die Theranostik in Radiopeptidtherapien N2 - Peptide receptor radionuclide therapy (PRRT) is a molecular targeted radiation therapy involving the systemic administration of radiolabeled somatostatin receptor binding peptides designed to target with high affinity and specificity receptors overexpressed on tumors. Peptides are applied which either target as agonist (with internalization) or antagonist (little to no internalization). Recently, two novel antagonistic agents have been developed for clinical use: OPS202 and OPS201. 68Ga-labelled OPS202 is used for diagnostic purposes with positron emission tomography and 177Lu-labelled OPS201 is used for the therapy in patients with neuroendocrine tumors (NETs). Both agents are presently under clinical evaluation. Despite the very low internalization rate, the use of somatostatin receptor antagonists which target more binding sites on receptors are expected to result in higher specificity, more favorable pharmacokinetics and higher tumor retention and better visualization than the agonists. The main goal of this thesis was analyzing the biodistribution, biokinetics and internal dosimetry of the recently developed somatostatin receptor antagonists (OPS201 and OPS202) for therapeutic and diagnostic purposes in different species (mice, pigs and patients). In addition, an analysis of the influence of image quantification and the integration of time activity curves on kidney dosimetry in a pig model was carried out. Furthermore, extrapolation methods, which are used for predicting organ absorbed doses for humans based on preclinical animal models, were systematically compared for blood, liver, and kidneys of OPS201 injected species. Based on the OPS202 injected patients’ investigations, 68Ga-OPS202 shows promising biodistribution and imaging properties with tumor contrast which is optimal one hour after injection of the radiotracer. OPS202 is well tolerated and delivers absorbed doses to organs that are lower than those by 18F-FDG and similar to other 68Ga-labeled somatostatin receptor ligands. As a result of 68Ga OPS202 injection, the highest absorbed doses were observed in the urinary bladder (0.10 mGy/MBq) and kidneys (0.84 mGy/MBq). The calculated mean effective dose coefficient of 68Ga-OPS202 injected patients was 0.024 mSv/MBq (3.6 mSv for 150 MBq 68Ga-OPS202 injection) which is similar to other 68Ga-labeled compounds. Based on the OPS201 biokinetics and dosimetry investigations, after the injection of 177Lu-OPS201, a fast blood clearance of the compound is observed in the first phase (half-life: 1.83 h) for each species. 10 min after injection, less than 5% of the injected activity per milliliter of blood circulates in pigs and humans. The analysis of the mice, pig and preliminary patient data provides evidence that, patients enrolled in a phase 1 177Lu-OPS201 trial would not be at risk of overexposure. Based on our results, for 177Lu labelled studies, late time points after 72 h have a great impact on absorbed dose calculations. That is why follow-up times especially at late time points (more than 72 h) are required for the time-integrated activity coefficient (TIAC) calculations in order to represent the area under the curve appropriately and to analyze both biokinetics and dosimetry accurately. In addition, to find the most adequate extrapolation methods that minimize the interspecies differences of dosimetry data, several extrapolation methods from animal to human have been tested. For OPS201 time scaling or combination of relative mass and time scaling results in most similar TIAC values, if the organ mass ratios between the species are high. In time scaling, the scan/sampling time is scaled by using the ratio of the whole body masses of the respective species. In relative mass scaling, the TIACs are scaled based on the ratio of the whole body and organ mass of respective species. Other methods tested showed higher deviations. For the study on the influence of image quantification and the choice of the optimal scanning time points, a study in a pig model, which was performed in collaboration with Aalborg University and Octreopharm Sciences GmbH, was reanalyzed. As kidneys are organs-at-risk in PRRT with 177Lu labelled peptides, several quantification methods, based on 2D and 3D quantitative imaging were chosen. For this purpose, a 3D printed pig kidney phantom was prepared and measured with/without background activities representing the activities in the pig SPECT/CT scans. The phantom dosimetry data based on multiple SPECT/CT images and based on multiple planar images in combination with one SPECT/CT scan (MP1S Imaging) were compared to the pig dosimetry. The calculated TIACs of the phantom with background based on multiple SPECT/CT and MP1S imaging were quite similar to the multiple SPECT/CT based pig TIAC. In addition, in order to investigate the effect of late time points on dosimetry and absorbed dose values in 177Lu therapies, the difference, associated with eliminating the late two scan time points, on the TIACs was analyzed. When the TIACs (including all time points) of the pig based on multiple SPECT/CT and MP1S imaging were investigated, the use of MP1S imaging results in considerably lower TIAC values to the kidney (by a factor of 1.4). With eliminating late time points from the created time activity curve, the factor increases up to 2.4 times with a corresponding increase in TIAC uncertainties. As a consequence, further evaluation of 68Ga-OPS202 for PET/CT imaging and 177Lu-OPS201 for the treatments of NET patients is necessary. In particular, a head-to-head comparison of agonists and OPS peptides with respect to biokinetics, biodistribution and dosimetry would be helpful. In addition, the influence of the late scan time points on dosimetry needs further attention in particular for kidney dosimetry N2 - Die Peptidrezeptor-Radionuklidtherapie (PRRT) beinhaltet die systemische Verabreichung von radioaktiv markierten Somatostatinrezeptor-bindende Peptiden. Sie zielt darauf ab, Rezeptoren, die in Tumoren überexprimiert sind, mit hoher Affinität und Spezifität anzusprechen. Es werden Peptide eingesetzt, die entweder als Agonist (mit Internalisierung) oder Antagonist (wenig bis gar keine Internalisierung) wirken. Vor kurzem wurden zwei neue antagonistische Wirkstoffe für den klinischen Einsatz entwickelt: OPS202 und OPS201. 68Ga markiertes OPS202 wird für diagnostische Zwecke mit der Positronen-Emissions-Tomographie und 177Lu markiertes OPS201 für die Therapie von Patienten mit neuroendokrinen Tumoren (NETs) verwendet. Beide Wirkstoffe befinden sich derzeit in der klinischen Erprobung. Trotz der sehr niedrigen Internalisierungsrate wird erwartet, dass der Einsatz von Somatostatinrezeptor-Antagonisten, die mehr Bindungsstellen an Rezeptoren ansprechen, zu einer höheren Spezifität, einer günstigeren Pharmakokinetik und einer höheren Tumorretention und besseren Visualisierung als die Agonisten führt. Das Hauptziel dieser Arbeit war die Analyse der Biodistribution, Biokinetik und der internen Dosimetrie der neu entwickelten Somatostatinrezeptor-Antagonisten (OPS201 und OPS202) für therapeutische und diagnostische Zwecke in verschiedenen Spezies (Mäuse, Schweine und Patienten). Darüber hinaus wurde eine Analyse des Einflusses der Bildquantifizierung und der Integration von Zeitaktivitätskurven auf die Nierendosimetrie in einem Schweinemodell durchgeführt. Zudem wurden Extrapolationsmethoden, die zur Vorhersage der Energiedosen für das Blut, die Leber und die Nieren für den Menschen auf der Grundlage präklinischer Tiermodelle, die mit OPS201 injiziert wurden, systematisch verglichen. Basierend auf den Patientenuntersuchungen mit OPS202 zeigt 68Ga-OPS202 vielversprechende Biodistributions- und Abbildungseigenschaften mit einem Tumorkontrast, der eine Stunde nach Injektion des Radiotracers optimal ist. OPS202 ist gut verträglich; die Energiedosen in den Organen sind niedriger als die von 18F-FDG und ähnlich wie andere 68Ga-markierte Somatostatinrezeptorliganden. Nach einer Injektion von OPS202, das mit 68Ga markiert wurde, wurden die höchsten Energiedosen in der Harnblase (0.10 mGy/MBq) und den Nieren (0.84 mGy/MBq) beobachtet. Der berechnete mittlere effektive Dosiskoeffizienten von Patienten, die mit 68Ga-OPS202 injiziert wurden, betrug 0.024 mSv/MBq (3.6 mSv für 150 MBq 68Ga-OPS202), ähnlich wie bei anderen 68Ga-markierten Verbindungen. Basierend auf den biokinetischen und dosimetrischen Untersuchungen von OPS201 wird nach der Injektion von 177Lu-OPS201 in der ersten Phase (Halbwertszeit: 1.83 h) für jede Spezies eine schnelle Ausscheidung der Verbindung beobachtet. 10 Minuten nach der Injektion zirkulieren weniger als 5% der injizierten Aktivität pro Milliliter Blut bei Schweinen und Menschen. Die Analyse der Daten von Mäusen, Schweinen und vorläufigen Patienten liefert Hinweise darauf, dass Patienten, die in eine 177Lu-OPS201-Studie aufgenommen werden, nicht dem Risiko für eine Überexposition ausgesetzt wären. Basierend auf unseren Ergebnissen werden für 177Lu markierte Studien Nachbeobachtungszeiten insbesondere zu späten Zeitpunkten (mehr als 72 h) für die Berechnungen des zeitintegrierten Aktivitätskoeffizienten (TIAC) benötigt, um die Fläche unter der Kurve angemessen darzustellen und sowohl die Biokinetik als auch die Dosimetrie genau zu analysieren. Späte Zeitpunkte (nach 72 h) haben einen großen Einfluss auf die Berechnung der Energiedosis. Darüber hinaus wurden mehrere Extrapolationsmethoden vom Tier auf den Menschen getestet, um die geeignetsten Extrapolationsmethoden zu finden, die die Unterschiede zwischen den verschiedenen Spezies von Dosimetrie-Daten minimieren. Für OPS201 ergibt die Zeitskalierung oder die Kombination von relativer Masse und Zeitskalierung die ähnlichsten TIAC-Werte, wenn die Organmassenverhältnisse zwischen den Spezies hoch sind. Bei der Zeitskalierung wird die Scan-/Samplingzeit durch das Verhältnis der Ganzkörpermassen der jeweiligen Spezies skaliert. Bei der relativen Massenskalierung werden die TIACs basierend auf dem Verhältnis der Ganzkörper- und Organmasse der jeweiligen Spezies skaliert. Andere getestete Methoden zeigten höhere Abweichungen. Um den Einfluss der Bildquantifizierung und die Wahl der optimalen Scanzeitpunkte zu untersuchen, wurde eine Studie in einem Schweinemodell, die in Zusammenarbeit mit der Universität Aalborg und der Octreopharm Sciences GmbH durchgeführt wurde, neu analysiert. Da die Nieren bei PRRT mit 177Lu markierten Peptiden Risikoorgane sind, wurden mehrere Quantifizierungsmethoden ausgewählt, die auf 2D- und 3D-Bildgebung basieren. Zu diesem Zweck wurde ein 3D gedrucktes Schweine-Nierenphantom vorbereitet und, mit und ohne Hintergrundaktivitäten, die den Aktivitäten in den Schweinescans entsprechen, gemessen und quantifiziert,. Dosimetrie-Daten, die aus dem Schweinescan basierend auf mehreren 3D-Bildern und basierend auf mehreren 2D-Planarbildern in Kombination mit einem SPECT/CT-Bild („MP1S-Imaging“) gewonnen wurden, wurden mit den Ergebnissen der Phantomscans verglichen. Die so ermittelten TIACs des Phantoms mit Hintergrund, basierend auf beiden Bildgebungstechniken, entsprachen in etwa den Ergebnissen derjenigen Schweinedaten, die auf mehrfachen SPECT/CT-Aufnahmen basierten. Um die Auswirkungen der späten Zeitpunkte auf die Dosimetrie und die Werte der Energiedosen in 177Lu Therapien zu untersuchen, wurde außerdem der Unterschied, der mit der Eliminierung der späten zwei Scanzeitpunkte verbunden ist, auf die TIACs analysiert. Wenn auf mehreren SPECT/CT- und Hybrid-Bildern basierten TIACs des Schweins untersucht wurden, war die berechnete TIAC (einschließlich aller Zeitpunkte) basierend auf mehreren SPECT/CT-Bildern im Vergleich zur Hybrid Imaging um den Faktor 1.4 höher. Durch die Eliminierung von späten Zeitpunkten aus der erstellten Zeitaktivitätskurve erhöht sich der TIAC um den Faktor 2.4 mit entsprechend höheren TIAC Unsicherheiten. Daher ist zu folgern, dass eine weitere Evaluierung von 68Ga-OPS202 für die PET/CT-Bildgebung und 177Lu-OPS201 für die Behandlung von NET-Patienten erforderlich ist. Insbesondere wäre ein direkter Vergleich von Agonisten und OPS-Peptiden in Bezug auf Biokinetik, Biodistribution und Dosimetrie hilfreich. Darüber hinaus bedarf der Einfluss der späten Zeitpunkte bei Dosimetrie-Scans weiterer Aufmerksamkeit, insbesondere bei der Nierendosimetrie. KW - biodistribution KW - biokinetics KW - internal dosimetry KW - somatostatin receptor antagonists KW - 177Lu-OPS201 KW - therapy KW - 68Ga-OPS202 KW - diagnostics Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-199553 ER - TY - THES A1 - Endres, Theresa T1 - PAF1 complex and MYC couple transcription elongation with double-strand break repair T1 - Koordination von Transkriptionselongation und Doppelstrangbruchreparatur durch den PAF1 Komplex und MYC N2 - The oncogene MYC is deregulated and overexpressed in a high variety of human cancers and is considered an important driver in tumorigenesis. The MYC protein binds to virtually all active promoters of genes which are also bound by the RNA Polymerase II (RNAPII). This results in the assumption that MYC is a transcription factor regulating gene expression. The effects of gene expression are weak and often differ depending on the tumor entities or MYC levels. These observations could argue that the oncogene MYC has additional functions independent of altering gene expression. In relation to this, the high diversity of interaction partners might be important. One of them is the RNAPII associated Factor I complex (PAF1c). In this study, direct interaction between PAF1c and MYC was confirmed in an in-vitro pulldown assay. ChIP sequencing analyses revealed that knockdown of PAF1c components resulted in reduced MYC occupancy at active promoters. Depletion or activation as well as overexpression of MYC led to reduced or enhanced global occupancy of PAF1c in the body of active genes, arguing that MYC and PAF1c bind cooperatively to chromatin. Upon PAF1c knockdown cell proliferation was reduced and additionally resulted in an attenuation of activation or repression of MYC-regulated genes. Interestingly, knockdown of PAF1c components caused an accumulation in S-phase of cells bearing oncogenic MYC levels. Remarkably, enhanced DNA damage, measured by elevated gH2AX and pKAP1 protein levels, was observed in those cells and this DNA damage occurs specifically during DNA synthesis. Strikingly, MYC is involved in double strand break repair in a PAF1c-dependent manner at oncogenic MYC levels. Collectively the data show that the transfer of PAF1c from MYC onto the RNAPII couples the transcriptional elongation with double strand break repair to maintain the genomic integrity in MYC-driven tumor cells. N2 - Das Onkogen MYC ist in einer Vielzahl verschiedener Krebsarten dereguliert und überexprimiert und deshalb ein wichtiger Faktor in der Tumorgenese. Zwei zentrale Beobachten sind: Erstens, das MYC Protein bindet grundsätzlich an allen zugänglichen Promotoren von Genen, die ebenfalls von der RNA Polymerase II gebunden sind. Das resultiert in der Annahme, dass MYC als ein Transktiptionfaktor klassifiziert werden kann, der Genexpression reguliert. Zweitens, die Effekte auf die Genregulation sind schwach und oftmal abhängig von der Tumorart als auch von der unterschiedlichen MYC Proteinmenge. Diese Beobachtungen lassen die Schlussfolgerung zu, dass MYC eine zusätzliche Funktion neben der des Transktiptionfaktors haben könnte. Darauf bezogen könnte die große Anzahl an Interaktionspartnern eine entscheidende Rolle spielen. Einer dieser Interaktionspartner ist der RNA Polymerase II assoziierte Faktor I Complex (PAF1c). In dieser Arbeit konnte die direkte Interaktion zwischen PAF1c und MYC mittels in-vitro Pulldown Assays bestätigt werden. ChIP-Sequenzierungen illustrierten, dass der Knockdown verschiedener Untereinheiten des PAF1c zur einer verminderten Bindung von MYC an aktiven Promotoren führt. Andererseits zeigte die Depletion oder Aktivierung sowie Überexpression des MYC Proteins entweder eine reduzierte oder aber eine gesteigerte PAF1c Bindung im Genkörper aktiver Gene. Folglich wird angenommen, dass MYC und PAF1c kooperativ an das Chromatin binden. Unabhängig von den MYC Proteinmengen, führte der Knockdown von PAF1c Untereinheiten zu einer reduzierten Proliferation von Zellen. Zusätzlich resultierte in RNA Sequenzierexperimenten, dass der PAF1c Knockdown zu einer abgeschwächten Aktivierung oder Repression von MYC regulierten Genen führt. Interessanterweise führte der Knockdown von PAF1c Untereinheiten zu einer Ansammlung in der S-Phase des Zellzyklus für viele Zellen, die onkogene MYC Proteinmengen aufweisten. Auffallend dabei war, dass diese Zellen erhöhten DNA Schaden, gemessen an erhöhten Proteinmengen von γH2AX und pKAP1, aufwiesen. Dieser DNA Schaden ereignete sich spezifisch während der DNA Synthese. Bemerkenswert ist, dass MYC, vor allem bei onkogenen MYC Proteinmengen, in die Doppelstrangbruchreparatur involviert ist und das dies in Zusammenarbeit mit PAF1c erfolgt. Zusammenfassend zeigen die Daten, dass der Transfer des PAF1c von MYC auf die RNAPII die transkriptionelle Elongation mit der Doppelstrangbruchreparatur vereint um die genomische Integrität in MYC getriebenen Tumoren zu gewährleisten. KW - MYC KW - PAF1c KW - double-strand break repair Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-249557 ER - TY - THES A1 - Staus, Madlen T1 - Glutathione-dependent reprogramming in melanoma T1 - Glutathion-abhängige Reprogrammierung im Melanom N2 - These days, treatment of melanoma patients relies on targeted therapy with BRAF/MEK inhibitors and on immunotherapy. About half of all patients initially respond to existing therapies. Nevertheless, the identification of alternative therapies for melanoma patients with intrinsic or acquired resistance is of great importance. In melanoma, antioxidants play an essential role in the maintenance of the redox homeostasis. Therefore, disruption of the redox homeostasis is regarded as highly therapeutically relevant and is the focus of the present work. An adequate supply of cysteine is essential for the production of the most important intracellular antioxidants, such as glutathione. In the present work, it was investigated whether the depletion of cysteine and glutathione is therapeutically useful. Depletion of glutathione in melanoma cells could be achieved by blocking cysteine supply, glutathione synthesis, and NADPH regeneration. As expected, this led to an increased level of reactive oxygen species (ROS). Surprisingly, however, these changes did not impair the proliferation and survival of the melanoma cells. In contrast, glutathione depletion led to cellular reprogramming which was characterized by the induction of mesenchymal genes and the repression of differentiation markers (phenotypic switch). This was accompanied by an increased migration and invasion potential which was favored by the induction of the transcription factor FOSL1. To study in vivo reprogramming, Gclc, the first and rate-limiting enzyme in glutathione synthesis, was knocked out by CRISPR/Cas9 in murine melanoma cells. The cells were devoid of glutathione, but were fully viable and showed a phenotypic switch, the latter only in MITF-expressing B16F1 cells and not in MITF-deficient D4M3A.781 cells. Following subcutaneous injection into immunocompetent C57BL/6 mice, Gclc knockout B16F1 cells grew more aggressively and resulted in an earlier tumor onset than B16F1 control cells. In summary, this work demonstrates that inhibition of cysteine supply and thus, glutathione synthesis leads to cellular reprogramming in melanoma. In this context, melanoma cells show metastatic capabilities, promoting a more aggressive form of the disease. N2 - Die Behandlung von Melanompatienten beruht heutzutage auf der gerichteten Therapie mit BRAF/MEK Inhibitoren und auf der Immuntherapie. Circa die Hälfte aller Patienten spricht zunächst auf die vorhandenen Therapien an. Dennoch ist die Identifizierung alternativer Therapieansätze für Melanompatienten mit intrinsischer oder erworbener Resistenz von großer Wichtigkeit. Im Melanom spielen Antioxidanzien eine essenzielle Rolle zur Aufrechterhaltung der Redox-Homöostase. Eine Störung der Redox-Homöostase wird daher als therapeutisch hochrelevant betrachtet und steht im Fokus der vorliegenden Arbeit. Eine ausreichende Versorgung mit Cystein ist essenziell zur Produktion der wichtigsten intrazellulären Antioxidanzien wie dem Glutathion. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob die Depletion von Cystein und Glutathion therapeutisch nützlich ist. Eine Depletion von Glutathion in Melanomzellen konnte durch eine Blockierung der Cysteinversorgung, der Glutathionsynthese und der NADPH-Regeneration erreicht werden. Dies führte wie erwartet zu einem erhöhten Level von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS). Überraschenderweise beeinträchtigten diese Veränderungen jedoch nicht die Proliferation und das Überleben der Melanomzellen. Im Gegenteil führte die Glutathion-Depletion zu einer zellulären Reprogrammierung, die durch die Induktion mesenchymaler Gene und der Repression von Differenzierungsmarkern gekennzeichnet war (phenotypic switch). Dies ging mit einem erhöhten Migrations- und Invasionspotential einher, welches durch die Induktion des Transkriptionsfaktors FOSL1 begünstigt wurde. Für die Untersuchung der Reprogrammierung in vivo wurde Gclc, das erste und geschwindigkeitsbestimmende Enzym der Glutathionsynthese, mittels CRISPR/Cas9 in murinen Melanomzellen ausgeknockt. Die Zellen waren voll lebensfähig und zeigten erwartungsgemäß reduzierte Glutathionlevel und einen phenotypic switch. Letzterer zeigte sich jedoch nur in MITF-exprimierenden B16F1 Zellen und nicht in MITF-defizienten D4M3A.781 Zellen. Nach subkutaner Injektion in immunkompetente C57BL/6 Mäuse wuchsen die Gclc-knockout B16F1 Zellen aggressiver und führten zu einer früheren Tumorentstehung als B16F1 Kontrollzellen. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass die Hemmung der Cysteinversorgung und somit der Glutathionmenge im Melanom zu einer Reprogrammierung führt, bei der Melanomzellen metastasierende Fähigkeiten aufweisen und somit zu einer aggressiveren Form der Erkrankung führen. KW - Melanom KW - Glutathion KW - Cystein KW - Phenotypic switch Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-168424 ER - TY - THES A1 - Bachmann, Julia T1 - Role of Adipose-Derived Stromal/Stem Cells in Cell-Assisted Lipotransfer – Characterization of their Secretory Capacity under Ischemia-Like Stress Conditions and Establishment of a 3D Adipose Tissue-ASC Co-Culture T1 - Bedeutung von mesenchymalen Stammzellen aus dem Fettgewebe für den zellassistierten Lipotransfer – Charakterisierung der Sekretionskapazität unter Ischämie-artigen Stressbedingungen und Etablierung einer 3D Fettgewebe-ASC-Kokultur N2 - The use of human adipose-derived mesenchymal stem cells (ASCs) for cell-based therapeutic approaches, in terms of repair and regeneration of various tissues and organs, offers an alternative therapeutic tool in the field of regenerative medicine. The ability of ASCs to differentiate along mesenchymal lineages is not the only property that makes these cells particularly attractive for therapeutic purposes. Their promising functions in promoting angiogenesis, reducing inflammation as well as in functional tissue restoration are largely related to the trophic effects of a broad panel of secreted cytokines and growth factors. However, in cell-based approaches, the cell-loaded construct often is exposed to an ischemic microenvironment characterized by severe oxidative and nutritional stress after transplantation due to the initial lack of vascular connection, resulting in reduced cell viability and altered cell behaviour. Therefore, the effective use of ASCs in regenerative medicine first requires a comprehensive characterization of the cells in terms of their viability, differentiation capacity and especially their secretory capabilities under ischemia-mimicking conditions in order to better understand their beneficial role. Accordingly, in the first part of this work, ASCs were investigated under different ischemic conditions, in which cells were exposed to both glucose and oxygen deprivation, with respect to viability and secretory function. Using mRNA gene expression analysis, significantly higher expression of selected angiogenic, anti-apoptotic and immunomodulatory factors (IL-6, VEGF, STC-1) could be demonstrated under harsh ischemic conditions. These results were reflected at the protein expression level by a significantly increased secretion of these factors. For stanniocalcin-1 (STC-1), a factor not yet described in ASCs, a particularly high expression with significant secreted amounts of the protein could be demonstrated under harsh ischemic conditions. Thus, the first part of this work, in addition to the characterization of the viability, provided first insights into the secretory response of ASCs under ischemic conditions. The response of ASCs to glucose deficiency in combination with severe hypoxia has been little explored to date. Thus, the focus of the second part of this work was on a more detailed investigation of the secretory response of ASCs under glucose and oxygen deprivation. For a more comprehensive analysis of the secretion profile, a cytokine antibody array was performed, which allowed the detection of a broad panel of secreted angiogenic factors (IL-8, ANG), matrix-regulating proteins (TIMP-1, TIMP-2), chemokines (MCP-1/CCL2, IP-10/CXCL 10) and other factors under ischemic conditions. To verify these results, selected factors were examined using ELISA. The analysis revealed that the secretion of individual factors (e.g., STC-1, VEGF) was significantly upregulated by the combination of glucose and oxygen deprivation compared to oxygen deprivation alone. In order to investigate the impact of the secretome of ischemic ASCs on cell types involved in tissue regeneration, the effect of conditioned medium of ischemia-challenged ASCs on both endothelial cells and fibroblasts was investigated in subsequent experiments. Significantly increased viability and tube formation of endothelial cells as well as activated migration of fibroblasts by the secreted factors of ischemic ASCs could be demonstrated. A direct correlation of these effects to STC-1, which was significantly upregulated under ischemic conditions and has been described as a regulator of key cellular functions, could not be verified. The particular secretory capacity of ASCs provides a valuable tool for cell-based therapies, such as cell-assisted lipotransfer (CAL), where by enriching fat grafts with isolated ASCs, a significantly improved survival rate of the transplanted construct is achieved with less resorption of the fat tissue as well as a reduction in adverse implications, such as fibrosis and cyst formation. In order to better understand the function of ASCs in CAL, an autologous transwell-based lipograft-ASC co-culture was established in the last part of this work, in which first investigations showed a markedly increased secretion of VEGF compared to lipografts without added ASCs. As the stability rate of the fat tissue and thus the success of CAL is presumably also dependent on the preparation of the tissue before transplantation, the conventional preparation method of fat tissue for vocal fold augmentation in laryngoplasty was additionally evaluated in vitro in a pilot experiment. By analyzing the viability and tissue structure of the clinically prepared injection material, a large number of dead cells and a clearly damaged tissue structure with necrotic areas could be demonstrated. In comparison, the preparation method of the fat tissue established in this work as small tissue fragments was able to provide a clearly intact, vital, and vascularized tissue structure. This type of adipose tissue preparation represents a promising alternative for clinical vocal fold augmentation. In conclusion, the results of this work contribute to a comprehensive characterization of ASCs under ischemic conditions, such as those prevalent at the transplantation site or in tissue regeneration. The results obtained, especially on the secretory capacity of ASCs, provide new insights into how ASCs mediate regenerative effects in an ischemic milieu and why their use for therapeutic purposes is highly attractive and promising. N2 - Der Einsatz von humanen mesenchymalen Stammzellen aus dem Fettgewebe (ASCs) für zell-basierte Therapieansätze zur Reparatur und Regeneration von verschiedenen Geweben und Organen bietet eine alternative therapeutische Lösung im Bereich der regenerativen Medizin. Die Fähigkeit der ASCs zur Differenzierung in verschiedene mesenchymale Zelltypen ist jedoch nicht die einzige Eigenschaft, die diese Zellen für therapeutische Zwecke besonders attraktiv macht. ASCs sezernieren vielmehr ein breites Spektrum an Zytokinen und Wachstumsfaktoren, die z.B. durch Förderung der Angiogenese oder der Reduktion von Entzündungsprozessen eine wichtige Rolle bei regenerativen Therapien spielen können. Allerdings ist in zellbasierten Ansätzen, das zellbeladene Konstrukt nach der Transplantation – durch den anfänglich fehlenden Gefäßanschluss und die damit einhergehende mangelnde Versorgung des implantierten Gewebes – starkem oxidativem und ernährungsbedingtem Stress, einem ischämischen Milieu, ausgesetzt, was zu einer reduzierten Zellviabilität und einem veränderten Zellverhalten führt. Der effektive Einsatz der ASCs in der regenerativen Medizin erfordert demnach zunächst eine umfassende Charakterisierung der Zellen in Bezug auf deren Lebensfähigkeit, Differenzierungsfähigkeit und insbesondere die sekretorischen Fähigkeiten unter simulierten ischämischen Bedingungen, um ihren therapeutischen Effekt besser verstehen und optimieren zu können. Dazu wurden im ersten Teil dieser Arbeit die ASCs unter verschiedenen ischämischen Bedingungen, bei denen die Zellen sowohl einem Glukose- als auch Sauerstoffmangel ausgesetzt waren, hinsichtlich der Viabilität und der sekretorischen Funktion in vitro untersucht. Durch mRNA Genexpressionsanalysen konnte für ausgewählte angiogene, anti-apoptotische und immunmodulatorische Faktoren (IL-6, VEGF, STC-1) eine signifikant höhere Expression unter stark ischämischen Bedingungen gezeigt werden. Diese Ergebnisse spiegelten sich gleichermaßen auf Proteinebene durch eine signifikant erhöhte Sekretion der Faktoren wider. Für Stanniocalcin-1 (STC-1), einen Faktor, dessen Rolle bislang im Zusammenhang mit ASCs noch nicht beschrieben ist, konnte eine besonders hohe Expression mit signifikanten sezernierten Mengen des Proteins bei hoher ischämischer Belastung der Zellen gezeigt werden. Somit konnten im ersten Abschnitt der Arbeit neben einer ersten Charakterisierung der ASCs auch erste Erkenntnisse über das sekretorische Verhalten der Zellen in einem ischämischen Milieu gewonnen werden. Die Reaktion von ASCs auf Glukosemangel in Kombination mit Hypoxie ist bislang wenig untersucht. Somit lag der Fokus im zweiten Teil dieser Arbeit auf der detaillierteren Untersuchung des Sekretionsverhaltens von ASCs unter Glucose- und Sauerstoffdeprivation. Für eine umfassende Analyse des Sekretionsprofils wurde ein Zytokin-Antikörper-Array durchgeführt, mit welchem die Sekretion eines breiten Panels von angiogenen Faktoren (IL-8, ANG), matrixregulierenden Proteinen (TIMP-1, TIMP-2), Chemokinen (MCP-1/CCL2, IP-10/CXCL 10) sowie weiterer Faktoren unter ischämischen Bedingungen nachgewiesen werden konnte. Zur Verifizierung dieser Ergebnisse wurden ausgewählte Faktoren mittels ELISA untersucht. Durch diese Analyse konnte gezeigt werden, dass die Sekretion einzelner Faktoren (z.B. STC-1, VEGF) durch die Kombination von Glukose- und Sauerstoffentzug deutlich hochreguliert wird, z.B. gegenüber nur dem Entzug von Sauerstoff. Um die Wirkung des Sekretoms von ischämischen ASCs auf Zelltypen, die in der Regeneration von Geweben eine Rolle spielen, zu untersuchen, wurde in nachfolgenden Experimenten die Wirkung von konditioniertem Medium ischämischer ASCs sowohl auf Endothelzellen als auch auf Fibroblasten untersucht. Dabei konnte sowohl eine deutlich gesteigerte Röhrenbildung („tube formation“) von Endothelzellen als auch eine aktivierte Migration von Fibroblasten durch die sezernierten Faktoren der ischämischen ASCs nachgewiesen werden. Ein direkter Zusammenhang dieser Effekte mit dem unter ischämischen Bedingungen signifikant hochregulierten Faktor STC-1, welcher als Regulator zellulärer Schlüsselfunktionen beschrieben wird, konnte hingegen nicht nachgewiesen werden. Die besondere Sekretionsfähigkeit von ASCs stellt ein wertvolles Werkzeug für zellbasierte Therapien dar, wie z.B. den zellassistierten Lipotransfer (CAL), bei dem durch die Anreicherung von Fetttransplantaten mit isolierten ASCs eine deutliche Verbesserung der Überlebensrate des transplantierten Konstrukts mit einer geringeren Resorption des Fettgewebes sowie einer Verringerung von unerwünschten Folgen, wie Fibrosen und Zystenbildung, erzielt wird. Um die Funktion der ASCs im CAL besser charakterisieren zu können, wurde im letzten Teil dieser Arbeit eine autologe Transwell-basierte Lipograft-ASC-Kokultur etabliert, in welcher durch erste Untersuchungen eine signifikant erhöhte Sekretion von VEGF im Vergleich zu den Lipografts ohne Zusatz von isolierten ASCs gezeigt werden konnte. Da die Stabilitätsrate des Fettgewebes und damit der Erfolg des CAL mutmaßlich auch von der Aufbereitung des Gewebes vor der Transplantation abhängig ist, wurde in einem Pilot-Experiment die konventionelle Präparationsmethode von Fettgewebe für die Stimmlippenaugmentation in der Laryngoplastik in vitro evaluiert. Durch Analysen zur Viabilität und Gewebestruktur konnte bei dem klinisch aufbereiteten Injektionsmaterial eine große Anzahl abgestorbener Zellen sowie eine deutlich geschädigte Gewebestruktur mit nekrotischen Arealen nachgewiesen werden. Im Vergleich dazu konnte mit der in dieser Arbeit etablierten Präparationsmethode des Fettgewebes als kleine Gewebsfragmente eine deutlich intakte, vitale und vaskularisierte Gewebestruktur erhalten werden. Damit bietet diese Art der Aufbereitung von Fettgewebe eine vielversprechende Alternative für die klinische Stimmlippenaugmentation.  Zusammengefasst tragen die Ergebnisse dieser Arbeit zu einer umfassenden Charakterisierung von ASCs unter ischämischen Bedingungen bei, wie sie beispielsweise am Transplantationsort oder in der Geweberegeneration vorliegen können. Die gewonnenen Ergebnisse, insbesondere zu den sekretorischen Fähigkeiten der ASCs, liefern neue Erkenntnisse darüber, wie ASCs regenerative Effekte in einem ischämischen Milieu vermitteln und weshalb deren Verwendung für therapeutische Zwecke besonders attraktiv und vielversprechend ist. KW - Adipose KW - Secretion KW - Regenerative Medicine KW - Ischemia KW - Hypoxia KW - Adipose-Derived Stromal/Stem Cells KW - Trophic Factors KW - Glucose Starvation KW - Cell-Assisted Lipotransfer Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-251786 ER - TY - THES A1 - El Merahbi, Rabih T1 - Adrenergic-induced ERK3 pathway drives lipolysis and suppresses energy dissipation T1 - Der adrenerge induzierte ERK3-Signalweg verstärkt Lipolyse und unterdrückt Energiedissipation N2 - Obesity-induced diabetes affects over 400 million people worldwide. Obesity is a complex metabolic disease and is associated with several co-morbidities, all of which negatively affect the individual’s quality of life. It is commonly considered that obesity is a result of a positive energy misbalance, as increased food intake and lower expenditure eventually lead to the development of this disease. Moreover, the pathology of obesity is attributed to several genetic and epigenetic factors that put an individual at high risk compared to another. Adipose tissue is the main site of the organism’s energy storage. During the time when the nutrients are available in excess, adipocytes acquire triglycerides, which are released during the time of food deprivation in the process of lipolysis (free fatty acids and glycerol released from adipocytes). Uncontrolled lipolysis is the consequent event that contributes to the development of diabetes and paradoxically obesity. To identify the genetic factors aiming for future therapeutic avenues targeting this pathway, we performed a high-throughput screen and identified the Extracellular-regulated kinase 3 (ERK3) as a hit. We demonstrate that β-adrenergic stimulation stabilizes ERK3 leading to the formation of a complex with the co-factor MAP kinase-activated protein kinase 5 (MK5) thereby driving lipolysis. Mechanistically, we identify a downstream target of the ERK3/MK5 pathway, the transcription factor FOXO1, which promotes the expression of the major lipolytic enzyme ATGL. Finally, we provide evidence that targeted deletion of ERK3 in mouse adipocytes inhibits lipolysis, but elevates energy dissipation, promoting lean phenotype and ameliorating diabetes. Moreover, we shed the light on our pharmacological approach in targeting ERK3/MK5 pathways using MK5 specific inhibitor. Already after 1 week of administering the inhibitor, mice showed signs of improvement of their metabolic fitness as showed here by a reduction in induced lipolysis and the elevation in the expression of thermogenic genes. Taken together, our data suggest that targeting the ERK3/MK5 pathway, a previously unrecognized signaling axis in adipose tissue, could be an attractive target for future therapies aiming to combat obesity-induced diabetes. N2 - Adipositas-induzierter Diabetes betrifft weltweit über 400 Millionen Menschen. Adipositas ist eine komplexe Stoffwechselerkrankung und geht mit mehreren Komorbiditäten einher, die sich alle negativ auf die Lebensqualität der Betroffenen auswirken. Es wird generell angenommen, dass Adipositas aus einem positiven Energieungleichgewicht resultiert, da eine erhöhte Nahrungsaufnahme und ein geringerer Verbrauch zu der Ausbildung dieser Krankheit führen. Darüber hinaus ist die Pathologie von Adipositas auf mehrere genetische und epigenetische Faktoren zurückzuführen, wodurch Individuen einem erhöhtem Risiko ausgesetzt sein können. Das Fettgewebe ist der vorwiegende Energiespeicher des Organismus. In Zeiten eines Nährstoffüberschusses speichern Adipozyten Triglyceride, die im Falle eines Nahrungsmangels durch den Prozess der Lipolyse in Form von freien Fettsäuren und Glycerin freigesetzt werden. Unkontrollierte Lipolyse ist ein Folgeereignis, welches zur Entwicklung von Diabetes und paradoxerweise zu Adipositas beiträgt. Um die genetischen Faktoren zu identifizieren, die in Zukunft therapeutische Angriffspunkte darstellen könnten, haben wir ein Hochdurchsatz-Screening durchgeführt und die extrazellulär regulierte Kinase 3 (ERK3) als Treffer identifiziert. Wir zeigen, dass β-adrenerge Stimulation ERK3 stabilisiert, was zur Bildung eines Komplexes mit dem Cofactor MAP-Kinase-aktivierte Proteinkinase 5 (MK5) führt und dadurch die Lipolyse vorantreibt. Mechanistisch identifizieren wir den Transkriptionsfaktor FOXO1, der dem ERK3/MK5-Signalweg nachgeschaltet ist und die Expression des wichtigsten lipolytischen Enzyms ATGL fördert. Darüber hinaus belegen wir, dass die gezielte Deletion von ERK3 in Maus-Adipozyten die Lipolyse hemmt, aber die Energiedissipation erhöht, den mageren Phänotyp fördert und Diabetes lindert. Außerdem nutzen wir einen pharmakologischen Ansatz durch Verwendung eines MK5 spezifischen Inhibitors, um auf den ERK3/MK5-Signalweg abzuzielen. Bereits eine Woche nach Verabreichung des Inhibitors zeigen Mäuse Anzeichen einer verbesserten metabolischen Fitness, die sich durch einer Verringerung der induzierten Lipolyse und eine verstärkte Expression von thermogenen Genen auszeichnet. Zusammenfassend legen unsere Daten nahe, dass der ERK3/MK5-Signalweg, eine zuvor nicht erkannte Signalachse im Fettgewebe, ein attraktiver Ansatzpunkt für zukünftige Therapien zur Bekämpfung von Adipositas-induziertem Diabetes sein könnte. KW - Metabolism KW - Lipolysis KW - Obesity KW - Adrenalin KW - ATGL KW - Foxo1 Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-217510 ER - TY - JOUR A1 - Shaikh, Haroon A1 - Vargas, Juan Gamboa A1 - Mokhtari, Zeinab A1 - Jarick, Katja J. A1 - Ulbrich, Maria A1 - Mosca, Josefina Peña A1 - Viera, Estibaliz Arellano A1 - Graf, Caroline A1 - Le, Duc-Dung A1 - Heinze, Katrin G. A1 - Büttner-Herold, Maike A1 - Rosenwald, Andreas A1 - Pezoldt, Joern A1 - Huehn, Jochen A1 - Beilhack, Andreas T1 - Mesenteric Lymph Node Transplantation in Mice to Study Immune Responses of the Gastrointestinal Tract JF - Frontiers in Immunology N2 - Mesenteric lymph nodes (mLNs) are sentinel sites of enteral immunosurveillance and immune homeostasis. Immune cells from the gastrointestinal tract (GIT) are constantly recruited to the mLNs in steady-state and under inflammatory conditions resulting in the induction of tolerance and immune cells activation, respectively. Surgical dissection and transplantation of lymph nodes (LN) is a technique that has supported seminal work to study LN function and is useful to investigate resident stromal and endothelial cell biology and their cellular interactions in experimental disease models. Here, we provide a detailed protocol of syngeneic mLN transplantation and report assays to analyze effective mLN engraftment in congenic recipients. Transplanted mLNs allow to study T cell activation and proliferation in preclinical mouse models. Donor mLNs proved viable and functional after surgical transplantation and regenerated blood and lymphatic vessels. Immune cells from the host completely colonized the transplanted mLNs within 7-8 weeks after the surgical intervention. After allogeneic hematopoietic cell transplantation (allo-HCT), adoptively transferred allogeneic CD4+ T cells from FVB/N (H-2q) mice homed to the transplanted mLNs in C57BL/6 (H-2b) recipients during the initiation phase of acute graft-versus-host disease (aGvHD). These CD4+ T cells retained full proliferative capacity and upregulated effector and gut homing molecules comparable to those in mLNs from unmanipulated wild-type recipients. Wild type mLNs transplanted into MHCII deficient syngeneic hosts sufficed to activate alloreactive T cells upon allogeneic hematopoietic cell transplantation, even in the absence of MHCII+ CD11c+ myeloid cells. These data support that orthotopically transplanted mLNs maintain physiological functions after transplantation. The technique of LN transplantation can be applied to study migratory and resident cell compartment interactions in mLNs as well as immune reactions from and to the gut under inflammatory and non-inflammatory conditions. KW - acute graft-versus host disease KW - alloreactive T cells KW - mesenteric lymph node KW - lymph node transplantation KW - mouse models KW - lymph node stromal cells Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-244869 SN - 1664-3224 VL - 12 ER - TY - THES A1 - Andreska, Thomas T1 - Effects of dopamine on BDNF / TrkB mediated signaling and plasticity on cortico-striatal synapses T1 - Effekte von Dopamin auf BDNF / TrkB vermittelte Signalwege und Plastizität an cortico-striatalen Synapsen N2 - Progressive loss of voluntary movement control is the central symptom of Parkinson's disease (PD). Even today, we are not yet able to cure PD. This is mainly due to a lack of understanding the mechanisms of movement control, network activity and plasticity in motor circuits, in particular between the cerebral cortex and the striatum. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) has emerged as one of the most important factors for the development and survival of neurons, as well as for synaptic plasticity. It is thus an important target for the development of new therapeutic strategies against neurodegenerative diseases. Together with its receptor, the Tropomyosin receptor kinase B (TrkB), it is critically involved in development and function of the striatum. Nevertheless, little is known about the localization of BDNF within presynaptic terminals in the striatum, as well as the types of neurons that produce BDNF in the cerebral cortex. Furthermore, the influence of midbrain derived dopamine on the control of BDNF / TrkB interaction in striatal medium spiny neurons (MSNs) remains elusive so far. Dopamine, however, appears to play an important role, as its absence leads to drastic changes in striatal synaptic plasticity. This suggests that dopamine could regulate synaptic activity in the striatum via modulation of BDNF / TrkB function. To answer these questions, we have developed a sensitive and reliable protocol for the immunohistochemical detection of endogenous BDNF. We find that the majority of striatal BDNF is provided by glutamatergic, cortex derived afferents and not dopaminergic inputs from the midbrain. In fact, we found BDNF in cell bodies of neurons in layers II-III and V of the primary and secondary motor cortex as well as layer V of the somatosensory cortex. These are the brain areas that send dense projections to the dorsolateral striatum for control of voluntary movement. Furthermore, we could show that these projection neurons significantly downregulate the expression of BDNF during the juvenile development of mice between 3 and 12 weeks. In parallel, we found a modulatory effect of dopamine on the translocation of TrkB to the cell surface in postsynaptic striatal Medium Spiny Neurons (MSNs). In MSNs of the direct pathway (dMSNs), which express dopamine receptor 1 (DRD1), we observed the formation of TrkB aggregates in the 6-hydroxydopamine (6-OHDA) model of PD. This suggests that DRD1 activity controls TrkB surface expression in these neurons. In contrast, we found that DRD2 activation has opposite effects in MSNs of the indirect pathway (iMSNs). Activation of DRD2 promotes a rapid decrease in TrkB surface expression which was reversible and depended on cAMP. In parallel, stimulation of DRD2 led to induction of phospho-TrkB (pTrkB). This effect was significantly slower than the effect on TrkB surface expression and indicates that TrkB is transactivated by DRD2. Together, our data provide evidence that dopamine triggers dual modes of plasticity on striatal MSNs by acting on TrkB surface expression in DRD1 and DRD2 expressing MSNs. This surface expression of the receptor is crucial for the binding of BDNF, which is released from corticostriatal afferents. This leads to the induction of TrkB-mediated downstream signal transduction cascades and long-term potentiation (LTP). Therefore, the dopamine-mediated translocation of TrkB could be a mediator that modulates the balance between dopaminergic and glutamatergic signaling to allow synaptic plasticity in a spatiotemporal manner. This information and the fact that TrkB is segregated to persistent aggregates in PD could help to improve our understanding of voluntary movement control and to develop new therapeutic strategies beyond those focusing on dopaminergic supply. N2 - Der fortschreitende Verlust der willkürlichen Bewegungskontrolle ist ein zentrales Symptom der Parkinson-Krankheit (PD). Auch heute sind wir noch nicht in der Lage, PD zu heilen. Dafür verantwortlich ist hauptsächlich ein mangelndes Verständnis von Mechanismen der Bewegungskontrolle, Netzwerkaktivität und Plastizität in motorischen Schaltkreisen, insbesondere zwischen Hirnrinde und Striatum. Der neurotrophe Faktor BDNF ist einer der wichtigsten Faktoren für die Entwicklung und das Überleben von Neuronen sowie für synaptische Plastizität im zentralen Nervensystem. BDNF ist daher ein Target für die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien gegen neurodegenerative Erkrankungen. Zusammen mit seinem Rezeptor, der Tropomyosin-Rezeptorkinase B (TrkB), ist BDNF maßgeblich an der Entwicklung und Funktion des Striatums beteiligt. Dennoch ist nur wenig bekannt, wo BDNF an Synapsen im Striatum lokalisiert ist, und wo BDNF in Neuronen der Hirnrinde synthetisiert wird. Außerdem ist der Einfluss von Dopamin aus dem Mittelhirn auf die Kontrolle der BDNF / TrkB-Interaktion in striatalen Medium-Spiny-Neuronen (MSNs) bisher unklar. Dopamin scheint jedoch eine wichtige Rolle zu spielen, da dessen Abwesenheit zu drastischen Veränderungen der striatalen Plastizität führt. Dopamin könnte synaptische Plastizität im Striatum über eine Modulation der BDNF / TrkB-Interaktion regulieren. Um diese Fragen beantworten zu können, haben wir ein sensitives und zuverlässiges Protokoll für den immunhistochemischen Nachweis von endogenem BDNF entwickelt. Wir fanden heraus, dass BDNF im Striatum vor allem in glutamatergen Synapsen von Projektion aus dem Kortex lokalisiert ist und nicht in Terminalen dopaminerger Neurone aus dem Mittelhirn. Tatsächlich fanden wir BDNF in den Zellkörpern von Neuronen in den Schichten II-III und V des primären und sekundären motorischen Kortex sowie Schicht V des somatosensorischen Kortex. Es sind jene Hirnareale, welche dichte Projektionen zum dorsolateralen Striatum senden und entscheidend an der Steuerung von willkürlichen Bewegungen beteiligt sind. Weiterhin konnten wir zeigen, dass eben jene Projektionsneurone die Bildung von BDNF während der juvenilen Entwicklung von Mäusen zwischen 3 und 12 Wochen signifikant herunter regulieren. In striatalen MSN fanden wir zudem einen modulatorischen Effekt von Dopamin auf die Translokation von TrkB zur Zelloberfläche. In MSNs des direkten Signalweges (dMSNs), welche Dopaminrezeptor 1 (DRD1) exprimieren, konnten wir die Bildung von TrkB-Aggregaten im 6-Hydroxydopamin (6-OHDA) - Rattenmodell der Parkinson Erkankung beobachten. Dies deutet darauf hin, dass die DRD1-Aktivität die TrkB-Oberflächenexpression in diesen Neuronen steuert. Im Gegensatz dazu fanden wir heraus, dass die DRD2-Aktivierung in MSNs des indirekten Signalweges (iMSNs) eine gegensätzliche Wirkung hat. Die Aktivierung von DRD2 führt zu einer schnellen Reduktion der TrkB-Oberflächenexpression, die reversibel und von cAMP abhängig ist. Außerdem führte die Stimulation von DRD2 zu einer Induktion von Phospho-TrkB (pTrkB). Dieser Effekt war deutlich langsamer als die Wirkung auf die TrkB-Oberflächenexpression und deutet auf eine Transaktivierung von TrkB über DRD2 hin. Insgesamt scheint Dopamin entgegengesetzte Plastizitätsmodi in striatalen MSNs auszulösen, indem es auf die TrkB-Oberflächenexpression in DRD1- und DRD2-exprimierenden MSNs einwirkt. Diese Oberflächenexpression des Rezeptors ist entscheidend für die Bindung von BDNF, welches aus kortiko-striatalen Afferenzen freigesetzt wird. Dies führt zur Induktion von TrkB-vermittelten-Signaltransduktionskaskaden und Langzeitpotenzierung (LTP). Daher könnte die dopamin-vermittelte Translokalisation von TrkB das Gleichgewicht zwischen dopaminergen und glutamatergen Signalen modulieren, um die synaptische Plastizität in einer räumlich-zeitlich abgestimmten Weise zu ermöglichen. Diese Information und die Tatsache, dass TrkB bei PD stabile Aggregate bildet, könnte dazu beitragen, unser Verständnis der willkürlichen Bewegungskontrolle zu verbessern und neue therapeutische Strategien zu entwickeln, die über jene hinausgehen, welche sich auf die dopaminerge Versorgung konzentrieren. KW - Brain-derived neurotrophic factor KW - Parkinson Krankheit KW - Plastizität KW - Motorisches Lernen KW - Basalganglien KW - Brain-derived neurotrophic factor KW - TrkB KW - Basal Ganglia KW - Motor learning KW - Parkinson's disease KW - Synaptic plasticity KW - Striatum KW - Medium spiny neurons KW - Cortico-striatal projection neurons Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-174317 ER - TY - THES A1 - Song, Boyuan T1 - Structural and functional studies of \(Saccharomyces\) \(cerevisiae\) Ccr4-Not complex with Electron microscopy T1 - Strukturelle und funktionelle Untersuchungen von \(Saccharomyces\) \(cerevisiae\) Ccr4-Not Komplexen mittels Elektronenmikroskopie N2 - The degradation of poly-adenosine tails of messenger RNAs (mRNAs) in the eukaryotic cells is a determining step in controlling the level of gene expression. The highly conserved Ccr4-Not complex was identified as the major deadenylation complex in all eukaryotic organisms. Plenty of biochemical studies have shown that this complex is also involved in many aspects of the mRNA metabolism, but we are still lacking the detailed structural information about its overall architecture and conformational states that could help to elucidate its multifunction and the way it is coordinated in the cells. Such information can also provide a basis to finding a possible way of intervention since the complex is also involved in some diseases such as cancer and cardiovascular disorders in humans. Meanwhile, the single particle Cryo-EM method has been through a “resolution revolution” recently due to the use of the newly developed direct electron detectors and has since resolved the high-resolution structures of many macromolecular protein complexes in their near-native state. Therefore, it was employed as a suitable method for studying the Ccr4-Not complex here. In this work, the Falcon 3EC direct detector mounted on the 300kV Titan Krios G3i Cryo-EM was evaluated for its practical performance at obtaining high-quality Cryo-EM data from protein samples of different molecular sizes. This served as a proof of principle for this detector’s capabilities and as a data collection guidance for studying the macromolecular complexes, such as the Ccr4-Not, when using an advanced high-performance microscope system. Next, the endogenous yeast Ccr4-Not complex was also purified via the immunoaffinity purification method and evaluated using negative staining EM to assess the conditions of the complex before proceeding to sample preparation for Cryo-EM. This has shown that the complex had an unexpected inherently dynamic property in vitro and extra optimisation procedures were needed to stabilise the complex during the purification and sample preparation. In addition, by using the label-free quantitative Mass spectrometry to examine the coimmunoprecipitated complex via different tagged subunits, it was deduced that two of the subunits (Not3/Not5) that shared some sequence similarity might compete for association with the scaffold subunit of the complex. An uncharacterised protein was also identified coimmunoprecipitating with the Caf130 subunit of the yeast complex. Cryo-EM data from the purified complex provided a low-resolution map that represents a surprisingly smaller partial complex as compared to 3D structures from previous studies, although gel electrophoresis and Mass spectrometry data have identified all of the nine subunits of the Ccr4-Not core complex in the sample. It was concluded that due to the presence of many predicted unstructured regions VI in the subunits and their dynamic composition in solution, the native complex could have been spontaneously denatured at the air/water interface during the sample preparation thus limiting the resolution of the Cryo-EM reconstruction. The purified complex was also examined for its deadenylase and ubiquitin ligase activity by in vitro assays. It was shown that the native complex has a different rate of activity and possibly also a different mode of action compared to the recombinant complexes from other species under similar reaction conditions. The Not4 E3 ligase was also shown to be active in the complex and was likely auto-ubiquitinated in the absence of a substrate. Both types of assays have also shown that the conformational flexibility does not seem to affect the enzymatic reactions when using a chemically crosslinked form of the complex for the assay, which implies that there can be other underlying mechanisms coordinating its structural and functional relationship. The findings from this work have therefore moved our understanding of the Ccr4-Not complex forward by looking at the different structural and functional behaviours of the endogenous complex, especially highlighting the obstacles in sample preparation for the native complex in high-resolution Cryo-EM. This would serve as foundation for future studies on the mechanism of this complex’s catalytic functions and also for optimising the Cryo-EM sample to generate better data that could eventually resolve the structure to a high-resolution. N2 - Der Abbau des Poly(A)-Schwanzes von Messenger-RNAs (mRNA) in den eukaryotischen Zellen ist ein entscheidender Schritt bei der Kontrolle des Niveaus der Genexpression. Der hochkonservierte Ccr4-Not-Komplex wurde in allen eukaryotischen Organismen als der Hauptdeadenylierungskomplex identifiziert. Zahlreiche biochemische Studien haben gezeigt, dass dieser Komplex auch an vielen Aspekten des mRNA-Metabolismus beteiligt ist. Uns fehlen jedoch noch die detaillierten Strukturinformationen über seine Gesamtarchitektur und seine Konformationszustände, die zur Aufklärung seiner Multifunktion und seiner Koordinierung in den Zellen beitragen könnten. Solche Informationen können auch Grundlage für die Suche nach einem möglichen Interventionsweg bieten, da der Komplex auch an einigen Krankheiten wie Krebs und Herz-Kreislauf-Erkrankungen des Menschen beteiligt ist. In der Zwischenzeit hat die Einzelpartikel-Kryo-EM-Methode aufgrund der Verwendung der neu entwickelten direkten Elektronendetektoren kürzlich eine „Auflösungsrevolution“ durchlaufen und seitdem die hochauflösenden Strukturen vieler makromolekularer Proteinkomplexe in ihrem nahezu nativen Zustand aufgelöst. Daher wurde es hier als geeignete Methode zur Untersuchung des Ccr4-Not-Komplexes eingesetzt. In dieser Arbeit wurde der Falcon 3EC-Direktdetektor, der an das 300-kV-Titan Krios G3i Kryo-EM montiert ist, auf seine praktische Leistung bei der Gewinnung hochwertiger Kryo-EM-Daten aus Proteinproben unterschiedlicher Molekülgröße untersucht. Dies diente als Grundsatznachweis für die Fähigkeiten des Detektors und als Leitfaden für die Datenerfassung zur Untersuchung der makromolekularen Komplexe wie Ccr4-Not bei Verwendung eines fortschrittlichen Hochleistungsmikroskopsystems. Als nächstes wurde der endogene Hefe-Ccr4-Not-Komplex auch über das Immunaffinitäts-Reinigungsverfahren gereinigt und unter Verwendung einer negativ gefärbten EM bewertet, um die Bedingungen des Komplexes zu bewerten, bevor mit der Probenvorbereitung für Kryo-EM fortgefahren wurde. Dies hat gezeigt, dass der Komplex in vitro eine unerwartete inhärent dynamische Eigenschaft aufwies und zusätzliche Optimierungsverfahren erforderlich waren, um den Komplex während der Reinigung und Probenvorbereitung zu stabilisieren. Darüber hinaus wurde unter Verwendung der markierungsfreien quantitativen Massenspektrometrie zur Untersuchung des co-immunpräzipitierten Komplexes über verschiedene markierte Untereinheiten abgeleitet, dass zwei der Untereinheiten (Not3 / Not5), die eine gewisse Sequenzähnlichkeit teilen, um die Verbindung mit der Gerüstuntereinheit des Komplexes konkurrieren könnten. Es wurde auch ein nicht charakterisiertes Protein identifiziert, das zusammen mit der Caf130-Untereinheit des Hefekomplexes immunpräzipitiert. Kryo-EM-Daten aus dem gereinigten Komplex lieferten eine Karte mit niedriger Auflösung, die im Vergleich zu 3D-Strukturen aus früheren Studien einen überraschend kleineren Teilkomplex darstellt, obwohl Gelelektrophorese- und Massenspektrometriedaten gezeigt haben, dass alle neun Untereinheiten des Ccr4-Not Kernkomplexware in der Probe vorhanden waren. Daraus kann man schließen, dass aufgrund des Vorhandenseins vieler vorhergesagter unstrukturierter Regionen in den Untereinheiten und ihrer dynamischen Zusammensetzung in Lösung der native Komplex während der Probenvorbereitung an der Luft / Wasser-Grenzfläche spontan denaturiert werden konnte, wodurch die Auflösung des Kryo-EM Wiederaufbaus begrenzt wurde. Der gereinigte Komplex wurde auch durch In-vitro-Tests auf seine Deadenylase- und Ubiquitin-Ligase-Aktivität untersucht. Es wurde aufgezeigt, dass der native Komplex eine andere Aktivitätsrate und möglicherweise auch eine andere Wirkungsweise aufweist als die rekombinanten Komplexe anderer Spezies unter ähnlichen Reaktionsbedingungen. Es wurde auch dargestellt, dass die Not4 E3-Ligase in dem Komplex aktiv ist und wahrscheinlich in Abwesenheit eines Substrats automatisch ubiquitiniert wird. Beide Arten von Assays haben auch gezeigt, dass die Konformationsflexibilität die enzymatischen Reaktionen bei Verwendung einer chemisch vernetzten Form des Komplexes für den Assay nicht zu beeinflussen scheint, was impliziert, dass es andere zugrunde liegende Mechanismen geben kann, die seine strukturelle und funktionelle Beziehung koordinieren. Die Ergebnisse dieser Arbeit haben daher unser Verständnis des Ccr4-Not-Komplexes weiterentwickelt, indem wir die unterschiedlichen strukturellen und funktionellen Verhaltensweisen des endogenen Komplexes untersucht und insbesondere die Hindernisse bei der Probenvorbereitung für den nativen Komplex im hochauflösendem Kryo-EM hervorgehoben haben. Dies würde als Grundlage für zukünftige Forschungen dienen, die Mechanismen seiner katalytischen Funktionen weiter zu untersuchen und auch die Kryo-EM-Probe zu optimieren, um bessere Daten zu generieren, die die Struktur schließlich in eine hohe Auflösung auflösen könnten. KW - CCR4 KW - Ccr4-Not KW - biochemistry KW - electron microscopy Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-216527 ER - TY - THES A1 - Anton, Selma T1 - Characterization of cAMP nanodomains surrounding the human Glucagon-like peptide 1 receptor using FRET-based reporters T1 - Charakterisierung der Rezeptor-assoziierten cAMP Nanodomänen des humanen Glucagon-like peptide 1 Rezeptors mittels FRET-basierter Sensoren N2 - Cyclic adenosine monophosphate (cAMP), the ubiquitous second messenger produced upon stimulation of GPCRs which couple to the stimulatory GS protein, orchestrates an array of physiological processes including cardiac function, neuronal plasticity, immune responses, cellular proliferation and apoptosis. By interacting with various effector proteins, among others protein kinase A (PKA) and exchange proteins directly activated by cAMP (Epac), it triggers signaling cascades for the cellular response. Although the functional outcomes of GSPCR-activation are very diverse depending on the extracellular stimulus, they are all mediated exclusively by this single second messenger. Thus, the question arises how specificity in such responses may be attained. A hypothesis to explain signaling specificity is that cellular signaling architecture, and thus precise operation of cAMP in space and time would appear to be essential to achieve signaling specificity. Compartments with elevated cAMP levels would allow specific signal relay from receptors to effectors within a micro- or nanometer range, setting the molecular basis for signaling specificity. Although the paradigm of signaling compartmentation gains continuous recognition and is thoroughly being investigated, the molecular composition of such compartments and how they are maintained remains to be elucidated. In addition, such compartments would require very restricted diffusion of cAMP, but all direct measurements have indicated that it can diffuse in cells almost freely. In this work, we present the identification and characterize of a cAMP signaling compartment at a GSPCR. We created a Förster resonance energy transfer (FRET)-based receptor-sensor conjugate, allowing us to study cAMP dynamics in direct vicinity of the human glucagone-like peptide 1 receptor (hGLP1R). Additional targeting of analogous sensors to the plasma membrane and the cytosol enables assessment of cAMP dynamics in different subcellular regions. We compare both basal and stimulated cAMP levels and study cAMP crosstalk of different receptors. With the design of novel receptor nanorulers up to 60nm in length, which allow mapping cAMP levels in nanometer distance from the hGLP1R, we identify a cAMP nanodomain surrounding it. Further, we show that phosphodiesterases (PDEs), the only enzymes known to degrade cAMP, are decisive in constraining cAMP diffusion into the cytosol thereby maintaining a cAMP gradient. Following the discovery of this nanodomain, we sought to investigate whether downstream effectors such as PKA are present and active within the domain, additionally studying the role of A-kinase anchoring proteins (AKAPs) in targeting PKA to the receptor compartment. We demonstrate that GLP1-produced cAMP signals translate into local nanodomain-restricted PKA phosphorylation and determine that AKAP-tethering is essential for nanodomain PKA. Taken together, our results provide evidence for the existence of a dynamic, receptor associated cAMP nanodomain and give prospect for which key proteins are likely to be involved in its formation. These conditions would allow cAMP to exert its function in a spatially and temporally restricted manner, setting the basis for a cell to achieve signaling specificity. Understanding the molecular mechanism of cAMP signaling would allow modulation and thus regulation of GPCR signaling, taking advantage of it for pharmacological treatment. N2 - G Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) stellen eine große und sehr vielfältige Familie an Membranproteinen dar, deren primäre Funktion die Signalübertragung von extrazellulären Stimuli in intrazelluläre Signale ist. Dank ihrer breiten Expression im gesamten menschlichen Körper regulieren sie unterschiedliche zelluläre Prozesse und damit deren physiologische Funktion, unter anderem die Sinnesempfindung, zelluläre Kommunikation und Neurotransmission. GPCRs stehen im Zusammenhang mit unterschiedlichen Erkrankungen wie Herzinsuffizienz, Krebs, neurologischen Funktionsstörungen und diverser metabolischer Krankheiten, weswegen sie als Ziele („Targets“) zur Behandlung verschiedener Erkrankungen erforscht und genutzt werden. Aufgrund ihrer Expression auf der Zelloberfläche sind sie leicht zugänglich, und die Diversität ihrer Liganden begünstigt zusätzlich ihre Nutzung als pharmakologische Targets. Heutzutage vermitteln bereits 30% aller weltweit zugelassenen Arzneistoffe ihre Wirkung an GPCRs. GPCRs üben ihre Funktion aus, indem sie hauptsächlich an G Proteine binden, welche wiederum die Produktion sogenannter second messenger in Gang setzen. cAMP ist das Hauptsignalmolekül der Rezeptoren, welche an das stimulatorische GS Protein koppeln. cAMP überträgt hunderte ankommende Signale in einer hochspezifischen Weise, indem es an unterschiedliche Effektorproteine bindet, welche sich in bestimmten zellulären Regionen befinden. Dadurch koordiniert dieses Signalmolekül eine Vielzahl zellulärer Prozesse, angefangen bei der Regulierung von Ionenkanalaktivität über die Kontraktilität glatter- und quergestreifter Muskulatur bis hin zur Genexpression, Zellproliferation und Apoptose. Durch die pleiotropen Effekte, welche durch cAMP reguliert werden, stellt sich die Frage, wie GS-gekoppelte Rezeptoren Signalspezifität erreichen, obwohl sie ihre Funktion durch dieses eine Signalmolekül ausführen. Ursprünglich ging man von einer uneingeschränkten Diffusion und dadurch homogenen Verteilung von cAMP in der Zelle aus. Diese Vorstellung ist jedoch nicht mit der Signalisierungsspezifität von GPCRs vereinbar, da unter diesen Umständen cAMP unselektiv all seine Effektorproteine in der gesamten Zelle aktivieren könnte. Daher entstand die Hypothese der cAMP-Kompartimentierung, wobei die Zelle lokal begrenzte Bereiche mit hohen oder niedrigen cAMP Konzentrationen umfassen würde. Jedoch gab es bisher keinerlei Beweise für die Existenz und die molekulare Zusammensetzung mutmaßlicher Domänen. Folglich setzten wir uns als Ziel, hochkonzentrierte cAMP-Kompartimente in der Zelle zu lokalisieren, ihre räumliche Dimension aufzuklären und ihre Rolle zur Realisierung zellulärer Signalisierungsspezifität zu ermitteln. Im Rahmen der vorliegenden Studie setzten wir einen Förster resonance energy transfer (FRET)-basierten cAMP Sensor ein, fusionierten ihn mit dem humanen glucagone-like peptide 1 Rezeptor (hGLP1R) als Prototyp eines GS-koppelnden Rezeptors, um cAMP am Ursprung des Signals zu messen. Mittels dieser Sensoren weisen wir eine Rezeptor-umgebende begrenzte cAMP Domäne nach, welche eine erhöhte cAMP Konzenztration aufweist (Figure ‎3.10). Bei Stimulation des Rezeptors mit GLP1 Konzenztrationen beginnend bei 10 fM entsteht eine Rezeptordomäne mit lokal erhöhten cAMP Konzentrationen, welche getrennt von Plasmamembran und Cytosol ist. Wir zeigen, dass das hGLP1R-Kompartiment geschützt ist vor cAMP Signalen, welche an weiteren, unabhängigen GS-gekoppelten Rezeptoren ihren Ursprung haben (Figure ‎3.11). Um die räumliche Dimension dieser Domäne zu untersuchen, verwendeten wir Nanolinker der Länge 30- und 60 nm als Abstandhalter zwischen Rezeptor und Sensor (Figure ‎3.12) und zeigen dabei, dass sich die Domäne über eine Länge von 60 Nanometern erstreckt, wobei ein abnehmender cAMP-Gradient erkennbar ist. Weiterhin beweisen wir, dass Phosphodiesterasen (PDEs) Schlüsselfaktoren für die Bildung des cAMP-Gradienten um den Rezeptor herum sind, indem sie die Diffusion ins Cytosol beschränken (Figure ‎3.13). Darüber hinaus zeigen wir (Figure ‎3.15), dass Rezeptor-spezifische cAMP Signale PKA-Phosphorylierung in der Rezeptordomäne auslösen und, dass AKAPs elementar für nanodomänen PKA-Aktivität sind, wohingegen die cytosolische PKA-Phosphorylierung unabhängig von AKAP-Targeting der PKA ist (Figure ‎3.16). Zusammenfassend beweisen unsere Ergebnisse die Existenz einer Rezeptor-umgebenden Nanodomäne mit erhöhten cAMP Spiegeln eines GS-gekoppelten Rezeptors. Zeitgleiche Studien in unserer Gruppe zeigen, dass cAMP in der Zelle weitgehend gebunden vorliegt und diffusionslimitiert ist. Dies stellt den Nachweis für eine eingeschränkte Diffusion als molekulare Voraussetzung für die Bildung von Signalkompartimenten dar. Wir gehen davon aus, dass unsere Ergebnisse ein Ausgangspunkt für die Aufklärung von Rezeptoren als Quelle für Signalkompartimente darstellen, jedoch bedarf es weiterer Studien, um die präzise molekulare Zusammensetzung und die beteiligten Proteine dieser Signaldomäne zu untersuchen. Das Grundverständnis der Signalisierungskaskaden auf molekularer Ebene könnte es uns ermöglichen, die zellulären Reaktionen zu manipulieren, um eine Fehlfunktion der Signalisierung in erkrankten Zellen wiederherzustellen. Da der hGLP1R entscheidend für Aufrechterhaltung ausgeglichener Blutglucosespiegel ist, würde die Erfassung der molekularen Details der kompartimentalisierten Signalübertragung die Feinabstimmung der Rezeptorsignale ermöglichen, um ihn als spezifisches Target zur Behandlung von Diabetes Mellitus einzusetzen. KW - FRET KW - cAMP KW - compartments KW - GPCR Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-190695 ER - TY - THES A1 - Riechelmann [verh. Steinbacher], Eva Katharina T1 - Gaze interaction: Cognitive mechanisms of oculomotor action control T1 - Blickinteraktion: Kognitive Mechanismen der okulomotorischen Handlungskontrolle N2 - Humans use their eyes not only as visual input devices to perceive the environment, but also as an action tool in order to generate intended effects in their environment. For instance, glances are used to direct someone else's attention to a place of interest, indicating that gaze control is an important part of social communication. Previous research on gaze control in a social context mainly focused on the gaze recipient by asking how humans respond to perceived gaze (gaze cueing). So far, this perspective has hardly considered the actor’s point of view by neglecting to investigate what mental processes are involved when actors decide to perform an eye movement to trigger a gaze response in another person. Furthermore, eye movements are also used to affect the non-social environment, for instance when unlocking the smartphone with the help of the eyes. This and other observations demonstrate the necessity to consider gaze control in contexts other than social communication whilst at the same time focusing on commonalities and differences inherent to the nature of a social (vs. non-social) action context. Thus, the present work explores the cognitive mechanisms that control such goal-oriented eye movements in both social and non-social contexts. The experiments presented throughout this work are built on pre-established paradigms from both the oculomotor research domain and from basic cognitive psychology. These paradigms are based on the principle of ideomotor action control, which provides an explanatory framework for understanding how goal-oriented, intentional actions come into being. The ideomotor idea suggests that humans acquire associations between their actions and the resulting effects, which can be accessed in a bi-directional manner: Actions can trigger anticipations of their effects, but the anticipated resulting effects can also trigger the associated actions. According to ideomotor theory, action generation involves the mental anticipation of the intended effect (i.e., the action goal) to activate the associated motor pattern. The present experiments involve situations where participants control the gaze of a virtual face via their eye movements. The triggered gaze responses of the virtual face are consistent to the participant’s eye movements, representing visual action effects. Experimental situations are varied with respect to determinants of action-effect learning (e.g., contingency, contiguity, action mode during acquisition) in order to unravel the underlying dynamics of oculomotor control in these situations. In addition to faces, conditions involving changes in non-social objects were included to address the question of whether mechanisms underlying gaze control differ for social versus non-social context situations. The results of the present work can be summarized into three major findings. 1. My data suggest that humans indeed acquire bi-directional associations between their eye movements and the subsequently perceived gaze response of another person, which in turn affect oculomotor action control via the anticipation of the intended effects. The observed results show for the first time that eye movements in a gaze-interaction scenario are represented in terms of their gaze response in others. This observation is in line with the ideomotor theory of action control. 2. The present series of experiments confirms and extends pioneering results of Huestegge and Kreutzfeldt (2012) with respect to the significant influence of action effects in gaze control. I have shown that the results of Huestegge and Kreutzfeldt (2012) can be replicated across different contexts with different stimulus material given that the perceived action effects were sufficiently salient. 3. Furthermore, I could show that mechanisms of gaze control in a social gaze-interaction context do not appear to be qualitatively different from those in a non-social context. All in all, the results support recent theoretical claims emphasizing the role of anticipation-based action control in social interaction. Moreover, my results suggest that anticipation-based gaze control in a social context is based on the same general psychological mechanisms as ideomotor gaze control, and thus should be considered as an integral part rather than as a special form of ideomotor gaze control. N2 - Der Mensch nutzt die Augen nicht nur zur Wahrnehmung seiner Umwelt, sondern auch als Handlungsinstrument, um intendierte Effekte in seiner Umwelt zu erzeugen. So werden Blicke beispielsweise dazu verwendet, die Aufmerksamkeit eines anderen auf einen bestimmten Ort zu lenken. Dies weist darauf hin, dass Blickkontrolle einen wichtigen Bestandteil in der sozialen Kommunikation darstellt. Die Forschung zu Blickkontrolle im sozialen Kontext hat sich bisher hauptsächlich auf den Blick-Empfänger konzentriert, um die Frage zu beantworten, wie Menschen auf wahrgenommene Blicke reagieren (Gaze Cueing). Dieser Ansatz hat dementsprechend bisher kaum den Standpunkt des Blick-Senders berücksichtigt. So wurde beispielsweise noch nicht untersucht, welche mentalen Prozesse der Ausübung einer Augenbewegung zugrunde liegen, die zum Ziel hat, bei einer anderen Person eine bestimmte Blickreaktion auszulösen. Darüber hinaus werden zielgerichtete Augenbewegungen auch im nicht-sozialen Kontext eingesetzt, beispielsweise beim Entsperren des Smartphones mithilfe der Augen. Diese und andere Beobachtungen zeigen allerdings klar die Notwendigkeit, Blickkontrolle sowohl in der sozialen Kommunikation als auch in anderen, nicht-sozialen Kontexten zu berücksichtigen und dabei gleichzeitig auf Gemeinsamkeiten und Unterschiede zu achten, die der Natur eines sozialen (vs. nicht-sozialen) Handlungskontextes innewohnen. Die vorliegende Arbeit untersucht daher die kognitiven Mechanismen, die solchen zielgerichteten Blickbewegungen in sozialen wie in nicht-sozialen Kontexten zugrunde liegen. Die in der vorliegenden Arbeit vorgestellten Experimente bauen auf bereits etablierten Paradigmen aus der Forschung zu Okulomotorik und zu basalen kognitiven Prozessen auf. Diese Paradigmen basieren auf dem Prinzip der ideomotorischen Handlungskontrolle, das eine Erklärung für die Entstehung zielgerichteter und beabsichtigter Handlungen liefert. Der ideomotorische Gedanke legt nahe, dass Menschen Assoziationen zwischen ihren Handlungen und den daraus resultierenden Effekten erwerben, die in zwei Richtungen wirken können: Eine Handlung kann die Antizipation ihrer Effekte auslösen, aber die aktive Antizipation eines Handlungseffektes kann auch die damit verbundene Handlung auslösen. Nach der ideomotorischen Theorie beinhaltet Handlungsgenerierung die mentale Antizipation des beabsichtigten Handlungseffektes, um das zugehörige motorische Muster zu aktivieren. Die vorliegenden Experimente beinhalten Situationen, in denen die Probanden den Blick eines virtuellen Gesichts mithilfe ihre eigenen Augenbewegungen steuern. Die im virtuellen Gesicht ausgelösten Blickreaktionen repräsentieren die visuellen Handlungseffekte. Die Situationen werden in Bezug auf die Determinanten von Handlungs-Effekt-Lernen (Kontingenz, Kontiguität, Handlungsmodus während des Lernens) variiert, um die zugrundeliegende Dynamik der okulomotorischen Handlungskontrolle in diesen Situationen zu verstehen. Zusätzlich zu den Gesichtern wurden Handlungseffekte in nicht-sozialen Objekten untersucht, um die Frage zu klären, ob sich die der Blickkontrolle zugrundeliegenden Mechanismen für soziale und nicht-soziale Kontextsituationen unterscheiden. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit lassen sich in drei Hauptergebnisse zusammenfassen. 1. Meine Resultate legen nahe, dass Menschen bi-direktionale Assoziationen zwischen ihren Augenbewegungen und der darauf folgenden Blickreaktion einer anderen Person erwerben, was über die Antizipation der beabsichtigten Effekte die okulomotorische Handlungssteuerung beeinflusst. Die beobachteten Ergebnisse zeigen zum ersten Mal, dass Augenbewegungen in einem Blickinteraktionsszenario in Form einer bei der anderen Person ausgelösten Blickreaktion repräsentiert werden. Diese Beobachtung steht im Einklang mit dem ideomotorischen Prinzip der Handlungskontrolle. 2. Die vorliegende Versuchsreihe belegt und erweitert die wegweisenden Ergebnisse von Huestegge und Kreutzfeldt (2012) in Bezug auf den bedeutenden Einfluss von Handlungseffekten in der okulomotorischen Handlungskontrolle. Ich konnte zeigen, dass sich die Ergebnisse von Huestegge und Kreutzfeldt (2012) über verschiedene Kontexte mit unterschiedlichem Stimulus-Material replizieren lassen unter der Bedingung, dass die wahrgenommenen Handlungseffekte ausreichend stark ausgeprägt waren. 3. Zudem konnte ich zeigen, dass sich Mechanismen der Blickkontrolle in einem sozialen Blickinteraktionskontext vermutlich nicht qualitativ von denen in einem nicht-sozialen Kontext unterscheiden. Zusammenfassend unterstützen die Ergebnisse die jüngsten theoretischen Überlegungen, die die Rolle von antizipativen Prozessen in der Handlungssteuerung in sozialen Interaktionskontexten betonen. Darüber hinaus legen meine Ergebnisse nahe, dass antizipationsbasierte Blickkontrolle im sozialen Kontext auf den gleichen allgemeinen psychologischen Mechanismen wie ideomotorische Blickkontrolle basiert und somit als integraler Bestandteil, und nicht als eine spezielle Form der ideomotorischen Blickkontrolle, betrachtet werden sollte. KW - Verhaltenskontrolle KW - Blickbewegung KW - Kognition KW - Ideomotorische Blickkontrolle KW - Soziomotorische Blickkontrolle KW - Blickinteraktion KW - Soziale Handlungseffekte KW - Effektantizipation KW - Ideomotor gaze control KW - Sociomotor gaze control KW - Gaze interaction KW - Social action effects KW - Effect anticipation KW - Ideomotorik Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-215279 ER - TY - THES A1 - Mony Nair, Rahul T1 - Elucidating ubiquitin recognition by the HECT-type ubiquitin ligase HUWE1 T1 - Studien zur Ubiquitinerkennung durch die HECT-Typus Ubiquitinligase HUWE1 N2 - The small protein modifier ubiquitin is at the heart of an immensely versatile posttranslational modification system that orchestrates countless physiological and disease-associated cellular processes. Key to this versatility are the manifold modifications that can be assembled from ubiquitin “building blocks” and are associated with specific functional outcomes for the modified substrates. In particular, ubiquitin molecules can form polymeric chains of distinct lengths and linkage types that give rise to distinct chain conformations, thereby providing recognition sites for specific signaling receptors/effectors. The class of E3 enzymes (ubiquitin ligases) provides critical specificity determinants in ubiquitin linkage formation; it is therefore crucial to unravel precisely how E3 enzymes operate in order to understand the structural basis of ubiquitin signaling and exploit these insights for therapeutic benefit. Overexpression and deregulation of the HECT-type ubiquitin ligase HUWE1 is implicated in several different cancer types and neurodegenerative disorders. It is largely unknown which factors control the ubiquitin modifications formed by HUWE1, how the catalytic HECT domain interacts with functionally distinct ubiquitin molecules (donor, acceptor and regulatory ubiquitin molecules) and which conformational transitions enable these interactions during ubiquitin chain formation. One aim of this study was to structurally elucidate the recognition of donor ubiquitin by the HECT domain of HUWE1. To this end I utilized a ubiquitin activity-based probe to reconstitute a proxy for a donor ubiquitin-linked conjugate of the HECT domain of HUWE1 and determined its structure by X-ray crystallography. This structure reveals that the donor ubiquitin binds to the C-lobe of HUWE1 in the same way as NEDD4-type ligases, corroborating the idea that HECT ligases utilize a conserved mode of donor ubiquitin recognition. independent of their linkage and substrate specificities. With the help of biochemical analyses, I also validated specific features of the structure, in particular the positioning of the C-terminal tail of the ligase, which was known to be critical for activity. In the newly determined structure, which reflects an “L-shaped”, active state of the HECT domain, this tail is fully resolved and coordinated at the N-lobe-C-lobe interface. I defined residues that are critical for this coordination and showed that they are also essential for the activity of HUWE1, including auto-ubiquitination, free ubiquitin chain formation, and substrate ubiquitination. Furthermore, I discovered that the N-lobe of HUWE1 harbors a ubiquitin-binding exosite similar to NEDD4-type ligases and E6AP. My in-vitro activity and binding assays show that HUWE1 uses the exosite for isopeptide bond formation, but that it is dispensable for thioester bond formation. The binding assays further show that the donor ubiquitin loaded HECT domain binds an additional ubiquitin molecule at the exosite more tightly than the apo HECT domain, which possibly suggests allosteric communication between the two sites. Finally, I showed that the ubiquitin activity-based probe (ubiquitin-propargylamine) can label the catalytic cysteine of HUWE1 and NEDD4-type with close to quantitative turn- over, while it does not react with the HECT domain of the evolutionarily more divergent E6AP. The determinants underlying these differential reactivities remain to be explored. Taken, together my results significantly enhance our mechanistic understanding of the catalytic domain of HUWE1 and pinpoint linchpins for therapeutic interventions with the activity of this disease-relevant enzyme. N2 - Der kleine Proteinmodifikator Ubiquitin ist das Herzstück eines immens vielseitigen posttranslationalen Modifikationssystems, das unzählige physiologische und krankheitsassoziierte zelluläre Prozesse orchestriert. Der Schlüssel zu dieser Vielseitigkeit sind die vielfältigen Modifikationen, die sich aus Ubiquitin-"Bausteinen" zusammensetzen lassen und mit spezifischen funktionellen Ergebnissen für die modifizierten Substrate verbunden sind. Insbesondere können Ubiquitin-Moleküle Ketten unterschiedlicher Länge und Verknüpfungstypen bilden, die zu unterschiedlichen Kettenkonformationen führen und dadurch Erkennungsstellen für spezifische Signalrezeptoren/-effektoren bieten. Die Klasse der E3-Enzyme (Ubiquitin-Ligasen) liefert kritische Spezifitätsdeterminanten für die Bildung von Ubiquitin-Bindungen; daher ist es entscheidend, die genaue Funktionsweise der E3-Enzyme zu entschlüsseln, um die strukturelle Grundlage der Ubiquitin-Signalisierung zu verstehen und diese Erkenntnisse für therapeutische Anwendungen zu nutzen. Die Überexpression und Deregulierung der Ubiquitin-Ligase HUWE1 aus der Klasse der HECT-E3-Ligasen ist an mehreren verschiedenen Krebsarten und neurodegenerativen Erkrankungen beteiligt. Es ist weitgehend unbekannt, welche Faktoren durch die von HUWE1 gebildeten Ubiquitin-Modifikationen kontrolliert werden, wie die katalytische HECT-Domäne mit funktionell unterschiedlichen Ubiquitin-Molekülen (Donor-, Akzeptor- und regulatorische Ubiquitin-Moleküle) interagiert und welche Konformationsübergänge diese Interaktionen während der Ubiquitin-Kettenbildung ermöglichen. Ein Ziel dieser Studie war es, die Erkennung des Donor-Ubiquitin-Moleküls durch die HECT-Domäne von HUWE1 strukturell aufzuklären. Zu diesem Zweck verwendete ich eine ´ubiquitin activity-based probe´, um ein Konjugat der HUWE1-HECT-Domäne mit einem Donor-Ubiquitin-Molekül zu rekonstitutieren und die Struktur mittels Röntgenkristallographie zu bestimmen. Diese Struktur zeigte, dass das Donor-Ubiquitin-Molekül auf die gleiche Weise an den C-lobe von HUWE1 bindet wie die Klasse der NEDD4-Ligasen, was die Idee bestätigt, dass HECT-Ligasen einen vergleichbaren Mechanismus bei der Donor-Ubiquitin-Erkennung verwenden, unabhängig von ihrer Bindung und Substratspezifität. Mit Hilfe biochemischer Analysen validierte ich auch spezifische Merkmale der Struktur, insbesondere die Positionierung des C-terminal tail der Ligase, der entscheidend für die Aktivität ist. In der neu bestimmten Struktur, die einen "L-förmigen", aktiven Zustand der HECT-Domäne widerspiegelt, ist der C-terminal tail an der Grenzfläche von N-lobe und C-lobe vollständig aufgelöst und koordiniert. Ich konnte Seitenketten festmachen, die für diese Koordination kritisch sind, und habe gezeigt, dass sie auch für die Aktivität von HUWE1 wesentlich sind, einschließlich der Auto-Ubiquitinierung, der freien Ubiquitin-Kettenbildung und der Substrat-Ubiquitinierung. Darüber hinaus entdeckte ich, dass der N-lobe von HUWE1 eine Ubiquitin-bindende exosite aufweist, ähnlich wie für die Klasse der NEDD4-Ligasen und E6AP. Meine in vitro Aktivitäts- und Bindungstests ergaben, dass HUWE1 die exosite für die Bildung von Isopeptidbindungen verwendet, diese aber für die Bildung von Thioesterbindungen entbehrlich ist. Die Bindungstests zeigten ferner, dass die Donor-Ubiquitin-beladene HECT-Domäne ein zusätzliches Ubiquitin-Molekül an der exosite stärker bindet als die Apo-HECT-Domäne, was möglicherweise auf eine allosterische Kommunikation zwischen den beiden Ubiquitin-Bindestellen hindeutet. Schließlich zeigte ich, dass die ´ubiquitin activity-based probe´ (Ubiquitin-Propargylamin) das katalytische Cystein von HUWE1 und NEDD4 mit nahezu quantitativem Umsatz markieren kann, während es nicht mit der HECT-Domäne des evolutionär stärker divergierenden E6AP reagiert. Die Faktoren, die diesen unterschiedlichen Reaktivitäten zugrunde liegen, müssen noch erforscht werden. Zusammengenommen verbessern meine Ergebnisse unser mechanistisches Verständnis der katalytischen Domäne von HUWE1 und geben uns die Dreh- und Angelpunkte für therapeutische Interventionen mit der Aktivität dieses krankheitsrelevanten Enzyms an die Hand. KW - HUWE1 KW - Ubiquitin-PA Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-221030 ER - TY - THES A1 - Königer, Tobias T1 - The Vessel Wall and Beyond: Characterization of Myeloid Progenitors in the Adult Mouse Brain T1 - Die Gefäßwand und darüber hinaus: Charakterisierung myeloider Vorläufer im adulten Mäusehirn N2 - After almost two decades of extensive research, some controversy has remained regarding the self-renewal of resident macrophages of the central nervous system (CNS). Concurrently, the vessel wall has emerged as a potentially ubiquitous niche for stem and progenitor cells, including committed macrophage precursors. It is conceivable that their occurrence in the CNS might explain the brain-resident hematopoietic potential, which has repeatedly been observed but not yet characterized in detail. In this work, the presence of hematopoietic progenitors inside and outside the vessel wall was studied in the adult mouse brain, as well as their possible contribution to the resident macrophage pool. An immunohistological analysis did not corroborate CD45+ SCA-1+ macrophage progenitors, which have been characterized in peripheral arteries, in the circle of Willis. Accordingly, the ex vivo culture of CNS vessels did not provide evidence for de novo formation of macrophages, but for the extensive proliferative capacity of mature cells. However, when analyzing whole brain suspensions in colony-forming unit (CFU) assays, rare Iba1- Cx3cr1- (immature) clonogenic cells were detected, which were enriched at the cerebral surface/meninges and differentiated into macrophages in culture. Intravenous antibody injection and cell sorting confirmed their residence behind the blood-brain barrier. Intriguingly, brain-derived CFUs produced a unique pattern of colony types compared to cells from bone marrow (BM) or blood. Still they displayed the same immunophenotype as BM-resident myeloid progenitors (CD45lo, LIN-, SCA-1-, IL7Rα-, c-KIT+) and could be further stratified into a progenitor hierarchy giving rise to all erythro-myeloid cell types in vitro. This similarity was substantiated by labeling of their progeny in Flt3Cre x Rosa26mT/mG mice, which indicated a descendance from hematopoietic stem cells. While forced repopulation of brain macrophages using the CSF-1R inhibitor PLX5622 did not point to a role of progenitors in in vivo microglia/macrophage maintenance, recent advances in hematology imply that they might be involved in CNS immunosurveillance. In conclusion, though there was no evidence for adventitial macrophage precursors in the CNS, this study confirms the presence of myeloid progenitors in the adult brain and provides the anatomical and phenotypical details necessary to elucidate their relevance in neuroinflammation. N2 - Nach fast zwei Jahrzehnten intensiver Forschung wird der Selbsterhalt residenter Makrophagen im zentralen Nervensystem (ZNS) immer noch kontrovers diskutiert. Gleichzeitig hat sich die Gefäßwand als eine potentiell ubiquitäre Nische für Stamm- und Vorläuferzellen herausgestellt, einschließlich determinierter Vorläufer für Makrophagen. Dass diese auch im ZNS vorhanden sind, könnte die wiederholten Berichte über hämatopoetisches Potenzial im Gehirn erklären, welches bisher nicht genau charakterisiert wurde. In der vorliegenden Arbeit wurde daher die Existenz hämatopoetischer Vorläuferzellen sowohl innerhalb als auch außerhalb der Gefäßwände des Gehirns erwachsener Mäuse untersucht. Weiterhin wurde deren Beitrag zu residenten Makrophagen-Populationen überprüft. Eine immunhistologische Analyse konnte CD45+ SCA-1+ Makrophagen-Vorläufer, wie sie in peripheren Arterien beschrieben wurden, im Circulus arteriosus Willisii nicht bestätigen. Entsprechend lieferte die Kultur von ZNS-Gefäßen keine Hinweise auf eine Neubildung von Makrophagen, zeigte aber ein hohes Teilungsvermögen reifer Zellen auf. Allerdings wurden in colony-forming unit assays mit Hirnzellsuspensionen seltene Iba1- Cx3cr1- (unreife) klonogene Zellen detektiert, die im Bereich der Hirnhaut angereichert waren und in Kultur zu Makrophagen differenzierten. Eine intravenöse Antikörperinjektion und Zellsortierung belegten, dass sie sich hinter der Blut-Hirn-Schranke befanden. Klonogene Zellen des Hirns erzeugten ein eigentümliches Muster an Kolonietypen, welches sich von dem des Knochenmarks und des Blutes unterschied. Trotzdem glichen sie in ihrem Immunphänotyp myeloiden Vorläuferzellen des Knochenmarks (CD45lo, LIN-, SCA-1-, IL7Rα-, c-KIT+) und konnten weiter in eine Hierarchie von Vorläufern aufgespalten werden, die in vitro alle erythro-myeloiden Zelltypen hervorbrachte. Diese Ähnlichkeit wurde dadurch unterstrichen, dass ihre Nachkommen in Flt3Cre x Rosa26mT/mG Mäusen markiert wurden, was eine Abstammung von hämatopoetischen Stammzellen anzeigte. Während die induzierte Repopulation von Hirn-Makrophagen mit Hilfe des CSF-1R Inhibitors PLX5622 keine Vorläuferbeteiligung beim Erhalt von Mikroglia/Makrophagen in vivo vermuten ließ, deuten neue Erkenntnisse im Bereich der Hämatologie darauf hin, dass die beschriebenen Vorläufer in die immunologische Überwachung des ZNS involviert sein könnten. Wenngleich keine Anhaltspunkte für adventitielle Makrophagen-Vorläufer im ZNS gefunden wurden, bestätigt diese Arbeit die Existenz myeloider Vorläufer im adulten Hirn und liefert notwendige anatomische und phänotypische Informationen, um deren Bedeutung im Rahmen entzündlicher Prozesse des ZNS aufzuklären. KW - Gehirn KW - Vorläufer KW - Gefäßwand KW - Hirnhaut KW - Brain KW - Myeloid KW - Progenitor KW - Vessel wall KW - Meninges KW - Microglia KW - Depletion Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-186465 ER - TY - THES A1 - Karimi, Sohail Mehmood T1 - A Comparative Study on Guard Cell Function of the Glycophyte \(Arabidopsis\) \(thaliana\) and the Halophyte \(Thellungiella\) \(salsuginea\) Under Saline Growth Conditions T1 - Eine vergleichende Studie zur Schließzellfunktion des Glycophyten \(Arabidopsis\) \(thaliana\) und des Halophyten \(Thellungiella\) \(salsuginea\) unter salinen Wachstumsbedingungen N2 - The greatest problems faced during the 21st century is climate change which is a big threat to food security due to increasing number of people. The increase in extreme weather events, such as drought and heat, makes it difficult to cultivate conventional crops that are not stress tolerant. As a result, increasing irrigation of arable land leads to additional salinization of soils with plant-toxic sodium and chloride ions. Knowledge about the adaptation strategies of salt-tolerant plants to salt stress as well as detailed knowledge about the control of transpiration water loss of these plants are therefore important to guarantee productive agriculture in the future. In the present study, I have characterized salt sensitive and salt tolerant plant species at physiological, phenotypic and transcriptomic level under short (1x salt) and long-time (3x) saline growth conditions. Two approaches used for long-time saline growth conditions (i.e increasing saline conditions (3x salt) and constant high saline conditions (3x 200 mM salt) were successfully developed in the natural plant growth medium i.e soil. Salt sensitive plants, A. thaliana, were able to survive and successfully set seeds at the toxic concentrations on the increasing saline growth mediums, with minor changes in the phenotype. However, under constant high saline conditions they could not survive. This was due to keeping low potassium, and high salt ions (sodium and chloride) in the photosynthetic tissue i.e leaf. Similarly, high potassium and low salt ions in salt tolerant T. salsuginea on both saline environments were the key for survival of this plant species. Being salt tolerant, T. salsuginea always kept high potassium levels and low sodium (during 1x) and chloride levels (during both 1x and 3x) in the leaf tissue. A strict control over transpirational water loss via stomata (formed by pair of guard cells) is important to maintain plant water balance. Aperture size of the stomata is regulated by the turgidity of the guard cells. More turgid the guard cells, bigger the apertures are and hence more transpiration. Under osmotic stress, the water loss is reduced which was evident in the salt sensitive A. thaliana plants under both short and long-time saline growth conditions. As the osmotic stress was only increased during long time saline growth conditions in T. salsuginea therefore, water loss was also decreased only under these saline conditions. Environmental CO2 assimilation also takes place via stomata in plants which then is used for photosynthesis. Stomatal apertures also influence CO2 assimilation. As the light absorbing photosynthetic pigments were more affected in A. thaliana, therefore photosynthetic activity of the whole plant was also reduced. Similarly, both short and long-time saline growth conditions also reduced the effective quantum yield of A. thaliana guard cells. Growth of the plant is dependent on energy which comes from photosynthesis. Reduced environmental CO2 assimilation would affect photosynthesis and hence growth, which was clearly observed in A. thaliana guard cells under long-time saline growth conditions. Major differences in both guard cells types were observed in their chloride and potassium levels. Energy Dispersive X-Ray Analysis (EDXA) suggested strict control of chloride accumulation in T. salsuginea guard cells as the levels remain unchanged under all conditions. Similarly, use of sodium in place of potassium for osmotic adjustments seems to be dependent on Na+/K+ rations in both guard cell types. Increased salt ions and reduced potassium levels in A. thaliana guard cells posed negative effect on photochemistry which in turn increased ROS metabolism and reduced energy related pathways at transcriptomic level in this plant species. Moreover, photosynthesis was strongly affected in A. thaliana guard cells both at transcriptomic and physiological levels. Similarly, global phytohormones induced changes were more evident in A. thaliana guard cells especially on 3x salt medium. Among all phytohormones, genes under the control of auxin were more differentially expressed in A. thaliana guard cells which suggests wide changes in growth and development in this plant species under salinity. Phytohormone, ABA is vital for closing the stomata under abiotic stress conditions. Increased levels of ABA during saline conditions led to efflux of potassium and counter anions (chloride, malate, nitrate) from the guard cells which caused the outward flow of water and hence reduction in turgor pressure. Reduced turgor pressure led to reduced water loss and CO2 assimilation especially in A. thaliana. Guard cells of both plant species synthesized ABA during saline conditions which was reflected from transcriptomic data and ABA quantification in the guard cells. ABA induced signaling in both plant species varied at the ABA receptor (PYL/PYR) levels where totally contrasting responses were observed. PYL2, PYL8 and PYL9 were specific to A. thaliana, furthermore, PYL2 was found to be differentially expressed only under 3x salt growth conditions thus suggesting its role during long term salt stress in this plant species. Protein phosphatases, which negatively regulate ABA signaling on one hand and act as ABA sensor on the other hand were found to be more differentially expressed in A. thaliana than T. salsuginea guard cells, which suggests their diverse role in both plant species under saline conditions. Differential expression of more ABA signaling players in long time saline conditions was prominent which could be because of darkness, as it is well known that rapid closure of stomata under dark conditions require ABA signaling. Moreover, representation of these components in dark also suggests that plants become more sensitive to dark under saline conditions which is also evident from the transpiration rates. Altogether, increased salt ions in A. thaliana guard cells and leaves led to pigment degradation and ABA induced reduction in transpiration which in turn influenced its growth. In contrast, T. salsuginea is the salt excluder and therefore keeps low levels of salt ions especially the chloride both in leaves and guard cells which mildly affects its growth. Guard cells of A. thaliana encounter severe energy problems at physiological and transcriptomic level. Main differences in the ABA signalling between both plant species were observed at the ABA receptor level. N2 - Das größte Problem des 21. Jahrhunderts ist der Klimawandel, der aufgrund der wachsenden Zahl von Menschen eine große Bedrohung für die Ernährungssicherheit darstellt. Die Zunahme extremer Wetterereignisse wie Dürre und Hitze erschwert den Anbau konventioneller, nicht stressresistenter Pflanzen. Eine zunehmende Bewässerung von Ackerland führt daher zu einer zusätzlichen Versalzung der Böden mit pflanzentoxischen Natrium- und Chloridionen. Kenntnisse über die Anpassungsstrategien salztoleranter Pflanzen an Salzstress sowie detaillierte Kenntnisse über die Kontrolle des Wasserverlusts durch Transpiration dieser Pflanzen sind daher wichtig, um eine produktive Landwirtschaft auch in Zukunft zu gewährleisten. In der vorliegenden Studie habe ich salzempfindliche und salztolerante Pflanzenarten auf physiologischer, phänotypischer und transkriptioneller Ebene unter kurzen (1x Salz) und langen (3x) Salzwachstumsbedingungen charakterisiert. In dem natürlichen Pflanzenwachstumsmedium, dh. dem Boden, wurden zwei Ansätze erfolgreich entwickelt, die für lang anhaltende Salzwachstumsbedingungen (dh zunehmende Salzbedingungen (3x Salz) und konstant hohe Salzbedingungen (3x 200 mM Salz) verwendet wurden. Die Pflanzen waren in der Lage, Samen bei den toxischen Konzentrationen auf den ansteigenden Salzwachstumsmedien zu überleben und erfolgreich zu setzen, wobei geringfügige Änderungen des Phänotyps auftraten. Unter konstant hohen Salzbedingungen konnten sie jedoch nicht überleben. Dies lag daran, dass wenig Kalium und hohe Salzionen vorhanden waren (Natrium und Chlorid) im photosynthetischen Gewebe, dh im Blatt. Ebenso stellten hohe Kalium- und niedrige Salzionen in salztoleranten T. salsuginea in beiden salzhaltigen Umgebungen den Schlüssel zum Überleben dieser Pflanzenart dar. Da T. salsuginea salztolerant war, blieb der Kaliumspiegel stets hoch und der Natrium- (während 1x) und Chloridspiegel (während 1x und 3x) im Blattgewebe niedrig. Eine strikte Kontrolle des transpirationelen Wasserverlusts über Stomata (gebildet von zwei Schließzellen) ist wichtig, um den Wasserhaushalt der Pflanzen aufrechtzuerhalten. Die Öffnungsgröße der Stomata wird durch den Turgor der Schutzzellen reguliert. Je praller die Schließzellen, desto größer die Öffnungen und damit die Transpiration. Unter osmotischem Stress wird der Wasserverlust verringert, was bei den salzempfindlichen A. thaliana-Pflanzen sowohl unter kurz- als auch langfristigen Salzwachstumsbedingungen offensichtlich war. Da der osmotische Stress in T. salsuginea nur über einen langen Zeitraum unter Salzwachstumsbedingungen anstieg, verringerte sich auch der Wasserverlust nur unter diesen Salzbedingungen. Die Aufnahme von CO2 in die Umwelt erfolgt auch über die Stomata und wird dann für die Photosynthese verwendet. Stomata beeinflussen daher auch die CO2-Assimilation. Da die lichtabsorbierenden photosynthetischen Pigmente in A. thaliana stärker betroffen waren, war auch die photosynthetische Aktivität der gesamten Pflanze verringert. In ähnlicher Weise verringerten sowohl kurz- als auch langzeitige Salzwachstumsbedingungen auch die effektive Quantenausbeute von A. thaliana-Schließzellen. Das Wachstum der Pflanze hängt von der Energie ab, die aus der Photosynthese stammt. Eine verringerte CO2-Assimilation aus der Umwelt würde die Photosynthese und damit das Wachstum beeinträchtigen, was bei A. thaliana-Schließzellenn unter lang andauerenden Salzwachstumsbedingungen deutlich zu beobachten war. Wesentliche Unterschiede bei beiden Schließzelltypen wurden in ihren Chlorid- und Kaliumspiegeln beobachtet. Die energiedispersive Röntgenanalyse (EDXA) ergab eine strikte Kontrolle der Chloridakkumulation in T. salsuginea Schließzellen, da die Chloridkonzentrationen unter allen Bedingungen unverändert bleiben. In ähnlicher Weise scheint die Verwendung von Natrium anstelle von Kalium für osmotische Anpassungen von Na + / K + -Verhältnissen in beiden Schließzelltypen abhängig zu sein. Erhöhte Salzionen und verringerte Kaliumspiegel in A. thaliana-Schließzellen wirkten sich negativ auf die Photochemie aus, was wiederum den ROS-Metabolismus erhöhte und die energiebezogenen Wege auf transkriptomischem Niveau bei dieser Pflanzenart verringerte. Darüber hinaus war die Photosynthese in A. thaliana-Schließzellen sowohl auf transkriptioneller als auch auf physiologischer Ebene stark beeinträchtigt. In ähnlicher Weise waren globale Phytohormon-induzierte Veränderungen in A. thaliana-Schließzellen, insbesondere auf 3 × Salzmedium, deutlicher. Unter allen Phytohormonen wurden Gene unter der Kontrolle von Auxin in A. thaliana-Schließzellen differenzierter exprimiert, was auf weitreichende Veränderungen im Wachstum und in der Entwicklung dieser Pflanzenart unter Salzgehalt hindeutet. Das Phytohormon ABA ist für das Schließen der Stomata unter abiotischen Stressbedingungen von entscheidender Bedeutung. Erhöhte ABA-Spiegel unter Salzbedingungen führten zum Austritt von Kalium und Gegenanionen (Chlorid, Malat, Nitrat) aus den Schließzellen, was den Wasserfluss nach außen und damit eine Verringerung des Turgordrucks bewirkte. Reduzierter Turgordruck führte insbesondere bei A. thaliana zu einem geringeren Wasserverlust und einer geringeren CO2-Aufnahme. Die Schließzellen beider Pflanzenarten synthetisierten ABA unter Salzbedingungen, was sich aus den Transkriptomdaten und der ABA-Quantifizierung in den Schließzellen widerspiegelte. Die ABA-induzierte Signalübertragung in beiden Pflanzenarten variierte bei den ABA-Rezeptor- (PYL / PYR-) Spiegeln, bei denen völlig unterschiedliche Reaktionen beobachtet wurden. PYL2, PYL8 und PYL9 waren spezifisch für A. thaliana. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass PYL2 nur unter dreifachen Salzwachstumsbedingungen unterschiedlich exprimiert wird, was auf seine Rolle bei langfristigem Salzstress bei dieser Pflanzenart hindeutet. Es wurde gefunden, dass Proteinphosphatasen, die einerseits die ABA-Signalübertragung negativ regulieren und andererseits als ABA-Sensor wirken, in A. thaliana differenzierter exprimiert werden als in T. salsuginea-Schließzellen, was auf ihre vielfältige Rolle in beiden Pflanzenarten unter Salzbedingungen hindeutet. Eine differenzierte Expression von mehr ABA-Signalgebern unter Bedingungen mit langer Salzwasserbewässerung war auffällig, was auf Dunkelheit zurückzuführen sein könnte, da bekanntlich ein schnelles Schließen der Stomata unter dunklen Bedingungen eine ABA-Signalgebung erfordert. Darüber hinaus deutet die Darstellung dieser Komponenten im Dunkeln auch darauf hin, dass Pflanzen unter salzhaltigen Bedingungen empfindlicher gegenüber Dunkelheit werden, was auch aus den Transpirationsraten hervorgeht. Insgesamt führten erhöhte Salzionen in A. thaliana-Schließzzellen und Blättern zu einem Pigmentabbau und einer durch ABA verursachten Reduktion der Transpiration, was deren Wachstum beeinflusste. Im Gegensatz dazu ist T. salsuginea in der Lage Salz auszuschließen und hält daher geringe Mengen an Salzionen, insbesondere das Chlorid sowohl in Blättern als auch in Schließzellen, dass sein Wachstum geringfügig beeinflusst. Schließzellen von A. thaliana stoßen auf physiologischer und transkriptomischer Ebene auf schwerwiegende Energieprobleme. Hauptunterschiede in der ABA-Signalgebung zwischen beiden Pflanzenarten wurden auf der ABA-Rezeptorebene beobachtet. KW - Glycophyten KW - Halophyten KW - salinen Wachstumsbedingungen KW - Schließzellfunktion KW - Transkriptomik anlyze KW - Halophytes KW - glycophytes KW - salt stress KW - guard cells KW - transcriptomic analysis Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-190942 ER - TY - THES A1 - Jetani, Hardikkumar T1 - Chimeric antigen receptor (CAR)-modified T cells targeting FLT3 in acute myeloid leukemia (AML) T1 - Chimäre Antigen Rezeptor (CAR)-modifizierte T-Zellen gegen FLT3 bei Akuter Myeloischer Leukämie (AML) N2 - Adoptive immunotherapy using chimeric antigen receptor (CAR)-modified T cells targeting CD19 has shown remarkable therapeutic efficacy against B cell leukemia and lymphoma, and provided proof of concept for therapeutic potential in other hematologic malignancies. Acute myeloid leukemia (AML) is an entity with an unmet medical need for effective and curative treatments. Therefore, there is a strong desire for development of potentially curative CAR-T cell immunotherapy for AML treatment. FMS-like tyrosine kinase 3 (FLT3) is a homodimeric transmembrane protein expressed uniformly by AML blasts. FLT3 plays a vital role in the survival of AML blasts and is a key driver of leukemia-genesis in AML cases with internal tandem duplication (FLT3ITD) and tyrosine kinase domain (TKD) mutations. These attributes suggest that FLT3 could be an excellent target for CAR-T cell immunotherapy. Here, we engineered human CD4+ and CD8+ T cells to express FLT3-specific CARs and demonstrate that they confer potent reactivity against AML cell lines and primary AML blasts that express either wild-type FLT3 or FLT3-ITD. Further, we show that FLT3 CAR-T cells exert potent antileukemia activity in xenograft models of AML and induce complete remissions. We also demonstrate that FLT3-expression on FLT3-ITD+ AML cells can be augmented by FLT3 inhibitors, which lead to increased recognition by CARs and improved efficacy of FLT3 CAR-T cells. We confirmed this principle with three different FLT3 inhibitors which are at distinct stages of clinical development i.e. Phase II/III clinical trial (crenolanib, quizartinib) and clinically approved (midostaurin). Further, we observed the strongest anti-leukemia activity of FLT3 CAR-T cells in combination with crenolanib in vivo. FLT3 is known to be expressed by normal hematopoietic stem and progenitor cells. We evaluated FLT3-expression on normal hematopoietic stem cells (HSCs) using flow cytometry and confirmed lower level of FLT3-expression on HSCs and progenitors compared to AML cells. As anticipated, we found that FLT3 CAR-T cells recognize normal HSCs in vitro and in vivo, and compromise normal hematopoiesis, suggesting that adoptive therapy with FLT3 CAR-T cells will require successive CAR-T cell depletion and allogeneic HSC transplantation (HSCT) to reconstitute the hematopoietic system. Moreover, an FLT3 inhibitor treatment does not increase FLT3-expression on HSCs. Accordingly, we demonstrate that the depletion of FLT3 CAR-T cells is possible with inducible Caspase 9 (iCasp9) safety switch. Collectively, our data establish FLT3 as a novel CAR target in AML with particular relevance in high-risk FLT3-ITD+ AML. Our data demonstrate that FLT3 CAR-T cells act synergistically with FLT3 inhibitors in FLT3-ITD+ AML. i.e. FLT3 inhibitors-induced upregulation of FLT3 in FLT3-ITD+ AML cells enhances their recognition and elimination by FLT3 CAR-T cells. Due to recognition of normal HSCs, the clinical use of FLT3 CART cells is likely restricted to a defined therapeutic window and must be followed by CART cell depletion and allogeneic HSCT for hematopoietic reconstitution. The data provide rational to use FLT3 CAR-T cells in combination with FLT3 inhibitors to augment the anti-leukemia efficacy of FLT3 CAR-T cells in high-risk FLT3-ITD+ AML patients, and to mitigate the risk of relapse with FLT3-negative AML variants, which could otherwise develop under therapeutic pressure. The data provide proof of concept for synergistic use of CAR-T cell immunotherapy and small molecule targeted therapy and encourage the clinical evaluation of this combination treatment in high-risk patients with FLT3-ITD+ AML. N2 - Adoptive Immuntherapie, die Chimäre- Antigenrezeptor (CAR) –modifizierte, gegen CD19 gerichtet T-Zellen verwendet, hat eine bemerkenswerte therapeutische Wirksamkeit gegen B-Zell-Leukämien und -Lymphome und großes therapeutisches Potenzial für die Behandlung anderer hämatologischer Erkrankungen gezeigt. Die Akute Myeloische Leukämie (AML) ist hierbei eine Entität, für die es bisher an wirksamen und kurativen Therapien fehlt und für die die Entwicklung einer potentiell kurativen CAR-T-Zellimmuntherapie von großer Bedeutung ist. FMS-like tyrosine kinase 3 (FLT3) ist ein homodimeres Transmembranprotein, das von AML-Blasten uniform exprimiert wird. FLT3 spielt eine wichtige Rolle beim Überleben von AML-Blasten und ist ein Schlüsselfaktor in der Leukämie-Genese bei AML-Fällen mit interner Tandem-Duplikation (FLT3-ITD) und Tyrosinkinase-Domänen (TKD)-Mutationen. Diese Eigenschaften legen die Vermutung nahe, dass FLT3 ein ausgezeichnetes Target für die CAR-T-Zell-Immuntherapie darstellen könnte. Daher setzten wir dort an und modifizierten humane CD4+ und CD8+ T-Zellen, um FLT3-spezifische CARs zu exprimieren, und konnten nachweisen, dass diese eine starke Reaktivität gegen AML-Zelllinien und primäre AML-Blasten besitzen, die entweder den FLT3-Wildtyp oder FLT3-ITD exprimieren. Weiterhin konnten wir zeigen, dass FLT3 CAR-T-Zellen in AML-Xenograft-Modellen eine starke anti-Leukämie-Aktivität besitzen und vollständige Remissionen hervorrufen können. Zudem gelang der Nachweis, dass die FLT3-Expression auf FLT3-ITD+ AML-Zellen durch FLT3-Inhibitoren verstärkt werden kann, was zu einer erhöhten Erkennung durch die CARs und einer verbesserten Wirksamkeit von FLT3-CAR-T-Zellen führt. Wir konnten dieses Prinzip mit drei verschiedenen FLT3-Inhibitoren belegen, die sich in unterschiedlichen Stadien der klinischen Entwicklung befinden, d. h. aus einer Klinischen Phase II / III-Studie (Crenolanib, Quizartinib) und einem klinisch zugelassenen Inhibitor (Midostaurin). Darüber hinaus beobachteten wir die stärkste anti-Leukämie-Aktivität von FLT3 CAR-T-Zellen in einer Kombination mit Crenolanib in vivo. Es ist bekannt, dass FLT3 von normalen hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen exprimiert wird. Wir untersuchten die FLT3-Expression in normalen hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) mittels Durchflusszytometrie und bestätigten im Vergleich zu AML-Zellen eine niedrigere FLT3-Expression auf HSCs und Vorläuferzellen. Wie erwartet, zeigte sich, dass FLT3 CAR-T-Zellen normale HSCs in vitro und in vivo erkennen und die normale Hämatopoese beeinträchtigen, was darauf hindeutet, dass eine adoptive Therapie mit FLT3 CAR-T-Zellen eine sukzessive CAR-T-Zell-Depletion und allogene HSC-Transplantation erfordert, um das hämatopoetische System wiederaufzubauen. Darüber hinaus erhöht die Behandlung mit einem FLT3-Inhibitor nicht die FLT3-Expression auf den HSCs. Dementsprechend konnten wir aufzeigen, dass die Depletion von FLT3 CAR-T Zellen mit einer induzierbaren Caspase 9 (iCasp9) als „Sicherheitsschalter“ möglich ist. Zusammenfassend etablieren unsere Daten FLT3 als ein neuartiges CAR-Target in der Behandlung von AML mit besonderer Relevanz für die Hochrisiko-FLT3-ITD+ AML. Unsere Daten zeigen, dass FLT3 CAR-T-Zellen synergistisch mit FLT3-Inhibitoren in FLT3-ITD+ AML wirken, d.h. eine FLT3-Inhibitoren-induzierte Hochregulation von FLT3 in FLT3-ITD+ AML-Zellen bewirkt und dies die Erkennung und Eliminierung durch FLT3-CAR-T-Zellen verstärkt. Durch ihre Eigenschaft der Erkennung von normalen HSCs ist die klinische Verwendung von FLT3 CAR-T-Zellen wahrscheinlich auf ein definiertes therapeutisches Fenster beschränkt und muss durch eine anschließende CAR-T-Zell-Depletion und eine allogene HSCT zur Rekonstitution des hämatopoetischen Systems ergänzt werden. In Anbetracht der Daten scheint es sinnvoll, FLT3-CAR-T-Zellen in Kombination mit FLT3-Inhibitoren zu verwenden, um die anti-leukämische Wirksamkeit von FLT3-CAR-T-Zellen bei Hochrisiko-FLT3-ITD+ AML-Patienten zu erhöhen und das Risiko eines Rückfalls mit FLT3-negativen AML-Varianten zu verringern, die sich sonst therapiebedingt entwickeln könnten. Die Daten stellen ein Proof-of-Concept für den synergistischen Einsatz von CAR-T-Zell-Immuntherapie und niedermolekularen Inhibitoren dar, der eine klinische Evaluation dieser Kombinationsbehandlung bei Hochrisikopatienten mit FLT3-ITD+ AML erstrebenswert macht. KW - Chimeric antigen receptor (CAR) KW - FMS-like tyrosine kinase 3 (FLT3) KW - FLT3 inhibitor KW - Acute myeloid leukemia (AML) Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-179096 ER - TY - THES A1 - Schihada, Hannes T1 - Novel optical methods to monitor G-protein-coupled receptor activation in microtiter plates T1 - Neue optische Methoden zur Messung der Aktivierung von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren in Mikrotiter-Platten N2 - G-protein-coupled receptors (GPCRs) regulate diverse physiological processes in the human body and represent prime targets in modern drug discovery. Engagement of different ligands to these membrane-embedded proteins evokes distinct receptor conformational rearrangements that facilitate subsequent receptor-mediated signalling and, ultimately, enable cellular adaptation to altered environmental conditions. Since the early 2000s, the technology of resonance energy transfer (RET) has been exploited to assess these conformational receptor dynamics in living cells and real time. However, to date, these conformational GPCR studies are restricted to single-cell microscopic setups, slowing down the discovery of novel GPCR-directed therapeutics. In this work, we present the development of a novel generalizable high-throughput compatible assay for the direct measurement of GPCR activation and deactivation. By screening a variety of energy partners for fluorescence (FRET) and bioluminescence resonance energy transfer (BRET), we identified a highly sensitive design for an α2A-adrenergic receptor conformational biosensor. This biosensor reports the receptor’s conformational change upon ligand binding in a 96-well plate reader format with the highest signal amplitude obtained so far. We demonstrate the capacity of this sensor prototype to faithfully quantify efficacy and potency of GPCR ligands in intact cells and real time. Furthermore, we confirm its universal applicability by cloning and validating five further equivalent GPCR biosensors. To prove the suitability of this new GPCR assay for screening purposes, we measured the well-accepted Z-factor as a parameter for the assay quality. All tested biosensors show excellent Z-factors indicating outstanding assay quality. Furthermore, we demonstrate that this assay provides excellent throughput and presents low rates of erroneous hit identification (false positives and false negatives). Following this phase of assay development, we utilized these biosensors to understand the mechanism and consequences of the postulated modulation of parathyroid hormone receptor 1 (PTHR1) through receptor activity-modifying protein 2 (RAMP2). We found that RAMP2 desensitizes PTHR1, but not the β2-adrenergic receptor (β2AR), for agonist-induced structural changes. This generalizable sensor design offers the first possibility to upscale conformational GPCR studies, which represents the most direct and unbiased approach to monitor receptor activation and deactivation. Therefore, this novel technology provides substantial advantages over currently established methods for GPCR ligand screening. We feel confident that this technology will aid the discovery of novel types of GPCR ligands, help to identify the endogenous ligands of so-called orphan GPCRs and deepen our understanding of the physiological regulation of GPCR function. N2 - Die Klasse der G-protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) stellt die größte Familie membranständiger Proteine dar. GPCRs regulieren eine Vielzahl diverser physiologischer Prozesse in eukaryotischen Zellen und kontrollieren so unterschiedliche Zellfunktionen im menschlichen Organismus. Sie stellen die Zelloberflächenrezeptoren für verschiedenartige extrazelluläre Stimuli, wie zum Beispiel Photonen, niedermolekulare chemische Verbindungen, Peptide und Lipide dar. Die Wechselwirkung mit diesen sogenannten Liganden stabilisiert spezifische GPCR-Konformationen. Diese dienen wiederum als Ausgangspunkt für nachgeschaltete intrazelluläre Signalkaskaden, die beispielweise über membranverankerte G-Proteine vermittelt werden können. Während endogene GPCR-Agonisten diese Signalweiterleitung verstärken, können andere Biomoleküle wie Lipide, Ionen oder andersartige Membranproteine die Funktion, und damit die Signalweiterleitung der GPCRs modulieren. Aufgrund ihrer Einbindung in eine Vielzahl physiologischer und pathophysiologischer Prozesse, wurden GPCRs schon früh als Angriffspunkte („Targets“) zur Behandlung verschiedener Erkrankungen erforscht und genutzt. Heutzutage vermitteln etwa 30% aller zugelassenen Arzneistoffe ihre Wirkung über G-protein-gekoppelte Rezeptoren. Dennoch wird das große Potential dieser Rezeptorfamilie als Targets für medikamentöse Behandlungen noch nicht in vollem Umfang ausgeschöpft. Tatsächlich gibt es für mehr als 200 GPCRs, die nicht der olfaktorischen Wahrnehmung dienen, noch keine Arzneistoffe, da wenig über deren Pharmakologie und physiologische Bedeutung bekannt ist. Zudem wird die Entwicklung neuartiger GPCR-Liganden erheblich durch das eingeschränkte Methodenrepertoire beeinträchtigt. Alle derzeit etablierten Techniken zur Identifizierung neuer GPCR-Liganden erfassen entweder den Ligand-GPCR-Bindungsprozess, der keine Informationen über die tatsächliche Aktivität der Verbindung liefert, oder messen weit-nachgeschaltete Signale, wie Änderungen sogenannter „Second-Messenger“-Konzentrationen (meist cAMP oder Calcium) und Reporter-Gen-Expressionslevel. Aufgrund ihrer Entfernung vom eigentlichen Rezeptor-Aktivierungsprozess haben diese Methoden allerdings bedeutende Nachteile und produzieren so häufig Falsch-Positive und Falsch-Negative Ergebnisse. Seit den frühen 2000er wurden GPCR-Konformationssensoren auf Basis von Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) zur Messung der Ligand-induzierten Rezeptordynamik genutzt. Jedoch wies keiner der bisher entwickelten FRET- oder BRET- (Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer) Sensoren ausreichende Signalstärke auf, um im Hochdurchsatz-Screening (HTS) angewendet werden zu können. Die vorliegende Studie beschreibt das erste GPCR-Sensordesign, das aufgrund seiner exzellenten Signalstärke im Hochdurchsatz-Verfahren verwendet werden kann. Wir haben 21 unterschiedliche FRET- und BRET-Sensoren des α2A-adrenergen Rezeptors (α2AAR) getestet und dabei die Kombination der kleinen und hellen Luziferase NanoLuciferase (Nluc) mit dem rot-fluoreszierenden HaloTag-Farbstoff 618 als sensitivstes RET-Paar identifiziert. Der α2AARNluc/Halo(618) Biosensor ermöglicht die Messung der Aktivität und Wirkstärke von α2AAR-Liganden im Mikrotiterplattenformat. Um die universelle Anwendbarkeit dieses Sensordesigns zu prüfen, wurden fünf weitere Nluc/Halo(618)-basierende Sensoren für GPCRs unterschiedlicher Unterfamilien entwickelt. Zudem konnten wir zeigen, dass diese GPCRNluc/Halo(618)-Fusionsproteine weiterhin ihre natürlichen Signalkaskaden in Gang setzen können und damit die biologische Funktionalität dieser Rezeptoren erhalten ist. Außerdem belegt die vorlegende Arbeit, dass diese neue Sensor-Generation zur Messung Ligand-vermittelter Rezeptordynamiken im Hochdurchsatz-Format und zur Untersuchung der GPCR-Regulation durch endogene Modulatoren genutzt werden kann. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass wir den ersten HTS-kompatiblen Assay zur Messung der GPCR-Konformationsänderungen entwickelt haben. Diese Biosensoren erlauben die Charakterisierung neuartiger GPCR-Liganden direkt auf der Rezeptorebene und funktionieren damit unabhängig von nachgeschalteter Signalamplifikation oder Überlagerung verschiedener Signalwege, welche die Aussagekraft traditioneller GPCR-Screening-Verfahren häufig beeinträchtigen. Diese Technik kann zur Entdeckung neuartiger GPCR-Arzneistoffe genutzt werden, zu einem besseren Verständnis bisher kaum erforschter Rezeptoren beitragen und der Identifizierung und Charakterisierung potentieller GPCR-Modulatoren dienen. KW - G-Protein gekoppelte Rezeptoren KW - Hochdurchsatz-Screening KW - Förster Resonanz Energie Transfer KW - High-thropughput screening KW - Bioluminescence resonance energy transfer KW - G-protein-coupled receptors KW - Receptor dynamics Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-175415 ER - TY - THES A1 - Balakrishnan, Ashwin T1 - Fast molecular mobility of β\(_2\)-adrenergic receptor revealed by time-resolved fluorescence spectroscopy T1 - Schnelle molekulare Beweglichkeit des β\(_2\)-adrenergen Rezeptors durch zeitaufgelöste Fluoreszenzspektroskopie N2 - G-protein- coupled receptors (GPCRs) are the largest family of membrane confined receptors and they transduce ligand binding to downstream effects. Almost 40% of the drugs in the world target GPCRs due to their function, albeit knowing less about their activation. Understanding their dynamic behaviour in basal and activated state could prove key to drug development in the future. GPCRs are known to exhibit complex molecular mobility patterns. A plethora of studies have been and are being conducted to understand the mobility of GPCRs. Due to limitations of imaging and spectroscopic techniques commonly used, the relevant timescales are hard to access. The most commonly used techniques are electron paramagnetic resonance or double electronelectron resonance, nuclear magnetic resonance, time-resolved fluorescence, single particle tracking and fluorescence recovery after photobleaching. Among these techniques only fluorescence has the potential to probe live cells. In this thesis, I use different time-resolved fluorescence spectroscopic techniques to quantify diffusion dynamics / molecular mobility of β2-adrenergic receptor (β2-AR) in live cells. The thesis shows that β2-AR exhibits mobility over an exceptionally broad temporal range (nanosecond to second) that can be linked to its respective physiological scenario. I explain how β2-AR possesses surprisingly fast lateral mobility (~10 μm²/s) associated with vesicular transport in contrast to the prior reports of it originating from fluorophore photophysics and free fluorophores in the cytosol. In addition, β2-AR has rotational mobility (~100 μs) that makes it conform to the Saffman-Delbrück model of membrane diffusion unlike earlier studies. These contrasts are due to the limitations of the methodologies used. The limitations are overcome in this thesis by using different time-resolved fluorescence techniques of fluorescence correlation spectroscopy (FCS), time-resolved anisotropy (TRA) and polarisation resolved fullFCS (fullFCS). FCS is limited to microsecond to the second range and TRA is limited to the nanosecond range. fullFCS complements the two techniques by covering the blind spot of FCS and TRA in the microsecond range. Finally, I show how ligand stimulation causes a decrease in lateral mobility which could be a hint at cluster formation due to internalisation and how β2-AR possesses a basal oligomerisation that does not change on activation. Thus, through this thesis, I show how different complementary fluorescence techniques are necessary to overcome limitations of each technique and to thereby elucidate functional dynamics of GPCR activation and how it orchestrates downstream signalling. N2 - G¬Protein¬gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) sind die größte Familie der Membran¬Rezeptoren und durch Bindung von Liganden leiten sie extrazlluläre Signal in das Innere der Zelle weiter. Fast 40% der Medikamente auf der Welt zielen aufgrund ihrer Funktion auf GPCRs ab, obwohl man relative wenig über ihre Aktivierung weiß. Das Verständnis ihres dynamischen Verhaltens im basalen und aktivierten Zustand könnte sich in Zukunft als Schlüssel zur Medikamentenentwicklung erweisen. GPCRs sind dafür bekannt, dass sie komplexe molekulare Bewegungsmuster aufweisen. Eine Fülle von Studien wurden und werden durchgeführt, um die Beweglichkeit von GPCRs zu verstehen. Aufgrund der Einschränkungen der gängigen bildgebenden und spektroskopischen Techniken sind die relevanten Zeitskalen nur schwer messbar. Die am häufigsten verwendeten Techniken sind die paramagnetische Elektronenresonanz oder die Doppel¬Elektron¬Elektron¬Resonanz, die magnetische Kernresonanz, die zeitaufgelöste Fluoreszenz, die Einzelpartikelverfolgung und die Fluoreszenzwiederherstellung nach Photobleichung. Unter diesen Techniken haben nur die Fluoreszenz¬basierten Techniken das Potential, lebende Zellen zu untersuchen. In dieser Arbeit werden verschiedene zeitaufgelöste fluoreszenzspektroskopische Techniken zur Quantifizierung der Diffusionsdynamik oder molekularen Mobilität des β2¬adrenergen Rezeptors (β2¬AR) in lebenden Zellen verwendet. Diese Arbeit zeigt, dass β2-AR eine Beweglichkeit über einen außergewöhnlich breiten, zeitlichen Bereich (Nanosekunde bis Sekunde) aufweist, der mit dem jeweiligen physiologischen Szenario verknüpft werden kann. Es wird gezeigt, wie β2¬AR eine überraschend schnelle, laterale Bewegung (~10 μm²/s) besitzt, welche mit vesikulärem Transport in Verbindung gebracht werden kann. Im Gegensatz zu früheren Berichten, wonach die beobachtete Komponente von der Photophysik der Fluorophore und freien Fluorophoren im Zytosol abstammt. Zusätzlich weist β2¬AR eine Rotationsbeweglichkeit (~100 μs) auf, welche es ¬ im Gegensatz zu früheren Studien ¬ dem Saffman¬Delbrück¬Modell der Membrandiffusion zuordnen lässt. Dieser Unterschied ist auf die Beschränkungen der verwendeten Techniken zurückzuführen. Die Einschränkungen werden in dieser Arbeit durch die Verwendung verschiedener zeitaufgelöster Fluoreszenztechniken überwunden, z. B. der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) im Bereich von mehreren hundert Nanosekunden bis Sekunden, der zeitaufgelösten Anisotropie (TRA) im Nanosekundenbereich und der polarisationsaufgelösten FullFCS (FullFCS), die die zeitlich Lücke zwischen FCS und TRA schließt. Zuletzt wird eine Abnahme der lateralen Beweglichkeit durch Ligandenstimulation gezeigt, was ein Hinweis auf Clusterbildung aufgrund von Internalisierung sein könnte, und dass β2¬AR eine basale Oligomerisierung aufweist, die sich bei Aktivierung nicht ändert. Zusammenfassend kann man sagen, dass verschiedene komplementäre Fluoreszenztechniken notwendig sind, um die Einschränkungen der einzelnen Techniken zu überwinden und dadurch die funktionelle Dynamik der GPCR¬Aktivierung und deren Bedeutung für die nachgeschaltete Signalübertragung aufzuklären. KW - Fluorescence correlation spectroscopy KW - GPCR KW - time-resolved anisotropy KW - adrenergic receptor KW - homoFRET Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-250856 ER - TY - THES A1 - Krüger, Sören T1 - Unterschiedliche Einflüsse von Komplement auf Reaktionen neutrophiler Granulozyten auf die Infektion mit \(Neisseria\) \(meningitidis\) T1 - Differential influences of complement on neutrophil responses to \(Neisseria\) \(meningitidis\) infection N2 - The gram-negative diplococcus Neisseria meningitidis (Nme) is a frequent human-specific, commensal bacterium of the upper respiratory tract. Under certain conditions especially in infants, meningococci can translocate into the bloodstream and cause invasive meningococcal disease (IMD) manifesting as meningitis or sepsis or a combination of both. IMD is feared for its rapid progression and high fatality rate if it remains untreated. IMD affects up to one million people annually causing substantial morbidity and mortality worldwide. It is well-established that the complement system is an important protective factor in meningococcal disease through opsonization of bacteria with C3b and the lytic activity of the membrane attack complex although the inflammatory C5a/C5aR1 axis can aggravate IMD. The role of neutrophil granulocytes in meningococcal infection is less clear despite their abundant recruitment throughout the course of disease. This study aimed to characterize neutrophil responses to Nme in vitro and the influence of complement on these responses. In infection assays with whole blood and isolated PMNs, effective binding, internalization and killing of Nme by neutrophils was demonstrated. A significant complement-dependence of neutrophil phagocytosis and oxidative burst was observed. The opsonizing and lytic pathway of the complement cascade were found to be most relevant for these responses since blockade of C3 using inhibitor Compstatin Cp20 reduced phagocytosis and oxidative burst significantly more than the blockade of the inflammatory branch with C5aR1-antagonist PMX53. Opsonization with specific antibodies could not replicate the effect of complement activation indicating that engagement of neutrophil complement receptors, particularly complement receptor 3, is involved. Other neutrophil effector functions such as degranulation and IL-8 release were activated in a complement-independent manner implying activation by other inflammatory signals. Considering existing evidence on the overall protective effect of PMNs, further studies investigating the contribution of each neutrophil effector function to infection survival in vivo are required. Ideally, this should be studied in a murine meningitis or sepsis model in the context of complement activation. N2 - Der Gram-negative Diplokokkus Neisseria meningitidis (Nme) ist ein weit verbreitetes, human-spezifisches, kommensales Bakterium des oberen Respirationstraktes. Unter bestimmten Bedingungen, insbesondere bei Kleinkindern, können Meningokokken in die Blutbahn translozieren und eine invasive Meningokokkenerkrankung (IMD) auslösen, die sich als Meningitis, Sepsis oder eine Kombination beider Krankheitsbilder manifestiert. IMD werden aufgrund ihrer raschen Progression und ohne Behandlung hohen Letalität gefürchtet. IMD betreffen jährlich bis zu einer Million Menschen weltweit mit substanzieller Morbidität und Mortalität. Es ist bekannt, dass das Komplement-system bei IMD als protektiver Faktor durch die Opsonisierung von Nme mit C3b und Lyse mittels Membranangriffskomplex wirkt, obwohl die inflammatorische C5a/C5aR1-Achse die Erkrankung aggravieren kann. Die Rolle neutrophiler Granulozyten (PMNs) bei IMD bleibt hingegen kontrovers, obwohl eine starke Rekrutierung dieser Zellen stattfindet. Diese Studie charakterisiert die Reaktionen neutrophiler Granulozyten auf Nme in vitro und deren Modulation durch Komplement. In Infektionsassays mit Vollblut und isolierten PMNs konnte die Bindung, Internalisierung und Elimination von Nme durch PMNs demonstriert werden. Oxidativer burst und Phagozytose zeigten dabei eine ausgeprägte Abhängigkeit von Komplement. Die opsonisierende und lytische Wirkung von Komplement erwiesen sich dabei als relevant für diese Funktionen, da die Blockade von C3 durch den Inhibitor Compstatin Cp20 Phagozytose und oxidativen Burst signifikant stärker reduzierte als die Blockade der Inflammation durch C5a mittels C5aR1-Antagonist PMX53. Die Opsonisierung mit spezifischen Antikörpern konnte den Effekt der Komplementaktivierung nicht replizieren, was auf eine Signalvermittlung durch Komplementrezeptoren insbesondere CR3 hindeutet. Andere Effektorfunktionen wie Degranulation und IL-8 Freisetzung waren komplementunabhängig, was auf deren Initiierung durch andere inflammatorische Signale hindeutet. In Anbetracht bestehender Evidenz für einen insgesamt protektiven Effekt von PMN sind weitere Studien nötig, die den Effekt der einzelnen Effektorfunktionen auf das Outcome in vivo untersuchen. Besonders geeignet wäre dafür ein murines Sepsis oder Meningitis-Modell. KW - Neisseria meningitidis KW - Neutrophiler Granulozyt KW - Komplement KW - Complement system KW - Neutrophil granulocyte Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-249697 ER - TY - THES A1 - Altrichter, Steffen T1 - Labeling approaches for functional analyses of adhesion G protein-coupled receptors T1 - Markierungsverfahren zur funktionellen Analyse von Adhäsions-G-Protein-gekoppelten Rezeptoren N2 - The superfamily of G protein-coupled receptors (GPCRs) comprises more than 800 members, which are divided into five families based on phylogenetic analyses (GRAFS classification): Glutamate, Rhodopsin, Adhesion, Frizzled/Taste2 and Secretin. The adhesion G protein-coupled receptor (aGPCR) family forms with 33 homologs in Mammalia the second largest and least investigated family of GPCRs. The general architecture of an aGPCR comprises the GPCR characteristics of an extracellular region (ECR), a seven transmembrane (7TM) domain and an intracellular region (ICR). A special feature of aGPCRs is the extraordinary size of the ECR through which they interact with cellular and matricellular ligands via adhesion motif folds. In addition, the ECR contains a so-called GPCR autoproteolysis-inducing (GAIN) domain, which catalyzes autoproteolytic cleavage of the protein during maturation. This cleavage leads to the formation of an N-terminal (NTF) and a C-terminal fragment (CTF), which build a unit by means of hydrophobic interactions and therefore appear as a heterodimeric receptor at the cell surface. In the past, it has been shown that the first few amino acids of the CTF act as a tethered agonist (TA) that mediates the activation of the receptor through the interaction with the 7TM domain. However, the molecular mechanism promoting the TA-7TM domain interaction remains elusive. This work reveals a novel molecular mechanism that does not require the dissociation of the NTF-CTF complex to promote release of the TA and thus activation of the aGPCR. The introduction of bioorthogonal labels into receptorsignaling- relevant regions of the TA of various aGPCRs demonstrated that the TA is freely accessible within the intact GAIN domain. This suggests a structural flexibility of the GAIN domain, which allows a receptor activation independent of the NTF-CTF dissociation, as found in cleavage-deficient aGPCR variants. Furthermore, the present study shows that the cellular localization and the conformation of the 7TM domain depends on the activity state of the aGPCR, which in turn indicates that the TA mediates conformational changes through the interaction with the 7TM domain, which ultimately regulates the receptor activity. In addition, biochemical analyses showed that the GAIN domain-mediated autoproteolysis of the human aGPCR CD97 (ADGRE5/E5) promotes further cleavage events within the receptor. This suggests that aGPCRs undergo cleavage cascades, which are initialized by the autoproteolytic reaction of the GAIN domain. Thus, it can be assumed that aGPCRs are subject to additional proteolytic events. Finally, the constitutive internalization of the NTF and the CTF of E5 was demonstrated by various labeling methods. It was possible to label both fragments independently and to follow their subcellular location in vitro. In summary, these obtained results contribute to a better understanding about the molecular mechanisms of activity and signaling of aGPCRs. N2 - Die Superfamilie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) umfasst weit mehr als 800 Mitglieder, welche aufgrund von phylogenetischen Analysen in fünf Familien unterteilt werden (GRAFS Klassifizierung): Glutamat, Rhodopsin, Adhäsion, Frizzled/Taste2 und Sekretin. Die Familie der Ädhesions-G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (aGPCRs) bildet mit 33 Homologen in Säugetieren die zweitgrößte Familie innerhalb der GPCRs. Die generelle Architektur eines aGPCRs weist die GPCR typischen Merkmale einer extrazellulären Region (ECR), einer sieben Transmembrandomäne (7TM) und einer intrazellulären Region (ICR) auf. Eine Besonderheit stellt hierbei die außergewöhnliche Größe der ECR, welche über vielfältige Domänen mit zellulären und matrixgebundenen Liganden interagieren, dar. Zusätzlich umfasst die ECR eine sogenannte GPCR Autoproteolyse-induzierende (GAIN) Domäne, an welcher während der Proteinreifung eine autoproteolytische Spaltung stattfindet. Diese Spaltung führt zur Entstehung eines N-terminalen (NTF) und C-terminalen Fragmentes (CTF), welche mittels hydrophober Wechselwirkung eine Einheit an der Zelloberfläche und daher einen heterodimeren Rezeptor bilden. In der Vergangenheit zeigte sich, dass die ersten paar Aminosäuren des CTF als angebundener Agonist (TA) agieren und über die Interaktion mit der 7TM Domäne eine Aktivierung des Rezeptors vermitteln. Der molekulare Mechanismus, welcher die Wechselwirkung zwischen TA und 7TM Domänen fördert, ist jedoch weiterhin unbekannt. Diese Arbeit enthüllt einen neuartigen molekularen Mechanismus, welcher keine Dissoziation des NTF-CTF Komplexes benötigt, um eine Freisetzung des TA und damit eine Aktivierung des aGPCR zu gewährleisten. Mittels der Einbringung von bioorthogonalen Markierungen in rezeptorsignalisierungs-relevante Bereiche des TA von diversen aGPCRs, wurde gezeigt, dass dieser innerhalb der intakten GAIN Domäne freizugänglich vorliegt. Dies lässt auf eine strukturelle Flexibilität der GAIN Domäne schließen, welche eine Rezeptoraktivierung unabhängig von der NTF-CTF Dissoziation erlaubt, wie sie auch bei spaltungsdefizienten aGPCR Varianten vorzufinden ist. Des Weiteren zeigt die vorliegende Arbeit, dass sich die zelluläre Lokalisation und die Konformation der 7TM Domäne abhängig vom Aktivitätszustand des aGPCR ist, was wiederrum daraufhin deutet, dass der TA über die Interaktion mit der 7TM Domäne eine Konformationsänderung vermittelt, welche letztendlich die Rezeptoraktivität reguliert. Zudem zeigten biochemische Analysen, dass neben der GAIN Domänen-vermittelten Autoproteolyse des humanen aGPCRs CD97 (ADGRE5/E5) weitere proteolytische Spaltungen innerhalb des Rezeptors stattfinden. Dies deutet daraufhin, dass aGPCRs Spaltungskaskaden durchlaufen, welche über die autoproteolytischen Reaktion der GAIN Domäne initialisiert werden. Dadurch kann angenommen werden, dass aGPCRs zusätzlichen proteolytischen Ereignissen unterliegen. Schlussendlich konnte mittels diverser Markierungsverfahren die konstitutive Internalisierung des NTF und des CTF von E5 nachgewiesen werden. Es war möglich beide Fragmente unabhängig voneinander zu markieren und deren subzelluläre Lokalisation in vitro zu verfolgen. Zusammenfassend tragen die gewonnen Ergebnisse zu einem besseren Verständnis der zugrundeliegenden molekularen Mechanismen in Bezug auf Aktivität und Signalübertragung von aGPCRs bei. KW - G-Protein gekoppelter Rezeptor KW - Labeling KW - Functional analyses KW - Adhesion GPCR Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-207068 ER - TY - THES A1 - Lindenberg [verh. Schubert], Annekathrin T1 - Timing of sensory preferences in \(Camponotus\) Ants T1 - Zeitliche Anpassung sensorischer Präferenzen in \(Camponotus\) Ameisen N2 - Ants belong to the most successful insects living on our planet earth. One criterion of their tremendous success is the division of labor among workers that can be related to age (age¬– or temporal polyethism) and/ or body size (size–related polymorphism). Young ants care for the queen and brood in the nest interior and switch to foraging tasks in the outside environment with ongoing age. This highly flexible interior–exterior transition probably allows the ant workers to properly match the colony needs and is one of the most impressive behaviors a single worker undergoes during its life. As environmental stimuli are changing with this transition, workers are required to perform a new behavioral repertoire. This requires significant adaptions in sensory and higher¬–order integration centers in the brain, like the mushroom bodies. Furthermore, foragers need proper time measuring mechanisms to cope with daily environmental changes and to adapt their own mode of life. Therefore, they possess a functional endogenous clock that generates rhythms with a period length of approximately 24 hours. The species–rich genus of Camponotus ants constitute a rewarding model to study how behavioral duties of division of labor were performed and modulated within the colony and how synaptic plasticity in the brain is processed, as they can divide their labor to both, age and body size, simultaneously. In my PhD thesis, I started to investigate the behavioral repertoire (like foraging and locomotor activity) of two sympatric Camponotus species, C. mus and C. rufipes workers under natural and under controlled conditions. Furthermore, I focused on the division of labor in C. rufipes workers and started to examine structural and ultrastructural changes of neuronal architectures in the brain that are accompanied by the interior–exterior transition of C. rufipes ants. In the first part of my thesis, I started to analyze the temporal organization of task allocation throughout the life of single C. rufipes workers. Constant video–tracking of individually labeled workers for up to 11 weeks, revealed an age–related division of labor of interior and exterior workers. After emergence, young individuals are tended to by older ones within the first 48 hours of their lives before they themselves start nurturing larvae and pupae. Around 52% switch to foraging duties at an age of 14–20 days. The workers that switched to foraging tasks are mainly media–sized workers and seem to be more specialized than nurses. Variations in proportion and the age of switching workers between and within different subcolonies indicate how highly flexible and plastic the age–related division of labor occurs in this ant species. Most of the observed workers were engaged in foraging tasks exclusively during nighttime. As the experiments were conducted in the laboratory, they are completely lacking environmental stimuli of the ants´ natural habitat. I therefore asked in a second study, how workers of the two closely related Camponotus species, C. rufipes and C. mus, adapt their daily activity patterns (foraging and locomotor activity) under natural (in Uruguay, South America) and controlled (in the laboratory) conditions to changing thermal conditions. Monitoring the foraging activity of both Camponotus species in a field experiment revealed, that C. mus workers are exclusively diurnal, whereas C. rufipes foragers are predominantly nocturnal. However, some nests showed an elevated daytime activity, which could be an adaption to seasonally cold night temperatures. To further investigate the impact of temperature and light on the differing foraging activity patterns in the field, workers of both Camponotus species were artificially exposed to different thermal regimes in the laboratory, simulating local winter and summer conditions. Here again, C. mus workers display solely diurnal locomotor activity, whereas workers of C. rufipes shifted their locomotor activity from diurnal under thermal winter conditions to nocturnal under thermal summer conditions. Hence, the combination of both, field work and laboratory studies, shows that daily activity is mostly shaped by thermal conditions and that temperature cycles are not just limiting foraging activity but can be used as zeitgeber to schedule the outside activities of the nests. Once an individual worker switches from indoor duties to exterior foraging tasks, it is confronted with an entirely new set of sensory information. To cope with changes of the environmental conditions and to facilitate the behavioral switch, workers need a highly flexible and plastic neuronal system. Hence, my thesis further focuses on the underlying neuronal adaptations of the visual system, including the optic lobes as the primary visual neuropil and the mushroom bodies as secondary visual brain neuropil, that are accompanied with the behavioral switch from nursing to foraging. The optic lobes as well as the mushroom bodies of light–deprived workers show an `experience–independent´ volume increase during the first two weeks of adulthood. An additional light exposure for 4 days induces an `experience–dependent´ decrease of synaptic complexes in the mushroom body collar, followed by an increase after extended light exposure for 14 days. I therefore conclude, that the plasticity of the central visual system represents important components for the optimal timing of the interior–exterior transitions and flexibility of the age–related division of labor. These remarkable structural changes of synaptic complexes suggest an active involvement of the mushroom body neuropil in the lifetime plasticity that promotes the interior–exterior transition of Camponotus rufipes ants. Beside these investigations of neuronal plasticity of synaptic complexes in the mushroom bodies on a structural level, I further started to examine mushroom body synaptic structures at the ultrastructural level. Until recently, the detection of synaptic components in projection neuron axonal boutons were below resolution using classical Transmission Electron Microscopy. Therefore, I started to implement Electron Tomography to increase the synaptic resolution to understand architectural changes in neuronal plasticity process. By acquiring double tilt series and consecutive computation of the acquired tilt information, I am now able to resolve individual clear–core and dense–core vesicles within the projection neuron cytoplasm of C. rufipes ants. I additionally was able to reveal single postsynaptic Kenyon cell dendritic spines (~62) that surround one individual projection neuron bouton. With this, I could reveal first insights into the complex neuronal architecture of single projection neuron boutons in the olfactory mushroom body lip region. The high resolution images of synaptic architectures at the ultrastructural level, received with Electron Tomography would promote the understanding of architectural changes in neuronal plasticity. In my PhD thesis, I demonstrate that the temporal organization within Camponotus colonies involves the perfect timing of different tasks. Temperature seems to be the most scheduling abiotic factors of foraging and locomotor activity. The ants do not only need to adapt their behavioral repertoire in accordance to the interior–exterior switch, also the parts in the peripheral and central that process visual information need to adapt to the new sensory environment. N2 - Ameisen gehören zu den erfolgreichsten Insekten unserer Erde. Hauptverantwortlich für ihren enormen Erfolg ist die Arbeitsteilung der Arbeiterinnenkaste. Ameisenarbeiterinnen können sich ihre Aufgaben abhängig ihrer Körpergröße teilen (Größenpolymorphismus), indem unterschiedlich große Tiere verschiedenen Aufgaben in der Kolonie nachgehen. Zusätzlich kann die Arbeitsteilung aber auch altersbedingt sein (auch genannt Alters– oder zeitlicher Polyethismus): Junge Ameisen kümmern sich um die Königin und Brut innerhalb des Nestes, bevor sie mit zunehmendem Alter das Nest verlassen und zu Futtersammlerinnen (Furageuren) werden. Der extrem anpassungsfähige Wechsel von Innen¬– zu Außendiensttieren ist einer der erstaunlichsten Verhaltensweisen, die Arbeiterinnen an den Tag legen und ermöglicht es ihnen, den unterschiedlichen Bedürfnissen ihrer Kolonie nachzugehen. Der Übergang der Ammentätigkeit zum Furagieren ist mit beträchtlichen Veränderungen der sensorischen Umgebung der einzelnen Arbeiterinnen verbunden und erfordert eine Verhaltensanpassung an diese neuen Gegebenheiten. Wenn sich die Verhaltensweisen der Arbeiterinnen ändert, führt das zu Anpassungen der sensorischen und höheren Verschaltungszentren in bestimmten Gehirnarealen. Eines dieser sensorischen Verarbeitungszentren sind die Pilzkörper. Außerdem müssen Furageure in der Lage sein, tägliche Veränderungen ihrer Umwelt wahrzunehmen, um ihre Verhaltensweisen stets optimal an die sich ändernde Umwelt anzupassen. Dafür brauchen sie eine funktionierende innere Uhr, die rhythmisch mit einer Periodenlänge von ca. 24 Stunden läuft. Die artenreiche Gattung der Camponotus Ameisen ist ein geeigneter Organismus, um die Verhaltensweisen die mit der Arbeitsteilung der Arbeiterinnenkaste einhergehen, zu untersuchen, da sowohl der Größenpolymorphismus als auch der Alterspolyethismus zeitgleich in dieser Gattung auftauchen können. Dadurch eignen sich Camponotus Ameisen auch hervorragend, um strukturelle Veränderungen synaptischer Komplexe im Gehirn, die sich durch die Arbeitsteilung ändern können, zu untersuchen. In meiner Doktorarbeit habe ich damit angefangen, die Verteilung von bestimmten Aufgaben (Ammen und Furageure) von C. rufipes Arbeiterinnen zu untersuchen. Mithilfe von Videoaufnahmen über elf Wochen, konnte ich sowohl eine altersabhängige, als auch eine größenabhängige Arbeitsteilung zwischen Ammen und Furageuren für diese Art zeigen. Frisch geschlüpfte Tiere wurden innerhalb der ersten 48 Stunden von anderen Ammen umsorgt, bevor sie selbst zu Ammen wurden und Aufgaben wie Brutpflege übernommen haben. Nach rund 14–20 Tagen sind 53% der Ammen zu Furageuren gewechselt. Zusätzlich zu der altersabhängigen Arbeitsteilung konnte ich zeigen, dass die Körpergröße der Ammen deutlich breiter gestreut ist als die der Furageure, was in einer höheren Spezialisierung der Furageure resultiert. Proportionale Unterschiede des Alters und der Größe der Tiere, die diesen Wechsel vollzogen haben zeigen, wie hoch flexibel und anpassungsfähig die Arbeitsteilung innerhalb der Arbeiterinnenkaste sein kann. Die meisten der beobachteten Furageure waren außerdem fast ausschließlich nachtaktiv. Da ich diese Experimente im Labor durchgeführt habe, fehlt es komplett an der natürlichen sensorischen Umgebung der Tiere. In dem zweiten Teil meiner Doktorarbeit habe ich mich damit beschäftigt, ob sich tägliche Aktivitätsmuster (Furagier– und Bewegungsaktivität) von Arbeiterinnen zweier nah verwandter Camponotus Arten (C. rufipes und C. mus) unter natürlichen Bedingungen (in Uruguay, Südamerika) und unter kontrollierten Bedingungen (im Labor), in Abhängigkeit von den abiotischen Faktoren Licht und Temperatur, verändern können. Meine Ergebnisse zeigen, dass C. mus Arbeiterinnen unter natürlichen Bedingungen strikt tagaktiv sind, wohingegen C. rufipes Arbeiterinnen vornehmlich nachts furagierten. Ein paar C. rufipes Nester zeigten allerdings eine erhöhte Furagieraktivität tagsüber, was auf die saisonal kalten Nächte zurückzuführen sein könnte. Um den Einfluss von Licht und Temperatur, der sich auf die Furagieraktivität im Feld gezeigt hat, genauer untersuchen zu können, wurden Arbeiterinnen beider Camponotus Arten verschiedenen Licht– und Temperaturbedingungen im Labor ausgesetzt. Auch hier zeigten Arbeiterinnen der Gattung C. mus eine strikt tagaktive Bewegungsaktivität, wohingegen C. rufipes Arbeiterinnen von tagaktiv unter Winter Temperaturbedingungen zu nachaktiv unter Sommer Temperaturbedingungen wechselten. Die Kombination aus den Ergebnissen der Feld– und Laborstudien zeigen deutlich, dass die generelle Aktivität der beiden Arten hauptsächlich durch Licht und Temperatur beeinflusst wird und dass Temperaturzyklen nicht nur ein limitierender Faktor der Furagieraktivität sind, sondern auch als Zeitgeber dienen können um Aktivität generell zu regulieren. Wenn der Übergang von Innen– zu Außendiensttieren stattgefunden hat, ändert sich die komplette sensorische Umgebung der Furageure. Um diese Veränderungen verarbeiten zu können, brauchen Arbeiterinnen ein hoch anpassungsfähiges und flexibles neuronales System. Daher beschäftigte ich mich in meiner Doktorarbeit außerdem mit den zugrundeliegenden neuronalen Anpassungen der visuellen Verarbeitungsregionen im Gehirn, wie die optischen Loben und die Pilzkörper, die mit dem Wechsel von Ammen zu Furageuren einhergehen. Ich konnte zeigen, dass die optischen Loben und die Pilzkörper von im Dunkeln gehaltenen Arbeiterinnen eine `Erfahrungs–unabhängige´ Volumenszunahme innerhalb der ersten zwei Wochen nach dem Schlupf zeigen. Eine folgende Lichtexposition von vier Tagen führte zu einer `Erfahrungs–abhängigen´ Abnahme der synaptischen Strukturen im Pilzkörper, die allerdings durch eine länger anhaltende Lichtexposition von 14 Tagen wieder anstieg. Diese Plastizität des zentralen visuellen Nervensystems repräsentiert eine wichtige Komponente für die optimale zeitliche Anpassung des Wechsels von Ammen zu Furageuren und die enorme Flexibilität der altersabhängigen Arbeitsteilung. Außerdem scheinen die Pilzkörper durch diese beeindruckenden strukturellen Veränderungen der synaptischen Komplexe aktiv an dieser neuronalen Plastizität beteiligt zu sein und daher den Übergang von Innen– zu Außendiensttieren in C. rufipes Ameisen zu unterstützen. Neben meinen Untersuchungen zur neuronalen Plastizität synaptischer Komplexe im Pilzkörper auf der strukturellen Ebene, habe ich damit begonnen, diese Plastizität der neuronalen Komplexe auch auf Ultrastruktur Ebene zu untersuchen. Durch die zu geringe Auflösungsmöglichkeit der klassischen Transmissions Elektronenmikroskopie, konnten bisher einzelne synaptischer Komponenten in den axonalen Endigungen der Projektionsneurone nicht detektiert werden. Deswegen habe ich damit angefangen, die Methode der Elektronen Tomographie zu etablieren um die Auflösung synaptischer Komplexe zu verbessern. Mit dieser höheren Auflösung ist es möglich, bauliche Veränderungen der synaptischen Komplexe in Plastizitätsprozessen besser zu verstehen. Mit der Durchführung von `double tilt´ Serien und der anschließenden Verarbeitung der erhaltenen Bildinformation, war es mir möglich, einzelne `clear–core´ und `dense–core´ Vesikel innerhalb des Zytoplasmas der Projektionsneurone von C. rufipes Ameisen detektieren. Außerdem konnte ich mit dieser Methode einzelne postsynaptische dendritische Dornen der Kenyon Zellen (~62) identifizieren, die ein einzelnes Endknöpfchen eines Projektionsneurons umgeben. In diesem Teil meiner Arbeit konnte ich erste Einblicke in die komplexe neuronale Bauweise einzelner Endigungen der Projektionsneurone in der olfaktorischen Region der Pilzkörper zeigen. Die hochauflösenden Bilder synaptischer Komplexe auf dem Ultrastruktur Level, die man mit der Elektronen Tomographie erzielen kann, bringen das Verständnis baulicher Veränderungen innerhalb der neuronales Plastizität voran. In meiner Doktorarbeit konnte ich zeigen, dass die zeitliche Organisation verschiedener Aufgaben innerhalb der Kolonien von Camponotus Ameisen einer perfekten Zeitplanung bedarf. Hier scheinen die abiotischen Faktoren Temperatur und Licht den größten Einfluss auf die Furagieraktivität und die generelle Aktivität zu haben. Die Ameisenarbeiterinnen müssen nicht nur ihre Verhaltensweise nach dem Übergang von Ammen zu Furageuren anpassen, es müssen sich auch die Teile des Gehirns, die für die Verarbeitung visueller Reize zuständig sind, dieser neuen sensorischen Umgebung anpassen. KW - Rossameise KW - Pilzkörper KW - Arbeitsteilung KW - Furagieraktivität KW - foraging activity KW - Neuronales visuelles System KW - neuronal visual system KW - Camponotus rufipes Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-160948 ER - TY - THES A1 - Figueiredo, Ludmilla T1 - Extinction debt of plants, insects and biotic interactions: interactive effects of habitat fragmentation and climate change T1 - Aussterbeschuld von Pflanzen, Insekten und biotischen Interaktionen: interaktiv Auswirkungen der Fragmentierung von Lebensräumen und des Klimawandels N2 - The importance of understanding species extinctions and its consequences for ecosystems and human life has been getting increasing public attention. Nonetheless, regardless of how pressing the current biodiversity loss is, with rare exceptions, extinctions are actually not immediate. Rather, they happen many generations after the disturbance that caused them. This means that, at any point in time after a given disturbance, there is a number of extinctions that are expected to happen. This number is the extinction debt. As long as all the extinctions triggered by the disturbance have not happened, there is a debt to be paid. This delay in extinctions can be interpreted as a window of opportunity, when conservation measures can be implemented. In this thesis, I investigated the relative importance of ecological and evolutionary processes unfolding after different disturbances scenarios, to understand how this knowledge can be used to improve conservation practices aiming at controlling extinctions. In the Introduction (chapter 1), I present the concept of extinction debts and the complicating factors behind its understanding. Namely, I start by presenting i) the theoretical basis behind the definition of extinction debts, and how each theory informed different methodologies of study, ii) the complexity of understanding and predicting eco-evolutionary dynamics, and iii) the challenges to studying extinctions under a regime of widespread and varied disturbance of natural habitats. I start the main body of the thesis (chapter 2) by summarizing the current state of empirical, theoretical, and methodological research on extinction debts. In the last 10 years, extinction debts were detected all over the globe, for a variety of ecosystems and taxonomic groups. When estimated - a rare occurrence, since quantifying debts requires often unavailable data - the sizes of these debts range from 9 to 90\% of current species richness and they have been sustained for periods ranging from 5 to 570 yr. I identified two processes whose contributions to extinction debts have been studied more often, namely 1) life-history traits that prolong individual survival, and 2) population and metapopulation dynamics that maintain populations under deteriorated conditions. Less studied are the microevolutionary dynamics happening during the payment of a debt, the delayed conjoint extinctions of interaction partners, and the extinction dynamics under different regimes of disturbances (e.g. habitat loss vs. climate change). Based on these observations, I proposed a roadmap for future research to focus on these less studies aspects. In chapters 3 and 4, I started to follow this roadmap. In chapter 3, I used a genomically-explicit, individual-based model of a plant community to study the microevolutionary processes happening after habitat loss and climate change, and potentially contributing to the settlement of a debt. I showed that population demographic recovery through trait adaptation, i.e. evolutionary rescue, is possible. In these cases, rather than directional selection, trait change involved increase in trait variation, which I interpreted as a sign of disruptive selection. Moreover, I disentangled evolutionary rescue from demographic rescue and show that the two types of rescue were equally important for community resistance, indicating that community re-assembly plays an important role in maintaining diversity following disturbance. The results demonstrated the importance of accounting for eco-evolutionary processes at the community level to understand and predict biodiversity change. Furthermore, they indicate that evolutionary rescue has a limited potential to avoid extinctions under scenarios of habitat loss and climate change. In chapter 4, I analysed the effects of habitat loss and disruption of pollination function on the extinction dynamics of plant communities. To do it, I used an individual, trait-based eco-evolutionary model (Extinction Dynamics Model, EDM) parameterized according to real-world species of calcareous grasslands. Specifically, I compared the effects of these disturbances on the magnitude of extinction debts and species extinction times, as well as how species functional traits affect species survival. I showed that the loss of habitat area generates higher number of immediate extinctions, but the loss of pollination generates higher extinction debt, as species take longer to go extinct. Moreover, reproductive traits (clonal ability, absence of selfing and insect pollination) were the traits that most influenced the occurrence of species extinction as payment of the debt. Thus, the disruption of pollination functions arose as a major factor in the creation of extinction debts. Thus, restoration policies should aim at monitoring the status of this and other ecological processes and functions in undisturbed systems, to inform its re-establishment in disturbed areas. Finally, I discuss the implications of these findings to i) the theoretical understanding of extinction debts, notably via the niche, coexistence, and metabolic theories, ii) the planning conservation measures, including communicating the very notion of extinction debts to improve understanding of the dimension of the current biodiversity crisis, and iii) future research, which must improve the understanding of the interplay between extinction cascades and extinction debts. N2 - Die Tatsache, dass es wichtig ist das Aussterben von Arten und dessen Folgen für Ökosysteme und das menschliche Leben zu verstehen, findet zunehmend öffentliche Beachtung. Unabhängig davon, wie dringlich und besorgniserregend der derzeitige Verlust an biologischer Vielfalt ist, finden Aussterbeereigniss, mit seltenen Ausnahmen, nicht unmittelbar nach einer Störung (z.B. Habitatverlust und Klimawandel) statt. Sie geschehen vielmehr viele Generationen nach der eigentlichen Störung. Dies bedeutet, dass nach einer Störung zu jeder Zeit eine bestimmte Anzahl von noch auszusterbenden Arten zu erwarten ist . Diese Anzahl wird Aussterbeschuld ("extinction debt") genannt. Solange nicht alle durch die Störung ausgelösten Aussterbeereignisse eingetreten sind, ist diese Schuld zu begleichen. Durch diese Verzögerung des Aussterbens von Arten entsteht ein Zeitfenster, in dem Erhaltungsmaßnahmen umgesetzt werden können. In dieser Forschungsarbeit untersuche ich die Bedeutung von ökologischen und evolutionären Prozessen als Folge verschiedener Störungsszenarien, um zu verstehen, wie dieses Wissen zur Verbesserung von Naturschutzmaßnahmen verwendet werden kann, um Aussterbeereignisse zu minimieren. In der Einleitung (Kapitel 1) stelle ich das Konzept der Aussterbeschuld vor und verschiedene Faktoren, die unser Verständnis dieses Sachverhaltes erschweren. Kapitel 1 fokussiert sich auf i) die theoretischen Grundlagen hinter der Definition der Aussterbeschuld und wie diese unterschiedliche Untersuchungsmethoden beeinflussten , ii) die Komplexität, ökologische Evolutionsdynamik zu verstehen und vorherzusagen, und iii) die Herausforderungen, die es mit sich bringt Aussterbeereignisse zu einer Zeit zu untersuchen, in der Störungen in natürlichen Lebensräumen weit verbreitet und vielfältig sind. Ich beginne den Hauptteil meiner Arbeit (Kapitel 2) mit einer Zusammenfassung des aktuellen Standes der empirischen, theoretischen und methodischen Forschung zur Aussterbeschuld. In den letzten 10 Jahren wurden Aussterbeschulden weltweit in einer Vielzahl von Ökosystemen und taxonomischen Gruppen festgestellt. Wenn der Größenwert der Aussterbeschuld geschätzt wird - was selten ist, da für eine Quantifizierung häufig nicht verfügbare Daten erforderlich sind -, liegt er zwischen 9 und 90\% des aktuellen Artenreichtums und variiert zwischen einer Dauer von 5 und 570 Jahren. Ich identifiziere zwei Hauptprozesse hinter der Aussterbeschuld, nämlich 1) Merkmale, die verschiedene Lebensstadien betreffen und dadurch das Überleben des Einzelnen verlängern, und 2) Populations- und Metapopulationsdynamiken, die es Populationen erlauben auch unter verschlechterten Bedingungen zu überleben. Weniger untersucht sind die mikroevolutionären Dynamiken, die während der Dauer der Aussterbeschuld auftreten, wie das verzögerte gleichzeitige Aussterben von Interaktionspartnern und die Aussterbedynamik unter verschiedenen Störungsregimen (z. B. Habitatverlust vs. Klimawandel). In den Kapiteln 3 und 4 widme ich mich diesen Fragen. Im dritten Kapitel verwende ich ein genomisch explizites, Individuen-basiertes Modell einer Pflanzengemeinschaft, um die mikroevolutionären Prozesse zu untersuchen, die nach Habitatverlust und Klimawandel ablaufen und möglicherweise zur Minderung der Aussterbeschuld beitragen. Ich zeige, dass eine demografische Erholung der Population durch Anpassung der Arteigenschaften, d.h. Rettung durch Evolution, möglich ist. In diesen Fällen äußert sich eine Änderung der Merkmale, anstatt in einer direktionalen Selektion, in einer Zunahme der Variation der Merkmale, was ich als Zeichen einer disruptiven Selektion interpretiere. Darüber hinaus kann ich die „evolutionäre Rettung“ von der „demografischen Rettung“ trennen und zeigen, dass diese beiden Arten der Rettung für die Widerstandsfähigkeit einer Gemeinschaft gleich wichtig sind. Dies weist darauf hin, dass die Wiederherstellung von Artengemeinschaften eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der biologischen Vielfalt nach Störungen spielt. Meine Ergebnisse zeigen, wie wichtig es ist, ökologische Evolutionsprozesse auf Artgemeinschaftsebene zu berücksichtigen, um den Wandel der biologischen Vielfalt zu verstehen und vorherzusagen. Darüber hinaus zeigt sich, dass die „evolutionäre Rettung“ ein begrenztes Potenzial hat, um Aussterbeereignisse unter Szenarien von Habitatverlust und Klimawandel zu vermeiden. Im vierten Kapitel vergleiche ich die Auswirkungen von Lebensraum- und Bestäubungsverlust auf die Aussterbedynamik einer Pflanzengemeinschaft. Dazu verwende ich ein Individuen- und Merkmal-basiertes Öko-Evolutionsmodell (Extinction Dynamics Model, EDM), welches für reale Mager-rasen-Arten parametrisiert worden ist. Insbesondere vergleiche ich die Auswirkungen dieser Störungen auf das Ausmaß der „extinction debt“ und die Zeitspanne bis zum Aussterben einer Art sowie darauf, wie sich die Funktionsmerkmale der einzelnen Arten auf die Aussterbedynamik der Artgemeinschaften auswirken. Ich zeige, dass Habitatverlust zu einer höheren Anzahl von unmittelbar aussterbenden Arten führt, aber der Verlust von Bestäubung eine höhere „extinction debt“ mit sich bringt, da Arten hierbei länger brauchen, um auszusterben. Darüber hinaus beeinflussten insbesondereFortpflanzungsmerkmale (klonale Fähigkeit, Abwesenheit von Selbstbestäubung und Insektenbestäubung) das Artensterben zur Tilgung der Aussterbeschuld. Bestäubung ist daher ein wesentlicher Faktor bei der Entstehung von Aussterbeschuld. Renaturierungsvorgaben müssen daher darauf abzielen, den Status ökologischer Prozesse und Funktionen in ungestörten Systemen zu überwachen, um diese in gestörten Gebieten zu verbessern. Abschließend diskutiere ich die Auswirkungen dieser Ergebnisse i) auf das theoretische Verständnis der Aussterbeschuld, insbesondere mit Hilfe der Nischen-, Koexistenz- und Metabolischen Theorie, ii) auf die Planung von Erhaltungsmaßnahmen, einschließlich der Vermittlung des Begriffs der Aussterbeschuld, um das Verständnis der Dimension der aktuellen Biodiversitätskrise zu erweitern, und iii) darauf, wie die zukünftige Forschung die Herausforderung angehen kann, das Zusammenspiel zwischen Auslöschungskaskaden und Aussterbenschuld zu verstehen. KW - Aussterbedynamik KW - Pflanzenaussterben KW - mechanistische Modellierung KW - schnelle Evolution KW - extinction dynamics KW - transient dynamics KW - Anthropocene KW - rapid evolution KW - metabolic theory of ecology Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-238738 ER - TY - THES A1 - Hartmannsberger, Beate T1 - The pathogenicity and origin of auto-antibodies in chronic inflammatory demyelinating polyradiculoneuropathy and the identification of cutaneous biomarkers in Charcot-Marie-Tooth 1A patients T1 - Die Pathogenität und Herkunft von Auto-Antikörpern bei chronisch inflammatorischer demyelinisierender Polyradikuloneuropathie und die Identifikation von Biomarkern in Haut von Charcot-Marie-Tooth 1A Patienten N2 - Peripheral neuropathies can severely affect patients. Causes for the disease are diverse but can be classified into two main groups, acquired and hereditary. Examples for these two types are chronic inflammatory demyelinating polyradiculoneuropathy (CIDP) and Charcot-Marie-Tooth disease type 1A (CMT1A). CIDP has an estimated prevalence of about 1-9:100 000. In this pathogenetically hetereo- geneous patient group about 5-10% show auto-antibodies against the node of Ranvier and present with distinct symptoms. Treatment with rituximab - a monoclonal antibody that deletes CD20 + B cells - has been shown to be effective in a majority of auto-antibody as- sociated CIDP cases. This suggests that B cells and the produced auto-antibodies might be pathogenic. Previous studies delivered evidence that auto-antibodies alone can induce nerve damage. In this study, the aim was to investigate the pathomechanism of auto-antibodies in vivo and their exact origin: For the analysis of the pathogenicity of auto-antibodies, passive transfer experiments on Lewis rats were performed with whole IgG from a patient with anti-contactin-1 (CNTN1) IgG4 auto-antibodies. IgG was infused through an intrathe- cal catheter targeting the thoracic/lumbar region of the spine over a long-term, 3-week period. In a previous study of our group, the IgG from the same patient has been re- ported to have mild pathogenic effects when applied intraneurally into the sciatic nerve of Lewis rats. In this study however, binding of auto-antibodies to nerve roots could not be detected. Neither evaluation of electrophysiological properties after the injection period nor motor and sensory skills tested throughout the injection period showed differences when compared to animals infused with control IgG. This suggests that in the chronic intrathecal protocol anti-CNTN1 auto-antibodies did not have a pathogenic effect. In peripheral blood, four B cell subsets capable to produce antibodies were previously described: memory B cells, plasmablasts (PBs), B1 cells and CD20 + CD38 hi cells. For the identification of the B cell subsets that produce auto-antibodies, purification and sort protocols as well as an enzyme-linked immuno spot (ELISpot) assay for IgG and IgM were established successfully. Since unstimulated B cell subsets produced very small amounts of IgG and IgM, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were stimulated with IL-2 and R848 for 72 h prior to sorting. While the memory B cell frequency decreased after stimulation, the frequency of CD20 + CD38 hi cells increased and the overall number of antibody-secreting cells was increased. When stimulating patient PBMCs for 10 days though, detection of anti-neurofascin-155 (NF155) auto-antibodies in supernatants by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was possible in two out of three patient samples. Even though cell sorting was feasible after 10 days of stimulation, detection of auto-antibodies could not be accomplished using antigen-specific ELISpot. Although the implementation of the cell sorting and purification protocol was successful, further adjustments of the antigen-specific ELISpot need to be performed. However, we could show that after 10 days of stimulation auto-antibody detection is possible by ELISA which helps to pre-screen if patient PBMC contain auto-reactive B cells. CMT1A has an estimated prevalence of 1:5000 and is caused by a duplication of the peripheral myelin protein 22 kDa (PMP22) gene. Patients suffer from distal weakness and muscle wasting leading even to wheelchair-dependency in some cases. Although different treatment options for CMT1A have been tested in previous clinical trials, none of them have been successful. In this study, the aim was to identify objective and reproducible outcome measures that assess the actual nerve damage in a large cohort of CMT1A patients by analyzing a series of parameters. Glabrous skin samples were collected from 48 CMT1A, 7 CIDP and 16 small fiber neuropathy patients and 45 healthy controls. 40-µm cryosections from the lateral part of the index finger were double-labeled using immunoflu- orescence to investigate cutaneous innervation. The disease severity which was assessed using the Charcot-Marie-Tooth Neuropathy Score version 2 (CMTNSv2) and ranged between mild to severe (3-27) correlated with age in CMT1A patients. Furthermore, the intraepidermal nerve fiber density (IENFD) was reduced in CMT1A patients in comparison to controls and correlated negatively with the disease severity. In controls however, the IENFD correlated inversely with age. Meissner corpuscle density tended to be reduced and correlated inversely with age in CMT1A patients. This was not observed in healthy controls though. Compared to controls, Merkel cell density was also reduced in CMT1A, while the fraction of denervated Merkel cell was increased and correlated with age. Further differences were revealed concerning the node of Ranvier. Paranodes were shortened and the fraction of long nodes was decreased in CMT1A patients compared to controls. These data suggest that the IENFD, the Meissner corpuscle and Merkel cell densities are possible candidates for outcome measures as they are associated with disease severity or age of patients. However, a reliable statement about the suitability as a marker for disease progression can not be made in this study since only six CMT1A patients agreed to give a follow-up biopsy two years later. N2 - Polyneuropathien können Patienten schwer betreffen. Krankheitsursachen sind vielfältig, können jedoch in zwei Hauptgruppen unterteilt werden. Sie können erworben oder genetisch bedingt sein. Beispiele für diese zwei Klassen sind die chronisch inflammatorische demyelinisierende Polyradikuloneuropathie (CIDP) und Charcot-Marie-Tooth-Erkrankung Typ 1A (CMT1A). CIDP hat eine geschätzte Häufigkeit von etwa 1-9:100 000. 5-10% der Patienten dieser pathogenetisch heterogenen Gruppe weisen Auto-Antikörper gegen den Ranvier’schen Schnürring auf und zeigen Symptome, die sich von anderen CIDP-Patienten unterscheiden. Es wurde gezeigt, dass die Behandlung mit Rituximab - einem monoklonalen Antiköper, der CD20+ B-Zellen deletiert - bei der Mehrheit der Auto-Antikörper-assoziierten CIDP-Fälle wirksam ist. Das deutet darauf hin, dass B-Zellen und die produzierten Auto-Antikörper pathogenetisch sein könnten. Frühere Studien liefern Beweise, dass Auto-Antikörper allein Nervenschädigungen verursachen können. Ziel dieser Studie war es, den Pathomechanismus der Auto-Antikörper in vivo zu untersuchen und deren genaue Herkunft zu ermitteln: Um die Pathogenität von Auto-Antikörpern zu ermitteln, wurden Passiv-Transfer-Versuche an Lewis Ratten mit Gesamt-IgG einer Patientin mit anti-CNTN1 IgG4 Auto-Antikörpern durchgeführt. Das IgG wurde mittels eines intrathekalen Katheters, der am thorakalen/lumbalen Abschnitt der Wirbelsäule endete, über eine langzeitige, 3-wöchige Zeitspanne injiziert. Eine frühere Studie unserer Arbeitsgruppe hat gezeigt, dass das IgG derselben Patientin milde pathogenetische Effekte hatte, als diese intraneural in den Ischiasnerv von Lewis Ratten appliziert wurden. In dieser Studie jedoch konnten keine Bindungen von Auto-Antikörpern an die Nervenwurzel ermittelt werden. Patienten-Tiere zeigten keine Unterschiede zu Tieren auf, die mit Kontroll-IgG behandelt wurden, weder in der Untersuchung von elektrophysiologischen Eigenschaften nach der Injektionszeit noch bezüglich motorischer und sensorischer Fähigkeiten, die auch während der Injektionszeit getestet wurden. Dies deutet darauf hin, dass anti-CNTN1 Auto-Antikörper keinen pathogenetischen Effekt bei Anwendung des chronischen, intrathekalen Protokolls hatten. In peripherem Blut wurden vier B-Zell-Subgruppen beschrieben, die fähig sind, Antikörper zu produzieren: Gedächtnis-B-Zellen, Plasmablasten, B1-Zellen und CD20+ CD38hi B-Zellen. Um die Auto-Antikörper-produzierenden B-Zell-Subtypen zu identifizieren, wurden Protokolle zur Anreicherung und zum Sortieren sowie zum ELISpot für IgG und IgM erfolgreich etabliert. Da die Produktion von IgG- und IgM-Antikörpern in unstimulierten B-Zell-Subtypen sehr gering war, wurden mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMCs, peripheral blood mononuclear cells) mit IL-2 und R848 vor dem Sorten für 72 h stimuliert. Während die Häufigkeit von Gedächtnis-B-Zellen nach der Stimulation abnahm, ist die Häufigkeit von CD20+ CD38hi B-Zellen gestiegen und die Gesamtzahl an Antikörper-sezernierenden Zellen hat zugenommen. Wurden Patienten PBMCs jedoch für 10 Tage stimuliert, konnten Auto-Antikörper in Überständen mittels ELISA in zwei von drei Patientenproben ermittelt werden. Obwohl das Sorten nach 10-tägiger Stimulation immernoch durchführbar war, war die Detektion von Auto-Antikörper durch antigenspezifischen ELISpot nicht erfolgreich. Trotz der gelungenen Etablierung der Anreicherungs- und Sortierungsprotokolle müssen weitere Einstellarbeiten am antigenspezifischen ELISpot-Protokoll vorgenommen werden. Trotzdem konnten wir zeigen, dass die Detektion von Auto-Antikörpern nach 10-tägiger PBMC-Stimulation mittels ELISA möglich ist, was dabei hilft zu ermitteln, ob Patienten-PBMCs auto-reaktive B-Zellen enthalten. CMT1A hat eine geschätzte Häufigkeit von etwa 1:5000 und wird durch eine Duplikation des PMP22-Gens (peripheral myelin protein 22 kDa) verursacht. Patienten leiden unter distaler Schwäche und Muskelschwund, was in manchen Fällen sogar zu Rollstuhlabhängigkeit führen kann. Obwohl verschiedene Behandlungsmöglichkeiten für CMT1A in früheren Studien getestet wurden, ist keine von ihnen erfolgreich gewesen. Das Ziel dieser Studie war es, objektive und reproduzierbare Outcome-Parameter, die den tatsächlichen Nervenschaden bemessen, in einer großen Kohorte von CMT1A-Patienten zu identifizieren, wozu eine Reihe an Parametern analysiert wurde. Von 48 CMT1A-, 7 CIDP- und 16 small fiber neuropathy- Patienten und 45 gesunden Kontrollen wurden unbehaarte Hautproben der lateralen Region des Zeigefingers entnommen. An diesen wurden Doppelfluoreszenzfärbungen vorgenommen, um die kutane Innervation zu untersuchen. Der Krankheitsgrad der CMT1A-Gruppe, der durch den Charcot-Marie-Tooth Neuropathy Score version 2 eingestuft wurde, erstreckte sich von mild bis schwer (3-27) und korrelierte mit dem Alter der Patienten. Zudem war die intraepidermale Nervenfaserdichte (IENFD) reduziert in CMT1A-Patienten im Vergleich mit gesunden Kontrollen und korrelierte invers mit dem Krankheitsgrad der Patienten. In gesunden Kontrollen korrelierte jedoch die IENFD invers mit dem Alter. Die Dichte der Meissner-Körperchen neigte zu Abnahme in CMT1A-Patienten und korrelierte negativ mit deren Alter, was nicht in gesunden Kontrollen beobachtet wurde. Im Vergleich mit gesunden Kontrollen war die Dichte der Merkel-Zellen ebenfalls verringert in CMT1A, während der Anteil von denervierten Merkel-Zellen erhöht war und mit dem Alter korrelierte. Weitere Unterschiede wurden am Ranvier’schen Schnürring festgestellt. Paranodale Regionen waren verkürzt und der Anteil von langen Schnürringen war erhöht in CMT1A-Patienten im Vergleich zu den Kontrollen. Diese Daten deuten darauf hin, dass die IENFD, die Dichten der Meissner-Körperchen und Merkel-Zellen potentielle Kandidaten für Outcome-Parameter sind, da sie entweder mit dem Krankheitsgrad oder dem Alter zusammenhängen. Jedoch kann in dieser Studie keine verlässliche Aussage über die Eignung dieser Parameter als Marker für den Krankheitsfortschritt gemacht werden, da zwei Jahre später nur sechs CMT1A-Patienten zu einer Folgebiopsie eingewilligt haben. KW - CMT1A KW - polyradiculoneuropathy KW - Charcot-Marie-Tooth 1A KW - skin KW - autoantibody KW - skin biopsy KW - B cells KW - CIDP Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-211451 ER - TY - THES A1 - Mottola, Austin T1 - Molecular characterization of the SNF1 signaling pathway in \(Candida\) \(albicans\) T1 - Molekulare Charakterisierung des SNF1-Signalweges von \(Candida\) \(albicans\) N2 - The fungus Candida albicans is a typical member of the human microbiota, where it usually behaves as a commensal. It can also become pathogenic; often causing minor superficial infections in healthy people, but also potentially fatal invasive systemic infections in immunocompromised people. Unfortunately, there is only a fairly limited set of antifungal drugs, and evolution of drug resistance threatens their efficacy. Greater understanding of the mechanisms that C. albicans uses to survive in and infect the host can uncover candidate targets for novel antifungals. Protein kinases are central to a vast array of signalling pathways which govern practically all aspects of life, and furthermore are relatively straightforward to design drugs against. As such, investigation and characterization of protein kinases in C. albicans as well as their target proteins and the pathways they govern are important targets for research. AMP-activated kinases are well conserved proteins which respond to energy stress; they are represented in yeasts by the heterotrimeric SNF1 complex, which responds primarily to the absence of glucose. In this work, the SNF1 pathway was investigated with two primary goals: identify novel targets of this protein kinase and elucidate why SNF1 is essential. Two approaches were used to identify novel targets of SNF1. In one, suppressor mutants were evolved from a strain in which SNF1 activity is reduced, which exhibits defects in carbon source utilization and cell wall integrity. This revealed a suppressor mutation within SNF1 itself, coding for the catalytic subunit of the complex – SNF1Δ311-316. The second approach screened a library of artificially activated zinc cluster transcription factors, identifying Czf1 as one such transcription factor which, upon artificial activation, restored resistance to cell wall stress in a mutant of the SNF1 pathway. Finally, a, inducible gene deletion system revealed that SNF1 is not an essential gene. N2 - Der Pilz Candida albicans ist ein typisches Mitglied der menschlichen Mikrobiota, wo er sich normalerweise als Kommensale verhält. Als fakultativ pathogener Erreger kann er jedoch auch leichte, überfachliche Infektionen bei gesunden Menschen verursachen, sowie potenziell tödliche, invasive systemische Infektionen bei immungeschwächten Menschen. Leider gibt es nur eine recht begrenzte Anzahl von Antimykotika, und die Entwicklung von Resistenzen bedroht deren Wirksamkeit. Ein besseres Verständnis der Mechanismen, die C. albicans nutzt, um im Wirt zu überleben und ihn zu infizieren, kann mögliche Angriffspunkte für neue Antimykotika aufdecken. Proteinkinasen sind von zentraler Bedeutung für eine Vielzahl von Signalwegen, die praktisch alle Aspekte des Lebens steuern und gegen die sich zudem relativ einfach Medikamente entwickeln lassen. Daher ist die Untersuchung und Charakterisierung von Proteinkinasen in C. albicans sowie ihrer Zielproteine und der von ihnen gesteuerten Signalwege ein wichtiges Ziel für die Forschung. AMP-aktivierte Kinasen sind hoch konservierte Proteine, die auf Energiestress reagieren; sie sind in Hefen durch den heterotrimeren SNF1-Komplex vertreten, der vor allem auf das Fehlen von Glukose reagiert. In dieser Arbeit wurde der SNF1-Signalweg mit zwei primären Zielen untersucht: die Identifizierung neuer Zielproteine dieser Proteinkinase und die Klärung der Frage, warum SNF1 essentiell ist. Für die Identifikation neuer Zielproteine von SNF1 wurden zwei Ansätze verwendet. Zum einen wurde ein Stamm mit reduzierter SNF1-Aktivität, für die Entwicklung von Suppressor-Mutanten verwendet, die einen Defekte bei der Verwertung von Kohlenstoffquellen und eine eingeschränkte Zellwandintegrität aufweisen. Dabei wurde eine Suppressormutation in SNF1 selbst entdeckt, die für die katalytische Untereinheit des Komplexes – SNF1Δ311-316 - kodiert. Für den zweite Ansatz wurde eine Bibliothek von künstlich aktivierten Zink-Cluster-Transkriptionsfaktoren untersucht. Dies führte zur Identifikation von Czf1 als einen solchen Transkriptionsfaktor, der nach künstlicher Aktivierung die Resistenz gegen Zellwandstress in einer Mutante des SNF1- Signalweges wiederherstellte. Schließlich zeigte ein induzierbares Gendeletionssystem, dass SNF1 kein essentielles Gen ist. KW - candida albicans KW - yeast KW - fungus KW - candida KW - kinase KW - cell wall Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-238098 ER - TY - THES A1 - Veepaschit, Jyotishman T1 - Identification and structural analysis of the Schizosaccharomyces pombe SMN complex T1 - Identifizierung und Strukturanalyse des Schizosaccharomyces pombe SMN-Komplex N2 - The biogenesis of spliceosomal UsnRNPs is a highly elaborate cellular process that occurs both in the nucleus and the cytoplasm. A major part of the process is the assembly of the Sm-core particle, which consists of a ring shaped heptameric unit of seven Sm proteins (SmD1•D2•F•E•G•D3•B) wrapped around a single stranded RNA motif (termed Sm-site) of spliceosomal UsnRNAs. This process occurs mainly in the cytoplasm by the sequential action of two biogenesis factors united in PRMT5- and SMN-complexes, respectively. The PRMT5-complex composed of the three proteins PRMT5, WD45 and pICln is responsible for the symmetric dimethylation of designated arginine residues in the C-terminal tails of some Sm proteins. The action of the PRMT5- complex results in the formation of assembly incompetent Sm-protein intermediates sequestered by the assembly chaperone pICln (SmD1•D2•F•E•G•pICln and pICln•D3•B). Due to the action of pICln, the Sm proteins in these complexes fail to interact with UsnRNAs to form the mature Sm-core. This kinetic trap is relieved by the action of the SMN-complex, which removes the pICln subunit and facilitates the binding of the Sm-core intermediates to the UsnRNA, thus forming the mature Sm-core particle. The human SMN complex consists of 9 subunits termed SMN, Gemin2-8 and Unrip. So far, there are no available atomic structures of the whole SMN-complex, but structures of isolated domains and subunits of the complex have been reported by several laboratories in the past years. The lack of structural information about the entire SMN complex most likely lies in the biophysical properties of the SMN complex, which possesses an oligomeric SMN core, and many unstructured and flexible regions. These were the biggest roadblocks for its structural elucidation using traditional methods such as X-ray crystallography, NMR or CryoEM. To circumvent these obstacles and to obtain structural insight into the SMN-complex, the Schizosaccharomyces pombe SMN complex was used as a model system in this work. In a collaboration with the laboratory of Dr. Remy Bordonne (IGMM, CNRS, France), we could show that the SpSMN complex is minimalistic in its composition, consisting only of SpSMN, SpGemin2, SpGemin8, SpGemin7 and SpGemin6. Using biochemical experiments, an interaction map of the SpSMN complex was established which was found to be highly similar to the reported map of the human SMN complex. The results of this study clearly show that SpSMN is the oligomeric core of the complex and provides the binding sites for the rest of the subunits. Through biochemical and X-ray scattering experiments, the properties of the SpSMN subunit such as oligomerization viii and intrinsic disorder, were shown to determine the overall biophysical characteristics of the whole complex. The structural basis of SpSMN oligomerization is presented in atomic detail which establishes a dimeric SpSMN as the fundamental unit of higher order SpSMN oligomers. In addition to oligomerization, the YG-box domain of SpSMN serves as the binding site for SpGemin8. The unstructured region of SpSMN imparts an unusual large hydrodynamic size, intrinsic disorder, and flexibility to the whole complex. Interestingly, these biophysical properties are partially mitigated by the presence of SpGemin8•SpGemin7•SpGemin6 subunits. These results classify the SpSMN complex as a multidomain entity connected with flexible linkers and characterize the SpSMN subunit to be the central oligomeric structural organizer of the whole complex. N2 - Die Biogenese von spliceosomalen UsnRNPs ist ein hochkomplexer zellulärer Prozess, der sowohl im Zellkern als auch im Zytoplasma stattfindet. Ein Hauptteil dieses Prozesses ist der Aufbau des Sm-Kernpartikels, der aus einem ringförmigen Heptamer aus sieben Sm-Proteinen (SmD1 · D2 · F · E · G · D3 · B) besteht, die um ein einzelsträngiges RNA-Motiv (das auch als Sm-Stelle bezeichnet wird) der spliceosomalen U snRNAs gewickelt ist. Dieser Prozess findet hauptsächlich im Zytoplasma durch die sequenzielle Wirkung von zwei Biogenesefaktoren statt, den PRMT5 und den SMN-Komplexen. Der PRMT5-Komplex besteht aus den drei Proteinen PRMT5, WD45 und pICln und ist für die symmetrische Dimethylierung bestimmter Argininreste in den C-terminalen Schwänzen einiger Sm-Proteine verantwortlich. Die Wirkung des PRMT5-Komplexes führt zur Bildung von inkompetenten Sm-Protein-Intermediaten, die durch das Assemblierungs-Chaperon pICln (SmD1 · D2 · F · E · G · pICln und pICln · D3 · B) sequestriert werden. Aufgrund der Wirkung von pICln interagieren die Sm-Proteine in diesen Komplexen nicht mit den U snRNAs, um den reifen Sm-Kern zu bilden. Diese kinetische Falle wird durch die Wirkung des SMN-Komplexes aufgelöst, der die pICln-Untereinheit entfernt und die Bindung der Sm-Core-Zwischenprodukte an die U snRNA erleichtert, wodurch der reife Sm-Core-Partikel gebildet wird. Der menschliche SMN-Komplex besteht aus 9 Untereinheiten, die als SMN, Gemin2-8 und Unrip bezeichnet werden. Bisher sind keine atomaren Strukturen des gesamten SMN-Komplexes verfügbar, aber Strukturen isolierter Domänen und Untereinheiten des Komplexes wurden in den letzten Jahren von mehreren Laboratorien beschrieben. Der Mangel an strukturellen Informationen über den gesamten SMN-Komplex liegt höchstwahrscheinlich in den biophysikalischen Eigenschaften des SMN-Komplexes, der einen oligomeren SMN-Kern und viele unstrukturierte und flexible Regionen besitzt. Dies waren die größten Hindernisse für die Strukturaufklärung mit traditionellen Methoden wie Röntgenkristallographie, NMR oder CryoEM. Um diese Hindernisse zu umgehen und strukturelle Einblicke in den SMN-Komplex zu erhalten, wurde in dieser Arbeit der SMN-Komplex von Schizosaccharomyces pombe als Modellsystem verwendet. In Zusammenarbeit mit dem Labor von Dr. Remy Bordonne (IGMM, CNRS, Frankreich) konnten wir zeigen, dass der SpSMN-Komplex in seiner Zusammensetzung minimalistisch ist und nur aus SpSMN, SpGemin2, SpGemin8, SpGemin7 und SpGemin6 besteht. Mit biochemischer Experimenten wurde eine x Interaktionskarte des SpSMN-Komplexes erstellt, die der bekannten Karte des menschlichen SMN-Komplexes sehr ähnlich war. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen deutlich, dass SpSMN der oligomere Kern des Komplexes ist und die Bindungsstellen für den Rest der Untereinheiten bereitstellt. Durch biochemische und Röntgenstreuungsexperimente wurde gezeigt, dass die Eigenschaften der SpSMNUntereinheit wie Oligomerisierung und intrinsische Störung die gesamten biophysikalischen Eigenschaften des gesamten Komplexes bestimmen. Die strukturelle Basis der SpSMN-Oligomerisierung wird atomar detailliert dargestellt, wodurch ein dimeres SpSMN als zentrale Grundeinheit der SpSMN-Oligomere höherer Ordnung festgelegt wird. Zusätzlich zur Oligomerisierung dient die YG-Box- Domäne von SpSMN als Bindungsstelle für SpGemin8. Die unstrukturierte Region von SpSMN verleiht dem gesamten Komplex eine ungewöhnlich große hydrodynamische Größe, intrinsische Unordnung und Flexibilität. Interessanterweise werden diese biophysikalischen Eigenschaften teilweise durch das Vorhandensein von SpGemin8 • SpGemin7 • SpGemin6-Untereinheiten gemindert. Diese Ergebnisse klassifizieren den SpSMN-Komplex als eine mit flexiblen Wechselwirkungen verbundene Multidomäneneinheit und charakterisieren die SpSMN-Untereinheit als den zentralen oligomeren Strukturorganisator des gesamten Komplexes. KW - Multiproteinkomplex KW - Survival Motor Neuron KW - Protein purification KW - X-ray crystallography KW - Small angle X-ray scattering KW - Biogenese KW - Schizosaccharomyces pombe KW - SMN Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-238365 ER - TY - THES A1 - Peters, Simon T1 - The impact of sphingolipids on \(Neisseria\) \(meningitidis\) and their role in meningococcal pathogenicity T1 - Einfluss von Sphingolipiden auf \(Neisseria\) \(meningitidis\) und deren Bedeutung für die Pathogenität N2 - The obligate human pathogen Neisseria meningitidis is a major cause of sepsis and meningitis worldwide. It affects mainly toddlers and infants and is responsible for thousands of deaths each year. In this study, different aspects of the importance of sphingolipids in meningococcal pathogenicity were investigated. In a first step, the acid sphingomyelinase (ASM), which degrades membrane sphingomyelin to ceramide, was studied in the context of meningococcal infection. A requirement for ASM surface activity is its translocation from the lysosomal compartment to the cell surface, a process that is currently poorly understood. This study used various approaches, including classical invasion and adherence assays, flow cytometry, and classical and super resolution immunofluorescence microscopy (dSTORM). The results showed that the live, highly piliated N. meningitidis strain 8013/12 induced calcium-dependent ASM translocation in human brain microvascular endothelial cells (HBMEC). Furthermore, it promoted the formation of ceramide-rich platforms (CRPs). In addition, ASM translocation and CRP formation were observed after treating the cells with pili-enriched fractions derived from the same strain. The importance for N. meningitidis to utilize this pathway was shown by the inhibition of the calcium-dependent ASM translocation, which greatly decreased the number of invasive bacteria. I also investigated the importance of the glycosphingolipids GM1 and Gb3. The results showed that GM1, but not Gb3, plays an important role in the ability of N. meningitidis to invade HBMEC. By combining dSTORM imaging and microbiological approaches, we demonstrated that GM1 accumulated prolifically around bacteria during the infection, and that this interaction seemed essential for meningococcal invasion. Sphingolipids are not only known for their beneficial effect on pathogens. Sphingoid bases, including sphingosine, are known for their antimicrobial activity. In the last part of this study, a novel correlative light and electron microscopy approach was established in the combination with click chemistry to precisely localize azido-functionalized sphingolipids in N. meningitidis. The result showed a distinct concentration-dependent localization in either the outer membrane (low concentration) or accumulated in the cytosol (high concentration). This pattern was confirmed by mass spectrometry on separated membrane fractions. Our data provide a first insight into the underlying mechanism of antimicrobial sphingolipids. N2 - Der obligate Humanpathogen Neisseria meningitidis ist weltweit einer der Hauptursachen für Sepsis und Meningitis. Er befällt vor allem Kleinkinder und Säuglinge und ist jedes Jahr für Tausende von Todesfällen verantwortlich. In dieser Studie wurden verschiedene Aspekte der Bedeutung von Sphingolipiden bei der Pathogenität von Meningokokken untersucht. In einem ersten Schritt wurde die saure Sphingomyelinase (ASM), die Membran-Sphingomyelin zu Ceramid abbaut, im Zusammenhang mit einer Meningokokken-Infektion untersucht. Eine Voraussetzung für die Oberflächenaktivität der ASM ist ihre Translokation vom lysosomalen Kompartiment auf die Zelloberfläche, ein Prozess, der derzeit noch wenig verstanden wird. In dieser Studie wurden verschiedene Ansätze verwendet, darunter klassische Invasions- und Adhärenztests, Durchflusszytometrie sowie klassische und superauflösende Immunfluoreszenzmikroskopie (dSTORM). Die Ergebnisse zeigten, dass der lebende, hochpiliatisierte N. meningitidis Stamm 8013/12 eine kalziumabhängige ASM-Translokation in mikrovaskulären Endothelzellen des menschlichen Gehirns (HBMEC) induzierte. Des Weiteren förderte er die Bildung Ceramid-reicher Plattformen (CRPs). Zusätzlich wurden ASM-Translokation und CRP-Bildung beobachtet, nachdem die Zellen mit pili-angereicherten Fraktionen desselben Stammes behandelt worden waren. Die Bedeutung für N. meningitidis in der Pathogenese zeigte sich durch die Hemmung der Calcium-abhängigen ASM-Translokation, wodurch die Zahl der invasiven Bakterien stark reduziert wurde. Ich untersuchte auch die Bedeutung der Glykosphingolipide GM1 und Gb3. Die Ergebnisse zeigten, dass GM1, aber nicht Gb3, eine wichtige Rolle bei der Fähigkeit von N. meningitidis spielt, in Gehirnendothelzellen einzudringen. Durch die Kombination von dSTORM-Bildgebung und mikrobiologischen Ansätzen konnten wir zeigen, dass sich GM1 während der Infektion vermehrt um die Bakterien herum anreicherte und dass diese Interaktion für die Invasion von Meningokokken essenziell ist. Sphingolipide sind nicht nur für ihre positive Wirkung auf Krankheitserreger bekannt. Sphingoidbasen, einschließlich Sphingosin, sind zusätzlich für ihre antimikrobielle Aktivität bekannt. Im letzten Teil dieser Studie wurde ein neuartiger korrelativer licht- und elektronenmikroskopischer Ansatz in der Kombination mit Click-Chemie etabliert, um azidofunktionalisierte Sphingolipide in N. meningitidis genau zu lokalisieren. Das Ergebnis zeigte eine deutliche konzentrationsabhängige Lokalisation entweder in der äußeren Membran (niedrige Konzentration) oder akkumuliert im Zytosol (hohe Konzentration). Dieses Muster konnte durch einen Massenspektrometrischen Ansatz bestätigt werden. Hierfür wurde eine Separation der inneren und äußeren Membran, nach Behandlung mit der niedrigen Konzentration, etabliert. Die verschiedenen Membranfraktionen wurden anschließend auf ihren Gehalt an funktionalisierten Sphingolipiden hin untersucht und bestätigten die lokalisierung in der äußeren Membran. Unsere Daten geben einen ersten Einblick in den zugrundeliegenden Mechanismus der antimikrobiellen Sphingolipide. KW - Neisseria meningitidis KW - Sphingolipide KW - Infektion KW - Pathogenität KW - host-pathogen interaction KW - antimicrobial Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-226233 ER - TY - THES A1 - Braun, Alexandra T1 - Psychosocial and somatic resilience factors of patients with fibromyalgia syndrome (FMS) T1 - Psychosoziale und somatische Resilienzfaktoren bei Patienten mit dem Fibromyalgie Syndrom (FMS) N2 - Background: In recent years, health care has increasingly become the focus of public interest, politics, health insurance companies, and research. This includes the development of therapeutic concepts that can respond individually to patients' resources in order to improve coping with chronic diseases. Research into psychosocial and biological resilience factors is very important and the basic objective of the present work. I studied patients with fibromyalgia syndrome (FMS), who suffer among others from chronic pain, fatigue, sleep and gastrointestinal problems. This patient cohort is characterized by a pronounced heterogeneity in terms of clinical outcome, degree in disability and coping. FMS has a prevalence of 3 – 8 % in the Western population and has a significant socio-economic impact. Validated psychosocial resilience factors include optimism, humor, coherence, self-efficacy, awareness with one's own resources and the ability to apply them profitably (coping), and a healthy social environment with positive relationships. Studies in patients with cancer revealed religiosity as positive and negative factor on the health outcome, but there is little data on religious aspects of pain resilience. Various genetic polymorphisms and anti-inflammatory cytokines are known as biological resilience factors. Various microRNA (miRNA) were detected to contribute to resilience in the context of stress and psychiatric disorders. Objective: The underlying research question of this work is to understand the factors that make some FMS patients resilient and others not, even though they suffer from the same disease. The long-term aim was to understand mechanisms and influencing factors of resilience to design preventive and resource-oriented therapies for FMS patients. Material and Methods: Three studies examined religious, physiological, biological, and psychosocial factors which may contribute to resilience in FMS patients. Study one combined data of questionnaires, a psychosocial interview, and regression analyses to investigate the relevance of religiosity for coping and resilience. Study two examined variance explaining factors and defined clusters among FMS patients by their differences in coping, pain phenotype and disability. The factor analysis used variables derived from questionnaires and qPCR of cytokines in white blood samples (WBC) of patients and healthy controls. Study three assessed cluster-wise miRNA signatures which may underly differences in behaviour, emotional and physiological disability, and resilience among patient clusters. A cluster-specific speculative model of a miRNA-mediated regulatory cycle was proposed and its potential targets verified by an online tool. Results: The data from the first study revealed a not very religious patient cohort, which was rather ambivalent towards the institution church, but described itself as a believer. The degree of religiosity played a role in the choice of coping strategy but had no effect on psychological parameters or health outcomes. The coping strategy "reinterpretation", which is closely related iv to the religious coping "reappraisal", had the highest influence on FMS related disability. Cognitive active coping strategies such as reappraisal which belongs to religious coping had the highest effect on FMS related disability (resilience) and could be trained by a therapist. Results from the second study showed high variances of all measured cytokines within the patient group and no difference between patient and control group. The high dispersion indicated cluster among patients. Factor analysis extracted four variance-explaining factors named as affective load, coping, pain, and pro-inflammatory cytokines. Psychological factors such as depression were the most decisive factors of everyday stress in life and represented the greatest influence on the variance of the data. Study two identified four clusters with respective differences in the factors and characterized them as poorly adapted (maladaptive), well adapted (adaptive), vulnerable and resilient. Their naming was based on characteristics of both resilience concepts, indicated by patients who were less stress-sensitive and impaired as a personal characteristic and by patients who emerged as more resilient from a learning and adaptive process. The data from the variance analysis suggests that problem- and emotion-focused coping strategies and a more anti-inflammatory cytokine pattern are associated with low impairment and contribute to resilience. Additional favorable factors include low anxiety, acceptance, and persistence. Some cluster-specific intervention proposals were created that combine existing concepts of behavioral and mindfulness therapies with alternative therapies such as vitamin D supplementation and a healthy intestinal flora. The results of the third study revealed lower relative gene expression of miR103a-3p, miR107, and miR130a-3p in the FMS cohort compared to the healthy controls with a large effect size. The adaptive cluster had the highest gene expression of miR103a-3p and tendentially of miR107, which was correlated with the subscale score "physical abuse" of the trauma questionnaire. Further correlations were found in particular with pain catastrophizing and FMS-related disability. MiR103a-3p and miR107 form a miRNA-family. Based on this, we proposed a miR103a/107 regulated model of an adaptive process to stress, inflammation and pain by targeting genetic factors which are included in different anti-inflammatory and stress-regulating pathways. Conclusion: All three studies provide new insights into resilience in FMS patients. Cognitive coping (reappraisal/reinterpretation) plays a central role and thus offers therapeutic targets (reframing in the context of behavioral therapy). Religosity as a resilience factor was only partially valid for our patient cohort. Basically, the use of resource-oriented therapy in large institutions still requires research and interdisciplinary cooperation to create a consensus between the humanities, natural sciences and humanism. N2 - Hintergrund: Die Gesunderhaltung ist in den letzten Jahren mehr und mehr in den Fokus des Interesses der Öffentlichkeit, Politik, Krankenkassen und Forschung gerückt. Dazu zählt auch die Entwicklung von Therapiekonzepten, die individuell auf die Bedürfnisse und Ressourcen der Patienten zugeschnitten sind, um den Umgang mit insbesondere chronischen Erkrankungen zu verbessern. Die Erforschung von psychosozialen und biologischen Resilienzfaktoren ist hierfür sehr wichtig, und das grundlegende Ziel der vorliegenden Arbeit. Zielgruppe sind Patienten mit Fibromyalgiesyndrom (FMS). Symptome des FMS sind u.a. chronischer Schmerz, Erschöpfung, Schlaf und Magen-, Darmprobleme. Die Patientengruppe erscheint in der Klinik als sehr heterogene mit unterschiedlichen Beeinträchtigungsgraden und verschiedenen Strategien, mit den Auswirkungen der Erkrankung umzugehen. Die Prävalenz des FMS liegt bei 3 – 8% in der westlichen Bevölkerung und ist somit von erheblicher gesellschaftlicher und sozioökonomischer Bedeutung. Validierte psychosoziale Resilienzfaktoren sind u.a. Optimismus, Humor, Kohärenzgefühl, Selbstwirksamkeit, Bewusstsein der eigenen Ressourcen und die Fähigkeit diese gewinnbringend anzuwenden (Coping) und ein gesundes soziales Umfeld mit positiven Beziehungen. Studien an Krebspatienten ergaben unterschiedliche Effekte von Religiosität als Copingstrategie und Resilienzfaktor. Im Allgemeinen liegen wenige Daten vor zum Thema Religiosität / als Schutzfaktor bei Schmerzpatienten. Als biologische Resilienzfaktoren sind verschiedene genetische Polymophismen, anti-inflammatorische Zytokine und microRNA (miRNA) bekannt, die zur Resilienz bei chronischem Stress und psychiatrischen Krankheitsbildern beitragen. Ziel: Die zugrundeliegende Forschungsfrage dieser vorliegenden Arbeit ist, welche Faktoren dazu beitragen, dass manche Patienten resilienter sind als andere, obwohl sie unter derselben Erkrankung leiden. Das langfristige Ziel dieser Forschung ist es, Mechanismen und Einflussfaktoren der Resilienz zu verstehen, um präventive und gezielte Ressourcen-orientierte Therapien für FMS Patienten zu entwickeln. Material und Methoden: Insgesamt drei Studien untersuchten explorativ eine Reihe von religiösen, physiologischen, biologischen und psychosozialen Faktoren und ihre Rolle als Schutzfaktor bei Patienten mit FMS. Studie 1 kombinierte Daten von Fragebögen, einem psychologischen Interview und Regressionsanalysen, um die Relevanz von Religiosität für das Coping und Resilienz zu untersuchen. Studie 2 versuchte mit einer explorativen Faktorenanalyse Einflussfaktoren zu ermitteln, die für die heterogene Datenlage der Patienten verantwortlich sind. Mithilfe einer Clusteranalyse wurden Subgruppen anhand ihrer Unterschiede in mentaler Gesundheit, Coping, Schmerzphänotyp und Beeinträchtigung definiert. Die Faktorenanalyse verwendete Daten der Fragebögen und Genexpressionsanalysen ausgewählter Zytokine aus Blutproben der Patienten und einer gesunden Kontrollgruppe. Zuletzt wurden Cluster-spezifische Therapievorschläge auf der Basis bereits bekannter Therapien zusammengestellt. Studie 3 bestimmte Cluster-charakteristische miRNA Signaturen, die verantwortlich für die Cluster-spezifischen Unterschiede in Verhalten (coping), emotionaler und körperlicher Beeinträchtigung, und Resilienz sein können. Die Ergebnisse wurden in einem Regulationsschema zusammengefasst und schlagen einen möglichen miRNA-regulierten Mechanismus von adaptivem Verhalten vor. Die potentiellen genetischen Targets wurden mittels eines online Tools „Target Scan Human“ verifiziert. Ergebnisse: Die Daten der ersten Studie zeigten eine wenig religiöse Patientenkohorte, die der Institution Kirche eher ambivalent gegenüberstand, sich jedoch dennoch als gläubig beschrieb. Der Grad der Religiosität spielte eine Rolle bei der Wahl der Copingstrategie, hatte jedoch keinen Einfluss auf psychologische Parameter oder die Gesundheit. Die Copingstrategie „Reinterpretation“, welche auch nah verwandt mit dem religiösen Coping „reappraisal“ ist, hatte einen signifikanten Einfluss auf die Beeinträchtigung, und könnte innerhalb einer Verhaltenstherapie erlernt werden. Ergebnisse der zweiten Studie zeigen hohe Varianzen aller gemessenen Zytokine innerhalb der Patientengruppe und keinen signifikanten Unterschied zwischen Patienten- und Kontrollgruppe. Die hohe Streuung deutete auf Subgruppen innerhalb der FMS Kohorte hin. Mittels einer Faktorenanalyse wurden vier Faktoren ermittelt, die dieser Varianz zugrunde liegen, welche absteigend als affektive Belastung, Coping, Schmerz und pro-inflammatorische Zytokine benannt wurden. Interessant ist, dass psychische Faktoren wie Depression den höchsten Einfluss auf die Belastung im Alltag darstellten und auch den größten Einfluss auf die Varianz der Daten abbildete. Studie 2 konnte vier Subgruppen mit jeweiligen Unterschieden in den charakterisierten Faktoren ermitteln und diese als schlecht angepasst (maladaptive), gut angepasst (adaptive), vulnerabel und resilient charakterisieren. Ihre Benennung basierte auf Charakteristika beider Resilienzkonzepte. Es gab Anzeichen für Patienten, die weniger stresssensibel und beeinträchtigt waren aufgrund von Persönlichkeitsstrukturen sowie Patienten, die aus einem Lern- und Anpassungsprozess nun resilienter hervorgingen. Die Daten der Varianzanalyse legten nahe, dass problem- und emotionsfokussierte Copingstrategien und ein eher antiinflammatorisches Zytokinmuster mit einer niedrigen Beeinträchtigung assoziiert sind und eher zur Resilienz beitragen. Zusätzliche begünstigende Faktoren sind niedrige Angstwerte, Akzeptanz und Durchhaltevermögen. Basierend auf diesen Erkenntnissen wurden einige Subgruppen-spezifische Interventionsvorschläge vorgestellt, welche bereits existierende Konzepte der Verhaltens- und Achtsamkeitstherapien mit alternativen Therapien wie Supplementierung von Vitamin D und eine gesunde Darmflora miteinander kombinieren. Die Ergebnisse der dritten Studie zeigten eine niedrigere relative Genexpression von miR103a-3p, miR107 und miR130a-3p in der FMS Kohorte verglichen mit der gesunden Kontrollkohorte mit einer großen Effektstärke. Die höchste relative Genexpression zeigte miR103a im adaptiven Cluster, das Cluster mit der niedrigsten Beeinträchtigung. MiR107 tendierte zu einer leicht erhöhten relativen Expression im adaptiven Cluster und war mit dem Subskalenscore „körperlicher Missbrauch“ des Traumafragebogens korreliert. Weitere Korrelationen fanden sich insbesondere mit den Variablen psychologischer Fragebögen zu Schmerz Katastrophisieren und FMS-bezogene Beeinträchtigung. MiR103a-3p und miR107 bilden zuammen eine miRNA Familie mit gleichen physiologischen Funktionen. Basierend auf diesen Erkenntnissen, schlugen wir ein Model der miR103a/107 regulierten Anpassung an Stress, Entzündung und Schmerz unter Einbezug verifizierter Gene, vor. Schlussfolgerung: Zusammenfassend geben alle drei Studien neue Einblicke in die Resilienzfaktoren von FMS Patienten. Dabei kommt dem kognitiven Coping (reappraisal / reinterpretation) eine zentrale Rolle zu, was therapeutische Ansatzpunkte (reframing innerhalb einer Verhaltenstherapie) bietet. Religiosität konnte sich in der hier untersuchten Kohorte als Schutzfaktor nur bedingt validieren. Grundsätzlich benötigt der Einsatz von ressourcenorientierter Therapie innerhalb großer Kliniken noch einiges an Forschung und interdisziplinärer Zusammenarbeit, die einen Konsens zwischen Geisteswissenschaften, Naturwissenschaften und Humanismus schafft. KW - Resilienz KW - resilience KW - Fibromyalgia KW - somatic resilience KW - psychosocial resilience Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-242809 ER - TY - THES A1 - Gupta, Rohini T1 - Intracellular self-activation of the TrkB kinase domain causes FAK phosphorylation and disrupts actin filopodia dynamics T1 - Intrazelluläre Selbst-aktivierung der TrkB Kinase induziert FAK Phosphorylierung und verändert die Dynamik von Aktinfilopodien N2 - The tropomysin receptor kinase B (TrkB), the receptor for the neurotrophin brain-derived neurotrophic factor (BDNF), plays an important role in neuronal survival, neuronal differentiation, and cellular plasticity. Conventionally, TrkB activation is induced by binding of BDNF at extracellular sites and subsequent dimerization of receptor monomers. Classical Trk signaling concepts have failed to explain ligand-independent signaling of intracellular TrkB or oncogenic NTRK-fusion proteins. The intracellular activation domain of TrkB consists of a tyrosine kinase core, with three tyrosine (Y) residues at positions 701, 705 and 706, that catalyzes the phosphorylation reaction between ATPγ and tyrosine. The release of cisautoinhibition of the kinase domain activates the kinase domain and tyrosine residues outside of the catalytic domain become phosphorylated. The aim of this study was to find out how ligand-independent activation of TrkB is brought about. With the help of phosphorylation mutants of TrkB, it has been found that a high, local abundance of the receptor is sufficient to activate TrkB in a ligand-independent manner. This self-activation of TrkB was blocked when either the ATP-binding site or Y705 in the core domain was mutated. The vast majority of this self-active TrkB was found at intracellular locations and was preferentially seen in roundish cells, lacking filopodia. Live cell imaging of actin dynamics showed that self-active TrkB changed the cellular morphology by reducing actin filopodia formation. Signaling cascade analysis confirmed that self-active TrkB is a powerful activator of focal adhesion kinase (FAK). This might be the reason why self-active TrkB is able to disrupt actin filopodia formation. The signaling axis from Y705 to FAK could be mimicked by expression of the soluble, cytosolic TrkB kinase domain. However, the signaling pathway was inactive, when the TrkB kinase domain was targeted to the plasmamembrane with the help of artificial myristoylation membrane anchors. A cancer-related intracellular NTRK2-fusion protein (SQSTM1-NTRK2) also underwent constitutive kinase activation. In glioblastoma-like U87MG cells, self-active TrkB kinase reduced cell migration. These constitutive signaling pathways could be fully blocked within minutes by clinically approved, anti-tumorigenic Trk inhibitors. Moreover, this study found evidences for constitutively active, intracellular TrkB in tissue of human grade IV glioblastoma. In conclusion, the data provide an explanation and biological function for selfactive, constitutive TrkB kinase domain signaling, in the absence of a ligand. N2 - Die Rezeptortyrosinkinase TrkB, der Rezeptor für das Neurotrophin brain-derived neurotrophic factor (BDNF), spielt eine wichtige Rolle für das neuronale Überleben, die neuronale Differenzierung und die zelluläre Plastizität. Üblicherweise wird TrkB bei der Bindung von BDNF an extrazellulären Domänen durch Dimerisierung von Rezeptormonomeren aktiviert. Klassische Konzepte der Trk Signalübertragung können jedoch die Liganden-unabhängige Signalübertragung von intrazellulären TrkB- oder Onkogen-aktiven NTRK-Fusionsproteinen nicht erklären. Die intrazelluläre Aktivierungsdomäne von TrkB besitzt eine Tyrosinkinasedomäne mit drei Tyrosin (Y)-Resten an den Positionen 701, 705 und 706. Diese katalysieren die Phosphorylierungsreaktion zwischen ATPγ und Tyrosin. Durch die Enthemmung der cis-Autoinhibition wird die Kinase-Domäne aktiv und Tyrosinreste außerhalb der katalytischen Domäne werden phosphoryliert. Ziel dieser Arbeit war herauszufinden, wie es zur Liganden-unabhängigen Aktivierung von TrkB kommen kann. Mit Hilfe von TrkB-Phosphorylierungsmutanten wurde gefunden, dass eine hohe, lokale Abundanz des Rezeptors ausreicht, um TrkB Liganden-unabhängig zu aktivieren. Diese Selbstaktivierung von TrkB konnte blockiert werden, wenn entweder die ATP-bindende Domäne oder Y705 in der Kinasedomäne mutiert wurden. Die überwiegende Mehrheit dieses selbstaktivierenden TrkB wurde intrazellulär, in rundlichen Zellen ohne Filopodien, gefunden. Live-Zellbildgebung der Aktindynamik zeigte zudem, dass selbstaktives TrkB die Zellmorphologie veränderte, indem es die Bildung von Aktin-Filopodien reduzierte. Die Analyse von Signalkaskaden bestätigte, dass selbstaktives TrkB ein starker Aktivator der Focal Adhesion Kinase (FAK) ist. Dies kann der Grund sein, warum selbstaktives TrkB die Bildung von Aktin-Filopodien zerstört. Die Signalkaskade von Y705 bis FAK konnte durch Expression der löslichen, zytosolischen TrkB-Kinase-Domäne imitiert werden. Der Signalweg war jedoch inaktiv, wenn die TrkB-Kinase-Domäne durch künstliche Myristoylierung an die Plasmamembran gebunden wurde. Ein intrazelluläres NTRK2-Fusionsprotein (SQSTM1-NTRK) zeigte ebenfalls konstitutive Kinaseaktivierung. In Glioblastom-ähnlichen U87MG-Zellen reduzierte die selbstaktive TrkB-Kinase sogar die Zellwanderung. Die konstitutiven Signalwege konnten durch klinisch zugelassene, anti-tumorale Trk-Inhibitoren innerhalb von Minuten vollständig blockiert werden. Darüber hinaus zeigt diese Studie Beweise für konstitutiv-aktives, intrazelluläres TrkB im Gewebe von humanem Glioblastom Grad IV. Die Daten dieser Arbeit geben somit eine Erklärung und eine biologische Funktion für die selbst-aktive, konstitutive Signalübertragung der TrkB-Kinase-Domäne, in Abwesenheit eines Liganden. KW - TrkB KW - self-activation KW - NTRK fusions KW - tyrosine kinase KW - BDNF KW - phosphorylation KW - cancer Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-233829 ER - TY - THES A1 - Richter, Julian Alexander Jürgen T1 - Wave-CAIPI for Accelerated Dynamic MRI of the Thorax T1 - Beschleunigte Dynamische MR-Bildgebung des Thorax mit wave-CAIPI N2 - In summary, the wave-CAIPI k-space trajectory presents an efficient sampling strategy for accelerated MR acquisitions. Using wave-CAIPI in parallel imaging reconstructions leads to a reduced noise level in the reconstructed images, compared to the Cartesian standard trajectory. This effect could be quantified by means of noise and SNR calculations. An SNR gain can be traded for a reduced scan time, i.e., additional undersampling, or for an enhanced image quality, keeping scan time constant. Acceleration of MR imaging is especially important in dynamic applications, since these examinations are inherently time-consuming. The impact of wave-CAIPI sampling on image quality and its potential for scan time reduction was investigated for two dynamic applications: self-gated dynamic 3D lung MRI during free breathing and cardiac 4D flow MRI. Dynamic 3D Lung MRI By employing wave-CAIPI sampling in self-gated, free-breathing dynamic 3D lung MRI for the purpose of radiotherapy treatment planning, the image quality of accelerated scans could be enhanced. Volunteer examinations were used to quantify image quality by means of similarity between accelerated and reference images. To this end, the normalized mutual information and the root-mean-square error were chosen as quantitative image similarity measures. The wave-CAIPI sampling was shown to exhibit superior quality, especially for short scan times. The values of the normalized mutual information were (10.2 +- 7.3)% higher in the wave-CAIPI case -- the root-mean-square error was (18.9 +- 13.2)% lower on average. SNR calculations suggest an average SNR benefit of around 14% for the wave-CAIPI, compared to Cartesian sampling. Resolution of the lung in 8 breathing states can be achieved in only 2 minutes. By using the wave-CAIPI k-space trajectory, precise tumor delineation and assessment of respiration-induced displacement is facilitated. Cardiac 4D Flow MRI In 4D flow MRI, acceleration of the image acquisition is essential to incorporate the corresponding scan protocols into clinical routine. In this work, a retrospective 6-fold acceleration of the image acquisition was realized. Cartesian and wave-CAIPI 4D flow examinations of healthy volunteers were used to quantify uncertainties in flow parameters for the respective sampling schemes. By employing wave-CAIPI sampling, the estimated errors in flow parameters in 6-fold accelerated scans could be reduced by up to 55%. Noise calculations showed that the noise level in 6-fold accelerated 4D flow acquisitions with wave-CAIPI is 43% lower, compared to Cartesian sampling. Comparisons between Cartesian and wave-CAIPI 4D flow examinations with a prospective acceleration factor R=2 revealed small, but partly statistically significant discrepancies. Differences between 2-fold and 6-fold accelerated wave-CAIPI scans are comparable to the differences between Cartesian and wave-CAIPI examinations at R=2. Wave-CAIPI 4D flow acquisitions of the aorta could be performed with an average, simulated scan time of under 4 minutes, with reduced uncertainties in flow parameters. Important visualizations of hemodynamic flow patterns in the aorta were only slightly affected by undersampling in the wave-CAIPI case, whereas for Cartesian sampling, considerable discrepancies were observed. N2 - Die wave-CAIPI k-Raum Trajektorie stellt eine effiziente Methode für beschleunigte MRT Akquisitionen dar. Die Benutzung der wave-CAIPI Trajektorie anstelle der kartesischen Standardmethode in der parallelen Bildgebung führt zu einem reduzierten Rausch-Niveau in den rekonstruierten Bildern. Dieser Effekt kann durch Berechnungen des Rauschpegels und des Signal-zu-Rausch Verhältnisses (SNR) quantifiziert werden. Das höhere Signal-zu-Rausch Verhältnis kann genutzt werden, um entweder die Akquisition durch eine höhere Unterabtastung zu beschleunigen, oder um die Bildqualität zu verbessern. Die Beschleunigung von MRT Akquisitionen ist besonders in dynamischen Anwendungen wichtig, da diese Untersuchungen inhärent sehr zeitaufwendig sind. Der Einfluss der wave-CAIPI Methode auf die Bildqualität und das Beschleunigungspotenzial der Messung wurde in dieser Arbeit sowohl für selbst-navigierte, dynamische 3D Lungenbildgebung, als auch für 4D Fluss MRTs des Herzens untersucht Dynamische 3D Lungen MRT Durch die Verwendung der wave-CAIPI Samplingmethode konnte die Bildqualität von selbst-navigierten, dynamischen 3D Lungen MRTs bei freier Atmung verbessert werden. Eine wichtige Anwendung dieser Technik liegt im Bereich der Strahlentherapieplanung. Dabei wurde im Rahmen einer Probandenstudie die Bildqualität anhand der Ähnlichkeit zwischen beschleunigten Bildern und den jeweiligen Referenzen quantifiziert. Zu diesem Zweck wurden die normalized mutual information und der root-mean-square error als quantitative Maße gewählt. Es konnte gezeigt werden, dass -- besonders bei kurzen Akquisitionszeiten -- die wave-CAIPI Methode zu besserer Bildqualität führte, verglichen mit dem kartesischen Standard. Berechnungen der normalized mutual information ergaben im Mittel (10.2 +- 7.3)% höhere Werte für die wave-CAIPI Methode -- der root-mean-square error war (18.9 +- 13.2)% geringer. Darüber hinaus lieferte die wave-CAIPI ein um etwa 14% höheres mittleres SNR. In 2 Minuten konnte die Atembewegung der Lunge in 8 Atemzustände aufgelöst werden. Eine präzise Tumor-Abgrenzung und die Evaluierung von respirationsinduzierten Tumorbewegungen wird durch die Verwendung der wave-CAIPI Methode vereinfacht. 4D Fluss Herz MRT Die Beschleunigung von 4D Fluss MRTs ist essentiell, um solche Untersuchungen in die klinische Routine zu integrieren. In der präsentierten Arbeit wurde eine 6-fache retrospektive Beschleunigung realisiert. 4D Fluss Untersuchungen von gesunden Probanden mit der wave-CAIPI und mit der kartesischen Samplingmethode wurden verwendet, um Unsicherheiten in verschiedenen Flussparametern für die beiden Samplingmethoden zu berechnen. Dabei zeigte sich, dass die geschätzten Fehler in den Flussparametern der 6-fach beschleunigten wave-CAIPI Untersuchungen bis zu 55% geringer sind als die Fehler der kartesischen Messungen. Ferner zeigten Rausch-Analysen, dass die beschleunigten wave-CAIPI Aufnahmen ein um 43% geringeres Rausch-Niveau aufweisen. Vergleiche zwischen Flussparametern, die aus 2-fach beschleunigten wave-CAIPI und kartesischen Messungen berechnet wurden, zeigten kleine, aber teilweise statistisch signifikante Unterschiede zwischen den beiden Methoden. Unterschiede zwischen 2-fach und 6-fach beschleunigten wave-CAIPI Aufnahmen sind vergleichbar mit den Unterschieden zwischen der wave-CAIPI Methode und der kartesischen Methode bei R=2. Wave-CAIPI 4D Fluss Aufnahmen des Herzens konnten mit einer mittleren, simulierten Aufnahmezeit von unter 4 Minuten durchgeführt werden. Die effizientere Samplingmethode ermöglichte dabei erheblich reduzierte Unsicherheiten in den berechneten Flussparametern. Wichtige Visualisierungen des Blutflusses in der Aorta wurden im Falle der wave-CAIPI Methode kaum von der Unterabtastung beeinflusst. Hingegen wiesen die Visualisierungen der beschleunigten kartesischen Messungen erhebliche Diskrepanzen auf. KW - Magnetresonanztomographie KW - Lunge KW - Herz KW - Fluss KW - Lung KW - Heart KW - Flow Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-232071 ER - TY - THES A1 - Segebarth, Dennis T1 - Evaluation and validation of deep learning strategies for bioimage analyses T1 - Evaluation und Validierung von Deep learning Strategien für die Analyse biologischer Bilddaten N2 - Significant advances in fluorescence imaging techniques enable life scientists today to gain insights into biological systems at an unprecedented scale. The interpretation of image features in such bioimage datasets and their subsequent quantitative analysis is referred to as bioimage analysis. A substantial proportion of bioimage analyses is still performed manually by a human expert - a tedious process that is long known to be subjective. Particularly in tasks that require the annotation of image features with a low signal-to-noise ratio, like in fluorescence images of tissue samples, the inter-rater agreement drops. However, like any other scientific analysis, also bioimage analysis has to meet the general quality criteria of quantitative research, which are objectivity, reliability, and validity. Thus, the automation of bioimage analysis with computer-aided approaches is highly desirable. Albeit conventional hard-coded algorithms are fully unbiased, a human user has to set its respective feature extraction parameters. Thus, also these approaches can be considered subjective. Recently, deep learning (DL) has enabled impressive advances in computer vision research. The predominant difference between DL and conventional algorithms is the capability of DL models to learn the respective task on base of an annotated training dataset, instead of following user-defined rules for feature extraction. This thesis hypothesized that DL can be used to increase the objectivity, reliability, and validity of bioimage analyses, thus going beyond mere automation. However, in absence of ground truth annotations, DL models have to be trained on manual and thus subjective annotations, which could cause the model to incorporate such a bias. Moreover, model training is stochastic and even training on the same data could result in models with divergent outputs. Consequently, both the training on subjective annotations and the model-to-model variability could impair the quality of DL-based bioimage analyses. This thesis systematically assessed the impacts of these two limitations experimentally by analyzing fluorescence signals of a protein called cFOS in mouse brain sections. Since the abundance of cFOS correlates with mouse behavior, behavioral analyses could be used for cross-validation of the bioimage analysis results. Furthermore, this thesis showed that pooling the input of multiple human experts during model training and integration of multiple trained models in a model ensemble can mitigate the impact of these limitations. In summary, the present study establishes guidelines for how DL can be used to increase the general quality of bioimage analyses. N2 - Fortschritte in den Methoden der fluoreszenz-basierten Bildgebung ermöglichen Biowissenschaftlern heutzutage noch nie dagewesene Einblicke in biologische Systeme. Die Interpretation sowie die anschließende quantitative Analyse von Bildelementen in biologischen Bilddatensätzen wird in der Wissenschaft als bioimage analysis bezeichnet. Ein wesentlicher Anteil der bioimage analysis wird noch immer von Experten per Hand durchgeführt - ein mühsamer Prozess, von dem man seit langem weiß, dass er subjektiv ist. Besonders bei Aufgabestellungen, welche die Annotierung von Bildelementen mit einem geringen Signal-Rausch-Verhältnis erfordern, wie es beispielsweise bei Fluoreszenzbildern von Gewebeproben der Fall ist, sinkt die Übereinstimmung zwischen den Bewertungen mehrerer Experten. Genauso wie jede andere wissenschaftliche Analyse, muss jedoch auch die bioimage analysis den generellen Qualitätskriterien quantitativer Forschung gerecht werden. Dies sind Objektivität, Zuverlässigkeit und Validität. Die Automatisierung der bioimage analysis mit Hilfe von computer-basierten Ansätzen ist somit erstrebenswert. Konventionelle, hartkodierte Algorithmen sind zwar vollkommen unvoreingenommen, jedoch legt ein menschlicher Benutzer jene Parameter fest, die der Algorithmus für die Extraktion der relevanten Bildelemente nutzt. Aus diesem Grund sind auch diese Ansätze zumindest partiell subjektiv. In den letzten Jahren hat Deep learning (DL) zu beeindruckenden Fortschritten auf dem Forschungsgebiet der computer vision beigetragen. Der vorherrschende Unterschied zwischen DL und konventionellen Algorithmen besteht darin, dass DL Modelle in der Lage sind die jeweilige Aufgabe auf Grundlage eines annotierten Trainingsdatensatzes zu lernen, anstatt starr den Parametern zu folgen, die der Benutzer für die Extraktion der relevanten Bildelemente vorgegeben hat. In dieser Dissertation wurde die Hypothese untersucht, ob DL, neben der Möglichkeit der automatischen Bildanalyse, auch dazu genutzt werden kann die Objektivität, die Zuverlässigkeit und die Validität der Bildanalyse zu verbessern. Ohne eine objektive Referenzannotierung muss das Training der DL Modelle jedoch auf händisch erstellten und somit also subjektiven Annotierungen durchgeführt werden. Theoretisch könnte dies dazu führen, dass das DL-Modell diese Vorgeingenommenheit übernimmt. Außerdem unterliegt das Training der Modelle stochastischen Prozessen und selbst Modelle, die auf den gleichen Trainingsdaten trainiert wurden, könnten sich danach in ihren ausgegeben Analysen unterscheiden. Demzufolge könnten also sowohl das Training auf subjektiven Annotierungen als auch die Variabilität von Modell zu Modell die Qualität der DL-basierten Analyse von biologischen Bilddaten beeinträchtigen. In dieser Dissertation werden die Einflüsse von diesen beiden Limitierungen auf Grundlage von experimentellen Daten untersucht. In den experimentellen Bilddaten werden Fluoreszenzsignale des Proteins cFOS in Hirnschnitten von Mäusen dargestellt und hier repräsentativ untersucht. Da das Vorkommen von cFOS mit dem Verhalten der Mäuse korreliert, kann die Analyse des Verhaltens der Mäuse zur Kreuzvalidierung der Analyse der biologischen Bilddaten herangezogen werden. Die Daten dieser Dissertation zeigen, dass die Integration mehrerer Experten in das Training eines Modells sowie die Integration mehrerer trainierter Modelle in ein Modell-Ensemble das Risiko einer subjektiven oder nicht reproduzierbaren Bildanalyse abschwächen können. Diese Arbeit etabliert Richtlinien dafür, wie DL verwendet werden kann, um die generelle Qualität der Analyse biologischer Bilddaten zu erhöhen. KW - Deeplearning KW - Biologie KW - Bildanalyse KW - bioimage analysis Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-243728 ER - TY - THES A1 - Volpato, Daniela T1 - Bitopic Ligands and their molecular fragments for the study of the M1 Muscarinic Receptor T1 - Bitopische Liganden und ihre Molekülfragmente für die Untersuchung des M1 Muskarinischen Rezeptors N2 - The past decades have witnessed the development of new pharmaceutical compounds that modulate receptor function by targeting allosteric sites. Allosteric sites are, by definition, domains topographically distinct from the orthosteric binding pocket where the natural ligand binds. Exploring the possibilities of linking orthosteric and allosteric pharmacophores in one compound to yield ‘bitopic’ compounds is a strategy derived from the “message-address” concept by Schwyzer , first applied to GPCRs by Portoghese et al. This concept explicitly underlines the orthosteric/allosteric combination, in opposite to the more general umbrella term bivalent. The broad possibilities of bitopic ligands in the pharmaceutical field are under continuous study. Bitopic compounds are promising pharmaceutical tools for taking advantage of the allosteric binding to achieve subtype selectivity while preserving high affinity at the receptor. The development of bitopic ligands, based on the idea of combining high affinity (via orthosteric sites) with high selectivity (via allosteric sites), have led to the development of highly selective bivalent ligands for GPCRs , such as for the opioid receptors , muscarinic acetylcholine receptors (mAChRs), serotonin receptors, cannabinoid receptors, and gonadotropin-releasing hormone receptors. This concept has even been extended to other receptors, for examples nicotinic receptors and other proteins, such as acetylcholinesterases and the tyrosine kinase receptors TrkA and TrkC. The reasons to pursue a bitopic ligand approach are various. An improved affinity for the target GPCR and/or an improved selectivity either at the level of receptor subtype, or at the level of signaling pathway. Another advantage of bitopic ligands over purely allosteric ligands is that the former rely on the appropriate presence of endogenous agonist tone to mediate their effects, whereas a bitopic ligand would engage the orthosteric site irrespective of the presence or absence of endogenous tone. By way of introduction to the hybrid approach, a review of the concept of hybrids compounds targeting the cholinergic system is presented in section A of this thesis. Recent updates in hybrid molecule design as a strategy for selectively addressing multiple target proteins involved in Alzheimer's disease (AD) is here reported . This represents the potential and the growing interest in hybrid compound as pharmacological tools to achieve receptor subtype selectivity and/or, to study the overall functional activity of the receptor. Until now, muscarinic acetylcholine receptors (mAChRs) have proved to be a particularly fruitful receptor model for the development and characterization of bitopic ligands. In this thesis, several examples of new muscarinic bitopic approach are reported in the results section. A study of bipharmacophoric ligands composed of the muscarinic positive allosteric modulators (BQCAderived compounds) linked with chain of various lengths to different orthosteric building blocks is reported in the result part 1. Synthesis and examination of the potential pharmacological characteristic of Oxotremorine-BQCAd compounds and Xanomeline-BQCAd hybrid derivatives are described in results parts 2 and 4, respectively. Moreover, the bitopic concept has even been extended to other proteins, such as acetylcholinesterase. In the result part 5 an overview of the new Tacrine-Xanomeline hybrids aiming to improve the inhibitory potency of the acetylcholinesterase and simultaneously to increase the cholinergic tone, via the xanomelinic portion acting on the M1 receptor is given. A new trivalent approach is presented for the first time to deepen the study of the M1 muscarinic receptor in the result part 6. Moreover, the synthesis of a new series of iperoxo-derived alkane, bis(ammonio)alkane-type and rigidified chain ligands is given in the result part 7 together with some prospects for further research. N2 - Mit zunehmendem Alter der Bevölkerung werden altersbedingte Krankheiten, insbesondere neurodegenerative Erkrankungen wie die Alzheimer-Krankheit (AD), häufiger und stellen darüber hinaus ein soziales und wirtschaftliches Problem für die Gesellschaft dar1,2. AD ist eine schwere altersabhängige neurodegenerative Erkrankung des Gehirns, die mit Gedächtnisverlust und einer Abnahme der kognitiven Funktionen verbunden ist und immer weiter fortschreitet. Die Krankheit ist derzeit unheilbar und aufgrund des demographischen Wandels wird ein starker Anstieg an Betroffenen erwartet. Daher beschäftigt sich eine Vielzahl wissenschaftlicher Studien mit der Prävention und der Behandlung von AD. Derzeit besteht das Hauptziel darin, die Ursachen und Mechanismen dieser Krankheit durch innovative Grundlagenforschung zu verstehen. AD ist ein komplexes Zusammenspiel verschiedener pathologischer Merkmale2,4. Diese besonderen Merkmale der Krankheit, die gleichzeitig auftreten, müssen untersucht und gleichzeitig untersucht werden, um wirksame und selektive Medikamente zu entwickeln. Diese Arbeit beschäftigt sich daher mit zwei Zielstrukturen der cholinergen Hypothese zur Entstehung von AD: dem muskarinischen M1-Rezeptor5,6 und der AChE7 unter Verwendung des Hybridisierungsansatzes. Zunächst wurden vermeintlich selektive M1 Agonisten entwickelt und synthetisiert. Diese sollten die cholinerge Transmission verstärken um die cholinerge Funktion in Alzheimer Patienten zu verbessern. Hierbei wurde die Hybridisierung durch die kovalente Verbindung einer allosterischen und einer orthosterischen Einheit in einem Molekül durchgeführt. ... KW - Ligand KW - Bitopic Ligands KW - Muscarinrezeptor KW - M1 Muscarinic Receptor KW - Bitopische Liganden Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-248815 ER - TY - THES A1 - Lohr, David T1 - Functional and Structural Characterization of the Myocardium T1 - Funktionelle und Strukturelle Charakterisierung des Myokardiums N2 - Clinical practice in CMR with respect to cardiovascular disease is currently focused on tissue characterization, and cardiac function, in particular. In recent years MRI based diffusion tensor imaging (DTI) has been shown to enable the assessment of microstructure based on the analysis of Brownian motion of water molecules in anisotropic tissue, such as the myocardium. With respect to both functional and structural imaging, 7T MRI may increase SNR, providing access to information beyond the reach of clinically applied field strengths. To date, cardiac 7T MRI is still a research modality that is only starting to develop towards clinical application. In this thesis we primarily aimed to advance methods of ultrahigh field CMR using the latest 7T technology and its application towards the functional and structural characterization of the myocardium. Regarding the assessment of myocardial microstructure at 7T, feasibility of ex vivo DTI of large animal hearts was demonstrated. In such hearts a custom sequence implemented for in vivo DTI was evaluated and fixation induced alterations of derived diffusion metrics and tissue properties were assessed. Results enable comparison of prior and future ex vivo DTI studies and provide information on measurement parameters at 7T. Translating developed methodology to preclinical studies of mouse hearts, ex vivo DTI provided highly sensitive surrogates for microstructural remodeling in response to subendocardial damage. In such cases echocardiography measurements revealed mild diastolic dysfunction and impaired longitudinal deformation, linking disease induced structural and functional alterations. Complementary DTI and echocardiography data also improved our understanding of structure-function interactions in cases of loss of contractile myofiber tracts, replacement fibrosis, and LV systolic failure. Regarding the functional characterization of the myocardium at 7T, sequence protocols were expanded towards a dedicated 7T routine protocol, encompassing accurate cardiac planning and the assessment of cardiac function via cine imaging in humans. This assessment requires segmentation of myocardial contours. For that, artificial intelligence (AI) was developed and trained, enabling rapid automatic generation of cardiac segmentation in clinical data. Using transfer learning, AI models were adapted to cine data acquired using the latest generation 7T system. Methodology for AI based segmentation was translated to cardiac pathology, where automatic segmentation of scar tissue, edema and healthy myocardium was achieved. Developed radiofrequency hardware facilitates translational studies at 7T, providing controlled conditions for future method development towards cardiac 7T MRI in humans. In this thesis the latest 7T technology, cardiac DTI, and AI were used to advance methods of ultrahigh field CMR. In the long run, obtained results contribute to diagnostic methods that may facilitate early detection and risk stratification in cardiovascular disease. N2 - Bei kardiovaskulären Erkrankungen konzentriert sich die kardiale MRT aktuell auf die Gewebecharakterisierung und insbesondere die Herzfunktion. In den letzten Jahren hat sich gezeigt, dass MRT-basierte Diffusions-Tensor-Bildgebung (DTI) die Beurteilung der Mikrostruktur anhand der Analyse der Brownschen Bewegung von Wassermolekülen in anisotropem Gewebe, wie dem Myokardium, ermöglicht. In Bezug auf sowohl die funktionelle als auch die strukturelle Bildgebung kann 7T MRT SNR verbessern und Information messbar machen, die außerhalb der Reichweite von klinisch angewendeten Feldstärken liegt. Heute ist kardiale 7T MRT noch eine Forschungsmodalität, die sich Richtung klinischer Anwendung entwickelt. Hauptziel dieser Dissertation war die Weiterentwicklung von Methoden der kardialen Ultrahochfeld-Bildgebung mittels der neuesten 7T-Technologie und dessen Anwendung für die funktionelle und strukturelle Charakterisierung des Myokardiums. Für die Mikrostrukturcharakterisierung des Myokardiums bei 7T wurde die Durchführbarkeit von ex vivo DTI Messungen von Großtierherzen demonstriert. In solchen Herzen wurde eine Sequenz evaluiert, die für in vivo DTI etabliert wurde. Zudem wurden fixationsbedinge Veränderungen von Diffusionsparametern und Gewebeeigenschaften ermittelt. Die Ergebnisse erlauben den Vergleich von bestehenden und zukünftigen ex vivo Studien und geben Informationen zu Messparametern bei 7T. Der Transfer von etablierten Methoden zu präklinischen Studien in Mäuseherzen demonstrierte, dass ex vivo DTI sensitive Marker für Mikrostruktur-Remodeling nach Subendokard-Schäden liefern kann. In solchen Fällen zeigte Echokardiographie eine leichte diastolische Dysfunktion und eingeschränkte Longitudinalverformung. Komplementäre DTI und Echokardiographie-Daten erweiterten zudem unser Verständnis von Struktur-Funktions-Interaktionen in Fällen von Verlust von kontraktilen Faserbündeln, Fibrose und linksventrikulärem, systolischem Versagen. Für die funktionelle Charakterisierung des Myokardiums bei 7T wurde ein dediziertes 7T-Humanprotokoll erarbeitet, welches akkurate Schichtplanung und die Bestimmung der Herzfunktion mittels Cine-Bildgebung umfasst. Die Herzfunktionsbestimmung erfordert die Segmentierung des Myokards. Hierfür wurde künstliche Intelligenz (KI) entwickelt, die eine schnelle, automatische Herzsegmentierung in klinischen Daten ermöglicht. Mittels Lerntransfer wurden KI-Modelle für Bilder angepasst, die mit der neuesten 7T-Technologie aufgenommen wurden. Methoden für die KI-basierte Segmentierung wurden zudem für die Bestimmung und Segmentierung von Narbengewebe, Ödemen und gesundem Myokard erweitert. Entwickelte Radiofrequenz-Komponenten ermöglichen translationale 7T-Studien, welche kontrollierte Bedingungen für die Methodenentwicklung von kardialen 7T-Anwendungen für den Humanbereich liefern. In dieser Arbeit werden die neueste 7T-Technologie, DTI am Herzen und AI genutzt, um Methoden der kardialen Ultrahochfeld-Bildgebung weiterzuentwickeln. Langfristig erweitern die erzielten Ergebnisse diagnostische Methoden, die Früherkennung und Risikoabschätzung in kardiovaskulären Erkrankungen ermöglichen können. KW - Diffusionsgewichtete Magnetresonanztomografie KW - Künstliche Intelligenz KW - 7T KW - DTI KW - AI KW - Cardiac Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-234486 ER - TY - THES A1 - Hu, Xiawei T1 - Role of claudin-12 in neuronal barriers in painful murine and human neuropathy T1 - Rolle von Claudin-12 im neuronalen Barrieren bei schmerzhaften Neuropathien in Mäusen und Patienten N2 - In peripheral nervous system (PNS), the blood-nerve barrier (BNB) and myelin barrier (MB) are important physiological fences for maintaining the environment for axons, Schwann cells and other associated cells within peripheral nerves. The perineurium surrounding the nerves and endoneurial vessels nourishing the nerves compose the BNB. Schwann cells wrapping around neurons form the MB. Destruction or malfunction of the barriers has been postulated as an initial step in the development of pathologic conditions concerning human peripheral nerves, such as traumatic neuropathy and the disease of chronic inflammatory demyelination polyneuropathy (CIDP). Tight junction proteins (TJPs) are intercellular junctions building the microstructure of barriers. They play a key role in tightly connecting adjacent cells, controlling the passage of ions, water and other molecules via the paracellular pathway, and maintaining the cell polarity. Among the family of TJPs, claudins are the major structural components which form the backbone of TJs. Certain key TJPs [e.g. claudins (claudin-1, -5, -19, occludin, zona occludens (ZO-1)] have been identified in neural barriers and explored for therapeutic targets. The expression of Cldn12 gene has been documented in human/rodent tibial nerves, spinal cord and DRG. However, the role of claudin-12 in PNS is unknown. In the present study, we firstly found a loss of claudin-12 immunoreactivity (IR) in male or postmenopausal female patients with painful CIDP or non-inflammatory polyneuropathy (PNP). Then, we utilized male and female Cldn12-KO mice and the chronic constriction injury (CCI) model. Cldn12 mRNA and IR were reduced in WT mice after nerve injury. Deletion of Cldn12 via general knockout (KO) induced mechanical allodynia at baseline level and after CCI in time-dependent manner in male mice. KO of Cldn12 in males resulted in loss of small axons, perineurial barrier and MB breakdown, as well as TJP complex disruption with claudin-1, -19 and Pmp22 reduction. Moreover, local Cldn12 siRNA application mimicked mechanical allodynia and MB breakdown. In conclusion, claudin-12 deficiency is associated with painful CIDP/non-inflammatory PNP. Claudin-12 is a regulatory TJP crucial for mechanical nociception, perineurial barrier and MB integrity, and proper TJP composition in mice. Therefore, further investigating the functions of claudin-12 and its mechanism is important to prompt the development of new therapeutic approaches for painful neuropathies. N2 - Im peripheren Nervensystem (PNS) sind die Blut-Nerven-Schranke (BNB) und die Myelin-Schranke (MB) wichtige physiologische Barrieren zur Aufrechterhaltung des Milieus für Axone, Schwann-Zellen und andere assoziierte Zellen innerhalb der peripheren Nerven. Das die Nerven umgebende Perineurium und die die Nerven ernährenden endoneurialen Gefäße bilden die BNB. Schwannsche Zellen, die sich um Neuronen wickeln, bilden die MB. Die Funktionsstörung der Barrieren wird als Schlüsselelement für die Entwicklung verschiedener neurologischer Erkrankungen wie der chronisch entzündlichen Demyelinisierungs-Polyneuropathie (CIDP) und der traumatischen Neuropathie angesehen. Tight Junction-Proteine (TJPs) sind interzelluläre Verbindungen und bilden die Mikrostruktur der Barrieren. Sie spielen eine Schlüsselrolle bei der engen Verbindung benachbarter Zellen, der Kontrolle des parazellulären Flusses von Ionen, Wasser und anderen Molekülen und der Aufrechterhaltung der Zellpolarität. In der Superfamilie der TJPs sind Claudine die Hauptstrukturkomponenten, die das Rückgrat der TJs bilden. Bestimmte TJPs [z.B. Claudin-1, -5, -19, Occludin, Zona occludens (ZO-1)] wurden in neuronalen Barrieren identifiziert und als therapeutische Targets untersucht. In neueren Untersuchungen wurde die Expression des Cldn12-Gens im N. tibialis, Rückenmark und DRG bei Nagern und Menschen dokumentiert. Die Rolle von Claudin-12 im PNS ist jedoch nicht bekannt. In der vorliegenden Studie wurde zunächst ein Verminderung der Immunreaktivität (IR) von Claudin-12 bei männlichen oder postmenopausalen weiblichen Patienten mit schmerzhafter CIDP oder nichtentzündlicher Polyneuropathie (PNP) belegt. Im Folgenden untersuchten wir männliche und weibliche Cldn12-KO-Mäuse bei traumatischer Neuopathie, der „chronic constriction injury“ (CCI), die ebefalls eine deutliche Entzündungsreaktion zeigt. Cldn12-mRNA und -IR waren in WT-Mäusen nach einer Nervenverletzung erniedrigt . Die vollständige Deletion von Cldn12 (KO) induzierte bei naiven männlichen Mäusen bereits eine mechanische Allodynie, die sich nach CCI weiter verstärkte. Cldn12- KO in männlichen Mäusen führte zum Verlust kleinkalibriger Axone, einer Öffnung der perineurialen Barriere und der MB sowie zu einer Störung der TJP-Komplexe mit Claudin-1, -19 und Pmp22. Darüberhinaus replizierte die lokale Anwendung von Cldn12 siRNA die mechanische Allodynie und den MB- Abbau nach. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass gerade die schmerzhafte CIDP/nicht entzündlichen PNP mit einem Claudin-12-Mangel verbunden sind. Claudin-12 ist ein regulatorisches TJP, welches für die Nozizeption mechanischer Reize, die perineuriale Barriere und die MB-Integrität sowie die richtige TJP- Zusammensetzung bei Mäusen entscheidend ist. Die weitere Erforschung der Funktionen von Claudin- 12 könnte die Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze für schmerzhafte Neuropathien anstoßen. KW - claudin-12 KW - neuropathy KW - blood nerve barrier KW - myelin barrier Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-208065 ER - TY - THES A1 - Kollert, Leonie T1 - Epigenetics of anxiety and depression – a differential role of TGFB-Inducible Early Growth Response Protein 2 gene promoter methylation T1 - Epigenetik von Angst und Depression – Die differentielle Rolle von TGFB-Inducible Early Growth Response Protein 2 Gen Promotor Methylierung N2 - Among mental disorders, panic disorder (PD) is one of the most common anxiety disorders characterized by recurring and unexpected episodes of extreme fear i.e. panic attacks. PD displays lifetime prevalence rates in the general population between 2.1-4.7 % and in about 30 to 40 % occurs comorbid with major depressive disorder (MDD). Differential methylation levels of the monoamine oxidase A (MAOA) gene have previously been associated with the etiology of both PD and MDD. The TGFB-Inducible Early Growth Response Protein 2 (TIEG2; alias KLF11), an activating transcription factor of the MAOA gene, has been reported to be increased in MDD, but has not yet been investigated in PD on any level. Therefore, in an attempt to further define the role of an impaired TIEG2-MAOA pathway in anxiety and affective disorders, in the present thesis TIEG2 promoter DNA methylation was analyzed in two independent samples of I) PD patients with or without comorbid MDD in a case/control design and II) MDD patients with and without anxious depression. Additionally, in PD patients of sample I), TIEG2 methylation was correlated with Beck Depression Inventory (BDI-II) scores. Finally, in a third independent healthy control sample, correlation of TIEG2 promoter methylation levels with Anxiety Sensitivity Index (ASI) scores as a PD-related measure was analyzed. No overall association of TIEG2 promoter methylation with PD was detected. However, PD patients with comorbid MDD showed significant TIEG2 hypomethylation compared to PD patients without comorbid MDD (p=.008) as well as to healthy controls (p=.010). In addition, MDD patients without anxious features displayed a statistical trend in decreased TIEG2 methylation in comparison to MDD patients with anxious depression (p=.052). Furthermore, TIEG2 methylation was negatively correlated with BDI-II scores in PD patients (p=.013) and positively correlated with ASI scores in the healthy control sample (p=.043). In sum, the current study suggests TIEG2 promoter hypomethylation as a potential epigenetic marker of MDD comorbidity in PD or of non-anxious depression, respectively. If replicated and verified in future studies, altered TIEG2 methylation might therefore represent a differential pathomechanism of anxiety and mood disorders. N2 - Die Panikstörung (PD) ist eine der häufigsten Angststörungen, die durch wiederkehrende und unerwartete Episoden extremer Angst gekennzeichnet ist. Die PD tritt in der Allgemeinbevölkerung mit Lebenszeitprävalenzraten zwischen 2,1 und 4,7 % und in etwa 30 bis 40 % der Fälle komorbid mit einer schweren Depression (MDD) auf. Unterschiedliche Methylierungs-Niveaus des Monoaminoxidase A (MAOA) Gens wurden bereits mit der Ätiologie von PD und MDD assoziiert. Das TGFB-Inducible Early Growth Response Protein 2 (TIEG2; alias KLF11) fungiert als ein aktivierender Transkriptionsfaktor des MAOA Gens und wurde bei Patienten mit MDD in seiner Expression erhöht gefunden. Bei der PD wurde TIEG2 bis heute jedoch noch nicht untersucht. Um die Rolle eines gestörten TIEG2-MAOA Signalwegs bei Angst- und affektiven Störungen genauer zu definieren, wurde in der vorliegenden Studie die Methylierung des TIEG2 Promotors in zwei unabhängigen Stichproben bestehend aus I) PD Patienten mit bzw. ohne komorbider MDD, sowie II) MDD Patienten mit bzw. ohne erhöhte Angstsymptomen untersucht. Zusätzlich wurde in der PD Stichprobe die TIEG2 Methylierung mit dem Beck Depression Inventar II (BDI-II) korreliert. Schließlich wurde in einer dritten unabhängigen Stichprobe gesunder Probanden die Korrelation der TIEG2 Methylierung mit den Punktwerten des Angstsensitivitätsindex (ASI) analysiert. Es wurde keine Assoziation von TIEG2 Promotor-Methylierung mit PD beobachtet. Allerdings waren PD Patienten mit komorbider MDD im Vergleich zu PD Patienten ohne komorbide MDD (p=,008) sowie zu gesunden Kontrollprobanden (p=,010) signifikant niedriger methyliert. MDD Patienten ohne ängstliche Symptome zeigten einen statistischen Trend von verringerte TIEG2 Methylierung im Vergleich zu MDD Patienten mit ängstlicher Depression (p=,052). Zusätzlich korrelierte die TIEG2 Methylierung negativ mit den BDI-II Werten bei PD Patienten (p=,013) und positiv mit den ASI Werten in der gesunden Probandenstichprobe (p=,043). KW - Epigenetik KW - Epigenetic Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-211268 ER - TY - THES A1 - Rauschenberger, Vera T1 - Stiff-person syndrome - Pathophysiological mechanisms of glycine receptor autoantibodies T1 - Stiff-Person Syndrom - Pathophysiologische Mechanismen von Glyzinrezeptor Autoantikörpern N2 - The Stiff-person syndrome (SPS) is a rare autoimmune disease that is characterized by symptoms including stiffness in axial and limb muscles as well as painful spasms. Different variants of SPS are known ranging from moderate forms like the stiff-limb syndrome to the most severe form progressive encephalomyelitis with rigidity and myoclonus (PERM). SPS is elicited by autoantibodies that target different pre- or postsynaptic proteins. The focus of the present work is on autoantibodies against the glycine receptor (GlyR). At start of the present thesis, as main characteristic of the GlyR autoantibody pathology, receptor cross-linking followed by enhanced receptor internalization and degradation via the lysosomal pathway was described. If binding of autoantibodies modulates GlyR function and therefore contributes to the GlyR autoantibody pathology has not yet been investigated. Moreover, not all patients respond well to plasmapheresis or other treatments used in the clinic. Relapses with even higher autoantibody titers regularly occur. In the present work, further insights into the disease pathology of GlyRα autoantibodies were achieved. We identified a common GlyRα1 autoantibody epitope located in the far N-terminus including amino acids A1-G34 which at least represent a part of the autoantibody epitope. This part of the receptor is easily accessible for autoantibodies due to its location at the outermost surface of the GlyRα1 extracellular domain. It was further investigated if the glycosylation status of the GlyR interferes with autoantibody binding. Using a GlyRα1 de-glycosylation mutant exhibited that patient autoantibodies are able to detect the de-glycosylated GlyRα1 variant as well. The direct modulation of the GlyR analyzed by electrophysiological recordings demonstrated functional alterations of the GlyR upon autoantibody binding. Whole cell patch clamp recordings revealed that autoantibodies decreased the glycine potency, shown by increased EC50 values. Furthermore, an influence on the desensitization behavior of the receptor was shown. The GlyR autoantibodies, however, had no impact on the binding affinity of glycine. These issues can be explained by the localization of the GlyR autoantibody epitope. The determined epitope has been exhibited to influence GlyR desensitization upon binding of allosteric modulators and differs from the orthosteric binding site for glycine, which is localized much deeper in the structure at the interface between two adjacent subunits. To neutralize GlyR autoantibodies, two different methods have been carried out. Transfected HEK293 cells expressing GlyRα1 and ELISA plates coated with the GlyRα1 extracellular domain were used to efficiently neutralize the autoantibodies. Finally, the successful passive transfer of GlyRα1 autoantibodies into zebrafish larvae and mice was shown. The autoantibodies detected their target in spinal cord and brain regions rich in GlyRs of zebrafish and mice. A passive transfer of human GlyRα autoantibodies to zebrafish larvae generated an impaired escape behavior in the animals compatible with the abnormal startle response in SPS or PERM patients. N2 - Das Stiff-person Syndrom (SPS) ist eine seltene Autoimmunerkrankung, die sich durch Symptome wie Steifheit in Muskeln des Rumpfes und der Gliedmaßen sowie schmerzhafte Spasmen auszeichnet. Vom SPS sind verschiedene Varianten bekannt, die von mäßigen Formen, wie dem Stiff-limb Syndrom (limb von engl. Extremitäten), bis zur schwersten Variante, der progressiven Enzephalomyelitis mit Steifheit und Myoklonus (PERM, vom engl. progressive encephalomyelitis with rigidity and myoclonus), reichen. Ausgelöst wird das SPS durch Autoantikörper, die an verschiedene prä- und postsynaptische Proteine binden. Der Fokus in dieser Arbeit liegt dabei auf Autoantikörpern, die gegen den Glyzinrezeptor (GlyR) gerichtet sind. Zu Beginn dieser Thesis galten als Hauptcharakteristika der Pathologie von Autoantikörpern die Quervernetzung von Rezeptoren gefolgt von einer verstärkten Rezeptor Internalisierung und dem Abbau über das Lysosom. Allerdings wurde bisher noch nicht untersucht, ob die GlyR Funktion durch eine Autoantikörperbindung verändert wird. Darüber hinaus sprechen nicht alle Patienten gut auf Plasmapheresen oder andere Therapien an. Rückfälle mit noch viel höheren Autoantikörpertitern treten regelmäßig auf. Die vorliegende Arbeit erweitert die Kenntnisse der pathophysiologischen Mechanismen, die durch GlyRα Autoantikörper ausgelöst werden. Wir konnten ein Epitop der GlyRα1 Autoantikörper im N-terminalen Bereich ausfindig machen, wobei die Aminosäuren A1-G34 zumindest einen Teil des Epitops bilden. Dieser GlyR Bereich kann durch die Autoantikörper sehr leicht erreicht werden, weil er sich an der Oberfläche der extrazellulären Domäne des GlyRs befindet. Weiterhin wurde untersucht, ob die Glykosylierung des GlyRs die Autoantikörperbindung beeinflusst. Mit Hilfe von Mutanten, bei denen die Glykosylierungsstelle entfernt wurde, konnte gezeigt werden, dass Patientenautoantikörper die nicht-glykosylierte Variante des GlyRα1 ebenfalls detektieren können. Elektrophysiologische Messungen ergaben, dass die Funktionalität des GlyRs durch die Bindung von Autoantikörpern beeinträchtigt wird. Erhöhte EC50 Werte zeigen, dass Autoantikörper die Wirksamkeit von Glyzin in niedrigeren Konzentrationen auf den Rezeptor verringern. Außerdem beeinflussen die Autoantikörper die Desensitisierung des Rezeptors. Allerdings waren die Glyzin-Wirksamkeit in sättigenden Konzentrationen und die Affinität von Glyzin zum Rezeptor unverändert. Diese Ergebnisse können durch die Lokalisierung des GlyR Autoantikörper-Epitops erklärt werden. Das ermittelte Epitop ist bekannt dafür, dass dort allosterische Modulatoren binden können und dadurch die Desensitisierung beeinflusst wird. Außerdem unterscheidet sich das Epitop von der orthosterischen Bindestelle von Glyzin, welche viel tiefer in der Struktur an der Grenze zweier benachbarter Untereinheiten liegt. Um die GlyR Autoantikörper zu neutralisieren, wurden zwei verschiedene Methoden entwickelt. Transfizierte HEK293 Zellen, die den GlyRα1 exprimieren, und ELISA Platten, die mit der extrazellulären Domäne des GlyRα1 beschichtet waren, wurden zur effizienten Neutralisation der Autoantikörper verwendet. Abschließend konnte in der vorliegenden Arbeit die erfolgreiche passive Übertragung von GlyRα1 Autoantikörpern in Zebrafischlarven und Mäusen gezeigt werden. In Zebrafischen und Mäusen detektierten die Autoantikörper ihr Antigen im Rückenmark und in Gehirnregionen, in denen der GlyR zahlreich exprimiert ist. Ein passiver Transfer von menschlichen GlyRα Autoantikörpern in Zebrafischlarven beeinträchtigte das Fluchtverhalten der Tiere, welches kompatibel mit dem krankhaften Startle Reflex in SPS- oder PERM-Patienten ist. KW - Glycinrezeptor KW - Autoantikörper KW - Pathophysiologie KW - Stiff-person syndrome KW - Stiff-Person Syndrom KW - Pathophysiologische Mechanismen KW - pathophysiological mechanisms Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-209588 ER - TY - THES A1 - Beer, Katharina Beate T1 - Identification and characterization of TAT-5 interactors that regulate extracellular vesicle budding T1 - Identifizierung und Charakterisierung von TAT-5 Interaktoren, welche die Ausschüttung von Extrazellulären Vesikeln regulieren N2 - Cells from bacteria to man release extracellular vesicles (EV) such as microvesicles (MV) that carry signaling molecules like morphogens and miRNAs to control intercellular communication during health and disease. MV release also sculpts membranes, e.g. repairing damaged membranes to avoid cell death. HIV viruses also bud from the plasma membrane in a similar fashion. In order to determine the in vivo functions of MVs and regulate their release, we need to understand the mechanisms of MV release by plasma membrane budding (ectocytosis). The conserved phospholipid flippase TAT-5 maintains the asymmetric localization of phosphatidylethanolamine (PE) in the plasma membrane and was the only known inhibitor of ESCRT-mediated ectocytosis in C. elegans. Loss of TAT-5 lipid flipping activity increased the externalization of PE and accumulation of MVs. However, it was unclear how cells control TAT-5 activity to release the right amount of MVs at the right time, since no upstream regulators of TAT-5 were known. To identify conserved TAT-5 regulators we looked for new proteins that inhibit MV release. To do so, we first developed a degradation-based technique to specifically label MVs. We tagged a plasma membrane reporter with the endogenous ZF1 degradation tag (degron) and expressed it in C. elegans embryos. This reporter is protected from degradation inside MVs, but is degraded inside the cell. Thus, the fluorescence is selectively maintained inside MVs, creating the first MV-specific reporter. We identified four MV release inhibitors associated with retrograde recycling, including the class III PI3Kinase VPS-34, Beclin1 homolog BEC-1, DnaJ protein RME-8, and the uncharacterized Dopey homolog PAD-1. We found that VPS-34, BEC-1, RME-8, and redundant sorting nexins are required for the plasma membrane localization of TAT-5, which is important to maintain PE asymmetry and inhibit MV release. Although we confirmed that PAD-1 and the GEF-like protein MON-2 are required for endosomal recycling, they only traffic TAT-5 in the absence of sorting nexin-mediated recycling. Instead, PAD-1 is specifically required for the lipid flipping activity of TAT-5 that inhibits MV release. Thus, our work pinpoints TAT-5 and PE as key regulators of plasma membrane budding, further supporting the model that PE externalization drives ectocytosis. In addition, we uncovered redundant intracellular trafficking pathways, which affect organelle size and revealed new regulators of TAT-5 flippase activity. These newly identified ectocytosis inhibitors provide a toolkit to test the in vivo roles of MVs. In the long term, our work will help to identify the mechanisms that govern MV budding, furthering our understanding of the mechanisms that regulate disease-mediated EV release, membrane sculpting and viral budding. N2 - Zellen von Bakterien bis zum Menschen produzieren Extrazelluläre Vesikel (EV) wie zum Beispiel Mikrovesikel (MV). MV können Signal Moleküle wie Morphogene und miRNA transportieren, welche die normale oder krankheitsbedingte interzelluläre Kommunikation kontrollieren. Bei der Produktion von MVs werden Membranen verformt, wie auch für die Reparatur von beschädigten Membranen um den Zelltod zu verhindern. Außerdem knospen HIV-Virus Partikel von der Plasma Membrane durch eine ähnliche Art und Weise. Um zu verstehen welche in vivo Funktion MV haben, müssen wir die Mechanismen der MV Knospung von der Plasma Membran (Ektozytose) verstehen. Die konservierte Phospholipid Flippase TAT-5 hält die asymmetrische Verteilung von Phosphatidylethanolamine (PE) in der Plasma Membrane aufrecht und war der einzig bekannte Inhibitor der von ESCRT Proteinen durchgeführten Ektozytose in C. elegans. Wenn die Lipid-flippende Funktion von TAT-5 verloren geht, wird PE externalisiert und MV sammeln sich außerhalb der Zelle an. Allerdings ist es unklar mit welchen Mechanismen die Aktivität von TAT-5 reguliert wird um die richtige Menge an MV zur richtigen Zeit zu produzieren, da die vorgeschalteten Regulatoren unbekannt sind. Um konservierte TAT-5 Regulatoren zu identifizieren suchten wir nach neuen Proteinen, die die Produktion von MV inhibieren. Dazu entwickelten wir eine Degradations-Technik um MV spezifisch zu kennzeichnen. Wir markierten einen fluoreszierenden Plasma Membran Marker mit dem endogenen ZF1 Degradations-Kennzeichen (Degron) und exprimierten es im C. elegans Embryo. Der Marker wird vor der Degradation geschützt, wenn er in einem MV von der Zelle ausgesondert wurde. Dadurch bleibt die Fluoreszenz speziell in MV erhalten, während sie innerhalb der Zelle abgebaut wird. Dadurch wurde die Sichtbarkeit von ausgeschütteten MV erhöht. Wir fanden vier Proteine, welche mit Protein Recycling in Verbindung gebracht werden, die die Ausschüttung von MV verhindern: Class III PI3Kiase VPS-34, Beclin1 Homolog BEC-1, DnaJ Protein RME-8 und das nicht näher charakterisierte Dopey Homolog PAD-1. Wir benutzten dieses Set an Proteinen, um zu testen ob und wie diese TAT-5 regulieren können. Wir fanden, dass Class III PI3Kinase, RME-8 und redundante Sorting Nexins für die Plasma Membran Lokalisierung von TAT-5 verantwortlich sind, was wichtig ist um die PE Asymmetrie aufrecht zu erhalten und die MV Produktion zu verhindern. Wenn auch PAD-1 und das GEF-ähnliche MON-2 für endosomales Recycling verantwortlich sind, regulieren sie die Lokalisation von TAT-5 nur in Abwesenheit von Sorting Nexins-reguliertem Transport. Zudem scheint PAD-1 direkt für die Lipid Translokations-Aktivität von TAT-5 verantwortlich zu sein. Demnach konnten wir zeigen, dass TAT-5 und PE Schlüsselregulatoren für MV Produktion sind, was weiterhin die Ansicht unterstützt, dass PE Externalisierung für die Ektozytose verantwortlich ist. Außerdem fanden wir, dass redundante intrazelluläre Transportwege für die Größe von Organellen verantwortlich sind und deckten neue TAT-5 Aktivitäts-Regulatoren auf. Diese neu aufgedeckten Ektozytose Inhibitoren könnten Werkzeuge sein um die in vivo Funktionen von MV zu testen. Längerfristig kann unsere Forschung dazu beitragen die Mechanismen der MV Produktion zu identifizieren und die Regulation während der krankheitsbedingten EV Produktion, der Membrane Reparatur und der Virus Knospung besser zu verstehen. KW - C. elegans KW - Extracellular Vesicles KW - Microvesicle KW - Flippase KW - P4-ATPase KW - Caenorhabditis elegans KW - Vesikelbildung Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-206724 ER - TY - THES A1 - Weiß, Esther T1 - Host-pathogen interactions of natural killer cells and Aspergillus fumigatus: Relevance of immune cell cross-talk and fungal recognition receptors T1 - Wirt-Pathogen Interaktionen von natürlichen Killerzellen und Aspergillus fumigatus: Relevanz von Immunzellinteraktionen und fungalen Erkennungsrezeptoren N2 - The human pathogen Aspergillus (A.) fumigatus is a fungal mold that can cause severe infections in immunocompromised hosts. Pathogen recognition and immune cell cross-talk are essential for clearing fungal infections efficiently. Immune cell interactions in particular may enhance individual cell activation and cytotoxicity towards invading pathogens. This study analyzed the reciprocal cell activation of natural killer (NK) cells and monocyte-derived dendritic cells (moDCs) after stimulation with A. fumigatus cell wall fractions and whole-cell lysates. Furthermore, the impact of the on moDCs expressed fungal receptors Dectin-1 and TLR-2 on NK cell activation was analyzed. Stimulation of moDCs with ligands for Dectin-1 and TLR-2 and transfer of soluble factors on autologous NK cells showed that moDCs could induce NK cell activation solely by secreting factors. In summary, both cell types could induce reciprocal cell activation if the stimulated cell type recognized fungal morphologies and ligands. However, moDCs displayed a broader set of A. fumigatus receptors and, therefore, could induce NK cell activation when those were not activated by the stimulus directly. Consequently, new fungal receptors should be identified on NK cells. The NK cell characterization marker CD56 was reduced detected in flow cytometry after fungal co-culture. Notably, this decreased detection was not associated with NK cell apoptosis, protein degradation, internalization, or secretion of CD56 molecules. CD56 was shown to tightly attach to hyphal structures, followed by its concentration at the NK-A. fumigatus interaction site. Actin polymerization was necessary for CD56 relocalization, as pre-treatment of NK cells with actin-inhibitory reagents abolished CD56 binding to the fungus. Blocking of CD56 suppressed fungal mediated NK cell activation and secretion of the immune-recruiting chemokines MIP-1α, MIP-1β, and RANTES, concluding that CD56 is functionally involved in fungal recognition by NK cells. CD56 binding to fungal hyphae was inhibited in NK cells obtained from patients during immune-suppressing therapy after allogeneic stem cell transplantation (alloSCT). Additionally, reduced binding of CD56 correlated with decreased actin polymerization of reconstituting NK cells challenged with the fungus. The immune-suppressing therapy with corticosteroids negatively influenced the secretion of MIP-1α, MIP-1β, and RANTES in NK cells after fungal stimulation ex vivo. Similar results were obtained when NK cells from healthy donors were treated with corticosteroids prior to fungal co-culture. Thus, corticosteroids were identified to have detrimental effects on NK cell function during infection with A. fumigatus. N2 - Der humanpathogene Pilz Aspergillus (A.) fumigatus kann lebensbedrohliche Infek-tionen in immunsupprimierten Patienten verursachen. Die Immunerkennung von Patho-genen sowie die Wechselwirkungen zwischen Immunzellen sind essentiell für die erfolg-reiche Bekämpfung von Pilzinfektionen. Zell-Zell-Interaktionen tragen zur gegenseitigen Aktivierung bei und können somit die Zytotoxizität gegenüber eindringenden Pathogenen steigern. In dieser Arbeit wurde die gegenseitige Zellaktivierung von natürlichen Killerzellen (NK-Zellen) und die aus Monozyten generierten, dendritischen Zellen (DZ) nach Stimula-tion mit Zellwandfraktionen und Zelllysaten des Pilzes A. fumigatus analysiert. Des Weite-ren wurde der Einfluss dendritischer Rezeptoren auf die NK-Zellaktivierung untersucht. Die Stimulation mit Liganden für Dectin-1 und TLR-2 induzierte die Freisetzung löslicher Faktoren, welche ausreichend waren, um autologe NK-Zellen zu stimulieren. Zusammen-fassend ist zu sagen, dass DZ mehr Rezeptoren zur Pilzerkennung exprimieren und so-mit NK-Zellen auch dann aktivieren konnten, wenn diese, aufgrund fehlender Rezepto-ren, nicht stimuliert wurden. Basierend auf diesen Ergebnissen sollten neue Pathogen-Erkennungsrezeptoren auf NK-Zellen identifiziert werden. Der Charakterisierungsmarker CD56 zeigte nach fun-galer Kokultur eine reduzierte Detektion in durchflusszytometrischen Analysen. Die ver-minderte Proteindetektion von CD56 war nicht assoziiert mit Apoptose, Internalisation, Sekretion oder Proteindegradierung. Weitere Analysen bestätigten eine starke CD56-Bindung zu Pilzhyphen, gefolgt von einer Konzentration des Proteins an der NK-A. fumi-gatus Interaktionsstelle. Diese Relokalisation zeigte eine Abhängigkeit zu Aktin, da Zytos-kelett-Inhibitoren die CD56-Bindung am Pilz verhinderten. Eine spezifische Blockade von CD56 Rezeptoren reduzierte die Freisetzung der immun-rekrutierenden Chemokine MIP-1α, MIP-1β und RANTES, was folgern ließ, dass CD56 eine funktionelle Rolle in der Pil-zerkennung der NK-Zellen hat. NK-Zellen, die während einer Immunsuppressionstherapie aus Empfängern einer al-logenen Stammzelltransplantation (alloSZT) gewonnen wurden, zeigten eine inhibierte Bindung von CD56 an Pilzhyphen. Diese korrelierte mit einer reduzierten Aktinpolymeri-sation nach fungaler Stimulation. Weiterhin hemmte eine Immunsuppressionstherapie mit Corticosteroiden die Sekretion von MIP-1α, MIP-1β und RANTES in NK-Zellen, die mit Pilz ex vivo stimuliert wurden. Ähnliches war zu beobachten, wenn NK-Zellen von ge-sunden Spendern vor Pilzstimulation mit Corticosteroiden vorbehandelt wurden. Daraus folgend wurde den Corticosteroiden ein negativer Einfluss auf die NK-Zellfunktion bei Pilzinfektionen zugesprochen. KW - Natürliche Killerzelle KW - Aspergillus fumigatus KW - Dendritische Zelle KW - NK cell KW - host-pathogen interaction KW - allogeneic stem cell transplantation KW - NK-DC cross-talk KW - DC Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-206077 ER - TY - THES A1 - Habenstein, Jens T1 - Neuropeptides in the brain of \(Cataglyphis\) \(nodus\) ants and their role as potential modulators of behavior T1 - Neuropeptide im Gehirn von \(Cataglyphis\) \(nodus\) Ameisen und ihre Rolle als potenzielle Modulatoren von Verhalten N2 - An adequate task allocation among colony members is of particular importance in large insect societies. Some species exhibit distinct polymorphic worker classes which are responsible for a specific range of tasks. However, much more often the behavior of the workers is related to the age of the individual. Ants of the genus Cataglyphis (Foerster 1850) undergo a marked age-related polyethism with three distinct behavioral stages. Newly emerged ants (callows) remain more or less motionless in the nest for the first day. The ants subsequently fulfill different tasks inside the darkness of the nest for up to four weeks (interior workers) before they finally leave the nest to collect food for the colony (foragers). This thesis focuses on the neuronal substrate underlying the temporal polyethism in Cataglyphis nodus ants by addressing following major objectives: (1) Investigating the structures and neuronal circuitries of the Cataglyphis brain to understand potential effects of neuromodulators in specific brain neuropils. (2) Identification and localization of neuropeptides in the Cataglyphis brain. (3) Examining the expression of suitable neuropeptide candidates during behavioral maturation of Cataglyphis workers. The brain provides the fundament for the control of the behavioral output of an insect. Although the importance of the central nervous system is known beyond doubt, the functional significance of large areas of the insect brain are not completely understood. In Cataglyphis ants, previous studies focused almost exclusively on major neuropils while large proportions of the central protocerebrum have been often disregarded due to the lack of clear boundaries. Therefore, I reconstructed a three-dimensional Cataglyphis brain employing confocal laser scanning microscopy. To visualize synapsin-rich neuropils and fiber tracts, a combination of fluorescently labeled antibodies, phalloidin (a cyclic peptide binding to filamentous actin) and anterograde tracers was used. Based on the unified nomenclature for insect brains, I defined traceable criteria for the demarcation of individual neuropils. The resulting three-dimensional brain atlas provides information about 33 distinct synapse-rich neuropils and 30 fiber tracts, including a comprehensive description of the olfactory and visual tracts in the Cataglyphis brain. This three-dimensional brain atlas further allows to assign present neuromodulators to individual brain neuropils. Neuropeptides represent the largest group of neuromodulators in the central nervous system of insects. They regulate important physiological and behavioral processes and have therefore recently been associated with the regulation of the temporal polyethism in social insects. To date, the knowledge of neuropeptides in Cataglyphis ants has been mainly derived from neuropeptidomic data of Camponotus floridanus ants and only a few neuropeptides have been characterized in Cataglyphis. Therefore, I performed a comprehensive transcriptome analysis in Cataglyphis nodus ants and identified peptides by using Q-Exactive Orbitrap mass spectrometry (MS) and matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight (MALDI-TOF) MS. This resulted in the characterization of 71 peptides encoded on 49 prepropeptide genes, including a novel neuropeptide-like gene (fliktin). In addition, high-resolution MALDI-TOF MS imaging (MALDI-MSI) was applied for the first time in an ant brain to localize peptides on thin brain cryosections. Employing MALDI-MSI, I was able to visualize the spatial distribution of 35 peptides encoded on 16 genes. To investigate the role of neuropeptides during behavioral maturation, I selected suitable neuropeptide candidates and analyzed their spatial distributions and expression levels following major behavioral transitions. Based on recent studies, I suggested the neuropeptides allatostatin-A (Ast-A), corazonin (Crz) and tachykinin (TK) as potential regulators of the temporal polyethism. The peptidergic neurons were visualized in the brain of C. nodus ants using immunohistochemistry. Independent of the behavioral stages, numerous Ast-A- and TK-immunoreactive (-ir) neurons innervate important high-order integration centers and sensory input regions with cell bodies dispersed all across the cell body rind. In contrast, only four corazonergic neurons per hemisphere were found in the Cataglyphis brain. Their somata are localized in the pars lateralis with axons projecting to the medial protocerebrum and the retrocerebral complex. Number and branching patterns of the Crz-ir neurons were similar across behavioral stages, however, the volume of the cell bodies was significantly larger in foragers than in the preceding behavioral stages. In addition, quantitative PCR analyses displayed increased Crz and Ast-A mRNA levels in foragers, suggesting a concomitant increase of the peptide levels. The task-specific expression of Crz and Ast-A along with the presence in important sensory input regions, high-order integration center, and the neurohormonal organs indicate a sustaining role of the neuropeptides during behavioral maturation of Cataglyphis workers. The present thesis contains a comprehensive reference work for the brain anatomy and the neuropeptidome of Cataglyphis ants. I further demonstrated that neuropeptides are suitable modulators for the temporal polyethism of Cataglyphis workers. The complete dataset provides a solid framework for future neuroethological studies in Cataglyphis ants as well as for comparative studies on insects. This may help to improve our understanding of the functionality of individual brain neuropils and the role of neuropeptides, particularly during behavioral maturation in social insects. N2 - Eine adäquate Aufgabenverteilung unter den Koloniemitgliedern ist in großen Insektengesellschaften von besonderer Bedeutung. Einige Arten weisen polymorphe Arbeiterklassen auf, die jeweils für einen bestimmten Aufgabenbereich zuständig sind. Viel häufiger jedoch steht das Verhalten der Arbeiterinnen im Zusammenhang mit dem Alter der Individuen. Ameisen der Gattung Cataglyphis (Foerster 1850) weisen einen ausgeprägten alterskorrelierten Polyethismus auf, der sich durch drei unterschiedliche Verhaltensstadien kennzeichnet. Neu geschlüpfte Ameisen (Callows) verharren den ersten Tag mehr oder weniger bewegungslos im Nest. Anschließend erfüllen die Ameisen in der Dunkelheit des Nestes bis zu vier Wochen lang verschiedene Aufgaben (Interior), bevor sie schließlich das Nest verlassen, um Nahrung für die Kolonie zu sammeln (Forager). Diese Arbeit konzentriert sich auf die neuronalen Grundlagen, die dem alterskorrelierten Polyethismus bei Cataglyphis nodus Ameisen zugrunde liegt, indem folgende Hauptziele verfolgt werden: (1) Untersuchung der Strukturen und der neuronalen Schaltkreise des Cataglyphis-Gehirns, um mögliche Effekte von Neuromodulatoren in spezifischen Hirnneuropilen besser zu verstehen. (2) Identifizierung und Lokalisierung von Neuropeptiden im Gehirn von Cataglyphis Ameisen. (3) Untersuchung der Expression geeigneter Neuropeptid-Kandidaten im Zuge der Verhaltensreifung von Cataglyphis Arbeitern. Das Gehirn bildet die Grundlage für die Steuerung des Verhaltens von Insekten. Obwohl die tragende Rolle des zentralen Nervensystems für das Verhalten zweifelsfrei bekannt ist, sind die funktionellen Aufgaben großer Bereiche des Insektengehirns nicht vollständig erforscht. Bei Cataglyphis Ameisen konzentrierten sich vorangegangene Studien fast ausschließlich auf die Hauptneuropile, während große Teile des zentralen Protocerebrums mangels klarer Abgrenzungen weitgehend unberücksichtigt geblieben sind. Daher habe ich ein dreidimensionales Cataglyphis-Gehirn mit Hilfe der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie rekonstruiert. Um die synapsinreichen Neuropile und Nerventrakte zu visualisieren, wurde eine Kombination aus fluoreszenzgekoppelten Antikörpern, Phalloidin (ein zyklisches Peptid, das an filamentöses Aktin bindet) und anterograden Tracern verwendet. Basierend auf der einheitlichen Nomenklatur für Insektengehirne definierte ich nachvollziehbare Kriterien für die Abgrenzung der einzelnen Neuropile. Die resultierende dreidimensionale neuronale Karte liefert Informationen über 33 verschiedene synapsinreiche Neuropile und 30 Nerventrakte, einschließlich einer umfassenden Beschreibung der olfaktorischen und visuellen Trakte im Cataglyphis-Gehirn. Dieser dreidimensionale Hirnatlas erlaubt es darüber hinaus, die vorhandenen Neuromodulatoren einzelnen Neuropilen des Gehirns zuzuordnen. Neuropeptide stellen die umfangreichste Gruppe an Neuromodulatoren im zentralen Nervensystem von Insekten dar. Sie regulieren wichtige physiologische Prozesse und Verhaltensweisen und wurden deshalb in jüngerer Vergangenheit mit der Regulation des alterskorrelierenden Polyethismus bei sozialen Insekten in Verbindung gebracht. Bislang wurde das Wissen über Neuropeptide bei Cataglyphis Ameisen hauptsächlich aus neuropeptidomischen Daten von Camponotus floridanus Ameisen abgeleitet und nur wenige Neuropeptide wurden bei Cataglyphis charakterisiert. Daher führte ich eine umfassende Transkriptomanalyse bei Cataglyphis nodus Ameisen durch und identifizierte Peptide mit Hilfe der Q-Exactive Orbitrap Massenspektrometrie (MS) und der Matrix-assistierte Laser Desorption-Ionisierung Time-of-Flight (MALDI-TOF) MS. Hierdurch konnten insgesamt 71 Peptide charakterisiert werden, die auf 49 Präpropeptid-Genen kodiert sind, einschließlich eines neuartigen Neuropeptid-ähnlichen Gens (Fliktin). Darüber hinaus wurde das hochauflösende MALDI-TOF MS-Imaging (MALDI-MSI) zum ersten Mal in einem Ameisenhirn angewandt, um Peptide auf dünnen Hirnkryoschnitten zu lokalisieren. Mittels MALDI-MSI konnte ich die räumliche Verteilung von 35 Peptiden sichtbar machen, die auf 16 Genen kodiert sind. Um die Rolle der Neuropeptide während der Verhaltensreifung zu untersuchen, wählte ich geeignete Neuropeptid-Kandidaten aus und analysierte deren räumliche Verteilung und Expressionsniveaus im Zuge wichtiger Verhaltensübergänge. Basierend auf aktuellen Studien schlug ich die Neuropeptide Allatostatin-A (Ast-A), Corazonin (Crz) und Tachykinin (TK) als mögliche Regulatoren des alterskorrelierenden Polyethismus vor. Die peptidergen Neurone wurden im Gehirn von C. nodus Ameisen mittels Immunhistochemie sichtbar gemacht. Unabhängig von den Verhaltensstadien innervieren die zahlreichen Ast-A- und TK-immunreaktiven (-ir) Neuronen wichtige Integrationszentren höherer Ordnung sowie sensorische Eingangsregionen, während ihre Zellkörper über die gesamte Zellkörperschicht verteilt sind. Im Gegensatz dazu wurden im Cataglyphis-Gehirn nur vier corazonerge Neuronen pro Hemisphäre gefunden. Ihre Somata sind in der Pars lateralis lokalisiert, deren Axone in das mediale Protocerebrum und den retrozerebralen Komplex projizieren. Anzahl und Verzweigungsmuster der Crz-ir Neuronen waren in allen Verhaltensstadien ähnlich, jedoch war das Volumen der Zellkörper bei Foragern signifikant größer als in den vorangegangenen Verhaltensstadien. Darüber hinaus zeigten quantitative PCR Analysen erhöhte Crz- und Ast-A mRNA-Level in Foragern, was auf einen gleichzeitigen Anstieg der Peptidspiegel schließen lässt. Die aufgabenspezifische Expression von Crz und Ast-A sowie deren Präsenz in wichtigen sensorischen Eingangsbereichen, Integrationszentren höherer Ordnung und den neurohormonellen Organen weisen auf eine tragende Rolle der Neuropeptide während der Verhaltensreifung von Cataglyphis Arbeiterinnen hin. Die vorliegende Arbeit beinhaltet ein umfassendes Nachschlagewerk für die Hirnanatomie und das Neuropeptidom von Cataglyphis Ameisen. Zudem konnte ich demonstrieren, dass Neuropeptide geeignete Modulatoren für den alterskorrelierenden Polyethismus von Cataglyphis Arbeitern sind. Der komplette Datensatz bietet eine solide Grundlage für zukünftige, neuroethologische Studien an Cataglyphis Ameisen sowie vergleichenden Studien in Insekten. Hierdurch kann unser Verständnis über die Funktionalität einzelner Hirnneuropile und die Rolle von Neuropeptiden, insbesondere während der Verhaltensreifung sozialer Insekten, in Zukunft verbessert werden. KW - Cataglyphis KW - Neuropeptide KW - Neuroethologie KW - Insektenstaaten KW - polyethism KW - neuropeptides KW - neuroethology KW - neuromodulation Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-249618 ER - TY - THES A1 - Kalb, Jacqueline T1 - The role of BRCA1 and DCP1A in the coordination of transcription and replication in neuroblastoma T1 - Die Rolle von BRCA1 und DCP1A in der Koordination von Transkription und Replikation im Neuroblastom N2 - The deregulation of the MYC oncoprotein family plays a major role in tumorigenesis and tumour maintenance of many human tumours. Because of their structure and nuclear localisation, they are defined as undruggable targets which makes it difficult to find direct therapeutic approaches. An alternative approach for targeting MYC-driven tumours is the identification and targeting of partner proteins which score as essential in a synthetic lethality screen. Neuroblastoma, an aggressive entity of MYCN-driven tumours coming along with a bad prognosis, are dependent on the tumour suppressor protein BRCA1 as synthetic lethal data showed. BRCA1 is recruited to promoter regions in a MYCN-dependent manner. The aim of this study was to characterise the role of BRCA1 in neuroblastoma with molecular biological methods. BRCA1 prevents the accumulation of RNA Polymerase II (RNAPII) at the promoter region. Its absence results in the formation of DNA/RNA-hybrids, so called R-loops, and DNA damage. To prevent the accumulation of RNAPII, the cell uses DCP1A, a decapping factor known for its cytoplasmatic and nuclear role in mRNA decay. It is the priming factor in the removal of the protective 5’CAP of mRNA, which leads to degradation by exonucleases. BRCA1 is necessary for the chromatin recruitment of DCP1A and its proximity to RNAPII. Cells showed upon acute activation of MYCN a higher dependency on DCP1A. Its activity prevents the deregulation of transcription and leads to proper coordination of transcription and replication. The deregulation of transcription in the absence of DCP1A results in replication fork stalling and leads to activation of the Ataxia telangiectasia and Rad3 related (ATR) kinase. The result is a disturbed cell proliferation to the point of increased apoptosis. The activation of the ATR kinase pathway in the situation where DCP1A is knocked down and MYCN is activated, makes those cells more vulnerable for the treatment with ATR inhibitors. In summary, the tumour suppressor protein BRCA1 and the decapping factor DCP1A, mainly known for its function in the cytoplasm, have a new nuclear role in a MYCN-dependent context. This study shows their essentiality in the coordination of transcription and replication which leads to an unrestrained growth of tumour cells if uncontrolled. N2 - Die MYC Onkoproteine spielen in einer Vielzahl humaner Tumore eine entscheidende Rolle und sind in fast allen Fällen dereguliert. Aufgrund ihrer Struktur und Lokalisation im Zellkern gelten sie für die Arzneimittelentwicklung als therapeutisch schwer angreifbar. Der Ansatz der synthetischen Lethalität ist es, Partnerproteine zu finden, die gerade für MYC-getriebene Tumore essenziell sind und diese zu inhibieren. Neuroblastome, die in einer besonders aggressiven Entität durch eine MYCN-Amplifikation getrieben sind und damit mit einer schlechten Prognose einhergehen, sind abhängig vom Tumorsupressor BRCA1, wie Daten zur synthetischen Lethalität zeigten. BRCA1 wird in Abhängigkeit von MYCN zu Promotoren rekrutiert. Diese Arbeit diente daher der Charakterisierung der Funktionalität von BRCA1 im Neuroblastom. BRCA1 verhindert die Akkumulation von RNA Polymerase II (RNAPII) in der Promoterregion. Ist BRCA1 nicht präsent, führt dies zur Bildung von DNA/RNA-Hybriden, sogenannten R-loops, und zu DNA Schäden. Um die Akkumulation von RNAPII zu verhindern, nutzt die Zelle DCP1A, einen Decapping Faktor, der sowohl im Cytoplasma als auch im Nukleus eine Rolle im mRNA Abbau spielt. DCP1A entfernt den schützenden 5’CAP der mRNA, wodurch diese von Exonukleasen abgebaut wird. BRCA1 ist notwendig für die Chromatin Bindung von DCP1A und die Rekrutierung zu RNAPII. Zellen mit einer akuten Aktivierung des MYCN Onkoproteins zeigen eine erhöhte Abhängigkeit von DCP1A. DCP1A verhindert eine Deregulation der Transkription, um Transkription mit Replikation erfolgreich zu koordinieren. Andernfalls führt dies beim Verlust von DCP1A zur Blockierung von Replikationsgabeln und der Aktivierung der Ataxia telangiectasia and Rad3 related (ATR) Kinase führt. In der Folge ist das Zellwachstum gestört und Zellen gehen vermehrt in Apoptose. Die Aktivierung des ATR Signalweges beim Verlust von DCP1A und MYCN Aktivierung verhindert vorerst den Zelltod, wodurch diese Zellen jedoch sensitiver auf die Inhibition von ATR reagieren. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass BRCA1 als Tumorsupressor und DCP1A als Decapping Faktor, hauptsächlich beschrieben als cytoplasmatisches Protein, eine entscheidende nukleäre Rolle in der Situation einer akuten Aktivierung von MYCN spielen. Dort sind sie essenziell um Transkription mit Replikation zu koordinieren und damit zu einem ungebremsten Wachstum der Tumorzellen beizutragen. KW - Neuroblastom KW - N-Myc KW - Gen BRCA 1 KW - Transkription KW - neuroblastoma KW - BRCA1 KW - Decapping KW - MYCN KW - transcription/replication conflicts Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-248711 ER - TY - THES A1 - Lapuente, Juan M. T1 - The Chimpanzees of the Comoé National Park, Ivory Coast. Status, distribution, ecology and behavior T1 - Die Schimpansen im Comoé Nationalpark, Elfenbeinküste. Status, Verbreitung, Ökologie und Verhalten N2 - Although wild chimpanzees (Pan troglodytes) have been studied intensely for more than 50 years, there are still many aspects of their ecology and behavior that are not well understood. Every time that a new population of chimpanzees has been studied, new behaviors and unknown aspects of their ecology have been discovered. All this accumulated knowledge is helping us to piece together a model of how could last human and chimpanzee common ancestors have lived and behaved between seven and five million years ago. Comoé chimpanzees had never been studied in depth, until we started our research in October 2014, only a few censuses had been realized. The last surveys prior our work, stated that the population was so decimated that was probably functionally extinct. When we started this research, we had to begin with a new intensive survey, using new methods, to ascertain the real status and distribution of the chimpanzees living in Comoé National Park (CNP). During the last five years, we have realized a deep study aiming to know more about their ecology and behavior. We combined transects and reconnaissance marches (recces) with the use of camera traps, for the first time in CNP, obtaining a wealth of data that is not fully comprised in this dissertation. With this research, we determined that there is a sustainable continuous population of Western chimpanzees (Pan troglodytes verus) in CNP and the adjacent area of Mont Tingui, to the West, with a minimum of 127 weaned chimpanzees living in our main 900 km2 study area, SW of CNP. We found that this population is formed by a minimum of eight different chimpanzee communities, of which we studied seven, four of them more in detail. These chimpanzees spent much more time in the forest than in the savanna habitats. We also found that Comoé chimpanzees consumed at least 58 different food items in their dit, which they obtained both from forest and savanna habitats. Another finding was that insectivory had an important role in their diet, with at least four species of ants, three of termites and some beetle larvae. These chimpanzees also hunted at least three species of monkeys and maybe rodents and duikers and occasionally consumed the big land snails of genus Achatina. We found that, during the fruit scarcity period in the late rainy season, they intensely consumed the cambium of Ceiba pentandra, as fallback food, much more than the bark or cambium of any other tree species. Another interesting finding was that all the chimpanzees in the studied area realized this particular bark-peeling behavior and had been repeatedly peeling the trees of this species for years. This did not increase tree mortality and the damage caused to the trees was healed in two years, not reducing the growth, thus being a sustainable use of the trees. We found that Comoé chimpanzees produced and used a great variety of tools, mainly from wooden materials, but also from stone and herbaceous vegetation. Their tool repertory included stick tools to dip for Dorylus burmeisteri ants, to fish for Camponotus and Crematogaster ants, to dip for honey, mainly from Meliponini stingless bees, but sometimes from honey bees (Apis mellifera). It also included the use of stick tools to fish termites of Macrotermes subhyalinus and Odontotermes majus (TFTs), to dip for water from tree holes and investigatory probes for multiple purposes. Additionally, these chimpanzees used leaf-sponges to drink from tree holes and to collect clayish water from salt-licks. They also used stones to hit the buttresses of trees during displays, the so called accumulative stone throwing behavior and probably used stones as hammers, to crack open hard-shelled Strichnos spinosa and Afraegle paniculata fruits and Achatina snails. The chimpanzees also used objects that are not generally accepted as animal tools, for being attached to the substrate, with different purposes: they drummed buttresses of trees with hands and/or feet to produce sound during male displays and they pounded open hard-shelled fruits, Achatina snails and Cubitermes termite mounds on stone or root anvils. We finally measured the stick tools and found significant differences between them suggesting that they were specialized tools made specifically for every purpose. We studied more in detail the differences between apparently similar tools, the honey dipping tools and the water dipping tools, often with brushes made at their tips to collect the fluids. These last tools were exclusive from Comoé and have not been described at any other site. We found that total length, diameter and brush length were significantly different, suggesting that they were specialized tools. We concluded that Comoé chimpanzees had a particular culture, different from those of other populations of Western chimpanzees across Africa. Efficient protection, further research and permanent presence of research teams are required to avoid that this unique population and its culture disappears by the poaching pressure and maybe by the collateral effects of climate change. N2 - Obwohl wild lebende Schimpansen (Pan troglodytes) seit mehr als 50 Jahren intensiv untersucht werden, gibt es noch zahlreiche Aspekte ihrer Ökologie und ihres Verhaltens, die nicht gut verstanden werden. Jedes Mal, wenn eine neue Population von Schimpansen studiert wurde, wurden neue Verhaltensweisen und unbekannte Aspekte ihrer Ökologie entdeckt. All dieses gesammelte Wissen hilft uns, ein Modell zu erstellen, wie lange die gemeinsamen Vorfahren von Menschen und Schimpansen vor sieben bis fünf Millionen Jahren gelebt und sich verhalten haben könnten. Als wir im Oktober 2014 mit unserer Forschung begannen waren die Comoé-Schimpansen, bis auf einige Populations-Zensus von Schimpansen in der Elfenbeinküste, noch nie eingehend untersucht worden. Die letzte Zählung bevor unsere Arbeit began ergab, dass die Schimansenpopulation so stark dezimiert war, dass sie als funktionell ausgestorben erarchtet werden konnte. Zum Beginn unserer Forschung, führten wir zuerst mit neusten Methoden einen neuen detailierten Zensus durch, um den tatsächlichen Status und die Verteilung der im Comoé-Nationalpark (CNP) lebenden Schimpansen zu ermitteln. In den folgenden fünf Jahren haben wir zudem eine umfassende Studie durchgeführt, um mehr über ihre Ökologie und ihr Verhalten zu erfahren. Wir haben im CNP erstmals systematische Transekte und Datenerhebungen mittels Kamerafallen kombiniert, um eine Fülle von Erkenntnissen zu erhalten, die in dieser Dissertation nicht vollständig enthalten sind. Wir stellten fest, dass es in CNP und dem westlich angrenzenden Gebiet des Mont Tingui nach wie vor eine nachhaltige und kontinuierliche Population westlicher Schimpansen (Pan troglodytes verus) existiert, wobei mindestens 131 adulte (entwöhnte) Schimpansen in unserem 900 km² großen Hauptuntersuchungsgebiet südwestlich des CNP leben. Diese Population besteht aus mindestens acht verschiedenen Schimpansengruppen, von denen wir sieben untersuchten, vier davon genauer. Wir konnten zeigen dass diese Schimpansen deutlich mehr Zeit im Wald als in den angrenzenden Savannenhabitaten verbringen. Wir stellten fest, dass Comoé- Schimpansen mindestens 58 verschiedene Futtermittel aus Wald- als auch aus Savannenhabitaten nutzen. Zudem spielt der Konsum von Insekten, bestelhend aus mindestens vier Ameisen-, drei Termiten- und verschiedenene Käferlarven eine wichtige Rolle in ihrem Ernährungsreportoire. Die Comoé-Schimpansen jagen zudem mindestens drei Affena sowie möglicherweise Nagetiere und Duiker, und fraßen gelegentlich die großen Schnecken der Gattung Achatina. Wir fanden heraus, dass sie den typischen Mangel an reifen Fuechten in der \späten Regenzeit durch den intensiven Konsum der Rinde (Kambium) von Ceiba pentandra kompensieren. Alle Schimpansen im untersuchten Gebiet zeigten dieses besondere Verhalten, bei dem sie die Rinde von Ceiba Bäumen schälen. Wir konnte zeigen, dass die Schimpansen diese Bäume seit Jahren wiederholt geschält hatten, was offenbar den Bäumen keinen nachhaltigen Schaden zugefügte. Innerhalb von zwei Jahren ware die Schäden geheilt and das Wachstum nicht verringert, was schlussfolgern lässt dass die Nutzung der Baumrinde nachhaltig ist. Wir fanden heraus, dass Comoé-Schimpansen eine Vielzahl von Werkzeugen aus Vegetation aber auch Steinen herstellten und verwendeten. Das Werkzeugrepertoire umfasste Stöckchen zur Gewinning von on Ameisen der Art Dorylus burmeisteri, sowie Ameisen der Gattungen Camponotus und Crematogaster, aber auch von Bienenhonig produziert von der stachellosen Gattung Melipoa sowie von Apis mellifera. Die Schimpansen nutzen ausserdem Pflanzenwerkzeuge zum Termitenfischen von Macrotermes subhyalinus und Odontotermes majus, um an das Wasser in Baumvertiefungen zu gelangen, sowie für diverse andere Untersuchungszwecke. Zusätzlich verwenden die Comoé-Schimpansen Blattschwämme, um aus Baumlöchern zu trinken und lehmiges Wasser von den Salzlecken zu sammeln. Im Rahmen ihres Imponierverhaltens schleuden sie Steine an die Brettwurzeln spezieller grosser Bäume, ein neu entdecktes Verhalten das als akkumulatives Steinerfen bezeichnet wird. Es ist wahrscheinlich dass sie Steine auch als Hammerwerkzeuge nutzen, um hartschalige Früchte wie Strichnos spinosa und Afraegle paniculata sowie grosse Landschnecken aufzubrechen. Die Schimpansen verwenden Gegenstände auch in anderen Zusammenhängen, die nicht unbedingt als Werkzeuggebrauch definiert werden können: Sie trommlen im Rahmen vom männlichen Imponierverhalten laut mit Händen und Füßen auf die Brettwurzeln von Bäumen, und zerschmettern harte Früchte, Schneckenhäuser und Cubitermes-Termitenhügel auf Ambossen aus Gestein oder Wurzeln. Wir haben signifikante Unterschiede beim Vermessen der Stabwerkzeuge festgestellt, was darauf hindeutet, dass es sich um Spezialwerkzeuge handelt, die speziell für verschiedene Zwecke hergestellt werden. Wir haben insbesondere die Unterschiede zwischen scheinbar ähnlichen Pinselwerkzeugen für den Konsum von Flüssigkeiten (H zu verhindern, sowie die möglichen Nebeneffekte des Klimawandels zu dokumentieren.onig, Wasser) genauer untersucht. Diese Pinselwerkzeuge der Comoé-Schimpansen sind offenbar einzigartig und bislang nicht in der Literatur beschrieben. Gesamtlänge, Durchmesser und Bürstenlänge weichen je nach Verwendungszweck der Pinsel erheblich voneinander ab, was darauf hindeutet, dass es sich um Spezialwerkzeuge handelt. Wir schlussfolgern, dass die Kultur der Comoé-Schimpansen einzigartig innerhalb der der westlichen Schimpansen ist. Um diese einzigartige Population von Schimpansen effektiv zu schützen benötigt es weitere Forschung sowie die ständige Präsenz von Forschungsteams, um Wilderei KW - Chimpanzee KW - ecology KW - distribution KW - behavior KW - Comoé National Park KW - tool-use KW - primate KW - tool KW - diet KW - habitat KW - Parc National de la Comoé KW - Schimpanse KW - Verhalten Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-223180 ER - TY - THES A1 - Pieper, Sabrina H. T1 - Temporal information transfer by electrical stimulation in auditory implants T1 - Zeitliche Informationsübertragung durch elektrische Stimulation bei Hörprothesen N2 - In deafness, which is caused by the malfunctioning of the inner ear, an implantation of a cochlear implant (CI) is able to restore hearing. The CI is a neural prosthesis that is located within the cochlea. It replaces the function of the inner hair cells by direct electrical stimulation of the auditory nerve fibers. The CI enables many deaf or severe hearing-impaired people to achieve a good speech perception. Nevertheless, there is a lot of potential for further improvements. Compared to normal-hearing listeners rate pitch discrimination is much worse. Rate pitch discrimination is the ability to distinguish the pitch of two stimuli with two different pulse rates. This ability is important for enjoying music as well as speech perception (in noise). Further, the small dynamic range in electrical hearing (compared to normal-hearing listeners) and therefore the small intensity resolution limits the performance of CI users. Both, rate pitch coding and dynamic range were investigated in this doctoral thesis. For the first issue, a pitch discrimination task was designed to determine the just-noticeable-difference (JND) in pitch with 200 and 400 pps as reference. Additionally to the default biphasic pulse (single pulse) the experiment was performed with double pulses. The double pulse consists out of two biphasic pulses directly after each other and a small interpulse interval (IPI) in between. Three different IPIs (15, 50, and 150 µs) were tested. The statistical analysis of JNDs revealed no significant effects between stimulation with single-pulse or double-pulse trains. A follow-up study investigated an alternating pulse train consisting of single and double pulses. To investigate if the 400 pps alternating pulse train is comparable in pitch with the 400 pps single-pulse train, a pairwise pitch comparison test was conducted. The alternating pulse train was compared with single-pulse trains at 200, 300 and 400 pps. The results showed that the alternating pulse train is for most subjects similar in pitch with the 200 pps single-pulse train. Therefore, pitch perception seemed to be dominated by the double pulses within the pulse train. Accordingly, double pulses with different amplitudes were tested. Based on the facilitation effect, a larger neuronal response was expected by stimulating with two pulses with a short IPI within the temporal facilitation range. In other studies, this effect was shown to be maximal in CIs of the manufacturer Cochlear, with first pulse amplitudes set at or slightly below the electrically evoked compound action potential (ECAP) threshold. The second pulse amplitude did not influence the facilitation effect and therefore could be choose at will. Similarly, this effect was tested in this thesis with CIs of the manufacturer MED-EL. Nevertheless, to achieve a proper signal-to-noise ratio, technical issues had to be addressed like a high noise floor, resulting in incorrect determination of the ECAP threshold. After solving this issues, the maximum facilitation effect was around the ECAP threshold as in the previous study with Cochlear. For future studies this effect could be used in a modified double pulse rate pitch experiment with the first pulse amplitude at ECAP threshold and the second pulse amplitude variable to set the most comfortable loudness level (MCL). The last study within this thesis investigated the loudness perception at two different loudness levels and the resulting dynamic range for different interphase-gaps (IPG). A larger IPG can reduce the amplitude at same loudness level to save battery power. However, it was unknown if the IPG has an influence on the dynamic range. Different IPGs (10 and 30 µs) were compared with the default IPG (2.1 µs) in a loudness matching experiment. The experiment was performed at the most comfortable loudness level (MCL) of the subject and the amplitude of half the dynamic range (50%-ADR). An upper dynamic range was calculated from the results of MCL and 50%-ADR (therefore not the whole dynamic range was covered). As expected from previous studies a larger IPG resulted in smaller amplitudes. However, the observed effect was larger at MCL than at 50%-ADR which resulted in a smaller upper dynamic range. This is the first time a decrease of this dynamic range was shown. N2 - Bei einer Taubheit, welche durch eine Schädigung des Innenohres hervorgerufen wird, ist es möglich das Gehör mittels eines Cochlea-Implantates (CI) wieder herzustellen. Das Implantat befindet sich innerhalb der Hörschnecke und ist in der Lage, die Funktion der inneren Haarzellen zu ersetzen. Dies geschieht durch direkte elektrische Stimulation der auditorischen Nervenfasern. Dadurch ermöglicht das CI Ertaubten oder stark Schwerhörigen, ein gutes Sprachverstehen zu erlangen. Dennoch gibt es weiterhin Verbesserungspotential. Im Vergleich zu Normalhörenden ist unter anderem die Tonhöhenunterscheidung stark eingeschränkt. Die Unterscheidung von Tonhöhen ist sowohl für den Musikgenuss als auch für das Sprachverstehen (im Störgeräusch) wichtig. Ebenso verfügen CI Träger über einen vergleichsweise kleinen Dynamikbereich und einer daraus resultierenden geringen Auflösung der Intensitäten. Dies kann zu einer Beeinträchtigung des Hörens führen. Sowohl die Fähigkeit der Tonhöhenunterscheidung als auch der Dynamikbereich werden in der vorliegenden Doktorarbeit untersucht. Hierfür wurde zunächst ein Tonhöhenunterscheidungs-Experiment entworfen, bei welchem der kleinste wahrnehmbare Unterschied zweier Pulsraten ermittelt wurde. Die Pulsraten 200 und 400 pps dienten als Referenzwert. Neben dem standardmäßig verwendeten Biphasischen Puls, wurden Doppelpulse genutzt. Diese bestehen aus zwei aufeinander folgenden biphasischen Pulsen gleicher Amplitude, welche durch ein kurzes interpuls Intervall (IPI) separiert sind. In dem Experiment wurden drei unterschiedliche IPIs getestet (15, 50 und 150 µs). Die Analyse des kleinesten wahrnehmbaren Tonhöhenunterschieds ergab keine signifikanten Unterschiede zwischen dem einfachen Puls und den Doppelpulsen. Ein Folgeexperiment beschäftigte sich mit einer alternierenden Pulsfolge bestehend aus dem einfachen und dem Doppelpuls. In einem paarweisen Vergleichsexperiment wurde die alternierende Pulsfolge bei 400 pps mit einem Einfachpuls bei 200, 300 und 400 pps in ihrer Tonhöhe verglichen. Es zeigte sich, dass die alternierende Pulsfolge bei 400 pps mehrheitlich mit dem Einzelpuls bei 200 pps vergleichbar war. Demzufolge scheint die Tonhöhenwahrnehmung der alternierenden Pulsfolge von dem Doppelpuls dominiert zu werden. Auf beide Experimente aufbauend, wurden Doppelpulse mit unterschiedlichen Amplituden untersucht. Basierend auf den Bahnungseffekt (Facilitation-Effekt), kann eine größere neuronale Antwort hervorgerufen werden, indem mit Doppelpulsen mit kurzem IPI stimuliert wird. In einer anderen Studie konnte anhand von CIs der Firma Cochlear gezeigt werden, dass dieser Effekt maximal war, wenn die Amplitude des ersten Pulses nahe der Schwelle zum elektrisch evozierten Summenaktionspotential (ECAP) liegt. Die Amplitude des zweiten Pulses dagegen hatte keinen Einfluss auf den „Facilitation“-Effekt und konnte beliebig gewählt werden. Dieser Effekt wurde mit CIs der Firma MED-EL in der vorliegenden Doktorarbeit nachgestellt. Es zeigte sich, dass auch hier der größte „Facilitation“-Effekt auftrat, wenn die Amplitude des ersten Pulses nahe der ECAP-Schwelle lag. In zukünftigen Studien könnte dieser Effekt für einen modifizierten Doppelpuls genutzt werden, um mit diesem das ursprüngliche Tonhöhenunterscheidungs-Experiment zu wiederholen. Dabei würde die Amplitude des ersten Pulses der ECAP-Schwelle entsprechen, während die zweite Pulsamplitude variiert wird, um den größten, möglichst angenehmen, Lautheitspegel zu erhalten. In einer letzten Studie wurde das Lautheitsempfinden bei zwei unterschiedlichen Lautheiten bei unterschiedlichen Interphasen-Gaps (IPG) untersucht und der daraus resultierende Dynamikbereich. Eine Vergrößerung des IPGs führt bei gleich bleibendem Lautheitsempfinden zu geringeren Stimulations-Amplituden und ist dadurch in der Lage die Batterie schonen. Allerdings ist der Einfluss auf den Dynamikbereich bisher unbekannt. In einem Lautheits-Experiment wurden Pulse mit verschiedenen IPGs (10 und 30 µs) mit dem standardmäßig verwendeten IPG (2.1 µs) in ihrer Lautheit angeglichen. Dieses Verfahren wurde bei MCL und der Amplitude des halben Dynamikbereichs (50%-ADR) durchgeführt. Aus den ermittelten Werten konnte ein „oberer“ Dynamikbereich zwischen MCL und 50%-ADR ermittelt werden. Es zeigte sich, dass sich die Amplituden mit größerem IPG, wie erwartet, verringerten. Jedoch zeigte sich ein stärkerer Effekt bei MCL, was eine Verringerung des Dynamikbereichs zur Folge hat. Dies ist das erste Mal, dass eine Verringerung des Dynamikbereichs gezeigt wurde. KW - Cochlear-Implantat KW - Bahnung KW - Elektrostimulation KW - temporal information transfer KW - ECAP KW - interphase gap KW - interpulse interval KW - cochlea implant KW - zeitlich Informationsübertragung Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-223887 ER - TY - THES A1 - Eisenhuth, Nicole Juliana T1 - Novel and conserved roles of the histone methyltransferase DOT1B in trypanosomatid parasites T1 - Neue und konservierte Rollen der Histonmethyltransferase DOT1B in Parasiten der Ordnung Trypanosomatida N2 - The family of trypanosomatid parasites, including the human pathogens Trypanosoma brucei and Leishmania, has evolved sophisticated strategies to survive in harmful host environments. While Leishmania generate a safe niche inside the host’s macrophages, Trypanosoma brucei lives extracellularly in the mammalian bloodstream, where it is constantly exposed to the attack of the immune system. Trypanosoma brucei ensures its survival by periodically changing its protective surface coat in a process known as antigenic variation. The surface coat is composed of one species of ‘variant surface glycoprotein’ (VSG). Even though the genome possesses a large repertoire of different VSG isoforms, only one is ever expressed at a time from one out of the 15 specialized subtelomeric ‘expression sites’ (ES). Switching the coat can be accomplished either by a recombination-based exchange of the actively-expressed VSG with a silent VSG, or by a transcriptional switch to a previously silent ES. The conserved histone methyltransferase DOT1B methylates histone H3 on lysine 76 and is involved in ES regulation in T. brucei. DOT1B ensures accurate transcriptional silencing of the inactive ES VSGs and influences the kinetics of a transcriptional switch. The molecular machinery that enables DOT1B to execute these regulatory functions at the ES is still elusive, however. To learn more about DOT1B-mediated regulatory processes, I wanted to identify DOT1B-associated proteins. Using two complementary approaches, specifically affinity purification and proximity-dependent biotin identification (BioID), I identified several novel DOT1B-interacting candidates. To validate these data, I carried out reciprocal co-immunoprecipitations with the most promising candidates. An interaction of DOT1B with the Ribonuclease H2 protein complex, which has never been described before in any other organism, was confirmed. Trypanosomal Ribonuclease H2 maintains genome integrity by resolving RNA-DNA hybrids, structures that if not properly processed might initiate antigenic variation. I then investigated DOT1B’s contribution to this novel route to antigenic variation. Remarkably, DOT1B depletion caused an increased RNA-DNA hybrid abundance, accumulation of DNA damage, and increased VSG switching. Deregulation of VSGs from throughout the silent repertoire was observed, indicating that recombination-based switching events occurred. Encouragingly, the pattern of deregulated VSGs was similar to that seen in Ribonuclease H2-depleted cells. Together these data support the hypothesis that both proteins act together in modulating RNA-DNA hybrids to contribute to the tightly-regulated process of antigenic variation. The transmission of trypanosomatid parasites to mammalian hosts is facilitated by insect vectors. Parasites need to adapt to the extremely different environments encountered during transmission. To ensure their survival, they differentiate into various specialized forms adapted to each tissue microenvironment. Besides antigenic variation, DOT1B additionally affects the developmental differentiation from the mammalian-infective to the insect stage of Trypanosoma brucei. However, substantially less is known about the influence of chromatin-associated proteins such as DOT1B on survival and adaptation strategies of related Leishmania parasites. To elucidate whether DOT1B’s functions are conserved in Leishmania, phenotypes after gene deletion were analyzed. As in Trypanosoma brucei, generation of a gene deletion mutant demonstrated that DOT1B is not essential for the cell viability in vitro. DOT1B deletion was accompanied with a loss of histone H3 lysine 73 trimethylation (the lysine homologous to trypanosomal H3K76), indicating that Leishmania DOT1B is also solely responsible for catalyzing this post-translational modification. As in T. brucei, dimethylation could only be observed during mitosis/cytokinesis, while trimethylation was detectable throughout the cell cycle in wild-type cells. In contrast to the trypanosome DOT1B, LmxDOT1B was not essential for differentiation in vitro. However, preliminary data indicate that the enzyme is required for effective macrophage infection. In conclusion, this study demonstrated that the identification of protein networks and the characterization of protein functions of orthologous proteins from related parasites are effective tools to improve our understanding of the parasite survival strategies. Such insights are a necessary step on the road to developing better treatments for the devastating diseases they cause. N2 - Vertreter der Familie der Trypanosomatidae einschließlich der humanpathogenen Trypanosoma brucei und Leishmania Arten entwickelten eine Reihe von ausgeklügelten Strategien, um in ihren Wirten zu überleben. Während sich Leishmanien eine sichere Nische in den Makrophagen ihrer Wirte aufbauen, lebt Trypanosoma brucei ausschließlich extrazellulär im Blutkreislauf der Säugetiere. Dort ist der Parasit ständig dem Angriff des Immunsystems ausgesetzt. Um sein Überleben zu sichern, wechselt er regelmäßig seine variablen Oberflächenproteine (VSG), eine Strategie, die auch als antigene Variation bekannt ist. Obwohl das Genom des Parasiten über ein enormes Repertoire an VSG Genen verfügt, wird immer nur eine einzige Art von einer von 15 spezialisierten telomerproximalen Expressionsstellen (ES) transkribiert. Um die VSG-Zelloberfläche zu wechseln, können Trypanosomen das VSG Gen der aktiven ES gegen ein inaktives VSG aus dem gigantischen Repertoire mittels Rekombination eintauschen. Eine weitere Möglichkeit ist der Transkriptionswechsel zu einer zuvor stillen ES. Die konservierte Histonmethyltransferase DOT1B katalysiert die Methylierung von Histon H3 am Lysin 76 und ist an der ES-Regulation beteiligt. DOT1B gewährleistet den transkriptionell inaktiven Status der ES und beeinflusst die Kinetik eines transkriptionellen ES Wechsels. Die molekularen Komponenten, die DOT1B diese regulatorischen Funktionen an der ES ermöglichen, sind jedoch noch unbekannt. Um mehr über die von DOT1B vermittelten Mechanismen zu erfahren, ist es notwendig, DOT1B-assoziierte Proteine zu identifizieren. Durch die Anwendung von komplementären biochemischen Proteinaufreinigungsmethoden gelang es mir, mehrere potentielle Proteininteraktionen zu DOT1B zu entdecken. Um die Daten zu validieren, führte ich weitere Proteinaufreinigungen mit den vielversprechendsten Kandidaten durch. Eine Interaktion zwischen DOT1B und der Ribonuklease H2 konnte bestätigt werden - eine Interaktion, die noch nie zuvor in anderen Organismen beschrieben wurde. In Trypanosomen gewährleistet Ribonuklease H2 die Genomintegrität, indem das Enzym RNA-DNA-Hybride auflöst. Diese Strukturen können zudem, wenn sie nicht richtig prozessiert werden, antigene Variation initiieren. In dieser Studie wurde daher außerdem DOT1B’s Beitrag zu diesem Weg der Initiation der antigenen Variation analysiert. In der Tat konnte gezeigt werden, dass DOT1B RNA-DNA-Hybride moduliert und die Genomintegrität sowie VSG-Wechselrate beeinflusst. Die Tatsache, dass in DOT1B-Mutanten VSG Isoformen von den unterschiedlichsten Genomregionen exprimiert wurden, deutet darauf hin, dass rekombinations-basierte Ereignisse dem VSG-Wechsel zu Grunde lagen. Da in den DOT1B-Mutanten ähnliche VSG exprimiert wurden wie in Ribonuklease H2-Mutanten, kann vermutet werden, dass beide Proteine bei der Modulation der RNA-DNA-Hybride zusammenwirken, um antigene Variation zu regulieren. Trypanosomen und Leishmanien werden mittels Insektenvektoren auf den nächsten Säugerwirt übertragen. Sie müssen daher nicht nur im Säugerwirt überleben, sondern sich auch an die extrem unterschiedliche Umgebung im Vektor anpassen. Dafür differenzieren sich die Parasiten in speziell angepasste Zellstadien. Zusätzlich zu der antigenen Variation beeinflusst DOT1B die Entwicklungsdifferenzierung in Trypanosoma brucei. In Leishmanien hingegen ist über den Einfluss von chromatin-assoziierten Proteinen wie DOT1B auf die Überlebens- und Anpassungsstrategien wesentlich weniger bekannt. Um herauszufinden, ob die Funktionen von DOT1B in Leishmanien konserviert sind, wurden Phänotypen nach Gendeletion analysiert. Wie auch in Trypanosoma brucei konnte gezeigt werden, dass DOT1B für das Überleben der Parasiten nicht essentiell ist. Die Deletion von DOT1B ging mit einem Verlust der Trimethylierung von Histon H3 am Lysin 73 (dem zum trypanosomalen H3K76 homologen Lysin) einher, was darauf hinweist, dass DOT1B auch in Leishmanien allein für die Katalyse dieser posttranslationalen Modifikation verantwortlich ist. Wie in Trypanosoma brucei konnte eine Dimethylierung nur in der Mitose/Zytokinese beobachtet werden, wobei die Trimethylierung während des gesamten Zellzyklus in Wildtyp-Zellen nachweisbar war. Im Gegensatz zum trypanosomalen DOT1B war LmxDOT1B für die Differenzierung in vitro entbehrlich. Vorläufige Daten zeigen jedoch, dass das Enzym für eine wirksame Makrophageninfektion wesentlich ist. Zusammenfassend zeigte diese Studie, dass die Identifizierung von Proteinnetzwerken und die Charakterisierung von Funktionen orthologer Proteine aus verwandten Parasiten wirksame Werkzeuge sind, um unser Verständnis der Überlebensstrategien der Parasiten zu verbessern. Solche Erkenntnisse sind ein notwendiger Schritt auf dem Weg zu effektiveren Behandlungsmethoden für die verheerenden Krankheiten, die diese Parasiten verursachen. KW - Trypanosoma brucei KW - Leishmania KW - Chromatin KW - Histon-Methyltransferase KW - DNA repair KW - developmental differentiation KW - DOT1 KW - Ribonuclease H2 Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-219936 ER - TY - THES A1 - Wagner, Rabea Marie T1 - The Bacterial Exo- and Endo-Cytoskeleton Spatially Confines Functional Membrane Microdomain Dynamics in \(Bacillus\) \(subtilis\) T1 - Das bakterielle Außen- und Innenskelett begrenzt die Mobilität funktionaler Membranmikrodomänen in \(Bacillus\) \(subtilis\) räumlich N2 - Cellular membranes form a boundary to shield the inside of a cell from the outside. This is of special importance for bacteria, unicellular organisms whose membranes are in direct contact with the environment. The membrane needs to allow the reception of information about beneficial and harmful environmental conditions for the cell to evoke an appropriate response. Information gathering is mediated by proteins that need to be correctly organized in the membrane to be able to transmit information. Several principles of membrane organization are known that show a heterogeneous distribution of membrane lipids and proteins. One of them is functional membrane microdomains (FMM) which are platforms with a distinct lipid and protein composition. FMM move within the membrane and their integrity is important for several cellular processes like signal transduction, membrane trafficking and cellular differentiation. FMM harbor the marker proteins flotillins which are scaffolding proteins that act as chaperones in tethering protein cargo to FMM. This enhances the efficiency of cargo protein oligomerization or complex formation which in turn is important for their functionality. The bacterium Bacillus subtilis contains two flotillin proteins, FloA and FloT. They form different FMM assemblies which are structurally similar, but differ in the protein cargo and thus in the specific function. In this work, the mobility of FloA and FloT assemblies in the membrane was dissected using live-cell fluorescence microscopy techniques coupled to genetic, biochemical and molecular biological methods. A characteristic mobility pattern was observed which revealed that the mobility of both flotillins was spatially restricted. Restrictions were bigger for FloT resulting in a decreased diffusion coefficient compared to FloA. Flotillin mobility depends on the interplay of several factors. Firstly, the intrinsic properties of flotillins determine the binding of different protein interaction partners. These proteins directly affect the mobility of flotillins. Additionally, binding of interaction partners determines the assembly size of FloA and FloT. This indirectly affects the mobility, as the endo-cytoskeleton spatially restricts flotillin mobility in a size-dependent manner. Furthermore, the extracellular cell wall plays a dual role in flotillin mobility: its synthesis stimulates flotillin mobility, while at the same time its presence restricts flotillin mobility. As the intracellular flotillins do not have spatial access to the exo-cytoskeleton, this connection is likely mediated indirectly by their cell wall-associated protein interaction partners. Together the exo- and the endo-cytoskeleton restrict the mobility of FloA and FloT. Similar structural restrictions of flotillin mobility have been reported for plant cells as well, where the actin cytoskeleton and the cell wall restrict flotillin mobility. These similarities between eukaryotic and prokaryotic cells indicate that the restriction of flotillin mobility might be a conserved mechanism. N2 - Zelluläre Membranen bilden eine Barriere um das Zellinnere von dem -äußeren abzuschirmen. Das ist insbesondere bei Bakterien wichtig, einzellige Organismen, deren Membranen in direktem Kontakt zu ihrer Umgebung stehen. Die Membran muss es ermöglichen, Informationen über mögliche vorteilhafte oder schädliche Einflüsse in der Umgebung wahrzunehmen, damit die Zelle dementsprechend eine Reaktion initiieren kann. Die Informationsaufnahme und die resultierenden Reaktionen werden von Membranproteinen in Gang gesetzt, deren Organisation in der Membran Voraussetzung für ihre Funktionalität ist. Mehrere Prinzipien zur Membranorganisation sind bekannt, die alle eine heterogene Verteilung von Proteinen und Lipiden zu Grunde legen. Ein Beispiel für ein solches Prinzip sind funktionelle Membranmikrodomänen (FMM), Plattformen mit einer besonderen Lipid- und Proteinzusammensetzung. FMM bewegen sich in der Membran und ihre Integrität ist für viele zelluläre Prozesse wichtig, zum Beispiel für Signaltransduktion, Membrantransport oder zur zellulären Differenzierung. Flotilline sind Markerproteine für FMM. Sie bilden eine Art Gerüst und funktionieren als Chaperone, indem sie die sogenannten Frachtproteine in den FMM binden. Dort wird die Effizienz der Oligomerisierung oder Komplexbildung der Frachtproteine gesteigert, was für ihre Funktionalität und die ihrer assoziierten Prozesse von Bedeutung ist. In dem Bakterium Bacillus subtilis gibt es zwei Flotilline, FloA und FloT. Diese formen FMM Plattformen, die zwar strukturell ähnlich sind, sich aber in ihren Frachtproteinen und somit auch in ihren spezifischen Funktionen unterscheiden. In dieser Arbeit wurde die Mobilität der FloA- und FloT-abhängigen Plattformen in der Membran untersucht. Dafür wurden Technologien der Fluoreszenzmikroskopie mit genetischen, biochemischen und molekularbiologischen Ansätzen kombiniert. Charakteristische Bewegungsmuster wurden beobachtet, die zeigten, dass die Beweglichkeit beider Flotilline räumlich begrenzt war. Dabei war die Einschränkung für FloT größer, und dementsprechend der Diffusionskoeffizient kleiner verglichen mit FloA. Die Mobilität von FloA und FloT hängt von dem Zusammenspiel mehrerer Faktoren ab. Zum einen bestimmen intrinsische Eigenschaften der Flotillinproteine ihre Fähigkeit verschiedene Interaktionspartner zu binden. Diese wirken sich dann direkt auf die Mobilität von Flotillinen aus. Des Weiteren bestimmt die Bindung verschiedener Interaktionspartner auch die Größe der FloA- und FloT- abhängigen Plattformen. Die resultierenden Größen beeinflussen die Mobilität indirekt, da das zelluläre Innenskelett die Flotillinmobilität räumlich in größenabhängiger Weise begrenzt. Außerdem spielt das Außenskelett der Zelle, die Zellwand, eine zweifache Rolle: die Zellwandsynthese fördert die Mobilität der Flotilline, während die Zellwand an sich gleichzeitig die Mobilität der Flotilline einschränkt. Da Flotilline räumlich keine Verbindung zum Außenskelett haben, wird diese Verbindung wahrscheinlich durch ihre Zellwand-assoziierten Interaktionspartner übermittelt. Zusammenfassend beschränken das Außen- und das Innenskelett die Mobilität von FloA und FloT. In Pflanzen wurden ähnliche strukturelle Beschränkungen der Mobilität von Flotillinen durch das Aktin- Zytoskelett und die Zellwand beschrieben. Diese Ähnlichkeit zwischen prokaryotischen und eukaryotischen Zellen deutet darauf hin, dass die Beschränkung der Mobilität der Flotillin-Plattformen ein konservierter Mechanismus sein könnte. KW - Heubacillus KW - Bakterienzellwand KW - Plasmamembran KW - Zellskelett KW - Bacillus subtilis KW - functional membrane microdomains KW - membrane dynamics KW - bacterial lipid rafts KW - cytoskeleton KW - cell wall Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-217458 ER - TY - THES A1 - Santos, Sara F. C. T1 - Expanding the targetome of Salmonella small RNA PinT using MS2 affinity purification and RNA-Seq (MAPS) T1 - Erweiterung des Targetoms der kleinen RNA PinT von Salmonella mittels MS2-Affinitätsaufreinigung und RNA-seq (MAPS) N2 - Bacterial small RNAs are key mediators of post-transcriptional gene regulation. An increasing number of sRNAs have been implicated in the regulation of virulence programs of pathogenic bacteria. Recently, in the enteric pathogen Salmonella Typhimurium, the PinT sRNA has gained increased importance as it is the most upregulated sRNA as Salmonella infects mammalian host cells (Westermann et al., 2016). PinT acts as a temporal regulator of Salmonella‘s two major pathogenicity islands, SPI-1 and SPI-2 (Kim et al., 2019; Westermann et al., 2016). However, the complete set of PinT targets, its role in Salmonella infection and host response is not yet fully understood. Building on the MS2 affinity purification and RNA- seq (MAPS) method (Lalaouna et al., 2015), we here set out to globally identify direct RNA ligands of PinT, relevant to Salmonella infection. We transferred the classical MAPS technique, based on sRNA-bait overexpression, to more physiological conditions, using endogenous levels of the sRNA. Making the henceforth identified targets, less likely to represent artefacts of the overexpression. More importantly, we progressed the MAPS technique to in vivo settings and by doing so, we were able pull-down bacterial RNA transcripts bound by PinT during macrophage infection. While we validate previously known PinT targets, our integrated data revealed novel virulence relevant target. These included mRNAs for the SPI-2 effector SteC, the PhoQ activator UgtL and the 30S ribosomal protein S22 RpsV. Next, we follow up on SteC, the best characterized virulence relevant PinT target. Using genetic and biochemical assays, we demonstrate that PinT represses steC mRNA by direct base-pairing and translational interference. PinT-mediated regulation of SteC leads to alterations in the host response to Salmonella infection. This regulation impacts the cytokine response of infected macrophages, by altering IL10 production, and possibly driving the macrophages to an anti-inflammatory state, more permise to infection. SteC is responsible for F-actin meshwork rearrangements around the SCV (Poh et al., 2008). Here we demonstrate that PinT-mediated regulation of SteC, impacts the formation of this actin meshwork in infected cells. Our results demonstrate that SteC expression is very tightly regulated by PinT in two layers; indirectly, by repressing ssrB and crp; and directly by binding to steC 5’UTR. PinT contributes to post-transcriptional cross-talk between invasion and intracellular replication programs of Salmonella, by controlling the expression of both SPI-1 and SPI-2 genes (directly and indirectly). Together, our collective data makes PinT the first sRNA in Gram-negatives with a pervasive role in virulence, at the center of Salmonella virulence programs and provide molecular input that could help explain the attenuation of pinT-deficient Salmonella strains in whole animal models of infection. N2 - Kleine RNAs sind zentrale Stellschrauben der posttranskriptionellen Genregulation in Bakterien. Eine zunehmende Anzahl von sRNAs ist an der Regulation von Virulenzprogrammen pathogener Bakterien beteiligt. In jüngster Zeit hat beim enterischen Erreger Salmonella Typhimurium die PinT-sRNA an Bedeutung gewonnen, da sie die am stärksten hochregulierte sRNA während der Infektion von Säugetierwirtszellen ist (Westermann et al., 2016). PinT fungiert als zeitlicher Regulator der beiden wichtigsten Pathogenitätsinseln von Salmonella, SPI-1 und SPI-2 (Kim et al., 2019a; Westermann et al., 2016). Die vollständige Liste der Targets von PinT und die Rolle von PinT bei der Salmonella-Infektion sowie der Wirstantwort sind jedoch noch nicht vollständig aufgeklärt. Mit Hilfe der MS2 affinity purification and RNA-seq (MAPS)-Methode (Lalaouna et al., 2015) möchten wir hier direkte RNA-Liganden von PinT identifizieren, die für die Salmonella-Infektion relevant sind. Wir übertragen die klassische MAPS-Technik, die auf der Überexpression von sRNA-Baits basiert, auf physiologischere Bedingungen unter Verwendung endogener Mengen der sRNA. Dadurch wird die Wahrschienlichkeit, dass die identifizierten Targets Artefakte sind, verringert. Darüber hinaus sind wir in der Lage, die MAPS-Technik unter in vivo-Bedingungen durchzuführen. Auf diese Weise konnten wie bakterielle Transkripte, die während einer Makrophageninfektion an PinT gebunden wurden, isolieren. Während wir bereits bekannte PinT-Ziele validieren, identifizieren unsere integrierten Daten ein neues Target, das für Virulenz relevant ist. Dazu gehörten mRNAs für den SPI-2-Effektor SteC, den PhoQ-Aktivator UgtL und das ribosomale 30S-Protein S22 RpsV. Zunächst untersuchen wir SteC, das am besten charakterisierte virulenzrelevante PinT-Ziel. Anhand genetischer und biochemischer Assays zeigen wir, dass PinT die steC-mRNA durch direkte Basenpaarung und Translationsrepression reguliert. Die PinT-vermittelte Regulation von SteC führt zu einer veränderten Wirtsreaktion auf eine Salmonella-Infektion. Diese Regulation beeinflusst die Zytokinreaktion infizierter Makrophagen, indem sie die IL10-Produktion verändert und die Makrophagen möglicherweise in einen entzündungshemmenden Zustand versetzt, der sie anfälliger für eine Infektion macht. SteC ist verantwortlich für die Umlagerung von F-Actin-Netzen um die SCV (Poh et al., 2008). Hier zeigen wir, dass die PinT-vermittelte Regulation von SteC die Bildung dieses Aktin-Netzwerks in infizierten Zellen beeinflusst. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Regulation der SteC-Expression durch PinT auf zwei Ebenden stattfindet: indirekt durch Unterdrückung von ssrB und crp; und direkt durch Bindung an steC 5’UTR. PinT trägt zum posttranskriptionellen Crosstalk zwischen Invasions- und intrazellulären Replikationsprogrammen von Salmonella bei, indem die Expression von SPI-1- und SPI-2-Genen (direkt und indirekt) gesteuert wird. Insgesamt macht unterstreichen unsere Daten die zentrale Rolle von PinT in Virulenzprogrammen von Salmonella. PinT ist die erste sRNA in Gram-Negativen mit einer derart durchdringenden Rolle bei der Virulenz. Zudem liefern unsere Ergebnisse Einblick auf molekularer Ebene, die die Attenuation von PinT-defizienten Salmonella-Stämmen in Tiermodellen erklären könnte. KW - Salmonella KW - small RNA KW - PinT KW - MS2-affinity purification and RNA-seq KW - effector protein KW - SteC Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-204926 ER - TY - THES A1 - Kouhestani, Dina T1 - Complementation of a bimolecular Antibody-Derivative within the context of the Immunological Synapse T1 - Komplementierung eines bimolekularen Antikörper-Derivates im Kontext der Immunologischen Synapse N2 - Cancer is a disease of uncontrolled cell proliferation and migration. Downregulation of antigen-presenting major histocompatibility complex (MHC) and co-stimulatory molecules are two of the most commonly used pathways by cancer cells to escape from immune surveillance. Therefore, many approaches have been developed for restoring the immune surveillance in cancer patients. One approach is to redirect the patient’s own T cells for tumor cell destruction. For T cell function it is important to induce a durable and robust cytotoxic response against target cells and to generate memory T cells, after MHC-mediated recognition of foreign intracellular antigens presented on the surface of antigen presenting cells (APC). Because of these cytotoxic properties, T cell mediated immunotherapy has been established as an effective and durable anti-neoplastic treatment. Different T cell mediated therapies for cancer treatment exist. One of them is using bispecific antibody fragments, so called bi-sepcific T cell engagers (BiTEs), for retargeting of T cells against single antigen positive tumor cells. The BiTE antibodies have two antigen binding domains, one against a target on the target cell, the second against CD3 on the T cells, facilitating cell-to-cell interactions. However, suitable single tumor antigens are limited, which restricts this approach to very few tumor types. To overcome this limitation, we have developed T cell-engaging antibody derivatives, termed hemibodies. Hemibodies exist as two complementary polypeptide chains. Each consists of two specific domains. On one end there is a single-chain variable fragment (scFv) against a target protein and on the other end there is either the heavy chain variable domain (VH) or light chain variable domain (VL) of an anti-CD3 binding antibody. Only when both hemibodies bind their respective antigens on the same tumor cell, the complementary anti CD3 VH and VL domains become aligned and reconstitute the functional CD3 binding-domain to engage T cells. For targeting malignant cells of hematopoietic origin, we used hemibodies against CD45 and HLA-A2. They were expressed in CHO cells, then purified via Strep-tag. To get more insight into the hemibody mechanism of T cell mediated target cell killing, we analyzed the biochemical and functional properties of hemibodies in more detail. Our main finding indicates that VLαCD3-scFvαHLA-A2 and VHαCD3-scFvαCD45 hemibodies induce an atypical immunological synapse characterized by a co-localization of HLA-A2 and CD45 out of the target cell -T cell interface. Nevertheless, hemibodies induce a high caspase activity in target cells in a concentration-dependent manner at nanomolar concentrations in vitro. Looking at ZAP70, which is usually recruited from the cytoplasm to the CD3 receptor in the middle of the cell-cell interface, we were able to detect activated ZAP70 outside of the cell-cell interface in the presence of hemibodies. In contrast cells treated with BiTEs show a central recruitment in the cell-cell interface as expected. We looked also at the interaction of hemibodies with soluble recombinant CD3 epsilon/gamma protein in the absence of target cells. The binding could be measured only at very high concentration out of the therapeutic window. This work contributes to the mechanistic understanding, which underlies the hemibody technology as a new dual antigen restricted T cell-mediated immunotherapy of cancer. N2 - Krebs ist eine Krankheit mit unkontrollierter Zellproliferation und -migration. Die Herunterregulierung des antigen-präsentierenden Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) und der co-stimulierenden Moleküle sind zwei der am häufigsten verwendeten Wege von Krebszellen, um der Immunüberwachung zu entkommen. Daher wurden viele Ansätze zur Wiederherstellung der Immunüberwachung bei Krebspatienten entwickelt. Ein Ansatz besteht darin, die eigenen T-Zellen des Patienten zur Zerstörung von Tumorzellen anzuleiten. T-Zellen zeichnen sich durch ihre schnelle Expansion nach MHC-vermittelter Erkennung von fremden intrazellulären Antigenen auf der Oberfläche von Antigen-präsentierenden Zellen (APC) aus. Darüber hinaus sind eine dauerhafte und robuste zytotoxische Immunantwort und die Erzeugung von Gedächtnis-T-Zellen wichtige Merkmale von T-Zellen. Aufgrund dieser Eigenschaften hat sich die T-Zell-vermittelte Immuntherapie als wirksame antineoplastische Behandlung in den letzten Jahren etabliert. Es gibt verschiedene Ansätze T-Zellen zur Krebsbehandlung zu nutzen. Ein Ansatz verwendet bispezifische Antikörperfragmente, sogenannte bi-sepezifische T-Zell-Engager (BiTEs), zum Retargeting von T-Zellen gegen Antigen-positive Tumorzellen. Die BiTE-Antikörper besitzen zwei Antigen-Bindungsdomänen. Eine ist gegen ein Antigen auf der Zielzelle gerichtet und die zweite ist gegen CD3 auf T-Zellen gerichtet, was zu einer direkten Rekrutierung der T-Zelle an die Zielzelle führt. Geeignete einzelne Tumorantigene, die nur auf Tumorzellen zu finden sind und nicht auf gesundem Gewebe sind jedoch begrenzt, was diesen Ansatz auf sehr wenige Tumortypen einschränkt. Um diese Einschränkung zu überwinden, haben wir bispezifische T-Zell-rekrutierende Antikörper-Derivate entwickelt, sogenannte Hemibodies. Hemibodies sind „single chain“ Polypeptidketten. Jeder Hemibody besitzt zwei spezifische Antigen bindende Domänen. Eine Domäne besteht aus einem „single chain variable Fragment“ (scFv) und ist gegen ein Zielantigen gerichtet und zweite Effektor-Domäne besteht entweder aus der variablen Domäne der schweren Kette (VH), oder die variable Domäne der leichten Kette (VL) eines Anti-CD3-Antikörpers. Nur wenn zwei komplementierende Hemibodies ihr jeweiliges Antigen auf der Oberfläche derselben Zielzelle binden, können die beiden anti-CD3-VH- und anti-CD3-VL-Domänen komplementieren und erst jetzt die funktionelle anti-CD3-Bindungsdomäne ausbilden um T-Zellen zu binden und zu aktivieren. Zur Therapie von bösartigen Zellen hämatopoetischen Ursprungs haben wir Hemibodies gegen CD45 und HLA-A2 hergestellt. Sie wurden in CHO-Zellen exprimiert und dann über Strep-Tag gereinigt. Um mehr über den Hemibody-Mechanismus der T-Zell-vermittelten Abtötung von Zielzellen zu erfahren, haben wir die biochemischen und funktionellen Eigenschaften von Hemibodies genauer analysiert. Unser Arbeit zeigt, dass VLαCD3-scFvαHLA-A2- und VHαCD3-scFvαCD45-Hemibodies eine atypische immunologische Synapse ausbilden. Diese ist gekennzeichnet durch die gemeinsame Verdrängung von HLA-A2 und CD45 aus dem „interface“ zwischen Zielzelle und T-Zelle. Dennoch können Hemibodies selbst bei Konzentrationen im nanomolaren Bereich in vitro eine Caspase-Aktivität in den Zielzellen induzieren. Betrachtet man ZAP70, dass bei T- Zell Aktivierung normalerweise vom Zytoplasma zum CD3-Rezeptor in der Mitte des Zell-Zell „interface“ rekrutiert wird, zeigt sich bei der Hemibody vermittelten T-Zell Aktivierung aktiviertes ZAP70 außerhalb des Zell-Zell „interface“. Im Gegensatz zu Hemibodies zeigen mit BiTEs aktivierte T-Zellen erwartungsgemäß eine zentrale Rekrutierung von ZAP70 im Zell-Zell „interface“. Wir untersuchten auch die Wechselwirkung von Hemibodies mit löslichem rekombinantem CD3-Epsilon / Gamma-Protein in Abwesenheit von Zielzellen. Eine Bindung konnte nur bei sehr hoher Konzentration außerhalb des therapeutischen Fensters gemessen werden. Diese Arbeit untersucht im Detail den T-Zell vermittelten Mechanismus der Hemibody Technologie. Die Ergebnisse ermöglichen uns den Wirkmechanismus der Hemibodies besser zu verstehen. Dies ist wichtig für die sichere Weiterentwicklung dieser neuen zielgerichteten T-Zell vermittelten Immuntherapie. KW - T cell engaging Antibody KW - Immunological synapse KW - Antibody Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-204669 ER - TY - THES A1 - Heydarian, Motaharehsadat T1 - Development of human 3D tissue models for studying \(Neisseria\) \(gonorrhoeae\) infection T1 - Entwicklung menschlicher 3D-Gewebemodelle zur Untersuchung der Infektion mit \(Neisseria\) \(gonorrhoeae\) N2 - Gonorrhea is the second most common sexually transmitted infection worldwide and is caused by Gram-negative, human-specific diplococcus Neisseria gonorrhoeae. It colonizes the mucosal surface of the female reproductive tract and the male urethra. A rapid increase in antibiotic resistance makes gonorrhea a serious threat to public health worldwide. Since N. gonorrhoeae is a human-specific pathogen, animal infection models are not able to recapitulate all the features of infection. Therefore, a realistic in vitro cell culture model is urgently required for studying the gonorrhea infection. In this study, we established and characterized three independent 3D tissue models based on the porcine small intestinal submucosa (SIS) scaffold by co-culturing human dermal fibroblasts with human colorectal carcinoma, endometrial epithelial, and male uroepithelial cells. The histological, immunohistochemical, and ultra-structural analysis showed that the 3D SIS scaffold-based models closely mimic the main characteristics of the site of gonococcal infection in the human host including the formation of epithelial monolayer, underlying connective tissue, mucus production, tight junction (TJ), and microvilli. In addition, functional analysis such as transepithelial electrical resistance (TEER) and barrier permeability indicated high barrier integrity of the cell layer. We infected the established 3D tissue models with different N. gonorrhoeae strains and derivatives presenting various phenotypes regarding adhesion and invasion. The results showed disruption of TJs and growing the interleukins production in response to the infection, which depends on the type of strain and cell. In addition, the 3D tissue models supported bacterial survival, which provided an appropriate in vitro model for long-term infection study. This could be mainly because of the high resilience of the 3D tissue models based on the SIS scaffold to the infection in terms of alteration in permeability, cell destruction, and bacterial transmigration. During gonorrhea infection, a high level of neutrophils migrates to the site of infection. The studies also showed that N. gonorrhoeae can survive or even replicate inside the neutrophils. Therefore, studying the interaction between neutrophils and N. gonorrhoeae is substantially under scrutiny. For this purpose, we generated a 3D tissue model by triple co-culturing of human primary fibroblast cells, human colorectal carcinoma cells, and human umbilical vein endothelial cells. The tissue model was subsequently infected by N. gonorrhoeae. A perfusion-based bioreactor system was employed to recreate blood flow in the side of endothelial cells and consequently study human neutrophils transmigration to the site of infection. We observed neutrophils activation upon the infection. Furthermore, we demonstrated the uptake of N. gonorrhoeae by human neutrophils and reverse transmigration of neutrophils to the basal side carrying N. gonorrhoeae. In summary, the introduced 3D tissue models in this research represent a promising tool to investigate N. gonorrhoeae infections under close-to-natural conditions. N2 - Tripper ist die zweithäufigste sexuell übertragbare Krankheit weltweit und wird durch Gram negative, humanspezifische Diplokokken Neisseria gonorrhoeae verursacht. Das human Pathogen besiedelt die Schleimhautoberfläche des weiblichen Fortpflanzungstraktes und der männlichen Harnröhre. Die rasante Zunahme der Antibiotikaresistenzen macht Gonorrhö zu einer ernsthaften Bedrohung für die öffentliche Gesundheit weltweit. Da N. gonorrhoeae ein humanspezifischer Erreger ist, ist es nicht möglich alle Merkmale einer Infektion in Tiermodellen nachzustellen, daher ist ein realistisches In-vitro-Zellkulturmodell für die Untersuchung der Gonorrhö-Infektion dringend erforderlich. In dieser Studie haben wir drei unabhängige 3D- Gewebemodelle etabliert und charakterisiert, die auf dem Gerüst der Schweine-Submukosa (SIS) basieren, indem wir menschliche dermale Fibroblasten mit menschlichen Darmkrebs-, Endometrialepithel- und männlichen Uroepithelzellen kultivieren. Die histologischen, immunhistochemischen und ultrastrukturellen Analysen zeigten, dass die 3D SIS-Gerüstmodelle die Hauptmerkmale der Stelle der Gonokokken Infektion im menschlichen Wirt genau nachahmen, indem sich Epithelien Monoschichten ausbildeten, unter denen sich Bindegewebe erstrechte. Zudem wiesen die Zellen enge Zell-Zell Kontakte auf und es kam zur Produktion von einer Mukosaschicht sowie Mikrovilli in den Modellen. Darüber hinaus zeigten Funktionsanalysen wie die Messung des transepithelialen elektrischen Widerstands (TEER) und die der Barriere Durchlässigkeit eine hohe Barriere Integrität der Zellschicht. Wir haben die etablierten 3D- Gewebemodelle mit verschiedenen N. gonorrhoeae-Stämmen und Derivaten infiziert, die verschiedene Phänotypen bezüglich der Adhäsion und der Invasion aufwiesen. Die Ergebnisse zeigten eine Unterbrechung der engen Zellverbindungen und eine Zunahme der Interleukin Produktion als Reaktion auf die Infektion, dessen Ausprägung allerdings stark von der Art des Stammes und des verwendeten Zelltyps abhängig ist. Darüber hinaus unterstützten die 3D- Gewebemodelle das bakterielle Überleben, was ein geeignetes In-vitro-Modell für Langzeit- Infektionsstudien liefert. Dies könnte vor allem auf die hohe Widerstandsfähigkeit der SIS- Gerüstmodelle gegen Infektionen in Bezug auf Veränderung der Permeabilität, Zellzerstörung und Bakterienwanderung zurückzuführen sein. Während der Gonorrhoe-Infektion wandert ein hoher Anteil an Neutrophilen an den Ort der Infektion. Die Studie zeigte auch, dass N. gonorrhoeae in den Neutrophilen überleben konnten oder sich sogar in diesen vermehren konnten. Deshalb wurde besonderes die Interaktion zwischen Neutrophilen und N. gonorrhoeae näher betrachtet. Zu diesem Zweck haben wir ein 3D-Gewebemodell mit Hilfe einer dreifache Co-Kultivierung von menschlichen primären Fibroblasten Zellen, menschlichen kolorektalen Karzinomzellen und menschlichen Nabelvenenendothelzellen erstellt. Das Gewebemodell wurde anschließend mit N. gonorrhoeae infiziert. Ein perfusionsbasiertes Bioreaktorsystem wurde eingesetzt, um den Blutfluss auf der Seite der Endothelzellen nachzuahmen und somit konnte die Auswanderung menschlicher Neutrophile zur Infektionsstelle untersucht werden. Darüber hinaus konnte mit diesem Modell die Aufnahme von N. gonorrhoeae in menschliche Neutrophilen und deren Rückwanderung in den Blutfluss beladen mit N. gonorrhoeae nachgewiesen werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das in dieser Forschung vorgestellte 3D-Gewebemodell ein vielversprechendes Instrument zur Untersuchung von N. gonorrhoeae-Infektionen unter naturnahen Bedingungen darstellt. KW - 3D-Gewebemodell KW - 3D tissue model KW - Neisseria gonorrhoeae KW - Co-Kultur KW - Bioreaktor KW - Neutrophil KW - co-culture KW - bioreactor KW - neutrophil Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-204967 ER - TY - THES A1 - Kessie, David Komla T1 - Characterisation of Bordetella pertussis virulence mechanisms using engineered human airway tissue models T1 - Charakterisierung der Virulenzmechanismen von Bordetella pertussis mit humanen Gewebemodellen der Atemwege N2 - Pertussis is a highly contagious acute respiratory disease of humans which is mainly caused by the gram-negative obligate human pathogen Bordetella pertussis. Despite the availability and extensive use of vaccines, the disease persists and has shown periodic re-emergence resulting in an estimated 640,000 deaths worldwide in 2014. The pathogen expresses various virulence factors that enable it to modulate the host immune response, allowing it to colonise the ciliated airway mucosa. Many of these factors also directly interfere with host signal transduction systems, causing damage to the ciliated airway mucosa and increase mucous production. Of the many virulence factors of B. pertussis, only the tracheal cytotoxin (TCT) is able to recapitulate the pathophysiology of ciliated cell extrusion and blebbing in animal models and in human nasal biopsies. Furthermore, due to the lack of appropriate human models and donor materials, the role of bacterial virulence factors has been extrapolated from studies using animal models infected with either B. pertussis or with the closely related species B. bronchiseptica which naturally causes respiratory infections in these animals and produces many similar virulence factors. Thus, in the present work, in vitro airway mucosa models developed by co-culturing human airway epithelia cells and fibroblasts from the conduction zone of the respiratory tract on a decellularized porcine small intestine submucosa scaffold (SISser®) were used, since these models have a high correlation to native human conducting zone respiratory epithelia. The major aim was to use the engineered airway mucosa models to elucidate the contribution of B. pertussis TCT in the pathophysiology of the disease as well as the virulence mechanism of B. pertussis in general. TCT and lipopolysaccharide (LPS) either alone or in combination were observed to induce epithelial cell blebbing and necrosis in the in vitro airway mucosa model. Additionally, the toxins induced viscous hyper-mucous secretion and significantly disrupted barrier properties of the in vitro airway mucosa models. This work also sought to assess the invasion and intracellular survival of B. pertussis in the polarised epithelia, which has been critically discussed for many years in the literature. Infection of the models with B. pertussis showed that the bacteria can adhere to the models and invade the epithelial cells as early as 6 hours post inoculation. Invasion and intracellular survival assays indicated the bacteria could invade and persist intracellularly in the epithelial cells for up to 3 days. Due to the novelty of the in vitro airway mucosa models, this work also intended to establish a method for isolating individual cells for scRNA-seq after infection with B. pertussis. Cold dissociation with Bacillus licheniformis subtilisin A was found to be capable of dissociating the cells without inducing a strong fragmentation, a problem which occurs when collagenase and trypsin/EDTA are used. In summary, the present work showed that TCT acts possibly in conjunction with LPS to disrupt the human airway mucosa much like previously shown in the hamster tracheal ring models and thus appears to play an important role during the natural B. pertussis infection. Furthermore, we established a method for infecting and isolating infected cells from the airway mucosa models in order to further investigate the effect of B. pertussis infection on the different cell populations in the airway by single cell analytics in the future. N2 - Pertussis ist eine hoch ansteckende akute Atemwegserkrankung des Menschen, die durch das gramnegative obligat humanpathogene Bakterium Bordetella pertussis verursacht wird. Obwohl seit langer Zeit effektive Impfstoffe verfügbar sind und weltweit eingesetzt werden, stellt die Krankheit nach wie vor ein großes Problem dar und tritt seit einiger Zeit auch in Ländern mit guten Impfraten wieder vermehrt auf. Allein in den letzten 10 Jahren wurden weltweit etwa 24 Millionen Neuinfektionen mit 640,000 Todesfällen pro Jahr gezählt. Die Bakterien exprimieren verschiedene Virulenzfaktoren, die es ihnen ermöglichen, die Immunantwort des Wirts zu modulieren, wodurch sie die Schleimhaut der oberen Atemwege besiedeln können. Viele dieser Faktoren stören auch direkt die Signaltransduktionssysteme des Zellen der oberen Atemwege, was zu einer Schädigung des Flimmerepithels der Atemwege und zu einer starken Erhöhung der Schleimproduktion führt. Von den vielen bekannten Virulenzfaktoren von B. pertussis kann soweit bekannt nur das Tracheale Cytotoxin (TCT) die typische Pathophysiologie des Flimmerepithels verursachen, die durch massive Gewebszerstörung gekennzeichnet ist und z.B. das Herauslösen von Epithelzellen aus der Epithelschicht oder die Ausbildung von bläschenförmigen Epithelzellen beinhaltet. Aufgrund des Mangels an geeigneten menschlichen Modellsystemen bzw. an Spendermaterialien wurden die Virulenzeigenschaften des Erregers entweder mit Hilfe von einfachen Zellkultursystemen oder in Tiermodellen untersucht, die keine natürlichen Wirte für B. pertussis darstellen. Alternativ hierzu wurden auch Daten, die mit dem eng verwandten tierpathogenen Bakterium B. bronchiseptica, das viele aus B. pertussis bekannte Virulenzfaktoren produziert, in entsprechenden Tiermodellen erhoben wurden, genutzt, um auf die Virulenzeigenschaften von B. pertussis zu schließen. Die vorliegende Arbeit verwendet In-vitro-Atemwegsschleimhautmodelle, die durch Co-Kultivierung von menschlichen Atemwegsepithelzellen und Fibroblasten auf einem dezellularisierten Schweine-Dünndarm-Submukosa-Gerüst (SISser®) entwickelt wurden. Die in-vitro-Atemwegsschleimhautmodelle weisen eine hohe Korrelation mit nativen menschlichen Epithelien der oberen Atemwege auf. Mithilfe dieser neuartigen Atemwegsschleimhautmodelle sollte der Beitrag von B. pertussis TCT zur Pathophysiologie der Krankheit und die Bedeutung von TCT als relevanter Virulenzfaktor aufgeklärt werden. Es wurde beobachtet, dass TCT und das bakterielle Lipopolysaccharid (LPS) entweder alleine oder in Kombination die Bildung von Epithelzellbläschen und Nekrose in diesen in-vitro-Atemwegsschleimhautmodellen induzieren. Zusätzlich induzierten diese Toxine eine viskose Hyperschleimsekretion und störten die Barriereeigenschaften der in-vitro-Atemwegsschleimhautmodelle signifikant. Zudem wurde in dieser Arbeit versucht, die Invasion und das intrazelluläre Überleben von B. pertussis in den polarisierten Epithelien zu bewerten, das in der einschlägigen Fachliteratur kritisch diskutiert wird. Die Infektion der Modelle mit B. pertussis zeigte, dass die Bakterien bereits 6 Stunden nach der Inokulation an den Modellen adhärieren und in diese eindringen können. Invasions- und intrazelluläre Überlebenstests zeigten, dass die Bakterien bis zu 3 Tage intrazellulär in die Epithelzellen überleben können. Aufgrund der Neuheit der in dieser Arbeit entwickelten in-vitro-Atemwegsschleimhautmodelle sollte auch eine Methode zur Isolierung einzelner Zellen für scRNA-seq Analysen nach Infektion mit B. pertussis etabliert werden. Dabei wurde festgestellt, dass die Inkubation der Modelle mit Subtilisin A von Bacillus licheniformis in der Kälte eine sehr gute Methode darstellt, um die Zellen zu dissoziieren, ohne eine starke Fragmentierung zu induzieren, wie sie unter Verwendung von Kollagenase und Trypsin / EDTA auftritt. Zusammenfassend wird in der vorliegenden Arbeit gezeigt, dass TCT gemeinsam mit LPS eine extrem destruktive Wirkung auf die menschliche Atemwegsschleimhaut besitzt, die der früher gezeigten Wirkung in Tiermodellen stark ähnelt. TCT sollte deshalb tatsächlich als ein wichtiger Virulenzfaktor von B. pertussis eingeschätzt werden. Darüber hinaus wurden Methoden zur Infektion und Isolierung von infizierten Zellen aus den Atemwegsschleimhautmodellen entwickelt, um künftig die Auswirkung einer B. pertussis Infektion auf die verschiedenen Zellpopulationen in den Atemwegen durch Einzelzellanalytik noch besser erforschen zu können. KW - Tissue engineering KW - Pertussis KW - Airway epithelia KW - Bordetella KW - tracheal cytotoxin KW - 3D models Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-235717 ER - TY - THES A1 - Stegmann, Yannik T1 - Electrocortical mechanisms of sustained attention during the acquisition and interaction of conditioned fear and anxiety T1 - Elektrokortikale Mechanismen der Aufmerksamkeit während der Akquisition und Interaktion konditionierter Furcht und Angst N2 - Adapting defensive behavior to the characteristics of a threatening situation is a fundamental function of the brain. Particularly, threat imminence plays a major role for the organization of defensive responses. Acute threat prompts phasic physiological responses, which are usually associated with an intense feeling of fear. In contrast, diffuse and potentially threatening situations elicit a sustained state of anxious apprehension. Detection of the threatening stimulus defines the key event in this framework, initiating the transition from potential to acute threat. Consequently, attention to threat is crucial for supporting defensive behavior. The functions of attention are finely tuned to the characteristics of a threatening situation. Potential threat is associated with hypervigilance, in order to facilitate threat detection. Once a threatening stimulus has been identified, attention is selectively focused on the source of danger. Even though the concepts of selective attention and hypervigilance to threat are well established, evidence for their neural correlates remain scarce. Therefore, a major goal of this thesis is to elucidate the neural correlates of selective attention to acute threat and hypervigilance during potential threat. A second aim of this thesis is to provide a mechanistic account for the interaction of fear and anxiety. While contemporary models view fear and anxiety as mutually exclusive, recent findings for the neural networks of fear and anxiety suggest potential interactions. In four studies, aversive cue conditioning was used to induce acute threat, while context conditioning served as a laboratory model of potential threat. To quantify neural correlates of selective attention and hypervigilance, steady-state visual evoked potentials (ssVEPs) were measured as an index of visuocortical responding. Study 1 compared visuocortical responses to acute and potential threat for high versus low trait-anxious individuals. All individuals demonstrated enhanced electrocortical responses to the central cue in the acute threat condition, suggesting evidence for the neural correlate of selective attention. However, only low anxious individuals revealed facilitated processing of the contexts in the potential threat condition, reflecting a neural correlate of hypervigilance. High anxious individuals did not discriminate among contexts. These findings contribute to the notion of aberrational processing of potential threat for high anxious individuals. Study 2 and 3 realized orthogonal combinations of cue and context conditioning to investigate potential interactions of fear and anxiety. In contrast to Study 1 and 2, Study 3 used verbal instructions to induce potentially threatening contexts. Besides ssVEPs, threat ratings and skin conductance responses (SCRs) were recorded as efferent indices of defensive responding. None of these studies found further evidence for the neural correlates of hypervigilance and selective attention. However, results for ratings and SCRs revealed additive effects of fear and anxiety, suggesting that fear and anxiety are not mutually exclusive, but interact linearly to organize and facilitate defensive behavior. Study 4 tested ssVEPs to more ecologically valid forms of context conditioning, using flickering video stimuli of virtual offices to establish context representations. Contrary to expectations, results revealed decreased visuocortical responses during sustained presentations of anxiety compared to neutral contexts. A disruption of ssVEP signals eventually suggests interferences by continuously changing video streams which are enhanced as a function of motivational relevance. In summary, this thesis provided evidence for the neural correlates of attention only for isolated forms of fear and anxiety, but not for their interaction. In contrast, an additive interaction model of fear and anxiety for measures of defensive responding offers a new perspective on the topography of defensive behavior. N2 - ZusammenfassungDie Anpassung defensiver Verhaltensweisen an die Anforderungen bedrohlicher Sit-uationen ist eine fundamentale Funktion des Gehirns. Akute Bedrohung führt in der Regel zu kurz-anhaltenden, physiologischen Reaktionen, die mit einem Gefühlintensiver Furcht einhergehen, während Situationen potenzieller Bedrohung zu einem anhaltenden Zustand erhöhter Angst führen. Dabei spielt das Erkennen der Gefahr eine besondere Rolle, da sie den Übergang von potenzieller zu akuter Bedrohung initiiert. Demnach kommt der Aufmerksamkeit eine wichtige Funktion bei der Unterstützung defensiver Verhaltensweisen zu. Mechanismen der Aufmerksamkeit sind dabei präzise auf die jeweilige Situation abgestimmt. Potenzielle Bedrohung führt zu Hypervigilanz, um bedrohliche Reize schneller zu entdecken ... KW - Furcht KW - Angst KW - Aufmerksamkeit KW - ssVEP KW - EEG KW - Conditioning KW - Visuelle Aufmerksamkeit Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-237700 ER - TY - THES A1 - Mortimer, Niall Patrick T1 - ADHD Genetics in Mouse and Man T1 - ADHS Genetik bei Maus und Mensch T1 - Genética del TDAH en ratón y hombre N2 - Attention-deficit/hyperactivity disorder (ADHD) is a neurodevelopmental disorder with an estimated heritability of around 70%. In order to fully understand ADHD biology it is necessary to incorporate multiple different types of research. In this thesis, both human and animal model research is described as both lines of research are required to elucidate the aetiology of ADHD and development new treatments. The role of a single gene, Adhesion G protein-coupled receptor L3 (ADGRL3) was investigated using a knockout mouse model. ADGRL3 has putative roles in neuronal migration and synapse function. Various polymorphisms in ADGRL3 have been linked with an increased risk of attention deficit/hyperactivity disorder (ADHD) in human studies. Adgrl3-deficient mice were examined across multiple behavioural domains related to ADHD: locomotive activity, visuospatial and recognition memory, gait impulsivity, aggression, sociability and anxiety-like behaviour. The transcriptomic alterations caused by Adgrl3-depletion were analysed by RNA-sequencing of three ADHD-relevant brain regions: prefrontal cortex (PFC), hippocampus and striatum. Increased locomotive activity in Adgrl3-/- mice was observed across all tests with the specific gait analysis revealing subtle gait abnormalities. Spatial memory and learning domains were also impaired in these mice. Increased levels of impulsivity and sociability accompanying decreased aggression were also detected. None of these alterations were observed in Adgrl3+/- mice. The numbers of genes found to exhibit differential expression was relatively small in all brain regions sequenced. The absence of large scale gene expression dysregulation indicates a specific pathway of action, rather than a broad neurobiological perturbation. The PFC had the greatest number of differentially expressed genes and gene-set analysis of differential expression in this brain region detected a number of ADHD-relevant pathways including dopaminergic synapses as well as cocaine and amphetamine addiction. The most dysregulated gene in the PFC was Slc6a3 which codes for the dopamine transporter, a molecule vital to current pharmacological treatment of ADHD. The behavioural and transcriptomic results described in this thesis further validate Adgrl3 constitutive knockout mice as an experimental model of ADHD and provide neuroanatomical targets for future studies involving ADGRL3 modified animal models. The study of ADHD risk genes such as ADGRL3 requires the gene to be first identified using human studies. These studies may be genome based such as genome wide association studies (GWAS) or transcriptome based using microarray or RNA sequencing technology. To explore ADHD biology in humans the research described in this thesis includes both GWAS and trancriptomic data. A two-step transcriptome profiling was performed in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of 143 ADHD subjects and 169 healthy controls. We combined GWAS and expression data in an expression-based Polygenic Risk Score (PRS) analysis in a total sample of 879 ADHD cases and 1919 controls from three different datasets. Through this exploratory study we found eight differentially expressed genes in ADHD and no support for the genetic background of the disorder playing a role in the aberrant expression levels identified. These results highlight promising candidate genes and gene pathways for ADHD and support the use of peripheral tissues to assess gene expression signatures for ADHD. This thesis illustrates how both human and animal model research is required to increase our understanding of ADHD. The animal models provide biological insight into the targets identified in human studies and may themselves provide further relevant gene targets. Only by combining research from disparate sources can we develop the thorough understanding on ADHD biology required for treatment development, which is the ultimate goal of translational science research. N2 - Die Aufmerksamkeitsdefizit- / Hyperaktivitätsstörung (ADHS) ist eine neurologische Entwicklungsstörung mit einer geschätzten Erblichkeit von etwa 70%. Um die ADHS-Biologie vollständig verstehen zu können, müssen verschiedene Forschungsansätze verfolgt werden. In dieser Dissertation werden sowohl Forschungsansätze am Menschen als auch im Tiermodell beschrieben, da beide Forschungsansätze erforderlich sind, um die Ätiologie von ADHS aufzuklären und neue Therapien zu entwickeln. Die Rolle eines einzelnen Gens, des Adhesion G-Protein-gekoppelten Rezeptors L3 (ADGRL3), wurde unter Verwendung eines Knockout-Mausmodells untersucht. ADGRL3 spielt eine mutmaßliche Rolle bei der neuronalen Migration und der Synapsenfunktion. Verschiedene Polymorphismen in ADGRL3 wurden in Studien an Menschen mit einem erhöhten Risiko für Aufmerksamkeitsdefizit- / Hyperaktivitätsstörung (ADHS) in Verbindung gebracht. Adgrl3-defiziente Mäuse wurden in mehreren Verhaltensbereichen im Zusammenhang mit ADHS untersucht: Bewegungsaktivität, visuelles und Erkennungsgedächtnis, Gangimpulsivität, Aggression, Umgänglichkeit und angstartiges Verhalten. Die durch Adgrl3-Depletion verursachten transkriptomischen Veränderungen wurden durch RNA-Sequenzierung von drei ADHS-relevanten Hirnregionen analysiert: präfrontaler Cortex (PFC), Hippocampus und Striatum. Bei allen Tests wurde eine erhöhte Aktivität der Lokomotive bei Adgrl3 - / - Mäusen beobachtet, wobei die spezifische Ganganalyse subtile Gangstörungen aufdeckte. Das räumliche Gedächtnis und die Lerndomänen waren bei diesen Mäusen ebenfalls beeinträchtigt. Es wurde auch ein erhöhtes Maß an Impulsivität und Umgänglichkeit festgestellt, begleitet von verminderter Aggression. Keine dieser Veränderungen wurde bei Adgrl3 +/- Mäusen beobachtet. Die Anzahl der Gene, bei denen eine unterschiedliche Expression festgestellt wurde, war in allen sequenzierten Hirnregionen relativ gering. Das Fehlen einer Dysregulation der Genexpression in großem Maßstab weist eher auf einen spezifischen Wirkmechanismus als auf eine breite neurobiologische Störung hin. Die PFC hatte die größte Anzahl differentiell exprimierter Gene, und eine Gen-Set-Analyse der differentiellen Expression in dieser Hirnregion ergab eine Reihe von ADHS-relevanten Signalwegen, einschließlich dopaminerger Synapsen sowie Kokain- und Amphetaminsucht. Das am stärksten dysregulierte Gen in der PFC war Slc6a3, das für den Dopamintransporter kodiert.Dieses Gen ist bei der derzeitigen pharmakologischen Behandlung von ADHS von entscheidender Bedeutung. Die in dieser Arbeit beschriebenen Verhaltens- und Transkriptomergebnisse bestätigen die konstitutiven Adgrl3-Knockout-Mäuse als experimentelles Modell für ADHS und liefern neuroanatomische Zielstrukturen für zukünftige Studien mit ADGRL3-modifizierten Tiermodellen. Die Untersuchung von ADHS-Risikogenen wie ADGRL3 erfordert zunächst, dass das Gen in Studien im Menschen identifiziert wird. Diese Studien können genombasiert sein, z.B. wie genomweite Assoziationsstudie (GWAS), oder transkriptombasiert unter Verwendung von Microarray- oder RNA-Sequenzierungstechnologie. Um die ADHS-Biologie beim Menschen zu erforschen, umfassen die in dieser Arbeit beschriebenen Forschungsansätze sowohl GWAS- als auch trankriptomische Daten. Ein zweistufiges Transkriptom-Profiling wurde in mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) von 143 ADHS-Patienten und 169 gesunden Kontrollpersonen durchgeführt. Wir kombinierten GWAS- und Expressionsdaten in einer Expressions-basierten PRS-Analyse (Polygenic Risk Score) in einer Gesamtstichprobe von 879 ADHS-Fällen und 1919 Kontrollen aus drei verschiedenen Datensätzen. Durch diese Untersuchungen fanden wir acht differentiell exprimierte Gene bei ADHS und keinen Hinweis darauf, dass der genetische Hintergrund der Störung eine Rolle bei den identifizierten aberranten Expressionsniveaus spielt. Diese Ergebnisse weisen auf vielversprechende Kandidatengene und Genwege für ADHS hin und unterstützen die Verwendung peripherer Gewebe zur Beurteilung der Genexpressionssignaturen für ADHS. Diese Arbeit zeigt, dass sowohl Forschungsansätze am Menschen als auch Tiermodelle erforderlich sind, um unser Verständnis von ADHS zu verbessern. Die Tiermodelle bieten biologische Einblicke in die in Studien an Menschen identifizierten Ziele und können selbst weitere relevante Genziele liefern. Nur durch die Kombination von Forschungsansätzen aus unterschiedlichen Quellen können wir ein tiefes Verständnis der ADHS-Biologie entwickeln, das für die Entwicklung von Behandlungsstrategien erforderlich ist. Dies ist das ultimative Ziel der translationalen wissenschaftlichen Forschung. N2 - El trastorno por déficit de atención con hiperactividad (TDAH) es un trastorno del desarrollo neural con una heredabilidad estimada de alrededor de un 70%. Para poder comprender plenamente la biología del TDAH, es necesario incorporar diversos tipos de investigación. En esta tesis, se describe la investigación en modelos tanto humanos como animales, ya que se requieren ambas líneas de investigación para aclarar la etiología del TDAH y poder desarrollar nuevos tratamientos. El papel de un solo gen, el receptor L3 acoplado a la proteína de adhesión G (ADGRL3) se ha investigado utilizando un modelo de ratón knock-out. El ADGRL3 tiene efectos putativos en la migración neuronal y en la función de la sinapsis. Varios polimorfismos en ADGRL3 se han relacionado con un mayor riesgo de trastorno por déficit de atención/ hiperactividad (TDAH) en estudios en humanos. Adicionalmente se han examinado ratones deficientes en ADGRL3 en varios ámbitos conductuales relacionados con el TDAH tales como la actividad locomotriz, la memoria visoespacial y de reconocimiento, la impulsividad de la marcha, la agresividad, la sociabilidad y los comportamientos similares a la ansiedad. Las modificaciones trabscriptómicas causadas por el agotamiento de ADGRL3 se han analizado por secuenciación del ARN de tres regiones del cerebro relevantes al TDAH: la corteza prefrontal (CPF), el hipocampo, y el estriado. Se ha observado una mayor actividad locomotriz en ratones ADGRL3 -/- en todas las pruebas con el análisis específico de la marcha que revela anomalías sutiles de la marcha. La memoria espacial y los dominios de aprendizaje también se han visto afectados en estos mismos ratones. También se detectaron niveles aumentados de impulsividad y sociabilidad que acompañan a la disminución de la agresividad. Ninguno de estos cambios se han observado en ratones ADGRL3 +/-. El número de genes encontrados que exhibieron una expresión diferencial ha sido relativamente bajo en todas las regiones del cerebro secuenciadas. La ausencia de desregulación de expresión génica a gran escala indica una vía de acción específica, en vez de una perturbación neurobiológica amplia. La corteza prefrontal tenía el mayor número de genes expresados diferencialmente y el análisis de conjuntos de genes de expresión diferencial en esta región del cerebro ha mostrado una serie de vías relevantes para el TDAH, incluyendo las sinapsis dopaminérgicas así como la adicción a la cocaína y a las anfetaminas. El gen más desregulado en la corteza prefrontal fue el Slc6a3, que codifica para el transportador de dopamina, una molécula esencial para el tratamiento farmacológico actual del TDAH. Los resultados conductuales y transcriptómicos descritos en esta tesis dan aún más validez a los ratones knock-out constitutivos de Adgrl3 como modelo experimental de TDAH y ofrecen objetivos neuroanatómicos para estudios futuros con modelos animales modificados con ADGRL3. El estudio de genes de riesgo de TDAH como el ADGRL3 requiere que el gen se identifique primero mediante estudios en humanos. Estos estudios pueden basarse en el genoma, como GWAS (estudio extenso de asociación en todo el genoma) o en transcriptoma, usando microarrays o tecnología de secuenciación de ARN. Para explorar la biología del TDAH en humanos, la investigación descrita en esta tesis incluye datos GWAS y trancriptómicos. Se ha realizado un perfil de transcriptoma de dos fases en células mononucleares de sangre periférica (CMSP) de 143 sujetos con TDAH y 169 controles sanos. Hemos combinado GWAS y datos de expresión en un análisis de puntuación de riesgo poligénico con sede en expression genica en una muestra total de 879 casos de TDAH y 1919 controles de tres conjuntos de datos distintos. A través de este estudio exploratorio, hemos encontrado ocho genes expresados diferencialmente en el TDAH y además que no existe indicio de que el fondo genético del trastorno tiene un papel en los niveles de expresión aberrantes identificados. Estos resultados subrayan genes candidatos prometedores y vías genéticas para el TDAH y además apoyan el uso de tejidos periféricos para evaluar las firmas de expresión génica para el TDAH Esta tesis muestra cómo se requiere la investigación en modelos humanos y animales para aumentar nuestra comprensión del TDAH. Los modelos animales proporcionan información biológica sobre los objetivos identificados en estudios en humanos y pueden proporcionar objetivos genéticos relevantes adicionales. Solo mediante la combinación de las investigaciones de fuentes dispares podemos desarrollar la comprensión exhaustiva de la biología del TDAH necesaria para el desarrollo del tratamiento, lo que es el objetivo principal de la investigación científica traslacional. KW - ADGRL3 KW - Neuroscience KW - Genetics KW - ADHD KW - Mouse Model KW - Human Transcriptome Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-236265 ER - TY - THES A1 - Haack, Stephanie T1 - A novel mouse model for systemic cytokine release upon treatment with a superagonistic anti-CD28 antibody T1 - Ein neues Mausmodell zur Untersuchung der Zytokinfreisetzung nach Behandlung mit einem superagonistischen anti-CD28 Antikörper N2 - The adaptive immune system is known to provide highly specific and effective immunity against a broad variety of pathogens due to different effector cells. The most prominent are CD4+ T-cells which differentiate after activation into distinct subsets of effector and memory cells, amongst others T helper 1 (Th1) cells. We have recently shown that mouse as well as human Th1 cells depend on T cell receptor (TCR) signals concomitant with CD28 costimulation in order to secrete interferon  (IFN) which is considered as their main effector function. Moreover, there is a class of anti-CD28 monoclonal antibodies that is able to induce T cell (re-)activation without concomitant TCR ligation. These so-called CD28-superagonists (CD28-SA) have been shown to preferentially activate and expand CD4+ Foxp3+ regulatory T (Treg) cells and thereby efficaciously conferring protection e.g. against autoimmune responses in rodents and non-human primates. Considering this beneficial effect, CD28-SA were thought to be of great impact for immunotherapeutic approaches and a humanized CD28-SA was subjected to clinical testing starting with a first-in-man trial in London in 2006. Unexpectedly, the volunteers experienced life-threatening side effects due to a cytokine release syndrome (CRS) that was unpredicted by the preclinical studies prior to the trial. Retrospectively, CD4+ memory T cells within the tissues were identified as source of pro-inflammatory cytokines released upon CD28-SA administration. This was not predicted by the preclinical testing indicating a need for more reliable and predictive animal models. Whether mouse CD4+ T cells are generally irresponsive to CD28-SA stimulation or rather the lack of a bona fide memory T cell compartment in cleanly housed specific-pathogen-free (SPF) mice is the reason why the rodent models failed to predict the risk for a CRS remained unclear. To provide SPF mice with a true pool of memory/effector T cells, we transferred in vitro differentiated TCR-transgenic OT-II Th1 cells into untreated recipient mice. Given that Treg cells suppress T cell activation after CD28- SA injection in vivo, recipients were either Treg-competent or Treg-deficient, wild type or DEREG mice, respectively. Subsequent CD28-SA administration resulted in induction of systemic pro-inflammatory cytokine release, dominated by IFN, that was observed to be much more pronounced and robust in Treg-deficient recipients. Employing a newly established in vitro system mirroring the in vivo responses to CD28-SA stimulation of Th1 cells revealed that antigen-presenting cells (APCs) amplify CD28-SAinduced IFN release by Th1 cells due to CD40/CD40L-interactions. Thus, these data are the first to show that mouse Th1 cells are indeed sensitive to CD28-SA stimulation in vivo and in vitro responding with strong IFN release accompanied by secretion of further pro-inflammatory cytokines, which is compatible with a CRS. In conclusion, this study will facilitate preclinical testing of immunomodulatory agents providing a mouse model constituting more “human-like” conditions allowing a higher degree of reliability and translationability. N2 - Das adaptive Immunsystem ermöglicht mittels hocheffektiver, antigen-spezifischer Mechanismen und unterschiedlicher Effektorzellen den Schutz vor einer nahezu unbegrenzten Vielfalt von Pathogenen. Die Hauptakteure stellen hierbei CD4+ T-Zellen dar, welche nach Aktivierung distinkte Effektorpopulationen, unter anderem Th1 Zellen, bilden. Wir zeigten kürzlich, dass sowohl für Maus- als auch humane Th1-Zellen CD28-Kostimulation mit zeitgleicher T-Zellrezeptor (TZR)-Aktivierung essentiell für die Sekretion von Interferon  (IFN), deren Haupteffektorfunktion, ist. Allerdings sind monoklonale anti-CD28 Anti-körper bekannt, die auch ohne TZR-Signal T-Zellen aktivieren können. Diese sogenannten CD28 Supera-gonisten (CD28-SA) aktivieren und expandieren vorrangig CD4+ Foxp3+ regulatorische T-Zellen (Treg) und vermitteln wirksamen Schutz vor z.B. Autoimmunreaktionen in Nagern und Primaten. Um diesen erfolgversprechenden Effekt für immuntherapeutische Ansätze nutzen zu können, wurde 2006 in Lon-don eine erste klinische Erprobung eines humanisierten CD28-SA begonnen. Unerwarteterweise zeigten sich bei den Probanden lebensbedrohliche Nebenwirkungen, die Ausdruck eines Zytokin-Ausschüttungs-Syndroms (Cytokine Release Syndrome, CRS) waren, welches durch die vorangegangenen präklinischen Studien nicht vorhersagbar war. Rückblickend konnte die Sekretion pro-inflammatorischer Zytokine auf CD4+ Gedächtnis-T-Zellen im Gewebe zurückgeführt werden, die so auf die Gabe des CD28-SA reagier-ten. Die unvorhersehbare Reaktion im Menschen zeigt deutlich, dass verlässlichere und prädiktivere Tiermodelle unverzichtbar sind. Ob Maus CD4+-T-Zellen möglicherweise nicht durch CD28-SA stimulier-bar sind oder dieser fehlgeleiteten Einschätzung über das mögliche Risiko eines CRS eher das Fehlen eines echten CD4+ Gedächtnis-T-Zellen-Kompartiments in sauber gehaltenen spezifischen-Pathogen-freien (SPF) Mäusen zugrunde liegt, ist bisher ungeklärt. Um in SPF-Mäusen ein Gedächtnis-T-Zell-Kompartiment zu etablieren, wurden in vitro-differenzierte Th1 Zellen, die TZR-transgenen OT-II-Mäusen entstammen, in unbehandelte Empfängermäuse transferiert. Da bekannt ist, dass Treg-Zellen die Aktivierung von T-Zellen nach Anwendung von CD28-SA in vivo supprimieren, wurden Treg-kompetente (wildtypische) oder -defiziente (DEREG) Empfänger verwendet. Die anschließend erfolgte Injektion von CD28-SA löste die systemische Sekretion pro-inflammatorischer Zytokine aus, wobei eine stark erhöhter IFN-Konzentration im Serum zu beobachten war, welche deutlich ausgeprägter und robuster bei den Treg-defizienten Empfängern ausfiel. Ein neu etabliertes in vitro-System, welches die in vivo Antwort der Th1-Zellen auf CD28-SA-Stimulation widerspiegelt, identifizierte Antigen-präsentierende Zellen (APZs) als essentiellen Faktor für die erhöhte IFN-Sekretion der Th1-Zellen nach CD28-SA-Stimulation in Abhängigkeit von CD40/CD40L-Interaktionen. Zusammenfassend zeigt diese Thesis zum ersten Mal, dass Maus Th1 Zellen sowohl in vivo als auch in vitro durch CD28 SA stimulierbar sind, wodurch eine starke IFN-Sekretion induziert wird, die von der gesteigerten Ausschüttung anderer pro-inflammatorischer Zytokine begleitet wird und in Abwesenheit von Treg einem CRS gleicht. Folglich kann diese Erkenntnis die präklinische Forschung bei der Erprobung neuer immuntherapeutischer Ansät-ze durch ein neues Mausmodell voranbringen, das dem menschlichen erfahreneren Immunsystem mehr als bisherige Modelle entspricht und somit verlässlichere Vorhersagen erlaubt und eine verbesserte Übertragbarkeit von Maus zu Mensch ermöglicht. KW - CD28 KW - CD28-SA KW - cytokine release syndrome Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-237757 ER - TY - THES A1 - Gunesch, Sandra T1 - Molecular Mode of Action of Flavonoids: From Neuroprotective Hybrids to Molecular Probes for Chemical Proteomics T1 - Wirkmechanismen von Flavonoiden: Von neuroprotektiven Hybriden zu Sonden für chemische Proteomik N2 - Alzheimer’s disease (AD) is the most common form of dementia, and currently, there is no treatment to cure or halt disease progression. Because the one-target strategy focusing on amyloid-β has failed to generate successful pharmaceutical treatment, this work studies natural products with pleiotropic effects focusing on oxidative stress and neuroinflammation as key drivers of disease progression. The central part of this work focused on flavonoids as neuroprotectants. 7-O-Esters of taxifolin and cinnamic or ferulic acid were synthesized and investigated towards their neuroprotective potential addressing aging and disease. 7-O-Feruloyl- and 7-O-cinnamoyltaxifolin showed overadditive effects in oxidative stress-induced assays in the mouse neuronal cell line HT22 and proved to be protective against neuroinflammation in microglial BV-2 cells. The overadditive effect translated to animals using an Aβ25-35-induced memory-impaired AD mouse model where the compounds were able to ameliorate short-term memory defects. While the disease-modifying effects in vivo were observed, the detailed mechanisms of action and intracellular targets of the compounds remained unclear. Hence, a chemical probe of the neuroprotective flavonoid ester 7-O-cinnamoyltaxifolin was developed and applied in an activity-based protein profiling approach. SERCA and ANT-1 were identified as potential targets. Further, chemical modifications on the flavonoids taxifolin, quercetin, and fisetin were performed. The achievements of this work are an important contribution to the use of secondary plant metabolites as neuroprotectants. Chemical modifications increased the neuroprotective effect of the natural products, and distinct intracellular pathways involved in the neuroprotective mechanisms were identified. The results of this work support the use of secondary plant metabolites as potential therapeutics and hint towards new pharmacological targets for the treatment of neurodegenerative disorders. N2 - Morbus Alzheimer ist die häufigste Form der Demenz und derzeit unheilbar. Die auf das Amyloidprotein fokussierte Medikamentenforschung konnte nicht zu einer erfolgreichen Therapie führen. In dieser Arbeit wurden Naturstoffe mit pleiotropischer Wirkung untersucht, die oxidativen Stress und Neuroinflammation als Schlüsselrollen für den Fortschritt der Krankheit adressieren. Das Flavonoid Taxifolin wurde in Position 7 mit Ferula- oder Zimtsäure verestert und hinsichtlich der neuroprotektiven Eigenschaften untersucht. Die Substanzen zeigten in Untersuchungen zu oxidativem Stress in der hippocampalen Mauszelllinie HT22 und in Untersuchungen neuronaler Entzündungsprozesse in BV-2 Mikroglia Zellen überadditive protektive Wirkung. Diese ließ sich auch auf ein Tiermodell übertragen. In einem Alzheimer Mausmodell konnten Beeinträchtigungen des Kurzzeitgedächtnisses durch die Verabreichung der Taxifolin-Zimtsäure- und -Ferulasäureester behoben werden. Trotz des krankheitsmodifizierenden Effekts in vivo sind die molekularen Mechanismen der Wirkung und die intrazellulären Zielstrukturen der Substanzen weitgehend unbekannt. Um dieses Problem zu adressieren, wurde eine chemische Sonde des Taxifolin-Zimtsäureesters entwickelt und synthetisiert, um Interaktionen der Substanz mit intrazellulären Proteinen mittels der sogenannten Activity Based Protein Profiling Methode aufzuklären. Hierbei konnten SERCA und ANT-1 als potenzielle Interaktionspartner identifiziert werden. Des Weiteren wurden chemische Modifikationen an den Flavonoiden Taxifolin, Quercetin und Fisetin durchgeführt. Die Erkenntnisse dieser Arbeit leisten einen wichtigen Beitrag zu der Verwendung von pflanzlichen Sekundärmetaboliten als Substanzen mit neuroprotektiven Eigenschaften. Die Ergebnisse dieser Arbeit unterstützen die Entwicklung naturstoffbasierter Therapeutika, die dringend benötigt werden, um neue Strategien für die Behandlung komplexer, neurodegenerativer Erkrankungen hervorzubringen. KW - Flavonoide KW - Morbus Alzheimer KW - Alzheimerkrankheit KW - Flavonoide KW - Neuroprotektivum Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-239360 ER - TY - THES A1 - Kodandaraman, Geema T1 - Influence of insulin-induced oxidative stress in genotoxicity and disease T1 - Einfluss von insulininduziertem oxidativem Stress auf Genotoxitität und Krankheit N2 - Hormones are essential components in the body and their imbalance leads to pathological consequences. T2DM, insulin resistance and obesity are the most commonly occurring lifestyle diseases in the past decade. Also, an increased cancer incidence has been strongly associated with obese and T2DM patients. Therefore, our aim was to study the influence of high insulin levels in accumulating DNA damage in in vitro models and patients, through the induction of oxidative stress. The primary goal of this study was to analyze the genotoxicity induced by the combined action of two endogenous hormones (insulin and adrenaline) with in vitro models, through the induction of micronuclei and to see if they cause an additive increase in genomic damage. This is important for multifactorial diseases having high levels of more than one hormone, such as metabolic syndrome and conditions with multiple pathologies (e.g., T2DM along with high stress levels). Furthermore, the combination of insulin and the pharmacological inhibition of the tumor suppressor gene: PTEN, was to be tested in in vitro models for their genotoxic effect and oxidative stress inducing potential. As the tumor suppressor gene: PTEN is downregulated in PTEN associated syndromes and when presented along with T2DM and insulin resistance, this may increase the potential to accumulate genomic damage. The consequences of insulin action were to be further elucidated by following GFP-expressing cells in live cell-imaging to observe the ability of insulin, to induce micronuclei and replicative stress. Finally, the detrimental potential of high insulin levels in obese patients with hyperinsulinemia and pre-diabetes was to be studied by analyzing markers of oxidative stress and genomic damage. In summary, the intention of this work was to understand the effects of high insulin levels in in vitro and in patients to understand its relevance for the development of genomic instability and thus an elevated cancer risk. N2 - In-vitro-Genotoxizitätsstudien mit hohen Konzentrationen von Insulin und die Kombination mit Adrenalin zeigten keinen additiven Anstieg der Mikrokernzahl. Der Insulinrezeptor und der AKT-Signalweg waren in den insulinvermittelten Genomschaden involviert. Die endogenen ROS-Quellen, Mitochondrien und NOX, waren an dem insulinvermittelten DNA-Schaden beteiligt. Hohe Konzentrationen von mitochondrialen ROS alleine, verursacht durch einen Komplex III Mitochondrien-Inhibitor, führten zu Zytotoxizität, aber nicht zu einer Zunahme des Genomschadens. Daher ist die durch das NOX-Enzym vermittelte ROS-Produktion wahrscheinlich der gemeinsame Faktor des genotoxischen Signalweges von Insulin und Adrenalin. Die Überstimulation des NOX-Enzyms führte zu einer Sättigung der zellulären biologischen Effekte und fehlender Additivität bei der Induktion von Genomschaden. Dies könnte jedoch unter physiologischen Bedingungen anders sein, da die Hormonspiegel niedriger sind und die ROS-Quellen nicht durch jedes einzelne der Hormone bereits maximal genutzt und daher erschöpft werden. Damit könnte die Möglichkeit eines additiven Genomschadens in vivo bestehen. Die Rolle des AKT-Signalwegs bei der Insulin-vermittelten genomischen Schädigung ist bereits etabliert und hier wurde nun die Funktion des negativen Regulatorproteins PTEN untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass die PTEN Inhibierung nicht nur zu einer erhöhten Genotoxizität durch MN-Induktion führte, sondern auch zur Beeinträchtigung der mitochondrialen Funktion. Obwohl kein Anstieg von ROS nach PTEN-Inhibierung beobachtet wurde, könnte die mitochondriale Dysfunktion zur metabolischen Imbalance sowie zur Zunahme des Genomschadens führen. Dies könnte insbesondere bei Patienten mit bestimmten PTEN-assoziierten Syndromen und Krebserkrankungen, die eine defekte PTEN-vermittelte Tumorsuppressorfunktion, DNA-Reparaturdefekte und kompromittierte antioxidative Abwehrmechanismen aufweisen, eine wichtige Rolle spielen. Wenn diese Patienten zusätzlich von Hyperinsulinämie betroffen sind, könnte eine Akkumulation von Genomschaden erfolgen und das Risiko zur Krebsentstehung wäre erhöht. Der Mechanismus der Genomschadensinduktion durch Insulin wurde bisher mit einer ROS-vermittelten DNA-Oxidation in Verbindung gebracht, aber noch nicht mit der mitogenen Signalgebung. Bei dieser beschleunigte das mitogene Potential des Insulins die Zellteilung und verursachte einen leichten replikativen Stress. Der milde replikative Stress könnte der Kontrolle durch die mitotischen Checkpoint-Proteine entgehen und zu Chromosomen-Fehlverteilungen und Chromosomenbrüchen führen. Dieser Effekt wurde in der Krebszelllinie Hela in Form von multipolaren Spindeln und Mikronuklei beobachtet und es ist nicht klar ob normale Zellen mit effizienterer Kontrolle dies verhindern könnten. Insgesamt könnte ein durch hohe Insulinspiegel vermittelter Schaden im Kontext anderer Komorbiditäten wie etwa PTEN Syndromen, metabolischem Syndrom oder Adipositas zu einer Akkumulation von DNA-Schäden führen. Schließlich zeigte die Analyse von Proben adipöser Patienten eine Zunahme von DNA-Schaden und oxidativem Stress im Vergleich zu den gesunden Kontrollen. Der Anstieg des DNA-Schadens war am höchsten in der Untergruppe der Patienten mit Insulinresistenz. Hoher Insulinspiegel bedeutet somit ein Risiko vom erhöhten oxidativen Stress und Genomschaden, insbesondere in Kombination mit Komorbiditäten. Erschwert wird das Verständnis dieser multifaktoriellen Zusammenhänge durch das komplexe Zusammenspiel von oxidativem Stress und seiner zellulären Regulation in vielen physiologischen sowie pathophysiologischen Prozessen. Daneben ist es eine Herausforderung, Genomschäden bei den geringen Wirkspiegeln hormoneller Effekte zu detektieren. Weitere Untersuchungen der komplexen Insulin-vermittelten Genomschadenswege werden notwendig sein, um mögliche Risiken der Hyperinsulinämie bei Erkrankungen wie Stoffwechselkrankheiten, Diabetes Typ 2 und Adipositas besser zu charakterisieren. KW - Insulin KW - Genotoxicity KW - Micronucleus Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-242005 ER - TY - THES A1 - Liang, Raimunde T1 - Identification of new drug targets in adrenocortical carcinoma through targeted mRNA analysis T1 - Identifikation neuer Drug Targets im Nebennierenrindenkarzinom durch gezielte mRNA-Analyse N2 - Adrenocortical carcinomas (ACC) are aggressive tumors associated with a heterogeneous but generally poor prognosis and limited treatment options for advanced stages. Despite promising molecular insights and improved understanding of ACC biology, efficient targeted therapies have not been identified yet. Thus, this study aims to identify potential new drug targets for a future personalized therapeutic approach. RNA was isolated from 104 formalin-fixed paraffin-embedded tumor samples from ACC patients, 40 of those 104 cases proved to be suitable for further mRNA analyses according to the quality check of the extracted RNA. Gene expression of 84 known cancer drug targets was evaluated by quantitative real-time PCR using 5 normal adrenal glands as reference. Protein expression was investigated for selected candidate drug targets by immunohistochemistry in 104 ACC samples, 11 adenomas and 6 normal adrenal glands. Efficacy of an available inhibitor of the most promising candidate was tested by functional in vitro experiments in two ACC cell lines (NCI-H295R and MUC1) alone or in combination with other drugs. Most frequently overexpressed genes were TOP2A, IGF2, CDK1, CDK4, PLK4 and PLK1. Nuclear immunostaining of CDK1, CDK4 and PLK1 significantly correlated with the respective mRNA expression. CDK4 was chosen as the most promising candidate for functional validation as it is actionable by FDA-approved CDK4/6 inhibitors. ACC samples with copy number gains at CDK4 locus presented significantly higher CDK4 expression levels. The CDK4/6 inhibitor palbociclib showed a concentration- and time- dependent reduction of cell viability in vitro, which was more pronounced in NCI-H295R than in MUC1 cells. This was in line with higher CDK4 expression at western blot analysis in NCI-H295R cells. Furthermore, palbociclib was applied in combination with dual IGFR/IR inhibitor linsitinib showing a synergistic effect on reducing cell viability. In conclusion, this proof-of-principle study confirmed RNA profiling to be useful to discover potential drug targets. Detected drug targets are suitable to be investigated by immunohistochemistry in the clinical setting. Moreover, CDK4/6 inhibitors are promising candidates for treatment of a subset of patients with tumors presenting CDK4 copy number gains and/or overexpression, while linsitinib might be an interesting combination partner in patients with both IGF2 and IGF1R overexpression. These results are intended as a basis for a validation study in a prospective cohort, further evaluation in vivo in suitable mouse models or testing in patients with ACC in clinical trials are needed and might improve the future management of patients with ACC in terms of precision medicine. N2 - Nebennierenrindenkarzinome (ACC) sind aggressive Tumore, die mit einer heterogenen, aber insgesamt ungünstigen Prognose sowie limitierten therapeutischen Optionen für fortgeschrittene Stadien assoziiert sind. Trotz hoffnungsvoll stimmenden molekularen Einblicken und verbessertem Verständnis für die Biologie des ACC wurden bisher keine effektiven Targeted Therapies (zielgerichtete Therapien) identifiziert. Daher strebt diese Studie die Identifikation potentieller neuer Drug Targets (Arzneimittelzielpunkte) im Rahmen einer zukünftigen personalisierten Therapie an. RNA wurde von 104 formalinfixierten und paraffineingebetteten Tumorproben von ACC Patienten isoliert, 40 der 104 Fälle zeigten sich nach der Qualitätsprüfung der extrahierten RNA geeignet für weiterführende mRNA-Analysen. Genexpression von 84 bekannten Karzinom-Drug Targets wurden durch quantitative Real-Time PCR unter Nutzung von 5 normalen Nebennieren als Referenz evaluiert. Proteinexpression wurde in selektierten Kandidaten-Drug Targets durch Immunhistochemie in 104 ACC-Proben, 11 Adenomen und 6 normalen Nebennieren untersucht. Das Potential eines verfügbaren Inhibitors gegen das vielversprechendste Kandidatengen wurde in funktionalen in vitro Experimenten mit zwei ACC-Zelllinien (NCI-H295R und MUC1) allein und in Kombination mit einem anderen Medikament getestet. Die am häufigsten überexprimierten Gene stellten TOP2A, IGF2, CDK1, CDK4, PLK4 und PLK1 dar. Die immunhistologische Kernfärbung für CDK1, CDK4 und PLK1 korrelierten signifikant mit der jeweiligen mRNA-Expression. CDK4 wurde als erfolgversprechendster Kandidat für weitere funktionale Validierung ausgewählt, da es durch FDA-genehmigte CDK4/6-Inhibitoren angreifbar ist. ACC-Proben mit Copy Number Gains des CDK4 Genlocus zeigten signifikant höhere CDK4 Expressionslevel. Der CDK4/6-Inhibitor Palbociclib wies eine zeit- und konzentrationsabhängige Reduktion der Zellviabilität in vitro auf, welche ausgeprägter in NCI-H295R- als in MUC1-Zellen war. Dies war in Einklang mit stärkerer CDK4 Expression in den NCI-H295R-Zellen in der Western Blot Analyse. Weiterhin wurde Palbociclib in Kombination mit dem dualen IGFR/IR-Inhibitor Linsitinib eingesetzt, dies zeigte einen synergistischen Effekt auf die Reduktion der Zellviabilität. Zusammenfassend bestätigte diese Proof-of-Principle den Nutzen von RNA Profiling zur Erfassung potentieller Drug Targets. Die ermittelten Drug Targets sind geeignet für immunhistochemische Untersuchungen im klinischen Setting. Darüber hinaus sind CDK4/6-Inhibitoren vielversprechende Kandidaten für die Behandlung einer Teilgruppe von Patienten mit Tumoren, die CDK4-Copy Number Gains und/oder -Überexpression aufweisen, während Linsitinib ein interessanter Kombinationspartner in Patienten mit sowohl IGF2- wie auch IGF1R-Überexpression darstellen könnte. Diese Resultate sollen als Basis für eine Validationsstudie in einer prospektiven Kohorte dienen, weitere Evaluation in vivo in geeigneten Mausmodellen oder Untersuchung in ACC-Patienten in klinischen Studien sind erforderlich und könnten das zukünftige Management von ACC-Patienten verbessern im Rahmen der Präzisionsmedizin. KW - Adrenokortikales Karzinom KW - CDK4 Inhibitor KW - Präzisionsmedizin KW - gezielte Therapie KW - Palbociclib KW - adrenocortical carcinoma KW - precision medicine KW - CDK4 inhibitor KW - ACC KW - targeted therapy Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-235545 ER - TY - THES A1 - Qureischi, Musga T1 - Selective modulation of alloreactive T cells in preclinical models of acute Graft-versus-Host Disease T1 - Selektive Modulation von alloreaktiven T-Zellen in präklinischen Modellen der akuten Graft-versus-Host Erkrankung N2 - Hematopoietic cell transplantation (HCT) is a curative therapy for the treatment of malignant and non-malignant bone marrow diseases. The major complication of this treatment is a highly inflammatory reaction called Graft-versus-Host Disease (GvHD). Here, transplanted donor T cells cause massive tissue destruction and inflammation in the main target organs liver, skin and the intestine. Currently, this inflammatory reaction can be treated successfully using strong immunosuppressive agents. One efficient group of immunosuppressants are calcineurin inhibitors such as Cyclosporin A (CsA) and Tacrolimus (FK506). These treatment strategies target all T lymphocytes subsets equally and do not separate GvH from the desirable Graft-versus-Leukemia (GvL) effect. Therefore, we aimed to find immunological targets on alloreactive T cells in order to develop novel treatment strategies, which selectively modulates alloreactive T cells without impairing the GvL effect or hematopoietic immune reconstitution. The aim of this thesis was to develop a predictive marker panel to track alloreactive T cells in the peripheral blood (PB) of murine allo-HCT recipients. In clinically relevant model of aGvHD we demonstrated that alloreactive T cells have a distinct surface marker expression profile and can be detected in the PB before aGvHD manifestation. Based on our data, we propose a combinatory panel consisting of 4 surface markers (a4b7 integrin, CD162E, CD162P und CD62L) on circulating CD8+ T cells to identify the risk of aGvHD after allo-HCT. Since tumor necrosis factor receptor superfamily (TNFR SF) members are involved in several immunological processes, we did extensive surface marker expression analysis of several TNFR superfamily members and other immunomodulatory molecules on conventional and regulatory T cells (Tcons vs. Tregs) on different time points during aGvHD progression. The aim of this study was to find subset-specific immunomodulatory molecules on recently activated Tcons and Tregs. We found that GITR, 4-1BB and CD27 were highly expressed on alloreactive and naïve Tregs. In contrast, PD1 expression was highly upregulated on recently activated alloreactive Tcons. The data of this study serves as basis for future approaches, which aim to develop T cell subset specific therapeutic antibody fusion proteins. a4b7 integrin and CD162P (P-Selectin ligand) are highly upregulated on alloreactive T cells and mediate the infiltration of these cells into GvHD target organs. We developed recombinant (antibody) fusion proteins to target these two homing molecules and could show that antibody-based fusion proteins are superior to ligand-based fusion proteins regarding production efficiency and binding affinity. Therefore, we propose for future studies to focus on the described antibody-based fusion proteins for the selective targeting of T cells. Since the widely used calcineurin inhibitors are impairing the desirable GvL effect, we investigated if selective NFATc1 inhibition might be a novel strategy to prevent or reduce alloreactivity, while hopefully maintaining the GvL effect. In particular, we addressed the role of the isoform NFATc1 and inhibited its posttranslational modification by SUMO (Small Ubiquitin-related Modifier). Indeed, inhibition of NFATc1 SUMOylation resulted in reduced inflammation and increased Treg frequencies in a murine MHC major mismatch aGvHD model. Conclusively, we showed that alloreactive T cells can be identified by their surface profile in the PB of allo-HCT recipients before aGvHD symptoms appeared. Furthermore, we introduced a approach to selectively target alloreactive T cells by antibody fusion proteins, which might serve as a novel strategy to separate GvH from GvL. Additionally, we demonstrated that averted posttranslational modification of NFATc1 by SUMOylation serves as potential target to reduce alloreactivity of T cells. N2 - Die hämatopoetische Stammzelltransplantation ist eine weltweite Therapiemaßnahme für die Behandlung von malignen und nicht-malignen Knochenmarkserkrankungen(z. B. Leukämien). Eine schwerwiegende Komplikation dieser Therapieform ist die Transplantat-gegen-Wirt Erkrankung (engl. Graft-versus-Host Disease, GvHD). Hierbei greifen Spender-T-Lymphozyten den Körper des Empfängers an und verursachen massive Entzündungsreaktionenin den GvHD Zielorganen Leber, Haut und Darm. Diese überschießende Immunreaktion kann klinisch behandelt werden, indem starkimmunsuppressive Medikamente wie Cyclosporin A (CsA) und Tacrolimus (FK506) eingesetzt werden. Jedoch greifen diese Medikamente alle T-Zellen gleichermaßen an und vermindern ebenfalls die gewünschte anti-Tumorantwort der Spender-T-Lymphozyten(engl. Graft-versus-Leukemiaeffect, GvL effect). Ein Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines prädiktiven FACS Tests, um T-Zellen im peripheren Blut (PB) von Stammzellenempfängern anhand ihrer Oberflächenmoleküle zu identifizieren. Dazu haben wir ein klinisch relevantes Mausmodell für aGvHD herangezogen und konnten zeigen, dass eine Kombination von Migrations- und Aktivierungsmolekülen (a4b7-Integrin, CD162E, CD162P und CD62L) alloreaktive T-Zellen im Blut eindeutig identifizieren konnten,bevor aGvHD Symptome entstanden. Einige Proteine der TNFR Superfamilie sind auf Immunzellen exprimiert und regulieren diverseimmunologische Prozesse. Wir haben konventionelle T-Zellen (Tcons) und regulatorische T-Zellen (Treg) an unterschiedlichen Zeitpunkten aus transplantierten Mäusenisoliert und die Expression von Proteinen der TNFR Superfamilie untersucht, um potenzielletherapeutische Zielstrukturen auf Spender-Lymphozytenzu identifizieren. Wir konnten zeigen, dass GITR,4-1BB und CD27 auf aktivierten, alloreaktiven wie auch auf naiven Tregs exprimiert wurde. Wohingegen, die PD1 Expression vor allem auf aktivierten Tcons induziert wurde. Die Daten dieser Studie dienen als Grundlage für künftige Strategien um T-Zellen mit Hilfe von Antikörper Fusionsproteinen selektiv zu modulieren. Unsere Daten zeigten, dass die Expression von 4 7-Integrin und CD162P auf alloreaktiven T Zellen im Zuge der aGvHD-Pathogenese induziert wird. Weiterhin erstellten wir rekombinante therapeutische Antikörper Fusionsproteinegegen dieoben genannten Migrationsmoleküle. Wir zeigten hier, dass Produktionseffizienz und Bindungsaffinität von Antikörperformaten besser waren als von Liganden-basierten Fusionsproteinen. Demnachempfehlen wir für künftige Studien Antikörperformate heranzuziehen und die hier aufgeführten Antikörper Konstrukteweiter zu entwickeln.Calcineurin Inhibitoren sind potente Immunsupressiva, die zur Behandlung von aGvHD eingesetzt werden. Diese Immunsuppressiva beeinträchtigen jedoch den GvL Effektsignifikant. Da Calcineurin Inhibitoren indirekt den NFAT Signalweg hemmen, haben wir hier dieselektive Inhibition von NFATin alloreaktiven T-Zellen untersucht. Wir zeigten, dass eine fehlende posttranslationale Modifikation von NFATc1 über SUMOylierung (Small Ubiquitin-related MOdifier) zu einer verminderten Alloreaktivität von T-Zellen führte. Diese Spender-T-Zellen zeigten eine verringerte Effektorfunktion, wobei die protektiven Tregs durch die fehlende SUMOylierung nicht beeinflusst wurden. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass alloreaktive T-Zellen über ihr spezifisches Oberflächenmarkerprofil im Blut identifiziertwerden konnten bevor aGvHD Symptome entstanden. Weiterhin beschreiben wir eine neue Strategie, um alloreaktive T-Zellen mittels Antikörper-basierten Fusionsproteinen spezifisch zu modulieren. Darüber hinaus zeigten wir, dass eine Verhinderung der NFATc1 SUMOylierung die Alloreaktivität von T-Zellen deutlich reduzierte, ohne den protektiven Effekt von Tregs zu vermindern. KW - GvHD Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-236031 ER - TY - THES A1 - Venturini, Elisa T1 - Small proteins in \(Salmonella\): an updated annotation and a global analysis to find new regulators of virulence T1 - Kleine Proteine in \(Salmonella\): Eine aktualisierte Annotation und eine globale Analyse, um neue Regulatoren der Virulenz zu finden N2 - Small proteins, often defined as shorter than 50 amino acids, have been implicated in fundamental cellular processes. Despite this, they have been largely understudied throughout all domains of life, since their size often makes their identification and characterization challenging. This work addressed the knowledge gap surrounding small proteins with a focus on the model bacterial pathogen Salmonella Typhimurium. In a first step, new small proteins were identified with a combination of computational and experimental approaches. Infection-relevant datasets were then investigated with the updated Salmonella annotation to prioritize promising candidates involved in virulence. To implement the annotation of new small proteins, predictions from the algorithm sPepFinder were merged with those derived from Ribo-seq. These were added to the Salmonella annotation and used to (re)analyse different datasets. Information regarding expression during infection (dual RNA-seq) and requirement for virulence (TraDIS) was collected for each given coding sequence. In parallel, Grad-seq data were mined to identify small proteins engaged in intermolecular interactions. The combination of dual RNA-seq and TraDIS lead to the identification of small proteins with features of virulence factors, namely high intracellular induction and a virulence phenotype upon transposon insertion. As a proof of principle of the power of this approach in highlighting high confidence candidates, two small proteins were characterized in the context of Salmonella infection. MgrB, a known regulator of the PhoPQ two-component system, was shown to be essential for the infection of epithelial cells and macrophages, possibly via its stabilizing effect on flagella or by interacting with other sensor kinases of twocomponent systems. YjiS, so far uncharacterized in Salmonella, had an opposite role in infection, with its deletion rendering Salmonella hypervirulent. The mechanism underlying this, though still obscure, likely relies on the interaction with inner-membrane proteins. Overall, this work provides a global description of Salmonella small proteins in the context of infection with a combinatorial approach that expedites the identification of interesting candidates. Different high-throughput datasets available for a broad range of organisms can be analysed in a similar manner with a focus on small proteins. This will lead to the identification of key factors in the regulation of various processes, thus for example providing targets for the treatment of bacterial infections or, in the case of commensal bacteria, for the modulation of the microbiota composition. N2 - Kleine Proteine, oft definiert als kürzer als 50 Aminosäuren, sind in fundamentale zelluläre Prozesse involviert. Trotzdem sind sie in allen Domänen des Lebens noch weitgehend unerforscht, da ihre Größe ihre Identifizierung und Charakterisierung oft schwierig macht. Diese Arbeit adressiert die Wissenslücke um kleine Proteine mit einem Fokus auf das bakterielle Modellpathogen Salmonella Typhimurium. In einem ersten Schritt wurden neue kleine Proteine mit einer Kombination aus bioinformatischen und experimentellen Ansätzen identifiziert. Anschließend wurden infektionsrelevante Datensätze mit der aktualisierten Salmonella-Annotation untersucht, um vielversprechende Kandidaten zu priorisieren, die an der Virulenz beteiligt sind. Um die Annotation neuer kleiner Proteine zu implementieren, wurden die Vorhersagen aus dem Algorithmus sPepFinder mit denen aus Ribo-seq kombiniert. Diese wurden der Salmonella-Annotation hinzugefügt und zur (Re-)Analyse verschiedener Datensätze verwendet. Für jede gegebene kodierende Sequenz wurden Informationen zur Expression während der Infektion (duale RNA-seq) und zum Beitrag zur Virulenz (TraDIS) gesammelt. Parallel dazu wurden Grad-seq-Daten ausgewertet, um kleine Proteine zu identifizieren, die an intermolekularen Interaktionen beteiligt sind. Die Kombination von dualer RNA-seq und TraDIS führte zur Identifizierung von kleinen Proteinen mit Merkmalen von Virulenzfaktoren, nämlich einer hohen intrazellulären Induktion und einem Virulenz-Phänotyp nach Transposon- Insertion. Als Beweis für die Leistungsfähigkeit dieses Ansatzes Identifikation von vielversprechenden Kandidaten wurden zwei kleine Proteine im Kontext einer Salmonella-Infektion charakterisiert. MgrB, ein bekannter Regulator des PhoPQ-Zweikomponentensystems, erwies sich als ein für die Infektion von Epithelzellen und Makrophagen essentielles Protein, möglicherweise über seine stabilisierende Wirkung von Flagellen oder durch Interaktion mit Sensorkinasen von Zweikomponentensystemen. YjiS, das in Salmonella bisher nicht charakterisiert wurde, hatte eine entgegengesetzte Rolle bei der Infektion, wobei seine Deletion Salmonella hypervirulent macht. Der Mechanismus, der dem zugrunde liegt, ist zwar noch unklar, beruht aber wahrscheinlich auf der Interaktion mit inneneren Membranproteinen. Insgesamt liefert diese Arbeit eine globale Beschreibung der kleinen Salmonella- Proteine im Kontext der Infektion mit einem kombinatorischen Ansatz, der die Identifizierung interessanter Kandidaten beschleunigt. Verschiedene Hochdurchsatz- Datensätze, die für ein breites Spektrum von Organismen verfügbar sind, können auf ähnliche Weise mit einem Fokus auf kleine Proteine analysiert werden. Dies wird zur Identifizierung von Schlüsselfaktoren in der Regulation verschiedener Prozesse führen und damit z. B. Targets für die Behandlung bakterieller Infektionen oder, im Falle kommensaler Bakterien, für die Modulation der Mikrobiota- Zusammensetzung liefern. KW - Salmonella Typhimurium KW - Kleine Proteine KW - small proteins KW - dual RNA-seq KW - TraDIS KW - MgrB Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-247029 ER -